JP2567079B2 - 組換えヒトインターロイキンー１αポリペプチド - Google Patents
組換えヒトインターロイキンー１αポリペプチドInfo
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/54—Interleukins [IL]
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Description
【発明の詳細な説明】 ヒトインターロイキン−１には２つの型、いわゆるα
型およびβ型が知られている（Marchら:Nature,315:641
〜647,1985）。ヒトインターロイキン−１α（hIL−１
α）をコードするDNAのヌクレオチド配列の解柝から、
分子量30,606ダルトンのhIL−１αプレカーサーポリペ
プチドに相当する271個のアミノ酸の大きな読み取り枠
が明らかにされた。
型およびβ型が知られている（Marchら:Nature,315:641
〜647,1985）。ヒトインターロイキン−１α（hIL−１
α）をコードするDNAのヌクレオチド配列の解柝から、
分子量30,606ダルトンのhIL−１αプレカーサーポリペ
プチドに相当する271個のアミノ酸の大きな読み取り枠
が明らかにされた。
Gubler（J.Immunol.,136:2492〜2497,1986）によつて決
定されたhIL−１αのプレカーサーポリペプチドのヌク
レオチド配列およびアミノ酸配列を第１図その１および
その２に示す。
定されたhIL−１αのプレカーサーポリペプチドのヌク
レオチド配列およびアミノ酸配列を第１図その１および
その２に示す。
ヨーロツパ特許出願公告第188,864号には、hIL−１α
プレカーサーポリペプチドの113番目のSerから271番目
のAlaまでのＣ末端部分（第１図その１およびその２）
が生物学的に活性であることが開示されている。ヨーロ
ツパ特許出願公告第188,920号には、第１図その１およ
びその２に示したアミノ酸配列と、114番目のAlaの代わ
りにコドンTCAでコードされるSerを有する点でアミノ酸
配列が異なるhIL−１αプレカーサーポリペプチドが開
示されている。ヨーロツパ特許出願第188,920にはさら
に、様々なhIL−１αポリペプチド、すなわち上述のよ
うに第１図その１およびその２に示したアミノ酸配列の
114番目のアラニン残基の存在位置がセリン残基によつ
て置換されているアミノ酸配列の位置63〜271,113〜27
1,115〜271,123〜271,127〜271,128〜271,129〜271,113
〜267,113〜264,113〜266,113〜265および128〜267のア
ミノ酸配列を有するhIL−１αポリペプチドの製造が開
示されている。ヨーロツパ特許出願公告第200,986号に
は、118番目から271番目までのアミノ酸配列と117番目
にメオニン残基を有する組換えhIL−１αポリペプチド
の製造が記載されている。このメチオニンは118番目か
ら271番目までのアミノ酸配列をコードするDNAフラグメ
ントの発現に用いられるATGコドンに由来するものであ
る。天然のhIL−１αポリペプチドは117番目の位置にセ
リン残基を有するので、ヨーロツパ特許出願公告第200,
986号の記載に従つて製造される組換えhIL−１αポリペ
プチドは、ヒト体液または培養ヒト細胞の上澄液から単
離された相当する天然成熟hIL−１αポリペプチドとは
Ｎ末端において相違する。この組換えhIL−１αポリペ
プチドにおける修飾Ｎ末端の存在は、この組換えポリペ
プチドで処置された患者に副作用が起こる可能性を生じ
る。このような副作用を回避するために、天然の成熟hI
L−１αのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する
組換え成熟hIL−１αポリペプチドの製造のための手段
が検討されてきた。そして驚くべきことに、第１図その
１およびその２に示したアミノ酸配列の117番目から271
番目までのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列 を有する組換え成熟hIL−１αポリペプチド、ならびに
第１図その１およびその２に示したアミノ酸配列の120
番目から271番目までのアミノ酸配列に相当するアミノ
酸配列 を有する組換え成熟hIL−１αポリペプチドが、単細胞
生物内で、Ｎ末端メチオニン残基をもたずに製造できる
ことが発見された。
プレカーサーポリペプチドの113番目のSerから271番目
のAlaまでのＣ末端部分（第１図その１およびその２）
が生物学的に活性であることが開示されている。ヨーロ
ツパ特許出願公告第188,920号には、第１図その１およ
びその２に示したアミノ酸配列と、114番目のAlaの代わ
りにコドンTCAでコードされるSerを有する点でアミノ酸
配列が異なるhIL−１αプレカーサーポリペプチドが開
示されている。ヨーロツパ特許出願第188,920にはさら
に、様々なhIL−１αポリペプチド、すなわち上述のよ
うに第１図その１およびその２に示したアミノ酸配列の
114番目のアラニン残基の存在位置がセリン残基によつ
て置換されているアミノ酸配列の位置63〜271,113〜27
1,115〜271,123〜271,127〜271,128〜271,129〜271,113
〜267,113〜264,113〜266,113〜265および128〜267のア
ミノ酸配列を有するhIL−１αポリペプチドの製造が開
示されている。ヨーロツパ特許出願公告第200,986号に
は、118番目から271番目までのアミノ酸配列と117番目
にメオニン残基を有する組換えhIL−１αポリペプチド
の製造が記載されている。このメチオニンは118番目か
ら271番目までのアミノ酸配列をコードするDNAフラグメ
ントの発現に用いられるATGコドンに由来するものであ
る。天然のhIL−１αポリペプチドは117番目の位置にセ
リン残基を有するので、ヨーロツパ特許出願公告第200,
986号の記載に従つて製造される組換えhIL−１αポリペ
プチドは、ヒト体液または培養ヒト細胞の上澄液から単
離された相当する天然成熟hIL−１αポリペプチドとは
Ｎ末端において相違する。この組換えhIL−１αポリペ
プチドにおける修飾Ｎ末端の存在は、この組換えポリペ
プチドで処置された患者に副作用が起こる可能性を生じ
る。このような副作用を回避するために、天然の成熟hI
L−１αのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する
組換え成熟hIL−１αポリペプチドの製造のための手段
が検討されてきた。そして驚くべきことに、第１図その
１およびその２に示したアミノ酸配列の117番目から271
番目までのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列 を有する組換え成熟hIL−１αポリペプチド、ならびに
第１図その１およびその２に示したアミノ酸配列の120
番目から271番目までのアミノ酸配列に相当するアミノ
酸配列 を有する組換え成熟hIL−１αポリペプチドが、単細胞
生物内で、Ｎ末端メチオニン残基をもたずに製造できる
ことが発見された。
したがつて、本発明は、アミノ酸配列（Ｉ）を有する
均一な組換えヒトインターロイキン−１αポリペプチ
ド、このポリペプチドをコードするDNA、このポリペプ
チドのいずれかをコードするDNAを含有する組換えベク
ター、ならびにこの組換えベクターを含有し、上述のDN
Aを発現できる単細胞生物を提供する。さらに、本発明
は、上述のインターロイキン−１αポリペプチドの製造
方法、このポリペプチドからなる医薬組成物、ならびに
宿主主体の免疫系の刺激、創傷治癒の促進および危篤状
態のタンパク質栄養不良患者の回復の改善のための上記
ポリペプチドまたは医薬組成物の使用に関する。
均一な組換えヒトインターロイキン−１αポリペプチ
ド、このポリペプチドをコードするDNA、このポリペプ
チドのいずれかをコードするDNAを含有する組換えベク
ター、ならびにこの組換えベクターを含有し、上述のDN
Aを発現できる単細胞生物を提供する。さらに、本発明
は、上述のインターロイキン−１αポリペプチドの製造
方法、このポリペプチドからなる医薬組成物、ならびに
宿主主体の免疫系の刺激、創傷治癒の促進および危篤状
態のタンパク質栄養不良患者の回復の改善のための上記
ポリペプチドまたは医薬組成物の使用に関する。
本発明のポリペプチドはペプチド合成の慣用方法によ
つて、液相でもしくは好ましくはたとえばMerrifield
（J.Am.Chem.Soc.,85:2149〜2154,1963）の方法のよう
に固相で、または本技術分野の他の均等方法によつて製
造することができる。
つて、液相でもしくは好ましくはたとえばMerrifield
（J.Am.Chem.Soc.,85:2149〜2154,1963）の方法のよう
に固相で、または本技術分野の他の均等方法によつて製
造することができる。
本発明のポリペプチドはまた、好ましくは、組換えDN
A技術の方法を用いて製造される。この場合、本発明の
成熟ヒトインターロイキン−１αポリペプチドをコード
するDNA配列を含有する組換えベクターを含む単細胞生
物を上記DNA配列の発現に適当な条件下に培養し、その
単細胞生物によつて産生されたヒトインターロイキン−
１αポリペプチドを培養物から単離する。
A技術の方法を用いて製造される。この場合、本発明の
成熟ヒトインターロイキン−１αポリペプチドをコード
するDNA配列を含有する組換えベクターを含む単細胞生
物を上記DNA配列の発現に適当な条件下に培養し、その
単細胞生物によつて産生されたヒトインターロイキン−
１αポリペプチドを培養物から単離する。
このような単細胞生物は原核細胞でも真核細胞でもよ
い。このような単細胞生物の多くは市販品として入手で
きるし、また、12301Park−Iawn Drive,Rockville,Mary
land,USAに所在するAmerican Iype Culture Collection
（ATCC）の寄託細胞から自由に入手できる。原核生物の
例には、大腸菌［たとえばDZ291として Villarejoら:J.Bacteriol.,120:466〜474,1974に記載さ
れているE.coli M15,E.coli 294（ATCC No.31446），E.
coli RR1（ATCC No.31343）またはE.Coli W3110（ATC
C）No27325）］のような分裂菌類、枯草菌(B.subtilli
s)のような桿菌類、ならびにたとえばネズミチフス菌
（Salmonella typhimurium)）および霊菌（Serratia ma
rcescens）のような腸内細菌類がある。プラスミドpRK2
48cIts（例参照）を含有するE.coli MC1061株はとくに
好ましい。また、ビール酵母菌（Saccharomyces cerevi
siae）のような酵母細胞も宿主生物として使用できる。
組換えベクターの宿主生物として適当な多くの真核細胞
が本技術分野の熟練者には知られている。CV−１（ATCC
No.CCL70）のような哺乳類細胞およびその誘導体たと
えばCOS−１（ATCC No.CRL1650）またはCOS−７（ATCC
No.CRL1651）の使用も好ましい。さらに、Smithら（Mo
l.Cell.Biol.,２:2156〜2165,1983）によつて記載され
た昆虫細胞の使用も可能である。
い。このような単細胞生物の多くは市販品として入手で
きるし、また、12301Park−Iawn Drive,Rockville,Mary
land,USAに所在するAmerican Iype Culture Collection
（ATCC）の寄託細胞から自由に入手できる。原核生物の
例には、大腸菌［たとえばDZ291として Villarejoら:J.Bacteriol.,120:466〜474,1974に記載さ
れているE.coli M15,E.coli 294（ATCC No.31446），E.
coli RR1（ATCC No.31343）またはE.Coli W3110（ATC
C）No27325）］のような分裂菌類、枯草菌(B.subtilli
s)のような桿菌類、ならびにたとえばネズミチフス菌
（Salmonella typhimurium)）および霊菌（Serratia ma
rcescens）のような腸内細菌類がある。プラスミドpRK2
48cIts（例参照）を含有するE.coli MC1061株はとくに
好ましい。また、ビール酵母菌（Saccharomyces cerevi
siae）のような酵母細胞も宿主生物として使用できる。
組換えベクターの宿主生物として適当な多くの真核細胞
が本技術分野の熟練者には知られている。CV−１（ATCC
No.CCL70）のような哺乳類細胞およびその誘導体たと
えばCOS−１（ATCC No.CRL1650）またはCOS−７（ATCC
No.CRL1651）の使用も好ましい。さらに、Smithら（Mo
l.Cell.Biol.,２:2156〜2165,1983）によつて記載され
た昆虫細胞の使用も可能である。
組換えベクターを単細胞生物に導入するには様様の方
法が知られている。このような方法の例としては、マイ
クロインジエクシヨン、トランスフエクシヨンまたはト
ランスダクシヨンがある。本技術分野の熟練者によれ
ば、使用する特定の宿主生物に最も適した方法を選択す
ることは容易である。
法が知られている。このような方法の例としては、マイ
クロインジエクシヨン、トランスフエクシヨンまたはト
ランスダクシヨンがある。本技術分野の熟練者によれ
ば、使用する特定の宿主生物に最も適した方法を選択す
ることは容易である。
本発明に用いられる組換えベクターは、本発明のhIL
−１αポリペプチドをコードするDNA、たとえば第１図
その１およびその２に示したヌクレオチド配列の385番
目から852番目までのヌクレオチド配列を有するDNAを含
有するベクターである。このようなDNAは慣用の化学的
方法、たとえばNarangら（Meth.Enzymol.,68:90〜108,1
979）によつて報告されているホスホトリエステル法、
またはBrownら（Meth.Enzymol.,68:109〜151,1979）の
ホスホジエステル法により合成できる。いずれの方法で
も、まず長いオリゴヌクレオチドを合成し、ついで予め
定められた順番に互いに連絡する。DNAのヌクレオチド
配列は上述のヌクレオチド配列と同一でも、また一部も
しくは完全に異なつていてもよい。これは遺伝暗号の退
縮、すなわち１つのアミノ酸が数個のコドンに対応して
いるという事実によるものである。hIL−１αポリペプ
チドの発現に用いられる宿主生物の好むコドン利用に適
合するようにコドンを選択することができる（Grosjean
ら:Gene,18:199〜209,1982）。この方法で得られるDNA
が、たとえば望ましくない制限酵素切断部位の導入によ
り組換えベクターの構築を困難にしたり、ポリペプチド
の発現を妨害する部分構造を含まないように注意する必
要がある。
−１αポリペプチドをコードするDNA、たとえば第１図
その１およびその２に示したヌクレオチド配列の385番
目から852番目までのヌクレオチド配列を有するDNAを含
有するベクターである。このようなDNAは慣用の化学的
方法、たとえばNarangら（Meth.Enzymol.,68:90〜108,1
979）によつて報告されているホスホトリエステル法、
またはBrownら（Meth.Enzymol.,68:109〜151,1979）の
ホスホジエステル法により合成できる。いずれの方法で
も、まず長いオリゴヌクレオチドを合成し、ついで予め
定められた順番に互いに連絡する。DNAのヌクレオチド
配列は上述のヌクレオチド配列と同一でも、また一部も
しくは完全に異なつていてもよい。これは遺伝暗号の退
縮、すなわち１つのアミノ酸が数個のコドンに対応して
いるという事実によるものである。hIL−１αポリペプ
チドの発現に用いられる宿主生物の好むコドン利用に適
合するようにコドンを選択することができる（Grosjean
ら:Gene,18:199〜209,1982）。この方法で得られるDNA
が、たとえば望ましくない制限酵素切断部位の導入によ
り組換えベクターの構築を困難にしたり、ポリペプチド
の発現を妨害する部分構造を含まないように注意する必
要がある。
本発明のhIL−１αポリペプチドをコードするDNAはま
た、本技術分野において公知の操作（たとえばMarch
ら：前出;Gublerら：前出）に従つてヒトcDNAライブラ
リーまたはヒト遺伝子ライブラリーからhIL−１αプレ
カーサーポリペプチドをコードするDNAを単離し、つい
で組換えDNA技術の分野でよく知られた方法に従い、制
限エンドヌクレアーゼおよび場合により小さな合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて、DNAを所望の大きさおよびヌ
クレオチド配列に構築することによつても製造できる。
た、本技術分野において公知の操作（たとえばMarch
ら：前出;Gublerら：前出）に従つてヒトcDNAライブラ
リーまたはヒト遺伝子ライブラリーからhIL−１αプレ
カーサーポリペプチドをコードするDNAを単離し、つい
で組換えDNA技術の分野でよく知られた方法に従い、制
限エンドヌクレアーゼおよび場合により小さな合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて、DNAを所望の大きさおよびヌ
クレオチド配列に構築することによつても製造できる。
上述の組換えベクターの構築には、ヨーロツパ特許出
願公告第200,986号に記載されているような多数のベク
ターを使用することができる。これらのベクターは、hI
L−１αポリペプチドをコードするDNAの転写および翻訳
のために必要な要素、ならびにそのベクターの宿主内に
おける維持および複写に必要な要素を含有する。本発明
の組換えベクターの構築に適当なベクターの選択および
その組換えベクターと適合する単細胞宿主生物の選択は
本分野の技術者の技能で十分対応できる事項である。
願公告第200,986号に記載されているような多数のベク
ターを使用することができる。これらのベクターは、hI
L−１αポリペプチドをコードするDNAの転写および翻訳
のために必要な要素、ならびにそのベクターの宿主内に
おける維持および複写に必要な要素を含有する。本発明
の組換えベクターの構築に適当なベクターの選択および
その組換えベクターと適合する単細胞宿主生物の選択は
本分野の技術者の技能で十分対応できる事項である。
本発明の組換えベクターはまた、好ましくは、hIL−
１αポリペプチドをコードするDNAを含む組換えベクタ
ーを、Morinagaら（BIO/TECHNOLOGY,２:636〜639,198
4）によつて記載されたオリゴヌクレオチドの特定部位
の突然変異誘発法を用いて修飾することでも製造でき
る。ベクターとhIL−１αポリペプチドをコードするDNA
を含むこのような組換えベクターの例には、プラスミド
phil♯１−154*がある。このプラスミドの構築はヨーロ
ツパ特許出願公告第200,986号に記載されている。
１αポリペプチドをコードするDNAを含む組換えベクタ
ーを、Morinagaら（BIO/TECHNOLOGY,２:636〜639,198
4）によつて記載されたオリゴヌクレオチドの特定部位
の突然変異誘発法を用いて修飾することでも製造でき
る。ベクターとhIL−１αポリペプチドをコードするDNA
を含むこのような組換えベクターの例には、プラスミド
phil♯１−154*がある。このプラスミドの構築はヨーロ
ツパ特許出願公告第200,986号に記載されている。
本発明によるポリペプチドの発現を行う方法は、使用
する発現ベクターおよび宿主生物によつて決定される。
通常、発現ベクターを含有する宿主生物は、その宿主生
物の生育に最適な条件下に生育される。単位時間あたり
の細胞数の増加が低下する対数増殖期の末期近くに、本
発明のポリペプチドの発現を誘導する。すなわち、ポリ
ペプチドをコードするDNAの転写、転写されたmRNAの翻
訳を行わせる。誘導は、生育メジウムにインデユーサー
またはデプレツサーを添加することにより、あるいは物
理的パラメーターたとえば温度を変化させることによつ
て行うことができる。
する発現ベクターおよび宿主生物によつて決定される。
通常、発現ベクターを含有する宿主生物は、その宿主生
物の生育に最適な条件下に生育される。単位時間あたり
の細胞数の増加が低下する対数増殖期の末期近くに、本
発明のポリペプチドの発現を誘導する。すなわち、ポリ
ペプチドをコードするDNAの転写、転写されたmRNAの翻
訳を行わせる。誘導は、生育メジウムにインデユーサー
またはデプレツサーを添加することにより、あるいは物
理的パラメーターたとえば温度を変化させることによつ
て行うことができる。
宿主生物中に産生されたポリペプチドは、特定の輸送
機構によつて細胞から分泌させるか、または細胞を破壊
することによつて単離できる。細胞は機械的な（Charm
ら:Meth.Enzymol.,22:476〜556,1971）、酵素的な（リ
ソチーム処理）または化学的な（界面活性剤処理、尿素
もしくはグアニジン塩酸塩処理等）手段、あるいはそれ
らの組合せによつて破壊することができる。
機構によつて細胞から分泌させるか、または細胞を破壊
することによつて単離できる。細胞は機械的な（Charm
ら:Meth.Enzymol.,22:476〜556,1971）、酵素的な（リ
ソチーム処理）または化学的な（界面活性剤処理、尿素
もしくはグアニジン塩酸塩処理等）手段、あるいはそれ
らの組合せによつて破壊することができる。
真核生物では、細胞から分泌されるポリペプチドはプ
レカーサー分子の型に合成される、成熟ポリペプチド
は、いわゆるシグナルペプチドの切断によつて生じる。
原核宿主生物では、プレカーサー分子から真核シグナル
ペプチを切断することができないので、原核宿主生物中
では、真核ポリペプチドを直接その成熟型として発現し
なければならない。DNAのレベルではコドンATGに相当す
る翻訳開始シグナルAUGは、原核宿主生物中では、すべ
てのポリペプチドをＮ末端にメチオニン残基をもつ型で
合成させる。場合によつては、用いた発現システムによ
り、また多分、発現されるポリペプチドにより、このメ
チオニン残基は切断される。
レカーサー分子の型に合成される、成熟ポリペプチド
は、いわゆるシグナルペプチドの切断によつて生じる。
原核宿主生物では、プレカーサー分子から真核シグナル
ペプチを切断することができないので、原核宿主生物中
では、真核ポリペプチドを直接その成熟型として発現し
なければならない。DNAのレベルではコドンATGに相当す
る翻訳開始シグナルAUGは、原核宿主生物中では、すべ
てのポリペプチドをＮ末端にメチオニン残基をもつ型で
合成させる。場合によつては、用いた発現システムによ
り、また多分、発現されるポリペプチドにより、このメ
チオニン残基は切断される。
本発明のポリペプチドは公知の方法により、たとえば
様々な速度での遠心分離、硫酸アンモニウムによる沈
殿、透析（常圧または減圧下での）、製造等電点電気泳
動、製造ゲル電気泳動、またはゲル濾過、高速液体クロ
マトグラフイー（HPLC）、イオン交換クロマイトグラフ
イー、逆相クロマトグラフイーおよびアフイニテイーク
ロマトグラフイー（たとえばSepharose Blue CL−6Bま
たはhIL−１αポリペプチドに対する担体結合モノクロ
ーナル担体）のような様々のクロマトグラフ法によつて
均一に精製できる。
様々な速度での遠心分離、硫酸アンモニウムによる沈
殿、透析（常圧または減圧下での）、製造等電点電気泳
動、製造ゲル電気泳動、またはゲル濾過、高速液体クロ
マトグラフイー（HPLC）、イオン交換クロマイトグラフ
イー、逆相クロマトグラフイーおよびアフイニテイーク
ロマトグラフイー（たとえばSepharose Blue CL−6Bま
たはhIL−１αポリペプチドに対する担体結合モノクロ
ーナル担体）のような様々のクロマトグラフ法によつて
均一に精製できる。
本発明の精製組換えhIL−１αポリペプチドは、たと
えば病原に対する宿主防御応答の改善、ワクチンアジユ
バントとしての作用および新生物疾患に対する宿主防御
増強によるような宿主自体の免疫系の刺激のために、そ
れ自体公知の方法で使用できる。本技術分野においてhI
L−１αについて同定されている他の臨床的用途には、
線維芽細胞の増殖を介して創傷治癒の促進および危篤状
態のタンパク質栄養不良患者の回復の改善が包含され
る。
えば病原に対する宿主防御応答の改善、ワクチンアジユ
バントとしての作用および新生物疾患に対する宿主防御
増強によるような宿主自体の免疫系の刺激のために、そ
れ自体公知の方法で使用できる。本技術分野においてhI
L−１αについて同定されている他の臨床的用途には、
線維芽細胞の増殖を介して創傷治癒の促進および危篤状
態のタンパク質栄養不良患者の回復の改善が包含され
る。
本発明に従つて製造された均一なhIL−１αポリペプ
チドは、上述の臨床的用途のため温血動物に投与するこ
とができる。投与は、静脈内、皮下または筋肉内のいず
れかの非経口投与のような任意の慣用方法で行われる。
必要な投与量は、当然、処置すべき特定の状態、状態の
重篤度、処置の期間および投与方法によつて変動する。
医療用途に適当な投与剤型は、減菌濾過し、凍結乾燥し
たhIL−１αポリペプチドから得られ、使用に先立つて
慣用方法で再構築される。均一なヒトインターロイキン
−１αを適合性のある医薬的に許容される担体材料、た
とえば緩衝剤、安定化剤、静菌剤および他の賦形剤なら
びに医薬経口投与剤型に慣用される添加剤と混合するこ
とによる本発明の均一なヒトインターロイキン−１α含
有医薬組成物の製造もまた、本分野の技術者の技能で十
分対応できる事項である。
チドは、上述の臨床的用途のため温血動物に投与するこ
とができる。投与は、静脈内、皮下または筋肉内のいず
れかの非経口投与のような任意の慣用方法で行われる。
必要な投与量は、当然、処置すべき特定の状態、状態の
重篤度、処置の期間および投与方法によつて変動する。
医療用途に適当な投与剤型は、減菌濾過し、凍結乾燥し
たhIL−１αポリペプチドから得られ、使用に先立つて
慣用方法で再構築される。均一なヒトインターロイキン
−１αを適合性のある医薬的に許容される担体材料、た
とえば緩衝剤、安定化剤、静菌剤および他の賦形剤なら
びに医薬経口投与剤型に慣用される添加剤と混合するこ
とによる本発明の均一なヒトインターロイキン−１α含
有医薬組成物の製造もまた、本分野の技術者の技能で十
分対応できる事項である。
例 Morinagaらによつて記載されたオリゴヌクレオチドの
特定部位の突然変異誘発法（BIO/TECHNOLOGY,2:636〜63
9,1984）を用いてプラスミドphil♯１−154*（ヨーロツ
パ特許出願公開第200,986号）に突然変異を誘発して、
第１図その１およびその２の117番目から271番目、119
番目から271番目および120番目から271番目までのアミ
ノ酸配列を有するhIL−１αポリペプチドをコードする
遺伝子を製造した。これらの操作を実施するには、以下
のヌクレオチド配列 を有する合成オリゴヌクレオチドをMatteucciらのホス
ホラミダイト固体支持体（J.Am.Chem.Soc.,103:3185〜3
191,1981）によつて製造した。
特定部位の突然変異誘発法（BIO/TECHNOLOGY,2:636〜63
9,1984）を用いてプラスミドphil♯１−154*（ヨーロツ
パ特許出願公開第200,986号）に突然変異を誘発して、
第１図その１およびその２の117番目から271番目、119
番目から271番目および120番目から271番目までのアミ
ノ酸配列を有するhIL−１αポリペプチドをコードする
遺伝子を製造した。これらの操作を実施するには、以下
のヌクレオチド配列 を有する合成オリゴヌクレオチドをMatteucciらのホス
ホラミダイト固体支持体（J.Am.Chem.Soc.,103:3185〜3
191,1981）によつて製造した。
プラスミドphil♯１−154*はBglIIおよびSalIを用い
てギヤツプ型に、PstIを用いて線型に変換した。ギヤツ
プ型のヘテロ二重鎖が製造された。上記オリゴヌクレオ
チドを３段階の別反応で、アニーリングし、二重鎖型に
変換してリゲーシヨンを行い、CaCl2法（Maniatisら：
“Moleculir Cloning,A Laboratory Manual"′250〜251
頁、Cold Spring Harbor Laboratory,1982）を用いてプ
ラスミドpRK248cIts（Bernardら:Meth.Enzymol.,68:482
〜492,1979）含有E.coli K−12MC1061株（Casadabanら:
J.Mol.Biol.,138:179〜207,1980）に形質転換した。E.c
oli MC1061およびプラスミドpRK248cItsはAmerican Typ
e Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockvill
e,Maryland,USAから、それぞれ寄託番号ATCC No.53338
およびATCC No.33766として入手できる。
てギヤツプ型に、PstIを用いて線型に変換した。ギヤツ
プ型のヘテロ二重鎖が製造された。上記オリゴヌクレオ
チドを３段階の別反応で、アニーリングし、二重鎖型に
変換してリゲーシヨンを行い、CaCl2法（Maniatisら：
“Moleculir Cloning,A Laboratory Manual"′250〜251
頁、Cold Spring Harbor Laboratory,1982）を用いてプ
ラスミドpRK248cIts（Bernardら:Meth.Enzymol.,68:482
〜492,1979）含有E.coli K−12MC1061株（Casadabanら:
J.Mol.Biol.,138:179〜207,1980）に形質転換した。E.c
oli MC1061およびプラスミドpRK248cItsはAmerican Typ
e Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockvill
e,Maryland,USAから、それぞれ寄託番号ATCC No.53338
およびATCC No.33766として入手できる。
所望の突然変異を含むコロニーはManiatisら（前出、
312〜315頁）によつて記載されたようにハイブリダイゼ
ーシヨンによつて同定した。プライマーの突然変異誘発
に用いた同じオリゴヌクレオチドをManiatisら（前出、
396頁）の操作に従いポリヌクレオチドキナーゼを用い
てγ−32P−ATPで５′末端を標識したのちハイブリダイ
ゼーシヨンのプローブとして使用した。
312〜315頁）によつて記載されたようにハイブリダイゼ
ーシヨンによつて同定した。プライマーの突然変異誘発
に用いた同じオリゴヌクレオチドをManiatisら（前出、
396頁）の操作に従いポリヌクレオチドキナーゼを用い
てγ−32P−ATPで５′末端を標識したのちハイブリダイ
ゼーシヨンのプローブとして使用した。
オリゴヌクレオチド（０、117）は、以下の配列修飾
によつてphil♯１−154*のpHuIL−１α（117〜271）へ
の変換に用いた。
によつてphil♯１−154*のpHuIL−１α（117〜271）へ
の変換に用いた。
同様に、オリゴヌクレオチド（０、119）は以下の配
列でpHuIL−１α（119〜271）を製造し、 オリゴヌクレオチド（０、120）は以下の配列でpHuIL−
１α（120〜271）を製造した。
列でpHuIL−１α（119〜271）を製造し、 オリゴヌクレオチド（０、120）は以下の配列でpHuIL−
１α（120〜271）を製造した。
DNA配列解析により上記突然変異を確認した。
phil♯１−154［ヨーロツパ特許出願公開第200,986
号、hIL−１α（118〜271）を発現できる］、pHuIL−１
α（117〜271）、pHuIL−１α（119〜271）およびpHuIL
−１α（120〜171）を含有するE.coli MC1061/pRK248cI
tsを、アンピシリンを含むM9メジウム（Maniatisら、前
出、68〜69頁）中、30℃で、550nmにおける吸収
（A550）が0.7に達するまで生育させ、ついで３時間温
度を42℃に上げた。培養液1mlからの細菌細胞を遠心分
離によつて集め、7Mグアニジン塩酸塩50μｌ中に可溶化
した。粗腺菌抽出液について、Mizelらのマウス胸腺細
胞増殖検定法（J.Immunol.,120:1497〜1508,1978）を用
いてインターロイキン−１の生物活性を検定した。４種
の抽出液のすべてが活性を示した。
号、hIL−１α（118〜271）を発現できる］、pHuIL−１
α（117〜271）、pHuIL−１α（119〜271）およびpHuIL
−１α（120〜171）を含有するE.coli MC1061/pRK248cI
tsを、アンピシリンを含むM9メジウム（Maniatisら、前
出、68〜69頁）中、30℃で、550nmにおける吸収
（A550）が0.7に達するまで生育させ、ついで３時間温
度を42℃に上げた。培養液1mlからの細菌細胞を遠心分
離によつて集め、7Mグアニジン塩酸塩50μｌ中に可溶化
した。粗腺菌抽出液について、Mizelらのマウス胸腺細
胞増殖検定法（J.Immunol.,120:1497〜1508,1978）を用
いてインターロイキン−１の生物活性を検定した。４種
の抽出液のすべてが活性を示した。
不溶性の細胞質封入体を４種のすべての誘導培養液か
ら単離し、上述のようにして精製し、可溶化してSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（Laemmli:Nature,227:6
80〜685,1970）に付した。インターロイキン−１αの主
バンドをAebersoldらの方法（J.Biol.Chem.,261:4229〜
4238,1986）によつて各ゲルから溶出し、Hewickらの方
法（J.Biol.Chem.,256:7990〜7997,1981）に従つてＮ末
端アミノ酸配列解析に付したところ、10サイクルで以下
の結果が得られた。
ら単離し、上述のようにして精製し、可溶化してSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（Laemmli:Nature,227:6
80〜685,1970）に付した。インターロイキン−１αの主
バンドをAebersoldらの方法（J.Biol.Chem.,261:4229〜
4238,1986）によつて各ゲルから溶出し、Hewickらの方
法（J.Biol.Chem.,256:7990〜7997,1981）に従つてＮ末
端アミノ酸配列解析に付したところ、10サイクルで以下
の結果が得られた。
明らかなように、最初のメチオニンはhIL−１α（117
〜271）およびhIL−１α（120〜271）からは切断されて
いるが、hIL−１α（119〜271）およびhIL−１α（118
〜271）には残つている。
〜271）およびhIL−１α（120〜271）からは切断されて
いるが、hIL−１α（119〜271）およびhIL−１α（118
〜271）には残つている。
hIL−１αポリペプチド、hIL−１α（117〜271）、hI
L−１α（118〜271）およびhIL−１α（120〜271）につ
いてさらに検討するために、pHuIL−１α（117〜27
1）、phil♯１−154およびpHuIL−１α（120〜271）を
取り込んだMC1061/pRK248cIts形質転換体の分解物の上
澄液分画の精製を次のように行つた。
L−１α（118〜271）およびhIL−１α（120〜271）につ
いてさらに検討するために、pHuIL−１α（117〜27
1）、phil♯１−154およびpHuIL−１α（120〜271）を
取り込んだMC1061/pRK248cIts形質転換体の分解物の上
澄液分画の精製を次のように行つた。
（１）各形質転換体5kgを含有する培養液を硫酸でpH1.8
に調整し、室温に30分〜１時間保持し、酸で殺した細胞
を遠心分離によつて回収した。
に調整し、室温に30分〜１時間保持し、酸で殺した細胞
を遠心分離によつて回収した。
（２）酸で殺した細胞を水18lに懸濁し、自動ブレード
攪拌器により室温で１時間攪拌した。
攪拌器により室温で１時間攪拌した。
（３）懸濁した物質を２重のチーズ布で濾過し、細胞屑
を除去した。
を除去した。
（４）濾過された物質を、8,000psi（約5.5×107Pa）で
操作したMonton−Gaulin細胞ホモジナイザー（Meth.Enz
ymol.,22:482〜484,1971）に２回、最初は15℃、次は約
30℃で通過させた。
操作したMonton−Gaulin細胞ホモジナイザー（Meth.Enz
ymol.,22:482〜484,1971）に２回、最初は15℃、次は約
30℃で通過させた。
（５）この物質を、Sorvall遠心分離器（Du Pont,Wilmi
ngton,Delaware,USA）により、GS−３ローター（Du Pon
t）を用いて、４℃、8,000rpmで１時間遠心分離した。
上澄液約16.6lを回収し、ペレツトは捨てた。
ngton,Delaware,USA）により、GS−３ローター（Du Pon
t）を用いて、４℃、8,000rpmで１時間遠心分離した。
上澄液約16.6lを回収し、ペレツトは捨てた。
（６）上澄液を0.8/0.2ミクロンSartoriusフイルター
（Sartorius Filters Inc.,Haywood,California,USAま
たはSartorius−Membranfilter GmbH,D−3400Gttinge
nから入手できる）を通して濾過したのち、50％（v/v）
水酸化ナトリウム溶液を用いてpH3.0に調整した。
（Sartorius Filters Inc.,Haywood,California,USAま
たはSartorius−Membranfilter GmbH,D−3400Gttinge
nから入手できる）を通して濾過したのち、50％（v/v）
水酸化ナトリウム溶液を用いてpH3.0に調整した。
（７）上澄液を、予め0.02M酢酸で平衡化した10×40cm
Nugel P−SPシリカカラム（スルホプロピル陽イオン交
換樹脂;40〜60ミクロン、200Å;Separation Industrie
s,Metuchen,New Jersey,USA）に適用した。サンプルを
適用後、カラムを31の0.02M酢酸で洗浄し、ついで30m
M Tris−HCl、pH8.0で溶出した。カラム溶出液について
280nmで比色的にモンタリングを行つた。このようにし
て、タンパク質の２つのピーク、4.5l容量の第１のピー
クおよび7.5lの主ピークが得られた。
Nugel P−SPシリカカラム（スルホプロピル陽イオン交
換樹脂;40〜60ミクロン、200Å;Separation Industrie
s,Metuchen,New Jersey,USA）に適用した。サンプルを
適用後、カラムを31の0.02M酢酸で洗浄し、ついで30m
M Tris−HCl、pH8.0で溶出した。カラム溶出液について
280nmで比色的にモンタリングを行つた。このようにし
て、タンパク質の２つのピーク、4.5l容量の第１のピー
クおよび7.5lの主ピークが得られた。
（８）工程７からの主ピークを、予め30mM Tris−HCl、
pH8.0で平衡化した10×40cmNuGel P−DEシリカカラム
（ジエチルアミノエチル陰イオン交換樹脂;40〜60ミク
ロン、200Å;Separation Industries）に適用した。カ
ラムを17lの30mM Tris−HClおよび0.075M NaCl、pH8.0
で洗浄し、ついで13lの30mM Tris−HClおよび0.25M NaC
l、pH8.0で溶出した。溶出液について280nmの光学密度
（O.D.280）で分光測光によりタンパク質の存在をモニ
タリングした。このようにして、13lの容量に含まれた
O.D.280タンパク質ピークが得られた。
pH8.0で平衡化した10×40cmNuGel P−DEシリカカラム
（ジエチルアミノエチル陰イオン交換樹脂;40〜60ミク
ロン、200Å;Separation Industries）に適用した。カ
ラムを17lの30mM Tris−HClおよび0.075M NaCl、pH8.0
で洗浄し、ついで13lの30mM Tris−HClおよび0.25M NaC
l、pH8.0で溶出した。溶出液について280nmの光学密度
（O.D.280）で分光測光によりタンパク質の存在をモニ
タリングした。このようにして、13lの容量に含まれた
O.D.280タンパク質ピークが得られた。
（９）工程８からの溶出液を3.7mM酢酸、pH4.8で４倍に
希釈し、pHを4.8に調整し、５×250cm NuGel P−SP HPL
Cカラム（Separation Industries）に流速150ml/分で適
用した。次にカラムをpH4.8（3.75mM酢酸）からpH6.8
（10mM K2HPO4）までの直線勾配により、流速75ml/分で
120分を要して溶出した。かくして、9.3lのO.D.280ピー
クが得られた。
希釈し、pHを4.8に調整し、５×250cm NuGel P−SP HPL
Cカラム（Separation Industries）に流速150ml/分で適
用した。次にカラムをpH4.8（3.75mM酢酸）からpH6.8
（10mM K2HPO4）までの直線勾配により、流速75ml/分で
120分を要して溶出した。かくして、9.3lのO.D.280ピー
クが得られた。
（10）HPLCカラムからの溶出液をAmiconらせんカートリ
ツジ（分子量1,000カツトオフ;W.R.Grace ＆ Co.のAmic
on Div.,Danvers,Massachusetts,USAから入手できる）
で約225mlに濃縮し、予め50mM K2HPO4＋0.1M NaCl,pH6.
8て平衡化した直列の２本の10×100cm Sephadex Ｇ−5
0カラム（Pharmacia Fine Chemicals,Piscataway,New J
ersey,USA）に適用した。800mlのO.D.280ピークが得ら
れた。これをAmiconらせんカートリツジ（分子量30,000
カツトオフ）により、パイロジエン除去に付した。最終
生成物の容量は約1,070mlであつた。
ツジ（分子量1,000カツトオフ;W.R.Grace ＆ Co.のAmic
on Div.,Danvers,Massachusetts,USAから入手できる）
で約225mlに濃縮し、予め50mM K2HPO4＋0.1M NaCl,pH6.
8て平衡化した直列の２本の10×100cm Sephadex Ｇ−5
0カラム（Pharmacia Fine Chemicals,Piscataway,New J
ersey,USA）に適用した。800mlのO.D.280ピークが得ら
れた。これをAmiconらせんカートリツジ（分子量30,000
カツトオフ）により、パイロジエン除去に付した。最終
生成物の容量は約1,070mlであつた。
とくに指示のない限り、上記精製工程は、室温で流し
たHPLCカラムを除き、すべて４℃で実施した。
たHPLCカラムを除き、すべて４℃で実施した。
精製したhIL−１α（117〜271）、hIL−１α（118〜2
71）およびhIL−１α（120〜271）タンパク質を、上述
のようにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動解析に付
し、クーマツシーブルーで染色した。いずれも均一な型
であることが明らかにされた。
71）およびhIL−１α（120〜271）タンパク質を、上述
のようにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動解析に付
し、クーマツシーブルーで染色した。いずれも均一な型
であることが明らかにされた。
生物活性の検定は、精製タンパク質について、Kayeら
のマウスD10強線細胞増殖検定法（J.Exp.Med.,158:836
〜856,1983）を用いて実施した。結果は第１表に示すと
おりである。
のマウスD10強線細胞増殖検定法（J.Exp.Med.,158:836
〜856,1983）を用いて実施した。結果は第１表に示すと
おりである。
第１表のデータは（ヨーロツパ特許出願公開第200,98
6号の表Ｉに示されたデータと考え合わせると）、分子
内に最低132番目から271番目まで（第１図その１および
その２）のカルボキシ末端が存在する限り、hIL−１α
タンパク質の正確な長さは重要でないことを示してい
る。すべてのタンパク質が同じ特異的生物活性を示し
た。これらのデータはまた、Ｎ末端の最初のメチオニン
の有無は活性に影響を与えないことも示している。Ｎ末
端に付加的なメチオニンを有するhIL−１α（118〜27
1）は、いずれもこのメチニオンを欠く他の両タンパク
質と活性が等しかつた。
6号の表Ｉに示されたデータと考え合わせると）、分子
内に最低132番目から271番目まで（第１図その１および
その２）のカルボキシ末端が存在する限り、hIL−１α
タンパク質の正確な長さは重要でないことを示してい
る。すべてのタンパク質が同じ特異的生物活性を示し
た。これらのデータはまた、Ｎ末端の最初のメチオニン
の有無は活性に影響を与えないことも示している。Ｎ末
端に付加的なメチオニンを有するhIL−１α（118〜27
1）は、いずれもこのメチニオンを欠く他の両タンパク
質と活性が等しかつた。
第１表のデータはまた驚くべきことに、可溶性hIL−
１α（117〜271）タンパク質の発現レベルは、タンパク
質をコードする遺伝子はすべて同じベクター中に組込
み、細胞の培養および収穫は全く同様に実施したにもか
かわらず、可溶性hIL−１α（118〜271）およびhIL−１
α（120〜271）タンパク質の発現レベルの３倍に達した
ことを示している。
１α（117〜271）タンパク質の発現レベルは、タンパク
質をコードする遺伝子はすべて同じベクター中に組込
み、細胞の培養および収穫は全く同様に実施したにもか
かわらず、可溶性hIL−１α（118〜271）およびhIL−１
α（120〜271）タンパク質の発現レベルの３倍に達した
ことを示している。
本発明は、ヒトインターロイキン−１α cDNAのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列
を示した第１図その１およびその２とともに考慮する
と、理解が容易であろう。
を示した第１図その１およびその２とともに考慮する
と、理解が容易であろう。
第１図は、ヒトインターロイキン−１α（hIL−１α）
プレカーサーポリペプチドのヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列を示す図である。
プレカーサーポリペプチドのヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＧＺ
Claims (7)
- 【請求項１】アミノ酸配列、 を有する均質組換えヒトインターロイキン−１αポリペ
プチド。 - 【請求項２】特許請求の範囲第１項に定義されたヒトイ
ンターロイキン−１αポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項３】特許請求の範囲第２項に記載のDNAを含有
し、適合性のある単細胞宿主生物中で上記DNAの発現の
指示が可能な組換えベクター。 - 【請求項４】特許請求の範囲第３項に記載の組換えベク
ターを含有し、ヒトインターロイキン−１αをコードす
るDNAを発現することができる単細胞生物。 - 【請求項５】宿主主体の免疫系の刺激、創傷治癒の促進
および危篤状態のタンパク質栄養不良患者の回復の改善
のための特許請求の範囲第１項に記載の均質なヒトイン
ターロイキン−１αポリペプチド。 - 【請求項６】（ａ）特許請求の範囲第４項に記載の単細
胞生物を、ヒトインターロイキン−１αポリペプチドを
コードするDNAの発現に適当な条件下に培養し、 （ｂ）培養物からヒトインターロイキン−１αポリペプ
チドを単離し、それを均質に精製する ことを含んでなる特許請求の範囲第１項に記載のヒトイ
ンターロイキン−１αポリペプチドの製造方法。 - 【請求項７】特許請求の範囲第１項に記載のヒトインタ
ーロイキン１αポリペプチドおよび医薬的に許容される
担体を含んでなる宿主主体の免疫系の刺激、創傷治癒の
促進および危篤状態のタンパク質栄養不良患者の回復の
改善のための医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14445788A | 1988-01-15 | 1988-01-15 | |
| US144457 | 1988-01-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH025892A JPH025892A (ja) | 1990-01-10 |
| JP2567079B2 true JP2567079B2 (ja) | 1996-12-25 |
Family
ID=22508674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1005058A Expired - Lifetime JP2567079B2 (ja) | 1988-01-15 | 1989-01-13 | 組換えヒトインターロイキンー１αポリペプチド |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
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