DE202004021723U1 - Medizinische Verwendung von Hemmern von Glutaminyl- und Glutamatcyclasen - Google Patents

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Abstract

Pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen, enteralen oder oralen Verabreichung, umfassend mindestens einen Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz desselben.

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft Glutaminyl-Cyclase (QC, EC 2.3.2.5), welche die intramolekulare Cyclisierung von N-terminalen Glutaminresten zu Pyroglutaminsäure (5-Oxoprolin, pGlu*) unter Freisetzung von Ammoniak und die intramolekulare Cyclisierung von N-terminalen Glutamatresten zu Pyroglutaminsäure unter Freisetzung von Wasser katalysiert.
  • Die vorliegende Erfindung identifiziert Säugetier QCs als Metallenzyme, und stellt neue physiologische Substrate von QC in Säugetieren und die Verwendung von Effektoren der QC und pharmazeutische Zusammensetzungen, die Effektoren der QC enthalten, für die Behandlung von Zuständen, die durch die Modulation der QC Aktivität behandelt werden können, bereit. Darüber hinaus wird gezeigt, dass Metall-Wechselwirkung ein nützlicher Ansatz für die Entwicklung von QC-Inhibitoren (QC-Hemmern) ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Effektoren der QC-Aktivität in Kombination mit Inhibitoren der DP IV oder DP IV-ähnlichen Enzymen zur Behandlung oder Linderung von Zuständen bereit, die durch die Modulation der QC- und/oder DP IV-Aktivität behandelt werden können.
  • Ein Screening-Verfahren für die Ermittlung und Auswahl von Effektoren der QC-Aktivität wird auch zur Verfügung gestellt.
  • Hintergrund
  • Glutaminyl-Cyclase (QC, EC 2.3.2.5) katalysiert die intramolekulare Cyclisierung von N-terminalen Glutaminresten zu Pyroglutaminsäure (pGlu*), wobei Ammoniak freigesetzt wird. 1963 wurde QC zum ersten Mal von Messer aus dem Latex der tropischen Pflanze Carica papaya isoliert (Messer, M. 1963 Nature 4874, 1299). 24 Jahre später wurde eine entsprechende enzymatische Aktivität in einer Tierhypophyse entdeckt (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. und Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 3628-3632). Für die Säugetier QC konnte die Umwandlung von Gln zu pGlu durch QC für die Vorläufer von TRH und GnRH gezeigt werden (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. und Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 3628-3632). Zudem ergaben erste Lokalisierungsversuche für QCin Rinderhypophyse eine Kolokalisation mit seinen mutmaßlichen Katalyseprodukten, wodurch die vorgeschlagene Funktion in der Peptid-Hormon-Synthese weiter belegt wurde (Rockers, T. M. et al. 1995 J Neuroendocrinol 7, 445-453). Im Gegensatz dazu ist die physiologische Funktion der pflanzlichen QC weniger klar. Im Fall des Enzyms aus C. papaya wurde eine Rolle bei der pflanzlichen Verteidigung gegen pathogene Mikroorganismen vorgeschlagen (El Moussaoui, A. et al. 2001 Cell Mol Life Sci 58, 556-570). Mutmaßliche QCs aus anderen Pflanzen wurden vor kurzem durch Sequenzvergleiche ermittelt (Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36). Die physiologische Funktion dieser Enzyme ist jedoch noch immer nicht eindeutig bekannt.
  • Die aus Pflanzen und Tieren bekannten QCs zeigen eine strikte Spezifität für L-Glutamin in der N-terminalen Position der Substrate und es wurde festgestellt, dass ihr kinetisches Verhalten der Michaelis-Menten Gleichung gehorcht (Pohl, T. et al. 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88, 10059-10063; Consalvo, A. P. et al. 1988 Anal Biochem 175, 131-138; Gololobov, M. Y. et al. 1996 Biol Chem Hoppe-Seyler 377, 395-398). Ein Vergleich der Primärstrukturen der QCs aus C. papaya und der der hochkonservierten QC aus Säugetieren ergab jedoch keine Sequenzhomologie (Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36). Während die pflanzlichen QCs zu einer neuen Enzymfamilie zu gehören scheinen (Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36), wurde gefunden, dass die Säugetier QCs eine ausgeprägte Sequenzhomologie zu bakteriellen Aminopeptidasen haben (Bateman, R. C. et al. 2001 Biochemistry 40, 11246-11250), was zu dem Schluss führte, dass die QCs aus Pflanzen und Tieren unterschiedliche evolutionäre Ursprünge haben.
  • EP 02 011 349.4 offenbart Polynucleotide, die für Insekten Glutaminyl-Cyclase codieren sowie Polypeptide, die dadurch codiert sind. Diese Anmeldung stellt ferner Wirtszellen bereit, die Expressionsvektoren enthalten, die erfindungsgemäße Polynucleotide enthalten. Isolierte Polypeptide und Wirtszellen, die Insekten QC enthalten, sind nützlich bei Screening-Verfahren nach Mitteln, die die Aktivität der Glutaminyl-Cyclase verringern. Solche Mittel werden beschrieben, nützlich als Pestizide zu sein.
  • Alzheimer-Krankheit (AD) ist durch eine abnorme Akkumulation von extrazellulären amyloiden Plaques charakterisiert, die eng mit dystrophischen Neuronen, reaktiven Astrozyten und Mikroglia assoziiert sind (Terry, R. D. und Katzman, R. 1983 Ann Neurol 14, 497-506; Glenner, G. G. und Wong, C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890; Intagaki, S. et al. 1989 J Neuroimmunol 24, 173-182; Funato, H. et al. 1998 Am J Pathol 152, 983-992; Selkoe, D. J. 2001 Physiol Rev 81, 741-766). Amyloid-beta (Aβ) Peptide sind die hauptsächlichen Bestandteile der senilen Plaques und es wird angenommen, dass sie unmittelbar an der Pathogenese und Progression von AD beteiligt sind, eine Hypothese, die durch genetische Studien gestützt wird (Glenner, G. G. und Wong, C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890; Borchelt, D. R. et al. 1996 Neuron 17, 1005-1013; Lemere, C. A. et al. 1996 Nat Med 2, 1146-1150; Mann, D. M. und Iwatsubo, T. 1996 Neurodegeneration 5, 115-120; Citron, M. et al. 1997 Nat Med 3, 67-72; Selkoe, D. J. 2001 Physiol Rev 81, 741-766). Aβ wird durch proteolytische Prozessierung des β-Amyloid-Vorläuferproteins (APP) generiert (Kang, J. et al. 1987 Nature 325, 733-736; Selkoe, D. J. 1998 Trends Cell Biol 8, 447-453), das sequenziell gespalten wird durch β-Sekretase am N-Terminus und γ-Sekretase am C-Terminus von Aβ (Haass, C. und Selkoe, D. J. 1993 Cell 75, 1039-1042; Simons, M. et al. 1996 J Neurosci 16, 899-908). Zusätzlich zu den dominanten Aβ Peptiden, die mit L-Asp am N-Terminus beginnen (Aβ1-42/40), tritt eine große Heterogenität von N-terminal verkürzten Formen bei senilen Plaques auf. Von diesen verkürzten Peptiden wird berichtet, dass sie in-vitro neurotoxischer sind und schneller als die vollständigen Isoformen aggregieren (Pike, C. J. et al. 1995 J Biol Chem 270, 23895-23898). Es ist bekannt, dass N-verkürzte Peptide in Subjekten mit familiärem AD (FAD) in einem frühen Stadium überproduziert werden (Saido, T. C. et al. 1995 Neuron 14, 457-466; Russo, C. et al. 2000 Nature 405, 531-532), früh im Gehirn bei Down-Syndrom (DS) auftreten und sich mit dem Alter anreichern (Russo, C. et al. 1997 FEBS Lett 409, 411-416; Russo, C. et al. 2001 Neurobiol Dis 8, 173-180; Tekirian, T. L. et al. 1998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94). Schließlich gibt deren Menge die fortschreitende Schwere der Erkrankung wieder (Russo, C. et al. 1997 FEBS Lett 409, 411-416). Zusätzlich können post-translationale Prozesse den N-Terminus weiter modifizieren, durch Isomerisierung oder Racemisierung des Aspartats bei Position 1 und 7 und durch Cyclisierung von Glutamat bei den Resten 3 und 11. Pyroglutamat-haltige Isoformen bei Position 3 [pGlu3] Aβ3-40/42] stellen die wichtigen Formen – ca. 50% der gesamten Aβ Menge – der N-verkürzten Arten bei senilen Plaques dar (Mori, H. et al. 1992 J Biol Chem 267, 17082-17086, Saido, T. C. et al. 1995 Neuron 14, 457-466; Russo, C. et al. 1997 FEBS Lett 409, 411-416; Tekirian, T. L. et al. 1998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94; Geddes, J. W. et al. 1999 Neurobiol Aging 20, 75-79; Harigaya, Y. et al. 2000 Biochem Biophys Res Commun 276, 422-427) und sie sind auch bei prä-amyloiden Läsionen vorhanden (Lalowski, M. et al. 1996 J Biol Chem 271, 33623-33631). Die Anhäufung von AβN3(pE) Peptiden erfolgt vermutlich aufgrund der strukturellen Änderung, die die Aggregation verstärkt und Resistenz gegenüber den meisten Aminopeptidasen verleiht (Saido, T. C. et al. 1995 Neuron 14, 457-466; Tekirian, T. L. et al. 1999 J Neurochem 73, 1584-1589). Dieser Nachweis gibt Hinweise für eine zentrale Rolle der AβN3(pE) Peptide bei der AD Pathogenese. Allerdings ist relativ wenig über ihre Neurotoxizität und Aggregationseigenschaften bekannt (He, W. und Barrow, C. J. 1999 Biochemistry 38, 10871-10877; Tekirian, T. L. et al. 1999 J Neurochem 73, 1584-1589). Darüber hinaus sind die Wirkung dieser Isoformen auf Gliazellen und die Antwort der Gliazellen auf diese Peptide völlig unbekannt, obwohl aktivierte Gliazellen strikt mit senilen Plaques assoziiert sind und aktiv zu der Anhäufung von Amyloid-Ablagerungen beitragen könnten. In neueren Studien wurden die Toxizität, Aggregationseigenschaften und der Katabolismus von Aβ1-42, Aβ1-40, [pGlu3]Aβ3-42 und [pGlu3]Aβ3-40 Peptiden in Kulturen von neuronalen und Gliazellen untersucht, und es wurde gezeigt, dass eine Änderung von Pyroglutamat die toxischen Eigenschaften der Aβ Peptide verschlimmert und auch deren Abbau durch kultivierte Astrozyten hemmt. Shirotani et al. untersuchten die Entstehung von [pGlu3]Aβ Peptiden in primären kortikalen Neuronen, die in vitro mit Sindbis-Virus infiziert waren. Sie konstruierten zu Amyloid-Vorläuferprotein komplementäre DNAs, die durch Aminosäure-Substitution und -Deletion für einen potentiellen Vorläufer von [pGlu3]Aβ codierten. Für einen künstlichen Vorläufer, der mit einem N-terminalen Glutaminrest an Stelle von Glutamat in dem natürlichen Vorläufer beginnt, wurde eine spontane Umwandlung oder eine enzymatische Umwandlung durch Glutaminyl-Cyclase zu Pyroglutamat vorgeschlagen. Der Cyclisierungsmechanismus des N-terminalen Glutamats bei Position 3 in dem natürlichen Vorläufer von [pGlu3]Aβ wurde in vivo nicht bestimmt (Shirotani, K., Tsubuki, S., Lee, H. J., Maruyama, K., und Saido, T. C. (2002) Neurosci Lett 327, 25-28).
  • Dipeptidylpeptidase IV (DP IV) ist eine post-Prolin (zu einem geringeren Umfang eine post-Alanin, post-Serin oder post-Glycin) spaltende Serinprotease, die in verschiedenen Geweben des Körpers gefunden wird, einschließlich Niere, Leber und Darm, und N-terminale Dipeptide aus einer Peptidkette spaltet. Vor kurzem wurde gezeigt, dass DP IV eine wichtige Rolle im Neuropeptid Stoffwechsel, bei der T-Zellaktivierung, der Bindung von Krebszellen an das Endothel und der Aufnahme von HIV in Lymphzellen spielt. Siehe hierzu WO 02/34242 , WO 02/34243 , WO 03/002595 und WO 03/002596 .
  • Es ist bekannt, dass DP IV-Inhibitoren für die Behandlung der pathologischen Glucosetoleranz und von Diabetes mellitus nützlich sein können (Internationale Patentanmeldung, Publikationsnummer WO 99/61431 , Pederson, R. A. et al. 1998 Diabetes 47, 1253-1258 und Pauly, R. P. et al. 1999 Metabolism 48, 385-389). Insbesondere offenbart WO 99/61431 DP IV-Inhibitoren, umfassend einen Aminosäurerest und eine Thiazolidin- oder Pyrrolidingruppe und Salze derselben, insbesondere L-threo-Isoleucyl Thiazolidin, L-allo-Isoleucyl Thiazolidin, L-threo-Isoleucyl Pyrrolidin, L-allo-Isoleucyl Thiazolidin, L-allo-Isoleucyl Pyrrolidin, und Salze derselben.
  • Weitere Beispiele für niedermolekulare Dipeptidylpeptidase IV-Inhibitoren sind Mittel, wie z. B. Tetrahydroisoquinolin-3-carboxamid-Derivate, N-substituierte 2-Cyanopyrrole und -pyrrolidine, N-(N'-substituierte Glycyl)-2-cyanopyrrolidine, N-(substituierte Glycyl)-Thiazolidine, N-(substituierte Glycyl)-4-cyanothiazolidine, Aminoacyl-borono-prolyl-Inhibitoren, Cyclopropyl-fusionierte Pyrrolidine und heterocyclische Verbindungen. Inhibitoren der Dipeptidylpeptidase IV sind beschrieben in US 6,380,398 ; US 6,011,155 ; US 6,107,317 ; US 6,110,949 ; US 6,124,305 ; US 6,172,081 ; WO 95/15309 ; WO 99/61431 , WO 99/67278 , WO 99/67279 , DE 198 34 591 , WO 97/40832 , DE 196 16 486 C2 , WO 98/19998 , WO 00/07617 , WO 99/38501 , WO 99/46272 , WO 99/38501 , WO 01/68603 , WO 01/40180 , WO 01/81337 , WO 01/81304 , WO 01/55105 , WO 02/02560 und WO 02/14271 , WO 02/04610 , WO 02/051836 , WO 02/068420 , WO 02/076450 , WO 02/083128 , WO 02/38541 , WO 03/000180 , WO 03/000181 , WO 03/000250 , WO 03/002530 , WO 03/002531 , WO 03/002553 , WO 03/002593 , WO 03/004496 , WO 03/024942 und WO 03/024965 , deren Lehren hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind, insbesondere im Hinblick auf diese Inhibitoren, ihre Definition, Verwendungen und ihre Herstellung.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue physiologische Substrate der QC in Säugetieren, Aβ3-40/42, [Gln3]Aβ3-40/42, [Glu11]Aβ11-40/42, [Gln11]Aβ11-40/42, [Gln1]Gastrin, [Gln1]Neurotensin, [Gln1]FPP, [Gln1]CCL2, [Gln1]CCL7, [Gln1]CCL8, [Gln1]CCL16, [Gln1]CCL18, [Gln1]Fractalkin, [Gln1]Orexin A, [Gln3]glucagon3-29 und [Gln5]Substanz P5-11 und die Verwendung von Effektoren der QC und pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend Effektoren der QC, für die Behandlung von Zuständen, die durch die Modulation der QC Aktivität behandelt werden können.
  • In Inhibitionsuntersuchungen wurde gezeigt, dass humane QC eine Metall-abhängige Transferase ist. QC Apoenzym ließ sich am wirksamsten durch Zinkionen reaktivieren, und das Metall-bindende Motiv der Zink-abhängigen Aminopeptidasen ist auch in humaner QC vorhanden. Verbindungen, die mit dem im aktiven Zentrum gebundenen Metall interagieren sind hochwirksame Inhibitoren.
  • Unerwartet wurde gezeigt, dass rekombinante humane QC sowie QC Aktivität aus Hirnextrakten sowohl die N-terminale Glutaminyl- als auch Glutamat-Cyclisierung katalysieren. Am auffallendsten ist die Feststellung, dass die Cyclase-katalysierte Glu1-Umlagerung bei etwa pH 6,0 begünstigt ist, während die Gln1-Umlagerung zu pGlu-Derivaten bei einem pH-Optimum von etwa 8,0 erfolgt. Da die Bildung von pGlu-Aβ-verwandten Peptiden durch Hemmung der rekombinanten humanen QC und QC Aktivitäten aus Extrakten von Schweinehypophyse unterdrückt werden kamen, ist das Enzym QC ein Ziel in der Medikamentenentwicklung zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit.
  • Durch die Gabe von Effektoren der QC-Aktivität an ein Säugetier kann es möglich sein, Zustände zu verhindern oder zu lindern, die ausgewählt sind aus: Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom, Magengeschwüren und Magenkrebs mit oder ohne Helicobacter pylori Infektionen, pathogene psychotische Zustände, Schizophrenie, Unfruchtbarkeit, Neoplasie, inflammatorische Reaktionen des Wirts, Krebs, Schuppenflechte, rheumatoide Arthritis, Arteriosklerose, beeinträchtigte humorale und Zell-vermittelte Immunantworten, Leukozyten-Adhäsion- und Migrationsprozesse im Endothel, eingeschränkte Nahrungsaufnahme, Schlaf-Wachsamkeit, beeinträchtigte homöostatische Regulation des Energiestoffwechsels, beeinträchtigte autonome Funktion, beeinträchtigte hormonale Balance und beeinträchtigte Regulierung der Körperflüssigkeiten.
  • Ferner kann es durch die Gabe von Effektoren der QC-Aktivität an ein Säugetier möglich sein, die Zellproliferation des Magen-Darm Traktes anzuregen, vorzugsweise die Proliferation von Zellen der Magenschleimhaut, Epithelzellen, die akute Säuresekretion und die Differenzierung der Säure produzierenden Belegzellen und Histamin-sekretierende enterochromaffine Zellen.
  • Weiterhin kann es durch die Verabreichung von Effektoren der QC-Aktivität an ein Säugetier möglich sein, die Proliferation von myeloischen Vorläuferzellen zu unterdrücken.
  • Darüber hinaus kann die Verabreichung von QC Inhibitoren zur Unterdrückung der männlichen Fruchtbarkeit führen:
    In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Effektoren der QC-Aktivität in Kombination mit Inhibitoren der DP IV oder DP IV-ähnlichen Enzymen für die Behandlung oder Linderung von Zuständen bereit, die durch die Modulation der QC und/oder DP IV Aktivität behandelt werden können.
  • Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen für die parenterale, enterale oder orale Verabreichung bereit, umfassend mindestens einen Effektor der QC, optional in Kombination mit üblichen Träger- und/oder Hilfsstoffen; oder umfassend mindestens einen Effektor der QC in Kombination mit mindestens einem DP IV-Inhibitor, optional in Kombination mit üblichen Träger- und/oder Hilfsstoffen.
  • Screening-Verfahren für die Ermittlung und Auswahl von Effektoren der QC werden auch bereit gestellt.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Weitere Erkenntnisse über diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Einbeziehung der Figuren erhalten, wobei:
  • 1 zeigt die Verlaufskurven der Cyclisierung von H-Gln-Ala-OH, katalysiert durch humane QC, wobei die Abnahme der Absorption bei 340 nm beobachtet wird. Die Proben enthielten 0,3 mM NADH/H+, 14 mM α-Ketoglutarsäure, 30 U/ml Glutamat-Dehydrogenase und 1 mM H-Gln-Ala-OH. Von Kurve A–D wurden unterschiedliche Konzentrationen von QC eingesetzt: A, 10 mU/ml, B, 5 mU/ml, C, 2,5 mU/ml. Bei der Kurve D wurde QC weggelassen. Eine lineare Beziehung zwischen der QC Konzentration und der beobachteten Aktivität wurde erhalten (eingefügter Graph).
  • 2 zeigt die pH-Abhängigkeit von humaner und Papaya (eingefügter Graph) QC, bestimmt unter Geschwindigkeitsbedingungen 1. Ordnung unter Verwendung von Gln-βNA als Substrat. Im Falle der humanen QC wurde ein Puffersystem verwendet, dass eine konstante Ionenstärke gemäß Ellis und Morrison bereit stellt, bestehend aus 25 mM MES, 25 mM Essigsäure und 50 mM Tris (Ellis, K. J. und Morrison, J. F. 1982 Methods Enzymol. 87, 405-426). Aufgrund einer leicht hemmenden Wirkung von Tris, wurde Papaya QC unter Verwendung von einem 50 mM MOPS Puffer untersucht. Die Ionenstärke wurde durch Zugabe von NaCl auf 0,05 M eingestellt. Die Geschwindigkeitsprofile wurden ausgewertet, indem sie an ein Modell angepasst wurden, das auf Abgangsgruppen basiert. Im Falle von Papaya QC wurde ein PKa von 7,13 ± 0,03 durch Anpassung der Daten an ein einzelnes Dissoziationsmodell erhalten.
  • 3 zeigt die Wirkung des pH-Wertes auf die Stabilität der QC aus Papaya Latex und humaner QC. Eine Enzymstammlösung wurde 20-fach verdünnt in 0,1 M Puffer verschiedener pH-Werte (pH 4–7 Natriumcitrat, pH 7–10 Natriumphosphat). Enzym-Lösungen wurden bei 30°C für 30 min inkubiert und anschließend wurde die enzymatische Aktivität gemäß dem Standard-Protokoll analysiert.
  • 4 zeigt den Vergleich der Spezifitätskonstanten kcat/KM für eine Reihe von Substraten, die Glutamat an der zweiten Aminosäureposition enthalten. Während eine Erhöhung der Spezifität bei der humanen QC von den Di- zu den Tetrapeptiden detektiert wurde, wurde im Falle der Papaya QC keine Veränderung beobachtet. Die hier präsentierten Daten sind eine Wiederholung der graphischen Darstellung der in Tabelle 3 angegebenen Parameter.
  • 5 zeigt die Bildung von pGlu-Lys (pGlu)-Arg-Ala-Leu-NH2 aus H-Gln-Lys (Gln)-Arg-Ala-Leu-NH2, katalysiert durch die humane QC. Die Substratumwandlung wird beobachtet durch die zeitabhängige Änderung des m/z-Verhältnisses aufgrund des Austretens von Ammoniak. Die Zusammensetzung der Probe war: 0,5 mM Substrat, 38 nM QC in 40 mM Tris/HCl, pH 7,7. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit der Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektren aufgenommen. Eine sehr ähnliche Abhängigkeit wurde im Falle der Papaya QC beobachtet.
  • 6 zeigt die Bildung von pGlu-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2 aus H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2, katalysiert durch Papaya QC. Die Substratumwandlung wird beobachtet durch die zeitabhängige Änderung des m/z-Verhältnisses aufgrund des Austretens von Methylamin. Die Zusammensetzung der Probe war: 0,5 mM Substrat, 0,65 μM Papaya QC in 40 mM Tris/HCl, pH 7,7. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit der Matrix-Losung (1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektren aufgenommen. Keine Substratumwandlung wurde in Proben ohne Papaya QC oder bei Anwendung von bis zu 1,5 μM humaner QC auf das Substrat beobachtet (nicht gezeigt).
  • 7 zeigt die Bildung von [Gln3]-Aβ3-11 aus [Gln3]Aβ1-11, katalysiert durch DP IV. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektren aufgenommen.
  • 8 zeigt die Verhinderung der Spaltung von [Gln3]Aβ1-11 durch den DP IV-Inhibitor Val-Pyrrolidid (Val-Pyrr). Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektren aufgenommen.
  • 9 zeigt die Bildung von [pGlu3]Aβ3-11 aus [Gln3]Aβ3-11, katalysiert durch QC. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektren aufgenommen.
  • 10 zeigt die Hemmung der Bildung von [pGlu3]Aβ3-11 aus [Gln3]Aβ3-11 durch den QC-Inhibitor 1,10-Phenanthrolin. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektren aufgenommen.
  • 11 zeigt die Bildung von [pGlu3]Aβ3-11 aus [Gln3]Aβ1-11 nach aufeinander folgender Katalyse durch DP IV und QC. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektren aufgenommen.
  • 12 zeigt die Hemmung der Bildung von [pGlu3]Aβ3-11 aus [Gln3]Aβ1-11 durch den QC-Inhibitor 1,10-Phenanthrolin in Gegenwart von katalytisch aktiver DP IV und QC. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektren aufgenommen.
  • 13 zeigt die Reduktion der Bildung von [pGlu3]Aβ3-11 aus [Gln3]Aβ1-11 durch den DP IV-Inhibitor Val-Pyrr in Gegenwart von katalytisch aktiver DP IV und QC. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus der Assay-Mischung entnommen, mit Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektren aufgenommen.
  • 14 zeigt die Bildung von Peptid [pGlu3]Aβ-3-11 aus [Gln3]Aβ1-11 nach aufeinander folgender Katalyse durch Aminopeptidase(n) und QC, die in Schweine-Hypophysen-Homogenat vorhanden sind. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektren aufgenommen.
  • 15A und B zeigen Massenspektren von Aβ3-11a und Aβ3-21a, inkubiert mit rekombinanter humaner QC, die vor ihrer Verwendung für 10 Minuten gekocht wurde. C und D zeigen Massenspektren von Aβ3-11 und Aβ3-21a in Gegenwart von aktiver humaner QC, was zur Bildung von [pGlu3]Aβ3-11a bzw. [pGlu3]Aβ3-21a führte. E und F zeigen Massenspektren von Aβ3-11a und Aβ3-21a in Gegenwart von aktiver QC und 5 mM Benzimidazol, das die Bildung von [pGlu3] unterdrückt.
  • 16 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeiten der von Papaya QC-katalysierten Glu-βNA-Umwandlung, aufgetragen gegen die Substratkonzentration. Die Anfangsgeschwindigkeiten wurden gemessen in 0,1 M Pyrophosphatpuffer, pH 6,1 (Quadrate), 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5 (Kreise) und 0,1 M Boratpuffer, pH 8,5 (Dreiecke). Die kinetischen Parameter lauten wie folgt: KM = 1,13 ± 0,07 mM, kcat = 1,13 ± 0,04 min–1 (pH 6,1); KM = 1,45 ± 0,03 mM, kcat = 0,92 ± 0,01 mm–1 (pH 7,5); KM = 1,76 ± 0,06 mM, kcat = 0,56 ± 0,01 min–1 (pH 8,5).
  • 17 zeigt die pH-Abhängigkeit der Umwandlung von Gln-βNA (Kreise) und Glu-βNA (Quadrate), bestimmt unter Geschwindigkeitsbedingungen 1. Ordnung (S << KM). Die Substratkonzentration war 0,01 mM bzw. 0.25 mM. Für beide Bestimmungen wurde ein Puffersystem aus drei Komponenten eingesetzt, bestehend aus 0,05 M Essigsäure, 0,05 M Pyrophosphorsäure und 0,05 M Tricin. Alle Puffer wurden durch Zugabe von NaCl auf gleiche Leitfähigkeit eingestellt, um Unterschiede in der Ionenstärke zu vermeiden. Die Daten wurden an Gleichungen angepasst, die für zwei Abgangsgruppen gelten und ergaben pKa-Werte von 6,91 ± 0,02 und 9,5 ± 0,1 für Gln-βNA und 4,6 ± 0,1 und 7,55 ± 0,02 für Glu-βNA. Die pKa-Werte der jeweiligen Substrat-Aminogruppen, bestimmt durch Titration, betrugen 6,97 ± 0,01 (Gln-βNA) und 7,57 ± 0,05 (Glu-βNA). Alle Bestimmungen wurden bei 30°C durchgeführt.
  • 18 zeigt die Verlaufskurven der durch humane QC-katalysierten Cyclisierung von H-Gln-AMC in Gegenwart von Imidazol, Dipicolinsäure und in Abwesenheit einer hemmenden Verbindung. Die hyperbolische Form der Kurve in Gegenwart von Dipicolinsäure weist auf die Entfernung von Metallionen aus dem aktiven Zentrum von QC hin.
  • 19 zeigt die zeitabhängige Inaktivierung von QC durch den heterocyclischen Chelatbildner 1,10-Phenanthrolin. Nach der Inkubation des QC-Enzyms mit dem Inhibitor in Abwesenheit von Substrat (durchgezogene Linie), wurde eine Verringerung der enzymatischen Aktivität im Vergleich zu Proben beobachtet, die nicht mit Inhibitor vorinkubiert wurden (gestrichelte Linie), was auf die Entfernung von Metallionen aus dem aktiven Zentrum der QC hinweist.
  • 20 zeigt die Reaktivierung von humaner QC mit einwertigen und zweiwertigen Metallionen. QC wurde durch Zugabe von 2 mM Dipicolinsäure in 50 mM Bis-Tris, pH 6,8 inaktiviert. Anschließend wurde das Enzym einer Dialyse gegen 50 mM Bis-Tris, pH 6,8, enthaltend 1,0 mM EDTA, unterzogen. Reaktivierung der Enzyme wurde durch Inkubation der inaktivierten Enzymprobe mit Metallionen bei einer Konzentration von 0,5 mM erreicht, in Gegenwart von 0,5 mM EDTA, um eine unspezifische Reaktivierung durch in Spuren in den Pufferlösungen vorhandene Metallionen zu vermeiden. Kontrollen werden durch Enzymproben erhalten, die nicht inaktiviert wurden, aber auch gegen EDTA-Lösung dialysiert wurden, wie das inaktivierte Enzym (+EDTA) und Enzymproben, die gegen Pufferlösungen ohne zugesetztes EDTA (–EDTA) dialysiert wurden.
  • 21 Sequenzanordnung (sequence alignment) der humanen QC (hQC) und anderer M28 Familienmitglieder der Metallopeptidase Clan MH. Die Anordnung mehrer Seuqenzen (multiple sequence alignment) erfolgte mit ClustalW bei ch.EMBnet.org mit Standardeinstellungen. Die Konservierung der das Zink-Ion bindenden Reste ist gezeigt für humane QC (hQC; GenBank X71125), der Zn-abhängigen Aminopeptidase aus Streptomyces griseus (SGAP; Swiss-Prot P80561), und innerhalb der N-acetylierten-alpha-verbundenen sauren Dipeptidase (NAALADase 1) Domäne (Reste 274–587) der humanen Glutamat-Carboxypeptidase II (hGCP II, Swiss-Prot Q04609). Die an der Metallbindung beteiligten Aminosäuren sind fett gedruckt und unterstrichen. Im Falle der humanen QC sind diese Reste die mutmaßlichen Entsprechungen zu den Peptidasen.
  • Peptid-Sequenzen
  • Die hierin erwähnten und verwendeten Peptide haben die folgenden Sequenzen:
    Figure 00110001
    Figure 00120001
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Effektoren der Glutaminyl-Cyclase (QC) bereit für
    • a) die Behandlung von Krankheiten bei Säugetieren, die durch die Modulation der QC Aktivität in vivo behandelt werden können und/oder
    • b) die Modulation von physiologischen Prozessen auf der Grundlage der Wirkung von pGlu-enthaltenden Peptiden, verursacht durch Modulation der QC Aktivität.
  • Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen zur Hemmung der Glutaminyl-Cyclase (QC, EC 2.3.2.5) und/oder QC-ähnlicher Enzyme in einem Säugetier bereit und die Verwendung von Inhibitoren der QC Aktivität für die Behandlung von pathologischen Zuständen, die mit QC Aktivität im Zusammenhang stehen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein neues Verfahren zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit und des Down-Syndroms bereit. Die N-Termini von Amyloid-beta Peptiden, die bei der Alzheimer-Krankheit und bei Down-Syndrom im Gehirn abgelagert sind, tragen Pyroglutaminsäure. Die Bildung von pGlu ist ein wichtiges Ereignis in der Entwicklung und der Progression der Krankheit, da die modifizierten amyloiden β-Peptide eine erhöhte Neigung zur Aggregation von Amyloid-beta und Toxizität zeigen, was wahrscheinlich den Ausbruch und die Progression der Krankheit verschlechtert. (Russo, C. et al. 2002 J Neurochem 82, 1480-1489).
  • Im Gegensatz dazu ist in den natürlichen Aβ Peptiden (3-40/42) Glutaminsäure als N-terminale Aminosäure vorhanden. Bisher ist keine enzymatische Umwandlung von Glu zu pGlu bekannt. Darüber hinaus ist bisher noch keine spontane Cyclisierung von Glu-Peptiden zu pGlu-Peptiden beobachtet worden. Daher war ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, die Rolle von QC bei der Alzheimer-Krankheit und Down-Syndrom zu bestimmen. Mit diesem Aspekt wurde sich befasst durch die Synthese von Aβ3-11 und Aβ1-11, die die Aminosäure Glutamin an Stelle von Glutaminsäure an Position 3 enthalten, die Bestimmung der Substrateigenschaften dieser modifizierten Amyloid-beta Peptide gegenüber QC, DP IV und DP IV-ähnlichen Enzymen und Aminopeptidasen und die Verwendung von Inhibitoren der QC, um die Bildung von pGlu aus einem N-terminalen Glutaminylrest der Amyloid-beta abgeleiteten Peptide (amyloid β-derived peptides) 1-11 und 3-11 zu verhindern. Die Ergebnisse sind in Beispiel 8 gezeigt. Das verwendete Verfahren wird in Beispiel 3 beschrieben.
  • Bis heute gibt es keine Hinweise, die eine Beteiligung der QC bei der Progression der Krankheit anzeigen, weil Glutaminsäure die N-terminale Aminosäure in Aβ (3-40/42 oder 11-40/42) ist. Aber QC ist das einzige bekannte Enzym, das fähig ist, pGlu am N-Terminus von Peptiden zu bilden. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen die folgenden Erkenntnisse und Entdeckungen:
    • a) In einer Nebenreaktion katalysiert QC die Cyclisierung von Glutaminsäure zu Pyroglutaminsäure mit sehr niedriger Geschwindigkeit,
    • b) Glutaminsäure aus APP oder dessen anschließend gebildeten Amyloid-beta Peptiden wird post-translational durch eine unbekannte enzymatische Aktivität in Glutamin umgewandelt und in einem zweiten Schritt katalysiert QC die Cyclisierung von Glutamin zu Pyroglutaminsäure nach der Prozessierung des N-Terminus des Amyloid-beta Peptids,
    • c) Glutaminsäure wird post-translational durch eine chemische Katalyse oder Autokatalyse in Glutamin umgewandelt und anschließend katalysiert QC die Cyclisierung von Glutamin zu Pyroglutaminsäure nach der Prozessierung des N-Terminus des Amyloid-beta Peptids,
    • d) im APP-Gen, das für das Amyloid-beta Protein codiert, gibt es Mutationen, die zu Gln statt Glu an Position 3 führen. Nach der Translation und Prozessierung des N-Terminus katalysiert QC die Cyclisierung von Glutamin zu Pyroglutaminsäure,
    • e) Glutamin wird in die entstehende Peptidkette von APP eingearbeitet, aufgrund einer Fehlfunktion einer unbekannten enzymatischen Aktivität und anschließend katalysiert QC die Cyclisierung des N-terminalen Glutamins zu Pyroglutaminsäure nach der Prozessierung des N-Terminus des Amyloid-beta Peptids.
  • QC ist in allen fünf oben aufgeführten Fällen am kritischen Schritt beteiligt, nämlich der Bildung von Pyroglutaminsäure, die die Aggregation von Amyloid-beta Peptiden begünstigt. So führt eine Hemmung der QC zu einer Verhinderung der Präzipitation der Plaquebildner Aβ3-40/41/43 oder Aβ11-40/41/43, die den Ausbruch und die Progression der Alzheimer-Krankheit und des Down-Syndroms verursachen, unabhängig vom Mechanismus durch den Cyclisierung erfolgt.
  • Glutamat wird an den Positionen 3, 11 und 22 des Amyloid-beta Peptids gefunden. Unter diesen ist die Mutation von Glutaminsäure (E) zu Glutamin (Q) an Position 22 (entsprechend zu dem Amyloid-Vorläuferprotein APP 693, Swissprot P05067) als so genannte Mutation der niederländischen Art der zerebralen Hämorrhagie mit Amyloidose (Dutch type cerebroarterial amyloidosis mutation) beschrieben worden.
  • Dier Amyloid-beta Peptide mit einem Pyroglutaminsäurerest an Position 3, 11 und/oder 22 sind als zytotoxischer und hydrophober als Aβ1-40/42/43 beschrieben worden (Saido T. C. 2000 Medical Hypotheses 54(3): 427-429).
  • Die vielfachen N-terminalen Variationen können an verschiedenen Stellen durch das β-Sekretase-Enzym β-Stellen-Amyloid-Vorläuferprotein-spaltendes Enzym (β-site amyloid precursor proteincleaving enzyme; BACE) erzeugt werden (Huse J. T. et al. 2002 J. Biol. Chem. 277 (18): 16278-16284), und/oder durch Prozessierung durch Aminopeptidase. In allen Fällen kann die Cyclisierung nach a)–e) erfolgen, wie oben beschrieben.
  • Bisher gab es keinen experimentellen Nachweis, der die enzymatische Umwandlung von Glu1-Peptiden zu pGlu-Peptiden durch eine unbekannte Glutamyl-Cyclase (EC) entsprechend Weg a) gestützt hat (Garden, R. W., Moroz, T. P., Gleeson, J. M., Floyd, P. D., Li, L. J., Rubakhin, S. S. und Sweedler, J. V. (1999) J Neurochem 72, 676-681; Hosoda R. et al. (1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57, 1089-1095). Bis heute wurde keine derartige Enzymaktivität identifiziert, die fähig ist, Glu1-Peptide, die N-terminal protoniert sind und eine negativ geladene Glu1 γ-Carboxylateinheit besitzen, unter schwach alkalischen pH-Bedingungen zu cyclisieren.
  • QC Aktivität gegenüber Gln1-Substraten ist unterhalb pH 7 dramatisch verringert. Im Gegensatz dazu scheint es, dass eine Glu1-Umwandlung bei sauren Reaktionsbedingungen erfolgen kann (Iwatsubo, T., Saido, T. C., Mann, D. M., Lee, V. M. und Trojanowski, J. Q. (1996) Am J Pathol 149, 1823-1830; Russo, C., Saido, T. C., DeBusk, L. M., Tabaton, M., Gambetti, P. und Teller, J. K. (1977) FEBS Lett 409, 411-416; Russo, C., Salis, S., Dolcini, V., Venezia, V., Song, X. H., Teller, J. K. und Schettini, G. (2001) Neurobiol Dis 8, 173-180; Tekirian, T. L., Saido, T. C., Markesbery, W. R., Russell, M. J., Wekstein, D. R., Patel, E. und Geddes, J. W. (1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57, 76-94; Russo, C., Violani, E., Salis, S., Venezia, V., Dolcini, V., Damonte, G., Benatti, U., DArrigo, C., Patrone, E., Carlo, P. und Schettini, G. (2002) J Neurochem 82, 1480-1489; Hosoda, R., Saido, T. C., Otvos, L., Jr., Arai, T., Mann, D. M., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. und Iwatsubo, T. (1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57, 1089-1095; Garden, R. W., Moroz, T. P., Gleeson, J. M., Floyd, P. D., Li, L. J., Rubakhin, S. S. und Sweedler, J. V. (1999) J Neurochem 72, 676-681).
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde untersucht, ob QC fähig ist, Amyloid-beta abgeleitete Peptide zu erkennen und unter leicht sauren Bedingungen umzuwandeln. Daher wurden die Peptide [Gln3]Aβ1-11a, Aβ3-11a, [Gln3]Aβ3-11a, Aβ3-21a, [Gln3]Aβ3-21a und [Gln3]Aβ3-40 als potentielle Substrate des Enzyms synthetisiert und untersucht. Diese Sequenzen wurden ausgewählt, um natürliche N-terminal und C-terminal trunkierte [Glu3]Aβ Peptide und [Gln3]Aβ Peptide nachzuahmen, die durch post-translationale Glu-Amidierung auftreten könnten.
  • In der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass Papaya und humane QC sowohl Glutaminyl- als auch Glutamyl-Cyclisierung katalysieren. Offenbar ist die primäre physiologische Funktion der QC, die Hormonreifung in endokrinen Zellen durch Glutamin-Cyclisierung vor oder während des Hormon-Sekretionsprozesses abzuschließen. Es ist bekannt, dass solche sekretorischen Vesikel einen sauren pH aufweisen. So könnte eine Nebenaktivität des Enzyms in dem engen pH-Bereich von 5,0 bis 7,0 seine neu entdeckte Glutamyl-Cyclaseaktivität sein, die auch Glu-Aβ Peptide umwandelt. Aufgrund der wesentlich langsamer erfolgenden Glu-Cyclisierung im Vergleich zur Gln-Umwandlung, ist es jedoch fraglich, ob die Glutamyl-Cyclisierung eine wesentliche physiologische Rolle spielt. In der Pathologie von neurodegenerativen Erkrankungen ist die Glutamyl-Cyclisierung jedoch von Bedeutung.
  • Bei der Untersuchung der pH-Abhängigkeit dieser enzymatischen Reaktion fanden wir, dass der unprotonierte N-Terminus für die Cyclisierung der Gln1-Peptide essentiell war und dementsprechend, dass der PKa-Wert des Substrats identisch zu dem pKa-Wert für die QC-Katalyse war (siehe 17). Somit stabilisiert QC den intramolekularen nucleophilen Angriff der unprotonierten α-Aminoeinheit auf den γ-Carbonyl-Kohlenstoff, elektrophil aktiviert durch Amidierung (Schema 1).
  • Im Gegensatz zu der einwertigen Ladung, vorhanden in Peptiden, die N-terminal Glutamin enthalten, ist der N-terminale Glu-Rest in Peptiden, die Glu enthalten, überwiegend zweiwertig geladen bei etwa neutralem pH. Glutamat zeigt pKa-Werte von etwa 4,2 und 7,5 für die γ-Carboxyl- bzw. die α-Aminoeinheit. D. h. bei neutralem pH und oberhalb ist die γ-Carboxylgruppe unprotoniert, obwohl der α-Amino-Stickstoff zum Teil oder vollständig unprotoniert und nucleophil ist, und so keine elektrophile Carbonyl Aktivität ausübt. Daher ist intramolekulare Cyclisierung unmöglich.
  • In dem pH-Bereich von etwa 5,2–6,5, zwischen ihren jeweiligen pKa-Werten, sind die zwei funktionellen Gruppen beide in nicht-ionisierter Form vorhanden, in Konzentrationen von etwa 1–10% (-NH2) oder 10–1% (-COOH) des gesamten N-terminal Glu-enthaltenden Peptids. Folglich sind über einen leicht sauren pH-Bereich Spezies von N-terminalen Glu-Peptiden vorhanden, die beide Gruppen ungeladen tragen und, deshalb, ist es möglich, dass QC das Zwischenprodukt der intramolekularen Cyclisierung zu pGlu-Peptid stabilisieren könnte. D. h., wenn die γ-Carboxylgruppe protoniert ist, ist der Carbonyl-Kohlenstoff elektrophil genug, um einen nucleophilen Angriff durch die unprotonierte α-Aminogruppe zu ermöglichen. Bei diesem pH fungiert das Hydroxylion als Abgangsgruppe (Schema 3). Diese Annahmen werden erhärtet durch die Daten der pH-Abhängigkeit, erhalten für die QC-katalysierte Umwandlung von Glu-βNA (siehe Beispiel 11). Im Gegensatz zur Glutamin-Umwandlung von Gln-βNA durch QC, verschiebt sich das pH-Optimum der Katalyse in den sauren Bereich um pH 6,0, d. h. der pH-Bereich, in welchem Substratmolekül-Spezies vorhanden sind, die gleichzeitig eine protonierte γ-Carboxyl- und eine unprotonierte α-Aminogruppe tragen. Darüber hinaus stimmt der kinetisch bestimmte pKa-Wert von 7,55 ± 0,02 hervorragend mit dem der α-Aminogruppe von Glu-βNA überein, bestimmt durch Titration (7,57 ± 0,05).
  • Physiologisch könnte bei pH 6,0 die Geschwindigkeitskonstante 2. Ordnung (oder Spezifitätskonstante, kcat/KM) der QC-katalysierten Glutamat-Cyclisierung könnte in dem Bereich von 8000-fach langsamer als die für die Glutamin-Cyclisierung sein (17). Die nicht-enzymatische Umsetzung der beiden Modellsubstrate Glu-βNA und Gln-βNA ist jedoch vernachlässigbar, was im Einklang mit der beobachteten vernachlässigbaren Bildung von pGlu-Peptid in der vorliegenden Erfindung ist. Daher kann für die pGlu-Bildung durch QC eine Steigerung von mindestens 108 aus dem Verhältnis der enzymatischen gegenüber der nicht-enzymatischen Geschwindigkeitskonstanten geschätzt werden (beim Vergleich der Geschwindigkeitskonstanten 2. Ordnung für die Enzymkatalyse mit der jeweiligen Geschwindigkeitskonstanten 1. Ordnung für die nicht-enzymatische Cyclisierung ist der katalytische Leistungsfaktor 109–1010 M–1 für die Gln- bzw. die Glu-Umwandlung). Die Schlussfolgerung aus diesen Daten ist, dass in vivo nur ein enzymatischer Weg denkbar scheint, der zu pGlu-Bildungen führt.
  • Da QC im Gehirn reichlich vorhanden ist und unter Berücksichtigung der hohen Umsetzungsrate von 0,9 min–1, die vor kurzem für die Reifung von 30 μM (Gln-)TRH-ähnlichem Peptid ((Gln-)TRH-like Peptide) gefunden wurde (Prokai, L., Prokai-Tatrai, K., Ouyang, X., Kim, H. S., Wu, W. M., Zharikova, A. und Bodor, N. (1999) J Med Chem 42, 4563-4571), kann man eine Halbwertszeit für die Cyclisierung von etwa 100 Stunden für ein geeignetes Glutamat-Substrat vorhersagen, sofern ähnlich Reaktionsbedingungen zur Verfügung gestellt werden. Angesichts der Kompartmentierung und Lokalisation der Gehirn-QC/EC im sekretorischen Stoffwechselweg, könnten die tatsächlichen in vivo Enzym- und Substrat-Konzentrationen und die Reaktionsbedingungen noch günstiger für die enzymatische Cyclisierung in der intakten Zelle sein. Und eine viel schnellere pGlu-Bildung, vermittelt durch QC, könnte erwartet werden, wenn N-terminales Glu zu Gln umgewandelt wird. In vitro wurden beide Reaktionen durch die Anwendung von Inhibitoren der QC/EC-Aktivität unterdfrückt (9, 10 und 15).
  • Zusammenfassend zeigt die vorliegende Erfindung, dass humane QC, die im Gehirn reichlich vorhanden ist, wahrscheinlich ein Katalysator für die Bildung der amyloiden pGlu-Aβ Peptide aus Glu-Aβ und Gln-Aβ Vorläufern ist, die mehr als 50% der Plaque-Ablagerungen, die bei Alzheimer-Krankheit gefunden werden, ausmachen. Diese Ergebnisse identifizieren QC/EC als Akteur bei der Bildung seniler Plaques und damit als ein neues Ziel für Medikamente zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit.
  • Bei einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass Amyloid-beta abgeleitete Peptide ein Substrat von Dipeptidylpeptidase IV (DP IV) oder DP IV-ähnlichen Enzymen sind, vorzugsweise Dipeptidylpeptidase II (DP II). DP IV, DP II oder andere DP IV-ähnliche Enzyme setzen ein Dipeptid aus dem N-Terminus des modifizierten Amyloid-beta Peptids (1-11) frei, wobei Amyloid-beta Peptid (3-11) mit Glutamin als N-terminalem Aminosäurerest generiert wird. Die Ergebnisse sind in Beispiel 8 gezeigt.
  • Vor der Spaltung durch DP II, DP IV oder anderen DP IV-ähnlichen Enzymen, kann die Peptidbindung zwischen Asparaginsäure (Rest 1 von Amyloid-beta Peptid) und Alanin (Rest 2 von Amyloid-beta Peptid) isomerisiert werden, wodurch ein Isoaspartylrest erhalten wird, wie in der Literatur beschrieben (Kuo, Y.-M., Emmerling, M. R., Woods, A. S., Cotter, R. J., Roher, A. E. (1997) BBRC 237, 188-191; Shimizu, T., Watanabe, A., Ogawara, M., Mori, H. und Shirasawa, T. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 381, 225-234).
  • Diese Isoaspartylreste machen die Amyloid-beta Peptide resistent gegen Aminopeptidase-Abbau und folglich enthalten die Kern-Plaques hohe Mengen an isoAsp1-Amyloid-beta Peptiden, was einen verringerten Umsatz am N-Terminus suggeriert.
  • Jedoch wird in der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal gezeigt, dass das N-terminale Dipeptid H-isoAsp1-Ala2-OH durch Dipeptidylpeptidasen freigesetzt werden kann, insbesondere unter sauren Bedingungen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Isomerisierung auch einer Spaltung durch β-Sekretase voraus gehen kann, und dass Isomerisierung die proteolytische Prozessierung beschleunigen kann, und damit zu einer Lösung einer N-terminalen Isoaspartyl-Bindung aus isoAsp1-Amyloid-beta Peptiden, die anschließend einer Umsetzung durch DP II, DP IV oder DP IV-ähnlichen Enzymen unterzogen wird (Mornand, J. und Clarke, S. (1987) Biochemistry 26, 7798-7805; Kuo, Y.-M., Emmerling, M. R., Woods, A. S., Cotter, R. J., Roher, A. E. (1997) BBRC 237, 188-191). Dementsprechend kann die Hemmung der Bildung von Isoaspartyl zur Verringerung der Spaltung durch β-Sekretase führen und, dies wiederum, zu einer verminderten Bildung von Amyloid-beta Peptiden. Darüber hinaus würde die Blockade der Umsetzung von isoAsp1-Amyloid-beta Peptid durch Hemmung der DP II, DP IV oder DP IV-ähnlichen Enzymen die Exposition von [Glu3]Aβ gegenüber der QC/EC-katalysierten Bildung von [pGlu3]Aβ verhindern.
  • In einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kam eine Kombination aus Inhibitoren der DP IV Aktivität und Inhibitoren der QC für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit und von Down-Syndrom eingesetzt werden.
  • Die kombinierte Wirkung von DP IV und/oder DP IV-ähnlichen Enzyme und von QC wird wie folgt veranschaulicht:
    • a) DP IV und/oder DP IV-ähnliche Enzyme spalten Aβ1-40/42, ein Dipeptid, umfassend H-Asp-Ala-OH, und Aβ3-40/42 werden freigesetzt,
    • b) In einer Nebenreaktion katalysiert QC die Cyclisierung von Glutaminsäure zu Pyroglutaminsäure bei sehr niedrigen Geschwindkeiten,
    • c) Glutaminsäure wird am N-Terminus post-translatorisch durch eine unbekannte enzymatische Aktivität zu Glutamin umgewandelt und anschließend, nach der Prozessierung des N-Terminus des Amyloid-beta Peptids, katalysiert QC die Cyclisierung von Glutamin zu Pyroglutaminsäure,
    • d) Glutaminsäure wird post-translatorisch durch eine chemische Katalyse oder Autokatalyse in Glutamin umgewandelt und in einem zweiten Schritt katalysiert QC die Cyclisierung von Glutamin zu Pyroglutaminsäure nach der Prozessierung des N-Terminus des Amyloid-beta Peptids,
    • e) Es gibt Mutationen im APP-Gen, die für das Amyloid-beta Protein codieren, was zu Gln an Stelle von Glu an Position 3 von Aβ führt. Nach der Translation und Prozessierung des N-Terminus katalysiert QC die Cyclisierung von Glutamin zu Pyroglutaminsäure,
    • f) Glutamin wird in die entstehenden Peptidkette von APP eingebaut, aufgrund einer Fehlfunktion einer unbekannten enzymatischen Aktivität, und anschließend katalysiert QC die Cyclisierung von N-terminalem Glutamin zu Pyroglutaminsäure nach der Prozessierung des N-Terminus des Amyloid-beta Peptids.
  • Die N-terminalle Gln-Exposition gegenüber QC Aktivität kann auch durch unterschiedliche Peptidase Aktivitäten getriggert werden. Aminopeptidasen können Asp und Ala sequenziell aus dem N-Terminus von Aβ1-40/41/43 entfernen, und somit Aminosäure 3 demaskieren, die zu Cyclisierung neigt. Dipeptidylpeptidasen, wie zum Beispiel DP I, DP II, DP IV, DP 8, DP 9 und DP 10, entfernen das Dipeptid Asp-Ala in einem Schritt. Daher ist die Hemmung von Aminopeptidase- oder Dipeptidylpeptidase Aktivität nützlich, um die Bildung von Aβ3-40/41/43 zu verhindern.
  • Die kombinierte Wirkung von Inhibitoren der DP IV und/oder DP IV-ähnlicher Enzyme und der Aktivitäts-mindernden Effektoren von QC wird auf die folgende Weise illustriet:
    • a) Die Inhibitoren der DP IV und/oder DP IV-ähnlichen Enzyme hemmen die Umwandlung von Aβ1-40/42 zu AβP3-40/42.
    • b) Eine N-terminale Exposition der Glutaminsäure wird dadurch verhindert und eine Umwandlung zu Glutamin, entweder durch enzymatische oder chemische Katalyse, die anschließend zur Bildung von Pyroglutaminsäure führt, ist nicht möglich.
    • c) Inhibitoren der QC verhindern außerdem die Bildung von Pyroglutaminsäure bei allen verbleibenden modifizierten Aβ3-40/42 Molekülen und jenen modifizierten Aβ3-40/42 Molekülen, die durch Mutationen des APP-Gens generiert werden.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine ähnliche kombinierte Wirkung von DP IV oder DP IV-ähnlichen Enzymen und QC für weitere Peptidhormone gezeigt, wie zum Beispiel Glucagon, CC Chemokine und Substanz P.
  • Glucagon ist ein Polypeptid mit 29 Aminosäuren, das aus den alpha-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse freigesetzt wird und bewirkt, dass die Euglykämie durch Anregung der hepatischen Glykogenolyse und Gluconeogenese aufrecht erhalten wird. Trotz ihrer Bedeutung gibt es eine Kontroverse über die Mechanismen, die für die Glucagon Ausscheidung im Körper verantwortlich sind. Pospisilik et al. untersuchten den enzymatischen Metabolismus von Glucagon unter Verwendung von empfindlichen massenspektrometrischen Verfahren, um die molekularen Produkte zu identifizieren. Inkubation von Glucagon mit gereinigter Schweine-Dipeptidylpeptidase IV (DP IV) ergab eine sequenzielle Produktion von Glucagon3-29 und Glucagon5-29. Im menschlichen Serum wurde der Abbau zu Glucagon3-29 schnell gefolgt von einer N-terminalen Cyclisierung von Glucagon, die eine weiterer DP IV-vermittelte Hydrolyse verhinderte. Ein Bioassay von Glucagon nach Inkubation mit gereinigter DP IV oder normalem Ratten-Serum zeigte einen signifikanten Verlust an hyperglykämischer Aktivität, während eine ähnliche Inkubation in DP IV-defizientem Ratten-Serum keinerlei Verlust der Bioaktivität von Glucagon zeigte. Der Abbau, beobachtet mit Hilfe von Massenspektrometrie und Bioassay, wurde durch den spezifischen DP IV Inhibitor Isoleucyl-Thiazolidin blockiert. Diese Ergebnisse identifizieren DP IV als ein primäres Enzym, das beim Abbau und der Inaktivierung von Glucagon beteiligt ist. Diese Erkenntnisse haben große Bedeutung für die Bestimmung von Glucagonspiegeln in humanem Plasma (Pospisilik et al. Regul Pept 2001 Jan 12; 96 (3): 133-41).
  • Humanes Monozyten chemotaktisches Protein 2 (Monocyte Chemotactic Protein (MCP)-2) wurde ursprünglich aus stimulierten Osteosarkomzellen isoliert als ein Chemokin, das zusammen mit MCP-1 und MCP-3 produziert wird. Von Coillie et al. (Van Collie, E. et al. 1998 Biochemistry 37, 12672-12680) klonierten eine 5'-Ende verlängerte MCP-2 cDNA aus einer cDNA-Bibliothek aus menschlichem Hoden. Es codierte für ein MCP-2 Protein mit 76 Resten, aber unterschied sich von der berichteten cDNA Sequenz des aus Knochenmark gewonnenen MCP-2 in Codon 46, das an Stelle eines Gln für ein Lys codiert. Diese MCP-2Lys46 Variante, verursacht durch einen Einzelnucleotid-Polymorphismus (single nucleotide polymorphism (SNP)), wurde biologisch mit MCP-2Gln46 verglichen. Die codierenden Bereiche wurden subkloniert in den bakteriellen Expressionsvektor pHEN1, und nach der Transformation von Escherichia coli, wurden die zwei MCP-2 Proteinvarianten aus dem Periplasma gewonnen. Edman-Abbau ergab einen Gln Rest am NH2-Terminus an Stelle eines pGlu. rMCP-2Gln46 und rMCP-2Lys46 und die entsprechenden NH2-terminalen cyclischen Ausführungen wurden auf monozytischen Zellen in Calcium Mobilisierungs- und Chemotaxis-Assays getestet. Kein signifikanter Unterschied in der biologischen Aktivität wurde zwischen den Isoformen rMCP-2Gln46 und rRMCP-2Lys46 beobachtet. Jedoch wurde für beide MCP-2 Varianten gezeigt, dass das NH2-terminale Pyroglutamat für die Chemotaxis essentiell ist, aber nicht für die Calcium Mobilisierung. Die NH2-terminale Verkürzung von rMCP-2Lys46 durch die Serinprotease CD26/Dipeptidylpeptidase IV (CD26/DPP IV) resultierte in der Freisetzung des NH2-terminalen Dipeptids Gin-Pro, während synthetisches MCP-2 mit einem Amino-terminalen pGlu unberührt blieb. CD26/DPP IV-verkürztes rMCP-2Lys46(3-76) war fast völlig inaktiv, sowohl bei Chemotaxis- als auch bei Signalisierungs-Assays. Diese Beobachtungen legen nahe, dass das NH2-terminale pGlu in MCP-2 für die chemotaktische Aktivität notwendig ist, aber auch, dass es das Protein gegen den Abbau durch CD26/DPP IV schützt (van Collie, E. et al. Biochemistry 1998 37, 12672-80).
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde durch LC/MS-Analyse festgestellt, dass die Bildung des N-terminalen Pyroglutamatrestes, bestimmt bei Glucagon3-29 (Pospisilik et al. 2001) und bei Isoformen von MCP-2 (van Coillie et al. 1998), durch QC katalysiert wird.
  • Darüber hinaus wurde durch LC/MS-Untersuchung bewiesen, dass nach der DP IV-katalysierten Entfernung der beiden Dipeptide Lys-Pro und Arg-Pro vom N-Terminus der Substanz P die verbleibende [Gln1]Substanz P5-11 durch QC zu [pGlu5]Substanz P5-11 umgewandelt wird.
  • DP IV – Inhibitoren sind in WO 99/61431 offenbart. Insbesondere sind DP IV-Inhibitoren offenbart, die einen Aminosäurerest und eine Thiazolidin- oder Pyrrolidingruppe umfassen, und deren Salze, vorzugsweise L-threo-Isoleucyl Thiazolidin, L-allo-Isoleucyl Thiazolidin, L-threo-Isoleucyl Pyrrolidin, L-allo-Isoleucyl Thiazolidin, L-allo-Isoleucyl Pyrrolidin, und deren Salze.
  • Weitere Beispiele für niedermolekulare Dipeptidylpeptidase IV-Inhibitoren sind Mittel, wie zum Beispiel Tetrahydroisoquinolin-3-carboxamid Derivate, N-substituierte 2-Cyanopyrrole und -Pyrrolidine, N-(N'-substituierte Glycyl)-2-cyanopyrrolidine, N-(substituierte Glycyl)-thiazolidine, N-(substituierte Glycyl)-4-cyanothiazolidine, Aminoacyl-borono-prolyl-Hemmer, Cyclopropyl-fusionierte Pyrrolidine und heterocyclische Verbindungen. Inhibitoren der Dipeptidylpeptidase IV sind beschrieben in US 6,380,398 , US 6,011,155 , US 6,107,317 ; US 6,110,949 ; US 6,124,305 ; US 6,172,081 , WO 95/15309 , WO 99/61431 , WO 99/67278 , WO 99/67279 , DE 198 34 591 , WO 97/40832 , DE 196 16 486 C2 , WO 98/19998 , WO 00/07617 , WO 99/38501 , WO 99/46272 , WO 99/38501 , WO 01/68603 , WO 01/40180 , WO 01/81337 , WO 01/81304 , WO 01/55105 , WO 02/02560 und WO 02/14271 , WO 02/04610 , WO 02/051836 , WO 02/068420 , WO 02/076450 , WO 02/083128 , WO 02/38541 , WO 03/000180 , WO 03/000181 , WO 03/000250 , WO 03/002530 , WO 03/002531 , WO 03/002553 , WO 03/002593 , WO 03/004496 , WO 03/024942 und WO 03/024965 , deren Lehren hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind, vor allem im Hinblick auf diese Inhibitoren, ihre Definition, Verwendungen und ihre Herstellung.
  • Bevorzugt für die Verwendung in Kombination mit Effektoren der QC sind DP IV Inhibitoren, wie zum Beispiel NVP-DPP728A (1-[[[2-[{5-Cyanopyridin-2-yl}amino]ethyl]amino]acetyl]-2-cyano-(S)-pyrrolidin) (Novartis), wie offenbart von Hughes et al. 1999 Biochemistry 38 11597-11603, LAF-237 (1-[(3-Hydroxy-adamant-1-ylamino)-acetyl]-pyrrolidin-2(S)-carbonitril); offenbart von Hughes et al., Tagung der American Diabetes Association 2002, Abstract Nr. 272 (Novartis), TSL-225 (Ttryptophyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure), offenbart von Yamada et al. 1998 Bioorg Med Chem Lett 8, 1537-1540, 2-Cyanopyrrolidide und 4-Cyanopyrolidide, wie offenbart von Asworth et al. 1996 Bioorg Med Chem Lett 6, 1163-1166 und 2745-2748, FE-999011 offenbart von Sudre et al. 2002 Diabetes 51, 1461-1469 (Ferring) und die Verbindungen, die in WO 01/34594 (Guilford) offenbart sind, bei Verwendung von Dosierungen, wie sie in den oben genannten Referenzen angegeben sind.
  • Stärker bevorzugte DP IV-Inhibitoren für die Verwendung in Kombination mit Effektoren der QC sind Dipeptidverbindungen, in denen die Aminosäure vorzugsweise ausgewählt ist aus einer natürlichen Aminosäure, wie, beispielsweise, Leucin, Valin, Glutamin, Glutaminsäure, Prolin, Isoleucin, Asparagin und Asparaginsäure. Die Dipeptid-ähnlichen Verbindungen, die gemäß der Erfindung verwendet werden, zeigen bei einer Konzentration (von Dipeptidverbindungen) von 10 μm eine Verringerung der Aktivität von Plasma-Dipeptidylpeptidase IV oder DP IV-analogen Enzymaktivitäten von mindestens 10%, insbesondere von mindestens 40%. Häufig ist auch eine Verminderung der Aktivität von mindestens 60% oder mindestens 70% in vivo gewünscht. Bevorzugte Verbindungen können auch eine Verminderung der Aktivität von maximal 20% oder 30% zeigen.
  • Bevorzugte Dipeptidverbindungen sind N-Valyl-prolyl, O-Benzoylhydroxylamin, Alanyl-Pyrrolidin, Isoleucyl-Thiazolidin, wie L-allo-Isoleucyl-Thiazolidin, L-threo-Isoleucyl-Pyrrolidin und Salze derselben, insbesondere die Salze der Fumarsäure und L-allo-Isoleucyl-Pyrolidin und Salze davon. Besonders bevorzugte Verbindungen sind Glutaminyl-Pyrrolidin und Glutaminyl-Thiazolidin, H-Asn-Pyrrolidin, H-Asn-Thiazolidin, H-Asp-Pyrrolidin, H-Asp-Thiazolidin, H-Asp(NHOH)-Pyrrolidin, H-Asp(NHOH)-Thiazolidin, H-Glu-Pyrrolidin, H-Glu-Thiazolidin, H-Glu(NHOH)-Pyrrolidin, H-Glu(NHOH)-Thiazolidin, H-His-Pyrrolidin-, H-His-Thiazolidin, H-Pro-Pyrrolidin, H-Pro-Thiazolidin, H-Ile-Azididin, H-Ile-Pyrrolidin, H-L-allo-Ile-Thiazolidin, H-Val-Pyrrolidin und H-Val-Thiazolidin und pharmazeutisch akzeptable Salze derselben. Diese Verbindungen sind beschrieben in WO 99/61431 und EP 1 304 327 .
  • Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Effektoren der QC in Kombination mit Substrat – ähnlichen Peptidverbindungen bereit, die nützlich für die kompetitive Modulation der Katalyse durch Dipeptidylpeptidase IV sind. Bevorzugte Peptidverbindungen sind 2-Amino-octansäure-Pro-Ile, Abu-Pro-Ile, Aib-Pro-Ile, Aze-Pro-Ile, Cha-Pro-Ile, Ile-Hyp-Ile, Ile-Pro-allo-Ile, Ile-Pro-t-butyl-Gly, Ile-Pro-Val, Nie-Pro-Ile, Nva-Pro-Ile, Orn-Pro-Ile, Phe-Pro-Ile, Phg-Pro-Ile, Pip-Pro-Ile, Ser(Bzl)-Pro-Ile, Ser(P)-Pro-Ile, Ser-Pro-Ile, t-Butyl-Gly-Pro-D-Val, t-Butyl-Gly-Pro-Gly, t-Butyl-Gly-Pro-Ile, t-Butyl-Gly-Pro-Ile-amid, t-Butyl-Gly-Pro-t-butyl-Gly, t-Butyl-Gly-Pro-Val, Thr-Pro-Ile, Tic-Pro-Ile, Trp-Pro-Ile, Tyr(P)-Pro-Ile, Tyr-Pro-allo-Ile, Val-Pro-allo-Ile, Val-Pro-t-butyl-Gly, Val-Pro-Val und pharmazeutisch akzeptable Salze derselben, wobei t-Butyl-Gly definiert ist als
    Figure 00230001
    und Ser(Bzl) und Ser(P) sind definiert als Benzylserin bzw. Phosphorylserin. Tyr(P) ist definiert als Phosphoryltyrosin. Diese Verbindungen sind in WO 03/002593 offenbart.
  • Weitere bevorzugte DP IV-Inhibitoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung in Kombination mit Effektoren der QC verwendet werden können, sind Peptidylketone, z. B.
    • • 2-Methylcarbonyl-1-N-[(L)-Alanyl-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid, 2-Methylcarbonyl-1-N-[(L)-Valinyl-(L)-Prolyl-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid,
    • • 2-[(Acetyl-oxy-methyl)carbonyl]-1-N-[(L)-Alanyl-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid,
    • • 2-[Benzoyl-oxy-methyl)carbonyl]-1-N-[{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid,
    • • 2-{[(2,6-Dichlorbenzyl)thiomethyl]carbonyl}-1-N-[{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-Pyrrolidin,
    • • 2-[Benzoyl-oxy-methyl)carbonyl]-1-N-[Glycyl-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid,
    • • 2-[([1,3]-Thiazolethiazol-2-yl)carbonyl]-1-N-[{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Trifluoracetat,
    • • 2-[(Benzothiazolethiazol-2-yl)carbonyl]-1-N-[N-{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Trifluoracetat,
    • • 2-[(-Benzothiazolethiazol-2-yl)carbonyl]-1-N-[{(L)-Alanyl}-Glycyl)]-(2S)-pyrrolidin- Trifluoracetat,
    • • 2-[(Pyridin-2-yl)carbonyl]-1-N-[N-{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Trifluoracetat
    und andere pharmazeutisch akzeptable Salze derselben. Diese Verbindungen sind in WO 03/033524 offenbart.
  • Ferner können gemäß der vorliegenden Erfindung substituierte Aminoketone in Kombination mit Effektoren der QC verwendet werden. Bevorzugte substituierte Aminoketone sind
    • • 1-Cyclopentyl-3-methyl-1-oxo-2-pentanaminiumchlorid,
    • • 1-Cyclopentyl-3-methyl-1-oxo-2-butanaminiumchlorid,
    • • 1-Cyclopentyl-3,3-dimethyl-1-oxo-2-butanaminiumchlorid,
    • • 1-Cyclohexyl-3,3-dimethyl-1-oxo-2-butanaminiumchlorid,
    • • 3-(Cyclopentylcarbonyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoliniumchlorid,
    • • N-(2-Cyclopentyl-2-oxoethyl)cyclohexanaminiumchlorid
    und andere pharmazeutisch akzeptable Salze derselben.
  • In der seltenen Gruppe von Prolin-spezifischen Proteasen wurde von DP IV ursprünglich angenommen, dass es das einzige Membran-gebundene Enzym ist, spezifisch für Prolin als vorletzter Rest am Amino-Terminus der Polypeptidkette. Jedoch wurden auch andere Moleküle identifiziert, sogar solche, die mit DP IV strukturell nicht homolog sind, aber eine entsprechende Enzymaktivität besitzen. DP IV-ähnliche Enzyme, die bisher identifiziert wurden, beinhalten z. B. Fibroblasten aktivierendes Protein α (fibroblast activation Protein α, FAPα), Dipeptidylpeptidase IV β, Dipeptidylaminopeptidase-ähnliches Protein (dipeptidyl aminopeptidase-like Protein), saure N-acetylierte α-verbundene Dipeptidase (N-acetylated α-linked acidic dipeptidase, NAALADase), Prolin-Dipeptidase aus ruhender Zelle (quiescent cell proline dipeptidase, QPP), Dipeptidylpeptidase II, Attractin und Dipeptidylpeptidase IV-verwandtes Protein (DPP 8), DPL1 (DPX, DP6), DPL2 und DPP9, beschrieben in Übersichtsartikeln von Sedo & Malik (Sedo und Malik, 2001, Biochim Biophys Acta, 36506, 1-10) und Abbott und Gorrell (Abbott, C. A. und Gorrell, M. D. 2002 in: Langner & Ansorge (Hrsg.), Ectopeptidases (Ectopeptidasen). Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 171-195). Vor kurzem wurde die Klonierung und Charakterisierung von Dipeptidylpeptidase 10 (DPP 10) berichtet (Qi, S. Y. et al. Biochemical Journal Immediate Publication. Veröffentlicht am 28. März 2003 als Manuskript BJ20021914).
  • Effektoren, wie dieser Begriff hier verwendet wird, sind definiert als Moleküle, die an Enzyme binden und deren Aktivität in vitro und/oder in vivo steigern oder herabsetzen. Einige Enzyme besitzen Bindungsstellen für kleine Moleküle, die ihre katalytische Aktivität beeinflussen; ein Stimulator-Molekül wird als Aktivator bezeichnet. Enzyme können sogar mehrere Stellen für die Erkennung von mehr als einem Aktivator oder Inhibitor haben. Enzyme können Konzentrationen einer Vielzahl von Molekülen detektieren und nutzen diese Informationen, um ihre eigenen Aktivitäten zu variieren.
  • Effektoren können enzymatische Aktivität modulieren, da Enzyme sowohl aktive als auch inaktive Konformationen annehmen können: Aktivatoren sind positive Effektoren, Inhibitoren sind negative Effektoren. Effektoren agieren nicht an den aktiven Zentren von Enzymen, sondern auch an regulatorischen Stellen, oder allosterischen Stellen, Begriffe werden benutzt, um zu betonen, dass die regulatorische Stelle ein Element des Enzyms ist, das verschieden ist vom katalytischen Zentrum, und um diese Form der Regulation zu unterscheiden von der Kompetition zwischen Substraten und Inhibitoren am katalytischen Zentrum (Darnell, J., Lodish, H. und Baltimore, D. 1990, Molecular Cell Biology 2nd Edition (Molekularbiologie der Zelle, 2. Aufl.), Scientific American Books, New York, Seite 63).
  • Bei den Peptiden der vorliegenden Erfindung wird jeder Aminosäurerest durch eine Ein-Buchstaben- oder Drei-Buchstaben-Bezeichnung wiedergegeben, der dem Trivialname der Aminosäure entspricht, in Übereinstimmung mit der folgenden üblichen Liste:
    Aminosäure Ein-Buchstaben-Symbol Drei-Buchstaben-Symbol
    Alanin A Ala
    Arginin R Arg
    Asparagin N Asn
    Asparaginsäure D Asp
    Cystein C Cys
    Glutamin Q Gin
    Glutaminsäure E Glu
    Glycin G Gly
    Histidin H His
    Isoleucin I Ile
    Leucin L Leu
    Lysin K Lys
    Methionin M Met
    Phenylalanin F Phe
    Prolin P Pro
    Serin S Ser
    Threonin T Thr
    Tryptophan W Trp
    Tyrosin Y Tyr
    Valin V Val
  • Der Begriff ”QC”, wie hierin verwendet, umfasst Glutaminyl-Cyclase (QC) und QC-ähnliche Enzyme. QC und QC-ähnliche Enzyme haben eine identische oder ähnliche Enzymaktivität, weiter definiert als QC Aktivität. In diesem Zusammenhang, QC-ähnliche Enzyme können sich in ihrer molekularen Struktur fundamental von QC unterscheiden.
  • Der Begriff ”QC Aktivität”, wie hierin verwendet, ist definiert als intramolekulare Cyclisierung von N-terminalen Glutaminresten zu Pyroglutaminsäure (pGlu*) oder von N-terminalem L-Homoglutamin oder L-β-Homoglutamin zu einem cyclischen Derivat der Pyroglutaminsäure (pyro-homoglutamine derivative) unter Freisetzung von Ammoniak. Siehe hierfür Schema 1 und Schema 2.
  • Schema 1: Cyclisierung von Glutamin durch QC
    Figure 00260001
  • Schema 2: Cyclisierung von L-Homoglutamin durch QC
    Figure 00270001
  • Der Begriff ”EC”, wie hierin verwendet, umfasst die Nebenaktivität von QC und QC-ähnlichen Enzymen als Glutamat-Cyclase (EC), weiter definiert als EC Aktivität.
  • Der Begriff ”EC Aktivität”, wie hierin verwendet, ist definiert als intramolekulare Cyclisierung von N-terminalen Glutamatresten zu Pyroglutaminsäure (pGlu*) durch QC. Siehe hierfür Schema 3.
  • Der Begriff ”Metall-abhängiges Enzym”, wie hierin verwendet, ist definiert als Enzym(e), das/die ein gebundenes Metallion benötigen, um ihre katalytische Funktion auszuüben und/oder ein gebundenes Metallion benötigen, um die katalytisch aktive Struktur zu bilden.
  • Moleküle, die an Enzyme binden und deren Aktivitäten steigern oder herabsetzen, werden als ”Effektoren” bezeichnet. Effektoren können enzymatische Aktivität verändern, weil Enzyme sowohl aktive als auch inaktive Konformationen annehmen können: Aktivatoren sind positive Effektoren; Inhibitoren sind negative Effektoren Effektoren binden an regulatorische Stellen oder allosterische Stellen (aus dem Griechischen für ”andere Form”); ein Begriff, verwendet, um zu betonen, dass die regulatorische Stelle ein Element des Enzyms ist; das verschieden ist vom katalytischen Zentrum, und um diese Form der Regulation zu unterscheiden von der Kompetition zwischen Substraten und Inhibitoren am katalytischen Zentrum. Gemäß den einzelnen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden entweder Aktivatoren oder Inhibitoren bevorzugt.
  • Schema 3: N-terminale Cyclisierung von ungeladenen Glutamylpeptiden durch QC (EC)
    Figure 00280001
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung von neuen physiologischen Substraten von QC. Diese wurden identifiziert durch Durchführung von Cyclisierungsexperimenten mit Säugetierpeptiden, wie in Beispiel 5 beschrieben. Vorher wurden humane QC und Papaya QC isoliert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die angewandten Verfahren sind in Beispiel 2 beschrieben und die eingesetzte Peptidsynthese ist in Beispiel 6 erläutert. Die Ergebnisse der Studie sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Neue physiologische Substrate von Glutaminyl-Cyclase (*, qualitativ bestimmt durch MALDI-TOF Experimente)
    Substrat humane QC Papaya QC
    KM (μM) kcat (s–1) kcat/KM (mM–1s–1) KM (μM) kcat (s–1) kcat/KM (mM–1s–1)
    [Gln1]-Gastrin 31 ± 1 54,1 ± 0,6 1745,2 ± 36,9 34 ± 2 25,8 ± 0,5 759 ± 30
    [Gln1]-Neurotensin 37 ± 1 48,8 ± 0,4 1318,9 ± 24,8 40 ± 3 35,7 ± 0,9 893 ± 44
    [Gln1]-FPP 87 ± 2 69,6 ± 0,3 800,0 ± 14,9 232 ± 9 32,5 ± 0,4 140 ± 4
    [Gln1]-TRH 90 ± 4 82,8 ± 1,2 920,0 ± 27,6 - - -
    [Gln1]-GnRH 53 ± 3 69,2 ± 1,1 1305,7 ± 53,2 169 ± 9 82,5 ± 1,9 488,2 ± 14,8
    [Gln3]-glucagon(3-29) * *
    (Gln5]-substance P(5-11) * *
  • Alle Analysen wurden entweder im optimalen Bereich der Aktivität und der Stabilität von humaner oder pflanzlicher QC durchgeführt, wie in Beispiel 4 gezeigt.
  • Die Aminosäuresequenzen der physiologisch aktiven Peptide mit einem N-terminalen Glutaminrest, weshalb sie Substrate für das QC Enzym sind, sind in Tabelle 2 aufgelistet.
  • Tabelle 2: Aminosäuresequenzen von physiologisch wirksamen Peptiden mit einem N-terminalen Glutaminrest
    Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • In einer vierten Ausführungsform wurden die Peptide [Gln1]Gastrin (17 und 34 Aminosäuren lang), [Gln1]Neurotensin und [Gln1]FPP als neue physiologische Substrate von QC identifiziert. Gastrin, Neurotensin und FPP umfassen einen pGlu Rest an ihrer N-terminalen Position. Für alle Peptide wurde gezeigt, dass dieser N-terminale pGlu Rest aus N-terminalem Glutamin durch QC-Katalyse gebildet wird. Als Folge davon, werden diese Peptide nach der Umwandlung des N-terminalen Glutamin Restes zu pGlu in Bezug auf ihre biologische Funktion aktiviert.
  • Am transepithelialen Transport beteiligte Zellen (transepithelial transducing cells), insbesondere die Gastrin (G)-Zelle, koordinieren die Sekretion der Magensäure mit der Ankunft der Nahrung im Magen. Jüngste Arbeiten haben gezeigt, dass mehrere aktive Produkte aus dem Gastrin-Vorläufer gebildet werden, und dass es eine Vielzahl von Kontrollpunkten bei der Biosynthese von Gastrin gibt. Biosynthetische Vorläufer und Zwischenprodukte (Progastrin und Gly-Gastrin) sind vermeintliche Wachstumsfaktoren; ihre Produkte, die amidierten Gastrine, regulieren die epitheliale Zellproliferation, die Differenzierung der Säure produzierenden Belegzellen (parietal cells) und der Histamin-sekretierende enterochromaffin-ähnlichen (ECL)-Zellen und die Expression von Genen, die an der Histaminsynthese und der Speicherung in ECL-Zellen beteiligt sind, sowie die akute Anregung der Säuresekretion. Gastrin stimuliert auch die Produktion von Mitgliedern der epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Familie, die wiederum die Funktion der Belegzellen hemmen, aber das Wachstum von Oberflächen-Epithelzellen stimulieren. Gastrin Plasma-Konzentrationen sind erhöht bei Subjekten mit Helicobacter pylori, von denen bekannt ist, dass sie ein erhöhtes Risiko für Zwölffingerdarmgeschwür (duodenal ulcer disease) und Magenkrebs (gastric cancer) haben (Dockray, G. J. 1999 J Physiol 15, 315-324).
  • Das Peptidhormon Gastrin, freigesetzt aus antralen G-Zellen, ist bekannt, dass es die Synthese und die Freisetzung von Histamin aus ECL-Zellen in der Magenschleimhaut (oxyntic mucosa) via CCK-2-Rezeptoren stimuliert. Das mobilisierte Histamin induziert die Säuresekretion durch Bindung an die H(2)-Rezeptoren, die sich auf den Belegzellen befinden. Neuere Studien legen nahe, dass Gastrin, sowohl in seiner vollständig amidierten als auch in seiner weniger prozessierten Form (Progastrin und Glycin-verlängertes Gastrin), auch ein Wachstumsfaktor für den Magen-Darm-Trakt ist. Es wurde festgestellt, dass die hauptsächliche trophische Wirkung von amidiertem Gastrin die die Schleimhaut des Magens betrifft (oxyntic mucosa of stomach), wo sie eine gesteigerte Proliferation von Magen-Stammzellen und ECL-Zellen bewirkt, was zu einer erhöhten Beleg- und ECL-Zellmasse führt. Auf der anderen Seite scheint das wichtigste trophische Ziel des weniger prozessierten Gastrin (z. B. Glycin-verlängertes Gastrin) die Kolonschleimhaut zu sein (Koh, T. J. und Chen, D. 2000 Regul Pept 9337-44).
  • In einer fünften Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von aktivitätssteigernden Effektoren der QC für die Stimulierung der Zellproliferation im Magen-Darm-Trakt bereit, insbesondere der Zellproliferation der Magenschleimhaut, der epithelialen Zellproliferation, der Differenzierung von Säure produzierenden Belegzellen und Histamin-sekretierenden enterochromaffin-ähnlichen (ECL)-Zellen, und die Expression von Genen, die an der Histaminsynthese und der Speicherung in ECL-Zellen beteiligt sind, sowie für die Anregung der akuten Säuresekretion bei Säugetieren durch die Aufrechterhaltung oder Erhöhung der Konzentration von aktivem [pGlu1]-Gastrin.
  • In einer sechsten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von aktivitätsvermindernden Effektoren der QC für die Behandlung von Zwölffingerdarmgeschwür und Magenkrebs mit oder ohne Helicobacter pylori bei Säugetieren bereit, indem die Umwandlungsgeschwindigkeit von inaktivem [Gln1]Gastrin zu aktivem [pGlu1]Gastrin verringert wird.
  • Neurotensin (NT) ist ein an der Pathophysiologie der Schizophrenie beteiligtes Neuropeptid, das spezifisch Neurotransmitter-Systeme moduliert, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie bei dieser Krankheit fehlgesteuert sind. Klinische Studien, in denen NT-Konzentrationen in cerebrospinaler Flüssigkeit (CSF) gemessen wurden, ließen eine Untergruppe von schizophrenen Patienten mit einer verminderten CSF NT-Konzentration, die durch wirksame Behandlung mit Psychopharmaka wieder hergestellt wird, erkennen. Ein deutlicher Beleg hierfür ist auch die Übereinstimmung mit der Beteiligung von NT-Systemen am Wirkungsmechanismus von Psychopharmaka. Die Auswirkungen auf das Verhalten und die biochemischen Wirkungen von zentral verabreichtem NT ähneln auffallend denen von systemisch verabreichten Psychopharmaka, und Psychopharmaka erhöhen die Neurotransmission von NT. Diese Verkettung von Erkenntnissen führte zu der Hypothese, dass NT als ein endogenes Psychopharmakon wirkt. Darüber hinaus ändern typische und atypische Psychopharmaka differenziell die Neurotransmission von NT in nigrostriatalen und mesolimbischen dopaminergen Endbereichen (nigrostriatal and mesolimbic dopamine terminal regions), und diese Effekte sind prädikativ für Belastungen duch Nebenwirkungen bzw. die Wirksamkeit (Binder, E. B. et al. 2001 Biol Psychiatry 50, 856-872).
  • In einer siebten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von aktivitätssteigernden Effektoren der QC für die Herstellung von Psychopharmaka und/oder für die Behandlung von Schizophrenie bei Säugetieren bereit. Die Effektoren der QC halten entweder die Konzentration von aktivem [pGlu1]Neurotensin oder erhöhen diese.
  • FPP (fertilization promoting peptide), ein Tripeptid, das verwandt ist zu TRH (thyrotrophin releasing hormone), wird in Samenplasma gefunden. Kürzlich in vitro und in vivo erhaltene Belege zeigten, dass FPP eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Fruchtbarkeit von Spermien spielt. Genau genommen stimuliert FPP zunächst unfruchtbare (nonfertilizing) (unkapazierte (uncapacitated)) Spermatozoen zur ”Einschaltung” und zum schneller fruchtbar werden, aber dann hält es die Fähigkeit an, so dass die Spermatozoen keinen spontanen Verlust des Akrosoms erleben und deshalb ihre Fruchtbarkeitsvermögen nicht verlieren. Diese Reaktionen werden nachgeahmt, und in der Tat gesteigert, durch Adenosin, das bekannt ist, den Stoffwechselweg der Signalübertragung der Adenylylcyclase (AC)/cAMP zu regulieren. Sowohl für FPP als auch für Adenosin wurde gezeigt, dass sie die cAMP-Produktion in unkapazitierten Zellen stimulieren, aber sie in kapazitierten Zellen hemmen, wobei FPP-Rezeptoren irgendwie mit Adenosin-Rezeptoren und G-Proteinen interagieren, um eine Regulierung der AC zu erreichen. Diese Ereignisse beeinflussen den Phosphorylierungsgrad von Tyrosin in verschiedenen Proteinen, von denen einige wichtig in der Anfangsphase der ”Einschaltung” sind, andere sind möglicherweise an der Akrosomreaktion selbst beteiligt. Calcitonin und Angiotensin-II, die auch im Samenplasma gefunden werden, haben in vitro eine ähnliche Wirkung auf unkapazitierte Spermatozoen und können die Antworten auf FPP steigern. Diese Moleküle haben ähnliche Wirkungen in vivo, sie beeinträchtigen die Fruchtbarkeit durch Stimulation und halten dann das Fruchtbarkeitsvermögen aufrecht. Jede Verringerung der Verfügbarkeit von FPP, Adenosin, Calcitonin, und Angiotensin-II oder Mängel an ihren Rezeptoren tragen zur männlichen Unfruchtbarkeit bei (Fraser, L. R. und Adeoya-Osiguwa, S. A. 2001 Vitam Horm 63, 1-28).
  • In einer achten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von aktivitätssenkenden Effektoren der QC für die Herstellung von die Fruchtbarkeit verhindernden Arzneimitteln und/oder zur Verringerung der Fruchtbarkeit bei Säugetieren bereit. Die aktivitätssenkenden Effektoren der QC verringern die Konzentration von aktivem [pGlu1]FPP, was zu einer Verhinderung der Spermienreifung (sperm capacitation) und einer Deaktivierung von Spermienzellen führt. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass aktivitätssteigernde Effektoren der QC in der Lage sind, die Fruchtbarkeit von Männern zu fördern und Unfruchtbarkeit zu behandeln.
  • In einer neunten Ausführungsform wurden weitere physiologische Substrate der QC im Rahmen der vorliegenden Erfindung identifiziert. Dabei handelt es sich um [Gln1]CCL2, [Gln1]CCL7, [Gln1]CCL8, [Gln1]CCL16, [Gln1]CCL18 und [Gln1]Fractalkine. Siehe Tabelle 2 für Details. Diese Polypeptide spielen eine wichtige Rolle bei pathophysiologischen Zuständen, wie z. B. der Suppression der Proliferation von myeloischen Vorläuferzellen, Neoplasie, inflammatorische Reaktionen des Wirts, Krebs, Schuppenflechte, rheumatoide Arthritis, Arteriosklerose, humoralen und Zell-vermittelten Immunantworten, Leukozyten-Adhäsions- und Migrationsprozessen im Endothel.
  • Mehrere zytotoxische T-Lymphozyten-Peptid-basierte Impfstoffe gegen Hepatitis B, humanen Immunschwächevirus und Melanom wurden kürzlich in klinischen Studien untersucht. Ein interessanter Melanom-Impfstoff-Kandidat allein oder in Kombination mit anderen Tumorantigenen ist das Dekapeptid ELA. Dieses Peptid ist ein Analogon des immundominanten Melan-A/MART-1 Antigenpeptids, mit einer N-terminalen Glutaminsäure. Es wurde berichtet, dass die Aminogruppe und die gamma-Carboxylgruppe von Glutaminsäuren sowie die Aminogruppe und gamma-Carboxamidgruppe von Glutaminen leicht kondensieren, um Derivate der Pyroglutaminsäure zu bilden. Um dieses Stabilitätsproblem zu überwinden, wurden mehrere Peptide von pharmazeutischem Interesse mit einer Pyroglutaminsäure an Stelle von N-terminalem Glutamin oder N-terminaler Glutaminsäure entwickelt, ohne Verlust der pharmakologischen Eigenschaften. Leider, verglichen mit ELA, löste das Pyroglutaminsäure-Derivat (PyrELA) und auch das N-terminal acetylierte (acetylcapped) Derivat (AcELA) keine zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Aktivität aus. Trotz der scheinbar geringfügigen Modifikationen, die in PyrELA und AcELA eingeführt sind, weisen diese beiden Derivate wahrscheinlich eine geringere Affinität als ELA für den spezifischen MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex)-Klasse I-Komplex (class I major histocompatibility complex) auf. Folglich muss die Bildung von PyrELA vermieden werden, um die volle Aktivität von ELA zu erhalten (Geck A. et al. 2001, J Pept Res 57(6): 528-38). Vor kurzem wurde gefunden, dass auch das Enzym Glutaminyl-Cyclase (QC) in Melanomen überexprimiert wird (Ross D. T. et al. 2000, Nat Genet 24: 227-35).
  • In einer zehnten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Effektoren der QC für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von pathophysiologischen Zuständen bereit, wie z. B. Suppression der Proliferation von myeloischen Vorläuferzellen, Neoplasie, inflammatorische Reaktionen des Wirts, Krebs, maligne Metastasen, Melanom, Schuppenflechte, rheumatoide Arthritis, Arteriosklerose, verminderte humorale und Zell-vermittelte Immunantworten, Leukozyten-Adhäsions- und Migrationsprozesse im Endothel.
  • In einer elften Ausführungsform wurde [Gln1]Orexin A als ein physiologisches Substrat der QC im Rahmen der vorliegenden Erfindung identifiziert. Orexin A ist ein Neuropeptid, dass eine bedeutende Rolle bei der Regulierung der Nahrungsaufnahme und Schlaf-Wachsamkeit spielt, möglicherweise, indem es die komplexen Verhaltens- und physiologischen Reaktionen dieser komplementären homöostatischen Funktionen. Es spielt auch eine umfassende Rolle bei der homöostatischen Regulation des Energiestoffwechsels, der autonomen Funktion, dem Hormonhaushalt und der Regulierung der Körperflüssigkeiten.
  • In einer zwölften Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Effektoren der QC für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von eingeschränkter Nahrungsaufnahme und Schlaf-Wachsamkeit, beeinträchtigter homöostatischer Regulierung des Energiestoffwechsels, beeinträchtigter autonomer Funktion, beeinträchtigtem Hormonhaushalt und beeinträchtigter Regulierung der Körperflüssigkeiten bereit.
  • Eine Verlängerung des Polyglutamin-Bereichs bei mehreren Proteinen führt zu neurodegenerativen Erkrankungen, wie Parkinson-Krankheit und Kennedy-Krankheit. Der Mechanismus bleibt daher weitgehend unbekannt. Die biochemischen Eigenschaften der Polyglutamin-Wiederholungen (polyglutamine repeats) liefern eine mögliche Erklärung: endolytische Spaltung bei einer Glutaminyl-Glutaminyl Bindung, gefolgt von einer Pyroglutamat-Bildung kann zur Pathogenese beitragen, indem die katabole Stabilität, Hydrophobie, Amyloidogenität (amyloidogenicity) und die Neurotoxizität der Polyglutaminyl-Proteine gesteigert wird (Saido, T; Med Hypotheses (2000) Mar; 54(3): 427-9).
  • In einer dreizehnten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung daher die Verwendung von Effektoren der QC für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Parkinson-Krankheit und von Huntington-Krankheit bereit.
  • In einer vierzehnten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen allgemeinen Weg zur Verringerung oder Hemmung der enzymatischen Aktivität von QC bereit. Beispiele für hemmende Verbindungen werden ebenfalls bereit gestellt.
  • Die Hemmung einer Säugetier-QC wurde zunächst nur für 1,10-Phenanthrolin und reduziertes 6-Methylpterin erkannt (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536). EDTA hemmte, QC nicht, und somit wurde gefolgert, dass QC kein Metall-abhängiges Enzym ist (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536, Bateman, R. C. J. et al. 2001 Biochemistry 40, 11246-11250, Booth, R. E. et al. 2004 BMC Biology 2). In der vorliegenden Erfindung wird jedoch gezeigt, dass humane QC und andere Tier-QCs Metall-abhängige Enzyme sind, wie deutlich gemacht durch die Hemmungseigenschaften der QC durch 1,10-Phenanthrolin, Dipicolinsäure, 8-Hydroxychinolin und anderen Chelatoren (18, 19) und durch die Reaktivierung der QC durch Übergangsmetallionen (20). Schließlich wird die Metallabhängigkeit durch einen Sequenzvergleich mit anderen Metall-abhängigen Enzymen dargelegt, der auch bei humaner QC eine Konservierung der chelierenden Aminosäurereste zeigt (21). Die Wechselwirkung von Verbindungen mit dem im aktiven Zentrum gebundenen Metallion stellt einen allgemeinen Weg zur Verringerung oder Hemmung der QC Aktivität dar.
  • In der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass Imidazolderivate wirksame Inhibitoren der QC sind. Unter Verwendung des kontinuierlichen Assay (siehe Beispiel 2 für Details) wurden viele Imidazolderivate in Bezug auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der humanen QC als einem Mitglied der hochkonservierten Säugetier-QCs analysiert.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung Imidazolderivate und Histidin und seine Derivate bereit als aktivitätsvermindernde Effektoren der QC und ihre Eigenschaften in Bezug auf die Hemmungsart und -Wirksamkeit. Strukturen und Ki-Werte sind in den Tabellen 3 und 4 gezeigt. Die Ergebnisse sind im Detail in Beispiel 7 beschrieben.
  • Tabelle 3: Inhibitionskonstanten von Imidazolderivaten bei durch humane QC-katalysierter Reaktion. Bestimmungen wurden durchgeführt bei 30°C in 0,05 M Tris-HCl pH 8,0, enthaltend 5 mM EDTA.
    Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Tabelle 4: Hemmung der QC durch L-Histamin und seine zwei biologischen Metaboliten (auch bekannt als tele-Methylhistamin).
    Figure 00390002
  • Figure 00400001
  • Überraschenderweise wurde während der Charakterisierung der enzymatischen Aktivität festgestellt, dass neben einem N-terminalen Glutaminylrest, N-terminale β-homo-Glutaminylreste auch die Eigenschaften als Substrate der QCs aus Pflanzen und Säugetieren erfüllen. Der N-terminale β-homo-Glutaminylrest wurde in einen fünfgliedrigen Lactamring umgewandelt durch Katalyse von humaner QC bzw. Papaya QC. Die Ergebnisse sind in Beispiel 5 beschrieben. Das verwendete Verfahren ist in Beispiel 2 dargestellt und die Peptidsynthese wurde wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Screening-Verfahren für Effektoren der QC.
  • Ein bevorzugtes Screening-Verfahren zur Identifizierung von aktivitätsändernden Effektoren der QC aus einer Gruppe von Verbindungen umfasst die Schritte:
    • a) Kontaktieren der Verbindungen mit QC unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen diesen erlauben;
    • b) Hinzufügen eines Substrats der QC;
    • c) Beobachtung der Umwandlung des Substrats oder gegebenenfalls Messung der verbleibenden QC-Aktivität; und
    • d) Berechnung von Änderungen bei der Substratumwandlung und/oder der Enzymaktivität der QC, um einen aktivitätsändernden Effektor zu identifizieren.
  • Ein weiteres bevorzugtes Screening-Verfahren betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und Auswahl von Effektoren, die direkt oder indirekt mit dem im aktiven Zentrum von QC gebundenen Metallion interagieren, und umfasst folgende Schritte:
    • a) Kontaktieren der Verbindungen mit QC unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen diesen erlauben;
    • b) Hinzufügen eines Substrats der QC, welches von QC umgewandelt wird;
    • c) Beobachtung der Umwandlung des Substrats oder gegebenenfalls Messung der verbleibenden QC-Aktivität; und
    • d) Berechnung von Änderungen bei der Substratumwandlung und/oder der Enzymaktivität der QC, wobei Änderungen benutzt werden können, um einen aktivitätsändernden Effektor der QC zu identifizieren.
  • Für die Verwendung in den vorstehend beschriebenen Screening-Verfahren bevorzugt sind Säugetier QC oder Papaya QC. Besonders bevorzugt ist Säugetier QC, da die durch diese Screening-Verfahren identifizierten Effektoren für die Behandlung von Krankheiten in Säugetieren, insbesondere bei Menschen, verwendet werden sollen.
  • Die Mittel, die durch die vorstehend beschriebenen Screening-Verfahren ausgewählt werden, können wirken durch eine Verminderung der Umwandlung von mindestens einem Substrat der QC (negative Effektoren, Inhibitoren) oder durch die Steigerung der Umwandlung von mindestens einem Substrat der QC (positive Effektoren, Aktivatoren).
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in Säureadditionssalze, insbesondere pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze, umgewandelt werden.
  • Die Salze der Verbindungen der Erfindung können in Form von anorganischen oder organischen Salzen vorliegen.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können umgewandelt werden in und eingesetzt werden als Säureadditionssalze, insbesondere pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze. Ein pharmazeutisch akzeptables Salz nimmt in der Regel eine Form an, bei der eine basische Seitenkette mit einer anorganischen oder organischen Säure protoniert ist. Repräsentative organische oder anorganische Säuren umfassen Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Hydroxyethansulfonsäure, Benzensulfosäure, Oxasäure, Pamosäure, 2-Naphthalinsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure (p-toulenesulfonic acid), Cyclamsäure (cyclohexanesulfamic acid), Salicylsäure, Saccharinsäure oder Trifluoressigsäure. Alle pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalzformen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sollen in den Bereich dieser Erfindung einbezogen sein.
  • In Anbetracht der engen Beziehung zwischen den freien Verbindungen und den Verbindungen in Form ihrer Salze soll auch ein entsprechendes Salz gemeint sein, sobald eine Verbindung in diesem Zusammenhang genannt wird, sofern dies unter den gegebenen Umständen möglich oder geeignet ist.
  • Sofern die Verbindungen gemäß dieser Erfindung mindestens ein chirales Zentrum aufweisen, können sie dementsprechend als Enantiomere existieren. Sofern die Verbindungen zwei oder mehr chirale Zentren besitzen, können sie darüber hinaus als Diastereomere existieren. Es sollte verstanden werden, dass alle diese Isomere und Mischungen derselben im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst sind. Außerdem können einige der kristallinen Formen der Verbindungen als Polymorphe existieren und als solche sind sie dazu bestimmt, in der vorliegenden Erfindung enthalten zu sein. Darüber hinaus können einige der Verbindungen Solvate mit Wasser (d. h. Hydrate) oder üblichen organischen Lösungsmitteln bilden, und solche Solvate sind auch dazu bestimmt, in den Umfang dieser Erfindung einbezogen zu sein.
  • Die Verbindungen, einschließlich ihrer Salze, können auch in Form ihrer Hydrate erhalten werden oder auch andere Lösungsmittel einschließen, die für ihre Kristallisation verwendet werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zur Vorbeugung oder Behandlung eines Zustands, der durch Modulation der QC-Enzymaktivität vermittelt wird, in einem bedürftigen Subjekt, welches das Verabreichen einer der Verbindungen der vorliegenden Erfindung oder von pharmazeutischen Zusammensetzungen derselben in einer Menge und einem Dosierungsregime, therapeutisch wirksam, um den Zustand zu behandeln, umfasst. Darüber hinaus umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, und ihrer entsprechenden pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalzformen, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung oder Behandlung eines Zustandes, der durch die Modulation der QC-Aktivität in einem Subjekt vermittelt wird. Die Verbindung kann einem Patienten durch jede übliche Art der Verabreichung verabreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, intravenöse, orale, subkutane, intramuskuläre, intradermale, parenterale Verabreichung und Kombinationen derselben.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, d. h. Arzneimittel, die mindestens eine Verbindung der Erfindung oder deren Salze enthalten, optional in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder Lösungsmitteln.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können, zum Beispiel, in Form von parenteralen oder enteralen Formulierungen sein und geeignete Träger enthalten, oder sie können in Form von oralen Formulierungen sein, die geeignete Träger, geeignet für die orale Verabreichung, enthalten können. Vorzugsweise sind sie in Form von oralen Formulierungen.
  • Die Effektoren der QC-Aktivität, verabreicht gemäß der Erfindung, können verwendet werden in pharmazeutisch verabreichbaren Formulierungen oder Formulierungskomplexen als Inhibitoren oder in Kombination mit Inhibitoren, Substraten, Pseudosubstraten, Inhibitoren der QC-Expression, Bindungsproteinen oder Antikörpern von jenen Enzymproteinen, die die QC-Proteinkonzentration bei Säugetieren verringern. Die Verbindungen der Erfindung machen es möglich, die Behandlung individuell an die Patienten und Krankheiten anzupassen, wobei es insbesondere möglich ist, individuelle Unverträglichkeiten, Allergien und Nebenwirkungen zu vermeiden.
  • Die Verbindungen zeigen auch unterschiedliche Grade der Aktivität als Funktion der Zeit. Der behandelnde Arzt erhält dadurch die Möglichkeit, unterschiedlich auf die individuelle Situation der Patienten zu reagieren: auf der einen Seite ist er in der Lage, die Geschwindigkeit des Beginns der Wirkung und, auf der anderen Seite, die Dauer der Wirkung und insbesondere die Intensität der Wirkung präzise anzupassen.
  • Ein bevorzugtes Behandlungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung stellt einen neuen Ansatz für die Vorbeugung oder Behandlung eines Zustandes dar, der durch Modulation der QC-Enzymaktivität bei Säugetieren vermittelt wird. Es ist vorteilhaft einfach, geeignet für die kommerzielle Anwendung und zur Verwendung bei Säugetieren und, insbesondere in der Humanmedizin, insbesondere zur Behandlung von Krankheiten, die auf unausgeglichener Konzentration von physiologisch aktiven QC-Substraten beruhen, z. B. aufgeführt in den Tabellen 1 und 2.
  • Die Verbindungen können vorteilhaft verabreicht werden, zum Beispiel, in Form von pharmazeutischen Zubereitungen, die den Wirkstoff in Kombination mit üblichen Zusätzen, wie Verdünnungsmitteln, Hilfsstoffen und/oder Trägern, bekannt aus dem Stand der Technik, enthalten. Zum Beispiel können sie parenteral verabreicht werden (z. B. i. v. in physiologischer Kochsalzlösung) oder enteral (z. B. oral, formuliert mit üblichen Trägern).
  • Abhängig von ihrer endogenen Stabilität und ihrer Bioverfügbarkeit, kann eine Dosis oder mehrere Dosen der Verbindungen pro Tag gegeben werden, um die gewünschte Normalisierung der Blutzuckerwerte zu erreichen. Zum Beispiel kann ein solcher Dosisbereich beim Menschen im Bereich von etwa 0,01 mg bis 250,0 mg pro Tag sein, vorzugsweise im Bereich von etwa 0,01 bis 100 mg der Verbindung pro kg Körpergewicht.
  • Durch Verabreichung von Effektoren der QC-Aktivität an ein Säugetier könnte es möglich sein, Zustände, ausgewählt aus Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom, Magengeschwür und Magenkrebs mit oder ohne Heliobacter pylori Infektionen, pathogenen psychotischen Zuständen, Schizophrenie, Unfruchtbarkeit, Neoplasie, inflammatorischen Reaktionen des Wirts, Krebs, Schuppenflechte, rheumatoide Arthritis, Arteriosklerose, beeinträchtigte humorale und Zell-vermittelte Immunantworten, Leukozyten-Adhäsions- und Migrationsprozesse im Endothel, beeinträchtigte Nahrungsaufnahme, Schlaf-Wachsamkeit, beeinträchtigte homöostatische Regulierung des Energiestoffwechsels, beeinträchtigte autonome Funktion, beeinträchtigter Hormonhaushalt und beeinträchtigte Regulierung der Körperflüssigkeiten, zu verhindern oder zu lindern.
  • Ferner könnte es durch die Verabreichung von Effektoren der QC-Aktivität an ein Säugetier möglich sein, die Zellproliferation des Magen-Darm-Trakts zu stimulieren, vorzugsweise die Proliferation von Zellen der Magenschleimhaut, Epithelzellen, akuter Säuresekretion und der Differenzierung der Säure produzierenden Belegzellen und Histamin-sekretierenden enterochromaffin-ähnlichen Zellen.
  • Darüber hinaus könnte die Verabreichung der QC-Inhibitoren an Säugetiere zu einem Verlust der Funktion einer Samenzelle führen, und damit zur Unterdrückung der männlichen Fruchtbarkeit. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Regulierung und Kontrolle der männlichen Fruchtbarkeit und die Verwendung von aktivitätsmindernden Effektoren der QC für die Herstellung von Arzneimitteln zur Empfängnisverhütung für Männer bereit.
  • Darüber hinaus kann es durch die Verabreichung von Effektoren der QC-Aktivität an ein Säugetier möglich sein, die Proliferation von myeloischen Vorläuferzellen zu supprimieren.
  • Die Verbindungen, eingesetzt gemäß der Erfindung, können dementsprechend in einer an sich bekannten Weise in übliche Formulierungen umgewandelt werden, wie z. B., beispielsweise Tabletten, Kapseln, Dragees, Pillen, Zäpfchen, Granulate, Aerosole, Sirupe, flüssige, feste und Creme-ähnliche Emulsionen und Suspensionen und Lösungen, unter Verwendung inerter, nicht giftiger, pharmazeutisch geeigneter Träger und Zusatzstoffe oder Lösungsmittel. In jeder dieser Formulierungen sind die therapeutisch wirksamen Verbindungen vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 80 Gew.-%, stärker bevorzugt von 1 bis 50 Gew.-%, der gesamten Mischung, vorhanden, d. h., in Mengen, die ausreichen, um die genannte Breite der Dosierung zu erhalten.
  • Die Substanzen können verwendet werden als Arzneimittel in der Form von Dragees, Kapseln, beißbaren Kapseln, Tabletten, Tropfen, Sirupen oder auch als Zäpfchen oder als Nasensprays.
  • Die Formulierungen können vorteilhaft hergestellt werden, zum Beispiel, indem der Wirkstoff gestreckt wird mit Lösungsmitteln und/oder Trägern, optional unter Verwendung von Emulgatoren und/oder Dispergiermitteln, wobei es möglich ist, zum Beispiel, in den Fällen, in denen Wasser als Verdünnungsmittel verwendet wird, optional organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel zu verwenden.
  • Beispiele für Hilfsstoffe, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen: Wasser, nicht toxische organische Lösungsmittel, wie z. B. Paraffine (z. B. Fraktionen von natürlichem Öl), Pflanzenöle (z. B. Rapsöl, Erdnussöl, Sesamöl), Alkohole (z. B. Ethylalkohol, Glycerol), Glykole (z. B. Propylenglykol, Polyethylenglykol); feste Trägerstoffe, wie z. B., beispielsweise natürliche Mineralien in Pulverform (z. B. hochdisperses Silica, Silikate), Zucker (z. B. Rohzucker, Laktose und Dextrose); Emulgatoren, wie z. B. nicht-ionische und anionische Emulgatoren (z. B. Polyoxyethylen-Fettsäureester, Polyoxyethylen-Fettalkoholether, Alkylsulfonate und Arylsulphonate), Dispergiermittel (z. B. Lignin, Sulfitlaugen, Methylcellulose, Stärke und Polyvinylpyrrolidon) und Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talkum, Stearinsäure und Natriumlaurylsulfat) und optional Aromastoffe.
  • Die Verabreichung kann auf übliche Weise erfolgen, vorzugsweise enteral oder parenteral, insbesondere oral. Im Falle der enteralen Verabreichung können Tabletten neben den genannten Trägern weitere Zusatzstoffe enthalten, wie z. B. Natriumcitrat, Calciumcarbonat und Calciumphosphat zusammen mit verschiedenen Zusätzen, wie z. B. Stärke, vorzugsweise Kartoffelstärke, Gelatine und dergleichen. Darüber hinaus können zur Tablettierung gleichzeitig Gleitmittel, wie z. B. Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talkum, verwendet werden. Im Fall von wässrigen Suspensionen und/oder Elixieren, bestimmt zur oralen Verabreichung, können verschiedene Geschmacksverbesserer und Farbstoffe zu den Wirkstoffen zusätzlich zu den oben genannten Hilfsstoffen zugesetzt werden.
  • Im Fall der parenteralen Verabreichung können Lösungen der Wirkstoffe unter Verwendung geeigneter flüssiger Träger eingesetzt werden. Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, im Fall der intravenösen Verabreichung, Mengen von etwa 0,01 bis 2,0 mg/kg, vorzugsweise etwa von 0,01 bis 1,0 mg/kg Körpergewicht pro Tag zu verabreichen, um effektive Ergebnisse zu erzielen und, im Fall der enteralen Verabreichung ist die Dosierung etwa 0,01 bis 2 mg/kg, vorzugsweise etwa von 0,01 bis 1 mg/kg Körpergewicht pro Tag.
  • Nichtsdestotrotz kann es jedoch in einigen Fällen notwendig sein, von den genannten Mengen abzuweichen, abhängig vom Körpergewicht des Versuchstieres oder des Patienten, oder von der Art des Verabreichungswegs, aber auch auf der Grundlage der Tierarten und ihrer individuellen Reaktion auf das Medikament oder dem Intervall, in welchem die Verabreichung erfolgt. Dementsprechend kann es in einigen Fällen ausreichend sein, weniger als die oben genannte Mindestmenge zu verwenden, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. In Fällen, in denen relativ große Mengen verabreicht werden, kann es ratsam sein, diese Mengen in mehrere Einzeldosen über den Tag zu verteilen. Für die Verabreichung in der Humanmedizin wird die gleiche Dosierungsbreite zur Verfügung gestellt. Die vorstehenden Ausführungen gelten in diesem Fall analog.
  • Beispiele für pharmazeutische Formulierungen
  • 1. Kapseln, enthaltend 100 mg einer Verbindung der Erfindung pro Kapsel:
  • Für etwa 10.000 Kapseln wird eine Lösung der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
    Verbindung der Erfindung 1.0 kg
    Glycerol 0.5 kg
    Polyethylenglykol 3.0 kg
    Wasser 0.5 kg
    5.0 kg
  • Die Lösung wird in weiche Gelatinekapseln in an sich bekannter Weise eingeführt. Die Kapseln sind geeignet zum Kauen oder zum Schlucken.
  • 2. Tabletten oder beschichtete Tabletten oder Dragees, enthaltend 100 mg einer Verbindung der Erfindung:
  • Die folgenden Mengen beziehen sich auf die Herstellung von 100.000 Tabletten: Verbindung der Erfindung,
    fein gemahlen 10,0 kg
    Glucose 4,35 kg
    Lactose 4,35 kg
    Stärke 4,50 kg
    Cellulose, fein gemahlen 4,50 kg
  • Die vorstehenden Bestandteile werden gemischt und dann mit einer Lösung versehen, hergestellt aus
    Polyvinylpyrrolidon 2,0 kg
    Polysorbat 0,1 kg
    und Wasser ca. 5,0 kg
    und in einer an sich bekannten Weise granuliert, indem die feuchte Masse durch ein Gitter gelassen wird und, nach der Zugabe von 0,2 kg Magnesiumstearat, getrocknet wird. Die fertige Tablettenmischung von 30,0 kg wird verarbeitet, um gewölbte Tabletten mit einem Gewicht von 300 mg zu bilden. Im Idealfall können die Tabletten in einer an sich bekannten Weise beschichtet oder mit Zucker beschichtet sein.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, durchgehend definiert in der Beschreibung, enthalten vorzugsweise eine Kombination aus mindestens einem Effektor der QC-Aktivität und mindestens einem DP IV-Inhibitor. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen sind besonders nützlich für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit und des Down-Syndroms.
  • Beispiel 1: Herstellung von humaner QC und Papaya QC
  • Wirtstämme und Medien
  • Pichia pastoris Stamm X33 (AOX1, AOX2), verwendet für die Expression von humaner QC wurde wachsen gelassen, transformiert und analysiert gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen). Die benötigten Medien für P. pastoris, d. h. gepuffertes Glycerol (BMGY) Komplex- oder Methanol (BMMY) Komplexmedium und das Basalsalzmedium zur Fermentation wurden nach den Empfehlungen des Herstellers zubereitet.
  • Molekulare Klonierung von Plasmidvektoren, die für die humane QC codieren
  • Alle Klonierungsverfahren wurden unter Anwendung von molekularbiologischen Standardverfahren durchgeführt. Für die Expression in Hefe wurde der Vektor pPICZαB (Invitrogen) verwendet. Der pQE-31 Vektor (Qiagen) wurde benutzt, um die humane QC in E. coli zu exprimieren. Die cDNA der reifen QC, beginnend mit Codon 38, wurde im Rahmen fusioniert mit dem durch das Plasmid codierten 6 × Histidin-Tag. Nach der Amplifikation unter Verwendung der Primer pQCyc-1 und pQCyc-2 (Tabelle 1) und Subklonierung wurde das Fragment in den Expressionsvektor unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen von SphI und HindIII eingefügt.
  • Transformation von P. pastoris und Expression im kleinen Maßstab
  • Plasmid-DNA wurde in E. coli JM109 amplifiziert und gereinigt gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Qiagen). In dem verwendeten Expressionsplasmid, pPICZαB, werden drei Restriktionsschnittstellen für die Linearisierung bereit gestellt. Da SacI und BstX1 innerhalb der cDNA von QC schneiden, wurde PmeI für die Linearisierung gewählt. 20–30 μg Plasmid-DNA wurden mit PmeI linearisiert, mit Ethanol gefällt, und in sterilem, entionisiertem Wasser gelöst. 10 μg der DNA wurden dann eingesetzt für die Transformation der kompetenten P. pastoris Zellen durch Elektroporation gemäß den Anweisungen des Herstellers (BioRad). Die Selektion erfolgte auf Platten, enthaltend 150 μg/ml Zeocin. Eine Transformation unter Verwendung des linearisierten Plasmids lieferte mehrere hundert Transformanten.
  • Um die rekombinanten Hefeklone auf QC-Expression zu testen, wurden die Rekombinanten für 24 h in 10 ml konischen Röhrchen, enthaltend 2 ml BMGY, wachsen gelassen. Anschließend wurde die Hefe zentrifugiert und resuspendiert in 2 ml BMMY, enthaltend 0,5% Methanol. Diese Konzentration wurde aufrecht erhalten durch Zugabe von Methanol, alle 24 h bis 72 h. Anschließend wurde die QC-Aktivität im Überstand bestimmt. Das Vorhandensein des Fusionsproteins wurde mittels Western Blot-Analyse unter Verwendung eines gegen das 6 × Histidin-Tag gerichteten Antikörpers (Qiagen) bestätigt. Klone, die die höchste QC-Aktivität zeigten, wurden für weitere Experimente und die Fermentation ausgewählt.
  • Expression in einem Fermenter in großem Maßstab
  • Die Expression von QC wurde durchgeführt in einem 51 Reaktor (Biostat B, B. Braun Biotech), im Wesentlichen, wie beschrieben in den "Richtlinien für den Fermentationsprozess für Pichia" (Invitrogen). Kurz gesagt, die Zellen wurden wachsen gelassen in dem Basalsalzmedium für die Fermentation, supplementiert mit Spuren von Salzen und mit Glycerol als einziger Kohlenstoffquelle (pH 5,5). In einer ersten Batchphase für etwa 24 h und einer anschließenden Fed-Batch-Phase für etwa 5 h wurde Zellmasse angesammelt. Sobald ein Zellnassgewicht von 200 g/l erreicht war, wurde eine Induktion der QC-Expression unter Verwendung von Methanol durchgeführt, wobei ein dreistufiges Fütterungsprofil über die gesamte Gärungszeit von etwa 60 h eingesetzt wurde. Anschließend wurden die Zellen aus dem QC-enthaltenden Überstand entfernt durch Zentrifugation bei 6000 × g, 4°C für 15 min. Der pH-Wert wurde auf 6,8 durch Zugabe von NaOH eingestellt, und die daraus resultierende trübe Lösung wurde erneut zentrifugiert bei 37000 × g, 4°C für 40 min. In Fällen fortgesetzter Trübung wurde ein zusätzlicher Filtrationsschritt unter Verwendung einer Cellulosemembran (Porenweite 0,45 μm) angewandt.
  • Reinigung von mit 6 × Histidin-Tag versehener QC, exprimiert in P. pastoris
  • Die mit His-Tag versehene QC wurde zuerst durch immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC) gereinigt. In einer typischen Reinigung wurden 1000 ml Kulturüberstand aufgetragen auf eine mit Ni2+-beladene chelatierende Sepharose FF-Säule (1,6 × 20 cm, Pharmacia), die mit 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, enthaltend 750 mM NaCl, bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min äquilibriert wurde. Nach dem Waschen mit 10 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer und 5 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer, enthaltend 5 mM Histidin, wurde das gebundene Protein eluiert durch einen Wechsel zu 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, enthaltend 150 mM NaCl und 100 mM Histidin. Das daraus resultierende Eluat wurde gegen 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 6,8, bei 4°C über Nacht dialysiert. Anschließend wurde die QC weiter gereinigt durch Anionenaustauschchromatographie auf einer Mono Q6 Säule (BioRad), äquilibriert mit Dialysepuffer. Die QC-haltige Fraktion wurde auf die Säule aufgetragen mit einer Fließgeschwindkeit von 4 ml/min. Die Säule wurde dann mit Äquilibrierungspuffer, enthaltend 100 mM NaCl gewaschen. Die Elution wurde mit zwei Gradienten durchgeführt, und resultierend mit 30 Säulenvolumen und 5 Säulenvolumen von einem Äquilibrierungspuffer, enthaltend 240 mM bzw. 360 mM NaCl. 6 ml Fraktionen wurden gesammelt und die Reinheit wurde durch SDS-PAGE analysiert. Fraktionen, enthaltend homogene QC, wurden zusammengefasst und durch Ultrafiltration konzentriert. Für die Langzeitlagerung (–20°C), wurde Glycerol zu einer Endkonzentration von 50% zugefügt. Protein wurde gemäß dem Verfahren von Bradford oder Gill und von Hippel (Bradford, M. M. 1976 Anal Biochem 72, 248-254; Gill, S. C. und von Hippel, P. H. 1989 Anal Biochem 182, 319-326.) quantifiziert.
  • Expression und Reinigung von QC in E. coli
  • Das Konstrukt, das für QC codiert, wurde transformiert in M15-Zellen (Qiagen) und auf selektiven LB Agarplatten bei 37°C wachsen gelassen. Die Proteinexpression wurde in LB-Medium, enthaltend 1% Glucose und 1% Ethanol, bei Raumtemperatur durchgeführt. Wenn die Kultur einen OD600 von etwa 0,8 erreichte, wurde die Expression mit mit 0,1 mM IPTG über Nacht induziert. Nach einem Zyklus von Einfrieren und Auftauen wurden die Zellen bei 4°C durch Zugabe von 2,5 mg/ml Lysozym in 50 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, enthaltend 300 mM NaCl und 2 mM Histidin, für etwa 30 min. lysiert. Die Lösung wurde geklärt durch Zentrifugation bei 37000 × g, 4°C für 30 min, gefolgt von einer Filtration unter Anwendung einer Glasfritte (DNA-Trennung) und zwei weiteren Filtrationsschritten unter Anwendung von Cellulosefiltern für Rohpräzipitate und feine Präzipitate. Der Überstand (etwa 500 ml) wurde aufgetragen auf eine Ni2+-Affinitätssäule (1,6 × 20 cm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min. Die Elution der QC wurde ausgeführt mit 50 mM Phosphatpuffer, enthaltend 150 mM NaCl und 100 mM Histidin. Die QC-haltige Fraktion wurde durch Ultrafiltration konzentriert.
  • Reinigung von QC aus Papay Latex
  • QC aus Papaya Latex wurde hergestellt unter Verwendung des BioCAD 700E (Perseptive Biosystems, Wiesbaden, Deutschland) mit einer modifizierten Version eines bereits berichteten Verfahrens (Zerhouni, S. et al. 1989 Biochim Biophys Acta 138, 275-290). 50 g Latex wurde in Wasser gelöst und zentrifugiert, wie darin beschrieben. Die Inaktivierung der Proteasen wurde durchgeführt mit S-Methylmethanthiosulfonat und der daraus resultierende Rohextrakt wurde dialysiert. Nach der Dialyse wurde der gesamte Überstand geladen auf eine (21 × 2,5 cm i. d.) SP Sepharose Fast Flow Säule, äquilibriert mit 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,0 (Fließgeschwindigkeit 3 ml/min). Die Elution wurde durchgeführt in drei Schritten durch die Erhöhung der Konzentration des Natriumacetatpuffers bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min. Der erste Schritt war ein linearer Gradient von 0,1 bis 0,5 M Acetatpuffer in 0,5 Säulenvolumen. Der zweite Schritt war eine lineare Erhöhung der Pufferkonzentration von 0,5 auf 0,68 M in vier Säulenvolumen. Während des letzten Elutionsschritts wurde ein Säulenvolumen mit 0,85 M Puffer aufgetragen. Fraktionen (6 ml), enthaltend die höchste enzymatische Aktivität wurden zusammen gefasst. Die Konzentration und Pufferänderungen zu 0,02 M Tris/HCl, pH 8,0 wurden mittels Ultrafiltration (Amicon; Molekulargewichtsgrenze (cut-off) der Membran 10 kDa) durchgeführt.
  • Ammoniumsulfat wurde zu einer Endkonzentration von 2 M zugefügt zu dem konzentrierten Papaya Enzym, erhalten aus dem Ionenaustauschchromatographie-Schritt. Diese Lösung wurde aufgetragen auf eine (21 × 2,5 cm i. d.) Butyl Sepharose 4 Fast Flow Säule (Fließgeschwindigkeit 1,3 ml/min), äquilibriert mit 2 M Ammoniumsulfat, 0,02 M Tris/HCl, pH 8,0. Die Elution wurde in drei Schritten mit abnehmenden Konzentrationen von Ammoniumsulfat durchgeführt. Während des ersten Schritts wurde ein linearer Gradient von 2 bis 0,6 M Ammoniumsulfat, 0,02 M Tris/HCl, pH 8,0 angewandt für 0,5 Säulenvolumen bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,3 ml/min. Der zweite Schritt war ein linearer Gradient von 0,6 bis 0 M Ammoniumsulfat, 0,02 M Tris/HCl, pH 8,0, in 5 Säulenvolumen bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/min. Der letzte Elutionsschritt wurde ausgeführt durch Auftragung von 2 Säulenvolumen 0,02 M Tris/HCl bei pH 8,0 bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/min. Alle Fraktionen, die QC-Aktivität enthielten, wurden vereinigt und durch Ultrafiltration konzentriert. Die resultierende homogene QC wurde bei –70°C gelagert. Die Endkonzentrationen des Proteins wurden ermittelt nach dem Verfahren von Bradford, im Vergleich zu einer Standardkurve, erhalten mit Rinderserumalbumin.
  • Beispiel 2: Assays für Glutaminyl-Cyclase Aktivität
  • Fluorometrische Assays
  • Alle Messungen wurden bei 30°C durchgeführt mit einem Bioassay Reader HTS-7000 Plus für Mikrotiterplatten (Perkin Elmer). QC-Aktivität wurde fluorometrisch bewertet unter Verwendung von H-Gln-βNA. Die Proben bestanden aus 0,2 mM fluorogenem Substrat, 0,25 U Pyroglutamyl-Aminopeptidase (Unizyme, Hørsholm, Dänemark) in 0,2 M Tris/HCl, pH 8,0, enthaltend 20 mM EDTA und ein entsprechend verdünntes Aliquot von QC in einem Endvolumen von 250 μl. Anregungs-/Emissionswellenlängen waren 320/410 nm. Die Assay-Reaktionen wurden durch Zugabe von Glutaminylcyclase gestartet. Die QC-Aktivität wurde bestimmt aus einer Standardkurve von β-Naphthylamin unter Assay-Bedingungen. Eine Einheit wird definiert als die Menge von QC, die die Bildung von 1 μmol pGlu-βNA aus H-Gln-βNA pro Minute unter den beschriebenen Bedingungen katalysiert.
  • In einem zweiten fluorometrischen Assay wurde die QC-Aktivität unter Verwendung von H-Gln-AMC als Substrat bestimmt. Die Reaktionen wurden bei 30°C unter Nutzung des Novostar Reader für Mikrotiterplatten (BMG labtechnologies) durchgeführt. Die Proben bestanden aus unterschiedlichen Konzentrationen des fluorogenen Substrats, 0,1 U Pyroglutamyl-Aminopeptidase (Qiagen) in 0,05 M Tris/HCl, pH 8,0, enthaltend 5 mM EDTA und ein geeignet verdünntes Aliquot von QC in einem Endvolumen von 250 μl. Anregungs-/Emissionswellenlängen waren 380/460 nm. Die Assay-Reaktionen wurden durch Zugabe von Glutaminylcyclase gestartet. QC-Aktivität wurde aus einer Standardkurve von 7-Amino-4-methylcumarin unter Assay-Bedingungen bestimmt. Die kinetischen Daten wurden unter Verwendung der Software GraFit ausgewertet.
  • Spektrophotometrischer Assay für QC
  • Dieser neue Assay wurde verwendet, um die kinetischen Parameter für die meisten Substrate von QC zu bestimmen. QC-Aktivität wurde spektrophotometrisch analysiert unter Verwendung von einem kontinuierlichen Verfahren, das erhalten wurde, indem ein früherer diskontinuierlicher Assay (Bateman, R. C. J. 1989 J Neurosci Methods 30, 23-28), der Glutamatdehydrogenase als Hilfsenzym verwendet, angepasst wurde. Die Proben bestanden aus dem jeweiligen QC-Substrat, 0,3 mM NADH, 14 mM α-Ketoglutarsäure und 30 U/ml Glutamatdehydrogenase in einem Endvolumen von 250 μl. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von QC gestartet und verfolgt durch Beobachtung der Abnahme der Absorption bei 340 nm für 8–15 min. Typische Zeitverläufe der Produktbildung sind in 1 dargestellt.
  • Die Anfangsgeschwindigkeiten wurden ausgewertet und die enzymatische Aktivität wurde aus einer Standardkurve von Ammoniak unter Assay-Bedingungen bestimmt. Alle Proben wurden bei 30°C gemessen, entweder unter Verwendung des SPECTRAFluor Plus oder des Sunrise (beide von TECAN) Reader für Mikrotiterplatten. Die kinetische Daten wurden unter Verwendung der Software GraFit ausgewertet.
  • Inhibitor-Assay
  • Zum Test eines Inhibitors war die Probenzusammensetzung die gleiche, wie vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, dass die vermeintlich hemmende Inhibitorverbindung zugefügt wurde. Für einen schnellen Test der QC-Hemmung enthielten die Proben 4 mM des jeweiligen Inhibitors und eine Substratkonzentration von 1 KM. Für detaillierte Untersuchungen der Hemmung und die Bestimmung von Ki-Werten, wurde zuerst der Einfluss des Inhibitors auf die Hilfsenzyme untersucht. In allen Fällen wurde kein Einfluss auf das jeweilige Enzym beobachtet, und somit war eine zuverlässige Bestimmung der QC-Hemmung möglich. Die Inhibitorkonstante wurde ausgewertet, indem der Satz von Verlaufskurven an die allgemeine Gleichung für kompetitive Hemmung unter Verwendung von der Software GraFit angepasst wurde.
  • Beispiel 3: MALDI-TOF Massenspektrometrie
  • Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation (Matrix-assisted Laser Desorption/Ionisation, MALDI) Massenspektrometrie wurde ausgeführt unter Verwendung des Hewlett-Packard G2025 LD-TOF Systems mit einem linearen Flugzeit-Analysator (time of flight analyzer). Das Instrument wurde ausgerüstet mit einem 337 nm Stickstoff-Laser, einer Ionenbeschleunigerquelle (potential acceleration source) (5 kV) und einer 1,0 m Flugöhre. Der Detektorbetrieb erfolgte im Positiv-Ionenmodus und die Signale wurden aufgezeichnet und gefiltert unter Verwendung eines LeCroy 9350M digitalen Speicheroszilloskops, das mit einem PC verbunden war. Die Proben (5 μl) wurden mit gleichen Volumen der Matrixlösung gemischt. Für die Matrixlösung verwendeten wir DHAP/DAHC, hergestellt, indem 30 mg 2,6-Dihydroxyacetophenon (Aldrich) und 44 mg Diammoniumhydrogencitrat (Fluka) in 1 ml Acetonitril/0,1% TFA in Wasser (1/1, v/v) gelöst wurden. Ein kleines Volumen (1 μl) der Matrix-Analyt-Mischung wurde zu einer Sondenspitze überführt und sofort in einer Vakuumkammer verdampft (Hewlett-Packard G2024A Probenvorbereitungszubehör), um eine schnelle und homogene Probenkristallisation zu gewährleisten.
  • Für die Langzeituntersuchungen der Glu1-Cyclisierung wurden Aβ-abgeleitete Peptide in 100 μl 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,2 oder 0,1 M Bis-Tris Puffer, pH 6,5 bei 30°C inkubiert. Die Peptide wurden aufgetragen in Konzentrationen von 0,5 mM [Aβ3-11a] oder 0,15 mM [Aβ3-21a] und 0,2 U QC wurde alle 24 Stunden hinzugefügt. Im Fall von Aβ3-21a enthielten die Assays 1% DMSO. Zu verschiedenen Zeiten wurden die Proben aus dem Assay-Röhrchen entnommen, die Peptide unter Verwendung von ZipTips (Millipore) nach Angaben des Herstellers extrahiert, mit Matrixlösung (1:1 v/v) gemischt und anschließend die Massenspektren aufgenommen. Negativkontrollen enthielten entweder kein QC oder Hitze deaktiviertes Enzym. Für die Inhibitoruntersuchungen war die Probenzusammensetzung die gleiche, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass die hemmende Verbindung zugefügt war (5 mM Benzimidazol oder 2 mM 1,10-Phenanthrolin).
  • Beispiel 4: pH-Abhängigkeit
  • Die pH-Abhängigkeit der Katalyse von humaner und Papaya QC wurde untersucht unter Geschwindigkeitsbedingungen 1. Ordnung, um dadurch die Auswirkungen der Protonenkonzentration auf die Spezifitätskonstante kcat/KM wiederzugeben. Zu diesem Zweck wurde der gekoppelte Enzymassay unter Verwendung von Pyroglutamyl-Aminopeptidase als Hilfsenzym und Gln-βNA als Substrat verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass Pyroglutamyl-Aminopeptidase aktiv und stabil zwischen pH 5,5–8,5 ist (Tsuru, D. et al. 1978 J Biochem (Tokyo) 84, 467-476). Somit ermöglichte der Assay die Untersuchung der QC-Katalyse in diesem pH-Bereich. Die erhaltenen Geschwindigkeitsprofile wurden an klassische glockenförmige Kurven angepasst, wie in 2 gezeigt. Die humane QC zeigt eine sehr enge pH-Abhängigkeit mit einem Optimum bei etwa pH 7,8–8,0. Bei basischerem pH tendierte die Geschwindigkeit dazu, sich zu verringern. Dies steht im Gegensatz zu dem für Papaya QC beobachteten Geschwindigkeitsprofil, das keinen Rückgang der Aktivität bis pH 8,5 zeigte (2, Einschub). Allerdings hatten beide Enzyme ihre optimale Spezifität bei pH 8. Überraschenderweise offenbarte die Auswertung der Kurven identische PKa-Werte im sauren Bereich von 7,17 ± 0,02 und 7,15 ± 0.02 für humane bzw. Papaya QC.
  • Die Abnahme der Aktivität der humanen QC bei basischen pH-Werten war offensichtlich bedingt durch die Dissoziation einer Gruppe mit einem pKa von etwa 8,5. Im Fall von Papaya QC war keine übermäßige Datenpunktsammlung im basischen pH-Bereich möglich, um eine zuverlässige Bestimmung des zweiten pKa-Wertes zu ermöglichen. Dies wird gestützt durch die Anpassung der Daten an ein Einzeldissoziationsmodell, das in einem nahezu identischen pKa-Wert (pKa 7,13 ± 0,03) resultiert, verglichen mit einer Anpassung der Daten an ein Zweifachdisssoziationsmodell. Dies deutet darauf hin, dass beide pKa-Werte ziemlich getrennt sind.
  • pH-Stabilität
  • Die Stabilität der Glutaminyl-Cyclasen wurde untersucht, indem die pflanzlichen und tierischen Enzyme bei 30°C für 30 min bei unterschiedlichen pH-Werten zwischen pH 4–10 inkubiert wurden. Danach wurde die QC-Aktivität unter Standardbedingungen bestimmt. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
  • Die QC aus Papaya Latex war stabil im untersuchten pH-Bereich, ohne eine offensichtliche Tendenz für eine Instabilität im sauren oder basischen Bereich. Im Gegensatz dazu zeigte die humane QC nur eine vergleichbare Stabilität im pH-Bereich zwischen 7 und 8,5, was eine bemerkenswerte Instabilität bei pH-Werten oberhalb von pH 8,5 und unterhalb von 6 anzeigt. Somit scheint der Bereich um pH 8 optimal zu sein für die Aktivität und die Stabilität der pflanzlichen und humanen QC, und ein geeigneter pH-Wert für die Durchführung eines Vergleichs der Substratspezifität der QCs.
  • Beispiel 5: Bestimmung der Substratspezifität von QC
  • Spektrophotometrischer Assay
  • Der kontinuierliche spektrophotometrische Assay wurde durchgeführt wie in Beispiel 2 beschrieben. Entsprechend wird die QC-Aktivität durch eine Abnahme der Absorption bei 340 nm wieder gespiegelt, verursacht durch die Freisetzung von Ammoniak und anschließendem Verbrauch von NADH/H+ auf Grund der Bildung von Glutamat aus α-Ketoglutarsäure. Wie in 1 gezeigt, wurden lineare Verlaufskurven beobachtet und es gab eine lineare Beziehung zwischen der gemessenen Aktivität und der Konzentration der QC. Darüber hinaus waren die kinetischen Parameter, erhalten für H-Gln-Gln-OH unter Verwendung des hierin präsentierten kontinuierlichen Assay (Tabelle 1), in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen, erhalten unter Verwendung des diskontinuierlichen Assay (KM = 175 ± 18 μM, kcat = 21.3 ± 0.6 s–1). Darüber hinaus sind die in Tabelle 1 gezeigten kinetischen Parameter für die Umwandlung der Substrate H-Gln-Ala-OH, H-Gln-Glu- OH, H-Gln-Gln-OH, H-Gln-OtBu und H-Gln-NH2 durch Papaya QC in guter Übereinstimmung mit denen, die unter Verwendung eines direkten Verfahrens bei pH 8,8 und 37°C bestimmt wurden (Gololobov, M. Y. et al. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395-398). Damit ist es ziemlich offensichtlich, dass der neue kontinuierliche Assay zuverlässige Ergebnisse liefert.
  • Di-, Tri- und Dipeptid-Surrogate
  • Unter Verwendung des neuen vorstehend beschriebenen kontinuierlichen Assay wurden etwa 30 Verbindungen als mögliche Substrate von QC aus C. papaya und humaner QC getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Durch Vergleich der Spezifitäten wurde gezeigt, dass nahezu alle kurzen Peptidsubstrate effizienter durch Papaya QC umgewandelt wurden, im zu dem humanen Enzym. Interessant ist, dass für beide Enzyme Substrate mit großen hydrophoben Resten an der Position zwei die wirksamsten Substrate sind, wie gezeigt durch die Spezifitäten für H-Gln-Tyr-Ala-OH, H-Gln-Phe-Ala-NH2 und H-Gln-Trp-Ala-NH2 im Vergleich zu denen anderer Tripeptide oder den Reaktivitäten der chromophoren Substrate H-Gln-AMC, H-Gln-βNA und H-Gln-Tyr-OH im Vergleich zu Dipeptidsubstraten. Für Papaya QC steht diese Feststellung im Einklang mit früheren Ergebnissen, die zeigen, dass die Spezifität mit der Größe des zweiten Aminosäurerestes korreliert (Gololobov, M. Y. et al. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395-398). Der einzige auffallende Unterschied in der Spezifität der pflanzlichen und tierischen QC wurde im Fall von H-Gln-OtBu beobachtet. Während der Ester von Papaya QC mit ähnlicher Spezifität im Vergleich zu Dipeptidsubstraten umgewandelt wurde, wurde er etwa um eine Größenordnung langsamer durch humane QC umgewandelt.
  • Oligopeptide
  • Neben mehreren Dipeptiden und Tripeptiden wurde eine Reihe von Oligopeptiden getestet auf die Umwandlung durch Papaya QC und humane QC (Tabelle 5). Interessant ist, dass im Ganzen der Unterschied in den Spezifitäten zwischen humaner und pflanzlicher QC für eine Reihe von Tetrapeptiden nicht so groß war, wie er für Dipeptid- und Tripeptidsubstraten beobachtet wurde. Dies deutet darauf hin, dass die Aminosäuren an Position 3 und 4 noch Einfluss auf das kinetische Verhalten haben, vor allem bei humaner QC. Eine Ausnahme stellen jedoch die Peptide mit einem Prolinrest an der Position der zweiten Aminosäure dar, die deutlich verringerte kcat/KM-Werte in einer Reihe von Tetrapeptiden mit der Struktur H-Gin-Xaa-Tyr-Phe-NH2 zeigen (Tabelle 5). Die Verringerung der Spezifität war ausgeprägter für humane QC, was zu einem etwa 8-fachen Unterschied bei den kcat/KM-Werten, verglichen mit Papaya QC, führt.
  • Leicht verringerte Spezifitäten der humanen QC wurden auch für die Umwandlung von Substraten mit einer positiv geladenen Aminosäure C-terminal zu Glutamin beobachtet, wie angezeigt durch die Spezifitäten für H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2, H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2 und H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2 im Vergleich zu anderen Tetrapeptiden. Offenbar war die verringerte Spezifität vor allem auf einen geringere Umsatzzahl (turnover number) zurück zu führen. Dieser Effekt trat im Fall des pflanzlichen Enzyms nicht auf.
  • Tabelle 5: Kinetische Auswertung von Peptidsubstraten der humanen und Papaya QC (n. r., nicht reaktiv; n. i., keine Hemmung; n. d., nicht bestimmt; *, für Substrathemmung)
    Figure 00560001
  • Die mit den Tetrapeptiden erzielten Ergebnisse lassen auch eine andere Schlussfolgerung zu. Wie bereits erwähnt, zeigte Papaya QC eine höhere Selektivität für Dipeptide. Für einige der Tetrapeptide wurden jedoch höhere Spezifitätskonstanten mit der humanen QC beobachtet, wie in 4 gezeigt, die eine graphische Darstellung der in Tabelle 5 angegeben Daten bereit stellt, für eine Reihe von Peptiden, die Glutamat an der zweiten Aminosäureposition enthalten. Weiterhin nimmt die Selektivität der humanen QC mit steigender Kettenlänge von Di- zu Tetrapeptiden zu, im Gegensatz zu den Ergebnissen die mit Papaya QC erhalten wurden. Darüber hinaus wurde die höchste Selektivität der humanen QC für die Peptide aufgezeichnet, die einen sperrigen hydrophoben Rest an der 3. und 4. Aminosäureposition enthalten, was auf hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Enzym hindeutet. Durch den Vergleich der kinetischen Parameter für die jeweiligen Peptide scheinen die Änderungen vor allem auf die niedrigeren KM-Werte zurück zu führen zu sein, für die Umsatzzahlen für die Umwandlung der Peptide wurde festgestellt, dass sie ähnlich sind. Somit wird angenommen, dass die höhere Selektivität der humanen QC für längere Peptide das Ergebnis einer festeren Bindung des hydrophoberen Substrates an das Enzym ist.
  • Die Unterschiede zwischen humaner und pflanzlicher QC, beobachtet mit Peptiden, die hydrophobe Aminosäuren an der 3. und 4. Position entahlten, wird auch deutlich durch einen Vergleich der Spezifitätskonstanten der Enzyme gegenüber H-Gln-Gly-Arg-Ile-NH2 und H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2 oder H-Gln-Gln-OH und H-Gln-Gln-Tyr-Phe-OH.
  • Für humane QC wurde auch gefunden, dass sie selektiver für homologe Substrate ist, die N-terminal Gln und eine wachsende Zahl von C-terminalen Ala Resten enthalten (Tabelle 6). Während die Selektivität der humanen QC mit der Substratlänge steigt, gab es keinen solche Tendenz bei der Papaya QC. Da die humane QC weniger spezifisch für ein Peptid mit einem Ser Rest in der Sequenz war, scheint auch die Art der Seitenkette von Bedeutung zu sein (Tabelle 6).
  • Tabelle 6: Einfluss der Substratlänge auf die Aktivität von humaner und Papaya QC
    Figure 00570001
  • Einfluss der Ionenstärke auf die Katalyse
  • Ein weiterer Parameter, der im Hinblick auf seinen Einfluss auf die Substratspezifität untersucht wurde, war die Ionenstärke. Zu diesem Zweck wurden die kinetischen Parameter für die Cyclisierung von mehreren Substraten in Gegenwart und Abwesenheit von 0,5 M KCl bestimmt (Tabelle 7). Überraschenderweise änderte sich im Fall der QC aus Papaya Latex und humaner QC die Selektivität für Substrate mit ungeladenem Rückgrat nicht wesentlich durch Zugabe von Salz. Die Spezifitätskonstanten der humanen QC für H-Gln-Ala-OH und H-Gln-Glu-OH nahmen durch die Zugabe von KCl jedoch ab. Wie durch die individuellen kinetischen Parameter angedeutet, war dieser Effekt auf eine Zunahme von KM und eine nur leichte Abnehme des kcat-Wertes zurück zu führen. Im Fall von Papaya QC gab es keinen Effekt auf einen der bestimmten Parameter. Der Effekt schien nicht auf das negativ geladene Substrat als solches zurück zu führen sein, da unveränderte Parameter für das negativ geladene Peptid H-Gln-Glu-Asp-Leu-NH2 gefunden wurden. Ein interessanter Effekt der Salzzugabe wurde für die positiv geladenen Substrate H-Gln-Gly-Arg-Ile-NH2 und H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2 gefunden. Im Fall von pflanzlicher und humaner QC wurde ein positiver Effekt auf die Katalyse bestimmt, hauptsächlich auf Grund eines geringeren KM-Wertes und einer leicht höheren Umsatzzahl.
  • Tabelle 7: Einfluss der Ionenstärke auf die Katalyse von humaner und Papaya QC
    Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Physiologische Substrate
  • In früheren Studien wurde die Umwandlung von [Gln1]-TRH und [Gln1]-GnRH durch QC bereits gezeigt für die QC aus Rinder- und Schweine-Hypophyse (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem. 262, 8532-8536; Fischer, W. H. und Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 3628-3632). Zusätzlich zu diesen bereits untersuchten Hypophysenhormonen wurden drei mögliche physiologische Substrate der humanen QC synthetisiert und die auf Umwandlung getestet, nämlich [Gln1]Gastrin, [Gln1]Neurotensin und [Gln1]FPP. Die kinetischen Parameter für ihre Umwandlung sind in Tabelle 1 aufgeführt. Interessanterweise werden die Glutaminyl-Peptide zu den jeweiligen Pyroglutamyl-Peptiden umgewandelt mit zunehmenden Spezifitätskonstanten in Abhängigkeit von ihrer Größe, d. h. Zuerst das größte Peptid pro-Gastrin mit 17 Aminosäuren, gefolgt von pro-Neurotensin, pro-GnRH, Pro-TRH und pro-FPP. Diese Feststellungen entsprechen den Daten, die mit den synthetischen Peptiden erhalten wurden.
  • Überraschenderweise werden auch die längeren Substrate mit höherer Selektivität durch das pflanzliche Enzym umgewandelt, ein Ergebnis, das zum Teil den Ergebnissen für die kürzeren Oligopeptide widerspricht. Möglicherweise gibt es weit vom aktiven Zentrum entfernte sekundäre Bindungswechselwirkungen zwischen Substrat und Enzym.
  • Peptide mit modifizierten Aminosäuren
  • Um die Spezifität und Selektivität der QCs weiter zu untersuchen, wurden Peptide synthetisiert, die entweder einen modifizierten N-terminalen Glutaminylrest oder eine modifizierte Aminosäure an der Position 2 enthalten. Die Umwandlung dieser Peptide wurde qualitativ unter Verwendung von MALDI-TOF Massenspektrometrie untersucht (siehe auch Beispiel 3). Auf Grund der Cyclisierung des Glutaminylrestes bzw. seinem Analogon wird für das Substrat und das Produkt der Katalyse eine Massendifferenz erkannt; ein Mol pro Mol Substrat in Fällen der Freisetzung von Ammoniak. Die Umwandlung wurde auch quantitativ unter Verwendung von dem spektrophotometrischen Assay analysiert.
  • H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2. Dieses N-terminal verzweigte Peptid, das zwei Glutaminylreste am N-Terminus enthält, die via einer Peptid- und partiellen Isopeptidbindung an einen Lysylrest gebunden sind, wurde durch humane QC (5) und Papaya QC (nicht dargestellt) auf scheinbar identische Art umgewandelt. Beide Glutaminylreste wurden in Pyroglutaminsäure umgewandelt, ohne irgendeine nachweisbare Präferenz für einen bestimmten Rest, wie angezeigt durch die konsistente Substratumwandlung (5). Somit unterscheidet sich die Selektivität der QCs für die unterschiedlich gebundenen Glutaminylreste nicht grundlegend.
  • H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2. Der methylierte Glutaminylrest wurde nur von Papaya QC in einen Pyroglutamylrest umgewandelt (6). Darüber hinaus wurde keine Hemmung der humanen QC durch das Peptid beobachtet, was darauf hinweist, dass der methylierte Rest von humaner QC nicht erkannt wird.
  • H-Glu(OMe)-βNA und H-Glu-βNA. Keine dieser Verbindungen wurde durch Papaya QC oder humane QC umgewandelt. Diese fluorogenen Substrate wurden fluorometrisch analysiert unter Verwendung von Pyroglutamyl-Aminopeptidase als Hilfsenzym. Der O-methylierte Glutamatrest zeigte jedoch eine bemerkenswerte Instabilität sowohl in Tris- als auch in Tricin-Puffer, mit der Tendenz zu einer nicht-enzymatisch katalysierten Cyclisierung. Weiterhin wurde die Aktivität von beiden QCs gegenüber H-Gln-AMC als Substrat nicht durch die längeren Peptide H-Glu(OMe)-Phe-Lys-Arg-Ala-Leu-NH2 oder H-Glu-Phe-Lys-Arg-Ala-Leu-NH2 gehemmt, was darauf hinweist, dass Glutaminsäure oder Derivate von beiden QC Formen nicht erkannt werden. Außerdem impliziert das Ergebnis, dass nicht nur die negative Ladung des Glutaminsäurerestes der Grund für die Verdrängung des Peptids aus dem aktiven Zentrum ist.
  • H-Gln-cyclo(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe). Die Umwandlung von H-Gln-cyclo(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe), welches eine partielle intramolekulare Isopeptidbindung enthält, wurde quantitativ analysiert, wobei ein KM-Wert von 240 ± 14 μM und 133 ± 5 μM für humane bzw. Papaya QC ermittelt wurde. Auf Grund der höheren Umwandlungszahl für die Umwandlung durch Papaya QC (49,4 ± 0,6 s–1) im Vergleich zu humaner QC (22,8 ± 0,6 s–1), zeigt das pflanzliche Enzym mit 372 ± 9 mM–1min–1 einen etwa 4-fach höheren kcat/KM-Wert als die humane QC. Somit ist die Spezifitätskonstante im Fall der Papaya QC nur leicht niedriger im Vergleich zu Substraten mit einer ähnlichen Größe, wie z. B. H-Gin-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-NH2. Der mit 95 ± 3 mM–1s–1 ermittelte kcat/KM-Wert für humane QC war jedoch etwa eine Größenordnung kleiner bei Vergleich mit Substraten ähnlicher Größe (Tabelle 5).
  • H-βhomoGln-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2. Der N-terminale β-Homoglutaminylrest wurde durch Katalyse mit humaner bzw. Papaya QC in einen fünfgliedrigen Lactamring umgewandelt. Die gleichzeitige Freisetzung von Ammoniak wurde spektrophotometrisch und mittels MALDI-TOF Analyse, wie zuvor beschrieben, analysiert. Es wurde keine Freisetzung von Ammoniak beobachtet, wenn QC weggelassen oder gekocht wurde, was auf eine spezifische Katalyse der Cyclisierung anzeigt. Interessanterweise katalysieren die QC aus C. papaya (KM = 3,1 ± 0,3 mM, kcat = 4,0 ± 0,4 s–1) und humane QC (KM = 2,5 ± 0,2 mM, kcat = 3,5 ± 0,1 s–1) die Umwandlung dieses Peptids mit nahezu identischen kcat/KM-Werten von 1,4 ± 0,1 bzw. 1,3 ± 0,1 mM–1s–1. Somit wird die Cyclisierung des β-Homoglutaminrestes mit einer etwa 1000-fach geringeren Effizienz katalysiert im Vergleich zu Peptiden ähnlicher Größe, die einen Glutaminylrest an ihrem N-Terminus enthalten. Dies zeigt, dass die Konstitution des α-Kohlenstoffs des Substrats wichtig für die Substraterkennung durch die QC Formen ist, aber nicht essentiell. Die essentielle Voraussetzung, um ein Substrat zu sein, ist eine γ-Amidgruppe und eine unprotonierte N-terminale Aminogruppe in einem zur Cyclisierung neigenden Abstand und Winkel, eine Voraussetzung, die von N-terminalen Glutaminyl- und Homoglutaminylresten erfüllt wird.
  • Beispiel 6: Synthese der QC-Substrate
  • Oligopeptide. Peptide wurden halbautomatisch in einem 0,5 mmol Maßstab synthetisiert unter Verwendung von einem Peptidsynthesizer (Labortec SP650, Bachem, Schweiz), wie zuvor beschrieben (Schilling, S. et al. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857). Längere Peptide wurden in einem 25 μmol Maßstab synthetisiert unter Verwendung des automatischen Symphony Peptidsynthesizer (Rainin Instrument Co.), wie beschrieben (Manhart, S. et al. 2003 Biochemistry 42, 3081-3088). Für alle Peptidkupplungen wurden modifizierte Fmoc-Protokolle für die Festphasen Peptidsynthese eingesetzt unter Verwendung von 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TBTU; Novabiochem)/Base (Diisopropylethylamin oder N-Methylmorpholin, Merck) oder im Fall von schwierigen Kupplungen wurde N-[(Dimethylamino)-1H- 1,2,3,-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylen]-N-methylmethanamminium hexafluorphosphat N-oxid (4,5) (HATU; Applied Biosystems)/Diisopropylethylamin als Aktivierungsreagenz verwendet. Nach Abspaltung vom Harz mit Trifluoressigsäure (TFA, Merck)-enthaltendem Cocktail, wurde das rohe Peptid durch präparative HPLC mit säurefreien Lösungsmitteln gereinigt, um eine weitere Cyclisierung des N-terminalen Glutamins zu vermeiden. Präparative HPLC wurde durchgeführt mit einem linearen Gradienten aus Acetonitril (Merck) in Wasser (5–40% oder 65% Acetonitril über 40 min) auf einer 250-21 Luna RP18 Säule (Phenomenex). Zur Bestätigung der Peptidreinheit und Identität wurden eine analytische HPLC und ESI-MS eingesetzt.
  • Glu(NH-NH2)-Ser-Pro-Thr-Ala-NH2. Das lineare Vorläuferpeptid (Fmoc-Glu-Ser-Pro-Thr-Ala-NH2) wurde nach Fmoc-Standardverfahren synthetisiert (Schilling, S. et al. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857) an einem Rink Amid MBHA Harz (Novabiochem). Nach Abspaltung des Fmoc-geschützten Peptids vom Harz wurde das Peptid mit Diethylether (Merck) präzipitiert, filtriert und getrocknet. HMBA-AM Harz (1,16 mmol/g, Novabiochem) wurde verwendet für die Kupplung der γ-Carboxylsäuregruppe der Glutaminsäure des Vorläuferpeptid (3 Äq.) in Dichlormethan (DCM, Merck). Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, Serva) (4 Äq.) und Dimethylaminopyridin (DMAP, Aldrich) (0,1 Äq) wurden als Kupplungsreagenzien verwendet. Nach 12 Stunden wurde das Harz filtriert, mit DCM gewaschen und die Reaktion wurde wiederholt. Nach der Entschützung der N-terminalen Fmoc-Gruppe durch den Einsatz von 20% Piperidin in DMF (3 × 5 min) wurde das Peptidharz für 1,5 Stunden mit einer 5%-igen Hydrazinlösung (20 ml/g) behandelt. Das Harz wurde filtriert und mit Dimethylformamid (DMF, Roth, Deutschland) und TFA gewaschen. Nach Evaporation wurde das Rohpeptid mit Ether präzipitiert, die Ausbeute betrug 76%.
  • H-Gln-Lys(Gln)Arg-Leu-Ala-NH2. Das lineare Peptid wurde synthetisiert nach dem Fmoc/tBu-Standardverfahren an Rink Amid MBHA (Schilling, S. et al. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857) unter Verwendung von Fmoc-Lys(Fmoc)-OH als vorletzte Aminosäurekupplung. Nach der Entschützung der beiden Aminoschutzgruppen von Lysin mit 20% Piperidin (Merck) in DMF, wurden 4 Äq. Fmoc-Gln(Trt)-OH gekuppelt. Standardabspaltungsverfahren ergaben eine 95% Ausbeute.
  • H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2. Fmoc-Gln(NMe)-OH wurde synthetisiert ausgehend von Fmoc-Glu-OtBu geladen an Fmoc-MI-AM (Novabiochem) Harz. Nach Schwellung mit DCM wurde das Harz (0,5 g) mit DMF gewaschen mit DMF und entschützt mit einer 20%igen Piperidinlösung in DMF. Das Harz wurde in 5 ml DMF gegeben und 5 Äq. Fmoc-Glu-OtBu, 5 Äq. HATU und 10 Äq. DIPEA wurden anschließend zugegeben und für 6 Stunden geschüttelt. Nach Filtration und Waschen wurde das Produkt abgespalten gemäß Standardbedingungen bei der Spaltung mit TFA. Das Peptid H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2 wurde wie beschrieben synthetisiert (Schilling, S. et al. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857). Fmoc-Gln(NMe)-OH wurde über Nacht mit HATU/DIPEA gekuppelt. Standardabspaltungsverfahren ergaben 78% des Rohpeptids.
  • H-Glu(OMe)-β-naphthylamid, H-Gln-Val-OH, H-Gln-Tyr-OH. Boc-geschützte Dipeptide wurden synthetisiert durch Standardverfahren unter Anwendung von gemischtem Anhydrid, indem Isobutylchlorcarbonat (Merck) verwendet wurde. Die C-terminalen Methylester Boc-Gln-Tyr-OMe und Boc-Gln-Val-OMe wurden verseift mit 1 N NaOH in Dioxan. Die Boc-geschützten Peptide wurden entschützt mit einer HCl/Dioxan-Lösung für 10 min. Nach der Evaporation wurde der Rückstand mit mehreren Lösungsmitteln kristallisiert, was 60–70% einer festen Verbindung ergab.
  • H-Gln-cyclo(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe). Der lineare Vorläufer Boc-Gln(Trt)-Lys-Arg(Pmc)-Ala-Gly-Phe-OH wurde synthetisiert an säureempfindlichem 2-Chlortrityl-Harz. Die Kupplung wurde ausgeführt unter Verwendung von einem Standardverfahren der Fmoc/tBu-Strategie unter Verwendung von Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Nach der Spaltung mit 3%iger TFA-Lösung in DCM (10 Mal 5 min) wurde die Lösung mit 10% Pyridin (Merck) in Methanol (MeOH, Merck) neutralisiert, 3 Mal mit DCM und MeOH gewaschen, auf 5% des Volumens eingedampft und das Rohpeptid wurde mit eiskaltem Wasser präzipitiert. Im Anschluss wurde das Rohpeptid cyclisiert unter Verwendung von DCC/N-Hydroxybenzotriazol (HOBt, Aldrich) Aktivierung. Das Rohpeptid wurde gelöst in trockenem Dichlormethan (0,2 mmol/50 ml), 0,2 mmol N-Methylmorpholin und 0,4 mmol 1-Hydroxybenzotriazol wurde zugefügt. Diese Lösung wurde bei 0°C tropfenweise zu einer Lösung von 0,4 mmol Dicyclohexylcarbodiimid in 250 ml Dichlormethan zugegeben. Die Reaktion wurde durch Rühren über Nacht bei Raumtemperatur abgeschlossen. Nach Filtration mit N,N'-Dicyclohexylharnstoff wurde das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und mehrmals gewaschen mit 1 N HCl, gesättigter Lösung von NaHCO3 und Wasser. Die Lösung wurde über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet, filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
  • Beispiel 7: Charakterisierung von Effektoren der QC
  • Imidazolderivate
  • Imidazol- und Benzimidazolderivate, die Substituenten an unterschiedlichen Positionen des fünfgliedrigen Rings tragen, wurden als Inhibitoren der QC getestet (Tabelle 3). Die Anordnung der Zahlen bezieht sich auf den Imidazolring. Die angewandten Verfahren sind in Beispiel 2 beschrieben.
  • C-4(5) und C-4,5 Derivate. Die Verbindungen, die entweder einen Substituenten an der 4- oder 5-Position des Imidazolrings, die konstitutionell äquivalent sind, tragen oder an beiden Positionen, zeigten eine verminderte Wirksamkeit für die Hemmung von humaner QC. Die einzige Ausnahme betraf jedoch N-ω-acetyliertes Histamin, das sich als eine der am stärksten hemmenden Verbindungen erwies. Kleine Substituenten an diesen Positionen hatten nur einen geringen Effekt auf die Bindung, wie angezeigt durch die ähnliche Hemmkonstante von 5-Hydroxymethyl-4-methylimidazol im Vergleich zu Imidazol. Größere und sperrigere an diesen Stellen angebrachte Gruppen verminderten oder verhinderten die Bindung der Verbindung an das Enzym. Einige der anderen getesteten Substituenten sind bekannt dafür, dass sie negative induktive oder mesomere Effekte ausüben, die in der Lage sind, die Elektronendichte im Imidazolring zu verringern, was auch zu schlechteren Bindungskonstanten beiträgt. Die Unterschiede bei den Ki-Werten von L-Histidin und Histidinamid zeigen auch einen gewissen Einfluss der Ladung auf die Bindung an. Der Nachweis für eine elektrostatische Abstoßung der geladenen Substrate wurde bereits in den Untersuchungen zur Substratspezifität gezeigt, d. h. Glutaminamid wurde von humaner QC leicht zu Produkten umgewandelt, aber für freies Glutamin als Substrat wurde keine Reaktivität beobachtet.
  • C-2 Derivate. Alle getesteten Derivate hemmten QC schwächer als Imidazol. Jede Substitution, die größer ist als ein Proton, verhindert eine ordnungsgemäße QC-Bindung. Allein aufgrund der Methylgruppe in 2-Methylbenzimidazol fällt die Hemmungskonstante um etwa eine Größenordnung. Eine sehr ähnliche Beziehung wurde gezeigt durch Vergleich der Ki-Werte für Benzimidazol und 2-Aminobenzimidazol. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass der Einfluss nicht mit elektronischen Änderungen verbunden ist.
  • N-1 Derivate. Unter den auf die Hemmung der humanen QC getesteten Imidazolderivaten zeigten die meisten Verbindungen, die einen verbesserten Ki-Werte im Vergleich zu Imidazol aufwiesen, Änderungen an einem Stickstoffatom. Diese Verbindungen enthielten auch einen der wirksamsten QC-Inhibitoren, 1-Benzylimidazol. Interessant ist, dass nur kleine Änderungen dieser Struktur zu einem Verlust der hemmenden Qualität führten, wie man an 1-Benzoylimidazol und Phenylimidazol sehen kann, die unter den Versuchsbedingungen inaktiv waren. Auch in diesem Fall schienen die beobachteten Veränderungen nicht nur durch eine verringerte Elektronendichte des Imidazolrings auf Grund des negativen mesomeren Effekts der Phenylgruppe verursacht zu werden, weil auch die sperrige Trimethylsilylgruppe, die einen positiven induktiven Effekt ausübt, eine verminderte Bindung im Vergleich zu anderen Resten zeigte. Interessanterweise war 1-Aminopropylimidazol eine der weniger wirksamen Verbindungen dieser Gruppe. Die geringe Wirksamkeit dieser Verbindung wird durch die basische Aminogruppe verursacht, da die sterisch ähnlichen Verbindungen 1-Methylimidazol und 1-Vinylimidazol eine verbesserte Bindung an das aktive Zentrum zeigten. Damit ist die positiv geladene Aminogruppe ursächlich für den kleineren Ki-Wert, ein Ergebnis, das durch einen Vergleich der Ki-Werte von N-ω-acetyliertem Histamin (Tabelle 3) und Histamin (Tabelle 4) bestätigt wird.
  • Effekt der 3,4 und 3,5 Derivatisierung. Die Imidazolderivate, die Substituenten an Position 4(5) oder beiden enthielten, zeigten, dass sie eine eingeschränkte Effizienz für die Bindung an das Enzym haben. Der Effekt der spezifischen Substitutionen wurde spezifiziert durch Vergleich der Hemmungskonstanten von L-Histamin und den beiden Zwischenprodukten beim biologischen Abbau von Histamin, 3-Methyl-4-Histamin und 3-Methyl-5-Histamin (Tabelle 4). L-Histamin offenbarte einen Ki-Wert, der im Vergleich zu seinem acetylierten Gegenstück etwa um eine Größenordnung kleiner war. Die Methylierung von einem Stickstoff führte zu einer erheblichen Verbesserung der Wirksamkeit im Fall von 3-Methyl-4-Histamin. Die zu 3-Methyl-5-Histamin führende Methylierung resultierte jedoch in einem völligen Verlust der inhibitorischen Aktivität. Somit scheint der beobachtete Effekt hauptsächlich auf eine sterische Hinderung der Bindung auf Grund der Derivatisierung des Kohlenstoffs neben dem basischen Stickstoff zurück zu (ihren zu sein. Vermutlich spielt der basische Stickstoff eine Schlüsselrolle für die Bindung an das Enzym.
  • Beispiel 8: Bildung von Aβ3-40/42 Derivaten
  • Die Messungen wurden ausgeführt mit zwei kurzen N-terminalen Peptid-Sequenzen von Aβ3-40/42, [Gln3]-Aβ1-11 (Sequenz: DAQFRHDSGYE) und [Gln3]Aβ3-11, die ein Glutamin an Stelle eines Glutaminsäurerestes an der dritten Position enthalten. Spaltung durch DP IV und Cyclisierung des N-terminalen Glutaminrestes durch QC wurde bei den beiden Peptiden durch getestet unter Verwendung von MALDI-TOF Massenspektrometrie. Die Messungen wurden ausgeführt unter Verwendung von gereinigter DP IV (Schweineniere) oder rohem Homogenat der Schweinehypophyse als Quellen für QC sowie für beide Enzyme für die Messungen der konsekutiven Katalyse.
  • Ergebnisse
  • 1. Bildung von [Gln3]Aβ3-11a aus [Gln3]Aβ1-11a, katalysiert durch DPIV, und deren Verhinderung durch den DP IV-Inhibitor Val-Pyrrolidid (Val-Pyrr)
  • DP IV oder DP IV-ähnliche Aktivität spaltet [Gln3]Aβ1-11a unter Bildung von [Gln3]Aβ3-11a (7). Der Rest an der dritten Position wird durch diese Spaltung freigelegt und wird dadurch für Modifikationen durch andere Enzyme, d. h. QC, zugänglich. Wie erwartet kann die Katalyse durch Val-Pyrr vollständig verhindert werden (8).
  • 2. Bildung von [pGlu3]Aβ3-11a aus [Gln3]Aβ3-11a durch Katalyse von QC aus Hypophysenhomogenat und Verhinderung durch Val-Pyrr und 1,10-Phenanthrolin
  • Glutaminyl-Cyclase, die im Homogenat von Schweinehypophyse vorhanden ist, katalysiert die Umwandlung von [Gln3]Aβ3-11a zu [pGlu3]Aβ3-11a (9). Bildung von [pGlu3]Aβ3-11a wurde gehemmt durch Zugabe von 1,10-Phenanthrolin (10).
  • 3. Konsekutive Katalyse von DP IV und QC, resultierend in der Bildung von [pGlu3]Aβ3-11a und Verhinderung durch Val-Pyrr und 1,10-Phenanthrolin
  • Bildung von [pGlu3]Aβ3-11a aus [Gln3]Aβ3-11a findet statt nach konsekutiver Katalyse durch DP IV und QC, gemessen in Rohhomogenat von Schweinehypophyse mit zugesetzter DP IV aus Schweineniere (11). [pGlu3]Aβ3-11a wurde nicht gebildet, wenn der QC-Inhibitor 1,10-Phenanthrolin (12) oder der DP IV-Inhibitor Val-Pyrr zugefügt wurde (13). Die leichte Erscheinung von [pGlu3]Aβ3-11a ist zurück zu führen auf eine Aminopeptidasespaltung und die folgende Cyclisierung des Glutaminrestes, auch angezeigt durch die Bildung von [Gln3]Aβ2-11a.
  • 4. Bildung von [pGlu3]Aβ3-11a in rohem Hypophysenhomogenat durch Katalyse von Aminopeptidase(n)
  • Auf Grund der Bildung von [pGlu3]Aβ3-11a, die nicht von DP IV Katalyse abhängig war, wurde der Abbau von [Gln3]Aβ1-11a untersucht in rohem Hypophysenhomogenat ohne Zusatz von DP IV (14). Wie aus den Daten in Abschnitt 4 erwartet, wurde die Bildung von [pGlu3]Aβ3-11a beobachtet. Die Daten zeigen, dass der Abbau von [Gln3]Aβ1-11a auch durch Aminopeptidase(n) katalysiert werden kann, resultierend in [pGlu3]Aβ3-11a. Damit zeigen die Ergebnisse, dass die Pyroglutamylbildung ein Endpunkt des N-terminalen Peptidabbaus in diesem Gewebe ist, was die Rolle von QC bei der Plaquebildung weiter stützt.
  • Beispiel 9: Umsatz von [Gln3]Aβ3-11a; 3-21a und 3-40 durch rekombinante humane QC
  • Alle getesteten [Gln3]Aβ-abgeleiteten Peptides wurden durch humane QC effizient in die entsprechenden Pyroglutamatylformen umgewandelt (Tabelle 8). Auf Grund der schlechten Löslichkeit von [Gln3]Aβ3-21a und [Gln3]Aβ3-40 in wässriger Lösung wurden die Bestimmungen in der Gegenwart von 1% DMSO ausgeführt. Die bessere Löslichkeit von [Gln3]Aβ3-11a erlaubte jedoch eine kinetische Analyse des QC-katalysierten Umsatzes in Gegenwart und Abwesenheit von DMSO (Tabelle 8). Zusammengefasst, die Untersuchung der Aβ Peptide als QC-Substrate mit einer Kettenlänge von 8, 18 und 37 Aminosäuren (siehe Tabelle 8) bestätigte die Beobachtung, dass humane QC-Aktivität mit der Länge seiner Substrate zunimmt. Dementsprechend sind Gln1-Gastrin, Gln1-Neurotensin, Gln1-GnRH unter den besten QC-Substraten, wenn man die Spezifitätskonstanten berücksichtigt. Ähnlich zeigten [Gln3]Aβ3-40 und Glucagon, die bisher größten untersuchten QC-Substrate, hohe Geschwindigkeitskonstanten 2. Ordnung (449 mM–1s–1 bzw. 526 mM–1s–1), sogar in Anwesenheit von 1% DMSO (Tabelle 8).
  • Interessanterweise änderten sich die kinetischen Parameter für die Umwandlung der untersuchten Amyloid- Peptide mit zunehmender Größe nicht dramatisch, was darauf hindeutet, dass der C-terminale Teil von Aβ nur moderate Auswirkungen auf die QC Katalyse hat. Wegen der besseren Löslichkeit und experimentellen Handhabbarkeit wurden daher die weiteren Untersuchungen bezüglich der Prozessierung durch N-terminale Aminopeptidasen unter Verwendung der kleineren Fragmente von Aβ, [Gln3]Aβ1-11a, [Gln3]Aβ3-11a und Aβ3-11a, durchgeführt. Tabelle 8: Kinetische Parameter für die Umwandlung von N-terminal Gln-enthaltenden Peptiden durch rekombinante humane QC in Pufferlösung, enthaltend 1% DMSO
    Peptid KM (μM) kcat (s–1) kcat/KM (mM–1s–1)
    [Gln3]Aβ3-11a 87 ± 3# 55 ± 1# 632 ± 10#
    [Gln3]Aβ3-11a 155 ± 4 41,4 ± 0,4 267 ± 4
    [Gln3]Aβ1-21a 162 ± 12 62 ± 3 383 ± 10
    [Gln3]Aβ3-40 89 ± 10 40 ± 2 449 ± 28
    Glucagon(3-29) 19 ± 1 10,0 ± 0,2 526 ± 17
    • # bestimmt in Abwesenheit von DMSO
  • Beispiel 10: Umsatz von Aβ3-11a und Aβ3-21a durch rekombinante humane QC
  • Die Inkubation von Aβ3-11a und Aβ3-21a in Gegenwart von QC ergab, dass im Gegensatz zu früheren Arbeiten, Glutamat-haltige Peptide auch als QC-Substrate dienen können (15C und D). Die QC-katalysierte Bildung von [pGlu3]Aβ3-11a und [Gln3]Aβ3-21a wurde untersucht bei pH 5,2 bzw. 6,5. Wenn der QC-Inhibitor Benzimidazol vor dem Start des Assays durch Zugabe von QC zu der Lösung zugegeben wurde, wurde die Substratumwandlung, die zu [Gln3]Aβ3-11a oder [Gln3]Aβ3-21a führt, unterdrückt (15E und F). Wenn QC vor der Zugabe gekocht wurde, war die Bildung der pGlu-Peptide vernachlässigbar (15A und B).
  • Beispiel 11: pH-Abhängigkeit der Papaya QC-katalysierten Cyclisierung von Gln-βNA und Glu-βNA
  • Papaya QC wandelte Glu-βNA in einem Konzentrationsbereich bis zu 2 mM (was durch die Löslichkeit des Substrats begrenzt war) gemäß Michaelis-Menten Kinetik um (16). Die Prüfung der Umsatz versus Substratkonzentration Diagramme für die QC-katalysierte Umwandlung von Glu-βNA, untersucht zwischen pH 6,1 und 8,5, ergab, dass sich für dieses Glu-Substrat beide Parameter, KM und kcat, in einer pH-abhängigen Art und Weise änderten (16). Dies steht im Gegensatz zu der vorher beschriebenen QC-katalysierten Cyclisierung von Glutamin, für die nur Änderungen bei KM über den angegebenen pH-Bereich beobachtet wurden (Gololobov, M. Y., Song, I., Wang, W. und Bateman, R. C. (1994) Arch Biochem Biophys 309, 300-307).
  • Anschließend wurde die pH-Abhängigkeit der Cyclisierung von Glu-βNA und Gln-βNA unter Bedingungen von Geschwindigkeitsraten 1. Ordnung (d. h. Substratkonzentrationen weit unterhalb KM-Werten) untersucht, um den Einfluss der Protonenkonzentration während der Glu- und Gln-Cyclisierung zu studieren (17). Die Cyclisierung von Glutamin hat ein pH-Optimum bei pH 8,0, im Gegensatz zu der Cyclisierung der Glutaminsäure, die ein pH-Optimum von pH 6,0 zeigte. Während sich die Spezifitätskonstanten bei den jeweiligen pH-Optima etwa 80000-fach unterscheiden, ist das Verhältnis von QC- versus EC-Aktivität um pH 6,0 nur etwa 8000.
  • Die nicht-enzymatische pGlu-Bildung aus Gln-βNA, untersucht bei pH 6,0, wurde für 4 Wochen verfolgt und ergab eine Geschwindigkeitskonstante 1. Ordnung von 1,2·10–7s–1. Jedoch wurde während dieses Zeitintervalls kein pGlu-βNA aus Glu-βNA gebildet, was erlaubt, die Geschwindigkeitskonstante für den Umsatz auf 1,0·10–9s–1 zu schätzen.
  • Beispiel 12: Enzyminaktivierungs-/-reaktivierungsverfahren
  • Ein Aliquot der humanen QC (0,1–0,5 mg, 1 mg/ml) wurde über Nacht inaktiviert durch Dialyse gegen einen 3000-fachen Überschuss von 5 mM 1,10-Phenanthrolin oder 5 mM Dipicolinsäure in 0,05 M Bis-Tris/HCl, pH 6,8. Anschließend wurde das Inaktivierungsmittel sorgfältig entfernt durch Dialyse (3 Zyklen, 2000-fachen Überschuss) der Proben gegen 0,05 M Bis-Tris/HCl, pH 6,8, enthaltend 1 mM EDTA. Reaktivierungsexperimente wurden 15 Minuten lang durchgeführt bei Raumtemperatur unter Verwendung von Zn++, Mn+ +, Ni++, Ca++, K+ und Co++ Ionen in Konzentrationen von 1,0, 0,5, 0,25 mM in 0,025 M Bis-Tris, pH 6,8, enthaltend 0,5 mM EDTA. QC-Aktivitätsassays wurden durchgeführt in 0,05 M Tris/HCl, pH 8,0, enthaltend 2 mM EDTA, um eine schnelle Reaktivierung durch Metallionen, in Spuren in Pufferlösungen vorhanden, zu vermeiden.
  • Die Hemmung von Schweine QC durch 1,10-Phenanthrolin wurde bereits beschrieben (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536, Bateman, R. C. J. et al. 2001 Biochemistry 40). Die Tatsache, dass für EDTA gezeigt worden, das es eine aktivierende Wirkung auf die QC-Katalyse hat, legte jedoch nahe, dass die Hemmung durch Phenanthrolin nicht auf eine Chelatisierung des Metalls zurück zu führen ist (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536, Bateman, R. C. J. et al. 2001 Biochemistry 40). Zusätzlich zu der Hemmung durch 1,10-Phenanthrolin wurde die von humaner QC katalysierte Substratcyclisierung auch in Gegenwart von Dipicolinsäure und 8-Hydroxychinolin, anderen Inhibitoren von Metalloenzymen, verhindert. Diese Chelatoren hemmen QC in einer kompetitiven und zeitabhängigen Weise, d. h. es wurde gefunden, dass bereits anfänglich kompetitiv gehemmte Aktivität nach längerer Inkubation mit den Verbindungen weiter verringert wird (18, 19). Interessanterweise zeigte EDTA unter keinen Bedingungen eine merkliche Hemmung, unabhängig von der Inkubationszeit.
  • Humane QC wurde nach umfangreicher Dialyse gegen 5 mM 1,10-Phenanthrolin oder 5 mM Dipicolinsäure fast vollständig inaktiviert. Nach wiederholter Dialyse über Nacht gegen Chelator-freie Pufferlösungen, wurde die QC-Aktivität teilweise reaktiviert, bis zu 50 bis 60%. Wenn jedoch gegen Puffer, enthaltend 1 mM EDTA, dialysiert wurde, wurde keine Reaktivierung beobachtet.
  • Nahezu vollständige Wiederherstellung der QC-Aktivität nach Inaktivierung mit entweder Dipicolinsäure oder 1,10-Phenanthrolin wurde erreicht durch 10 minütige Inkubation des Protein mit 0,5 mM ZnSO4 in Gegenwart von 0,5 mM EDTA (20). Teilweise Wiederherstellung der QC-Aktivität wurde gleichermaßen bei Verwendung von Co++- und Mn++-Ionen für die Reaktivierung erreicht. Selbst in Gegenwart von 0,25 mM Zn++ war eine Reaktivierung bis zu 25% der ursprünglichen Aktivität möglich. Keine Reaktivierung wurde beobachtet bei Anwendung von Ni++-, Ca+ +- oder K+-Ionen. Ebenso hatte die Inkubation von vollständig aktiver QC mit diesen Ionen keinen Effekt auf die Enzymaktivität.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (15)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen, enteralen oder oralen Verabreichung, umfassend mindestens einen Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz desselben.
  2. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, die zusätzlich einen Inhibitor der DP IV oder DP IV-ähnlichen Enzym umfasst, wobei das DP IV-ähnliche Enzym ausgewählt wird aus FAPα (fibroblast activation Protein α), Dipeptidylpeptidase IVβ, Dipeptidylaminopeptidase-ähnliches Protein (dipeptidyl aminopeptidase-like Protein), NAALADase (N-acetylated α-linked acidic dipeptidase), QPP (quiescent cell proline dipeptidase), Dipeptidylpeptidase II, Attractin und DPP8, DP6, DPL2, DPP9 und DPP10.
  3. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung einer Krankheit, ausgewählt aus Alzheimer-Krankheit und Down-Syndrom.
  4. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2 für die Behandlung einer Krankheit, ausgewählt aus Alzheimer-Krankheit und Down-Syndrom.
  5. Verwendung von einem Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes desselben, zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung einer Krankheit, ausgewählt aus Alzheimer-Krankheit und Down-Syndrom.
  6. Ein Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz desselben, zur Vorbeugung oder Behandlung einer Krankheit, ausgewählt aus Alzheimer-Krankheit und Down-Syndrom.
  7. Die Verwendung oder der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase in Kombination mit einem Inhibitor der DP IV oder DP IV-ähnlichen Enzym verwendet wird, wobei das DP IV-ähnliche Enzym ausgewählt wird aus FAPα (fibroblast activation Protein α), Dipeptidylpeptidase IVβ, Dipeptidylaminopeptidase-ähnliches Protein (dipeptidyl aminopeptidase-like Protein), NAALADase (N-acetylated α-linked acidic dipeptidase), QPP (quiescent cell proline dipeptidase), Dipeptidylpeptidase II, Attractin und DPP 8, DP6, DPL2, DPP9 und DPP10.
  8. Die pharmazeutische Zusammensetzung oder der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase oder die Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase ein kompetitiver Inhibitor ist.
  9. Die pharmazeutische Zusammensetzung oder der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase oder die Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase ausgewählt wird aus
    Figure 00720001
  10. Der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase oder die Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 3 und 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Umwandlung der N-terminalen Glutaminsäure- oder Glutaminreste zu Pyroglutaminsäureresten von mindestens einem Substrat der Glutaminyl-Cyclase, ausgewählt aus Aβ3-40/42, [Gln3]Aβ3-40/42, [Glu11]Aβ11-40/42 und [Gln11]Aβ11-40/42, gehemmt (inhibiert) wird.
  11. Der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase oder die Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 3 und 7 bis 10, wobei die H-isoAsp-Ala-OH-erzeugende Aktivität des DP IV-ähnlichen Enzyms blockiert wird.
  12. Der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase oder die Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 3 und 7 bis 11, wobei das DP IV-ähnliche Enzym DP II ist.
  13. Der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase oder die Verwendung nach irgendeinem der Anspreche 3 und 7 bis 10, wobei der DP IV-Inhibitor ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus L-threo-Isoleucyl Thiazolidin, L-allo-Isoleucyl Thiazolidin, L-threo-Isoleucyl Pyrrolidin, L-allo-Isoleucyl Thiazolidin, L-allo-Isoleucyl Pyrrolidin, NVP-DPP728A (1-[[[2-[{5-Cyanopyridin-2-yl} amino]ethyl]amino]acetyl]-2-cyano-(S)-pyrrolidin), LAF-237 (1-[(3-Hydroxy-adamant-1-ylamino)-acetyl]-pyrrolidin-2(S)-carbonitril), TSL-225 (Ttryptophyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure), FE-999011, N-Valyl-prolyl, O-Benzoylhydroxylamin, Alanyl-Pyrrolidin, H-Asn-Pyrrolidin, H-Asn-Thiazolidin, H-Asp-Pyrrolidin, H-Asp-Thiazolidin, H-Asp (NHOH)-Pyrrolidin, H-Asp(NHOH)-Thiazolidin, H-Glu-Pyrrolidin, H-Glu-Thiazolidin, H-Glu (NHOH)-Pyrrolidin, H-Glu(NHOH)-Thiazolidin, H-His-Pyrrolidin, H-His-Thiazolidin, H-Pro-Pyrrolidin, H-Pro-Thiazolidin, H-Ile-Azididin, H-Ile-Pyrrolidin, H-L-allo-Ile-Thiazolidin, H-Val-Pyrrolidin und H-Val-Thiazolidin, 2-Amino-octansäure-Pro-Ile, Abu-Pro-Ile, Aib-Pro-Ile, Aze-Pro-Ile, Cha-Pro-Ile, Ile-Hyp-Ile, Ile-Pro-allo-Ile, Ile-Pro-t-butyl-Gly, Ile-Pro-Val, Nle-Pro-Ile, Nva-Pro-Ile, Orn-Pro-Ile, Phe-Pro-Ile, Phg-Pro-Ile, Pip-Pro-Ile, Ser(Bzl)-Pro-Ile, Ser(P)-Pro-Ile, Ser-Pro-Ile, t-Butyl-Gly-Pro-D-Val, t-Butyl-Gly-Pro-Gly, t-Butyl-Gly-Pro-Ile, t-Butyl-Gly-Pro-Ile-amid, t-Butyl-Gly-Pro-t-butyl-Gly, t-Butyl-Gly-Pro-Val, Thr-Pro-Ile, Tic-Pro-Ile, Trp-Pro-Ile, Tyr(P)-Pro-Ile, Tyr-Pro-allo-Ile, Val-Pro-allo-Ile, Val-Pro-t-butyl-Gly, Val-Pro-Val, oder einen pharmazeutisch akzeptablen Salz derselben.
  14. Der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase oder die Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 3 und 7 bis 10, wobei der DP IV-Inhibitor ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus 2-Methylcarbonyl-1-N-[(L)-Alanyl-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid, 2-Methylcarbonyl-1-N-[(L)-Valinyl-(L)-Prolyl-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid, 2-[(Acetyl-oxy-methyl)carbonyl]-1-N-[(L)-Alanyl-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid, 2-[Benzoyl-oxy-methyl)carbonyl]-1-N-[{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid, 2-{[(2,6-Dichlorbenzyl)thiomethyl]carbonyl}-1-N-[{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-Pyrrolidin, 2-[Benzoyl-oxy-methyl)carbonyl]-1-N-[Glycyl-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid, 2-[([1,3]-Thiazolethiazol-2-yl)carbonyl]-1-N-[{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Trifluoracetat, 2-[(Benzothiazolethiazol-2-yl)carbonyl]-1-N-[N-{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Trifluoracetat, 2-[(-Benzothiazolethiazol-2-yl)carbonyl]-1-N-[{(L)-Alanyl}-Glycyl)]-(2S)-pyrrolidin-Trifluoracetat, 2-[(Pyridin-2-yl)carbonyl]-1-N-[N-{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Trifluoracetat, 1-Cyclopentyl-3-methyl-1-oxo-2-pentanaminiumchlorid, 1-Cyclopentyl-3-methyl-1-oxo-2-butanaminiumchlorid, 1-Cyclopentyl-3,3-dimethyl-1-oxo-2-butanaminiumchlorid, 1-Cyclohexyl-3,3-dimethyl-1-oxo-2-butanaminiumchlorid, 3-(Cyclopentylcarbonyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoliniumchlorid, N-(2-Cyclopentyl-2-oxoethyl)cyclohexanaminiumchlorid, oder andere pharmazeutisch akzeptable Salze derselben.
  15. Die pharmazeutische Zusammensetzung oder der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase oder die Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Inhibitor der Glutaminyl-Cyclase an das im aktiven Zentrum der Glutaminyl-Cyclase gebundene Metallion bindet.
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