BR112019017751A2 - composições e métodos de inibição de proteínas de linhagem específica - Google Patents

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Lydeard John
Bolen Joseph
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Abstract

a presente invenção refere-se a composições, métodos e kits para uso no tratamento de malignidades hematopoiéticas, as composições, métodos e kits compreendem um agente citotóxico direcionado a células que expressam uma proteína de superfície celular de linhagem específica e uma população de células hematopoiéticas que expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica, as células hematopoiéticas sendo manipuladas de tal modo que não se ligam ao agente citotóxico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE INIBIÇÃO DE PROTEÍNAS DE LINHAGEM ESPECÍFICA.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119 (e) do pedido provisório número 62/464.975 depositado em 28 de fevereiro de 2017. Todo o conteúdo do pedido referenciado é incorporado por referência neste documento.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Um grande desafio na concepção de terapias direcionadas é a identificação bem-sucedida de proteínas que são expressas exclusivamente em células que seriam terapeuticamente relevantes para eliminar (por exemplo, células-alvo anormais, malignas ou outras), mas não presentes em células que não se deseja eliminar (por exemplo, células normais, saudáveis ou outras células não alvo). Por exemplo, muitas terapêuticas contra o câncer lutam para atingir eficazmente as células cancerosas, deixando as células normais ilesas.
[003] Uma estratégia alternativa que surgiu envolve o direcionamento de uma linhagem celular inteira, que inclui o direcionamento de células normais, células cancerosas e células pré-cancerosas. Por exemplo, células T receptoras de antígeno quimérico direcionadas a CD19 (células T CAR) e anticorpos monoclonais anti-CD20 (por exemplo, Rituximab) cada uma direciona proteínas de linhagem de células B (CD19 e CD20, respectivamente). Embora seja potencialmente eficaz no tratamento de malignidades de células B, a uso de tais terapias é limitada, uma vez que a eliminação de células B é prejudicial. Similarmente, o direcionamento de proteínas de linhagem específica de outras populações de células, por exemplo, células da linhagem mieloide (por exemplo, cânceres que surgem de blastos mieloides, monócitos, megacariócitos, etc.) não é possível, uma vez
Petição 870190083273, de 26/08/2019, pág. 17/187
2/110 que estas populações de células são necessárias para a sobrevivência.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [004] A presente descrição baseia-se, ao menos em parte, na identificação de epítopos (por exemplo, epítopos não essenciais) dentro de uma proteína de superfície celular de linhagem específica que pode ser direcionada por um agente citotóxico, que provoca a morte celular de células expressando o proteína que contém esse epitopo, mas não aquelas células (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas) expressando a proteína na qual o epitopo foi manipulado (por exemplo, geneticamente) de tal modo que eles reduziram a ligação ao agente citotóxico e consequentemente evadem a morte celular. Espera-se que tais métodos forneçam um tratamento seguro e eficaz para malignidades hematopoiéticas.
[005] Consequentemente, um aspecto da presente descrição fornece métodos para tratar uma malignidade hematopoiética, o método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade de tratamento (i) uma quantidade eficaz de um agente citotóxico direcionado a células que expressam uma proteína de superfície celular de linhagem específica e (ii) uma população de células hematopoiéticas, em que as células hematopoiéticas são manipuladas de tal modo que elas ou os seus descendentes não se ligam ao agente citotóxico ou têm ligação reduzida ao agente citotóxico. Em algumas modalidades, o agente citotóxico compreende um fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas ou os seus descendentes expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica e são manipuladas geneticamente, de tal modo que a proteína de superfície celular de linhagem específica não tem o epitopo ao qual o agente citotóxico se
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3/110 liga. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são manipuladas geneticamente de tal modo que a proteína de superfície celular de linhagem específica expressa nas células hematopoiéticas ou os seus descendentes tem um epitopo mutado ou variante ao qual o agente citotóxico tem uma atividade de ligação reduzida ou não pode se ligar. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica pode não ser essencial.
[006] Opcionalmente, qualquer um dos métodos aqui fornecidos pode compreender precondicionar o indivíduo antes da administração do agente citotóxico e/ou das células hematopoiéticas, por exemplo, administrando um ou mais agentes quimioterápicos ou outra terapia ou terapias contra o câncer ao indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo foi precondicionado antes da administração do agente citotóxico e/ou das células hematopoiéticas. Em outras modalidades, qualquer um dos métodos aqui fornecidos pode ainda compreender administrar um ou mais agentes quimioterápicos ou outra terapia ou terapias contra o câncer ao indivíduo em conjunto com a administração do agente citotóxico e/ou das células hematopoiéticas. O agente quimioterápico ou outra terapia contra o câncer pode ser administrado antes, simultaneamente ou subsequentemente à administração do agente citotóxico e/ou das células hematopoiéticas.
[007] Alternativamente ou ainda, qualquer um dos métodos aqui descritos pode ainda compreender preparar as células hematopoiéticas sem o epitopo ao qual o agente citotóxico se liga, por exemplo, através de modificação genética.
[008] O agente citotóxico para uso em qualquer dos métodos aqui descritos compreende um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um fragmento de anticorpo de cadeia simples ou scFv) que se liga especificamente a um epitopo em uma proteína de superfície
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4/110 celular de linhagem específica. Em algumas modalidades, o agente citotóxico é um anticorpo ou um conjugado anticorpo - fármaco (ADC). Em algumas modalidades, o agente citotóxico pode ser uma célula imune (por exemplo, uma célula T) expressando um receptor quimérico que compreende o fragmento de ligação ao antígeno. A célula imune pode ser alogênica ou autóloga.
[009] Os receptores quiméricos podem ainda compreender (a) um domínio de dobradiça, (b) um domínio transmembrana, (c) ao menos um domínio coestimulatório, (d) um domínio de sinalização citoplasmático ou (e) uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende ao menos um domínio de sinalização coestimulatório. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulatório é derivado de um receptor coestimulatório selecionado a partir do grupo que consiste em CD27, CD28, 41BB, 0X40, CD30, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, GITR, HVEM e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende ao menos um domínio de sinalização citoplasmático. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático é a partir de CD3, por exemplo, CD3 zeta (Οϋ3ζ). Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende ao menos um domínio de dobradiça. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é de CD8a ou CD28.
[0010] As células hematopoiéticas (por exemplo, alogênicas ou autólogas) para uso nos métodos aqui descritos podem ser célulastronco hematopoiéticas, que podem derivar, por exemplo, de células da medula óssea, células do sangue do cordão ou células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são células-tronco hematopoiéticas alogênicas obtidas a partir de um doador tendo um haplótipo HLA que corresponde ao haplótipo HLA do indivíduo. Em algumas modalidades, o
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5/110 método compreende ainda obter as células hematopoiéticas de um doador tendo um HLA que corresponde ao haplótipo HLA do indivíduo. [0011] Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas usadas nos métodos aqui descritos podem ser manipuladas por modificação genética para romper um epitopo ligado pelo agente citotóxico. Alternativamente, as células hematopoiéticas podem ser manipuladas colocando-as em contato com um agente bloqueador, que se liga à proteína de superfície celular de linhagem específica nas células ou seus descendentes e bloqueia assim a ligação do agente citotóxico às células. Isto pode ser conseguido incubando as células hematopoiéticas com o agente bloqueador ex vivo, ou administrando o agente bloqueador ao indivíduo antes, simultaneamente, ou após a administração das células hematopoiéticas.
[0012] Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são geneticamente modificadas de tal modo que expressam uma proteína de superfície celular de linhagem específica variante, em que a proteína de superfície celular de linhagem específica variante não se associa com o agente citotóxico. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são geneticamente modificadas de modo a expressarem uma proteína de superfície celular de linhagem específica variante, em que a proteína de superfície celular de linhagem específica variante reduziu a ligação (por exemplo, afinidade de ligação reduzida) com o agente citotóxico. O epitopo essencial para a ligação do agente citotóxico pode estar contido em uma sequência de aminoácidos contígua linear (por exemplo, um epitopo linear) ou pode ser dependente da conformação da proteína de superfície celular de linhagem específica em que o epitopo de ligação ao agente citotóxico pode ser dependente de sequências de aminoácido não contíguas (por exemplo, um epitopo conformacional). Assim, por exemplo, as células hematopoiéticas podem ser geneticamente modificadas de tal modo
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6/110 que a região ou domínio da proteína de superfície celular de linhagem específica contendo o epitopo de ligação ao agente citotóxico pode ser deletada ou mutada. Alternativamente, o epitopo inteiro pode ser deletado (por exemplo, 3 a 15 aminoácidos) ou um ou mais dos aminoácidos mutados de modo que a ligação ao agente citotóxico seja impedida. Alternativamente, os aminoácidos que são essenciais para a conformação do epitopo dependente da conformação da superfície celular de linhagem específica podem ser deletados ou mutados de tal modo que a conformação do epitopo seja rompida, reduzindo ou impedindo assim a ligação pelo agente citotóxico.
[0013] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do epitopo pode ser alterada para impedir ou reduzir a ligação do agente citotóxico, enquanto preservando um elemento estrutural essencial da proteína de superfície celular de linhagem específica. Tais alterações podem ser mutações de um único ou múltiplos aminoácidos dentro do epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica.
[0014] Em algumas modalidades, múltiplos epítopos distintos reconhecidos por agentes citotóxicos distintos podem ser alterados, permitindo assim que os agentes citotóxicos sejam usados terapeuticamente em combinações ou usados sequencialmente.
[0015] Em algumas modalidades, a proteína de superfície celular de linhagem específica expressa na população de células hematopoiéticas ou os seus descendentes tem uma deleção de um fragmento, que é codificado por um éxon de um gene da proteína de superfície celular de linhagem específica, e onde o fragmento compreende o epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica.
[0016] Em algumas modalidades, o antígeno de superfície celular de linhagem específica é uma proteína de superfície celular de linhagem específica tipo 2. Em algumas modalidades, a proteína de
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7/110 superfície celular de linhagem específica tipo 2 é CD33. Em algumas modalidades, a proteína expressa na superfície das células hematopoiéticas é uma variante de CD33, que pode não ter um epitopo (por exemplo, um epitopo não essencial), ao qual o agente citotóxico se liga. Em alguns exemplos, o epitopo está localizado na região codificada pelo éxon 2 do gene CD33. Em algumas modalidades, uma variante de CD33 expressa nas células hematopoiéticas aqui descritas não tem o éxon 2 de CD33 ou uma porção deste. Em algumas modalidades, uma variante de CD33 expressa nas células hematopoiéticas aqui descritas não tem os aminoácidos W11 a T139 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, uma variante de CD33 expressa nas células hematopoiéticas aqui descritas não tem um epitopo compreendendo aminoácidos 47 a 51 ou 248 a 252 da SEQ ID NO: 1. Variantes de CD33 exemplificativas podem compreender uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 2 a 7. Assim, em algumas modalidades, a descrição fornece células hematopoiéticas geneticamente modificadas de tal modo que expressam uma proteína CD33 variante que não tem um epitopo ao qual o agente citotóxico se liga. Em algumas modalidades específicas, as células hematopoiéticas geneticamente modificadas expressam uma variante CD33 na qual o éxon 2, ou uma porção deste, é deletado. Em algumas modalidades específicas, as células hematopoiéticas geneticamente modificadas expressam uma CD33 variante que não tem um epitopo compreendendo os aminoácidos 47 a 51 ou 248 a 252 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades específicas, as células hematopoiéticas geneticamente modificadas expressam uma variante CD33 compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 2 a 7.
[0017] Em algumas modalidades, a proteína de superfície celular de linhagem específica é uma proteína de superfície celular de
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8/110 linhagem específica tipo 1. Em algumas modalidades, a superfície celular de linhagem específica tipo 1 é CD19. Em algumas modalidades, a proteína expressa na superfície das células hematopoiéticas é uma variante de CD19, que pode não ter um epitopo (por exemplo, um epitopo não essencial), ao qual o agente citotóxico se liga. Em alguns exemplos, o epitopo está localizado na região codificada pelo éxon 2 do gene CD19. Em algumas modalidades, uma variante de CD19 expressa nas células hematopoiéticas aqui descritas não tem o éxon 2 de CD19 ou uma porção deste. Assim, em algumas modalidades, a descrição fornece células hematopoiéticas geneticamente modificadas de tal modo que expressam uma proteína CD19 variante que não tem um epitopo ao qual o agente citotóxico se liga. Em algumas modalidades específicas, as células hematopoiéticas geneticamente modificadas expressam uma variante CD 19 na qual o éxon 2, ou uma porção deste, é deletado.
[0018] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o indivíduo pode ter linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, leucemia, ou mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, o indivíduo tem leucemia, por exemplo, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoblástica aguda ou leucemia linfoblástica crônica.
[0019] Qualquer uma das células hematopoiéticas geneticamente modificadas aqui descritas e os seus usos no tratamento de uma malignidade hematopoiética estão também dentro do escopo da presente descrição.
[0020] Outros aspectos da presente descrição fornecem métodos para preparar células hematopoiéticas geneticamente manipuladas sem um ou mais epítopos de ligação ao agente citotóxico em uma proteína de superfície celular de linhagem específica, o método compreendendo (i) fornecer uma população de células hematopoiéticas obtidas a partir de um indivíduo humano, em que a
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9/110 população de células hematopoiéticas expressa a proteína de superfície celular de linhagem específica; (ii) manipular geneticamente a população de células hematopoiéticas para introduzir mutações em um epitopo candidato na proteína de superfície celular de linhagem específica, e (iii) determinar a funcionalidade das células hematopoiéticas geneticamente manipuladas para verificar que a alteração do epitopo candidato mantém a função da proteína de linhagem específica.
[0021] Ainda outros aspectos da presente descrição fornecem métodos para identificar um epitopo não essencial em uma proteína de superfície celular de linhagem específica, o método compreendendo (i) fornecer uma população de células hematopoiéticas que expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica; (ii) manipular geneticamente a população de células hematopoiéticas para introduzir mutações em um epitopo candidato na proteína de superfície celular de linhagem específica; (iii) determinar a funcionalidade das células hematopoiéticas geneticamente manipuladas; e (iv) avaliar se o epitopo candidato portador das mutações mantém a função da proteína de linhagem específica como determinado em (iii), em que a manutenção da função da proteína de linhagem específica indica que o epitopo candidato é um epitopo não essencial.
[0022] Também são abrangidos no escopo da presente descrição kits para uso no tratamento de uma malignidade hematopoiética compreendendo (i) um ou mais agentes citotóxicos direcionados a células que expressam uma proteína de superfície celular de linhagem específica, em que o agente citotóxico compreende um fragmento de ligação à proteína que se liga especificamente a um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica; e (ii) uma população de células hematopoiéticas (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas) expressando a proteína de superfície celular de
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10/110 linhagem específica, em que as células hematopoiéticas são manipuladas de tal modo que não se ligam ao agente citotóxico ou têm ligação reduzida com o agente citotóxico. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são manipuladas de tal modo que a proteína de superfície celular de linhagem específica não tem o epitopo ao qual o agente citotóxico se liga. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são manipuladas de tal modo que a proteína de superfície celular de linhagem específica tem um epitopo variante ao qual o agente citotóxico não se liga ou tem ligação reduzida.
[0023] Além disso, a presente descrição fornece composições farmacêuticas compreendendo quaisquer agentes citotóxicos direcionados a células que expressam uma proteína de superfície celular de linhagem específica e/ou qualquer das células hematopoiéticas expressando a proteína de superfície celular de linhagem específica que são manipuladas de tal modo que não se ligam ao agente citotóxico para uso no tratamento de uma malignidade hematopoiética; bem como os usos dos agentes citotóxicos e células hematopoiéticas para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento de uma malignidade hematopoiética.
[0024] Os detalhes de uma ou mais modalidades da descrição são apresentados na descrição abaixo. Outras características ou vantagens da presente descrição serão evidentes a partir da descrição detalhada de várias modalidades e também das reivindicações em anexo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0025] Os desenhos que se seguem fazem parte da presente especificação e são incluídos para demonstrar ainda certos aspectos da presente descrição, que podem ser compreendidos melhor por referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a
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11/110 descrição detalhada de modalidades específicas aqui apresentadas.
[0026] A Figura 1 é um esquema que mostra um exemplo de processo terapêutico envolvendo os métodos aqui descritos. A: O processo inclui as etapas de obter células CD34+ (obtidas a partir de um doador ou de forma autóloga), modificar geneticamente as células CD34+, enxertar as células manipuladas em um paciente, realizar terapia de células T CAR no paciente, resultando em carga de câncer depurada ou reduzida e hematopoiese mantida. B: Uma célula CD34+ de doador modificada na qual o epitopo não essencial de uma proteína de superfície celular de linhagem específica é modificado de tal forma que não se liga a uma célula T CAR que é específica para um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica.
[0027] A Figura 2 é um esquema das porções extracelular e transmembrana da proteína CD33 humana de superfície celular de linhagem específica. As regiões de CD33 que são previstas como sendo menos nocivas quando modificadas são indicadas pelas caixas. A sequência corresponde à SEQ ID NO: 51.
[0028] A Figura 3 mostra que as células T CAR se ligam a células que expressam CD33 humano, mas não a células que expressam CD33 humano, nas quais um epitopo de CD33 foi modificado ou deletado. A: Células T CAR direcionadas para células de leucemia mieloide aguda CD33+ levando à lise celular. B: Células T CAR não são capazes de se ligar a células enxertadas de doadores geneticamente modificadas nas quais um epitopo de CD33 foi modificado ou deletado. Como um resultado, essas células não sofrem lise.
[0029] A Figura 4 é um esquema da deleção genômica mediada por CRISPR / Cas9 do éxon 2 de CD19, resultando na expressão de uma variante de CD19 tendo o éxon 2 deletado.
[0030] A Figura 5 inclui diagramas que mostram a investigação de vários RNAs guia únicos modificados (ms-sgRNAs) direcionados a
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CD19 em uma linhagem de células de leucemia humanas (células K562). A: Fotos mostrando os amplicons de PCR derivados da região que abrange os introns 1 e 2 do gene CD19, conforme determinado pelos ensaios de T7E1. As amostras foram tratadas (+) ou não tratadas (-) com T7E1. A eficiência percentual de divagem é indicada em cada faixa. C = Controle da amostra de New England Biolabs (NEB), WT = células não transfectadas de ocorrência natural, Cas9 = apenas Cas9. B: um gráfico que mostra o percentual de INDEL determinado pelos ensaios T7E1 e pela análise TIDE.
[0031] A Figura 6 inclui diagramas que mostram a deleção mediada por ms-sgRNA duplo do éxon 2 de CD19 em células K562. A: um esquema que mostra um ensaio baseado em PCR para detectar a deleção genômica mediada por CRISPR / Cas9 do éxon 2 de CD19 através de CRISPR / Cas9 duplas mediadas por ms-sgRNA. B: Uma foto que mostra a deleção da região entre o éxon 1 e o éxon 3 após o tratamento de células K562 com pares indicados de ms-sgRNAs por um ensaio de PCR de desfecho do DNA genômico. C: Um gráfico que mostra a deleção percentual quantificada por PCR de desfecho.
[0032] A Figura 7 inclui diagramas que mostram a triagem de CD19 ms-sgRNAs direcionados para os introns 1 ou 2 em CD34+ HSCs por ensaio T7E1 e análise TIDE. A: Uma foto que mostra amplicons de PCR derivados da região abrangendo os introns 1 e 2 do gene CD19, conforme determinado pelos ensaios T7E1. As amostras foram tratadas (+) ou não tratadas (-) com T7E1. O percentual de inserção / deleção (INDEL) e eficiência de divagem estão indicadas em cada faixa. C = Controle de Amostra NEB, Cas9 = Cas9 apenas. B: Os amplicons de PCR derivados da região que mede os introns 1 e 2 do gene CD19 foram analisados por análise de T7E1 ou TIDE, e o percentual de INDEL foi determinado. Cas9 = controle de apenas cas9.
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13/110 [0033] A Figura 8 inclui diagramas que mostram a deleção mediada por ms-sgRNA duplo do éxon 2 CD19 em CD34+ HSCs. A: Uma foto que mostra o produto de PCR de deleção menor em comparação com a faixa de origem maior, conforme determinado por PCR através da região de deleção genômica. B: Um gráfico que mostra a porcentagem de deleção quantificada por PCR de desfecho.
[0034] A Figura 9 inclui diagramas que mostram a investigação de ms-sgRNAs direcionados aos introns 1 ou 2 de CD19 em CD34+ HSCs. A: Uma foto que mostra amplicons de PCR derivados da região abrangendo os introns 1 e 2 do gene CD19, conforme determinado pelos ensaios T7E1. A eficiência percentual de divagem é indicada em cada faixa. B: Gráfico que mostra os amplicons de PCR derivados da região dos introns 1 e 2 do gene CD19 analisados pelo teste T7E1 e o percentual de INDEL. Cas9 = controle apenas cas9.
[0035] A Figura 10 inclui diagramas que mostram uma deleção mediada por ms-sgRNA eficiente do éxon 2 de CD19in CD34+ HSCs. A: Uma foto que mostra o produto de PCR de deleção menor em comparação com a faixa de origem maior, conforme determinado por PCR através da região de deleção genômica. A deleção percentual é indicada em cada faixa. B: Um gráfico que mostra a deleção percentual quantificada por PCR de desfecho.
[0036] A Figura 11 é um fluxo de trabalho esquemático para avaliar o potencial de diferenciação de CD34+ HSCs editadas, d = dias, w = semanas, w/o = semanas de idade, RNP = ribonucleoproteína.
[0037] A Figura 12 é um fluxo de trabalho esquemático para avaliar a seletividade in vivo e eficácia da terapia com CART19 em um modelo de tumor de linfoma de Raji Burkitt, d = dias, w = semanas, w/o = semanas de idade.
[0038] A Figura 13 inclui diagramas que mostram a geração de
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14/110 células Raji-fluc-GFP nas quais o éxon 2 de CD19 foi deletado. A: Diagramas que mostram a expressão de CD19 em linhagens de células de Raji-fluc-GFP transfectadas com as combinações indicadas de ms-sgRNAs como determinado por FACS. Células parentais Raji e Raj-fluc-GFP nucleofectadas com Cas9 apenas são incluídas como controles. B: É um gráfico que mostra a porcentagem de células vivas em cada população de células (CD19 hi, CD19 int e CD19 Io). C: É uma foto que mostra o menor produto de PCR para a deleção do éxon 2 em comparação com a maior faixa parental, conforme determinado por PCR através da região de deleção genômica. D: É um gráfico que mostra a percentagem de células tendo um éxon 2 deletado de CD19 na população total de células, conforme determinado por PCR de desfecho.
[0039] A Figura 14 inclui diagramas que mostram o nível de citotoxicidade de CART19 contra células Raji nas quais o éxon 2 de CD19 foi deletado. A: Um gráfico de linhas que mostra que as células nas quais o éxon 2 de CD19 foi deletado são resistentes à citotoxicidade de CART19. B: Um gráfico de barras que mostra que as células nas quais o éxon 2 de CD19 foi deletado são resistentes à citotoxicidade de CART19.
[0040] A Figura 15 é um esquema que mostra um modelo in vivo exemplificativo que avalia a eficácia e seletividade de um terapêutico CART pareado com HSCs editados envolvendo os métodos aqui descritos.
[0041] A Figura 16 é um esquema que mostra a edição do éxon 2 de CD33, resultando na expressão da variante CD33m.
[0042] A Figura 17 é um gráfico que mostra a investigação de vários ms-sgRNAs direcionados aos introns 1 ou 2 de CD33 em CD34+ HSCs por análise TIDE. Os amplicons de PCR derivados da região abrangendo os introns 1 e 2 do gene CD33 foram analisados
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15/110 por análise TIDE e o percentual de INDEL foi determinado.
[0043] A Figura 18 inclui diagramas que mostram a caracterização de CD34+ HSC primáriao CD33-editados. A: Um gráfico que mostra ms-sgRNAs selecionados direcionados aos introns 1 ou 2 de CD33 investigados em CD34+ HSCs pela análise TIDE e o percentual de INDEL. Sg e 811 representam sgRNAs de controle direcionados aos éxons 2 e 3, respectivamente. B: Uma foto que mostra o produto de PCR de deleção menor em comparação com a faixa parental maior, conforme determinado por PCR na região de deleção genômica. C: Um diagrama que mostra a perda do domínio CD33 V codificado pelo éxon 2, conforme avaliado por análise de citometria de fluxo.
DESCRCÀO DETALHADA DA INVENÇÃO [0044] A identificação bem-sucedida de proteínas adequadas para terapias direcionadas para o câncer apresenta um desafio significativo. Muitas potenciais proteínas alvo estão presentes tanto na superfície celular de uma célula cancerosa quanto na superfície celular de células não cancerosas normais, que podem ser exigidas ou estar criticamente envolvidas no desenvolvimento e/ou sobrevida do indivíduo. Muitas das proteínas alvo contribuem para a funcionalidade de tais células essenciais. Assim, terapias direcionadas a estas proteínas podem levar a efeitos prejudiciais no indivíduo, tal como toxicidade significativa e/ou outros efeitos colaterais.
[0045] A presente descrição fornece métodos, células, composições e kits destinados a abordar ao menos os problemas mencionados acima. Os métodos, células, composições e kits descritos aqui fornecem um tratamento seguro e eficaz para malignidades hematológicas, permitindo o direcionamento de proteínas de superfície celular de linhagem específicas (por exemplo, tipo 0, tipo 1 ou tipo 2) que estão presentes não apenas em células cancerosas, mas também em células críticas para o desenvolvimento e/ou sobrevida do indivíduo.
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Os métodos aqui descritos envolvem eliminar as células que expressam uma proteína de superfície celular de linhagem específica alvo através da administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de um agente citotóxico que se liga especificamente a um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica; e fornecer ao indivíduo células hematopoiéticas, que, ou descendentes das quais, expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica, em que as células hematopoiéticas são manipuladas (por exemplo, geneticamente) de tal modo que não podem ser direcionadas, ou ter um alvo reduzido, pelo agente citotóxico. Por exemplo, o epitopo de ligação na proteína de superfície celular de linhagem específica é ou deletado, ou mutado ou bloqueado da ligação com o agente citotóxico. Expressar uma proteína de superfície celular de linhagem específica significa que ao menos uma porção da proteína de superfície celular de linhagem específica pode ser detectada na superfície das células hematopoiéticas ou seus descendentes. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas manipuladas para uso nos métodos aqui descritos expressam uma proteína de superfície celular de linhagem específica biologicamente funcional. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas manipuladas para uso nos métodos aqui descritos podem não expressar uma proteína de superfície celular de linhagem específica biologicamente funcional; no entanto, as células diferenciadas a partir delas (por exemplo, seus descendentes) expressam tal proteína de superfície celular de linhagem específica funcional.
[0046] Consequentemente, são aqui descritas composições e métodos envolvendo o uso de agentes citotóxicos direcionados a uma proteína de superfície celular de linhagem específica, tal como qualquer uma das proteínas de superfície celular de linhagem específica aqui descritas ou de outro modo conhecidas na técnica, por
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17/110 exemplo, CD33 ou CD19 e células hematopoiéticas, tais como célulastronco hematopoiéticas (HSCs), que, ou seus descendentes, expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica e são manipuladas de tal modo que elas não se ligam ao agente citotóxico ou têm ligação reduzida com o agente citotóxico, quais composições e métodos podem ser usados no tratamento de uma malignidade hematopoiética. São aqui fornecidas células hematopoiéticas geneticamente manipuladas que expressam uma variante de uma proteína de superfície celular de linhagem específica que não tem um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica, bem como métodos de preparação de tais células. Também são aqui descritos métodos para identificar epítopos não essenciais de uma proteína de superfície celular de linhagem específica.
Agentes Citotóxicos Direcionados a Células Expressando Proteínas de Superfície Celular de Linhagem Específica [0047] Aspectos da descrição fornecem agentes citotóxicos direcionados a células (por exemplo, células cancerosas) expressando uma proteína de superfície celular de linhagem específica. Como aqui usado, o termo agente citotóxico refere-se a qualquer agente que pode induzir, direta ou indiretamente, a citotoxicidade de uma célula alvo, que expressa a proteína de superfície celular de linhagem específica (por exemplo, uma célula cancerosa alvo). Tal agente citotóxico pode compreender um fragmento de ligação à proteína que se liga e é direcionado a um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica. Em alguns casos, o agente citotóxico pode compreender um anticorpo, que pode ser conjugado com um fármaco (por exemplo, um fármaco anticâncer) para formar um conjugado anticorpo - fármaco (ADC).
[0048] O agente citotóxico para uso nos métodos aqui descritos pode causar diretamente morte celular de uma célula alvo. Por exem
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18/110 pio, o agente citotóxico pode ser uma célula imune (por exemplo, uma célula T citotóxica) expressando um receptor quimérico. Após o engajamento do domínio de ligação de proteína do receptor quimérico com o epitopo correspondente em uma proteína de superfície celular de linhagem específica, um sinal (por exemplo, sinal de ativação) pode ser transduzido para a célula imune resultando na liberação de moléculas citotóxicas, tais como perforinas e granzimas, bem como a ativação de funções efetoras, conduzindo à morte da célula alvo. Em outro exemplo, o agente citotóxico pode ser uma molécula de ADC. Mediante ligação a uma célula alvo, a porção de fármaco no ADC exercería atividade citotóxica, conduzindo à morte da célula alvo.
[0049] Em outras modalidades, o agente citotóxico pode indiretamente induzir a morte celular da célula alvo. Por exemplo, o agente citotóxico pode ser um anticorpo, que, mediante ligação com a célula alvo, desencadearia atividades efetoras (por exemplo, ADCC) e/ou recrutaria outros fatores (por exemplo, complementos), resultando na morte das células alvo.
Proteínas de Superfície Celular de Linhagem Específica [0050] Tal como aqui usado, os termos proteína, peptídeo e polipeptídeo podem ser usados de forma intercambiável e referem-se a um polímero de resíduos de aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. Em geral, uma proteína pode ser de ocorrência natural, recombinante, sintética ou qualquer combinação dos mesmos. Também dentro do escopo do termo estão as proteínas variantes, que compreendem uma mutação (por exemplo, substituição, inserção ou deleção) de um ou mais resíduos de aminoácidos em relação à contraparte de ocorrência natural.
[0051] Como usado aqui, os termos proteína de superfície celular de linhagem específica e proteína de linhagem específica de superfície celular podem ser usados de forma intercambiável e referem-se
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19/110 a qualquer proteína que esteja suficientemente presente na superfície de uma célula e esteja associada a um ou mais populações de linhagens celulares. Por exemplo, a proteína pode estar presente em uma ou mais populações de linhagens celulares e ausente (ou em níveis reduzidos) na superfície celular de outras populações de células.
[0052] Em geral, as proteínas de superfície celular de linhagem específica podem ser classificadas com base em vários fatores, tais como se a proteína e/ou as populações de células que apresentam a proteína são necessárias para a sobrevida e/ou o desenvolvimento do organismo hospedeiro. Um sumário dos tipos exemplificativos de proteínas de linhagem específica é apresentado na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1: Classificação de Proteínas de Linhagem Específica
Tipo de proteína de linhagem específica Características da proteína de linhagem específica
Tipo 0 a) A proteína é necessária para a sobrevivência de um organismo, e b) A proteína carregando o tipo de célula tipo 0 é necessária para a sobrevivência de um organismo e não é exclusiva para um tumor, ou vírus associado a tumor
Tipo 1 a) A proteína não é necessária para a sobrevivência de um organismo, e b) A proteína carregando o tipo de célula tipo 1 não é necessária para a sobrevivência de um organismo
Tipo 2 a) A proteína não é necessária para a sobrevivência de um organismo, e b) A proteína carregando o tipo de célula tipo 2 não é necessária para a sobrevivência de um organismo
Tipo 3 a) A proteína não é necessária para a sobrevivência de um organismo, e b) A proteína carregando o tipo de célula tipo 2 não é necessária para a sobrevivência de um organismo, e c) A proteína é exclusiva para um tumor, ou um vírus associado a tumor. Um exemplo é a proteína LMP-2 em células infectadas com EBV, incluindo células de tumor infectadas com EBV (carcinoma nasofaríngeo e Linfoma de Burkitts).
[0053] Como mostrado na Tabela 1, as proteínas da superfície celular de linhagem específica tipo 0 são necessárias para a homeostasia e sobrevivência do tecido, e a proteína de superfície
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20/110 celular de linhagem específica tipo 0 pode também ser necessária para a sobrevivência do indivíduo. Assim, dada a importância de proteínas de superfície celular de linhagem específica tipo 0, ou células portadoras de proteínas de superfície celular de linhagem específica tipo 0, na homeostasia e sobrevivência, o direcionamento dessa categoria de proteínas pode ser desafiador usando imunoterapias convencionais de células T CAR, à medida que a inibição ou remoção de tais proteínas e células portadoras dessas proteínas podem ser prejudiciais para a sobrevivência do indivíduo. Consequentemente, as proteínas de superfície celular de linhagem específica (tais como proteínas de linhagem específica tipo 0) e/ou os tipos de células portadoras de tais proteínas podem ser necessárias para a sobrevivência, por exemplo, porque realizam uma função vital não redundante no indivíduo, então este tipo de proteína de linhagem específica pode ser um alvo fraco para imunoterapias convencionais baseadas em células T CAR.
[0054] Ao contrário das proteínas do tipo 0, as proteínas de superfície celular de linhagem específica do tipo 1 e células portadoras de proteínas de superfície celular de linhagem específica do tipo 1 não são necessárias para a homeostasia do tecido ou sobrevivência do indivíduo. Não é provável que o direcionamento de proteínas de linhagem específica de superfície celular do tipo 1 leve à toxicidade aguda e/ou morte do indivíduo. Por exemplo, como descrito por Elkins e outros (Mol. Cancer Ther. (2012) 10: 2222-32), uma célula T CAR manipulada para direcionar CD307, uma proteína do tipo 1 expressa exclusivamente em células plasmáticas normais e células de mieloma múltiplo (MM) levaria à eliminação de ambos os tipos de células. No entanto, uma vez que a linhagem de células plasmáticas é dispendiosa para a sobrevivência do organismo, CD307 e outras proteínas de linhagem específica do tipo 1 são proteínas que são adequadas para
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21/110 imunoterapia baseada em células T CAR. As proteínas de linhagem específica da classe tipo 1 podem ser expressas em uma ampla variedade de tecidos diferentes, incluindo ovários, testículos, próstata, mama, endométrio e pâncreas. Em algumas modalidades, o agente é direcionado a uma proteína de superfície celular de linhagem específica que é uma proteína do tipo 1. Tais métodos podem ser projetados para melhorar a sobrevida a longo prazo e a qualidade de vida do paciente. Por exemplo, ter como alvo todas as células plasmáticas, embora não se espere que cause toxicidade aguda e/ou morte, poderia ter consequências a longo prazo, tal como a redução da função do sistema imune humoral, levando ao aumento do risco de infecção.
[0055] Direcionar as proteínas do tipo 2 apresenta uma dificuldade significativa em comparação com as proteínas do tipo 1. As proteínas do tipo 2 são aquelas caracterizadas pelo fato de que: (1) a proteína é dispensável para a sobrevivência de um organismo (isto é, não é necessária para a sobrevivência), e (2) a linhagem celular portadora da proteína é indispensável para a sobrevivência de um organismo (isto é, a linhagem celular específica é necessária para a sobrevivência). Por exemplo, CD33 é uma proteína do tipo 2 expressa tanto em células mieloides normais quanto em células de Leucemia Mieloide Aguda (LMA) (Dohner e outros, NEJM 373: 1136 (2015)). Como um resultado, uma célula T CAR manipulada para atingir a proteína CD33 poderia levar à morte tanto das mieloides normais quanto das células LMA, que podem ser incompatíveis com a sobrevivência do indivíduo. Em algumas modalidades, o agente tem como alvo uma proteína de superfície celular de linhagem específica que é uma proteína do tipo 2. [0056] Uma ampla variedade de proteínas pode ser alvo dos métodos e composições da presente descrição. Anticorpos monoclonais para estas proteínas podem ser adquiridos comercialmente ou
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22/110 gerados usando técnicas padrão, incluindo imunização de um animal com a proteína de interesse seguida por metodologias convencionais de anticorpo monoclonal. Os anticorpos ou ácidos nucleicos que codificam para os anticorpos podem ser sequenciados utilizando qualquer técnica padrão de DNA ou de sequenciamento de proteínas. [0057] Em algumas modalidades, a proteína de superfície celular de linhagem específica é BCMA, CD19, CD20, CD30, ROR1, B7H6, B7H3, CD23, CD38, molécula similar à lectina do tipo C-1, CS1, IL-5, L1-CAM, PSCA, PSMA, CD138, CD133, CD70, CD7, NKG2D, ligando NKG2D, CLEC12A, CD11, CD123, CD56, CD34, CD14, CD33, CD66b, CD41, CD61, CD62, CD235a, CD146, CD326, LMP2, CD22, CD52, CD10, CD3/TCR, CD79/BCR e CD26. Em algumas modalidades, a proteína de superfície celular de linhagem específica é CD33 ou CD19.
[0058] Alternativamente ou ainda, a proteína de superfície celular de linhagem específica pode ser uma proteína cancerosa, por exemplo, uma proteína de superfície celular de linhagem específica que está diferencialmente presente nas células cancerosas. Em algumas modalidades, a proteína cancerosa é uma proteína que é específica de um tecido ou linhagem celular. Exemplos de proteínas de superfície celular de linhagem específica que estão associadas a um tipo específico de câncer incluem, sem limitação, CD20, CD22 (linfoma não Hodgkin, linfoma de células B, leucemia linfocítica crônica (LLC)), CD52 (células B CLL), CD33 (leucemia mieloide aguda (LMA)), CD10 (gp100) (leucemia linfocítica comum (pré-B) e melanoma maligno), receptor de célula T/CD3 (TCR) (linfoma de células T e leucemia), recetor célula B/CD79 (BCR) (linfoma de células B e leucemia), CD26 (malignidades epiteliais e linfoides), antígeno leucocitário humano (HLA)-DR, HLA-DP e HLA-DQ (malignidades linfoides), RCAS1 (carcinomas ginecológicos, adenocarcinomas
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23/110 biliares e adenocarcinomas ductais do pâncreas), bem como antígeno de membrana específico da próstata. Em algumas modalidades, a proteína de superfície celular CD33 está associada a células de LMA.
[0059] Qualquer um dos agentes citotóxicos aqui descritos tem como alvo uma proteína de superfície celular de linhagem específica, por exemplo, compreendendo um fragmento de ligação à proteína que se liga especificamente a um epitopo na proteína de linhagem específica.
[0060] Como aqui usado, o termo epitopo refere-se a uma sequência de aminoácidos (linear ou conformacional) de uma proteína, tal como uma proteína de superfície celular de linhagem específica, que está ligada pelas CDRs de um anticorpo. Em algumas modalidades, o agente citotóxico liga-se a um ou mais epítopos (por exemplo, ao menos 2, 3, 4, 5 ou mais) de uma proteína de superfície celular de linhagem específica. Em algumas modalidades, o agente citotóxico liga-se a mais do que um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica e as células hematopoiéticas são manipuladas de tal modo que cada um dos epítopos está ausente e/ou indisponível para ligação pelo agente citotóxico.
[0061] Em algumas modalidades, a proteína de superfície celular de linhagem específica é CD33. Como será do conhecimento de um versado na técnica, CD33 é codificado por sete éxons, incluindo os éxons 7A e 7B alternativamente processados (Brinkman-Van der Linden e outros Mol Cell. Biol. (2003) 23: 4199 a 4206).
[0062] Em algumas modalidades, a proteína de superfície celular de linhagem específica é CD19. Em algumas modalidades, a proteína de superfície celular de linhagem específica é CD33.
1. Epitopo Não Essencial de uma Proteína de Superfície Celular de Linhagem Específica [0063] Em algumas modalidades, o agente citotóxico para uso nos
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24/110 métodos aqui descritos tem como alvo um epitopo não essencial em uma proteína de superfície celular de linhagem específica. Um epitopo não essencial (ou um fragmento compreendendo tal) refere-se a um domínio dentro da proteína de linhagem específica, a mutação na qual (por exemplo, deleção) é menos provável de afetar substancialmente a bioatividade da proteína de linhagem específica e assim a bioatividade das células expressando tal. Por exemplo, quando as células hematopoiéticas compreendem uma deleção ou mutação de um epitopo não essencial de uma proteína de superfície celular de linhagem específica, essas células hematopoiéticas são capazes de se proliferar e/ou sofrer diferenciação eritropoiética a um nível similar às células hematopoiéticas que expressam uma proteína de superfície celular de linhagem específica de ocorrência natural.
[0064] Os epítopos não essenciais de uma proteína de superfície celular de linhagem específica podem ser identificados pelos métodos aqui descritos ou por métodos convencionais relacionados com a previsão da função da estrutura da proteína. Por exemplo, um epitopo não essencial de uma proteína pode ser previsto com base na comparação da sequência de aminoácidos de uma proteína de uma espécie com a sequência da proteína de outras espécies. Os domínios não conservados geralmente não são essenciais para a funcionalidade da proteína. Como será evidente para um versado na técnica, o epitopo não essencial de uma proteína é previsto usando um algoritmo ou software, tal como o software PROVEAN (ver, por exemplo: provean.jcvi.org; Choi e outros PLoS ONE (2012) 7 (10): e46688), para prever potenciais epítopos não essenciais em uma proteína de interesse de linhagem específica (epitopo candidato não essencial). Mutações, incluindo substituição e/ou deleção, podem ser feitas em qualquer um ou mais resíduos de aminoácidos de um epitopo candidato não essencial utilizando tecnologias de modificação de ácido
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25/110 nucleico convencionais. As variantes de proteína assim preparadas podem ser introduzidas em um tipo adequado de células, tais como células hematopoiéticas, e a funcionalidade da variante de proteína pode ser investigada para confirmar que o epitopo candidato não essencial é, de fato, um epitopo não essencial.
[0065] Alternativamente, um epitopo não essencial de uma proteína de superfície celular de linhagem específica pode ser identificado através da introdução de uma mutação em uma região candidata em uma proteína de linhagem específica de interesse em um tipo adequado de células hospedeiras (por exemplo, células hematopoiéticas) e examinando a funcionalidade da proteína de linhagem específica mutada nas células hospedeiras. Se a proteína de linhagem específica mutante mantiver substancialmente a atividade biológica da contraparte nativa, isto indica que a região onde a mutação é introduzida não é essencial para a função da proteína de linhagem específica.
[0066] Os métodos para avaliar a funcionalidade da proteína de superfície celular de linhagem específica e as células hematopoiéticas ou seus descendentes serão conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaios de proliferação, ensaios de diferenciação, formação de colônias, análise de expressão (por exemplo, gene e/ou proteína), localização de proteína, sinalização intracelular, ensaios funcionais, e modelos de camundongo humanizados in vivo.
[0067] Qualquer um dos métodos para identificar e/ou verificar epítopos não essenciais em proteínas de superfície celular de linhagem específica também está dentro do escopo da presente descrição.
2. Variantes de Proteínas de Superfície Celular de Linhagem Específica [0068] Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas para uso nos métodos aqui descritos expressam uma variante de uma
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26/110 proteína de superfície celular de linhagem específica de interesse, que reduziu a ligação a um agente citotóxico como aqui descrito. A variante pode não ter o epitopo ao qual o agente citotóxico se liga. Alternativamente, a variante pode conter uma ou mais mutações do epitopo ao qual o agente citotóxico se liga, de tal modo que a ligação ao agente citotóxico é reduzida ou abolida em comparação com a contraparte de proteína de superfície celular de linhagem específica natural ou de ocorrência natural. Tal variante é preferencial para manter uma atividade biológica substancialmente similar à de ocorrência natural.
[0069] A variante pode compartilhar uma homologia de sequência de ao menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou acima) como a contraparte de ocorrência natural e, em algumas modalidades, pode conter nenhuma outra mutação além daquelas para mutar ou deletar o epitopo de interesse. A identidade percentual de duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Karlin e Altschul Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264-68, 1990, modificado como em Karlin e Altschul Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-77, 1993. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, e outros J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990. Pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína da invenção. Quando existem lacunas entre duas sequências, Gapped BLAST pode ser usado como descrito por Altschul e outros, Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402, 1997. Quando utilizando programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados.
[0070] Em alguns casos, a variante contém uma ou mais substitui
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27/110 ções de resíduos de aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais) dentro do epitopo de interesse, de tal modo que o agente citotóxico não se liga ou tem ligação reduzida ao epitopo mutado. Tal variante pode ter uma afinidade de ligação substancialmente reduzida ao agente citotóxico (por exemplo, tendo uma afinidade de ligação que é ao menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% inferior à sua contraparte de ocorrência natural). Em alguns exemplos, tal variante pode ter abolido a atividade de ligação ao agente citotóxico. Em outros casos, a variante contém uma deleção de uma região que compreende o epitopo de interesse. Tal região pode ser codificada por um éxon. Em algumas modalidades, a região é um domínio da proteína de superfície celular de linhagem específica de interesse que codifica o epitopo. Em um exemplo, a variante tem apenas o epitopo deletado. O comprimento da região deletada pode variar de 3 a 60 aminoácidos, por exemplo, 5 a 50, 5 a 40, 10 a 30, 10a 20, etc.
[0071] A(s) mutação(ões) ou deleções em uma variante de uma proteína de superfície celular de linhagem específica podem estar dentro ou circundar um epitopo não essencial, tal que a(s) mutação(ões) ou deleção(ões) não afetam substancialmente a bioatividade da proteína.
[0072] Em alguns exemplos, são aqui fornecidas variantes de CD33, que podem compreender uma deleção ou mutação de um fragmento da proteína que é codificado por qualquer um dos éxons de CD33, ou uma deleção ou mutação em um epitopo não essencial. A estrutura prevista de CD33 inclui dois domínios de imunoglobulina, um domínio de IgV e um domínio de lgC2. Em algumas modalidades, uma porção do domínio V da imunoglobulina de CD33 é deletada ou mutada. Em algumas modalidades, uma porção do domínio C de imunoglobulina de CD33 é deletada ou mutada. Em algumas modalidades, o éxon 2 de CD33 é deletado ou mutado. Em algumas
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28/110 modalidades, a variante CD33 não tem os resíduos de aminoácidos W11 a T139 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o fragmento deletado ou mutado sobrepõe ou abrange o epitopo ao qual o agente citotóxico se liga. Como descrito no Exemplo 1, em algumas modalidades, o epitopo compreende os aminoácidos 47 a 51 ou 248 a 252 da porção extracelular de CD33 (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, o epitopo compreende os aminoácidos 248 a 252 (SEQ ID NO: 8), 47 a 51 (SEQ ID NO: 9), 249 a 253 (SEQ ID NO: 10), 250 a 254 (SEQ ID NO: 11), 48 a 52 (SEQ ID NO: 12), ou 251 a 255 (SEQ ID NO: 13) da porção extracelular de CD33 (SEQ ID NO: 1).
[0073] Em alguns exemplos, são fornecidas aqui variantes de CD19, que podem compreender uma deleção ou mutação de um fragmento da proteína que é codificado por qualquer um dos éxons de CD19, ou deleções ou mutações em um epitopo não essencial de CD19. A sequência inteira do gene CD19, contendo quinze éxons, é conhecida na técnica. Ver, por exemplo, o No. de acesso ao GenBank NC_000016. Por exemplo, um ou mais epítopos localizados na região codificada pelo éxon 2, o gene CD19 pode ser deletado ou mutado. Certas modificações da região do gene CD19 codificando o éxon 2 mostraram resultar em expressão da proteína CD 19 com sucesso, localização na membrana e manutenção parcial da função da proteína (Sotillo e outros, Cancer Discovery. (2015) 5: 1282 a 1295). Por exemplo, mutações missense ou de deslocamento do quadro de leitura no éxon 2 do gene CD19 ou, alternativamente, modificações que reduzem permanentemente ou transientemente a expressão do fator de splicing SRSF3, que está envolvido na retenão do éxon 2 de CD 19, podem reduzir a expressão de CD 19 in vivo. Em algumas modalidades, um ou mais epítopos localizados na região codificada pelo éxon 2 do gene CD19 são mutados ou deletados. Por exemplo, o epitopo FMC63 de CD19, que é um alvo conhecido de terapias de
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CAR direcionadas para CD19, pode ser mutado ou deletado (Sotillo e outros, Cancer Discovery. (2015) 5: 1282-129; Nicholson e outros, Mol Immunol. (1997) 34: 1157 a 1165, Zola e outros, Immunol Cell Biol (1991) 69: 411 a 422). Em algumas modalidades, o éxon 2 de CD19 é mutado ou deletado.
B. Agentes Citotóxicos
1. Anticorpos e Fragmentos de Ligação ao Antígeno [0074] Qualquer anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser usado como um agente citotóxico para construir um agente citotóxico que tem como alvo um epitopo de uma proteína de superfície celular de linhagem específica como aqui descrito. Tal anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser preparado por um método convencional, por exemplo, a tecnologia de hibridoma ou tecnologia recombinante.
[0075] Como aqui usado, o termo anticorpo refere-se a uma glicoproteína compreendendo ao menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto, isto é, heterotetrâmeros covalentes constituídos por duas cadeias idênticas de IgH e duas cadeias idênticas L cadeias que são codificadas por genes diferentes. Cada cadeia pesada é constituída por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é composta de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é constituída de uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é composta de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é
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30/110 composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complementar clássico. A formação de uma molécula de anticorpo funcional madura pode ser realizada quando duas proteínas são expressas em quantidades estequiométricas e se auto-montam com a configuração apropriada.
[0076] Em algumas modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento de anticorpo de cadeia simples (scFv) que se liga especificamente ao epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica. Em outras modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente ao epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica.
[0077] Como aqui descrito e como ser evidente para um versado na técnica, as CDRs de um anticorpo ligam-se especificamente ao epitopo de uma proteína alvo (a proteína de superfície celular de linhagem específica).
[0078] Em algumas modalidades, os anticorpos são anticorpos de comprimento total, significando que os anticorpos compreendem uma porção de fragmento cristalizável (Fc) e uma porção de fragmento de ligação ao antígeno (Fab). Em algumas modalidades, os anticorpos são do isotipo IgG, IgA, IgM, IgA ou IgD. Em algumas modalidades, uma população de anticorpos compreende um isotipo de anticorpo. Em algumas modalidades, os anticorpos são anticorpos IgG. Em algumas modalidades, os anticorpos são anticorpos IgM. Em algumas
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31/110 modalidades, uma população de anticorpos compreende mais do que um isotipo de anticorpo. Em algumas modalidades, uma população de anticorpos é composta por uma maioria de um isotipo de anticorpos, mas também contém um ou mais outros isotipos de anticorpos. Em algumas modalidades, os anticorpos são selecionados a partir do grupo que consiste em lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgAI, lgA2, IgAsec, IgD, IgE.
[0079] Os anticorpos aqui descritos podem ligar-se especificamente a uma proteína alvo. Como aqui usado, ligação específica refere-se ligação de anticorpo a uma proteína predeterminada, tal como um antígeno de câncer. Ligação específica envolve maior duração de interação, mais frequente, mais rápida, e/ou maior afinidade com uma proteína alvo em relação a proteínas alternativas. Em algumas modalidades, uma população de anticorpos liga-se especificamente a um epitopo particular de uma proteína alvo, significando que os anticorpos se ligam à proteína particular com mais frequência, mais rapidamente, com uma maior duração de interação e/ou com maior afinidade com o epitopo relativo a epítopos alternativos da mesma proteína alvo ou a epítopos de outra proteína. Em algumas modalidades, os anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo particular de uma proteína alvo podem não se ligar a outros epítopos da mesma proteína.
[0080] Anticorpos ou seus fragmentos podem ser selecionados com base na afinidade de ligação do anticorpo à proteína ou epitopo alvo. Alternativamente ou ainda, os anticorpos podem ser mutados para introduzir uma ou mais mutações para modificar (por exemplo, aumentar ou reduzir) a afinidade de ligação do anticorpo à proteína ou epitopo alvo.
[0081] Os presentes anticorpos ou porções de ligação ao antígeno podem ligar-se especificamente com uma constante de dissociação
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32/110 (Kd) inferior a cerca de 10-7 M, inferior a cerca de 10-8 M, inferior a cerca de 10-9 M, inferior a cerca de 10-1° M, inferior a cerca de 10-11 M, ou inferior a cerca de 10-12 M. As afinidades dos anticorpos de acordo com a presente descrição podem ser prontamente determinadas utilizando técnicas convencionais (ver, por exemplo, Scatchard e outros, Ann. NY Acad. Sci (1949) 51: 660 e Patentes US. Nos. 5.283.173, 5.468.614, ou equivalente).
[0082] A afinidade de ligação ou especificidade de ligação para um epitopo ou proteína pode ser determinada por uma variedade de métodos incluindo diálise de equilíbrio, ligação de equilíbrio, filtração em gel, ELISA, ressonância plasmônica de superfície ou espectroscopia.
[0083] Por exemplo, anticorpos (ou seus fragmentos de ligação ao antígeno) específicos para um epitopo de uma proteína de linhagem específica de interesse podem ser produzidos pela tecnologia de hibridoma convencional. A proteína de linhagem específica, que pode ser acoplada a uma proteína carreadora, tal como KLH, pode ser usada para imunizar um animal hospedeiro para gerar anticorpos que se ligam a esse complexo. A via e o esquema de imunização do animal hospedeiro estão geralmente de acordo com as técnicas estabelecidas e convencionais para a estimulação e produção de anticorpos, como aqui descrito. Técnicas gerais para a produção de anticorpos de camundongo, humanizados e humanos são conhecidas na técnica e são aqui descritas. É considerado que qualquer indivíduo mamífero, incluindo seres humanos ou células produtoras de anticorpos a partir do mesmo, podem ser manipuladas para servir de base para a produção de linhagens de células de hibridoma de mamífero, incluindo hibridoma humano. Tipicamente, o animal hospedeiro é inoculado de forma intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutânea, intraplantar e/ou intradérmica com uma quantidade de
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33/110 imunogene, incluindo como aqui descrito.
[0084] Os hibridomas podem ser preparados a partir dos linfócitos e células de mieloma imortalizadas utilizando a técnica geral de hibridização de células somáticas de Kohler, B. e Milstein, C. (1975) Nature 256: 495 a 497 ou tal como modificado por Buck, D. W, e outros, In vitro, 18: 377 a 381 (1982). As linhagens de mieloma disponíveis, incluindo, mas não limitadas a X63-Ag8.653 e de Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, USA, podem ser usadas na hibridização. Geralmente, a técnica envolve a fusão de células de mieloma e células linfoides, utilizando um fusogênio, tal como polietileno glicol, ou por meios elétricos bem conhecidos dos versados na técnica. Após a fusão, as células são separadas do meio de fusão e cultivadas em um meio de crescimento seletivo, tal como meio de hipoxantina - aminopterina - timidina (HAT), para eliminar as células parentais não hibridadas. Qualquer um dos meios aqui descritos, suplementados com ou sem soro, pode ser usado para cultivar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais. Como outra alternativa à técnica de fusão celular, podem ser usadas células B imortalizadas por EBV para produzir os anticorpos monoclonais similares a TCR aqui descritos. Os hibridomas são expandidos e subclonados, se desejado, e os sobrenadantes são ensaiados quanto à atividade anti-imunogênica por procedimentos convencionais de imunoensaio (por exemplo, radioimunoensaio, imunoensaio enzimático ou imunoensaio de fluorescência).
[0085] Os hibridomas que podem ser usados como fonte de anticorpos abrangem todos os derivados, células de progênie dos hibridomas parentais que produzem anticorpos monoclonais capazes de se ligarem a uma proteína de linhagem específica. Os hibridomas que produzem tais anticorpos podem ser cultivados in vitro ou in vivo utilizando procedimentos conhecidos. Os anticorpos monoclonais
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34/110 podem ser isolados a partir dos meios de cultura ou fluidos corporais, por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina tais como precipitação com sulfato de amônio, eletroforese em gel, diálise, cromatografia e ultrafiltração, se desejado. A atividade indesejada, se presente, pode ser removida, por exemplo, através da execução da preparação sobre adsorventes feitos do imunogene ligado a uma fase sólida e eluindo ou liberando os anticorpos desejados do imunogene. A imunização de um animal hospedeiro com uma proteína alvo ou um fragmento contendo a sequência de aminoácidos alvo conjugada a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina da lapa californiana, albumina de soro, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, maleimidobenzoil sulfossucinimida éster (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxisucinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido sucínico, SOCI, ou R1N = C = NR, onde R e R1 são grupos alquila diferentes, podem produzem uma população de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais).
[0086] Se desejado, um anticorpo de interesse (por exemplo, produzido por um hibridoma) pode ser sequenciado e a sequência polinucleotídica pode então ser clonada em um vetor para expressão ou propagação. A sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro. Em uma alternativa, a sequência polinucleotídica pode ser usada para manipulação genética para humanizar o anticorpo ou para melhorar a afinidade (afinidade de maturação) ou outras características do anticorpo. Por exemplo, a região constante pode ser manipulada para se assemelhar mais a regiões constantes humanas para evitar a resposta imune se o anticorpo for usado em ensaios clínicos e
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35/110 tratamentos em seres humanos. Pode ser desejável manipular geneticamente a sequência de anticorpo para obter maior afinidade com a proteína de linhagem específica. Será evidente para um versado na técnica que uma ou mais alterações polinucleotídicas podem ser feitas no anticorpo e ainda manter a sua especificidade de ligação à proteína alvo.
[0087] Em outras modalidades, anticorpos totalmente humanos podem ser obtidos utilizando camundongos comercialmente disponíveis que foram manipulados para expressar proteínas de imunoglobulina humana específicas. Os animais transgênicos que são concebidos para produzir uma resposta imune mais desejável (por exemplo, anticorpos totalmente humanos) ou mais robusta podem também ser usados para geração de anticorpos humanizados ou humanos. Exemplos de tal tecnologia são XenomouseRTM de Amgen, Inc. (Fremont, Califórnia) e HuMAb-MouseR™ e TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, N.J.). Em outra alternativa, os anticorpos podem ser produzidos de forma recombinante por tecnologia de exibição de fago ou levedura. Ver, por exemplo, Patentes 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; e 6.265.150; e Winter e outros, (1994) Annu. Rev. Immunol. 12: 433 a 455. Alternativamente, a tecnologia de exibição de fagos (McCafferty e outros, (1990) Nature 348: 552 a 553) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro, a partir de repertórios de genes do domínio variável de imunoglobulina (V) de doadores não imunizados.
[0088] Os fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo intacto (anticorpo de comprimento total) podem ser preparados através de métodos de rotina. Por exemplo, os fragmentos F(ab’)2 podem ser produzidos por digestão com pepsina de uma molécula de anticorpo, e fragmentos Fab que podem ser gerados reduzindo as pontes dissulfeto de fragmentos F(ab’)2.
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36/110 [0089] Anticorpos geneticamente modificados, tais como anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples, e anticorpos biespecíficos, podem ser produzidos, por exemplo, via tecnologia recombinante convencional. Em um exemplo, o DNA codificando para anticorpos monoclonais específicos de uma proteína alvo pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como uma fonte preferencial de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em um ou mais vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras tal como E. coli, células COS simianas, células de ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzem imunoglobulina proteína, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Ver, por exemplo, Publicação PCT No. WO 87/04462. O DNA pode então ser modificado, por exemplo, substituindo-se a sequência de codificação por domínios constantes de cadeia pesada e leve humanos em vez das sequências murinas homólogas, Morrison e outros (1984) Proc. Nat. Acad. Sei. 81: 6851, ou por ligação covalente à sequência de codificação da imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação para um polipeptídeo não imunoglobulina. Dessa maneira, os anticorpos geneticamente modificados, tal como anticorpos quiméricos ou híbridos; que podem ser preparados têm a especificidade de ligação de uma proteína alvo.
[0090] As técnicas desenvolvidas para a produção de anticorpos quiméricos são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Morrison e outros (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6851; Neuberger e outros (1984) Nature 312, 604; e Takeda e outros (1984) Nature 314:
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452.
[0091] Os métodos para a construção de anticorpos humanizados são também bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Queen e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029 a 10033 (1989). Em um exemplo, regiões variáveis de VH e VL de um anticorpo não humano parental são submetidas à análise de modelagem molecular tridimensional seguindo métodos conhecidos na técnica. Em seguida, os resíduos estruturais de aminoácidos previstos como importantes para a formação das estruturas corretas de CDR são identificados usando a mesma análise de modelagem molecular. Em paralelo, as cadeias VH e VL humanas tendo sequências de aminoácidos que são homólogas àquelas do anticorpo não humano parental são identificadas a partir de qualquer banco de dados de genes de anticorpos utilizando as sequências VH e VL parentais como consultas de pesquisa. Os genes humanos aceitadores de VH e VL são então selecionados.
[0092] As regiões CDR dentro dos genes aceitadores humanos selecionados podem ser substituídas pelas regiões CDR do anticorpo não humano parental ou suas variantes funcionais. Quando necessário, os resíduos dentro das regiões estruturais da cadeia parental que são previstos como sendo importantes na interação com as regiões CDR (ver a descrição acima) podem ser usados para substituir os resíduos correspondentes nos genes aceitadores humanos.
[0093] Um anticorpo de cadeia simples pode ser preparado através de tecnologia recombinante, ligando uma sequência nucleotídica que codifica para uma região variável de cadeia pesada e uma sequência nucleotídica que codifica para uma região variável de cadeia leve. De preferência, um ligante flexível é incorporado entre as duas regiões variáveis. Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (Patentes US. Nos. 4.946.778 e 4.704.692) podem ser adaptadas para produzir uma biblioteca scFv de
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38/110 fago ou levedura e clones de scFv específicos para uma proteína de linhagem específica podem ser identificados a partir da biblioteca seguindo procedimentos de rotina. Os clones positivos podem ser submetidos à triagem adicional para identificar aqueles que se ligam à proteína de linhagem específica.
[0094] Em alguns casos, o agente citotóxico para uso nos métodos aqui descritos compreende um fragmento de ligação ao antígeno que tem como alvo a proteína CD33 de linhagem específica. Em outros exemplos, o agente citotóxico para uso nos métodos aqui descritos compreende um fragmento de ligação ao antígeno que tem como alvo a proteína de linhagem específica CD19. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno direcionados a CD33 ou CD19 podem ser preparados pela prática de rotina. Exemplos não limitados de fragmentos de ligação ao antígeno direcionados a CD19 podem ser encontrados em Porter DL e outros NEJM (2011) 365: 725-33 e Kalos M e outros, Sci Transi Med. (2011) 3: 95ra73. Ver também descrições aqui. Tais fragmentos de ligação ao antígeno direcionados para CD19 podem ser usados para preparar os construtos de CAR descritos no presente documento.
[0095] 2. Células Imunes Expressando Receptores de Antígeno
Quiméricos [0096] Em algumas modalidades, o agente citotóxico que tem como alvo um epitopo de uma proteína de superfície celular de linhagem específica como aqui descrito é uma célula imune que expressa um receptor quimérico, que compreende um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo de cadeia simples) capaz de se ligar ao epitopo da proteína de linhagem específica (por exemplo, CD33 ou CD19). O reconhecimento de uma célula alvo (por exemplo, uma célula cancerosa) tendo o epitopo da proteína de linhagem específica em sua superfície celular pelo fragmento de ligação ao antígeno do
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39/110 receptor quimérico transduz um sinal de ativação ao(s) domínio(s) de sinalização (por exemplo, domínio de sinalização coestimulatório e/ou domínio de sinalização citoplasmático) do receptor quimérico, que pode ativar uma função efetora na célula imune que expressa o receptor quimérico.
[0097] Como aqui usado, um receptor quimérico refere-se a uma molécula de ocorrência não natural que pode ser expressa na superfície de uma célula hospedeira e compreende um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epitopo de uma proteína de superfície celular de linhagem específica. Em geral, os receptores quiméricos compreendem ao menos dois domínios que são derivados de moléculas diferentes. Em adição ao fragmento de ligação ao epitopo aqui descrito, o receptor quimérico pode ainda compreender um ou mais dos seguintes: um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, um domínio coestimulatório, um domínio de sinalização citoplasmático, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende de N terminal a C terminal, um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a uma proteína de superfície celular de linhagem específica, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização citoplasmático. Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende ainda ao menos um domínio coestimulatório.
[0098] Em algumas modalidades, os receptores quiméricos aqui descritos compreendem um ou mais domínios de dobradiça. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça pode estar localizado entre o fragmento de ligação ao antígeno e um domínio transmembrana. Um domínio de dobradiça é um segmento de aminoácido que é geralmente encontrado entre dois domínios de uma proteína e pode permitir flexibilidade da proteína e movimento de um ou ambos os domínios um em relação ao outro. Qualquer sequência de
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40/110 aminoácidos que fornece tal flexibilidade e movimento do fragmento de ligação ao antígeno em relação a outro domínio do receptor quimérico pode ser usada.
[0099] O domínio de dobradiça pode conter cerca de 10 a 200 aminoácidos, por exemplo, 15 a 150 aminoácidos, 20 a 100 aminoácidos ou 30 a 60 aminoácidos. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça pode ser de cerca de 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180,190 ou 200 aminoácidos de comprimento.
[00100] Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é um domínio de dobradiça de uma proteína de ocorrência natural. Os domínios de dobradiça de qualquer proteína conhecida na técnica por compreender um domínio de dobradiça são compatíveis para uso nos receptores quiméricos aqui descritos. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é ao menos uma porção de um domínio de dobradiça de uma proteína de ocorrência natural e confere flexibilidade ao receptor quimérico. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é de CD8a ou CD28. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é uma porção do domínio de dobradiça de CD8a, por exemplo, um fragmento contendo ao menos 15 (por exemplo, 20, 25, 30, 35 ou 40) aminoácidos consecutivos do domínio de dobradiça de CD8a ou CD28.
[00101] Os domínios de dobradiça de anticorpos, tal como um anticorpo IgG, IgA, IgM, IgE ou IgD, são também compatíveis para uso nos receptores quiméricos aqui descritos. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é o domínio de dobradiça que une os domínios constantes CH1 e CH2 de um anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é de um anticorpo e compreende o domínio de dobradiça do anticorpo e uma ou mais regiões constantes do anticorpo.
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Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça compreende o domínio de dobradiça de um anticorpo e a região constante de CH3 do anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça compreende o domínio de dobradiça de um anticorpo e as regiões constantes de CH2 e CH3 do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG, IgA, IgM, IgE ou IgD. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende a região de dobradiça e as regiões constantes CH2 e CH3 de um anticorpo lgG1. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende a região de dobradiça e a região constante CH3 de um anticorpo IgG 1.
[00102] Também dentro do escopo da presente descrição estão os receptores quiméricos compreendendo um domínio de dobradiça que é um peptídeo de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça entre o C terminal do domínio de ligação ao ligando extracelular de um receptor Fc e o N terminal do domínio transmembrana é um ligante peptídico, tal como um ligante (GlyxSer)n, em que x e n, independentemente pode ser um número inteiro entre 3 e 12, incluindo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais.
[00103] Os ligantes peptídicos adicionais que podem ser usados em um domínio de dobradiça dos receptores quiméricos aqui descritos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Wriggers e outros, Current Trends in Peptide Science (2005) 80 (6): 736 a 746, e Publicação PCT WO 2012/088461.
[00104] Em algumas modalidades, os receptores quiméricos aqui descritos podem compreender um ou mais domínios transmembrana. O domínio transmembrana para uso nos receptores quiméricos pode estar em qualquer forma conhecida na técnica. Como aqui usado, um domínio transmembrana refere-se a qualquer estrutura de proteína
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42/110 que seja termodinamicamente estável em uma membrana celular, preferencialmente uma membrana celular eucariótica. Os domínios transmembrana compatíveis para uso nos receptores quiméricos aqui usados podem ser obtidos a partir de uma proteína de ocorrência natural. Alternativamente, o domínio transmembrana pode ser um segmento de proteína sintético, de ocorrência não natural, por exemplo, um segmento de proteína hidrofóbico que é termodinamicamente estável em uma membrana celular.
[00105] Os domínios transmembrana são classificados com base na topologia do domínio transmembrana, incluindo o número de passagens que o domínio transmembrana atravessa a membrana e a orientação da proteína. Por exemplo, proteínas de membrana de passagem única atravessam a membrana celular uma vez, e proteínas de membrana de passagem múltipla atravessam a membrana celular ao menos duas vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais vezes). Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é um domínio transmembrana de passagem única. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é um domínio transmembrana de passagem única que orienta o N terminal do receptor quimérico para o lado extracelular da célula e o C terminal do receptor quimérico para o lado intracelular da célula. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é obtido a partir de uma proteína transmembrana de passagem única. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é de CD8a. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é de CD28. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é de ICOS.
[00106] Em algumas modalidades, os receptores quiméricos aqui descritos compreendem um ou mais domínios de sinalização coestimulatórios. O termo domínio de sinalização coestimulatório, como usado aqui, refere-se a ao menos uma porção de uma proteína que medeia a transdução de sinal dentro de uma célula para induzir
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43/110 uma resposta imune, tal como uma função efetora. O domínio de sinalização coestimulatório do receptor quimérico aqui descrito pode ser um domínio de sinalização citoplasmático de uma proteína coestimulatória, que transduz um sinal e modula respostas mediadas por células imunes, tal como células T, células NK, macrófagos, neutrófilos ou eosinófilos.
[00107] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende mais de um (ao menos 2, 3, 4 ou mais) domínio de sinalização coestimulatórios. Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende mais de um domínio de sinalização coestimulatório obtido a partir de diferentes proteínas coestimulatórias. Em algumas modalidades, o receptor quimérico não compreende um domínio de sinalização coestimulatório.
[00108] Em geral, muitas células imunes exigem coestimulação, além da estimulação de um sinal específico de antígeno, para promover a proliferação, diferenciação e sobrevida celular, e para ativar funções efetoras da célula. A ativação de um domínio de sinalização coestimulatório em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula imune) pode induzir a célula a aumentar ou diminuir a produção e secreção de citocinas, propriedades fagocíticas, proliferação, diferenciação, sobrevida e/ou citotoxicidade. O domínio de sinalização coestimulatório de qualquer proteína coestimulatória pode ser compatível para uso nos receptores quiméricos aqui descritos. O(s) tipo(s) de domínio de sinalização coestimulatório é selecionado com base em fatores como o tipo de células imunes nas quais os receptores quiméricos seriam expressos (por exemplo, células T primárias, linhagens de células T, linhagens de células NK) e a função efetora imune desejada (por exemplo, citotoxicidade). Exemplos de domínios de sinalização coestimulatórios para uso nos receptores quiméricos podem ser o domínio de sinalização citoplasmático de proteínas
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44/110 coestimulatórias, incluindo, sem limitação, CD27, CD28, 4-1 BB, 0X40, CD30, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3. Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório é derivado de 4-1 BB, CD28 ou ICOS. Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório é derivado de CD28 e o receptor quimérico compreende um segundo domínio coestimulatório de 4-1 BB ou ICOS.
[00109] Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório é um domínio de fusão compreendendo mais de um domínio coestimulatório ou porções de mais de um domínio coestimulatório. Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório é uma fusão de domínios coestimulatórios de CD28 e ICOS.
[00110] Em algumas modalidades, os receptores quiméricos aqui descritos compreendem um ou mais domínios de sinalização citoplasmático(s). Qualquer domínio de sinalização citoplasmático pode ser usado nos receptores quiméricos aqui descritos. Em geral, um domínio de sinalização citoplasmático transmite um sinal, tal como a interação de um domínio de ligação ao ligando extracelular com o seu ligando, para estimular uma resposta celular, tal como a indução de uma função efetora da célula (por exemplo, citotoxicidade).
[00111] Como será evidente para um versado na técnica, um fator envolvido na ativação de células T é a fosforilação do motivo de ativação do imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM) de um domínio de sinalização citoplasmático. Qualquer domínio contendo ITAM conhecido na técnica pode ser usado para construir os receptores quiméricos aqui descritos. Em geral, um motivo ITAM pode compreender duas repetições da sequência de aminoácidos YxxL/l separadas por 6 a 8 aminoácidos, em que cada x é independentemente qualquer aminoácido, produzindo o motivo conservado YxxL/lx(68)YxxL/l. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático é de CD3Ç.
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45/110 [00112] Em algumas modalidades, o receptor quimérico aqui descrito tem como alvo uma proteína do tipo 2. Em algumas modalidades, o receptor quimérico tem como alvo CD33. Em algumas modalidades, o receptor quimérico aqui descrito tem como alvo uma proteína do tipo 1. Em algumas modalidades, o receptor quimérico tem como alvo CD19. Tal receptor quimérico pode compreender um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um scFv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve que se liga a CD19. Alternativamente, o receptor quimérico pode compreender um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve que se liga a CD33.
[00113] Um construto de receptor quimérico direcionado a CD33 ou CD19 pode ainda compreender ao menos um domínio de dobradiça (por exemplo, de CD28, CD8a ou um anticorpo), um domínio transmembrana (por exemplo, de CD8a, CD28 ou ICOS), um ou mais domínios coestimulatórios (de um ou mais de CD28, ICOS ou 4-1 BB) e um domínio de sinalização citoplasmático (por exemplo, de CD3Ç), ou uma combinação dos mesmos.
[00114] Qualquer um dos receptores quiméricos aqui descritos pode ser preparado por métodos de rotina, tais como tecnologia recombinante. Os métodos para a preparação dos receptores quiméricos envolvem a geração de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo cada um dos domínios dos receptores quiméricos, incluindo o fragmento de ligação ao antígeno e, opcionalmente, o domínio de dobradiça, o domínio transmembrana, ao menos um domínio de sinalização coestimulatório e domínio de sinalização citoplasmático. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam os componentes de um receptor quimérico são unidos em conjunto utilizando tecnologia recombinante.
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46/110 [00115] Sequências de cada um dos componentes dos receptores quiméricos podem ser obtidas via tecnologia de rotina, por exemplo, amplificação por PCR de qualquer uma de uma variedade de fontes conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, as sequências de um ou mais dos componentes dos receptores quiméricos são obtidas a partir de uma célula humana. Alternativamente, as sequências de um ou mais componentes dos receptores quiméricos podem ser sintetizadas. Sequências de cada um dos componentes (por exemplo, domínios) podem ser unidas direta ou indiretamente (por exemplo, utilizando uma sequência de ácido nucleico codificando um ligante peptídico) para formar uma sequência de ácido nucleico codificando o receptor quimérico, utilizando métodos tais como amplificação por PCR ou ligação. Alternativamente, o ácido nucleico que codifica o receptor quimérico pode ser sintetizado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é DNA. Em outras modalidades, o ácido nucleico é RNA.
[00116] A mutação de um ou mais resíduos dentro de um ou mais dos componentes do receptor quimérico (por exemplo, o fragmento de ligação ao antígeno, etc.) pode ser realizada antes ou após a ligação das sequências de cada um dos componentes. Em algumas modalidades, uma ou mais mutações em um componente do receptor quimérico podem ser feitas para modular (aumentar ou diminuir) a afinidade do componente para um epitopo (por exemplo, o fragmento de ligação ao antígeno para a proteína alvo) e/ou modular a atividade do componente.
[00117] Qualquer um dos receptores quiméricos aqui descritos pode ser introduzido em uma célula imune adequada para expressão através de tecnologia convencional. Em algumas modalidades, as células imunes são células T, tais como células T primárias ou linhagens de células T. Alternativamente, as células imunes podem ser células NK, tais como linhagens de células NK estabelecidas (por exemplo, células
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NK-92). Em algumas modalidades, as células imunes são células T que expressam CD8 (CD8+) ou CD8 e CD4 (CD8+ / CD4+). Em algumas modalidades, as células T são células T de uma linhagem de células T estabelecida, por exemplo, células 293T ou células Jurkat.
[00118] As células T primárias podem ser obtidas a partir de qualquer fonte, tais como células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), medula óssea, tecidos tais como baço, nódulo linfático, timo ou tecido tumoral. Uma fonte adequada para obter o tipo de células imunes desejadas seria evidente para um versado na técnica. Em algumas modalidades, a população de células imunes é derivada de um paciente humano tendo uma malignidade hematopoiética, tal como a partir da medula óssea ou de PBMCs obtidas a partir do paciente. Em algumas modalidades, a população de células imunes é derivada de um doador saudável. Em algumas modalidades, as células imunes são obtidas a partir do indivíduo a quem as células imunes que expressam os receptores quiméricos serão subsequentemente administradas. As células imunes que são administradas ao mesmo indivíduo a partir do qual as células foram obtidas são chamadas de células autólogas, enquanto as células imunes que são obtidas a partir de um indivíduo que não é o indivíduo a quem as células serão administradas são chamadas de células alogênicas.
[00119] O tipo de células hospedeiras desejadas pode ser expandido dentro da população de células obtidas por coincubação das células com moléculas estimuladoras, por exemplo, anticorpos anti-CD3 e antiCD28 podem ser usados para expansão de células T.
[00120] Para construir as células imunes que expressam qualquer um dos construtos de receptor quimérico aqui descritos, vetores de expressão para a expressão estável ou transiente do construto de receptor quimérico podem ser construídos através de métodos convencionais como aqui descrito e introduzidos em células
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48/110 hospedeiras imunes. Por exemplo, os ácidos nucleicos que codificam os receptores quiméricos podem ser clonados em um vetor de expressão adequado, tal como um vetor viral em ligação operável a um promotor adequado. Os ácidos nucleicos e o vetor podem ser colocados em contato, sob condições adequadas, com uma enzima de restrição para criar extremidades complementares em cada molécula que podem parear uma com a outra e ser unidas a uma ligase. Alternativamente, os ligantes de ácido nucleico sintéticos podem ser ligados aos terminais do ácido nucleico que codifica os receptores quiméricos. Os ligantes sintéticos podem conter sequências de ácido nucleico que correspondem a um sítio de restrição particular no vetor. A seleção de vetores de expressão / plasmídeos / vetores virais dependería do tipo de células hospedeiras para a expressão dos receptores quiméricos, mas deveria ser adequada para a integração e a replicação em células eucarióticas.
[00121] Uma variedade de promotores pode ser usada para a expressão dos receptores quiméricos aqui descritos, incluindo, sem limitação, o promotor precoce intermediário de citomegalovírus (CMV), uma LTR viral tal como a LTR do vírus do sarcoma de Rous, a LTR de HIV, LTR de HTLV-1, LTR do vírus da leucemia murina de Maloney (MMLV), LTR do vírus do sarcoma mieoloproliferativo (MPSV), LTR do vírus formadores de foco no baço (SFFV), promotor precoce do vírus símio 40 (SV40), promotor do vírus herpes simplex tk, promotor do fator de alongamento do fator 1-alfa (EF1-a) com ou sem o íntron EF1-a. Promotores adicionais para a expressão dos receptores quiméricos incluem qualquer promotor constitutivamente ativo em uma célula imune. Alternativamente, qualquer promotor regulável pode ser usado, de tal modo que a sua expressão possa ser modulada dentro de uma célula imune.
[00122] Ainda, o vetor pode conter, por exemplo, alguns ou todos os
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49/110 seguintes: um gene marcador selecionável, tal como o gene da neomicina para seleção de transfectantes estáveis ou transientes em células hospedeiras; sequências estimuladoras / promotoras a partir do gene precoce imediato do CMV humano para níveis elevados de transcrição; terminação de transcrição e sinais de processamento de RNA de SV40 para estabilidade de mRNA; regiões 5’- e 3’- não traduzidas para estabilidade de mRNA e eficiência de tradução a partir de genes altamente expressos como α-globina ou β-globina; origens de replicação do polioma SV40 e ColE1 para replicação epissômica adequada; sítios internos de ligação ao ribossoma (IRESes), múltiplos sítios de clonagem versáteis; promotores de RNA T7 e SP6 para transcrição in vitro de RNA senso e antissenso; um comutador suicida ou gene suicida que quando desencadeado faz com que as células que transportam o vetor morram (por exemplo, timidina quinase de HSV, uma caspase induzível tal como iCasp9), e gene repórter para avaliar a expressão do receptor quimérico. Ver a seção VI abaixo. Vetores e métodos adequados para a produção de vetores contendo transgenes são bem conhecidos e estão disponíveis na técnica. Exemplos da preparação de vetores para a expressão de receptores quiméricos podem ser encontrados, por exemplo, em US2014/0106449, aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00123] Em algumas modalidades, o construto do receptor quimérico ou o ácido nucleico que codifica o dito receptor quimérico é uma molécula de DNA. Em algumas modalidades, o construto do receptor quimérico ou o ácido nucleico que codifica o dito receptor quimérico é um vetor de DNA e pode ser eletroporado para células imunes (ver, por exemplo, Till, e outros, Blood (2012) 119 (17): 3940 a 3950). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o receptor quimérico é uma molécula de RNA, que pode ser eletroporada para células imunes.
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50/110 [00124] Qualquer um dos vetores compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um construto de receptor quimérico aqui descrito está também dentro do escopo da presente descrição. Tal vetor pode ser entregue a células hospedeiras, tais como células imunes do hospedeiro, por um método adequado. Os métodos de entregar vetores a células imunes são bem conhecidos na técnica e podem incluir eletroporação de DNA, RNA ou transposons, reagentes de transfecção, tais como lipossomas ou nanopartículas, para entregar DNA, RNA ou transposons; entrega de DNA, RNA, ou transposons ou proteína por deformação mecânica (ver, por exemplo, Sharei e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (2013) 110 (6): 2082 a 2087); ou transdução viral. Em algumas modalidades, os vetores para a expressão dos receptores quiméricos são entregues a células hospedeiras por transdução viral. Os métodos virais exemplificativos para entrega incluem, mas não estão limitados a, retrovirus recombinantes (ver, por exemplo, Publicações PCT No. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; Patentes US Nos. 5.219.740 e 4.777.127; Patente GB No. 2.200.651; e Patente EP No. 345452), vetores baseados em alfavírus e vetores de vírus adenoassociados (AAV) (ver, por exemplo, Publicações PCT Nos. WO 94/12649; WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655). Em algumas modalidades, os vetores para expressão dos receptores quiméricos são retrovirus. Em algumas modalidades, os vetores para expressão dos receptores quiméricos são lentivírus. Em algumas modalidades, os vetores para expressão dos receptores quiméricos são vírus adenoassociados.
[00125] Nos exemplos em que os vetores que codificam receptores quiméricos são introduzidos nas células hospedeiras usando um vetor viral, as partículas virais que são capazes de infectar as células imunes e transportam o vetor podem ser produzidas por qualquer
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51/110 método conhecido na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, nos Pedidos PCT Nos. WO 1991/002805A2, WO 1998/009271 A1, e Patente US 6.194.191. As partículas virais são colhidas a partir do sobrenadante de cultura celular e podem ser isoladas e/ou purificadas antes do contato das partículas virais com as células imunes.
[00126] Os métodos de preparação de células hospedeiras expressando qualquer um dos receptores quiméricos aqui descritos podem compreender ativar e/ou expandir as células imunes ex vivo. A ativação de uma célula hospedeira significa estimular uma célula hospedeira em um estado de ativação no qual a célula pode ser capaz de realizar funções efetoras (por exemplo, citotoxicidade). Os métodos de ativação de uma célula hospedeira dependerão do tipo de célula hospedeira usada para a expressão dos receptores quiméricos. A expansão das células hospedeiras pode envolver qualquer método que resulte em um aumento do número de células que expressam receptores quiméricos, por exemplo, permitindo que as células hospedeiras se proliferem ou estimulando as células hospedeiras a se proliferarem. Os métodos para estimular a expansão das células hospedeiras dependerão do tipo de célula hospedeira usada para a expressão dos receptores quiméricos e serão evidentes para um versado na técnica. Em algumas modalidades, as células hospedeiras que expressam qualquer um dos receptores quiméricos aqui descritos são ativadas e/ou expandidas ex vivo antes da administração a um indivíduo.
3. Conjugado Anticorpo - Fármaco [00127] Em algumas modalidades, o agente citotóxico direcionado a um epitopo de uma proteína de superfície celular de linhagem específica é um conjugado anticorpo - fármaco (ADC). Como será evidente para um versado na técnica, o termo conjugado anticorpo fármaco pode ser usado de forma intercambiável com imunotoxina e
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52/110 refere-se a uma molécula de fusão compreendendo um anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) conjugado com uma toxina ou molécula de fármaco. A ligação do anticorpo ao epitopo correspondente da proteína alvo permite a entrega da toxina ou molécula de fármaco a uma célula que apresenta a proteína (e o seu epitopo) na superfície celular (por exemplo, célula alvo), resultando assim na morte da célula alvo. Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo
- fármaco (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) se liga ao seu epitopo correspondente de uma proteína de superfície celular de linhagem específica, mas não se liga a uma proteína de superfície celular de linhagem específica que não tem o epitopo ou na qual o epitopo foi mutado.
[00128] Em algumas modalidades, o agente é um conjugado anticorpo - fármaco. Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo
- fármaco compreende um fragmento de ligação ao antígeno e uma toxina ou fármaco que induz a citotoxicidade em uma célula alvo. Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo - fármaco tem como alvo uma proteína do tipo 2. Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo - fármaco tem como alvo CD33. Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo - fármaco tem como alvo uma proteína do tipo 1. Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo - fármaco tem como alvo CD19.
[00129] As toxinas ou fármacos compatíveis para uso no conjugado anticorpo - fármaco são bem conhecidos na técnica e serão evidentes para um versado na técnica. Ver, por exemplo, Peters e outros, Biosci. Rep. (2015) 35 (4): e00225. Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo - fármaco pode ainda compreender um ligante (por exemplo, um ligante peptídico, tal como um ligante clivável) acoplando o anticorpo e a molécula de fármaco.
[00130] Em algumas modalidades, dois ou mais epítopos de uma
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53/110 proteína de superfície celular de linhagem específica foram modificados, permitindo que dois agentes citotóxicos diferentes (por exemplo, dois ADCs) sejam direcionados para os dois epítopos. Em algumas modalidades, as toxinas carregadas pelos ADCs podem trabalhar sinergicamente para aumentar a eficácia (por exemplo, a morte das células alvo).
[00131] Um ADC aqui descrito pode ser usado como um tratamento de seguimento para indivíduos que foram submetidos à terapia combinada tal como aqui descrito.
Células Hematopoiéticas [00132] A presente descrição também fornece células hematopoiéticas ou descendentes das quais expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica ou suas variantes para uso nos métodos de tratamento aqui descritos. As células hematopoiéticas ou seus descendentes são manipuladas de modo a não se ligarem ao agente citotóxico ou terem uma ligação reduzida com o agente citotóxico. Como usado aqui, descendentes de células hematopoiéticas incluem qualquer tipo de célula ou linhagem de células que surgem das células hematopoiéticas. Em algumas modalidades, os descendentes das células hematopoiéticas são um tipo de célula ou linhagem de células que se diferenciaram a partir das células hematopoiéticas.
[00133] Como aqui usado, o termo ligação reduzida refere-se à ligação que é reduzida em ao menos 25%. O nível de ligação pode referir-se à quantidade de ligação do agente citotóxico a uma célula hematopoiética ou descendente desta ou à quantidade de ligação do agente citotóxico à proteína de superfície celular de linhagem específica. O nível de ligação de uma célula hematopoiética ou descendente desta que foi manipulado para um agente citotóxico pode ser relativo ao nível de ligação do agente citotóxico a uma célula
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54/110 hematopoiética ou descendente desta que não tenha sido manipulada como determinado pelo mesmo ensaio nas mesmas condições. Alternativamente, o nível de ligação de uma proteína de superfície celular de linhagem específica que não tem um epitopo para um agente citotóxico pode ser relativo ao nível de ligação do agente citotóxico a uma proteína de superfície celular de linhagem específica que contém o epitopo (por exemplo, uma proteína de ocorrência natural), conforme determinado pelo mesmo ensaio nas mesmas condições. Em algumas modalidades, a ligação é reduzida em ao menos 25%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100 %. Em algumas modalidades, a ligação é reduzida de tal modo que não há substancialmente nenhuma ligação detectável em um ensaio convencional.
[00134] Como aqui usado, sem ligação refere-se substancialmente a nenhuma ligação, por exemplo, nenhuma ligação detectável ou apenas ligação de linha de base como determinado em um ensaio de ligação convencional. Em algumas modalidades, não existe ligação entre as células hematopoiéticas ou seus descendentes que foram manipuladas e o agente citotóxico. Em algumas modalidades, não existe ligação detectável entre as células hematopoiéticas ou seus descendentes que foram manipulados e o agente citotóxico. Em algumas modalidades, nenhuma ligação das células hematopoiéticas ou descendentes destas ao agente citotóxico refere-se a um nível de linha de base de ligação, como mostrado utilizando qualquer ensaio de ligação convencional conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o nível de ligação das células hematopoiéticas ou seus descendentes que foram manipulados e o agente citotóxico não é biologicamente significativo. O termo sem ligação não se destina a exigir a ausência
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55/110 absoluta de ligação.
[00135] Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são células-tronco hematopoiéticas. As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são capazes de dar origem tanto a células progenitoras mieloides quanto linfoides que dão origem a células mieloides (por exemplo, monócitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, células dendríticas, eritrócitos, plaquetas, etc.) e células linfoides (por exemplo, células T, células B, células NK), respectivamente. As HSCs são caracterizadas pela expressão do marcador de superfície celular CD34 (por exemplo, CD34+), que pode ser usado para a identificação e/ou o isolamento de HSCs, e ausência de marcadores de superfície celular associados ao comprometimento com uma linhagem celular.
[00136] Em algumas modalidades, as HSCs são obtidas a partir de um indivíduo, tal como um indivíduo mamífero. Em algumas modalidades, o indivíduo mamífero é um primata não humano, um roedor (por exemplo, camundongo ou rato), um bovino, um porco, um equino ou um animal doméstico. Em algumas modalidades, as HSCs são obtidas a partir de um paciente humano, tal como um paciente humano com uma malignidade hematopoiética. Em algumas modalidades, as HSCs são obtidas a partir de um doador saudável. Em algumas modalidades, as HSCs são obtidas a partir do indivíduo a quem as células imunes expressando os receptores quiméricos serão subsequentemente administradas. As HSCs que são administradas ao mesmo indivíduo do qual as células foram obtidas são chamadas de células autólogas, enquanto HSCs que são obtidas de um indivíduo que não é o indivíduo a quem as células serão administradas são chamadas de células alogênicas.
[00137] Em algumas modalidades, as HSCs que são administradas ao indivíduo são células alogênicas. Em algumas modalidades, as HSCs são obtidas a partir de um doador tendo um haplótipo HLA que
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56/110 é combinado com o haplótipo HLA do indivíduo. O Antígeno Leucocitário Humano (HLA) codifica as proteínas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em humanos. As moléculas de MHC estão presentes na superfície de células apresentadoras de antígeno bem como muitos outros tipos de células e apresentam peptídeos dos próprios antígenos e antígenos não próprios (por exemplo, estranhos) para a imunovigilância. No entanto, os HLA são altamente polimórficos, o que resulta em muitos alelos distintos. Alelos diferentes (estranhos, não próprios) podem ser antigênicos e estimular as respostas imunes adversas robustas, particularmente no transplante de órgãos e células. As moléculas de HLA reconhecidas como estranhas (não próprias) podem resultar em rejeição de transplante. Em algumas modalidades, é desejável administrar HSCs do doador que tenha o mesmo tipo de HLA que o paciente para reduzir a incidência de rejeição.
[00138] Os lóci HLA de um indivíduo doador podem ser tipificados para identificar um indivíduo como doador de HLA correspondente para o indivíduo. Os métodos para tipagem dos lóci de HLA serão evidentes para um versado na técnica e incluem, por exemplo, métodos de sorologia (sorotipagem), tipagem celular, sequenciação de genes, fenotipagem e PCR. Um HLA de um doador é considerado pareado com o HLA do indivíduo se os lóci de HLA do doador e do indivíduo forem idênticos ou suficientemente semelhantes de tal modo que não seja esperada uma resposta imune adversa.
[00139] Em algumas modalidades, o HLA do doador não é combinado com o HLA do indivíduo. Em algumas modalidades, ao indivíduo são administrados HSCs que não são HLA correspondente com o HLA do indivíduo. Em algumas modalidades, ao indivíduo são ainda administrados um ou mais agentes imunossupressores para reduzir ou prevenir a rejeição das células HSC do doador.
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57/110 [00140] As HSCs podem ser obtidas a partir de qualquer fonte adequada utilizando meios convencionais conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, as HSCs são obtidas a partir de uma amostra de um indivíduo (ou doador), tal como uma amostra de medula óssea ou de uma amostra de sangue. Alternativamente ou ainda, as HSCs podem ser obtidas a partir de um cordão umbilical. Em algumas modalidades, as HSCs são de medula óssea, células do sangue do cordão, ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Em geral, as células de medula óssea podem ser obtidas a partir da crista ilíaca, fêmur, tíbia, coluna vertebral, costela ou outros espaços medulares de um indivíduo (ou doador). A medula óssea pode ser retirada do paciente e isolada através de várias separações e procedimentos de lavagem conhecidos na técnica. Um procedimento exemplificative para o isolamento de células da medula óssea compreende as seguintes etapas: a) extração de uma amostra de medula óssea; b) separação centrífuga da suspensão de medula óssea em três frações e coleta da fração intermediária, ou creme leucocitário; c) a fração de creme leucocitário da etapa é (b) centrifugada mais uma vez em um fluido de separação, geralmente Ficoll™, e uma fração intermediária que contém as células de medula óssea é coletada; e d) lavagem da fração coletada a partir da etapa (c) para recuperação de células de medula óssea re-transfectadas.
[00141] As HSCs tipicamente residem na medula óssea, mas podem ser mobilizadas para o sangue circulante por meio da administração de um agente mobilizador, a fim de coletar HSCs a partir do sangue periférico. Em algumas modalidades, ao indivíduo (ou doador) a partir do qual as HSCs são obtidas é administrado um agente mobilizador, tal como fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF). O número de HSCs coletadas após a mobilização usando um agente mobilizador é tipicamente maior do que o
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58/110 número de células obtidas sem o uso de um agente mobilizador.
[00142] As HSCs para uso nos métodos aqui descritos podem expressar a proteína de superfície celular de linhagem específica de interesse. Em qualquer das modificações aqui descritas (por exemplo, modificação genética ou incubação com um agente de bloqueio), as HSCs não seriam direcionadas pelo agente de citotoxicidade também aqui descrito. Alternativamente, as HSCs para uso nos métodos aqui descritos podem não expressar a proteína de superfície celular de linhagem específica de interesse (por exemplo, CD19); no entanto, as células descendentes diferenciadas das HSCs (por exemplo, células B) expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica. Após modificação genética, um gene endógeno das HSCs que codificam a proteína de superfície celular de linhagem específica pode ser rompido em uma região que codifica um epitopo não essencial da proteína de superfície celular de linhagem específica. As células descendentes diferenciadas de tais HSC modificadas (por exemplo, in vivo) expressariam uma proteína de superfície celular de linhagem específica modificada tendo o epitopo não essencial mutado de tal modo que não seriam direcionados pelo agente de citotoxicidade capaz de se ligar ao epitopo não essencial.
[00143] Em algumas modalidades, uma amostra é obtida a partir de um indivíduo (ou doador) e é então enriquecida para um tipo de célula desejado (por exemplo, células CD34+ / CD33-). Por exemplo, as células hematopoiéticas PBMC e/ou CD34+ podem ser isoladas a partir do sangue como aqui descrito. As células também podem ser isoladas a partir de outras células, por exemplo, por isolamento e/ou ativação com um anticorpo que se liga a um epitopo na superfície celular do tipo de célula desejado. Outro método que pode ser usado inclui a seleção negativa utilizando anticorpos para marcadores de superfície celular para enriquecer seletivamente para um tipo de célula
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59/110 específica sem ativar a célula através do engajamento do receptor.
[00144] As populações de HSC podem ser expandidas antes ou após a manipulação da HSC de tal modo que não se liguem ao agente citotóxico ou tenham uma ligação reduzida com o agente citotóxico. As células podem ser cultivadas sob condições que compreendem um meio de expansão compreendendo uma ou mais citocinas, tais como fator de célula-tronco (SCF), ligando Flt-3 (Flt3L), trombopoietina (TPO), Interleucina 3 (IL-3) ou Interleucina 6 (IL-6). A célula pode ser expandida por cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 dias ou qualquer intervalo necessário. Em algumas modalidades, as HSC são expandidas após isolamento de uma população de células desejada (por exemplo, CD34+ / CD33-) a partir de uma amostra obtida de um indivíduo (ou doador) e antes da manipulação (por exemplo, engenharia genética, contato com um agente bloqueador). Em algumas modalidades, as HSC são expandidas após engenharia genética, expandindo, desse modo, seletivamente as células que sofreram a modificação genética e não têm o epitopo (por exemplo, têm uma deleção ou substituição de ao menos uma porção do epitopo) da proteína de superfície celular de linhagem específica à qual o agente citotóxico se liga. Em algumas modalidades, uma célula (um clone) ou várias células tendo uma característica desejada (por exemplo, fenótipo ou genótipo) após modificação genética podem ser selecionadas e expandidas independentemente. Em algumas modalidades, as HSC são expandidas antes de colocar em contato a HSC com um agente bloqueador que se liga ao epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica, fornecendo assim uma população de HSC que expressa a proteína de superfície celular de linhagem específica que não pode ser ligada pelo agente citotóxico devido ao bloqueio do epitopo correspondente pelo agente bloqueador.
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60/110 [00145] Como descrito aqui, as células hematopoiéticas ou os seus descendentes expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica alvo pelo agente citotóxico, mas são manipuladas de tal modo que o agente citotóxico não se liga ou tem ligação reduzida com a proteína de superfície celular de linhagem específica. O termo manipulado, como aqui usado, refere-se à manipulação genética (isto é, engenharia genética) ou qualquer outra forma de manipulação ou modificação que resulte no epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica ausente, mutado e/ou não disponível para ligação pelo agente citotóxico. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são manipuladas através do contato das células hematopoiéticas com um agente bloqueador que compreende o fragmento de ligação ao antígeno, que bloqueia o epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica da ligação pelo agente citotóxico. As células hematopoiéticas podem ser colocadas em contato com o agente bloqueador ex vivo, por exemplo, incubando as células com o agente bloqueador na cultura de tecidos. Alternativamente ou ainda, as células hematopoiéticas podem ser colocadas em contato com o agente bloqueador in vivo, por exemplo, o agente bloqueador é coadministrado ao indivíduo simultaneamente com as células hematopoiéticas.
[00146] Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são geneticamente manipuladas de tal modo que as células não têm o epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica à qual o agente citotóxico (o seu fragmento de ligação ao antígeno) se liga. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são geneticamente manipuladas, de tal modo que expressam qualquer variante de proteína de superfície celular de linhagem específica aqui descrita, em que o epitopo para ligação ao agente citotóxico é mutado ou deletado. Ainda em outras modalidades, dois ou mais epítopos são genetica
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61/110 mente modificados para permitir o direcionamento de dois ou mais agentes citotóxicos ou imunomoduladores para as células para as quais a morte celular é desejada. Como aqui usado, as células hematopoiéticas manipuladas, incluindo uma proteína de superfície celular de linhagem específica presente nas células hematopoiéticas, são consideradas como não se ligando ao agente citotóxico se houver uma redução substancial (ou ausência) de ligação, incluindo a ligação prevista, do agente citotóxico à proteína de superfície celular de linhagem específica manipulada de tal modo que respostas significativas não seriam induzidas quando o agente citotóxico está em contato com as células hematopoiéticas. Em alguns exemplos, o agente citotóxico não se liga de forma alguma a uma variante de proteína de linhagem específica expressa nas células hematopoiéticas, isto é, somente uma ligação de nível básico pode ser detectada por um método de ensaio convencional em comparação com um controle em branco ou negativo como conhecido na técnica.
[00147] Em algumas modalidades, o epitopo ao qual o agente citotóxico se liga não está presente (isto é, o epitopo ou ao menos uma porção do epitopo foi deletado) na proteína de superfície celular de linhagem específica. Em algumas modalidades, o epitopo ao qual o agente citotóxico se liga foi mutado (por exemplo, ao menos 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos do epitopo) tal que o epitopo não esteja mais presente e/ou o epitopo já não é reconhecido pelo agente citotóxico. A ligação de um agente citotóxico a um epitopo de uma proteína pode ser avaliada por qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, a presença de um epitopo de uma proteína de superfície celular de linhagem específica pode ser avaliada através da detecção do epitopo com um anticorpo específico do antígeno (por exemplo, métodos de citometria de fluxo, Western blotting).
[00148] Qualquer uma das células hematopoiéticas geneticamente
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62/110 modificadas, tais como HSCs, que não têm um epitopo de uma proteína de superfície celular de linhagem específica, pode ser preparada por um método de rotina ou por um método aqui descrito. Em algumas modalidades, a engenharia genética é realizada usando a edição do genoma. Como aqui usado, edição de genoma refere-se a um método de modificação do genoma, incluindo qualquer sequência nucleotídica codificante ou não codificante de proteína, de um organismo para anular a expressão de um gene alvo. Em geral, os métodos de edição do genoma envolvem o uso de uma endonuclease que é capaz de clivar o ácido nucleico do genoma, por exemplo, em uma sequência nucleotídica alvo. A reparação das quebras de cadeia dupla no genoma pode ser feita introduzindo mutações e/ou ácido nucleico exógeno pode ser inserido no sítio alvo.
[00149] Os métodos de edição de genoma são geralmente classificados com base no tipo de endonuclease que está envolvida na geração de quebras de cadeia dupla no ácido nucleico alvo. Estes métodos incluem o uso de nucleases dedo de zinco (ZFN), nuclease baseada em efetores do tipo ativador de transcrição (TALEN), meganucleases, e sistemas CRISPR / Cas.
[00150] Em um aspecto da presente descrição, a substituição de células cancerosas por uma população modificada de células normais é realizada utilizando células normais que foram manipuladas de tal modo que as células não se ligam ao agente citotóxico. Tal modificação pode incluir a deleção ou mutação de um epitopo da proteína de linhagem específica utilizando um sistema CRISPR-Cas9, em que o sistema de Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Interespaçadas Agrupadas (CRISPR)-Cas9 é um sistema CRISPR-Cas9 que não ocorre naturalmente modificado.
[00151] A presente descrição utiliza o sistema CRISPR / Cas9 que hibridiza com uma sequência alvo em um polinucleotideo de proteína
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63/110 de linhagem específica, em que o sistema CRISPR / Cas9 compreende uma nuclease Cas9 e um crRNA / tracrRNA manipulado (ou RNA guia simples). O complexo CRISPR / Cas9 pode ligar-se ao polinucleotideo de proteína de linhagem específica e permitir a divagem do polinucleotideo de proteína, modificando assim o polinucleotideo.
[00152] O sistema CRISPR / Cas da presente descrição pode ligarse e/ou clivar a região de interesse dentro de uma proteína de superfície celular de linhagem específica em uma região codificante ou não codificante, dentro ou adjacente ao gene, tal como, por exemplo, uma sequência líder, sequência de reboque ou íntron, ou dentro de uma região não transcrita, a montante ou à jusante da região codificante. Os RNAs guia (gRNAs) usados na presente descrição podem ser concebidos de tal modo que o gRNA dirija a ligação dos complexos Cas9-gRNA para sítios de divagem pré-determinados (sítio alvo) em um genoma. Os sítios de divagem podem ser escolhidos de forma a liberar um fragmento que contém uma região de sequência desconhecida, ou uma região contendo um SNP, inserção de nucleotídeos, deleção de nucleotídeos, rearranjo, etc.
[00153] A divagem de uma região do gene pode compreender a divagem de uma ou duas cadeias na localização da sequência alvo pela enzima Cas. Em uma modalidade, tal divagem pode resultar na diminuição da transcrição de um gene alvo. Em outra modalidade, a divagem pode compreender ainda reparar o polinucleotideo alvo clivado por recombinação homóloga com um polinucleotideo modelo exógeno, em que a reparação resulta em uma inserção, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos do polinucleotideo alvo.
[00154] Os termos gRNA, RNA guia e sequência guia CRISPR podem ser usados de forma intercambiável e referem-se a um ácido nucleico compreendendo uma sequência que determina a especificidade de uma proteína de ligação ao DNA Cas de um sistema
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CRISPR/Cas. Um gRNA hibridiza com (complementar a, parcialmente ou completamente) uma sequência de ácido nucleico alvo no genoma de uma célula hospedeira. O gRNA ou sua porção que hibridiza com o ácido nucleico alvo pode ter entre 15 e 25 nucleotideos, 18 e 22 nucleotideos ou 19 e 21 nucleotideos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência de gRNA que hibridiza com o ácido nucleico alvo tem 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotideos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência de gRNA que hibridiza com o ácido nucleico alvo está entre 10 e 30, ou entre 15 e 25 nucleotideos de comprimento.
[00155] Além de uma sequência que se liga a um ácido nucleico alvo, em algumas modalidades, o gRNA também compreende uma sequência de arcabouço. A expressão de um gRNA que codifica tanto uma sequência complementar a um ácido nucleico alvo quanto uma sequência de arcabouço tem a função dupla de ligação (hibridização) com o ácido nucleico alvo e recrutamento da endonuclease para o ácido nucleico alvo, o que pode resultar em atividade CRISPR sítioespecífica. Em algumas modalidades, esse gRNA quimérico pode ser chamado de um RNA guia único (sgRNA).
[00156] Como aqui usado, uma sequência de arcabouço, também chamada de um tracrRNA, refere-se a uma sequência de ácido nucleico que recruta uma endonuclease Cas para um ácido nucleico alvo ligado (hibridizado) a uma sequência de gRNA complementar. Qualquer sequência de arcabouço que compreende ao menos uma estrutura de alça de haste e recruta uma endonuclease pode ser usada nos elementos genéticos e vetores aqui descritos. Sequências arcabouço exemplificativas serão evidentes para um versado na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, em Jinek, e outros, Science (2012) 337 (6096): 816 a 821, Ran, e outros Nature Protocols (2013) 8: 2281 a 2308, Pedido PCT No. WO 2014/093694 e Pedido
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PCT No. WO 2013/176772.
[00157] Em algumas modalidades, a sequência de gRNA não compreende uma sequência de arcabouço e uma sequência de arcabouço é expressa como um transcrito separado. Em tais modalidades, a sequência de gRNA compreende ainda uma sequência adicional que é a uma porção da sequência de arcabouço e funciona para se ligar (hibridizar) à sequência de arcabouço e recrutar a endonuclease para o ácido nucleico alvo.
[00158] Em algumas modalidades, a sequência de gRNA é ao menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 %, ou ao menos 100% complementar a um ácido nucleico alvo (ver também Patente US 8.697.359, que é incorporada por referência para o seu ensinamento de complementaridade de uma sequência de gRNA com uma sequência polinucleotídica alvo). Foi demonstrado que os desemparelhamentos entre uma sequência guia CRISPR e o ácido nucleico alvo próximo da extremidade 3’ do ácido nucleico alvo podem abolir a atividade de divagem da nuclease (Upadhyay, e outros, Genes Genome Genetics (2013) 3 (12): 2233 a 2238). Em algumas modalidades, a sequência de gRNA é ao menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 %, ou ao menos 100% complementar à extremidade 3’ do ácido nucleico alvo (por exemplo, os últimos 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos da extremidade 3’ do ácido nucleico alvo).
[00159] Sequências de sgRNA exemplificativas direcionadas para os introns 1 e 2 de CD19 são fornecidas na Tabela 3. A sequência de sgRNA exemplificativa direcionada para os introns 1 e 2 de CD33 são fornecidas na Tabela 4. Como pode ser observado pelos versados na técnica, a seleção de sequências de sgRNA pode depender de fatores tal como o número de sítios de ligação previstos no alvo e/ou fora do alvo. Em algumas modalidades, a sequência de sgRNA é selecionada
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66/110 para maximizar os potenciais sítios no alvo e minimizar potenciais sítios fora do alvo.
[00160] O ácido nucleico alvo é flanqueado na extremidade 3’ por um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) que pode interagir com a endonuclease e estar ainda envolvido no direcionamento da atividade da endonuclease para o ácido nucleico alvo. Considera-se geralmente que a sequência de PAM que flanqueia o ácido nucleico alvo depende da endonuclease e da fonte a partir da qual a endonuclease é derivada. Por exemplo, para endonucleases Cas9 que são derivadas de Streptococcus pyogenes, a sequência de PAM é NGG. Para as endonucleases Cas9 derivadas de Staphylococcus aureus, a sequência de PAM é NNGRRT. Para as endonucleases Cas9 que são derivadas de Neisseria meningitidis, a sequência de PAM é NNNNGATT. Para endonucleases Cas9 derivadas de Streptococcus thermophilus, a sequência de PAM é NNAGAA. Para a endonuclease Cas9 derivada de Treponema denticola, a sequência de PAM é NAAAAC. Para uma nuclease de Cpf1, a sequência de PAM é TTN.
[00161] Em algumas modalidades, a engenharia genética de uma célula também compreende a introdução de uma endonuclease Cas na célula. Em algumas modalidades, a endonuclease Cas e o ácido nucleico que codifica o gRNA são fornecidos no mesmo ácido nucleico (por exemplo, um vetor). Em algumas modalidades, a endonuclease Cas e o ácido nucleico que codifica o gRNA são fornecidos em diferentes ácidos nucleicos (por exemplo, vetores diferentes). Alternativamente ou ainda, a endonuclease Cas pode ser fornecida ou introduzida na célula na forma de proteína.
[00162] Em algumas modalidades, a endonuclease Cas é uma enzima Cas9 ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, a endonuclease Cas9 é derivada de Streptococcus pyogenes, Staphylo
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67/110 coccus aureus, Neisseria meningitidis, Streptococcus thermophilus ou Treponema denticola. Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica que codifica a endonuclease Cas pode ser codificada para expressão em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a endonuclease é um homólogo ou ortólogo de Cas9.
[00163] Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica codificando a endonuclease Cas9 é ainda modificada para alterar a atividade da proteína. Em algumas modalidades, a endonuclease Cas9 é uma Cas9 cataliticamente inativa. Por exemplo, dCas9 contém mutações de resíduos cataliticamente ativos (D10 e H840) e não tem atividade de nuclease. Alternativamente ou ainda, a endonuclease Cas9 pode ser fundida a outra proteína ou porção da mesma. Em algumas modalidades, dCas9 é fundido a um domínio repressor, tal como um domínio KRAB. Em algumas modalidades, tais proteínas de fusão de dCas9 são usadas com as construtos aqui descritos para a repressão do gene multiplexado (por exemplo, interferência de CRISPR (CRISPRi)). Em algumas modalidades, dCas9 é fundido a um domínio ativador, tal como VP64 ou VPR. Em algumas modalidades, tais proteínas de fusão de dCas9 são usadas com os construtos aqui descritos para a ativação do gene (por exemplo, ativação de CRISPR (CRISPRa)). Em algumas modalidades, dCas9 é fundido a um domínio de modulação epigenética, tal como um domínio de histona desmetilase ou um domínio de histona acetiltransferase. Em algumas modalidades, dCas9 é fundido a um LSD1 ou p300, ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, a fusão dCas9 é usada para modulação epigenética baseada em CRISPR. Em algumas modalidades, dCas9 ou Cas9 é fundido a um domínio de nuclease Fok1. Em algumas modalidades, Cas9 ou dCas9 fundido a um domínio de nuclease Fok1 é usado para edição de genomas. Em algumas modalidades, Cas9 ou dCas9 é fundido a uma proteína fluorescente
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68/110 (por exemplo, GFP, RFP, mCherry, etc.). Em algumas modalidades, proteínas Cas91 dCas9 fundidas a proteínas fluorescentes são usadas para marcação e/ou visualização de lóci genômicos ou identificação de células que expressam a endonuclease Cas.
[00164] Em algumas modalidades, a endonuclease é um editor de base. Em algumas modalidades, a endonuclease compreende um dCas9 fundido a um domínio de inibidor de uracil glicosilase (UGI). Em algumas modalidades, a endonuclease compreende um dCas9 fundido a um editor base de adenina (ABE), por exemplo, um ABE desenvolvido a partir do RNA adenina desaminase TadA.
[00165] Alternativamente ou ainda, a endonuclease Cas é uma nuclease Cpf1. Em algumas modalidades, a célula hospedeira expressa uma nuclease Cpf1 derivada de Provetella spp. ou Francisella spp. Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica que codifica a nuclease Cpf1 pode ser códon-otimizada para a expressão em uma célula hospedeira.
[00166] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece composições e métodos para inibir uma proteína de superfície celular de linhagem específica em células hematopoiéticas utilizando um sistema CRISPR / Cas9, em que a sequência de RNA guia hibridiza com a sequência nucleotídica que codifica um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica. Em algumas modalidades, a sequência de RNA guia hibridiza com a sequência nucleotídica que codifica um éxon da proteína de superfície celular de linhagem específica. Em algumas modalidades, a proteína de superfície celular de linhagem específica é CD33 ou CD19 e o gRNA hibridiza com uma porção da sequência nucleotídica que codifica um epitopo de CD33 ou CD19.
[00167] Em algumas modalidades, pode ser desejável ainda modificar geneticamente as HSC, particularmente HSCs alogênicas,
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69/110 para reduzir os efeitos do enxerto versus hospedeiro. Por exemplo, a terapia padrão para LMA recidivante é o transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT). No entanto, ao menos um dos fatores limitantes para HSCT bem-sucedido é a doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), em que a expressão da molécula de superfície celular CD45 foi implicada. Ver, por exemplo, Van Besie, Hematology Am. Soc. Hematol Educ Program (2013) 56; Mawad Curr. Hematol Malig. Rep. (2013) 8 (2): 132. CD45RA e CD45RO são isoformas de CD45 (encontradas em todas as células hematopoiéticas, exceto nos eritrócitos). Nos linfócitos T, o CD45RA é expresso em células virgens, enquanto o CD45RO é expresso em células de memória. As células T CD45RA têm um alto potencial de reatividade contra proteínas específicas do recebedor após o HSCT, resultando em GVHD. CD45 é uma proteína de linhagem tipo 1, uma vez que as células portadoras de CD45 são necessárias para a sobrevivência; no entanto, a porção antigênica de CD45 pode ser deletada das células-tronco usando CRISPR para prevenir e/ou reduzir a incidência ou extensão de GvHD. [00168] Também são aqui fornecidos métodos de produção de uma célula que não tem um epitopo de uma proteína de superfície celular de linhagem específica envolvendo fornecer uma célula e a introduzi-la nos componentes celulares de um sistema CRISPR Cas para edição do genoma. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que compreende um RNA guia CRISPR-Cas (gRNA) que hibridiza ou é previsto para hibridizar com uma porção da sequência nucleotídica que codifica a proteína de superfície celular de linhagem específica é introduzido na célula. Em algumas modalidades, o gRNA é introduzido na célula em um vetor. Em algumas modalidades, uma endonuclease Cas é introduzida na célula. Em algumas modalidades, a endonuclease Cas é introduzida na célula como um ácido nucleico que codifica uma endonuclease Cas. Em algumas modalidades, o gRNA e
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70/110 uma sequência nucleotídica que codifica uma endonuclease Cas são introduzidos na célula no mesmo ácido nucleico (por exemplo, o mesmo vetor). Em algumas modalidades, a endonuclease Cas é introduzida na célula na forma de uma proteína. Em algumas modalidades, a endonuclease Cas e o gRNA são pré-formados in vitro e são introduzidos na célula como um complexo de ribonucleoproteína. [00169] Os vetores da presente descrição podem conduzir a expressão de uma ou mais sequências em células de mamífero utilizando um vetor de expressão de mamífero. Exemplos de vetores de expressão de mamífero incluem pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329: 840) e pMT2PC (Kaufman e outros, EMBO J. (1987) 6: 187). Quando usado em células de mamíferos, as funções de controle do vetor de expressão são tipicamente fornecidas por um ou mais elementos reguladores. Por exemplo, os promotores comumente usados são derivados de polioma, adenovirus 2, citomegalovírus, vírus símio 40 e outros aqui descritos e conhecidos na técnica. Para outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas, ver, por exemplo, os Capítulos 16 e 17 de Sambrook, e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989.
[00170] Os vetores da presente descrição são capazes de dirigir a expressão do ácido nucleico preferencialmente em um tipo de célula particular (por exemplo, elementos reguladores específicos do tecido são usados para expressar o ácido nucleico). Tais elementos reguladores incluem promotores que podem ser específicos do tecido ou específicos de célula. O termo tecido-específico, como se aplica a um promotor, refere-se a um promotor que é capaz de dirigir a expressão seletiva de uma sequência nucleotídica de interesse para um tipo específico de tecido (por exemplo, sementes) na ausência
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71/110 relativa de expressão da mesma sequência nucleotídica de interesse em um tipo diferente de tecido. O termo específico de tipo de célula, como aplicado a um promotor, refere-se a um promotor que é capaz de dirigir a expressão seletiva de uma sequência nucleotídica de interesse em um tipo específico de célula na ausência relativa de expressão da mesma sequência nucleotídica de interesse em um tipo diferente de célula dentro do mesmo tecido. O termo tipo específico de célula quando aplicado a um promotor também significa um promotor capaz de promover a expressão seletiva de uma sequência nucleotídica de interesse em uma região dentro de um único tecido. A especificidade do tipo de célula de um promotor pode ser avaliada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, coloração imuno-histoquímica.
[00171] Os métodos convencionais de transferência genética de base viral e não viral podem ser usados para introduzir ácidos nucleicos que codificam CRISPR / Cas9 em células de mamífero ou tecidos alvo. Tais métodos podem ser usados para administrar ácidos nucleicos que codificam componentes de um sistema CRISPR-Cas a células em cultura ou em um organismo hospedeiro. Sistemas de entrega de vetores não virais incluem plasmídeos de DNA, RNA (por exemplo, um transcrito de um vetor descrito aqui), ácido nucleico nu, e ácido nucleico complexado com um veículo de entrega. Os sistemas de entrega de vetores virais incluem vírus de DNA e RNA, que têm ou genomas epissômicos ou integrados após a entrega na célula.
[00172] Os vetores virais podem ser administrados diretamente a pacientes (in vivo) ou podem ser usados para manipular células in vitro ou ex vivo, onde as células modificadas podem ser administradas a pacientes. Em uma modalidade, a presente descrição utiliza sistemas baseados em vírus incluindo, mas não limitados a, vetores de vírus retrovirus, lentivírus, adenovirus, vírus adenoassociados e vírus
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72/110 herpes simplex para transferência de genes. Além disso, a presente descrição fornece vetores capazes de integração no genoma do hospedeiro, tal como retrovirus ou lentivírus. De um modo preferencial, o vetor usado para a expressão de um sistema CRISPR-Cas da presente descrição é um vetor lentiviral.
[00173] Em uma modalidade, a descrição fornece a introdução de um ou mais vetores que codificam CRISPR-Cas em células eucarióticas. A célula pode ser uma célula cancerosa. Alternativamente, a célula é uma célula hematopoiética, tal como uma célula-tronco hematopoiética. Exemplos de células-tronco incluem células-tronco pluripotentes, multipotentes e unipotentes. Exemplos de células-tronco pluripotentes incluem células-tronco embrionárias, células germinativas embrionárias, células de carcinoma embrionário e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em uma modalidade preferencial, a descrição fornece a introdução de CRISPR-Cas9 em uma célula-tronco hematopoiética.
[00174] Os vetores da presente descrição são entregues à célula eucariótica em um indivíduo. A modificação das células eucarióticas através do sistema CRISPR / Cas9 pode ocorrer em uma cultura celular, em que o método compreende isolar a célula eucariótica a partir de um indivíduo antes da modificação. Em algumas modalidades, o método compreende ainda retornar a dita célula eucariótica e/ou células derivadas da mesma para o indivíduo.
Métodos de Tratamento e Terapias de Combinação [00175] Como aqui descrito, os agentes citotóxicos compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epitopo de uma proteína de superfície celular de linhagem específica podem ser administrados a um indivíduo em combinação com células hematopoiéticas expressando a proteína de superfície celular de linhagem específica, mas foram manipuladas de tal forma que as
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73/110 células não se ligam ao agente citotóxico.
[00176] Assim, a presente descrição fornece métodos para o tratamento de uma malignidade hematopoiética, o método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade de tratamento (i) uma quantidade eficaz de um agente citotóxico direcionado às células expressando uma proteína de superfície celular de linhagem específica; e (ii) uma população de células hematopoiéticas, em que as células hematopoiéticas são manipuladas de tal modo que elas ou os seus descendentes não se ligam ao agente citotóxico ou têm ligação reduzida com o agente citotóxico. Em algumas modalidades, os métodos para tratar uma malignidade hematopoiética compreendem administrar a um indivíduo em necessidade de tratamento (i) uma quantidade eficaz de um agente citotóxico direcionado às células expressando uma proteína de superfície celular de linhagem específica, em que o agente citotóxico compreende um fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica; e (ii) uma população de células hematopoiéticas, em que as células hematopoiéticas são manipuladas de tal modo que elas ou os seus descendentes não se ligam ao agente citotóxico ou têm ligação reduzida com o agente citotóxico. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são manipuladas geneticamente de tal modo que a proteína de superfície celular de linhagem específica expressa nas células hematopoiéticas ou nos seus descendentes não tem o epitopo ao qual o agente citotóxico se liga. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são manipuladas geneticamente de tal modo que a proteína de superfície celular de linhagem específica expressa nas células hematopoiéticas ou em seus descendentes tem um epitopo mutado ou variante ao qual agente citotóxico não pode se ligar (ou tem ligação reduzida com ele). Em algumas modalidades, o epitopo da
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74/110 proteína de superfície celular de linhagem específica não é essencial.
[00177] Como usado aqui, sujeito, indivíduo e paciente são usados de forma intercambiável, e referem-se a um vertebrado, de preferência, um mamífero tal como um ser humano. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados, a primatas humanos, primatas não humanos ou espécies murinas, bovinas, equinas, caninas ou felinas. Em algumas modalidades, o indivíduo é um paciente humano com uma malignidade hematopoiética.
[00178] Em algumas modalidades, os agentes citotóxicos e/ou as células hematopoiéticas podem ser misturados com um carreador farmaceuticamente aceitável para formar uma composição farmacêutica, que também está dentro do escopo da presente descrição.
[00179] Para executar os métodos aqui descritos, uma quantidade eficaz do agente citotóxico compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica e uma quantidade eficaz de células hematopoiéticas podem ser coadministradas a um indivíduo em necessidade de tratamento. Como aqui usado, o termo quantidade eficaz pode ser usado de forma intercambiável com o termo quantidade terapeuticamente eficaz e refere-se à quantidade de um agente citotóxico, população celular ou composição farmacêutica (por exemplo, uma composição compreendendo agentes citotóxicos e/ou células hematopoiéticas) que é suficiente para resultar em uma atividade desejada após a administração a um indivíduo em necessidade de tratamento. No contexto da presente descrição, o termo quantidade eficaz refere-se à quantidade de um composto, população de células ou composição farmacêutica que é suficiente para retardar a manifestação, interromper a progressão, aliviar ao menos um sintoma de um distúrbio tratado pelos métodos da presente descrição. Observa-se que quando uma combinação de ingredientes ativos é
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75/110 administrada, a quantidade eficaz da combinação pode ou não incluir quantidades de cada ingrediente que seriam eficazes se administradas individualmente.
[00180] As quantidades eficazes variam, conforme reconhecido pelos versados na técnica, dependendo da condição particular a ser tratada, da gravidade da condição, dos parâmetros individuais do paciente incluindo idade, condição física, tamanho, gênero e peso, duração do tratamento, natureza da terapia simultânea (se houver), a via específica de administração e fatores semelhantes dentro do conhecimento e perícia do profissional de saúde. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz alivia, melhora, aprimora, reduz os sintomas ou atrasa a progressão de qualquer doença ou distúrbio no indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um paciente humano com uma malignidade hematopoiética.
[00181] Como aqui descrito, as células hematopoiéticas e/ou células imunes que expressam receptores quiméricos podem ser autólogas ao indivíduo, isto, as células são obtidas a partir do indivíduo em necessidade de tratamento, manipuladas de modo que as células não se liguem aos agentes citotóxicos, e então administradas ao mesmo indivíduo. A administração de células autólogas a um indivíduo pode resultar na redução da rejeição das células hospedeiras em comparação com a administração de células não autólogas. Alternativamente, as células hospedeiras são células alogênicas, isto é, as células são obtidas a partir de um primeiro indivíduo, manipuladas de tal modo que as células não se ligam aos agentes citotóxicos e depois administradas a um segundo indivíduo que é diferente do primeiro indivíduo, mas da mesma espécies. Por exemplo, as células imunes alogênicas podem ser derivadas de um doador humano e administradas a um recebedor humano que é diferente do doador.
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76/110 [00182] Em algumas modalidades, as células imunes e/ou células hematopoiéticas são células alogênicas e foram ainda geneticamente modificadas para reduzir a doença de enxerto versus hospedeiro. Por exemplo, tal como aqui descrito, as células-tronco hematopoiéticas podem ser geneticamente modificadas (por exemplo, utilizando a edição de genoma) para reduzir a expressão de CD45RA.
[00183] Em algumas modalidades, as células imunes expressando qualquer um dos receptores quiméricos aqui descritos são administradas a um indivíduo em uma quantidade eficaz para reduzir o número de células alvo (por exemplo, células cancerosas) em ao menos 20%, por exemplo, 50%, 80%, 100%, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais.
[00184] Uma quantidade típica de células, isto é, células imunes ou células hematopoiéticas, administradas a um mamífero (por exemplo, um humano) pode estar, por exemplo, na faixa de cerca de 106 a 1011 células. Em algumas modalidades, pode ser desejável administrar menos do que 106 células ao indivíduo. Em algumas modalidades, pode ser desejável administrar mais do que 1011 células ao indivíduo. Em algumas modalidades, uma ou mais doses de células incluem cerca de 106 células a cerca de 1011 células, cerca de 107 células a cerca de 101° células, cerca de 108 células a cerca de 109 células, cerca de 106 células a cerca de 108 células, cerca de 107 células a cerca de 109 células cerca de 107 células a cerca de 101° células, cerca de 107 células a cerca de 1011 células, cerca de 108 células a cerca de 101° células, cerca de 108 células a cerca de 1011 células, cerca de 109 células a cerca de 101° células, cerca de 109 células a cerca de 1011 células ou cerca de 101° células a cerca de 1011 células.
[00185] Em algumas modalidades, o indivíduo é precondicionado antes da administração do agente citotóxico e/ou células hematopoiéticas. Em algumas modalidades, o método compreende
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77/110 ainda precondicionar o indivíduo. Em geral, o precondicionamento de um indivíduo envolve submeter o paciente a uma ou mais terapias, tal como quimioterapia ou outro tipo de terapia, tal como irradiação. Em algumas modalidades, o precondicionamento pode induzir ou aumentar a tolerância do paciente a uma ou mais terapias subsequentes (por exemplo, uma terapia alvo), como aqui descrito. Em algumas modalidades, o precondicionamento envolve a administração de um ou mais agentes quimioterápicos ao indivíduo. Exemplos limitantes de agentes quimioterápicos incluem actinomicina, azacitidina, azatioprina, bleomicina, bortezomib, carboplatina, capecitabina, cisplatina, clorambucil, ciclofosfamida, citarabina, daunorrubicina, docetaxel, doxifluridina, doxorrubicina, epirrubicina, epotilona, etoposídeo, fludarabina, fluorouracil, gencitabina, hidroxiureia, idarrubicina, imatinib, irinotecano, mecloretamina, mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatina, paclitaxel, pemetrexed, teniposido, tioguanina, topotecano, valrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina.
[00186] Em algumas modalidades, o indivíduo é precondicionado ao menos um dia, dois dias, três dias, quatro dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, duas semanas, três semanas, quatro semanas, cinco semanas, seis semanas, sete semanas, oito semanas, nove semanas, dez semanas, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses ou ao menos seis meses antes da administração do agente citotóxico e/ou células hematopoiéticas.
[00187] Em outras modalidades, a(s) quimioterapia(s) ou outra(s) terapia(s) são administradas simultaneamente com o agente citotóxico e células hematopoiéticas manipuladas. Em outras modalidades, a(s) quimioterapia(s) ou outra(s) terapia(s) são administradas após o agente citotóxico e células hematopoiéticas manipuladas.
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78/110 [00188] Em uma modalidade, o receptor quimérico (por exemplo, um ácido nucleico que codifica o receptor quimérico) é introduzido em uma célula imune e o indivíduo (por exemplo, paciente humano) recebe uma administração inicial ou dose das células imunes que expressam o receptor quimérico. Uma ou mais administrações subsequentes do agente citotóxico (por exemplo, células imunes que expressam o receptor quimérico) podem ser fornecidas ao paciente em intervalos de 15 dias, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 dias após a administração anterior. Mais do que uma dose do agente citotóxico pode ser administrada ao indivíduo por semana, por exemplo, 2, 3, 4 ou mais administrações do agente. O indivíduo pode receber mais do que uma dose do agente citotóxico (por exemplo, uma célula imune que expressa um receptor quimérico) por semana, seguido de uma semana sem administração do agente, e finalmente seguido por uma ou mais doses adicionais do agente citotóxico (por exemplo, mais de uma administração de células imunes expressando um receptor quimérico por semana). As células imunes que expressam um receptor quimérico podem ser administradas em dias alternados durante 3 administrações por semana durante duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais semanas.
[00189] Qualquer um dos métodos aqui descritos pode ser para o tratamento de uma malignidade hematológica em um indivíduo. Como aqui usado, os termos tratar, tratando e tratamento significam aliviar ao menos um sintoma associado à doença ou distúrbio, ou retardar ou reverter a progressão da doença ou distúrbio. Dentro do significado da presente descrição, o termo tratar também denota parar, atrasar o início (isto o período antes da manifestação clínica de uma doença) e/ou reduzir o risco de desenvolver ou agravar uma doença. Por exemplo, em conjunto com o câncer, o termo tratar pode significar eliminar ou reduzir o número ou a replicação de células
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79/110 cancerosas, e/ou prevenir, atrasar ou inibir a metástase, etc.
[00190] Em algumas modalidades, um agente citotóxico compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica e uma população de células hematopoiéticas deficientes que expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica, mas que foram manipuladas de tal modo que não se ligam ao agente citotóxico, são administrados a um indivíduo. Consequentemente, em tais métodos terapêuticos, o agente citotóxico reconhece (se liga) uma célula alvo que expressa o epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica para morte dirigida. As células hematopoiéticas que expressam a proteína mas não se liga ao ácido citotóxico (por exemplo, porque não têm o epitopo da proteína) permitem o repovoamento de um tipo de célula que é alvo do agente. Em algumas modalidades, o tratamento do paciente pode envolver as seguintes etapas: (1) administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente citotóxico ao paciente e (2) infundir ou reinfundir o paciente com célulastronco hematopoiéticas, autólogas ou alogênicas, em que as células hematopoiéticas foram manipuladas de modo a não se ligarem ao agente citotóxico. Em algumas modalidades, o tratamento do paciente pode envolver as seguintes etapas: (1) administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma célula imune expressando um receptor quimérico ao paciente, em que a célula imune compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor quimérico que se liga a um epitopo de uma proteína de superfície celular de linhagem específica associada à doença; e (2) infundir ou reinfundir o paciente com células hematopoiéticas (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas), autólogas ou alogênicas, em que as células hematopoiéticas foram manipuladas de modo a não se ligarem ao agente citotóxico.
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80/110 [00191] A eficácia dos métodos terapêuticos utilizando um agente que compreende um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a uma proteína de superfície celular de linhagem específica e uma população de células hematopoiéticas deficientes na proteína de superfície celular de linhagem específica pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica e seria evidente para um profissional médico qualificado. Por exemplo, a eficácia da terapia pode ser avaliada pela sobrevida do indivíduo ou carga de câncer no indivíduo ou tecido ou amostra do mesmo. Em algumas modalidades, a eficácia da terapia é avaliada quantificando o número de células pertencentes a uma população particular ou linhagem de células. Em algumas modalidades, a eficácia da terapia é avaliada quantificando o número de células que apresentam a proteína de superfície celular de linhagem específica.
[00192] Em algumas modalidades, o agente citotóxico compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica e à população de células hematopoiéticas é administrado simultaneamente.
[00193] Em algumas modalidades, o agente citotóxico compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epitopo de uma proteína de superfície celular de linhagem específica (por exemplo, células imunes expressando um receptor quimérico como aqui descrito) é administrado antes da administração das células hematopoiéticas. Em algumas modalidades, o agente compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epitopo de uma proteína de superfície celular de linhagem específica (por exemplo, células imunes expressando um receptor quimérico como aqui descrito) é administrado ao menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11
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81/110 semanas, 12 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses ou mais antes da administração das células hematopoiéticas.
[00194] Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas são administradas antes do agente citotóxico compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica (por exemplo, células imunes que expressam um receptor quimérico como aqui descrito). Em algumas modalidades, a população de células hematopoiéticas é administrada ao menos cerca de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses ou mais antes da administração do agente citotóxico compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica.
[00195] Em algumas modalidades, o agente citotóxico direcionado à proteína de superfície celular de linhagem específica e a população de células hematopoiéticas são administrados substancialmente ao mesmo tempo. Em algumas modalidades, o agente citotóxico direcionado à proteína de superfície celular de linhagem específica é administrado e o paciente é avaliado por um período de tempo, após o qual a população de células hematopoiéticas é administrada. Em algumas modalidades, a população de células hematopoiéticas é administrada e o paciente é avaliado por um período de tempo, após o qual o agente citotóxico direcionado à proteína de superfície celular de linhagem específica é administrado.
[00196] Também dentro do escopo da presente descrição estão múltiplas administrações (por exemplo, doses) dos agentes citotóxicos e/ou das populações de células hematopoiéticas. Em algumas modalidades, os agentes citotóxicos e/ou as populações de células
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82/110 hematopoiéticas são administrados ao indivíduo uma vez. Em algumas modalidades, os agentes citotóxicos e/ou as populações de células hematopoiéticas são administrados ao indivíduo mais de uma vez (por exemplo, ao menos 2, 3, 4, 5 ou mais vezes). Em algumas modalidades, os agentes citotóxicos e/ou as populações de células hematopoiéticas são administrados ao indivíduo em um intervalo regular, por exemplo, de seis em seis meses.
[00197] Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo humano com uma malignidade hematopoiética. Como aqui usado, uma malignidade hematopoiética refere-se a uma anomalia maligna envolvendo células hematopoiéticas (por exemplo, células sanguíneas, incluindo células progenitoras e células-tronco). Exemplos de malignidades hematopoiéticas incluem, sem limitação, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, leucemia, ou mieloma múltiplo. As leucemias exemplificativas incluem, sem limitação, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoblástica aguda ou leucemia linfoblástica crônica, e leucemia linfoide crônica.
[00198] Em algumas modalidades, as células envolvidas na malignidade hematopoiética são resistentes a terapias convencionais e padrão usadas para tratar a malignidade. Por exemplo, as células (por exemplo, células cancerosas) podem ser resistentes a um agente quimioterápico e/ou células T CAR usadas para tratar a malignidade.
[00199] Em algumas modalidades, a malignidade hematopoiética está associada a células CD19+. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, malignidades de células B tais como linfoma não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia, mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoide aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica crônica, leucemia linfoide crônica, e leucemia linfocítica crônica.
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83/110 [00200] Em algumas modalidades, a leucemia é leucemia mieloide aguda (LMA). A LMA é caracterizada como uma doença neoplásica, clonal e heterogênea, que se origina de células transformadas que adquiriram progressivamente alterações genéticas críticas que interrompem as principais vias de diferenciação e de regulação do crescimento. (Dohner e outros, NEJM, (2015) 373: 1136). A glicoproteína CD33 é expressa na maioria das células de leucemia mieloide, bem como em precursores mieloides e monocíticos normais e tem sido considerada um alvo atraente para a terapia de LMA (Laszlo e outros, Blood Rev. (2014) 28 (4): 143-53). Embora os ensaios clínicos utilizando terapia baseada em anticorpos monoclonais anti-CD33 tenham mostrado melhora na sobrevida em um subgrupo de pacientes com LMA quando combinada com quimioterapia padrão, esses efeitos também foram acompanhados por preocupações com a segurança e a eficácia.
[00201] Qualquer uma das células imunes que expressam receptores quiméricos aqui descritos pode ser administrada em um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável como uma composição farmacêutica.
[00202] A frase farmaceuticamente aceitável, como usada em conjunto com composições e/ou células da presente descrição, referese a entidades moleculares e outros ingredientes de tais composições que são fisiologicamente toleráveis e não produzem tipicamente reações adversas quando administrados a um mamífero (por exemplo, um ser humano). Preferencialmente, tal como aqui usado, o termo farmaceuticamente aceitável significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou de um estado ou listado na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em mamíferos, e mais particularmente em humanos. Aceitável significa que o carreador é compatível com o ingrediente ativo da
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84/110 composição (por exemplo, os ácidos nucleicos, vetores, células ou anticorpos terapêuticos) e não afeta negativamente o indivíduo ao qual a composição é administrada. Qualquer uma das composições farmacêuticas e/ou células a serem usadas nos presentes métodos pode compreender carreadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.
[00203] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis, incluindo tampões, são bem conhecidos na técnica e podem compreender fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes; polipeptídeos de baixo peso molecular; proteínas, tal como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; aminoácidos; polímeros hidrofóbicos; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos; complexos metálicos; e/ou tensoativos não iônicos. Ver, por exemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed. (2000) Lippincott Williams e Wilkins, Ed. K. E. Hoover.
Kits para Usos Terapêuticos [00204] Também dentro do escopo da presente descrição estão kits para uso dos agentes citotóxicos direcionados a proteínas de superfície celular de linhagem específica em combinação com populações de células hematopoiéticas que expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica, mas que foram manipuladas de tal modo que não se ligam ao agente citotóxico ou têm ligação reduzida com o agente citotóxico. Tais kits podem incluir um ou mais recipientes compreendendo uma primeira composição farmacêutica que compreende qualquer agente citotóxico compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a uma proteína de superfície celular de linhagem específica (por exemplo, células imunes expressando receptores quiméricos aqui descritos) e um carreador farmaceutica
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85/110 mente aceitável, e uma segunda composição farmacêutica que compreende uma população de células hematopoiéticas (por exemplo, uma célula-tronco hematopoiética) que expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica, mas que foram manipuladas de tal modo que não se ligam ou têm ligação reduzida com o agente citotóxico, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00205] Em algumas modalidades, o kit pode compreender instruções para uso em qualquer dos métodos aqui descritos. As instruções incluídas podem compreender uma descrição da administração da primeira e da segunda composição farmacêutica a um indivíduo para alcançar a atividade pretendida em um indivíduo. O kit pode ainda compreender uma descrição de selecionar um indivíduo adequado para tratamento com base na identificação do indivíduo em necessidade de tratamento. Em algumas modalidades, as instruções compreendem uma descrição da administração da primeira e da segunda composição farmacêutica a um indivíduo em necessidade de tratamento.
[00206] As instruções relativas uso dos agentes citotóxicos direcionados a proteínas de superfície celular de linhagem específica e da primeira e da segunda composição farmacêutica aqui descritas incluem geralmente informações quanto à dosagem, programa de dosagem, e via de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens multidose) ou doses subunitárias. As instruções fornecidas nos kits da descrição são tipicamente instruções escritas em um rótulo ou folheto informativo. O rótulo ou folheto informativo indica que as composições farmacêuticas são usadas para tratar, atrasar o início e/ou aliviar uma doença ou distúrbio em um indivíduo.
[00207] Os kits aqui fornecidos estão em embalagem adequada. A embalagem adequada inclui, mas não está limitada a, frascos,
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86/110 garrafas, jarras, embalagens flexíveis e similares. São também consideradas embalagens para uso em combinação com um dispositivo específico, tal como um inalador, dispositivo de administração nasal, ou um dispositivo de infusão. Um kit pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente também pode ter uma porta de acesso estéril. Ao menos um agente ativo na composição farmacêutica é uma variante de receptor quimérico como aqui descrito.
[00208] Os kits, opcionalmente, podem fornecer componentes adicionais, tal como tampões e informações interpretativas. Normalmente, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou folheto(s) informativo(s) no recipiente ou associados com o recipiente. Em algumas modalidades, a descrição fornece artigos de fabricação compreendendo os conteúdos dos kits descritos acima.
Técnicas Gerais [00209] A prática da presente descrição utilizará, salvo indicação ao contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da perícia da técnica. Tais técnicas são explicadas integralmente na literatura, tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook, e outros, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Pleenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, e D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir
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87/110 e C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vetors for Mammalian Cells (J. M. Miller e Μ. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, e outros eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, e outros, eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan e outros, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988 a 1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I e II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985»; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984»; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed. (1986»; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986»; e B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel e outros (eds.).
[00210] Sem mais elaboração, acredita-se que um versado na técnica pode, com base na descrição acima, utilizar a presente descrição em sua extensão máxima. As seguintes modalidades específicas devem, portanto, ser interpretadas como meramente ilustrativas, e não limitantes do restante da descrição de qualquer forma. Todas as publicações aqui citadas são incorporadas por referência para os fins ou assuntos aqui mencionados.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: Identificação e mutação de epítopos em CD33 expresso em células hematopoiéticas [00211] Utilizando o CD33 humano como um antígeno de superfície celular de linhagem específica exemplificativo, as regiões da proteína
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88/110 em que a mutação e/ou a deleção de aminoácidos são menos prováveis de resultar em efeitos prejudiciais (por exemplo, uma redução ou anulação da função) foram previstas utilizando software PROVEAN (ver: provean.jcvi.org; Choi e outros PLoS ONE (2012) 7 (10): e46688). Exemplos das regiões previstas são apresentados em caixas na Figura 2 e deleções exemplificativas nas regiões previstas são apresentadas na Tabela 2. A numeração dos resíduos de aminoácidos baseia-se na sequência de aminoácidos de CD33 humano fornecida pela SEQ ID NO: 1.
Tabela 2: Deleções Exemplificativas em CD33
Deleção Escore PROVEAN Epitopo direcionado por agente citotóxico
S248-E252 -5,508 SGKQE (SEQ ID NO: 8)
I47-D51 -5,661 IPYYD (SEQ ID NO: 9)
G249-T253 -7,078 GKQET (SEQ ID NO: 10)
K250-R254 -7,184 KQETR (SEQ ID NO: 11)
P48-K52 -7,239 PYYDK (SEQ ID NO: 12)
Q251-A255 -7,888 QETRA (SEQ ID NO: 13)
[00212] A sequência nucleotídica codificando CD33 é manipulada geneticamente para deletar qualquer epitopo da proteína (da porção extracelular de CD33), ou um fragmento contendo tal, utilizando métodos convencionais de manipulação de ácido nucleico. As sequências de aminoácidos fornecidas abaixo são sequências exemplificativas de mutantes de CD33 que foram manipuladas para não terem cada um dos epítopos da Tabela 2.
[00213] A sequência de aminoácidos da porção extracelular de
CD33 é fornecida pela SEQ ID NO: 1. O peptídeo sinal é mostrado em itálico e os sítios para manipulação são mostrados em sublinhado e negrito. O domínio transmembrana é mostrado em itálico com sublinhado.
MPLLLLLPLL
WAGALAMDPN
FWLQVQESVT
VQEGLCVLVP
CTFFHPIPYY
DKNSPVHGYW
FREGAIISRD
SPVATNKLDQ
EVQEETQGRF
RLLGDPSRNN
CSLSIVDARR
RDNGSYFFRM
ERGSTKYSYK
SPQLSVHVTD
LTHRPKILIP
GTLEPGHSKN
LTCSVSWACE
QGTPPIFSWL
SAAPTSLGPR
TTHSSVLIIT
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89/110
PRPQDHGTNL TCQVKFAGAG VTTERTIQLN VTYVPQNPTT GIFPGDGSGK
QETRAGWHG AIGGAGVTAL LALCLCLIFF IVKTHRRKAA RTAVGRNDTH
PTTGSASPKH QKKSKLHGPT ETSSCSGAAP TVEMDEELHY ASLNFHGMNP skdtsteyse vrtq (SEQ ID NO: 1) [00214] A sequência de aminoácidos da porção extracelular de CD33 compreendendo uma deleção dos resíduos S248 a E252 é fornecida pela SEQ ID NO: 2. O peptídeo sinal é mostrado em itálico e o domínio transmembrana é mostrado em itálico com sublinhado.
[00215] S248_E252insdelTRNAD; Score PROVEAN = -1.916
MPLLLLLPLL WAGALAMDPN FWLQVQESVT VQEGLCVLVP CTFFHPIPYY
DKNSPVHGYW FREGAIISRD SPVATNKLDQ EVQEETQGRF RLLGDPSRNN
CSLSIVDARR RDNGSYFFRM ERGSTKYSYK SPQLSVHVTD LTHRPKILIP
GTLEPGHSKN LTCSVSWACE QGTPPIFSWL SAAPTSLGPR TTHSSVLIIT
PRPQDHGTNL TCQVKFAGAG VTTERTIQLN VTYVPQNPTT GIFPGDGTAR
NDTRAGWHG AIGGAGVTAL LALCLCLTFF JVKTHRRKAA RTAVGRNDTH
PTTGSASPKH QKKSKLHGPT ETSSCSGAAP TVEMDEELHY ASLNFHGMNP
SKDTSTEYSE [00216] A VRTQ (SEQ ID NO: 2) sequência de aminoácidos da porção extracelular de
CD33 compreendendo uma deleção dos resíduos I47 a D51 é fornecida pela SEQ ID NO: 3. O peptídeo sinal é mostrado em itálico e o domínio transmembrana é mostrado em itálico com sublinhado.
[00217] I47_D51 insdelVPFFE; Pontuação PROVEAN = -1,672
MPLLLLLPLL WAGALAMDPN FWLQVQESVT VQEGLCVLVP CTFFHPVPFF
EKNSPVHGYW FREGAIISRD SPVATNKLDQ EVQEETQGRF RLLGDPSRNN
CSLSIVDARR RDNGSYFFRM ERGSTKYSYK SPQLSVHVTD LTHRPKILIP
GTLEPGHSKN LTCSVSWACE QGTPPIFSWL SAAPTSLGPR TTHSSVLIIT
PRPQDHGTNL TCQVKFAGAG VTTERTIQLN VTYVPQNPTT GIFPGDGTAR
NDTRAGWHG AIGGAGVTAL LALCLCLTFF JVKTHRRKAA RTAVGRNDTH
PTTGSASPKH QKKSKLHGPT ETSSCSGAAP TVEMDEELHY ASLNFHGMNP
SKDTSTEYSE [00218] A VRTQ (SEQ ID NO: 3) sequência de aminoácidos da porção extracelular de
CD33 compreendendo uma deleção dos resíduos G249 a T253 é
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90/110 fornecida por SEQ ID NO: 4. O peptídeo sinal é mostrado em itálico e o domínio transmembrana mostrado em itálico com sublinhado.
MPLLLLLPLL WAGALAMDPN FWLQVQESVT VQEGLCVLVP CTFFHPIPYY
DKNSPVHGYW FREGAIISRD SPVATNKLDQ EVQEETQGRF RLLGDPSRNN
CSLSIVDARR RDNGSYFFRM ERGSTKYSYK SPQLSVHVTD LTHRPKILIP
GTLEPGHSKN LTCSVSWACE QGTPPIFSWL SAAPTSLGPR TTHSSVLIIT
PRPQDHGTNL TCQVKFAGAG VTTERTIQLN VTYVPQNPTT GIFPGDGSRA
GWRGAIGGA GVTALLALCL CLIFFIVKTH RRKAARTAVG RNDTHPTTGS
ASPKHQKKSK LHGPTETSSC SGAAPTVEMD EELHYASLNF HGMNPSKDTS
teysevrtq (SEQ ID NO: 4) [00219] A sequência de aminoácidos da porção extracelular de CD33 compreendendo uma deleção dos resíduos K250 a R254 é fornecida pela SEQ ID NO: 5. O peptídeo sinal é mostrado em itálico e o domínio transmembrana é mostrado em itálico com sublinhado.
MPLLLLLPLL WAGALAMDPN FWLQVQESVT VQEGLCVLVP CTFFHPIPYY
DKNSPVHGYW FREGAIISRD SPVATNKLDQ EVQEETQGRF RLLGDPSRNN
CSLSIVDARR RDNGSYFFRM ERGSTKYSYK SPQLSVHVTD LTHRPKILIP
GTLEPGHSKN LTCSVSWACE QGTPPIFSWL SAAPTSLGPR TTHSSVLIIT
PRPQDHGTNL TCQVKFAGAG VTTERTIQLN VTYVPQNPTT GIFPGDGSGA
GWH GATGGA GVTALLALCL CLTFFTVKTH RRKAARTAVG RNDTHPTTGS
ASPKHQKKSK LHGPTETSSC SGAAPTVEMD EELHYASLNF HGMNPSKDTS
teysevrtq (SEQ ID NO: 5) [00220] A sequência de aminoácidos da porção extracelular de CD33 compreendendo uma deleção dos resíduos P48 a K52 é fornecida pela SEQ ID NO: 6. O peptídeo sinal é mostrado em itálico e o domínio transmembrana é mostrado em itálico com sublinhado.
MPLLLLLPLL WAGALAMDPN FWLQVQESVT VQEGLCVLVP CTFFHPINSP
VHGYWFREGA IISRDSPVAT NKLDQEVQEE TQGRFRLLGD PSRNNCSLSI
MPLLLLLPLL WAGALAMDPN FWLQVQESVT VQEGLCVLVP CTFFHPINSP
VHGYWFREGA IISRDSPVAT NKLDQEVQEE TQGRFRLLGD PSRNNCSLSI
VDARRRDNGS YFFRMERGST KYSYKSPQLS VHVTDLTHRP KILIPGTLEP
GHSKNLTCSV SWACEQGTPP IFSWLSAAPT SLGPRTTHSS VLIITPRPQD
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HGTNLTCQVK
FAGAGVTTER
TIQLNVTYVP
QNPTTGIFPG
DGSGKQETRA
GWH GAIGGA
GVTALLALCL
CLIFFIVKTH
RRKAARTAVG
RNDTHPTTGS
ASPKHQKKSK
LHGPTETSSC
SGAAPTVEMD
EELHYASLNF
HGMNPSKDTS teysevrtq (SEQ ID NO: 6) [00221] A sequência de aminoácidos da porção extracelular de
CD33 compreendendo uma deleção dos resíduos Q251 a A255 é fornecida pela SEQ ID NO: 7. O peptídeo sinal é mostrado em itálico e o domínio transmembrana é mostrado em itálico com sublinhado.
MPLLLLLPLL WAGALAMDPN FWLQVQESVT VQEGLCVLVP CTFFHPIPYY
DKNSPVHGYW EREGAITSRD SPVATNKLDQ EVQEETQGRF RLLGDPSRNN
CSLSIVDARR RDNGSYFFRM ERGSTKYSYK SPQLSVHVTD LTHRPKILIP
GTLEPGHSKN LTCSVSWACE QGTPPIFSWL SAAPTSLGPR TTHSSVLIIT
PRPQDHGTNL TCQVKFAGAG VTTERTIQLN VTYVPQNPTT GIFPGDGSGK
GWH GAIGGA GVTALLALCL CLTFFTVKTH RRKAARTAVG RNDTHPTTGS
ASPKHQKKSK LHGPTETSSC SGAAPTVEMD EELHYASLNF HGMNPSKDTS
teysevrtq (SEQ ID NO: 7)
EXEMPLO 2: Geração e Caracterização de Células [00222] Células T CD8+ humanas primárias são isoladas a partir do sangue periférico dos pacientes por separação imunomagnética (Miltenyi Biotec). As células T são cultivadas e estimuladas com esferas revestidas com mAbs anti-CD3 e anti-CD28 (Invitrogen) como anteriormente descrito (Levine e outros, J. Immunol. (1997) 159 (12): 5921).
[00223] Receptores quiméricos que se ligam a um epitopo de CD33 são gerados usando tecnologias convencionais de DNA recombinante e inseridos em um vetor lentiviral. Os vetores contendo os receptores quiméricos são usados para gerar partículas lentivirais, que são usadas para transduzir células T CD8+ primárias. IL-2 humana recombinante pode ser adicionada em dias alternados (50 IU / mL). As células T são cultivadas por aproximadamente 14 dias após a estimulação. A expressão dos receptores quiméricos pode ser
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92/110 confirmada utilizando métodos tais como Western blotting e citometria de fluxo.
[00224] As células T que expressam os receptores quiméricos são selecionadas e avaliadas quanto à sua capacidade de se ligarem a CD33 e de induzir citotoxicidade de células expressando CD33. As células imunes que expressam o receptor quimérico são também avaliadas quanto à sua capacidade de induzir citotoxicidade de células que expressam CD33 que foi manipulado para não ter o epitopo ao qual o receptor quimérico se liga. De um modo preferencial, as células imunes que expressam receptores quiméricos que se ligam a CD33, mas não a CD33 que não têm o epitopo, são selecionadas (Figura 3).
[00225] As células (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas) que expressam CD33 mas não têm um epitopo de CD33 são também avaliadas quanto a várias características, incluindo proliferação, diferenciação eritopoiética, e formação de colônias para confirmar que a manipulação do epitopo não afetou significativamente a função de CD33.
EXEMPLO 3: Tratamento da Doença Hematológica [00226] Um regime de tratamento exemplificativo utilizando os métodos, células e agentes aqui descritos para leucemia mieloide aguda é fornecido abaixo.
1) Identificar um paciente com LMA que é um candidato para receber um transplante de células hematopoiéticas (HCT);
2) Identificar um doador de HCT com haplótipos HLA pareados, usando métodos e técnicas padrão;
3) Extrair a medula óssea do doador;
4) Manipular geneticamente as células da medula óssea do doador ex vivo. Resumidamente, introduzir uma modificação direcionada (deleção, substituição) de um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica. Em geral, o epitopo deve
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93/110 geralmente ser ao menos 3 aminoácidos (por exemplo, cerca de 6 a 10 aminoácidos). A modificação genética deste epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica alvo nas células da medula óssea do doador não deve impactar substancialmente na função da proteína e, como uma consequência, não deve afetar substancialmente a função das células da medula óssea, incluindo sua capacidade de enxertar com sucesso no paciente e mediar os efeitos do enxerto versus tumor (GVT);
Etapas Opcionais 5-7:
[00227] Em algumas modalidades, as Etapas 5-7 fornecidas abaixo podem ser realizadas (uma vez ou várias vezes) em um método de tratamento exemplificative como aqui descrito:
5) Precondicionar o paciente com LMA usando técnicas padrão, tal como infusão de agentes quimioterápicos (por exemplo, etoposídeo, ciclofosfamida) e/ou irradiação;
6) Administrar a medula óssea do doador modificada para o paciente com LMA, permitindo o enxerto com sucesso;
7) Acompanhar com um agente citotóxico, tal como células imunes expressando um receptor quimérico (por exemplo, célula T CAR) ou conjugado anticorpo - fármaco, em que o epitopo ao qual o agente citotóxico se liga é o mesmo epitopo que foi modificado e não está mais presente no enxerto de medula óssea do doador modificada. A terapia alvo deve, assim, visar especificamente o epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica, sem eliminar simultaneamente o enxerto da medula óssea, no qual o epitopo não está presente;
Etapas Opcionais 8-10:
[00228] Em algumas modalidades, as Etapas 8-10 podem ser realizadas (uma ou várias vezes) em um método de tratamento exemplificative como aqui descrito:
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8) Administrar um agente citotóxico, tal como células imunes expressando um receptor quimérico (por exemplo, célula T CAR) ou conjugado anticorpo - fármaco que tem como alvo um epitopo de uma proteína de superfície celular de linhagem específica. Esperase que esta terapia direcionada elimine tanto as células cancerosas quanto as células não cancerosas do paciente;
9) Precondicionar o paciente com LMA usando técnicas padronizadas, tal como a infusão de agentes quimioterápicos;
10) Administrar a medula óssea do doador modificada para o paciente com LMA, permitindo o enxerto com sucesso.
[00229] As etapas 8-10 resultam na eliminação das células cancerosas e normais do paciente que expressam a proteína alvo, enquanto restabelecendo a população de células normais com células do doador que são resistentes ao terapêutico alvo.
EXEMPLO 4: Deleção do Éxon 2 de CD19 ou CD33 através da Edição do Gene Mediada por CRISPR / Cas9 Materiais e Métodos
Projeto de construtos de sqRNA [00230] Todos os sgRNAs foram projetados por inspeção manual para o SpCas9 PAM (5’-NGG-3’) com proximidade com a região alvo e priorizados de acordo com a especificidade prevista, minimizando possíveis sítios fora do alvo no genoma humano com um algoritmo de busca on-line (Benchling, Doench e outros, 2016, Hsu e outros, 2013). Todos os sgRNAs sintéticos foram adquiridos a partir de Synthego com nucleotideos quimicamente modificados nas três posições terminais tanto na extremidade 5’ quanto na extremidade 3’. Os nucleotideos modificados continham 2’-O-metil-3’-fosforotioato (abreviado como ms) e os ms-sgRNAs foram purificados por HPLC. A proteína Cas9 foi adquirida a partir de Synthego (Figuras 5 a 8) e Aldervon (Figuras 9, 10, 14, 17, 18).
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Manutenção Celular e Eletroporação de Linhagens de Células Humanas Imortalizadas [00231] As linhagens de células de leucemia humana K562 foram obtidas a partir de American Type Culture Collection (ATCC) e mantidas em DMEM + FBS a 10% e mantidas a 37° C em CO2 a 5%. As células K562 foram editadas por eletroporação da ribonucleoproteína Cas9 (RNP) utilizando 0 Lonza Nucleofector (programa SF220) e 0 kit de nucleofecção de células humanas P3 (VPA-1002, Lonza). As células Raji-Fluc-GFP foram adquiridas a partir de Capital Biosciences e mantidas em RPMI + FBS a 10% + Glutamina a 1% a 37° C em CO2 a 5%. As células Raji-Fluc-GFP foram editadas por eletroporação de RNP utilizando 0 Lonza Nucleofector (programa DS104) e a linhagem de células SG 4D-Nucleofector X Kit S (V4XC-3032, Lonza). O Cas9 RNP foi produzido por incubação de proteína com mssgRNA em uma relação molar de 1:9 (20:180 pmol) a 25° C durante 10 minutos imediatamente antes da eletroporação. Após a eletroporação, as células foram incubadas durante 10 minutos na cuveta, transferidas para 1 ml do meio acima, e cultivadas durante 24 a 72 horas para análise à jusante.
Edição em CD34+ HSCs primárias humanas [00232] As CD34+ HSCs congeladas derivadas de sangue periférico mobilizado foram adquiridas a partir de AllCells e descongeladas de acordo com as instruções do fabricante. As CD34+ HSCs derivadas do sangue do cordão congelado foram adquiridas congeladas a partir de AllCells ou Stemcell e descongeladas e mantidas de acordo com as instruções do fabricante. Para editar HSCs, ~ 1e6 HSCs foram descongeladas e cultivadas em meio StemSpan SFEM suplementado com coquetel StemSpan CC110 (StemCell Technologies) por 24 h antes da eletroporação com RNP. Para eletroporar as HSCs, 1,5e5 foram peletizadas e ressuspensas em 20
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96/110 μΙ_ de solução de Lonza P3, e misturadas com 10 uL de Cas9 RNP como descrito acima. As CD34+ HSCs foram eletroporadas utilizando o Lonza Nucleofector 2 (programa DU-100) e o kit de nucleofecção de células humanas P3 (VPA-1002, Lonza).
Análise de DNA Genõmico [00233] Para todas as análises genômicas, o DNA foi coletado a partir das células usando o kit Qeasgen DNeasy. Para os ensaios de T7E1, a PCR foi realizada com os iniciadores flanqueando os sítios de corte CRISPR. Os produtos foram purificados por purificação por PCR (Qiagen) e 200 ng foram desnaturados e recozidos em um termociclador e digeridos com T7 Endonuclease I (New England Biolabs) de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA digerido foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1% e visualizado em um imageador BioRad ChemiDoc. As intensidades das bandas foram analisadas usando o Image Lab Software (Bio-Rad) e as frequências de modificação alélica (INDEL) foram calculadas com a fórmula: 100 χ (1-(1- fração clivada) Λ 0,5). Para análise das frequências de modificação alélica usando TIDE (Triagem de Indels por Decomposição), os produtos de PCR purificados foram sequenciados por Sanger (Eton) usando ambos os iniciadores de PCR e cada cromatograma de sequência foi analisado com o software TIDE online (Deskgen). As análises foram realizadas utilizando uma sequência de referência de uma amostra falsamente transfectada (apenas proteína Cas9). Os parâmetros foram definidos para o tamanho de indel máximo padrão de 10 nucleotídeos e a janela de decomposição para cobrir a maior janela possível com traços de alta qualidade. Todas as análises TIDE abaixo da sensibilidade de detecção de 3,5% foram definidas como 0%.
[00234] Para determinar a deleção genômica de extensão com mssgRNAs duplos, a PCR de desfecho foi realizada com iniciadores
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97/110 flanqueando os sítios de corte CRISPR que amplificam uma região de 804bp. Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 1% e observados em um imageador BioRad ChemiDoc para observar a banda parental intacta e o produto de deleção menor esperado (400-600 pb dependendo da combinação de ms-sgRNA). As intensidades das bandas foram analisadas usando o Software Image Lab (Bio-Rad) e as porcentagens de deleções foram calculadas com a fórmula: 100 χ fração clivada. As bandas de gel foram extraídas com um kit de extração de gel (Qiagen) e posteriormente purificadas por purificação por PCR (Qiagen) para sequenciação Sanger (Eton Bioscience).
Citometria de Fluxo e Análise FACS [00235] As células Raji-fluc-GFP nucleofectadas com RNP como descrito acima foram mantidas em cultura de células por 48 horas. As células vivas foram coradas com anticorpo CD19 conjugado com PE (IM1285U; Beckman Coulter) e analisadas separadas em um BD FACS Aria por expressão de CD19. As CD34+ HSCs foram coradas para CD33 usando um anticorpo anti-CD33 (P67.7) e analisadas por citometria de fluxo no citômetro de fluxo Attune NxT (Life Technologies).
Ensaios de Citotoxicidade de Células CAR-T [00236] As células CAR-T dirigidas para CD19 (CART19) foram geradas por transdução de lentivírus expressando CART19 em células T CD4+ e CD8+ de doadores humanos saudáveis. O construto CART19 contém um domínio de reconhecimento de CD19 (fragmento variável de cadeia simples derivado do anticorpo monoclonal FMC63), um domínio coestimulatório derivado de CD28 e o domínio CD3 zeta. A citotoxicidade do CART19 foi avaliada por ensaio baseado em citometria de fluxo. As células Raji-fluc-GFP coradas com corante CellTrace Violet serviram como células alvo. As células T não
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98/110 transduzidas com o construto de CART19 foram usadas como um controle negativo para o ensaio de citotoxicidade. As células efetoras (E) e as células tumorais alvo (T) foram cocultivadas nas relações E / T indicadas (10:1, 3:1, 0:1), com 1 χ 104 células alvo em um volume total de 200 μΙ por poço em meio isento de soro à base de CTS OpTmizer. Após 20 horas de incubação, as células foram coradas para iodeto de propídio e analisadas pelo citômetro de fluxo Attune NxT (Life Technologies). As células alvo vivas foram selecionadas como Iodeto de Propídio-neagativas e CelITrace Violet-positivas. A citotoxicidade foi calculada como (1- (fração de célula alvo ativa no grupo CART19) / (fração de célula alvo ativa no grupo de controle negativo)) x 100%.
Experimentos de Enxerto In vivo [00237] Para experimentos de enxerto in vivo de CD19, as células são enxertadas em camundongos NOD scid gamma (camundongos NSGTM; The Jackson Laboratory). Para experimentos de enxerto in vivo de CD33, as células são enxertadas em camundongos NSGSGM3 (The Jackson Laboratory).
Direcionando o Éxon 2 de CD19
Seleção de qRNAs [00238] O éxon 2 de CD19 foi alvo de deleção genômica mediada por CRISPR/Cas9 como exemplificado na Figura 4. Um par de sgRNAs, um sgRNA tendo como alvo o íntron 1 e um sgRNA tendo como alvo o íntron 2, conduz à geração simultânea de quebras de cadeia dupla de DNA (DSB) por Cas9 e excisão da região incluindo perda completa do éxon 2 de CD 19. As extremidades distais ao sítio de corte são reparadas através da ligação dos introns 1 e 2 através da união de extremidade não homóloga (NHEJ). A transcrição do gene CD19 modificado resulta na expressão de uma variante de CD19 sem o éxon 2 (deleção de éxon2 de CD19) através do salto do éxon 2
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99/110 durante o splicing do RNA.
[00239] Um painel de sgRNAs direcionados aos introns 1 e 2 foi projetado por inspeção manual para o SpCas9 PAM (5’-NGG-3’) com proximidade ao éxon 2 de CD19 e priorizado de acordo com a especificidade prevista, maximizando os potenciais sítios alvo e minimizando os potenciais sítios fora do alvo no genoma humano com um algoritmo de busca on-line (Benchling, Doench e outros (2016); Hsu e outros (2013)) (Tabela 3). Para cada um dos CD19 sgRNAs exemplificativos, a sequência tem como alvo CD19 e o tipo de Cas é SpCas9.
Tabela 3: Painel de CD19 sqRNA
Nome Sequênia de sgRNA Localização Fita PAM No alvo (Doench e outros, 2016)1 Fora do Alvo (Hsu e outros, 2013)1
CD19_sgRNA-1 GAGGCTGGAAACTTGAGTTG (SEQ ID NO: 14) intron 1 1 TGG 57 67
CD19_sgRNA-3 GAGGGTAAGTTACTCAGCCA (SEQ ID NO: 15) intron 1 -1 AGG 68 60
CD19_sgRNA-4 AAATTCAGGAAAGGGTTGGA (SEQ ID NO: 16) intron 1 1 AGG 53 62
CD19_sgRNA-5 AAGGGTTGGAAGGACTCTGC (SEQ ID NO: 17) intron 1 1 CGG 60 64
CD19_sgRNA-6 AGCAGAGGACTCCAAAAGCT (SEQ ID NO: 18) intron 1 -1 GGG 62 59
CD19_sgRNA-7 CACACCAGGTTATAGAGCAG (SEQ ID NO: 19) intron 1 -1 AGG 63 67
CD19_sgRNA-8 CTGCTCTATAACCTGGTGTG (SEQ ID NO: 20) intron 1 1 AGG 71 63
CD19_sgRNA-9 ACCTGGTGTGAGGAGTCGGG (SEQ ID NO: 21) intron 1 1 GGG 58 69
CD19_sgRNA-10 CACAGCGTTATCTCCCTCTG (SEQ ID NO: 22) Exon 2 -1 TGG 68 69
CD19_sgRNA-13 CGGACCTCTTCTGTCCATGG (SEQ ID NO: 23) intron 2 -1 TGG 65 65
CD19_sgRNA-14 CCATGGACAGAAGAGGTCCG (SEQ ID NO: 24) intron 2 1 CGG 72 65
CD19_sgRNA-15 GGGCGAAACTCGGAGCTAGG (SEQ ID NO: 25) intron 2 1 TGG 80 65
CD19_sgRNA-16 GCTAGGTGGGCAGACTCCTG (SEQ ID NO: 26) intron 2 1 GGG 59 60
CD19_sgRNA-1 GAGGCTGGAAACTTGAGTTG (SEQ ID NO: 14) intron 1 1 TGG 57 67
CD19_sgRNA-3 GAGGGTAAGTTACTCAGCCA (SEQ ID NO: 15) intron 1 -1 AGG 68 60
CD19_sgRNA-4 AAATTCAGGAAAGGGTTGGA (SEQ ID NO: 16) intron 1 1 AGG 53 62
1 Previsões no alvo e fora do alvo baseadas nos algoritmos publicados indicados. O escore é baseado em 100 e é uma previsão de sucesso. [00240] Para edição de genes, os sgRNAs foram modificados conforme descrito em Materiais e Métodos. Os sgRNAs modificados
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100/110 são indicados com o prefixo ms.
[00241] Os CD 19 sgRNAs que têm como alvo o íntron 1 ou 2 foram rastreados em células K562, uma linhagem de células de leucemica humana e analisados por ensaio T7E1 e análise TIDE (Figura 5). Dos 12 ms-sgRNAs avaliados, os ms-sgRNAs 1, 3-9 têm como alvo o íntron 1, ms-sgRNA 10 tem como alvo o éxon 2, e o ms-sgRNA 14-16 tem como alvo o íntron 2.
[00242] O percentual de INDEL para ms-sgRNA-1 não foi calculado para esta amostra porque a alteração de tamanho entre as bandas editadas e não editadas não pode ser distinguida com precisão utilizando o conjunto atual de iniciadores de PCR.
[00243] Foram usados pares de ms-sgRNAs para deletar o éxon 2 de CD19 em células K562, e foi usado um ensaio baseado em PCR para detectar a deleção genômica mediada por CRISPR / Cas9 do éxon2 de CD19 (Figura 6). A atividade combinada de ms-sgRNAs direcionados ao íntron 1 (ms-sgRNAs 3, 4, 5, 6, 9) foi rastreada em combinação com ms-sgRNAs direcionados ao íntron 2 (ms-sgRNAs 14, 15, 16) para gerar deleções genômicas. PCR através da região de deleção genômica mostra o produto de PCR de deleção menor (400560 pb) em comparação com a banda parental maior (801 pb). A eficiência de edição foi quantificada como porcentagem de deleção por PCR de desfecho (Figura 6, painel C).
[00244] Os CD19 sgRNAs que têm como alvo o íntron 1 ou 2 foram também rastreados em CD34+ HSCs (Figuras 7 e 9).
[00245] Pares de ms-gRNAs foram usados para deletar o éxon 2 de CD19 em CD34+ HSCs. A atividade combinada de ms-sgRNAs dirigidos para o íntron 1 (ms-sgRNAs 4, 6, 9) foi rastreada em combinação com ms-sgRNAs dirigidos ao íntron 2 (ms-gRNAs 14, 15, 16) para gerar deleções genômicas (Figura 8). PCR através da região de deleção genômica mostra o produto de PCR de deleção menor em
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101/110 comparação com a faixa parental maior. A eficiência de edição foi quantificada uma porcentagem de deleção por PCR de desfecho.
[00246] Pares adicionais de ms-gRNAs foram usados para excluir o éxon 2 de CD19 em CD34+ HSCs. A combinação de ms-sgRNAs direcionados ao íntron 1 (ms-sgRNAs 1, 6, 7) em combinação com mssgRNAs direcionados ao íntron 2 (ms-gRNAs 14, 15, 16) mostrou gerar eficientemente deleções genômicas do éxon 2 (Figura 10).
Potencial de Diferenciação de CD34+ HSCs Editadas [00247] O potencial de diferenciação de qualquer uma das células editadas produzidas utilizando os métodos aqui descritos pode ser avaliado.
[00248] As CD34+ HSCs editadas que são deficientes no éxon 2 são geradas ex vivo e analisadas conforme descrito em Materiais e Métodos. As CD34+ HSCs editadas são geradas ex vivo, conforme descrito em Materiais e Métodos. Resumidamente, as CD34+ HSCs são descongeladas e colocadas em contato com a ribonucleoproteína pré-formada (RNP). As amostras são divididas em duas frações: 2% das células são caracterizadas in vitro e a fração restante é enxertada em camundongos NOD scid gamma de 6 a 8 semanas de idade (NOD.Cg-Prkdcscid ||2rgtm1Wjl / SzJ (camundongos NSG™); The Jackson Laboratory) (Figura 11)). A fração in vitro é caracterizada pelo ensaio de unidade de formação de colônia (CFU) e genotipagem.
[00249] A fração in vivo é administrada a camundongos NSG™ irradiados. Os grupos de camundongos são apresentados na Tabela 4. As amostras de sangue são obtidas a partir dos camundongos em vários momentos (por exemplo, 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas) e analisadas por genotipagem e para avaliar a percentagem de células CD45+ humanas. Às 16 semanas, os camundongos são sacrificados e o sangue periférico, a medula óssea e os baços são colhidos para análise. O desfecho primário é o percentual de enxerto, que é avaliado
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102/110 por genotipagem e análise de citometria de fluxo (por exemplo, CD45 de camundongo vs humano, CD20 / CD19, CD19 deficiente no éxon 2, Cd34, CD33, CD3). Um desfecho secundário é a expressão de CD19 que é deficiente no éxon 2 por Western blotting e/ou qRT-PCR.
Tabela 4: Grupos de Caracterização In vivo
Grupo Nome do Grupo Comentário # Camundongo
1 Não tratado 5
2 Simulado Grupo de doadores #1 10
3 Teste 10
4 Não tratado 5
5 Simulado Grupo de doadores #2 10
6 Teste 10
Modelo de Tumor Raji In vivo [00250] Um modelo de tumor Raji in vivo pode ser usado para testar a eficácia de qualquer um dos métodos de tratamento aqui descritos.
[00251] As células Raji-fluc-GFP que expressam CD19 endógeno deficiente no éxon 2 (deleção de éxon2 de CD19) foram geradas ex vivo como descrito nos Materiais e Métodos. Após o enriquecimento das células editadas, as amostras são divididas em duas frações: uma fração é caracterizada in vitro e a fração restante é xenoenxertada em camundongos NSG com 6 a 8 semanas de idade (Figura 12).
[00252] A fração in vitro é caracterizada por citotoxicidade e ensaios moleculares, como descrito em Materiais e Métodos.
[00253] A fração in vivo é avaliada quanto à eficácia e à seletividade de CART19 em modelo de camundongo de Linfoma de Burkett e avaliada pelos ensaios indicados e como descrito em Materiais e Métodos. Os grupos de camundongos são mostrados na Tabela 5. Resumidamente, uma semana após a injeção das células Raji-flucGFP que expressam CD19 endógeno deficiente no éxon 2, os camundongos são células CART19 infundidas. Os camundongos são avaliados em vários momentos (por exemplo, 6 dias, 12 dias, 18 dias, 35 dias) pelo sistema de imagiologia in vivo (IVIS) para determinar a
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103/110 abundância de células Raji (CD19 I CD19ex2). Amostras de sangue também são obtidas a partir dos camundongos para quantificar o número de células CART19.
Tabela 5: Grupos de Caracterização In vivo
Grupo Condição CART19 # Camundongo
1 Controle não tratado - 4
2 Controle não tratado + 10
43 Raji FlucGFP; CD19+/+ - 10
4 Raji FlucGFP; CD19+/+ + 10
5 Raji FlucGFP; CD19éxon2DEL - 10
6 Raji FlucGFP; CD19éxon2DEL + 10
[00254] O desfecho primário da eficácia do tratamento é avaliado, por exemplo, pela sobrevida, volume de carga tumoral, e carga tumoral através da imagiologia IVIS. O desfecho primário de seletividade do tratamento é avaliado, por exemplo, pela determinação da persistência de células Raji-GFP.
[00255] Os desfechos secundários para a terapia com CART19 incluem farmacocinética e infiltração tumoral, e os desfechos secundários para CD19 incluem a expressão de CD19 que é deficiente no éxon 2.
[00256] É esperado que as células Raji expressando o éxon 2 de CD19 sejam mortas pelas células CART19, enquanto as células Raji que foram manipuladas para eliminar o éxon 2 de CD19 sobreviverão e escaparão à morte de CART.
Geração de Linhagens de Células Raji-fluc-GFP Deficientes no Éxon CD19 2 [00257] As linhas de células Raji-fluc-GFP foram transfectadas com pares de ms-sgRNA e ensaiadas quanto à expressão de CD19 por triagem de células ativadas por fluorescência (FACS). As células foram selecionadas em três populações com base na expressão relativa de CD19: hi (alta), int (intermediária) e Io (baixa) (Figura 13). As células parentais Raji e Raj-fluc-GFP nucleofectadas com Cas9
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104/110 apenas foram incluídas como controles. A porcentagem de células vivas em cada condição foi quantificada (Figura 13, painel B). PCR foi também realizado através da região de deleção genômica das células em cada condição, mostrando o produto de PCR de deleção menor em comparação com a maior banda parental (Figura 13, painel C). A porcentagem do éxon 2 de CD19 na população a granel foi também avaliada por PCR de desfecho em cada condição (Figura 13, painel D), indicando que havia uma porcentagem mais elevada de células com a deleção do éxon 2 de CD19 em populações de células CD19 int e CD19 Io.
Citotoxicidade de CART [00258] As células CAR-T dirigidas para CD19 (CART19) foram geradas como descrito em Materiais e Métodos e incubadas com células Raji-fluc-GFP. Após 20 horas de incubação, a citotoxicidade foi avaliada por citometria de fluxo. A Figura 14 mostra que houve redução da lise específica de células CD19 Io de Raji em comparação com populações de CD19 hi.
[00259] Como mostrado na Figura 13, a população de Raji hi é uma população de células genotipicamente mistas. Células individuais podem ser enriquecidas para analisar populações clonais, bem como populações parentais não editadas. A população de controle de CD19hi é um genótipo misto (20-40% de deleção de éxon2 de CD19), e espera-se uma morte aumentada com populações de controle de ocorrência natural.
Eficácia e Seletividade In vivo [00260] A Figura 15 descreve um modelo abrangente in vivo que avalia a eficácia e a seletividade da terapia CART pareada com HSCs editadas. Resumidamente, HSCs deficientes no éxon 2 de CD19 (CD19ex2delete) são preparadas. A grupos de camundongos são administradas HSCs de controle (não editadas) ou HSCs deficientes
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105/110 no éxon 2 de CD19. Após quatro semanas, aos camundongos são administrados células de linfoma de Raji Burkitt, seguidos pelas células CART19 uma semana depois. Os camundongos são avaliados semanalmente por imagiologia IVIS, e as amostras de sangue são obtidas a cada quatro semanas. Após 12 semanas, os camundongos são sacrificados e o sangue periférico, a medula óssea e os baços são colhidos para análise.
Direcionado ao Éxon 2 de CD33
Seleção de gRNAs [00261] O gene CD33 codifica duas isoformas principais, uma das quais retém o éxon 2, chamada de CD33M, e uma que exclui o éxon 2, chamada de CD33m (Figura 16). Um terapêutico direcionado a um epitopo no éxon 2 de CD33 tal como gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg) pode ser pareado com HSCs que são deficientes no éxon 2 de CD33 (por exemplo, CD33m).
[00262] Como mostrado na Figura 14, a nuclease Cas9 é direcionada para os introns 1 e 2 de CD33 por dois sgRNAs. A geração simultânea de quebras de fita dupla de DNA (DSBs) por Cas9 leva à excisão da região incluindo a perda completa do éxon 2. As extremidades distais ao sítio de corte são reparadas através da ligação dos introns 1 e 2 por meio de junção não homóloga (NHEJ) com a junção reparada indicada pelo triângulo. A transcrição do genoma modificado resulta na expressão da isoforma CD33m.
[00263] Um painel de ms-sgRNAs foi projetado por inspeção manual para o SpCas9 PAM (5’-NGG-3’) com proximidade ao éxon 2 de CD33 e priorizado de acordo com a especificidade prevista, minimizando potenciais sítios fora do alvo no genoma humano com um algoritmo de busca online (Benchling, Doench e outros, 2016); Hsu e outros (2013)) (Tabela 6). Um subconjunto de ms-sgRNAs visando o íntron 1 ou 2 foi então selecionado com base na eficiência de edição
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106/110 genética in vitro. Cada um dos sgRNAs tem como alvo CD33 humano e usa Cas9 tipo SpCas9.
Tabela 6: Painel CD33 sqRNA
Nome Sequência de sgRNA PAM Localização No Alvo (Doench e outros, 2016)1 Fora do Alvo (Hsu e outros, 2013)1
CD33_sgRNA-1 GCTGTGGGGAGAGGGGTTGT (SEQ ID NO: 27) CGG intron 1 39 29
CD33_sgRNA-2 CTGTGGGGAGAGGGGTTGTC (SEQ ID NO: 28) GGG intron 1 46 35
CD33_sgRNA-3 TGGGGAAACGAGGGTCAGCT (SEQ ID NO: 29) CGG intron 1 60 29
CD33_sgRNA-4 GGGCCCCTGTGGGGAAACGA (SEQ ID NO: 30) GGG intron 1 65 40
CD33_sgRNA-5 AGGGCCCCTGTGGGGAAACG (SEQ ID NO: 31) AGG intron 1 50 36
CD33_sgRNA-6 GCTGACCCTCGTTTCCCCAC (SEQ ID NO: 32) AGG intron 1 47 31
CD33_sgRNA-7 CTGACCCTCGTTTCCCCACA (SEQ ID NO: 33) GGG intron 1 52 27
CD33_sgRNA-8 TGACCCTCGTTTCCCCACAG (SEQ ID NO: 34) GGG intron 1 71 29
CD33_sgRNA-9 CCATAGCCAGGGCCCCTGTG (SEQ ID NO: 35) GGG intron 1 61 24
CD33_sgRNA-10 GCATGTGACAGGTGAGGCAC (SEQ ID NO: 36) AGG intron 2 56 36
CD33_sgRNA-11 TGAGGCACAGGCTTCAGAAG (SEQ ID NO: 37) TGG intron 2 55 32
CD33_sgRNA-12 AGGCTTCAGAAGTGGCCGCA (SEQ ID NO: 38) AGG intron 2 54 39
CD33_sgRNA-13 GGCTTCAGAAGTGGCCGCAA (SEQ ID NO: 39) GGG intron 2 58 44
CD33_sgRNA-14 GTACCCATGAACTTCCCTTG(SEQID NO: 40) CGG intron 2 75 40
CD33_sgRNA-15 GTGGCCGCAAGGGAAGTTCA (SEQ ID NO: 41) TGG intron 2 63 42
CD33_sgRNA-16 TGGCCGCAAGGGAAGTTCAT (SEQ ID NO: 42) GGG intron 2 53 43
CD33_sgRNA-17 GGAAGTTCATGGGTACTGCA (SEQ ID NO: 43) GGG intron 2 66 42
CD33_sgRNA-18 TTCATGGGTACTGCAGGGCA (SEQ ID NO: 44) GGG intron 2 59 32
CD33_sgRNA-19 CTAAACCCCTCCCAGTACCA (SEQ ID NO: 45) GGG intron 2 61 40
CD33_sgRNA-20 CACTCACCTGCCCACAGCAG (SEQ ID NO: 46) GGG intron 1 56 23
CD33_sgRNA-21 CCCTGCTGTGGGCAGGTGAG (SEQ ID NO: 47) TGG intron 1 44 20
CD33_sgRNA-22 TGGGCAGGTGAGTGGCTGTG (SEQ ID NO: 48) GGG intron 1 61 26
CD33_sgRNA-23 GGTGAGTGGCTGTGGGGAGA (SEQ ID NO: 49) GGG intron 1 42 24
CD33_sgRNA-24 GTGAGTGGCTGTGGGGAGAG (SEQ ID NO: 50) GGG intron 1 49 20
1 Previsões no alvo e fora do alvo baseadas nos algoritmos publicados indicados. O escore é baseado em 100 e é uma previsão de sucesso. [00264] Os CD33 ms-sgRNAs dirigidos aos introns 1 ou 2 foram rastreados em CDS+ HSCs primárias pelo ensaio TIDE (Figuras 17 e 18).
[00265] Pares de ms-gRNAs foram usados testados em CD34+
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HSCs (Figura 18, painéis B e C). A deleção eficiente dos éxons 2 e 3 foi observada usando sgRNAs de controle visando os éxons 2 e 3 (Sg e 811, respectivamente). Observou-se uma redução no CD33 contendo éxon 2 com pares de sgRNA dirigidos aos introns 1 e 2 (por exemplo, sgRNAs 17 e 23; sgRNAs 17 e 24).
[00266] Outros pares de sgRNAs para excluir o éxon 2 de CD33 podem ser selecionados para identificar os pares que alcançam uma perda eficiente do éxon 2.
OUTRAS MODALIDADES [00267] Todas as características descritas nesta especificação podem ser combinadas em qualquer combinação. Cada característica descrita nesta especificação pode ser substituída por uma característica alternativa que serve a mesma finalidade, equivalente ou similar. Assim, a menos que expressamente declarado ao contrário, cada característica descrita é apenas um exemplo de uma série genérica de características equivalentes ou similares.
[00268] A partir da descrição acima, um versado na técnica pode facilmente verificar as características essenciais da presente descrição, e sem abandonar o espírito e o escopo da mesma, pode fazer várias alterações e modificações da descrição para adaptá-la a vários usos e condições. Assim, outras modalidades estão também dentro das reivindicações.
EQUIVALENTES [00269] Embora várias modalidades da invenção tenham sido descritas e ilustradas aqui, os versados na técnica prontamente imaginarão uma variedade de outros meios e/ou estruturas para realizar a função e/ou obter os resultados e/ou uma ou mais das vantagens descritas aqui, e cada uma dessas variações e/ou modificações é considerada dentro do escopo das modalidades da invenção aqui descritas. De um modo mais geral, os versados na técnica
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108/110 entenderão prontamente que todos os parâmetros, dimensões, materiais e configurações aqui descritos pretendem ser exemplificativos e que os parâmetros, dimensões, materiais e/ou configurações reais dependerão da aplicação ou aplicações específicas para as quais os ensinamentos da invenção são usados. Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades da invenção específicas aqui descritas. É, portanto, para ser entendido que as modalidades anteriores são apresentadas apenas a título de exemplo e que, dentro do escopo das reivindicações em anexo e seus equivalentes, as modalidades da invenção podem ser praticadas de forma diferente da especificamente descrita e reivindicada. As modalidades da invenção da presente descrição destinam-se a cada característica individual, sistema, artigo, material, kit e/ou método aqui descrito. Além disso, qualquer combinação de duas ou mais características, sistemas, artigos, materiais, kits e/ou métodos, se tais características, sistemas, artigos, materiais, kits e/ou métodos não forem mutuamente inconsistentes, está incluída no escopo da invenção da presente descrição.
[00270] Todas as definições, como definidas e usadas aqui, devem ser entendidas como controlando sobre definições de dicionários, definições em documentos incorporados por referência e/ou significados ordinários dos termos definidos.
[00271] Todas as referências, patentes e pedidos de patentes aqui descritos são incorporados por referência no que diz respeito ao assunto para o qual cada um é citado, o que em alguns casos pode abranger a totalidade do documento.
[00272] Os artigos indefinidos um e uma, como usados aqui na especificação e nas reivindicações, a menos que claramente indicado ao contrário, devem ser entendidos para significar ao menos um.
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109/110 [00273] A frase e/ou, como usada aqui na especificação e nas reivindicações, deve ser entendida como significando um ou ambos dos elementos assim unidos, isto é, elementos que estão conjuntamente presentes em alguns casos e disjuntivamente presentes em outros casos. Múltiplos elementos listados com e/ou devem ser interpretados da mesma maneira, isto é, um ou mais dos elementos de forma conjunta. Outros elementos podem opcionalmente estar presentes, além dos elementos especificamente identificados pela cláusula e/ou, se relacionados ou não aos elementos especificamente identificados. Assim, como um exemplo não limitante, uma referência a A e/ou B, quando usada em conjunto com linguagem aberta como compreendendo pode referir-se, em uma modalidade, apenas a A (opcionalmente incluindo elementos diferentes de B); em outra modalidade, apenas para B (opcionalmente incluindo elementos diferentes de A); ainda em outra modalidade, tanto a A quanto a B (incluindo opcionalmente outros elementos); etc.
[00274] Como aqui usado na especificação e nas reivindicações, ou deve ser entendido como tendo o mesmo significado que e/ou como definido acima. Por exemplo, ao separar itens em uma lista, ou ou e/ou deve ser interpretado como inclusive, ou seja, a inclusão de ao menos um, mas também incluindo mais de um, de um número ou lista de elementos, e, opcionalmente, itens adicionais não listados. Apenas termos claramente indicados ao contrário, tal como apenas um de ou exatamente um de, ou, quando usados nas reivindicações, consistindo de, referem-se à inclusão de exatamente um elemento de um número ou lista de elementos. Em geral, o termo ou, como usado aqui, só deve ser interpretado como indicando alternativas exclusivas (ou seja, uma ou outra, mas não as duas), precedidas por termos de exclusividade, como qualquer um, um de, apenas um de, ou exatamente um de. Consistindo essencialmente em,
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110/110 quando usado nas reivindicações, terá seu significado comum como usado no campo da lei de patentes.
[00275] Como aqui usado na especificação e nas reivindicações, a frase ao menos um, em referência a uma lista de um ou mais elementos, deve ser entendida como significando ao menos um elemento selecionado a partir de qualquer um ou mais dos elementos na lista de elementos, mas não necessariamente incluindo ao menos um de cada elemento especificamente listado na lista de elementos e não excluindo quaisquer combinações de elementos na lista de elementos. Esta definição também permite que elementos possam opcionalmente estar presentes, além dos elementos especificamente identificados dentro da lista de elementos aos quais a frase ao menos um se refere, se relacionados ou não aos elementos especificamente identificados. Assim, como exemplo não limitante, ao menos um de A e B (ou, equivalentemente, ao menos um de A ou B, ou, equivalentemente ao menos um de A e/ou B) pode se referir, em uma modalidade, a ao menos um, opcionalmente incluindo mais de um, A, sem B presente (e opcionalmente incluindo elementos diferentes de B); em outra modalidade, a ao menos um, opcionalmente incluindo mais do que um, B, sem A presente (e opcionalmente incluindo elementos diferentes de A); ainda em outra modalidade, a ao menos um, opcionalmente incluindo mais de um, A, e ao menos um, opcionalmente incluindo mais de um, B (e opcionalmente incluindo outros elementos); etc.
[00276] Também dever-se-ia entender que, a menos que claramente indicado ao contrário, em qualquer dos métodos aqui reivindicados que incluam mais de uma etapa ou ação, a ordem das etapas ou ações do método não está necessariamente limitada à ordem em que as etapas ou ações do método são citadas.

Claims (60)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para tratar uma malignidade hematopoiética, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade de tratamento:
    (i) uma quantidade eficaz de um agente citotóxico dirigido a células que expressam uma proteína de superfície celular de linhagem específica, em que opcionalmente o agente citotóxico compreende um fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica; e (ii) uma população de células hematopoiéticas, em que as células hematopoiéticas são manipuladas de tal modo que elas ou seus descendentes têm uma ligação reduzida com o agente citotóxico.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas ou os seus descendentes expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica e são manipuladas geneticamente de tal modo que a proteína de superfície celular de linhagem específica não tem o epitopo ao qual o agente citotóxico se liga.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica expressa na célula hematopoética ou em seus descendentes compreende uma deleção do epitopo ou alteração de um ou mais resíduos de aminoácidos no epitopo ao qual o fragmento de ligação ao antígeno no agente citotóxico se liga.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica e são manipuladas por contato das células hematopoiéticas com um agente bloqueador que compreende o fragmento de ligação ao antígeno, e em que o agente bloqueador se liga à proteína de superfície celular de linhagem
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    2/9 específica e bloqueia a sua ligação com o agente citotóxico.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas são incubadas ex vivo com o agente bloqueador.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o agente bloqueador é administrado ao indivíduo.
  7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica é um epitopo não essencial.
  8. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento de anticorpo de cadeia simples (scFv) que se liga especificamente ao epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica.
  9. 9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é um anticorpo ou um conjugado anticorpo - fármaco (ADC).
  10. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é uma célula imune que expressa um receptor quimérico que compreende o fragmento de ligação ao antígeno.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as células imunes são células T.
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o receptor quimérico ainda compreende:
    (a) um domínio de dobradiça, (b) um domínio transmembrana,
    c) ao menos um domínio coestimulatório, (d) um domínio de sinalização citoplasmático, ou
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    3/9 (e) uma combinação dos mesmos.
  13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o receptor quimérico compreende ao menos um domínio de sinalização coestimulatório, que é derivado a partir de um receptor coestimulatório selecionado a partir do grupo que consiste em CD27, CD28, 4-1 BB, 0X40, CD30, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, GITR, HVEM, e uma combinação dos mesmos
  14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o receptor quimérico compreende um domínio de sinalização citoplasmático, que é de Οϋ3ζ.
  15. 15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o receptor quimérico compreende um domínio de dobradiça, que é de CD8a ou CD28.
  16. 16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica é um epitopo compreendendo ao menos 3 aminoácidos.
  17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o epitopo consiste em 6 a 10 aminoácidos.
  18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica expressa na população de células hematopoiéticas ou em seus descendentes tem uma deleção de um fragmento, que é codificado por um éxon de um gene da proteína de superfície celular de linhagem específica, e em que o fragmento compreende o epitopo da proteína de superfície celular de linhagem específica.
  19. 19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica é uma proteína de superfície celular de linhagem específica tipo 1.
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    4/9
  20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica tipo 1 é CD19.
  21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o epitopo está localizado na região codificada pelo éxon 2 do gene CD19.
  22. 22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica é uma proteína de superfície celular de linhagem específica tipo 2.
  23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica tipo 2 é CD33.
  24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o epitopo está localizado na região codificada pelo éxon 2 do gene CD33.
  25. 25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas são células-tronco hematopoiéticas.
  26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as células-tronco hematopoiéticas são de células da medula óssea, células do sangue do cordão, ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs).
  27. 27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que as células imunes, as células hematopoiéticas, ou ambas, são alogênicas ou autólogas.
  28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas são células-tronco hematopoiéticas alogênicas que correspondem ao haplótipo HLA do indivíduo.
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    5/9
  29. 29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que compreendeainda obter as células hematopoiéticas a partir de um doador tendo um haplótipo HLA que corresponde ao haplótipo HLA do indivíduo.
  30. 30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende ainda preparar as células hematopoiéticas sem o epitopo ao qual o agente citotóxico se liga.
  31. 31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas sem o epitopo são preparadas por modificação genética de um gene endógeno das células hematopoiéticas que codificam a proteína de superfície celular de linhagem específica.
  32. 32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi precondicionado antes da administração do agente citotóxico e/ou das células hematopoiéticas.
  33. 33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que compreende ainda precondicionar o indivíduo antes da administração do agente citotóxico e/ou das células hematopoiéticas.
  34. 34. Método, de acordo com a reivindicação 23 ou 33, caracterizado pelo fato de que o precondicionamento compreende administrar um ou mais agentes quimioterápicos ao indivíduo.
  35. 35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, leucemia, ou mieloma múltiplo.
  36. 36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem leucemia, que é leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoblástica
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    6/9 aguda, ou leucemia linfoblástica crônica.
  37. 37. Célula hematopoiética geneticamente manipulada expressando uma variante de uma proteína de superfície celular de linhagem específica, caracterizada pelo fato de que a variante não tem um epitopo não essencial na proteína de superfície celular de linhagem específica.
  38. 38. Célula hematopoiética geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a célula hematopoiética é uma célula-tronco hematopoiética.
  39. 39. Célula hematopoiética geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizada pelo fato de que são de células da medula óssea, células do sangue do cordão, ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs).
  40. 40. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizada pelo fato de que o epitopo na proteína de superfície celular de linhagem específica é um epitopo compreendendo ao menos 3 aminoácidos.
  41. 41. Célula hematopoiética geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que o epitopo tem 6 a 10 aminoácidos.
  42. 42. Célula hematopoiética geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 41, caracterizada pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica é uma proteína de superfície celular de linhagem específica tipo 1.
  43. 43. Célula hematopoiética geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica tipo 1 é CD19.
  44. 44. Célula hematopoiética geneticamente modificada, de
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    7/9 acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o epitopo está localizado na região codificada pelo éxon 2 do gene CD19.
  45. 45. Célula hematopoiética geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 44, caracterizada pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica é uma proteína de superfície celular de linhagem específica tipo
    2.
  46. 46. Célula hematopoética geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica tipo 2 é CD33.
  47. 47. Célula hematopoiética geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o epitopo está localizado na região codificada pelo éxon 2 do gene CD33.
  48. 48. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (i) um agente citotóxico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 36; e (ii) uma população de células hematopoiéticas como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 36.
  49. 49. Método para preparar as células hematopoiéticas geneticamente manipuladas, sem um epitopo não essencial em uma proteína de superfície celular de linhagem específica, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (i) fornecer uma população de células hematopoiéticas obtidas a partir de um indivíduo humano, em que a população de células hematopoiéticas ou os seus descendentes expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica;
    (ii) manipular geneticamente a população de células hematopoiéticas para introduzir mutações em um epitopo candidato na
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    8/9 proteína de superfície celular de linhagem específica, e (iii) determinar a funcionalidade das células hematopoiéticas geneticamente manipuladas para verificar se o epitopo candidato é um epitopo não essencial.
  50. 50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas são células-tronco hematopoiéticas.
  51. 51. Método, de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas são de células da medula óssea, células do sangue do cordão, ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs).
  52. 52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, caracterizado pelo fato de que o epitopo candidato na proteína de superfície celular de linhagem específica é um epitopo compreendendo ao menos 3 aminoácidos.
  53. 53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o epitopo consiste em 6 a 10 aminoácidos.
  54. 54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 53, caracterizado pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica é uma proteína de superfície celular de linhagem específica tipo 1 ou tipo 2.
  55. 55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica é CD19 ou CD33.
  56. 56. Método para identificar um epitopo não essencial em uma proteína de superfície celular de linhagem específica, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (i) fornecer uma população de células hematopoiéticas, em que as células hematopoiéticas ou seus descendentes expressam a proteína de superfície celular de linhagem específica;
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    9/9 (ii) manipular geneticamente a população de células hematopoiéticas para introduzir mutações em um epitopo candidato na proteína de superfície celular de linhagem específica;
    (iii) determinar a funcionalidade das células hematopoiéticas geneticamente manipuladas; e (iv) avaliar se o epitopo candidato portador das mutações mantém a função da proteína de linhagem específica como determinado em (iii), em que a manutenção da função da proteína de linhagem específica indica que o epitopo candidato é um epitopo não essencial.
  57. 57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas são células-tronco hematopoiéticas.
  58. 58. Método, de acordo com a reivindicação 56 ou 57, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas são de células da medula óssea, de células do sangue de cordão, ou de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).
  59. 59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 58, caracterizado pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica é uma proteína de superfície celular de linhagem específica do tipo 1 ou tipo 2.
  60. 60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a proteína de superfície celular de linhagem específica é CD33 ou CD19.
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