JPH03254691A - 薬剤耐性癌に対するキメラ抗体およびその製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 く技術分野〉 本発明は、薬剤耐性癌に対するキメラ抗体およびその製
造に関する。さらに具体的には、本発明は、マウス由来
のモノクローナル抗体の可変（Ｖ）領域とヒト由来の免
疫グロブリンの定常（ｃ）領域とから成るキメラ抗体お
よびその生産方法に関する。

〈従来技術〉 各種の化学療法剤に対する腫瘍の耐性は、癌の治療にお
ける重要な問題となっている。腫瘍細胞は、単一薬剤で
治療した後にドキソルビシン（アドリアマイシン）、ビ
ンカアルカロイドおよびアドリアマイシンＤのような薬
剤に対する耐性を獲得することができる（後記参考文献
１．２）。多剤耐性を引き起こす遺伝子、ｍｄｒは、細
胞から各種の細胞毒薬剤を輻送するポンプとして作用す
る膜糖タン白質（Ｐ−糖タン白質）をコードする（３）
。このＰ−糖タン白質は抗癌剤に結合しく４．５）、耐
性細胞の原形質膜に局在したＡＴＰａｓｅ（６，７）で
あることか示されている（８．９）。クローニングした
ｍａｒ配列のトランスフェクションにより、感受性細胞
に多剤耐性が付与される（１０〜１２）。

Ｐ−糖タン白質発現の量を腫瘍試料で測定し、本来的に
薬剤耐性の結腸癌、腎臓癌および副腎癌、および化学療
法の後に薬剤耐性を獲得した幾つかの種類の腫瘍で高く
なることが見出だされた（１３〜１５）。Ｐ−糖タン白
質はヒト癌の獲得多剤耐性および本来的薬剤耐性の両方
に関連していると思われるので、Ｐ−糖タン白質を発現
する腫瘍細胞を選択的に殺すことが癌の治療に極めて重
要である。ヒト薬剤耐性癌の効果的な治療法の検討で、
多剤輸送体Ｐ−糖タン白質に反応性のモノクローナル抗
体を開発した（１６）。このモノクローナル抗体を静脈
内に投与したところ、薬剤耐性のヒト卵巣癌細胞を皮下
に接種した無胸腺マウスで腫瘍の発生が効果的に予防さ
れた（１７）。

モノクローナル抗体の１種であるＭＲＫ１６で治療した
ところ、定着した皮下腫瘍が速やかに退行し、ある種の
動物では冶癒した。これらのモノクローナル抗体はＰ−
糖タン白質を有する多剤耐性のヒト腫瘍の治療手段とし
ての可能性を有する（１７）。このモノクローナル抗体
を包含する薬剤耐性癌に関するモノクローナル抗体につ
いては、本発明者らによってすでに出願されている（特
願昭６０−２０１４４５号明細書、特開昭６２６１５９
６号公報参照）。

しかしながら、異種タン白質としてのマウス抗体はそれ
らの効果を破壊する反作用性免疫反応を引き起こすこと
があり、また、患者のアレルギー反応を引き起こすこと
がある（１８．１つ）。

腫瘍細胞表面に対するモノクローナル抗体を癌治療に用
いることは、以前から期待されていた（３６）。幾つか
の場合には、モノクローナル抗体は、単独で腫瘍細胞の
増殖を阻害することができるが（１７，３７〜３つ）、
他の系では、腫瘍の増殖阻止は抗体と各種の毒性物質と
の複合体によって遠戚される（４０〜４２）。モノクロ
ーナル抗体を用いると、インビトロでも残存する悪性細
胞を根絶することができる（４３）。かかる処理には多
くの困難があるが（３６）、幾つかの新しい成功例か報
告されており（４４）、免疫療法は将来において重要な
臨床的価値を有するようになるであろう。

ネズミ由来のモノクローナル抗体の臨床的使用の主な制
限は、異種タン白質に対して誘発される免疫反応であり
、これにより抗体が無効になったり、患者を害すること
もある（１８．１つ、３６）。さらにマウスモノクロー
ナル抗体は、腫瘍の破壊を媒介するヒトエフェクター細
胞との相互作用の効率が低いことがある。ヒトモノクロ
ーナル抗体を用いる治療は研究中であるが、ヒトハイブ
リドーマ細胞系は大部分が人手不可能であり、存在する
にしても、通常は不安定であって、免疫グロブリンの産
生量は低い（４５）。

〔発明の概要〕

本発明は、上記のような問題点を解決し、多剤耐性ヒト
癌に対して特異的でしかも免疫原性の低い抗体を提供す
ることを目的とするものである。

ヒトでのネズミモノクローナル抗体の抗原性を防止する
一つの方法は、ネズミｖ／ヒトＣキメラ免疫グロブリン
を構築することである。はとんどの免疫グロブリンの抗
原性はＣ領域にあるので、ネズミＶ／ヒトＣキメラ免疫
グロブリンの作成によって、ネズミモノクローナル抗体
の特異性を有しながら、ヒト免疫反応（２０，４６，４
７）を誘発しない抗体が得られる。さらにこのようなキ
メラタン白質はそれらのヒトＣ（定常）領域のためにヒ
ト細胞性免疫系と一層効果的に相互作用するので、対応
するネズミ抗体（４８）よりも有利な治療を行うことが
できる。マウス−ヒトキメラ抗体は、ハブテン抗原（４
９〜５１）および幾つかの癌関連抗原（５２〜５５）と
反応する能力を保持することが示された。癌の免疫療法
において、これらのキメラ抗体を用いる幾つかの試みが
現在進行中である（５６）。

く要　旨〉 本発明者らは、モノクローナル抗体ＭＲＫ１６の抗原認
識可変（Ｖ）領域がヒト抗体（２０１２１）の定常（ｃ
）領域と結合している組換えキメラ抗体を作成し、ヒト
エフェクター細胞を用いて薬剤耐性腫瘍細胞を死滅させ
る能力を抗体依存性細胞傷害性試験によって測定したと
ころ、このキメラ抗体がマウスＭＲＫ１６よりも効果的
であることを見出し、この知見をもとに本発明を完成さ
せるに至った。

すなわち、本発明による薬剤耐性癌に対するキメラ抗体
は、薬剤耐性癌に対するマウスモノクローナル抗体にお
ける可変領域と実質的に相同なアミノ酸配列を有する可
変領域と、ヒト免疫グロブリンにおける定常領域と実質
的に相同なアミノ酸配列を有する定常領域と、からなる
こと、を特徴とするものである。

また、本発明による薬剤耐性癌に対するキメラ抗体の製
造法は、下記の工程（ａ）〜（ｆ）を含むこと、を特徴
とするものである。

（ａ）　　薬剤耐性癌に対するマウスモノクローナル抗
体のＨ鎖における可変領域と実質的に相同なアミノ酸配
列をコードする遺伝子の転写下流側に、ヒト免疫グロブ
リンのＨ鎖における定常領域と実質的に相同なアミノ酸
配列をコードする遺伝子の転写上流側を連結して、キメ
ラＨ鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖を調製す
ること。

（ｂ）　　薬剤耐性癌に対するマウスモノクローナル抗
体のＬ鎖における可変領域と実質的に相同なアミノ酸配
列をコードする遺伝子の転写下流側に、ヒト免疫グロブ
リンのＬ鎖における定常領域と実質的に相同なアミノ酸
配列をコードする遺伝子の転写上流側を連結して、キメ
ラＬ鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖を調製す
ること。

（ｃ）　　工程（ａ）および（ｂ）より得られる各ＤＮ
Ａ鎖を、同一のまたは別々の発現ベクターに、その遺伝
情報が発現可能な状態で挿入して組換え体ＤＮＡを作成
すること。

（ｄ）　　工程（ｃ）より得られる組換え体ＤＮＡによ
って宿主細胞を形質転換して形質転換体を作成すること
。

（ｅ）　　工程（ｄ）より得られる形質転換体を培養し
て培養物中に薬剤耐性癌に対するキメラ抗体を産生させ
ること。

（ｆ）　　必要に応じて、工程（ｅ）で培養物中に産生
されたキメラ抗体を回収すること。

く効　果〉 本発明によるキメラ抗体は多剤耐性を示す癌細胞を選択
的に増殖阻害するか、あるいはその薬物に対する感受性
を高める能力を有しており、且つ定常領域がヒト由来の
Ｃ領域であるために、免疫原性が極めて低い、すなわち
ヒト免疫反応を誘発しにくい、という特長を有している
。

従って、本発明によるキメラ抗体は、副作用が極めて少
なくて選択性の高いかつ多剤耐性を示す癌細胞に対して
有効な薬剤あるいは方法の確立という重要な課題に対す
る優れた解決手段となりうるちのである。

〔発明の詳細な説明〕

くキメラ抗体〉 本発明によるキメラ抗体は、薬剤耐性癌に対するマウス
モノクローナル抗体における可変領域と実質的に相同な
アミノ酸配列を有する可変（Ｖ）領域と、ヒト免疫グロ
ブリンにおける定常（ｃ）領域と実質的に相同なアミノ
酸配列を有する定常領域とからなることを特徴とするも
のであることは前記した通りであり、基本的に免疫グロ
ブリンのＩｇＧに属するもの、すなわち可変領域と定常
領域とからなるそれぞれ相同な２本づつのＨ（重）鎖お
よびＬ（軽）鎖がＳ−３結合でつながった構造を有する
ものである。

ここで、上記可変領域の由来となる薬剤耐性癌に対する
モノクローナル抗体とは、具体的には下記の（イ）〜（
ニ）によって定義される前２ｐ−糖タン白質に対するモ
ノクローナル抗体であり、本発明者らによる特許出願−
特願昭６０２０１４４５号明細書に記載されているもの
である。

（イ）　ヒト骨髄性白血病細胞株に５６２のアドリアマ
イシン耐性株に５６２／ＡＤＭにより免疫されたマウス
から得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させ
て作成したハイブリドーマにより生産されるものである
こと。

（ロ）　アドリアマイシン耐性株を特異的に識別する能
力があること。

（ハ）　アドリアマイシン耐性株の細胞増殖を阻害する
かあるいはその細胞のビンクリスチンまたはアドリアマ
イシンＤに対する感受性を高める能力があること。

（ニ）　　　ＩｇＣ；イソタイプに属するものであるこ
と。

このようなモノクローナル抗体の具体的なものは、イソ
タイプがＩｇＧ２ａであるＭＲＫ１６およびイソタイプ
がＩｇＧ１であるＭＲＫ１７がある。

なお、モノクローナル抗体ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７
を産生するハイプリドーマＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７
は、微工研条寄第２２００号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２２
００）および第２２０１号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２２０
１）として寄託されている。

モノクローナル抗体ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７は、薬
剤耐性ヒト癌細胞に対して選択的な増殖阻害作用ないし
対薬剤感受性増加作用を有する（前記特願昭６０−２０
１４４５号参照）。

モノクローナル抗体ＭＲＫ１６のＨ鎖及びＬ鎖可変領域
のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は第４図
（ａからｂ）および第５図（ａからｂ）に示されている
。

本発明でいう可変領域とは、上記のようなマウスモノク
ローナル抗体の可変領域の他に、可変領域のポリペプチ
ドかマウスモノクローナル抗体としての特異的な抗原結
合能を有する限りこのポリペプチドのアミノ酸配列のい
くつかについて置換、欠失、追加等の修飾のある可変領
域をも包含するものである。

上記定常領域の由来となるヒト免疫グロブリンは、ヒト
の免疫反応によって生し、その構造の基本単位が相同な
２本づつのＨ（重）鎖およびＬ（軽）鎖がＳ−８結合で
つながったポリペプチド分子であると定義されるもので
ある。ヒト免疫グロブリンのＨ鎖の定常領域の遺伝子配
列およびアミノ酸配列は既に発表されている（ＩｇＭ（
６２）、ＩｇＤ　（６Ｂ）、Ｉ　ｇＧｌ（６４）。

Ｉ　ｇ　Ｇ　２（６５）　、ｊ　ｇ　Ｇ　３　（６６）
　、Ｉ　ｇ　Ｇ４（６７）、Ｉ　ｇＥ　（６８）および
ＩｇＡ（６９）参照）。Ｌ鎖（に型）の定常領域の遺伝
子配列およびアミノ酸配列も公知である（７０）。

本発明でいう定常領域とは、このようなヒト免疫グロブ
リンの定常領域の他に、定常領域のポリペプチドがヒト
免疫グロブリンの定常領域としての生理機能（たとえば
補体結合能など）を有する限りこのポリペプチドのアミ
ノ酸配列のいくつかについて置換、欠失、追−加等のあ
る定常領域をも包含するものである。

従って、本発明によるキメラ抗体の例は、マウスモノク
ローナル抗体ＭＲＫ１６における可変領域と実質的に相
同なアミノ酸配列を有する可変領域にヒト免疫グロブリ
ンＩｇＧ１における定常領域と実質的に相同なアミノ酸
配列を有する定常領域を連結させたもの、およびマウス
モノクローナル抗体ＭＲＫ１７における可変領域と実質
的に相同なアミノ酸配列を有する可変領域にヒト免疫グ
ロブリンＩｇＧ１における定常項域と実質的に相同なア
ミノ酸配列を有する定常項域を連結させたものである。

くキメラ抗体の製造〉 本発明によるキメラ抗体の製造法は、下記の工程（ａ）
〜（ｆ）を含むこと、を特徴とするものであることは前
記した通りであり、これによって前述したような本発明
キメラ抗体か作成される。

（ａ）　　薬剤耐性癌に対するマウスモノクローナル抗
体のＨ鎖における可変領域と実質的に相同なアミノ酸配
列をコードする遺伝子の転写下流側に、ヒト免疫グロブ
リンのＨ鎖における定常項域と実質的に相同なアミノ酸
配列をコードする遺伝子の転写上流側を連結して、キメ
ラＨ鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖を調製す
ること。

（ｂ）　　薬剤耐性癌に対するマウスモノクローナル抗
体のＬ鎖における可変領域と実質的に相同なアミノ酸配
列をコードする遺伝子の転写下流側に、ヒト免疫グロブ
リンのＬ鎖における定常領域と実質的に相同なアミノ酸
配列をコードする遺伝子の転写上流側を連結して、キメ
ラＬ鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖を調製す
ること。

（ｃ）　　工程（ａ）および（ｂ）より得られる各ＤＮ
Ａ鎖を、同一のまたは別々の発現ベクターに、その遺伝
情報が発現可能な状態で挿入して組換え体ＤＮＡを作成
すること。

（ｄ）　　工程（ｃ）より得られる組換え体ＤＮＡによ
って宿主細胞を形質転換して形質転換体を作成すること
。

（ｅ）　　工程（ｄ）より得られる形質転換体を培養し
て培養物中に薬剤耐性癌に対するキメラ抗体を産生させ
ること。

（ｆ）　　必要に応じて、工程（ｅ）で培養物中に産生
されたキメラ抗体を回収すること。

本発明キメラ抗体は１、基本的には、マウスモノクロー
ナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖における可変領域をコードす
る遺伝子を、マウス由来の適当な遺伝子源から回収・ク
ローニングおよび適当な制限酵素の使用により取得し、
一方ヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖における定常
項域をコードする遺伝子を、同様にしてヒト由来の適当
な遺伝子源から取得し、上記可変領域および定常領域の
両遺伝子断片をリガーゼによって連結してキメラＨ鎖お
よびＬ＠遺伝子を作成し、この両遺伝子を、別々のまた
は同一の適当な発現ベクターに連結した状態で宿主細胞
に導入して形質転換体を作威し、この形質転換体を培養
することにより製造することができる。

このようなキメラ抗体ないしはキメラタン白質あるいは
組換えタンパク質は、これらの分野において公知の組換
技術に関する文献、たとえばマニアナイス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）等、モレキュラー・クローニング：実験室マニ
ュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−（１９８９）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａ
ｌ、　２ｎｄ　Ｅｄ、　（１９８９）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）など
、を参照して製造することができる。

本発明においては、工程（ａ）と（ｃ）、および（ｂ）
と（ｃ）をそれぞれ別々に実施（すなわちキメラＨ鎖お
よびＬ鎖遺伝子を調製した後にこれらの遺伝子を発現ベ
クターに挿入）してもよいが、より好ましい態様は、工
程（ａ）および（ｂ）において、二つの領域遺伝子のう
ちの一方、たとえばヒト免疫グロブリンの定常領域をコ
ードする遺伝子を工程（ｃ）の発現ベクターにあらかじ
め連結させたものを使用することである。この場合には
工程（ａ）および（ｂ）の段階で組換え体ＤＮＡが構築
されるので、別々の発現ベクターに挿入して組換え体Ｄ
ＮＡを作成する工程（ｃ）は不必要となる。

以下は、本発明によるキメラ抗体の製造法を好ましい態
様に基づいて更に説明するものである。

１）　キメラＨ鎖遺伝子および組換え体ＤＮＡの構築 （ｉ）　　可変領域の遺伝子 可変領域をコードする遺伝子は、具体的にはＰ−糖タン
白質に対するマウスモノクローナル抗体を産生ずる細胞
、たとえば前記モノクローナル抗体ＭＲＫ１６を産生ず
るハイブリドーマＭＲＫ１６およびモノクローナル抗体
ＭＲＫ１７を産生ずるハイブリドーマＭＲＫ１７Ｃいず
れも前記のように寄託されている）の染色体遺伝子のラ
イブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法
、たとえば適当なプローブによるノ＼イブリダイゼーシ
ョン法、により得ることができる。好ましいプローブと
しては、たとえばマーカー遺伝子（マウスＩｇＧのＨ鎖
可変領域中のＪ領域をコードする遺伝子）含有フラグメ
ント（ＪＨプローブ、（２６））があげられる。

（１１）　　定常領域の遺伝子 定常領域をコードする遺伝子は、ヒト胎盤ＤＮＡより遺
伝子ライブラリーを作成し、遺伝子工学の分野で慣用さ
れている方法、たとえば適当なプローブによるハイブリ
ダイゼーション法、により得ることができる。

上記（ｉ）および（ｉｉ）の遺伝子は、必要があれば通
常の核酸合成の方法に従って鎖長の少なくとも一部を化
学合成することもできる。また、これらの遺伝子として
は、縮重コドンにおいてのみ異なるその縮重異性体、の
他に可変領域および定常領域の各領域におけるポリペプ
チドの前記アミノ酸配列の変化（置換、欠失、追加など
）に対応する塩基配列を持つものまたはその異性体であ
ってもよい。

実際に（ｉ）と（ｉｉ）の遺伝子を連結させてキメラＨ
鎖遺伝子を構築する場合、定常領域の遺伝子をあらかじ
め発現ベクターに連結しておいたものを用いると、前記
したように組換え体ＤＮＡの作成のためにより都合がよ
い。

発現ベクターは、そこに含有される所望の遺伝子を宿主
細胞中で発現できるものであればよく、プラスミドの形
態が一般的である。また形質転換細胞選択のためのマー
カー遺伝子（たとえば薬物耐性、栄養要求性などに関す
るもの）を有していることが必要である。

定常領域（ヒト由来）の遺伝子をあらかじめ連結した発
現ベクターの好ましい具体例としては、たとえばヒト由
来Ｃγ１領域を有するｐＳＶ２−ＨＧＩ−ｇｐ　ｔ　（
（２４）参照）があげられる。

遺伝子ライブラリーから適当な制限酵素を使用して得ら
れる（ｉ）の可変領域遺伝子の転写下流側（３′側）に
、（ｉｔ）の遺伝子が連結された発現ベクターの定常領
域遺伝子の転写上流側（５′側）を連結することにより
、キメラＨ鎖遺伝子が構築されると共に組換え体ＤＮＡ
が構築される。

正しい塩基配列を確保するため、必要があれば（ｉ）あ
るいは（ｉｉ）の遺伝子の連結側端部について適当な長
さ分欠失させたり、適当な塩基配列を付加させてもよい
。上記発現ベクターとしてヒト由来Ｃγ１領域を有する
ｐＳＶ２−ＨＧＩ−ｇｐｔを使用し、これにＭＲＫ−１
６由来の可変領域をコードする遺伝子を結合させること
による、キメラ抗体Ｈ鎖のための発現ベクターｐＳＶ２
−ＶＨ１６−ＨＧ１ｇｐｔの作成を第１Ａ図に示した（
後記実験例〔２〕参照）。

発現ベクターは、上記のキメラＨ鎖遺伝子の遺伝情報を
宿主細胞中で発現させるための、すなわちそのＤＮＡを
ｍＲＮＡへ転写させるための適当なプロモーターを有し
ている必要がある。更に大量の抗体を発現させるために
は、エンノ＼ンサーを含むことが必要である。

薬剤耐性癌に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖可
変領域をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡから採取する
ときは、その遺伝子の上流にあるプロモーター及びその
下流にあるエンＩ＼ンサーを含むフラグメントとして切
り出すことができる。このようなフラグメントを用いれ
ば、プロモーター及びエンハンサ−を別途組み、込む必
要がないため便利である。

２）　キメラＬ鎖遺伝子および組換え体ＤＮＡの構築 （ｉ）　　可変領域の遺伝子 可変領域をコードする遺伝子は、具体的には１）で前記
したように、たとえばノ＼イブリドーマＭＲＫ１６およ
びＭＲＫ１７の染色体遺伝子のライブラリーから適当な
プローブによるノ１イブリダイゼーション法により得る
ことができる。好ましいプローブとしてはたとえばマウ
スＪに遺伝子（マウスＩｇＧのに型り鎖の可変領域中の
Ｊ領域をコードする遺伝子）含有フラグメント（Ｊにプ
ローブ、（２５））があげられる。

（ｉｔ）　　定常領域の遺伝子 り鎖の定常領域をコードする遺伝子は、Ｈ鎖の場合と同
様、前記ヒト胎盤染色体遺伝子のライブラリーから得る
ことができる。

上記（ｉ）および（１１）において、１）の可変領域の
場合と同様、この遺伝子の鎖長の少なくとも一部を化学
合成することができ、またこの遺伝子としては縮重異性
体の他、可変領域および定常領域の各領域におけるアミ
ノ酸配列の変化（置換、欠失、追加など）に対応する塩
基配列を持つものまたはその異性体であってもよい。

実際に（ｉ）と（１１）の遺伝子を連結させてキメラＬ
鎖遺伝子を構築するには、キメラＨ鎖遺伝子の場合と同
様、定常領域の遺伝子をあらかじめ発現ベクターに連結
しておいたものを用いると都合がよい。定常領域（ヒト
由来）の遺伝子をあらかじめ連結した発現ベクターの好
ましい具体例としては、たとえばヒト由来Ｃｋ領域を有
するｐＳＶ２−ＨＣ−ｎｅｏ　（（２４）参照）かあに げられる。

遺伝子ライブラリーから適当な制限酵素を使用して得ら
れる（ｉ）の可変領域遺伝子の転写下流側（３′側）に
、（１１）の遺伝子が連結された発現ベクターの定常領
域遺伝子の転写上流側（５′側）を連結することにより
、キメラＬ鎖遺伝子が構築されると共に組換え体ＤＮＡ
が構築される。

正しい塩基配列を確保するため、必要があれば（ｉ）あ
るいは（１１）の遺伝子の連結側端部について適当な長
さ分欠失させたり適当な塩基配列を付加させてもよい。

上記発現ベクターとしてヒト由来Ｃに領域を有するｐＳ
Ｖ２−ＨＣ−ｎｅ。

に を使用し、これにＭＲＫ−１６由来の可変領域をコード
する遺伝子を結合させることによる、キメラ抗体り鎖の
ための発現ベクターｐＳＶ２−Ｖ１６−ＨＣｎｅｏの作
成を第１Ｂ図に示しに　　　　　　　　　　　　に た（後記実験例〔２〕参照）。

発現ベクターは、上記のキメラＬ鎖遺伝子の遺伝情報を
宿主細胞中で発現させるための適当なプロモーターを有
している必要がある。更に大量の抗体を発現させるため
には、エンｌ＼ンサーを含むことが必要である。

薬剤耐性癌に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖可
変領域をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡから採取する
ときは、プロモーター及びエンハンサ−を含むフラグメ
ントとして切り出し、それを使用することが便利である
。またヒトＬ鎖の定常領域をコードする遺伝子の上流に
あるエンハンサ−を使用することもできる。

３）　形質転換 上記のようにして得られるキメラＨ鎖遺伝子およびＬ鎖
遺伝子を一般的な生物工学的手法によって適当な宿主細
胞に導入して形質転換体をつくり、この宿主細胞に両キ
メラ鎖遺伝子の発現産物、すなわち本発明によるキメラ
抗体、をつくらせることができる。

形質転換するための宿主細胞は、大量の抗体を産生させ
る目的のため、Ｂ細胞系腫瘍であるミエローマが好まし
い。この例として、ＮＳ１、Ｐ３Ｕ１、Ｓ　Ｐ　２１０
等、ミエローマ由来であるが、すでに抗体を産生じない
変異株が最も有効である。

上記キメラ鎖遺伝子が挿入された発現ベクターすなわち
組換え体ＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、遺伝子工
学の分野で慣用されている合目的的な任意の方法によっ
て行うことができる。このような方法の好ましい例とし
て、たとえばリン酸カルシウムあるいは塩化カルシウム
を使用するトランスフェクション法、エレクトロポレー
ションによるトランスフェクション法あるいはりポフェ
クション法などがある。

形質転換体は、上記両キメラ鎖遺伝子によって導入され
る新たな形質（すなわちＩｇＧキメラ鎖の産生能）およ
び使用ベクター由来の形質ならびに場合によって生じて
いるかもしれない遺伝子組換時の使用ベクターからの一
部の遺伝情報の欠落を除けば、そのシュツタイブないし
フェノタイプあるいは菌学的性質において使用宿主細胞
と同じである。

４）　キメラ鎖遺伝子の発現／キメラ抗体の産生 上記のようにして得られる形質転換体のクローンを培養
することにより、培養物（細胞内および／または培地）
中にキメラ抗体（ＩｇＧ）が産生される。

形質転換体の培養条件は、使用するもとの宿主細胞の場
合と本質的に変わらない。

５）　キメラ抗体の単離 上記培養物からのキメラ抗体の単離は、タン白質あるい
は抗体の単離に関する常法に従って行うことかできる。

このような方法の好ましい例として、たとえばプロティ
ンＡ−セファロースカラムによるアフィニ゛ティクロマ
トグラフィーを用いる方法がある（文献（３３）参照）
。

−旦作成したキメラ抗体を発現している形質転換株から
このキメラ抗体をコードするｍ−ＲＮＡを常法により分
離精製することができる。このｍＲＮＡから、さらに常
法によりｃＤＮＡを作成し得られたこのキメラ抗体をコ
ードするｃ　ＤＮＡの上流に適当なプロモータ又はエン
ハンサ−領域を組み込むことにより、ミエローマ細胞以
外の宿主細胞、例えば酵母やカイコあるいは植物、でも
このキメラ抗体を発現生産することができる。

後記実験例に示すように、キメラ性のマウス■／ヒトＣ
免疫グロブリン遺伝子を含む発現ベクターをマウスミエ
ローマ細胞にトランスフェクションしたところ、元のハ
イブリドーマ抗体と同じ親和性および結合特異性を有す
る機能性キメラＩｇＧを産生じた。このキメラ抗体は、
マウス抗体よりも免疫原性が遥かに低い。さらに、キメ
ラ抗体のヒトＣ領域は、ヒトエフェクター機能を一層効
果的に実行することができる。

〔実　験　例〕

〔１〕　材料および実験方法 （ａ）ベクター、クローン、プローブおよび細胞：薬剤
耐性癌に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域を
コードする遺伝子源としては、ＭＲＫ１６を産生ずるハ
イブリドーマＭＲＫ１６（Ｆ　Ｅ　ＲＭ−Ｂ　Ｐ　−２
２００）を用いた。

ＥｃｏＲＩて切り出した、マウスモノクローナル抗体の
Ｈ鎖の可変領域を含むサブクローニングベクターとして
λファージλｇｔｌＯ（２２）を用いた。またＢａｍＨ
Ｉで切り出したマウスモノクローナル抗体のＬ鎖の可変
領域を含むサブクローニングベクターとしてλＥＭＢＬ
３　（２３）を用いた。

マウスモノクローナル抗体のＬ鎖の可変領域のプローブ
としては、クローンＩｇ１４６から単離したマウスＪに
遺伝子含有フラグメント（Ｊにプローブ）（２５）を用
いた。マウスモノクローナル抗体のＨ鎖の可変領域のプ
ローブとしては、ＭＥＰ２０３から単離したマウスＪＨ
プローブ（２６）を用いた。

ヒトＩｇＧのＨ鎖の定常領域をコードする遺伝子が連結
されている発現ベクターとしてｐｓＶ２ＨＧ１ｇｐｔを
、またトＩｇＧのＬ鎖の定常領域をコードする遺伝子が
連結されている発現ベクターとし、ｐＳＶ２Ｈ（、ｃｎ
ｅｏ　（２４）を用いた。

発現ベクターの宿主細胞としてＡＴＣＣ（ロツクヴイル
、メリーランド（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　、　ＨＤ）から
人手したマウスミエローマＳ　ｐ　２１０　（Ｓ　ｐ　
２１０−Ａｇ１４）を用いた。

抗体依存性細胞傷害試験に用いたヒト薬剤耐性細胞系（
Ｋ５６２／ＡＤＭおよび２７８０　ＡＤ）とそれらの患
者薬剤感受性細胞系（それぞれに５６２およびＡ２７８
０）は既報の方法で保持した（２７）。

（ｂ）サイズ分画ＤＮＡのクローニング：マウスモノク
ローナル抗体のＨ鎖の可変領域をコードする遺伝子を含
有するフラグメントは、ＥｃｏＲＩで消化したゲノムＤ
ＮＡをＪＨプローブでササンアナリシスして同定した。

Ｌ鎖の可変領域をコードする遺伝子を含有するフラグメ
ントは、ＢａｍＨＩで消化したゲノムＤＮＡをＪにプロ
ーブでササンアナリシスして同定した。これらの遺伝子
は再編成されていることが確認された。

それぞれのフラグメントは、アガロースゲル上で同定さ
れた部分から溶出し、λｇｔｌｏアーム及びλＥＭＢＬ
３と連結してλファージにパッケージングした。

プラークハイブリダイゼーションは、ベントン（Ｂｅｎ
ｔｏｎ）−デービス（Ｄａｖｉｓ　）の方法によって行
った（２つ）。

（ｃ）マウスＳ　ｐ　２１０ミエローマ細胞のＤＮＡト
ランスフェクション： プラスミドｐＳＶ２−ＶＨ１６−ＨＧ１ｇｐｔとｐＳＶ
２−Ｖ／Ｃ１６−Ｈ（、ｃｎｅｏ　（第１図を参照）の
それぞれ２００μｇを、エレクトロポレーション（３０
，３１）によって１０７のマウス５ｐ２１０細胞（ｃＲ
Ｌ１５８１、ＡＴＣＣ）に共トランスフェクションした
。形質転換体は、１０％ウシ胎児血清と０．８ｍｇ／ｍ
１Ｇ４１８　（ギプコ（ＧＩＢＣＯ）　、グランド・ア
イランド、ニューヨーク（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　
ＮＹ　）　）を補足したＲＰＭ４１６４０倍地中で選択
した。増殖培地中のキメラ抗体を、酵素結合イムノソル
ベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ　）法（１６，２７）によ
って検出して、抗体産生細胞を採取した。

ｄ）キメラ抗体の単離： 抗体産生細胞は、プロティンＡ−セファロースＣＬ−４
Ｂ　（ファルマシアＣＰｈａｒｔｘａｃｉａ　）　、ウ
プサラ、スウェーデン）を用いるアフィニティクロマト
グラフィによってプロティンＡ結合ウシ免疫グロブリン
を予め除去した１、０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭ
１１６４０培地で増殖させた（３２）。抗体の精製はプ
ロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂでのアフィニティ
クロマトグラフィを用いて、既報の通りに行った（３３
）。

（ｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　： 変性ゲル電気泳動は、４〜２０％ポリアクリルアミド直
線勾配ゲルを用いて、レムリ（Ｌａｅｓ＊Ｉｉ　）（３
４）の方法によって行い、ゲルは０．０５％クマシーブ
リリアントブルーで染色した。

（ｆ）抗体依存性細胞傷害性試験（＾ｎｔｉｂｏｄｙ−
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｃ
ｙｔｏｌｙｓｌｓ　）　：正常な志願者の末梢血からの
単核細胞をエフェクター細胞源として用いた。標的細胞
は、既報の１ 通りに　Ｃｒで標識した（１７）。１０４個の標識した
標的２７８０ＡＤ細胞を含む細胞懸濁液（１００μｌ）
を、９６ウエルのマイクロカルチャープレートで各種の
濃度のモノクローナル抗体と共に３７℃で３０分間イン
キュベーションした。

次いで、エフェクター単核細胞を含む細胞懸濁液１００
μｌを、それぞれのウェルに加えた。プレートを、加湿
した５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で６時間インキュベー
ションした。溶解しなかった２７８０ＡＤを遠心分離に
より除去した後、上清１００μｍ中の放射能をガンマ−
カウンターで計数した。測定は３回行った。パーセント
比細胞溶解は、次のようにして、試験試料と対照試料の
５１Ｃｒ放出量から算出した。

％化成出量−［（Ｅ−５）／　（Ｍ−Ｓ）コＸ　１００
、但しＥ−実験的放出量（エフェクター細胞と実験抗体
とでインキュベーションした標的細胞がらの上清のｃｐ
ｌ）、Ｓ−自然放出ｆｆ１（培地のみでインキュベーシ
ョンした標的細胞からの上清のｃｐＩｌ）、およびＭ−
最大放出ｊｌ（１％トライトン（Ｔｒｉ　ｔｏｎ）Ｘ−
１００で溶解した標的細胞から放出されたｃｐｓ　　）
　　。

〔２〕　実験例 〔１〕の材料および方法を用いて、以下キメラ抗体の作
成およびその性質の確認試験を行った。

１）キメラ抗体の作成 （ａ）キメラＨ鎖遺伝子の構築： マウスＨ鎖の可変領域遺伝子をＭＲＫ１６産生ハイブリ
ドーマ細胞からＥｃｏＲＩにより３．〇−ｋｂフラグメ
ントとして切り出し、λｇＨＯにサブクローニングした
。これをマウスＪＨプローブとハイブリダイズして同定
した。可変領域遺伝子はＪ３分節（Ｖ−Ｄ−Ｊ）に再編
成していた。このようにして得たマウス可変領域遺伝子
を、キメラＨ鎖遺伝子構築用のＥｃｏＲＩフラグメント
として用いた（第１Ａ図）。マウス可変領域遺伝子を、
同じ転写方向でヒト定常領域の５′部位に連結して、ｐ
ＳＶ２−ＶＨ１６−ＨＧｌｇｐ　ｔを構築した（第１Ａ
図）。

（ｂ）キメラＬ鎖遺伝子の構築： Ｌ鎖の可変領域遺伝子を、ＭＲＫ１６産生ハイブリドー
マのゲノムＤＮＡから１ｌ−ｋｂのＢａｗＨＩフラグメ
ントとして切り出し、λＥ　Ｍ　Ｂ　Ｌ３にサブクロー
ニングした。これをマウスＪ　ブに ローブとハイブリダイズして同定した。可変領域遺伝子
は、１１分節に再編成していた。

＋ ｐ　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ　Ｍ　１３　　（ス
トラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　、う・ホヤ（
Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）　、カルフォルニア）からの多重ク
ローニング部位を切り出して、ｐＳＶ２ＨＣにｎｅｏの
Ｈｉｎｄｍ部位に入れた（第１Ｂ図）。次いで、マウス
可変領域遺伝子を７−ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｘｂ　ａ　Ｉ
　７ラグメントになるようにトリミングして、ｐ　Ｂｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　ＫＭ１Ｂ＋のＢａ５ＨＩ−Ｘｂ
ａ１部位にサブクローニングした。生成するマウス可変
領域の７−ｋｂのフラグメントをＮｏｔＩ／５ａｉｌ消
化によって切断してｐＳＶ２ＨＣにｎｅｏの多重クロー
ニング部位にクローニングした。こうして、マウスＬ鎖
可変領域遺伝子を同じ転写方向でヒト定常領域の５′部
位に連結して、ｐ　５Ｖ２−Ｖｔｃ　１６−ＨＣにｎｅ
ｏを構築した（第１Ｂ図）。

（ｃ）マウスミエローマ細胞の形質転換：Ｓ　Ｐ　２１
０すなわち非生産体マウスミエローマ細胞系をエレクト
ロポレーション法（３０，３１）を用いてキメラＨ鎖お
よびＬ鎖遺伝子により共トランスフェクションした。形
質転換細胞は、Ｇ４１８で選択した。生成する安定な形
質転換体で、エレクトロポレーションの約２週間後に得
られたものをスクリーニングして多剤耐性細胞系に５６
２／ＡＤＭに特異的な抗体を産生ずるクローンを選択し
た。スクリーニングは、陰性コントロールとして親に５
６２細胞（アドリアマイシン感受性株）を用いて酵素結
合イムノツルバントアッセイ法によって行った（１６）
。キメラ抗体を産生ずる２種類の陽性クローンをＩ×１
０７個の細胞から確立した。再クローニングした形質転
換体のうち、より高い産生量のクローンの生成物をＭＨ
１６２と名付け、それを用いて、更に分析を行った。

Ｓ　Ｐ　２１０形質転換体は、十分な量のキメラ抗体を
産生じた（プロティンＡ結合免疫グログリンを取り去っ
た１％血清を補足した培地で５〜１０μｇ／ｍｌ）。キ
メラ抗体（ＭＨ１６２）のに５６２／ＡＤＭ細胞抗原に
対する見掛けの親和性は、酵素結合イムノソルベントア
ッセイ法によって測定したところ、マウス抗体（ＭＲＫ
１６）の親和性と類似していた。

２）キメラ抗体の性質 （ａ）抗体特異性の試験： 抗体（ＭＨ１６２）の特異性を、酵素結合イムノソルベ
ントアッセイ法によって試験した（データは示されてい
ない）。多剤耐性細胞系に５６２／ＡＤＭおよび２７８
０ＡＤは、元のマウスＭＲＫ１６とほぼ同程度にキメラ
抗体に結合した。他方、親の薬剤感受性系に５６２およ
びＡ２７８０は、いずれも結合しなかった。したがって
、このＭＨ１６２はＭＲＫ１６　（１６，３５）と同じ
結合特異性を有している。

（ｂ）キメラ抗体の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析：キメラ抗体
ＭＨ１６２を、プロティンＡ−セファロースを用いた−
段階アフィニティクロマトグラフィによって見掛上均質
になるまで精製した（第２図）。モノクローナル抗体Ｍ
ＲＫ１６（レーン１）とＭＨ１６２（レーン２）のそれ
ぞれ０．５μｇをメルカプトエタノール処理を行って（
Ａ）、または行わずに（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付
した。分子量マーカはアメルシャム（Ａ＋ｇｅｒｓｈａ
ａ）　、日本から人手した。

（ｃ）キメラ抗体による抗体依存性細胞傷害性試験： エフェクターとしてヒト単核細胞を用いる抗体依存性細
胞傷害性試験（ＡＤＣＣ）分析法で、キメラＭＨ１６２
を用いた。第３図は２７８０ＡＤ細胞を抗体１μｇ／ｍ
ｌおよびヒトエフェクター細胞の各種の投与量に暴露し
た実験の知見を示す。キメラＭＨ１６２は、エフェクタ
一対標的細胞の比率が１０＝１でも有意な細胞毒性を生
じるが、マウスＭＲＫ１６モノクローナル抗体のＡＤＣ
Ｃ活性の水準は微々たるものであった。親Ａ２７８０系
からの細胞は、キメラＭＨ１６２またはマウスＭＲＫ１
６によって溶解されなかった（データは示されていない
）。ここでＡＤＣＣは、１μｇ／ｍｌのＭＨ１６２（・
）　、１　ｕ　ｇ／ｍｌ　　ＭＲＫ　１６（ム）を用い
て、またはモノクローナル抗体なしで（■）、材料およ
び方法に記載した通りに行った。測定は３回行なった。

参照文献 （１）　　リオーダン、ジェイ・アール（Ｒｉｏｒｄａ
ｎ、　Ｊ　。

Ｒ，）とリング、ブイ（Ｌｉｎｇ、　Ｖ、）、多剤耐性
の遺伝学的および生化学的特性決定、Ｐａｈｒｇａｃｏ
ｌ　、Ｔｈｅｒ、　。

２Ｂ：　５１−７５．１９１１１５゜ （２）　　ツルオ、ティ（Ｔｓｕｒｕｏ、　Ｔ、　）　
、多剤耐性の機構と治療との関連性、Ｊｐｎ、　Ｊ、　
Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、。

７９：　′２８５−２９８．１９８７゜（３〉　　ロニ
ンソン、アイ、ビー（Ｒｏｎｉｎｓｏｎ、　１．Ｂ、）
（編集）「腫゛瘍細胞の多剤耐性の分子および細胞生物
学」ニューヨーク、ブリューナム・パブリッシング・コ
ーポレーション（ＰｌｅｕｎｕＩＩＰｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇＣｏｒｐ、）　、印刷中、１９８９年。

（４）　　サファ、エイ・アール（Ｓａｆ’ａ、＾、Ｒ
１）、グローバー、シー・ジエイ（Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｃ
，Ｊ、）、メイヤーズ、エム・ビー（Ｍｅｙｅｒｓ、　
Ｍ、Ｂ、）、ビードラ−、ジエイ・エル（Ｂｉｅｄｌｅ
ｒ、　Ｊ、Ｌ、）およびフェルスチット、アール・エル
（Ｆｅｌｓｔｅｄ、　Ｒ，Ｌ、）　、多剤耐性細胞に特
異的な高分子量表面脱糖タン白質のビンブラスチンのフ
ォトアフィニティ標識、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｉ、、２６１　　：　　６１３７−６１４０．１
９８６゜（５）：７−ンウエル、エム・エム（ｃｏｒｎ
ｗｅｌｌ、　Ｍ。

Ｈｌ）、サファ、エイ・アール（Ｓａｆａ、　Ａ、Ｒ，
）、フェルスチット、アール・エル（Ｆｅｌｓｔｅｄ、
　Ｒ，Ｌ、）　、ボッラマン、エム・エム（Ｇｏｔｔｅ
ｓｎ＋ａｎ、　Ｍ、Ｍ、）およびパスタン、アイ（Ｐａ
ｓｔａｎ、　１．）、多剤耐性ヒト癌細胞からの膜小胞
はフォトアフィニティ標識によって検出される特異的な
１５０−から１７０−ｋＤａタン白質を含む、Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ　、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８
３：　３８４７−３８５０．１９８６゜ （６）　　ハ７ダ、エイチ（Ｈａａ＋ａｄａ、Ｈ，）お
よびツルオ、ティー　（Ｔｓｕｒｕｏ、　Ｔ、）、多剤
耐性と関連した１７０−から１８０−キロダルトンの脱
糖タン白質はＡＴＰアーゼである、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　
ｃｈｅｍ、＋　２６３　　：　１４５４−１４５８゜１
９８８゜ （７）ハマダ、エイチ（）Ｉａｎａｄａ、Ｈ，）および
ツルオ、ティー　（Ｔｓｕｒｕｏ、　Ｔ、）、多剤耐性
と関連した１７０−か、ら１８０−キロダルトンの脱糖
タン白質（Ｐ−糖タン白質）のＡＴＰアーゼ活性の特性
決定、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、　　４８：　４９２Ｂ−
４９３２，１９８８゜（８）　　ライリンガム、エム・
シー（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ。

Ｍ、Ｃ，）　、リチェート、エヌ・デ（−（Ｒｉｃｈｅ
ｒｔ。

Ｎ、Ｄ、）コーンウェル、エム−エム（ｃｏｒｎｗｅｌ
ｌ、Ｍ。

Ｘ、〉、ツルオ、ティー　（Ｔｓｕｒｕｏ、　Ｔ、）、
ハマダ、エイチ（ＨａＩｌａｄａ、　Ｈ，）ボッラマン
、エム・エム（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、　Ｍ、Ｍ、）およ
びパスタン、アイ（Ｐａｓｔａｎ、　１．）、多剤耐性
ヒト細胞の原形質膜におけるＰ１７０の免疫細胞化学的
局在化、　Ｊ。

Ｈｉｓｔｏｃｈｅｔ　Ｃｙｔｏｃｈｅｌｌ、、３５：　
１４５１−１４５８．１９８７゜（９）スガワラ、アイ
（Ｓｕｇａｗａｒａ、　１．）、カタオヵ、アイ（Ｋａ
ｔａｏｋａ、　１．）　、モリシタ・ワイ（Ｍｏｒｉｓ
ｈｉ−ｊａ、Ｙ、）　、ハ７ダ、エイチ（Ｈａｍａｄａ
、Ｈ，）およびツル第１テイー　（Ｔｓｕｒｕｏ、　Ｔ
、）、イトヤマ、ニス（Ｉｔｏｙａａ＋ａ、　Ｓ、）お
よびそり、ニス（Ｍｏｒｉ、　Ｓ、）、モノクローナル
抗体、ＭＲＫ１６によって認められる多剤耐性遺伝子に
よってコードされるＰ−糖タン白質の組織分布、Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４８　：　１９２Ｂ−１９２９゜１
９８８゜ （１０）　　ジエン、ディーダブリュ（Ｓｈｅｎ、　Ｄ
−Ｗ、）、フォジョー、エイ（Ｐｏｊｏ、　Ａ、）、ロ
ニンソン、アイ・ビー（Ｒｏｎｉｎｓｏｎ、　１．Ｂ、
）、チン、ジエイ◆イー（ｃｈｉｎ、　Ｊ、Ｅ、）、ソ
フィア、アール（Ｓｏｆ’ｆｉｅｒ、　Ｒ，）、パスタ
ン、アイ（Ｐａｓｔａｎ、　１．）およびボッラマン、
エム・エム（Ｇｏｔｔｅｓｉａｎ、　Ｍ、Ｍ、）　、Ｄ
ＮＡ媒介形質転換体の多剤耐性はヒトｍｄｒｌ遺伝子の
伝達に関係する、Ｎｏｔ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、
　　６　：　４０３９−４０４５゜１９８６゜ （１１）　　グロス、ビー（Ｇｒｏｓ、　Ｐ、）ネリア
、ニー・ビー（Ｎｅｒｌａｈ、　Ｕ、Ｂ、）、クループ
、ジエイ・エム（ｃｒｏｏｐ、　Ｊ、Ｍ、）およびハウ
スマン、デイ−・イー（Ｈｏｕｓｍａｎ、　Ｄ、Ｅ、）
　、多剤耐性を付与する相補的ＤＮＡ　（ｍａ　ｒ）の
単離および発現、Ｎａｔｕｒｅ、　３２３ニア２８−７
３１．１９８６゜ （（２〉　　ウエダ、ケイ（ｌｌｅｄａ、　Ｋ、）、カ
ルダレリ、シー（ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ、　Ｃ，）、ボ
ッラマン、エム・エム（ＧｏｔＬｅｓｍａｎ、　Ｍ、Ｍ
、）およびパスタン、アイ（Ｐａｓｔａｎ、！、）　、
ヒトｍｄｒｌ（Ｐ−糖タン白質）遺伝子の全長ｃＤＮＡ
の発現が多剤耐性を付与する、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．、　ＵＳＡ、８４：　３００４
−３００８．１９８７゜ （１３〉　　ベル、デイ−・アール（Ｂｅ１１．　Ｄ、
Ｒ，）、ゲルラッハ、ジェイ・エイチ（Ｇｅｒｌａｃｈ
、　Ｊ、Ｈ，）　、カートナー、エヌ（Ｋａｒｔｎｅｒ
、　Ｎ、）　、ブイヒ、アール・エヌ（Ｂｕｉｃｈ、　
Ｒ，Ｎ、）及びリング、ケイ（Ｌｉｎｇ、　Ｖ、）、卵
巣癌におけるＰ−糖タン白質の検出：多剤耐性に関連し
た分子マーカー、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、０ｎｃｏ１．、　３
　：ａｌｌ−３１５，１９８５゜ （１４〉　　フォジオー、エイ・ティー（Ｐｏｊｏ、　
Ａ、Ｔ、）、ウエダ、ケイ（Ｕｅｄａ、　Ｋ、）、スラ
モン、デイ−・ジェイ（Ｓｌａｍｏｎ、　Ｄ、Ｊ、）、
ボブラック、デイ−・ジー（Ｐｏｐｌａｅｋ、　Ｄ、Ｇ
、）　、ボッラマン、エム・エム（Ｇｏｔｔｅｓｓａｎ
、　Ｍ、Ｍ、）およびパスタン、アイ（Ｐａｓｔａｎ、
１．）　、ヒト腫瘍および組織における多剤耐性遺伝子
の発現、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、ＵＳＡ。

８４　：　２６５−２６９．１９８７゜（１５〉　　ツ
ルオ、ティー（Ｔｕｒｕｏ、　Ｔ、）　、スギモト、ワ
イ（Ｓｕｇｌｍｏｔｏ、　Ｙ、）、ハマダ、エイチ（Ｈ
ａｗａｄａ。

Ｈｏ）、ロニンソン、アイ（Ｒｏｎｉｎｓｏｎ、　１．
）、オフムラ、エム（Ｏｋｕｍｕｒａ、　Ｍ、）　、ア
ダナ、ケイ（Ａｄａｔｈｉ　。

Ｋ、〉、モリシマ、ワイ（Ｍｏｒｉｓｈｉ＊ａ、　Ｙ、
）およびオーツ、アール（Ｏｈｎｏ、　Ｒ，）、ヒト白
血病細胞での多剤耐性マーカー、Ｐ−糖タン白質および
ｍｄｒｌｍＲＮＡの検出、Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅ
ｒ　　Ｒｅｓ、　　７８：１４１５−１４１９．１９８
７゜ （１Ｇ）　　ハ７ダ、エイチ（Ｈａａ＋ａｄａ、Ｈ，）
　、ツルオ、ティー（Ｔｕｒｕｏ、　Ｔ、）　、モノク
ローナル抗体によって示される薬物耐性腫瘍細胞に特異
的な１７０−から１８０−ｋＤａの糖タン白質の機能的
役割、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３：　’７７８５−７
７８９．１９８８゜（１７）　　ツルオ、テ４−（Ｔｕ
ｒｕｏ、　Ｔ、）　、ハ７ダ、エイチＣＨａｔｓａｄａ
、Ｉ１．）　、サトー、ニス（Ｓａｔｏ、　Ｓ、）およ
びヘイケ、ワイ（Ｉ（ｅｉｋｅ、　Ｙ、）　、抗−Ｐ−
糖タン白質モノクローナル抗体による無胸腺マウスにお
ける多剤耐性ヒト腫瘍の増殖の阻止、Ｊｐｎ、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、８０：　６２７−６３１．１
９８９゜（１８）　　ミーカー・ティー・シー（Ｍｅｅ
ｋｅｒ、　Ｔ、Ｃ，）、ロウジー、ジエイ（Ｌｏｖｄｅ
ｒ、　Ｊ、）７０ネイ、デイ−・ジー（Ｍａｌｏｎｅｙ
、　Ｄ、Ｇ、）　、ミラー、アール・エイ（Ｍｉｌｌｅ
ｒ、　Ｒ，Ａ、）、ティールマンス、ケイ（Ｔｈｉｅｌ
ｅ−ｓａｎｓ、　Ｋ、）　、ワーンケ・アール（ｗａｒ
ｎｋｅ、　Ｒ，）およびレビー、アール（Ｌｅｖｙ、　
Ｒ，）、Ｂ細胞腫の抗イデイオタイプ療法の臨床的試用
、Ｂｌｏｏｄ、　６５　：　１３４９−１３６３．１９
８５゜ （１９）　　ミラー、アール−エイ（Ｍｉｌｌｅｒ、　
Ｒ，Ａ、）、ロウター、ジエイ（Ｌｏｖｄｅｒ、　Ｊ、
）、ミーカー・ティー・シー（Ｍｅｅｋｅｒ、　Ｔ、Ｃ
，）、ブラウン、ニス（Ｂｒｏｗｎ。

Ｓ、）およびレビー、アール（Ｌａｖｙ、　Ｒ，）、Ｂ
−細胞腫瘍治療における抗−イディオタイプ、Ｎａｔ　
Ｉ　。

Ｃａｎｃｅｒ　１ｎｓｔ、　Ｍｏｎｏｇｒ、、　　３　
：　１３１−１３４．１９８７　。

（２０）　　マルクス、ジェイーエル（Ｍａｒｘ、　Ｊ
、Ｌ、）、作成抗体ニ一部がマウスで一部がヒトのキメ
ラ抗体はモノクローナル抗体の治療への使用を妨げる問
題を解決することができる、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９
　：　４５５−４５８．１９８７゜ （２１〉　　モリソン、ニス・エル（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ
、　Ｓ、Ｌ、）およびオイ、ブイ・ティー（Ｏｆ、　Ｖ
、Ｔ、）、遺伝子工学的に得られた抗体分子、＾ｄｖ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　４４：６５−９２．　１９８９゜ （２２）　　ヒューン、テ（”ブイ（Ｈｕｙｎｈ、　Ｔ
、Ｖ、）　、ヤング、アール・エイ（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ
，Ａ、）およびデイビス、アール・ダブリｘ（Ｄａｖｉ
ｓ、　Ｒ，ν、）、λｇｔｌｏおよびλｇｔｌｌにおけ
るｃＤＮＡライブラリーの作成とスクリーニング、グロ
ーμ、デイ−・エム（Ｇｌｏｂｅｒ、　Ｄ、Ｍ、）編集
ｒＤＮＡクローニング」１巻、４９−７８頁、オックス
フォード、アイ・アール・エル・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒ
ｅｓｓ）　、１９８５年。

（２３）　　フリラシャラフ、エイ（Ｆｒｉｓｃｈａｕ
ｆ’、　Ａ、）、レーラッハ、エイチ（Ｌｅｈｒａｃｈ
、　！（、）　、ポウスト力、エイ（Ｐｏｕｓｔｋａ、
　Ａ、）およびムレイ、エフ（Ｈｕｒｒａｙ。

Ｎ、）、ポリリンカー配列を有するラムダ−置換ベクタ
ー、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１７０　：　８２７
−８４２．１９８３゜（２４）　　カメヤマ、ケイ（Ｋ
ａｍｅｙａｉａ、　Ｋ、）、イマイ１ケイ（Ｉｍａｌ、
　Ｋ、）、イト−、ティー　（ｌｔｏｈ、　Ｔ、）、タ
ニグチ、エム（Ｔａｒ＋ｆｇｕｃｈｉ、　Ｍ、）　ミウ
ラ、ケイ（ＭｉｕｒａＫ、）およびクロサワ、ブイ（Ｋ
ｕｒｏｓａｗａ、　Ｙ、）、キメラマウス／ヒト抗体の
作成用の好都合なプラスミドベクター、ＦＥＢＳ　Ｌｅ
ｔｔ　、　２４４（２）、　３０１−３０［１（１９８
９）。

（２５〉　　サカノ、エイチ（Ｓａｋａｎｏ、　Ｈ，）
、ヒュツビーケイ（Ｈｕｅｐｐｉ、　Ｋ、）、ハイリツ
ヒ、ジー（Ｈｅｉｒｉｃｈ。

Ｇ、）およびトネガワ、ニス（Ｔｏｎｅｇａｖａ、　Ｓ
、）、免疫グロブリン軽鎖遺伝子の体細胞組換え部位に
おける配列、Ｎａｔｕｒｅ、　２８０：　２８８−２９
４．１９７９゜（２６）　　レーダー、ダヴリュ（Ｒｏ
ｅｄｅｒ、　Ｗ、）、マキ、アール（ＭａｋＬ　Ｒ，）
、トララネツカ−、エイ（Ｔｒａｕ−ｎｅｃｋｅｒ、　
Ａ、）およびトネガワ、ニス（Ｔｏｎｅｇａｗａ。

Ｓ、）　、４個のγサブクラス重鎮遺伝子の結合、Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、
　７８．４７４−４７８゜１９８１　。

（２７）　　ハ、ダ、エイチ（Ｈａｍａｄａ、　Ｈ，）
、オコチ、イー（Ｏｋｏｃｈｉ、　Ｅ、）、オーハラ、
ティー　（Ｏｈ−ｈａｒａ、　Ｔ、）およびツルオ、テ
ィー（Ｔｕｒｕｏ、　Ｔ、）　、多剤耐性と関連するＭ
　ｒ　２２．０００のカルシウム結合タン白質（ツルシ
ン）の精製およびモノクローナル抗体によるその検出、
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４ｇ：　３１７３−３１７８
．１９Ｈ０（２８〉　　ササン、イー（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ、　Ｅ、）、ゲル電気泳動によって分離されるＤＮＡ
フラグメント中の特異的配列の検出、Ｊ、　Ｍｏ１．　
Ｂｉｏｌ、、９８：　５０３−５１７゜１９７５゜ （２９〉　　ベントン、ダブリュ・デイ−（Ｂｅｎｔｏ
ｎ、　’ｄ。

Ｄ、）およびデイビス、アール・ダブリュ（Ｄａｖｉｓ
。

Ｒ，Ｗ、）　、単一プラークに対するｉｎ　５ｉｔｕハ
イブリダイゼーシヨンによるλｇｔ組換えクローンのス
クリーニング、５ｃｉｅｎｃｅ、　１９６：　１８０−
１８２．１９７７゜（３０）　　ボッター、エイチ（Ｐ
ｏｔｔｅｒ、　Ｈ，）、ワイア、エル（Ｗｅｉｒ、　Ｌ
、）およびレーダー、ピー（Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、）エレ
クトロポーレーションによってマウスブレーＢリンパ細
胞に導入されたヒト免疫グロブリン遺伝子のエンハンサ
−依存性発現、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＩＪＳＡ、　８１：　７１８１
−７１８５．１９８４゜（３１）　　）ネグゾ、エフ（
Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ、　Ｆ、）　、ヘイデイ、エイ・シ
ー（Ｈａｙｄａｙ、　Ａ、Ｃ，）およびキーティング、
エイ（Ｋｅａｔｉｎｇ、　Ａ、）　、電場によって媒介
されるＤＮＡ移人：ヒトおよびマウスのリンパ性細胞に
おける過度および安定遺伝子の発現、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ
。

Ｂｉｏｌ、、　６：　７０３−７０６．１９８６゜（３
２）　　アンダーウッド、ビー・エイ（υｎｄｅｒｗｏ
ｏｄ。

Ｐ、Ａ、）　、プロティンＡを用いるハイブリドーマ培
養における血清からウシ免疫グロブリンの除去、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｓｏｌ、、　　１２１　　：　　
３０１−３０６．　１９８８　　。

（３３）　　ゴーディング、ジエイ・ダブリュ（Ｇｏｄ
　ｉ　ｎｇ。

Ｊ、Ｗ、）　、モノクローナル抗体：原理と実施、ニュ
ーヨーク、アカデミツク・プレス（ＡｃａｄｅＩＩｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）、１９８３年。

〈３４〉　　レムリ、ニー・ケイ（Ｌａｅｍｏ＋ｌｉ、
　Ｕ、に、）　、バクテリオファージＴ４のヘッドの会
合中の構造タン白質の開裂、Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：
　［０−８８５，１９７０゜（３５）ハマダ、エイチ（
ＨａＩＩｌａｄａ、　Ｈ，）およびツルオ、ティー（Ｔ
ｕｒｕｏ、　Ｔ、）　、Ｐ−糖タン白質に対スルモノク
ローナル抗体による多剤耐性細胞の増殖の阻止、アイ・
ビー・ロニンソン（１，Ｂ、　Ｒｏｎｉｎｓｏｎ）編集
、腫瘍細胞の多剤耐性の分子および細胞生物学、ニュー
ヨーク、プレナム・パブリッシング・コーポレーション
（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、）
印刷中、１９８９年。

（３Ｂ）　　レビー、アール・エル（Ｌｅｖｙ、　Ｒ，
Ｌ、）およびミラー、アール・エイ（Ｘｉ　Ｉ　ｌｅｒ
、Ｉ？、Ａ、）、リンパ細胞ハイブリドーマの生物学的
および臨床的関係：モノクローナル抗体を用いる腫瘍の
治療、Ａｎｎｕ。

Ｒｅｖ、Ｍｅｄ、３４．１０７−１ｉＢ、　１９８３゜
（３７）　　ミラー、アール・エイ（Ｍｉｌｌｅｒ、　
Ｒ，Ａ、）、マロネイ、デイ−・ジー（Ｍａｌｏｎｅｙ
、　Ｄ、Ｇ、）　、’７−ンケ・アール（Ｗａｒｎｋｅ
、　Ｒ，）およびレビー、アール（Ｌｅｖｙ、　Ｒ，）
、モノクローナル抗イデイオタイプ抗体を用いたＢ細胞
リンパ腫の治療、Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ。

Ｍｅｄ、、　３０８　：　５１７−５２２．１９８２゜
（３８）バーリン、デイ−（Ｈｅｒｌｙｎ、　Ｄ、）お
よびコブロウスキー、エイチ（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、Ｈ
，）、１ｇＧ２ａモノクローナル抗体はエフェクター細
胞との相互作用によりヒト腫瘍の増殖を阻止する、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＬＩＳＡ、　７９：　４７６１
−４７６５．１９８２゜（３９〉マスイ、エイチ（Ｍａ
ｓｕｉ、　Ｈ，）　、カワモト、ティー（Ｋａｖａｍｏ
ｔｏ、　Ｔ、）、サン、ジェイ・ティ（Ｓａｔａ、　Ｊ
、Ｄ、）、ウォルフ、ビー（Ｗｏｌｆ、　Ｂ、）サト、
ジー（Ｓａｔｏ、　Ｇ、）およびメンデルゾーン、ジエ
イ（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、　Ｊ、）、抗−表皮増殖因
子レセプターモノクローナル抗体による無胸腺マウスに
おけるヒト腫瘍細胞の増殖阻止、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ
、、　　４４　：１００２−１００７．１９８４゜ （４０）　　ソープ、ビー・イー（Ｔｈｏｒｐｅ、　Ｐ
、Ｅ、）、ブラウン、エイ・エフ（Ｂｒｏｗｎ、　Ａ、
Ｎ、）　、ブレンマージエイ・エイ（ＢｒｅＩｌｌｆｆ
ｌｅｒ、　Ｊ、Ａ、）　、フォックスウェル、ビ・エム
（Ｆｏｘｗｅｌｌ、　Ｂ、Ｍ、）およびスターブ、エフ
（Ｓｔｉｒｐｅ、　Ｐ、）、モノクローナル抗−”ｒｈ
ｙｌ、１抗体と５ａｐａｎａｒｊａ　ｏｒｆ’１ｅｉｎ
ａｌｊｓからのリポソーム不活性化タン白質とから成る
免疫毒素：生体外および生体内での強力な抗腫瘍効果、
ＪＮＣＩ。

７５：　１５１−１５９．１９８５゜ （４１）バスタン、アイ（ＰａｓＬａｎ、　Ｉ）　、ラ
イリンガム、エム・シー（ＷＮＩｉｎｇｈａａ＋、　Ｍ
、Ｃ，）およびフィッツジエラルド、デイ−・ジェイ・
ビー（Ｆｉｔｚ−Ｇｅｒａｌｄ、　Ｄ、Ｊ、Ｐ、）　、
免疫毒素、Ｃｅ１ｉ、　４７：　６４１−６４８、１９
８６゜ 〈４２〉　　フィッッジェラルド、デイ−・ジェイ（Ｆ
ｉｔｚ　Ｇｅｒａｌｄ、　Ｄ、Ｊ、）　、ライリンガム
、エム・シー（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｎ＋、　Ｍ、Ｃ，）
、カーダレリ、シー・オー（ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ、　
Ｃ，０，）、ハマダ、エイチ（Ｈａｍａｄａ。

Ｈ９〉、ツルオ、テ（−（Ｔｕｒｕｏ、　Ｔ、）ボッラ
マン、エム・エム（Ｇｏｔｔｅｓａａｎ、　Ｍ、Ｍ、）
およびバスタン、アイ（Ｐａｓｔａｎ、１．）　、多剤
耐性細胞を特異的に殺すモノクローナル抗体−Ｐｓｃｕ
ｒＪｏｔｎｏｎａｓ毒素抱合体、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、ＵＳＡ、８４：　４２８８−
７２９２．１９８７゜ （４３）　　カイザー、エイチ（Ｋａｉｚｃｒ、　Ｈ，
）、レピーアール（Ｌｅｖｙ、　Ｒ，）およびサントス
、ジー（ＳａｎｔＯＳ。

Ｇ、）　、Ｔ細胞腫瘍における自己骨髄移植：腫瘍細胞
の除去のための緩解骨髄の生体外でのモノクローナル抗
体処理の使用、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｉ、、
増補６、Ｎｏ、０１１４号、４１頁、１９８２年。

（４４）　　ホートン、エイ・エフ（Ｈｏｕｇｈ　ｔｏ
ｎ　、＾、Ｎ、〉、ミノツアー１デイ−（Ｍｉｎｔｚｅ
ｒ、　Ｄ、）　、：７−トンーカルド、シー（ｃｏｒｄ
ｏｎ−Ｃａｒｄｏ、　Ｃ，）、ヴエルト、ニス（ｗｅｌ
ｔ、　Ｓ、）、フリーゲル、ビー（Ｐｌｉｅｇｅｌ、　
Ｂ、）、ヴアーダン、ニス（Ｖａｄｈａｎ、　Ｓ、）、
カールスウェル、イー（ｃａｒｓｖｅｌｌ、　Ｅ、）、
メラメド、エム・アール（Ｍｅｌａａ＋ｅｄ、　Ｍ、Ｒ
，）　、ｓ−ットゲン、エイチー、１１７（Ｏｅｔｔｇ
ｅｎ、　Ｈ，Ｐ、）およびオールド、エル・ジエイ（Ｏ
ｌｄ、　Ｌ、Ｊ、）　、ＧＤ３ガングリオシドを検出す
るマウスモノクローナルＩｇＧ’３抗体：悪性ミエロー
マの患者での第１相試用、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ　　、ＵＳＡ、８２：　　１２４２−１２４［ｉ
、１９８５　。

（４５）　　ラリツク、ジエイ・ダブリュ（Ｌａｒｒｉ
ｃｋ、　Ｊ。

Ｗ、）およびブック、デイ−・ダブリュ（Ｂｕｃｋ、　
Ｄ。

Ｖ、〉、ヒトモノクローナル抗体産生の実施態様、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　２　：　Ｌ　１９８４゜（
４６）モリマン、ニス・エル（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ
、Ｌ、）、トランスフエフトーマは新規なキメラ抗体を
生じる、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９：　１２０２．１９
８５゜（４７〉　　ステプリュスキー、ゼット（Ｓｔｅ
ｐｌｅｖｓｋｉ　。

２、）、サン、エル・ケイ（Ｓｕｎ、　Ｌ、に−）　、
シェアマン、シー・ダブリュ（Ｓｈｅａｒｍａｎ、　Ｃ
，Ｗ、）、グレイニブ、ジエイ・ダドッナ・ビー（Ｇｈ
ｒａｙｅｂ・Ｊ。

ＤａｄｄＱＪｌａ、　Ｐ、）およびコブロウスキー、エ
イチ（Ｋｏｐｒｏｖｓｋｉ　、Ｈ，）、抗腫瘍特異性を
有するヒト−マウスＩｇＧ１．１ｇＧ２．１ｇＧ３およ
びＩｇＧ４キメラモノクローナル抗体の生物活性、Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、ＵＳＡ、　８５：
　４８５２−４８５６．１９８８゜（４８）モリマン、
ニス・エル（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ、Ｌ、）、ジョン
ソン、エム・ジエイ（Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｍ、Ｊ、）　
、ヘルツエンバーブ、エル・エイ（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒ
ｇ、　Ｌ、＾、〉およびオイ、つ′イ・ティー（Ｏｉ、
　Ｖ、Ｔ、）、キメラヒト抗体分子：ヒト不変頭載ドメ
インを有するマウス抗原結合ドメイン、Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８１：　８８５１−６８５５．１９８４゜（４
９）　　ブリアン、ジー・エル（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ、
　Ｇ、Ｌ、）、ホズミ、エフ（Ｈｏｚｕｍｉ、　Ｎ、）
およびジュールマン、エム・ジエイ（Ｓｈｕｌ餠ａｎ、
　Ｍ、Ｊ、）　、機能性キメラマウス／ヒト抗体の産生
、Ｎａｔｕｒｅ、　３１２：　８４３−８４６゜１９８
４゜ （５０）　　ノイバーガー、エム・ニス（Ｎｃｕｂｅｒ
ｇｅｒ、　Ｍ。

Ｓ、〉、ウィリアムス、ジー◆ティー（ＷｉｌｌｉａＩ
ｌｓ。

Ｇ、Ｔ、）　、ミッチェル、イー−ビー（Ｍｉｔｃｈｅ
ｌｌ、　Ｅ。

Ｂ、）、ジヨウハル、ニス・ニス（Ｊｏｕｈａｌ、　Ｓ
、Ｓ、）フラナガン、ジェイ・ジー（Ｆｌａｎａｇａｎ
、　Ｊ、Ｇ、）およびラビッツ、ティー・エイチ（Ｒａ
ｂｂｉＬｔｓ、　Ｔ、Ｈ，）、ヒト生理学的エフェクタ
ー機能を有するノ＼ブテンー特異的キメラＩｇＥ抗体、
Ｎａｔｕｒｅ、　３１４：　２６８−２７０１９８５゜ （５１）　　サバガン、ビー・ジー（Ｓａｈａｇａｎ、
　Ｂ、Ｇ、）、ドライ、エイチ（Ｄｏｒａｊ、　Ｉｌ、
）　、ザルツガーバーミュージー、ジエイ（Ｓａｌｚｇ
ａｂｅｒ−Ｍｕｌ　Ｉｅｒ、Ｊ、）、トネグツツオ、エ
フ（Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ、　Ｆ、）　、ギントン、シー
・エイ（Ｇｕｉｄｏｎ、　Ｃ，Ａ、）、リリー、ニス・
ビー（Ｌｉｌｌｙ、　Ｓ、Ｐ、）　、マクドナルド、ケ
イ・ダブリュ（ＭｃＤｏｎａｌｄ、　Ｋ、ν、）、モリ
セイ、デイ−・ケイー（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、　Ｄ、Ｖ
、）　、ストーン、ビー◆エイ（Ｓｔｏｎｅ、　Ｂ、Ａ
、）　、デイヴイス、ジー・エル（Ｄａｖｉｓ、　Ｇ、
Ｌ、）　、７　ツキントツシュ、ビー・ケイ（Ｍｃｌｎ
ｔｏｓｈ、　Ｐ、に、）およびムーア、ジー・ビー（Ｍ
ｏｏｒｅ、　Ｇ、Ｐ、）　、遺伝子工学的に作成された
ネズミ／ヒトキメラ抗体はヒト腫瘍に関連した抗原の特
異性を保持する、Ｊ、　１ａｎｕｎｏ１．、１３７　：
　１０ＢＧ−１０７４，１９８８０ （５２）　　サン、エル・ケイ（Ｓｕｎ、　Ｌ、に、）
　、カーチス、ビー（ｃｕｒｔｉｓ、　Ｐ、）、ラコケ
イツツーシュルクツインスカ、イー（Ｒａｋｏｖｊｃｚ
−８ｚｕｌｃｚｙｎｓｋａ、　Ｅ、）、グレイニブ、ジ
エイ（Ｇｈｒａｙｅｂ、　Ｊ、）　、チャン、エフ（ｃ
ｈａｎｇ、　Ｎ、）　、モリマン、ニス・エル（Ｍｏｒ
ｒｊｓｏｎ。

Ｓ、Ｌ、）およびコブロウスキー、エイチ（Ｋｏｐｒｏ
−ｖｓｋｌ、Ｈ，）、ヒト不変領域とマウス可変領域を
有する腫瘍関連抗原１７−ＩＡに対するキメラ抗体、Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、ＵＳＡ
、　８４：　２１４−２１８゜１９８７゜ （５３）　　、ニジムラ、ブイ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、
　Ｙ、）　、ヨコヤマ、エム（Ｙｏｋｏｙａｌｌｌａ、
　Ｍ、）、アラキ、ケイ（Ａｒａｋｉ。

Ｋ、）、ウエダ、アール（Ｕｅｄａ、　Ｒ，）、クドー
、エイ（Ｋｕｄｏ、　Ａ、）、ワタナベ、テ（−（Ｗａ
ｔａｎａｂｅ、　Ｔ、）、通常の急性リンパ細胞性白血
病抗原に特異的な組換えヒト−マウスキメラモノクロー
ナル抗体、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、　４７：　９９９−
１００５．１９８７゜（５４）　　リウ、エイ・ブイ（
Ｌｉｕ、　Ａ、Ｙ、）　、ロビンソン、アール・アール
（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｒ，Ｒ，）、ムレイ、イー・デ
イ−（Ｈｕｒｒａｙ、　Ｅ、Ｄ、）、レドベッター、ジ
ェイ・エイ（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ、　Ｊ、Ａ、）　、ヘ
ルシュトレーム、アイ（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｅａ、　１．
）およびヘルシュトレーム、ケイ・イー（Ｈｅｌｌｓｔ
ｒｏｅｍ、　Ｋ、Ｅ、）、強力なＦｃ−依存性生物活性
を有するＣＤ２０に対するマウス−ヒトキメラモノクロ
ーナル抗体、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３９　：　３５２１−３５２８．１９８７゜（５５）
　　リウ、エイ・ブイ（Ｌｉｕ、　Ａ、Ｙ、）　、ｏビ
ンソン、アール・アール（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｒ，Ｒ
，）、ヘルシュトレーム、ケイ・イー（Ｈｅｌｌｓｔｒ
ｏｅｍ、　Ｋ、Ｅ、）、ムレイ、イー・デイ−（Ｍｕｒ
ｒａｙ、Ｅ、Ｄ、）、チャン、シー・ビー（ｃｈａｎｇ
、　Ｃ，Ｐ、）およびヘルシュトレーム、アイ（Ｈｅｌ
ｌｓｔｒｏｅＩｌ、　１．）、癌細胞の溶解を媒介する
ことかできるキメラマウス−ヒト１ｇＧ１抗体、Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ　、ＬＩＳＡ、
　８４：　３４３９−３４４３゜１９８７゜ （５６）　　ロブグリオ、エイ・エフ（ＬｏＢｕｇｌｉ
ｏ、　Ａ、Ｆ、）、ホイージー、アール・エイチ（Ｗｈ
ｅｅｌｅｒ、　Ｒ，Ｈ，）　トラング、ジェイ（Ｔｒａ
ｎｇ、　Ｊ、）・ヘイネス・エイ（Ｈａｙｎｅｓ、　Ａ
、）、ロジャーズ、ケイ（Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｋ、）、ハ
ーヴ工−、イー・ビー（Ｈａｒｖｅｙ、　Ｅ、Ｂ、）、
サン、エル（Ｓｕｎ、　Ｌ、）　、グレイニブ、ジエイ
（Ｇｈｒａｙｅｂ。

Ｊ、）およびカザエリ、エム・ビー（Ｋｈａｚａｅ　ｌ
　ｉ　。

Ｍ、Ｂ、）　、ヒトにおけるマウス／ヒトキメラモノク
ローナル抗体：速度論と免疫反応、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　　　ＵＳＡ、　８６　：　４２
２０−４２２４．１９８９゜（５７〉　　シーバウト、
エフ（Ｔｈｉｅｂａｕｔ、　Ｆ、）、ツルオ、ティー（
Ｔｕｒｕｏ、　Ｔ、）　、ハマダ、エイチ（Ｈａｍａｄ
ａ。

Ｈｌ）、ボッラマン、エム・エム（ＧｏＬｔｅｓｍａｎ
、　Ｍ。

−、）、バスタン、アイ（Ｐａｓｔａｎ、　１．）およ
びライリンガム、エム・シー（ＷｉｌｌｔｎｇｈａＩＩ
ｌ、　Ｍ、Ｃ，）、正常なヒト組織における多剤耐性遺
伝子生成物であるＰ−糖タン白質の細胞内での局在化、
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８４　：　７７３５−
７７３８．１９８７゜（５８）　　スガワラ、アイ（Ｓ
ｕｇａｖａｒａ、　１．）Ｓデカハラ１エム（Ｎａｋａ
ｈａｒａ、　Ｍ、）、ハマダ、エイチ（Ｈａｉａｄａ。

Ｈ，）　、ツルオ、ティー　（Ｔｕｒｕｏ、　Ｔ、）お
よびモリ、ニス（Ｍｏｒｉ、　Ｓ、）、Ｍ　ｒ　１７０
，０００〜１８０．０００のＰ−糖タン白質のヒト副腎
髄質におけるよりもヒト副腎皮質において明らかで一層
強力な発現、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、　４８：　４６１
１−４６１４．１９８８゜（５９）　　コードンーカル
ド、シー（ｃａｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ。

Ｃ１）、オブリエン、ジエイ・ビー（０’　Ｂｒ１ｅｎ
、　Ｊ。

Ｐ、）、カザルス、デイ−（ｃａｓａｌｓ、　Ｄ、）、
リッツマンーグラウアー、エル（Ｒｉｔｔｓａｎ−Ｃｒ
ａｕｅｒ、　Ｌ、）、ビードラ−、ジエイ・エル（Ｂｉ
ｅｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｌ、）　、メラメド、エム・アール
（Ｍｅｌａｓｅｄ、　Ｍ、Ｒ，）およびベルチノ、ジェ
イ・アール（Ｂｅｒｔｉｎｏ、　Ｊ、Ｒ，）　、多剤耐
性遺伝子（Ｐ−糖タン白質）は血演−脳関門部位での内
皮細胞によって発現される、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８８：　６９５−６９Ｌ
　１９８９゜（６０〉　　シーバウト、エフ（Ｔｈｉｅ
ｂａｕｔ、　Ｆ、）、ツルオ、ティー（Ｔｕｒｕｏ、　
Ｔ、）　、ハマダ、エイチ（Ｈａｍａｄａ。

Ｈｌ〉、ボッラマン、エム・エム（Ｇｏｔｔｅｓａ＋ａ
ｎ、　Ｍ。

Ｈｌ）、パスタン、アイ（Ｐａｓｔａｎ、　１．）およ
びライリンガム、エム・シー（ＷｉｌｌｉｎｇｈａＩｌ
ｌ、　Ｍ、Ｃ，）、多剤輻送タン白質Ｐ１７０の様々な
エピトープの正常組織における免疫組織化学的局在化：
脳毛細血管中の局在化の証拠および１種類の抗体と筋肉
タン白質との交差反応性、Ｊ、　ｌ１ｉｓｔｏｃｈｅａ
、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、　３７　：１５９−１６４．１
９８９゜ （６１）　　ヤング、シー−ビー・エイチ（Ｙａｎｇ、
　Ｃ−Ｐ。

Ｈｏ〉、デピンホ、ニス・ジー（ＤｅＰｉｎｈｏ、　Ｓ
、Ｇ、）、グリーンバーガー、エル・エム（Ｇｒｅｅｎ
ｂｅｒｇｅｒ。

Ｌ、Ｍ、）アルセキ、アール・ジェイ（Ａｒｃｅｃｉ、
　Ｒ，Ｊ、）、およびホルウィッツ・ニス・ビー（Ｈｏ
ｒｗｉｔｚ、Ｓ、Ｂ、）、プロゲステロンは多剤耐性細
胞および妊娠子宮の子宮内膜のＰ−糖タン白質と相互作
用する、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、２６４：　　７８２−７８８．
１９８９゜（６２）　　ワード、シー・ジエイ（Ｗｏｒ
ｄ、　Ｃ，Ｊ、）、ホワイト、エム・ビー（Ｗｈｉｔｅ
、　Ｍ、　Ｂ、）　、クツイール、ダプリュ・エイ（Ｋ
ｕｚ４ｅ１．　Ｗ、　Ａ、　）　、ジエン、エイ・エル
（Ｓｈｅｎ、　Ａ、　Ｌ、）、ブラットナー・エフ・ア
ール（Ｂｌａｔｔｎｅｒ、　Ｆ、　Ｒ）およびタッカ−
、ビー・ダブリュ（Ｔｕｃｋｅｒ、　Ｐ、　Ｗ、　）　
、ヒト免疫グロブリンＣμ−Ｃδ座（ｆｏｃｕｓ）：完
全なヌクレオチド配列および構造分析、Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　１ｍｍｕｎｏｌ。

１　、２９６−３０９（１９８９）。

（６３〉　　ミルスティン、シー・ビー（Ｘｉ　１ｓｔ
ｅｉｎ、ｃＰ、）、デバーソン、イー・ヴ（（Ｄｅｖｅ
ｒｓｏｎ、ＥＪ、）およびラビッツ、ティー・エッチ（
Ｒａｂｂｉｔｔｓ、Ｔ。

Ｈｌ）、ヒト免疫グロブリンμｍδイントロンの配列は
可能性のある退化スイッチ配列（ｖｅｓｔｉｇｉａｌｓ
ｗｉｔｃｈ　ｓｅｇｕｅｎｃｅｓ）を現わす、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ。

Ｒｅｓ、　１２　、８５２３−８５３５（１９８４）。

（６４〉　　エリソン、ジエイ（ＥＩ　ｌ１ｓｏｎ、Ｊ
、）、バーゾン、ビー・ジェイ（Ｂｅｒｓｏｎ、Ｂｊ、
）およびフード、エル・イー（Ｈｏｏｄ、Ｌ、Ｅ、）　
、ヒト免疫グロブリンＣ７１遺伝子のヌクレオチド配列
、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１０．４０７１−４０７９（１９ｇ２）。

（６５〉　　エリマン、ジェイ（Ｅｌ　１ｉｓｏｎ、Ｊ
、）およびフード、エル（Ｈｏｏｄ、Ｌ、）　、二つの
ヒト免疫グロブリンγ鎖定常領域遺伝子の結合および配
列ホモロジーＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｅｔ、　ＵＳＡ、７９．１９８４−１９８８（１９８２
）。

（８８）　　ハック、ニス（Ｈｕｃｋ、Ｓ、）　、フォ
ルト、ビー（Ｆｏｒｔ、Ｐ、）　、クローフォード、デ
イ−・エッチ（ｃｒａｖｆ’ｏｒｄ、Ｄ、Ｈ，）　、レ
フランク、エム−ピー（Ｌｅｆ’ｒａｎ−ｃ、Ｍ−Ｐ、
）およびレフランク、ジー（Ｌｅｆ’ｒａｎｃ、Ｇ）　
、ヒト免疫グロブリンガンマ３重鎖（ｈｅａｖｙ　ｃｈ
ａ［ｎ）の定常領域遺伝子の配列：他のヒトＣγ遺伝子
との比較、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、１４゜１
７７９−１７８９（１９８６）。

（６７〉　　エリマン、ジエイ（ＥＩ　ｌ１ｓｏｎ、Ｊ
、）、バックスバウム、ジェイ（Ｂｕｘｂａｕｍ、Ｊ、
）およびフード、エル（Ｈｏｏｄ、Ｌ、）　、ヒト免疫
グロブリンＣγ４遺伝子のヌクレオチド配列、ＤＮＡ、
　１．１ｌ−１８（１９８１）。

（６８）　　７ツクス、イー・イーＭａｘ、Ｅ、Ｅ、）
　、メイラエル、ジエイーケイ・ジェイアール（Ｍａｉ
ｚｅｌ　、Ｊ、Ｖ。

Ｊｒ）およびレーダー、ピー（Ｌｅｄｅｒ、Ｐ、）、ヒ
ト免疫グロブリンε遺伝子における重複および欠失、Ｃ
ｅ１ｌ　２９．６９１−６９９（１９８２）。

（６９）　　７ラナガン、ジェイ・ジー（Ｐｌａｎａｇ
ａｎ、　Ｊ。

Ｇ、〉、レフランク、エム−ビー（Ｌｅｆ’　ｒａｎｃ
　、　Ｍ−Ｐ、　）およびラビッツ、ティー・エッチ（
Ｒａｂｂｉｕｓ、Ｔ、ｔＬ）、ヒト免疫グロブリンα１
およびα２定常領域遺伝子配列の分散および集中、Ｃｅ
１ｌ　３６．６８１−６８８（１９８４）。

＜７０）　　ハイター、ビー・エイ（Ｉｌｉｅｔｅｒ、
Ｐ、＾、）、マックス、イー・イー（Ｍａｘ、Ｅ、Ｅ、
）、サイドマン、ジェイ・ジー（Ｓｅｉｄｍａｎ、Ｊ、
Ｇ、）、マイラエル、ジエイ・ケイ（Ｍａｉｚｅｌ、Ｊ
、Ｖ、）　、およびレーダー、ピーＬｅｄｅｒ、Ｐ、）
　、クローン化したヒトおよびマウスカッパ免疫グロブ
リン定常およびＪ領域遺伝子は機能的セグメントにおい
て、ホモロジーを保持した、Ｃｅ１ｌ　２２．１９７−
２０７（１９８０）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＳＶ２−ＶＨ １６−ＨＧ１ｇｐｔ（Ａ）およびｐＳＶ２−Ｖに１６−
ＨＣにｎ　ｅ　ｏ　（Ｂ）の構築を示す説明図であり、
図中の略号は次の通りである。 Ｐ−プロモーター： Ｅｎ−エンハンサ−； ０ｒｉ−ｐＢＲ３２２ｏｒｉ； Ａｍｐ−β−ラクタマーゼ； ５Ｖ４０−ＳＶ４０ブＯ（−一ター； ポリＡＩポリＡ付着シグナル； ＭＣ５−多クローニング部位； ＶＤＪ３−マウスＨ鎖の可変領域をコードする遺伝子； Ｊ４−マウスＨ鎖のＪ４領域をコードする遺伝子；ＶＪ
Ｉ−マウスＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子： Ｊ２−５−マウスＬ鎖の１２−５領域をコードする遺伝
子； Ｃに一マウス又はヒトのＬ鎖の定常領域をコードする遺
伝子； Ｃ１０−ヒトＨ鎖の定常項域をコードする遺伝子：Ｅｃ
ｏｇｐｔ−大腸菌のキサンチン−グアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼをコードする遺伝子；ｎｅｏ−Ｔ
ｎ５ネオマイシン耐性をコードする遺伝子； ＭＣ３（ｐＢｌｕｅｃｒｌｐｔ　ＳＫ＋）−プラスミド
ｐＢｌｕｅｃｒｉｐｔＳＫ＋のマルチクローニングサイ
ト； 制限酵素： Ｅ−ＥｃｏＲＩ； Ｂ−ＢａｍＨＩ； Ｈ−ＨｉｎｄＩｎ； Ｘ−ＸｂａＩ。 第２図は、マウス−ヒトキメラ抗体ＭＨ１６２の５ＤＳ
−ＰＡＧＥ分析結果を示す体動パターンを模写したもの
である。 第３図は、２７８０ＡＤ細胞についてのＭＨ１６２また
はＭＲＫ１６による抗体依存性細胞傷害試験の活性を示
すグラフである。 バーは標準偏差（ＳＤ）を表わす。 第４図は、ＭＲＫ１６由来のＨ鎖の可変領域のアミノ酸
配列（ａからｂ）、およびこれをコードする塩基配列を
示す説明図である。 第５図は、ＭＲＫ１６由来のＬ鎖の可変領域のアミノ酸
配列（ａからｂ）、およびこれをコードする塩基配列を
示す説明図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、薬剤耐性癌に対するマウスモノクローナル抗体にお
   ける可変領域と実質的に相同なアミノ酸配列を有する可
   変領域と、ヒト免疫グロブリンにおける定常領域と実質
   的に相同なアミノ酸配列を有する定常領域と、からなる
   ことを特徴とする、薬剤耐性癌に対するキメラ抗体。 ２、薬剤耐性癌の抗原がＰ−糖タン白質である、請求項
   １記載のキメラ抗体。 ３、マウスモノクローナル抗体が、ヒト骨髄性白血病細
   胞株に５６２のアドリアマイシン耐性株Ｋ５６２／ＡＤ
   Ｍにより免疫されたマウスから得られた脾細胞とマウス
   の骨髄腫細胞とを融合させて作成したハイブリドーマＭ
   ＲＫ１６またはＭＲＫ１７により生産されるものである
   、請求項１または２記載のキメラ抗体。 ４、下記の工程（ａ）〜（ｆ）を含むことを特徴とする
   、請求項１に記載のキメラ抗体の製造法。 （ａ）薬剤耐性癌に対するマウスモノクローナル抗体の
   Ｈ鎖における可変領域と実質的に相同なアミノ酸配列を
   コードする遺伝子の転写下流側に、ヒト免疫グロブリン
   のＨ鎖における定常領域と実質的に相同なアミノ酸配列
   をコードする遺伝子の転写上流側を連結して、キメラＨ
   鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖を調製するこ
   と。 （ｂ）薬剤耐性癌に対するマウスモノクローナル抗体の
   Ｌ鎖における可変領域と実質的に相同なアミノ酸配列を
   コードする遺伝子の転写下流側に、ヒト免疫グロブリン
   のＬ鎖における定常領域と実質的に相同なアミノ酸配列
   をコードする遺伝子の転写上流側を連結して、キメラＬ
   鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖を調製するこ
   と。 （ｃ）工程（ａ）および（ｂ）より得られる各ＤＮＡ鎖
   を、同一のまたは別々の発現ベクターに、その遺伝情報
   が発現可能な状態で挿入して組換え体ＤＮＡを作成する
   こと。 （ｄ）工程（ｃ）より得られる組換え体 ＤＮＡによって宿主細胞を形質転換して形質転換体を作
   成すること。 （ｅ）工程（ｄ）より得られる形質転換体を培養して培
   養物中に薬剤耐性癌に対するキメラ抗体を産生させるこ
   と。 （ｆ）必要に応じて、工程（ｅ）で培養物中に産生され
   たキメラ抗体を回収すること。 ５、薬剤耐性癌の抗原がＰ−糖タン白質である、請求項
   ４記載の製造法。 ６、マウスモノクローナル抗体が、ヒト骨髄性白血病細
   胞株に５６２のアドリアマイシン耐性株Ｋ５６２／ＡＤ
   Ｍにより免疫されたマウスから得られた脾細胞とマウス
   の骨髄腫細胞とを融合させて作成したハイブリドーマＭ
   ＲＫ１６またはＭＲＫ１７により産生されるものである
   、請求項４または５記載のキメラ抗体の製造法。