JPH04281796A

JPH04281796A - 土壌病原糸状菌の簡易検出法

Info

Publication number: JPH04281796A
Application number: JP3043240A
Authority: JP
Inventors: Isamu Yamaguchi; 勇山口; Tsutomu Arie; 力有江; Masaki Furuya; 古谷　雅樹; Akira Hase; 長谷　あきら
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1991-03-08
Filing date: 1991-03-08
Publication date: 1992-10-07
Anticipated expiration: 2013-02-10
Also published as: JP2711595B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フザリウム属に属する
土壌病原糸状菌に特異的に反応するモノクローナル抗体
、該モノクローナル抗体を産生するバイブリドーマ、お
よびモノクローナル抗体を用いた土壌病原糸状菌である
フザリウム属菌の簡易検出法に関する。

【０００２】

【従来の技術】土壌病原糸状菌であるフザリウム属菌は
、農業生産上大きな被害を及ぼすことが知られている。本菌は、苗伝染するため、苗を検診する必要があり、そ
のために本菌を植物組織から検出する手段が開発されて
きた。例えば、植物組織から選択培地を用いて分離、培
養し、その菌学的性状を調査する方法が提案されている
が、検定に要する時間が長く、未だ実用化されていない
。また、フザリウム　　オキシスポラム　　エフ　　エ
スピー　　リコペルシキ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　ｏｘｙ
ｓｐｏｒｕｍ　　ｆ．　　ｓｐ．　　ｌｙｃｏｐｅｒｓ
ｉｃｉ）やフザリウム　　オシシスポラム　　エフ　　
エスピー　　アピ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕ
ｍ　　ｆ．ｓｐ．　　ａｐｉｉ）と反応する抗体は得ら
れている（日植病報５６巻、３９０頁）が、フザリウム
属に属する菌全体と特異的に反応するモノクローナル抗
体は得られていない。フザリウム属に属する菌に特異的に反応するモノクロー
ナル抗体が得られれば、フザリウム属に属する菌の簡易
検出が可能となり、苗や土壌の診断に応用できる他、フ
ザリウム属に属する菌と他の菌に属する菌とを区別する
ことや、フザリウム属に属する菌の抗原タンパク質の解
析、これらを発現する遺伝子レベルのメカニズムの解明
が可能となることが期待される。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、フ
ザリウム属に属する菌に特異的に反応するモノクローナ
ル抗体を提供することを目的とするものである。さらに
、本発明は該モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを提供することをも目的とするものである。さらに
、該モノクローナル抗体を用いて、植物組織中、植物組
織片、植物汁液から、蛍光抗体法、ドットイムノバイン
ディングアッセイ法、酵素免疫測定法により、簡易検出
する方法を提供することをも目的とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、フザリウム
属菌に特異的なモノクローナル抗体を得るため、フザリ
ウム属に属する菌として一般的性状を保有するフザリウ
ム　　オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　ｏｘｙｓ
ｐｏｒｕｍ）８６０９２６ａを選択し、この菌体を液体
窒素中で磨砕したものを抗原として用いることにより、
該抗原に対する抗体産生細胞のハイブリドーマ、及び該
ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を得、該
モノクローナル抗体を用いて植物組織中や植物組織片植
物汁液から、蛍光抗体法、ドットイムノバインディング
アッセイ法により、フザリウム属に属する菌を簡易検出
する方法を見出し本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明はフザリウム属に属する
土壌病原糸状菌の菌体および該菌体磨砕液に特異的に反
応するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用いて
、植物組織中、植物組織片、植物汁液から、蛍光抗体法
、ドットイムノバインディングアッセイ法、酵素免疫測
定法により、簡易検出する方法を提供するものである。

【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。まず、本
発明のモノクローナル抗体の製造に使用する抗原を以下
のようにして得ることができる。Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　　８６０９２６ａ（日植病報５６
（１９９０）９５−９６）をポテトデキストロース液体
培地で、２７℃、１０日間培養する。この菌体１０ｇを
液体窒素中でワーリングブレンダーを用いて１０，００
０ｒｐｍ、５分間磨砕して抗原を得た。上記抗原を５０
ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　　
ｂｕｆｆｅｒｅｄ　　Ｓａｌｉｎｅ）に懸濁したものを
抗原懸濁液として用いた。

【０００７】上記抗原懸濁液中に含まれる総タンパク質
は、ＢＩＯ−ＲＡＤ　　プロテインアッセイ試薬を用い
、測定することが可能である。上記の抗原懸濁液をマウ
ス、ラッド、ヒツジ、ウマ、好ましくはマウスに接種す
ることにより、該磨砕菌体を抗原として免疫された動物
が得られる。例えば、上記の抗原懸濁液とフロインドコ
ンプリートアジュバンドの混合物エマルジョン（１：１
）を２回、上記の抗原懸濁液とフロインドインコンプリ
ートアジュバンドの混合物エマルジョン（１：１）約１
０回を約２週間毎に腹部皮内投与し、約３週間後に最終
免疫として上記の抗原懸濁液を腹腔内投与することによ
り効率良くマウスを免疫することができる。

【０００８】上記のようにして得られた免疫マウスから
、リンパ節細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、抹消血細胞等の
抗体産生細胞を分離することにより抗体産生細胞を得る
ことができる。例えば、脾臓細胞を抗体産生細胞として
使用する場合には、脾臓を摘出した後に、１０％牛胎児
血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬
製）（以下ＲＰＭＩ１６４０培地という）で３回洗浄す
ることにより抗体産生細胞を得ることができる。

【０００９】細胞融合に使用するミエローマ細胞として
は、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトラン
スフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠損するマウスのミエロ
ーマを使用することができる。このようなミエローマは
、未融合の状態ではＨＧＰＲＴを欠くためにヒポキサン
チン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地で核酸
の合成ができずに死滅するが、脾臓細胞と融合しＨＧＰ
ＲＴ活性を回復したハイブリドーマはアミノプテリンで
核酸の生合成を阻害されてもヒポキサンチンを利用して
生育することができるのでハイブリドーマのみが生育す
る。また、これらのミエローマ細胞は非分泌型の細胞株
であることが好ましい。この様なマウスミエローマ細胞
としては、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８−６５３（Ｘ６３・６
・５・３）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３　Ｕ１　
）、Ｐ３／ＮＳ１−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、ＳＰ
２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ２）等を挙げることができる。

【００１０】細胞融合はＲＰＭＩ１６４０等の動物細胞
培養培地中で１０７　〜１０８　個のミエローマ細胞と
上記の抗体産生細胞を混合比１：５〜１：１０で混合し
て行う。細胞融合促進物質としては平均分子量２０００
〜６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリ
ビニルアルコール、センダイウイルス等が使用でき、通
常２５〜３７℃で１〜３分間の融合を行えば良い。特に
ＰＥＧを用いることが好ましい。

【００１１】細胞融合処理後の細胞からハイブリドーマ
を選別するには選択培地における選択的増殖を行えばよ
い。例えば、細胞をＲＰＭＩ１６４０等の培地で脾臓細
胞換算で２×１０８　細胞数／ｍｌとなるように希釈し
た後に、マイクロタイタープレート上に１０５　細胞数
／ウェルとなる様に各ウェルに細胞を入れ、各ウェルに
例えばＨＡＴ培地等の選択培地を加えて、以降培養すれ
ばよい。例えば、ミエローマ細胞としてＳＰ２を使用し
た場合にはＨＡＴ培地添加後１０−１４日間培養するこ
とによりハイブリドーマのみを選別することができる。

【００１２】該抗原に特異的なモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマを選択するには、例えばドットイ
ムノバインディングアッセイ法（ＤＩＢＡ法ともいう。）や酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法ともいう。）により
以下の様にして行えばよい。例えば、ＤＩＢＡ法により
選択する場合は、予め該抗原を含む検体をＰＢＳ等の緩
衝液に懸濁し、ニトロセルロース、ナイロン等のメンブ
レン等の固相に加え、例えば室温で２時間静置して吸着
させる。次に抗原懸濁液を除き、１０％ＦＣＳを含むＰ
ＢＳを加えて室温で２時間静置して抗原の結合していな
い部分をＦＣＳでブロックする。その後に、ＰＢＳで洗
浄した後、ハイブリドーマの上清を１００μｌずつ加え
て例えば室温で１時間静置し、その後ＰＢＳで３回洗浄
する。次に酵素結合抗マウスイムノグロブリン抗血清（
２次抗体）を加えて室温で１時間放置する。ＰＢＳで３
回洗浄した後に酵素の基質を加えて発色させることによ
り、抗原と結合力のある抗体を産生するハイブリドーマ
が検索される。さらに、フザリウム属に属する土壌病原
菌およびフザリウム以外の属に属する土壌病原菌の菌体
懸濁液（調製法は上述のＦｕｓａｒｉｕｍ　　ｏｘｙｓ
ｐｏｒｕｍ８６０９２６ａに準ずる）を吸着させた上記
固相を上記ＤＩＢＡ法で反応させ、フザリウム属に属す
る菌と反応し、フザリウム以外の属に属する菌と反応し
ない性質を有する抗体を成生する抗体産生細胞を選抜す
る。さらに、該抗体産生細胞をコロニー形成法、限界希
釈法等によりクローニングを行うことにより単一のハイ
ブリドーマを起源とする抗体産生細胞を得ることができ
る。

【００１３】上記のフザリウム属特異的モノクローナル
抗体産生ハイブリドーマによるモノクローナル抗体は、
培養びんや培養フラスコを用いて、ＲＰＭＩ１６４０培
地、又は無血清培地等の動物細胞培養用培地で培養して
、その培養上清から得ることができ、培養方法及び条件
は通常の動物細胞培養方法に準じて当業者が容易に選択
し得るものである。

【００１４】上記のようにして得られるハイブリドーマ
としては、ＡＰＩ９−２、ＡＰＩ９−３を例示できる。上記ハイブリドーマのうち、ＡＰＩ９−２は、平成３年
２月２１日付けで工業技術院微生物工業技術研究所に受
託番号微工研菌寄１２０３１号として受託された。

【００１５】上記のモノクローナル抗体を用いて、植物
組織中の抗原すなわちフザリウム属菌を検出するために
は、上述のＤＩＢＡ法、ＥＬＩＳＡ法、および蛍光抗体
法により、以下のように行えばよい。例えば、ＤＩＢＡ
法により検出する場合は、予め検体の植物組織をＰＢＳ
等の緩衝液中で磨砕してニトロセルロース、ナイロン等
のメンブレン等の固相に加え、あるいは植物組織の切片
をニトロセルロース、ナイロン等のメンブレン等の固相
に載せて例えば室温で３０分〜１時間静置して抗原を吸
着させる。次に抗原懸濁液や切片を除き、１０％ＦＣＳ
を含むＰＢＳを加えて室温で２時間静置して抗原の結合
していない部分をＦＣＳでブロックする。その後に、Ｐ
ＢＳで洗浄した後、モノクローナル抗体を１００μｌず
つ加えて例えば室温で１時間静置し、その後ＰＢＳで３
回洗浄する。次に酵素結合抗マウスイムノグロブリン抗
血清（２次抗体）を加えて室温で１時間放置する。ＰＢ
Ｓで３回洗浄した後に酵素の基質を加えて、抗原すなわ
ちフザリウム属菌を含む検体のみが発色する。

【００１６】また、ＥＬＩＳＡ法により検出する場合は
、予め検体の植物組織をＰＢＳ等の緩衝液中で磨砕し、
ポリスチレン、ポリビニール、ポリカーボネート、ポリ
プロピレン等の固相に加え、例えば室温で２時間静置し
て吸着させ、以下ＤＩＢＡ法と同様な手順で反応させ、
発色させた後に吸光光度計等で測定すれば、この測定値
を用いて抗原濃度が換算できる。

【００１７】また、蛍光抗体法により検出する場合は、
植物組織の切片を１０％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で、例え
ば室温で２時間静置して抗原の結合していない部分をＦ
ＣＳでブロックする。その後に、ＰＢＳで洗浄した後、
モノクローナル抗体中で、例えば室温で１時間静置し、
その後ＰＢＳで３回洗浄する。次に蛍光色素結合抗マウ
スイムノグロブリン抗血清（２次抗体）を加えて室温で
１時間放置したのち、落射型蛍光顕微鏡で観察すると、
植物組織中の抗原が観察される。

【００１８】上記の手法により、植物組織中の抗原すな
わちフザリウム属菌が５時間以内に特異的に、また簡易
に検出される。

【００１９】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体およびこれ
を用いた植物組織からフザリウム属に属する土壌病原菌
を検出する方法により、植物がフザリウム属に属する土
壌病原菌に感染しているか否かが容易に診断できる。ま
た、フザリウム属に属する菌の抗原部位となるタンパク
質、糖タンパク質などの解析、単離、精製、同定が可能
となり、さらに、フザリウム属に属する菌の病原性発現
メカニズムの解明や、フザリウム属に属する菌と他の菌
に属する菌の分類、進化の物質レベルの解析が可能とな
った。

【００２０】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。（参考例）Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　
　８６０９２６ａ　　抗原の製造Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　　８６０９
２６ａは、ポテトデキストロース液体培地１リットル中
で２５℃、１０日間静置培養した。培地中の菌体（生重
１０ｇ）は、ガーゼ濾過および遠心処理（１０、０００
Ｇ、１０分間）で集め、液体窒素中でワーニングブレン
ダーを用い、１１、０００ｒｐｍ、５分間で破砕し、５
０ｍｌのＰＢＳに懸濁して、抗原懸濁液を得た。該抗原
懸濁液中のタンパク質濃度は、ＢＩ０−ＲＡＤプロテイ
ンアッセイ試薬を用いて、０．２ｍｇ／ｍｌであった。

【００２１】（実施例１）ハイブリドーマの取得参考例
で製造した抗原懸濁液は、その５０μｌにフロインドコ
ンプリートアジュバンド（和光純薬）５０μｌを加えエ
マルジョンとした。該エマルジョンをマウス（Ｂａｌｂ
／ｃ系統、メス、１０週令）腹部皮内に注射して投与し
た（初回免疫）。初回免疫より１３日後に初回免疫と同
じエマルジョンを投与、その後は、該抗原懸濁液５０μ
ｌにフロインドインコンプリートアジュバンド（和光純
薬）５０μｌを加えたエマルジョンを初回免疫より３１
、４６、６１、７４、８７、１０２、１１６、１３０、
１５２、１９０、２０５日後に腹部皮内に注射して投与
した。初回免疫より２２４日後に、最終免疫として該抗
原懸濁液１００μｌを腹腔内に注射して投与した。最終
免疫より３日後に、該マウスより脾臓を取り出し、ＲＰ
ＭＩ１６４０で３度洗浄した後に破壊して脾細胞を得た
。

【００２２】マウスミエローマ細胞ＳＰ２は、ＲＰＭＩ
１６４０培地で継代後約２日間培養したものを用いた。上記のマウス脾細胞（３×１０８　）と上記ミエローマ
細胞（５×１０７　）を混合して、ＲＰＭＩ１６４０培
地で１回洗浄した後に培地を除去し、細胞融合剤として
１０ｍＭＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に５０
％濃度に溶解したＰＥＧ４０００を２ｍｌと１０ｍＭＨ
ＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地１８ｍｌを加え、
３７℃、３分間融合処理を行った。その後、ＲＰＭＩ１
６４０培地で１回洗浄を行い、脾臓細胞数換算で培地１
ｍｌあたり２×１０８　個になるようにＲＰＭＩ１６４
０培地で希釈して細胞浮遊液とした。該細胞浮遊液を９
６ウェルマイクロタイタープレートに１ウェルあたり１
００μｌずつ分注して、３７℃、５．０％炭酸ガス条件
下で培養した。さらに、２４時間後に、選択培地として
５０倍ＨＡＴ（シグマ製）をＲＰＭＩ１６４０培地で２
５倍に希釈したものを１ウェルあたり１００μｌずつ分
注して、３７℃、５．０％炭酸ガス条件下で培養すると
、７〜１４日目からハイブリドーマの増殖したコロニー
が出現した。

【００２３】抗体産生細胞の選択には、ＤＩＢＡ法を用
い、バイオドット（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）に装着したニト
ロセルロースメンブレン（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）に１ドッ
トあたり５０μｌの上述の抗原懸濁液を滴下して吸着さ
せた後に、１０％ＦＣＳを含むＰＢＳでブロッキング、
さらに上記ハイブリドーマを培養した培養上清１００μ
ｌを反応させた。洗浄後にメンブレンをバイオドットか
ら取り出し、ベルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ＋Ａ
＋Ｍ抗体（２μｇ／ｍｌ、Ｂｉｎｄｉｎｇ　　Ｓｉｔｅ
製）を反応させ、ＰＢＳで洗浄した後にクロロナフトー
ル２４ｍｇ、メタノール８ｍｌ、過酸化水素水（３１％
）５０μｌを含むＰＢＳ中で発色させ、青色の反応が確
認されたドットにブロットし培養上清中に抗体が産生さ
れていることが確認された。

【００２４】上記のようにして抗体産生が確認された細
胞が増殖しているウェルの細胞を取り出し、これをＲＰ
ＭＩ１６４０培地１ｍｌあたり１０２　個となるように
調製し、この細胞希釈液を９６ウェルマイクロタイター
プレートに１ウェルあたり１００μｌずつ分注して、３
７℃、５．０％炭酸ガス条件下で培養すると、コロニー
が約２０ウェルに１つの割合で出現した。

【００２５】上記のクローニングを２度繰り返して、単
一のハイブリドーマを起源とするモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ例えばＡＰＩ９−２、ＡＰＩ９−３が
得られた。（実施例２）モノクローナル抗体の生産（１）　ハイブ
リドーマ培養上清による生産ハイブリドーマＡＰＩ９−
２、ＡＰＩ９−３をそれぞれＲＰＭＩ１６４０培地で９
６穴ウェルプレート、２４穴ウェルプレート、５０ｍｌ
培養瓶、２００ｍｌ培養瓶とスケールアップしながらそ
れぞれ３７℃、５％炭酸ガス条件化で培養し、約１０日
で約５０ｍｌの培養上清を得た。この培養上清は、ＤＩ
ＢＡ法により、抗原と１０倍希釈まで反応した。（２）　マウスの腹水による生産９週令のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、オス）の腹腔に０．５
ｍｌのプリスタン（アルドリッチ製）を注射し、約５週
間後にハイブリドーマＡＰＩ９−２、ＡＰＩ９−３の各
ハイブリドーマ細胞をマウスあたり５×１０８　個の割
合で腹腔内注射した。約１０日後に腹部が肥大している
のを確認後、開腹して、マウスあたり腹水約７．５ｍｌ
を採取した。この腹水は、ＤＩＢＡ法により、抗原と１
０倍希釈まで反応した。

【００２６】（実施例３）モノクローナル抗体の血清学
的性質実施例２（１）　の培養上清１００μｌをモノクローナ
ル　　マウス　　イムノグロブリン　　イソタイプ　　
キット　　（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ製）を用いて、上述
のＥＬＩＳＡ法により反応させたところ表１に示すよう
に、ＡＰＩ９−２およびＡＰＩ９−３ともその培養上清
が抗ＩｇＭおよび抗ＩｇＬκ抗体とのみ黄色の反応を示
し、該培養上清中の抗体がマウスＩｇＭκ抗体であるこ
とがわかった。

【００２７】さらに、バイオドット（ＢＩＯ−ＲＡＤ製
）に装着したニトロセルロースメンブレン（ＢＩＯ−Ｒ
ＡＤ製）１ウェルあたり５０μｌの各種土壌病原菌（表
２に示す）懸濁液（製造法は上述のＦｕｓａｒｉｕｍ　
　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　　８６０９２６ａと同様）を吸
着させたものに、上述のＤＩＢＡ法の手順で実施例２（
１）の培養上清１００μｌを反応させたところ、表２に
示した結果が得られた。この結果から、ＡＰＩ９−２お
よびＡＰＩ９−３の培養上清はフザリウム属に属する菌
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ　　ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　ｍｏ
ｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）と陽性に反応した。また、他属の
土壌病原菌、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　　ｄａｈｌｉ
ａｅ、Ｎｅｃｔｒｉａｇｌｉｏｃｌａｄｉｏｉｄｅｓ、
Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ　　ｂｒａｓｓｉｃａｅ
、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ　　ｒｏｌｆｓｉｉ、Ｓｃｌｅ
ｒｏｔｉｎｉａ　　ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｒｈｉ
ｚｏｃｔｏｎｉａ　　ｓｏｌａｎｉと反応しなかった。

【００２８】以上より、該培養上清中に含まれるモノク
ローナル抗体はフザリウム属に属する菌と特異的に反応
することがわかった。（実施例３）モノクローナル抗体を用いた蛍光抗体法に
よる植物組織からのフザリウム属菌の検出フザリウム属
に属する菌に罹病したトマト（品種：桃太郎、タキイ種
苗製）および罹病していない健全なトマト、さらに、フ
ザリウム属に属する菌に罹病したミツバ（ヤマト種苗緑
化製）および罹病していない健全なミツバの茎、葉柄、
茎の冠部、根、腋芽の組織をカミソリを用いて、約５ｍ
ｍ×５ｍｍ、厚さ０．２ｍｍに切り出し、この組織切片
をを１０％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で、室温で２時間静置
して抗原の結合していない部分をＦＣＳでブロックした
。その後に、ＰＢＳで洗浄した後、実施例２（１）　の
培養上清をＰＢＳで５倍に希釈した溶液中で、例えば室
温で１時間静置して反応させ、その後ＰＢＳで３回洗浄
した。次にＰＢＳで２００倍に希釈した蛍光色素ＦＩＴ
Ｃラベル抗マウスＩｇＭ抗体（カッペル製）溶液中で室
温で１時間放置したのち、ＰＢＳで２度洗浄し、落射型
蛍光顕微鏡（Ｂ励起）で観察すると、フザリウム属に属
する菌に罹病したトマトおよびミツバの植物組織中に存
在するフザリウム属に属する菌の菌体が植物組織と区別
されて観察できた（図１および２）。

【００２９】（実施例４）モノクローナル抗体を用いた
ＤＩＢＡ法による植物組織からのフザリウム属に属する
菌の検出フザリウム属に属する菌に罹病したトマト（品種：桃太
郎、タキイ種苗製）および罹病していない健全なトマト
の茎、葉柄、腋芽、根の組織をカミソリを用いて、厚さ
約２ｍｍ横断切片とした。上記横断切片を、ＰＢＳで洗
浄したニトロセルロースメンブレンに載せ、室温で３０
分間静置した。その後、上述のＤＩＢＡ法の手順に従い
、実施例２（１）　の培養上清をＰＢＳで５倍に希釈し
た溶液を用いて反応させたところ、約４時間で、フザリ
ウム属に属する菌に罹病したトマトの、フザリウム属に
属する菌が存在する組織にあたる部位が特異的に青色の
反応を示し、フザリウム属に属する菌の検出ができた（
図３）。

【００３０】（実施例５）モノクローナル抗体を用いた
ＤＩＢＡ法およびＥＬＩＳＡ法による植物組織汁液から
のフザリウム属に属する菌の検出フザリウム属菌に罹病したトマト（品種：桃太郎、タキ
イ種苗製）および罹病していない健全なトマトの茎、葉
柄、腋芽の組織約１ｇを、５ｍｌのＰＢＳ中でワーニン
グブレンダーを用い、１５，０００ｒｐｍ、３分間、室
温で磨砕して植物組織汁液とした。この汁液をＤＩＢＡ
法により検出する場合は、ニトロセルロースメンブレン
にそれぞれ５０μｌ加え、また、ＥＬＩＳＡ法による場
合は、ポリスチレンの９６ウェルマイクロタイタロプレ
ートにそれぞれ１００μｌ加え、室温で１時間静置した
。以下、上述のＤＩＢＡ法、およびＥＬＩＳＡ法の手順
で、実施例２（１）　の培養上清をＰＢＳで５倍に希釈
した溶液を用いて反応させた。この結果、フザリウム属
に属する菌に罹病したトマトの組織汁液のみが発色し、
検出することができた。

【００３１】

【表１】

【００３２】

【表２】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　フザリウム属に属する土壌病原菌の菌
体および該菌体磨砕液に特異的に反応するモノクローナ
ル抗体。
【請求項２】　　請求項１記載のモノクローナル抗体を
産生することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項３】　　植物組織中からフザリウム属に属する
土壌病原糸状菌を請求項１記載のモノクローナル抗体を
用いて蛍光抗体法により検出する方法。
【請求項４】　　植物汁液からフザリウム属に属する土
壌病原糸状菌を請求項１記載のモノクローナル抗体を用
いてドットイムノバインディングアッセイ法及び酵素免
疫測定法により検出する方法。
【請求項５】　　植物組織片からフザリウム属に属する
土壌病原糸状菌を請求項１記載のモノクローナル抗体を
用いてドットイムノバインディングアッセイ法により検
出する方法。