JPH11504217A

JPH11504217A - 抗肥満タンパク質を製造する方法

Info

Publication number: JPH11504217A
Application number: JP8532668A
Authority: JP
Inventors: マッケラー，ウォーレン・シー
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1995-04-26
Filing date: 1996-04-24
Publication date: 1999-04-20
Also published as: EP0745610A3; WO1996034111A1; AU5571396A; CA2218880A1; EP0745610A2; US5614379A

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞粘菌、Ｄictyostelium discoideumから単離されるジペプチジルアミノペプチダーゼを使用して、抗肥満タンパク質を製造する新規方法に関する。その方法は、抗肥満タンパク質を高収率で製造する。

Description

【発明の詳細な説明】抗肥満タンパク質を製造する方法本発明は、バイオテクノロジーの分野である。より具体的には、本発明は、粘菌、Ｄictyostelium discoideumから単離されるジペプチジルアミノペプチダーゼを使用して、配列番号１の抗肥満タンパク質を製造する方法に関する。肥満、特に上半身の肥満は、米国において、また世界中で、一般的であって、非常に深刻な公衆衛生問題である。最近の統計によれば、米国の人口の２５％、およびカナダの人口の２７％以上が重量超過である。Ｋuczmarski、Ａmer．Ｊ． of Ｃlin．Ｎut. 、５５：４９５Ｓ−５０２Ｓ（１９９２）；Ｒeederら、Ｃan．Ｍed．Ａss．Ｊ. 、２３：２２６−２３３（１９９２）。上半身の肥満は、II型糖尿病に関して知られている最も強い危険因子であって、心臓血管疾患および癌に関する強い危険因子でもある。肥満の医療費に関する最近の見積もりは、全世界的に１５０,０００,０００,０００ドルである。その問題は、米国社会に蔓延した肥満症の常なる増加と闘うために、外科医長官が主導権をとり始めているほど深刻となっている。この肥満により誘発される病状の多くは、異脂肪症(dyslipidemia)、高血圧症、およびインシュリン抵抗性との強い関連に起因し得る。多くの研究により、食事制限および運動による肥満の減少は、これらの危険因子を著しく減少させることが実証されている。運悪く、これらの処置は、９５％に達する失敗率で殆ど不成功に終わっている。この失敗は、その状態が、食欲の増加、高カロリー食品に対する嗜好、身体活動の減少、および脂質生成代謝の増加に寄与する、遺伝的に受け継がれた因子と強く関連しているという事実によるものであり得る。このことは、これらの遺伝特性を受け継いでいる人々が、その状態と闘おうとする彼らの努力に関係なく、肥満になりやすいことを示す。従って、この肥満症のハンディキャップを矯正することができて、彼らの遺伝性質にもかかわらず、医者が肥満患者を上手く処置することを可能にする薬理学的物質が必要である。 ob／ob マウスは、第６染色体での変異に関連付けられる、常染色体の劣性特性をもたらすことが知られている、肥満および糖尿病のモデルである。最近では、Ｙiying Ｚhangおよび共同研究者らが、この状態と関連付けられたマウス遺伝子の位置クローニングを公表した。Ｙiying Ｚhangら、Ｎature、３７２：４２５−３２（１９９４）。この報告により、脂肪組織において独占的に発現される２１個のアミノ酸のシグナルペプチドをもつ、１６７個のアミノ酸のタンパク質をコードする遺伝子が開示された。ごく最近では、１９９５年２月６日に提出された、Ｂasinskiら、米国特許出願番号第０８／３８３，６３８号において、生物学的に活性な抗肥満タンパク質が開示され、特許請求されている。これらのタンパク質は、配列番号１で開示されている。本発明は、粘菌、Ｄictyostelium discoideumから単離されるジペプチジルアミノペプチダーゼを使用して、配列番号１の抗肥満タンパク質を製造する方法を提供する。Ｄictyostelium discoideumは、一般的に粘菌、またはより具体的には、細胞粘菌と呼ばれる原始真核微生物である。その生物は、土壌および糞の表面上で自然に見い出されている。野生型のアメーバは、自ら細菌全体の摂取(ファゴサイトーシス)により栄養を得る；このため、それらは時に肉食性と呼ばれる。「食用」細菌の共培養なしに増殖することができ、従って、可溶性培地で増殖することができるＤ. discoideumの純増殖変異体が単離されている。ジペプチジルアミノペプチダーゼ(ＤＡＰ)は、最後から２番目のアミノ末端ペプチド結合を加水分解し、ペプチドおよびタンパク質のブロックされていないアミノ末端からジペプチドを放出させる酵素である。現在、４つの群のジペプチジルアミノペプチダーゼ(ＤＡＰ−Ｉ、ＤＡＰ−II、ＤＡＰ−III、およびＤＡＰ− IVと呼ばれる)があり、これらは、それらの物理的特性、およびそれらが様々なアミノ末端ペプチド配列での切断を触媒する速度に基づいて区別される。ＤＡＰ −Ｉは、比較的、非特異的なＤＡＰであり、これは、ペプチドおよびタンパク質のブロックされていないアミノ末端からの、多くのジペプチドの組み合わせの放出を触媒するであろう。出現するジペプチドがＸ−Ｐro、Ａrg−Ｘ、またはＬys −Ｘ（Ｘは、いずれかのアミノ酸である）ならば、ＤＡＰ−Ｉは、活性をほとんど、または全く示さない。ＤＡＰ−IIは、Ａrg−ＸまたはＬys−Ｘ(より低い程度では、Ｘ−Ｐro)で始まる、アミノ末端ジペプチド配列に対して選択性を示す。ＤＡＰ−IIは、大部分の他のジペプチドの組み合わせに対して、著しくより低い切断速度を示す。ＤＡＰ−IIIは、Ａrg−ＡrgおよびＬys−Ｌys型のアミノ末端ジペプチド配列を好む性質を有するらしい。ＤＡＰ−IVは、Ｘ−Ｐro型のジペプチド配列に対して、その最も高い速度の加水分解活性を示す。ＤＡＰ酵素、特にＤＡＰ−ＩおよびＤＡＰ−IVは、タンパク質のプロセッシングにおいて有用であることが示されている。本発明の方法は、別の型のＤＡＰ、細胞粘菌、Ｄictyostelium discoideumから単離されるdＤＡＰを使用する。dＤＡＰを使用して、配列番号１の抗肥満タンパク質を高収率で製造することができる。本発明は、配列番号１のタンパク質を製造する方法であって、配列番号２のタンパクをdＤＡＰと接触させることを含んでなる方法を提供する。本明細書中に開示し、特許請求する本発明の目的のために、次の用語および略号は、以下に定義する通りである。 dＤＡＰ−Ｄictyostelium discoideumから単離されるジペプチジルアミノペプチダーゼ、これは、ＧＦpＮＡを基質としてpＨ約３.５の最適pＨを示し、また分析用超遠心分離により測定して、約２２５,０００ダルトンの天然の分子量を有し、またＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定して、約６６, ０００ダルトンのサブユニット分子量を有する。支持体表面−そのまま使用するか、または容易に誘導体化もしくは活性化して、タンパク質を結合することができる、いずれかの固体、または半固体、またはマトリックス、これは、最小の非特異的な吸着を示し、物理的に、機械的に、および化学的に安定であり、非常に多孔質であって、リガンドの接近可能性を与え、またその表面を劣化することなく、再生することができる。 dＤＡＰベッド(bed)−一重または多重の支持体表面に固定化された、いずれかの量のdＤＡＰ、これは、凝集物体積または固定化されたdＤＡＰの単位を形成する。ＧＦpＮＡ−Ｇly−Ｐhe p−ニトロアニリド。配列番号１とは、配列表に示す配列を言い、また以下の式のタンパク質を意味する。［式中、４の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；７の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；２２の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；２７の位置にあるＸaaは、ＴhrまたはＡlaであり；２８の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ｇluであるか、または存在せず；３４の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；５４の位置にあるＸaaは、Ｍet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal 、Ａla、またはＧlyであり；５６の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；６２の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；６３の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；６８の位置にあるＸaaは、Ｍet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal 、Ａla、またはＧlyであり；７２の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；７５の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；７８の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；８２の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；１００の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ｔrp、Ｔyr、Ｐhe、Ｉle、Ｖal、またはＬ euであり；１０８の位置にあるＸaaは、ＡspまたはＧluであり；１３０の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；１３４の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；１３６の位置にあるＸaaは、Ｍet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖ al、Ａla、またはＧlyであり；１３８の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ｔrp、Ｔyr、Ｐhe、Ｉle、Ｖal、またはＬ euであり；および１３９の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluである］。配列番号２とは、配列表に示す配列を言い、また以下の式のタンパク質を意味する。［式中、２の位置にあるＸaaは、Ｐroを除く、いずれかのアミノ酸であり；６の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；９の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；２４の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；２９の位置にあるＸaaは、ＴhrまたはＡlaであり；３０の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ｇluであるか、または存在せず；３６の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；５６の位置にあるＸaaは、Ｍet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal 、Ａla、またはＧlyであり；５８の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；６４の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；６５の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；７０の位置にあるＸaaは、Ｍet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal 、Ａla、またはＧlyであり；７４の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；７７の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；８０の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；８４の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；１０２の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ｔrp、Ｔyr、Ｐhe、Ｉle、Ｖal、またはＬ euであり；１１０の位置にあるＸaaは、ＡspまたはＧluであり；１３２の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；１３６の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；１３８の位置にあるＸaaは、Ｍet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖ al、Ａla、またはＧlyであり；１４０の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ｔrp、Ｔyr、Ｐhe、Ｉle、Ｖal、またはＬ euであり；および１４１の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluである］。本開示で使用するアミノ酸の略号は全て、３７Ｃ.Ｆ.Ｒ．§１.８２２(ｂ)( ２)（１９９０）に詳述されている、米国特許商標庁により承認された略号である。先に述べたように、本発明は、配列番号１のタンパク質を製造する方法であって、該dＤＡＰの作用がアミノ末端ジペプチドを除去することを可能にするのに十分な条件下、配列番号２のタンパクをdＤＡＰと接触させることを含んでなる方法を提供する。好ましい態様には、２の位置にあるＸaaがＡrg、Ａsp、またはＴyrである、配列番号２のタンパク質が含まれる。他の好ましいタンパク質には、６の位置にあるＸaaがＧlnであり；９の位置にあるＸaaがＧlnであり；２４の位置にあるＸaaがＡsnまたはＡspであり；２９の位置にあるＸaaがＴhrまたはＡlaであり；３０の位置にあるＸaaがＧlnであるか、または存在せず；３６の位置にあるＸaaがＧlnであり；５６の位置にあるＸaaがＭetであり；５８の位置にあるＸaaがＧlnであり；６４の位置にあるＸaaがＧlnであり；６５の位置にあるＸaaがＧlnであり；７０の位置にあるＸaaがＭetであり；７４の位置にあるＸaaがＡsnであり；７７の位置にあるＸaaがＧlnであり；８０の位置にあるＸaaがＡsnであり；８４の位置にあるＸaaがＡsnであり；１０２の位置にあるＸaaがＴrpであり；１１０の位置にあるＸaaがＡspであり；１３２の位置にあるＸaaがＧlnであり；１３６の位置にあるＸaaがＧlnであり；１３８の位置にあるＸaaがＭetであり；１４０の位置にあるＸaaがＴrpであり；および１４１の位置にあるＸaaがＧlnである、配列番号２のタンパク質が含まれる。本発明のdＤＡＰ酵素は、配列番号２のタンパク質を配列番号１のタンパク質に転換させるのに有用である。いずれの酵素反応でも、切断部位が反応を進行させるのに利用できることが重要である。最も意外なことには、配列番号２の抗肥満タンパク質のＮ末端が特に酵素切断を受け易い。従って、本発明の方法は、配列番号１のタンパク質を９０％以上、典型的には、９０−９５％の収率で産生する。さらにまた、ジペプチドを抗肥満タンパク質から除去するための、dＤＡＰ酵素の使用は、dＤＡＰが約２.８の最適pＨを有し、これは、その反応が酸性のpＨ範囲で行われることを可能にするという点で有利である。酸性のpＨ反応の利点は、当業界で認められていて、より低いレベルの鎖内ジスルフィド二量体、または基質のポリマーが生成されて、メチオニン残基の酸化が最小となることを含む。本発明の方法のさらなる利点は、経済的なことである。発酵技術は、より優れた産物の一致性(consistency)と酵素の再現性を可能にするので、動物源からの酵素の商業的産生に頼るよりは、発酵培養から得られた酵素を使用することが、費用の面でより有効である。動物由来の酵素を用いないことは、一定起源の高度に精製されたバルク物質を可能にする。Ｄ. discoideum Ａx３(ＡＴＣＣ２８３６８)の発酵、続いて、遠心分離、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーにより、高度に精製されたdＤＡＰ酵素の溶液を得、これは、保存するか、または直ちに使用することができる。本発明の方法は、広く様々な温度、pＨ範囲、および期間で行うことができる。その反応は、一般に、適当に緩衝化した水性培地で行って、約２.０から約５. ５までのpＨを得て維持する。好ましくは、その培地のpＨは、約２.４から約４. ５、また最も好ましくは、約２.４から約２.８の範囲である。しかし、当業者は、いずれの特異的な反応の最適なpＨも、該タンパク質および酵素の安定性および溶解度といったような因子により決定されるであろうことが分かるであろう。幾つかの場合には、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、グアニジン等といったような可溶化剤を使用することができる。プロセッシング反応は、僅か２秒から数日までの範囲で、いずれかの一定期間行うことが可能である。好ましくは、その反応は、約１分から約２４時間、また最も好ましくは、約１時間から約８時間の間行うことが可能である。当業者は、その反応時間は、使用する個々の条件で変わることが分かるであろう。プロセッシング反応の温度は、約４℃から約４５℃の間である。さらに好ましくは、その反応温度は、約２０℃から約３７℃の間であって、最も好ましくは、その反応は、約２５℃から約３７℃の間で起こる。広範囲にわたる緩衝物質のいずれもを使用することができ、唯一必要なのは、望ましい範囲内にpＨを維持する、それらの能力である。典型的な緩衝物質の例は、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グリシン等である。好ましい緩衝物質は、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびグリシンである。先の方法はまた、dＤＡＰを支持体表面上に固定化することにより行うこともできる。固体の支持体表面には、多孔質シリカ、調節された(controlled)細孔ガラス、およびヒドロキシアパタイトといったような無機物質が含まれ得る。ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、およびポリスチレンといったような合成有機ポリマーもまた、例示的な支持体表面である。加えて、セルロース、デキストラン、セファデックス(商標)、セファロース(商標)、およびアガロースといったような多糖は、さらに例示的な支持体表面の例である。膜およびフィルターといったような他の支持体表面もまた、実施可能である。商業的に入手可能な膜の例は、Ａcti−Ｍod(商標)第四級アミンモジュール(ＦＭＣＢioＰroducts)である。好ましい支持体表面は、その表面に一度結合したdＤＡＰに悪影響を及ぼさない支持体表面である。様々な大きさのビーズに形成された、商業的に入手可能な多糖マトリックスは、多孔質であり、取り扱いが容易であり、また生化学的精製技術において十分知られ、かつ理解されていることから、さらに好ましい。より高度に好ましい支持体表面は、商業的に入手可能な陰イオン交換樹脂である。最も好ましい支持体表面は、Ｑセファロース(商標)樹脂(Ｐharmacia)である。Ａf finity Ｃhromatography Ｐrinciples ＆Ｍethods 、Ｐharmacia Ｆine Ｃhemic als（１９８３）；Ｂiotechnology Ｐroducts Ｃatalog １９９３、Ｐharmacia Ｂiotech Ｉnc.、８００Ｃentennial Ａve.、Ｐiscataway、ＮＪ０８８５４を参照。酵素の固定化は、大底は通常、酵素への樹脂の共有結合を可能にする官能基が含まれるよう、修飾または活性化されている固体の支持体、一般にクロマトグラフィー樹脂を使用して成し遂げられる。典型的には、脂肪族リンカーアームを使用する。商業的に入手可能な共有結合固定化樹脂の例は、活性化ＣＨセファロース(商標)４Ｂ(Ｐharmacia)である。多くのタイプの化学作用の１つは、Ｐharm aciaがセファロース(商標)４Ｂ塩基マトリックスに結合することである。通例、活性化された樹脂は、同じ塩基マトリックスの陰イオン交換樹脂以上に著しく費用がかかり、イオン交換クロマトグラフ媒体のように広範囲にわたる様々な塩基マトリックスタイプを入手することは不可能であり、従って、低い清澄度(cla rity)のカラム充填または高い移動相の流速を取り扱う、それらの能力において、さらに限定され得る。 dＤＡＰ酵素はまた、例えば、イオンまたは疎水性機構によって、固体の支持体表面に非共有結合することもできる。多くの様々なイオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は、活性化された共有結合固定化樹脂より安い費用で、多数の販売元から入手可能である。先の論議は、本発明の範囲を何ら限定しようとするものではない。当業者は、タンパク質を支持体表面に結合する多数の他のスキームを知っているであろう。そのうえ、支持体表面の選択、およびdＤＡＰを固定化する方法は、主として、便利性の問題であって、様々な支持体表面に関する専門家の知識と好み、さらにはまた、様々な固定化スキームに対する専門家の好み、および基質の知識に依存する。 dＤＡＰが支持体表面上に一度固定化されたら、処理された配列番号１のポリペプチドへの、配列番号２のタンパク質の転換は、先に記載した様々な適当な条件下に成し遂げることができる。好ましい方法は、基質が固定化された酵素表面上を通過して、反応を進行させることができるよう、クロマトグラフィーカラムを固定化されたdＤＡＰで充填することである。酵素が支持体表面に結合したままであることから、物理的に反応混合物の一部とはならず、従って、その後の再生使用に利用できる。接触工程を１回またはそれ以上繰り返して、タンパク質の完全なプロセッシングを確実なものとするのが好ましい。従って、その反応物／生成物の流れを同じ dＤＡＰベッド上に１回またはそれ以上再循環させても、または連続的に別々のd ＤＡＰベッド上を通過させてもよい。配列番号２のタンパク質は、組換えＤＮＡ技術、または溶液もしくは固相ペプチド合成といったような周知の化学的方法、または従来の溶液法によって結合させたタンパク質フラグメントで始まる、溶液中での半合成のいずれかにより産生することができる。高収率が望まれるならば、組換え法が好ましい。タンパク質の組換え産生における基本的な工程には、ａ）そのタンパク質をコードする合成または半合成(または天然源からの単離) ＤＮＡの構築、ｂ）タンパク質の発現に適当な方法で、そのコード配列を単独で、または融合タンパク質として発現ベクターに組込むこと、ｃ）適当な真核または原核宿主細胞を発現ベクターで形質転換すること、およびｄ）組換え的に産生したタンパク質を回収して精製することが含まれる。インビトロまたはインビボにおける、その転写および翻訳がタンパク質の産生をもたらすであろう合成遺伝子は、当業界で周知の技術により構築することができる。当業者は、遺伝コードの天然の縮重のために、該タンパク質をコードする、相当な大きさの、さらに限定された数のＤＮＡ配列を構築することができることが分かるであろう。ＤＮＡにおいて予め決められた部位で置換変異を引き起こす技術、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発は、十分知られている。本発明の抗肥満タンパク質をコードするＤＮＡにおいて引き起こされ得る変異は、その配列をリーディングフレームの外に配置してはならず、第二mＲＮＡの構造をもたらすことができる相補的領域を作り出さないのが好ましいであろう。ＤeＢoerら、欧州特許第７５,４４４Ａ号（１９８３）を参照。合成遺伝子の構築方法は、当業界で十分知られている。例えば、Ｂrownら（１９７９）、Ｍethods in Ｅnzymology、Ａcademic Ｐress、Ｎ.Ｙ.、第６８巻、１０９−１５１頁を参照。合成タンパク質遺伝子に対応するＤＮＡ配列は、Ａpp lied Ｂiosystems ３８０Ａ型または３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置(Ａpplied Ｂio systems,Ｉnc.、８５０Ｌincoln Ｃenter Ｄrive、Ｆoster Ｃity、ＣＡ９４４０４から商業的に入手可能である)のような、従来のＤＮＡ合成装置を使用して作り出すことができる。タンパク質をコードする遺伝子はまた、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を使用することにより作り出すこともできる。その鋳型は、cＤＮＡライブラリー(ＣＬＯＮＥＴＥＣＨまたはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥから商業的に入手可能である)、またはヒト脂肪組織から単離されたmＲＮＡであり得る。そのような方法は、当業界のＭaniatisら、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpr ing Ｈarbor Ｐress、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory、Ｃold Ｓpring Ｈa rbor、Ｎew Ｙork（１９８９）で十分知られている。所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクターの構築は、標準的なライゲーション技術を使用する。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを切断し、適合させ(tailored)、所望の形に再びライゲートして、必要とされるプラスミドを形成する。所望のタンパク質の翻訳を行うために、操作された合成ＤＮＡ配列を、適当な制限エンドヌクレアーゼの使用によって、過剰の適当な組換えＤＮＡ発現ベクターのいずれかに挿入する。合成コード配列は、これらの発現並びに増幅並びに発現プラスミドからの単離、およびこれらへの組込みを促進するために、制限エンドヌクレアーゼの切断部位を転写物のどちらかの末端に有するよう設計されている。当業界で十分知られている技術により、所望のクローニングベクターへの、この配列の組込みを促進するために、単離されたcＤＮＡコード配列を、合成リンカーの使用により容易に修飾することができる。使用する個々のエンドヌクレアーゼは、使用すべき親発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断パターンにより指示されるであろう。制限部位の選択は、正しい枠内での読み取りとタンパク質の発現を達成するために、制御配列をもつコード配列が正しく方向付けされるよう選択される。通例、宿主細胞と適合する種から誘導された、プロモーターおよび制御配列を含むプラスミドベクターを、これらの宿主と共に使用する。そのベクターは、普通、複製部位、および形質転換された細胞において表現型の選択を与えることができるマーカー配列を有する。例えば、Ｅ. coliは、典型的には、pＢＲ３２２、Ｅ. coli種から誘導されたプラスミドを使用して形質転換される(Ｂolivarら、Ｇene ２：９５（１９７７））。プラスミドpＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を含み、従って、形質転換された細胞を同定する容易な方法を与える。そのpＢＲ３２２プラスミド、または他の微生物プラスミドもまた、プロモーター、および組換えＤＮＡ技術で一般的に使用される他の調節要素を含まなければならず、またはそれらを含むよう修飾しなければならない。所望のコード配列を、プロモーターおよびリボソーム結合部位から転写されるよう正しい方向で発現ベクターに挿入するが、これらは両方とも、タンパク質が発現されるべき宿主細胞において機能的でなければならない。そのような発現ベクターの一例は、Ｂelagajeら、米国特許第５,３０４,４９３号（この教示は、本明細書の一部を構成する）に記載されているプラスミドである。米国特許第５ ,３０４,４９３号に記載されているＡ−Ｃ−Ｂプロインシュリンをコードする遺伝子は、制限酵素ＮdeＩおよびＢamＨＩを用いて、プラスミド pＲＢ１８２から除去することができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子を、ＮdeＩおよびＢamＨＩ制限フラグメントカセット上でプラスミド骨格に挿入することができる。通例、本発明において有用なベクターを構築する際のＤＮＡ配列のクローニングには、原核生物を使用する。例えば、Ｅ. coli Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣ第３１４４６号)が特に有用である。使用することができる他の微生物株には、Ｅ. coli ＢおよびＥ. coli Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ第３１５３７号)が含まれる。これらの例は、限定するというよりはむしろ、例示的なものである。原核生物をまた、発現にも使用する。前述の株、さらにはまた、Ｅ. coli Ｗ３１１０(原栄養体、ＡＴＣＣ第２７３２５号)、Ｂacillus subtilisのようなバチルス属の細菌、並びにＳalmonella typhimuriumまたはＳerratia marcescens といったような他の腸内細菌科、および様々なシュードモナス種属を使用することができる。原核宿主での使用に適当なプロモーターには、β−ラクタマーゼ( ベクター pＧＸ２９０７［ＡＴＣＣ３９３４４］は、レプリコン並びにβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む)、およびラクトースプロモーターシステム(Ｃhangら、Ｎature 、２７５：６１５（１９７８）；並びにＧoeddelら、Ｎature、２８１：５４４（１９７９）)、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーターシステム(ベクター pＡＴＨ１［ＡＴＣＣ３７６９５］は、trpプロモーターの調節下、trpＥ融合タンパク質としてのオープンリーディングフレームの発現を促進するよう設計されている)、およびtac プロモーター(プラスミド pＤＲ５４０、ＡＴＣＣ３７２８２から単離できる)のようなハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、そのヌクレオチド配列が一般に知られている他の機能性細菌プロモーターにより、当業者は、リンカーまたはアダプターを使用し、それらを、そのタンパク質をコードするＤＮＡにライゲートし、いずれかの必要とされる制限部位を与えることができる。細菌システムで使用するためのプロモーターはまた、タンパク質をコードするＤＮＡに機能的に結合させたＳhine−Ｄal garno配列も含むであろう。次の製造例および実施例を提示して、本発明をさらに説明する。本発明の範囲は、単に次の製造例および実施例のみからなるものと解釈されるべきものではない。製造例１標準的なＰＣＲ法を使用して、次のタンパク質配列をコードするＤＮＡ配列：を得る。前方プライマー(５'−ＧＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＧＧＧＴＡＣＣＴＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＡＣＡＣ)および逆プライマー(５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＧＣＡＣＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴ)を使用して、ヒト脂肪細胞ライブラリー(ＣＬＯＮＥＴＥＣＨから商業的に入手可能である)から得られた配列を増幅する。そのＰＣＲ産物をＰＣＲ−Ｓcript(ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥから入手可能である)にクローン化して、配列決定する。製造例２製造例１のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを、ＮdeＩおよびＢamＨＩ制限部位が含まれるよう構築する。クローン化されたＰＣＲ産物を有するプラスミドを、ＮdeＩおよびＢamＨＩ制限酵素で消化する。小さな〜４５０bpのフラグメントをゲル精製し、Ａ−Ｃ−Ｂプロインシュリンに対するコード配列を欠失させたベクター pＲＢ１８２にライゲートさせる。そのライゲーション産物をＥ. coli ＤＨ１０Ｂ(ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから商業的に入手可能である)に形質転換させて、１０mg／mlのテトラサイクリンを補ったトリプトン−酵母(ＤＩＦＣＯ)プレート上で増殖したコロニーを分析する。プラスミドＤＮＡを単離し、ＮdeＩおよびＢamＨＩで消化して、その結果得られたフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離する。予期される〜４５０bpのＮdeＩ〜Ｂ am ＨＩのフラグメントを含むプラスミドを保持する。Ｅ. coli ＢＢＬ２１(ＤＥ３)(ＮＯＶＯＧＥＮから商業的に入手可能である)を、タンパク質産生のための培養に適当な、この第二プラスミド発現で形質転換させる。製造例３Ｄictyostelium discoideumの発酵Ｄictyostelium discoideum Ａx３の凍結乾燥させた培養物を、受託番号ＡＴＣＣ２８３６８の下に寄託されている、Ｒockville、ＭarylandのＡmerican Ｔ ype Ｃulture Ｃollectionから得て、Ｄifco Ｙeast 抽出物(７.１５)、Ｄifco Ｂacto ペプトン(１４.３)、Ｎa₂ＨＰＯ₄(０.５１)、およびＫＨ₂ＰＯ₄(０.４９ )：(ｇ／Ｌ)から成る、緩衝化した酵母抽出物−ペプトン培地を含む寒天プレート(１.２％Ｄifco Ｂacto 寒天)上に幾つかの密度でプレートし、分離滅菌後、これに、グルコース(最終１０ｇ／Ｌ)を無菌的に加えて、これをＮaＯＨまたはＨ₂ＳＯ₄で最終pＨ６.５(＋／−０.１)に調節した。これと同じ培地(寒天を含まない)を約１リットル未満の体積での液体培養増殖に使用した。その寒天プレートを２１℃〜２４℃で３〜５日インキュベートした。Ａx３培養で凍結乾燥させた「食用細菌」を拾い上げないように注意しながら、そのプレートから胞子袋 (Ｓpore sacks)を収集した後、緩衝化した酵母抽出物−ペプトンブロス３mlに播種して、穏やかに振盪しながら、２１−２４℃でインキュベートした。その後、次第により多い体積となる、緩衝化した酵母抽出物−ペプトンブロスへの連続移入により、Ｄ. discoideumの細胞を増殖させた。各々の連続移入工程は、約１０倍〜２５倍の間の希釈によるものであって、細胞密度が約２×１０⁶／mlを超える時点で行った(occured)。ブロスを穏やかに撹拌しながら常に２１−２４℃でインキュベートした。撹拌発酵は、一般に、最初の酵母抽出物−ペプトン培地中、Ｂacto ペプトンの代わりに(Ｐhytone ペプトンまたはＭarcor 大豆ペプトンといったような)大豆ペプトンを２〜１４.３ｇ／Ｌの濃度で含む、同様の培地で行われた。収集物は、通常、１〜３つの、４０−１５０ＲＰＭで回転するＲushton タービン撹拌機が取り付けられた、１０から５０００リットルまでの作業体積をもつ発酵槽から得られた。温度を２２＋／−１℃に調節し、空気の流れを液体ブロス１体積あたり０.１〜０.５の間の体積の空気に調節して、背圧を３−５ｐ.ｓ.ｉ.に維持した。幾つかの発酵を、硫酸で６.４に調節したｐＨで、また幾つかを、撹拌と空気の流れを変えることにより４０−６０％に調節した溶存酸素で行った。増殖中の壁のないアメーバである細胞の取り扱い、および発酵において切断(shear) を最小とするよう注意した。通例、Ｄ. discoideum Ａx３の撹拌した培養物は、１２〜３６時間の間で２倍に増殖した。溶存酸素は、次第に減少した(調節していない場合)後、細胞密度の増加が停止してから、ある時点で上昇し始めた。最終細胞密度は、３×１０⁶／m l〜５×１０⁷／mlの間の範囲であり、より低い最大細胞密度での、それらの発酵において、酸素移入を明らかに限定する。時々、試料を採取して、細胞密度とＧＦ−pＮＡse活性に関して分析した。Ｐe troff−Ｈauser 計数チャンバーを使用して、約５×１０⁵／ml以上の細胞密度と見積もった。通例、ＧＦ−pＮＡの加水分解活性は、発酵中ずっと増加した。最大dＤＡＰ活性は、最大細胞密度に達してから２〜４日後に見受けられた。ブロス全体を４℃で保存するか、または−２０℃で凍結させて、後に解凍し、活性に関して分析した。１０℃未満まで冷却して、細胞を連続フロー遠心機で除去することにより、発酵物を収集した。製造例４ d ＤＡＰの調製Ａ．細胞除去および濃縮Ｄictyostelium discoideumの発酵ブロスからの、dＤＡＰの最初の精製は、細胞除去および濃縮工程を含む。細胞除去は、Ｗestern Ｓtates 遠心機での連続フロー遠心分離により行った。５０,０００分子量のカットオフ膜を使用するタンジェンシャルフロー限外濾過により、細胞不含有培地を約２０倍濃縮した。残留物(retentate)を限外濾過ユニットから排出し、そのユニットを５０mＭトリス緩衝液(pＨ７)で洗浄して、さらなるdＤＡＰを回収した。その残留物と洗浄試料を合わせて、最終濃縮物を形成し、さらなるプロセッシングを行う前に、これを−２０℃で数カ月凍結保存した。Ｂ．清澄化凍結させた最終濃縮物を室温で約１２時間解凍した。一度解凍したら、最初のカラムクロマトグラフィー工程の前に、その最終濃縮物を清澄にする。清澄化は、遠心分離と、続いての５ミクロンの膜濾過との組み合わせにより達成される。清澄にした最終濃縮物をpＨ７.０に調節して、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を待つ間、４〜１０℃で１２時間未満保った。Ｃ．陰イオン交換クロマトグラフィー dＤＡＰ精製方法の最初のクロマトグラフィー工程は、Ｐharmacia Ｑ−セファロースファーストフロー樹脂(ＦＦＱ)を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーであった。カラムを５０mＭトリス緩衝液(pＨ７)で平衡化した。清澄にした細胞不含有濃縮物を、樹脂１リットルあたり６０リットルの濃縮していない発酵培地の割合にて、５０cm／時間のリニアフロー速度で適用した。この結果、樹脂１リットルあたり約６０グラムのタンパク質チャージとなった(タンパク質の定量は、標準のウシ血清アルブミンの対するＰierce ＢＣＡタンパク質アッセイに基づくものであった)。ＦＦＱ樹脂１リットルあたり約２５０ユニットのdＤＡＰ活性を適用した。細胞不含有濃縮物の伝導率は、約５mＭＨＯＳ／cmであった。試料の充填が完了してから、そのＦＦＱ樹脂を３カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄した。１０カラム体積以上を５０cm／時間のフロー速度で適用する、５０m Ｍトリス(pＨ７)中の０〜１ＭＮaＣlのリニアグラジエントを使用して、その樹脂からdＤＡＰ活性を溶出した。画分の大きさは、０.１カラム体積であった。そのＦＦＱカラムを、３カラム体積の、５０mＭトリス(pＨ７)中の０.１ＭＮ aＣlでさらに溶出した。溶出物を伝導率と２８０nmでの吸光度によりモニターして、画分を、比色基質Ｇly−Ｐhe パラ−ニトロアニリド(ＧＦpＮＡ)をpＨ３. ５で切断する、それらの能力により、dＤＡＰ活性に関してアッセイした。溶出した全dＤＡＰ活性の約９０％を含む画分を合わせることにより、主流となる(ma instream)プールを調製した。そのdＤＡＰ活性は、大きさが約２カラム体積のシングルピークとして溶出した。１０％ｖ／ｖＨＣlを使用して、その主流となるプールをpＨ３.５まで酸性にした。そのＦＦＱの酸性にした主流となるプールを４℃で２日未満保った。Ｄ．疎水的相互作用クロマトグラフィーそのＦＦＱの酸性にした主流となるプールを、次に、Ｐharmacia フェニルセファロースファーストフロー樹脂での疎水的相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)により精製した。そのカラムは、陰イオン交換カラムの１／３の体積であった。樹脂１リットルあたり約６５０ユニットの活性を適用し、またタンパク質充填は、樹脂１リットルあたり４グラムであった(２８０nmでの１吸光度ユニットは、１mg／ml タンパク質に匹敵した)。１リットルあたり硫酸アンモニウムを１４０グラム加えることにより、ＦＦＱの主流をＨＩＣカラムへの充填用に調製した。その充填物をpＨ３.５に調節し、また最終伝導率は、約９０mＭＨＯＳ／cm であった。そのＨＩＣカラムを、１リットルあたり硫酸アンモニウムを少なくとも１４０グラム含む、５０mＭクエン酸塩(pＨ３.５)中で平衡化した。その充填物を４０cm／時間のリニアフロー速度で適用して、樹脂を少なくとも３カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄した。１０カラム体積以上を４０cm／時間で適用する、５０mＭクエン酸塩(pＨ３.５)中の、硫酸アンモニウム１リットルあたり１４０グラム〜０ｇのリニアグラジエントを使用して、その樹脂からdＤＡＰ活性を溶出した。そのカラムを、少なくとも３カラム体積の５０mＭクエン酸塩(pＨ３.５)でさらに溶出した。画分の大きさは、０.１カラム体積であった。溶出物を伝導率と２８０nmでの吸光度によりモニターして、画分を、ＧＦpＮＡをpＨ３.５で切断する、それらの能力により、dＤＡＰ活性に関してアッセイした。溶出した全dＤＡＰ活性の約９０％を含む画分を合わせることにより、主流となるプールを調製した。そのdＤＡＰ活性は、大きさが約２カラム体積のシングルピークとして溶出した。１０％ｖ／ｖＨＣlまたは１０％ｗ／ｗＮaＯＨを使用して、その主流となるプールをpＨ３.５に調節した。プロセッシングを続ける前に、そのＨＩＣの主流を４℃で１日未満保った。Ｅ．サイズ排除クロマトグラフィーそのＨＩＣの主流をさらに、Ｓ−２００セファロースＨＲでのサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)により処理した。そのカラムは、ＨＩＣカラムの２倍の体積であり、またベッドの高さは７８cmであった。１０,０００ダルトンの分子量のカットオフをもつ膜を使用する限外濾過ユニットで濃縮することにより、ＨＩＣの主流をＳＥＣカラム用に調製した。そのＨＩＣの主流を２.５％ＳＥＣカラム体積まで濃縮して、そのユニットから残留物を排出した。その限外濾過ユニットを、２.５％ＳＥＣカラム体積に匹敵する、１体積の５０mＭクエン酸塩緩衝液(pＨ３.５)で洗浄した。その残留物と洗浄物を合わせて、最終濃縮物を形成し、１０％ｖ／ｖＨＣlまたは１０％ｗ／ｗＮaＯＨでpＨ３.５に調節した。その最終濃縮物の伝導率は、約３０mＭＨＯ／cmであった。そのＳＥＣカラムを、５０mＭ酢酸、２０mＭ塩化ナトリウム(pＨ３.５)で平衡化し、これは、約２mＭＨＯ／cmの伝導率を有していた。そのＳＥＣカラムに、最終濃縮物を１５cm／時間のリニアフローで適用して、dＤＡＰ活性を１カラム体積の平衡化緩衝液の適用により溶出した。画分の大きさは、０.０２カラム体積であった。溶出物を伝導率と２８０nmでの吸光度によりモニターして、画分を、ＧＦpＮＡをpＨ３.５で切断する、それらの能力により、dＤＡＰ活性に関してアッセイした。溶出した全dＤＡＰ活性の約９０％を含む画分を合わせることにより、主流となるプールを調製した。そのdＤＡＰ活性は、大きさが約０.０８カラム体積のシングルピークとして溶出した。そのＳＥＣの主流となるプールは、４℃で数カ月間保つことができる。陰イオン交換、疎水的相互作用、およびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを使用するdＤＡＰの精製の結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで主要なバンドとして移動する物質が生じた。そのバンドは、分子量標準のウシ血清アルブミン(６６キロダルトン)に相当するゲル上の位置に移動した。ＩＳＳＰro−青色染色を使用して、そのタンパク質を染色した。その移動パターンは、試料調製中、(１００℃、５分間を加えた)０.１ＭＤＴＴの存在または不存在により影響されなかった。ＤＡＰ−Ｉ(ウシ起源)のサブユニットの分子量は、ＳＤＳ−−ＰＡＧＥにより、約２２,０００ダルトンであると見積もられる。実施例１転換配列番号３は、上述のタンパク質をコードするプラスミドを有するＥ. coliの細胞質中の不溶性の凝集物として産生した。その不溶性のタンパク質を８Ｍ尿素中で可溶化した。配列番号３の１mgあたり３−６ミリユニットのdＤＡＰを加えることにより、その転換反応を開始した。その転換反応を室温で６−８時間進行させた。より多くの酵素を加える、配列番号３の濃度を増大させる、または反応温度を上昇させることにより、その反応速度を増大させることができる。その反応の進行は、高性能逆相クロマトグラフィーによりモニターした。pＨをＮaＯＨで８に調節することにより、その反応を終了した。転換されたdes(Ｍet−Ａrg )配列番号３をさらに、陰イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。転換後、ペプチドマッピング、Ｎ−末端の配列決定、質量分析、および逆相ＨＰＬＣが含まれる分析方法は、Ｎ−末端上のmet−argが開裂されたことを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ )，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．式：［式中、４の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；７の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；２２の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；２７の位置にあるＸaaは、ＴhrまたはＡlaであり；２８の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ｇluであるか、または存在せず；３４の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；５４の位置にあるＸaaは、Ｍet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal 、Ａla、またはＧlyであり；５６の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；６２の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；６３の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；６８の位置にあるＸaaは、Ｍet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal 、Ａla、またはＧlyであり；７２の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；７５の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；７８の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；８２の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；１００の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ｔrp、Ｔyr、Ｐhe、Ｉle、Ｖal、またはＬ euであり；１０８の位置にあるＸaaは、ＡspまたはＧluであり；１３０の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；１３４の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；１３６の位置にあるＸaaは、Ｍet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖ al、Ａla、またはＧlyであり；１３８の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ｔrp、Ｔyr、Ｐhe、Ｉle、Ｖal、またはＬ euであり；および１３９の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluである］のタンパク質を製造する方法であって、式：［式中、２の位置にあるＸaaは、Ｐroを除く、いずれかのアミノ酸であり；６の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；９の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；２４の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；２９の位置にあるＸaaは、ＴhrまたはＡlaであり；３０の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ｇluであるか、または存在せず；３６の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；５６の位置にあるＸaaは、Ｍet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal 、Ａla、またはＧlyであり；５８の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；６４の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；６５の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；７０の位置にあるＸaaは、Ｍet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal 、Ａla、またはＧlyであり；７４の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；７７の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；８０の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；８４の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ａsn、またはＡspであり；１０２の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ｔrp、Ｔyr、Ｐhe、Ｉle、Ｖal、またはＬ euであり；１１０の位置にあるＸaaは、ＡspまたはＧluであり；１３２の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；１３６の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluであり；１３８の位置にあるＸaaは、Ｍet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖ al、Ａla、またはＧlyであり；１４０の位置にあるＸaaは、Ｇln、Ｔrp、Ｔyr、Ｐhe、Ｉle、Ｖal、またはＬ euであり；および１４１の位置にあるＸaaは、ＧlnまたはＧluである］のタンパク質をdＤＡＰと接触させることを含んでなる方法。２．配列番号２の２の位置にあるＸaaがＡrg、Ａsp、またはＴyrである、請求項１に記載の方法。３．配列番号２のタンパク質を該dＤＡＰと約１分〜約８時間の間接触させる、請求項１または２に記載の方法。４．pＨ約２.０〜pＨ約５.５の間の溶液中、配列番号２のタンパク質を該d ＤＡＰと接触させる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。５．pＨ約２.４〜pＨ約２.８の間の溶液中、配列番号２のタンパク質を該d ＤＡＰと接触させる、請求項４に記載の方法。６．配列番号２のペプチドを該dＤＡＰと約２０℃〜約３７℃の間の温度で接触させる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．dＤＡＰを適当な支持体表面上に固定化する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。８．配列番号２のＮ末端アミノ酸が酸化メチオニンである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。