SK116896A3 - Enhanced secretion of polypeptides - Google Patents

Description

Zvyšovanie sekrécie polypeptidov

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových signálnych peptidových sekvencií a sekvencií nukleových kyselín, ktoré sú užitočné pri zvyšovaní sekrécie určitých polypeptidov. Ďalej sa vynález týka spôsobu zvyšovania účinnosti sekrécie týchto polypeptidov z bakteriálnych buniek.

Doterajší stav techniky

Priama expresia polypeptidov

Mnohé z farmaceutického hľadiska dôležité polypeptidy sa pripravujú v prokaryotických bunkách, použitím rekombinantných DNA techník.

ako sú bunky baktérií, DNA kódujúca polypeptid (často získaná z humánnych tkanív) sa môže vložiť do hostiteľskej bunky, kde je exprimovaná (tj . preložená) z DNA na polypeptid v cytoplazme. Polypeptid sa potom purifikuje z hostiteľských buniek. Tento postup býva často označovaný názvom priama expresia polypeptidov.

Priama expresia polypeptidu je síce často najúčelnejší spôsob výroby tohto polypeptidu,ale môže byť spojená s určitými problémami.

Keď sa polypeptid syntetizuje v hostiteľskej bunke a začína sa akumulovať, môže sa stať toxickým pre hostiteľskú bunku a usmrtiť ju. Okrem toho intracelulárne proteázy môžu rýchlo degradovať syntetizované molekuly polypeptidu. Okrem toho, pri zvyšovaní intracelulárnej hostiteľská bunka prestať mechanizmu spätnej väzby, koncentrácie polypeptidu môže produkovať polypeptid na základe ktorý vyvoláva ukončenie syntézy polypeptidu. Iná možnosť spočíva v tom, že polypeptidy, ktoré zostanú v cytoplazme môžu po syntéze podľahnúť posttranslačnej modifikácii, ako je napríklad acetylácia.

Sekrécia polypeptidov

Aby bolo možné sa vyhnúť problémom spojeným s priamou expresiou polypeptidov, boli vyvinuté iné spôsoby expresie polypeptidov. Jednou takouto metódou je tzv. nepriama expresia, ktorá umožňuje sekréciu polypeptidu z hostiteľskej bunky počas jeho produkcie. Táto metóda býva tiež označovaná názvom sekrécia alebo spracovanie (processing) polypeptidu. Po sekrécii môže byť polypeptid izolovaný z kultivačného média, alebo, v prípade gram-negatívnych bakteriálnych hostiteľských buniek, z periplazmatického priestoru alebo periplazmy, čo je oblasť medzi vnútornou a vonkajšou bunkovou membránou. Použitie sekrécie môže preto napomôcč znížiť problémy spojené s intracelulárnou akumuláciou polypeptidu.

Niektoré polypeptidy, ktoré sú prirodzene produkované v bakteriálnych bunkách (alebo iných bunkách), sú z týchto buniek vylučované do mimobunkového prostredia (alebo v prípade gram-négatívnych baktérií do periplazmy). Sekrécia polypeptidu z bakteriálnych buniek pravdepodobne zahrnuje zladenie niekoľkých intracelulárnych proteínov, ktoré sú známe po názvom proteíny chaperone (Zhu et al., Pharm. Tech., apríl (1993), str. 28 až 38; Simonen et al., Microbiol. Rev. 57: 109 až 137, (1993)). Proteíny chaperone identifikujú polypeptid, ktorý má byť vylučovaný a pomáhajú procesu sekrécie.

Vylučované polypeptidy majú obvykle túto štruktúru: ako súčasť aminokyselinovej sekvencie obsahujú signálny peptid (ktorý je tiež známy pod označením vedúci peptid, vedúca sekvencia alebo signálna sekvencia). Signálny peptid je obvykle pomerne malý peptid, ktorý je zvyčajne syntetizovaný počas translácia ako aminoterminálna časť polypeptidu. Polypeptid, ku ktorému je pripojený jeho signálny peptid, býva často označovaný názvom prekurzorový polypeptid alebo imaturovaná forma polypeptidu. Signálny peptid orientuje polypeptid s plnou dĺžkou naprieč bunkovou membránou. Počas sekrécie polypeptidu sa signálny peptid odštiepi. Vďaka tomu sa bunkovou stenou membrány (alebo vnútornou bunkovou membránou v prípade gram-negatívnych baktérií, ako je to popísané ďalej) vylučuje len maturovaná forma polypeptidu. Keďže sa signálny polypeptid odštiepi, má maturovaný polypeptid obvykle nižšiu molekulovú hmotnosť ako prekurzorový polypeptid.

Sekvencie nukleovej kyseliny alebo gény kódujúce väčšinu polypeptidov vyskytujúcich sa v prírode, ktoré sú určené pre sekréciu, obvykle obsahujú sekvencie DNA prekurzorového polypeptidu, tj. 5' koniec génu obsahuje sekvenciu kódujúcu signálny peptid a 3' koniec signálnej sekvencie DNA je pripojený k 5' koncu sekvencie kódujúcej maturovanú formu polypeptidu. Prekurzorový polypeptid sa preto počas translácie syntetizuje ako jediná jednotka so signálnou sekvenciou pri aminokonci polypeptidu. Boli identifikované mnohé prokaryotické-signálne peptidy (pozri napríklad Gennity et al., J. Bioenerg. Biomemb., 22:- 233 až 269, 1990) .

Signálne peptidy majú často zhodné určité štruktúrne znaky. Tak napríklad mnohé signálne peptidy s prokaryotickým pôvodom majú dĺžku asi 20 až 30 aminokyselín. Okrem toho, aminokoniec signálneho peptidu obvykle nesie kladný náboj a centrálna časť signálneho peptidu je obvykle hydrofóbna (Pugsley, Microbiol. Rev. 57: 50 až 108, 1993) . Napriek týmto podobnostiam vykazuje každý vylúčený polypeptid, ktorý bol súčasnosti identifikovaný v niektorom prokaryotickom organizme, ako je napríklad E. coli, určitú jedinečnú sekvenciu signálneho peptidu. Okrem toho, nie všetky typy buniek rozpoznávajú a majú teda schopnosť spracovať všetky sekvencie signálneho peptidu. Určitý signálny peptid môže byť rozpoznaný a môže byť teda schopný orientovať polypeptid cez bunkovú stenu v určitých prokaryotických bunkách, ale nemusí byť funkčný v eukaryotických bunkách.

Polypeptid, ktorý nie je normálne vylučovaný prokaryotickými bunkami, je možné skonštruovať pre sekréciu použitím rekombinantnej DNA techniky. Pritom sa môže postupovať tak, že sa vytvorí konštrukt nukleovej kyseliny, v ktorom je DNA kódujúca polypeptid pripojená svojim 5’-koncom k prírodnej alebo syntetickej sekvencii DNA kódujúcej signálny peptid. Pre sekréciu je nutné, aby bola zvolená sekvencia signálneho peptidu rozpoznateľná a teda spracovateľná hostiteľskou bunkou, do ktorej má byť konštrukt vložený a v ktorej má dôjsť k expresii. Tak napríklad signálny peptid získaný z prírodného vylúčené bakteriálneho polypeptidu môže byť pripojený k polypeptidu z iného zdroja, ako z ľudského tkaniva, za vzniku hybridného prekurzorového polypeptidu, ktorý môže byť syntetizovaný v týchto bakteriálnych (alebo iných prokaryotických) bunkách rozpoznávajúcich tento signálny peptid a schopných ho spracovať a ktorý môže byť vylučovaný z týchto buniek. Tento hybridný konštrukt môže byť zavedený do hostiteľskej bunky a hostiteľská bunka môže mať potom schopnosť produkovať a vylučovať polypeptid.

Okrem základného problému, Či bude polypeptid z buniek vylučovaný alebo nie, bude skutočné množstvo polypeptidu produkovaného v bakteriálnych bunkách ovplyvňované množstvom faktorov. Medzi takéto faktory patria napríklad podmienky kultivácie (Jacques et al., J. Mol. Biol. 226: 597 až 608, 1992), rýchlosť iniciácie translácie (Gold, Ann. Rev. Biochem., 57: 199 až 233, 1988) a rýchlosť degradácie polyeptidu v bunke (aspoň čiastočne v dôsledku pôsobenia intracelylárnych proteáz). Rýchlosť a množstvo vylučovaného polypeptidu sú teda ovplyvňované týmito faktormi. Okrem toho má na sekvenciu vplyv typ aminokyselinového zvyšku prítomného pri aminokonci maturovaného polypeptidu. Zdá sa, že keď niektorý z týchto zvyškov nesie kladný náboj, je sekrécia znížená (Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9751 až 9754, 1991).

Polypeptidy Met-less

Mnoho terapeuticky užitočných humánnych polypeptidov je produkovaných v prokaryotických bunkách, ako sú baktérie, použitím rekombinantných DNA techník.

Heterológny polypeptid (ako je humánny polypeptid) produkovaný v prokaryotických bunkách použitím rekombinantnej DNA techniky nie je vždy totožný s prírodnou formou tohto polypeptidu. Tieto dve formy sa môžu vo svojej chemickej štruktúre mierne líšiť. Tak napríklad mnohé humánne polypeptidy, produkované v bakteriálnych hostiteľských bunkách použitím rekombinantnej DNA techniky, obsahujú aminokyselinu metionín Met pri aminokonci (aminoterminálna Met). Tieto rovnaké humánne polypeptidy v podobe, v akej sa vyskytujú v prírode, obvykle neobsahujú aminoterminálnu Met, keďže tento zvyšok je obvykle odštiepený počas sekrécie polypeptidov z humánnej bunky, v ktorej sú prirodzene syntetizované, do prúdu krvi alebo inej extracelulárnej tekutiny, v kde sa prirodzene nachádzajú.

V niektorých prípadoch, v ktorých sa humánne polypeptidy syntetizujú v prokaryotických bunkách, môže byť aminoterminálny metionín odštiepený cytoplazmatickou metionín-amino peptidázou hostiteľskej bunky, ale takéto odštiepenie je zriedkavo úplné, ak dochádza v hostiteľskej bunke k nadexpresii polypeptidu.

Polypeptidy NGF

Trieda polypeptidy príbuzných bunkách a inervované polypeptidov NGF (NGF = nervový rastový faktor), tzv.

NF, predstavuje skupinu štruktúrne a funkčne neurotrofných faktorov vyskytujúcich sa v mnohých tkanivách nervového systému a tkanivách, ktoré sú zložkami nervového systému. V súčasnosti zahrnuje trieda polypeptidov NGF polypeptidy BDNF (neurotrofný faktor pochádzajúci z mozgu), NGF (nervový rastový faktor), NT-3 (neurotrofín-3), NT-4 (neurotrofín-4; popísaný v prihláške PCT č.

93/25684 publikovanej 23. decembra 1993; PCT prihláške č. 92/05254 publikovanej 2. apríla 1992 a Hallbook et al., Neurón, 6: 845 až 858, 1991) a NT-5.

Bolo ukázané, že tieto prežívaní a/alebo diferenciácii polypeptidy fungujú pri raste, rôznych typov nervových buniek.

Polypeptidy BDNF, NT-3, NGF a NT-4 vykazujú významnú homológiu sekvencie aminokyselín. Polypeptidy BDNF a NGF sú homológne približne z 55 % na úrovni aminokyselín. NT-3 je homológny vzhľadom na BDNF asi z 58 % a na NGF asi z 57 % (Narhi et al., J. Biol. Chem. 268: 13309 až 13317, 1993). Homológia NT-4 vzhľadom na maturované polypeptidy NGF, BDNF a NT-3 na úrovni aminokyselín je 46, 55 a 52 % (PCT 92/05254, dátum zverejnenia 2. apríla 1992; Hallbook et al., Neurón 6: 845 až 858, 1991).

Polypeptidy NGF obsahujú niekoľko cysteínových zvyškov a aminokyselinová sekvencia v oblasti týchto cysteínových zvyškov je pomerne konzervovaná (Narhi et al., vyššie uvedená citácia).

S ohľadom na úlohy polypeptidov NGF, NT-3, NT-4 a BDNF pri udržiavaní nervového systému sa predpokladá, že ak budú tieto polypeptidy vyrobené v biologicky účinnej užitočnými liečivami na liečenie rôznych forme, stanú sa chorôb a porúch nervového systému.

Ide napríklad o poruchy alebo poškodenia nervového infekciami, neuropatie, roztrúsenú systému vyvolané úrazmi, chirurgickými zákrokmi, expozíciou toxínom a/alebo zlou výživou; rôzne Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, sklerózu, amylotrofnú laterálnu sklerózu,

Huntigtonovu choreu, extra-familiálny tremor a pod.

V US patente č. 5 235 043 (patent vydaný 10. augusta 1993) sú údajne popísané produkcie maturovaných humánnych členov patriacich do triedy proteínov NGF (NT-3)/BDNF, ktoré vykazujú plnú biologickú účinnosť. Tieto polypeptidy môžu byť údajne vylučované z hostiteľských buniek použitím signálneho peptidu, ako je signálny peptid OmpA.

V US patente č. 4 757 013 (patent vydaný 12. júla 1988) je popísaný klonovací plazmid, ktorý je užitočný pre sekréciu polypeptidov v bakteriálnych hostiteľoch. Okrem iných sekvencií nukleovej kyseliny obsahuje tento plazmid poprípade fragment DNA kódujúci signálny peptid proteínu OmpA z E. coli. Tento plazmid údajne zaisťuje účinnú sekréciu cez cytoplazmatickú membránu.

Ί

V US patente č. 4 338 397 (patent vydaný 6. júla 1982) je popísaný spôsob sekrécie polypeptidu produkovaného v bakteriálnej hostiteľskej bunke. Tento spôsob údajne umožňuje produkciu proteínu chemických substituentov, ako je proteín f-met.

V publikácii Tanji et al., J. Bacteriol., 173: 1997 až 2005, 1991 sú popísané určité aminokyselinové substitúcie alebo delécie v signálnom peptide OmpA aminokyselinovej sekvencie.

V publikácii Goldstein et al., J. Bacteriol. 172: 1225 až 1231, 1990 sú popísané mutanty signálneho peptidu OmpA s pozmenenou úrovňou hydrofobicity. Tieto mutanty údajne vykazujú rôznu schopnosť, pôsobiť ako signálne peptidy pre dva proteíny pri prechode cez membránu bunky E. coli.

V publikácii Lenhardt et al., J. Biol. Chem. 263: 10300 až 10303, 1988, sú popísané mutanty signálneho peptidu OmpA, v ktorých je údajne pozmenený celkový náboj aminoterminálneho konca.

V publikácii Lenhardt et al., J. Biol. Chem. 262: 1716 až 1719, 1987, je popísaná produkcia mutantov signálneho peptidu OmpA. Tieto mutanty obsahujú skrátenú hydrofóbnu oblasť a údajne je zmenená ich schopnosť pôsobiť ako sekrečné sekvencie pre určité proteíny.

S ohľadom na problémy, s ktorými sa stretla príprava veľkých množstiev polypeptidov použitím rekombinantnej DNA techniky, existuje v tomto obore potreba vyvinúť spôsoby výroby zaisťujúce zvýšenie výťažku týchto polypeptidov pri výrobe použitím rekombinantnej DNA techniky. Okrem toho existuje v tomto obore potreba vyvinúť rekombinantné polypeptidy vo forme Met-less.

Úlohou tohto vynálezu je preto vyvinutie signálneho peptidu a sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej tento signálny peptid s cieľom zaistenia zvýšenej účinnosti sekrécie polypeptidu NGF produkovaného v prokaryotickej hostiteľskej bunke.

Ďalšou úlohou tohto vynálezu je vyvinúť spôsob prípravy polypeptidov NGF vo forme Met-less.

Ďalšie úlohy tohto vynálezu budú zrejmú odborníkom v tomto obore na základe podrobného popisu, ktorý nasleduje.

Podstata vynálezu

Jedným z aspektov tohto vynálezu je signálny peptid vykazujúci sekvenciu

MKKRARAIAIAVALAGFATVAHA (SEQ ID NO: 1) .

Iným aspektom tohto vynálezu je vyššie uvedený- signálny peptid, ktorý pri svojom karboxylovom konci obsahuje polypeptid BDNF, NGF, NT-3, NT-4 alebo NT-5.

Ďalším aspektom tohto vykazujúca sekvenciu SEQ ID NO:

Ďalším aspektom tohto vykazujúca sekvenciu SEQ ID NO:

vynálezu 2 .	je	nukleová	kyselina
vynálezu	je	nukleová	kyselina
3 .

Ešte ďalším aspektom tohto vynálezu je nukleová kyselina vykazujúca sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 3, ktorá navyše obsahuje pri svojom 3' konci nukleovú kyselinu kódujúcu aminoterminálny polypeptid NGF Met-less.

Ešte ďalším aspektom tohto vynálezu je vektor obsahujúci nukleovú kyselinu s výkazom sekvencie SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 3, ktorá je svojim koncom 3' pripojená k nukleovej kyseline kódujúcej aminoterminálny polypeptid NGF Met-less. Tento vektor môže byť poprípade vektor pCFM1656/BDNFopt3 alebo pCMF1656/NT-3opt3.

Ešte ďalším aspektom tohto vynálezu je prokaryotická hostiteľská bunka, do ktorej bol vložený vyššie uvedený vektor.

Ďalším aspektom vynálezu je spôsob prípravy polypeptidu NGF v podobe Met-less, ktorého podstata spočíva v tom, že sa kultivuje prokaryotická hostiteľská bunka, do ktorej bol vložený vektor obsahujúci nukleovú kyselinu s výkazom sekvencie SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID N0:3, ktorá je svojim koncom 3’ pripojená k nukleovej kyseline kódujúcej aminoterminálny polypeptid NGF Met-less a izoluje sa vylúčený polypeptid NGF.

Prehľad obr, na výkresoch

Na obr. 1 je znázornená aminokyselinová sekvencia syntetického signálneho peptidu RH, ktorý je užitočný pre zvýšenie sekrécie určitých polypeptidov z buniek E. colí (SEQ ID NO: 1) .

Na obr. 2 je znázornená degenerovaná nukleotidová sekvencia kódujúca signálny peptid RH. R predstavuje A alebo G; W predstavuje A predstavuje A, skonštruovaná alebo T/U; Y predstavuje C alebo T/U a D G alebo T/U (SEQ ID NO: 2). Táto sekvencia bola s cieľom využitia prednostného kodónu u prokaryotických buniek.

Na obr. 3 je znázornená jedna nukleotidová sekvencia RH11, ktorá kóduje signálny peptid RH (SEQ ID NO: 3).

Na obr. 4A a 4B sú znázornené syntetické sekvencie DNA kódujúce humánnu aminokyselinov sekvenciu BDNF, ktorá je užitočná pre prípravu a expresiu BDNF v prokaryotickej hostiteľskej bunke. Na obr. 4A (SEQ ID NO: 4) je znázornená sekvencia so štart kodónom Met, zatiaľ čo na obr. 4B (SEQ ID NO: 22) je znázornená rovnaká sekvencia bez štart kodónu ATG Met.

Na obr. a a 5B sú znázornené syntetické sekvencie DNA kódujúce humánnu aminokyselinovú sekvenciu NT-3, ktorá je užitočná pre prípravu a expresiu NT-3 v prokaryotickej hostiteľskej bunke. Na obr. 5A (SEQ ID NO: 5) je znázornená sekvencia so štart kodónom Met, zatiaľ čo na obr. 5B (SEQ ID NO: 23) je znázornená rovnaká sekvencia bez štart kodónu ATG Met.

Na obr. 6 je uvedený schematický diagram znázorňujúci stratégiu použitú pri príprave syntetickej sekvencie nukleovej kyseliny BDNF, ktorá je svojim 5' koncom pripojená k sekvencii nukleovej kyseliny kódujúcej signálny peptid RH. SP označuje sekvenciu signálneho peptidu; v diagrame sú tiež uvedené zvolené reštrikčné enzýmy. Relatívne veľkosti sekvencii nukleových kyselín nie sú uvedené v mierke.

Ako už bolo uvedené vyššie, je vynález založený na objave, že určité sekvencie signálneho peptidu slúžia na zvýšenie množstva polypeptidov NGF vylúčených z niektorých prokaryotických hostiteľských buniek.

Príprava vynálezu

Vynález predpokladá použitie signálneho peptidu RH s cieľom zvýšenia expresie a sekrécie polypeptidov z triedy polypeptidov nervového rastového faktora (NGF) syntetizovaných a exprimovaných v prokaryotických hostiteľských bunkách. Tieto polypeptidy sú v popise označované názvom polypeptidy NGF alebo NGF polypeptidy.

Vynález okrem toho poskytuje prostriedok umožňujúci prípravu polypeptidu NGF, ktorému chýba pri zvyšok. Takéto polypeptidy NGF sú jeho aminokonci metionínový v popise označované názvom polypeptidy NGF Met-less.

1. Príprava sekvencii nukleových kyselín RH

Do rozsahu vynálezu patria všetky možné sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce signálny peptid RH. Nukleové kyseliny s čiastočne degenerovaným kodónom (táto sekvencia bola skonštruovaná s cieľom využitia prednostného kodónu u prokaryotických buniek) pre RH sú uvedené na obr. 2. Jednou ·ς prednostných nukleových kyselín kódujúcich RH je RH11, ktorého sekvencia je uvedená na obr. 3.

Nukleové kyseliny kódujúce signálny peptid RH môžu byť ľahko pripravené spôsobmi známymi v tomto obore, ako napríklad spôsobom popísaným v Engels et al., Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716 až 734, 1989. Prednostným spôsobom je syntéza na polymérnom nosiči použitím štandardnej fosforamiditovej chémie.

2. Príprava DNA kódujúcej polypeptidy NGF

Do rozsahu tohto vynálezu patrí spôsob prípravy polypeptidu NGF z akéhokoľvek cicavčieho zdroja. Ako neobmedzujúce príklady je možné uviesť polypeptidy NGF humánneho, hovädzieho a bravčového pôvodu. Prednostný zdroj je človek. Ako neobmedzujúce príklady polypeptidov NGF patriacich do rozsahu tohto vynálezu je možné uviesť BDNF (neurotrofný faktor pochádzajúci z mozgu), NT-3 (neurotrofín-3, tiež označovaný názvom NGF-3, kde skratka NGF označuje nervový rastový faktor), NT-4 (neurotrofín-4), NT-5 (neurotrofín-5) a iní členovia tejto triedy, ktorí sú spriaznení významnou homológiou sekvencie aminokyselín alebo nukleovej kyseliny, ako je homológia, ktorú vykazujú v súčasnosti známi členovia tejto triedy.

Sekvenciu DNA kódujúcu polypeptidy NGF podľa vynálezu je možné izolovať a získať vo vhodnom množstve použitím jedného alebo viacerých spôsobov, ktoré sú dobre známe v tomto obore. Tieto a iné spôsoby, ktoré sú užitočné pre izoláciu takejto DNA sú napríklad uvedené v nasledujúcich citáciách: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cold Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 a Berger a Kimmel :Methods in Enzymology: Guideto Molecular Cloning Techniques, zv. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987.

Prednostné sekvencie nukleovej kyseliny pre BDNF sú sekvencie uvedené na obr. 4A a 4B. Prednostné sekvencie nukleovej kyseliny pre NT-3 sú sekvencie uvedené na obr. 5A a 5B.

Ak je aminokyselinová sekvencia polypeptidu NGF známa, je možné pravdepodobnú a funkčnú nukleovú kyselinu kódujúcu tento polypeptid odvodiť použitím známych a/alebo prednostných kodónov pre každý z aminokyselinových zvyškov.

Ak je sekvencia nukleovej kyseliny polypeptidu NGF úplne známa, túto sekvenciu je možné syntetizovať úplne alebo čiastočne použitím metód chemickej syntézy, ako sú napríklad metódy popísané v Engels et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716 až 734, 1989. Tieto metódy okrem iného zahrnujú fosfotriesterový, fosforamiditový a .H-fosfonátový spôsob syntézy nukleových kyselín, dna kódujúca takýto polypeptid bude mať obvykle dĺžku niekoľko stoviek bázových párov (bp) alebo nukleotidov.-Nukleové kyseliny s väčšou dĺžkou ako asi 100 nukleotidov je možné syntetizovať vo forme niekoľkých fragmentov, z ktorých každý bude obsahovať až asi 100 nukleotidov. Pripravené fragmenty sa dajú potom ligovať, ako je to popísané ďalej za vzniku nukleovej kyseliny s úplnou dĺžkou kódujúcou polypeptid NGF.

Alternatívne sa dá nukleová kyselina kódujúca polypeptid NGF získať pomocou screeningu vhodnej cDNA knižnice (tj. pripravenej z tkanivového zdroja, pri ktorom sa predpokladá expresia tohto polypeptidu) alebo genómovej knižnice použitím jednej alebo viacerých nukleových kyselín ako prób (oligonukleotidov, alebo fragmentov cDNA alebo genómovej DNA s prijateľnou úrovňou homológie vzhľadom na nukleovú kyselinu, ktorá má byť klonovaná a pod.), ktorá sa bude selektívne hybridizovať s požadovanou nukleovou kyselinou.

Ďalšia vhodná metóda na získanie nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid NGF je reťazová polymerizačná reakcia pri použití polymerázy (PCR). úspešné použitie tejto metódy však vyžaduje, aby bolo k dispozícii dostatočné množstvo informácii so sekvenciou nukleovej kyseliny kódujúcou polypeptid NGF, ktoré by umožnili skonštruovať vhodné oligonukleotidové priméry užitočné pre amplifikáciu sekvencie nukleovej kyseliny.

spôsob prípravy nukleovej kyseliny kódujúcej vyžaduje použitie oligonukleotidovych primérov screening cDNA alebo bý mať oligonukleotidové

Ak zvolený

NGF (napríklad PCR alebo screening cDNA alebo genómovej mali bý mať oligonukleotidové sekvencie zvolené ako priméry vhodnú dĺžku a mali by byť dostatočne určité, rozsah nešpecifickej väzby, ku ktorej polypeptid alebo prób kriižnice) , próby alebo aby sa minimalizoval dochádza počas screeningu knižnice alebo PCR. Skutočná sekvencia prób alebo primérov je obvykle založená na konzervovaných vysoko homológnych sekvenciách alebo oblastiach z rovnakého alebo podobného génu z iného organizmu. Próby alebo priméry môžu byť poprípade degenerované.

V prípadoch, kedy je známa len aminokyselinová sekvencia polypeptidu NGF, je možné pravdepodobnú a funkčnú nukleovú kyselinu kódujúcu túto polypeptidovú sekvenciu odvodiť použitím známych a prednostných kodónov pre každý z aminokyselinovych zvyškov. Takáto sekvencia sa dá potom chemicky syntetizovať pomocou spôsobov uvedených vyššie.

Do rozsahu patrí tiež príprava mutantných sekvencií polypeptidov NGF. Pod označením mutantná sekvencia, ako sa používa v tomto popise, sa rozumie sekvencia obsahujúca jednu alebo viac nukleotidových substitúcií, delécií a/alebo inzercií v porovnaní so sekvenciou divokého typu. Takéto substitúcie, delécie a/alebo inzercie nukleotidov môžu viesť k vzniku polypeptidov NGF, ktoré sa svojou aminokyselinovou sekvenciou odlišujú od aminokyselinovej sekvencie divokého typu. Príprava týchto typov mutantov je v tomto obore dobre známa a je napríklad popísaná v publikácii Wells et al., Gene, 34: 315, 1985 a v publikácii Sambrook et al., citovanej vyššie.

3. Príprava prekurzora polypeptidu NGF

Nukleovú kyselinu kódujúcu prekurzor polypeptidu NGF (tj . formu obsahujúcu sekvenciu signálneho peptidu) je možné pripraviť použitím ktorejkoľvek z množstva metód. Podľa jednej metódy je možné nukleovú kyselinu kódujúcu signálny peptid RH priamo ligovať k nukleovej kyseline kódujúcej polypeptid NGF, pri predpoklade, že nukleová kyselina kódujúca polypeptid NGF neobsahuje kodón pre aminoterminálny metionín. Ligáciu dvoch nukleových kyselín je možné uskutočniť pomocou ligácie natupo alebo vytvorenia vhodného miesta pre reštrikčnú endonukleázu v oblasti pri 3' konci nukleovej kyseliny pre signálny peptid RH použitím enzýmu ligázy a podľa protokolu výrobcu alebo použitím metód dobre známych v tomto obore, ako sú napríklad metódy uvedené vo vyššie citovanej publikácii Sambrook et al.

Alternatívne sa dá nukleová kyselina kódujúca signálny peptid RH pripojiť k sekvencii nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid NGF použitím reakcie PCR. V tomto prípade sa- ako prvý PCR primér použije nukleová kyselina kódujúca signálny peptid RH s obsahom celej RH sekvencie a prídavné 50 až 21 nukleotidov pri 3' konci, ktoré zahrnujú prvých (tj. 5') päť až sedem kodónov sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid NGF s vylúčením Met kodónu (obvykle ATG).

Primér tvorený nukleovou kyselinou RH/5' NGF sa syntetizuje použitím dobre známych metód, ako je napríklad štandardná fosforamiditová chémia. Druhý PCR primér môže byť nukleová kyselina, ktorá je komplementárna k posledným 6 až 8 kodónom (18 až 24 nukleotidom) nukleovej kyseliny NGF, tj. ku kodónom pri 3' konci tejto nukleovej kyseliny. Týmto spôsobom sadá použitím PCR vytvoriť sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá sa skladá z RH pripojeného k plnej dĺžke nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid NGF bez aminoterminálneho Met kodónu nukleovej kyseliny kódujúcej tento polypeptid NGF.

Pri inom spôsobe, ktorý je užitočný pre prípravu nukleovej kyseliny kódujúcej prekurzor polypeptidu NGF sa tiež používa PCR. Tu sa nukleová kyselina s úplnou dĺžkou kódujúca polypeptid NGF (ktorý môže obsahovať aminoterminálny Met kodón) najprv vloží do klonovacieho alebo expresného vektora. Reakcia PCR sa potom použije na prípravu nukleovej kyseliny obsahujúcej sekvenciu RH pripojenú k nukleovej kyseline s úplnou dĺžkou kódujúcej polypeptid NGF. Ako PCR priméry sa používajú podobné priméry, ako boli popísané vyššie.

Jeden z primérov použitých pre PCR je komplementárny k sekvencii vektora umiestenej v smere 3' vzhľadom na oblasť nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid NGF. Druhý primér obsahuje v poradí 5' až 3' časť (asi 12 až 25 nukleotidov) sekvencia vektora, ktorá je umiestená bezprostredne v smere 5' vzhľadom na sekvenciu kódujúcu NGF; nukleotidovú sekvenciu s úplnou dĺžkou kódujúcu signálny peptid RH a nukleotidovú sekvenciu kódujúcu prvých 5 až 8 aminokyselín s vylúčením aminoterminálneho metionínu polypeptidu NGF. Keď sa tento primér hybridizuje k vektoru obsahujúcemu ako inzert nukleovú-kyselinu kódujúcu polypeptid NGF, môže sa časť sekvencia vektora a časť sekvencie kódujúcej polypeptid NGF hybridizovať k priméru, zatiaľ čo časť sekvencie RH sa hybridizovať nemôže, časť rh môže vytvoriť sluČkovú štruktúru.

Druhý PCR primér pre použitie pri tejto metóde môže byť sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá je komplementárna k posledným šiestim až ôsmim kodónom (18 až 24 nukleotidom) nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid NGF alebo k časti sekvencie vektora umiestenej 3' vzhľadom na sekvenciu nukleovej kyseliny NGF.

Počas PCR bude amplifikovaný produkt nukleovej kyseliny obsahovať 5' až 3' časť 5' sekvencie vektora, sekvenciu signálneho peptidu RH, sekvenciu nukleovej kyseliny s úplnou dĺžkou kódujúcej polypeptid NGF bez aminoterminálneho Met kodónu a časť 3' sekvencie vektora. Po PCR je možné získaný PCR produkt štiepiť pomocou vhodných reštrikčných enzýmov s cieľom získania nukleovej kyseliny kódujúcej prekurzorovú formu polypeptidu NGF, kde po odštiepení signálneho peptidu RH počas sekrécie sa poskytne aminoterminálny polypeptid NGF Met-less.

4. Príprava/selekcia vektora

Môže sa použiť akýkoľvek expresný vektor, ktorý je funkčný vo zvolenej prokaryotickej hostiteľskej bunke, pri predpoklade, že tento vektor obsahuje všetky potrebné zložky nukleovej kyseliny alebo prvky zaisťujúce expresiu prekurzora polypeptidu NGF.

Tento vektor bude obvykle obsahovať promótor, prvok začiatku replikácie, prvok terminácie transkripcie, prvok miesta viažúceho ribozóm, oblasť polylinkéra pre vloženie nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid, ktorý má byť exprimovaný a prvok selekčného merkéra.

A. Prvok promótora

Promótor môže byť homológny (tj. môže pochádzať z rovnakého prokaryotického druhu a/alebo kmeňa ako hostiteľská bunka), heterológny (tj. z odlišného zdroja, ako je druh alebo kmeň prokaryotickej hostiteľskej bunky) alebo syntetický. Zdrojom promótora môže byť teda akýkoľvek jednobunkový prokaryotický alebo eukaryotický organizmus, organizmus akéhokoľvek stavovca alebo bezstavovca alebo akákoľvek rastlina, s tou podmienkou, že je tento promótor funkčný v hostiteľskej bunke a môže ňou byť regulovaný. Väčšia prednosť sa z promótorov podľa vynálezu dáva indukovateľným promótorom, ako sú napríklad promótory pochádzajúce z bakteriofágu lambda, tj. lambda promótorom, ako sú promótory P_r alebo P , promótor T_s alebo promótor T_v; bakteriálnym promótorom, ako je lac, tac (kompozit promótorov trp a lac), trp a tna. Vôbec najväčšia prednosť sa dáva promótoru P .

Promótorové sekvencie nukleovej kyseliny, ktoré sú užitočné podľa tohto vynálezu, je možné získať pomocou ktoréhokoľvek spôsobu známeho v tomto obore. Užitočné promótory boli obvykle predtým identifikované mapovaním a/alebo štiepením reštrikčnou endonukleázou a dajú sa preto získať aj z vhodného tkanivového zdroja použitím príslušných reštrikčných endonukleáz. V niektorých prípadoch mohol byť promótor aj sekvenovaný. Ak je sekvencia DNA promótora známa, môže byť. promótor syntetizovaný použitím vyššie popísaných spôsobov syntézy alebo klonovania nukleovej kyseliny.

Ak sú u promótorov známe celé sekvencie alebo ich časti, môže byť promótor získaný použitím PCR a/alebo screeningom genómovej knižnice použitím vhodných oligonukleotidov a/alebo fragmentov promótorovej sekvencie z rovnakého alebo odlišného druhu.

Ak sekvencia promótora známa nie je, môže sa fragment DNA s obsahom promótora izolovať z väčšieho kusu DNA, ktorý môže napríklad obsahovať kódujúcu sekvenciu alebo dokonca iný gén alebo gény. Izolácia sa môže uskutočniť štiepením reštrikčnou endonukleázou použitím jedného alebo viacerých starostlivo zvolených enzýmov, aby mohol byť izolovaný správny fragment DNA. Po štiepení je možné požadovaný fragment izolovať purifikáciou na agarózovom géle, stĺpci Qiagen^<R> alebo pomocou iných spôsobov, ktoré sú dobre známe odborníkom v tomto obore. Výber vhodných enzýmov pre tento účel je odborníkom v tomto obore úplne zrejmý.

B. Prvok začiatku replikácie

Táto zložka je obvykle časťou prokaryotických expresných vektorov, ktoré sa dajú kúpiť na trhu a pomáha pri amplifikácii vektora v hostiteľskej bunke. Amplifikácia vektora na určitý počet kópií môže byť v niektorých prípadoch dôležitá pre optimálnu expresiu polypeptidu NGF. Ak neobsahuje zvolený vektor miesto začiatku replikácie, môže byť toto miesto chemicky syntetizované na základe známej sekvencie a do tohto vektora ligované.

C. Prvok terminácie transkripcie

Tento prvok je obvykle umiestený 3' vzhľadom na koniec sekvencie kódujúcej polypeptid NGF a slúži na termináciu transkripcie polypeptidu NGF. Prvok terminácie transkripcie v prokaryotických bunkách je obvykle tvorený fragmentom bohatým na B-C, po ktorom nasleduje poly T sekvencia. Tento prvok sa ľahko klonuje z knižnice alebo sa dá kúpiť ako súčasť vektora, ale tiež sa dá ľahko syntetizovať použitím spôsobov syntézy nukleových kyselín, ako napríklad spôsobov popísaných vyššie.

D. Prvok selekčného markéra (markérov)

Gény selekčného markéra kódujú proteíny potrebné na prežitie a rast hostiteľskej bunky rastúcej v selekčnom kultivačnom médiu. Typické gény selekčných markérov kódujú proteíny, ktoré a) udávajú rezistenciu voči antibiotikám alebo iným toxínom, napríklad ampicilínu, tetracyklínu alebo kanamycínu, v prípade prokaryotických hostiteľských buniek, b) dopĺňajú auxotrofné deficiencie bunky alebo c) dodávajú kritické živiny, ktoré nie sú dostupné z komplexného média. Prednostné selekčné markéry sú: gén rezistencie voči kanamycínu, gén rezistencie voči ampicilínu a gén rezistencie voči tetracyklínu.

E. Prvok miesta viažúceho ribozóm

Tento prvok, ktorý sa obvykle označuje názvom Shine-Dalgarnova sekvencia, je potrebný pre transláciu iniciácie mRNA. Je obvykle umiestený 3' vzhľadom na promótor a 5' vzhľadom na sekvenciu kódujúcu polypeptid, ktorý má byť syntetizovaný. Shine Dalgarnova sekvencia môže byť rôzna, ale obvykle ide o polypurín (tj. o sekvenciu s vysokým obsahom A-G). Bolo identifikované množstvo Shine-Dalgarnových sekvencií a všetky sa dajú ľahko syntetizovať použitím vyššie popísaných metód.

Všetky vyššie uvedené prvky, ako aj ďalšie prvky, ktoré sú užitočné podľa vynálezu, sú dobre známe odborníkom v tomto obore a sú napríklad popísané v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 a Berger a Kimmel: Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, zv. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987.

F. Konštrukcia vektorov

Ako vektory, ktoré sú vysoko užitočné pri uskutočňovaní tohto vynálezu, je možné uviesť akékoľvek expresné vektory, ktoré kompatibilné so zvolenou prokaryotickou hostiteľskou bunkou.

V niektorých prípadoch môžu byť niektoré z rôznych prvkov vektora uvedených vyššie už prítomné v obchodne dostupných vektoroch, ako sú napríklad vektory pUC-18, pUC-19 a pGEM (Promega Corp., Madison, WI, USA), vektory p-Bluescript^<R>, ako je pBIISK+/- (Stragagene Corp., La Jolla, CA, USA) a pod., ktoré sú všetky vhodné pre prokaryotické hostiteľské bunky a môžu sa použiť pri realizácii tohto vynálezu.

Ak jeden alebo viac prvkov už nie je prítomných vo vektore, ktorý sa má použiť, môžu sa získať jednotlivo a do vektora ligovať. Spôsoby vhodné pri získavaní všetkých týchto prvkov sú dobre známe odborníkom v tomto obore a sú porovnateľné s vyššie uvedenými metódami (tj. syntézou DNA, screeningom knižnice a pod.).

Prednostný vektor podľa tohto vynálezu je pCFM1656 (vektor uložený podľa Budapeštianskej dohody 24. februára 1993 v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301, Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, pod prírastkovým číslom 69 576), pGEM, vektory pBluescript^<R>, pUC18 a pUC19. Plazmid pCFM1656 vyžaduje pre zvýšenie počtu plazmidových kópií kultivačnú teplotu v rozmedzí od asi 30 do asi 42 °C; pri zvýšení teploty nad asi 42 °C dochádza k inaktivácii represorového prvku CI857 promótora PL.

Finálny vektor pre použitie podľa vynálezu sa obvykle konštruuje z východiskového vektora, ako napríklad z obchodne dostupného vektora. Východiskový vektor môže alebo nemusí obsahovať niektoré prvky, ktoré sú súčasťou finálneho vektora. Ak neobsahuje východiskový vektor žiadny z požadovaných prvkov, je' možné každý z týchto prvkov individuálne ligovať do vektora rozštiepením vektora príslušnou reštrikčnou endonukleázou alebo endonukleázami tak, aby konce ligovaného prvku boli pri ligácii kompatibilné s koncami vektora. V niektorých prípadoch môže byť nutné konce, ktoré majú byť spolu ligované, otupiť, aby sa dosiahla uspokojivá ligácia. Otupenie sa uskutočňuje tak, že sa zavedú lepivé konce použitím DNA polymerázy KÍenow alebo DNA polymerázy T4 za prítomnosti všetkých štyroch nukleotidov. Tento postup je dobre známy v danom obore a je napríklad popísaný v publikácii Sambrook et al., citovanej vyššie.

Alternatívne sa dajú dva alebo viaceré prvky vkladané do vektora najprv vzájomne ligovať (ak majú byť umiestené vedľa seba) a potom vzniknutý fragment ligovať do vektora.

Jedna z ďalších metód konštrukcie vektora spočíva v-súčasnej ligácii rôznych prvkov v jednej reakčnej zmesi. Pritom vznikne množstvo nekódujúcich alebo nefunkčných vektorov vďaka nevhodnej ligácii alebo inzercii prvkov, pomocou štiepenia reštrikčnou endonukleázou je však možné identifikovať a selektovať funkčný vektor.

Po konštrukcii vektora a po vložení nukleovej kyseliny NGF do vhodného miesta vektora sa môže vzniknutý vektor vložiť do prokaryotickej hostiteľskej bunky s cieľom amplifikácie a expresie NGF polypeptidu. Ako prokaryotické bunky sa obvykle používajú akékoľvek kmene E. coli, ktoré ’sú kompatibilné s promótorom vo vektore tak, že tento promótor je v bunke E. coli funkčný. Zvolený kmeň by mal prednostne obsahovať regulačné prvky riadiace promótor tak, aby bola expresia polypeptidu NGF správne indukovaná. Ako vhodné kmene E. coli je možné uviesť kmeň FM-5 (kmeň uložený podľa Budapeštianskej dohody v zbierke ATCC, 19. mája 1989 pod prírastkovým číslom 53911), DH 5-alfa, MJ-101 a pod. Ako hostiteľské bunky môžu byť okrem toho užitočné gra-negatívne baktérie, ako je napríklad Salmonella a gra-pozitívne baktérie, ako je Bacillus. Môžu sa použiť aj iné prokaryotické bunky.

Inzercia (tiež označovaná termínom transformácia” alebo transfekcia) vektora do zvolenej hostiteľskej bunky sa môže uskutočňovať použitím takých metód, ako je metóda s chloridom vápenatým, elektroporácia, mikroinjekcia, lipofekcia alebo DEAE-dextránová metóda. Vhodná metóda sa čiastočne volí podľa typu použitej hostiteľskej bunky. Tieto a iné vhodné metódy, ktoré sú dobre známe odborníkom v tomto obore, sú napríklad popísané v publikácii Sambrook et al., citovanej vyššie.

Hostiteľské bunky obsahujúce vektor (tj. transformované hostiteľské bunky) je možné kultivovať v štandardných médiách, ktoré sú dobre známe odborníkom v tomto obore. Tieto médiá zvyčajne obsahujú všetky živiny potrebné pre rast a prežitie buniek. Ako vhodné médiá pre kultiváciu buniek E. coli je napríklad možné uviesť pôdu Luria Broth (LB) a/alebo- Terrific Broth (TB). K médiu sa obvykle pridáva ako prísada antibiotikum alebo iná zlúčenina užitočná pre selektívny rast len transformovaných buniek. Druh tejto zlúčeniny je závislý od selekčného markérového prvku obsiahnutého v plazmide, ktorým bola hostiteľská bunka transformovaná. Ak je napríklad prvkom selekčného markéra rezistencia voči kanamycínu, bude sa ku kultivačnému médiu ako prísada pridávať kanamycín.

5. Vyhodnotenie sekrécie

Množstvo polypeptidu NGF vylúčeného z hostiteľskej bunky a tým prevedeného na maturovanú formu Met-less je možné vyhodnotiť pomocou štandardných metód známych v tomto obore. Ako neobmedzujúce príklady vhodných metód je možné uviesť analýzu Western blot, elektroforézu na SDS-polyakrylamidovom géle, elektroforézu na nedenaturačnom géle, separáciu HPLC, imunoprecipitáciu a/alebo stanovenie aktivity.

Pri uskutočňovaní niektorých vyššie uvedených stanovení môže byť potrebná najprv predbežná manipulácia s kultivačným materiálom hostiteľských buniek s cieľom extrakcie polypeptidu. Obvykle sa pri týchto stanoveniach porovnáva množstvo spracovaného, teda maturovaného, polypeptidu vylúčeného z hostiteľskej bunky s celkovým množstvom exprimovaného polypeptidu (maturovaného polypeptidu + prekurzorového polypeptidu). Extrakty z hostiteľských buniek je možné pripraviť pomocou štandardných metód známych v tomto obore, ako sú napríklad metódy popísané v publikácii Cull et al., Meth. Enz. 182: 147 až 153, 1990. Ak sú použitými hostiteľskými bunkami gram-pozitívne baktérie alebo iné prokaryonty obsahujúce len jedinú cytoplazmatickú membránu, môže byť vylúčený polypeptid obsiahnutý v bunkovom kultivačnom médiu. Ak sú hostiteľskými bunkami gram-negatívne baktérie, ako sú napríklad baktérie E. coli alebo iné prokaryotické bunky s dvoma mambránami (vnútornou a vonkajšou membránou), bude väčšina vylúčeného peptidu obsiahnutá v periplazmatickom priestore, tj. v priestore medzi vnútornou a vonkajšou membránou.

Zhromaždenie nespracovanej formy polypeptidu NGF (tj. prekurzorovej formy) bude obvykle vyžadovať extrakciu polypeptidu z hostiteľskej bunky. Pre väčšinu analýz, ako je gélová elektroforéza, analýza Western blot a dot-blot, nie je potrebné prekurzor polypeptidu NGF purifikovať. Namiesto toho je možné hostiteľské bunky obsahujúce prekurzor polypeptidu NGF jednoducho zhromaždiť pomocou peletizácie v centrifúge a potom podrobiť pri štandardných podmienkach lýze. Zvyšky buniek (membrány, materiál bunkových stien a pod.) je možné oddeliť pomocou peletizácie v centrifúge a rozpustnú frakciu je potom možné priamo naniesť na gél alebo dot-blot pre ďalšiu analýzu.

Metódy použité na zhromaždenie spracovanej alebo vylúčenej formy polypeptidu NGF budú závisieť od toho, či je polypeptid umiestený v periplazme (gram-negatívne baktérie) alebo v kultivačnom médiu (gram-pozitívne baktérie a iné prokaryonty) .

Ak sa predpokladá, že polypeptid NGF bude obsiahnutý v kultivačnom médiu, môžu sa alikvóty kultivačného média priamo použiť pre gélovú elektroforézu, analýzu blot-dot a/alebo imunoprecipitáciu.

Ak sa očakáva, že bude polypeptid NGF obsiahnutý prevažne v periplazmatickom priestore, môže sa obsah periplazmy, vrátane inkluzívnych telies (ak spracovaný polypeptid vytvoril takéto komplexy) extrahovať z hostiteľskej bunky použitím štandardných technológií, ktoré sú známe odborníkom v tomto obore. Hostiteľské bunky je možné napríklad podrobiť lýze s cieľom uvoľnenia ich periplazmatického obsahu. Táto lýza sa môže uskutočňovať vo francúzskom lise, homogenizáciou a/alebo spracovaním ultrazvukom. Vzniknutý homogenát sa dá potom podrobiť centrifugácii.

Ak polypeptid NGF vytvoril v periplazme inkluzívne telesá, sú tieto inkluzívne telesá často viazané k vnútornej a/alebo vonkajšej bunkovej membráne a preto sú po centrifugácii prevážne obsiahnuté v materiáli pelety. Materiál pelety sa dá v takomto prípade spracovať chaotropickým činidlom, akým je guanidín alebo močovina, aby došlo k uvoľneniu, odštiepeniu a solubilizácii inkluzívnych telies. Polypeptid NGF, ktorý sa po takomto spracovaní vyskytuje v rozpustnej forme, je potom možné analyzovať pomocou elektroforézy na géle, imunoprecipitácie a pod. Ak má byť polypeptid NGF izolovaný, môžu sa na izoláciu použiť štandardné metódy, ako sú metódy popísané ďalej a v publikácii Marston et al., Meth. Enz. 182: 264 až 275, 1990.

Ak v periplazme hostiteľskej bunky vo významnom rozsahu nevzniknú inkluzívne telesá s obsahom polypeptidu NGF, je polypeptid NGF po centrifugácii bunkového homogenátu obsiahnutý prevážne v supernatante. Zo supernatantu je možné polypeptid NGF izoloval pomocou spôsobov, ktoré sú napríklad uvedené ďalej.

V tých situáciách, kedy sa dáva prednosč tomu, aby bola prekurzorová a/alebo maturovaná forma polypeptidu NGF čiastočne alebo úplne izolovaná, môže sa produkt podrobiť purifikácii použitím štandardných metód známych odborníkom v tomto obore. Ako neobmedzujúce príklady vhodných metód je možné uviesť eletroforetickú separáciu nasledovanú elektroelúciou, rôzne typy chromatografie (imunoafinitnú chromatografiu, chromatografiu na molekulovom site a/alebo chromatografiu s výmenou iónov a/alebo vysokotlakovú kvapalinovú chromatografiu). Pre úplnú purifikáciu sa v niektorých prípadoch prednostne používa viac ako jedna z vyššie uvedených metód.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch realizácie vynálezu. Tieto príklady majú výlučne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú.

Príklady realizácie vynálezu

Príkladl

Sekrécia BDNF

A. Príprava konštruktov DNA

Neurotrofný faktor pochádzajúci z humánneho mozgu (BDNF) bol pripravený expresiou v bunkách E. coli podľa nasledujúceho protokolu. Najprv bol skonštruovaný syntetický gén BDNF s cieľom zlepšenia expresie v bunkách E. coli. Tento gén obsahoval niekoľko kodónov pozmenených v jednej alebo viacerých bázach v porovnaní so sekvenciou nukleovej kyseliny BDNF vyskytujúcou sa v prírode. Sekvencia syntetické génu označená skratkou BDNFopt3 je uvedená na obr. 4. Tento gén kóduje metionín (ATG) pri 5' konci génu.

Sekvencia BDNFopt3 bola pripravená pomocou syntézy na polymérnom nosiči použitím štandardných metód fosforamiditovej chémie. S ohľadom na dĺžku sekvencie BDNFopt3 bol gén syntetizovaný vo forme štyroch separátnych segmentov: segment 1 obsahoval 104 báz a zahrnoval 5' nepreloženú sekvenciu zodpovedajúcu sekvenciu vektora, reštrikčné miesto Xbal, štart kodón ATG a prvých 76 báz sekvencie nukleovej kyseliny BDNFopt3; segment 2 obsahoval nasledujúcich 117 báz BDNFopt3; segment 3 obsahoval nasledujúcich 107 báz BDNFopt3 a segment 4 obsahoval zvyšných 57 báz BDNFopt3 spolu so stop kodónom TAA, sekvenciou reštrikčného miesta BamHI a 5 prídavnými nukleotidmi. Segmenty boli spolu ligované použitím štandardných ligačných protokolov. Pred ligáciou boli tri oligonukleotidy hybridizované k fragmentom génu BDNFopt3 s cieľom zaistenia, že budú štyri génové segmenty ligované v správnom poradí. Každý z týchto troch oligonukleotidov sprostredkúva jedno spojenie medzi fragmentmi génu BDNFopt3.

Sekvencia nukleovej kyseliny	každého	z týchto	oligonukleotidov je
uvedená ďalej
'’ÄČTGCGGTTTTCTTATCAGC	(SEQ	ID	NO: 6)
CAGCCTTCTTTAGTGTAACC	(SEQ	ID	NO:7)
GGATGAAGCGCCAGCCGATA	(SEQ	ID	NO: 8)

Po ligácii segmentov sa malá časť ligačnej zmesi s úplnou dĺžkou jednoreťazcového génu použijú ako templát pre PCR s cieľom amplifikácie génu. Ako priméry pre PCR amplifikáciu sa použije

TTGATTCTAGAAGGAGGAA (SEQ ID NO:9)

TCCGCGGATCCTTAGCGGCC (SEQ ID NO:10)

Bolo uskutočnených 25 cyklov PCR pri použití týchto podmienok: denaturácia pri 94 °C počas 1 minúty; teplotná hybridizácia pri 55 °C počas 1 minúty; a predlžovanie pri 72 °C počas 2 minút. Amplifikovaný fragment bol purifikovaný z agarózového gélu použitím súpravy GENECLEAN II (Bio 101, Inc., La Jolla, CA, USA) a štiepený reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI. Fragment bol vložený do vektora pCFN1656 (prírastkové číslo ATCC 69576) dopredu rozštiepeného Xbal a BamHI. Tento vektor obsahujúci celú dĺžku génu BDNFoptS, označený názvom pCFM1656/BDNFopt3, poslúžil ako templát na prípravu sekretovateľnej formy génu BDNFopt3 (tj . formy obsahujúcej signálnu sekvenciu). Klonovacia stratégia použitá pri príprave sekretovateľnej formy génu BDNFopt3 je znázornená na obr. 6.

Degenerované sekvencie oligonukleotidu kódujúce sekvencie signálneho peptidu uvedené na obr. 2 boli pripravené použitím syntézy na polymérnom nosiči a štandardnej fosforamiditovej chémie. Každá sekvencia obsahovala pri svojom 5' konci asi 24 báz sekvencie vektora pCFM1656 s. umiestením 5' vzhľadom na sekvenciu génu BDNFopt3 v pCFM1656/BDNFopt3 a pri svojom 3' konci asi 13 báz kódujúcich prvých šesť aminokyselín BDNFopt3 (s vylúčením aminoterminálneho meticnínu, ktorý bol vypustený s cieľom získania formy Met-less vylučovaného BDNFopt3) .

Pri príprave vylučovanej formy BDNFopt3 boli oligonukleotidy s degerovanými kodónmi signálneho peptidu RH a druhý oligonukleotid, ktorý je komplementárny k sekvencii vektora za 3' koncom génu BDNFopt3 (táto sekvencia je uvedená ďalej ako SEQ ID NO: 11) teplotné hybridizované k pCFM1656/BDNFopt3.

GTTGCTGCGATTCTCACCAA (SEQ ID NO:11)

Na syntézu génu kódujúceho celú sekvenciu BDNFopt3 pripojenú svojim 5' koncom k nukleovej kyseline kódujúcej sekvenciu signálneho peptidu RH bola použitá reťazová reakcia iniciovaná polymerázou (PCR). Reakcia PCR bola uskutočnená použitím reakčných zložiek a taq DNA polymerázy získanej od firmy Boehringer Mannheim Biochemicals Inc. Bolo uskutočnených 25 cyklov PCR pri použití týchto podmienok: denaturácia pri 94 °C počas 1 minúty; teplotná hybridizácia pri 50 °C počas 1 minúty; a predlžovanie pri 72 °C počas 2 minút. Po PCR bol PCR produkt (asi 574 bp kódujúcich BDNFopt3 a signálny peptid RH) spracovaný na 0,8% agarózovom géle a 574bp fragment bol z gélu vyštiepený a purifikovaný použitím súpravy GENECLEAN II (Bio 101, Inc.) podľa inštrukcií výrobcu. Purifikovaný fragment bol rozštiepený Xbal a Xhol za vzniku fragmentu DNA s dĺžkou asi 20 bp kódujúceho signálny peptid RH a približne jednu tretinu génu BDNFopt3 pri 5' konci. Vektor pCFM1656/BDNFopt3 bol rozštiepený Xbal a Xhol, malý fragment kódujúci 5' koniec BDNFopt3 bol odstránený a 200bp sekvencia RH/BDNFopt3 bola ligovaná do takto rozštiepeného vektora. Ligácia bola uskutočnená cez noc pri teplote asi 16 °C použitím ligázového pufra a enzýmu od firmy Boehringer Mannheim Inc., pričom reakcia bola uskutočnená podľa inštrukcií výrobcu.

Po ligácii boli plazmidy vložené (transformácia) do kompetentných buniek E. coli K12 kmeňa FMr5 (prírastkové číslo ATCC 53911} . Inzercia plazmidu bola uskutočnená použitím štandardného postupu s chloridom vápenatým, ktorý je popísaný v publikácii Sambrook et al., citovanej vyššie. Transformované bunky boli kultivované cez noc pri teplote asi 30 °C v miskách so Štandardným agarovým médiom Luria Broth (LB) obsahujúcim kanamycín v množstve asi ,50 ug/ml. Po kultivácii bolo selektovaných 16 jednotlivých kolónií. Týmito kolóniami bolo zaočkované médium LB Kultivácia prebiehala kultivácii boli bunky pôdou Terrific Broth s obsahom kanamycínu asi 50 _zug/ml. cez noc pri asi 30 °C v trepačke. Po zriedené asi v pomere 1:10 štandardnou (TB) (Sambrook et al., vyššie uvedená citácia) s obsahom kanamycínu a ponechané rásť pri asi 30 °C az do denzity OD600 0,5 až 0,8. Potom bola teplota zvýšená na asi 42 °C s cieľom indukcie expresie a sekrécie BDNFopt3.

Po asi 4 hodinách bol približne 1 mg vlhkej bunkovej hmoty peletizovaný a peleta bola podrobená lýze varením počas asi 10 minút v asi 100 _zul štandardného Tris-glycínového SDSrPAGE denaturačného/redukčného pufra (62,5mM Tris HC1, pH 6,8, 2% SDS, 0,0025% brómfenolová modrá, 10% glycerol, 2,5% betarmerkaptoetanol). Asi 10 ^ul vzniknutej zmesi bolo potom spracované na štandardnom SDS polyakrylamidovom géle (asi 18 % akrylamidu). Spracovanie bolo uskutočnené pri konštantnom napätí asi 130 V počas asi 2,5 hodiny. Gély, vzorkový pufer a mobilný pufer boli zakúpené od firmy NOVEX, Inc. (San Diego, CA, USA) a boli použité podľa inštrukcií výrobcu.

Ako kontrolný signálny peptid pre rovnakých postupov, prípravou nukleovej systém bola nukleová kyselina kódujúca OmpA pripojená ku génu BDNFopt3 použitím aké boli uvedené vyššie v súvislosti s kyseliny RH/BDNFopt3. Aby sa vytvoril signálny peptid OmpA, bola použitá táto oligonukleotidová sekvencia:

ATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGAAAAAGACAGČTATCGCGATT

GCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCCACTCTG ACCCGGCTCGT (SEQ ID N0:12).

Tak, ako pokiaľ ide oligonukleotidy RH, obsahoval oligonukleotid OmpA pri svojom 5' konci asi 24 báz sekvencie vektora pCFM1656 a pri svojom 3' konci asi 18 báz kódujúcich prvých 6 aminokyselín BDNFopt3 (s vylúčením aminoterminálneho metionínu).

B. Analýza sekvencií nukleovej kyseliny signálneho peptidu

Účinnosť rôznych nukleotidových sekvencií kódujúcich signálny peptid RH bola analyzovaná ako percentný podiel množstva spracovaného BDNFopt3 (polypeptidu BDNFopt3, z ktorého bol odštiepený signálny peptid) v porovnaní s celkovým množstvom produkovaného proteínu BDNFopt3 (spracované aj nespracované formy). Na porovnanie týchto dvoch foriem BDNFopt3 bol SDS gél ofarbený modrou Coomassie a po ofarbení podrobený skúmaniu s cieľom zistenia relatívneho množstva každej z týchto foriem.

Molekulová hmotnosť nespracovaného prekurzorového polypeptidu

BDNFopt3 je asi 15,8 kDa, zatiaľ čo spracovanej formy BDNFopt3 je asi 13,5 BDNFopt3 teda vytvárajú zreteľne molekulová hmotnosť kDa. Tieto dve formy odlišné pásy na

SDSrdenaturovanom polyakrylamidovom géle.

V prípade polypeptidov RH/BDNFopt3 boli obidva pásy (tj . pás spracovaného aj nespracovaného BDNFopt3) viditeľné ako pri ofarbení gélu modrou Coomassie, tak aj pri analýze gélu pomocou Western blotting pri použití detekcie BDNFopt3 na blote Western pomocou polyklonálnej protilátky antirBDNF. Pri vizuálnej inšpekcii sa ukázalo, že jedna sekvencia nukleovej kyseliny RH, tj. RH11, spracovala viac BDNFopt3 v porovnaní s ostatnými sekvenciami nukleovej kyseliny RH, ako RH12 a v porovnaní so

..

sekvenciou nukleovej kyseliny OmpA. Gél bol preskúmaný použitím zariadenia Ultrascan XL (Pharmacia LKB) s cieľom zistenia relatívnych množstiev spracovaného a nespracovaného BDNF v prípade rôznych sekvencií nukleovej kyseliny signálneho peptidu RH a sekvencie nukleovej kyseliny signálneho peptidu OmpA. Výsledky tohto skúmania v prípade sekvencií nukleovej kyseliny RH11, RH12 a OmpA sú uvedené v tabuľke 1, ktorá nasleduje. Tieto výsledky uvádzajú plochu pod krivkou (absorbancia x šírka proteínového pásu na géle v mm) s tým, že získanie pochádzalo z merania na géle.

Tabuľka 1

	OmpA	1U111	RH12
Nespracovaný BDNF	0,64	0,07	1,61
Spracovaný BDNF	0,34	0, 65	0, 73
Podiel spracovaného BDNF (%)	34,7	90,3	31,2

Ako je zrejmé, pri použití sekvencie nukleovej kyseliny signálneho peptidu RH11 sa dosiahne účinnejšie spracovanie BDNFopt3 v porovnaní s použitím sekvencie OmpA alebo RH12.

Príklad 2

Sekrécia NT-3

A. Príprava konštruktov DNA

Bol pripravený syntetický gén kódujúci humánny NT? 3 s cieľom expresie v bunkách E. coli. Tento gén bol zostrojený, aby sa zlepšila expresia v týchto bunkách pri použití prednostných bakteriálnych kodónov. Sekvencia tohto syntetického génu je uvedená na obr. 5.

Syntetický gén s názvom NT-3opt3 bol pripravený pomocou syntézy na polymérnom nosiči použitím štandardných metód fosforamiditovej chémie. S ohľadom na dĺžku sekvencie NT-3opt3 bol gén syntetizovaný vo forme štyroch separátnych fragmentov nukleovej kyseliny, ktorých dĺžka ležala v rozmedzí od 94 do 104 nukleotidov; fragment kódujúci 5’ časť génu NT-3opt3 obsahoval určitú nekódujúcu sekvenciu 5' vzhľadom na štart kodón ATG s cieľom poskytnutia miesta Xbal. Fragment kódujúci 3’ časť génu NT=3opt3 obsahoval určitú nekódujúcu sekvenciu pri 3' konci s cieľom poskytnutia reštrikčného miesta EamHI.

Po syntéze boli fragmenty navzájom ligované pri použití nukleových kyselín pre oligonukleotidové spojenie, ich sekvencie sú komplementárne vzhľadom na oblasti okolo každého ligačného spojenia. Teplotné hybridizácie a ligácie boli uskutočňované použitím štandardných protokolov. Oligonukleotidové sekvencie použité ako sekvencie pre spojenie sú uvedené ďalej

AGCGGAGGATTTGTCGGTAA (SEQ ID NO:13)

CTTTGCAACGGGTTTCGTAG (SEQ ID NO:14)

GTTTTCGGAGGTCAGAGCAC (SEQ ID NO:15)

Malá časť ligovanéj zmesi s úplnou dĺžkou jednoreťazcoveho génu NT-3opt3 bola použité ako templát pre PCR s cieľom amplifikácie génu NT^3opt3 . Pre túto PCR boli použité tieto dva oligonukleotidy ako priméry

TTGATTCTAGAAGGAGGAAT (SEQ ID NO:16)

TCCGCGGATCCTTAGGTACG (SEQ ID NO:17)

Bolo uskutočnených 25 cyklov PCR pri použití týchto podmienok: denaturácia pri 94 °C počas 1 minúty; teplotná hybridizácia pri 55 °C počas 1 minúty; a predlžovanie pri 72 °C počas 2 minút. Amplifikovaný fragment bol purifikovaný na agarózovom géle pri použití súpravy GENECLEAN II (Bio 101) a štiepený Xbal a BamHI. Potom bol rozštiepený fragment vložený do vektora pCFM1656, ktorý bol dopredu rozštiepený Xbal a BamHI. Plazmid obsahujúci gén NTr3opt3 bol použitý na prípravu génu NT3opt3 obsahujúceho nukleovú kyselinu kódujúcu sekvenciu signálneho peptidu RH. Použitá stratégia je porovnateľná so stratégiou popísanou vyššie v súvislosti s BDNFopt3 (pozri príklad 1 a obr. 6).

Čiastočne degenerované oligonukleotidové sekvencie kódujúce sekvenciu signálneho peptidu RH (pozri obr. 2) boli syntetizované použitím štandardných metód syntézy DNA pomocou fosforamiditovej chémie. Každá sekvencia obsahovala pri svojom 5’ konci asi 24 báz sekvencie vektora pCFM1656. Každá sekvencia obsahovala pri svojom konci 3’ 18 báz kódujúcich prvých šesť aminokyselín NT=3opt3 (s vylúčením prvého metionínového zvyšku, ktorý bol vypustený s cieľom prípravy aminoterminálnej Met-less formy vylučovaného NT-3opt3).

Pre prípravu vylúčenej (sekretovanej) formy NT-3opt3 boli oligonukleotidovéj sekvencie obsahujúcej degenerované kodóny signálneho peptidu RH teplotné hybridizované k vektoru pCFN1656/BDNF3opt3 s cieľom PCR. K pCFM1656/NT3opt3 bola súčasne teplotné hybridizovaná druhá oligonukleotidové sekvencia, ktorá je komplementárna k 3' konci sekvencie vektora za génom NTr3opt3. S cieľom syntézy génu kódujúceho úplnú sekvenciu NT?3opt3 pripojenú svojím 5' koncom k nukleovej kyseline kódujúcej sekvenciu peptidu RH bola použitá reťazová reakcia iniciovaná polymerázou (PCR).

Reakcia PCR bola uskutočnená použitím reakčných zložiek a taq DNA polymerázy získanej od firmy Boehringer Mannheim Biochemicals Inc. Bolo uskutočnených 25 cyklov PCR pri použití týchto podmienok: denaturácia pri 94 °C počas 1 minúty; teplotná hybridizácia pri 50 °C počas 1 minúty; a predlžovanie pri 72 °C počas 2 minút. Po PCR bol PCR produkt (asi 574 bp kódujúcich

NT-3opt3 a signálny peptid RH) spracovaný na 0,8% agaróžovom géle a približne 574bp nukleotidový fragment RH/NT-3opt3 bol z gélu vyštiepený a purifikovaný použitím súpravy GENECLEAN II (Bio 101, Inc.) podľa inštrukcií výrobcu. Purifikovaný fragment bol rozštiepený Xbal a HindlII za vzniku fragmentu DNA s dĺžkou asi 371bp kódujúceho signálny peptid RH a 5' časť génu NT-3. Vektor pCFM1656/NT-3opt3 bol rozštiepený Xbal a HindlII, fragment kódujúci 5' časť NT-3opt3 bol odstránený a nahradený ligáciou s približne 371bp sekvenciou DNA RH/NT-3opt3 (získanou pomocou PCR). Ligácia bola uskutočnená cez noc pri teplote asi 16 °C použitím ligázového pufra a enzýmu od firmy Boehringer Mannheim inc., pričom reakcia bola uskutočnená podľa inštrukcií výrobcu.

Po ligácii boli plazmidy. vložené (transformácia) do kompetentných buniek E. coli K12 kmeňa FM-5 (prírastkové číslo ATCC 53911). Inzercia plazmidu do buniek E. coli bola uskutočnená použitím štandardného postupu s chloridom vápenatým, ktorý je popísaný v publikácii Sambrook et al., citovanej vyššie. Transformované bunky boli kultivované cez noc pri teplote asi 30 °C v miskách so štandardným agarovým médiom Luria Broth (LB) obsahujúcim kanamycín v množstve asi 50 _zug/ml. Po kultivácii bolo selektovaných 13 jednotlivých kolónií. Týmito kolóniami bolo zaočkované médium LB Kultivácia prebiehala kultivácii boli bunky pôdou Terrific Broth s obsahom kanamycínu asi 50 _zug/ml. cez noc pri asi 30 °C v trepačke. Po zriedené asi v pomere 1:10 štandardnou (TB) (Sambrook et al., vyššie uvedená citácia) s obsahom kanamycínu a ponechané rásť pri asi 30 °C až do denzity OD600 0,5 až 0,8. Potom bola teplota zvýšená na asi °C s cieľom indukcie expresie a sekrécie NT-3opt3.

Po asi 4 hodinách bol približne 1 mg vlhkej bunkovej hmoty peletizovaný a peleta bola podrobená lýze varením počas asi 10 minút v asi 100 _zul štandardného SDS-PAGE denaturačného/redukčného pufra (popísané v príklade 1). Asi 10 _zul vzniknutej zmesi bolo potom spracované na štandardnom SDS polyakrylamidovom géle (asi 18 % akrylamidu). Spracovanie bolo uskutočnené pri konštantnom napätí asi 130 V počas asi 2,5 hodiny. Gély, vzorkový pufer a mobilný pufer boli zakúpené od firmy NOVEX, Inc. (San Diego, Ch, USA) a boli použité podľa inštrukcií výrobcu.

B. Analýza sekvencií nukleovej kyseliny signálneho peptidu

Účinnosť rôznych nukleotidových sekvencií kódujúcich signálny peptid RH bola.analyzovaná ako percentný podiel množstva spracovaného NT-3opt3 (polypeptidu NT-3opt3, z ktorého bol odštiepený signálny peptid) v porovnaní s celkovým množstvom produkovaného proteínu NT-3opt3 (spracované aj nespracované formy) . Na porovnanie týchto dvoch foriem NT-3opt3 bol SDS gél ofarbený modrou Coomassie a po Ofarbení podrobený skúmaniu s cieľom zistenia relatívneho množstva každej z týchto foriem. Molekulová hmotnosť nespracovaného prekurzorového polypeptidu NT-3opt3 je asi 15,9 kDa, zatiaľ čo molekulová hmotnosť spracovanej formy NT-3opt3 je asi 13,6 kDa. Tieto dve formy NT-3opt3 teda vytvárajú zreteľne odlišné pásy na SDS-denaturovanom polyakrylamidovom géle.

V prípade polypeptidov RH/NTopt3 boli obidva pásy (tj. pás spracovaného aj nespracovaného NT-3opt3) viditeľné ako pri ofarbení gélu modrou Coomassie, tak aj pri analýze gélu pomocou Westem blotting pri použití detekcie NT-3opt3 na blote Western pomocou polyklonálnej protilátky anti-NT-3opt3. Pri vizuálnej inšpekcii sa ukázalo, že dve sekvencie nukleovej kyseliny RH, tj. RH3, RH5 a RH11, vykazovali vyšší podiel spracovaného NT-3opt3 v porovnaní s ostatnými sekvenciami nukleovej kyseliny RH. Sekvencie RH3 (SEQ ID NO: 18), RH4 (SEQ ID NO: 19), RH5 (SEQ ID NO: 20) a RH6 (SEQ ID NO: 21) sú charakterizované ďalej, zatiaľ čo sekvencia RH11 je uvedená na obr. 3.

RH3: ’

ATGAAGAAACGTGCGCGCGCGATTGCAATTGCAGTAGCGCTGGCTG

GCTTTGCTACCGTAGCGCACGCG (SEQ ID NO: 18)

RH4:

ATGAAAAAGCGČGCACGCGCTATCGCTATCGCTGTTGCTCTGGCTG

GCTTTGČAACTGTTGCTCATGCA (SEQ ID NO:19)

RH5: ¹ ·

ATGAAAAÄGCGCGCACGCGCAATTGCGATTGCGGTTGCTCTGGCGG GTTTCGCTÁCCGTTGCGCATGCG (SEQ ID NO:20)

- · *

RH6:

ATGAAAAAGCGCGCTCGTGCGATCGCGATTGCTGTAGCGCTGGČGG GTTTTGCAACTGTAGCTCACGCG (SEQ ID NO:21) ' ’

Gél bol preskúmaný spôsobom popísaným v príklade 1 s cieľom zistenia relatívnych množstiev spracovaného a nespracovaného NT-3opt3 v prípade rôznych sekvencií nukleovej kyseliny signálneho peptidu RH. Výsledky tohto skúmania aktivity sekvencií nukleovej kyseliny sú uvedené v tabuľke 2, ktorá nasleduje. Tieto výsledky uvádzajú plochu pod krivkou (absorbancia x šírka proteínového pásu na géle v mm) s tým že získanie pochádzalo z merania na géle.

Tabuľka 2

	RH3	RH4	RH5	RH6	RH11 .
Nespracovaný NŤ-3opt3	0,05	0,87	0,05	0,70	0,05
Spracovaný NT-3opt3	0,46	1,01	0,53	0,76	0,40
Podiel spracovaného NT-3opt3 (%)	90,2	53,7	91,4	52,1	88,9

...

Všetky citácie uvedené v tomto popise sú tu citované náhradou za prenesenie ich celého obsahu do popisu tohto vynálezu.

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNE INFORMÁCIE:

(i) PRIHLASOVATEĽ: Amgen Inc.

(ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Enhanced Secretion of Polypeptides (Zvyšovanie sekrécie polypeptidov) (iii) POČET SEKVENCIÍ: 23 (iv) ADRESA PRE KOREŠPONDENCIU:

(A) ADRESÁT: Amgen Inc. U.S. Patent Operation/NAO (B) ULICA: 1840 Dehavilland Drive (C) MESTO: Thousand Oaks (D) ŠTÁT: Kalifornia (E) KRAJINA: USA (F) PSČ: 91320 (ZIP) (v) STROJOVO ČITATEĽNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, verzia #1.25 (vi) DÁTA VZŤAHUJÚCE SA K TEJTO PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: 08/215,138 (B) DÁTUM PODANIA: 18. marca 1994 (C) ZATRIEDENIE:

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 1:

(i).CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1:

Met Lys Lys Arg Ala Arg Ala íle Ala íle Ala Val Ala Leu Ala Gly ^! 1 i, 5 10 15

Phe Ala Thr Val Ala His Ala

-33..-. . 20 ·’---ľ ------(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 69 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 2:

ATGAARAARC GYGCDCGYGC DATYGCDATY GCDGTWGCDC TGGCDGGYTT YGCDACYGTW

GCDCAYGCD (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 69 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 3:

ATGAAAAAGC GCGCGCGTGC GATCGCGATC GCGGTTGCGC TGGCTGGCTT CGCTACCGTT

GCGCACGCT (A) (B) (C) (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE: DĹŽKA: 363 bázových párov TYP: nukleová kyselina REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 4:

ATGCÄCTCTG	ACCCGGCTCG TCGTGGTGAA CTGTCTGTTT GTGATTCTAT CTCTGAATGG	60
GTTACCGCGG	CTGATAAGAA AACCGCÄGTC GACATGTCTG GTGGCACTGT TACCGTCCTC	120
GAGAAAGTTC	CTGTATCTAA AGGTCAGCTG AAACAATATT TCTACGAAAC CAAATGCAAT	180
CCGATGGGTT	ACACTAAAGA AGGCTGCCGT GGCATCGACA AACGTCATTG GAACTCTCAG	240
TGTCGTACTA	CCCAGTCTTA TGTTCGTGCG CTGACCATGG ACTCCAAGAA ACGTATCGGC	300
TGGCGCTTCA	TCCGTATTGA CACTAGTTGC GTTTGTACTC TGACTATCAA ACGTGGCCGC	360

TAA 363 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 363 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 5:

ATGTACGCTG	AACACAAATC	CCACCGTGGT	GAATATTCCG	TTTGCGACTC	CGAATCCCTG	60
TGGGTTACCG	ACAAATCCTC	CGCTATCGAT	ATCCGTGGTC	ACCAGGTTAC	CGTTCTGGGT	120
GAAATCAAAA	CCGGTAACTC	CCCAGTAAAA	CAGTACTTCT	ACGAAACCCG	TTGCAAAGAA	180
GCTCGTCCGG	TTAAAAACGG	TTGCCGCGGT	ATCGACGACA	AACATTGGAA	CTCTCAGTGC	240
AAAACTAGTC	AGACCTACGT	TCGTGCTCTG	ACCTCCGAAA	ACAACAAGCT	TGTTGGTTGG	300
CGTTGGATTC	GTATCGACAC	CAGCTC-CGTT	TGCGCTCTGT	CCCGTAAAAT	CGGTCGTACC	360
TAA						363

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec

38.

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 6:

ACTGGCGGTTT TCTTATCAGC 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) .TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 7:

CAGCCTTCTT TAGTGTAACC 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 8:

GGATGAAGCG CCAGCCGATA 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 9:

TTGATTCTAG AAGGAGGAA (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 10:

.(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: j eden reťazec . . ; (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 10:

TCCGCGGATC CTTAGCGGCC 20 (2), INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 11:

GTTGCTGCGA TTCTCACCAA 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 103 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 12:

ATTCTAGAAG GAGGAATAAC ATATGAAAAA GACAGCTATC GCGATTGCAG TGGCACTGGC 6'

TGGTTTCGCT ACCGTAGCGC AGGCCCACTC TGACCCGGCT CGT ¹⁰ (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

40. ..,, (A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 13:

AGCGGAGGAT TTGTCGGTAA 20 (2) INFORMÁCIE O. SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: j eden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 14:

CTTTGCAACG GGTTTCGTAG 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 15:

CTTTTCGGAG GTCAGAGCAC 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA •ľ: 41 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 16:

TTGATTCTAG AAGGAGGAAT (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 17:

TCCGCGGATC CTTAGGTACG 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 69 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 18:

ATGAAGAAAC GTGCGCGCGC GATTGCAATT GCAGTAGCGC TGGCTGGCTT TGCTACCGTA 60 ^: GCGCACGCG (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 69 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 19:.

ATGAAAAAGC GCGCACGCGC TATCGCTATC GCTGTTGCTC TGGCTGGCTT TGCAACTGTT

GCTCATGCA (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 69 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden retzazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 20:

ATGAAAAAGC GCGCACGCGC AATTGCGATT GCGGTTGCTC TGGCGGGTTT CGCTACCGTT60

GCGCATGCG69 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 21:.

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 69 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reéazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 21:

ATGAAAAAGC GCGCTCGTGC GATCGCGATT GCTGTAGCGC TGGCGGGTTT TGCAACTGTA 60

GCTCACGCG 69 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 360 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 22:

^:43'1

CACTCTGACC	CGGCTCGTCG	TGGTGAACTG	TCTGTTTGTG	ÁTTCTATCTC	TGAATGGGTT	60
ACCGCGGCTG	ATAAGAAAAC	CGCAGTCGAC	ATGTCTGGTG	GCACTGTTAC	CGTCCTCGAG	120
AAAGTTCCTG	TATCTAAAGG	TCAGCTGAAA	CAATATTTCT	ACGAAACCAA	ATGCAATCCG	180
ATGGGTTACA	CTAAAGAAGG	CTGCCGTGGC	ATCGACAAAC	GTCATTGGAA	CTCTCAGTGT	240
ČGTACTACCC	AGTCTTATGT	TCGTGCGCTG	ACCATGGACT	CCAAGAÄACG	ŤATCGGCTGG	300
CGCTTCATCC	GTATTGACAC	TAGTTGCGTT	TGTACTCTGA	CTATCAAACG	TGGCCGCTAA	360

(2) INFORMÁCIE Ο SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 360 bázových párov (B) TYP.: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 23:

TACGCTGAAC ACAAATCCCA CCGTGGTGAA TATTCCGTTT GCGACTCCGA ATCCCTGTGG : GTTACCGACA AATCCTCCGC TATCGATATC CGTGGTCACC..AGGTTACCGT TCTGGGTGAA ATCAAAACCG GTAACTCCCC AGTAAAACAG TACTTCTACG AAACCCGTTG CAAAGAAGCT CGTCCGGTTA AAAACGGTTG CCGCGGTATC GACGACAAAC ATTGGAACTC TCAGTGCAAA ACTAGTCAGA CCTACGTTCG TGCTCŤGACC TCCGAAAACA ACAAGCTTGT’TGGTTGGCGT TGGATTCGTA’TCGACACCAG CTGCGTTTGC GCTCTGTCCC GTAAAATCGG TCGTACCTAA

120. 180 240· 300 360

Claims (24)

1. . 1. Peptid vykazujúci sekvenciu

   MKKRARAIAIAVALAGFATVAHA (SEQ ID NO: 1) .
2. 2. Peptid podľa nároku 1, ktorý ďalej obsahuje pri svojom karboxylovom konci polypeptid BDNF.
3. 3. Peptid podľa nároku 1, ktorý ďalej obsahuje pri svojom karboxylovom konci polypeptid NT-3.
4. 4. Peptid podľa nároku 1, ktorýďalej obsahuje pri svojom karboxylovom konci polypeptid NGF.
5. 5. Peptid podľa nároku 1, ktorý ďalej obsahuje pri svojom karboxylovom konci polypeptid NT-4.
6. 6. Nukleová kyselina vykazujúca sekvenciu SEQ ID NO: 2.
7. 7. Nukleová kyselina vykazujúca sekvenciu zvolenú zo súboru zahrnujúceho SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 a SEQ ID NO: 21.
8. 8. Nukleová kyselina vykazujúca sekvenciu SEQ ID NO: 3.
9. 9. Nukleová kyselina vykazujúca sekvenciu SEQ ID NO: 18.
10. 10. Nukleová kyselina vykazujúca sekvenciu SEQ ID NO:19.
11. 11. Nukleová kyselina vykazujúca sekvenciu SEQ ID NO:20.
12. 12. Nukleová kyselina vykazujúca sekvenciu SEQ ID NO:21.
13. 13. Nukleová kyselina podľa nároku 6, ktorá ďalej obsahuje '· )45.pri svojom 3' konci nukleovú kyselinu kódujúcu polypeptid NGF v podobe Met-less.

    14. Nukleová kyselina podľa nároku 13, v ktorej je polypeptidom NGF polypeptid BDNF. 15. Nukleová kyselina polypeptidom NGF polypeptid NT- podľa -3. nároku 13, v ktorej je 16. Nukleová kyselina podľa polypeptidom NGF polypeptid NGF. nároku 13, v ktorej je 17. Nukleová kyselina podľa nároku 13, v ktorej je

    polypeptidom NGF polypeptid NT-4.
14. 18. Nukleová kyselina podľa nároku 8, ktorá ďalej obsahuje pri svojom 3' konci nukleovú kyselinu kódujúcu polypeptid NGF v podobe Met-less.

    19. Nukleová kyselina podľa polypeptidom NGF polypeptid BDNF. nároku 18, v ktorej je 20. Nukleová kyselina podľa polypeptidom NGF polypeptid NT-3. nároku 18, v ktorej je 21. Nukleová kyselina podľa polypeptidom NGF polypeptid NGF. nároku 18, v ktorej je 22. Nukleová kyselina podľa polypeptidom NGF polypeptid NT-4. nároku 18, v ktorej je
15. 23. Nukleová kyselina podľa nároku 9, ktorá ďalej obsahuje pri svojom 3’ konci nukleovú kyselinu kódujúcu polypeptid NGF v podobe Met-less.
16. 24. Nukleová kyselina podľa nároku 23, polypeptidom NGF polypeptid NT-3.

    v ktorej j e 46?
17. 25. Nukleová kyselina podľa nároku 11, ktorá ďalej obsahuje pri svojom 3' konci nukleovú kyselinu kódujúcu polypeptid NGF v podobe Met-less.
18. 26. Nukleová kyselina podľa nároku 25, v ktorej je polypeptidom NGF polypeptid NT-3.
19. 27. Vektor obsahujúci nukleovú kyselinu podľa niektorého z nárokov 6, 7, 8, 9, 10, 11 alebo 12.
20. 28. Vektor obsahujúci nukleovú kyselinu podľa niektorého z nárokov 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 alebo

    26.
21. 29. Vektor pCFM1656/BDNFopt3.
22. 30. Vektor pCFM1656/NT-3opt3.
23. 31. Prokaryotická hostiteľská bunka s vloženým vektorom podľa nároku 28, 29 alebo 30.
24. 32. Spôsob prípravy polypeptidu NGF v podobe Met-less, vyznačujúci sa tým, že sa

    a) kultivuje prokaryotická hostiteľská bunka podľa nároku

    29, 30 alebo 31 a

    b) oddelí vylúčený polypeptid NGF.