JPH02157657A - 配糖化した化合物を生産する細胞の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、配糖化した有用成分を生産する植物細胞の検
出方法に関し、植物組織培養における有用物質生産細胞
の検出、選抜に好適である。

〔従来の技術〕

植物組織培養により有用物質の生産を行う場合、その物
質を効率良く生産する細胞を検出し、選抜することが生
産性の向上を図る上で必須の要件となっている。しかし
ながら、現状ではあらゆる物質について、その物質を生
産する細胞を検出、あるいは選抜する技術が確立してい
る訳ではない。

すなわち、その有用物質が色または螢光を持つ場合は目
視または紫外線を照射することにより、多数の細胞の中
から目的の細胞を検出し選抜することが可能であるが、
配糖化した低分子化合物である強心配糖体のように有用
物質が色や螢光を持たない場合はこのような方法で有用
物質を生産する細胞を検出することは困難であった。

一方、特定の物質の局在を特異的に検出する方法として
は抗原抗体反応を利用した免疫組織化学的検出法がある
。しかし、この方法はタンパク質、ホリペブチドのよう
な高分子化合物を検出するための方法であり、強心配糖
体のような配糖化した低分子化合物を免疫組織化学的手
法によって検出した例はない、なお、従来公知の免疫組
織化学的手法−′に関して例えば渡辺慶−２中根−穂編
の「改釘板酵素抗体法」（学際企画）に記載されている
。

〔発明が解決しようとする課題〕

植物組織において、強心配糖体なとの配糖化した低分子
化合物を生産する細胞を検出する方法を確立するために
、配糖化した低分子化合物を組織に固定させた後、免疫
組織化学的手法によって強心配糖体なとの配糖化した低
分子化合物を生産する細胞を検出する方法について研究
した結果、次のような事実を見い出した。

〔課題を解決するための手段〕

強心配糖体等の配糖化した化合物を生産する植物組織を
過ヨウ素酸を含む固定液で固定処理を行うことによって
配糖化した化合物が植物組織に固定化され、その後、抗
原抗体反応を利用した免疫組織化学的手法によって配糖
化した化合物を生産する細胞を検出できることを見い出
し、本発明を完成するに至った。

なお、過ヨウ素酸は糖の部分に作用して、ジアルデヒド
を生成しタンパクのε−アミノ基の複合体が形成される
ことが知られているが、過ヨウ素酸を使用して強心配糖
体なとの配糖化した低分子化合物を組織に固定化させた
例はない。

本発明の対象となる植物種としては特に制限はないが、
強心配糖体を生産するゴマノハグサ科のＤｉｇｉｔａｌ
ｉｓ　１ａｎａｔａ、　Ｄｉｇｉｔａｌｉｓｌｕｔｅａ
、　Ｄｉｇｉｔａｌｉｓｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｄｉｇｉｔ
ａｌｉｓ　ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａなどのジギタリス属
やステビオサイドを生産するキク科の５ｔｅｖｉａｒｅ
ｂａｕｄｉａｎａなどのステビア属を例示できる。

また配糖化した化合物としては非タンパク性の低分子化
合物があり、アークナイン、バニリンなどのフェノール
配糖体、アミグダリン、サンプニグリンなどのニトリル
配糖体、エスクリン、ケニリンなどのクマリン配糖体、
クリソファネイン、センノサイドなどのアントラセン配
糖体、ステビオサイド、ベルベナリンなどのテルペン配
糖体、ゲンチオピタリン、コンズランギンなどの苦味配
糖体、アカジイン、アビインなどのフラボン配糖体、イ
リジン、オノニンなどのイソフラボン配置ｉ体、アビク
ラリン、アビクラリンなどのフラボノール配糖体、エリ
オジクチン、サフラニンなどのフラバノン配糖体、イブ
イン、クリサンチミンなどのシアニジン配糖体、エニン
、デルフィニンなどのデルフィニジン配糖体、オスラジ
ン、ジギトゲニンなどのステロイド配糖体、アシアチコ
シド、グリチルリチンなどのトリテルペノイド配糖体、
ジギトキシン、・ジゴキシンなどの強心配糖体、その他
インドキシル配糖体、アゾキシ配糖体、アルカロイド配
糖体、ジベレリン配糖体、リグナン配糖体などを例示で
きる。

上述した配糖化した化合物が存在する植物組織を過ヨウ
素酸を含む固定液に浸漬し、４°Ｃで一晩以上放置する
ことによって配糖化した化合物を組織に固定することが
できる。なお、ここで用いる固定液としては、グルタル
アルデヒド、ホルマリン、バラホルムアルデヒドが例示
できる。

その後、常法に従って顕微鏡切片を作製し配糖化した化
合物に対する抗体を用いて免疫組織化学的手法によって
配糖化した化合物を特異的に染色する等の方法によって
配糖化した化合物を検出することができる。

なお、本発明の検出法は画像処理装置を使用することに
よって配糖化した化合物の局在をさらに明確にすること
もできる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を更に具体的に説明する。

実施例１ Ｄｔｇｉｔａｌｉｓ　ｐｕｒｐｕｒｅａの苗条の培養組
織を用いて強心配糖体の局在を調べた。以下順を逼って
説明する。

（１）　　組織の固定と凍結切片の作製Ｄｉｇｉｔａｌ
ｉｓ　ｐｕｒｐｕｒｅａの苗条培養の葉部組織を切り取
り、１０ａＭ　Ｎａ１０４．５％パラホルムアルデヒド
、０、１　Ｍリン酸緩ｄｊ液を含む固定液（ｐＨ６，２
）に浸漬し、４°Ｃで２４時間放置後、固定液ｔｏｙあ
たり２１．４■のＮａ１Ｏ４を追加し、さらに２４時間
放置した後、組織を生理食塩水で洗浄した後、液体窒素
で凍結させ、厚さ２０μｍ〜４０μ鴎程度の凍結切片を
作製した。なお、凍結切片の具体的作製法については、
渡辺慶−１中根−穂編集の「改訂版酵素抗体法」（学際
企画）に記載されている。

（２）酵素抗体法による強心配糖体の染色■　作製した
凍結切片を（１）に記載の固定液に３０分間浸漬した後
、生理食塩水で洗浄後生理食塩水に１０分間浸漬そして
洗浄を３回繰り返した。

■　次にジギトキシン抗体（コスモバイオ社より購入）
の１００倍希釈液を凍結切片に滴下し、凍結切片を乾燥
させないように湿度１００％のモイスチャーチャンバー
内で１時間、室温で反応させた。

■　１時間後、生理食塩水で洗浄後、生理食塩水に１０
分間浸漬そして洗浄を３回繰り返した。

■　パーオキシダーゼを標識した２次抗体（和光純薬よ
り購入）の２５０倍希釈液を該凍結切片に滴下してモイ
スチャーチャンバー内で１時間、室温で反応させた。

■　■と同様の操作を行った。

■　パーオキシダーゼの発色反応液（ＤＡＢ−ＨｔＯ。

液）に凍結切片を浸漬して発色させた。

なお、発色反応液に関して、渡辺、生根編集の「改訂版
　酵素抗体法」　（学際企画）のＰ、７０に記載されて
いる。

■　発色後、生理食塩水で洗浄し、カバー゛グラスで封
入し顕微鏡で観察した。

■　染色部を明確にするためにネクサス製の画像処理装
置を用いて染色部を赤で着色した。

画像処理の写真を第１図に示す、赤で着色した染色部は
第１図において黒色の部分であり、これはジキトキシン
抗体と反応する強心配糖体の局在を示す。

（発明の効果） 本発明方法によれば、配糖化した化合物を生産する細胞
を効率よく検出しうる。

【図面の簡単な説明】

第１図はジキタリスベルブレアの葉部組織における強心
配糖体を生産する細胞の存在を示す写真である。 なお、第１図は生物の形態を示す写真である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）配糖化した化合物を生産する植物の組織を過ヨウ
   素酸を含む固定液で処理し、次いで免疫組織化学的検出
   法によって配糖化した化合物を生産する細胞を検出する
   ことを特徴とする配糖化した化合物を生産する細胞の検
   出方法。
2. （２）配糖化した化合物が非タンパク性の低分子化合物
   である請求項１記載の方法。
3. （３）配糖化した化合物が強心配糖体である請求項２記
   載の方法。