CZ284204B6 - Zvyšování sekrece polypeptidů - Google Patents

Abstract

Sekvence signálního peptidu a nuklenových kyselin kodujících tuto sekvenci, které jsou užitečné pro zlepšení účinnosti sekrece polypeptidů NGF. Způsob přípravy polypeptidů NGF v podobě Met-less.ŕ

Description

Peptid, molekula nukleové kyseliny, vektor, prokaryontní hostitelská buňka a způsob přípravy NGF polypeptidu

Oblast techniky

Vynález se týká nových signálních peptidových sekvencí a sekvencí nukleových kyselin, které jsou užitečné pro zvyšování sekrece určitých polypeptidu. Dále se vynález týká způsobů zvyšování účinnosti sekrece těchto polypeptidů z bakteriálních buněk. Konkrétně se vynález týká určitého peptidu, molekuly nukleové kyseliny, která tento peptid kóduje, vektoru obsahujícího tuto nukleovou kyselinu, prokaryontní hostitelské buňky do níž byl vložen tento vektor a způsobu přípravy NGF polypeptidu v podobě Met-less kultivací této buňky.

Dosavadní stav techniky

Přímá exprese polypeptidů

Mnohé z farmaceutického hlediska důležité polypeptidy se připravují v prokaryontních buňkách, jako jsou buňky bakterií, za použití rekombinantních DNA technik. DNA kódující polypeptid (často získaná z humánních tkání) se může vložit do hostitelské buňky, kde je exprimována (tj. přeložena) z DNA na polypeptid v cytoplasmě. Polypeptid se potom purifikuje z hostitelských buněk. Tento postup bývá často označován názvem „přímá“ exprese polypeptidu.

Přímá exprese polypeptidu je sice často nejůčelnějším způsobem výroby tohoto polypeptidu, ale může být spojena s určitými problémy.

Když se polypeptid syntetizuje v hostitelské buňce a začíná se akumulovat, může se stát toxickým pro hostitelskou buňku a usmrtit ji. Kromě toho intracelulámí proteasy mohou rychle degradovat syntetizované molekuly polypeptidu. Mimo to, při zvyšování intracelulámí koncentrace polypeptidu může hostitelská buňka přestat produkovat polypeptid na základě mechanismu zpětné vazby, který vyvolá ukončení syntézy polypeptidu. Jiná možnost spočívá v tom, že polypeptidy, které zůstanou v cytoplasmě mohou po syntéze podlehnout posttranslační modifikaci, jako je acetylace.

Sekrece polypeptidů

Aby bylo možno se vyhnout problémům spojeným s přímou expresí polypeptidů, byly vyvinuty jiné způsoby exprese polypeptidů. Jednou takovou metodou je tzv. „nepřímá exprese“, která umožňuje sekreci polypeptidu z hostitelské buňky během jeho produkce. Tato metoda bývá také označována názvem „sekreace“ nebo „zpracování“ (processing) polypeptidu. Po sekreci může být polypeptid izolován z kultivačního média nebo, v případě gram-negativních bakteriálních hostitelských buněk z periplasmického prostoru nebo „periplasmatu“, což je oblast mezi vnitřní a vnější buněčnou membránou. Použití sekrece může proto napomoci snížit problémy spojené s intracelulámí akumulací polypeptidu.

Některé polypeptidy, které jsou přirozeně produkovány v bakteriálních buňkách (nebo jiných buňkách), jsou z těchto buněk vylučovány do mimobuněčného prostředí (nebo v případě gramnegativních bakterií do periplasmatu). Sekreace polypeptidu z bakteriálních buněk pravděpodobně zahrnuje sladění několika intracelulámích proteinů, které jsou známy pod názvem proteiny „chaperone“ (Zhu et al., Pharm. Těch., duben 1993), str. 28 až 38; Simonen et al., Microbiol. Rev. 57: 109 až 137, 1993). Proteiny chaperone identifikují polypeptid, který má být vylučován a napomáhají sekrečnímu procesu.

- 1 CZ 284204 B6

Vylučované polypeptidy mají obvykle následující struktur. Jakou součást aminokyselinové sekvence obsahují signální peptit (který je též znám pod označením vedoucí peptid, vedoucí sekvence nebo signální sekvence). Signálním peptidem je obvykle poměrně malý peptid, který je zpravidla syntetizován během translace jako aminoterminální část polypeptidu. Polypeptid, 5 k němuž je připojen jeho signální peptid, bývá často označován názvem „prekursorový polypeptid“ nebo „immaturovaná forma polypeptidu“. Signální peptid orientuje polypeptid o plné délce napříč buněčné membrány. V průběhu sekrece polypeptidu se signální peptid odštěpí. Díky tomu se buněčnou stěnou membrány (nebo vnitřní buněčnou membránou v případě gramnegativních bakterií, jak je to popsáno dále) vylučuje pouze „maturovaná“ forma polypeptidu. 10 Jelikož se signální peptid odštěpí, má maturovaný polypeptid obvykle nižší molekulovou hmotnost než prekursorový polypeptid.

Sekvence nukleové kyseliny nebo geny kódující většinu polypeptidů vyskytujících se v přírodě, které jsou určeny pro sekreci, obvykle obsahují sekvence DNA prekursorového polypeptidu, tj. 15 5’ konec genu obsahuje sekvenci kódující signální peptid a 3’ konec signální sekvence DNA je připojen k 5’ konci sekvence kódující maturovanou formu polypeptidu. Prekursorový polypeptid se proto během translace syntetizuje jako jediná jednotka se signální sekvencí u aminokonce polypeptidu. Byly identifikovány mnohé prokaryontní signální peptidy (viz např. Gennity et al., J. Bioenerg. Biomemb., 22: 233 až 269, 1990).

Signální peptidy mají často shodné určité strukturní znaky. Tak například mnohé signální peptidy prokaryontního původu mají délku asi 20 až 30 aminokyselin. Kromě toho, aminokonec signálního peptidu obvykle nese kladný náboj a centrální část signálního peptidu je obvykle hydrofobní (Pugsley, Microbiol. Rev. 57: 50 až 108, 1993). Přes tyto podobnosti vykazuje každý 25 vyloučení polypetid, který byl současné době identifikován v některém prokaryontním organismu, jako je bakterie E. coli, určitou jedinečnou sekvencí signálního peptidu. Kromě toho ne všechny typy buněk rozpoznávají a mají tedy schopnost zpracovat všechny sekvence signálního peptidu. Určitý' signální peptid může být rozpoznán a může být tedy schopen orientovat polypeptid přes buněčnou stěnu v určitých prokaryontních buňkách, ale nemusí být 30 funkční v eukaryontních buňkách.

Polypeptid. který není normálně vylučován prokaryontními buňkami, je možno zkonstruovat pro sekreaci za použití rekombinantní DNA techniky. Přitom se může postupovat tak, že se vytvoří konstrukt nukleové kyseliny, v němž je DNA kódující polypeptid připojena svým 5’-koncem 35 k přírodní nebo syntetické sekvenci DNA kódující signální peptid. Pro sekreci je nutné, aby byla zvolená sekvence signálního peptidu rozpoznatelná, a tedy zpracovatelná hostitelskou buňkou, do níž má být konstrukt vložen a v níž má dojít k expresi. Tak například signální peptid získaný z přírodního vyloučeného bakteriálního polypeptidu může být připojen k polypeptidu z jiného zdroje, jako z lidské tkáně, za vzniku hybridního prekursorového polypeptidu, který- může byt 40 syntetizován v těchto bakteriálních (nebo jiných prokaryontních) buňkách rozpoznávajících tento signální peptid a schopných jej zpracovat a který může být vylučován z těchto buněk. Tento hybridní konstrukt mže být zaveden do hostitelské buňky a hostitelská buňka může mít potom schopnost produkovat a vylučovat tento polypeptid.

Vedle základního problému, zda bude polypeptid z buněk vylučován, či nikoliv, bude skutečné množství polypeptidu produkovaného v bakteriálních buňkách ovlivňováno řadou faktorů. Takovými faktory jsou například podmínky kultivace (Jacques et al., J. Mol. Biol. 226: 597 až 608, 1992), rychlost iniciace translace (Gold, Ann. Rev. Biochem., 57: 199 až 233, 1988) a rychlost degradace polypeptidu v buňce (alespoň částečně v důsledku působení intracelulámích 50 proteas). Rychlost a množství vylučovaného polypeptidu jsou tedy ovlivňovány těmito faktory.

Kromě toho má na sekreaci vliv typ aminokyselinového zbytu přítomného u aminokonce maturovaného polypeptidu. Zdá se, že když některý z těchto zbytků nese kladný náboj, je sekrece snížena (Andersson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:9751 až 9754, 1991).

-2CZ 284204 B6

Polypeptidy „Met-less“

Mnoho terapeuticky užitečných humánních polypeptidů je produkováno v prokaryontních buňkách, jako jsou bakterie, za použití rekombinantních DNA technik.

Heterologní polypeptid (jako je humánní polypeptid) produkovaný v prokaryontních buňkách za použití rekombinatní DNA techniky není vždy totožný s přírodní formou tohoto polypeptidů. Tyto dvě formy se mohou ve své chemické struktuře mírně lišit. Tak například mnohé humánní polypeptidy produkované v bakteriálních hostitelských buňkách za použití rekombinantní DNA 10 techniky obsahují aminokyselinu methionin „Met“ u aminokonce („aminoterminální Met“). Tyto stejné humánní polypeptidy v podobě, v jaké se vyskytují v přírodě, obvykle neobsahují aminoterminální Met, poněvadž ten zbytek je obvykle odštěpen během sekreace polypeptidů z humánní buňky, v níž jsou přirozeně syntetizovány, do proudu krve nebo jiné extracelulámí tekutiny, v němž se přirozeně nacházejí.

V některých případech, v nichž se humánní polypeptidy syntetizují v prokaryontních buňkách, může být aminotermální methionin odštěpen cytoplasmatickou methionin-amino peptidasou hostitelské buňky, ale takové odštěpení je zřídka kdy úplné, pokud dochází v hostitelské buňce k nadexpresi polypeptidů.

Polypeptidy NGF

Třída polypeptidů NGF (NGF = nervový růstový faktor), tzv. polypeptidy NGF, představuje skupinu strukturně a funkčně příbuzných neurotrofních faktorů vyskytujících se v mnoha 25 buňkách a tkáních nervového systému a tkáních, které jsou inervovány složkami nervového systému. V současné době zahrnuje třída polypeptidů NGF polypeptidy BDNF (neurotrofhí faktor pocházející z mozku), NGF (nervový růstový faktor), NT-3 (neurotrofin-3), NT—1 (neurotrofin—k popsaný v přihlášce PCT č. 93/25684 publikované 23. prosince 1993; PCT přihlášce č. 92/05254 publikované 2. Dubna 1992 a Hallbook et al., Neuron, 6: 845 až 858, 30 1991)aNT-5.

Bylo ukázáno, že tyto polypeptidy fungují při růstu, přežívání a/nebo diferenciaci různých typů nervových buněk.

Polypeptidy BDNF, NT-3, NGF a NT-4 vykazují významnou homologii sekvence aminokyselin. Polypeptidy BDNF a NGF jsou homologní přibližně z 55 % na úrovni aminokyselin. NT-3 je homologní vzhledem k BDNF asi z 58 % a kNGF asi z 57 % (Narhi et al., J. Biol. Chem. 268: 13309 a 13317, 1993). Homologie NT-4 vzhledem k maturovaným polypeptidúm NFG, BDNF a NT-3 na úrovni aminokyselin činí 46, 55 a 52 % (PCT 92/05254, datum zveřejnění 2. dubna 40 1992; Hallbook et al., Neuron 6: 846 až 858, 1991).

Polypeptidy NGF obsahují několik cysteinových zbytků a aminokyselinová sekvence v oblasti těchto cysteinových zbytků je poměrně konzervovaná (Narhi et al., výše uvedená citace).

S ohledem na úkoly polypeptidů NGF NT-3, NT-4 a BDNF při udržování nervového systému se předpokládá, že pokud budou tyto polypeptidy vyrobeny v biologicky účinné formě, stanou se užitečnými léčivy pro léčení různých chorob a poruch nerovového systému. Jedná se například o poruchy nebo poškození nervového systému vyvolané: úrazy, chirurgickými zákroky, infekcemi, expozicí toxinům a/nebo špatnou výživou; různé neuropathie, Alzheimerovu chorobu, 50 Parkinsonovu chorobu, roztroušenou sklerózu, amylotrofní laterální sklerózu, Huntingtonovu choreu, extra-familiámí tremor apod.

V US patentu č. 5 235 043 (patent vydán 10. srpna 1993) jsou údajně popsány způsoby produkce maturovaných humánních členů spadajících do třídy proteinů NGF (NT—3)/BDNF, které

- j CZ 284204 B6 vykazují plnou biologickou účinnost. Tyto polypeptidy mohou být údajně vylučovány z hostitelských buněk za použití signálního peptidu, jako je signální peptid OmpA.

V US patentu č. 4 757 013 (patent vydán 12. července 1988) je popsán klonovací plasmid, který je užitečný pro sekreci polypeptidů v bakteriálních hostitelích. Kromě jiných sekvencí nukleové kyseliny obsahuje tento plasmid popřípadě fragment DNA kódující signální peptid proteinu OmpA z E. coli. Tento plasmid údajně zajišťuje účinnou sekreci přes cytoplasmatickou membránu.

V US patentu č. 4 338 397 (patent vydán 6. července 1982) je popsán způsob sekrece polypeptidů produkovaného v bakteriální hostitelské buňce. Tento způsob údajně umožňuje produkci proteinů bez chemických substituentů, jako je protein „f-met“.

V publikaci Tanji et al., J. Bacteriol., 1973: 1997 až 2005, 1991 jsou popsány určité aminokyselinové substituce nebo delece v signálním peptidu OmpA aminokyselině sekvence.

V publikaci Godstein et al., J. Bacteriol. 172: 1225 až 1231, 1990 jsou popsány mutanty signálního peptidu OmpA s pozměněnou úrovní hydrofobicity. Tyto mutanty údajně vykazují různou schopnost působit jako signální peptidy pro dva proteiny při průchodu membránou buňky E. coli.

V publikaci Lenhardt et al., J. Biol. Chem. 263: 10300 až 10303, 1998, jsou popsány mutanty signálního peptidu OmpA. v nichž je údajně pozměněn celkový náboj aminoterminálního konce.

V publikaci Lenhardt et al., J. Biol. Chem 262: 1716 až 1719, 1987, je popsána produkce mutantů signálního peptidu OmpA. Tyto mutanty obsahují zkrácenou hydrofobní oblast a údajně je změněna jejich schopnost působit jako sekreční sekvence pro určité proteiny.

S ohledem na problémy, se kterými se střetla příprava velkých množství polypeptidů za použití rekombinantní DNA techniky, existuje v tomto oboru potřeba vyvinout způsoby výroby zajišťující zvýšení výtěžku těchto polypeptidů při výrobě za použití rekombinantní DNA techniky. Kromě toho existuje v tomto oboru potřeba vyvinout rekombinantní polypeptidy ve formě „Met-less“.

Úkolem tohoto vynálezu je proto vyvinout signální peptid a sekvenci nukleové kyseliny kódující tento signální peptid pro zajištění zvýšené účinnosti sekrece polypeptidů NGF produkovaného v prokaryontní hostitelské buňce.

Dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob přípravy polypeptidů NGF ve formě Metless.

Další úkoly tohoto vynálezu budou zřejmé odborníkům v tomto oboru na základě podrobného popisu, který následuje.

Podstata vynálezu

Jedním aspektem tohoto vy nálezu je signální peptid vykazující sekvenci

MKKRARAIAIAVALAGFATVAHA (SEQ ID NO: 1).

Jiným aspektem tohoto vynálezu je výše uvedený signální peptid, který u svého karboxylového konce obsahuje polypeptid BDNF, NGF, NT-3, NT-4 nebo NT-5.

-4CZ 284204 B6

Dalším aspektem tohoto vynálezu je nukleová kyselina vykazující sekvenci SEQ ID NO: 2.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je nukleová kyselina vykazující sekvenci SEQ ID NO: 3.

Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu je nukleová kyselina vykazující sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 3, která navíc obsahuje u svého 3’ konce nukleovou kyselinu kódující aminoterminální polypeptid NGF Met-less.

Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu je vektor obsahující nukleovou kyselinu vykazující sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo SEW ID NO: 3, která je svým koncem 3’ připojena k nukleová kyselině kódující aminoterminální polypeptid NGF Met-less. Tímto vektorem může být popřípadě vektor pCFM1656/BDNFopt3 nebo pCFM1656/NT-3opt3.

Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu je prokaryontní hostitelská buňka, do níž byl vložen výše uvedený vektor.

Dalším aspektem vynálezu je způsob přípravy polypeptidu NFG v podobě Met-less, jehož podstata sočívá v tom, že se kultivuje prokaryontní hostitelská buňka, do níž byl vložen vektor obsahující nukleovou kyselinu vykazující sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 3, která je svým koncem 3’ připojena knukleové kyselině kódující aminoterminální polypeptid NGF Metless a izoluje se vyloučený polypeptit NGF.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněna aminokyselinová sekvence syntetického signálního peptidu RH, který je užitečný pro zvýšení sekrece určitých polypeptidů z buněk E. coli (SEQ ID NO: 1).

Na obr. 2 je znázorněna degenerovaná nukleotidová sekvence kódující signální peptid RH. „R*‘ představuje A nebo G; „W“ představuje A nebo T/U; „Y“ představuje C nebo T/U; a „D“ představuje A, G nebo T/U (SEQ ID NO: 2). Tato sekvence byla zkonstruována pro využití přednostního kodonu u prokaryotních buněk.

Na obr. 3 je znázorněna jedna nukleotidová sekvence RH11, která kóduje signální peptid RH (SEQ ID NO: 3).

Na obr. 4A a 4B jsou znázorněny syntetické sekvence DNA kódující humánní aminokyselinovou sekvenci BDNF, která je užitečná pro přípravu a expresi BDNF v prokaryontní hostitelské buňce. Na obr. 4A (SEQ ID NO: 4) je znázorněna sekvence se start kodonem Met, zatímco na obr. 4B (SEQ ID NO: 22) je znázorněna stejná sekvence bez start kodonu ATG Met.

Na obr. 5A a 5B jsou znázorněny syntetické sekvence DNA kódující humánní aminokyselinovou sekvenci NT-3, která je užitečná pro přípravu a expresi NT-3 v prokaryotní hostitelské buňce. Na obr. 5A (SEQ ID NO: 5) je znázorněna sekvence se start kodonem Met, zatímco na obr. 5B (SEQ ID NO: 23) je znázorněna stejná sekvence bez start kodonu ATG Met.

Na obr. 6 je uveden schematický diagram znázorňující strategii použitou při přípravě syntetické sekvence nukleové kyseliny BDNF, jež je svým 5’ koncem připojena k sekvenci nukleové kyseliny kódující signální peptid RH. „SP“ označuje sekvenci signálního peptidu; v diagramu jsou také uvedeny zvolené restrikční enzymy. Relativní velikosti sekvencí nukleových kyselin nejsou uvedeny v měřítku.

Jak již bylo uvedeno výše, je vynález založen na objevu, že určité sekvence signálního peptidu slouží pro zvýšení množství polypeptidů NFG vyloučených z některých prokaryontních hostitelských buněk.

Příprava vynálezu

Vynález předpokládá použití signálního peptidu RH pro zvýšení exprese a sekrece polypeptidů z třídy polypeptidů nervového růstového faktoru (NGF) syntetizovaných a exprimovaných v prokaryontních hostitelských buňkách. Tyto polypeptidy jsou v popisu označovány názvem „polypeptidy NGF“ nebo „NGF polypeptidy“.

Vynález kromě toho poskytuje prostředek umožňující přípravu polypeptidů NGF, který postrádá u svého amino-konce methioninový zbytek. Takové polypeptidy NGF jsou v popisu označovány názvem „polypeptidy NGF Met-less“.

1. Příprava sekvencí nukleových kyselin RH

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají všechny možné sekvence nukleové kyseliny kódující signální peptid RH. Nukleové kyseliny se zčásti degenerovaným kodonem (tato sekvence byla zkonstruována pro využití přednostního kodonu u prokaryontních buněk) pro RH jsou uvedeny na obr. 2. Jednou z přednostních nukleových kyselin kódujících RHje RH11. jehož sekvence je uvedena na obr. 3.

Nukleové kyseliny kódující signální peptid RH mohou být snadno připraveny způsoby dobře známými v tomto oboru, jako například způsobem popsaným v Engels et al.. Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716 až 734. 1989. Přednostním způsobem je syntéza na polymemím nosiči za použití standardní fosforamiditové chemie.

2. Příprava DNA kódující polypeptidy NGF

Do rozsahu tohoto vy nálezu spadá způsob přípravy polypeptidů NGF z jakéhokoliv savčího zdroje. Jako neomezující příklady je možno uvést polypeptidy NGF humánního hovězího a vepřového původu. Přednostním zdrojem je člověk. Jako neomezující příklady polypeptidů NGF spadajících do rozsahu tohoto vynálezu je možno uvést BDNF (neurotrofní faktor procházející z mozku), NT-3 (neurotrofm-3, také označovaný názvem NGF-3, kde zkratkou NGF se označuje nervový růstový faktor), NT^l (neurotrofin-4), NT-5 (neurotrofin-5) a jiní členové této třídy, kteří jsou spřízněni významnou homologií sekvence aminokyselin nebo nukleové kyseliny, jako je homologie. již vykazují v současné době známí členové této třídy.

Sekvenci DNA kódující poly peptidy NGF podle vynálezu je možno izolovat a získat ve vhodném množství za použití jednoho nebo více způsobů, které jsou dobře známy v tomto oboru. Tylo a jiné způsoby, které jsou užitečné pro izolaci takové DNA jsou například uvedeny v následujících citacích: Sambrook et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 a Berger a Kimmel (Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, sv. 152. Academie Press, lne., San Diego, CA, 1987.

Přednostními sekvencemi nukleové kyseliny pro BDNF jsou sekvence uvedené na obr. 4A a 4B. přednostními sekvencemi nukleové kyseliny pro NT-3 jsou sekvence uvedené na obr. 5A a 5B.

Pokud je aminokyselinová sekvence polypeptidů NGF známa, je možno pravděpodobnou a funkční nukleovou kyselinu kódující tento polypeptid odvodit za použití známých a/nebo přednostních kodonů pro každý z aminokyselinových zbytků.

-6CZ 284204 B6

Pokud je sekvence nukleové kyseliny polypeptidu NGF úplně známa, tuto sekvenci je možno syntetizovat úplně nebo zčásti za použití metod chemické syntézy, jako jsou například metody popsané v Engels et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716 až 734, 1989. Tyto metody mj. zahrnují fosfotriesterový, fosforamiditový a H-fosfonátový způsob syntézy nukleových kyselin. DNA kódující takový polypeptid bude mít obvykle délku několika stovek bázových párů (bp) nebo nukleotidů. Nukleové kyseliny ve formě několika fragmentů, z nichž každý bude obsahovat až asi 100 nukleotidů. Připravené fragmenty lze potom ligovat, jak je to popsáno dále za vzniku nukleové kyseliny o úplné délce kódující polypeptid NGF.

Alternativně lze nukleovou kyselinu kódující polypeptid NGF získat screeningem vhodné cDNA knihovny (tj. připravené z tkáňového zdroje, u něhož se předpokládá exprese tohoto polypeptidu) nebo genomové knihovny za použití jedné nebo více nukleových kyselin jako prób (oligonukleotidů, nebo fragmentů cDNA nebo genomové DNA s přijatelnou úrovní homologie vzhledem k nukleové kyselině, která má být klonována apod.), jež bude selektivně hybridizovat s požadovanou nukleovou ky selinou.

Další vhodnou metodou pro získání nukleové kyseliny kódující polypeptid NGF je řetězová polymerační reakce za použití polymerasy (PCR). Úspěšné použití této metody však vyžaduje, aby bylo k dispozici dostatečné množství informací o sekvenci nukleové kyseliny kódující polypeptid NGF, jež by umožnily zkonstruovat vhodné oligonukleotidové primery užitečné pro amplifikaci sekvence nukleové kyseliny.

Pokud zvolený způsob přípravy nukleové kyseliny kódující polypeptid NGF vyžaduje použití oligonukleotidových příměrů nebo prób (například PCR nebo screening cDNA nebo genomové knihovny), měly by mít oligonukleotidové sekvence zvolené jako próby nebo primery vhodné délku a měly by být dostatečně určité, aby se minimalizoval rozsah nespecifické vazby, k níž dochází během screeningu knihovny nebo PCR. Skutečná sekvence prób nebo primerů je obvykle založena na konzervovaných vysoce homologních sekvencích nebo oblastech ze stejného nebo podobného genu z jiného organismu. Próby nebo primery mohou být popřípadě degenerované.

V případech, kdy je známa pouze aminokyselinová sekvence polypeptidu NGF, je možno pravděpodobnou a funkční nukleovou kyselinu kódující tuto polypeptidovou sekvenci odvodit za použití známých a přednostních kodonů pro každý z aminokyselinových zbytků. Takovou sekvenci lze potom chemicky syntetizovat způsoby uvedenými výše.

Do rozsahu vynálezu spadá také příprava mutantních sekvencí polypeptidů NGF. Pod označením „mutantní sekvence/ jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí sekvence obsahující jednu nebo více nukleotidových substitucí, delecí a/nebo insercí ve srovnání se sekvencí divokého typu. Takové substituce, delece a/nebo inserce nukleotidů mohou vést ke vzniku polypeptidů NGF, který se svou aminokyselinovou sekvencí odlišuje od aminokyselinové sekvence divokého typu. Příprava takových mutantů je v tomto oboru dobře známa a je například popsána v publikaci Wells et al. Gene, 34: 315, 1985 a v publikaci Sambrook at al. citované výše.

3. Příprava prekursoru polypeptidu NGF

Nukleovou kyselinu kódující prekursor polypeptidu NGF (tj. formu obsahující sekvenci signálního peptidu) je možno připravit za použití kterékoliv z řady různých metod. Podle jedné metody je možno nukleovou kyselinu kódující signální peptid RH přímo ligovat k nukleové kyselině kódující polypeptid NGF, za předpokladu, že nukleová kyselina kódující polypeptid NGF neobsahuje kodon pro aminoterminální methionin. Ligaci dvou nukleových kyselin je možno provést ligaci natupo nebo vytvořením vhodného místa pro restrikční endonukleasu v oblasti u 3’ konce nukleové kyseliny pro signální peptid RH za použití enzymu ligasy a podle

-7CZ 284204 B6 protokolu výrobce nebo za použití metod dobře známých v tomto oboru, jako jsou metody uvedené ve výše citované publikaci Sambrook et al.

Alternativně lze nukleovou kyselinu kódující signální peptid RH připojit k sekvenci nukleové kyseliny kódující polypeptid NGF za použití reakce PCR. V tomto případě se jako prvního PCR primeru použije nukleové kyseliny kódující signální peptid RH obsahující celou RH sekvenci a případně 50 až 21 nukleotidů u 3’ konce, které zahrnují prvních (tj. 5’) pět až sedm kodonů sekvence nukleové kyseliny kódující polypeptid NGF s vyloučením Met kodonu (obvykle ATG).

Primer tvořený nukleovou kyselinou RH/5’ NGF se syntetizuje za použití dobře známých metod, jako je standardní fosforamiditová chemie. Druhým PCR primerem může být nukleová kyselina, která je komplementární k posledním 6 až 8 kodonům (18 až 24 nukleotidům) nukleové kyseliny NGF, tj. ke kodonům u 3’ konce této nukleové kyseliny. Tímto způsobem lze za použití PCR vytvořit sekvenci nukleové kyseliny, jež se skládá z RH připojeného k plné délce nukleové kyseliny kódující polypeptid NGF bez aminoterminálního Met kodonu nukleové kyseliny kódující tento polypeptid NGF.

Při jiné způsobu, který je užitečný pro přípravu nukleové kyseliny kódující prekursor polypeptidu NGF se také používá PCR. Zde se nukleová kyselina o úplné délce kódující polypeptid NGF (který může obsahovat aminoterminální Met kodon) nejprve vloží do klonovacího nebo expresního vektoru. Reakce PCR se potom použije pro přípravu nukleové kyseliny obsahující sekvenci RH připojenou k nukleové kyselině o úplné délce kódující polypeptid NGF. Jako PCR primerů se používá podobných primerů. jaké byly popsány výše.

Jeden z primerů použitých pro PCR je komplementární k sekvenci vektoru umístěné ve směru 3‘ vzhledem k oblasti nukleové kyseliny kódující polypeptid NGF. Druhý primer obsahuje v pořadí 5’ až 3’ část (asi 12 až 25 nukleotid) sekvence vektoru, jež je umístěna bezprostředně ve směru 5’ vzhledem k sekvenci kódující NGF; nukleotidovou sekvenci o úplné délce kódující signální peptid RH a nukleotidovou sekvenci kódující prvních 5 až 8 aminokyselin s vyloučením aminoterminálního methoninu polypeptidu NGF. Když se tento primer hybridizuje k vektoru obsahujícímu jako insert nukleovou kyselinu kódující polypeptid NGF může část sekvence vektoru a část sekvence kódující polypeptid NGF hybridizovat k primeru, zatímco část sekvence RH hybridizovat nemůže. Část RH může vytvořit smyčkovou strukturu.

Druhý PCR primerem pro použití při této metodě může být sekvence nukleové kyseliny, jež je komplementární k posledním šesti až osmi kodonům (18 až 24 nukleotidům) nukleové kyseliny kódující polypeptid NGF nebo k části sekvence vektoru umístěné 3’ vzhledem k sekvenci nukleové kyseliny NGF.

Během PCR bude amplifikovaný produkt nukleové kyseliny obsahovat 5’ až 3’ část 5' sekvence vektoru, sekvenci signálního peptidu RH, sekvenci nukleové kyseliny o plné délce kódující polypeptid NGF bez aminoterminálního Met kodonu a část 3’ sekvence vektoru. Po PCR je možno získaný PCR produkt štěpit vhodnými restrikčními enzymy za účelem získání nukleové kyseliny kódující prekursorovou formu polypeptidu NGF, jež po odštěpení signálního peptidu RH během sekrece poskytne aminoterminální polypeptid NGF Met-less.

4. Příprava/selekce vektoru

Může se použít jakékoliv expresního vektoru, který je funkční ve zvolené prokaryotní hostitelské buňce, za předpokladu, že tento vektor obsahuje všechny potřebné složky nukleové kyseliny nebo prvky zajišťující expresi prekursoru polypeptidu NGF.

-8CZ 284204 B6

Tento vektor bude obvykle obsahovat promotor, prvek počátku replikace, prvek terminace transkripce, prvek místa vázajícího ribosom, oblast polylinkeru pro vložení nukleové kyseliny kódující polypeptid, který má být exprimován a prvek selekčního marketu.

A. Prvek promotoru

Promotor může být homologní (tj. může pocházet ze stejného prokaryontního druhu a/nebo kmene jako hostitelská buňka, heterologní (tj. z odlišného zdroje, než je druh nebo kmen prokaryontní hostitelské buňky) nebo syntetický. Zdrojem promotoru může být také jakýkoliv jednobuněčný prokaryontní nebo eukaryontní organismus, organismus jakéhokoliv obratlovce nebo bezobratlého nebo jakákoliv rostlina, s tou podmínkou, že je tento promotor funkční v hostitelské buňce a může jí být regulován. Větší přednost se z promotorů podle vynálezu dává indukovatelným promotorům, jako jsou promotory pocházející z bakteriofágu lambda, tj. lambda promotorům, jako jsou promotory Pr nebo Pl, promotor T₅ nebo promotor T₇; bakteriální promotorům, jako je lac, tac, (kompozit promotorů trp a lac), trp a tna. Vůbec největší přednost se dává promotor P_L.

Promotorové sekvence nukleové kyseliny, které jsou užitečné podle tohoto vynálezu, je možno získat kterýmkoliv způsobem známým v tomto oboru. Užitečné promotory byly obvykle dříve identifikovány mapováním a/nebo štěpením restrikční endonukleasou a je proto možno je izolovat i z vhodného tkáňového zdroje za použití příslušných restřikčních endonukleas. V některých případech mohl být promotor i sekvenován. Pokud je sekvence DNA promotoru známa, může být promotor syntetizován za použiti výše popsaných způsobů syntézy nebo klonování nukleové kyseliny.

Pokud jsou u promotorů známy celé sekvence nebo jejich části, může být promotor získán za použití PCR a/nebo screeningem genomové knihovny za použití vhodných oligonukleotidů a/nebo fragmentů promotorové sekvence za stejného nebo odlišného druhu.

Pokud sekvence promotoru známa není, může se fragment DNA obsahující promotor izolovat z většího kusu DNA. Který může například obsahovat kódující sekvenci nebo dokonce jiný gen nebo geny. Izolace se může provést štěpením restrikční endonukleasou za použití jednoho nebo více pečlivě zvolených enzymů, aby mohl být izolován správný fragment DNA. Po štěpení je možno požadovaný fragment izolovat purifikací na agarosovém gelu, sloupci Qiapqen^(R) nebo jinými způsoby, které jsou dobře známé odborníkům v tomto oboru. Výběr vhodných enzymů pro tento účel je odborníkům v tomto oboru zcela zřejmý.

B. Prvek počátku replikace

Tato složka je obvykle částí prokaryontních expresních vektorů, které lze zakoupit na trhu a napomáhá při aplifikaci vektoru v hostitelské buňce. Aplifikace vektoru na určitý počet kopii může být v některých případech důležitá pro optimální expresi polypetidu NGF. Neobsahuje-li zvolený vektor místo počátku replikace, může být toto místo chemicky syntetizováno na základě známé sekvence a do tohoto vektoru ligováno.

C. Prvek terminace transkripce

Tento prvek je obvykle umístěn 3' vzhledem ke konci sekvence kódující polypeptid NGF a slouží pro terminaci transkripce polvpeptidu NGF. Prvek terminace transkripce v prokaryontních buňkách je obvykle tvořen fragmentem bohatým na B-C, po němž následuje póly T sekvence. Tento prvek se snadno klonuje z knihovny nebo ho lze i zakoupit jako součást vektoru, ale také ho lze snadno syntetizovat za použití způsob syntézy nukleových kyselin, jako například způsobů popsaných výše.

-9CZ 284204 B6

D. Prvek selekčního markéru (markérů)

Geny selekčního markéru kódují proteiny potřebné pro přežití a růst hostitelské buňky rostoucí v selekčním kultivačním médiu. Typické geny selekčních markérů kódují proteiny, které a) udělují resistenci vůči antibiotikům nebo jiným toxinům, například ampicilinu, tetracyklinu nebo kanamycinu, v případě prokaryontních hostitelských buněk, b) doplňují autoxtrofní defícience buňky nebo c) dodávají kritické živiny, které nejsou dostupné z komplexního média. Přednostními selekčními markéry jsou gen resistence vůči kanamycinu, gen resistence vůči ampicilinu a gen resistence vůči tetracyklinu.

E. Prvek místa vázajícího ribosom

Tento prvek, který se obvykle označuje názvem Shine-Dalgamova sekvence, je potřebný pro translaci iniciace mRNA. Je obvykle umístěn 3’ vzhledem k promotoru a 5’ vzhledem k sekvenci kódující polypeptid, který· má být syntetizován. Shine-Dalgamova sekvence může být různá, ale obvykle se jedná o polypurin (tj. o sekvenci s vysokým obsahem A-G). Byla identifikována řada Shine-Delgemových sekvencí a všechny lze snadno syntetizovat za použití výše popsaných metod.

Všechny výše uvedené prvky, jakož i další prvky, které jsou užitečné podle vynálezu, jsou dobře známy odborníkům v tomto oboru a jsou například popsány v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 a Berger a Kimmel (Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, sv. 152, Academie Press, lne., San Diego, CA, 1987.

F. Konstrukce vektorů

Jako vektory, které jsou vy soce užitečné při provádění tohoto vynálezu, je možno uvést jakékoliv expresní vektory, které jsou kompatibilní se zvolenou prokaryotní hostitelskou buňkou.

V některých případech mohou být některé z různých prvků vektoru uvedených výše již přítomny v obchodně dostupných vektorech, jako jsou vektory pCU-18, pUC-19 a pGEM (Promega Corp., Madison, WI, USA), vektory p-Bluescript®, jako je pBIISK+/- (Stragagene Corp. La Jolla, CA, USA) apod., které se všechny hodí pro prokaryontní hostitelské buňky a může se jich použít při provádění tohoto vynálezu.

Pokud jeden nebo více prvků již není přítomno ve vektoru, jehož se má použít, mohou se získat jednotlivě a do vektoru ligovat. Způsoby vhodné pro získávání všech těchto prvků jsou době známy odborníkům v tomto oboru a jsou srovnatelné s výše popsanými metodami (tj. syntézo DNA, sereeningem knihovny apod.).

Přednostními vektory podle tohoto vynálezu jsou pCFMI1656 (vektor uložen podle Budapešťské dohody 24. února 1993 ve sbírce Američan Type Culture Collection, 12301, Parklawn Drive, Rockville. MD 20852, USA, pod přírůstkovým číslem 69 576), pGEM, vektory pBluescript^(R), pUC18 a pUC19. Plasmid pCFM1656 vyžaduje pro zvýšení počtu plasmidových kopií kultivační teplotu v rozmezí od asi 30 do asi 42 °C; při zvýšení teploty nad asi 42 °C dochází k inaktivaci represorového prvku CI857 promotoru PL.

Finální vektor pro použití podle vynálezu se obvykle konstruuje z výchozího vektoru, jako například z obchodně dostupného vektoru. Výchozí vektor může nebo nemusí obsahovat některé prvky, které jsou součástí finálního vektoru. Neobsahuje-li výchozí vektor žádný z požadovaných prvků, je možno každý z těchto prvků individuálně ligovat do vektoru rozštěpením vektoru příslušnou restrikční endonukleasou nebo endonukleasami tak, aby konce ligovaného prvku byly při ligaci kompatibilní s konci vektoru. V některých případech může být nutné konce, které mají

- 10CZ 284204 B6 být spolu ligovány, otupit, aby se dosáhlo uspokojivé ligace. Otupení se provádí tak, že se zavedou lepivé konce za použití DNA polymerasy Klenow nebo DNA polymerasy T4 za přítomnosti všech čtyř nukleotidů. Tento postup je dobře znám v daném oboru a je například popsán v publikaci Sambrook et al., citované výše.

Alternativně lze dva nebo více prvků vkládaných do vektoru nejprve vzájemně ligovat (pokud mají být umístěny vedle sebe) a potom vzniklý fragment ligovat do vektoru.

Jedna z dalších metod konstrukce vektoru spočívá v současné ligaci různých prvků v jedné reakční směsi. Přitom vznikne řada nekódujících nebo nefunkčních vektorů díky nevhodné ligaci nebo inserci prvků, pomocí štěpení restrikční endonukleasou je však možno identifikovat a selektovat funkční vektor.

Po konstrukci vektoru a po vložení nukleové kyseliny NGF do vhodného místa vektoru se může vzniklý vektor vložit do prokaryontní hostitelské buňky za účelem amplifikace a exprese NGF polypeptidu. Jako prokaryontních buněk se obvykle používá jakéhokoliv kmene E. coli, který je kompatibilní s promotorem ve vektoru tak, že tento promotor je v buňce E. coli funkční. Zvolený kmen by měl přednostně obsahovat regulační prvky řídící promotor tak, aby byla exprese polypeptidu NGF správně indukována. Jako vhodné kmeny E. coli je možno uvést kmen FM—5 (kmen uložen podle Budapešťské dohody ve sbírce ATCC, 19. května 1989 pod přírůstkovým číslem 53911), DH 5-a, MJ-101 apod. Jako hostitelské buňky mohou být kromě toho užitečné gram-negativní bakterie, jako jsou Salmonella a gram-pozitivní bakterie, jako Bacillus. Může se použít i jiných prokary ontních buněk.

Inserce (také označovaná termínem „transformace“ nebo „transfekce“) vektoru do zvolené hostitelské buňky se může provést za použití takových metod, jako je metoda s chloridem vápenatým, elektroporace. mikroinjekce, lipofekce nebo DEAE-dextranová metoda. Vhodná metoda se zčásti volí podle typu použití hostitelské buňky. Tyto a jiné vhodné metody, které jsou dobře známy odborníkům v tomto oboru, jsou například popsány v publikaci Sambrook et al., citované výše.

Hostitelské buňky obsahující vektor (tj. transformované hostitelské buňky) je možno kultivovat ve standardních médiích, která jsou dobře známa odborníkům v tomto oboru. Tato média zpravidla obsahují všechny živiny potřebné pro růst a přežití buněk. Jako vhodné média pro kultivaci buněk E. coli je například možno uvést půdu Luria Broth (LB) a nebo Terrific Broth (TB). K. médiu se obvykle přidává jako přísada antibiotikum nebo jiná sloučenina užitečná pro selektrivní růst pouze transformovaných buněk. Druh této sloučeniny je závislý na selekčním markerovém prvku obsaženém v plasmidu, jímž byla hostitelská buňka transformována. Je-li například prvkem selekčního markéru resistence vůči kanamycinu, buse se ke kultivačnímu médiu jako přísada přidávat kanamycin.

5. Vyhodnocená sekrece

Množství polypeptidu NGF vyloučeného z hostitelské buňky a tím převedeného na maturovanou formu Met-less je možno vyhodnotit standardními metodami známými v tomto oboru. Jako neomezující příklady vhodných metod je možno uvést analýzu Western blot. elektroforézu na SDS-polyakrylamidovém gelu, elektroforézu na nedenaturačním gelu, separaci HPLC. imunoprecipitaci a/nebo stanovení aktivity.

Pro provádění některých z výše uvedených stanovení může být zapotřebí nejprve předběžné manipulace s kultivačním materiálem hostitelských buněk, za účelem extrakce polypeptidu. Obvykle se při těchto stanoveních porovnává množství zpracovaného, tedy maturovaného, polypeptidu vyloučeného z hostitelské buňky s celkovým množstvím exprimovaného polypeptidu

- 11 CZ 284204 B6 (maturovaného polypeptidu + prekursorového polypeptidu). Extrakty z hostitelských buněk je možno připravit standardními metodami známými v tomto oboru, jako jsou například metody popsané v publikaci Culí et al., Meth. Enz. 182: 147 až 153, 1990. Pokud jsou použitými hostitelskými buňkami gram-pozitivní bakterie nebo jiné prokaryonty obsahující pouze jedinou cytoplasmatickou membránu, může být vyloučený polypeptid obsazen v buněčném kultivačním médiu. Pokud jsou hostitelskými buňkami gram-negativní bakterie, jako jsou bakterie E. coli nebo jiné prokaryontní buňky se dvěma membránami (vnitřní a vnější membránou), bude většina vyloučeného peptidu obsažena v periplasmickém prostoru, tj. v prostoru mezi vnitřní a vnější membránou.

Shromáždění nezpracované formy polypeptidu NGF (tj. prekursorové formy) bude obvykle vyžadovat extrakci polypeptidu z hostitelské buňky. Pro většinu analýz, jako je gelová elektroforéza, analýza Western blot a dot-blot, není potřeba prekursor polypeptidu NGF purifikovat. Místo toho je možno hostitelské buňky obsahující prekursor polypeptidu NGF jednoduše shromáždit peletizací v centrifuze a potom podrobit za standardních podmínek lysi. Zbytky buněk (membrány, materiál buněčných stěn apod.) je možno oddělit peletizací v centrifuze a rozpustnou frakci je potom možno přímo nanést na gel nebo dot-blot pro další analýzu.

Metody použité pro shromáždění zpracované nebo vyloučené formy polypeptidu NGF budou závislé na tom, zda je polypeptid umístěn v periplasmatu (gram-negativní bakterie) nebo v kultivačním médiu (gram—pozitivní bakterie a jiné prokaryonty).

Předpokládá-li se. že pohpeptid NGF bude obsažen v kultivačním médiu, může se alikvotu kultivačního média přímo použít pro gelovou elektroforézu, analýzu dot-blot a/nebo imunoprecipitaci.

Očekává-li se, že bude polypeptid NGF obsažen převážně v periplasmickém prostoru, může se obsah periplasmatu, včetně inklusních těles (pokud zpracovaný polypeptid vytvořil takové komplexy) extrahovat z hostitelské buňky za použití standardních technologií, které jsou známé odborníkům v tomto oboru. Hostitelské buňky je například možno podrobit lyži za účelem uvolnění jejich periplasmatického obsahu. Tato lyže se může provést ve francouzském lisu, homogenizací a/nebo zpracováním ultrazvukem. Vzniklý homogenát lze potom podrobit centrifugách

Pokud polypeptid NGF vytvořil v periplasmatu inklusní tělesa, jsou tato inklusní tělesa často vázána k vnitřní a/nebo vnější buněčné membráně, a proto jsou po centrifugaci převážně obsažena v materiálu pelety . Materiál pelety lze v takovém případě zpracovat chaotropickým činidlem, jako je guanidin nebo močovina, aby došlo k uvolnění, odštěpení a solubilizaci inkluzních těles. Polypeptid NGF, který· se po takovém zpracování vyskytuje v rozpustné formě, je potom možno analyzovat elektroforézou na gelu, imunoprecipitaci apod. Pokud má být polypeptid NGF izolován, může se pro izolaci použít standardních metod, jako jsou metody popsané dále a v publikaci Marston et al., Meth. Enz. 182: 264 až 275, 1990.

Pokud v periplasmatu hostitelské buňky ve významném rozsahu nevzniknou inklusní tělesa s obsahem polypeptidu NGF, je polypeptid NGF po centrifugaci buněčného homogenátu obsažen převážně v supematantu. Ze supematantu je možno polypeptit NGF izolovat způsoby, které jsou například uvedeny dále.

V těch situacích, kdy se dává přednost tomu, aby byla prekursorová a/nebo maturovaná forma polypeptidu NGF zčásti nebo úplně izolována, může se produkt podrobit purifikaci za použití standardních metod známých odborníkům v tomto oboru. Jako neomezující příklady vhodných metod je možno uvést elektroforetickou separaci následovanou elektroelucí, různé typy chromatografie (imunoafinitní chromatografie, chromatografie na molekulovém sítu a/nebo

- 12 CZ 284204 B6 chromatografie s výměnou iontů a/nebo vysokotlaká kapalinová chromatografie). Pro úplnou purifikaci se v některých případech přednostně používá více než jedné z výše uvedených metod. Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení vynálezu. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Sekrece BDNF

A. Příprava konstruktů DNA

Neurotrofní faktor pocházející z humánního mozku (BDNF) byl připraven expresí v buňkách E. coli podle následujícího protokolu. Nejprve byl zkonstruován syntetický gen BDNF za účelem zlepšení exprese v buňkách E. coli. Tento gen obsahoval několik kodonů pozměněných v jedné nebo více bázích ve srovnání se sekvencí nukleové kyseliny BDNF vyskytující se v přírodě. Sekvence syntetického genu označená zkratkou BDNFoptS, je uvedena na obr. 4. Tento gen kóduje methionin (ATG) u 5' konce genu.

Sekvence BDNFoptj byla připravena syntézou na polymemím nosiči za použití standardních metod fosforamiditové chemie. S ohledem na délku sekvence BDNFoptS byl gen syntetizován ve formě čtyř separátních segmentů: segment 1 obsahoval 104 bází a zahrnoval 5’ nepřeloženou sekvenci odpovídající sekvenci vektoru, restrikční místo Xbal, start kodon ATG a prvních 76 bází sekvence nukleové kyseliny GDNFopt3; segment 2 obsahoval následujících 117 bází BDNFopt3; segment 3 obsahoval následujících 107 bází BDNFopt3 a segment 4 obsahoval zbývajících 57 bází BDNFopt3 spolu se stop kodonem TAA, sekvencí restrikčního místa BamHI a 5 přídavnými nukleotid}. Segmenty byly spolu ligovány za použití standardních ligačních protokolů. Před ligací byly tři oligonukleotidy hybridizovány k fragmentům genu BDNFopt3 pro zajištění, že budou čtyři genové segmenty ligovány ve správném pořadí. Každý z těchto tří oligonukleotidů zprostředkovává jedno spojení mezi fragmenty genu BDNFopt3. Sekvence nukleové kyseliny každého z těchto oligonukleotidů je uvedena dále

ACTGCGGTTTTCTTATCAGC (SEQ ID NO : 6)

CAGCCTTCTTTAGTGTAACC (SEQ ID NO : 7)

GGATGAAGCGCCAGCCGATA (SEQ ID NO : 8)

Po liganci segmentů se malé části ligační směsi s úplnou délkou jednořetězcového genu použije jako templátu pro PCR za účelem amplifikace genu. Jako primerů pro PCR amplifikaci se použije

TTGATTCTAGAAGGAGGAA (SEQ ID NO : 9)

TCCGCGGATCCTTAGCGGCC (SEQ ID NO : 10)

Bylo provedené 25 cyklů PCR za použití následujících podmínek: denaturace při 94 °C po dobu 1 minuty; teplotní hybridizace při 55 °C po dobu 1 minuty; a prodlužování při 72 °C po dobu 2 minut. Amplifikovaný fragment byl purifikován z agarosového genu za použití soustavy GENECLEAN II (Bio 101, lne., La Jolla, CA, USA) a štěpen restrikčními enzymy Xbal a BamHI. Fragment byl vložen do vektoru pCFM1656 (přírůstkové číslo ATCC 69576) předem

- 13 CZ 284204 B6 rozštěpeného Xbal a BamHI. Tento vektor obsahující celou délku genu BDNFopt3, označený názvem pCFM1656/BDNFopt3, posloužil jako templát pro přípravu sekretovatelné formy genu BDNFopt3 (tj. formy obsahující signální sekvenci). Klonovací strategie použitá pro přípravu sekretovatelné formy genu BDNFopt 3 je znázorněna na obr. 6.

Degenerované sekvence oligonukleotidu kódující sekvence signálního peptidů uvedené na obr. 2 byly připraveny za použití syntézy na polymemím nosiči a standardní fosforamiditové chemie. Každá sekvence obsahovala u svého 5' konce asi 24 bází sekvence vektoru pCFM1656 umístěné 5’ vzhledem k sekvenci genu BDNFopt3 v pCFM1656/BDNFopt3 a u svého 3’ konce asi 18 bází kódujících první šest aminokyselin BDNFopt3 (s vyloučením aminoterminálního methioninu, který byl vypuštěn za účelem získání formy Met-les vylučovaného BDNFopt3).

Pro přípravy vylučované formy BDNFopt3 byly oligonukleotidy s degenerovanými kodony signálního peptidů RN a druhý oligonukleotid, který je komplementární k sekvenci vektoru za 3’ koncem genu BDNFoptS (tato sekvence je uvedena dále jako SEQ ID NO: 11) teplotě hybridizovány k pCFM1656/BDNFopt3.

GTTGCTGCGATTCTCACCAA (SEQ ID NO: 11)

Pro syntézu genu kódujícího celou sekvenci BDNFopt3 připojenou svým 5’ koncem knukleové kyselině kódující sekvenci signálního peptidů RH bylo potom použito řetězové reakce iniciované polymerasou (PCR). Reakce PCR byla provedena za použití reakčních složek a taq DNA polymerasy získané od firmy Boehringer Mannheim Biochemicals Ind. Bylo provedeno 25 cyklů PCR za použití následujících podmínek:

denaturace při 94 °C po dobu 1 minuty; teplotní hybridizace při 50 °C po dobu 1 minuty; a prodlužování při 72 °C po dobu 2 minut. Po PCR byl PCR produkt (asi 574 bp kódujících BDNFopt3 a signální peptid RH) zpracován na 0,8 % agarosovém gelu a 574bp fragment byl z gelu vyštěpen a purifikován za použití soupravy GENECLEAN II (Bio 101, lne.) podle instrukcí výrobce. Purifikovaný fragment byl rozštěpen Xbal a Xhol za vzniku fragmentu DNA o délce asi 20 bp kódujícího signální peptid RH a přibližně jednu třetinu genu BDNFopt 3 u 5’ konce. Vektor pCFM1656BDNFopt3 byl rozštěpen Xbal a Xhol, malý fragment kódující 5’ konec BDNFopt3 byl odstraněn a 200bp sekvence RH/BDNFopt3 byla ligována do takto rozštěpeného vektoru. Ligace byla provedena přes noc při teplotě asi 16 °C za použití ligasového pufru a enzymy od firmy Boehringer Mannheim lne., přičemž reakce byla prováděna podle instrukcí výrobce.

Po ligaci byly plasmidv vloženy (transformace) do kompetentních buněk E. coli K12 kmene FM-5 (přírůstkové číslo ATCC 5391 1). Inserce plasmidu byla provedena za použití standardního postupu s chloridem vápenatým, který je popsán v publikaci Sambrook et al., citované výše. Transformované buňky byly kultivovány přes nos při teplotě asi 30 °C v miskách se standardním agarovým médiem Luria Broth (LB) obsahujícím kanamycin v množství asi 50 μg/mL Po kultivaci bylo selektováno 16 jednotlivých kolonií. Těmito koloniemi bylo zaočkováno médium LB s obsahem kanamycinu asi 50 μg/ml. Kultivace probíhala přes nos při asi 30 °C v třepačce. Po kultivaci byly buňky zředěny asi v poměru 1 : 10 standardní půdou Terrific Broth (TB); Sambrook et al., výše uvedená citace) s obsahem kanamycinu a ponechány růst při asi 30 °C až do density OD600 0,5 až 0.8. Potom byla teplota zvýšena na asi 42 °C pro indukci exprese a sekrece BDNFopt3.

Po asi 4 hodinách byl přibližně 1 mg vlhké buněčné hmoty peletizován a peleta byla podrobena lyži vařením po dobu asi 10 minut vaši 100 μΐ standardního Tris-glycinového SDS-PAGE denaturačního/redukčního pufru (62,5mM Tris HC1, pH 6,8, 2 % SDS, 0,0025% bromfenolová modř, 10% glycerol, 2,5% β-merkaptoethanol). Asi 10 μΙ vzniklé směsi bylo potom zpracováno

- 14CZ 284204 B6 na standardním SDS polyakrylamidovém gelu (asi 18% akrylamidu). Zpracování bylo provedeno za konstantního napětí asi 130 V po dobu asi 2,5 hodiny. Gely, vzorkový pufr a mobilní pufr byly zakoupeny od firmy NOVEX, lne. (San Diego, CA, USA) a bylo jich použito podle instrukcí výrobce.

Jako kontrolní systém byla nukleová kyselina kódující signální peptid pro OmpA připojena ke genu BDNFopt3 za použití stejných postupů, jaké byly uvedeny výše v souvislosti s přípravou nukleové kyseliny RH/BDNFopt3. Pro vytvoření signálního peptidu OmpA bylo použito následujících oligonukleotidové sekvence:

ATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGAAAAAGACAGCTATCGCGATT GCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCCACTCTG ACCCGGCTCGT (SEQ ID NO: 12)

Tak jako u oligonukleotidů RH obsahoval oligonukleotid OpmA u svého 5’ konce asi 24 bází sekvence vektoru pCM1656 a u svého 3’ konce asi 18 bází kódujících prvních 6 aminokyselin BDNFopt3 (s vyloučením aminoterminálního methoninu).

B. Analýza sekvencí nukleové kyseliny signálního peptidu

Účinnost různých nukleotidových sekvencí kódujících signální peptid RH byla analyzována jako procentický podíl množství zpracovaného BDNFopt3 (polypeptidu BDNFopt3, z něhož byl odštěpen signální peptid) ve srovnání s celkovým množstvím produkovaného proteinu BDNFopt3 (zpracované i nezpracované formy). Pro srovnání těchto dvou forem BDNFopt3 byl SDS gen obarven modří Coomassie a po obarvení podroben zkoumání za účelem zjištění relativního množství každé z těchto forem. Molekulární hmotnost nezpracovaného prekursorového polypeptidu BDNFopt3 je asi 15,8 kDa, zatímco molekulární hmotnost zpracované formy BDNFopt3 je asi 13,5 kDa. Tyto dvě formy BDNFopt3 tedy vytvářejí zřetelně odlišné pásy na SDS-denaturovaném polyakrylamidovém gelu.

V případě řady polypeptidů RH/BDNFopt3 byly oba pásy (tj. pás zpracovaného i nezpracovaného BDNFopt3) viditelné jak při obarvení gelu modří Coomassie, tak při analýze gelu pomocí Western blotting za použití detekce BDNFopt3 na blotu Western pomocí polyklonální protilátky anti-BDNF. Při vizuální inspekci se ukázalo, že jedna sekvence nukleové kyseliny RH, tj. RH11, zpracovalo více BDNFopt3 ve srovnání s ostatními sekvencemi nukleové kyseliny RH, jako RH12 a ve srovnání se sekvencí nukleové kyseliny OmpA. Gel byl prozkoumán za použití zařízení Ultrascan XL (Pharmacie LKB) za účelem zjištění relativních množství zpracovaného a nezpracovaného BDNF v případě různých sekvencí nukleové kyseliny signálního peptidu RH a sekvence nukleové kyseliny signálního peptitu OmpA. Výsledky tohoto zkoumání v případě sekvencí nukleové kyseliny RH11, RH12 a OmpA jsou uvedeny v tabulce 1, která následuje. Tyto výsledky uvádějí plochu pod křivkou (absorbance x šířka proteinového pásu na gelu v mm) získané měřením na gelu.

Tabulka 1

OmpA RH11 RH12

Nezpracovaný BDNF	0,64	0,07	1,61
Zpracovaný BDNF	0,34	0,65	0,73
Podíl zpracovaného
BDNF (%)	34,7	90,3	31,2

- 15 CZ 284204 B6

Jak je zřejmé, za použití sekvence nukleové kyseliny signálního peptidu RH11 se dosáhne účinnějšího zpracování BDNFopt3 ve srovnání s použitím sekvence OmpA nebo RH12.

Příklad 2

Sekrece NT-3

A. Příprava konstruktů DNA

Byl připraven syntetický gen kódující humánní NT-3 za účelem exprese v buňkách E. coli. Tento gen byl sestrojen pro zlepšení exprese v těchto buňkách za použití přednostních bakteriálních kodonů. Sekvence tohoto syntetického genu je uvedena na obr. 5.

Syntetický gen o názvu NT-3opt3 byl připraven syntézou na polymemím nosiči za použití standardních metod fosforamiditové chemid. S ohledem na délku sekvence NT-3otp3 byl gen syntetizován ve formě čtyř separátních fragmentů nukleové kyseliny, jejichž délka ležela v rozmezí od 94 do 104 nukleotidů: fragment kódující 5’ část genu NT-3opt3 obsahoval určitou nekódující sekvenci 5’ vzhledem ke start kodonu ATG za účelem poskytnutí místa Xbal. Fragment kódující 3’ část NT-3opt3 obsahoval určitou nekódující sekvenci u 3’ konce za účelem poskytnutí restrikčního místa BamHI.

Po syntéze byly fragmenty vzájemně ligovány za použití nukleových kyselin pro oligonukleotidové spojení, jejich sekvence jsou komplementární vzhledem k oblastem okolo každého ligačního spojení. Teplotní hybridizace a ligace byly prováděny za použití standardních protokolů.

Oligonukleotidové sekvence použití jako sekvence pro spojení jsou uvedeny dále

AGCGGAGGATTTGTCGGTAA (SEQ ID NO: 13)

CTTTGCAACGGGTTTCGTAG (SEQ ID NO: 14)

GTTTTCGGAGGTCAGAGCAC (SEQ ID NO: 15)

Malé částice ligované směsi s úplnou délkou jednořetězcového genu NT-3 opt3 bylo použito jako templátu pro PCR za účelem amplifíkace genu NT-3opt3. Pro tuto PCR bylo použito následujících dvou oligonukleotidů jako primerů.

TTGATTCTAGAAGGAGGAAT (SEQ ID NO: 16)

TCCGCGGATCCTTAGGTACG (SEQ ID NO: 17)

Bylo provedeno 25 cyklů PCR za použití následujících podmínek: denaturace při 94 °C po dobu 1 minuty; teplotní hybridizace při 55 °C po dobu 1 minuty; a prodlužování při 72 °C po dobu 2 minut. Amplifikovaný fragment byl purifikován na agarosovém gelu za použití soustavy GENECLEAN II (Bio 101) a štěpen Xbal a BamHI. Poté byl rozštěpený fragment vložen do vektoru pCFM1656, který byl předem rozštěpen Xbal a BamHI. Plasmidu obsahujícího gen NT3opt3 bylo použito pro přípravu genu NT3opt3 obsahujícího nukleovou kyselinu kódující sekvenci signálního peptidu RH. Použitá strategie je srovnatelná se strategií popsanou výše v souvislosti s BDNFopt3 (viz příklad 1 a obr. 6).

Zčásti degenerované oligonukleotidové sekvence kódující sekvenci signálního peptidu RH (viz obr. 2) byly syntetizovány za použití standardních metod syntézy DNA pomocí fosforoamiditové chemie. Každá sekvence obsahovala u svého 5’ konce asi 24 bází sekvence vektoru

- 16CZ 284204 B6 pCFM1656. Každá sekvence obsahovala u svého 3’ konce 18 bází kódujících prvních šest aminokyselin NT-3opt3 (s vyloučením prvního methioninového zbytku, který byl vypuštěn za účelem přípravy aminoterminální Met-less formy vylučovaného NT-3opt3).

Pro přípravu vyloučené (sekretované) formy NT-3opt3 byly oligonukleotidové sekvence obsahující degenerované kodony signálního peptidu RH teplotně hybridizovány k vektoru pCFM1656/NT3opt3 za účelem PCR. K pCFM1656/NT3opt3 byla současně teplotně hybridizována druhá oligonukleotidová sekvence, která je komplementární ke 3’ konci sekvence vektoru za genem NT-3opt3. Pro syntézu genu kódujícího úplnou sekvenci NT-3opt3 připojenou svým 5’ koncem knukleové kyselině kódující sekvenci signálního peptidu RH bylo použito řetězové reakce iniciované polymerasou (PCR).

Reakce PCR byla provedena za použití reakčních složek a taq DNA polymerasy získané od firmy Boehringer Mennhein Biochemicals lne. Bylo provedeno 25 cyklů PCR za použití následujících podmínek: denaturace při 94 °C po dobu 1 minuty; teplotní hybridizace při 50 °C po dobu 1 minuty; a prodlužování při 72 °C po dobu 2 minut. Po PCR byl PCR produkt (asi 574 bp kódujících NT-3opt3 a signální peptid RH) zpracován na 0,8 % agarosovém gelu a přibližně 574bp nukleotidový fragment RH/NT-3opt3 byl z genu vyštěpen a purifikován za použití soupravy GENECLEAN II (Biol 101, lne.) podle instrukcí výrobce. Purifikovaný fragment byl rozštěpen Xbal a HindlII za vzniku fragmentu DNA o délce asi 371 bp kódujícího signální peptid RH a 5’ část genu NT-3. Vektor pCFM1656/NT-3opt3 byl rozštěpen Xbal a HindlII, fragment kódující 5’ část NT-3opt3 byl odštěpen a nahrazen ligací s přibližně 371bp sekvencí DNA RH/NT-3opt3 (získanou pomoci PCR). Ligace byla provedena přes noc při teplotě 16 °C za použití ligasového pufru a enzymu od firmy Boehringer Mennheim lne., přičemž reakce byla prováděna podle instrukcí výrobce.

Po ligací byly plasmidy vloženy (transformace) do kompetentních buněk E. coli K12 kmene FM-5 (přírůstkové číslo ATCC 53911). Inserce plasmidu do buněk E. coli byla provedena za použití standardního postupu s chloridem vápenatým, který je popsán v publikaci Sambrook et al., citované výše. Transformované buňky byly kultivovány přes noc při teplotě asi 30 °C v miskách se standardním agarovým médiem Luria Broth (LB) obsahujícím kanamycin v množství asi 50 ug/ml. Po kultivaci bylo selektováno 13 jednotlivých kolonií. Těmito koloniemi bylo zaočkováno médium LB s obsahem kanamycinu asi 50 pg/ml. Kultivace probíhala přes noc při asi 30 °C. Po kultivaci byly buňky zředěny asi v poměru 1:10 standardní půdou Terrific Broth (TB; Sambrook et al., výše uvedená citace) s obsahem kanamycinu a ponechány růst při asi 30 °C až do density OD600 0,5 až 0,8. Potom byla teplota zvýšena na asi 42 °C pro indukci exprese a sekrece NT-3opt3.

Po asi 4 hodinách byl přibližně 1 mg vlhké buněčné hmoty peletizován a peleta byla podrobena lyži vařením po dobu asi 10 minut vaši 100 μΐ standardního SDS-PAGE denaturačního/redukčního pufru (popsaného v příkladu 1). Asi 10 μΐ vzniklé směsi bylo potom zpracováno na standardním SDS polvakrylamidovém gelu (asi 18% akrylamidu). Zpracování bylo provedeno za konstantního napětí asi 130 V po dobu asi 2,5 hodiny. Gely, vzorkový pufr a mobilní pufr byly zakoupeny od firmy NOVEX, lne. (San Diego, CA, USA) a bylo jich použito podle instrukcí výrobce.

B. Analýza sekvencí nukleové kyseliny signálního peptidu

Účinnost různých nukleotidových sekvencí kódujících signální peptid RH byla analyzována jako procentický podíl množství zpracovaného NT-3opt3 (polypeptidu NT-3opt3, z něhož byl odštěpen signální peptid) ve srovnání s celkovým množstvím produkovaného proteinu NT-3opt3 (zpracované i nezpracované formy). Pro srovnání těchto dvou forem NT-3opt3 byl SDS gen obarven modří Coomassie a po obarvení podroben zkoumání za účelem zjištění relativního

- 17CZ 284204 B6 množství každé z těchto forem. Molekulární hmotnost nezpracovaného prekursorového polypeptidu NT-3opt3 je asi 15,9 kDa, zatímco molekulární hmotnost zpracované formy NT-3opt3 je asi 13,6 kDa. Tyto dvě formy NT-3opt3 tedy vytvářejí zřetelně odlišené pásy na SDS-denaturovaném polyakrylamidovém gelu.

V případě řady polypeptidů RH/Ntopt3 byly oba pásy (tj. pás zpracovaného i nezpracovaného NT-3opt3) viditelné jak při obarvení gelu modří Coomassie, tak při analýze gelu pomocí Western blotting za použití detekce NT-3opt3 na blotu Western pomocí polyklonální protilátky anti-NT-3opt3. Při vizuální inspekci se ukázalo, že dvě sekvence nukleové kyseliny RH, tj. RH3, RH5 a RH11, vykazovaly vyšší podíl zpracovaného NT-3opt3 ve srovnání s ostatními sekvencemi nukleové kyseliny RH. Sekvence RH3 (SEQ ID NO: 18), RH4 (SEQ ID NO: 19), RH5 (SEQ ID NO: 20) a RH6 (SEQ ID NO: 21) jsou charakterizovány dále, zatímco sekvence RH11 je uvedena na obr. 3.

RH3:

ATGAAGAAACGTGCGCGCGCGATTGCAATTGCAGTAGCGCTGGCTG GCTTTGCTACCGTAGCGACACGCG (SEQ ID NO: 18)

RH4:

ATGAAAAAGCGCGCACGCGCTATCGCTATCGCTGTTGCTCTGGCTG GCTTTGCAACTGTTGCTCATGCA (SEQ IN NO: 19)

RH5:

ATGAAAAAGCGCGCACGCGCAATTGCGATTGCGGTTGCTCTGGCGG GTTTCGCTACCGTTGCGCATGCG (SEQ ID NO: 20)

RH6:

ATGAAAAAGCGCGCTCGTGCGATCGCGATTGCTGTAGCGCTGGCGG GTTTTGCAACTGTAGCTCACGCG (SEQ ID NO: 21)

Gel byl prozkoumán způsobem popsaným v příkladu 1 za účelem zjištění relativních množství zpracovaného a nezpracovaného NT-3opt3 v případě různých sekvencí nukleové kyseliny signálního peptidu RH. Výsledky tohoto zkoumání aktivity sekvencí nukleové kyseliny jsou uvedeny v tabulce 2, která následuje. Tyto výsledky uvádějí plochu pod křivkou (absorbance x šířka proteinového pásu na gelu v mm) získané měřením na gelu.

Tabulka 2

RH3 RH4 RH5 RH6 RH11

Nezpracovaný NT-3opt3	0,05	0,87	0,05	0,70	0,05
Zpracovaný NT-3opt3	0,46	1,01	0,53	0,76	0,40
Podíl pracovaného
NT-3opt3 (%)	90,2	53,7	91,4	52,1	88,9

Všechny citace uvedené v tomto popisu jsou zde citovány náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vy nálezu.

- 18CZ 284204 B6

Seznam sekvencí (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Amgen lne.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Enhanced Secretion of Polypeptides (Zvyšování sekrece polypeptidů) (iii) POČET SEKVENCÍ: 23 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: Angen lne., U.S. Patent Operations/NAO (B) ULICE: 1840 Devilland Drive (C) MĚSTO: Thousand Oaks (D) STÁT: Kalifornie (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 91320 (ZIP) (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MEDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentit Release #1.0, verze #1.25 (ví) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: 08/215, 138 (B) DATUM PODÁNÍ: 18. března 1994 (C) ZATŘÍDĚNÍ:

(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: I:

Met Lys Lys Arg Ala Arg Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly

5 10 15

Phe Ala Thr Val Ala His Ala (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 69 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: linerámí (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

- 19CZ 284204 B6

ATGAARAARC GYGCDCGYGC DATYGCDATY GCDGTWGCDC TGGCDGGYTT YGCDACYGTW 60 GCDCAYGCD 69 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 69 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

ATGAAAAGC GCGCGCGTGC GATCGCGATC GCGGTTGCGC TGGCTGGCTT CGCTACCGTT 60

GCGCACGCT 69 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 363 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

ATGCACTCTG ACCCGGCTCG TCGTGGTGAA CTGTCTGTTT GTGATTCTAT CTCTGAATGG 60 GTTACCGCGG CTGATAAGAA AACCGCAGTC GACATGTCTG GTGGCACTGT TACCGTCCTC 120 GAGAAAGTTC CTGTATCTAA AGGTCAGCTG AAACAATATT TCTACGAAAC CAAATGCAAT 180 CCGATGGGTT ACACTAAAGA AGGCTGCCGT GGCATCGACA AACGTCATTG GAACTCTCAG 240 TGTCGTACTA CCCAGTCTTA TGTTCGTGCG CTGACCATGG ACTCCAAGAA ACGTATCGGC 300 TGGCGCTTCA TCCGTATTGA CACTAGTTGC GTTGTACTC TGACTATCAA ACGTGGCCGC 360 TAA 363 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 363 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: j eden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

ATGTACGCTG AACACAAATC CCACCGTGGT GAACCGTGGT TTTGCGACTC CGAATCCCTG 60 TGGGTTACCG ACAAATCCTC CGCTATCGAT ATCCGTGGTC ACCAGGTTAC CGTTCTGGGT 120 GAAATCAAAA CCGGTAACT CCCAGTAAAA CAGTACTTCT ACGAAACCCG TTGCAAAGAA 180 GCTCGTCCGG TTAAAAACGG TTGCCGCGGT ATCGACGACA AACATTGGAA CTCTCAGTGC 240 AAAACTAGTC AGACCTACGT TCGTGCTCTG ACCTCCGAAA ACAACAAGCT TGTTGGTTGG 300 CGTTGGATTC GTATCGACAC CAGCTGCGTT TGCGCTCTGT CCCGTAAAAT CGGTCGTACC 360 TAA 363 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina

-20CZ 284204 B6 (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

ACTGCGGTTT TCTTATCAGC (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 7:

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární

TYP MOLEKULY: cDNA (i) (ii) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

CAGCCTTCTT TAGTGTAACC (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 8:

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární

TYP MOLEKULY: cDNA (>) (i·) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

GGATGAAGCG CCAGCCGATA (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 9:

(i) (>i) (xi)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární

TYP MOLEKULY: cDNA

POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:

TTGATTCTAG AAGGAGGAA (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

-21 CZ 284204 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

TCCGCGGATC CTTAGCGGCC 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

GTTGCTGCGA TTCTCACCAA 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 103 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

ATTCTAGAAG GAGGAATAAC ATATGAAAAA GACAGCTATC GCGATTGCAG TGGCTGGC TGGTTTCGCT ACCGTAGCGC AGGCCCACTC TGACCCGGCT CGT (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:

AGCGGAGGAT TTGTCGGTAA 20

103 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

CTTTGCAACG GGTTTCGTAG 20

-22CZ 284204 Β6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

CTTTTCGGAG GTCAGAGCAC 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

TTGATTCTAG AAGGAGGAAT 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:

TCCGCGGATC CTTAGGTACT 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 69 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

ATGAAGAAAC GTGCGCGCGC GATTGCAATT GCAGTAGCGC TGGCTGGCTT TGCTACCGTA 60

GCGCACGCG 69 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 69 bázových párů

-23 CZ 284204 B6 (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

ATGAAAAAGC GCGCACGCGC TATCGCTATC GCTGTTGCTC TGGCTGGCTT TGCAACTGTT 60 GCTCATGCA69 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 69 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 20:

ATGAAAAAGC GCGCACGCGC AATTGCGATT GCGGTTGCTG TGGCGGGTTT CGCTACCGTT 60

GCGATGCT 69 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 69 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 21:

ATGAAAAAGC GCGCTCGTGC GATCGCGATT GCTGTAGCGC TGGCGGGTTT TGCAACTGTA 60 GCTCACGCG 69 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 360 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 22:

CACTCTGACC CGGCTCGTCG TGGTGAACTG TCTGTTTGTG ATTCTATCTC TGAATGGGTT 60 ACCGCGGCTG ATAAGAAAAC CGCAGTCGAC ATGTCTGGTG GCACTGTTAC CGTCCTCGAG 120 AAAGTTCCTG TATCTAAAGG TCAGCTGAAA CAATATTCT ACGAAACCAA ATGCAATCCG 180 ATGGGTTACA CTAAAGAAGG CTGCCGTGGC ATCGACAAAC GTCATTGGAA CTCTCAGTGT 240 CGTACTACCC AGTCTTAGT TCGTGCGCTG ACCATGGACT CCAAGAAACG TATCGGCTGG 300 CGCTTCATCC GTATTGACAC TAGTTGCGTT TGTACTCTGA CTATCAAACG TGGCCGCTAA 360

-24CZ 284204 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 360 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 23:

TACGCTGAAC ACAAATCCCA CCGTGGTGAA TATTCCGTTT GCGACTCCGA ATCCCTGTGG 60 GTTACCGACA AATCCTCCGC TATCGATATC CGTGGTCACC AGGTTACCGT TCTGGGTGAA 120 ATCAAAACCG GTAACTCCC AGTAAAACAG TACTTCTACG AAACCCGTTG CAAACAAGCT 180 CGTCCGGTTA AAAACGGTTG CCGCGGTATC GACGACAAAC ATTGGAACTC TCAGTGCAAA 240 ACTAGTCAGA CCTACGTTCG TGCTCTGACC TCCGAAAACA ACAAGCTTGT TGGTTGGCGT 300 TGGATTCGTA TCGACACCAG CTGCGTTTGC GCTCTGTCCC GT.AAAATCGG TCGTACCTAA 360

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (30)

1. Peptid vykazující sekvenci

MKKRARAIAIAVALAGFATVAHA (SEQ ID NO: 1).

2. Peptid podle nároku 1, který dále obsahuje u svého karboxylového konce polypeptid BDNF.

3. Peptid podle nároku 1, který dále obsahuje u svého karboxylového konce polypeptid NT-3.

4. Peptid podle nároku 1, který dále obsahuje u svého karboxylového konce polypeptid NGF.

5. Peptid podle nároku 1, který dále obsahuje u svého karboxylového konce polypeptid NT-4.

6. Molekula nukleové kyseliny vykazující sekvenci SEQ ID NO: 2, kódující peptid podle nároku 1, kde R představuje A nebo G; W představuje A nebo T/U; Y představuje C nebo T/U; a D představuje A, G nebo T/U.

7. Molekula nukleové kyseliny vykazující sekvenci zvolené ze souboru zahrnující SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 a SEQ ID NO: 21, kódující peptid podle nároku 1:

8. Molekula nukleové kyseliny vykazující sekvenci SEQ ID NO: 3, kódující peptid podle nároku 1.

9. Molekula nukleové kyseliny vykazující sekvenci SEQ ID NO: 18, kódující peptid podle nároku 1.

10. Molekula nukleové kyseliny vykazující sekvenci SEQ ID NO: 19, kódující peptid podle nároku 1.

11. Molekula nukleové kyseliny vykazující sekvenci SEQ ID NO: 20, kódující peptid podle nároku 1.

-25 CZ 284204 B6

12. Molekula nukleové kyseliny vykazující sekvenci SEQ ID NO: 21, kódující peptid podle nároku 1.

13. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 6, která dále obsahuje u svého 3’ konce nukleovou kyselinu kódující NGF polypeptid v podobě Met-less.

14. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13, kde NGF polypeptidem je BDNF.

15. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13, kde NGF polypeptidem je NT-3.

16. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13, kde NGF polypeptidem je NGF.

17. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13, kde NGF polypeptidem je NT-4.

18. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 8, která dále obsahuje u svého 3’ konce nukleovou kyselinu kódující NGF polypeptid v podobě Met-less.

19. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 18, kde NGF polypeptidem je BDNF.

20. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 18, kde NGF polypeptidem je NT-3.

21. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 18, kde NGF polypeptidem je NGF.

22. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 18, kde NGF polypeptidem je NT-4.

23. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 9, která dále obsahuje u svého 3’ konce nukleovou kyselinu kódující NGF polypeptid v podobě Met-less.

24. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 23, jejíž 3’ konec kóduje NT-3.

25. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 11, která dále obsahuje u svého 3’ konce nukleovou kyselinu kódující NGF polypeptid v podobně Met-less.

26. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 25, jejíž 3' konec kóduje NT-3.

27. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle některého z nároků 6, 7, 8, 9, 10, 11 nebo 12.

28. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle některého z nároků 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25 nebo 26.

29. Prokaryontní hostitelská buňka s vloženým vektorem podle nároku 28.

30. Způsob přípravy NGF polypeptidu v podobě Met-less, vyznačující se tím, že se

a) kultivuje prokaryontní hostitelská buňka podle nároku 29 a

b) oddělí se vyloučený NGF polypeptid.