JPS6262000A - カンジタ菌の同定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本弁明はカンジダ菌菌体表面抗原に対する新規モノクロ
ーナル抗体及びこれを用い之真菌症診断法に関する。

真菌は元来病原性が弱く、免疫能が正常に機能している
患者には感染しにくいが、免疫能を低下嘔せるｂ因があ
れば感染、発病に至る。たとえば血液疾患（特に急性白
血病やリンノ月匝）、肺癌、抗免疫療法、副腎皮質ホル
モン剤の使用時等のように患者の免疫能を低下させる病
気あるいは治療法の場合に真菌による感染症全併発する
。従って、真菌の迅速なかつ簡単な同定法は臨床上重要
な意味をもっている。また、発酵醸造工程中発生する有
害な真菌類と醸造酵母とを迅速かつ正確にぶに別する方
法が発酵産業界において要求されている。

カンジダ菌は上記のような問題をもつ真菌類の中でも代
表的なものの一つである。

「従来の技術」 従来、カンジダ菌の分類分よび同定は形態学的および生
化学的な性質をもとに行なわれていたが、これらは操作
が煩雑な上に孔度な熟練金必鮫とし種の血清学的同定法
の詳細な研冗を行ない、酵母の血清学的特異性は抗原決
定基である細胞壁マンナンの構造に密接な関連があるこ
とを明らかにし文。実際、上記の研究業Ｒを基礎にした
「−カンノダ同定用因子抗体キット」（株式会社ヤトロ
ン製）が１９７０年よシ市販されている。このキットハ
欠のような方法で製造されている。すなわち、ラピット
に種々なカンジダ菌で免疫を行い、得几抗血清を免疫に
用いた菌種とは異なる菌体で吸収して菌特異的な因子抗
体？得る。現在、このような因子抗体を用いて、種々な
カンジダの因子抗原が明らかになっている。

この力／ノダ属の血清学的同定法は、上記の従来の方法
に比べて、エリ迅速にかつより藺単にカンジダ属の同定
が可能であるけルども、多種類の特異性全もつ抗体のｌ
昆仕物から煩雑な吸収操作によって作成された因子抗体
は生産コストおよび製品管理の点で様々な困難？もつ。

すなわち、多数の動物に対する免疫操作、多種人足の免
疫原（菌）の培養、大証の採血かつ煩雑な吸収操作等で
ある。

他方センダイウィルスおよびポリエチレングリコールに
よる細胞融合の基本的原理、さらに抗体産生細胞とミエ
ローマ細胞との融合によって特異的な抗体？産生ずるハ
イブリドーマが得られるこ６）７）　　・・　　８） とは、開田、ＫａｏとＭｉｃｈａｙｌｕｋ　、　Ｋｏｈ
ｌｅｒ　　らの報告によって知ら九ており、また前述の
ごとく、カンソゲの血清学的同定法は、土星らの報告、
深沢らの報告および市販カンジダ同定用因子抗体キット
に見られるごとく公知の事実であるが、本願発明以前に
は、上記のカンジダ同定用ポリクローナル因子抗体と同
じ性質をもつモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマが形成され得るか否かは未だ知られていなかった。

１）Ｔｓｕｃｈｌｙａ＋　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　１９６
５．　Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌ、Ｍｙｃｏｌ。

Ａｐｐｌ、　２６　：　１ ２）Ｔｓｕｃｈｉｙａ、　Ｔ、　ａｔ　ａｌ、　１９７
４．　Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌ、Ｍｙｃｏｌ。

ＡｐＰｌ、　５３ニア７ ３）　Ｆｕｋａｚａｗａ　Ｙ、　＠ｔ　ａｔ、　１９８
０．　ｐ、１２７−１３６．　ＩｎＰｒｅｕｓｓ＠ｒ、
Ｈ，（ｅｄ）＋　Ｍｅｄｌｃａｌｍｙｅｏｌｏｇｙ、　
Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ。

Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、５ｕｐｐ１．８＋Ｇｕａｔａｖ　
Ｆｉｇｃｈｅｒ　Ｖｅｒｌａｒｇ。

Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

４）　Ｆｕｋａｚａｖａ　Ｙ、　＠ｔ　ａｌ、　１９７
６、　ｐ、２１３−２１　、　Ｉｎ　ｂｖａｔａ。

Ｋ、（ａｄ）＋　Ｙｅａｓｔｓ　ａｎｄ　ｙｅａｓｔ−
１ｉｋｅ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｌｓｍａＩｎ　ｍｅｄ
ｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｕｎｌｖｅｒｓｌ　ｔｙ
　ｏｆ　Ｔｏｋｙ。

Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｋｙｏ。

５）Ｏｋａｄａ、Ｙ、　１９６２．　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１
ｌ　Ｒｅｓ、　２６．９８６）　Ｋａｏ＋　Ｋ、Ｎ、　
ａｎｄ　Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ　Ｍ、Ｒ，１９７４，Ｐｌ
ａｎｔａ。

１１５．３５５ ７）　Ｋ；ｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９７５．　Ｎａ
ｔｕｒ＠２５６ｓ１９５「発明が解決しようとする問題
点」 本発明者等は、鋭意研究の結果、カンジダ菌に対する抗
体産生細胞とミエローマ細胞を融合せしめることにより
、カン・ジグ菌に対する抗体を産生し、しかも長期継代
培養ｂ］能なハイブリドーマを得、該ハイブリドーマよ
り分泌されるモノクローナル抗体を採取、利用すること
によって、従来のポリクローナル因子抗体と同様の特異
性を持ち、しかもそれに比べ高い力価をもつ抗カンジダ
モノクローナル因子抗体が得られることを見い出し、本
発明を完成するに至り几。従って本発明は、抗カンノダ
、同定用因子モノクローナル抗体全提供するものである
。

「問題点全解決するための手段」 すなわち、本発明はカンジダ属に対する抗体産生細胞と
ミエローマ細胞とを融合させ、選別することによって得
らするハイブリドーマから産生、分泌されるカンノブ属
に対するモノクローナル抗体である。

本発明は以下の工程よりなる。

本発明のカンジダ属に対するモノクローナル抗体は、抗
カンジダ抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合するこ
とによって得られる抗カンジダモノクローナル抗体産生
性ハイブリドーマから産生されるものである。

ここで、ハイブリドーマの製造に用いられる抗カンジダ
抗体産生細胞としては、次に挙げる菌種Ｃａｎｄｌｄａ
　ａｌｂｌｃａｎｍ　５ｅｒｏｔｙｐｅ　Ａｎ　Ｃａｎ
ｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓｓｅｒｏｔｙｐｅ　Ｂ、　
Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｕｌｌｌ［ｅｒｍｏｎｄｉ、　Ｃａ
ｎｄｌｄａｇｌａｂｒａｔａ、　Ｃａｎｄｊｄａ　ｋｅ
ｆｒｙ＋　Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅｉ。

Ｃａｎｄｔｄ＆ｐａｒａｐｓＬＬｏｓｌｓ　　の生菌、
グルタルアルデヒド処理菌、マイトマイシン処理菌或い
は熱処理菌等をマウスなどの動物に免疫し、免疫後その
牌臓等全採取することによって得られる牌８２細胞が用
いられる。

免疫に用いる動物としてマウス特にＢａ１ｂ／Ｃ系マウ
スが好適に用いられる。

なお、免疫の際の免疫原投与法は皮下注射、腹腔内注射
、静脈内注射、皮肉注射および筋肉注射等いづれでもよ
いが、腹腔内注射が好ましい。免疫は適当な間隔、好ま
しくは１〜２週間をおいて繰り返し行なう。毎免疫、１
週間後に免疫した動物血清中の抗カンジダ抗体価を測定
し、抗体価が充分高くなった、好捷しくけ凝集力価反応
３２０倍希釈以上になった動物から抗体産生細胞を得て
用いれば、抗カンジダ抗体産生ハイブリドーマを得る確
率は著しく高くなる。

細胞融合には最終免疫後、３日目のマゲス由来の抗体産
生細胞を用いるのが好ましい。なお、このようにして得
られる抗カンジダ抗体産生細胞は、還流法等によってバ
ラバラにほぐして使用することが好フしい、 この抗カンジダ抗体産生細胞との融合に用いるミエロー
マ細胞としては、マウス由来の骨髄腫細胞、　Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ　８、Ｓｐ　２１０−Ａｇ　１４　、　Ｐ３
−ＮＳＩ　／　１−Ａｇ４−１’ｌたはＸ６３−Ａｇ　
８．６５３　　が有効に使用される。

これらの両蛯１］胞を融合する場合は、ミエローマ細胞
に対し抗カンジダ抗体産生細胞を細胞数２倍以上の割合
でダルベツコ改変イーグル培地（以下ＤＭＥと表示）等
の適当な培地中で混合し、遠心して上？’ｌ除去し友後
、ポリエチレングリコールで融合する方法が好適に採用
される。なおこの場合、ポリエチレングリコールは、分
子Ｊｉｔ１０００，１５４０゜２０００．４０００また
は６０００のものを用いるのが好ましい。ポリエチレン
グリコールは４０〜５０チの水邑液として使用し、反応
は３７〜３８℃、１〜２分間とすることが好ましい。反
応後は必要にろじて上記のＤＭＥ培地で遠心法によって
洗浄した後、好適にはウシ胎児血清を１０〜１５％よむ
ＤＭＥ培地等の適宜な培地を加えて１日程度培養するこ
とが好ましい。

この細胞融合によって得られる灰石物中に目的とするハ
イブリドーマのほか、未融合の抗カンジグ抗体産生細胞
とミエローマ細胞が混在している丸め、ハイプリドーマ
全選択的に培養する必要がある。この目的の丸めにウシ
胎児血清１０〜１５チ含むＤＭＥ培地にアミノプテリン
、ヒボキサンチン、チミジンを加えたＦ（ＡＴ培地が有
効に用いられる。これにより）・イブリドーマのみを選
択的に生育、増殖させることができる。一方、未融合の
抗カンジダ抗体産生細胞とミエローマ細胞は死滅する。

この場合、ＦＬＡＴ培地全アミノプテリンを除いたＨＴ
培地に徐々に変換することができる。

このようにして生育、増殖したハイブリドーマは、１０
〜１５チウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地にヒ、ｊ５キサ
ンチン、チミジンを添加したｆ（Ｔ培地で３〜６日間程
度培養し、その後１０〜１５係ウシ胎児血清を含むＤＭ
Ｅ培地等の・・イブリドーマ用培地で培養することが好
ましい。

得られたハイブリドーマ群からカン７ダに対するモノク
ローナル産生性）・イブリドーマ全選別する方法として
種々な方法かりる。たとえば、ラノオイムノアノセイ（
ＲＩＡ）、エンプイムイムノアツセイおよび間接螢光抗
体法等の方法である。この場合ＥＬＩＳＡ　（Ｅｎｚｙ
ｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａ
ｓ５ａｙ）は感度も十分に冒く、かつ簡単であるので好
適に採用てれる。

上記の方法で選別し九ハイブリドーマは、一般には２個
以上のクローンを含むことが多く、完全に同一の性質を
有する細胞の集団ではない。ま念、九とえ最初は同一の
性質を有する細胞の集団であっても培養中に、その集団
の中から抗体を産生じないクローンが出現することが変
度ある。そこで個々のクローンを分離するために、ハイ
ブリドーマのクローニングを行なうことが必要である。

クローン化の方法としては、限界希釈法、軟寒天法、フ
ィブリンダル法等を用いることができる８この場合、限
界希釈法が好適に採用される。また、培地としては１０
〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地にヒポキサンチ
ン、チミジン全顎えｆＨＴ培地または１０〜１５チウン
胎児血清を含むＤＭＥ培地を用い２）ことが可能である
。

抗体の製造にあたっては、カンノダ菌に対する抗体全産
生するハイブリドーマをインビトロで増殖培養すること
ができ、１だハイブリドーマをマウス腹腔等に投与して
インビ１ｇで増殖することもできる。

なお、このようにして得られたカンノダに対するモノク
ローナル抗体産生性・・イブリド−マは、１０％ツメチ
ルスルホキシド°全含むウシ胎児血清で液体窒素中凍結
保存することが可能である。

本発明の抗体は、粗製抗体液、すなわち抗カンヅグ抗体
産生性ハイブリドーマ培養上清液あるいはマウス腹腔液
の′１ま使用することもでさる。さらに、硫安アンモニ
ウム分画やイオン交換クロマトグーｙフィあるいはプロ
ティン人や抗原カラムなどによるアフィニティクロマト
グラフィにより精製して使用することも可能である。

以上のような方法で得られた粗製抗体あるいは精製抗体
は、後述の実施例に示すように、前述のカンジダ同定用
因子ポリクローナル抗体と同じ性質ヲもつモノクローナ
ル抗体である。

「実施例」 す、下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例　１ （１）抗体産生細胞（免疫原）および細胞壁マンナンの
調製 Ｃａｎｄｌｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　Ｍ−１０１２株（
＋！１ｅｒｏｔｙｐｅ　Ａ　）　ｆ２７℃、４８時間ザ
ブロ培地で培養後、遠心分離（１００ＯＸＮ　、４℃、
１０分間）によって菌体ケ集める。この菌体を脱イオン
水で遠心法によって３回洗浄後、１００℃で２時間熱処
理を行なう。

菌は２×１０　個／ｒｎｔの濃度に調整し、免疫原菌浮
遊＋ｆ［とじて以下の実験に用いた。

他方、菌細胞壁マンナンの抽出は次の操作で行なう。熱
処理した菌体を遠心分離によって集め、り にして精製した。このようにして得たマンナンは、抗カ
ンノダ抗体産生性ハイブリドーマヲ選別するためのＥＬ
Ｉ　ＳＡ用抗原として使用する。

８）　Ｆｕｋａｚａｗａ、Ｙ、　ｅｔ　ａｌ−１９８０
，ＩｎｔＪ、　５ｙｓｔ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　３０：１９６ ９）　Ｇｏｒｔｎ、Ｐ、Ａ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｓｐ＠ｎｃ
ｅｒ、Ｊ、Ｆ、Ｔ、　１９６８−Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｈ
ｅｍ、４６：２２９９（２）細胞融合 上記の免疫原菌浮遊欣０．２−をＢａ１ｂ／ｃ系マウス
腹腔内に投与することにより免疫を行なっ几。

血中抗体価が十分に上昇する甘で、１〜２週間間隔で免
疫する。血中抗体価は、上記のｆ＃製マンナンをコート
したポリスチレングレートを用いたＥＬＩＳＡ法ＶＣＬ
り測定した。

抗体価の上昇し之マウスに１回追加免疫し、３日後の牌
臓を無菌的に摘出した。次に、１０〜１５俤胎児血清金
含むＤＭＥ培地培地５全ｌｔした７ヤーレに牌臓金入れ
、牌臓を１０〜１５俤胎児血清を廿むＤＭＥ培地で還流
して牌細ｆ＠全流出させた後、この牌細胞愁濁孜をナイ
ロンメッンーに通す。この１１♀細胞を５０ｍ１遠心チ
ー−ブに巣めて５００ｘ＆。

１０分間遠心する。こうして得之細胞ベレッｌこ３〜５
−のヘモライズイングｍＷ　（１５５ｎＭＮＨａＣｔ、
Ｉ　Ｕ　ｍＭＫＨＣＯ３，ｌ　ｍＭ　　ＮＩＬ２　ＥＤ
ＴＡ　ｐ”　７．０　）？加え、懸濁させる。０℃で５
〜１０分間放石”すると給血が起る。１０〜２０　ｍｅ
の１０〜１５％胎児血？′ｉ￥全含むＤＭＥ培地全加全
顎から遠心分離すＺ）。

このようにして得たｊ面胞ベレン）　ｉ　ＤＭＥ培地で
遠心法によって洗浄し、生きた牌細胞の数音カウントす
る。

一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞ＳＰ２１０
−Ａｇ　１４約２×１０　個に１×１０　個の上記牌細
胞を加え、ＤＭＥ培地中でよく混和し、遠心分離を行な
った（ｓｏｏＸｙ、ｉｏ仕分間。その上清に吸引し、ベ
レット金よく解きほぐし、３８℃に保温しておいた４０
チポリエチレングリコール４０００俗夜’ｔｏ、５ｍｔ
２滴下し、遠心チューブ２手で、１分間穏やかに回転す
ることによってポリエチレングリコールｍ夜と細胞Ｒレ
ット全混合させた。次に、３８℃に保温しておいｆｃＤ
ＭＥ培地金、３０秒毎に１ｄずつ加えてチューブを穏や
かに回転させる。この操作ｉ１０回繰９返した後、２．
０〜３〇−の１５多胎児血清を含むＤＭＥ培地を加えて
、遠心分離（５００Ｘ＆、１０分間）全行なった。

上清を除去した後、細胞ペレットｆ　］　Ｏ−１５チ胎
児血清を含む１（ＡＴ培地で、遠心法で２回洗浄後、４
０−の上記１（ＡＴ培地に懸濁する。このＬ１１胞懸濁
故ｌＪ：（Ｊ　６ウエル細胞培養プレートの各ウェルに
２００μｌずつ分注し、３７℃、５飴炭酸ガスを含む炭
酸ガス培養器で培養全開始した。培養後、２〜３日間隔
で各ウェルの培地を約１００μｌ除き、新たに上記のｆ
（ＡＴ培地を１ＯＯ１１１加えることにより）ＩＡＴ培
地中で増殖するハイブリドーマを選択した。１０日白目
からＨＴ培地（１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
培地に１０−’　Ｍヒボキサンチン、１．６Ｘ１０　　
Ｍチミジンを加え友もの）に交換し。

ハイプリドーマの増殖全観察するとともに、約１４白目
に、下達のＥＬＩ　ＳＡ法により、抗カンノダ抗体産生
性ハイブリドーマｔスクリーニングした。

（３）　　ハイブリドーマの樹立 ハイプリドーマ培養上清中の産生抗体の■無はＥＬＩＳ
Ａ法によりｉｒ＋＋１定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用
ル−ト（Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ　＋日本グ
イナテック株式会社）の各ウェルに、先に精製した細胞
壁マンナン（＋−５０ｍＭ炭酸水累す）　１）ラム緩’
４６で５０μｇ／−の４度に調整し几俗孜全５０μΔず
つ分注し、３７℃で２４時間放訂した。次に０．０５　
％　Ｔｗｅｅｎ　２Ｏ−ｓａｌｉｎｅ市（牧で３１ｐｊ
鼠浄した汝、各ウェルに培養上清を５０μ！加え、室温
で１時間反応させた。次に２００倍希釈し九被ルオキシ
ダーゼ結合抗マウスグロブリン抗体（ダコ社、デンマー
ク）５０μｌ全各ウエルに加え之。

反応終了後、０．０５　％　Ｔｗｅｅｎ　２Ｏ−ｓａｌ
ｉｎｅで各ウェルｆｒ、３回洗浄し、０．５ｍＭアミノ
アンチピリン、１０ｍＭ石炭酸および０．００５％過酸
化水素水を含む浴液２５０μｌｋ各ウェルに加え、室温
で３０分間反応させ、各ウェルの４９２ｎｍＫおける吸
光度を測定した。その結果、１９２ウエル中３ウエルに
抗体産生が認められ友。

上記のＥＬＩＳＡ法によって認められた培養上清中の抗
カンジダ抗体が免疫原であるＣａ　ｎｄ　ｔ　ｄ　ａａ
ｌｂｉｃａｎａ　Ｊ　１０１２　（５ｅｒｏｔｙｐｅ　
Ａ）と凝集反Ｅｋ起すか否か全検討した。凝集板の各ウ
ェルに免疫原として使用し九菌懸濁液（Ｉ　Ｘ　１０”
個／−）を２０μｌ加える。次に培養上清ｉ’ｉｓｏμ
ｌ加えた後、よく混和して１分間放置する。１分後、各
ウェルの凝集程度全観察する。ＥＬＩＳＡ法によって抗
体産生が認められ几ウェルの培養上清は、すべて上記の
菌と凝集反応を起し九〇 抗体産生が認められ几ウェル中のノ・イブリドーマは２
４ウエルプレートに移し、Ｆ（Ｔ培地で４〜５日間培養
した後、再度ＥＬＩＳＡ法と凝集反応法とにより抗体産
生の南無？確認してから限界希釈法によってクローニン
グし几。限界希釈法は、ＨＴ培地でハイブリドーマが５
個／ｒｎｔとなるように希釈した細胞浮遊液を予め正常
Ｂａ１ｂ／ｃ系マウスの腹腔細胞がウェルあたり２×１
０　個分性してりる９６ウエルプレートの各ウェルにｌ
ＯＯμｌずつ分注した。２週■」後、ＥＬＩ　ＳＡ法と
凝集反応法によって抗体産生性ハイプリドーマのクロー
ンをスクリーニングＬＵ。その結果、各）・イブリドー
マにつき、２０〜４０個の抗体産生クローンが得られる
。これらのクローンの中から、増殖のよい、抗体分泌能
が高い、しかも安定なりローンを選び、前述の同様の方
法で再度クローン化全行い、抗Ｃａｎｄ　１ｄａａｌｂ
ｊｃａｎｓ　５ｅｒｏｔｙｐｅ　Ａ抗体産生／Ｓイブリ
ドーマＣＡ−４、ＣＡ−５およびｃＡ−６ｋｉＩ！Ｊ立
した。

（４）抗体の産生 グリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）　０．５ｄｉ　１０〜１２週齢のＢａ１ｂ／ｃ
系マウスの腹腔内に投与後１４〜２０日目のマ白目腹腔
内にインビトロで増殖させたハイブリドーマＣＡ−４、
ＣＡ−５捷ｔはＣＡ−６をマウス−匹あたり２×１０６
個接種し友。接種後２〜３週間目に腹水を採取し、遠心
分離（１００Ｘｇ、１０分間）により腹水上清を得九。

各ハイブリド−マにつき一匹のマウスから約１０〜１５
−の腹水上清が得られた。

その抗体ｍｈ、ＣＡ−４、５ｍｙ／ｍｌ、　ＣＡ−５、
４，８ｍｇ／づおよびＣＡ−６，１０ダ／−であった。

（５）抗体の特異性およびクラス ハイブリドーマＣＡ−４、ＣＡ−５、ＣＡ−５の産生分
泌する抗体が抗原細胞Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｔｃａｎ
ｓ　Ｍ１０１２（ａｅｒｏｔｙｐｅ　Ａ）の他、同種異
味、同属異属の細胞と凝集反Ｇ’ｃ起すか否か及び、さ
らにその力価を検討した。結果全表１，２に示す。

各抗体のクラスはオフテロニー法によって決定した。こ
の場合、抗マウス１．９Ｇ抗体、抗マウス１ｇＡ　オよ
び抗マウス１．９Ｍ抗体はベルフリーズ社（アメリカ）
のものを使用した。その結果、得られた３種の抗体はす
べて１９Ｍであった。

実施例　２ （１）抗体産生細胞および細胞壁マンナンの調製Ｃａｎ
ｄｉｄａ　ａｌｂｔｃａｎａ　Ｂ−７９２（５ｅｒｏｔ
ｙｐｅ　Ｂ　）を２７℃、４８時間サブロ培地で培養後
、遠心分離（１０００Ｘ、９．１０分間）によって菌体
を集める。

この菌体を脱イオン水で遠心法によって３回洗浄後、Ｊ
ＯＯ℃で２時間熱処理を行う。菌は２Ｘ　１０８個／ｍ
／！の濃度に調整し、免疫原浮遊液として以下の実験に
用いた。−万、卸１胞壁マンナンの抽出Ｖユ次の操作で
行なった。熱処理した菌を遠心分離によって東め、菌体
体積の５信置の２％水酸化カリウムＭ敵に懸濁させるこ
とによって抽出し、銅錯塩にして精製し友。このように
して抽出、種実したマンナンは抗カンジダ抗体産生性ハ
イブリドーマ全選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として
使用する。

（２）　　＃Ｉ胞融合 抗体産生細胞およびミエローマ細胞の調整、細胞融合ば
′−Ａ施例１（２）と同様の方法で行なった。

（３）・・イブリドーツの樹立 融合細胞培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＩＳＡ法と
スライド凝集反応法によって実施例１（３）と同様の方
法で行なっ几。その結果抗Ｃａｎｄｉｄａ　ａ　１ｂｌ
ｃａｎａＢ−７９２（５ｅｒｏｔｙｐｅ　Ｂ　）抗体産
生ハイブリドーマＣＢ　−４およびＣＢ−１３を樹立し
た。

（４）抗体の産生 実施例１（４）に記載の方法で行ない、Ｂａ１ｂ／ｃ系
マウス１匹あたり約１０〜１５−の腹水上清を得九〇 （５）抗体の特異性およびクラス 実施例１（５）に記載の方法でバイブリド９−マＣＢ−
４およびＣＢ　−１３の産生分泌する抗体の特異性、免
疫グロブリンのクラスおよび力価を調べた。七の結果は
表１，２に示す。

実施例　３ （１）免疫原および細胞壁マンナンの調製Ｃａｎｄｌｄ
ａ　ｇｕｔｌｌｔｅｒｍｏｎｃｌＬ　ｆ　２７℃４８時
間サブロす地で培養後、遠心分離（１００ＯＸＦ、１０
分間）によって菌体を集める。この菌体を脱イオン水で
遠心法によって３回洗浄後、１００℃で２時間熱処理を
行う。菌は２×１０　個／−の濃度に調整し、免疫原浮
遊液として以下の実験に用いた。

一方、細胞壁マンナンの抽出は次の操作で行なった。熱
処理しｍ預金遠心分離によって集め、菌体体積の５倍縫
０２％水酸化カリウムｍ夜に懸濁させることによって抽
出し、銅錯塩にして精製した。

このようにして抽出、精製し之マンナンは抗カンジダ抗
体産生性ハイブリドーマ全選別する九めのＥＬＩＳＡ用
抗原として使用する。

（２）細胞融合 抗体産生細胞およびミエローマ細胞の調製、細胞融合は
実施例１（２）と同様の方法で行なった。

（３）　　ハイブリドーマの樹立 融合細胞培養上清中の産生抗体の’／＋に無はＥＬＩＳ
Ａ法とスライド凝集反応法によって実施例１（３）と同
様の方法で行なった。七の１結果、抗Ｃａｎｔｌｌｄａ
ｇｕｌｌｌｌｅｒｍｏｎｄｌ抗体産生性ハイブリドー−
ｒ　ＣＧ　−９を樹立し足。

（４）抗体の産生 実施例１（４）に記載の方法で行ない、Ｂａ１ｂ／ｃ系
マウス１匹あｆｃり約１０〜１５−の腹水上清を得た。

（５）抗体の特異性およびクラス 実施１３ｉｌＪ　１　（５）に記載の方法でハイブリド
ーマＣＧ−９の産生分泌する抗体の特異性、免疫グロブ
リンのクラスおよび力価を調べ友。その結果は表１゜２
に示す。

実施例　４ （１）免疫原訃よび細胞壁マンナンの調製Ｃａｎｄ［ｄ
ａ　ｇｌａｂｒａｔａ　　ｆ　２７℃４８時間サブロす
地で培養後、遠心分離（１００ＯＸＦ　、１０分間）に
よって菌体を集める。この菌体を脱イオン水で遠心法に
よって３回洗浄後、１００℃で２時間熱処理を行う。Ｍ
は２×１０　個／Ｔｎｔの濃度に調整し、免疫原浮遊液
として以下の実験に用いた。−万、細胞壁マンナンの抽
出は次の操作で行なった。熱処理した預金遠心分離によ
って集め、菌体体積の５倍鼠の２％水酸化カリウムＭ数
に懸濁させることによって抽出し、銅錯塩にして精製し
た・このようにして抽出、精製シフｆｒ、マンナンは抗
カンジダ抗体産生性バイブリド・−マを選別するための
ＥＬＩＳＡ用抗原として使用する。

（２）細胞融合 抗体産生細胞およびミエローマ細胞の調製、細胞融合は
実施例１（２）と同様の方法で行なり之。

（３）　ハイブリドーマの樹立 融合細胞培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＩＳＡ法と
スライド凝集反応法によっで実施例１（３）と同様の方
法で行なった。その結果、抗ＣＢｎｄｌｄａｇｌｘｂｒ
ａｔａ　　抗体産生性ハイブリドーマＣＧＬ−３４’を
樹立［、、ニア’ｎ。

（４）抗体の産生 実施例１（４）に記載の方法で行ない、Ｂａ１ｂ／ｃ系
７ウス１匹あたり約１０〜１５−の腹水上清を得た。

（５）　　抗体の％異性およびクラス 実、１７ｉ！ｉｔす１（５）に記載の方法でハイブリド
ーマＣＧＬ−３４の産生分泌する抗体の特異性、免疫グ
ロブリンのクラスおよび力価を調べた。その結果は表１
゜２に示す。

実施例　５ （］）免疫原および細胞壁マンナンの調製Ｃａｎｄｌｄ
ａ　ｋｅｆｒｙ　ｆ　２７℃４８時間サブロす地で培養
後、遠心分離（１０００）Ｉｌ、１０分間）によって菌
体全集める。この菌体を説イオン水で遠心法によって３
回洗浄後、１００℃で２時間熱処理金行う。菌は２×１
０　個／　ｍｌの濃度に調整し、免疫原浮遊液として以
下の実験に用いた。一方、細胞壁マンナンの抽出は次の
操作で行なっ几。熱処理し次面を遠心分離によって集め
、菌体体積の５倍皿の２チ水酸化力リウムＭＵに懸濁さ
せることによって抽出し、銅錯塩にして精製した。この
ようにして、抽出、精製したマンナンは抗カンジダ抗体
産生性ハイブリドーマ全選別するためのＥＬＩＳＡ用抗
原として使用する。

（２）細胞融合 抗体産生細胞およびミエローマ細胞の調整、細胞融合は
実施例１（２）と同様の方法で行なっ几。

（３）　　ハイブリドーマの樹立 融合細胞培養上清中の産生抗体の有無ｉｄ　ＥＩＪＳＡ
法とスライド凝集反応法によ一〕て実施例１（３）と同
様の方法で行なツタ７、その結果、抗Ｃａｎｄｉｄａ　
ｋｅｆｒｙ抗体産生性ハ・１ブリドーマＣＫ−８全樹立
し、た。

（４）抗体の産生 実施例１（４）！’こ記載の方法、でｆＴ；＋２：い、
Ｂａ１ｂ／ｃ系・−１・ウス１匹あたり約１０〜１５−
の腹水上清を得１ζ　。

（５）抗体の特異性お↓びクラス ′Ｍ詮）ψｌ］　］、　（５）に記載の方法でハイブリ
ドーマＣＫ−８の産生う〕泌″ｉる抗体の特異性、免疫
グロブリンのクラスおよび力価ゲ調べた。その結果は表
１゜２ｅＣ厚”′ｆ′。

１！６１Ｊｘｉ　１１１６ （１）免疫原↓、・よび、！１」側壁マンナンの調Ｑμ
Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅｌ　ｆ（２７℃４８時間ザ
ブロ培地で培＊伎、遠心外Ｑｌ（（１０００Ｘｇ、１０
分間）によ・〕ｒ、、閑体ｆ　ｇ％める。この閑体全脱
イオン水で遠心法Ｖ（Ｘ　、ｆ：って３回洗浄後、１０
０Ｃで２時間熱処理を行う。菌は２ＸｌＯ個／　ｍｌの
ｉ）％　ｆｇ−に調整し、免疫原浮遊液として以下の実
験に用い九。−万、細胞壁マンナンの抽出は次の操作で
行なつｆｒ：、、熱処理し止面を遠心分離によって集め
、菌体体積の５倍量の２ｔｌｊ水酸化力リウムｍ液に懸
濁させることによって抽出し、銅錯塩にして精製した。

このようにして抽出、。精製したマンナンは抗カンうク
ズ抗体産生性ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩＳ
Ａ用抗原として使用する。

（２）細胞融合 抗体産生細胞およびミエローマ細胞の調整、細胞融合は
実施例１（２）と同様の方法で行なった。

（３）　　ハイブリドーマの樹立 融合細胞培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＩ　ＳＡ法
とスライド凝集反応法によって実施例１（３）と同様の
方法で行なッ′ｆｒ、。その結果、抗Ｃａｎｄｉｄａ　
ｋｒｕｓｅｉ抗体産生性ハ・イブリドーマＣ１＝１１’
に樹立した。

（４）抗体の産生 実施例１（４）に記載の方法で行ない、Ｂａ１ｂ／ｃ糸
マウス１匹あたり約１０〜１５ゴの腹水り清ゲ得た。

（５）抗体の特異性およびクラス 実施例１（５）に記載の方法でノ・イブリＰ−マ・ＣＫ
Ｒ−１１の産生分泌する抗体の特異性、免疫グロブリン
のクラスおよび力価を調べ九。その結果は表１゜２に示
す。

実施例　７ （１）免疫原および細胞壁マンナンの調製Ｃａｎｄｌｄ
ａ　ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉａ　’ｋ　２７℃４８時間
サブロす地で培養後、遠心分離（１０００Ｘ＆　、１０
分間）によって菌体を集める。この菌体全脱イオン水で
遠心法によって３回洗浄後、１００℃で２時間熱処理を
行う、菌は２×１０個／ｄの濃度に調整し、免疫原浮遊
級として以下の実験に用いた。一方、細胞壁マンナンの
抽出は欠の操作で行なった。熱処理した面金遠心分離に
よって集め、菌体体積の５倍社の２チ水酸化カリウム俗
液に懸濁させることによって抽出し、銅錯塩にして精製
した。このようにして抽出、精製し几マンナンは抗カン
ノグ抗体産生性ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩ
ＳＡ用抗原として使用する。

（２）細胞融合 抗体産生細胞およびミエローマ細胞の調整、細胞融合は
実施例１（２）と同様の方法で行なっ几。

（３）　　ハイブリドーマの樹立 融合細胞培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＩＳＡ法と
スライド凝集反応法によって実施例１（３）と同様の方
法で行なっ九。その結果、抗Ｃａｎｄｉｄａｐａｒａｐ
ｓｉｌｏｓｉｓ　　抗体産生性バイブリド−？ＣＰ−１
３を樹立した。

（４）抗体の産生 実施例１（４）に記載の方法で行ない、Ｂａ１ｂ／ｅ系
マウス１匹あたシ約１０〜１５ゴの腹水上清を得た。

（５）抗体の特異性およびクラス 実施例１（５）に記載の方法でハイブリドーマＣＰ−１
３の産生分泌する抗体の特異性、免疫グロブリンのクラ
スおよび力価を調べた。その結果は表１゜２に示す。

表　２　腹水由来抗カンジダ抗体の力価ａ、　　ＣＡ−
４ハイブリドーマを投与したマウスの腹水上清のスライ
Ｐ′Ｉｉｉ集反応 水上清のスライド凝集反応 ｃ、　　ＣＡ−６ハイブリドーマを投与したマウスの腹
水上清のスライド凝集反応 水上清のスライド凝集反応 ｅ、　　ＣＢ−１３ハイブリドーマを投与したマウスの
腹水上清のスライド凝集反応 ｆ、　　ＣＧ−９ハイブリドーマを投与したマウスの腹
水上清のスライド凝集反応 腹水上清のスライド凝集反応 水上清のスライド凝集反応 ｔ、　　ＣＫＲ−１１ハイブリドーマを投与したマウス
の腹水上清のスライド凝集反応 腹水上清のスライド凝集反応

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. カンジダ属に対する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを
   融合させ、選別することによって得られるハイブリドー
   マから産生、分泌されるカンジダ属に対するモノクロー
   ナル抗体。