CN117795082A - 抗EGFRviii抗体、多肽、表达前述多肽的细胞、包含前述细胞的医药组合物、前述细胞的制造方法、及包含编码前述多肽的碱基序列的多核苷酸或载体 - Google Patents

抗EGFRviii抗体、多肽、表达前述多肽的细胞、包含前述细胞的医药组合物、前述细胞的制造方法、及包含编码前述多肽的碱基序列的多核苷酸或载体 Download PDF

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Abstract

选自由(a‑1)～(a‑3)组成的组的、作为具有特定CDR序列的抗体的抗EGFRviii抗体、包含前述抗体的多肽、表达前述多肽的细胞、包含前述细胞的医药组合物、前述细胞的制造方法、及包含编码前述多肽的碱基序列的多核苷酸或载体。

Description

抗EGFRviii抗体、多肽、表达前述多肽的细胞、包含前述细胞 的医药组合物、前述细胞的制造方法、及包含编码前述多肽的 碱基序列的多核苷酸或载体
技术领域
本公开文本涉及抗EGFRviii抗体、多肽、表达前述多肽的细胞、包含前述细胞的医药组合物、前述细胞的制造方法、及包含编码前述多肽的碱基序列的多核苷酸或载体。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor：以下，也称为“CAR”。)是使识别癌细胞的细胞表面抗原的靶抗原结合区、与诱导T细胞的活化的信号传导区融合而成的人工嵌合蛋白质。
例如，通过向外周血T细胞(外周血T淋巴球)导入编码CAR的基因，从而能够大量地制作CAR表达T细胞(以下，也称为“CAR-T细胞”。)。该CAR-T细胞具有肿瘤反应性，能够在不依赖与主要组织相容性基因复合体(MHC)的相互作用的情况下导入对癌细胞的伤害。
对于通过CAR-T细胞的施予进行的癌症免疫疗法，更具体而言是从患者采集T细胞，向该T细胞导入编码CAR的基因并进行扩增，再次移入患者的疗法而言，正在当今全世界进行临床试验，获得了在白血病、淋巴瘤等造血器官恶性肿瘤等中显示出有效性的结果。
在基于CAR-T细胞的癌症免疫疗法中，需要寻找在目标肿瘤中特异性表达的靶抗原。此外，需要与该靶抗原特异性结合、能够作为CAR的靶抗原结合区使用的抗体。对于作为靶抗原结合区使用的抗体而言，在作为CAR的一部分表达时表达率需要充分高，表达CAR的细胞需要显示出高的抗肿瘤效果。与抗原的亲和性高的抗体未必可用于CAR，能够作为靶抗原结合区使用的抗体的探索并不容易。
另一方面，认为CAR-T细胞疗法难以对实体肿瘤获得效果。作为其主要原因，认为有如下原因等：CAR-T细胞在生物体内的存活率低；向肿瘤局部的聚集低；肿瘤细胞所分泌的免疫抑制因子等对活性产生抑制。
作为解决这样的问题的方法，报道了将编码CAR的核酸、以及编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸一同导入T细胞的方法。例如，日本专利第6761113号公报公开了以实体肿瘤抗原作为靶抗原的CAR、及对实体肿瘤有效的CAR-T细胞。
发明内容
发明所要解决的课题
日本专利第6761113号公报公开了对作为靶抗原的神经节苷脂GM2显示有效性的CAR-T细胞，但要求开发以实体肿瘤抗原中的神经节苷脂GM2以外的抗原作为靶抗原的CAR、以及对实体肿瘤进一步有效的CAR-T细胞及能够用于其的肽。
本公开文本涉及的一实施方式所要解决的课题在于提供与EGFRviii特异性地结合、且也能够作为嵌合抗原受体的靶抗原结合区使用的新型抗体。
本公开文本涉及的另一实施方式所要解决的课题在于提供包含上述新型抗体的多肽、表达该多肽的细胞、包含编码该多肽的碱基序列的多核苷酸或载体、以及包含该细胞的医药组合物。
用于解决课题的手段
本公开文本的一实施方式包含以下的方式。
<1>抗EGFRviii抗体，其为选自由下述(a-1)～(a-3)组成的组中的抗体或其抗原结合片段：
(a-1)包含含有由序列号1或4所记载的氨基酸序列构成的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3的重链可变区、和
含有由序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列构成的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3的轻链可变区、并且
具有与EGFRviii的结合能力的抗体或其抗原结合片段；
(a-2)包含由序列号1或4所记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成的重链可变区、和
由序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成的轻链可变区、并且
具有与EGFRviii的结合能力的抗体或其抗原结合片段；及
(a-3)包含由与序列号1或4所记载的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的重链可变区、和
由与序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的轻链可变区、并且
具有与EGFRviii的结合能力的抗体或其抗原结合片段。
<2>如<1>所述的抗EGFRviii抗体，其中，前述重链可变区在序列号1或4所记载的氨基酸序列中在21位具有T，在24位具有F，在54位具有F，在59位具有K，在67位具有S，在73位具有K，在77位具有T或K，及在83位具有K或T。
<3>如<1>或<2>所述的抗EGFRviii抗体，其中，前述轻链可变区在序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列中在4位具有M，在16位具有E或G，在27位具有Q，在35位具有K，在55位具有S，在58位具有N，在74位具有R，在79位具有K，在81位具有S，在87位具有D，在99位具有V。
<4>如<1>～<3>中任一项所述的抗EGFRviii抗体，其中，
前述重链可变区含有序列号1所记载的氨基酸序列，并且前述轻链可变区含有序列号2所记载的氨基酸序列；
前述重链可变区含有序列号1所记载的氨基酸序列，并且前述轻链可变区含有序列号3所记载的氨基酸序列；
或者，
前述重链可变区含有序列号4所记载的氨基酸序列，并且前述轻链可变区含有序列号5或序列号6所记载的氨基酸序列。
<5>如<1>～<4>中任一项所述的抗EGFRviii抗体，其中，前述抗体为单链抗体。
<6>如<5>所述的抗EGFRviii抗体，其中，前述单链抗体从N末端起依次包含前述轻链可变区、将前述重链可变区与前述轻链可变区连结的肽接头、和前述重链可变区。
<7>如<5>所述的抗EGFRviii抗体，其中，前述单链抗体为选自由下述(I)～(III)组成的组中的多肽：
(I)包含选自由序列号12～18及38组成的组中的氨基酸序列的多肽；
(II)由与选自由序列号12～18及38组成的组中的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成、并且具有与EGFRviii的结合能力的多肽；以及，
(III)由选自由序列号12～18及38组成的组中的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、并且具有与EGFRviii的结合能力的多肽。
<8>多肽，其包含靶抗原结合区、跨膜区、和信号传导区，
前述靶抗原结合区包含<1>～<7>中任一项所述的抗EGFRviii抗体。
<9>如<8>所述的多肽，其为嵌合抗原受体。
<10>细胞，其表达<8>或<9>所述的多肽。
<11>如<10>所述的细胞，其还表达IL-7及CCL19中的至少一者，优选还表达外源IL-7及外源CCL19中的至少一者。
<12>如<10>或<11>所述的细胞，其中，前述细胞为免疫细胞。
<13>如<12>所述的细胞，其中，前述免疫细胞为T细胞。
<14>多核苷酸，其包含编码<8>或<9>所述的多肽的碱基序列。
<15>如<14>所述的多核苷酸，其还包含编码IL-7的碱基序列及编码CCL19的碱基序列中的至少一者，优选以外源核酸的形式还包含编码IL-7的碱基序列及编码CCL19的碱基序列中的至少一者。
<16>载体，其包含<14>或<15>所述的多核苷酸。
<17>如<16>所述的载体，其还包含编码IL-7的碱基序列及编码CCL19的碱基序列中的至少一者。
<18>表达多肽的细胞的制造方法，其包括将<14>或<15>所述的多核苷酸导入细胞中。
<19>表达多肽的细胞的制造方法，其包括将<16>或<17>所述的载体导入细胞中。
<20>医药组合物，其包含<10>～<13>中任一项所述的细胞。
<21>如<20>所述的医药组合物，其为用于治疗或预防肿瘤的医药组合物。
发明的效果
根据本公开文本的一实施方式，能够提供与EGFRviii特异性地结合、且也能够作为嵌合抗原受体的靶抗原结合区使用的新型抗体。
根据本公开文本的另一实施方式，能够提供包含上述新型抗体的多肽、表达该多肽的细胞、包含编码该多肽的碱基序列的多核苷酸或载体、及包含该细胞的医药品组合物。
附图说明
[图1A]图1A为示出对与EGFRviii结合的抗体的氨基酸序列进行分析而得的结果的一例的图。
[图1B]图1B为示出对与EGFRviii结合的抗体的氨基酸序列进行分析而得的结果的一例的图。
[图2A]图2A为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图2B]图2B为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图2C]图2C为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图2D]图2D为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图2E]图2E为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图2F]图2F为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图2G]图2G为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图2H]图2H为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图2I]图2I为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图3A]图3A为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图3B]图3B为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图3C]图3C为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图3D]图3D为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图4A]图4A为示出对PRIME EGFRviii CAR-T细胞的细胞毒活性进行测定而得的结果的一例的图。
[图4B]图4B为示出对PRIME EGFRviii CAR-T细胞的细胞毒活性进行测定而得的结果的一例的图。
[图5A]图5A为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图5B]图5B为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图5C]图5C为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图5D]图5D为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图5E]图5E为示出利用流式细胞术测定抗EGFRviiiCAR的表达水平而得的结果的一例的图。
[图6A]图6A为示出对PRIME EGFRviii CAR-T细胞的细胞毒活性进行测定而得的结果的一例的图。
[图6B]图6B为示出对PRIME EGFRviii CAR-T细胞的细胞毒活性进行测定而得的结果的一例的图。
[图7]图7为示出对PRIME EGFRviii CAR-T细胞、与EGFRviii表达细胞(胶质母细胞瘤细胞U87MGviii 4.12细胞)或EGFRviii非表达细胞(U87MG细胞)之比(E：T比)设为1：3时的培养上清液的IFNγ浓度进行测定而得的结果的一例的图。
[图8A]图8A为示出利用流式细胞术对使用了健康人供者的样品的情况下的抗EGFRviiiCAR的表达水平进行测定而得的结果的一例的图。
[图8B]图8B为示出利用流式细胞术对使用了健康人供者的样品的情况下的抗EGFRviiiCAR的表达水平进行测定而得的结果的一例的图。
[图8C]图8C为示出利用流式细胞术对使用了健康人供者的样品的情况下的抗EGFRviiiCAR的表达水平进行测定而得的结果的一例的图。
[图8D]图8D为示出利用流式细胞术对使用了健康人供者的样品的情况下的抗EGFRviiiCAR的表达水平进行测定而得的结果的一例的图。
[图9A]图9A为示出利用ATP分析、以EGFRviii非表达肿瘤细胞作为靶标来测定PRIME EGFRviii CAR-T细胞及活化T细胞的细胞毒活性的结果的一例的图。
[图9B]图9B为示出利用ATP分析、以EGFRviii表达肿瘤细胞作为靶标来测定PRIMEEGFRviii CAR-T细胞及活化T细胞的细胞毒活性的结果的一例的图。
[图9C]图9C为示出利用ATP分析、以EGFRviii非表达肿瘤细胞作为靶标来测定PRIME EGFRviii CAR-T细胞及活化T细胞的细胞毒活性的结果的一例的图。
[图9D]图9D为示出利用ATP分析、以EGFRviii表达肿瘤细胞作为靶标来测定PRIMEEGFRviii CAR-T细胞及活化T细胞的细胞毒活性的结果的一例的图。
[图10]图10为示出利用PE标记的抗人EGFRviii抗体对肿瘤细胞进行染色、并进行流式细胞术分析而得的结果的一例的图。
[图11]图11为示出移植了肿瘤细胞的肿瘤模型小鼠的背部的照片的一例的图。
[图12A]图12A为示出肿瘤模型小鼠的肿瘤体积变化的结果的一例的曲线图。
[图12B]图12B为示出肿瘤模型小鼠的肿瘤体积变化的结果的一例的曲线图。
[图12C]图12C为示出肿瘤模型小鼠的肿瘤体积变化的结果的一例的曲线图。
具体实施方式
以下，对本发明的内容详细地进行说明。以下记载的技术特征的说明有时基于本发明的代表性实施方式进行，但本发明不限于这样的实施方式。
需要说明的是，本说明书中，表示数值范围的“～”以包含记载于其前后的数值作为下限值及上限值的含义使用。
在本公开文本中阶段性地记载的数值范围中，以一个数值范围记载的上限值或下限值可以替换为其他阶段性记载的数值范围的上限值或下限值。另外，在本公开文本中记载的数值范围中，该数值范围的上限值或下限值可以替换为实施例所示的值。
另外，本公开文本中，“质量％”与“重量％”与“Wt％”含义相同，“质量份”与“重量份”含义相同。
此外，本公开文本中，2个以上的优选方式的组合是更优选的方式。
本公开文本提供的多肽、多核苷酸、载体、及细胞可以为分离的状态。即，本说明书中记载的多肽、多核苷酸、载体、及细胞可以为分离的多肽、分离的多核苷酸、分离的载体、及分离的细胞。
(抗EGFRviii抗体)
本公开文本涉及的抗EGFRviii抗体为选自由下述(a-1)～(a-3)组成的组中的抗体或抗原结合片段。
本公开文本涉及的抗EGFRviii抗体为包含由下述的特定氨基酸序列构成的重链可变区(以下，有时也称为“VH区域”。)的CDR1、CDR2及CDR3、和由下述的特定氨基酸序列构成的轻链可变区(以下，有时也称为“VL区域”。)的CDR1、CDR2及CDR3、并且具有与EGFRviii的结合能力的抗体或抗原结合片段，由此能够与EGFRviii特异性结合、另外也能够作为嵌合抗原受体(CAR)的靶抗原结合区使用。
作为抗EGFRviii抗体，可举出单克隆抗体或多克隆抗体，从对EGFRviii的特异性的观点考虑，优选为单克隆抗体。
<抗体或抗原结合片段>
本公开文本涉及的抗EGFRviii抗体为选自由下述(a-1)～(a-3)组成的组中的抗体或抗原结合片段。
作为上述抗体或抗原结合片段，只要具有对EGFRviii的结合能力即可，没有特别限制，例如，可举出后述的单链抗体(scFv)、Fab、diabody、ScDb、scFv2-Fc、IgG-scFv、scFv-HSA-scFv、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、scFv-Fc等低分子抗体。
〔(a-1)～(a-3)〕
(a-1)包含含有由序列号1或4所记载的氨基酸序列构成的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3的重链可变区、和
含有由序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列构成的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3的轻链可变区、并且
具有与EGFRviii的结合能力的抗体或其抗原结合片段。
(a-2)包含由序列号1或4所记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成的重链可变区、和
由序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成的轻链可变区、并且
具有与EGFRviii的结合能力的抗体或其抗原结合片段。
(a-3)包含由与序列号1或4所记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的重链可变区、和
由与序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的轻链可变区、并且
具有与EGFRviii的结合能力的抗体或其抗原结合片段。
(a-1)所规定的重链可变区只要包含由序列号1或4所记载的氨基酸序列构成的重链可变区中的CDR1的氨基酸序列、CDR2的氨基酸序列、及CDR3的氨基酸序列，则在这些以外的部分中，可以与序列号1或4所记载的氨基酸序列不同。即，重链可变区中的除了CDR1区域、CDR2区域、及CDR3区域以外的部分中，可以与由序列号1或4所记载的氨基酸序列构成的重链可变区不同。(a-1)所规定的轻链可变区只要包含由序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列构成的轻链可变区中的CDR1的氨基酸序列、CDR2的氨基酸序列、及CDR3的氨基酸序列，则在这些以外的部分中，可以与序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列不同。即，轻链可变区中的除了CDR1区域、CDR2区域、及CDR3区域以外的部分中，可以与由序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列构成的轻链可变区不同。(a-2)及(a-3)中的序列号1或4所记载的氨基酸序列、以及序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列中的突变的位置可以为CDR1、CDR2及CDR3以外的区域。
上述CDR1、CDR2及CDR3的“CDR”推定为抗体分子的可变区域中与抗原直接接触的区域，是指包含互补决定区(Complementarity Determining Region：CDR)的区域。
需要说明的是，CDR可以由作为CDR的定义已知的任意定义确定，例如，可以使用基于Kabat、Chothia、AbM、contact、IMGT、Aho、Mrtin(Enhanced Chothia)等的定义。本公开文本涉及的抗EGFRviii抗体的CDR的氨基酸序列可以基于任意定义。
-VH区域的基于Kabat定义的CDR1～3的氨基酸序列-
作为由序列号1或4所记载的氨基酸序列构成的VH区域的CDR1～3的一例，将基于Kabat定义的CDR1～3的氨基酸序列分别示于序列号31～33。
-VL区域的基于Kabat定义的CDR1～3的氨基酸序列-
作为由序列号2所记载的氨基酸序列构成的VL区域的CDR1的一例，将基于Kabat定义的CDR1的氨基酸序列示于序列号37。
作为由序列号3、5、或6所记载的氨基酸序列构成的VL区域的CDR1的一例，将基于Kabat定义的CDR1的氨基酸序列示于序列号34。
另外，作为由序列号2、3、5、或6所记载的氨基酸序列构成的VL区域的CDR2及CDR3的一例，将基于Kabat定义的CDR2及CDR3的氨基酸序列分别示于序列号35及36。
(a-1)～(a-3)中，作为包含重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3的重链可变区，优选为序列号4。
(a-1)～(a-3)中，作为包含轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3的轻链可变区，优选为序列号5或6。
上述(a-2)中，“多个”例如能够为2个～30个，优选为2～20个，更优选为2个～10个，进一步优选为2个～5个，例如，可以设为2个、3个、4个、或5个。另外，“突变”可以为缺失、取代、附加、及插入中的任意，也可以为它们的组合。
另外，突变的位置优选为CDR1～CDR3以外的区域(即，框架区)。
作为人抗体的框架序列，例如，可以选自在GenBank等已知的序列数据库中登录的人抗体的氨基酸序列的框架序列、从来源于人抗体的各子群的公共序列(Human MostHomologous Consensus Sequence；Kabat,E.A.等人的Sequences of Proteins ofImmunological Interest,USDept.Health and HumanServices,1991)中选择的氨基酸序列等。
上述(a-3)中，序列同一性只要为70％以上即可，没有特别限定，可以为80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上。
需要说明的是，氨基酸序列彼此的序列同一性(即，同源性)如下求出：将2个氨基酸序列以对应的氨基酸一致最多的方式，在相当于插入及缺失的部分加入空位(gap)地并排设置，所得到的比对中一致的氨基酸相对于除空位以外的氨基酸序列整体的比例。
氨基酸序列彼此的序列同一性可以使用本技术领域中已知的各种同源性检索软件求出。例如，氨基酸序列的序列同一性的值可以通过以由已知的同源性检索软件BLASTP得到的比对为基础的计算而得到。
从能够与EGFRviii特异性地结合、且也能够作为嵌合抗原受体CAR的靶抗原结合区使用的观点考虑，就本公开文本涉及的抗EGFRviii抗体而言，前述重链可变区优选在序列号1或4所记载的氨基酸序列中在21位具有T，在24位具有F，在54位具有F，在59位具有K，在67位具有S，在73位具有K，在77位具有T或K，及在83位具有K或T。
需要说明的是，序列号1或4所记载的氨基酸序列中在21位具有T是指：与序列号1或4所记载的氨基酸序列比对时，从序列号1或4所记载的氨基酸序列的N末端侧起计数，与第21位对应的位置的氨基酸为T。
从能够与EGFRviii特异性地结合、且也能够作为嵌合抗原受体的靶抗原结合区使用的观点考虑，就本公开文本涉及的抗EGFRviii抗体而言，前述轻链可变区优选在序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列中在4位具有M，在16位具有E或G，在27位具有Q，在35位具有K，在55位具有S，在58位具有N，在74位具有R，在79位具有K，在81位具有S，在87位具有D，在99位具有V。
需要说明的是，本说明书中，有时用1个字母或3个字母表示氨基酸或氨基酸残基。
〔SG序列〕
就上述抗EGFRviii抗体而言，从维持对EGFRviii的结合性能的方面考虑，优选氨基酸序列中的Asn-Gly(NG)序列转换为Ser-Gly(SG)序列，更优选轻链可变区中的NG序列转换为SG序列，进一步优选轻链可变区中的CDR1的NG序列转换为SG序列。
作为将NG序列转换为SG序列而得的氨基酸序列，例如，可举出序列号3、5或6所记载的氨基酸序列。
〔人抗体〕
抗EGFRviii抗体所来源的生物没有特别限定，可以为来源于人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子及猴等动物的抗体，优选为人抗体。
另外，本公开文本涉及的抗EGFRviii抗体不仅包含单克隆抗体，也包含嵌合抗体、人源化抗体及双特异性抗体(bispecific抗体)等人为改造的抗体。
从临床上的有用性的观点考虑，抗EGFRviii抗体优选为人源化抗体。作为人源化抗体的制作方法，没有特别限制，可以利用已知的方法来制作。例如，可举出将使用基因工程在小鼠中制作的抗体的抗原结合部位移植至来源于人的抗体分子中来制作的方法等。
作为人源化抗体(人抗EGFRviii抗体)，例如，可举出具有序列号4所记载的氨基酸序列作为重链可变(VH)区域、具有序列号5或6所记载的氨基酸序列作为轻链可变(VL)区域的抗体等。
作为本公开文本涉及的抗EGFRviii抗体的制作方法，没有特别限制，可以使用已知的抗体制作方法。例如，可以使用下述方法：将具有编码抗EGFRviii抗体的序列的核酸插入表达载体中，将该表达载体导入宿主细胞中并使其表达。
<单链抗体(scFv)>
本公开文本涉及的抗EGFRviii抗体可以为单链抗体(scFv：single chainvariable fragment)。
scFv是用肽接头将抗体的重链可变区(VH区域)与轻链可变区(VL区域)连结而得的多肽。scFv通常用作后述的嵌合抗原受体(CAR)的靶抗原结合区。
scFv中，用肽接头将VH区域与VL区域结合的顺序没有特别限制，可以是从N末端侧起依次为VH区域、肽接头、及VL区域，也可以是从N末端侧起依次为VL区域、肽接头、及VH区域。
本公开文本的一实施方式中，scFv优选从N末端起依次包含上述抗体的轻链可变区、将重链可变区与前述轻链可变区连结的肽接头、和重链可变区。
scFv中，将VH区域与VL区域连结的肽接头没有特别限定，使用scFv中通常使用的肽接头即可。
作为肽接头的例子，例如，可举出接头15(序列号41)、接头25(序列号42)等，但不限于这些。
抗EGFRviii抗体为scFv的情况下，上述scFv可以为选自由下述(I)～(III)组成的组中的多肽。
(I)包含选自由序列号12～18及38组成的组中的氨基酸序列的多肽；
(II)由与选自由序列号12～18及38组成的组中的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性(优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、更加优选为97％以上的同一性)的氨基酸序列构成、并且具有与EGFRviii的结合能力的多肽；以及、
(III)由选自序列号12～18及38组成的组中的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、并且具有与EGFRviii的结合能力的多肽。
上述(II)中的序列同一性与上述(a-3)中的序列同一性含义相同，优选方式也同样。
上述(III)中的“多个”与上述(a-2)中的“多个”含义相同，优选方式也同样。
作为scFv，优选为
(I)包含序列号13、15或17的氨基酸序列的多肽；
(II)由与序列号13、15或17的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性(优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、更加优选为97％以上的同一性)的氨基酸序列构成、并且具有与EGFRviii的结合能力的多肽；以及、
(III)由序列号13、15或17的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、并且具有与EGFRviii的结合能力的多肽，
更优选为
(I)包含序列号15或17的氨基酸序列的多肽；
(II)由与序列号15或17的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性(优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、更加优选为97％以上的同一性)的氨基酸序列构成、并且具有与EGFRviii的结合能力的多肽；以及、
(III)由序列号15或17的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、并且具有与EGFRviii的结合能力的多肽。
(多肽)
本公开文本涉及的多肽优选包含靶抗原结合区、跨膜区、和信号传导区，靶抗原结合区为上述抗EGFRviii抗体。
本公开文本的一个方式中，本公开文本涉及的多肽优选为嵌合抗原受体(CAR)。
本说明书中，所谓“嵌合抗原受体(CAR)”，是指使来源于特异性识别抗原的抗体的部分、与诱导免疫细胞的活化的信号传导区融合而成的人工嵌合蛋白质。
作为嵌合抗原受体，优选为包含靶抗原结合区、跨膜区、和信号传导区的、嵌合蛋白质。作为靶抗原结合区，优选包含本公开文本涉及的抗EGFRviii抗体。
本公开文本涉及的多肽为CAR、并且多肽中包含的靶抗原结合区为抗EGFRviii抗体的情况下，有时称为抗EGFRviiiCAR。
需要说明的是，嵌合蛋白质是指包含来源于2种以上异种蛋白质的序列的蛋白质。
CAR不限于仅包含上述3个区域，也包括还包含其他区域的CAR。
以下，对本公开文本涉及的多肽所包含的各区域的详细内容进行说明。
<靶抗原结合区>
所谓“靶抗原结合区”，是指本公开文本涉及的多肽中的与靶抗原结合的区域，并且是位于细胞外的区域。需要说明的是，关于细胞的详细内容，在后文陈述。
例如，在导入有嵌合抗原受体(CAR)基因的T细胞(以下，也称为“CAR-T细胞”。)中表达的CAR转移至细胞膜，成为位于细胞外的靶抗原结合区与位于细胞内的T细胞活化信号传导区介由贯穿细胞膜的跨膜区而连结的状态。当CAR-T细胞与具有靶抗原作为膜抗原的细胞接触时，靶抗原结合区结合该靶抗原，由此T细胞活化信号从T细胞活化信号传导区传导至T细胞内，T细胞被活化。在使本公开文本涉及的多肽在T细胞以外的细胞中表达的情况下，也可利用同样的方法或遵照其的方法将该细胞活化。
〔EGFRviii〕
本公开文本涉及的多肽中，靶抗原结合区所结合的靶抗原为EGFRviii。
EGFRviii为表皮生长因子受体(EGFR)的突变体之一，认为在正常细胞中不表达。
已知EGFRviii在多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、间变性星形细胞瘤、髓母细胞瘤、乳癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、大肠癌、头颈部癌、中枢神经系统癌、皮肤癌、及它们的转移癌等中表达，是癌治疗的靶标志物之一。
本公开文本涉及的多肽的靶抗原结合区包含本公开文本涉及的抗EGFRviii抗体。因此，前述靶抗原结合区包含在抗EGFRviii抗体的说明时陈述的CDR。
需要说明的是，CDR可以由作为CDR的定义已知的任意定义确定，例如，可以使用基于Kabat、Chothia、AbM、contact、IMGT、Aho、Mrtin(Enhanced Chothia)等的定义。
作为靶抗原结合区，包含上述的抗EGFRviii抗体的单链抗体(scFv)的多肽为靶抗原结合区的优选例。在具有与2个不同的抗原结合的靶抗原结合区的双特异性抗体的情况下，可以将其中的一个靶抗原结合区作为上述的抗EGFRviii抗体。
单链抗体(scFv)与上述抗EGFRviii抗体中的scFv含义相同，优选方式也同样。
<跨膜区>
本公开文本涉及的多肽优选包含跨膜区。
本说明书中，所谓“跨膜区”，是指本公开文本涉及的多肽在细胞中表达时，贯穿细胞膜地存在，将细胞外区域与细胞内区域连结的区域。
跨膜区只要是具有贯穿细胞膜的功能的多肽即可，没有特别限定。跨膜区可以来源于天然蛋白质，也可以人为设计。
来源于天然蛋白质的跨膜区可以从任意的膜结合蛋白质或跨膜蛋白质取得。跨膜区优选以与靶抗原对靶抗原结合区的结合对应地，向T细胞活化信号传导区传导活化信号。
作为跨膜区，没有特别限制，例如，可举出T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR等的跨膜区。
这些之中，优选为CD8的跨膜区。
跨膜区的蛋白质所来源的生物没有特别限定，可以为人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子及猴等，优选为人。这些蛋白质的氨基酸序列可以从GenBank等已知的序列数据库获得。例如，作为人CD8的氨基酸序列的例子，可举出作为GenBank号：NM＿001768.6登录的氨基酸序列等。作为跨膜区的氨基酸序列，例如，可举出序列号19及20所记载的氨基酸序列。
另外，跨膜区可以为上述这样的来源于天然蛋白质的跨膜区的突变体。
作为来源于天然蛋白质的跨膜区的突变体的例子，例如，可举出以下这样的多肽。
(2a)由与来源于天然蛋白质的跨膜区的氨基酸序列(例如，序列号19及20)具有70％以上的序列同一性(同源性)的氨基酸序列构成、并且具有跨膜能力的多肽。
(2b)由来源于天然蛋白质的跨膜区的氨基酸序列(例如，序列号19及20)中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、并且具有跨膜能力的多肽。
上述跨膜区的氨基酸序列(2a)中，序列同一性只要为70％以上即可，没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
上述跨膜区的氨基酸序列(2b)中，“多个”例如能够为2～10个，优选为2～5个，更优选为2～4个，进一步优选为2或3个。另外，“突变”可以为缺失、取代、附加、及插入中的任意，也可以为它们的组合。
<信号传导区>
本公开文本涉及的多肽优选包含信号传导区。作为信号传导区，只要是在靶抗原结合部位(即，抗EGFRviii抗体)与作为靶抗原的EGFRviii结合时，能够在表达本公开文本涉及的多肽的细胞内进行信号传导的区域即可。需要说明的是，关于细胞的详细内容，在后文陈述。
作为一例，在使用T细胞作为细胞的情况下，作为信号传导区，优选为T细胞活化信号传导区。
本说明书中，所谓“信号传导区”，是指本公开文本涉及的多肽在细胞中表达时，位于细胞内、且向细胞内传导信号的区域。
本说明书中，所谓“信号传导区”，是指本公开文本涉及的多肽在细胞中表达时，位于细胞内、且向细胞内传导该细胞的活化信号的区域。
在T细胞中，当MHC((Major Histocompatibility Complex；主要组织相容性复合体)·肽复合体与T细胞受体(T cell Receptor：TCR)结合时，介由TCR·CD3复合体向细胞内传导T细胞活化信号，引发各种磷酸化信号(一次信号传导)。在CAR-T细胞中，通过使抗原与靶抗原结合部位结合，从而能够在不依赖与MHC的相互作用的情况下向T细胞传导一次信号。
另外，已知在T细胞的细胞表面上表达的共刺激分子(例如，后述的CD28、4-1BB等)通过与在抗原呈递细胞的细胞表面上表达的针对各共刺激分子呈特异性的配体结合，从而向细胞内传导共刺激信号，辅助T细胞的活化(二次信号传导)。在CAR-T细胞中，通过将这样的共刺激分子并入CAR，从而当靶抗原结合部位与抗原结合时，能够向T细胞传导二次信号。
本说明书中，“T细胞活化信号传导”包含前述一次信号传导及二次信号传导两者。另外，“T细胞活化信号传导区”是指参与前述一次信号传导及二次信号传导中的至少一者的蛋白质的、参与该信号传导的细胞内区域。
信号传导区只要是参与细胞的活化信号传导的蛋白质的细胞活化信号传导区即可，没有特别限定。
例如，已知免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-basedactivation motif：ITAM)参与一次信号传导。因此，作为信号传导区的例子，可举出具有ITAM的蛋白质的细胞活化信号传导区。
作为具有ITAM的蛋白质的例子，例如，可举出CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d等。含有ITAM的信号传导区为本公开文本涉及的多肽中使用的细胞活化信号传导区的优选例。作为更优选例，可举出CD3ζ等的细胞活化信号传导区。
另外，如上所述，共刺激分子参与二次信号传导。因此，作为信号传导区的例子，也可举出共刺激分子的信号传导区。
作为共刺激分子，例如，可举出CD2、CD4、CD5、CD8、CD27、CD28、OXO40(CD134)、4-1BB(CD137)、ICOS，CD154、HVEM(Herpesvirus entry mediator)、GITR、FcReceptor-associatedγchain等。这些蛋白质的细胞活化信号传导区也是本公开文本涉及的多肽中使用的细胞活化信号传导区的优选例。
作为更优选例，可举出CD28、4-1BB等细胞活化信号传导区。
上述信号传导区的蛋白质所来源的生物没有特别限定，可以为人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子及猴等，优选为人。需要说明的是，这些蛋白质的氨基酸序列可以从GenBank等已知的序列数据库获得。
例如，作为人CD3ζ的氨基酸序列的例子，可举出作为GenBank号：NM＿000734.3登录的氨基酸序列等，作为信号传导区的氨基酸序列，可举出序列号25所记载的氨基酸序列。
另外，作为人CD28的氨基酸序列的例子，可举出作为GenBank号：NM＿006139.2登录的氨基酸序列等，作为信号传导区的氨基酸序列，可举出序列号26所记载的氨基酸序列。另外，作为人4-1BB的氨基酸序列的例子，可举出作为GenBank号：NM＿001561.5登录的氨基酸序列等，作为信号传导区的氨基酸序列，可举出序列号27所记载的氨基酸序列。
另外，信号传导区可以为上述这样的来源于天然蛋白质的信号传导区的突变体。作为来源于天然蛋白质的活化信号传导区的突变体的例子，例如，可举出以下这样的多肽。
(3a)由与来源于天然蛋白质的信号传导区的氨基酸序列(例如，序列号25～27)具有70％以上的序列同一性(同源性)的氨基酸序列构成、并且具有细胞活化信号传导能力的多肽。
(3b)由来源于天然蛋白质的信号传导区的氨基酸序列(例如，序列号25～27)中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、并且具有细胞活化信号传导能力的多肽。
上述信号传导区的氨基酸序列(3a)中，序列同一性只要为70％以上即可，没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
上述的氨基酸序列(3b)中，就“多个”而言，例如，在使用参与一次信号传导的蛋白质的情况下，能够为2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，进一步优选为2～5个。另外，例如，在使用共刺激分子的情况下，“多个”能够为2～15个，优选为2～10个，更优选为2～5个，进一步优选为2或3个。
另外，“突变”可以为缺失、取代、附加、及插入中的任意，也可以为它们的组合。
本公开文本涉及的多肽所包含的信号传导区的数目不限于1个，也可以包含多种信号传导区。该情况下，多种信号传导区可以为相同的信号传导区，也可以为不同的信号传导区。
作为本公开文本涉及的多肽，优选包含2个以上的信号传导区。该情况下，本公开文本涉及的多肽所包含的信号传导区优选为参与一次信号传导的信号传导区与参与二次信号传导的信号传导区的组合。
作为具体例，可举出CD3ζ与CD28的细胞活化信号传导区的组合、CD3ζ与4-1BB的细胞活化信号传导区的组合、CD3ζ、CD28与4-1BB的细胞活化信号传导区的组合等。
需要说明的是，将参与一次信号传导的信号传导区与参与二次信号传导的信号传导区组合的情况下，优选将参与一次信号传导的信号传导区配置在C末端侧。
上述的具体例中，优选将CD3ζ的T细胞活化信号传导区配置在比CD28或4-1BB的T细胞活化信号传导区更靠C末端侧。在同时使用CD28和4-1BB的情况下，可以为任意的配置顺序，可举出从N末端侧起以CD28、4-1BB的顺序进行配置的例子。
在仅使用一个T细胞活化信号传导区的情况下，优选使用参与一次信号传导的T细胞活化信号传导区，更优选使用CD3ζ的T细胞活化信号传导区。
〔其他区域〕
本公开文本涉及的多肽可以包含除了上述跨膜区、及信号传导区以外的区域(以下，也称为“其他区域”。)。作为其他区域的例子，可举出细胞外铰链区、细胞质区域、间隔区、信号肽等。
-细胞外铰链区-
本公开文本涉及的多肽可以包含细胞外铰链区。
本说明书中，“细胞外铰链区”是指将细胞外的靶抗原结合区与跨膜区连结的区域。细胞外铰链区有时也被认为是跨膜区的一部分。
细胞外铰链区只要能够将靶抗原结合区与跨膜区连结即可，没有特别限定。作为构成细胞外铰链区的蛋白质，可以来源于天然蛋白质，也可以人为地设计。
细胞外铰链区可以由例如1个～100个左右的氨基酸、优选10个～70个左右的氨基酸构成。细胞外铰链区优选不妨碍靶抗原结合区的EGFRviii结合能力、并且不妨碍基于信号传导区的信号传导。
作为细胞外铰链区，例如，可举出CD8、CD28、CD4等的细胞外铰链区。另外，作为细胞外铰链区，可以使用免疫球蛋白(例如，IgG4等)的铰链区。作为细胞外铰链区，优选CD8的细胞外铰链区。
上述细胞外铰链区的蛋白质所来源的生物没有特别限定，可以为人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子及猴等，优选为人。需要说明的是，构成这些细胞外铰链区的蛋白质的氨基酸序列可以从GenBank等已知的序列数据库获得。作为人CD8的氨基酸序列的例子，可举出上述的氨基酸序列。
作为细胞外铰链区的氨基酸序列，例如，可举出序列号21及22所记载的氨基酸序列。
另外，细胞外铰链区可以为上述这样的来源于天然蛋白质的细胞外铰链区的突变体。作为来源于天然蛋白质的细胞外铰链区的突变体的例子，例如，可举出以下这样的多肽。
(4a)由与来源于天然蛋白质的细胞外铰链区的氨基酸序列(例如，序列号21及22)具有70％以上的序列同一性(同源性)的氨基酸序列构成的多肽。
(4b)由来源于天然蛋白质的细胞外铰链区的氨基酸序列(例如，序列号21及22)中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成的多肽。
上述细胞外铰链区的氨基酸序列(4a)中，序列同一性只要为70％以上即可，没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
上述细胞外铰链区的氨基酸序列(4b)中，“多个”例如能够为2～20个，优选为2～15个，更优选为2～10个，进一步优选为2～5个。另外，“突变”可以为缺失、取代、附加、及插入中的任意，也可以为它们的组合。
-间隔区-
就本公开文本涉及的多肽而言，上述的靶抗原结合区、跨膜区、信号传导区等各区域可以介由间隔区而连结。
本说明书中，“间隔区”表示将蛋白质的2个功能区域(结构域)连结的短肽。间隔区没有特别限定，使用嵌合蛋白质的制作中通常使用的即可。
作为间隔区的长度，可举出1～100个氨基酸、优选为10～50个氨基酸。作为间隔区的例子，可举出甘氨酸-丝氨酸连续序列等。
-信号肽-
本公开文本涉及的多肽可以包含信号肽。
本说明书中，“信号肽”表示指示膜蛋白质、分泌蛋白质的局部化(localization)的肽。信号肽通常是由存在于膜蛋白质的N末端的5个～60个左右的氨基酸构成的肽，在局部化完成的成熟蛋白质中，信号肽被除去。
本公开文本涉及的多肽所包含的信号肽优选为指示向细胞膜的局部化的信号肽，优选为膜蛋白质的信号肽。
作为信号肽的例子，可举出T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链等的信号肽。
作为信号肽的氨基酸序列的具体例，可举出序列号23及24所记载的氨基酸序列。
在本公开文本涉及的多肽中，上述的各区域优选从N末端起按照靶抗原结合区、跨膜区、及信号传导区的顺序配置。这些各区域可以彼此直接连结，也可以介由其他区域、间隔序列等而连结。
本公开文本涉及的多肽包含细胞外铰链区的情况下，细胞外铰链区优选配置于靶抗原结合区与跨膜区之间。
另外，本公开文本涉及的多肽包含信号肽的情况下，信号肽优选配置于多肽的N末端。
作为本公开文本涉及的多肽的具体例，可举出下述多肽，其包含：含有抗EGFRviii抗体的scFv的靶抗原结合区；CD8的跨膜区(或其突变体)；CD28的细胞活化信号传导区(或其突变体)；4-1BB的T细胞活化信号传导区(或其突变体)；及CD3ζ的细胞活化信号传导区(或其突变体)。
作为另一优选例，可举出下述CAR，其包含：含有抗EGFRviii的scFv的靶抗原结合区；CD8的细胞外铰链区(或其突变体)；CD8的跨膜区(或其突变体)；CD28的细胞活化信号传导区(或其突变体)；4-1BB的细胞活化信号传导区(或其突变体)；及CD3ζ的T细胞活化信号传导区(或其突变体)。
作为另一优选例，可举出下述CAR，其包含：含有抗EGFRviii的scFv的靶抗原结合区；CD8的细胞外铰链区(或其突变体)；CD8的跨膜区(或其突变体)；4-1BB的细胞活化信号传导区(或其突变体)；及CD3ζ的细胞活化信号传导区(或其突变体)。
作为这样的本公开文本涉及的多肽(优选为CAR)，例如，可举出下述CAR，其包含含有选自由序列号12～18及38组成的组中的氨基酸序列的scFv。
(细胞)
本公开文本涉及的细胞优选为表达本公开文本涉及的多肽的细胞。
本公开文本涉及的细胞优选表达上述多肽(以下，方便起见，也称为“抗EGFRviiiCAR”，但上述多肽不限于CAR。)。
表达EGFRviii的细胞(EGFRviii表达细胞)中，EGFRviii大量存在于细胞表层。推测当本公开文本涉及的细胞与表达EGFRviii的细胞接触时，通过抗EGFRviiiCAR的靶抗原结合区，与EGFRviii表达细胞表层的EGFRviii结合，由此，本公开文本涉及的细胞被活化，细胞毒性颗粒释放或产生细胞因子，通过这些细胞毒性颗粒、细胞因子，EGFRviii表达细胞被破坏。
本公开文本涉及的细胞优选为哺乳动物细胞。作为哺乳动物细胞，例如，可以为人细胞、或小鼠、大鼠、牛、绵羊、马、狗、猪、猴等非人哺乳动物细胞。这些之中，作为哺乳动物细胞，更优选为人细胞。
细胞的种类没有特别限定，可广泛使用能够从血管通过而到达癌组织的细胞。例如，可举出从血液、骨髓液、脾脏、胸腺、淋巴结等采集的细胞；原发性肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌组织中浸润的免疫细胞、间充质干细胞等。
本公开文本中，“免疫细胞”是指生物体中担负免疫功能的细胞。另外，免疫细胞有时称为免疫活性细胞。免疫细胞优选为从生物体分离的细胞。作为免疫细胞，例如，可举出T细胞、自然杀伤性细胞(NK细胞)、B细胞等淋巴球系细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原呈递细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等粒细胞等。
更具体而言，能够合适地使用从外周血分离的外周血单核细胞等。
外周血单核细胞所包含的细胞中，优选效应细胞，作为效应细胞，例如使用T细胞及其前体细胞。T细胞的种类没有特别限定，可以为αβT细胞、γδT细胞、CD8阳性T细胞、细胞毒性T细胞、CD4阳性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞、初始T细胞、肿瘤浸润T细胞、自然杀伤性T细胞等中的任意T细胞。
这些之中，作为T细胞，更优选为CD8阳性T细胞或细胞毒性T细胞。
<<IL-7及CCL19>>
本公开文本涉及的细胞优选除了表达抗EGFRviiiCAR以外，还表达白细胞介素(Interleukin：IL)-7(IL-7)及趋化因子(C-C基序)配体19(Chemokine(C-Cmotif)Ligand19：CCL19)中的至少一者。
本公开文本涉及的细胞优选为表达(i)抗EGFRviiiCAR、和(ii)IL-7及CCL19中的至少一者的细胞，进一步优选为表达抗EGFRviiiCAR、IL-7、和CCL19的细胞。前述IL-7及/或CCL19优选为外源性的、即由外源核酸表达。
IL-7是T细胞的生存所必需的细胞因子，由骨髓、胸腺、淋巴器官·组织的基质细胞等非造血细胞产生，但几乎未确认到在T细胞中的产生。
另一方面，CCL19主要由淋巴结的树突状细胞、巨噬细胞产生，具有介由其受体即CC趋化因子受体7(Chemokine(C-Cmotif)Receptor7：CCR7)而引起T细胞、B细胞、成熟的树突状细胞的迁移的功能。
IL-7及CCL19所来源的生物没有特别限定，可以为人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子及猴等，优选为人。需要说明的是，这些蛋白质的氨基酸序列可以从GenBank等已知的序列数据库获得。
作为人IL-7的氨基酸序列的例子，可举出作为GenBank号：NM＿000880.3(序列号28)登录的氨基酸序列等。另外，作为人CCL19的氨基酸序列的例子，可举出作为GenBank号：NM＿006274.2(序列号29)登录的氨基酸序列等。
需要说明的是，IL-7及CCL19具有信号肽，成熟蛋白质中，信号肽被除去。
例如，序列号28所记载的人IL-7的氨基酸序列中，1位～25位的序列属于信号肽。另外，例如，序列号29所记载的人CCL19的氨基酸序列中，1位～21位的序列属于信号肽。
另外，IL-7及CCL19可以为上述这样的天然蛋白质的突变体。作为IL-7的突变体的例子，例如，可举出以下这样的多肽。
(6a)由与天然IL-7的氨基酸序列(例如，序列号28)具有70％以上的序列同一性(同源性)的氨基酸序列构成、且具有促进T细胞的免疫功能的功能的多肽。
(6b)由天然IL-7的氨基酸序列(例如，序列号28)中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、且具有促进T细胞的免疫功能的功能的多肽。
另外，作为CCL19的突变体的例子，例如，可举出以下这样的多肽。
(7a)由与天然CCL19的氨基酸序列(例如，序列号29)具有70％以上的序列同一性(同源性)的氨基酸序列构成、且具有促进T细胞的免疫功能的功能的多肽。
(7b)由天然CCL19的氨基酸序列(例如，序列号29)中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、且具有促进T细胞的免疫功能的功能的多肽。
需要说明的是，“促进T细胞的免疫功能的功能”是指维持及/或促进T细胞的生存、增殖、细胞毒活性、迁移活性、对肿瘤组织的浸润活性等的功能。
上述(6a)及(7a)中，序列同一性只要为70％以上即可，没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
另外，上述(6b)及(7b)中，“多个”例如能够为2个～30个，优选为2个～20个，更优选为2个～10个，进一步优选为2个～5个。
另外，“突变”可以为缺失、取代、附加、及插入中的任意，也可以为它们的组合。
另外，就IL-7及CCL19的突变体而言，可以是将这些蛋白质的信号肽变更为其他信号肽而得的，也可以是除去信号肽而得的。优选地，IL-7及CCL19的突变体具有分泌蛋白质的信号肽，向细胞外分泌。
本公开文本涉及的细胞为分离的细胞的情况下，通过与抗EGFRviiiCAR一同还表达选自由IL-7及CCL19组成的组中的至少一者、优选由外源核酸表达，从而促进T细胞的免疫功能，能够成为对EGFRviii表达细胞的细胞毒活性、向肿瘤组织的浸润、或在肿瘤微环境下的生存能力优异的细胞。
本公开文本涉及的细胞、优选免疫细胞可以还表达IL-15、CCL21、IL-2、IL-4、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IP-10、Interferon-γ、MIP-1alpha、GM-CSF、M-CSF、TGF-beta、TNF-alpha等其他免疫功能控制因子，作为上述其他免疫控制因子，优选为IL-12以外的免疫功能控制因子。需要说明的是，这些其他免疫控制因子可以由编码各因子的内源核酸表达，也可以由编码各因子的外源核酸表达。
通常，在细胞中导入外来基因并强制表达的情况下，有外来基因的数目越多则表达率越降低的倾向。因此，在除了抗EGFRviiiCAR以外还强制表达IL-7及CCL19等的情况下，抗EGFRviiiCAR的表达率可能降低。但是，如后述的实施例所示，若使用选自由上述(a-1)～(a-3)组成的组中的抗EGFRviii抗体，则能够使抗EGFRviiiCAR以充分高的比例表达。充分高的表达率表示例如20％以上、25％以上、或30％以上的表达率。
另外，本公开文本涉及的细胞除了表达抗EGFRviiiCAR以外，还可以表达自杀基因。本公开文本涉及的细胞通过表达自杀基因，能够根据需要在本公开文本涉及的细胞中诱导凋亡。
自杀基因没有特别限定，可以使用已知的自杀基因。例如，作为自杀基因，可举出单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)基因、诱导性caspase9(inducible caspase9)基因等。表达HSV-TK的细胞通过使更昔洛韦(ganciclovir)共存而能够诱导细胞死亡。
另外，表达诱导性caspase9的细胞能够通过使AP1903等的二聚体诱导化合物(chemical induction of dimerization：CID)共存而诱导细胞死亡。
自杀基因的氨基酸序列可以从GenBank等已知的序列数据库获得。另外，也可以利用市售的包含自杀基因的载体等的序列。
本公开文本涉及的细胞优选包含抗EGFRviiiCAR。
作为本公开文本涉及的细胞，优选为包含抗EGFRviiiCAR、和选自由IL-7及CCL19组成的组中的至少一者的细胞，更优选为包含抗EGFRviiiCAR、IL-7、及CCL19的细胞，也可以为包含抗EGFRviiiCAR、IL-7、CCL19、及自杀基因的细胞。前述IL-7及CCL19各自优选由编码自身的外源核酸(从细胞外导入的载体等)表达。
本公开文本涉及的细胞可通过将后述的、包含编码抗EGFRviiiCAR的碱基序列的多核苷酸或载体导入细胞中而得到。
(多核苷酸)
本公开文本涉及的多核苷酸优选包含编码上述多肽的碱基序列。
本公开文本涉及的多核苷酸只要包含编码抗EGFRviiiCAR的碱基序列即可，没有特别限定。抗EGFRviiiCAR如上述[嵌合抗原受体(抗EGFRviiiCAR)]一项中记载。
本公开文本涉及的多核苷酸优选包含编码上述[嵌合抗原受体(抗EGFRviiiCAR)]一项中示例的抗EGFRviiiCAR的氨基酸序列的碱基序列。
<碱基序列>
例如，作为编码靶抗原结合区的碱基序列，可举出编码抗EGFRviii抗体的scFv的碱基序列。
更具体而言，可示例包含编码序列号1或4所记载的氨基酸序列的碱基序列和编码序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列的碱基序列的、碱基序列。
作为编码序列号4所记载的氨基酸序列的碱基序列，可示例序列号8中记载的碱基序列。另外，作为编码序列号6所记载的氨基酸序列的碱基序列，可示例序列号7中记载的碱基序列。
编码抗EGFRviii抗体的scFv的碱基序列优选由编码肽接头的碱基序列连结。关于肽接头，如上述“嵌合抗原受体”一项中记载。例如，作为编码上述中示例的接头15的碱基序列，可示例序列号43中记载的碱基序列。另外，作为编码接头25的碱基序列，可示例序列号44中记载的碱基序列。
作为编码抗EGFRviii抗体的scFv的碱基序列的具体例，可举出序列号9及10中记载的碱基序列等。
作为编码靶抗原结合区的碱基序列，优选根据要导入的细胞的生物物种而进行密码子优化，在导入人细胞中的情况下，优选针对人密码子进行优化。
另外，编码跨膜区及信号传导区的碱基序列可以从GenBank等已知的序列数据库获得。另外，上述多肽(优选为EGFRviiiCAR)包含细胞外铰链区等其他区域的情况下，编码该其他区域的碱基序列也可从GenBank等已知的序列数据库获得。
例如，使用人CD8的跨膜区作为跨膜区的情况下，作为编码人CD8的碱基序列，可举出作为GenBank号：NM＿001768.6登录的碱基序列等，作为编码跨膜区的碱基序列，可示例序列号45中记载的碱基序列。
另外，例如，在使用人CD3ζ、人CD28、人4-1BB的T细胞活化信号传导区作为T细胞活化信号传导区的情况下，作为编码人CD3ζ、人CD28、及人4-1BB的碱基序列，分别可举出作为GenBank号：NM＿000734.3、NM＿006139.2、及NM＿001561.5登录的碱基序列等，作为编码人CD3ζ、人CD28、及人4-1BB的T细胞活化信号传导区的碱基序列，分别可示例序列号46～48中记载的碱基序列。
编码上述各区域的碱基序列不限于已知的碱基序列，只要是编码上述各区域的碱基序列，则可以为任何序列。由于基因密码子的简并，与1个氨基酸对应的密码子存在多个。因此，编码同一氨基酸序列的碱基序列存在多个。编码上述各区域的碱基序列只要编码这些区域，则可以是因基因密码子的简并而产生的多个碱基序列中的任意。
作为编码上述各区域的碱基序列，优选根据要导入的细胞的生物物种来进行密码子优化，在导入人细胞中的情况下，优选针对人密码子进行优化。
另外，编码上述各区域的碱基序列可以是编码来源于天然蛋白质的各区域的突变体的碱基序列。关于各区域的突变体，如上述[嵌合抗原受体(抗EGFRviiiCAR)]一项中记载。
编码本公开文本涉及的多肽(抗EGFRviiiCAR)的各区域的碱基序列优选从5’侧起依次按照编码靶抗原结合区的碱基序列、编码跨膜区的碱基序列、编码信号传导区的碱基序列的顺序配置。
在使用信号肽、细胞外铰链区等的情况下，优选将编码信号肽的碱基序列配置于编码靶抗原结合区的碱基序列的5’侧、将编码细胞外铰链区的碱基序列配置于编码靶抗原结合区的碱基序列与编码跨膜区的碱基序列之间。
编码这些区域的碱基序列可以直接连结，也可以介由编码间隔区的碱基序列而连结。
关于间隔区，如上述[嵌合抗原受体(抗EGFRviiiCAR)]一项中记载。
上述多肽为抗EGFRviiiCAR的情况下，作为编码抗EGFRviiiCAR的碱基序列的具体例，可举出由序列号11表示的碱基序列等。
本公开文本涉及的多核苷酸可通过将由编码上述多肽(优选为抗EGFRviiiCAR)的各区域的碱基序列构成的多核苷酸直接连结或介由间隔序列连结而得到。编码上述多肽的各区域的多核苷酸可以通过基于各区域的碱基序列、利用已知的方法进行化学合成而取得。
另外，也可以将从T细胞等提取的DNA、从T细胞等提取的RNA进行逆转录而得到的cDNA作为模板，利用PCR法、LAMP法、TRC法等等温扩增法等，对编码各区域的多核苷酸进行扩增而取得。
以这样的方式得到的编码各区域的多核苷酸也可以在不丧失翻译后的各区域的功能的范围内进行取代、缺失、附加、插入等改变。
本公开文本涉及的多核苷酸除了包含编码抗EGFRviiiCAR的碱基序列以外，还可以包含启动子、增强子、多聚A附加信号、终止子等控制序列、编码其他蛋白质的碱基序列等。
作为其他蛋白质，例如，可举出IL-7及CCL19等。编码这些蛋白质的碱基序列可以从GenBank等已知的序列数据库获得。
例如，使用人IL-7的情况下，作为编码人IL-7的碱基序列，可举出作为GenBank号：NM＿002190.2(序列号49)登录的碱基序列等。另外，使用人CCL19的情况下，作为编码人CCL19的碱基序列的例子，可举出作为GenBank号：NM＿006274.2(序列号50)登录的碱基序列等。
另外，编码这些蛋白质的碱基序列不限于已知的碱基序列，只要是编码这些蛋白质的碱基序列，则可以为任意序列，也可以是因基因密码子的简并而产生的多个碱基序列中的任意。作为编码这些蛋白质的碱基序列，优选根据要导入的细胞的生物物种而进行密码子优化，在导入人细胞中的情况下，优选针对人密码子进行优化。
另外，编码这些蛋白质的碱基序列也可以编码天然IL-7及天然CCL19的突变体。关于这些突变体，如上述[表达抗EGFRviiiCAR的细胞(抗EGFRviiiCAR表达细胞)]一项中记载。
另外，作为其他蛋白质，也可举出自杀基因。关于自杀基因，如上述[表达抗EGFRviiiCAR的细胞(抗EGFRviiiCAR表达细胞)]一项中记载。
编码自杀基因的碱基序列可以从GenBank等已知的序列数据库获得。另外，也能够利用市售的包含自杀基因的载体等的序列。
本公开文本涉及的多核苷酸包含编码其他蛋白质的碱基序列的情况下，在编码抗EGFRviiiCAR的碱基序列、与编码该其他蛋白质的碱基序列之间，可以存在有编码2A肽等自切割型肽的碱基序列、IRES(internal ribozyme entry site)序列等。
另外，在其他蛋白质为2个以上的情况下，也可以在该其他蛋白质之间存在有自切割型肽、IRES等。通过存在有这些序列，从而能够由1个启动子独立地表达多个蛋白质。
作为2A肽，例如，可示例小核糖核酸病毒、轮状病毒、昆虫病毒、口蹄疫病毒、锥虫病毒等的2A肽。
作为具体例，将小核糖核酸病毒的2A肽(F2A)的氨基酸序列示于序列号40。编码2A肽的碱基序列优选根据要导入的细胞的生物物种而进行密码子优化，在导入人细胞中的情况下，优选针对人密码子进行优化。将2A肽的切割位置的氨基酸序列示于序列号39，以C末端的脯氨酸与其一个N末端的甘氨酸之间被切割的形式翻译蛋白质。
另外，本公开文本涉及的多核苷酸也可以在编码上述多肽(优选为抗EGFRviiiCAR)的碱基序列及编码其他蛋白质的碱基序列的每个蛋白质编码序列中具有启动子、增强子、多聚A附加信号、终止子等控制序列。另外，也可以一部分蛋白质编码序列独立地具有控制序列，其他蛋白质编码序列介由2A肽、IRES等连结而具有共同的控制序列。
(载体)
本公开文本涉及的载体优选包含编码上述多肽的碱基序列。
上述多核苷酸可以为载体的形态。
载体的种类没有特别限定，可举出通常使用的表达载体等。
载体可以是直链状也可以是环状，可以是质粒等非病毒载体，也可以是病毒载体，还可以是基于转座子的载体。
作为载体，例如，可举出病毒载体、质粒载体、附加型载体(episomal vector)、人工染色体载体等。
作为病毒载体，例如，可举出仙台病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、痘病毒载体，脊髓灰质炎病毒载体、辛德比斯病毒(sindbis virus)载体、弹状病毒载体，副粘液病毒载体、正粘液病毒载体等。
作为质粒载体，例如，可举出pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等动物细胞表达用质粒载体。
附加型载体是能够在染色体外进行自主复制的载体。作为附加型载体，例如，可举出包含来自EBV(EV病毒)、SV40(Simian virus40)等的自主复制所需的序列作为载体要素的载体。作为自主复制所需的载体要素，具体而言，可举出编码复制起始点、和与复制起始点结合来控制复制的蛋白质的基因。
例如，EBV可举出复制起始点oriP和EBNA-1基因，SV40可举出复制起始点ori和SV40LT基因。
作为人工染色体载体，例如，可举出YAC(Yeast artificial chromosome)载体、BAC(Bacterial artificial chromosome)载体、PAC(P1-derived artificialchromosome)载体等。
作为本公开文本涉及的载体的优选例，可举出病毒载体，作为更优选例，可举出逆转录病毒载体。
作为逆转录病毒载体，可示例pMSGV1载体(Tamada K等人，Clin Cancer Res 18:6436-6445(2012))、pMSCV载体(Takara Bio公司制)。通过使用逆转录病毒载体，载体中的基因被整合到宿主细胞的基因组中，能够在宿主细胞中长时间稳定地表达。
本公开文本涉及的载体除了包含上述[包含编码抗EGFRviiiCAR的碱基序列的多核苷酸]一项中记载的碱基序列以外，可以还包含编码复制起始点、与复制起始点结合并控制复制的蛋白质的碱基序列、编码抗药性基因、报告基因等标记基因的碱基序列等。
编码本公开文本涉及的多肽(优选为抗EGFRviiiCAR)的碱基序列优选以在适当的启动子的控制下表达的方式配置在载体内。另外，在载体包含编码其他蛋白质的碱基序列的情况下，这些碱基序列也优选以在适当的启动子的控制下表达的方式配置在载体内。
作为启动子，例如，可举出SRα启动子、SV40初始启动子、逆转录病毒的LTR、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、热激启动子等。
另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。作为一例，可以举出CAG启动子(包括巨细胞病毒增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、β-球蛋白基因的多聚A信号部位)等。另外，也可以如上述[包含编码抗EGFRviiiCAR的碱基序列的多核苷酸]中记载，在各蛋白质编码序列间配置编码自切割型肽的碱基序列、IRES，在共同的启动子的控制下进行转录。
本公开文本涉及的载体优选除了包含编码上述多肽(优选为抗EGFRviiiCAR)的碱基序列以外，还包含编码IL-7的碱基序列及编码CCL19的碱基序列中的至少一者，更优选除了包含编码抗EGFRviiiCAR的碱基序列以外，还包含编码IL-7的碱基序列及编码CCL19的碱基序列。
载体优选包含编码与适当的启动子功能性地连结的抗EGFRviiiCAR的碱基序列，更优选包含编码上述多肽(优选为抗EGFRviiiCAR)的碱基序列、编码IL-7的碱基序列、及编码CCL19的碱基序列介由编码自切割型肽的碱基序列或IRES连结而成的碱基序列、且该碱基序列与适当的启动子功能性地连结。
<<载体中包含的碱基序列的组合>>
载体中包含的碱基序列的组合没有特别限制，可以将编码上述多肽(优选为抗EGFRviiiCAR)的碱基序列、编码IL-7的碱基序列及编码CCL19的碱基序列分别载入分开的载体中并导入细胞中。另外，也可以将选自这些碱基序列中的2个以上的碱基序列组合而载入同一载体并导入细胞中。
例如，在表达本公开文本涉及的多肽、IL-7及CCL19的情况下，可以将编码它们的各碱基序列载入不同的载体并导入细胞中，也可以将载有编码本公开文本涉及的多肽的碱基序列及编码IL-7的碱基序列的载体、和载有编码CCL-19的碱基序列的载体这2种导入细胞中，也可以将载有编码本公开文本涉及的多肽的碱基序列及编码CCL19的碱基序列的载体、和载有编码IL-7的碱基序列的载体这2种导入细胞中，还可以将载有编码本公开文本涉及的多肽的碱基序列及编码IL-7的碱基序列的载体、和载有编码本公开文本涉及的多肽的碱基序列及编码CCL19的碱基序列的载体这2种导入细胞中，还可以将载有编码本公开文本涉及的多肽的碱基序列、编码IL-7的碱基序列、及编码CCL19的碱基序列的1种载体导入细胞中。
需要说明的是，本说明书中，“与启动子功能性地连结”是指，以在启动子的控制下表达的方式连结于启动子的下游。前述的例子中，编码本公开文本涉及的多肽的碱基序列、编码IL-7的碱基序列、及编码CCL19的碱基序列的配置顺序没有特别限定，可以设为任意的配置顺序。
(表达多肽的细胞的制造方法)
表达本公开文本涉及的多肽的细胞的制造方法(以下，有时也简称为“细胞的制造方法”。)优选包括将上述多核苷酸导入细胞。另外，表达本公开文本涉及的多肽的细胞的制造方法优选包括将上述多核苷酸或载体导入细胞。
将上述多核苷酸或载体导入细胞的方法没有特别限定，可以使用已知的方法。例如，可举出病毒感染法、脂质体转染法、微注入法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法、使用转座子的方法、基因枪法等。
另外，细胞的制造方法中使用的载体为逆转录病毒载体的情况下，也可以基于载体所具有的LTR序列及包装信号序列选择适当的包装细胞，使用其来制备逆转录病毒粒子。
作为包装细胞，例如，可示例PG13、PA317、GP+E-86、GP+envAm-12、Psi-Crip等。另外，也可以将转染效率高的293细胞、293T细胞用作包装细胞。
各种逆转录病毒载体及可用于该载体的包装的包装细胞被广泛市售，因此可以使用它们的市售品。例如，可以使用GP2-293细胞(Takara Bio(株)制)、Plat-GP细胞(COSMOBIO(株)制)、PG13细胞(ATCCCRL-10686)、PA317细胞(ATCCCRL-9078)等，也可以使用Retrovirus packaging Kit Eco(Takara Bio(株)制)等市售的试剂盒。
在表达本公开文本涉及的多肽的细胞中表达IL-7、CCL19、自杀基因等其他外来蛋白质的情况下，可以使编码这些其他蛋白质的碱基序列包含在含有编码本公开文本涉及的多肽(优选为抗EGFRviiiCAR)的碱基序列的载体中，也可以包含在其他载体中。使编码其他蛋白质的碱基序列包含在其他载体中的情况下，可以与将包含编码本公开文本涉及的多肽(优选为抗EGFRviiiCAR)的碱基序列的载体同时或分开地将该载体导入细胞中。
另外，表达本公开文本涉及的多肽的细胞可以通过使用已知的基因编辑技术等，将包含编码本公开文本涉及的多肽的碱基序列的多核苷酸以能够在适当的启动子的控制下表达的方式组装到细胞的基因组中而制造。
作为基因编辑技术，例如，可举出使用锌指核酸酶、TALEN(转录活化因子样效应核酸酶)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Cas系统、PPR(pentatricopeptide repeat)等核酸内切酶的技术。
在表达本公开文本涉及的多肽的细胞中表达其他外来蛋白质的情况下，也同样地，可以使用基因编辑技术等，将包含编码其他外来蛋白质的碱基序列的多核苷酸以能够在适当的启动子的控制下表达的方式组装到细胞的基因组中。例如，可以举出将包含编码与适当启动子功能性地连结的本公开文本涉及的多肽(或其他蛋白质)的碱基序列的多核苷酸组装到细胞基因组的非编码区域等的方法；将包含编码本公开文本涉及的多肽(或其他蛋白质)的碱基序列的多核苷酸组装到细胞基因组的内源性启动子的下游的方法等。
作为内源性启动子，例如可举出TCRα、TCRβ的启动子等。
-表达的确认方法-
在将包含编码本公开文本涉及的多肽的碱基序列的多核苷酸或载体导入细胞中之后，该细胞中的上述多肽的表达可通过流式细胞术、RT-PCR、Northern印迹、Western印迹、ELISA、荧光免疫染色等已知的方法来确认。另外，IL-7及CCL19等其他的外来蛋白质的表达也可以同样地利用已知的方法来确认。
(医药组合物)
本公开文本涉及的医药品组合物优选包含上述细胞。
表达本公开文本涉及的多肽的细胞对表达EGFRviii的细胞显示出特异性细胞毒活性。因此，表达上述多肽的细胞能够用于治疗或预防表达上述多肽的细胞所参与的疾病。EGFRviii在包括肺癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、恶性间皮瘤、骨髓瘤等在内的广泛的肿瘤细胞中表达，因此包含表达上述多肽的细胞的医药组合物能够作为用于治疗或预防肿瘤的医药组合物利用。
肿瘤可以是在骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织及造血组织的任意中产生的。作为肿瘤，例如，可举出神经胶质瘤、黑素瘤、恶性间皮瘤、肺癌、胰癌、头颈部癌、肝癌、子宫癌、膀胱癌、胆道癌、食道癌、精巢肿瘤、甲状腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、大肠癌、肾癌、卵巢癌、乳癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大细胞癌、小细胞癌、皮肤癌、阴道癌、颈部癌、脾脏癌、气管癌、支气管癌、小肠癌、胃癌、胆囊癌、精巢癌等癌症；骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、软组织肉瘤等肉瘤；神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、胰母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等母细胞瘤；胚细胞肿瘤；淋巴瘤、白血病、骨髓瘤等血液癌等，但不限于这些。
特别地，本公开文本涉及的医药组合物适合作为用于治疗或预防表达EGFRviii的肿瘤的医药组合物。
肿瘤是否表达EGFRviii例如可通过使用了抗EGFRviii抗体等的已知方法来确认。
作为确认EGFRviii的表达的已知的方法，可示例流式细胞术、ELISA、免疫染色、荧光免疫染色等。
只要是表达EGFRviii的肿瘤，则除了表达本公开文本涉及的多肽以外还表达IL-7及CCL19中的任一者或两者(优选由外源核酸表达)的细胞对于实体肿瘤也能够发挥出强的细胞毒活性。因此，包含表达本公开文本涉及的多肽、以及IL-7及CCL19中的任一者或两者的细胞的医药组合物能够特别合适地用于表达EGFRviii的实体肿瘤。因此，包含表达本公开文本涉及的多肽、以及IL-7及CCL19中的任一者或两者的细胞的用于治疗或预防实体肿瘤的医药组合物是本公开文本涉及的医药组合物的优选例。
“实体肿瘤”是指从造血系组织产生的血液癌以外的肿瘤，包含上皮细胞癌和非上皮细胞癌。
本公开文本涉及的医药组合物除了包含表达本公开文本涉及的多肽的细胞以外，还可以包含药学上允许的担载体等其他成分。
作为其他成分，例如，除了药学上允许的担载体以外，还可以举出细胞因子等T细胞活化因子、免疫活化剂、免疫检验点抑制剂、其他表达CAR的细胞、抗炎症剂等，但不限于这些。作为药学上允许的担载体，可举出细胞培养培养基、生理盐水、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等。
本公开文本涉及的医药组合物可以利用已知的方法施予，优选可以通过注射或输液来施予至患者。作为施予途径，优选为静脉内施予，但不限于此，也可以通过向肿瘤内注入等来进行施予。
本公开文本涉及的医药组合物可以包含治疗有效量的、表达本公开文本涉及的多肽的细胞。
本说明书中，“治疗有效量”是指对于疾病的治疗或预防有效的药剂的量。治疗有效量可根据施予对象的疾病的状态、年龄、性别、及体重等而变动。本公开文本涉及的医药组合物中，表达上述多肽的细胞的治疗有效量例如为表达上述多肽的细胞能够抑制肿瘤的增殖的量，优选为带来肿瘤的缩小的量。
本公开文本涉及的医药组合物的施予量及施予间隔可以根据施予对象的年龄、性别及体重等、疾病的种类、进行度及症状等、以及施予方法等来适当选择。
作为施予量，可以施予治疗有效量，例如，在1次施予中，作为施予细胞的个数，可举出1×104个～1×1010个、优选1×105个～1×109个、更优选5×106个～5×108个。
作为本公开文本涉及的医药组合物的施予间隔，例如，可以设为每1周、每10天～30天、每1个月、每3月～6月、每1年等。另外，表达本公开文本涉及的多肽的细胞能够在施予对象的体内自主地增殖，因此也可以一次性施予。另外，也可以在施予后监测体内的表达上述多肽的细胞的数量，根据其结果来确定施予时期。
另外，本公开文本涉及的医药组合物可以与其他抗癌剂并用而使用。作为其他抗癌剂，可举出环磷酰胺等烷基化剂、喷司他丁等代谢拮抗剂、利妥昔单抗等分子靶向药、伊马替尼等激酶抑制剂、硼替佐米等蛋白酶体抑制剂、环孢霉素等钙调神经磷酸酶抑制剂、伊达比星等抗癌性抗生素、伊立替康等植物生物碱，顺铂等铂制剂、他莫昔芬等激素疗法药、纳武单抗、派姆单抗等免疫控制药等，但并不限定于这些。
另外，本公开文本涉及的医药组合物的施予对象没有特别限制，可以为人、猴、狗等。
另外，另一方式中，本公开文本提供：1)表达本公开文本涉及的多肽的细胞在用于治疗或预防肿瘤的医药组合物的制造中的用途；2)治疗或预防表达EGFRviii的肿瘤的方法，其包括将表达本公开文本涉及的多肽的细胞施予至对象(例如，罹患表达EGFRviii的肿瘤的患者、进行了肿瘤的外科切除的患者等)；3)用于治疗或预防肿瘤的表达本公开文本涉及的多肽的细胞；4)用于治疗或预防肿瘤的表达本公开文本涉及的多肽的细胞的用途。
此外，另一方式中，还提供用于制作表达本公开文本涉及的多肽的细胞的试剂盒，其包含本公开文本涉及的载体。该试剂盒只要包含上述本公开文本涉及的载体即可，没有特别限制，可以包含用于制作表达本公开文本涉及的多肽的细胞的说明书、用于将载体导入细胞中的试剂等。
实施例
以下，通过实施例对本公开文本进行说明，但本公开文本不限于以下的实施例。
(实施例1)抗EGFRviii抗体的制作
按照通常方法，使用来源于EGFRviii的肽将小鼠免疫，使用表达EGFRviii的HEKEGFRviii细胞、和不表达EGFRviii的HEK293细胞进行筛选，得到产生与EGFRviii结合的抗体的48个杂交瘤。
进而，使用表达EGFRviii的CLTH/EGFRviii细胞(Celther Polska公司)和不表达EGFRviii的293细胞(国立研究开发法人医药创新·健康·营养研究所JCRB Cell Bank制)，进行基于FACS分析的筛选，选择1B10、2H9、及3C2这3个克隆。
对这些克隆实施单一克隆(single cloning)。以对EGFRviii表达株的结合强、且对EGFRviii非表达株的结合弱、及细胞增殖快作为克隆的选择基准，选择1B10-1A12克隆(序列号1及2)、2H9-1B5克隆(序列号51及52)、及3C2-1B10克隆(序列号53及54)，用于以下的实验。
对3个克隆的氨基酸序列进行分析，并进行比对，将所得的结果示于图1A及图1B。
如图1A及图1B所示，可知3个克隆彼此显示高的序列同一性。图1A及图1B中所示的CDR基于Kabat的定义。
(实施例2)小鼠抗EGFRviiiCAR-T细胞的研究
<基于1B10-1A12克隆的抗EGFRviiiscFv的设计>
首先，使用1B10-1A12克隆的VH和VL、以及接头15和接头25，设计了以下的表1中记载的8种抗EGFRviiiscFv。但是，该表中的序列号13、15为转换为以下记载的(SG)后的序列，因此实际上序列号14的164位的Ser及序列号16的174位的Ser替换为Asn。
[表1]
构成 序列号
S#020 VL15VH(NG) 13
S#021 VH15VL(NG) 14
S#022 VL25VH(NG) 15
S#023 VH25VL(NG) 16
S#024 VL15VH(SG) 3，41，1
S#025 VH15VL(SG) 1，41，3
S#026 VL25VH(SG) 3，42，1
S#027 VH25VL(SG) 1，42，3
表1中，VL15VH是指从N末端起依次包含1B10-1A12克隆的VH区域、接头15、及1B10-1A12克隆的VL区域，(NG)是指在VL的CDR1中含有NG(Asn-Gly)序列，(SG)表示该NG序列转换为SG(Ser-Gly)序列。
在位于VL的CDR1的NG(Asn-Gly)序列中，容易发生脱酰胺化，脱酰胺化可能使抗原结合能力降低，因此制作了变更为SG(Ser-Gly)序列而得的序列。
<抗EGFRviiiCAR的scFv序列及DNA片段的合成>
合成编码上述8种抗EGFRviiiscFv的氨基酸序列的DNA片段。
<抗EGFRviiiCAR表达载体的制作>
〔表达IL-7/CCL19及HSV-TK的抗EGFRviiiIL-7/CCL19CAR表达载体的制作〕
对于上述8种抗EGFRviiiscFv，按照国际公开第2017/159736号小册子中记载的方法，首先制作了从N末端侧起依次具备抗EGFRviiiscFv、人CD8跨膜区、及人CD28、4-1BB、CD3ζ细胞内信号传导区的第3代CAR构建体。
在该构建体的C末端加入作为2A肽(序列号39)的F2A，进而在其下游加入人IL-7-F2A-人CCL19-F2A-HSV-TK。下述表2示出各氨基酸序列。
接着，在上述pMSGV载体内的抗EGFRviiiscFv区域，将由上述“抗EGFRviiiCAR的scFv序列及DNA片段的合成”一栏中记载的方法合成的各EGFRviiiscFvDNA片段进行限制性内切酶(NcoI及NotI)处理，并利用连接(ligation)进行插入，制作了各“IL-7/CCL19表达-抗EGFRviiiCAR载体”。
[表2]
<导入有IL-7/CCL19表达-抗人EGFRviiiCAR载体的逆转录病毒的制作>
为了向T细胞进行基因导入，制作了逆转录病毒。
首先，使用转染试剂(制品名：Lipofectamine3000(Life Technology公司制))，将上述的各IL-7/CCL19表达-抗EGFRviiiCAR载体和p-Ampho质粒(Takara Bio公司制)转染至GP2-293包装细胞株(Takara Bio公司制)，由此制作了导入有IL-7/CCL19表达-抗EGFRviiiCAR载体的逆转录病毒。
转染起48小时后，将含有导入了上述抗EGFRviii载体的逆转录病毒的上清液分别回收。
作为前述GP2-293细胞的培养液，使用加入有10％FCS、1％青霉素-链霉素(富士胶片和光纯药(株)制)的DMEM。另外，作为后述的实施例中使用的T细胞的培养液，使用包含CTS Immune CellSR(Gibco公司制)、1％青霉素-链霉素(富士胶片和光纯药(株)制)、2.5μg/mL的两性霉素B(Bristol Myers Squibb公司制)、2mM的L-谷氨酰胺的OpTmizer(Gibco公司制)。
<向T细胞的转导>
在固相化有用于将T细胞活化的抗CD3单克隆抗体(5μg/mL)及RetroNectin(注册商标)(Takara Bio(株)制，25μg/mL)的板上，将从健康人供者的血液中采集的2×106个外周血单核细胞与IL-2(Miltenyi公司制)一起在37℃、5％CO2培养箱中培养3天。
在培养开始后第2天，将上述制作的含有导入有IL-7/CCL19表达-抗人EGFRviiiCAR载体的逆转录病毒的上清液以每1孔各500μL的量添加于预先用25μg/mL的RetroNectin(Takara Bio(株)制)包被的表面未处理24孔板中，通过2000g、2小时的条件进行离心分离，制作了逆转录病毒预装载板。
针对各逆转录病毒，上述逆转录病毒预装载板各制作2张，结束离心分离后，用1.5％BSA/PBS进行清洗，于4℃保存至使用。
在培养第3天，从上述板中回收活化的细胞，以细胞数成为1×105个细胞/mL的方式制备细胞悬浮液。将该细胞悬浮液以每1孔各1mL的量添加于逆转录病毒预装载板中，在IL-2的存在下在37℃、5％CO2培养箱中培养24小时，进行第1次的逆转录病毒感染。
第二天(培养第4天)，将各孔的细胞溶液转移至保存的第2张逆转录病毒预装载板中，以500g离心分离1分钟后，于37℃培养4小时，进行第2次的感染。
于37℃培养4小时后，将各孔的细胞悬浮液1mL转移到新的12孔细胞培养板中，用含有IL-2的新的培养液(OpTmizer)稀释至4倍，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
从外周血单核细胞的培养开始日起计数，培养至第7天，得到作为导入有IL-7/CCL19表达-抗EGFRviiiCAR载体的T细胞的抗EGFRviiiCAR-T细胞(以下，也称为“PRIMEEGFRviii CAR-T细胞”。)。
抗PRIME EGFRviii CAR-T细胞含有编码外源的抗人EGFRviiiCAR的核酸、编码外源的IL-7的核酸、及编码外源的CCL19的核酸。
另外，同时，作为CAR阴性细胞对照，制作利用同样的方法将从同一健康人供者获得的外周血单核细胞活化、但未进行逆转录病毒感染的“CAR、IL-7、及CCL19非表达-T细胞”(非基因导入细胞：Non-infection、或活化T细胞：ActT)。
<CAR的表达的确认>
〔流式细胞术分析〕
对于PRIME EGFRviii CAR-T细胞的表达水平，利用流式细胞术进行测定。
使活化的T细胞、和PRIME EGFRviii CAR-T细胞、与重组EGFRviii蛋白质及别藻蓝蛋白(APC)标记抗CD8单克隆抗体(Affymetrix公司制)反应来进行染色。
上述流式细胞术使用CytoFLEX S(Beckman Coulter公司制)，数据分析使用FlowJo software(Tree Star公司制)。
(结果)
结果示于图2A～2H。各图2A～2H中，横轴表示CAR的表达，纵轴表示CD8的表达。
如图2A～2H所示，在活化的T细胞(图中的ActT)中，观察到CD8的表达，但未观察到CAR的表达。另一方面，在作为导入有IL-7/CCL19表达-抗人EGFRviiiCAR载体的T细胞的“PRIME EGFRviii CAR-T细胞”中，无论scFv的种类如何均显示出充分高的表达率。其中，观察到以VL作为N末端侧的VL15VH和VL25VH的表达率高的倾向。
<基于2H9-1B5克隆及3C2-1B10克隆的抗EGFRviiiCAR-T细胞的制作>
利用与基于1B10-1A12克隆的方法同样的方法，制作了基于2H9-1B5克隆及3C2-1B10克隆的PRIME EGFRviii CAR-T细胞。scFv均为VL25VH(SG)型。
将测定表达率而得的结果示于图3A～3D。
尽管与1B10-1A12克隆相比VH及VL的序列同一性非常高，但就基于1B10-1A12克隆的PRIME EGFRviii CAR-T细胞而言，由流式细胞术得到的测定结果为32.4％，与此相对，基于2H9-1B5克隆及3C2-1B10克隆的PRIME EGFRviii CAR-T细胞的测定结果分别为3.6％、及1.4％，极低。认为其原因在于，2H9-1B5克隆及3C2-1B10克隆的表达率低、及/或与重组EGFRviii蛋白质的结合亲和性低。
由此，以下的实施例中，使用1B10-1A12克隆。
<CAR-T细胞的细胞毒活性的测定>
关于基于1B10-1A12克隆的PRIME EGFRviii CAR-T细胞，使CAR-T细胞与EGFRviii表达细胞(CLTH/EGFRviii细胞)或EGFRviii非表达细胞(293细胞)之比(E：T比)为1：1，测定PRIME EGFRviii CAR-T细胞的细胞毒活性，将结果示于图4A及图4B。图4A及图4B中，NI表示Non Infection的细胞，是指该细胞中未导入CAR基因。另外，NI24％是指根据CAR的表达率将该细胞的浓度调整为24％，同样地，NI16％是指将该细胞的浓度调整为16％。
如图4A及图4B所示，在包含NG序列的scFv与包含SG序列的scFv中，表达率及细胞毒活性未观察到大的差异。
如图4A所示，无论scFv的种类如何，PRIME EGFRviii CAR-T细胞均对EGFRviii表达细胞显示出特异性细胞毒活性。
根据以上的结果，在以下的实验中，使用S#024VL15VH(SG)及S#026VL25VH(SG)。
<第2代构建体的研究>
对于具有基于1B10-1A12克隆的S#024VL15VH(SG)及S#026VL25VH(SG)作为scFv的抗EGFRviiiCAR，研究了使用第2代CAR构建体来代替第3代CAR构建体。
第2代构建体从N末端侧起依次具备抗EGFRviiiscFv、人CD8跨膜区、4-1BB、及CD3ζ细胞内信号传导区。
将测定表达率而得的结果示于图5A～5E。
观察到第2代构建体的表达率高于第3代构建体的倾向。
另外，改变PRIME EGFRviii CAR-T细胞、与EGFRviii表达细胞(胶质母细胞瘤细胞U87MGviii 4.12细胞)或EGFRviii非表达细胞(U87MG细胞)之比(E：T比)，测定PRIMEEGFRviii CAR-T细胞的细胞毒活性，将得到的结果示于图6A及图6B。如图6A及图6B所示，无论scFv的构成如何及构建体为第2代还是第3代，任意PRIME EGFRviiiCAR-T细胞均对EGFRviii表达细胞显示出特异性细胞毒活性。需要说明的是，图6A及图6B中的Act T是指活化的T细胞，用作对照。
此外，对E：T比为1：3时的培养上清液的IFNγ浓度进行测定，将得到的结果示于图7。如图7所示，可知仅在与EGFRviii表达细胞共培养的情况下，PRIME EGFRviii CAR-T细胞分泌IFNγ。需要说明的是，图7中的Act T是指活化的T细胞，用作对照。
(实施例3)人PRIME EGFRviii CAR-T细胞的研究
将scFv人源化，制作了具有VL25VH型scFv的PRIME-EGFRviii CAR-T细胞#744，所述VL25VH型scFv使用了由序列号4所记载的氨基酸序列构成的VH和由序列号5所记载的氨基酸序列构成的VL。scFv中的NG序列转换为SG序列，使用了上述第2代构建体，但作为信号序列及跨膜区，使用以下的序列。
〔信号序列〕
IgG SS：MDWTWRILFLVAAATGAHS(序列号23)
〔跨膜区〕
CD8a short：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITL(序列号30)
对2名健康人供者的样品测定表达率，将得到的结果示于图8A～8D。任意CAR均显示出高的表达率。
<利用ATP分析来测定EGFRviii CAR-T细胞的以肿瘤细胞作为靶标的细胞毒活性>
将PRIME EGFRviii CAR-T细胞相对于肿瘤细胞之比(E：T比)进行各种变更来进行ATP分析，测定PRIME EGFRviii CAR-T细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性。
-肿瘤细胞培养培养基的制备-
向500mL MEM培养基中分别加入50mL的FBS、5mL的青霉素-链霉素(液态)，制备肿瘤细胞培养培养基(也称为肿瘤细胞用培养基)。
将肿瘤细胞(后述的胶质母细胞瘤细胞U87MGviii 4.12)以成为5×105个细胞/mL的方式稀释于上文制备的肿瘤细胞用培养基中，将经稀释的肿瘤细胞以每孔100μL的量分注于经胶原蛋白包被的96孔板中。
PRIME EGFRviii CAR-T细胞利用细胞计数器测定细胞数及存活率。
根据细胞计数器的数据及CAR阳性率，以CAR阳性细胞成为5×105个细胞/mL的方式悬浮于肿瘤细胞用培养基中，制备了CAR-T细胞液。
将用肿瘤细胞用培养基逐步稀释CAR-T细胞液而得的液体以每孔100μL的量添加至分注有肿瘤细胞的孔板中，以E：T比成为0：1、0.01：1、0.03：1、0.1：1、0.3：1、或1：1的方式进行制备。
将上述96孔板放入设定为37℃、5vol％CO2的CO2培养箱中，进行48小时的共培养。
将肿瘤细胞培养培养基从取出自CO2培养箱的孔板中除去，用PBS进行清洗。将经冷冻保存的、CellTiter-Gro Reagent(Promega公司制)在遮光下融化后，将一小瓶的CellTiter-Gro substrate(Promega公司制)全部投入10mL的CellTiter-Gro buffer(Promega公司制)中并混合，以每孔100μL的量分注于96孔板中。
在96孔板的盖上覆盖铝箔，以25℃、200rpm(每分钟转数，revolutions perminute)的条件振荡10分钟而与ATP反应。反应后，立即用微孔板检测仪(PlateReader)测定发光(Shake 5秒(60rpm)、Delay 30秒)，测定活细胞数。
另外，作为对照，代替U87MGviii细胞而使用不表达EGFRviii的神经胶质母细胞瘤细胞株U87MG细胞，另外，代替PRIME EGFRviii CAR-T细胞而使用活化T细胞，同样地测定。结果示于图9A～9D。
PRIME EGFRviii CAR-T细胞以EGFRviii表达特异性的方式显示出强的细胞毒活性。
(实施例4)抗EGFRviiiCAR-T细胞的体内(in vivo)抗肿瘤活性的评价
<胶质母细胞瘤细胞U87MGviii 4.12中的EGFRviii的表达的确认>
〔流式细胞术分析〕
为了用于调查细胞毒活性的分析、制备用于调查体内的抗肿瘤活性的动物模型，对胶质母细胞瘤细胞U87MGviii 4.12(以下，也简称为“肿瘤细胞”。)的EGFRviii的表达进行了确认。具体而言，将抗人EGFRviii抗体的杂交瘤培养上清液(克隆1B10-1A12)以50uL/样品的量添加后，将作为二抗的经APC(allophycocyanin)标记的抗小鼠IgG抗体(Cat.No.405308BioLegend公司制)以50ng/样品的量进行染色，进行流式细胞术分析。
上述流式细胞仪使用CytoFLEX S(Beckman Coulter公司制)，数据分析使用FlowJo software(Tree Star公司制)。
(结果)
结果示于图10。确认了80％以上的肿瘤细胞表达EGFRviii。
<使用了小鼠肿瘤模型的治疗效果>
向NGO基因和B2M基因的双缺陷小鼠(NOG-lab/b2mdKOmouse)的皮下接种1.0×106个胶质母细胞瘤细胞U87MGviii4.12，制作了肿瘤模型小鼠。
在皮下接种10天后，作为未处置组，将Hank's balanced salt solution(HBSS)施予至5只肿瘤模型小鼠的静脉内，作为活化T细胞施予组，将1.25×107个活化T细胞施予至5只肿瘤模型小鼠的静脉内，作为PRIME EGFRviii CAR-T细胞(#744)施予组，将1×107个EGFRviii CAR-T细胞(基于CAR表达率80％的细胞组，为1.25×107个)施予至5只肿瘤模型小鼠的静脉内。
然后，一周测定2次模型小鼠的肿瘤体积和体重，对体重减少20％、或观察到显著的衰弱的模型小鼠进行解剖，对解剖照片和有无肿瘤转移进行确认。
将接种了肿瘤细胞的肿瘤模型小鼠的背部照片示于图11。
将肿瘤模型小鼠的肿瘤体积的变化的结果示于图12A～12C。横轴表示将肿瘤细胞接种于小鼠后的天数(将接种于小鼠当天作为第0天)，纵轴表示肿瘤体积(肿瘤的长轴×(肿瘤的短轴)2/2(mm3))。另外，各数据的编号为个体识别编号。
未处置组中，除了肿瘤细胞未植活的1例以外，肿瘤体积增大。活化T细胞施予组中，所有例子均观察到肿瘤体积的大幅增加。另一方面，PRIME EGFRviii CAR-T细胞施予组中，肿瘤体积几乎不增加。
如图11及图12A～12C所示，确认了在肿瘤模型小鼠中，PRIME EGFRviii CAR-T细胞(抗EGFRviiiCAR-IL-7/CCL19表达T细胞)显示出优异的抗肿瘤活性。

Claims (21)

1.抗EGFRviii抗体，其为选自由下述(a-1)～(a-3)组成的组中的抗体或其抗原结合片段，
(a-1)包含含有由序列号1或4所记载的氨基酸序列构成的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3的重链可变区、和
含有由序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列构成的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3的轻链可变区、并且
具有与EGFRviii的结合能力的抗体或其抗原结合片段；
(a-2)包含由序列号1或4所记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成的重链可变区、和
由序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成的轻链可变区、并且
具有与EGFRviii的结合能力的抗体或其抗原结合片段；及
(a-3)包含由与序列号1或4所记载的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的重链可变区、和
由与序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的轻链可变区、并且
具有与EGFRviii的结合能力的抗体或其抗原结合片段。
2.如权利要求1所述的抗EGFRviii抗体，其中，所述重链可变区在序列号1或4所记载的氨基酸序列中在21位具有T，在24位具有F，在54位具有F，在59位具有K，在67位具有S，在73位具有K，在77位具有T或K，及在83位具有K或T。
3.如权利要求1或2所述的抗EGFRviii抗体，其中，所述轻链可变区在序列号2、3、5或6所记载的氨基酸序列中在4位具有M，在16位具有E或G，在27位具有Q，在35位具有K，在55位具有S，在58位具有N，在74位具有R，在79位具有K，在81位具有S，在87位具有D，在99位具有V。
4.如权利要求1～3中任一项所述的抗EGFRviii抗体，其中，
所述重链可变区含有序列号1所记载的氨基酸序列，并且所述轻链可变区含有序列号2所记载的氨基酸序列；
所述重链可变区含有序列号1所记载的氨基酸序列，并且所述轻链可变区含有序列号3所记载的氨基酸序列；
或者，
所述重链可变区含有序列号4所记载的氨基酸序列，并且所述轻链可变区含有序列号5或序列号6所记载的氨基酸序列。
5.如权利要求1～4中任一项所述的抗EGFRviii抗体，其中，所述抗体为单链抗体。
6.如权利要求5所述的抗EGFRviii抗体，其中，所述单链抗体从N末端起依次包含所述轻链可变区、将所述重链可变区与所述轻链可变区连结的肽接头、和所述重链可变区。
7.如权利要求5所述的抗EGFRviii抗体，其中，所述单链抗体为选自由下述(I)～(III)组成的组中的多肽：
(I)包含选自由序列号12～18及38组成的组中的氨基酸序列的多肽；
(II)由与选自由序列号12～18及38组成的组中的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成、并且具有与EGFRviii的结合能力的多肽；以及，
(III)由选自由序列号12～18及38组成的组中的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、并且具有与EGFRviii的结合能力的多肽。
8.多肽，其包含靶抗原结合区、跨膜区、和信号传导区，
所述靶抗原结合区包含权利要求1～7中任一项所述的抗EGFRviii抗体。
9.如权利要求8所述的多肽，其为嵌合抗原受体。
10.细胞，其表达权利要求8或9所述的多肽。
11.如权利要求10所述的细胞，其还表达IL-7及CCL19中的至少一者。
12.如权利要求10或11所述的细胞，其中，所述细胞为免疫细胞。
13.如权利要求12所述的细胞，其中，所述免疫细胞为T细胞。
14.多核苷酸，其包含编码权利要求8或9所述的多肽的碱基序列。
15.如权利要求14所述的多核苷酸，其还包含编码IL-7的碱基序列及编码CCL19的碱基序列中的至少一者。
16.载体，其包含权利要求14或15所述的多核苷酸。
17.如权利要求16所述的载体，其还包含编码IL-7的碱基序列及编码CCL19的碱基序列中的至少一者。
18.表达多肽的细胞的制造方法，其包括将权利要求14或15所述的多核苷酸导入细胞中。
19.表达多肽的细胞的制造方法，其包括将权利要求16或17所述的载体导入细胞中。
20.医药组合物，其包含权利要求10～13中任一项所述的细胞。
21.如权利要求20所述的医药组合物，其为用于治疗或预防肿瘤的医药组合物。
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