JPS6261596A - 薬剤耐性癌に関するモノクロ−ナル抗体およびその製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、薬剤耐性癌細胞に関するモノクローナル抗体
およびその製造に関する。さらに具体的には、本発明は
、該モノクローナル抗体、それを生産するハイブリドー
マおよび該モノクローナル抗体の生産方法に関する。

癌を化学療法により治療していく際に、抗癌剤に対する
耐性を有する癌細胞が選択されて出現してくる現象がみ
られ、重大な問題となっている。

この耐性を克服するためには抗癌剤の投与量を増やすこ
とが考えられよう。しかし、投与量の増大は正常細胞に
対する障害というり１作用で患者を不必要に苦しめるこ
とになる。耐性克服のための他の手段として他の種類の
抗癌剤を使用することが考えられよう。しかし、この場
合では、一旦一つの薬剤に対し耐性となった癌細胞はし
ばしばいわゆる［多剤交叉耐性（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉ
ｃ　ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｃ　）を示すことが
あって効果が少ないことが多い。

従って、こうした癌細胞の薬剤耐性を克服するため、副
作用が少なくて、選択性の高い、かつ多剤交叉耐性を示
す癌ｍ胞に対して有効な薬剤あるいは方法の確立は重要
な課題となっている。

Ｉ匡旦遣 多剤交叉耐性を示す癌細胞に選択性を有するモノクロー
ナル抗体は既に作成されている（ジャーナル・オブ・ク
リニカル・オンフロジー（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　０ｎｃｏ
ｌｏａｙ　）　、第３巻、第３１１〜３１５頁（１９８
５年）〕。これは、多剤交交叉性を示す癌Ｉｌｌ胞の１
１１Ｉ１１膜上に特異的に出現する分子１１７万〜１８
万ダルトンの糖蛋白質に反応するモノクローナル抗体で
ある。しかし、このモノクローナル抗体を作成する際に
用いた耐性細胞株は、ヒトではなくてチャイニーズハム
スター由来のものであり、またこのモノクローナル抗体
により耐性癌ｍ胞の薬剤に対する感受性については何ら
報告されていない。

従って、この先行技術に係るモノクローナル抗体は、ヒ
ト薬剤耐性癌Ｉｔ胞の選択的治療に用いることができな
いであろうと解される。

発明の概要 要　　　　旨 本発明者らは、アドリアマイシン耐性腫瘍細胞で免疫し
たマウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させて得
られたハイブリドーマにより生産されるモノクローナル
抗体が多剤交叉耐性を示す癌ＩＩｌ胞を選択的に増殖用
害するかあるいはその薬物に対する感受性を高めること
を見出して本発明を完成した。

従って、本発明による薬剤耐性癌にｇＡするモノクロー
ナル抗体は、下記の（イ）〜（ニ）によって定義される
ものであること、を特徴とするものである。

また、本発明による下記の（イ）〜（ニ）によって定義
される薬剤耐性癌に関するモノクローナル抗体の製造法
は、下記の工程（ａ）〜（ｇ）からなること、を特徴と
するものである。

（ａ）　　ヒト骨髄性白血病細胞株に５６２から遺失し
て確立したアドリアマイシン耐性株に５６２／ＡＤＭに
よりマウスを免疫すること。

（ｂ）　　免疫されたマウスから脾臓を取り出して、そ
の細胞懸濁液を作成すること。

（ｃ）　　このｎ′ｍ胞をマウス骨髄腫細胞と共に細胞
融合条件にイ４して、両細胞の融合によるハイブリドー
マを形成させること。

（ｄ）　　上記の工程より得られる細胞混合物を、ハイ
ブリドーマのみを成育させることのできる選択培地で培
養すること。

（ｅ）　　ハイブリドーマ含有上清について目的抗体の
有無を測定して、目的抗体を産生ずるハイブリドーマを
選択すること。

（ｆ）　　選択されたハイブリドーマをクローン化する
こと。

（０）　　このクローンをマウスの腹腔内に移殖するか
あるいは培地にて培養し、電性の腹水中または培養上清
中に生成蓄積されたモノクローナル抗体を採取すること
。

（イ）　ヒト骨髄性白血病［１胞株に５６２のアドリア
マイシン耐性株に５６２／ＡＤＭにより免疫したマウス
から得られたＩ？Ｉ［ｌ胞とマウスの骨髄１１１１１１
とを融合させて作成したハイブリドーマにより生産され
るものであること。

（ロ）　アドリアマイシン耐性株を特巽的に識別する能
力があること。

（ハ）　アドリアマイシン耐性株の細胞増殖を阻害する
かあるいはその細胞のビンクリスチンまたはアドリアマ
イシンＤに対する感受性を高める能力があること。

（ニ）　　ＩＯＧイソタイプに属するものであること。

本発明は、また、ハイブリドーマにも関するものである
。すなわち、本発明によるモノクローナル抗体生産性ハ
イブリドーマは、ヒト骨髄性白血病細胞株に５６２のア
ドリアマイシン耐性株に５６２／ＡＤＭにより免疫した
マウスから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞との細
胞融合により作成されたものである。

効　　　　果 前記したように、また後記実験例から明らかなように、
本発明によるモノクローナル抗体は多剤交叉耐性を承り
癌細胞を選択的に増殖阻害するか、あるいはその薬物に
対する感受性を高める能力を有している。

従って、本発明によるモノクローナル抗体は、副作用が
少なくて選択性の高いかつ多剤交叉耐性を示す癌細胞に
対して有効な薬剤あるいは方法の確立という重要な課題
に対する一つの解決手段となりうるちのである。

１１立ｌ焦五１１ 本発明によるモノクローナル抗体は、抗体産生細胞がア
ドリアマイシン耐性ヒト腫瘍細胞であるという点に留意
すれば、Ｉｌｌ胞融合によるハイブリドーマの製造およ
びこのハイブリドーマによるモノクローナル抗体の製造
からなる合目的的な任意の方法によって製造することが
できる。

ＩＩ胞融合法を含めてモノクローナル抗体の’ｔＪｉ？
＋に関しては既に綜説ないし成南がいくつか知られてい
るので、本発明の一興体例についての下記の説明以外に
必要な情報に関してはそれらの文献を参照されたい。適
当な文献のいくつかを挙げれば、たとえば、ガルフレお
よびミルスティン：［メソツヅ・イン・エンザイモロジ
−Ｊ　　（Ｇ、Ｇａ１ｆｒｅ、ＣＨｉｌｓｔｅｉｎ：　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｇｙ＋ｌｏ１．）第７３巻、第３
−４６頁（１９８１）およびゴーディング二「モノクロ
ーナル・アンチボディーズ：プリンシブルズ・アンド・
ブラクチス」　（アカデミツク・プレスＴＩＪ　１９８
３　）　（Ｊ、Ｗ、Ｇｏｄｉｎｇ：Ｈｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａ
ｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ、１９８３）がある。

立 本発明らによって、すでに、ビンカアルカロイド系の抗
ガン剤であるビンクリスチン耐性のヒト骨髄性白血病細
胞株（Ｋ５６２／ＶＣＲ）が選択確立されているが、こ
の耐性株は、アンスラサイクリン系の抗ガン剤であるア
ドリアマイシンに対してもすでに軽度の交叉耐性を示し
ている（「癌（Ｇａｎｎ）　Ｊ　）第７４巻、第７５１
〜７５８頁（１９８３））。本発明の具体例では、この
株を出発の細胞株として用いている。この株は、（財）
癌研究会・癌化学療法センター（東京都豊島区上池袋ｌ
−３７−１）から自由に入手することができる。

最初にビンクリスチン耐性細胞株に５６２／ＶＣＲを、
ＩＣ５０である３ｎＭのアドリアマイシンを含むＲＰＭ
１１６４０（１０％牛脂児血清（Ｆｅ２）’）で培養し
、成育してきた細胞について以下順次約３倍の比率でア
ドリアマイシンの濃度を増量させることにより、１１５
１１度の薬剤耐性株を選択していく。

耐性株が成育しうる最高Ｉｌｒ！１の薬剤存在下に、選
択した薬剤耐性株を約１年間成育させ、その後薬剤を含
まない培地にて培養しても耐性の性質を失わない安定し
た細胞株を得る。

（２）　免疫化動物脾細胞の調製 得られたアドリアマイシン耐性ヒト骨髄白血病細胞株に
５６２／ＡＤＭを、−匹のマウスにつき１０７細胞とな
るよう０．５ｍのハンクスのバランス緩衝生理食塩水（
以下、ＨＢＢＳという）にて−回洗浄のあと、同量のＨ
ＢＢＳに懸濁させ、４〜６週令のメスの３ａ　ｌ　ｂ／
ｃマウスに腹腔的投与する。同様に週に一回の割合で抗
体価が充分上昇するまで投与を続け、細胞融合の３日前
に１０６細胞を０．１ｍに懸濁させてブースターとして
静脈内に投与する。このようして得た免疫化動物より無
菌的に脾臓を採取する。取り出した脾臓はシャーレ上で
ビンセットを用いて無菌的にほぐし、その一部をとって
、得られた細胞数を算出する。

抗体価の測定のためには、抗アドリアマイシン耐性株抗
体価を以下に示す固相法による酵素免疫測定法で調べる
。

■　プレートの前処理：　ファルコンプレート３９１２
に、１ウエルあたり、５０μｍのポリ−し一リジン０．
００１％溶液を加え、室温で３０分間反応させた後、水
をきり、風乾させる。

■　細胞のプレートへの結合：　　Ｋ５６２１１株およ
びに５６２／ＡＤＭ耐性株をそれぞれ２００万個・細胞
／Ｍ１の濃度で懸濁し、調製したものを１ウエルあたり
５０μＩ（細胞数にして１０万個）づつ、それぞれのウ
ェルに分注し、ｉ、ｏｏ。

ｒｐｍで５分間遠心することによりウェルに結合させる
。その後、０．５％のグルタルアルデヒドを１ウエルあ
たり５０μｍずつ加えることで結合をより完全にする。

■　ブロッキング二　余分な結合基をマスクするために
、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０中に３％になるよう溶解したウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ウエルあたり２００μ
ｍ加え、３０分間至室温処理する。

■　測定サンプルの添加：　抗体価を測定するサンプル
は、１ウエルあたり５０μｍずつ、一種類のサンプルに
ついて、Ｋ５６２とに５６２／ＡＤＭのそれぞれのウェ
ルに加え、室温あるいは３７℃にて２時間反応させる。

その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて、４回洗
浄する。

■　二次抗体の添加二　二次抗体としてヤギのペルオキ
シダーゼ結合−抗マウスＩａ抗体のＦ（ａｂ′　）２フ
ラグメント〔米国カッベル（ｃａｔ）ｌ）ｅｌ　）社製
〕を、１５００倍ＰＢＳ中にて希釈した溶液を各ウェル
に加え、さらに２時間室温で反応させる。

■　判定：　ペルオキシダーゼの基質としてオルトラ１
ニレンジアミンを各ウェルに加え、反応を硫酸で停止さ
せた後、Ｋ２Ｏ２とに５６２／ＡＤＭの間の発色の有無
と差違を、肉眼あるいはオートリーダーにより判定する
。

（３）　マウス骨髄腫細胞の″Ｊ４製 骨髄細胞株としては、たとえば、マウス由来の８−アザ
グアニン耐性Ｉｔ１ｉ１ｍ細胞株Ｐ３・Ｘ６３・Ａｇ８
・６５３〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　）第１２３巻第
１５４８〜１５５０頁（１９７９））を用いる。

融合当日２Ｘ１０７以上の細胞数をつかえるようにして
おく。この株は、米国メリーランド州のアメリカン・タ
イプ・カルチア−・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　
Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に
ＣＲＬ−１５８０として登録されており、同所あるいは
米国フロー・ラボラトリ−・インコーホレーテッド（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｃ、）から自由に
入手することができる。

（４）　細胞融合 （２）で免疫した動物より得られる脾細胞と（３）で得
られる骨髄ＩＩ！！細胞とを、細胞数が脾細胞：骨髄腫
細胞＝７：１となるよう混合し、ポリニブレンゲリコー
ル４０００とジメチルスルホ４シトをそれぞれ４３％と
１３％含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で細胞融合させる
。

融合した細胞は、９６ウエルプラスチツクプレートにて
、ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（以
下ＨＡＴと略す）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で７
日間、さらにＨＡ　Ｔを含まない培地中で成育させる。

この間、３〜５日ごとに培地の交換をおこなう。

融合後約２週間口に、生き残った細胞について、その培
養上清中の、Ｋ５６２／ＡＤＭに選択的に結合する抗体
の有無を、上記（２）で示した酵素免疫測定法により検
索する。

陽性のウェルについては２０％の牛胎児血清を含むＲＰ
Ｍｉ１６４０を希釈液として、限外希釈法をくりかえす
ことにより、陽性細胞のクローンニングを行なう。

（５）　モノクローナル抗体のｒｌＡ製ブリブリスタン
あらかじめ−匹あたり０．５ｍ腹腔内に投与することに
より前処理したマウスに、目的とする抗体の産生ハイプ
リドーマＩ胞を一匹あたり１０７個腹腔内投与する。投
与後、約２週間でハイブリドーマは腹水癌化するので、
この貯留した腹水を採取し、蓄積した抗体の有無を上記
の（２）の酵素免疫測定法により調べる。

腹水を保存する場合は、遠心分離侵の上清を小分けして
一７０℃で凍結保存する。

抗体をさらに精製するために、腹水を４５％飽和の硫安
により４℃で塩析し、ざらにセファクリル−４００（ス
ウェーデン国ファルマシア社製）を用いてゲル濾過する
。タンパク質の定石はＯ−リー法によりおこなう。

モノクローナル一体の性質 上記のようにし１得られるモノクローナル抗体のクラス
は、ウサギの抗マウスＩＯ各クラスの杭体く米国カッペ
ル社製）を用いて判定することができる。

また、細胞における抗原の局在は、蛍光発色基であるＦ
ＩＴＣが結合したヤギ抗マウスＩＱ抗体（米国カッベル
社！ｌ）を用いて蛍光を顕微鏡下で観察することによっ
て知ることができる。

薬物耐性株のに５６２／ＡＤＭに対する選択性は、親株
であるに５６２を対照として（２）の酵素免疫測定法に
よるものの他に、それぞれの細胞株に対する細胞増殖の
阻害の程度を測定して調べることができる。

また、薬物耐性株の薬剤に対する感受性のモノクローナ
ル抗体による変化も種々の１１度の薬剤の存在下でモノ
クローナル抗体と共存させることにより、その細胞増殖
の阻害の程度を測定して調べることができる。

本発明によるモノクローナル抗体の具体例は、イソタイ
プがＩＱＧ３であるもの、ＩｇＧ２ａであるものおよび
ＩｑＧｌであるもの等である。本発明では、これらを、
それぞれＭＲＫ４、ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７と名付
けている。これらのうちで、代表的なのは、ＭＲＫ１６
およびＭＲＫ１７である。

モノクローナル抗体ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７は、薬
剤耐性ヒト癌細胞に対して選択的な増殖阻害作用ないし
対薬剤感受性増加作用を有する（実施例■参照）。

実　　験　　例 施　工　モノクローナル　　の ａ）　アドリアマイシン耐性株の選抜および確立アドリ
アマイシン耐性細胞株に５６２／ＡＤＭの選抜のために
、同じ親株のヒト骨髄性白血病細胞株に５６２から作成
されていたビンクリスチン耐性Ｉｆ胞株に５６２／ＶＣ
Ｒを出発の細胞株とした。

最初に、Ｋ５６２／ＶＣＲをこの細胞株のＩＣ５０（Ｉ
Ｉ胞増殆を５０％阻害する濃度）であるアドリアマイシ
ン１５ｎＭを含有するＲＰＭＩ−１６４０（牛胎児血清
を１０％含む）培地で一週間培養の後、成育してくる細
胞を選抜した。次にアドリアマイシンの薬物濃度を約３
倍の５０ｎＭに増重し、−週間培養ののち得られた耐性
細胞について、さらに３信用である１５０ｎＭと段階的
に薬物濃度を増ｍしていき、最終的に４５０ｎＭのアド
リアマイシン存在下でも生育しつるアドリアマイシン耐
性細胞を得ることができた。

このアドリアマイシン耐性細胞は、この薬剤を５００ｎ
Ｍ含有する培地中で約１年問培養し続けることにより、
その後約３カ月間アドリアマイシンを含まない培地中で
培養してもその耐性を失わない安定した耐性株となった
。本発明者らは、これをに５６２／ＡＤＭと名づけだ。

ｂ）　マウスの免疫および細胞融合 ａ）で得られたに５６２／ＡＤＭ１．：ついＴ、−匹あ
たり１０７個細胞となる量を０．５ｄのＨＢＢＳにて浮
遊させ、一度洗浄の後、４〜６′ｉｊ４令のメスのＢａ
　ｌ　ｂ／ｃマウスに腹腔内投与した。

同様にして、毎週−回、６週間にわたり連続して投与を
くりかえし、最後の週に、追加免疫（ブースター）とし
て１０６細胞を０．１ｄのＨＢＳＳに浮遊させて静脈内
に投与し、その３日後に無菌的に脾臓をとりだした。牌
Ｎｌｌ胞は、マウス−匹あたり１．４〜３×１０８個得
られた。脾臓はビンレットでほぐして懸濁液とした。

細胞の融合は、ケーラーおよびミルスティン両氏の方法
に従って実施した。すなわち、この脾細胞１．４Ｘ１０
８個を、４３％のポリエチレングリコール４０００と、
１３％のジメチルスルホキシドを含むＲＰＭ１１６４０
培地中にて２×１０７個のＰ３・６３・Ａａ８・６５３
骨髄腫細胞と融合させた。

Ｃ）　ハイブリドーマの選択 細胞の融合の後、９６ウエルのプラスチックプレート上
でＳＡＴ培地中で７日間、さらにＨＡＴを含まない培地
中で７日間、生育させた。−匹のマウスあたり３００〜
４００ウエルの培養をおこない、そのうちの約７５％の
ウェルで、ｌｌ１１の生育がみられた。これらのウェル
の培養上清について、酵素免疫測定法により、Ｋ２Ｏ２
とに５６２／ＡＤＭに対する反応をみたところ、約３分
の２ウエルではに５６２とに５６２／ＡＤＭの両方に同
程度の陽性の発色がみられ、残りの３分の１のウェルで
は両方ともに反応しなかった。さらに、−匹のマウスに
由来する３００〜４００ウエルあたり０〜３個のに５６
２とに５６２／ＡＤＭに反応するが、明らかにに５６２
／ＡＤＭにより強く反応するウェルがみつかった。

全部で１８匹のマウスを用いて約６０００ウエルのスク
リーニングを行なって、同様にに５６２＜Ｋ５６２／Ａ
ＤＭの反応性を持つ２５個のウェルがみつかった。

ｄ）　ハイブリドーマのクローニング Ｃ）で選択された２５個のウェルについて、限界希釈法
によって、反応陽性Ｉｔ胞のクローニングを行なった。

希釈液としては２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭ　Ｉ　
−１６４０を用い、１個のウェルに０．５〜５個の細胞
が分配されるように希釈して培養を行なった。各々のウ
ェルについて、酵素免疫測定法により、培養上清中の抗
体の有無および性質を調べ、陽性度の強いウェルについ
ては、さらに限界希釈法によるクローニングをくりかえ
して、２５個の安定したハイブリドーマのクローンを得
ることができた。

ｅ）　抗体の産生および精製 ｄ）で得られた２５個のハイブリドーマのうち１６個の
クローンについて、マウス腹腔内に一匹あたり１０７個
の投与を行なって、腹水癌を発生させ、２週間後に一匹
あり５〜１０１＋１！の腹水を得た。残りの９個のクロ
ーンは凍結保存（−７０℃にて）した。腹水中の総タン
パク願は、５〜１５１１３／ｄであった。

これらの腹水を、４５％飽和硫安で塩析の後に、セファ
クリル−４００（スウェーデン国ファルマシア社製）で
ゲル濾過することにより抗体を￥ａ製した。

ａ）　抗体のイソタイプ 得られたモノクローナル抗体１６種類について、米国カ
ッペル社製ウサギ抗マウスＩＱ各イソタイプの抗体を用
いるキットにより、そのイソタイプを判定した。その結
果、ＩＱＧ３が１個（ＭＲＫ４）、１ｇＧ２８が１個（
ＭＲＫ１６）および１　ｏＧｌが１個（ＭＲＫ１７）Ｗ
Ｉられ、他は全て１ｏＭイソタイプに属していることが
明らかとなった。

ｂ）　蛍光抗体法による抗原の所在の判定ＦＩＴＣ結合
のヤギ抗マウスＩｑ抗体（カッペル社）を用いて、ＭＲ
Ｋ１６およびＭＲＫ１７各々のモノクローナル抗体とに
５６２／ＡＤＭＩＩＩＩＩＩｌ上の抗原との結合部位を
調べたところ、両方とも細胞膜表面上にリング状に分布
する蛍光の発色がみられた。すなわち、いずれの抗体も
に５６２／ＡＤＭ細胞の膜に局在する抗原を認識してい
た。

対照として親株のに５６２に同様の処冒をおこなっても
、このような蛍光の発色は全くみられず、ＭＲＫ１６、
ＭＲＫ１７ともに、Ｋ５６２／ＡＤＭに強い選択性を有
することが明らかとなった。また、放射性同位元素免疫
定量法によってもＭＲＫ１６とＭＲＫ１７はに５６２細
胞には反応せず、耐性株であるに５６２／ＡＤＭに非常
に高い選択性をもって反応することが明らかとなった（
第１図参照）。すなわち、１０６個の細胞をそれぞれＭ
ＲＫ１６および同１７の腹水希釈液と反応させ、細胞を
洗浄後、　　　■でラベルした羊の抗マウスＩｏのＦ（
ａｂ′）２フラグメント（英国アマーシＶム社製）と４
℃で３０分間反応させ、洗浄後、細胞と反応したＭＲＫ
１６および同１７の反応性（ｃｐｍ）を測定した結果は
、第１図に示す通りであった。

Ｃ）　他の薬剤耐性株の識別 これまで、ヒトの腫瘍ＩＩ胞株ではアドリアマイシン耐
性株は数が少ないとされ、唯一利用できたヒト卵巣カル
シノーマ細胞株２７８０のアドリアマイシン耐性株２７
８０ＡＯについて、ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７との反
応性を放射性同位元素免疫定量法を用いて調べたところ
、両方のモノクローナル抗体とも親株の２７８０に比較
して耐性株の２７８０Ａ０に強く反応した（第２図参照
）。すなわち、３×１０５個の細胞をディツシュにまき
、細胞がディツシュに接着した２４時間後に、第１図に
示した場合と同様にしてＭＲＫ１６と同１７の反応性（
ｃｐｍ）を測定した結果は、第２図に示す通りであった
。

ｄ）　　ＭＲＫ１７のに５６２／ＡＤＭに対する選択的
細胞増殖阻害 耐性株のに５６２／ＡＤＭとその親株に５６２ならびに
比較のために別の細胞株に属する耐性株の２７８０ＡＤ
とその親株２７８０について、それぞれモノクローナル
抗体ＭＲＫ１７を含む腹水を段階的に希釈してその細胞
増殖に対する阻害効果を調べた（第３図参照）。すなわ
ち、２×１０４個のに５６２およびに５６２／ＡＤＭ［
ｌ胞、ならびに６Ｘ１０’個の２７８０および２７８０
Ａ０Ｉｔ胞をＭＲＫ１７の腹水希釈液と共にインキュベ
ートし、７２時間後の細胞数を測定して増殖阻害パーセ
ントを計算して得た結果は第３図に示した通りであった
。

その結果、それぞれの感受性の親株であるに５６２また
は２７８０に対しては４００分の１希釈まで抗体の濃度
を増やしてもほとんど阻害は見られなかったのに対し、
薬剤耐性株である２７８０Ａ０では同じ抗体濃度で約３
０％の増殖阻害がみられ、Ｋ５６２／ＡＤＭに至っては
８０％の増殖阻害が、また１００分の１の希釈抗体では
９０％以上の増殖阻害が見られた（トリブリケートデー
タＳＤ＜４％）。

同様の実験をＭＲＫｌ６を用いて行なったところ、Ｋ５
６２／ＡＤＭに対し、最高で約１２％の軽度の増殖阻害
が見られた。

すなわち、ＭＲＫｌ７の大きな特徴は、薬物耐性株に選
択的な強い増殖阻害作用を有していることであるといえ
る。

ｅ）　　ＭＲＫｌ６によるに５６２／ＡＤＭの薬剤感受
性に対する効果 ＭＲＫｌ６は上記ｄ）で、薬物耐性株に５６２／ＡＤＭ
に対する直接の増殖阻害効果は軽度であったが、この実
験率にビンクリスチンを０．５μｇ／−の濃度で添加し
たところ、ＭＲＫｌ６の共存により、最大的７５％まで
の耐性株の増殖阻害が観察された（第４図参照）。すな
わち、２×１０４個のに５６２／ＡＤＭ細胞をビンクリ
スチン（ＶＣＲ）５００ｎｏ／ｄの存在下および非存在
下にＭＲＫｌ６の腹水希釈液と共にインキュベートし、
７２時間後の増殖阻害パーセントを測定して得た結果は
、第４図に示す通りであった。

ビンクリスチンを用いて、Ｋ５６２／ＶＣＲ綱胞内での
蓄積に対するＭＲＫｌ６の効果をみたところ、抗体無添
加の対照実験に比べて約６０〜７０％の増加が見られた
く第５図参照）。すなわち、２×１０５個のに５６２／
ＶＣＲ細胞をＭＲＫｌ６（腹水１：２００希釈液）存在
下および非存在下に、（３Ｈ）ＶＣＲ（１００ｎＭ）と
共にインキュベートし、細胞にとり込まれたビンクリス
チンを定員した結果は第５図に示す通りであった。

すなわち、ＭＲＫｌ６は、耐性株において六進している
細胞内薬物の細胞外へのくみ出しに関与する作用点を認
識している可能性をもっている。

ここで、Ｋ５６２／ＡＤＭ以外の耐性株の２７８０Ａ０
を用いて、ビンクリスチンに対する感受性の変化をみた
ところ、そのＩＣ５０値で２０〜３０％の減少、すなわ
ち薬物に対する感受性の増加、がみられた。

ＭＲＫｌ６は、また、ビンクリスチン以外に、アクチノ
マイシンＤに対するに５６２／ＡＤＭの感受性も約３倍
強めることができた（第６図参照）。すなわち、２×１
０４個のに５６２／ＡＤＭ細胞をＭＲＫｌ６（腹水１：
１０００希釈液）の存在下および非存在課に、種々の濃
度のアクチノマイシンＤと共に３７℃でインキニーベー
トし、７２時間後の増殖阻害パーセントを測定して得た
結果は、第６図に示す通りであった。

これらの結果から、ＭＲＫｌ６は、多くの抗ガン剤耐性
株に選択的に働き、その薬物に対する感受性を高めるこ
とができる抗体であるといえる。

【図面の簡単な説明】

第１図（Ａ）および（Ｂ）は、放射性同位元素免疫定量
法によるＭＲＫｌ　６　（Ａ）およびＭＲＫｌ７（Ｂ）
のヒト骨髄性白血病細胞に５６２およびそのアドリアマ
イシン耐性株に５６２／ＡＤＭ細胞に対する反応性を示
すグラフである。 第２図（Ａ）および（Ｂ）は、放射性同位元素免疫定量
法ｉ法にｃｌＭＲＫｌ　６　（Ａ）　およびＭＲＫｌ７
（Ｂ）のヒト卵巣癌細胞２７８０およびそのアドリアマ
イシン耐性株２７８０Ａ０に対する反応性を示すグラフ
である。 第３図は、ＭＲＫｌ７による細胞増殖阻害を示すグラフ
である。 第４図は、ＭＲＫｌ６とビンクリスチンの併用による細
胞阻害を示すグラフである。 第５図は、ＭＲＫｌ６によるビンクリスチンのとり込み
上昇を示すグラフである。 第６図は、ＭＲＫｌ７によるアクチノマイシンＤの効果
増強を示すグラフである。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 ＭＲＫ１６１１ｆｆ本４秋千 （Ａ） Ｐ）１ ＭＲＫ１７ＦＩ叉ンｌへ４Ｆ叱声７３Ｐ（Ｂ） 口 ＭＲＫ＋６ＲＸ）＜！−伏十 （Ａ） も２ ＭＲＫ１７１１４傳秋十 （Ｂ） 囚

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の（イ）〜（ニ）によって定義されるものであ
   ることを特徴とする、薬剤耐性癌に関するモノクローナ
   ル抗体。 （イ）ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２のアドリアマイ
   シン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭにより免疫されたマウスか
   ら得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させて
   作成したハイブリドーマにより生産されるものであるこ
   と。 （ロ）アドリアマイシン耐性株を特異的に識別する能力
   があること。 （ハ）アドリアマイシン耐性株の細胞増殖を阻害するか
   あるいはその細胞のビンクリスチンまたはアクチノマイ
   シンＤに対する感受性を高める能力があること。 （ニ）ＩｇＧイソタイプに属するものであること。 ２、ハイブリドーマがハイブリドーマＭＲＫ１６または
   ハイブリドーマＭＲＫ１７である、特許請求の範囲第１
   項記載のモノクローナル抗体。 ３、下記の工程（ａ）〜（ｇ）からなることを特徴とす
   る、下記の（イ）〜（ニ）によって定義される薬剤耐性
   癌に関するモノクローナル抗体の製造法。 （ａ）ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２から選抜して確
   立したアドリアマイシン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭにより
   マウスを免疫すること。 （ｂ）免疫されたマウスから脾臓を取り出して、その細
   胞懸濁液を作成すること。 （ｃ）この脾細胞をマウス骨髄腫細胞と共に細胞融合条
   件に付して、両細胞の融合によるハイブリドーマを形成
   させること。 （ｄ）上記の工程より得られる細胞混合物を、ハイブリ
   ドーマのみを成育させることのできる選択培地で培養す
   ること。 （ｅ）ハイブリドーマ含有上清について目的抗体の有無
   を測定して、目的抗体を産生するハイブリドーマを選択
   すること。 （ｆ）選択されたハイブリドーマをクローン化すること
   。 （ｇ）このクローンをマウスの腹腔内に移殖するかある
   いは培地にて培養し、癌性の腹水中または培養上清中に
   生成蓄積されたモノクローナル抗体を採取すること。 （イ）ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２のアドリアマイ
   シン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭにより免疫したマウスから
   得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させて作
   成したハイブリドーマにより生産されるものであること
   。 （ロ）アドリアマイシン耐性株を特異的に識別する能力
   があること。 （ハ）アドリアマイシン耐性株の細胞増殖を阻害するか
   あるいはその細胞のビンクリスチンまたはアクチノマイ
   シンＤに対する感受性を高める能力があること。 （ニ）ＩｇＧイソタイプに属するものであること。 ４、ハイブリドーマがハイブリドーマＭＲＫ１６または
   ハイブリドーマＭＲＫ１７である、特許請求の範囲第３
   項記載のモノクローナル抗体の製造法。 ５、ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２のアドリアマイシ
   ン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭにより免疫したマウスから得
   られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞との細胞融合により
   作成されたモノクローナル抗体生産性ハイブリドーマ。 ６、ハイブリドーマＭＲＫ１６またはハイブリドーマＭ
   ＲＫ１７である、特許請求の範囲第５項記載のハイブリ
   ドーマ。