JPS60110289A - ジゴキシンに対し高い親和性を有するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はジギタリス配糖体であるジゴキシンに対し高い
親和性を有し、関連する配糖体やスピロノラクトンに対
して低い選択性を有するモノクローナル抗体、このモノ
クローナル抗体を産生ずるセルライン、この抗体の使用
、そしてこのモノクローナル抗体を含む試験系に関する
。

現在西ドイツにおいて毎日６００万人の心１負病患者が
ジギタリス配糖体による治療を受けている（Ｊ、Ｒ，○
ｃｈｓ、　Ｇ、Ｂｏｄｅｍ、　Ｍｓｄ、　Ｗｅｌｔ　５
０　ｒ　６０２（１９７８））。従ってこの杵の配糖体
は最も頻繁に処方されている。この群の中でジゴキシン
か最も重要であり、９０％以上はジゴキシンが使用され
ている。

しかしゾギクリス配循体が広く頻繁に使用されているか
らといって、これらの物質が治療範囲の狭いという危険
性を有している物質であることを忘れてはならない。従
って効果的かつ安全な治療を行なうためにはジギクリス
瀬度を連続的に追跡することが必須であり、この目的の
ために棟々の異なった試験方法が開発されている。これ
らの方法においては、配糖体に対して生体により産生さ
れた抗体が試薬として使用されている。これらの抗体は
、ジギクリスで免疫した動物の血清から得られる。こう
してポリクローナル抗体、すなわち異なった抗体を含有
する抗血清が得られる。

しかしなから多くのジゴキシンの試験系における大きな
問題はジギトキシン（９１２位に水酸基が存在しない点
のみかジゴキシンと異なる物質）との強い交叉反応であ
る。

（１）ジゴキシン、（２）ジャトキシン、（３１スピロ
ノラクトンの構造式 しかしゾギトキシンの交叉反応よりもさらに重要な問題
は、スピロノラクトン（たとえはＡｌｄａｃｔｏｎｅ■
）による交叉反応性妨害の可能性があることである。ス
ピロノラクトンはアルドステロン拮抗剤であり、ジゴキ
シンと共に細索に投与され、多くの測定系、さらに市販
製剤において存在する。スピロノラクトンは芙質的に高
い投与量で使用されるため、試験糸がスピロノラクトン
とジゴキシンを充分区別できない場合は、スピロノラク
トンが高ゾゴキシン濃度として現われる危険性がある。

ウサギやヒツジにおいて常法により産生される抗血清の
交叉反応性を改良するために、アフイニテイクロマトグ
ラフイーによる面倒な精製が試みられている。しかしこ
こでの問題は（精製収率が低いために起きる）大量の抗
血清の不足であり、交叉反応性の改良にはしばしば検出
感度の有意な低下がつきまとうことである。収率が悪い
のは、尚感度の原因となる高親和性の抗体はアフイニテ
ィカラムからの溶出が非常に困難であるか又は不ＥＪ能
であるためである。

抗体産生の従来法に変わるものとして１９７゜年代末期
より、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｓｉｎの先駆的な仕事
ｉ　９７５／７６　（Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５
（１９７５）、ｌに基〈ハイフリトーマセルラインの細
胞培養による抗体の産生がしだいに重要になってきた。

これらのセルラインはあらかじめ免疫したマウスの牌細
胞をマウスの腫瘍セルラインと体細胞融合させ、次にク
ローニング操作を繰返すことにより得られる。

ハイブリドーマｉ胞は全て羊−の親細胞に由来している
ため、均一な特異性を有する単一の型の抗体、モノクロ
ーナル抗体（ｍＡＫ　）のみを産生ずるという点で区別
される。ハイプリドーマ細胞は腫瘍セルラインであるた
め理論的には無限に増殖でき、理論的に無限大の量の抗
体を産生することができる。

ジゴキシンによる治療を受けている患者の連続的な追跡
、中中寡の治療の試験のためには、前述の代表的な性質
から、試験系に瓜を用いることが当然好ましい。

不発明の目的は体細胞融合により、ジギタリス配楯体で
あるジゴキシンに対し＾い親オ■性を有するモノクロー
ナル抗体を開発することであった。

すでに述べた様にジゴキシン検査においては他物質によ
る交叉反応の問題が特に重要である。したがって本発明
のもうひとつの目的は、関連の配糖体（％にジギトキシ
ン）に対する親和性が低く、アルドステロン拮抗剤であ
るスピロノラクトンに対し感度が低いことを特徴とする
、ジギタリス配楯体であるジゴキシンに対し高い親和性
を有するモノクローナル抗体を開発することであった。

抗体は全ての抗体に共通の定常部分と、ポリペプチドの
可変部分から成り、抗体の特異性は可変部にのみ依存す
る。生物を抗原で刺激して抗体を作らせると、この抗原
に対する免疫グロブリンが産生される。しかし抗原には
いくつかの抗原決定基があり抗体の結合部位がいくつか
存在するため、同じ抗原に対する抗体ではあるが親和定
数が異なり特異性の異なる抗体の混合物が作られる。

問題は、もし目」目ニならばジゴキシンに対し向い親和
性と特異性という２つの性質を兼ね備えた抗体をこの（
昆合切の中から見つけることである。

これまで使用されてさた試験で侍られた好ましい感度を
有するモノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体と同
じ短所をイ弓している。すなわちそれらはジゴキシンに
対し親和性はあるが、ジギトキシン及び／又はスピロノ
ラクトンに対する交叉反応性も無視できないということ
である。

ジゴキシンで免疫した後得られたマウスのＰＭ細胞をマ
ウスのｊ庫瘍セルラインと公知の方法により融合し、こ
の体細胞融合させた細胞を適当な培地中で培養し、特別
なスクリーニング試験により同定、選択することにより
、所期の抗体（すなわちジゴキシンに対する高い観オＵ
性と感度を有するモノクローナル抗体）を産生ずるハイ
ブリッド細胞を得ることかでさ、本発明の目的は驚く程
うまく達成された。

このため同一の細ｒ＋＝培養液の上澄液の同一の試料に
ついて、一方で′はジゴキシンに対する結合活性を、も
う一方ではゾギトキシンに対する結合活性をラジオイム
ノアッセイ法で調べた。この活性を相互に比較すること
により、ジゴキシン存在下ではきわめて活性が強く、ゾ
ギトキシン存仕下では活性の弱いｍＡＫを産生ずるセル
ラインを選択することがでさた。この重度に特殊な細胞
を単離し、確立した。

マウスの免疫、屏細胞の単離、細胞の融合、ハイブリッ
ドの培養と選択、所期の抗体を産生ずるハイブリッドの
サブクローニング、ハイブリッドや抗体の単離は全て、
当業者に公知の方法に従い実施した。文献としてはＫｏ
ｈｌｅｒ　ａｎｄ　ＭｉｌｓｔｅｉｎのＮａｔｕｒｅ２
５６．　４９５　（１９；’５　）、Ｈｏｃｈｋｅｐｐ
ｅｌらのＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１８．
　４６７　（１９８１）及び５ｅｃｈｅｒらのＮａｔｕ
ｒｅ　２８５．４４６　（１９８０）を参照。

免疫には、当業者は通常使用されるＢａ１ｂ／ｃマウス
を用いることができる。ハイブリッドの安定化及び複製
には培養はｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏででき
る。ｉｎ　ｖｉｖｏ培養の場合は、あらかじめ１１屯瘍
第１ｊ原物質で処理したマウスの脹脛にハイブリッドを
注入′１−る。次に腹水より９１期の特異性を有するｇ
、製されたモノクローナル抗体を卑離し、必要な場合は
イａ製する。

本発明によるこのモノクローナル抗体はジゴキ、　シン
に対し＾い栽オロ性を有することか判明し、試験系に使
用するための基本的条件は満たしている。

ポリクローナル性の大多数の通常の抗ジゴキシン血清や
文献［Ｙｓｌｔｏｎ、　Ｄ、Ｅ、、　５ｃｈａｒｆｆ、
　Ｍ、Ｄ、；Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
５０．６５７−６８０゜（１９８１）　；　ｍａｒｇｏ
ｌｉｅｓ、　Ｎ、Ｍ、　Ｈｕｎｔｅｒ、　Ｍ、Ｍ、；Ｓ
ｍ１ｔｈ、　Ｔ、Ｖ／、；　Ｎ０ＶＯｔｎｙ＋　Ｊ　、
ｓ　ＨＥＬｂｅｒ　Ｅ、；　Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｆｃｅｌｌｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａｓ；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ、　Ｇ、Ｊ、；
　Ｈａｍｍｓｒｌｉｎｇ、Ｕ、；　Ｋｓａｒｎｅｙ＋Ｊ
。

Ｆ、；ｅｄｓ、；　ｐｐ　６６７−６７４　Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ／ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ　（１９８１）　；
　Ｂａｎｇ、　Ｂ、Ｅ、；　Ｈｕｒｍｅ、　Ｍ、；Ｉｕ
ｎｔｕｎｅｎ、　ｋ、；　Ｍａｋｅｌａ＋　Ｏ，；　５
ｃａｎｄ、　Ｊ’、Ｃ１１ｎ、　Ｌａｌ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　４　Ｌ　７５−７８　（１９８１）　
；Ｈｕｎｄｓｒ。

Ｍ、Ｍ、；　ｍａｒｇｏｌｉｅｓ、　Ｍ、Ｎ、　Ｊｕ、
　Ａ、；　Ｈａｂｅｒ、　Ｅ、；　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、’Ｉ　２９．　１１６５−１１７２
．（１９８２））に記載のいくつかの他のモノクローナ
ル抗ジゴキシン抗悴と比較すると、本発明の工はジゴキ
シンに対する特異性が著しく高い。ジコゝキシンに類似
のジギトキシンのような物置も明瞭に区別される（交叉
反応性は約１．６％）。

他の信遺か類似の化合物（たとえはステロイド）につい
ても交叉反応性が見られないことは確認された。ジゴキ
シンと共に投与されることの多いアルドステロンの拮抗
剤であるスピロノラクトンに対する親和性が極めて小さ
いことから、治療の追跡にこの匡の使用は特に好ましい
。この場合交叉反応性はわずかに０．００７％と無視で
きる程小さい。

この抗−ジゴキシンモノクローナル抗体を用いてＭｉｃ
ｒｏｔｉｔｅｒ■プレート中で試験系を確立した。この
試験系により時間かかなり節約できたばかりでなく、必
要な試薬の量も大幅に減少した。特に［ミクロ−ＲＩＡ
　ｊ　（ＲＩＡ　＝ラジオイムノアッセイ）ではその感
度（検出限界：　０．８　ｎｇ／ｄ　）のよさのため、
治療量、のジゴキシンの投与後の、前処理なしていない
血漿試料の測定が可能になる。

賃するに本発明のｍＡＫを用いる試験系は、現在市販さ
れているキットに比較して感度、特異性共に優れている
。

このミクロ試験糸は、ルーチンの検査として有効に実施
−■能である。モノクローナル抗体を用いるＲＩＡの特
別の利点は、増殖し続けるセルライン（細胞培養の浮遊
液中、又はマウスの腹水中）として、一定の性質を持っ
たモノクローナル抗体を理論的に無限量産化できる抗体
の供給源に、理論的に無限の期間戻ることができるだろ
うということである。

別紙２の図の説明 図１：２匹の動物における抗体産生の増加。

図２：１０日増殖後の細胞クローンの顕微鏡像。

図６：１復水のアフイニテイクロマトグラフイーによる
精製の溶出パターン（ＤＥＡＥＡｆｆｉ　（ｌｅｌＢｌ
ｕｅ■を使用）。

図４　：　ｍＡＫ　Ｄ　５０　（”ミクロ−ＲＩ’Ａ　
”系）を使用した場合のジゴキシン−ＲＩＡの感度。

４回の測足値の平均値（±標準偏差）　（ｍＡＫ稀釈１
　：　４０．０００．　Ｔ＝６．０００　ｃｐｍ。

ｂｏ＝４０　％、　Ｎ５Ｂ＝　１−７％）。

図５＝ジゴキシンミクロ−ＲＩＡにおける、構造類似物
置の妨害。

図６＝　［ミクロ−ＲＩＡＪの操作の流れ。個々の操作
は１．９．２　（方法）に詳述されている。

要約＝１００μｌの試料又はジゴキシン標準物置、１０
０μｔの１２５Ｉ−ジゴキシン、そして１００μ！の抗
ジゴキシンｍＡＫをピペットで採りＭｉｃｒｏｔｉｔｅ
ｒ■プレートの穴に入れる。室温でインキュベーション
後、結合した放射能と遊離の放射能をテキストラン活性
炭を用いて分離する。各混合液の一定蛍をとり結合した
放射能を測定する。

以下本発明をさらに詳しく説明する。

１、方法 １．１免疫物質の調製 ハプテンとしてのジゴキシンと担体分子としての牛血清
アルブミン（ＢＳＡ、マイルズ）より成る免疫物置複合
体はＢｕｔｌｅｒ　＆　Ｃｈｅｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔ。

Ｓｃｉ、　（ｔ）ＳＡ）５７．　７１−７８　（１９６
７）の方法により調製した。

１．２供血体であるマウスの免役 免疫にはＢａ１ｂ／ｃ株のマウスのみ用い、２０匹のマ
ウスの群を免疫する。ジゴキシン−ＢＳＡと完全フロイ
ンドアジュバント（ＣＦＡ、ディフコラボラトリーズ）
１：６の比の乳濁液を各マウスの膜腔内に投与する（マ
ウス−匹につき免疫原２０−５０μｇ）。

４週間後に０．９％ＮａＣ１中のジゴキシン−ＢＡＡを
２０−５０μｇ追加免疫する。必要であれは４週問おき
にこの追加免疫を数回繰返す。

マウスの免疫反応を定期的に血液試料を採取して追跡す
る（　Ｐｉ、　ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌｓ　）　’ａ
血中の抗体価を測定するために市販のＲＩＡキット（Ｄ
ＩＡＧＮＯ８ＴＩＣＰＲＯＤｔＪＣＴ８社）の試薬を用
いる。

１．６マウスの癌セルラインの培養 セルラインｘ　６５　、　Ａ　Ｇ　８−６５５　ｒＫｅ
ａｒｎｅｙら、Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．１２５．　ｉ　５
４８　（１９７９））を融合に用いる。この＋ｌ＋１ｉ
ＩｌＪ＆は凍結用培地中でα体だシャーレ（直径ｉ　Ｑ
ｃｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ　）に入れる。

対駆増殖期の細胞を融合に用いる。

１．４体剣胤融合 最後の追加免疫をしてから６−４日後に無菌朱件下で、
免役したマウスの肺臓をとり出す。ステンレス製のｆＩ
４＜孔の大きさ１００μｍ）の上で注息深くすりつぶし
た後、牌細胞から結合組織を分離し、ＰＢＳ　（ＩＪン
酸緩衝生理食塩水、につける。

ＤＰＢＳ　（夕゛ルベツコーＰＥＳで２回洗い（１，０
００ｒｐｍで５分間遠心分離）、次にＤＰＢＳにつける
。

この混合液中で牌細胞とＡｇ８細胞を２：１で混合する
。ポリエチレングリコール−ＤＰＢＳ　（ダルベツコ−
ＰＢＳ中ＰＥ０４０００７１％、　ＤＭＳＯ６％；ＲＯ
ＴＩＳ　Ｉ　ＧＭＡ／ＳＥＲＯＭＦＤより販売）を加え
て、細胞融合を開始する。１分後にダル・＼ツコーＰＢ
Ｓ（ＤＰＢＳ　）を加えてＰＥＧを権釈する。ＰＥＧが
完全になくなるまで細胞浮遊液を洗い、次に１０６細胞
／ｍｌの濃度になるようにヒボキサンチン／アミノゾテ
リン／チミジン選択用地（ＬｉｔｔｌｅｆユｅｌｄのＨ
ＡＴ培地）に入れる。この選択培地中では融合した細胞
のみ生存でさ、浮遊液中の融合してない細胞やＡｇ　８
細胞は生存できない。

１．５ハイプリドーマ細川の培養 融合後の細１１ｉ！Ｉ浮遊液（ＨＡ’ｒ培地中）をピペ
ットで２０ＯＮずつとり、Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ■プレ
ート（Ｃ０３ＴＡＲｔｙｐｅ　６５９６　）の９６個の
穴の中に入れる。６７°Ｃ１相対湿度９５％で、９６％
の空気と７％のＣＯ２の雰囲気中で培地を変えないでイ
ンキュベーター中で通気をしなから７−１０日間インキ
ュベートする。この間に定期的に細胞の増殖を追跡する
。

２−６週間後に、この目゛的のために開発した特別のス
クリーニング法（１，９を参照）を用いて、陽性の培養
液（すなわち所期の特異性を有する免疫グロブリンを産
生じている培養液）を同定する。

同時に培養液をＨＡＴ培地からＴ−１１Ｔ培地にそして
ＲＰＭ：［１６４０培地に順番にかえていく。

１、６　）・イブリドーマ培養細胞のクローニンクゞ陽
性の瑠殖培誉欣を大容量の堵養容＠＠　（Ｃ０８ＴＡＲ
細Ｉ＠ｉ冶誉プレー）　ｔＹｌ）８．５５２４又は３５
０６）中で増殖させる。以下のクローニングは「限界イ
イ１くクローニング」法により実施する。この方法でＱ
工１場性の培養液を綿釈して新しく培養を始めたとき移
植された細胞欽が飢Ｈ１的にそれぞれ１０又は１個にな
るようにする。８−１２日後に単一の細胞力・ら出発し
た大きなコロニーがすでに見えるようになる。

本当にモノクローナルの細胞（単−Ｊ）共通の親＋Ｙ、
１１１施から得られた培養細胞）が増殖していることを
確認するため、クローニング操作ｋま少なくとも２回行
なう。

１．７・・イブリドーマ培養細胞の」−１加１．７．１
培養細胞の増加（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）約１０３個の細
胞を１０ｍ１のＲＰＭＩ　１６４０の＆まいつ’ｊｊ”
ｔ’−ｖ（ｕｉ径１０１．　ＧＲＥＩＮＥＲ）の中にま
く。シャーレのかわりに細胞培養ビンヲ使ッテもよい。

数日後に細胞を含まない上鍬次中に細胞の分泌したｍＡ
Ｘが含まれている。これ＆ま直接ＲＩＡに使用し得る。

１．７．２マウスの腹水の瑠加（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）腹
膜なｒＸＩ−１ｍするために鉱物油Ｐｒ１ｓｔａｎ■（
ＲＯＴＨ）０．５−をＢａ１ｂ／ｃマウスに腹腔内投与
する。

７−６０日以内にこうして前処理したマウスの＋Ｗ腔内
に一匹あたり１０６−１０’１固の・・イブリドーマ細
＋＋＝の浮遊＃：　（ＰＢＳ中）を投与する。８−１０
日後に腹腔にカニユーレをさしこんで細胞を含有する腹
水を集める。

遠心分離（１１０００ｒｐｍｊ　１０分）により腹水か
ら細Ｊｊ＝成分を分離する。モノクローナル抗体を含有
する上澄画分も（必要な場合は稀釈してから）分注して
一７０℃で保存するか、又はアブイニテイクロマトグラ
フイーで精製する。

１．８腹水の和製 Ｂｒｕｃｋらの方法［Ｊ’、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅ
ｔｈ、　５５　。

５１５−５１９　（１９８２））により精製する。

１、８．１腹水の前処理 腹水を１．ｏｏｏｘｇで５分間遠心分離して細胞成分な
′沈澱させる。超遠心分離（１００，０ＯＯｘ、！ｉ’
。

６０分）により細胞断片とフィブリン塊を分離除去する
。次に上澄画分を１００倍量のトリス−ＨＣヱ緩両漱（
０’、０２　ｍｌ沼、ｐｉ−１７，２）で−晩透析する
。

そして１０．０００Ｘｇで１５分間遠ノｂ分離する。

１．８．２クロマトグラフイー 前処理した腹水１ゴをＤＥＡＦ　Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　Ｂ
：ｌｕｓ■（ＢＩ○−Ｐ、ＡＤ）　（ベッド容積７−）
を充填したカラムに添加する。カラムをカラムの緩衝ｅ
、（トリス−ＨＣＪ、０．０２　ｙｎ／−ｅ、ｐＨ７，
２）で洗う。異なる蛋白なＮａＣＪの濃度勾配（０−１
００ｍｍｏｌ　／　１３　）で流速５Ｏ−４０ｆｎｌ／
ｈで溶出する。１−２ｒｎ１．の画分を果める。溶出中
容画分の蛋白含量を追跡する。

抗体を含む一分を集め０．０２％ＮａＮ３添加後４°Ｃ
で保存する。

１．９全血、細胞培養上澄画分と腹水における抗体検出
のためのスクリーニング試験 ジゴキシンのｍＡＫの開発の過程に細胞培養上澄画分に
おける抗体を見出す方法として２つの方法（同相酵素免
疫定量法とラジオイムノアッセイ）を用いた。スクリー
ニング段階ですでに、ジゴキシンに対し交叉反応性の低
いｍＡＫの選択にはラジオイムノアッセイが待に優れて
いることがわかった。

１．９．１固相免疫足電法 ＥＬＩＳＡ　７′）レートの−８り製 同相酵素完投足量法（Ｓ　Ｐ　−ＥＬＩＳＡ　）として
抗体産生の一般的スクリーニング試験を行なった（　Ｅ
ＬＩＳＡ　＝　ｅｎｚｙｍｅ　１ａｂｅｌｌｅｄ　ｉｍ
ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ　）。免疫において
免役物質として用いたジゴキシ：ｙ　ＢＳＡ結合物で、
Ｍ工。ｒｏｔｉｔｅｒ■プレートの９６個の穴をまず被
覆しく５６μｇ／穴）、６７℃で９０分インキュベート
する。残っている遊離の非特異的結合部位を牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）　（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ、０．０
５％ツイーン２０．０．０２％ＮａＮ３　）でブロック
する。生理食−水（２回蒸留水中０．１５　Ｍ　ＮａＣ
Ｊ！、０−０５％ツイーン２０．０．０２％ＮａＮ３　
）で２回洗浄後、こうして前処理したプレートを湿潤相
中４°Ｃで４週間まで保存する。

ＥＬＩＳＡ法 各細胞培養上澄画分を、あらかじめ仮積したプレートの
谷穴にピペットで入れる。６７℃で９０分−ｊインキュ
ベーション佐、穴の中の内容物を捨て、プレートを生理
食塩水で６回洗う。

抗原（ジゴキシン−ＢＳＡ　）に結合し侍る抗体、した
がって細胞上澄画分の面相に結会し得る抗体を検出する
ために、検出試薬としてアルカリ性ホスファクーゼで標
識した第２抗体（ＭＥＤＡＣＬｔｄ。

襄のヤギ抗マウス免疫グロブリン、抗−ｘｇＭ）を用い
る。さらにインキュベーション（９０分、６７℃）後、
ホスファターゼ基質（ｐ−二トロフェニルホスフエート
の２ナトリウム塩、Ｓ工ＯＭＡ。

０．１％ジェタノールアミン緩衝液、ｐ）１９．０．　
１００μｌ／穴）を添加して酵素反応を開始させる。呈
温で約１時間反応後、陽性の培養液の細胞上澄画分を含
有するプレート中の穴に、有意な黄色の発色がみられる
。Ｍｉｃｉｏｔｉｔｅｒ■系に一致する８−チャンネル
光度計（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ、　Ｆ
ｌｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ｌｐ　）を用いて
、プレート中の発色反応を直接定量する。

１、φ、２抗体意生のスクリーニングのためのラジオイ
ムノアッセイ スクリーニング用１（ＩＡはマイクロクイクープレート
中で［ミクロ−ＲＩＡＪ（下記）として行なう。

混合欣は下記の試薬より成る。

細胞Ｊ４！Ｉ養上澄液１００μｔ ｌに５ニージゴキシントレーサー１ｏｏμｅ（ＤＩＡＧ
ＮＯ３ＴＩＣＰＲＯＤ［ＪＣＴＳ）又はｌに５ニーシイ
キシントレーサー１００μ１（ＤＩＡＧＮＯ８ＴＩＣＰ
ＲＯＤＴＪＣＴＳ）正常ヒト血清１００　ｆｉｌ　（Ｍ
ＡＩＮＴＺ　血液銀行）周囲温度でインキュベーション
（３０−４５分）後、遊離の放射活性と抗体に結合した
放射活性をデキストラン被覆活性炭（ＭＥＲＣＫ　）の
リン酸緩衝数浮遊液を加えて１５００Ｘｇで１０分間遠
心分離して分離する。Ｍｉｃｒｏｔｉｔｓｒ■プレート
の各穴から一部採り、結合した放射活性（上澄液中）を
ガンマシンチレーションカウンター（ＫＯＮＴＲＯＮ　
ＭＲ４８０ｃ）で測定する。

１．１０シイキシンのラジオイムノアッセイ１、９．２
で記載したスクリーニング試験と同様にして、ジゴキシ
ンＲＩＡをＭｉｃｒｏｔｉｔｅｒ（Ｂ’プレート中の１
−シクロ−ＲＩＡｊとして行なう。この場合Ｊ）混会奴
は下記の試榮より成る。

抗ジゴキシンＩｎＡＫ１００μｔ １２５ニージゴキシントレーサー１００μを血漿試料ｉ
ｏｏμｅ 又は血漿中のジゴキシン標準液１００μｔピペツテイン
グ操作は（谷試料又は標準液を採取する場合を除＠）８
チヤンネル又は１２チヤンネルピペツト（ＴＩＴＥＲＴ
ＥＫ”　ＦＬＯＷ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ装）を用
いて行なう。

インキュベーション時間や他の操作は全てスクリーニン
グＲＩＡと同じである。

１、１１　ｍＡＫ　ノ兜＆グロブリンのサブクラスの決
定ｍＡＫは固相ＥＬＩＳＡ系において一層特徴が出る。

Ｍｉｃｒｏｔｉｔｓｒ■ゾレートの穴を抗原（ジゴキシ
ン−ＢＳＡ　）で仮積する。こうして細胞培養液の慮で
調製したプレートをインキュベーション（６７℃で２時
間）後、種々のクラスそしてサブクラスの抗マウス免疫
グロブリンや種々のクラスの免疫グロブリンのＬ頭やＨ
鎖を使用して、２回目のインキュベーション（６７′Ｇ
で１時間）を何なう。次に酵素標誠ヤギ抗つサギ兇投グ
ロブリンを加え１時間インキュベートし、ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェートを添加して酵素反応を開始させる。

２、結果 ２．１マウスの免疫応答 免疫後何週間かすると２０匹の群のマウスのうち１６匹
の全血中に、ラジオイムノアッセイで抗ジゴキシン抗体
を産生じているのが検出される。

特に免疫反応性の高いことがわかったマウスだけを、次
の融合実験における肺臓の提供マウスとして用いる。

図１に２匹のマウスの抗体産生の上昇の例を示しである
。

２．２ハイブリドーマセルラインの確立融合のもうひと
つのセルラインとしてはＰ５ｘ６５　、　Ａｇ　８−６
５５−　Ｔｈのみを用いる。こうして５０−８０％の融
合頻度（ＨＡＴ選択培地で生存している細胞の比率）が
規則的に得られる（表１）。

１７　３１４　’８Ｌ７％　１　１ ２０　２９９　５２．０％　６１ ２８　４４８　７７．８　％　６１ 表１　例としてあげた６回の融合実験における融合収率
の要約。

融合１７：もともと６８４個の培養からスタートした；
融合２０と２８＝もともと５７６１固の培養。

安定した増殖と抗体産生を示すコロニーを「限界稀釈ク
ローニング」法（培養した細胞を融合後侑釈し、２個の
Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ■プレート（１９２（ｉｍの培養
）に入れ、各折しい培養液中の細胞数が統計的に１であ
るようにする）によりクローニングする。

１０日後にプレートの各人に最初のクローン細胞か肉眼
で検出できる。この段階では顕微鏡で規則的で均一な細
胞の増殖が容易にみられる（図２）。

正確に１週問おきにまず固相ＥＬＩＳＡ法でそして次に
ＲＩＡ法で、各クローンの抗ジゴキシン抗体の産生ｔｆ
：追跡する。

数週間にわたって継続的に抗体を産生するクローンな２
つの異なる方法で増やす。第１の方法では培養細胞の浮
遊敢を大きなシャーレの中か又は細胞培養ビンの中へ入
れる（　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ系）。

第２の方法では、Ｐｒ１ｓｔａｎ■で前処理したマウス
の腹膜における腹水として・・イブリド−マクローンを
増殖させる（　ｉｎ　ｖｉｖｏ系）０細胞浮遊液の一部
を凍結保存する。

２．６　培養細胞と腹水における−の産生２つの系にお
けるセルラインの遺伝的安定性従って目的のモノクロー
ナル抗体を産生ずる能力を、ＲＩＡ法により抗体価を絶
えず調べることによりかなり長期間にわたって追跡する
。こうすると安定なりローンは比較的少数であることが
わかる。大多数のクローンでは数週間すると抗体価が絶
えず低下するため、Ｒ工Ａにおける放射性トレーサーの
同一の結合力を得るためには、腹水又は培養細胞の上澄
液をさらに濃縮しなければならないという事実より、そ
れらのクローンは遺伝的に不安定であることかわかる。

ハイブリドーマ体が腹水としてｍ′ＡｉＬでいるマウス
（工１３厘々の物置、斗寺に蛋白、従って免ｊ文グロブ
リンそして破壊旧酵素（例えは７０ロチアーゼ）を腹水
中に放出する。

これらの成分は又後で腹水を試験系で丈用するとき問題
と７よるので、腹水を積装することか好ましい。

２．４　腹水の槓製 ＤＥＡＥ　Ａｆｆｉ　Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅｏ　ｋ用いるア
フイニテイクロマトグラフイーで腹水を梢４Ｄする。

ＮａＣＪｄ度勾配（０−’１００　ｍｍｏｌ／４　）で
溶出中にＩｇＧ画分を破壊的プロテアーゼ（これはＮａ
（Ｊ改変が１２０　ｍ　ｍｏｌ／−６より筒いときのみ
溶出される）やアルブミンから分離する（図６）。

モノクローナル抗ジゴキシン抗体は、Ｎａ（４３５−５
０ｍ　ｍｏｌ　／４３のＩｇＧピークで溶出される。ピ
ーク画分（６５−７０）の蛋白濃度は８０μｇ／−であ
る。プロテアーゼ検査キット（ＢＩＱ　ＲＡＤ’　）を
用いると、工ｇＧピークの両分にはプロテアーゼが汚染
していないことが証明できる。

■ｇＧピークの蛋白強度が最も商い両分が、放射γδ性
ジゴキシントレーサーに対し最も親和性の商い画分と必
ずしも一緒に浴出していないことか結合定量法（ＲＩＡ
）によりわかる。

２．５　ジゴキシンに対するｍＡＫの性質２、５．１免
疫グロブリンサブクラス 抗ジゴキシン抗体ｍＡＫ　Ｄ　２８−　Ａ　９１−１６
−Ｂ６４　（Ｄ５０と省略）はサブクラスＩｇ０１の免
疫グロブリンでありＬ鎖はカッパ型である。

２．５．２　親オロ性 ｍＡＫＤ２８−Ａ９’１−ｉ６−Ｂ６４にクイてジゴキ
シンに対する結合の親和定数はラジオイムノアッセイの
データを用いてめる。この測定結果と２つの市販のＲＩ
Ａキットのポリクローナル抗体と比較した結果を衣２に
示す。

ｍＡＫＤ５０　’、　４．Ｉ　Ｘ　１０９抗血７ＪＩＤ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　６．ＯＸ　１
　Ｑ９表２　ｍＡＫＤ５０のＫａ　ｊｌ［と市販のキッ
トの抗皿消のＫａ値の比較。

ジゴキシンに対する慮の親木ロホ数はＲＩＡのデータよ
り釆めた。

表のＫａ値より抗ジゴキシンｍＡＫは親和性の向い抗体
であることがわ〃）る。その親４０足数はポリクローナ
ル抗体と同じオーダーである。

２、５．６感反 ｍＡＫ　Ｄ　５　［］を用いるＲＩＡ糸の感度をめるた
めに、標準液一度が０．０６ｎｇ／−から１００　ｎｇ
　／ｄの範囲で各磁度に４点を用いて測定する（図４）
。

検出限界（「ミク０−　ＲＩＡ　ｊでは）はｉｎｇ／ｍ
Ａより有意に低値であり、この点からもｍＡＫのシイキ
シンに対する親和性の高さがわかる。

２、５．４特異性 図４から明らかな様に、各点の何回かの測定値の変動は
非常に少ない。測定の再現性の正確さを示す例として、
表６に絶対標準偏差及び相対標準偏差と共に図４の標準
曲線な得たデータを示す。

ジゴキシン　％ｂ／ｂ（ｃ）　絶対　相対Ｃｎｇ／ｆｎ
ｌ〕　標準偏差　標準偏差０．０５　９９．２４　２．
５５　２．５７　％０．０５　９Ｂ、５５　５．０５　
．５．０８　％０．１　９７．１）　１．５））　１．
９’９　％表６　ジゴキシン［ミクロ−ＲＩＡ　Ｊの精
度（試験のパラメータについては図４を参照） 試験系（たとえば追跡治療）において抗ジゴキシン抗体
を用いている場合は特に、ジゴキシンと他の類似の物質
（たとえはある場合にはステロイドのような内因性の物
質、又はアルドステロンの拮抗剤であるスピロノラクト
ンのようにジゴキシン療法において一緒に投与される物
質）をどれだけ区別できるかということがきわめて重要
である。

又ジゴキシンと、ステロイド環の１２位の。Ｈ基がない
という点でのみシイキシと異なるジギトキシンを明瞭に
区別できることが好ましい。

ｍＡＫ　Ｄ　２８−　Ａ　９１−１６−　Ｂ　６４は「
ミクロ−ＲＩＡ　ｊにおいてジゴキシンに対し非常に優
れ７−″特異性を示す（図ｂ）。ジギトキシンとの交叉
反応性は１゜６矛であり、スピロノラクトンに対する交
叉反応性は０．００７％である。同体に試験し１こ独々
のステロイドによる勧告はほんのわすかである（図５）
。

２、４．５　ジゴキシン測定用「ミクロ−１（工Ａ」ス
クリーニング試験においてはマイクロクイター系か籍に
優れていた。培養細胞の上澄液画分を同じ格子構造を有
する試験プレートに移す用ＩＪヒ性かあるため特別のビ
ペツテ１ング装置（１２チャンネル−ペット）を使用す
ることができ、人手と時間が大幅に減少できる。

スクリーニングアッセイでの充分な経験を−４１，υ、
してマイクロタイクー格子系の利点をジゴキシンの検葺
自牙゛にも使用した。従来のＪＲＩＡ試験管（プラスチ
ック試以管、７５　ｘ　１２　ｍｍ、５ＡｎｓＴｒｉ；
ＤＴ）でもともと実施されていたＲＩＡを、マイクロク
イター系に適応させた。

この目的のために測疋容績を６００μｅに減らした。結
合した放射能と遊離の放射能の分離は、５０μｔを越え
ない基の適当な一度の油性炭浮遊液によりイ丁なう。

こうして有用なＲＩＡ示か得られる。このイ々の操作を
図６に俣式的に示す。本例Ｉ￥ｔｉＩＶのＲ工Ａのデー
タは全て（標準曲線、特異性の証拠など）、この測定系
を用いてめた。測定容量か少ないということは、操作時
間が火曜に節約できる（「ミクロ−ＲＩＡＪ系では１時
間あたり約６００不の試料が処理できる）のみでなく、
必要な試薬の量も減らすことができる。

セルライン１ａＫ　Ｄ　５０　（Ｄ　２８−　Ａ　９１
−１６−Ｂ６４）は１９８６年１２月２１日に番号ニー
２７２でＣＮＣＭ　（Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｎａｔｉ
ｏｎａｌｅ　ｄａｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅ　ｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ　）　、パスツール研究所、バリ
ーに寄託した。

使用した緩衝液と培地の組成 土緩衝液 １．１ダルベツコ−ＰＢＳ　（ＤＰＢ’Ｓ、量は７１り
７石）文献：　Ｅａｒｌｓ、　Ｗ、Ｒ，ｅｔ、ａｌ、＋
　Ｊ、Ｎａｔ、ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ。

４．１６５（１９４５） ＨａｌｌｋＳ＋　ＪＩＵ、ａｎｄ　Ｒ，Ｅ、Ｗａｌｌａ
ｃｅ、Ｐｒｏｃ。

Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、７１　、　１９６
（１９４９） Ｄｕｌｂｅｃｃｏ、Ｒ，ａｎｄ　Ｍ、Ｖｏｇｔ、Ｊ　、
Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。

９９、　１６７（１９５４） ＰＢＳ　Ｅａｒｌ’ｓ　Ｈａｎｋｓ’ （り）ｌくツコー）　５ａｌｔｓ　５ａｌｔｓＮａＣＪ
　’５ｏｏｏ　＜５８００　８０００Ｋ（Ｊ　２０［）
　４００　４０Ｏ Ｎａ２ＨＰＯ４１１５０−４８ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ１４０− ＫＨ２ＰＯ４２００６０ ＭｇｃＪ２−６Ｈ２０１００−−“ ＭｇＳＯ３・７Ｈ２０２００２００” ＣａＣＪ２　１００　２００　１４０ グルコース　１ｏｏｏ　ｉｏｏ。

フェノールレッド　−１０１Ｏ ＮａＨＣＯ３２２００３５０ 餐本来の組成はＭｇＣｌ２６Ｈ２０１００〜／ＬとＭｇ
５ｏ、７Ｈ２ｏＶＯＯｎ＆／ｉである。

１．２リンは緩袖Ｉ液（ＰＢＳ、承はｇ／石）９．６　
ｍｌＡ　、ｐＨ＝＝　７　、４ＮａＣＪ　８．０ ＫＣ１Ｏ，２ １Ｊａ２ＨＰＯ４−２Ｈ２０１，４４ ＫＨ２Ｐ０．　０．２ ０．１１＋１０１　／、８ＮａＨＣＯ３（２回蒸留水中
）０．１　ｍｏｌ／−ｇＮａ２ｃＯ３（２回蒸留水中）
ｐＨ９，［］に調整 ８．２０５　ｊ；ｉ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ２９．２２　ｇ
１１ａＣ２８００ｍＨ２Ｏ中酢酸でｐＨ４，Ｏに調整し
、２回蒸留水で１．８に調整する。

１．５グリシンＨ（Ｊ緩衝液（０，１ｍｏｌ／−ｇ）溶
液ａ　：　Ｏ，ｉ　ｍｏｌ　／　に３グリシン（７，５
０５ｇ／石）＋　Ｑ、　ｉ　Ｍ　Ｎａ（Ｊ（５−８５７
／−ａ　）溶１　ｂ　：　０．１　ｍｏｌ／、＃　Ｈ（
Ｊ緩衝液の組成：浴液ａ８８％ 浴液ｂ１２　％ −６，２ ０−１５ｍｏｌＡＮａＣＪ！ ０．０５％ツイーン２０ ０．０２　％　ＮａＮ３ ２回蒸留水中 ０．５％Ｈ８Ａ ０．０５％ツイーン２０ＰＢＳ中 ０．０２％ＮａＮ５ ジェタノールアミン４８− Ｍｇ（Ｊ２　（５２，２６■ＭｇＣＡ。・６Ｈ２０）　
ｌｚ・６Ｈ２０）２回蒸留水４０〇− ｉ　ｍｏｌＡのＨＣＪでｐＨ９，０に調整し、２回蒸留
水で５００−にする ＰＥＧ４０００　２０．！ｉ’ ２０分間オートクレーブ（１２１°Ｃ）８０°Ｃに冷や
す ２８−のＤＰＢＳ　（１５饅ＤＩシＳＯ含む）を加える
６、細側培誉培地 ３、Ｉ　ＰＰＭＩ　１６４０培地（意は〜／り文献：　
Ｍ、ｏｏｒｅ、　Ｇ、Ｅ、　ｅｔｌｌｌ、ｓＪ、　Ａｍ
、　Ｍｓｄ、　Ａｓ５ｏｃ、　１９９＋　５１９　（１
９６７’Ｎａ（Ｊ　６０００ ＫＣＪ、　４０Ｏ Ｎａ　２ＨＰＯ４・７Ｈ２０１５１２ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１００ Ｃａ（ＮＯ３）２４Ｈ２０１００ Ｄ−グルコース　２０００ フエノールレツド　５・。

ＮａＨＣＯ３、２０００ Ｌ−アルギニン　２００１ Ｌ−アスパラギン　５０ Ｌ−アスパラギン酸　２０ Ｌ−シスチン　５０ Ｌ−グルタミン　６００ Ｌ−グルタミン酸　２０ グリシン　１０ Ｌ−ヒスチジン　１５ Ｌ−ヒドロキシプロリン　２０ Ｌ−イソロイシン　５０ Ｌ−ロイシン　５０ Ｌ−リジン−ＨＣＪ　４０ Ｌ−メチオニン　１５ Ｌ−フェニルアラニン　１５ Ｌ−プロリン　２０ Ｌ−セリフ　６０ Ｌ−スレオニン　２０ Ｌ−トリプトファン　５ Ｌ−チロシン　２０ Ｌ−バリン　２０ グルタチオン　１ ビオチン　０・２ ビタミンＢ１゜　０　、００５ Ｄ−ＣＡ−パントテン酸塩　０．２５ 塩化コリン　６ 葉酸　１ Ｌ−イノシトール　６５ ニコチンアミド　１ ｐ−’γミノ安、す、含酸　１ ピリドキシン・ＨＣＪ　１ リボフ２ピン　０．２ チアミン・ＨＣｊｌ、　１ 液坏堵地は１０１１Ｉ！７’／沼のフェノールレッドな
含有するざらに： ０．００２ｍｏｌＡ　Ｌ−グｈｐミン １０５ｔ）／４　ペニシリン−ストレプトマイシン２ｘ
ｌＯ”ｍｃ＋ν石　メルカゾトエタノール１０−１５％
　Ｆｅ２ ５、２　ＨＡＴ培地／ＨＴ培地 Ａ二アミノプテリン５−８２ＴＱ／　２００　ｒｎｌｌ
　２回蒸留水゛ｎ’ｒ：ｇボキサンチン２７２．２０１
１１５／（２０［１ｍ２回蒸留水中）チミジン７６．５
０〜 ＨＡＴ培地：基礎浴液Ａｉ［１ｔｎｌ十基礎溶液ＨＴ１
０ｄＲＰＭ１１６４０（添加物を全て加えである）１０
００ゴ ＨＴ培地：基礎溶液ＨＴ１０ｍ ＲＰＭＩ（ｍ加物を全て加えである）１０００ｍ／！６
．６沫結用堵地 ７０％ＤＰＢＳ １０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキサイド）２０％ＦＣ
８（牛脂児血Ｉｎ）

【図面の簡単な説明】

図１：２匹の動物における杭体産生の増加。 図２＝１０日増鵠俊の画側クローンの顕微鏡像。 図６＝腹水のアフイニテイクロマトダラフイーによる精
製の溶出パターン（ＤＥＡＥ　Ａｆｆｉ　Ｇｅ１Ｂｌｕ
ｓ■を使用）。 図４　：　ｍｋＫ　Ｄ　５０　（”ミクＣ１−Ｒｌｋ　
’糸）を使用した場合のジブキシン−ＲＩＡの感度。 ４回の測足値の平均値（±標準偏差）　（ｍＡＫ稀釈１
　：　４０，０００．　Ｔ＝　６．ＯＯＬｌ　ｃｐｍ。 ｂｏ　＝　４　Ｑ％、Ｎ５Ｂ−＝１．７％）。 図５＝ジゴキシンミクロ−ＲＩＡにおける、構造類似物
質の妨害。 図６：　［ミクロ−ＲＩＡＪの操作の流れ。個々の保作
は１．９．２　（方法）に詳述されている。 手続補正書（方式） 昭和オ／年／、？月２日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和ヨテ年持許願第１７．．）ρり乙　号事件との関係
　持３′１出願人 ５、補正命令の日付　圭′８ 昭和ｄ年り／月−２日 ６、補正により増加する発明の数　＋、ｊ；。 −も ７・補ＢＥ（Ｄ対象　、−，９，へ？・し２ｉ山　（内
＃１７疫ψクリ　、ビ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ジゴキシンに対し高い栽オロ性と選択性を有する
   モノクローナル抗体を産生ずることを特徴とする、ハイ
   ブリッドセルライン。 （２）産生するモノクローナル抗体のジゴキシンに対す
   る交叉反応性が１．５％未満であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の・・イブリッドセルライン。 （３１浬生するモノクローナル抗体のスピロノラクトン
   に対する交叉反応性が０．００７％未満であることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記載のハイブ
   リッドセルライン。 （４）　マウスにジゴキシンを免疫し、ジゴキシン、ジ
   ギクリス配楯体およびスピロノラクトンを用いて、体細
   胞融合の通常の操作段階に必要なハイブリッド細胞の選
   択をすることに−より産生される、特許請求の範囲第１
   項から第６項のいずれか１項に記載のハイブリッドセル
   ライン〇 （５）ジギタリス配糖体としてジギトキシンを用いるこ
   とにより産生される、特許請求の範囲第４項記載のハイ
   ブリッドセルライン。 （６）ジゴキシンに対し高い栽オロ性と特異性をイコす
   ることを特許とする、モノクローナル抗体。 （７）ジギトキシンに対する交叉反応性か１．６φ未滴
   であることを特徴とする特許請求の範囲第６項記載のモ
   ノクローナル抗体。 （８）　スピロノラクトンに対する交叉反応性が０．０
   ０７％未満であることを％徽と１−る、特ｒＦ　請求の
   範囲第６項又は第７項記載のモノクロ−カル抗体。 （９）　マウスをジゴキシンで免疫し、ジゴキシン、ジ
   ギクリス配糖体およびスピロノラクトンを用いて、体細
   胞融合の通常の操作段階に必要な・・イブリッド細胞の
   選択を行ない、ついでモノクローナル抗体を単離するこ
   とにより調製され得る、特許請求の範囲第６唄から第８
   項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。 ０１ＪＩシｅクリス配循体としてジギトキシンヲ用いる
   ことにより産生される、特許請求の範囲第９項Ｈｄｇの
   モノクローナル抗体。 ０１）　ａ）マウスを免疫原で処理し、ｂ）これらのマ
   ウスの屏細胞をマウスのミエローマ細胞で融合し、 Ｃ）融合していない細胞のハイブリッドを分離除去し、 ｄ）免疫原に対するモノクローナル抗体を産生ずるハイ
   ブリッドを選択し、そして ｅ）必要な場合にはハイブリッドを単離する特許請求の
   範囲第１項から第６項のいずれか１項にｄ己載のハイブ
   リッドセルラインの製造方法において、 シコゝキシンをａ）の免疫原として使用し、ジゴキシン
   、ジギタリス配樹体そしてスピロノラクトンを用いてｄ
   ）の選択を行なうことを特徴とする、上記方法。 ＠　ジギクリス配ｈｒ体としてジギトキシンを用いるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の方法。 ａａａ）　マウスを免疫原で処理し、 ｂ）　これらのマウスのＩ］￥！細胞をマウスのミエロ
   ーマ細胞で融合し、 Ｃ）融会し−こいない細胞の・・イブリッドを分離除去
   し、 ｄ）免疫原に対するモノクローナル抗体を産生するハイ
   ブリッドを選択し、そして ｅ）　ｉｎ　ｖｉｖｏ　（生体内）又はｉｎ　ｖｉｔｒ
   ｏ　（生体外）において細胞を増殖させた後、モノクロ
   ーナル抗体を任意に単離する特許請求の範囲第６項から
   第８項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の製
   造方法において、ジゴキシンをａ）の免疫原として使用
   し、ジゴキシン、ジギクリス配糖体およびスピロノラク
   トンを用いてｄ）の選択を行なうことを特徴とする、上
   記方法。 ０４　ジャタリス配糖体としてジギトキシンを使用する
   ことを特徴とする特許請求の馳囲第１６項記載の方法。 ＯＱ　ジゴキシンの検出、診断、定量用に、特許請求の
   範囲第６項、第７項、又は第８．！ＪＩに記載のモノク
   ローナル抗体を使用すること。 ｒｓ　全血において検出、診断、定量用に特許請求の範
   囲第１５項記載のモノクローナル抗体を使用すること。 （＋７）　％許請求の範囲第６項、第７項、又は第８項
   に記載のモノクローナル抗体以外に、標鐘したジゴキシ
   ントレーサーを含有することを特徴とする、試験糸。 （ト）　トレーサーとして１２５ニージゴキシンを使用
   することを特徴とする特許請求の範囲第１７項記載の試
   験系。