RU2620559C1 - Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии (варианты) - Google Patents
Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2620559C1 RU2620559C1 RU2016101277A RU2016101277A RU2620559C1 RU 2620559 C1 RU2620559 C1 RU 2620559C1 RU 2016101277 A RU2016101277 A RU 2016101277A RU 2016101277 A RU2016101277 A RU 2016101277A RU 2620559 C1 RU2620559 C1 RU 2620559C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- room temperature
- hours
- phosphate buffer
- methanol
- samples
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 title claims description 8
- 238000004040 coloring Methods 0.000 title abstract 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 5
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 168
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 112
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 93
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 37
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 36
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 34
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims description 28
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims description 28
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 claims description 25
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 21
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 claims description 13
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims description 12
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims description 12
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims description 12
- POAOYUHQDCAZBD-UHFFFAOYSA-N 2-butoxyethanol Chemical compound CCCCOCCO POAOYUHQDCAZBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 8
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 8
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 claims description 8
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 claims description 8
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 claims description 8
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 7
- 229960002903 benzyl benzoate Drugs 0.000 claims description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 claims description 6
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 5
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 4
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 claims description 4
- 238000007447 staining method Methods 0.000 claims description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 8
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 abstract description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012800 visualization Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 51
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 7
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000000695 crystalline len Anatomy 0.000 description 4
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- CDEURGJCGCHYFH-UHFFFAOYSA-N 5-ethynyl-1-[4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(C#C)=C1 CDEURGJCGCHYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CDEURGJCGCHYFH-DJLDLDEBSA-N 5-ethynyl-2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C#C)=C1 CDEURGJCGCHYFH-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 description 3
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 3
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- -1 antibodies Chemical class 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000004141 dimensional analysis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008556 epithelial cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000001542 lens epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается вариантов способа окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии. Предложенные способы позволяют окрашивать препараты образцов биологических тканей молодых и взрослых животных целиком, без предварительного секционирования. Использование предлагаемых способов окрашивания позволяет сохранять морфологию образцов и высокоспецифично выявлять этинильную группу даже в толще крупных препаратов (не менее 5 мм) биологической ткани. Изобретение значительно облегчает и ускоряет процесс визуализации и анализа препаратов за счет использования методов трехмерной микроскопии и томографии. Препараты образцов, окрашенные предлагаемыми способами, обладают высоким соотношением сигнал : фон и специфичностью окраски, что позволяет использовать их для проведения автоматизированного количественного и качественного анализа выявленных меток. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 ил.
Description
Предлагаемая группа изобретений относится к области экспериментальной биологии и медицины, где необходимо приготовление препаратов цельных биологических тканей и органов для оптической проекционной, блок-фэйс и серийной двухфотонной томографии, конфокальной, мультифотонной и светоплоскостной микроскопии с целью получения трехмерных карт гистологической локализации популяций клеток, меченных этинильным маркером. Изобретения могут быть использованы для предклинических испытаний фармакологических препаратов и оценки физиологических воздействий на организм, а также для работы с материалом биопсий в диагностических и исследовательских целях.
В последние годы в связи с развитием методов трехмерной микроскопии и оптической томографии возникла потребность в новых методах детекции различных популяций клеток в цельных (несекционированных) биологических образцах. В настоящий момент с этой целью используют иммуногистохимические техники. Несмотря на достоинства иммуногистохимии, ее использование для окрашивания крупных образцов ткани затруднено ограниченной проницаемостью высокомолекулярных соединений, таких как антитела, вглубь биологического образца. Это обуславливает длительность процесса иммуногистохимического окрашивания цельных образцов.
В последние годы в качестве альтернативы иммуногистохимической реакции стали использовать клик-реакции, в частности реакцию [3+2] алкил-азидного циклоприсоединения. Для этого животному вводят в качестве экзогенного маркера алкильную (обычно этинильную) группу, которую детектируют затем при помощи флуоресцентно меченного азида. Несмотря на то, что молекулы азида почти 1/500 раз меньше молекулы антител, благодаря чему они имеют гораздо более высокую скорость диффузии внутрь ткани, данный метод для окрашивания цельных образцов биологической ткани до сих пор практически не использовался.
Известен способ клик-гистохимического окрашивания цельных образцов биологической ткани, в котором использовали нефиксированные образцы тонкого кишечника толщиной 1-2 см, для чего у мышей маркировали пролиферирующие клетки внутрибрюшинным введением 100-200 мкг 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU), забирали образцы через 24, 48 или 96 ч после инъекции, отмывали их фосфатным буфером, а затем инкубировали в течение 30 мин в свежеприготовленном растворе, содержащем 100 мМ Tris (pH 8.5), 0.5-1 мМ CuSO4, 100 мкМ азида, конъюгированного с TMR, 50-100 мМ аскорбиновой кислоты, после чего образцы отмывали буфером, фиксировали формальдегидом и несколько раз промывали фосфатным буфером с 0.2% Triton Х-100 [Salic A., Mitchison Т.J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2008. - V. 105. - №7. - Р. 2415-2420].
Однако описанный в данной работе способ применялся к нефиксированным образцам ткани взрослых животных, в то время как фиксированная ткань обладает большей гидрофобностью в сравнение с нефиксированной и, как следствие, худшей проницаемостью для реагентов. Оценка глубины окрашивания не производилась. Реакционная смесь, применяемая в данной работе, не позволяет проводить клик-реакцию в течение длительного времени, необходимого для окрашивания крупных образцов, вследствие быстрого снижения ее реакционной способности.
Известен способ клик-гистохимического окрашивания цельных эмбрионов курицы (до 18 стадии), которых маркировали 500 мкМ - 2 мМ EdU в течение 4 ч, фиксировали в растворе 4% параформальдегида в течение ночи при 4°С, отмывали 3 раза по 3 мин в фосфатном буфере, затем 3 мин в воде, 2 раза по 3 мин в 3% БСА на фосфатном буфере, затем пермеабилизировали в растворе 0.5% Triton Х-100 в течение 20 мин, инкубировали 2 раза по 3 мин 3% БСА на фосфатном буфере при комнтаной температуре, затем проводили клик-реакцию с азидом, конъюгированным с AlexaFluor488 при помощи Click-iT™ Kit (Invitrogen, США) в течение 30 мин в темноте и отмывали в 3% БСА на фосфатном буфере [Warren М., Puskarczyk K., Chapman S.C. Chick embryo proliferation studies using EdU labeling // Dev. Dyn. - 2009. - V. 238. - №4. - P. 944-949].
Однако описанный в данной работе способ применялся к образцам малого размера (толщина до 500 мкм), использовались эмбрионы, а не ткани взрослых животных, в то время как использование гистохимических техник в зрелой ткани, в особенности в нервной системе, в отличие от эмбриональной ткани, сильно затруднено вследствие ее высокой гидрофобности. Образцы эмбрионов старше 72 ч прокрашивались не полностью. Реакционная смесь, применяемая в данной работе, не позволяет проводить клик-реакцию в течение длительного времени, необходимого для окрашивания крупных образцов, вследствие быстрого снижения ее реакционной способности.
Известен способ клик-гистохимического окрашивания цельных хрусталиков взрослых мышей, в котором у мышей маркировали пролиферирующие клетки внутрибрюшинным введением 100-200 мкг EdU за 1 ч до декапитации, изолированные хрусталики фиксировали 10% нейтральным формалином при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего отмывали и пермеабилизировали образцы в растворе 0.5% Triton-X100 на фосфатном буфере в течение 1 ч, а затем проводили клик-реакцию с азидом, конъюгированным с AlexaFluor488 при помощи Click-iT™ Kit (Invitrogen, США) в течение 1 ч в темноте, по окончанию окраски хрусталики отмывали фосфатным буфером с 0.03% азидом натрия в течение 1 ч при 4°С [Wiley L.A., Shui Y.B., Beebe D.C. Visualizing lens epithelial cell proliferation in whole lenses // Mol. Vis. - 2010. - V. 16. - Р. 1253-1259].
Описанный в данной работе способ применялся к небольшим образцам ткани взрослых животных размером до 2 мм, при этом пролиферирующие клетки располагались у поверхности образца, вследствие чего невозможно оценить глубину окрашивания образцов. Реакционная смесь, применяемая в данной работе, не позволяет проводить клик-реакцию в течение длительного времени, необходимого для окрашивания крупных образцов, вследствие быстрого снижения ее реакционной способности.
Техническим результатом предлагаемой группы изобретений является окрашивание методом клик-гистохимии препаратов цельных биологических тканей и органов (в частности, мозга) животных разного возраста толщиной не менее 10 мм с сохранением морфологии образцов, возможностью проведения детализированного качественного и количественного трехмерного анализа выявленных меток за счет высокого соотношения фон - сигнал, а также короткой продолжительностью процесса, в сравнении с иммуногистохимическим окрашиванием.
Указанный технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии, включающем фиксацию ткани раствором параформальдегида, постфиксацию, дегидратацию в метаноле, регидратацию в растворах метанола, отмывку фосфатным буфером, инкубацию в растворе для клик-реакции, удаление ионов меди, отмывку, дегидратацию, просветление в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1, постфиксацию сначала проводят 1-4%-ным параформальдегидом в течение 24 ч при 4°С, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°С, после этого образец ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол:диметилсульфоксид:30%Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, затем отмывают 3 раза по 1-2 ч в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°С, после чего регидратируют последовательно в 50, 25 и 12.5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем образцы отмывают от метанола сначала фосфатным буфером в течение 1-2 ч при комнатной температуре, а затем дважды в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре, после этого проводят клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0.2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере в течение 4-18 ч при комнатной температуре и в темноте, после клик-реакции ионы Cu (II) удаляют, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0,1М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, после чего образцы отмывают в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляют в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, способ окрашивания, начиная с операции постфиксации, проводят при постоянном помешивании.
Указанный технический результат достигается также тем, что ткань фиксируют методом транскардиальной перфузии 1-4% раствором параформальдегида, охлажденным до 4-10°С.
Указанный технический результат достигается также тем, что ткань фиксируют методом погружения образца в 1-4% раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°С.
Указанный технический результат достигается также тем, что дегидратированные образцы до окрашивания накапливают и хранят в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°С.
Указанный технический результат достигается также тем, что окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 75, 96%-ных растворах этанола по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 60-90 мин, а затем помещают в 2-бутоксиэтанол для длительного хранения при 4°С.
Указанный технический результат достигается тем, что предлагаемый способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии, включающий фиксацию ткани раствором параформальдегида, постфиксацию, дегидратацию в метаноле, регидратацию в растворах метанола, пермеабилизацию, отмывку фосфатным буфером, инкубацию в растворе для клик-реакции, удаление ионов меди, отмывку, дегидратацию, просветление в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1, отличается тем, что постфиксацию сначала проводят 1-4%-ным параформальдегидом в течение 24 ч при 4°С, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°С, после этого образец ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол:диметилсульфоксид:30%Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, затем отмывают 3 раза по 1-2 ч в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°С, после чего регидратируют последовательно в 50, 25 и 12.5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем образцы трижды отмывают от метанола фосфатным буфером, причем два раза отмывают по 1-2 ч при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°С, последующую пермеабилизацию образца проводят в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный сапонин, 5%-ный диметилсульфоксид, в течение 1 ч при 37°С, затем образец отмывают дважды в фосфатном буфере, содержащем 0.01% %-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре, после этого проводят клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0,2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере в течение 4-18 ч при комнатной температуре и в темноте, после клик-реакции ионы Сu (II) удаляют, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0.1М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, после чего образцы отмывают в фосфатном буфере, содержащем 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляют в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, способ окрашивания, начиная с операции постфиксации, проводят при постоянном помешивании.
Указанный технический результат достигается также тем, что ткань фиксируют методом транскардиальной перфузии 1-4% раствором параформальдегида, охлажденным до 4-10°С.
Указанный технический результат достигается также тем, что ткань фиксируют методом погружения образца в 1-4% раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°С.
Указанный технический результат достигается также тем, что дегидратированные образцы до окрашивания накапливают и хранят в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°С.
Указанный технический результат достигается также тем, что окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 75, 96%-ных растворах этанола по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 60-90 мин, а затем помещают в 2-бутоксиэтанол для длительного хранения при 4°С.
Сущность настоящей группы изобретений поясняется иллюстративным материалом в виде микрофотографий окрашенных по способу образцов биологической ткани на фиг. 1-2, где:
на фиг. 1 - слева представлено изображение среза мозга взрослой мыши (возраст 2 мес) с пролиферирующими клетками, выявленными с помощью заявленного способа окрашивания методом клик-гистохимии цельного мозга, и демонстрирующее полное его прокрашивание; справа представлено трехмерное изображение гиппокампа взрослой мыши в возрасте 2 мес, окрашенного заявленным способом, и увеличенный фрагмент гранулярного слоя зубчатой фасции гиппокампа с флуоресцентно меченными ядрами пролиферирующих клеток, визуализация осуществлена при помощи сканирующей конфокальной микроскопии.
на фиг. 2 - представлено трехмерное изображение цельного мозга новорожденной мыши в возрасте 9 сут, окрашенное заявленным способом, справа представлен оптический срез этого образца, демонстрирующий полное его прокрашивание, визуализация осуществлена при помощи светоплоскостной микроскопии.
Первый вариант заявленного способа иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологических тканей осуществляют следующим образом. Образцы биологической ткани (мозг новорожденных и молодых мышей, другие легкоразрушающиеся ткани) фиксируют методом транскардиальной перфузии 1-4%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при рН7.4, охлажденным до 4-10°С. Далее все операции проводят при постоянном помешивании. Образцы постфиксируют сначала 1-4%-ным параформальдегидом в течение 24 ч при 4°С, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида (ДМСО) в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°С. Ткань также можно фиксировать методом погружения образца в 1-4% раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°С, а затем постфиксировать в растворе 20%-ного ДМСО в 100%-ном метаноле, как описано выше.
Фиксированные образцы ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол : ДМСО : 30% Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, после чего их отмывают 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°С. На этом этапе дегидратированные образцы можно накапливать и хранить длительное время в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°С. Далее дегидратированные препараты регидратируют последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, а затем образцы отмывают от метанола сначала фосфатным буфером в течение 1-2 ч при комнатной температуре, а затем дважды в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре. После этого проводят клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0.2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере в течение 4-18 ч при комнатной температуре и в темноте (время инкубации подбирается в зависимости от размера образца, чем крупнее образец - тем дольше инкубация).
После клик-реакции ионы Сu (II) удаляют, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0,1М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. После этого образцы отмывают в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляют в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. Окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 75, 96%-ных растворах этанола по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 60-90 мин, а затем помещают в 2-бутоксиэтанол для длительного хранения при 4°С.
Второй вариант заявленного способа иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологических тканей осуществляют следующим образом. Образцы биологической ткани (образцы мозга взрослых животных) фиксируют методом транскардиальной перфузии 1-4%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при рН7.4, охлажденным до 4-10°С. Далее все операции проводят при постоянном помешивании. Образцы постфиксируют сначала 1-4%-ным параформальдегидом в течение 24 ч при 4°С, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида (ДМСО) в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°С. Ткань также можно фиксировать методом погружения образца в 1-4% раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°С, а затем постфиксировать в растворе 20%-ного ДМСО в 100%-ном метаноле, как описано выше.
Фиксированные образцы ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол : ДМСО : 30% Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, после чего их отмывают 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°С. На этом этапе дегидратированные образцы можно накапливать и хранить длительное время в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70...-80°С. Далее дегидратированные препараты регидратируют последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, а затем образцы отмывают от метанола сначала фосфатным буфером в течение 1-2 ч при комнатной температуре, а затем дважды в фосфатном буфере, содержащем 0,01% %-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре.
Далее осуществляют пермеабилизацию образца в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный сапонин, 5%-ный диметилсульфоксид, в течение 1 ч при 37°С, после чего образец отмывают дважды в фосфатном буфере, содержащем 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре. После этого проводят клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0.2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере в течение 4-18 ч при комнатной температуре и в темноте (время инкубации подбирается в зависимости от размера образца, чем крупнее образец - тем дольше инкубация). После клик-реакции ионы Cu (II) удаляют, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0,1М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. После этого образцы отмывают в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляют в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. Окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 75, 96%-ных растворах этанола по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 60-90 мин, а затем помещают в 2-бутоксиэтанол для длительного хранения при 4°С.
Ниже приведены конкретные примеры реализации заявленных способов:
Пример 1.
Окрашивали образцы целого головного мозга новорожденных мышей линии NestinCFPnuc в возрасте 9-и постнатальных суток. Мышатам вводили подкожно 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU) в дозе 123 мкг на кг веса за 2 ч до декапитации. Мозг извлекали и фиксировали методом погружения образца в 1% раствор параформальдегида в течение 48 ч при 4°С. Далее все операции проводили при помешивании. После трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре образцы постфиксировали в растворе 20%-ного ДМСО в 100%-ном метаноле в течение 2 ч при температуре 4°С. Фиксированные препараты мозга отбеливали в растворе, содержащем 100%-ный метанол : ДМСО : 30% Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, после чего их отмывали 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживали не менее чем на 1 час при -80°С.
Далее препараты регидратировали последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 90 мин в каждом при комнатной температуре, а затем образцы отмывали от метанола сначала фосфатным буфером в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем дважды в фосфатном буфере, содержащем 0,01% %-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 2 ч при комнатной температуре. Последнюю отмывку делали в течение ночи. Далее осуществляли клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0.2% сапонина, 10 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере при комнатной температуре и в темноте в течение 18 ч. После клик-реакции ионы Сu (II) удаляли, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0,1М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. После этого образцы отмывали в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляли в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. Окрашенные препараты дофиксировали 4%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при рН7.4 в течение ночи при 4°С и отмывали в фосфатном буфере сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре.
Окрашенные образцы мозга дегидратировали последовательно в 50, 96%-ных растворах этанола в фосфатном буфере по 60 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживали сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2 раза по 60 мин, а затем в 2-бутоксиэтаноле при 4°С в течение 18 ч. На этом этапе окрашенные образцы ткани хранили в 2-бутоксиэтаноле при 4°С. Дегидратированные образцы просветляли при комнатной температуре в течение ночи в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1. Съемку препаратов проводили на светоплоскостном микроскопе, построение трехмерных реконструкций окрашенных образцов осуществляли в Imaris 6.0 (Bitplane AG, Швейцария).
В препаратах, окрашенных по заявленному способу, отчетливо видны ядра пролиферирующих клеток, включивших во время S-фазы клеточного цикла синтетический аналог тимидина - 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU), в структурах с активным нейрогенезом - в обонятельной луковице, субвентрикулярной зоне, ростральном миграционном пути и в субгранулярной зоне зубчатой фасции гиппокампа, мозжечке, а также в ряде других структур (Фиг. 1). Препараты целого новорожденного мозга прокрашены целиком, без затухающего градиента (Фиг. 1, справа). После просветления в растворе Мюррея не наблюдаются потери флуоресцентного сигнала, ядерное разрешение наблюдается по всей глубине образца (Фиг. 1, справа). В окрашенных образцах достигается высокое соотношение сигнал : фон, что делает принципиально возможным осуществление автоматизированного количественного и качественного анализа.
Пример 2.
Окрашивали образцы целого полушария головного мозга и изолированного гиппокампа взрослых мышей линии NestinCFPnuc в возрасте около 60-х постнатальных суток. Мышам вводили внутрибрюшинно 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU) в дозе 123 мкг на кг веса за 2 ч до декапитации. Проводили транскардиальную перфузию сначала 0.1М фосфатным буфером при рН 7.4 в объеме 30 мл, а затем охлажденным до 10°С 1%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при рН 7.4, также в объеме 30 мл. После этого извлекали головной мозг и постфиксировали его 1%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при 4°С в течение 48 ч. После этого мозг либо разрезался пополам, либо из него извлекали гиппокамп. Далее все операции проводили при помешивании. После трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре образцы постфиксировали в растворе 20%-ного ДМСО в 100%-ном метаноле в течение 2 ч при температуре 4°С. Фиксированные препараты отбеливали в растворе, содержащем 100%-ный метанол:ДМСО: 30% Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, после чего их отмывали 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживали не менее чем на 1 час при -80°С.
Далее дегидратированные полушария и гиппокампы регидратировали последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 90 мин в каждом при комнатной температуре, а затем образцы отмывали от метанола сначала фосфатным буфером в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем дважды в фосфатном буфере, содержащем 0,01% %-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 2 ч при комнатной температуре. Последнюю отмывку делали в течение ночи. Далее осуществляли пермеабилизацию образца в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный сапонин, 5%-ный диметилсульфоксид, в течение 1 ч при 37°С, после чего образцы отмывали дважды в фосфатном буфере, содержащем 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 2 ч при комнатной температуре. После этого проводили клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton X-100, 0.2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере при комнатной температуре и в темноте в течение 4 ч (изолированные гиппокампы) или 18 ч (целые полушария).
После клик-реакции ионы Сu (II) удаляли, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0,1М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. После этого образцы отмывали в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляли в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре. Окрашенные препараты дофиксировали 4%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при рН 7.4 в течение ночи при 4°С и отмывали в фосфатном буфере сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре.
Из окрашенных целиком полушарий мозга при помощи вибратома изготавливали срезы толщиной 50 мкм, помещали их на предметные стекла и покрывали средой Fluoromount (Sigma, США). Окрашенные препараты изолированных гиппокампов дегидратировали последовательно в 50, 96%-ных растворах этанола в фосфатном буфере по 60 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживали сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2 раза по 60 мин, а затем в 2-бутоксиэтаноле при 4°С в течение 18 ч. На этом этапе окрашенные образцы ткани хранили в 2-бутоксиэтаноле при 4°С. Дегидратированные образцы просветляли при комнатной температуре в течение 4 ч в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1. Анализ и съемку образцов осуществляли с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Olympus FluoView 1000, Япония). Послойное панорамное сшивание и построение трехмерных реконструкций окрашенных гиппокампов осуществляли в Imaris 6.0 (Bitplane AG, Швейцария).
В препаратах, окрашенных по заявленному способу, отчетливо видны ядра пролиферирующих клеток, включивших во время S-фазы клеточного цикла синтетический аналог тимидина - 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU), в нейрогенных структурах зрелого мозга - в обонятельной луковице, субвентрикулярной зоне, ростральном миграционном пути и в субгранулярной зоне зубчатой фасции гиппокампа (Фиг. 2). Препараты целого мозга прокрашены целиком, без затухающего градиента (Фиг. 2, слева). После просветления в растворе Мюррея не наблюдаются потери флуоресцентного сигнала, ядерное разрешение наблюдается по всей глубине образца (Фиг. 2, справа). В окрашенных образцах достигается высокое соотношение сигнал:фон, что делает принципиально возможным осуществление количественного анализа как на отдельных гиппокампах, так и в целиком окрашенных полушариях.
Предлагаемые варианты способа окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии позволяют окрашивать препараты образцов биологических тканей молодых и взрослых животных целиком, без предварительного секционирования. Использование предлагаемых способов окрашивания позволяет сохранять морфологию образцов и высокоспецифично выявлять этинильную группу даже в толще крупных препаратов (не менее 5 мм) биологической ткани. Продолжительность окрашивания с помощью предлагаемого способа составляет от 4 до 6 суток, однако значительно облегчает и ускоряет процесс визуализации и анализа препаратов за счет использования методов трехмерной микроскопии и томографии.
Препараты образцов, окрашенные предлагаемыми способами, обладают высоким соотношением сигнал : фон и специфичностью окраски, что позволяет использовать их для проведения автоматизированного количественного и качественного анализа выявленных меток.
Claims (10)
1. Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии, включающий фиксацию ткани раствором параформальдегида, постфиксацию, дегидратацию в метаноле, регидратацию в растворах метанола, отмывку фосфатным буфером, инкубацию в растворе для клик-реакции, удаление ионов меди, отмывку, дегидратацию, просветление в смеси бензил бензоата : бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1, отличающийся тем, что постфиксацию сначала проводят 1-4%-ным параформальдегидом в течение 24 ч при 4°C, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°C, после этого образец ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол : диметилсульфоксид : 30% Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, затем отмывают 3 раза по 1-2 ч в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°C, после чего регидратируют последовательно в 50, 25 и 12.5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем образцы отмывают от метанола сначала фосфатным буфером в течение 1-2 ч при комнатной температуре, а затем дважды в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре, после этого проводят клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0.2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере в течение 4-18 ч при комнатной температуре и в темноте, после клик-реакции ионы Cu(II) удаляют, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0,1 М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, после чего образцы отмывают в фосфатном буфере, содержащем 0,01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляют в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, способ окрашивания, начиная с операции постфиксации, проводят при постоянном помешивании.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ткань фиксируют методом транскардиальной перфузии 1-4%-ным раствором параформальдегида, охлажденным до 4-10°C.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ткань фиксируют методом погружения образца в 1-4%-ный раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°C.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дегидратированные образцы до окрашивания накапливают и хранят в 100%-ном метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°C.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 75, 96%-ных растворах этанола по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 60-90 мин, а затем помещают в 2-бутоксиэтанол для длительного хранения при 4°C.
6. Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии, включающий фиксацию ткани раствором параформальдегида, постфиксацию, дегидратацию в метаноле, регидратацию в растворах метанола, пермеабилизацию, отмывку фосфатным буфером, инкубацию в растворе для клик-реакции, удаление ионов меди, отмывку, дегидратацию, просветление в смеси бензил бензоата : бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1, отличающийся тем, что постфиксацию сначала проводят 1-4%-ным параформальдегидом в течение 24 ч при 4°C, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°C, после этого образец ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол : диметилсульфоксид : 30% H2O2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, затем отмывают 3 раза по 1-2 ч в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°C, после чего регидратируют последовательно в 50, 25 и 12.5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем образцы трижды отмывают от метанола фосфатным буфером, причем два раза отмывают по 1-2 ч при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C, последующую пермеабилизацию образца проводят в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный сапонин, 5%-ный диметилсульфоксид, в течение 1 ч при 37°C, затем образец отмывают дважды в фосфатном буфере, содержащем 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид по 1-2 ч при комнатной температуре, после этого проводят клик-реакцию в реакционном растворе, содержащем 5% диметилсульфоксид, 0.01% Triton Х-100, 0,2% сапонина, 10-20 мМ меченого азида, 6 мМ CuSO4, 120 мМ аскорбата натрия в фосфатном буфере в течение 4-18 ч при комнатной температуре и в темноте, после клик-реакции ионы Cu(II) удаляют, отмывая образцы в фосфатном буфере, содержащем 0.1 М ЭДТА (рН 8.0), 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, после чего образцы отмывают в фосфатном буфере, содержащем 0.01%-ный Triton Х-100 и 5% диметилсульфоксид сначала 2 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, итоговую отмывку осуществляют в фосфатном буфере сначала 3 раза по 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при комнатной температуре, способ окрашивания, начиная с операции постфиксации, проводят при постоянном помешивании.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что ткань фиксируют методом транскардиальной перфузии 1-4%-ным раствором параформальдегида, охлажденным до 4-10°C.
8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что ткань фиксируют методом погружения образца в 1-4%-ный раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°C.
9. Способ по п. 6, отличающийся тем, что дегидратированные образцы до окрашивания накапливают и хранят в 100%-ном метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°C.
10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 75, 96%-ных растворах этанола по 60-90 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 60-90 мин, а затем помещают в 2-бутоксиэтанол для длительного хранения при 4°C.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016101277A RU2620559C1 (ru) | 2016-01-18 | 2016-01-18 | Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии (варианты) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016101277A RU2620559C1 (ru) | 2016-01-18 | 2016-01-18 | Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии (варианты) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2620559C1 true RU2620559C1 (ru) | 2017-05-26 |
Family
ID=58882625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016101277A RU2620559C1 (ru) | 2016-01-18 | 2016-01-18 | Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии (варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2620559C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111024935A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-17 | 苏州大学 | 一种斑马鱼胚胎心脏免疫荧光标记法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4117832A1 (de) * | 1991-05-29 | 1992-12-03 | Medite Ges Fuer Medizintechnik | Trog fuer behandlungsstationen einer vorrichtung zur faerbung von auf objekttraegern in objekttraegerhaltern angeordneten histologischen praeparaten |
| RU2033610C1 (ru) * | 1991-07-01 | 1995-04-20 | Институт зоологии им.И.И.Шмальгаузена АН Украины | Способ окраски хрящевой и костной ткани |
| US5601650A (en) * | 1991-05-29 | 1997-02-11 | Medite Gesellschaft Fur Medizintechnik Mbh | Process and device for dyeing histological preparations arranged on microscope slides |
| RU2172138C2 (ru) * | 1999-07-15 | 2001-08-20 | Нижегородский государственный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии | Способ приготовления цитологического препарата по в.г. воробьеву |
| RU2202776C2 (ru) * | 2000-09-22 | 2003-04-20 | Дагестанская государственная медицинская академия | Способ окраски гистологических препаратов |
-
2016
- 2016-01-18 RU RU2016101277A patent/RU2620559C1/ru active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4117832A1 (de) * | 1991-05-29 | 1992-12-03 | Medite Ges Fuer Medizintechnik | Trog fuer behandlungsstationen einer vorrichtung zur faerbung von auf objekttraegern in objekttraegerhaltern angeordneten histologischen praeparaten |
| US5601650A (en) * | 1991-05-29 | 1997-02-11 | Medite Gesellschaft Fur Medizintechnik Mbh | Process and device for dyeing histological preparations arranged on microscope slides |
| RU2033610C1 (ru) * | 1991-07-01 | 1995-04-20 | Институт зоологии им.И.И.Шмальгаузена АН Украины | Способ окраски хрящевой и костной ткани |
| RU2172138C2 (ru) * | 1999-07-15 | 2001-08-20 | Нижегородский государственный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии | Способ приготовления цитологического препарата по в.г. воробьеву |
| RU2202776C2 (ru) * | 2000-09-22 | 2003-04-20 | Дагестанская государственная медицинская академия | Способ окраски гистологических препаратов |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Wiley L.A., Shui Y.B., Beebe D.C. Visualizing lens epithelial cell proliferation in whole lenses // Mol. Vis. 2010. V. 16. р. 1253-1259. * |
| МИХЕЕВ А.Г. ИННОВАЦИОННЫЕ ФИКСАТОРЫ И КРАСИТЕЛИ ДЛЯ МАЗКОВ КРОВИ, КОСТНОГО МОЗГА, ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ И ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ КЕМЕРОВО. 2011. Найдено онлайн: http://www.kemsma.ru/hystology/sample.pdf. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111024935A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-17 | 苏州大学 | 一种斑马鱼胚胎心脏免疫荧光标记法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Small et al. | Visualising the actin cytoskeleton | |
| EP2866017B1 (en) | Method for rendering biological material transparent | |
| Acloque et al. | In situ hybridization analysis of chick embryos in whole‐mount and tissue sections | |
| EP2711682B1 (en) | Clarifying reagent for biological materials and use thereof | |
| CN108061677A (zh) | 用于生物材料的澄清试剂和其用途 | |
| JP2012503475A5 (ru) | ||
| CN105368853A (zh) | 一种与非小细胞肺癌辅助诊断相关的标志物及其应用 | |
| Lecointe et al. | Scleractinian coral cell proliferation is reduced in primary culture of suspended multicellular aggregates compared to polyps | |
| CN112834737A (zh) | 一种用于整体组织样本的精准免疫荧光标记方法 | |
| CN104634626A (zh) | 一种改进的冰冻切片方法及其应用 | |
| RU2620559C1 (ru) | Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии (варианты) | |
| Altman | Neuroanatomical techniques: insect nervous system | |
| Huang et al. | A rapid and sensitive, multiplex, whole mount RNA fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry protocol | |
| CN106918484A (zh) | 一种基于组织切片的三维模型的构建方法 | |
| CN1955738B (zh) | 一种鲆鲽鱼类受精卵微管骨架免疫荧光染色观察方法 | |
| CN111979306B (zh) | 一种适用于荧光成像与转录组测序的组织样本制备方法与试剂盒 | |
| RU2563679C2 (ru) | Способ иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологических тканей (варианты) | |
| EP2686661B1 (en) | Method, composition and kit for visualization and characterization of the nervous system | |
| Qi et al. | Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections | |
| Da Costa et al. | Immunolocalization of AGPs and pectins in Quercus suber gametophytic structures | |
| RU2429462C2 (ru) | Способ оптического просветления образцов биологических тканей | |
| WO2016004563A1 (en) | Aqueous tissue clearing solution and uses thereof | |
| RU2797189C1 (ru) | Способ выявления микротопографии нейронов в центральной нервной системе | |
| CN112924427B (zh) | 一种消除植物组织自体荧光的方法 | |
| Fowler et al. | Live tissue antibody injection: A novel method for imaging ECM in limb buds and other tissues |