SU1752764A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к бактери м рода BRUceLLa - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи , ветеринари , медицина. Сущность изобретени : штамм получают гибридизацией спленоци- тов мышей линии Balb/c с клетками миело- мы Х63-Ад 8-653. Продуктивность штамма достигает 35-45 мкг/мл в культуральной жидкости и 7-8 мг/мл в асцитной. Монокло- нальные антитела (МКА) направлены к белку внешней мембраны бактерий рода Bruceila смол.м. 14 кД. МКА относ тс  к классу lgG1. Штамм обозначен СзН4 и хранитс  под номером ВСКК(П) 518Д. 2 табл.

Description

со С

Изобретение относитс  к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии, касаетс  получени  моноклональных антител (МКА) к антигенам бактерии рода Bruceila и может быть использовано в ветеринарии и медицине при разработке средств диагностики и профилактики бруцеллеза.

Известны штаммы гибридных клеток (гибридом), вырабатывающие МКА к 0-цепи липополисахарида (ЛПС) бруцелл, которые  вл етс  хорошо изученным антигеном гра- мотрицательных бактерий.

Имеютс  также штаммы гибридом - продуцентов МКА против кор участка пол- исахаридной молекулы бруцелл.

Получен также штамм. МКА которого позвол ют дифференцировать Bruceila от Yersinia enterocolitica 0-9

Антигенные свойства белков внешней мембраны (БВМ) Bruceila начали изучатьс  сравнительно недавно Имеющиес  данные свидетельствуют об иммуногенности БВМ и

возможности использовани  их в качестве протективного антигена в создании вакцин. Перспективность белковых антигенов в конструировании вакцинных препаратов объ сн етс  тем, что они могут быть легче синтезированы или получены методом ре- комбинантной ДНК (генетической инженерии ) в достаточном количестве, чем компоненты ЛПС.

Кроме того, установлено, что за перекрестные реакции, отмечаемые между Bruceila и другими микроорганизмами, ответственны не белковые, а полисахаридные антигены. МКА, направленные к белковым антигенам бруцелл, особенно к БВМ, могут быть незаменимым инструментами в разработке как диагностических, так и профилактических препаратов.

Известны клоны гибридных клеток Bruce 5 и Bruce б, вырабатывающие МКА к белкам клеточной стенки Bruceila. Гибридо- мы были получены путем сли ни  спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных инактивированными клетками Brucella abortus с миеломной линией NC-1. МКА этих гибридом реагировали с ультразвуковым дезинтегратом клеток, но не св зыва- лись с ЛПС и не обладали способностью агглютинировать бруцелл, Это свойство дает основание отнести МКА Bruce 5 и Bruce 6 к белокспецифическим антителам.

Известна гибридома - А23, продуциру- юща  МКА к БВМ Brucella. МКА клона А23 взаимодействовали с имтактными клетками в твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА), но не про вл ли активность по отношению к ЛПС. На основании этих дан- ных можно сделать вывод, что данный клон продуцирует МКА, специфичные к эпитопу белка. В приведенных работах не установлена молекул рна  масса, антигенность и другие свойства белков, против которых получены МКА, вырабатываемые упом нутыми гибридомами,

Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридных клеток мыши, продуцирующих МКА к БВМ бактерии рода Brucella с мол, м. 14 КД.

Штамм получают следующим образом.

Мышам линии BALB/c в первый день иммунизации внутрибрюшинно ввод т 100 мкг БВМ, полученного из Brucella melltensls 16М, в 0,1 мл неполного адьюванта Фрейд- на. На 7. 11, 12 и 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2-7,4. Спуст  4 дн  после по- следней иммунизации извлекают селезенку с тех мышей, которые дают более высокие титры антител по ТИФА, Клетки селезенки иммунных мышей в количестве 20х10б гиб- ридизуют с 2х106 клетками миеломы Х63- Ад8-5.6.3 в присутствии 1 мл раствора, содержащего 45% (объем на объем) полиэти- ленгликол  с мол. м. 4000 и 10% диме- тилсульфооксида в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэти- ленгликол  их высевают в  чейки 96-луноч- ной панели.

Селекцию гибридных клеток провод т на среде, содержащей гипоксантин-ами- ноптерин-тимидин.. Гибриды-продуценты клонируют два раза методом лимитирующих разведений, высева  в  чейки 96-лу- ночной панели с питающим слоем перито- неальны макрофагов мыши. После второго клонировани  практически 100% субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену . Продуктивный клон гибридомы обозначают 1 СЗ Н4.

Штамм гибридомы 1 СЗ Н4 хранитс  в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П)518Д и характеризуетс  следующими свойствами.

Морфологическа  характеристика. Культура состоит из слабоприкрепл ющихс  к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клетку Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка.

Культуральные свойства. Среда культивировани  - RPMI-1640 с 10% фетальной СЫВОРОТКИ теленка, 2x10 М глютамина, 1x10 М пирувата натри , М 2-мер- каптозтанола, 1x10 HEPES. Культивирование штамма ведут при 37,5°С в атмосфере с 5% С02. Характер роста - стационарна  сус- пенз и , Частота пассировани  - через 2-3 сут, кратность рассева 1:3-1:4. Посевна  концентраци  клеток 1-2хЮ5 в 1 мл. Наибольшее число клеток в логарифмической фазе роста 0,5 млн/мл.

При внутрибрюшинной прививке мышам гибридомы образуют опухоль в асцит- ной форме на 10-12-й день. Доза клеток при прививке 2x10 клеток. За 7 дней до введени  гибридомы необходимо инъецировать животным пристан-2, 6, 10,14-тетраметил- пентадекан в дозе 0,5 мл на голову, К моменту депонировани  штамм прошел 5 пассажей на мышах BALB/c.

Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивировани  гибридомы секреци  МКА достигаетс  35-45 мкг/мл в культуральной среде. В асцитной жидкости концентраци  иммуноглобулинов составл ет 7-8 мг/мл. Количество последней от одной мыши 4- 8 мл.

Характеристика полезного продукта. МКА относ тс  к классу IgG подкласса 1. Оно специфично к антигенной детерминанте БВМ бруцелл с мол, м. 14 кД При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додециосульфата натри  МКА раздел ютс  на Н и L цепи с мол м, 60 и 20 КД соответственно. Константа св зывани  2x10 М,

Методы оценки специфичности МКА: непр мой и сэндвич варианты ТИФА, им- муноблот.

Контаминаци  штамма Контаминатов линии, включа  бактерии, грибов, дрожжей и микоплазм не обнаружено,

Криоконсерваци , К осадку гибридных клеток добавл ют фетальной сыворотки теленка и диметилсульфооксида до конечной концентрации 10% Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимис  крышками по 1--5 млн. кл., помещают в коробку из пенопласта и

став т на 1 сут в морозильник при -70°С, после чего ампулы перенос т в жидкий азот.

Услови  размораживани . Замороженные клетки штамма вынимают из сосуда с жидким азотом м быстро помещают в вод ную баню на 37°С. Как только растают последние кусочки льда, суспензию гибридомы перенос т стерильной пипеткой в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды, отмывают один раз и засевают в  чейки 24-луночной панели с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Выживаемость при размораживании 85%.

Штамм 1 СЗ Н4 используют следующим образом,

Пример 1. Гибридные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5 х 105 в 5 мл среды культивировани , инкубируют 3-4 дн  при 37,5°С в атмосфере , содержащей 5% С02. Культуральную среду собирают, центрифугируют 10 мин при 800 g и 4°С с целью отделени  клеток надосадочной жидкости - супенатанта, содержащего антитела. При культивировании гибридомы In vivo иммуноглобулиновую фракцию на асцитной жидкости получают высаливанием белков сульфатом аммони  45%-ного насыщени  с последующим диализом против ЗФР (рН 7,2-7,4) при 4°С в течение ночи Полученные антителосодер- жащие материалы (супернатант и очищенную асцитную жидкость) используют как реагенты дл  изучени  специфичности взаимодействи  МКА с тестируемыми антиге1- нами.

П р и м е р 2. Дл  проведени  непр мого варианта ТИФА на полистироловую 96-лу- ночную панель дл  микротитровани  сорбируют интактные клетки микроорганизмов в концентрации 1 х 107 кл/мл или БВМ бру- целл по 10 мкг/мл в 100 мкл ЗФР.рН 7,2-7,4 при 4°С в течение ночи Затем панель отмывают 3 раза ЗФР с 0,05%-ным твином-20 (ЗФР-ТВ) и 3 раза ЗФР, готов т в  чейках панели двукратные разведени  супернатан- та (1.2 и выше) и очищенной асцитной жидкости (1.100 и выше) в объеме 100 мкл ЗФР-Тв После инкубации в течение 1,5 ч при 37°С панель отмывают описанным способом и внос т в  чейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой. Через 1 ч повтор ют процедуру отмывки с целью удалени  несв занных продуктов реакции, а св завшуюс  пероксидазу, а значит, и антитела против антигена бактерий определ ют количественно по расщеплению субстрата -НаОз в присутствии хромогена - оргофенилендиамина. Положительна  реакци  характеризуетс 

коричневым окрашиванием и просчитыва етс  при 492 нм.

Результаты опыта по определению специфичности МКА в непр мом варианте ТИ- 5 ФА представлены в табл. 1

Как видно из табл. 1, МКА штамма 1 СЗ Н4 взаимодействуют с БВМ трех использованных видов бруцелл. Причем титры МКА против Brucella abortus шт. 19 и Brucella suis

0 шт. 1330 выше, чем против вида Brucella melltensls 16M, использованного дл  иммунизации мышей. Следует отметить, что МКА, специфичные к БВМ бруцелл, не реагируют с аналогичным антигеном бактерии Yerslnia

5 enterocolltlka 0:9, который, как известно, серологически не отличаютс  от Brucella.

Как следовательно ожидать, испытуемые МКА не св зывались с ЛПС бруцелл. Титры МКА против интактных бактерий бы0 ли ниже и определ лись они только при исследовании асцитной жидкости, что объ сн етс  малой концентрацией специфического антигена , адсорбированного твердой фазой полистиролового носител , в случае исполь5 зовани  суспензии клеток.

П р и м е р 3. На полистироловую 96-лу- ночную панель дл  микротитровани  сЪрби- руют МКА из асцитной жидкости (20 мкг/мл), очищенной высаливанием сульфатом аммо0 ни .в 100 мкл бикарбонатного буфера (рН 9,5) при 4°С в течение ночи. Затем панель отмывают по три раза ЗФР-Тв и ЗФР, внос т в  чейки БВМ бруцелл в концентрации 5 мкг/мл в ЗФР-Тв и инкубируют 1,5ч при 37°С. Панель

5 отмывают описанным способом, готов т в  чейках двукратные разведени  биофабричной позитивной бруцеллезной сыворотки крупного рогатого скота, имеющей титр в реакции агглютинации 1:600, в ЗФР-Тв

0 (1.100 и выше). В качестве отрицательного контрол  использовали негативную сыворотку этого же вида животного. После выдерживани  панели при 37°С в течение 1,5 ч повтор ют процедуру отмывки и в  чейки

5 внос т антивидовые антитела, меченные пероксидазой . Концентрацию св завшихс  антител определ ют по примеру 2.

Результаты исследований приведены в табл, 2.

0 Приведенные данные свидетельствуют не только о специфичности МКА, но и анти- генности белков захваченных антителами штамма 1 СЗ Н4, а также возможности использовани  этой тест-системы в разработ5 ке методов диагностики бруцеллеза.

П р и м е р 4. Постановка иммуноблота. Образцы БВМ различных видов бруцелл в количестве 10 мкг подвергают электрофорезу в 10%-ном полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натри .

Электрофореграмму перенос т на нитро- целлюлозную бумагу в течение 1 ч при 60 В и 250 мА. Свободные участки носител  блокируют 1%-ным бычьим сывороточным альбумином в ЗФР, рН 7,2-7,4 (18 ч при 4°С), затем отмывают по три раза ЗФР и инкубируют 1,5 ч при 37°С с МКА из очищенной асцитной жидкости, разведенной 1:100, ЗФР-Тв. После этого носитель отмывают три раза ЗФР-Тв и ЗФР, затем его выдерживают в рабочем разведении антимышиных антител, меченных пероксидазой (1 ч при 37°С). Повтор ют процедуру отмывки и про вл ют реакцию с помощью 4-хлор-1- нафтола.

Примечание, РО - реакци  отрицательна .

5

При электрофорезе БВМ Brucella abortus шт, 19, Brucella melltensls шт. 16М и 565, Brucella suls шт. 1330 раздел ли на 4 фракции с мол. м. 48; 41-43; 23; 14 кД. Им- мунохимическое вы вление специфического белка, выполненное по примеру 4, показало, что МКА, продуцируемые штаммом гибридомы 1 СЗ Н4, направлены против детерминанты БВМ с мол. м, 14 кД. Формул а изо бретен и  Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК (П) 518Д, используемый дл  получени  моно- клональных антител к белку внешней мембраны бактерий рода Brucella с мол, м. 14 кД.

Таблица 1

Таблица 2

Claims (1)

10 Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК (Π) 518Д, используемый для получения моноклональных антител к белку внешней мембраны бактерий рода Brucella с мол. м. 14 кД.

Таблица 1

Виды бактериальных антигенов Титры МКА в культуральной среде в асцитной жидкости БВМ Brucella abortus шт.19 1:32 1:6400 БВМ Brucella melltensls шт. 16М 1:4 1:800 БВМ Brucella suls шт.1330 1:16 1:3200 БВМ Yersinia enterocolltlca 0:9 РО РО ЛПС Brucella abortus шт. 19 РО РО Интактные клетки: ' Brucella abortus шт.19 РО 1:800 Brucella melltensls шт. 498 РО 1:400 Brucella suls шт. 1000 РО 1:400 Brucella ovls шт. 428 РО 1:400 Yersinia enterocolltlca 0:9 РО РО Escherlhla coll РО РО Campylobacter fetus veneralls РО РО

П р и м е ч а н и е. РО - реакция отрицательная.

Таблица 2

БВМ бруцелл Показатели экстинции в зависимости от степени разведения позитивной сыворотки 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 Brucella abortus шт.19 0,505 0,478 0,381 0,219 0,103 0,068 Brucella melltensls шт. 565 0,493 0,407 0,336 0,202 0,096 0,053 Brucella suls шт.1330 0,467 0,350 -.298 0.187 0,091 0,049

Примечание. Показатель экстинции негативной сыворотки был равен 0,048.