KR101313975B1 - 글루타미닐 및 글루타메이트 사이클라제 이펙터의 용도 - Google Patents

글루타미닐 및 글루타메이트 사이클라제 이펙터의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유동물의 글루타미닐 사이클라제(QC, BC 2.3.2.5)의 신규한 생리학적 기질, QC의 새로운 이펙터 및 상기 이펙터의 용도, 그리고 QC-활성의 조절에 의해 치료될 수 있는, 예를 들면 헬리코박터 파일로리 감염에 의한 또는 이와는 무관한 십이지장암, 대장암, 졸리저-엘리슨 증후군(Zolliger-Ellison syndrome), 가족력 브리티쉬 치매(FBD) 및 가족력 덴마크 치매(FDD)로 구성된 군으로부터 선택되는 질병을 치료하기 위한 상기 이펙터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

글루타미닐 및 글루타메이트 사이클라제 이펙터의 용도{Use of effectors of glutaminyl and glutamate cyclases}
본 발명은 암모니아의 배출(liberation) 하에서 N-말단 글루타민 잔기를 피로글루탐산(5-옥소-프롤린, pGlu*)으로 분자내 고리화하는 작용, 및 물의 배출 하에서 N-말단 글루타메이트 잔기를 피로글루탐산으로 분자내 고리화하는 작용을 촉매하는 글루타미닐 사이클라제(QC, EC 2.3. 2.5)에 관한 것이다.
본 발명은 포유동물 QC를 금속효소로서 확인하고, 포유동물에서 QC의 신규한 생리학적 기질을 제공하며, 신규항 QC 이펙터, QC 이펙터의 용도 및 QC-활성의 조절에 의해 치료될 수 있는 상태의 치료를 위한 QC 이펙터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 금속 상호작용이 QC 저해제의 개발에 유용한 접근법임을 밝힌다.
바람직한 일 양태에서, 본 발명은 QC- 및 DP Ⅳ-활성의 조절에 의해 치료될 수 있는 상태의 치료 또는 완화를 위한 QC 활성 이펙터를 DP Ⅳ 또는 DP Ⅳ-유사 효소들의 저해제와 병용하여 사용하는 것을 제공한다.
또한 QC 활성 이펙터를 확인하고 선택하는 스크리닝 방법을 제공한다.
글루타미닐 사이클라제(QC, EC 2.3. 2.5)는 암모니아를 배출시키면서, N-말단 글루타민 잔기를 피로글루탐산(pGlu*)으로 분자내 고리화하는 작용을 촉매한다. QC는 Messer에 의해 1963년에 처음으로 열대 식물 카리카 파파야(Carica papaya)로부터 분리되었다(Messer, M. 1963 Nature 4874, 1299). 24년 후, 상응하는 효소 활성이 동물 뇌하수체에서 발견되었다(Busby, W. H. J. 등. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. 및 Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3628-3632). 포유동물 QC의 경우, QC에 의해 Gln을 pGlu로 전환하는 것은 TRH 및 GnRH의 전구체에 대하여 나타내어 질 수 있다(Busby, W. H. J. 등. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. 및 Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3628-3632). 또한, QC의 초기 위치 측정 실험에서는 펩타이드 호르몬 합성에서 추정되는 기능을 개선하는 이외에도, 소의 뇌하수체에서 촉매작용 추정 생성물과 공존하는 것으로 나타났다(Bockers, T. M. 등. 1995 J Neuroendocrinol 7, 445-453). 반면, 식물성 QC의 생리학적 기능은 덜 명확하다. C. papaya에서 유래한 효소의 경우, 병원성 미생물에 대한 식물 방어 기작에서의 역할이 제시되어 있다(El Moussaoui, A. 등. 2001 Cell Mol Life Sci 58, 556-570). 다른 식물들로부터 추정되는 QC들은 서열 비교로 최근 확인되었다(Dahl, S. W. 등. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36). 하지만 이러한 효소들의 생리학적 작용은 여전히 불명확하다.
식물 및 동물로부터 알려진 QC들은 기질의 N-말단 위치에 있는 L-글루타민에 대한 정확한 특이성을 나타내고, 그들의 역학적 구동(kinetic behavior)은 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 식을 따르는 것으로 밝혀졌다(Pohl, T. 등. 1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88, 10059-10063; Consalvo, A. P. 등. 1988 Anal Biochem 175, 131-138 ; Gololobov, M. Y. 등. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395-398). C. 파파야에서 유래한 QC들과 포유동물에서 유래한 높은 보존성 QC의 일차 구조를 비교하였으나, 어떠한 서열 상동성도 밝혀내지 못했다(Dahl, S. W. 등. 2000 Protein Expr Purif 20,27-36). 식물 QC들은 신규한 효소 과(family)에 속하는 것으로 나타난 반면(Dahl, S. W. 등. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36), 포유동물 QC들은 박테리아성 아미노펩티다제와 확실한 서열 상동성을 가지는 것으로 나타나(Bateman, R. C. 등. 2001 Biochemistry 40,11246-11250), 식물과 동물에서 유래한 QC들은 상이한 진화 기원을 가진다는 결론에 도달한다.
EP 02 011 349.4은 곤충 글루타미닐 사이클라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 이에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 개시하고 있다. 또한, 상기 특허출원은 이 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 곤충 QC를 포함하는 분리된 폴리펩타이드 및 숙주세포는 글루타미닐 사이클라제 활성을 감소시키는 제제를 스크리닝하는 방법에 유용하다. 그러한 제제들은 살충제로서 유용한 것으로 기재되어 있다.
알츠하이머병(AD)은 이영양성 뉴런, 반응성 성상세포 및 소 신경 교세포(microglia)와 밀접하게 연관되어 있는 세포외 아밀로이드성 플라크가 비정상적으로 축적되는 것을 특징으로 한다(Terry, R. D. 및 Katzman, R. 1983 Ann Neurol 14, 497-506; Glenner, G. G. 및 Wong, C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890; Intagaki, S. 등. 1989 J Neuroimmunol 24, 173-182; Funato, H. 등. 1998 Am J Pathol 152, 983-992; Selkoe, D. J. 2001 Physiol Rev 81, 741-766). 아밀로이드-β(Aβ) 펩타이드는 노인성 플라크의 일차적인 성분이고, 유전적 연구에 의해 지지되는 가설인 AD의 병인(phathogenesis) 및 진행에 직접적으로 연관되어 있는 것으로 여겨지고 있다(Glenner, G. G. 및 Wong, C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890; Borchelt, D. R. 등. 1996 Neuron 17, 1005-1013; Lemere, C. A. 등. 1996 Nat Med 2, 1146-1150; Mann, D. M. 및 lwatsubo, T. 1996 Neurodegeneration 5, 115-120; Citron, M. 등. 1997 Nat Med 3,67-72 ; Selkoe, D. J. 2001 Physiol Rev 81, 741-766). Aβ는 β-아밀로이드 전구체 단백질(APP, Amyloid precursor protein)의 단백질 분해과정에 의해 생성되며(Kang, J. 등. 1987 Nature 325, 733-736; Selkoe, D. J. 1998 Trends Cell Biol 8, 447-453), 이는 후속적으로 Aβ의 N-말단에서의 β-세크레타제에 의해, 그리고 Aβ의 C-말단에서 γ-세크레타제에 의해 순차적으로 절단된다(Haass, C. 및 Selkoe, D. J. 1993 Cell 75,1039-1042 ; Simons, M. 등. 1996 J Neurosci 16 899-908). N-말단에서 L-Asp로 시작하는 주된 Aβ 펩타이드(Aβ1-42/40)외에도, N-말단에서 절제된(truncated) 많은 이종적 형태가 노인성 플라크에서 발생한다. 이렇게 짧아진 펩타이드들은 시험관 내에서 신경독성이며, 전장(full-length) 이소폼(isoform)들보다 더 신속하게 응집하는 것으로 보고되고 있다(Pike, C. J. 등. 1995 J Biol Chem 270 23895-23898). N-절제된 펩타이드들은 초기 개시되는 가족력 AD(FAD) 대상자에서 과생산되고(Saido, T. C. 등. 1995 Neuron 14, 457-466; Russo, C. 등. 2000 Nature 405,531-532), 다운 증후군 (DS) 뇌에서 초기에 나타나고 나이가 듦에 따라 증가되는 것(Russo, C. 등. 1997 FEBS Lett 409,411-416, Russo, C. 등. 2001 Neurobiol Dis 8, 173-180; Tekirian, T. L. 등. 1998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94)으로 알려져 있다. 마지막으로, 이들의 양은 질병의 진행 정도를 반영한다(Russo, C. 등. 1997 FEBS Lett 409, 411-416). 추가적인 번역후(post-translation) 과정은 위치 1과 7에서 아스파테이트를 이성화하거나 또는 라세미화하고 잔기 3과 11에서 글루타메이트를 고리화함으로써 N-말단을 더욱 변경할 수 있다. 위치 3에서의 피로글루타메이트-함유 이소폼들 [pGlu3]Aβ(3-40/42)는 노인성 플라크에서 N-절제된 종의 주된 형태-전체 Aβ 양의 약 50%-를 나타내며(Mori, H. 등. 1992 J Biol Chem 267, 17082-17086, Saido, T. C. 등. 1995 Neuron 14, 457-466; Russo, C. 등. 1997 FEBS Lett 409, 411-416 ; Tekirian, T. L. 등. 1998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94; Geddes, J. W. 등. 1999 Neurobiol Aging 20,75-79 ; Harigaya, Y. 등. 2000 Biochem Biophys Res Commun 276,422-427), 이들은 또한 예비(pre)-아밀로이드 병변에도 존재한다(Lalowski, M. 등. 1996 J Biol Chem 271, 33623-33631). [pGlu3]Aβ(3-40/42) 펩타이드의 축적은 응집하는 것을 향상시키고 대부분의 아미노-펩티다제에 저항성을 부여하는 구조적 변경 때문인 것으로 보인다(Saido, T. C. 등. 1995 Neuron 14, 457-466; Tekirian, T. L. 등. 1999 J Neurochem 73,1584-1589). 이러한 증거는 AD 발병에 있어서의 [pGlu3]Aβ(3-40/42) 펩타이드의 중심적 역할에 대한 실마리를 제공해준다. 그러나, 이들의 신경독성 및 응집 특성에 대해 알려진 것은 상대적으로 적다(He, W. 및 Barrow, C. J. 1999 Biochemistry 38, 10871-10877; Tekirian, T. L. 등. 1999 J Neurochem 73, 1584-1589). 더욱이, 비록 활성화된 아교세포(glia)가 노인성 플라크와 단연 연관되어 있고 아밀로이드 침적물 축적에 활동적으로 기여할 것이라고 해도, 아교세포의에 대한 이러한 이소폼들의 작용 및 이러한 펩타이드에 대한 아교세포의 반응들은 완전히 알려져 있지 않다. 최근의 연구에서, Aβ(1-42), Aβ(1-40), [pGlu3]Aβ(3-42) 및 [pGlu3]Aβ(3-40) 펩타이드의 독성, 응집 특성 및 이화작용을 신경 및 아교세포의 배양에서 조사하였고, 피로글루타메이트 변경은 Aβ-펩타이드의 독성을 더 악화시키며, 또한 배양된 성상세포에 의한 분해를 저해시킨다는 것이 밝혀졌다. Shirotani 등(2002)은 신드비스(Sindbis) 바이러스에 의해 감염된 일차 원추형 뉴런에서 시험관 내에서 [pGlu3]Aβ 펩타이드를 발생시켰다. 그들은 아미노산 치환 및 삭제에 의해 [pGlu3]Aβ에 대한 잠재적인 전구체를 인코딩하고 있는 아밀로이드 전구체 단백질 상보성 DNA들을 구성하였다. 야생 전구체에서 글루타메이트 대신에 N-말단 글루타민 잔기로 시작하는 하나의 인공 전구체에 대하여, 피로글루타메이트로의 자연적 전환 또는 글루타미닐 사이클라제에 의한 효소성 전환이 제시되었다. [pGlu3] Aβ의 천연 전구체(natural precursor)에서 위치 3에 있는 N-말단 글루타메이트의 고리화 기작은 생체 내에서는 결정되지 않았다(Shirotani, K., Tsubuki, S., Lee, H. J., Maruyama, K., 및 Saido, T. C. (2002) Neurosci Lett 327, 25-28).
가족력 브리티쉬 치매(FBD)와 가족력 덴마크 치매(FDD)는 경련과 소뇌 기능 장애로 점진적으로 인식되는 장애로 간주되고 있는 조기 발병되는 상염색체의 우성 질병이다(Ghiso, J. et. al. 2000, Ann N Y Acad Sci 903, 129-137;Vidal, R. et al. 1999, Nature 399, 776-781; Vidal, R.et al. 2004, J Neuropathol Ezp Neurol 63, 787-800). 알츠하이머병과 유사하게, 환자에게 해마 신경퇴행, 보체(complement)와 아교세포의 활성에 의하여 넓게 퍼진 유연조직과 혈관성 아밀로이드 침전물이 형성된다(Rostagno, A. et al. 2002, J Biol Chem 277, 49782-49790). 상기 질병은 BRI 유전자(SwissProt Q9Y287)에서의 서로 다른 돌연변이에 의해 유발되어, 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)이 천연형 BRI에 비해 11개의 아미노산이 더 길어진다. FBD의 경우는, ORF의 변화가 BRI의 종결코돈(BRI-L)에서의 돌연변이에 의해 유발되는 반면, FDD에서는 10개 뉴클레오티드의 중복-삽입이 더 큰 BRI(BRI-D)가 되도록 한다(Ghiso J. et al. 2001 Amyloid 8, 277-284; Rostagno, A. et al. 2002 J Biol Chem 277, 49782-49790). BRI, 분류 2의 막통과 단백질은 염색체 13 상에 인코딩된 것으로, 23개의 아미노산의 긴 펩타이드를 방출하면서, 퓨린과 C-말단 지역의 다른 프로호르몬 전환효소에 의해 공정되는 것으로 보여진다(Kim, S. H. et al. 2000 Ann N Y Acad Sci 920, 93-99; Kim S. H. et al. 2002 J Biol Chem 277, 1872-1877). 돌연변이 BRI 단백질인 BRI-D와 BRI-L의 분열은 펩타이드(34개의 아미노산으로 되어있는 ABri 와 ADan)의 생성을 이끄는데, 그것은 아밀로이드 섬유(fibril)뿐만 아니라 비-섬유(non-fibrillar) 침전물을 응집하게 하는 경향이 있다(EI Agnaf, O. M et al. 2004 Protein Pept Lett 11, 207-212; EI Agnaf, O. M. et al. 2001 Biochemistry 40, 3449-3457; EI Agnaf, O. M. et al. 2001 J Mol Biol 310, 157-168; Srinivasan et al. 2003 J Mol Biol 333, 1003-1023). ADan 및 ABri 펩타이드는 N-말단의 22 아미노산이 서로 동일하지만, C-말단 지역은 전혀 다르다. 상기 C-말단 부분은 섬유 형성과 신경독성에 요구되는 부분인 것으로 보여진다(EI Agnaf, O. M. et al. 2004 Protein Pept Lett 11, 207-212).
ABri 및 ADan 펩타이드의 N-말단은 피로글루타밀의 형성에 의해 차단되는 것으로 알려져 왔다. 알츠하이머병에서 Aβ의 N-말단에서의 피로글루타밀(pGlu)의 형성은 글루탐산으로부터 형성된다(Ghiso J. et al. 2001 Amyloid 8; Saido et al. 1996 Neuron 14, 457-466). 피로글루타밀의 형성은, 차례로 대부분의 아미노 펩티다아제의 분해를 유발하여 펩타이드를 고정시킴으로써 그 질병의 진행을 야기한다. 응집의 형성은 세포의 분비경로의 안쪽뿐만 아니라 세포 바깥쪽으로도 진행되는 것으로 보여진다(Kim et al. 2002 J Biol Chem 277, 1872-1877). 그러므로, 글루타밀과 글루타메이트 시클라아제의 저해에 의한 ABri 및 ADan 펩타이드의 신경독성의 N-말단에서의 pGlu 형성의 억제는 FBD와 FDD의 치료에 대한 새로운 접근임을 나타낸다.
디펩티딜 펩티다제 Ⅳ(DP Ⅳ)는 신장, 간 및 장을 포함하는 인체 내의 여러 조직에서 발견되는 포스트(post)-프롤린(더 약한 정도로는, 포스트-알라닌, 포스트-세린 또는 포스트-글리신) 절단 세린 프로테아제이고, 펩타이드 사슬로부터 N-말단 디펩타이드를 절단한다. 최근에, DP Ⅳ가 뉴로펩타이드 대사, T-세포 활성화, 상피 조직으로의 암세포 고착, 및 임파성 세포로의 HIV 진입에 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌다(WO 02/34242, WO 02/34243, WO 03/002595 및 WO 03/002596 참조).
WO 99/61431에 기재된 DP Ⅳ 저해제는 아미노산 잔기와, 티아졸리딘기 또는 피롤리딘기, 및 이들의 염, 특히 L-트레오-이소류실 티아졸리딘, L-알로-이소류실 티아졸리딘, L-트레오-이소류실 피롤리딘, L-알로-이소류실-티아졸리딘, L-알로-이소류실 피롤리딘을 포함한다.
저분자량 디펩티딜 펩티다제 Ⅳ 저해제의 추가적인 예들은 테트라히드로이소퀴놀린-3-카복사마이드 유도체, N-치환 2-시아노피롤류 및 -피롤리딘류, N-(N'-치환 글리실)-2-시아노피롤리딘류, N-(치환 글리실)-티아졸리딘류, N-(치환 글리실)-4-시아노티아졸리딘류, 아미노-아실-보로노-프롤릴-저해제류, 사이클로프로필-융합 피롤리딘류 및 헤테로사이클릭 화합물과 같은 제제들이다. 디펩티딜 펩티다제 Ⅳ의 저해제들은 US 6,380,398, US 6,011,155; US 6,107,317; US 6,110,949; US 6,124,305; US 6,172,081; WO 95/15309, WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 198 34 591, WO 97/40832, DE 196 16 486 C 2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105, WO 02/02560 및 WO 02/14271, WO 02/04610, WO 02/051836, WO 02/068420, WO 02/076450; WO 02/083128, WO 02/38541, WO 03/000180, WO 03/000181, WO 03/000250, WO 03/002530, WO 03/002531, WO 03/002553, WO 03/002593, WO 03/004496, WO 03/024942 및 WO 03/024965에 설명되어 있고, 이들의 교시는 특히 이러한 저해제들, 이들의 정의, 용도 및 생산에 관한 내용 전체적으로, 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.
발명의 요약
본 발명은 Gln1-ABri, Gln1-ADan, Gln3-Aβ(3-40/42), 및 Gln1-가스트린(17 및 34)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 포유동물에서의 QC의 신규한 생리학적 기질, QC 이펙터의 용도, 및 QC 활성의 조절에 의해 치료될 수 있는, 바람직하게는 헬리코박터 파이롤리 감염에 의한 또는 이와 무관한 십이지장암, 대장암, 졸리저-엘리슨 증후군(Zolliger-Ellison syndrome), 가족력 브리티쉬 치매 및 가족력 덴마크 치매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질병의 치료를 위한 QC 이펙터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
인간 QC(human QC)는 금속-의존성 트란스퍼라제라는 것이 저해 연구를 통해 밝혀졌다. QC 아포효소(apoenzyme)는 아연 이온에 의해 가장 효과적으로 재활성화될 수 있고, 아연-의존성 아미노펩티다제의 금속-결합 모티프(motif)가 또한 인간 QC에 존재한다. 활성-부위 결합된 금속과 상호작용하는 화합물이 강력한 QC의 저해제이다.
의외로, 재조합 인간 QC는 물론 뇌 추출물로부터 얻은 QC-활성체 둘 다 N-말단 글루타미닐은 물론 글루타메이트 고리화를 촉매한다. 가장 놀라운 발견은 사이클라제-촉매된 Glu1-전환이 pH 6.0 근처에서 유리한 반면 pGlu-유도체로의 Gin1-전환은 pH 8.0 근처에서 최적으로 일어난다는 것이다. 그러므로 pGlu-Aβ-관련된 펩타이드의 형성은 재조합 인간 QC 및 돼지 뇌하수체 추출물로부터 얻은 QC-활성체의 저해에 의해 억제될 수 있기 때문에, 본 발명에 따르면, 상기 효소 QC는 알츠하이머병의 치료를 위한 약물 개발의 목표물이다.
본 발명은 선택적으로 통상적인 담체 및/또는 부형제와 병용하는 적어도 하나의 QC 이펙터를 포함하거나, 또는 선택적으로 통상적인 담체 및/또는 부형제와 적어도 하나의 DP Ⅳ-저해제와 병용하는 적어도 하나의 QC 이펙터를 포함하는, 비경구용, 장관 또는 경구 투여용 약제학적 조성물을 제공한다
본 발명은 일반적으로 하기 화학식 1로 표시되는 QC-저해제 또는 모든 입체이성질체를 포함한 약제학적으로 허용가능한 이들의 염을 제공한다.
Figure 112012076472834-pat00001
상기 식에서,
R1 내지 R6는 각각 H 또는 분지된 또는 비분지된 알킬 사슬, 분지된 또는 비분지된 알케닐 사슬, 분지된 또는 비분지된 알키닐 사슬, 카보사이클릭, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 아자-아미노산, 아미노산 또는 이들의 유사체, 펩타이드 또는 이들의 유사체이며; 상기 모든 잔기는 선택적으로 치환될 수 있고, n은 0 내지 2일 수 있다.
본 발명은
a) 생체 내에서 QC 활성의 조절에 의해 치료될 수 있는 포유동물 질병의 치료; 및/또는
b) QC 활성의 조절에 의해 유발되는 pGlu-함유 펩타이드의 작용에 기초한, 생리학적 과정의 조절을 위한 글루타미닐 사이클라제(QC) 이펙터를 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 포유동물에서 글루타미닐 사이클라제(QC, EC 2.3. 2.5) 및/또는 QC-유사 효소를 저해하는 화합물, 및 QC 활성과 관련된 병인적 상태를 치료하기 위한 QC 활성 저해제의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 알츠하이머병 및 다운 증후군의 새로운 치료 방법을 제공한다.
알츠하이머병 및 다운 증후군의 뇌에 침적된 아밀로이드 β-펩타이드의 N-말단은 피로글루탐산을 보유하고 있다. pGlu 형성은 이러한 질병들의 발병 및 진행에 중요한데, 이는 변형된 아밀로이드 β-펩타이드가 β-아밀로이드 응집 및 독성의 경향을 더욱 강하게 나타내면서, 상기 질병의 개시 및 진행을 악화시키는 것으로 보이기 때문이다(Russo, C. 등. 2002 J Neurochem 82, 1480-1489).
반면, 야생 Aβ-펩타이드(3-40/42)에서, 글루탐산은 N-말단 아미노산으로서 존재한다. Glu에서 pGlu로의 효소 전환은 현재까지 알려져 있지 않다. 더욱이, Glu-펩타이드에서 pGlu-펩타이드로의 자연적인 고리화는 아직 관찰되지 않았다. 그러므로, 본 발명의 하나의 양상은 알츠하이머병 및 다운 증후군에서의 QC 역할을 결정하는 것이다. 이러한 양상은 위치 3에서 글루탐산 대신에 아미노산 글루타민을 포함하는 Aβ(3-11) 및 Aβ(1-11)의 합성, QC, DP Ⅳ 및 DP Ⅳ-유사 효소, 아미노펩티다제에 대한 이러한 변형된 아밀로이드 β-펩타이드의 기질 특성의 결정, 및 아밀로이드 β-유도 펩타이드(1-11) 및 (3-11)의 N-말단 글루타미닐 잔기로부터 pGlu가 형성되는 것을 예방하는 QC 저해제의 용도에 의해 특징된다. 상기 결과를 실시예 8에 나타내었다. 상기 적용된 방법은 실시예 3에 설명되어 있다.
현재까지, 상기 질병의 진행에 QC가 관여되어 있다는 사실을 나타내는 아무런 단서가 없었는데, 이는 글루탐산이 Aβ(3-40/42, 또는 11-40/42)에서의 N-말단 아미노산이기 때문이다. 그러나, QC는 펩타이드의 N-말단에서 pGlu를 형성할 수 있는 유일하게 알려진 효소이다. 본 발명 다른 양상은 하기의 연구 결과 및 발견에 관한 것이다:
a) 글루타민 외에도, QC는 글루탐산에서 피로글루탐산으로의 고리화를 낮은 속도로 촉매한다,
b) APP의 글루탐산 또는 이의 후속적으로 형성된 아밀로이드-β-펩타이드는 미지의 효소 활성에 의해 번역후 과정적으로 글루타민으로 전환되고, 두 번째 단계에서, QC는 아밀로이드 β-펩타이드 N-말단의 프로세싱 이후 글루타민에서 피로글루탐산으로의 고리화를 촉매한다,
c) 글루탐산은 화학적 촉매작용 또는 자체 촉매작용에 의해 번역후 과정으로 글루타민으로 전환되고, 후속적으로 QC는 아밀로이드 β-펩타이드 N-말단의 프로세싱 이후 글루타민에서 피로글루탐산으로의 고리화를 촉매한다,
d) 아밀로이드 β-단백질을 인코딩하는 APP 유전자에는, 위치 3에서 Glu 대신 Gln을 나타내게 하는 돌연변이들이 있다. N-말단의 번역 및 프로세싱 이후, QC는 글루타민에서 피로글루탐산으로의 고리화를 촉매한다,
e) 미지의 효소 활성의 기능장애로 인해, 글루타민은 APP의 신생되는 펩타이드 사슬 내 포함되고, 순차적으로 QC는 아밀로이드 β-펩타이드 N-말단의 프로세싱 이후, N-말단의 글루타민에서 피로글루탐산으로의 고리화를 촉매한다.
QC는 상기 열거된 다섯 가지 경우에서 결정적 단계(critical step), 즉 아밀로이드 β-펩타이드의 응집에 유리한 피로글루탐산의 형성에 관여한다. 따라서, QC의 저해는 고리화를 일으키는 기작에 관계없이, 알츠하이머병 및 다운 증후군의 개시와 진행을 야기시키는, 플라크-형성 Aβ(3-40/42) 또는 Aβ(11-40/42)의 침전을 방지할 수 있다.
글루타메이트는 아밀로이드 β-펩타이드의 위치 3, 11 및 22에서 발견된다. 이들 중, 위치 22에서의 글루탐산(E)의 글루타민(Q)으로의 변이(아밀로이드 전구체 단백질 APP 693, Swissprot P05067에 상응함)는 소위 네덜란드형 대뇌동맥성 아밀로이드증 변이(Dutch type cerebroarterial amyloidosis mutation)로 설명되어 왔다.
위치 3, 11 및/또는 22에서 피로글루탐산 잔기를 가지는 β-아밀로이드 펩타이드는 Aβ(1-40/42/43)보다 더욱 세포독성이고 소수성인 것으로 알려져 있다(Saido T. C. 2000 Medical Hypotheses 54 (3): 427-429).
다중의 N-말단 변이체는 β-세크레타제 효소인 β-부위 아밀로이드 전구체 단백질-절단 효소(BACE, β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme)에 의해 상이한 부위에서(Huse J. T. 등. 2002 J. Biol. Chem. 277 (18): 16278-16284), 및/또는 아미노펩티다제 프로세싱에 의해 발생될 수 있다. 모든 경우에, 전술한 바와 같이 a) 내지 e)에 따라 고리화가 일어날 수 있다.
지금까지, 미지의 글루타밀 사이클라제(EC)에 의해 경로 a)에 상응하는 Glu1-펩타이드에서 pGlu-펩타이드로의 효소성 전환을 지지하는 증거는 없었다(Garden, R. W., Moroz, T. P., Gleeson, J. M., Floyd, P. D., Li, L. J., Rubakhin, S. S., 및 Sweedler, J. V. (1999) J Neurochem 72, 676-681; Hosoda R. 등. (1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57,1089-1095). 현재까지, N-말단에서 양성자화되고, 온화한 알카리성 pH-조건 하에 음하전된 Glu1γ-카복실레이트 부분체(moiety)를 보유하는 Glu1-펩타이드를 고리화할 수 있는, 그러한 효소 활성은 확인되지 않았다.
Gln1-기질에 대한 QC-활성은 pH 7.0 미만에서 급격히 감소된다. 반면, Glu1-전환은 산성 반응 조건에서 일어날 수 있는 것으로 보인다(Iwatsubo, T. et al.1996 Am J Pathol 149, 1823-1830; Russo, C. et al.1977 FEBS Lett 409, 411-416; Russo, C. et al.2001 Neurobiol Dis 8, 173-180; Tekirian, T. L. et al.1998 J Neuropathol Exp Neurol. 57, 76-94 ; Russo, C. et al.2002 J Neurochem 82, 1480-1489 ; Hosoda, R. et al. 1998 J Neuropathol Exp Neurol. 57, 1089-1095; Garden, R. W. et al.1998 J Neuropathol Exp Neurol. 56, 1089-1095; Garden, R. W. et al.1999 J Neurochem 72, 676-681).
본 발명에 따라, QC가 온화한 산성 조건 하에 아밀로이드-β 유도성 펩타이드를 인식하고 변경할 수 있는지 여부를 조사하였다. 그러므로, 상기 효소의 잠재적인 기질로서 펩타이드 Gln3-Aβ(1-11)a, Aβ(3-11)a, Gln3-Aβ(3-11)a, Aβ(3-21)a, Gln3-Aβ(3-21)a 및 Gln3-Aβ(3-40)를 합성하고 조사하였다. 이러한 서열들은 번역후 Glu-아마이드화로 인하여 일어날 수 있는, 천연의 N-말단 및 C-말단에서 절제된(truncated) Glu3-Aβ 펩타이드 및 Gln3-Aβ 펩타이드를 모사하기 위해 선택되었다.
본 발명에 있어서, 파파야 및 인간 QC는 글루타미닐 및 글루타밀 고리화를 둘 다 촉매하는 것으로 나타났다. 명백히, QC의 1차적 생리학적 기능은 호르몬 분비 과정 이전 또는 과정 중에 글루타민 고리화과정에 의해 내분비 세포에서 호르몬 성숙을 완성하는 것이다. 그러한 분비 소체(secretory vesicle)들은 산성 pH인 것으로 알려져 있다. 따라서, 5.0 내지 7.0의 좁은 pH 범위에서 상기 효소의 부차적 활성은 새롭게 발견된, Glu-Aβ 펩타이드를 또한 변형하는 글루타밀 사이클라제 활성일 수 있다. 그러나, Gln-전환에 비해 Glu-고리화가 훨씬 더 늦게 일어나기 때문에, 글루타밀 고리화가 유의한 생리학적 역할을 수행하는지는 의문이 있다. 그러나, 퇴행성 신경질병의 병리학적 소견에 있어서, 상기 글루타밀 고리화가 관련성이 있다.
이러한 효소성 반응의 pH-의존성을 조사하여, 본 발명자들은 비양성자화된 N-말단이 Gln1-펩타이드의 고리화에 필수적이고, 따라서 그 기질의 pKa-값이 QC-촉매작용에 대한 pKa-값과 동일하다는 것을 발견하였다(도 17 참조). 따라서, QC는 아마이드화에 의해 친전자적으로 활성화된 γ-카보닐 탄소 상의 비양성자화된 α-아미노 부분체의 분자내 친핵성 공격을 안정화시킨다(반응식 1).
N-말단 글루타민 함유 펩타이드 상에 존재 하는 1가 하전에 비해, Glu-함유 펩타이드 내의 N-말단 Glu-잔기는 중성 pH 주위에서 주로 2가가 하전되어 있다. 글루타메이트는 γ-카복실 및 α-아미노 부분체에 대해 각각, 약 4.2 및 7.5의 pKa-값을 나타낸다. 즉, 중성 pH 및 그 이상에서, 비록 α-아미노 질소가 부분적으로 또는 전체적으로 비양성자화되고 친핵성이라 할지라도, 상기 γ-카복실기는 비양성자화되어 있고, 따라서 친전자성 카보닐 활성을 나타내지 않는다. 그러므로, 분자내 고리화는 불가능하다.
그러나, 약 5.2 내지 6.5의 pH 범위에서, 상기 두 개의 작용기(functional group)는, 그들 각각의 pKa-값 사이에서, 전체 N-말단 Glu-함유 펩타이드의 약 1 내지 10 %(-NH2) 또는 10 내지 1 %(-COOH)의 농도로, 비-이온화된 형태로 둘 다 존재한다. 그 결과, 온화한 산성 pH-범위에 걸쳐, N-말단 Glu-펩타이드류는 양쪽 기를 하전되지 않게 가지고 있으며, 그러므로, QC가 pGlu-펩타이드로 분자내 고리화되는 중간체를 안정화키는 것이 가능하다. 즉, γ-카복실기가 양성자화되어 있다면, 카보닐 탄소는 비양성자화된 α-아미노기에 의한 친핵성 공격을 허용할 만큼 충분히 친전자성이 된다. 이러한 pH에서, 수산화 이온은 이탈기(leaving group)로서 작용한다(반응식 3). 이러한 가정은 Glu-βNA의 QC 촉매된 전환에 대하여 얻은 pH-의존성 데이터에 의해 확증된다(실시예 11 참조). QC에 의한 Glu-βNA의 글루타민 전환과 반대로, 촉매 작용의 최적 pH는 pH 6.0 근처의 산성 범위, 즉, 양성자화된 γ-카복실기 및 비양성자화된 α-아미노기를 가지고 있는 기질 분자류들이 동시에 많은 pH-범위로 이동한다. 더 나아가, 역학적으로 결정된 7.55 ±0.02의 pKa 값은 적정에 의해 결정된 Glu-βNA의 α-아미노기의 그것(7.57±0.05)과 정확히 일치한다.
생리학적으로, pH 6.0에서 QC-촉매된 글루타메이트 고리화의 2차 속도 상수(또는 특이성 상수, Kcat/KM)는 글루타민 고리화에 대한 것보다 8,000배 더 느린 범위일 수 있다(도 17). 그러나, 양쪽 모델 기질 Glu-βNA 및 Gln-βNA의 비효소성 전환은 무시될 수 있고, 본 발명에서 관측된, 무시될 수 있는 pGlu-펩타이드 형성과 일치한다. 따라서, QC에 의한 pGlu-형성에 대하여, 효소성 대 비-효소성 속도 상수의 비(ratio)로부터 적어도 108의 촉진계수가 얻어질 수 있다(효소 촉매작용에 대한 2차 속도 상수와 각각의 비효소성 고리화 1차 속도 상수와 비교하면, 촉매성 숙달 인자(catalytic proficiency factor)는 Gln- 및 Glu-전환, 각각에 대하여, 109-1010 M-1이다). 이러한 데이터로부터 얻은 결론은 생체 내에서 pGlu-형성을 유발하는 효소성 경로만이 생각될 수 있을 뿐이라는 것이다.
QC는 뇌에 매우 많고, (Gln-)TRH-유사 펩타이드의 30 μM의 성숙에 대해 최근 발견된 0.9 min-1의 높은 전환 속도를 고려할 때(Prokai, L., Prokai-Tatrai, K., Ouyang, X., Kim, H. S., Wu, W. M., Zharikova, A., 및 Bodor, N. (1999) J Med Chem 42,4563-4571), 유사한 반응 조건이 제시된다면 적절한 글루타메이트-기질에 대해서 약 100 시간의 고리화 반감기를 예상할 수 있다. 더욱이, 분비 경로에서 뇌 QC/EC가 구획화되고 편재화되는 경우, 실제적인 생체 내 효소와 기질 농도, 및 반응 조건은 온전한 세포에서 효소성 고리화 작용에 대해 더더욱 유리하게 될 것이다. 그리고, 만일 N-말단 Glu가 Gln으로 변형된다면, pGlu-형성이 QC에 의해 훨씬 더 빠르게 매개될 것으로 예상된다. 시험관에서, 양쪽 반응은 QC/EC-활성의 저해제를 적용함으로써 억제되었다(도 9, 10 및 15).
요약하면, 본 발명은 뇌에 매우 많은 인간 QC가 알츠하이머병에서 발견되는 플라크 침적물의 50% 이상을 구성하는 Glu-Aβ와 Gln-Aβ 전구체로부터, 아밀로이드성 pGlu-Aβ 펩타이드를 형성하는 촉매임을 나타낸다. 이러한 발견은 QC/EC를 노인성 플라크 형성에 역할체이며, 따라서 알츠하이머병의 치료에 신규한 약물 타겟임을 밝힌다.
본 발명의 두 번째 구현예에서, 아밀로이드 β-유도된 펩타이드들은 디펩티딜 펩티다제 Ⅳ(DP Ⅳ) 또는 DP Ⅳ-유사 효소들, 바람직하게는 디펩티딜 펩티다제 Ⅱ(DP Ⅱ)의 기질이다. DP Ⅳ, DP Ⅱ 또는 다른 DP Ⅳ-유사 효소들은 글루타민을 N-말단 아미노산 잔기로 가지는 아밀로이드 β-펩타이드 (3-11)를 생성하면서, 변형된 아밀로이드 β-펩타이드 (1-11)의 N-말단으로부터 디펩타이드를 방출한다. 상기 결과들을 실시예 8에 나타내었다.
문헌에 설명된 바와 같이, DP II, DP Ⅳ 또는 다른 DP Ⅳ-유사 효소에 의한 절단 이전에, 아스파트산(아밀로이드 β-펩타이드의 잔기 1) 및 알라닌(아밀로이드 β-펩타이드의 잔기 2) 사이의 펩타이드 결합은, 이소아스파틸 잔기를 형성하면서 이성화될 수 있다(Kuo, Y.-M., Emmerling, M. R., Woods, A. S., Cotter, R. J., Roher, A. E. (1997) BBRC 237, 188-191; Shimizu, T., Watanabe, A., Ogawara, M., Mori, H. 및 Shirasawa, T. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 381,225-234).
이러한 이소아스파틸 잔기들은 아밀로이드 β-펩타이드를 아미노펩티다제 분해에 대해 내성을 가지도록 하며, 결론적으로 코어 플라크들은 많은 양의 isoAsp1-아밀로이드 β-펩타이드를 포함하고, 이는 N-말단에서의 전환 감소를 말한다.
그러나, 본 발명에서 N-말단 디펩타이드 H-isoAsp1-Ala2-OH가 디펩티딜 펩티다제에 의해, 특히 산성 조건 하에 방출될 수 있다는 것을 처음으로 밝힌다. 더 나아가, 이성화는 또한 β-세크리타제에 의한 절단에 앞서서 일어나며, 단백질 분해 프로세싱을 가속화시켜, 따라서 isoAsp1-아밀로이드 β-펩타이드들의 N-말단 이소아스파틸 결합이 배출되는데에 이르게 되며, 이는 후속적으로 DP II, DP Ⅳ 또는 DP Ⅳ-유사 효소들에 의해 전환됨을 나타내었다(Momand, J. 및 Clarke, S. (1987) Biochemistry 26, 7798- 7805; Kuo, Y.-M., Emmerling, M. R., Woods, A. S., Cotter, R. J., Roher, A. E. (1997) BBRC 237, 188-191). 따라서, 이소아스파틸 형성의 저해는 β-세크리타제에 의한 절단을 감소시키고, 그 다음 아밀로이드 β-펩타이드들의 형성을 감소시킬 수 있다. 또한, DP Ⅱ, DP Ⅳ 또는 DP Ⅳ-유사 효소의 저해로 인한 isoAsp1-아밀로이드 β-펩타이드 전환을 차단하면 Glu3-Aβ를 QC/EC-촉매된 [pGlu3]Aβ로 형성시키는 것을 방지할 수 있을 것이다.
본 발명의 세 번째 구현예에서, DP Ⅳ-활성 저해제 및 QC의 저해제들의 조합을 알츠하이머병 및 다운 증후군 치료에 사용할 수 있다.
DP Ⅳ 및/또는 DP Ⅳ-유사 효소 및 QC의 조합된 효과는 하기에 설명된다:
a) DP Ⅳ 및/또는 DP Ⅳ-유사 효소들은 Aβ(1-40/42)를 절단하고, H-Asp-Ala-OH를 함유한 디펩타이드 및 Aβ(3-40/42)가 방출된다,
b) 부반응에서, QC는 글루탐산을 피로글루탐산으로 매우 낮은 속도로 고리화시키는 것을 촉매한다.
c) 글루탐산은 N-말단에서 번역후 과정으로 미지의 효소 활성에 의해 글루타민으로 전환되고, 이어서 QC는 아밀로이드 β-펩타이드 N-말단의 프로세싱 이후, 글루타민을 피로글루탐산으로 고리화시키는 것을 촉매한다.
d) 글루탐산은 화학적 촉매작용 또는 자가 촉매작용에 의해 번역후 과정으로 글루타민으로 전환되고, 두 번째 단계에서, QC는 아밀로이드 β-펩타이드 N-말단 프로세싱 이후 글루타민을 피로글루탐산으로 고리화시키는 것을 촉매한다.
e) 아밀로이드 β-단백질들 인코딩하는 APP 유전자에 변이가 있어, Aβ의 위치 3에서 Glu 대신 Gln을 나타내게 하며, N-말단의 번역 및 프로세싱 이후, QC는 글루타민을 피로글루탐산으로 고리화시키는 것을 촉매한다.
f) 글루타민은, 미지의 효소 활성의 기능장애로 인해, APP의 신생 펩타이드 사슬에 포함되고, 후속적으로, QC는 아밀로이드 β-펩타이드 N-말단의 프로세싱 이후 N-말단의 글루타민을 피로글루탐산으로 고리화시키는 것을 촉매한다.
QC-활성에 N-말단 Gln을 노출시키는 것은 또한 상이한 펩티다제 활성에 의해 개시될 수 있다. 아미노펩티다제는 Aβ(1-40/42)의 N-말단으로부터 순차적으로 Asp 및 Ala을 제거하고, 따라서 고리화하기 쉬운 아미노산 3을 드러낼 수 있게 한다. DP I, DP Ⅱ, DP Ⅳ, DP 8, DP 9 및 DP 10와 같은 디펩티딜 펩티다제들은 한번에 디펩타이드 Asp-Ala를 제거한다. 따라서, 아미노펩티다제- 또는 디펩티딜펩티다제-활성의 저해는 Aβ(3-40/42) 형성을 예방하는데에 유용하다.
DP Ⅳ 및/또는 DP Ⅳ-유사 효소의 저해제 및 QC 활성 저하 이펙터의 조합된 효과는 하기의 방식으로 설명된다:
a) DP Ⅳ 및/또는 DP Ⅳ-유사 효소의 저해제는 Aβ(l-40/42)에서 Aβ(3-40/42)로의 전환을 저해한다.
b) 이에 따라, 글루탐산의 N-말단 노출은 방지되고, 효소성이건 화학적 촉매작용에 의하건, 후속적으로 피로글루탐산 형성으로 이끄는, 글루타민으로의 전환이 없는 것이 가능하다.
c) QC의 저해제들은 또한, 임의의 잔류된 변형 Aβ(3-40/42) 분자 및 APP 유전자의 돌연변이에 의해 생성되는 그러한 변형된 Aβ(3-40/42) 분자들로부터 피로글루탐산이 형성되는 것을 방지한다.
본 발명 내에서, DP Ⅳ 또는 DP Ⅳ-유사 효소 및 QC의 유사한 조합된 작용은 글루카곤, CC 케모카인 및 기질 P(substance P)과 같은 추가의 펩타이드 호르몬류에 대해 증명되었다.
글루카곤은 이자섬(pancreatic islet) 알파-세포로부터 분비되는 29-아미노산 폴리펩타이드로서, 간의 글리코겐 분해반응 및 포도당 신생반응(gluconeogenesis)을 자극하여 정상혈당(euglycemia)을 유지하는 작용을 한다. 이러한 중요성에도 불구하고, 체내에서 글루카곤 소거를 담당하는 기작에 대해 논란이 있다. Pospisilik 등은 분자 생성물을 확인하는 섬세한 질량 분광분석 기술을 사용하여 글루카곤의 효소 대사를 조사하였다. 글루카곤을 정제된 돼지 디펩티딜 펩티다제 IV (DP Ⅳ)와 함께 항온처리하면 글루카곤 (3-29) 및 글루카곤 (5-29)이 연속적으로 생성되었다. 인간 혈청에서, 글루카곤(3-29)으로 분해 후 글루카곤이 빠르게 N-말단 고리화되고, 추가의 DP Ⅳ-매개 가수분해가 방지되었다. 정제된 DP Ⅳ 또는 정상적인 래트(rat) 혈청으로 항온처리후 글루카곤을 생체시험한 결과 고혈당성 활성이 현저히 손실되었으며, 반면, DP Ⅳ-결핍 래트 혈청에서 유사하게 항온처리하면 글루카곤 생체 활성의 어떠한 손실도 나타나지 않았다. 질량 분광분석 및 바이오어세이(bioassay)로 측정한 결과, 특이성 DP Ⅳ 저해제인, 이소류실 티아졸리딘에 의해 분해가 차단되었다. 이러한 결과는 DP Ⅳ가 글루카곤의 분해 및 불활성화에 관련된 1차적 효소라는 것을 증명한다. 이러한 발견은 인간 혈장 내의 글루카곤 농도를 결정하는 데 중요한 의미를 내포하고 있다(Pospisilik 등., Regul Pept 2001 Jan 12; 96 (3): 133-41).
인간 단핵구 화학주성(Chemotactic) 단백질(MCP-2)는 원래 자극된 골육종(osteosarcoma) 세포로부터 MCP-1 및 MCP-3과 함께 생성된 케모카인으로 분리되었다. Von Coillie 등.(Van Coillie, E. 등. 1998 Biochemistry 37, 12672-12680)은 인간 고환 cDNA 라이브러리로부터 5'-말단 신장된 MCP-2 cDNA를 클론하였다. 이것은 76 개의 잔기를 갖는 MCP-2 단백질을 인코딩하고 있으나, 보고된 골수-유도 MCP-2 cDNA 서열과는 달리, 코돈 46에 있어서 Gln 대신 Lys를 코딩하는 것에 차이가 있었다. 단일 염기 다형성(SNP)에 의해 야기된 이러한 MCP-2Lys46 변이체를 MCP-2Gln46과 생물학적으로 비교하였다. 코딩 부위를 박테리아 발현 벡터 pHEN1에 서브-클론(sub-clone)하고, 대장균(Escherichia coli)에 형질전환한 후에, 세포막과 세포벽 사이의 공간(periplasm)에서 두 개의 MCP-2 단백질 변이체를 회수하였다. 에드만 분해 결과, NH2 말단에서 pGlu 대신 Gln 잔기가 발견되었다. rMCP-2Gln46과 rMCP-2Lys46, 및 상기 NH2-말단 고리형 상응체(counterpart)를 단핵구성 세포상에서 칼슘 동원(mobilization) 및 화학주성 분석법으로 시험하였다. rMCP-2Gln46 및 rMCP-2Lys46 이소폼 사이에는 생물학적 활성에 유의한 차이가 없는 것으로 관찰되었다. 그러나, 양쪽 MCP-2 변이체들에 대하여, NH2-말단 피로글루타메이트는 화학주성에 필수적인 것으로 나타났지만, 칼슘 동원에 있어서는 그렇지 않았다. 세린 프로테아제 CD26/디펩티딜 펩티다제 IV(CD26/DPP IV)에 의해 rMCP-2Lys46의 NH2-말단을 절제하면, NH2-말단 Gln-Pro 디펩타이드가 분비되나, 아미노-말단 pGlu을 갖는 합성 MCP-2는 영향을 받지 않고 남아있었다. CD26/DPP IV-절단된 rMCP-2Lys46(3-76)은 거의 완벽하게 화학주성 및 신호 분석법 모두에서 불활성으로 나타났다. 이러한 관찰은 MCP-2에서 NH2-말단 pGlu가 화학주성 활성에 필수적이라는 것을 의미하나, 또한 그것은 CD26/DPP IV에 의한 분해에 대해서 단백질을 보호한다는 것을 나타낸다(van Coillie, E.. 등. Biochemistry 1998 37,12672-80).
본 발명 내에서, 글루카곤(3-29)(Pospisilik 등., 2001) 및 MCP-2 이소폼 (van Coillie 등., 1998)에서 결정된 N-말단 피로글루타메이트 잔기의 형성은 QC에 의해 촉매된다는 것이 LC/MS-분석으로 밝혀졌다.
또한, 기질 P로부터 두 개의 펩타이드 Lys-Pro 및 Arg-Pro의 N-말단 DP Ⅳ-촉매된 제거 이후, 잔류된 [Gln5] 기질 P 5-11은 QC에 의해 [pGlu5] 기질 P 5-11로 전환된다는 것이 LC/MS-분석에 의해 증명되었다.
DP Ⅳ 저해제들은 WO 99/61431에 개시되어 있다. 특히, 아미노산 잔기와 티아졸리딘기 또는 피롤리딘기, 및 이들의 염, 특히 L-트레오-이소류실 티아졸리딘, L-알로-이소류실 티아졸리딘, L-트레오-이소류실 피롤리딘, L-알로-이소류실 티아졸리딘, L-알로-이소류실 피롤리딘, 및 이들의 염을 포함하는 DP Ⅳ 저해제들이 개시되어 있다.
저분자량 디펩티딜 펩티다제 IV 저해제의 추가적인 예는 테트라히드로이소퀴놀린-3-카복사미드 유도체류, N-치환 2-시아노피롤류 및 -피롤리딘류, N-(N'-치환 글리실)-2-시아노피롤리딘류, N-(치환 글리실)-티아졸리딘류, N-(치환 글리실)-4-시아노티아졸리딘류, 아미노-아실-보로노-프롤릴-저해제류, 사이클로프로필-융합 피롤리딘류 및 헤테로사이클릭 화합물과 같은 제제이다. 디펩티딜 펩티다제 IV의 저해제들이 US 6,380,398, US 6,011,155; US 6,107,317; US 6,110,949 ; US 6,124,305; US 6,172,081; WO 95/15309, WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 198 34 591, WO 97/40832, DE 196 16 486 C 2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105, WO 02/02560 및 WO 02/14271, WO 02/04610, WO 02/051836, WO 02/068420, WO 02/076450; WO 02/083128, WO 02/38541, WO 03/000180, WO 03/000181, WO 03/000250, WO 03/002530, WO 03/002531, WO 03/002553, WO 03/002593, WO 03/004496, WO 03/024942 및 WO 03/024965에 기재되어 있고, 이들의 교시는 전체적으로, 특히 이러한 저해제들, 이들의 정의, 용도 및 이들의 생산에 관해서는 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.
QC 이펙터와 병용하여 사용하기 바람직한 것은 DP Ⅳ 저해제들로서, 예를 들어 Hughes 등. 1999 Biochemistry 38 11597-11603에 개시된 NVP-DPP728A(1-[[[2-[{5-시아노피리딘-2-일}아미노]에틸]아미노]아세틸]-2-시아노-(S)-피롤리딘)(Novartis), Hughes 등., eeting of the American Diabetes Association 2002, Abstract no. 272 (Novartis)에 개시된 LAF-237(1-[(3-히드록시-아다만트-1-일아미노)-아세틸]-피롤리딘-2(S)-카보니트릴); Yamada 등. 1998 Bioorg Med Chem Lett 8, 1537-1540에 개시된 TSL-225(트립토필-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카복실산), Asworth 등. 1996 Bioorg Med Chem Lett 6,, 1163-1166 및 2745- 2748에 개시된 2-시아노피롤리다이드류및 4-시아노피롤리다이드류, Sudre 등. 2002 Diabetes 51, 1461-1469(Ferring)에 개시된 FE-999011, 및 WO 01/34594(Guilford)에 개시된 화합물이고, 상기 참조문헌에 설정된 투약범위를 적용한다.
QC 이펙터들과 조합하여 사용하기 더 바람직한 DP Ⅳ 저해제들은 아미노산이, 예를 들어, 루이신, 발린, 글루타민, 글루탐산, 프롤린, 이소루이신, 아스파라진 및 아스파르트산과 같은 천연 아미노산으로부터 선택된 디펩타이드 화합물이다. 본 발명에 따라 사용되는 디펩타이드-유사 화합물들은 10 μM의 (디펩타이드 화합물의) 농도에서, 혈장 디펩티딜 펩티다제 IV의 활성 또는 DP Ⅳ-유사 효소의 활성을 적어도 10%, 특히 적어도 40% 감소시킨다. 빈번하게, 적어도 60 % 또는 적어도 70 %의 활성 감소 또한 생체 내에 바람직하다. 바람직한 화합물은 또한 활성을 최대 20 % 또는 30 % 감소시킬 수 있다.
바람직한 디펩타이드 화합물은 N-발릴 프로릴, 0-벤조일 히드록실아민, 알라닐 피롤리딘, 이소류실 티아졸리딘 유사 L-알로-이소류실 티아졸리딘, L-트레오-이소류실 피롤리딘 및 이들의 염, 특히 푸마르 염, 및 L-알로-이소류실 피롤리딘 및 이들의 염이다. 특히 바람직한 화합물은 글루타미닐 피롤리딘 및 글루타미닐 티아졸리딘, H-Asn-피롤리딘, H-Asn-티아졸리딘, H-Asp-피롤리딘, H-Asp-티아졸리딘, H-Asp(NHOH)-피롤리딘, H-Asp(NHOH)-티아졸리딘, H-Glu-피롤리딘, H-Glu-티아졸리딘, H-Glu(NHOH)-피롤리딘, H-Glu(NHOH)-티아졸리딘, H-His-피롤리딘, H-His-티아졸리딘, H-Pro-피롤리딘, H-Pro-티아졸리딘, H-Ile-아지디딘, H-Ile-피롤리딘, H-L-알로-Ile-티아졸리딘, H-Val-피롤리딘 및 H-Val-티아졸리딘, 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 이러한 화합물들은 WO 99/61431 및 EP 1 304 327에 개시되어 있다.
더 나아가, 본 발명은 디펩티딜 펩티다제 IV 촉매작용의 경쟁적 조절에 유용한 기질-유사 펩타이드 화합물과 병용하는 QC 이펙터의 용도를 제공한다. 바람직한 펩타이드 화합물은 2-아미노 옥탄산-Pro-Ile, Abu-Pro-Ile, Aib-Pro-Ile, Aze-Pro-Ile, Cha-pro-Ile, Ile-Hyp-Ile, Ile-Pro-알로-Ile, Ile-Pro-t-부틸-Gly, Ile-Pro-Val, Nle-Pro-Ile, Nva-Pro-Ile, Orn-Pro-Ile, Phe-Pro-Ile, Phg-Pro-Ile, Pip-Pro-Ile, Ser(Bzl)-Pro-Ile, Ser(P)-Pro-Ile, Ser-Pro-Ile, t-부틸-Gly-Pro-D-Val, t-부틸-Gly-Pro-Gly, t-부틸-Gly-Pro-Ile, t-부틸-Gly-Pro-Ile-아마이드, t-부틸-Gly-Pro-t-부틸-Gly, t-부틸-Gly-Pro-Val, Thr-Pro-Ile, Tic-Pro-Ile, Trp-Pro-Ile, Tyr(P)-Pro-Ile, Tyr-Pro-알로-Ile, Val-Pro-알로-Ile, Val-Pro-t-부틸-Gly, Val-Pro-Val 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염이고, 여기서 t-부틸-Gly는 하기 화학식으로 정의되고,
Figure 112012076472834-pat00002

또한 Ser(Bzl) 및 Ser(P)는 벤질-세린 및 포스포릴-세린으로 각각 정의된다. Tyr(P)는 포스포릴-타이로신으로 정의된다. 이들 화합물은 WO 03/002593에 개시되어 있다.
본 발명에 따라 QC 이펙터와 병용하여 사용될 수 있는 더욱 바람직한 DP Ⅳ-저해제들은 펩티딜케톤류, 예를 들면,
·2-메틸카보닐-1-N-[(L)-알라닐-(L)-발리닐]-(2S)-피롤리딘 히드로브로마이드, 2-메틸카보닐-1-N-[(L)-발리닐-(L)-프롤릴-(L)-발리닐]-(2S)-피롤리딘 히드로브로마이드,
·2-[(아세틸-옥시-메틸)카보닐]-1-N-[(L)-알라닐-(L)-발리닐]-(2S)-피롤리딘 히드로브로마이드,
·2-[(벤조일-옥시-메틸)카보닐]-1-N-[{(L)-알라닐}-(L)-발리닐]-(2S)-피롤리딘 히드로브로마이드,
·2-{[(2,6-디클로로벤질)티오메틸]카보닐}-1-N-[{(L)-알라닐}-(L)-발리닐]-(2S)- 피롤리딘,
·2-[(벤조일-옥시-메틸)카보닐]-1-N-[글리실-(L)-발리닐]-(2S)-피롤리딘 히드로브로마이드,
·2-[([1,3]-티아졸에티아졸-2-일)카보닐]-1-N-[{(L)-알라닐}-(L)-발리닐]-(2S)-피롤리딘 트리플루오르아세테이트,
·2-[(벤조티아조에티아졸-2-일)카보닐]-1-N-[N-{(L)-알라닐}-(L)-발리닐]-(2S)-피롤리딘 트리플루오르아세테이트,
·2-[(벤조티아조에티아졸-2-일)카보닐]-1-N-[{(L)-알라닐}-글리실]-(2S)-피롤리딘 트리플루오르아세테이드,
·2-[(피리딘-2-일)카보닐]-1-N-[N-{(L)-알라닐}-(L)-발리닐]-(2S)-피롤리딘 트리플루오르아세테이트
및 이들의 다른 약제학적으로 허용 가능한 염이다. 이들 화합물들은 WO 03/033524에 개시되어 있다.
더 나아가, 본 발명에 따르면, 치환된 아미노케톤류가 QC 이펙터와 병용하여 사용될 수 있다. 바람직한 치환된 아미노케톤류는,
·1-사이클로펜틸-3-메틸-1-옥소-2-펜타나미늄 클로라이드,
·1-사이클로펜틸-3-메틸-1-옥소-2-부타나미늄 클로라이드,
·1-사이클로펜틸-3,3-디메틸-1-옥소-2-부타나미늄 클로라이드,
·1-사이클로헥실-3,3-디메틸-1-옥소-2-부타나미늄 클로라이드,
·3-(사이클로펜틸카보닐)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀리늄 클로라이드,
·N-(2-사이클로펜틸-2-옥소에틸)사이클로헥사나미늄 클로라이드 및 이들의 다른 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
프롤린-특이성 프로테아제들의 희귀군 중에서, DP Ⅳ는 원래 폴리펩타이드 사슬의 아미노-말단에서 끝에서 두 번째 잔기로서 프롤린에 특이성이 있는 유일한 막-결합 효소로 생각되었다. 그러나, 다른 분자들, DP Ⅳ와 구조적으로 유사하지 않지만 상응하는 효소활성을 지니는 것들조차 확인되었다. 지금까지 확인된, DP Ⅳ-유사 효소들은 예를 들어, 섬유아세포 활성화 단백질 α, 디펩티딜 펩티다제 IV β, 디펩티딜 아미노펩티다제-유사 단백질, N-아세틸화 α-연결 산성 디펩티다제, 휴지성(quiescent) 세포 프롤린 디펩티다제, 디펩티딜 펩티다제 Ⅱ, 아트락틴(attractin) 및 디펩티딜 펩티다제 IV 관련 단백질(DPP 8), DPL1(DPX, DP6), DPL2 및 DPP 9로서, Sedo & Malik(Sedo 및 Malik 2001, Biochim Biophys Acta, 36506,1-10) 및 Abbott와 Gorrell(Abbott, C. A. 및 Gorrell, M. D. 2002 In : Langner & Ansorge (ed.), Ectopeptidases. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 171-195)의 리뷰 논문에 실려있는 것들이다. 최근에, 디펩티딜 펩티다제 10(DPP 10)의 클로닝과 특성화가 보고되었다(Qi, S. Y. 등., Biochemical Journal Immediate Publication. Published on 28 Mar 2003 as manuscript BJ20021914).
이펙터는, 여기서 사용되는 용어와 같이, 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 효소에 결합하여 이들의 활성을 증가시키는 분자로 정의된다. 몇몇 효소들은 이들의 촉매적 활성에 영향을 주는 작은 분자용 결합 부위를 가지고 있다; 자극 분자는 활성체로 지칭된다. 효소들은 하나 이상의 활성체 또는 저해제를 인지하는 다중부위를 가질 수 있다. 효소들은 다양한 분자의 농도를 인지하고 그 정보를 사용하여 그들 자신의 활성을 변경할 수 있다.
이펙터는 효소가 활성과 비활성 형태 모두를 띨 수 있기 때문에 효소 활성을 조절할 수 있다: 활성체는 양성적 이펙터이고, 저해제는 음성적 이펙터이다. 이펙터는 효소의 활성 부위에서 작용할 뿐 아니라, 규제 부위 또는 알로스테릭(allosteric) 부위에 작용하며, 이 용어는 상기 규제 부위가 촉매작용 부위와 떨어진 곳에 있는 효소의 부분임을 강조하고, 촉매작용 부위에서의 이러한 형태의 규제는 기질과 저해제 간의 경쟁과는 구별하기 위해 사용되었다(Darnell, J., Lodish, H. 및 Baltimore, D. 1990, Molecular Cell Biology 2nd Edition, Scientific American Books, New York, 63 면).
본 발명에 따른 바람직한 이펙터는 QC- 및 EC-활성 저해제이다. 가장 바람직한 것은 QC- 및 EC-활성의 경쟁적 저해제이다.
적절하게, QC- 및 EC-활성의 활성제이다.
본 발명의 펩타이드에서, 각 아미노산 잔기는 아미노산의 일반명에 상응하는, 일-문자 기호 또는 세-문자 기호로, 하기 목록과 같이 나타낸다:
Figure 112012076472834-pat00003

본 명세서에 사용되는, 용어 "QC"는 글루타미닐 사이클라제(QC) 및 QC-유사 효소들을 포함한다. QC 및 QC-유사 효소들은 동일하거나 또는 유사한 효소 활성, 추가로 QC 활성으로 정의된다. 이와 관련하여, QC-유사 효소들은 기본적으로 QC와 분자 구조가 다르다.
본 명세서에 사용되는, 용어 "QC 활성"은 암모니아 배출 하에 N-말단 글루타민 잔기를 피로글루탐산(pGlu*)으로, 또는 N-말단 L-호모글루타민 또는 L-β-호모글루타민을 고리형 피로-호모글루타민 유도체로 분자 내 고리화하는 것으로 정의된다(반응식 1 및 2 참조).
[반응식 1]
QC에 의한 글루타민의 고리화
Figure 112012076472834-pat00004

[반응식 2]
QC에 의한 L-호모글루타민의 고리화
Figure 112012076472834-pat00005

본 명세서에서 사용되는, 용어 "EC"는 QC, 및 글루타메이트 사이클라제(EC)로서의 QC-유사 효소의 부차적 활성, 추가로 EC 활성으로 정의된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어"EC 활성"은 QC에 의한 N-말단 글루타메이트 잔기에서 피로글루탐산(pGlu*)으로의 분자내 고리화로 정의된다(반응식 3 참조).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "금속-의존성 효소"는 촉매 기능을 수행하기 위하여, 결합된 금속이온을 요하고 및/또는 촉매적으로 활성 구조를 형성하기 위해 결합된 금속 이온을 요하는 효소(들)로 정의된다.
[반응식 3]
QC (EC)에 의해 비하전(uncharged)된 글루타밀 펩타이드의 N-말단 고리화
Figure 112012076472834-pat00006

본 발명의 또 다른 양상은, QC의 신규한 생리학적 기질을 확인하는 것이다. 이들은 실시예 5에 기재된는 바와 같이, 포유동물 펩타이드를 사용하여 고리화 실험을 수행하여 확인되었다. 먼저, 인간 QC 및 파파야 QC를 실시예 1에 기재된 바와 같이 분리하였다. 적용된 방법은 실시예 2에 기재되어 있으며 사용된 펩타이드 합성은 실시예 6에 약술되어 있다. 연구 결과를 표 1에 나타내었다.
글루타미닐 사이클라제의 신규한 생리학적 기질
기질 인간 QC 파파야 QC
KM
(μM)		 kcat
(s-1)		 kcat
(mM-1s-1)		 KM
(μM)		 kcat
(s-1)		 kcat/KM
(mM-1s-1)
[Gln1]-가스트린 31±1 54.1±0.6 1745.2±36.9 34±2 25.8±0.5 759±30
[Gln1]-뉴로텐신 37±1 48.8±0.4 1318.9±24.8 40±3 35.7±0.9 893±44
[Gln1]-FPP 87±2 69.6±0.3 800.0±14.9 232±9 32.5±0.4 140±4
[Gln1]-TRH 90±4 82.8±1.2 920.0±27.6 n.d n.d. n.d.
[Gln1]-GnRH 53±3 69.2±1.1 1305.7±53.2 169±9 82.5±1.9 488.2±14.8
[Gln3]-글루카곤(3-29) * *
[Gln5]-기질 P (5-11) * *
*, MALDI-TOF 실험에 의한 정성적으로 결정됨
모든 분석은 실시예 4에서 나타난 인간 또는 식물 QC의 최적 활성과 안정성 범위에서 수행하였다.
N-말단에 글루타민 잔기를 가지며 따라서 QC 효소에 대한 기질이 되는 생리학적 활성 펩타이드의 아미노산 서열을 표 2에 나열되어 있다:
피로글루탐산(pGlu)으로 번역후 전환되는, N-말단에 글루타민 잔기를 가지는 생리학적 활성 펩타이드의 아미노산 서열
펩타이드 아미노산 서열 기능
가스트린 17
Swiss-Prot:P01350		 QGPWL EEEEEAYGWM DF(아마이드) 가스트린은 위점막을 자극하여 염산을 생성 및 분비하고, 판크레아스를 자극하여 그것의 소화효소를 분비하게 한다. 또한 위와 장에서 평활근 수축을 자극하고 혈액 순환 및 물 분비를 증가시킨다.
뉴로텐신
Swiss-Prot: P30990		 QLYENKPRRP YIL 뉴로텐신은 지방 대사 조절에서 내분비 또는 방분비(paracrine) 역할을 한다. 평활근의 수축을 야기한다.
FPP QEP 아마이드 타이로트로핀 방출 호르몬 (TRH)과 관계있는 트리펩타이드는 정장(seminal plasma)에서 발견된다. 최근 FPP가 시험관내 및 생체내에서 정자 생식능력을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 증거를 얻었다.
TRH
Swiss-Prot: P20396		 QHP 아마이드 TRH는 뇌하수체 전엽 선에서 TSH의 생합성 조절자로서 및 중추 및 말초 신경계의 신경전달자/신경조절자로서 작용한다.
GnRH
Swiss-Prot : P01148		 QHWSYGL RP(G) 아마이드 고나도트로핀(gonadotropin)의 분비를 자극; 황체형성 호르몬 및 여포자극호르몬 둘 다의 분비를 자극한다.
CCL16
(작은 유도성 사이토카인 A16)
Swiss-Prot:015467		 QPKVPEW VNTPSTCCLK YYEKVLPRRL VVGYRKALNC
HLPAIIFVTK RNREVCTNPN
DDWVQEYIKD PNLPLLPTRN
LSTVKIITAK NGQPQLLNSQ		 임파구와 단핵구에 대해서 화학주성 활성을 보이나 중성구(neutrophil)에 대해서는 그렇지 않음. 또한 강력한 골수억제(myelosuppressive) 활성을 보임, 골수모세포의 증식을 억제한다. 재조합 SCYA16는 단핵구 및 THP-1 단핵구에 대해 화학주성 활성을 보이나 휴지 임파구 및 중성구에 대해서는 그렇지 않다. RANTES로 미리 발현시켜 탈감작된(desensitized) THP-1 세포에서 칼슘 유동을 유도함.
CCL8
(작은 유도성 사이토카인 A8)
Swiss-Prot: P80075		 QPDSVSI PITCCFNVIN
RKIPIQRLES YTRITNIQCP
KEAVIFKTKR GKEVCADPKE
RWVRDSMKHL DQIFQNLKP		 단핵구, 임파구, 호염기구 및 호산구를 유인하는 화학주성 인자. 신생물 형성 및 염증성 숙주 반응에 역할 가능성. 이 단백질은 헤파린과 결합할수 있다.
CCL2
(작은 유도성 사이토카인 A2)
Swiss-Prot: P13500		 QPDAINA PVTCCYNFTN
RKISVQRLAS YRRITSSKCP
KEAVIFKTIV AKEICADPKQ
KWVQDSMDHL DKQTQTPKT		 단핵구 및 호염기구를 유인하지만 중성구 또는 호산구는 그렇지 않은 화학주성 인자. 단핵구 항-종양 활성을 증가시킴. 건선, 류마티스 관절염 또는 아테롬성 동맥경화증과 같은 단핵구성 침윤으로 특징되는 질병의 병리에 관련됨. 아테롬성 동맥경화증의 질병 진행중에 단핵구를 동맥 벽에 끌어다 놓는데 역할 가능. CCR2 및 CCR4에 결합함.
CCL18
작은 유도성 사이토카인A18)
Swiss-Prot : P55774		 QVGTNKELC CLVYTSWQIP
QKFIVDYSET SPQCPKPGVI
LLTKRGRQIC ADPNKKWVQK
YISDLKLNA 		임파구를 유인하지만 단핵구나 과립구는 그렇지 않은 화학주성 인자. 림프절에서 B 세포가 B 세포 낭으로 이동하는데 관련 가능성. 림프절에서, 순전한 T 임파구를 수지상 세포 및 활성화된 대식세포 쪽으로 유인하고, 천연 T 세포, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대해 화학주성 활성을 가지며 따라서 체액성 및 세포-매개성 면역 반응에서 역할 할 수 있다.
프랙탈킨
(neurotactin)
Swiss-Prot: P78423		 QHHGVT KCNITCSKMT
SKIPVALLIH YQQNQASCGK
RAIILETRQH RLFCADPKEQ
WVKDAMQHLD RQAAALTRNG
GTFEKQIGEV KPRTTPAAGG
MDESWLEPE ATGESSSLEP
TPSSQEAQRA LGTSPELPTG
VTGSSGTRLP PTPKAQDGGP
VGTELFRVPP VSTAATWQSS
APHQPGPSLW AEAKTSEAPS
TQDPSTQAST ASSPAPEENA
PSEGQRVWGQ GQSPRPENSL
EREEMGPVPA HTDAFQDWGP
GSMAHVSVVP VSSEGTPSRE
PVASGSWTPK AEEPIHATMD
PQRLGVLITP VPDAQAATRR
QAVGLLAFLG LLFCLGVAMF
TYQSLQGCPR KMAGEMAEGL
RYIPRSCGSN SYVLVPV 		용해 형태는 T 세포 및 단핵구에 대해서는 화학주성이지만 중성구에 대해서는 그렇지 않다. 막 결합 형태는 백혈구를 내피세포로 흡착시키는 것을 촉진. 내피에서 백혈구 흡착 및 이동 과정에 역할. cx3cr1에 결합
CCL7
(작은 유도성 사이토카인A7)
Swiss-Prot : P80098		 QPVGINT STTCCYRFIN
KKIPKQRLES YRRTTSSHCP
REAVIFKTKL DKEICADPTQ
KWVQDFMKHL DKKTQTPKL		 단핵구 및 호염기구를 유인하지만 중성구는 그렇지 않은 화학주성 인자. 단핵구 항-종양 활성을 증가시킴. 또한 젤라티나제 B의 방출을 유도. 이 단백질은 헤파린과 결합가능. CCR1, CCR2 및 CCR3에 결합.
오렉신(Orexin) A
(Hypocretin-1)
Swiss-Prot O43612		 QPLPDCCRQK TCSCRLYELL
HGAGNHAAGI LTL 		대개는 이러한 상보적 항상성 기능의 복잡한 거동적 및 생리학적 반응을 조화롭게 함으로써 음식 섭취 및 수면-각성 상태를 조절하는데 중요한 역할을 하는 신경펩타이드. 그것은 또한 에너지 대사, 자율신경 기능, 호르몬 균형, 및 체액 조절에서 또한 역할을 수행한다. 오렉신-A는 높은 친화력으로 OX1 R 및 OX2R 둘 다에 결합한다.
기질 P RPK PQQFFGLM
(잔기 14의 절단 이후 Gln5의 고리화)		 타치키닌류에 속함. 타치키닌은 뉴런을 흥분시키고, 거동 반응을 일깨우는 활성 펩타이드로서 강력한 혈관 확장제 및 인슐린 분비촉진제(secretagogues)이고, 많은 평활근을 (직접 또는 간접적으로) 수축시킨다.
네 번째 구현예에서, 펩타이드 Gln1-가스트린(17 및 34 아미노산 길이), Gln1-뉴로텐신 및 Gln1-FPP는 QC의 새로운 생리학적 기질로 확인되었다. 가스트린, 뉴로텐신 및 FPP는 그들의 N-말단 위치에 pGlu 잔기를 포함한다. 이러한 N-말단 pGlu 잔기는 모든 펩타이드에 대하여 QC 촉매작용에 의해 N-말단 글루타민으로부터 형성되는 것으로 나타났다. 그 결과, 이러한 펩타이드들은 N-말단의 글루타민 잔기를 pGlu로 전환시 이들의 생물학적 기능면이 활성화된다.
경상피성 변환(transepithelial transducing) 세포, 특히 가스트린 (G) 세포는 위에의 음식물의 도착과 위산 분비를 맞춘다. 최근의 연구에 따르면, 다수의 활성 생성물이 가스트린 전구체로부터 생성되고, 가스트린 생합성에 다수의 조절 포인트들이 있다는 것이 밝혀졌다. 생합성 전구체 및 중간체(프로가스트린 및 Gly-가스트린)들은 추정되는 성장 인자들이다; 그들의 생성물들, 즉 아마이드화된 가스트린들은 상피세포 증식, 산-생성 체강벽 세포 및 히스타민-분비 장크롬친화성-유사 (ECL) 세포의 분화, 및 ECL 세포에서의 히스타민 합성 및 저장과 관련있는 유전자의 발현을 조절하는 것은 물론, 급성으로 산 분비를 자극한다. 가스트린은 또한 표피성장인자(EGF) 과(family)의 구성원의 생성을 자극하며, 그 다음으로 세포 기능을 저해하지만 표면 상피세포의 성장을 자극한다. 십이지장 궤양 질병 및 위암의 위험이 커지는 것으로 알려진, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)에 감염된 대상(subject)은 높은 혈장 가스트린 농도를 가진다(Dockray, G. J. 1999 J Physiol 15 315-324).
공동(antral) G 세포에서 방출되는 펩타이드 호르몬 가스트린은, 산분비(oxyntic) 점막에서 CCK-2 수용체를 통해 ECL 세포로부터 히스타민의 합성 및 방출을 자극하는 것으로 알려져 있다. 이동된 히스타민은 체강벽 세포 상에 위치하는 H(2) 수용체에 결합함으로써 산 분비를 유도한다. 최근의 연구는, 가스트린은, 그것의 완전히 아마이드화된 형태 및 덜 처리된 형태(프로가스트린 및 글리신-연장 가스트린) 둘 다에서, 위장계에 대한 성장인자라는 것을 또한 제시하고 있다. 아마이드화된 가스트린의 주요 트로픽(tropic) 효과는 위의 산분비 점막을 위한 것이고, 여기서 그것은 위 줄기 세포(gastric stem cell) 및 ECL 세포의 증식을 증가시켜, 체강벽 및 ECL 세포 질량을 증가시키는 결과를 낳는다는 것이 확립되어있다. 반면, 상기 덜 처리된 가스트린(예를 들어, 글리신-연장 가스트린)의 주요 트로픽 효과는 대장 점막으로 보인다(Koh, T. J. 및 Chen, D. 2000 Regul Pept 9, 337-44).
다섯 번째 구현예에서, 본 발명은 QC 활성 증가 이펙터를 위장관계 세포 증식, 특히 위 점막 세포 증식, 상피세포 증식을 자극시키는데에, 산 생성 체강벽 세포 및 히스타민-분비 장크롬친화성-유사(ECL) 세포를 분화시키는데에 또한, ECL 세포에서의 히스타민 합성 및 저장과 연관된 유전자를 발현시키는데는 물론, 활성 [pGlu1]가스트린의 농도를 유지 또는 증가시킴으로써 포유동물에서 급성 산 분비를 자극하기 위한 용도를 제공한다.
여섯 번째 구현예에서, 본 발명은 비활성 Gln1-가스트린의 활성 [pGlu1]가스트린으로의 전환률을 감소시킴으로서 포유동물에서 헬리코박터 파일로리 감염에 의한 또는 이와 무관한 십이지장 궤양 질병 및 위암, 대장암, 그리고 졸리저-엘리슨 증후군(Zolliger-Ellison Syndrome)의 치료를 위한 QC 활성 감소 이펙터의 용도를 제공한다.
뉴로텐신(NT)은 정신분열증의 병리생리학에 관여된 신경펩타이드로서, 이전에 이러한 질병에 이상 제어된(misregulated) 것으로 나타난 신경전달 시스템을 특이적으로 조절하는 것이다. 뇌척수액(CSF) NT 농도를 측정하는 임상 연구에 따라 일련의 정신분열증 환자의 감소된 CSF NT 농도가 효과적인 항정신병 약물 치료에 의해 관련된다는 것이 알려졌다. 척추로 투여된 NT의 거동 및 생화학적 효과는 전신적으로 투여된 항정신병 약물의 그것과 현저히 유사하고, 항정신병 약물은 NT 신경전달을 증가시킨다. 결과적으로, NT가 내인성 항정신병제로서 기능한다. 더욱이, 전형적인 그리고 비전형적인 항정신병 약물은 흑질선조체(nigrastriatal) 및 중뇌변연계의 도파민 말단 부위에서 NT 신경전달을 상이하게 변경시키고, 이러한 효과들은 부작용 장애 및 효능을 각각 예측할 수 있다(Binder, E. B. 등. 2001 Biol Psychiatry 50, 856-872).
일곱 번째 구현예에서, 본 발명은 항정신병 약물의 제조 및/또는 포유동물에서의 정신분열증 치료를 위한 QC 활성 증가 이펙터의 용도를 제공한다. QC 이펙터는 활성 [pGlu1]뉴로텐신의 농도를 유지 또는 증가시킨다.
임신 촉진 펩타이드(FPP, Fertilization prompting peptide), 즉, 갑상선 자극 호르몬 분비 호르몬(TRH, Thyrotrophin releasing hormone)과 연관된 트리펩타이드는 정장에서 발견된다. 시험관내 및 생체내에서 얻은 최근의 증거에 따르면, FPP는 정자 수정능력을 조절하는데에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 특히, FPP는 처음에는 비수정능(무생식능) 정자를 자극하여 "작동 개시(switch on)"가 되게 하고, 더 빠르게 수정능력이 있도록 하지만, 이후의 정자의 자발적 첨체(acrosome) 손실이 진행되지 않도록 하여, 생식 잠재 능력을 잃지 않도록 하기 위해 수정능 획득(capacitation)을 저지시킨다. 이러한 반응들은 아데닐릴 사이클라제(AC)/cAMP 신호 전달 경로를 조절하는 것으로 알려진, 아데노신에 의해 모사(mimicked)되고 증대된다. FPP 및 아데노신 모두 무생식능 세포에서 cAMP 생성을 자극하나 생식능 세포에서는 그것을 저해하는 것으로 나타났으며, FPP 수용체와 함께 아데노신 수용체 및 G 단백질과 어느 정도 상호작용하여 AC의 조절을 이룬다. 이러한 작용들은, 일부가 초기 "작동 개시"에 중요하고 다른 일부는 첨체 반응 자체에 관련된, 다양한 단백질의 타이로신 인산화 상태에 영향을 끼친다. 칼시토닌 및 안지오텐신 Ⅱ 또한 정장에서 발견되고, 무생식능 정자에 대해 시험관 내에서 유사한 효과를 가지며, FPP에 대한 반응을 증가시킬 수 있다. 이러한 분자들은 생체내에서 유사한 효과를 가지며, 생식 잠재능력을 자극하고 유지함으로써 생식능에 영향을 끼친다. FPP, 아데노신, 칼시토닌, 및 안지오텐신 Ⅱ의 이용가능성의 감소 또는 이들의 수용체의 결함은 남성 불임증을 유발한다(Fraser, L. R. 및 Adeoya-Osiguwa, S. A. 2001 Vitam Horm 63, 1-28).
여덟 번째 구현예에서, 본 발명은 피임 약물의 제조 및/또는 포유동물의 수정능력을 감소시키는 약물의 제조를 위한, QC 활성 저하 이펙터의 용도를 제공한다. QC 활성 저하 이펙터는 활성 [pGlu1]FPP의 농도를 감소시켜, 정자 생식능을 방지하고 정자 세포의 불활성화를 가져온다, 반면, QC 활성 증가 이펙터들은 남성 생식능을 자극하고 불임증을 치료할 수 있다는 것으로 나타났다.
아홉 번째 구현예에서, 추가적인 QC의 생리학적 기질은 본 발명 내에서 확인된다. 이들은 Gln1-CCL2, Gln1-CCL7, Gln1-CCL8, Gln1-CCL16, Gln1-CCL18 및 Gln1-프랙탈킨이다(상세한 것은 표 2 참조). 이러한 폴리펩타이드들은 골수성 모세포 증식, 신생물 형성, 염증성 숙주 반응, 암, 건선, 류마티스 관절염, 아테롬성 동맥경화증, 체액성 및 세포성-면역반응, 내피에서의 백혈구 흡착 및 이동 과정의 억제, 그리고 알츠하이머병과 관련된 염증성 과정, FBD와 FDD 같은 병리생리학적 조건에서 중요한 역할을 한다.
B형 간염, 인간 면역결핍 바이러스 및 흑색종에 대한, 몇몇의 세포독성 T 임파구 펩타이드에 기초한 백신이 최근 임상시험에서 연구되었다. 단독으로 또는 다른 종양 항원과 조합하여, 하나의 흥미로운 흑색종 백신 후보로 되는 것은 데카펩타이드 ELA이다. 이러한 펩타이드는 N-말단 글루탐산을 가진 Melan-A/MART-1 항원 면역 발현(immunodominant) 펩타이드 유사체이다. 글루탐산의 아미노기 및 감마-카복실기는 물론 글루타민의 아미노기 및 감마-카복사미드기는 쉽게 축합되어 피로글루타믹 유도체를 형성한다는 것이 보고되었다. 이러한 안정성 문제를 극복하기 위해, 약제학적으로 관심있는 몇몇 펩타이드들이, 약제학적인 특성의 손실 없이, N-말단 글루타민 또는 글루탐산 대신 피로글루탐산을 가지는 것으로 개발되었다. 불행히도 ELA와 비교할 때, 피로글루탐산 유도체(PyrELA)와 N-말단이 아세틸-캡핑된(acetyl-capped) 유도체(AcELA)는 세포독성 T 임파구(CTL) 활성을 이끌어내는데 실패하였다. PyrELA 및 AcELA에 도입된 표면상의 작은 변경에도 불구하고, 이러한 두 개의 유도체는 대개는 특이성 클래스 I 주 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)에 대하여 ELA보다 낮은 친화성을 가진다. 결론적으로, ELA의 전체 활성을 보전하기 위해, PyrELA의 형성을 피해야 한다(Beck A. 등. 2001, J Pept Res 57, 528-38.). 최근, 효소 글루타미닐 사이클라제(QC)가 흑색종에서 과발현된다는 사실이 또한 발견되었다(Ross D. T 등., 2000, Nat Genet 24, 227-35.).
열 번째 구현예에서, 본 발명은 골수성 모세포의 증식, 신생물 형성, 염증성 숙주 반응, 암, 악성 전이, 흑색종, 건선, 류마티스 관절염, 아테롬성 동맥경화증, 체액성 및 세포-매개성 면역반응 장애, 내피조직에서의 백혈구 흡착 및 이동 과정의 억제, 그리고 알츠하이머병과 관련된 염증성 과정, FBD와 FDD와 같은 병리 생리학적 상태의 치료용 의약품을 제조하기 위한 QC 이펙터의 용도를 제공한다.
열한 번째 구현예에서, Gln1-오렉신 A는 본 발명에서 QC의 생리학적 기질로 확인되었다. 오렉신 A는 음식 섭취 및 수면-각성 상태를 조절하는데 중요한 역할을 하는 신경펩타이드(neuropeptide)로서, 대개는 이러한 상보적 항상성 기능의 복잡한 거동적 및 생리학적 반응을 조화롭게 기능한다. 그것은 또한 에너지 대사, 자율신경 기능, 호르몬 균형 및 체액 조절에서도 역할을 수행한다.
열두 번째 구현예에서, 본 발명은 음식 섭취 장애 및 수면-각성상태, 에너지 대사의 항상성 조절 장애, 자율신경 기능 장애, 호르몬 균형 장애 및 체액 조절 장애를 치료하는 약제(medicament)의 제조를 위한 QC 이펙터의 용도를 제공한다.
몇몇의 단백질에서 폴리글루타민의 확장은 파킨슨병 및 케네디병(Kennedy's disease)과 같은 신경퇴행성 질병을 이끈다. 따라서, 그 기작은 대부분 미지로 남아있다. 폴리글루타민 반복체들의 생화학적 특성이 한 가지 가능한 설명을 제시한다: 글루타미닐-글루타미닐 결합에서의 내부 절단 후의 피로글루타메이트 형성은, 폴리글루타미닐 단백질의 이화적 안정성, 소수성, 아밀로이드 생성도 및 신경독성의 증대를 통해 발병에 기여할 수 있다(Saido, T; Med Hypotheses (2000) Mar; 54, 427-9).
열세 번째 구현예에서, 본 발명은 따라서 파킨슨병 및 헌팅톤병의 치료용 양제의 제조를 위한 QC 이펙터의 용도를 제공한다.
열네 번째 구현예에서, 본 발명은 QC의 효소성 활성을 감소 또는 저해하는 일반적인 방법을 제공한다. 저해 화합물의 예 또한 제공된다.
포유동물 QC의 억제는 처음에는 1,10-페난트롤린(phenanthroline) 및 환원된 6-메틸프테린에 대하여만 검출되었다(Busby, W. H. J. 등. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536). EDTA는 QC를 저해하지 않고, 따라서, QC는 금속-의존성 효소가 아니라는 결론에 이른다(Busby, W. H. J. 등. 1987 J Biol Chem 262,8532-8536, Bateman, R. C. J. 등. 2001 Biochemistry 40, 11246-11250, Booth, R. E. 등. 2004 BMC Biology 2). 하지만, 본 발명에서는 1,10-페난트롤린, 디피콜린산, 8-히드록시-퀴놀린 및 다른 킬레이터들에 의한 QC의 저해 특성(도 18, 19) 및 전이 금속 이온에 의한 QC의 재활성화(도 20)에 의해 드러난 바와 같이, 인간 QC 및 다른 동물 QC들은 금속-의존성 효소임이 밝혀졌다. 마지막으로, 상기 금속 의존성은 인간 QC에도 킬레이팅 아미노산 잔기가 보전되어 있다는 것을 보여주는, 다른 금속-의존성 효소와의 서열 비교에 의해 나타난다(도 21). 화합물과 활성-부위 결합 금속 이온과의 상호작용은 QC 활성을 감소 또는 저해하는 일반적 방법을 제시하고 있다. 본 발명에서, 이미다졸 유도체가 강력한 QC 저해제라는 것이 나타난다. 연속 분석법을 사용하여(상세한 것은 실시예 2 참조), 많은 이미다졸 유도체를 고도로 보전된 포유동물 QC들의 구성원으로서 인간 QC를 저해하는 능력에 대하여 분석하였다.
따라서, 본 발명은 저해 유형 및 잠재성 측면에서 QC 활성 저하 이펙터 및 이의 특성으로서, 이미다졸 유도체 및 히스티딘과 이의 유도체를 제공한다. 구조 및 Ki-값은 표 3과 4에 도시되어 있다. 결과는 실시예 7에 상세히 기재하였다.
인간 QC 촉매 반응에서의 이미다졸 유도체의 억제 상수. 결정은 30 ℃에서 0.05 M Tris-HCl pH 8.0으로, 5 mM EDTA를 포함하여 수행함.
화합물 Ki-값(mM) 구조
중심 구조체
이미다졸 0.103±0.004
벤즈이미다졸 0.138±0.005
N-1 유도체
1-벤질이미다졸 0.0071±0.0003
1-메틸이미다졸 0.030±0.001
1-비닐이미다졸 0.049±0.002
옥살산 디이미다졸리다이드 0.078±0.002
N-아세틸이미다졸 0.107±0.003
N-(트리메틸실릴)-이미다졸 0.167±0.007
N-벤조일이미다졸 0.174±0.007
1-(2-옥소-2-페닐-에틸)-이미다졸 0.184±0.005
1-(3-아미노프로필)-이미다졸 0.41±0.01
1-페닐이미다졸 저해없음
1,1'-설포닐디이미다졸 저해없음
C-4(5) 유도체
N-오메가-아세틸히스타민 0.017±0.001
L-히스티딘아마이드 0.56±0.04
H-His-Trp-OH 0.60±0.03
L-히스티디놀 1.53±0.12
L-히스티딘 4.4±0.2
4-이미다졸-카복스알데히드 7.6±0.7
이미다졸-4-카본산 14.5±0.6
메틸에스테르 L-히스타민 0.85±0.04
C-4,5 유도체
5-히드록시메틸-4-메틸-이미다졸 0.129±0.005
4-아미노-이미다졸-5-카르본 산 아마이드 15.5±0.5
4,5-디페닐-이미다졸 저해없음
4,5-디시아노이미다졸 저해없음
C-2 유도체
2-메틸-벤질이미다졸 0.165±0.004
2-에틸-4-메틸-이미다졸 0.58±0.04
2-아미노벤즈이미다졸 1.8±0.1
2-클로로-1H-벤즈이미다졸 저해없음
기타
3-(1H-이미다졸-1-일)-1-(3-메틸벤조[b]티오펜-2-일)프로판-1-온 0.0025±0.0001
Figure 112012076472834-pat00007
4-[(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-3-프로필디히드로퓨란-2-(3H)-온 0.0067±0.0003
Figure 112012076472834-pat00008
4-[2-(1H-이미다졸-1-일)-에톡시]벤조산 0.0034±0.0001
Figure 112012076472834-pat00009
3-[3-(1H-이미다졸-1-일)프로필]-2-티옥소이미다졸리딘-4-온 0.00081±0.00001
Figure 112012076472834-pat00010
5-니트로-2-[2-([{3-(1H-이미다졸-1-일-)프로필}아미노]카보닐)페닐]푸라미드 0.0066±0.0004
Figure 112012076472834-pat00011
N-(4-클로로페닐)-N'-[2-(1H-이미다졸-
1-일)에틸]티오우레아 		0.00165±0.00007
Figure 112012076472834-pat00012
Figure 112012076472834-pat00013
 0.0322±0.0007
Figure 112012076472834-pat00014
 n.d.
이미다조<1.5a>피리딘 0.0356±0.0005
Figure 112012076472834-pat00015
메틸 (2S)-2-{[(2S)-2-아미노-5-(1H-이미다졸-1-일아미노)-5-옥소펜타노일]아미노}-3-메틸부타노에이트 0.164±0.004
Figure 112012076472834-pat00016
L-히스타민 및 이의 두 가지 생물학적 대사물(텔레-메틸히스타민으로도 알려짐)에 의한 QC 억제
화합물 Ki 값(mM) 구조
L-히스타민 0.85±0.04
Figure 112012076472834-pat00017
3-메틸-4-(β-아미노에틸)-이미다졸 0.120±0.004
Figure 112012076472834-pat00018
1-메틸-4-(β-아미노에틸)-이미다졸 n.i.
Figure 112012076472834-pat00019
열다섯 번째 구현예에서, 시스티아민에 기초한, QC 및 QC-유사 효소들의 신규한 새로운 저해제들이 제공된다.
이미다졸 유도체와 히드록사메이트 외에도, 티올 약제들은 종종 메탈-의존 효소의 저해제로서 설명된다(Lowther, W. T. and Matthews,B. W. 2002 Chem Rev 102, 4581-4607; Lipscomb, W. N and Strater, N. 1996 Chem Rev 96, 2375-2433). 게다가, 티올 펩타이드는 Clan MH의 아미노펩티다아제와 관계된 QC의 저해제로서 설명된다(Huntington, K. M. et. al. 1999 Biochemistry 38, 15587-15596). 비록 이러한 저해제들이 포유동물 QCs에 대해서는 비활성이지만, 강력한 경쟁적 QC-저해제로서 시스티아민 유도체를 분리시키는 것을 가능하게 한다(도 23).
본 발명은 일반적으로 하기 화학식 1로 표시될 수 있는 QC-저해제 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하며, 모든 입체이성질체를 포함한다:
Figure 112012076472834-pat00020
화학식 1
상기 식에서,
R1-R6은 각각 H 또는 분지된 또는 비분지된 알킬 사슬, 분지된 또는 비분지된 알케닐 사슬, 분지된 또는 비분지된 알키닐 사슬, 카보사이클릭, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 아자-아미노산, 아미노산 또는 그의 유사체, 펩타이드 또는 그의 유사체이고; 상기 모든 잔기는 선택적으로 치환될 수 있고,
n은 0,1 또는 2이고, 바람직하게는 1, 가장 바람직하게는 0이다.
명세서와 청구항 전체에 걸쳐, "알킬"은 C1 -50 알킬기, 바람직하게는 C1 -30 알킬기, 특히 C1 -12 또는 C1 -8 알킬기로 표시될 수 있다; 예를 들면, 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 부틸기일 수 있다. "alk"라는 표현, 예를 들면, "alkoxy"라는 표현, 그리고 "alkan"라는 표현, 예를 들면 "alkanoyl"라는 표현은 "alkyl"로서 정의될 수 있다; 방향족("aryl") 화합물은 바람직하게는 치환된 또는 선택적으로 비치환된 페닐, 벤질, 나프틸, 비페닐 또는 안트라센기이며, 이는 적어도 8C 원자를 가지는 것이 바람직하다; "alkenyl"이라는 표현은 C2 -10 알케닐기, 바람직하게는 C2 -6 알케닐기로 표시될 수 있는데, 이는 임의의 원하는 위치에 이중 결합을 가지고 치환 또는 비치환될 수 있다; "alkynyl"이라는 표현은 C2 -10 알키닐기, 바람직하게는 C2 -6 알키닐기라고 표시될 수 있는데, 그것은 임의의 원하는 위치에 삼중결합을 가지고 치환 또는 비치환될 수 있다; "substitured" 또는 "substituent"라는 표현은 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 하나 또는 두 개, 알킬, 알케닐, 알키닐, 단일- 또는 다중-가의 아실, 알카노일, 알콕시알카노일 또는 알콕시알킬기로 임의의 원하는 치환이 표시될 수 있다; 앞에서 언급된 치환체들은 측기(side group)로서 하나 또는 그 이상의(그러나 바람직하게는 0) 알킬, 알케닐, 알키닐, 단일- 또는 다중-가의 아실, 알카노일, 알콕시알카노일 또는 알콕시알킬기로 차례로 가질 수 있다.
명세서와 청구항 전체에 걸쳐 "acyl"이라는 표현은 C1 -20 아실 잔기, 바람직하게는 C1 -8 아실 잔기, 특히 바람직하게는 C1 -4 아실 잔기로 표시될 수 있다; 그리고 "carbocyclic"은 C3 -12 카복실 잔기, 바람직하게는 C4, C5 또는 C6 카복실 잔기로 표시될 수 있다. "Heteroaryl"은 아릴 잔기로 정의될 수 있는데, 상기에서 1 내지 4, 더 바람직하게는 1, 2 또는 3 고리 원자들이 N, S 또는 O과 같은 헤테로원자로 치환된다. "Heterocyclic"은 사이클로알킬 잔기로, 상기에서 1, 2 또는 3 고리 원자는 N, S 또는 O과 같은 헤테로원자로 치환된다.
"펩타이드 유사체(Peptide mimetics)" 자체는 당업자에게 알려져 있다. 이들은 바람직하게는 펩타이드와 같은 2차 구조를 가지는 조성물, 그리고 선택적으로 추가의 구조화된 특성을 가지는 조성물로 정의된다; 그것의 작용 형태는 본래 펩타이드의 작용 형태와 크게 비슷하거나 동일하다; 그러나, 그것의 작용(예를 들면, 길항제 또는 저해제로서의 작용)은 본래 펩타이드, 특히 수용체나 효소와의 비교를 위해 변경될 수 있다. 더욱이, 그들은 본래 펩타이드의 효과를 모방할 수 있다(길항제). 펩타이드 유사체의 예로는 골격 유사체(scaffold mimetics), 비펩타이드성 유사체, 펩토이드, 펩타이드 핵산, 올리고피롤리논, 바이닐로그펩타이드 및 올리고카바메이트가 있다. 이러한 펩타이드 유사체들의 정의는 Lexikon der Chemie, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin, 1999에서 볼 수 있다.
"아자-아미노산(aza-amino acid)"는 키랄성α-CH기가 질소원자로 치환된 아미노산으로 정의되며, 반면 "아자-펩타이드(aza-peptide)"는 펩타이드 사슬 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 키랄성 α-CH기가 질소원자로 치환된 펩타이드를 말한다.
티올 및 아미노기의 역할은 표 5에서 보는바와 같이 디메틸시스테아민, 시스테아민, 머캅토에타놀, 에틸렌디아민, 에타놀아민의 억제 효능의 비교에 의해 나타난다. 오직 아미노 및 티올기를 갖는 화합물만 효능이 있고, 둘 중의 어떤 기의 결실 또는 변경은 억제 능력을 감소시킨다. 더욱이, 시스테아민, 디메틸시스테아민 및 머캅토에타놀에 의한 뮤린 QC의 억제의 pH-의존성은 차이를 보이는데, 그 억제의 양성자화 상태는 저해제가 활성 부위에 결합하는 것에 영향을 준다(도 22).
QC를 저해하기 위한 시스테아민-유도된 화합물들의 효능 비교(n.i., 5mM의 농도, pH = 8.0, 30℃ 그리고 샘플 내 기질 농도 1KM에서 저해가 검출되지 않음, n.d., 측정되지 않음)
화합물 K i -값( mM ) 구조
시스테아민 0.043±0.002
Figure 112012076472834-pat00021
디메틸-시스테아민 0.0190±0.0002
Figure 112012076472834-pat00022
디에틸-시스테아민 0.0109±0.0004
Figure 112012076472834-pat00023
머캅토에타놀 3.91±0.08
Figure 112012076472834-pat00024
에틸머캅탄 n.d.
Figure 112012076472834-pat00025
에틸렌디아민 n.i.
Figure 112012076472834-pat00026
에타놀아민 n.i.
Figure 112012076472834-pat00027
놀랍게도, 효소 활성을 특성화하는 동안, N-말단 글루타미닐 잔기 외에, N-말단의 β-호모-글루타미닐 잔기 또한 식물 및 동물로부터 유래한 QC 기질로서 특성을 수행하는 것이 발견되었다. N-말단의 β-호모-글루타미닐 잔기는 각각 인간 및 파파야 QC의 촉매작용에 의해 5-원자 락탐 고리로 전환되었다. 결과는 실시예 5에 기재하였다. 적용된 방법은 실시예 2에 나타내었으며, 펩타이드 합성은 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행되었다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예는 QC 이펙터를 스크리닝하는 방법을 포함한다.
하나의 군의 화합물로부터 QC 활성 변경 이펙터를 확인하는 바람직한 스크리닝 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
a) 상기 화합물들과 QC를 이들 간에 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 단계;
b) QC 기질을 첨가하는 단계;
c) 기질의 전환을 관측하거나 또는 선택적으로 잔류 QC 활성을 측정하는 단계;
d) 기질 전환 및/또는 QC의 효소 활성에서의 변화를 계산하여 활성 변경 이펙터를 확인하는 단계.
다른 바람직한 스크리닝 방법은 QC 활성-부위 결합 이온과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 이펙터의 확인 및 선택 방법에 관한 것이고, 하기의 단계들을 포함한다:
a) 상기 화합물과 QC를 이들 간에 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 단계;
b) QC에 의해 전환되는 QC 기질을 첨가하는 단계;
c) 기질의 전환을 관측하거나 또는 선택적으로 잔류 QC 활성을 측정하는 단계; 및
d) 기질 전환 및/또는 QC의 효소 활성에서의 변화를 계산하는 것으로, 상기 변화는 QC 활성 변경 이펙터를 확인하는 데에 사용될 수 있는 단계.
전술한 스크리닝 방법에 있어서 바람직한 것은 포유동물 QC 또는 파파야 QC이다. 특히, 바람직한 것은 포유동물 QC이고, 이는 이러한 스크리닝 방법에 의해 확인된 이펙터들이 포유동물, 특히 인간의 질병을 치료하기 위해 사용될 것이기 때문이다.
전술한 스크리닝 방법에 의해 선택된 제제는 적어도 하나의 QC 기질의 전환을 저하시키거나(음성적 이펙터, 저해제), 적어도 하나의 QC 기질의 전환을 증가시킴으로써(양성적 이펙터, 활성체) 작동할 수 있다.
본 발명의 화합물은 산 부가 염, 특히 약제학적으로 허용가능한 산 부가 염으로 전환될 수 있다.
본 발명의 화합물의 염은 무기염 또는 유기염의 형태로 있을 수 있다.
본 발명의 화합물은 산 부가 염, 특히 약제학적으로 허용가능한 산 부가 염으로 전환되고 사용될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 일반적으로 기본 측쇄가 무기 또는 유기산으로 양성자화된 형태를 취한다. 대표적인 유기 또는 무기산은 염화수소산, 브롬화수소산, 과염소산, 황산, 질산, 인산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 만델산, 메탄술폰산, 히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 옥살산, 파모산(pamoic acid), 2-나프탈렌술폰산, p-톨루엔술폰산, 사이클로헥산설팜산, 실리실산, 사카린(saccharinic)산 또는 트리플루오로아세트산을 포함한다. 본 발명의 화합물의 모든 약제학적으로 허용가능한 산 부가 염 형태는 본 발명의 범위 내에 포함되어 있다.
유리(free) 화합물 및 이들의 염의 형태인 화합물간의 밀접한 관계의 관점에서, 본 명세서에서 화합물이 언급될 때마다, 상응하는 염이 조건 하에 가능하거나 적절하다면, 또한 포함되도록 의도되는 것이다.
따라서 본 발명에 따른 화합물들이 적어도 하나의 키랄 중심을 가지고 있을 때, 이들은 거울 이성질체(enantiomer)로서 존재할 수 있다. 상기 화합물들이 둘 이상의 키랄 중심을 가지고 있을 때, 이들은 부가적으로 부분입체이성질체(diastereomer)로서 존재할 수 있다. 이러한 모든 이성질체 및 이들의 혼합물은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 더 나아가, 상기 화합물의 결정 형태 일부는 다형체로서 존재할 수 있고, 그러한 것은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 또한, 상기 화합물의 일부는 물에서 용매화합물(즉, 수화물) 또는 통상의 유기 용매를 형성할 수 있고, 그러한 용매화합물들은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
염을 포함하는 이들 화합물은 또한 이들의 수화물 형태로 얻어질 수 있거나, 또는 이들의 결정화에 사용되는 다른 용매를 포함할 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상에서 QC 효소 활성의 조절에 의해 매개되는 상태를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는바, 이는 본 발명의 임의의 화합물 또는 이들의 약제학적 조성물을 다량으로 투여하고, 상기 상태를 치료하는데 치료학적으로 효과적인 섭생법으로 투약하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 이들의 상응하는 약제학적으로 허용가능한 산 부가 염 형태를, 대상에서 QC 활성의 조절에 의해 매개되는 상태를 예방 또는 치료하는 의약품의 제조를 위한 용도를 포함한다. 상기 화합물은 정맥내, 경구, 피하, 근육내, 피부내, 비경구 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 통상적인 투여 경로로 환자에게 투여될 수 있다.
추가의 바람직한 구현 형태에서, 본 발명은 약제학적 조성물, 즉, 본 발명의 적어도 하나의 화합물 또는 이들의 염, 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 용매와 병용하는 것을 포함하는 약제에 관한 것이다.
상기 약제학적 조성물은, 예를 들어, 비경구 또는 장관 제형의 형태로 있을 수 있고 적절한 담체를 포함할 수 있고, 또는 경구 투여에 적합한 담체를 포함하는 경구 제형으로 있을 수 있다. 바람직하게는, 경구투여의 형태이다.
본 발명에 따라 투여된 QC 활성 이펙터는 QC- 및 EC- 활성 저해제로서 약학적으로 투여 가능한 제형 또는 제형 복합체일 수 있고, 바람직하게는 경쟁적 저해제, 또는 포유동물에서 QC 단백질 농도를 낮추는 효소 저해제, 경쟁적 효소 저해제, 기질, 가기질(pseudosubstrate), QC 발현의 저해제, 결합 단백질 또는 이들 효소 단백질의 항체와 병용하여 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 환자와 질병에 대해, 특히 개인적 내성, 알레르기 및 부작용을 피하기 위해, 개별적으로 치료를 조정할 수 있다.
상기 화합물은 또한 시간의 함수로서 달라지는 활성 정도를 나타낸다. 치료하는 의사에게는 이에 따라 환자의 개별적인 상황에 따라 상이하게 반응하는 기회가 주어진다: 그는 한편으로는, 작용 개시 속도를, 다른 한편으로는 작용 기간, 특히 작용 강도를 정확하게 조정할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 치료 방법은 포유동물에서 QC 효소 활성의 조절로 매개되는 상태의 예방 또는 치료에 대한 새로운 접근을 제시한다. 유리하게는, 그것은 포유동물에, 특히 인간 약제에, 간단하고, 상업적 적용이 가능하고, 사용하기 적합한, 특히 예를 들어, 표 1 및 2에 열거된 생리학적 활성 QC 기질의 불균형적 농도에 기초한 질병의 치료에 사용하기에 적합하다.
예를 들어, 상기 활성 성분을 선행기술로부터 알려진 희석제, 부형제 및/또는 담체와 같은 통상적인 부형제와 병용하는 것을 포함하는 약제학적 제조의 형태로 화합물을 유리하게 투여할 수 있다. 예를 들어, 이들은 비경구(예를 들어 생리식염수에 포함되어 정맥 내로) 또는 장관으로(예를 들어, 통상적인 담체와 제제되어, 경구로) 투여될 수 있다.
상기 화합물의 하나 이상의 일일 투여량이, 내생적 안정성 및 생체 이용가능성에 따라, 원하는 정상혈당치를 이루도록 제시될 수 있다. 예를 들어, 인체에서 이러한 투약 범위는 일일 약 0.01 mg 내지 250.0 mg의 범위일 수 있고, 바람직하게는 체중 킬로그람당 화합물 약 0.01 내지 100 mg의 범위일 수 있다.
QC 활성 이펙터를 포유동물에 투여함으로써, 알츠하이머병, 다운 증후군, 가족력 브리티쉬 치매(FBD)와 가족력 덴마크 치매(FDD), 헬리코박터 파일로리 감염에 의한 또는 이와 무관한 궤양 질병 및 위암, 대장암, 졸리저-엘리슨 증후군, 병원성 정신이상증, 정신분열증, 불임증, 신생물 형성, 염증성 숙주 반응, 암, 건선, 류마티스 관절염, 아테롬성 동맥경화증, 체액성 및 세포-매개성 면역반응 장애, 내피에서의 백혈구 흡착 및 이동 과정, 음식 섭취 장애, 수면-각성 상태, 에너지 대사의 항상성 조절 장애, 자율신경 기능 장애, 호르몬 균형 장애 및 체액 조절 장애로부터 선택된 상태를 예방 또는 완화시키거나 치료할 것이다.
더 나아가, QC 활성 이펙터를 포유동물에 투여함으로써, 위장관계 세포 증식, 바람직하게는 위 점막 세포, 상피 세포의 증식, 산 생성 체강벽 세포 및 히스타민-분비 장크롬친화성-유사 세포의 급성 산 분비 및 분화를 자극하는 것이 가능할 것이다.
또한, QC 저해제를 포유동물에 투여하면 정자 세포 기능의 손실에 이르게 되고, 따라서 남성 생식능을 억제시킨다. 따라서, 본 발명은 남성 생식능을 규제 및 조절하는 방법 및 QC 활성 저하 이펙터를 남성 피임약으로 제조하기 위한 용도를 제공한다.
더 나아가, QC 활성 이펙터를 포유동물에 투여함으로써, 골수성 모세포의 증식을 억제하는 것이 가능할 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 화합물은, 따라서 원래 공지된 방식으로, 불활성, 비-독성, 약제학적으로 적합한 담체 및 부형제 또는 용매를 사용하여, 예를 들어, 정제, 캡슐, 당제, 알약, 좌약, 과립, 에어로솔, 시럽, 액상, 고상 및 크림-유사 에멀젼 및 현탁액 및 용액과 같은 통상적인 제형으로 전환될 수 있다. 이러한 각 제형에서, 치료학적으로 유효한 화합물은 바람직하게는 전체 혼합물의 약 0.1 내지 80 중량 %, 더 바람직하게는 1 내지 50 중량 %로, 즉 얻고자하는 전술한 투약 수준에 충분한 양으로 있다.
상기 기질들은 당제, 캡슐, 이중 캡슐, 정제, 점적액, 시럽 형태의 약품으로, 또는 또한 좌약으로 또는 비강 분무제로서 사용될 수 있다.
상기 제형들은 유리하게는, 예를 들어, 활성 성분을 용매 및/또는 담체로 증량함으로써 제조할 수 있는데, 가능하다면, 예를 들어 물이 희석제로서 사용되는 경우, 선택적으로 유화제 및/또는 분산제를 보조용매로서 선택적으로 사용되는 유기용매에 대해 사용할 수 있다.
본 발명과 관련하여 유용한 부형제의 예는: 물; 파라핀류(예를 들어 천연 오일 분), 식물성 기름(예를 들어 평지씨유, 땅속열매 기름, 참기름), 알콜류(예를 들어 에틸 알콜, 글리세롤), 글리콜류(예를 들어 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜)와 같은 비-독성 유기용매; 예를 들어, 천연 분말 광물(예를 들어 고도로 분산된 실리카, 실리케이트), 당류(예를 들어 원당, 락토즈 및 덱스트로즈)와 같은 고체형 담체; 비이온성 및 음이온성 유화제류(예를 들어 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르, 알킬설포네이트류 및 아릴설포네이트류)와 같은 유화제류; 분산제류(예를 들어 리그닌, 설파이트 액, 메틸셀룰로즈, 전분 및 폴리비닐피롤리돈); 윤활제(예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 탤컴(talcum), 스테아르산 및 소듐 라우릴 설페이트) 및 선택적으로 향료제를 포함한다.
투여는 일반적인 방식, 바람직하게는 장관 또는 비경구, 특히 경구적으로 수행될 수 있다. 장관 투여의 경우, 정제들은 전술한 담체 외에도 소듐 사이트레이트, 칼슘 카보네이트 및 칼슘 포스페이트와 같은 추가의 부형제를, 바람직하게는 감자 전분, 젤라틴 등과 같은 다양한 부형제와 함께 포함할 수 있다. 더 나아가, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 탤컴과 같은 윤활제는 정제(tabletting) 함께 사용될 수 있다. 경구 투여용 수성 현탁액 및/또는 엘릭시르(elcxir) 경우, 다양한 맛의 중화제 또는 착색제가 전술한 부형제에 더하여 활성 성분에 첨가될 수 있다.
비경구 투여의 경우, 적합한 액상 담체를 사용하는 활성 성분의 용액이 사용될 수 있다. 일반적으로, 정맥내 투여의 경우, 효과적인 결과를 얻기 위해서는, 체중 kg당, 일일 약 0.01 내지 2.0 mg, 바람직하게는 약 0.01 내지 1.0 mg의 양을 투여하고, 장관 투여의 경우 투여량은 체중 kg당 일일 약 0.01 내지 2 mg, 바람직하게는 약 0.01 내지 1 mg인 것이 유리하다.
하지만 어떠한 경우 실험 동물 또는 환자의 체중에 따라 또는 투여 경로의 유형에 따라, 뿐만 아니라 동물의 종류 및 약제에 대한 개별적 반응, 또는 투여되는 간격을 기초로하여, 전술한 것과 다른 투여량이 필요할 수 있다. 따라서, 어떤 경우는 전술한 최소량보다 더 적은 양을 사용하는 것이 충분할 수도 있는 반면, 다른 경우에는 전술한 상한치가 초과되어야만 한다. 상대적으로 많은 양이 투여되는 경우, 이러한 양을 하루에 걸쳐 몇 번의 단일 투여량으로 나누는 것이 바람직하다. 인간 약제로 투여시, 상기와 동일한 투약 범위가 주어진다. 이 경우 전술한 것이 유사하게 적용된다.
본 발명의 이러한 양상 및 다른 양상을 하기 도면을 참조함으로써 더욱 잘 이해될 것이다:
도 1은 340 nm에서 흡광도 감소를 측정하여, 인간 QC에 의해 촉매된, H-Gln-Ala-OH의 고리화에 대한 진행 곡선을 나타낸다. 샘플들은 0.3 mM NADH/H+, 14 mM α-케토글루타르산, 30 U/ml 글루탐 탈수소효소 및 1 mM H-Gln-Ala-OH를 포함하였다. 곡선 A-D에 있어서, 다양한 농도의 QC가 적용되었다: A, 10 mU/m, B, 5 mU/ml, C, 2.5 mU/ml. 곡선 D의 경우, QC를 적용하지 않았다. QC 농도 및 관측된 활성 (삽입도) 사이에 선형적 연관성이 관찰되었다.
도 2는 Gln-βNA을 기질로 사용하여 1차 속도 하에서 측정시, 인간 및 파파야 (삽입도) QC의 pH 의존성을 나타낸다. 인간 QC의 경우, 25 mM MES, 25 mM 아세트 산 및 50 mM 트리스 (Ellis, K. J. 및 Morrison, J. F. 1982 Methods Enzymol. 87,405-426)로 구성되는, 엘리스 및 모리슨에 따른 일정한 이온 강도를 제공하는 완충 시스템을 사용하였다. 트리스의 약한 억제 효과로 인해, 파파야 QC는 50 mM 몹스(Mops) 완충액을 사용하여 조사되었다. NaCl을 첨가하여, 이온강도를 0.05M로 조절하였다. 속도 분포상(rate profile)은 분리기에 기초한 모델에 맞춤으로써 평가되었다. 파파야 QC의 경우, 상기 데이터를 단일 분리 모델에 맞춤으로써 pKa 7.13 ±0.03을 얻었다.
도 3은 파파야 라텍스에서 유래한 QC 및 인간 QC의 안정성에 대한 pH의 효과를 나타낸다. 효소 저장 용액을 다양한 pH 값의 0.1 M 완충액(pH 4 내지 7 소듐 사이트레이트, pH 7 내지 10 소듐 포스페이트)에 20배로 희석시켰다. 효소 용액을 30 ℃에서 30분간 처리하고 후속적으로 효소 활성을 표준 방법에 따라 분석하였다.
도 4는 두 번째 아미노산 위치에서 글루타메이트를 포함하는 일단의 기질에 대한 특이성 상수 kcat/KM을 비교한 도면이다. 디펩타이드 내지 테트라펩타이드로부터 인간 QC의 특이성 증가가 나타나는 반면, 파파야 QC의 경우 아무런 변화가 관측되지 않았다. 여기서 주어진 데이터는 표 3에 제시된 파라미터를 재도시한 것이다.
도 5는 인간 QC에 의해 촉매된, H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2로부터의 pGlu-Lys(pGlu)-Arg-Leu-Ala-NH2의 형성을 나타낸다. 기질 전환은 암모니아의 배출로 인하여 m/z 비율에서 시간-의존적 변화로 관찰하였다. 샘플 조성물은 0.5 mM 기질, 38 nM QC를 포함한 40 mM Tris/HCl, pH 7.7이었다. 지시된 시간에, 샘플을 분석 튜브로부터 제거하고, 매트릭스 용액과 혼합(1:1 v/v)한 후, 질량 스펙트럼을 기록하였다. 파파야 QC의 경우 매우 유사한 의존성이 관측되었다.
도 6은 파파야 QC에 의해 촉매된, H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2로부터의 pGlu-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2의 형성을 나타낸다. 기질 전환은 메틸아민의 배출로 인하여 m/z 비율에서 시간 의존적 변화로 관찰하였다. 샘플 조성물은 0.5 mM 기질, 0. 65 μM 파파야 QC를 함유한 40 mM Tris/HCl, pH 7.7이었다. 지시된 시간에, 샘플을 분석 튜브로부터 제거하고, 매트릭스 용액과 혼합(1:1 v/v)한 후, 질량 스펙트럼을 기록하였다. 샘플 내에는 파파야 QC 없이 또는 인간 QC를 1.5 μM까지 기질에 적용하기 까지는(미도시) 어떠한 기질 전환도 관찰되지 않았다.
도 7은 DP Ⅳ에 의해 촉매된, Gln3-Aβ(1-11)로부터 Gln3-Aβ(3-11)의 형성을 나타낸다. 지시된 시간에, 샘플을 분석 튜브로부터 제거하고, 매트릭스 용액과 혼합(1:1 v/v)한 후, 질량 스펙트럼을 기록하였다.
도 8은 DP Ⅳ-저해제 Val-피롤리다이드 (Val-Pyrr)에 의한 Gln3-Aβ(1-11)의 절단의 방지를 나타낸다. 지시된 시간에, 샘플을 분석 튜브로부터 제거하고, 매트릭스 용액과 혼합(1:1 v/v)한 후, 질량 스펙트럼을 기록하였다.
도 9는 QC에 의해 촉매된, Gln3-Aβ(3-11)로부터 pGlu3-Aβ(3-11)의 생성을 나타낸다. 지시된 시간에, 샘플을 분석 튜브로부터 제거하고, 매트릭스 용액과 혼합(1:1 v/v)한 후, 질량 스펙트럼을 기록하였다.
도 10은 QC-저해제 1,10-페난트롤린에 의한 Gln3-Aβ(3-11)로부터의 [pGlu3]Aβ(3-11) 형성 저해를 나타낸다. 지시된 시간에, 샘플을 분석 튜브로부터 제거하고, 매트릭스 용액과 혼합(1:1 v/v)한 후, 질량 스펙트럼을 기록하였다.
도 11은 DP Ⅳ 및 QC에 의한 연속적 촉매작용 후 Gln3-Aβ(1-11)로부터 [pGlu3]Aβ(3-11)의 형성을 나타낸다. 지시된 시간에, 샘플을 분석 튜브로부터 제거하고, 매트릭스 용액과 혼합(1:1 v/v)한 후, 질량 스펙트럼을 기록하였다.
도 12는 촉매적으로 활성인 DP Ⅳ 및 QC의 존재 하에서 QC-저해제 1,10-페난트롤린에 의한 Gln3-Aβ(1-11)로부터 [pGlu3]Aβ(3-11)의 형성 억제를 나타낸다. 지시된 시간에, 샘플을 분석 튜브로부터 제거하고, 매트릭스 용액과 혼합(1:1 v/v)한 후, 질량 스펙트럼을 기록하였다.
도 13은 촉매적으로 활성인 DP Ⅳ 및 QC의 존재 하에서 DP Ⅳ-저해제 Val-Pyrr에 의한 Gln3-Aβ(1-11)로부터 [pGlu3]Aβ(3-11)의 형성 감소를 나타낸다. 지시된 시간에, 샘플을 분석 튜브로부터 제거하고, 매트릭스 용액과 혼합(1:1 v/v)한 후, 질량 스펙트럼을 기록하였다.
도 14는 돼지 뇌하수체 분쇄물에 존재 하는 아미노펩티다제(들) 및 QC에 의한 연속적인 촉매작용 후 Gln3-Aβ(1-11)로부터 [pGlu3]Aβ(3-11)의 형성을 나타낸다. 지시된 시간에, 샘플을 분석 튜브로부터 제거하고, 매트릭스 용액과 혼합(1:1 v/v)한 후, 질량 스펙트럼을 기록하였다.
도 15A 및 도 15B는 사용 전에 10분간 가열한 재조합 인간 QC와 함께 항온처리한(incubate) Aβ(3-ll)a 및 Aβ(3-21)a의 질량 스펙트럼을 나타낸다. 도 15C와 도 15D는 활성 인간 QC 존재 하에서 Aβ(3-11)a 및 Aβ(3-21)a의 질량 스펙트럼으로, 각각 [pGlu3]Aβ(3-11)a 및 [pGlu3]Aβ(3-21)a를 형성하는 것을 나타낸다. 도 15E와 도 15F는 활성 QC 및 5 mM 벤즈이미다졸의 존재 하에서의 Aβ(3-11)a 및 Aβ(3-21)a의 질량 스펙트럼으로, [pGlu3] 형성을 억제하는 것을 나타낸다.
도 16은 기질농도에 대하여 플로팅된, 파파야 QC-촉매된 Glu-βNA-전환의 반응속도를 나타낸다. 개시 속도는 0.1 M 피로인산염(pyrophosphate) 완충액, pH 6.1(사각형), 0.1 M 인산염 완충액, pH 7.5(원형) 및 0.1 M 보레이트(borate) 완충액, pH 8.5 (삼각형)에서 측정되었다. 역학적 파라미터는 하기와 같다: KM = 1.13 ±0.07 mM, kcat = 1.13 ±0.04 min-1(pH 6.1); KM = 1.45 ±0.03 mM, kcat = 0.92 ±0.01 min-1(pH 7.5); KM = 1.76 ±0.06 mM, kcat = 0.56 ±0.01 min-1(pH 8.5).
도 17은 일차 속도 법칙 조건(S<<KM)하에 결정된, Gln-βNA(원형) 및 Glu-βNA(사각형)의 전환시 pH-의존성을 나타낸다. 기질 농도는 각각 0.01 mM 및 0.25 mM 이었다. 두 결정 모두 0.05 M 아세트산, 0.05 M 피로인산 및 0.05 M 트리신으로 구성된 삼 성분 완충액 시스템을 적용하였다. 모든 완충액은 이온 강도의 차이를 피하기 위해, NaCl을 첨가하여 전도성이 동일하도록 조정하였다. 데이터를 두 개의 해리기(dissociating group)에 대해 설정된 식에 맞추었고, pKa-값은 Gln-βNA에 대해서는 6.91 ±0.02이고, 9.5 ±0.1 및 Glu-βNA에 대해서는 4.6 ±0.1 및 7.55 ±0.02임을 밝혔다. 적정으로 결정된, 각 기질 아미노기의 pKa 값은 6.97 ±0.01(Gln-βNA) 및 7.57 ±0.05(Glu-βNA)이었다. 모든 결정은 30 ℃에서 수행되었다.
도 18은 이미다졸, 디피콜린산의 존재 하 및 저해성 화합물의 부재 하에서, 인간 QC-촉매된 H-Gln-AMC의 고리화의 진행 곡선을 나타낸다. 디피콜린산의 존재 하에서 곡선의 하이퍼볼릭 모양은 QC 활성 부위로부터 금속 이온이 제거되었음을 나타낸다.
도 19는 헤테로사이클릭 킬레이터 1,10-페난트롤린에 의한 QC의 시간-의존성 불활성화를 나타낸다. 기질의 부재(연속선) 하에서 QC-효소를 저해제로 처리한 후, 저해제로 미리 처리되지 않은(점선) 샘플에 비해 감소된 효소 활성이 관측되었으며, 이는 QC 활성 부위로부터 금속 이온이 제거되었음을 나타낸다.
도 20은 인간 QC를 1가- 및 2가 금속 이온으로 재활성화한 것을 나타낸다. QC는 2 mM 디피콜린산을 포함하는 50 mM Bis-Tris, pH 6.8을 첨가함으로써 불활성화되었다. 이어서, 1.0 mM EDTA를 포함하는 50 mM Bis-Tris, pH 6.8에 대해 효소를 투석하였다. 효소의 재활성화는, 완충액 용액에 존재 하는 미량의 금속 이온에 의한 불특징적 재활성화를 피하기 위해, 0.5 mM EDTA 존재 하에서 불활성화된 효소 샘플을 0.5 mM 농도의 금속이온으로 처리하였다. 불활성화되지 않았으나, 불활성화된 효소(+EDTA)로서 EDTA 용액에 대해 투석된 효소 샘플과 EDTA 첨가 없이(-EDTA) 완충 용액에 대해서 투석된 효소 샘플을 대조구로 하였다.
도 21은 인간 QC (hQC) 및 금속펩티다제 Clan MH의 다른 M28 과(family) 구성원의 서열을 배치한 것을 나타낸다. 다중의 서열 배치를 ch.EMBnet.org에 있는 ClustalW를 설정값으로 사용하여 수행하였다. 아연-이온 결찰(ligating) 잔기의 보존이 인간 QC(hQC; GenBank X71125), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 유래의 Zn-의존성 아미노펩티다제(SGAP; Swiss-Prot P80561), 및 인간 글루타메이트 카복시펩티다제 Ⅱ(hGCP Ⅱ; Swiss-Prot Q04609)의 N-아세틸화-알파-연결된 산성 디펩티다제(NAALADase I) 도메인(잔기 274-587)에서 나타났다. 금속 결합에 연관된 아미노산들은 굵게 인쇄하여 밑줄로 표시하였다. 인간 QC의 경우, 이러한 잔기들은 펩티다제에 대한 추정 대응물이다.
도 22는 뮤린 QC의 저해제가 시스테아민(사각형), 디메틸-시스테아민(원형) 및 머캅토에타놀(삼각형)에 의해 pH-의존성을 보이는 것을 나타낸다. 포인트들은 하나의 해리기에 대해 설정된 식에 맞추었다. 곡선은 서로 다른 모양으로 나타나는데, 그 의존성은 저해제의 양성자화(protonation)에서의 변화에 의한 것임을 나타낸다. 시스테아민에 대해 역학적으로 결정된 pKa-값(8.07±0.07)과 디메틸-시스테아민의 값(8.07±0.03)은 아미노기에 대한 문헌 값(각각, 8.6과 7.95)으로부터 얻은 것과 매우 일치한다(Buist, G. J. and Lucas, H. J. 1957 J Am Chem Soc 79, 6157; Edsall, J. T. Biophysical Chemistry, Academic Press, Inc., New York, 1958). 따라서, 머캅토에타놀의 pH-의존성은 일치된 기울기를 가지는데, 그것은 조사된 pH-범주에서는 해리기를 운반하지 않기 때문이다.
도 23은 Gln-AMC의 전환으로 얻은 이중역수 도시(Lineweaver-Burk plot)를 나타내는데(0.25, 0.125, 0.063, 0.031 mM), 다양한 농도의 시스테아민(0, 0.25, 0.5, 1 mM)의 존재 하에서 인간 QC에 의해 촉매된 것이다. 상기 데이터는 경쟁적 저해제에 따라 맞추었다. 결정된 Ki-값은 0.037±0.001 mM이다.
펩타이드 서열
본 발명에서 언급되고 사용된 펩타이드들은 하기 서열을 가진다:
Aβ(1-42):
*Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe- Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
Aβ(1-40):
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe- Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
Aβ(3-42):
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
Aβ(3-40):
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala- Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
Aβ(1-11)a:
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2
Aβ(3-11)a:
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2
Aβ(1-21)a:
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH2
Aβ(3-21)a:
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH2
Gin 3 -Aβ(3-40):
Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
Gln 3 -Aβ(3-21)a:
Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH2
Gln 3 -Aβ(1-11)a:
Asp-Ala-Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2
Gln 3 -Aβ(3-11)a:
Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2
ABri
pGlu-Ala-Ser-Asn-Cys-Phe-Ala-Ile-Arg-His-Phe-Glu-Asn-Lys-Phe-Ala-Val-Glu- Thr-Leu-Ile-Cys-Ser-Arg-Thr-Val-Lys-Lys-Asn-Ile-Ile-Glu-Glu-Asn
Gln 1 - ABri
Glu-Ala-Ser-Asn-Cys-Phe-Ala-Ile-Arg-His-Phe-Glu-Asn-Lys-Phe-Ala-Val-Glu-Thr-Leu-Ile-Cys-Ser-Arg-Thr-Val-Lys-Lys-Asn-Ile-Ile-Glu-Glu-Asn
ADan
pGlu-Ala-Ser-Asn-Cys-Phe-Ala-Ile-Arg-His-Phe-Glu-Asn-Lys-Phe-Ala-Val-Glu-Thr-Leu-Ile-Cys-Phe-Asn-Leu-Phe-Leu-Asn-Ser-Gln-Glu-Lys-His-Tyr
Glu 1 - ADan
Glu-Ala-Ser-Asn-Cys-Phe-Ala-Ile-Arg-His-Phe-Glu-Asn-Lys-Phe-Ala-Val-Glu-Thr-Leu-Ile-Cys-Phe-Asn-Leu-Phe-Leu-Asn-Ser-Gln-Glu-Lys-His-Tyr
약제학적 제형의 실시예
1. 본 발명의 화합물을 개당 100 mg 함유하는 캡슐:
약 10,000개 캡슐용으로, 하기 조성물의 용액을 제조하였다:
본 발명의 화합물 1.0 kg
글리세롤 0.5 kg
폴리에틸렌 글리콜 3.0 kg
물 0.5 kg
5.0 kg
상기 용액을 공지된 방법으로 연질 젤라틴 캡슐에 넣었다. 상기 캡슐은 씹거나 넘기기에 적합하다.
2. 본 발명의 화합물을 100 mg 포함하는 정제 또는 코팅된 정제, 또는 당제:
하기 양으로 100,000 정제를 제조하였다:
본 발명의 화합물,
미세분말 10.0 kg
글루코스 4.35 kg
락토오스 4.35 kg
전분 4.50 kg
셀룰로즈, 미세분말 4.50 kg
상기 성분들을 혼합한 후 하기로부터 제조한 용액을 첨가하였다
폴리비닐피롤리돈 2.0 kg
*폴리소르베이트 0.1 kg
물 약. 5.0 kg
그리고 습한 질량체를 갈고, 마그네슘 스테아레이트 0.2 kg을 첨가한 후, 건조시키는 공지된 방법으로 과립화하였다. 완료된 정제 혼합물 30.0 kg을 가공하여 300 mg 무게의 볼록한 정제를 형성하였다. 이상적으로는, 상기 정제에 공지된 방법으로 코팅 또는 당-코팅을 시켰다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 유리하게는 QC 활성의 적어도 하나의 이펙터 및 적어도 하나의 DP Ⅳ 저해제의 조합을 포함한다. 이러한 약제학적 조성물은 특히 알츠하이머병 및 다운 증후군의 치료에 유용하다.
실시예 1 : 인간 및 파파야 QC 의 제조
숙주 균주( strain ) 및 배지
인간 QC의 발현에 사용되는 피치아 파스토리스(P. pastoris, Pichia pastoris) 균주 ×33 (AOX1 , AOX2)을 제조사(Invitrogen)의 설명서에 따라 배양하고, 형질전환하고 분석하였다. P. 파스토리스에 필요한 배지, 즉 완충 글리세롤 (BMGY) 복합 또는 메탄올(BMMY) 복합 배지(complex media), 및 발효 기본 염 배지를 제조사의 추천에 따라 제조하였다.
인간 QC 를 인코딩하는 플라스미드 벡터의 분자 클로닝
표준 분자 생물학 기술을 적용하여 모든 클로닝 과정을 행하였다. 효모에서의 발현에는 벡터 pPICZαB(Invitrogen)를 사용하였다. pQE-31 벡터(Qiagen)를 사용하여 대장균에서 인간 QC를 발현시켰다. 코돈 38로 시작하는 성숙한 QC의 cDNA를, 6x히스티딘 태그를 인코딩하고 있는 플라스미드로 프레임 내에 융합하였다. 프라이머 pQCyc-1 및 pQCyc-2를 이용한 증폭 및 서브클로닝 후, SphＩ 및 HindⅢ의 제한 부위를 사용하는 발현 벡터에 단편(fragment)을 삽입하였다.
P. 파스토리스의 형질전환 및 소규모 발현
플라스미드 DNA를 대장균 JM109에서 증폭시키고 제조사(Qiagen)의 추천에 따라 정제하였다. 사용된 발현 플라스미드 pPICZαB에는, 선형화(linearization)를 위한 세 개의 제한 부위를 제공하였다. QC cDNA 내에서 SacI 및 BstXI이 절단되므로, PmeI을 선택하였다. 20 내지 30 μg 플라스미드 DNA를 PmeI으로 선형화시켜, 에탄올로 침전시키고, 멸균 탈이온수에 용해시켰다. 그 후 제조사(BioRad) 설명서에 따라 전기 천공법(electroporation)으로 상기 DNA 10 μg을 컴피턴트(competent) P. 파스토리스 세포의 형질전환에 적용하였다. 150 μg/ml Zeocin을 함유한 플레이트 상에서 선택하였다. 선형화된 플라스미드를 사용하여 한번 형질전환하여 수백 개의 형질전환체를 수득하였다.
상기 재조합 효모 클론을 QC 발현에 대해 시험하기 위해, 재조합체를 2 ml BMGY를 함유한 10 ml 원추형 튜브에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 효모를 원심분리하고 및 0.5 % 메탄올을 함유한 2 ml BMMY에 재현탁하였다. 이 농도는 메탄올을 매 24시간마다 72시간까지 첨가하여 유지시켰다. 그 후, 상등액에서 QC 활성을 결정하였다. 상기 융합 단백질의 존재는 6x히스티딘 태그(Qiagen)에 대해 직접적인 항체를 사용하는 웨스턴 블럿 분석으로 확인하였다. 가장 높은 QC 활성을 나타내는 클론들을 선택하여 추가의 실험 및 발효에 사용하였다.
발효기에서의 대규모 발현
QC의 발현은 5l 반응기(Biostat B, B. Braun biotech)에서, 특히 "피치아 발효 과정 가이드라인"(Invitrogen)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단하게, 세포를 트레이스(trace)염 및 유일한 탄소원으로서 글리세롤이 보충된 발효 기본 염 배지(pH 5.5)에서 배양하였다. 약 24시간 동안의 처음 배치 상 및 후속적인 약 5시간 동안의 페드-배치(fed-batch) 상 동안, 세포 질량이 축적되었다. 세포 습 무게(wet weight)가 200 g/l에 도달하면, 전체 약 60시간의 발효에 3단계 공급 과정을 적용하면서, 메탄올을 사용하여 QC 발현을 유도하였다. 후속적으로, 6000xg 속도로 4 ℃에서 15분 동안 원심분리하여 QC-함유 상등액으로부터 세포를 제거하였다. NaOH를 첨가하여 pH를 6.8로 조정하고, 결과인 탁한 용액을 37000xg 속도로, 4 ℃에서 40분간 다시 원심분리하였다. 계속 혼탁할 경우, 셀룰로즈 막(구멍 폭 0.45 μm)을 사용하여 추가적인 여과 단계를 적용하였다.
P. 파스토리스에서 발현된 6x히스티딘 표지 QC 의 정제
고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)로 His-표지 QC를 먼저 정제하였다. 일반적인 정제로, 750 mM NaCl을 함유하고, 50 mM 인산염 완충액, pH 6.8로 평형화시킨 Ni2 +-적하 Chelating Sepharose FF 컬럼(1.6 x 20 cm, Pharmacia)에 배양 상등액 1000 ml를 5 ml/min의 유동속도로 적용하였다. 10배 컬럼 부피의 평형 완충액 및 5 mM 히스티딘을 함유하는 5배 컬럼 부피의 안정화 완충액으로 세척한 후, 결합 단백질을 150 mM NaCl 및 100 mM 히스티딘을 함유하는 pH 6.8의 50 mM 인산염 완충액으로 용출시켰다. 수득한 용출물을 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 6.8에 대하여 4 ℃에서 밤새 투석하였다. 후속적으로, QC를 투석 완충액으로 평형화시킨 Mono Q6 컬럼(BioRad) 상에서 음이온 교환 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. QC-함유 분획물을 컬럼상에 4 ml/min의 유동속도로 적재하였다. 그 다음, 컬럼을 100 mM NaCl을 함유하는 평형 완충액으로 세척하였다. 각각 30배 또는 5배 컬럼 부피에서 240 mM 및 360 mM NaCl을 함유하는 평형 완충액을 나타내는 두 가지 구배로 용출하였다. 6 ml의 분획물을 모아 SDS-PAGE로 순도를 분석하였다. 균질한 QC를 함유하는 분획물을 합쳐 한외여과(ultrafiration)로 농축시켰다. 장기간 보관하기 위해(-20℃), 글리세롤을 최종 농도의 50 %로 첨가하였다. 단백질을 Bradford 또는 Gill 및 von Hippel의 방법(Bradford, M. M. 1976 Anal Biochem 72, 248-254 ; Gill, S. C. 및 von Hippel, P. H. 1989 Anal Biochem 182, 319-326.)에 따라 정량하였다.
대장균에서의 QC 의 발현 및 정제
QC를 인코딩 하는 작제물(construct)을 M15 세포로 형질전환하고(Qiagen) 및 선택성 LB 아가 플레이트 상에서 37 ℃로 배양하였다. 단백질 발현은 1 % 글루코스 및 1 % 에탄올을 함유하는 LB 배지에서 실온으로 수행하였다. 배양물이 약 0.8의 OD600에 도달하였을 때, 0.1 mM IPTG로 밤새 발현을 유도하였다. 한 주기의 동결 및 해동 후, 세포를 300 mM NaCl 및 2 mM 히스티딘을 함유한 50 mM 인산염 완충액, pH 8.0의 2.5 mg/ml 라이소자임으로 4 ℃에서 30분간 처리하여 용혈시켰다. 그 용액을 37000xg 속도로, 4 ℃에서 30분간 원심분리하여 깨끗하게 한 후, 유리 프릿(glass frit)을 적용(DNA 분리)하여 여과시켜 미정제 및 정제 침전물에 셀룰로스 여과기를 적용하는 두 개의 추가적인 여과 단계를 실시하였다. 상등액(약 500 ml)을 Ni2 +-친화성 컬럼(1.6 x 20 cm) 상에 1 ml/min의 유동속도로 적용하였다. 150 mM NaCl 및 100 mM 히스티딘을 함유하는 50 mM 인산염 완충액으로 QC를 용출을 수행하였다. QC-함유 분획물을 한외여과로 농축시켰다.
파파야 라텍스로부터의 QC 의 정제
BioCAD 700E(Perseptive Biosystems, Wiesbaden, Germany)를 사용하여 기존의 보고된 방법의 변형된 버전(Zerhouni, S. 등. 1989 Biochim Biophys Acta 138, 275-290)으로 QC를 파파야 라텍스로부터 제조하였다. 50 g 라텍스를 물에 용해시키고 상기 문서에 기재된 바와 같이 원심분리하였다. S-메틸 메탄티오술포네이트로 프로테아제를 불활성화시키고, 수득한 미정제 추출물을 투석하였다. 투석 후, 전체 상등액을(21 X 2.5 cm i.d.) 100 mM 소듐 아세테이트 완충액, pH 5.0로 평형화시킨 SP Sepharose Fast Flow 컬럼에 적재하였다(유동속도 3 ml/min). 2 ml/min의 유동속도에서 소듐 아세테이트 완충액 농도를 증가시켜 3단계로 용출을 수행하였다. 제1단계는 0.5배 컬럼 부피에서 아세테이트 완충액을 0.1에서 0.5 M까지 선형 구배한 것이었다. 제2단계는 4배 컬럼 부피에서 완충액 농도를 0.5에서 0.68 M까지 선형 증가시킨 것이었다. 마지막 용출단계에는, 일 컬럼 부피의 0.85 M 완충액을 적용하였다. 최고 효소 활성을 함유하는 분획물(6 ml)들을 합쳤다. 한외여과를 통해 농도와 완충액을 0.02 M Tris/HCl, pH 8.0까지 변화시켰다(아미콘(Amicon); 막의 컷-오프 분자질량 10 kDa).
이온 교환 크로마토그래피 단계로부터 수득한 농축된 파파야 효소에 2 M의 최종 농도로 암모늄 설페이트를 첨가하였다. 이 용액을 2 M 암모늄 설페이트, 0.02 M Tris/HCl, pH 8.0로 평형화된(21 X 2.5 cm i.d.) Butyl Sepharose 4 Fast Flow 컬럼 상에 적용하였다(유동속도 1.3 ml/min). 암모늄 설페이트의 농도를 낮추면서 3단계로 용출하였다. 제1단계에서, 2에서 0.6 M까지의 암모늄 설페이트, 0.02 M Tris/HCl, pH 8.0의 선형 구배를 0.5배 컬럼 부피에 1.3 ml/min의 유동속도로 적용하였다. 제2단계는 5배 컬럼 부피에서 0.6에서 0 M까지의 암모늄 설페이트, 0.02 M Tris/HCl, pH 8.0의 선형 구배를 1.5 ml/min의 유동속도로 적용하였다. 마지막 용출 단계는 0.02 M Tris/HCl, pH 8.0을 2배 컬럼 부피에 1.5 ml/min의 유동속도로 적용하여 수행하였다. QC 활성을 함유하는 모든 분획물을 합쳐 한외여과로 농축시켰다. 얻어진 균질한 QC를 -70 ℃에서 보관하였다. 최종 단백질 농도는 Bradford 방법을 이용하여, 소혈청 알부민으로 얻은 표준 곡선과 대비하여 결정하였다.
실시예 2 : 글루타미닐 사이클라제 활성 분석
형광광도 분석법( Fluorometric assays )
마이크로플레이트(Perkin Elmer)에 대해 30 ℃에서 BioAssay Reader HTS-7000Plus로 모든 측정을 수행하였다. QC 활성은 H-Gln-βNA를 사용하여 형광광도적으로 평가하였다. 샘플은 최종 250 μl의 부피 내에, 0.2 mM 형광발생성 기질, 20 mM EDTA를 함유하는 0.2 M Tris/HCl, pH 8.0 내의 0.25 U 피로글루타밀 아미노펩티다제(Unizyme, Horsholm, Denmark) 및 QC의 적절히 희석된 분배물로 구성하였다. 여기(excitation)/방출(emission) 파장은 320/410 nm이었다. 글루타미닐 사이클라제의 첨가로 분석법 반응을 개시하였다. QC 활성은 분석 조건하에 β-나프틸아민의 표준 곡선으로부터 결정하였다. 일 유닛(unit)은 설정된 조건하에 분당 H-Gln-βNA로부터 1 μmol pGlu-βNA를 형성하는데 촉매하는 QC의 양으로 정의한다.
제2 형광광도 분석법에서, QC 활성은 H-Gln-AMC를 기질로 사용하여 결정하였다. 반응은 마이크로플레이트에 대해 NOVOStar 리더(BMG labtechnologies)를 사용하여 30 ℃에서 수행하였다. 샘플은 최종 부피 250 μl 내에, 다양한 농도의 형광발생성 기질, 5 mM EDTA를 함유한 0.05 M Tris/HCl, pH 8.0에 포함된 0.1 U 피로글루타밀 아미노펩티다제(Qiagen) 및 QC의 적절히 희석된 분배물로 구성하였다. 여기/방출 파장은 380/460 nm이었다. 글루타미닐 사이클라제의 첨가로 분석법 반응을 개시하였다. QC 활성은 분석법 조건하에 7-아미노-4-메틸쿠마린의 표준 곡선으로부터 결정하였다. 역학적 데이터는 GraFit 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
QC 의 분광광도 분석법
이러한 신규한 분석법을 사용하여 대부분의 QC 기질에 대하여 역학적 파라미터를 결정하였다. QC 활성은, 글루타메이트 탈수소효소를 보조 효소로 사용하는 이전의 불연속적 분석법(Bateman, R. C. J. 1989 J Neurosci Methods 30,23-28)를 적용하여 유도한, 연속적 방법을 사용하여, 분광광도적으로 분석하였다. 샘플은 최종 250 μl의 부피 내에, 각각의 QC 기질, 0.3 mM NADH, 14 mM α-케토글루타르 산 및 30 U/ml 글루타메이트 탈수소효소로 구성하였다. 반응은 QC 첨가로 개시하였고, 340 nm에서 8 내지 15 분간 흡광도 감소를 측정하여 관측하였다. 전형적인 시간 경과에 따른 생성물의 형성은 도 1에 나타내었다.
초기 속도를 평가하고, 분석법 조건하에 암모니아의 표준 곡선으로부터 효소 활성을 결정하였다. 모든 샘플은 30 ℃에서, 마이크로플레이트에 대해 SPECTRAFluor Plus 또는 Sunrise(둘 다 TECAN 제품) 리더를 사용하여 측정하였다. 역학적 파라미터는 GraFit 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
저해제 분석법
저해제 시험에 대해, 샘플 조성물은 추정되는 저해성 화합물을 첨가한 것을 제외하고는 전술한 바와 같았다. 신속한 QC-저해 시험용 샘플은 4 mM의 각 저해제 및 1 KM에서의 기질 농도를 포함하였다. 저해를 상세히 연구하고 Ki-값을 결정하기 위해, 보조 효소에 대한 저해제의 영향을 먼저 조사하였다. 모든 경우에서, 어느 효소에서도 영향이 검출되지 않았고, 따라서 QC 저해의 신뢰할만한 결정이 이루어 질 수 있었다. 저해 상수는 GraFit 소프트웨어를 사용하여 진행 곡선을 경쟁적 저해에 대한 일반적인 식에 맞추어 평가하였다.
실시예 3: MALDI - TOF 질량 분광분석
매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 질량분광분석을 선형적 비행시간 분석기를 구비한 휴렛-팩카드 G2025 LD-TOF 시스템을 사용하여 수행하였다. 상기 장비는 337 nm 질소 레이저, 강력한 가속원(source) (5 kV) 및 1.0 m 탈출관(flight tube)을 구비하였다. 검출기 작동은 양이온 모드이고 신호는 개인용 컴퓨터에 연결된 LeCroy 9350M 디지털 보관 오실로스코프를 사용하여 기록하고 여과하였다. 샘플(5 μl)을 동일한 부피의 매트릭스 용액과 혼합하였다. 매트릭스 용액에 대해서는, 30 mg 2',6'-디히드록시아세토페논(Aldrich) 및 44 mg 디암모늄 히드로젠 시트레이트 (Fluka)를 1 ml 아세토니트릴/0.1% TFA함유 물(1/1, v/v) 내에 용해시켜 제조한, DHAP/DAHC를 사용하였다. 작은 부피(=1μl)의 매트릭스-분석체-혼합물을 탐침 팁에 이전하고, 진공 챔버(Hewlett-Packard G2024A 샘플 prep accessory)에서 즉시 증발시켜 신속하고 균일하게 샘플을 결정화시켰다.
Glu1-고리화의 장기간 시험을 위해, Aβ-유도 펩타이드를 100μl 0.1 M 소듐 아세테이트 완충액, pH 5.2 또는 0.1M Bis-Tris 완충액, pH 6.5에서 30 ℃에서 항온처리하였다. 펩타이드를 0.5mM [Aβ3-11a] 또는 0.15mM [Aβ3-21a] 농도로 적용하고, 0.2 U QC를 24시간 내내 첨가하였다. Aβ(3-21)a의 경우, 분석물은 1 % DMSO을 함유하였다. 상이한 시간에서, 샘플을 분석법 튜브로부터 제거하고, ZipTips(Millipore)를 제조사 설명서에 따라 사용하여 펩타이드를 추출하였으며, 매트릭스 용액(1:1 v/v)과 혼합한 후, 질량 스펙트럼을 기록하였다. 음성 대조군은 QC 또는 가열 비활성화 효소 어느 것도 포함하지 않았다. 저해제 연구를 위해, 저해성 화합물을 첨가한 것을 제외하고는(5mM 벤즈이미다졸 또는 2mM 1,10-페난트롤린) 샘플 조성물은 전술한 바와 같은 것을 사용하였다.
실시예 4: pH 의존성
인간 및 파파야 QC의 촉매작용의 pH-의존성을 1차 속도 조건하에 조사하여, 특이성 상수 kcat/KM에 대한 양성자 농도의 영향을 반영하였다. 이를 위해, 피로글루타밀 아미노펩티다제를 보조효소로서 및 Gln-βNA를 기질로서 사용하는 연계된 효소 분석법을 이용하였다. 피로글루타밀 아미노펩티다제는 pH 5.5-8.5 사이에서 활성이며 안정한 것으로 나타났다(Tsuru, D. 등. 1978 J Biochem (Tokyo) 84, 467-476). 따라서, 이 분석법은 이러한 pH-범위에서 QC 촉매작용을 연구할 수 있도록 한다. 상기 도 2에 나타난 바와 같이, 얻은 속도 곡선은 전형적인 종(bell) 모양 곡선에 꼭 맞았다. 인간 QC는 약 pH 7.8 내지 8.0에서 최적을 나타내는 매우 좁은 pH-의존성을 가진다. 속도는 더 염기성 pH일수록 낮아지는 경향이 있었다. 이것은 pH 8.5까지는 활성이 떨어지지 않는 파파야 QC로 관측되는 속도 곡선(도 2, 삽입도)과 대조되었다. 그러나, 두 효소 모두는 pH 8에서 최적의 특이성을 가졌다. 상기 곡선을 평가한 결과, 놀랍게도 인간 및 파파야 QC 에 대해 각각 7.17±0.02 및 7.15±0.02의 산 범위에서 동일한 pKa-값이 나타내는 것으로 밝혀졌다.
염기성 pH-값에서 인간 QC 활성의 감소는, 명백히 약 8.5의 pKa를 가지는 기(group)의 분리 때문이다. 파파야 QC의 경우, 두 번째 pKa 값의 신뢰성있는 결정을 가능케하는 기본 pH-범위에서 지나친 데이터 포인트가 없다. 이는 상기 데이터를 단일 분리 모델에 맞춤으로써 지지되며, 데이터를 이중 분리 모델에 맞추는 것과 비교할 때, 거의 동일한 pKa-값(pKa 7.13±0.03)을 가지도록 한다. 이는 두 pKa-값이 모두 상당히 떨어져 있다는 것을 가리킨다.
pH 안정성
식물 및 동물 효소를 30 ℃에서 30 분간 pH 4 내지 10 사이의 상이한 pH 값에서 항온처리하여 글루타미닐 사이클라제의 안정성을 조사하였다. 그 후, 표준 조건하에 QC 활성을 결정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
파파야 라텍스로부터의 QC는 연구한 pH-범위에서 안정하였고, 산성 또는 염기성 범위에서 명백히 불안정한 경향이 없었다. 대조적으로, 인간 QC는 7과 8.5 사이의 pH-범위에서 비교할만한 안정성을 보였을 뿐, pH 8.5 이상 및 pH 6 이하의 pH 값에서는 현저히 불안정하였다. 따라서, pH 8 근처 범위가 식물 및 인간 QC 활성과 안정성에 최적인 것으로 보이며, QC들의 기질 특이성 비교를 수행하기 위한 적절한 pH-값으로 보인다.
실시예 5 : QC 의 기질 특이성 결정
분광분석법
연속 분광분석법을 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 따라서, α-케토글루타르산으로부터 글루타메이트로 형성됨에 따른 암모니아 방출 및 후속적인 NADH/H+ 소비에 의해 야기된 340nm에서의 흡광도 감소는 QC 활성을 반영한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 선형적인 진행 곡선이 관측되었으며, 측정된 활성과 QC 농도 간에 선형적 관계가 있었다. 더 나아가, 연속 분석법을 사용하여 H-Gln-Gln-OH에 대해 얻은 역학적 파라미터는(표 1) 불연속적 방법을 사용하여 얻은 것과 상당히 일치하였다(KM = 175±18μM, kcat = 21.3±0.6 s-1). 표 1에 나타난, 파파야 QC에 의한 기질 H-Gln-Ala-OH, H-Gln-Glu-OH, H-Gln-Gln-OH, H-Gln-OtBu 및 H-Gln-NH2의 전환에 대한 역학적 파라미터는, pH 8.8 및 37 ℃에서 직접적인 방법을 사용하여 결정한 것과 매우 상응하였다(Gololobov, M. Y. 등. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395-398). 따라서, 신규한 연속 분석법이 신뢰할 만한 결과를 제공한다는 것은 매우 명백하다.
디-, 트리- 및 디펩타이드 -대용물( surrogate )
전술한 신규한 연속 분석법을 사용하여, 약 30개의 화합물들을 C. 파파야 및 인간 QC의 잠재적인 기질로서 시험하였다. 그 결과를 표 5에 나타냈다. 특이성들을 비교함으로써, 거의 모든 짧은 펩타이드 기질들이 인간 효소에 비해 파파야 QC에 의해 더 효과적으로 전환된다는 것이 나타났다. 흥미롭게도, 두 효소 모두에 대하여, 두 번째 위치에서 큰 소수성 잔기를 가지는 기질이, 다른 트리펩타이드와 비교하여 H-Gln-Tyr-Ala-OH, H-Gln-Phe-Ala-NH2 및 H-Gln-Trp-Ala-NH2의 특이성에 의해서 또는 디펩타이드 기질과 비교하여 발색성 기질 H-Gln-AMC, H-Gln-βNA 및 H-Gln-Tyr-OH의 반응성에 의해서 나타난 바와 같이, 가장 유력한 것이었다. 파파야 QC의 경우, 이러한 발견은 특이성이 두 번째 아미노산 잔기의 크기와 관계가 있다는 이전의 결과와 일치하였다(Gololobov, M. Y. 등. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377,395-398).
식물 및 동물 QC의 특이성에서 유일하게 인상적인 차이는 H-Gln-OtBu의 경우관찰되었다. 에스테르가 디펩타이드 기질에 비해 유사한 특이성을 가지는 파파야 QC에 의해 전환되는 반면, 인간 QC에 의해서는 약 1차수의 크기로 느리게 전환하였다.
올리고펩타이드
몇몇의 디펩타이드 및 트리펩타이드 외에도, 많은 올리고펩타이드들을 파파야 및 인간 QC에 의한 전환시 시험하였다(표 6). 흥미롭게도, 한 세트의 테트라펩타이드에 대한 인간 및 식물 QC 간의 특이성의 전체적인 차이는 디펩타이드 및 트리펩타이드 기질에 대해 관찰한 바와 같이 크지 않았다. 이는 3번째 및 4번째 위치의 아미노산이 특히 인간 QC의 역학적 거동에 여전히 영향을 미친다는 것을 가리킨다. 그러나, 예외적으로, 두 번째 아미노산 위치에서 프롤린 잔기를 가지는 펩타이드들은 구조체 H-Gln-Xaa-Tyr-Phe-NH2의 한 세트의 테트라펩타이드에서 현저하게 감소된 kcat/KM 값을 나타냈다(표 6). 특이성의 감소는 인간 QC에 대해 더욱 심화되며, 이는 파파야 QC와 비교하여 kcat/KM-값이 약 8배 차이가 나도록 했다.
다른 테트라펩타이드들에 비교하여 H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2, H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2 및 H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2에 대한 특이성에 의해 나타난 바와 같이, 글루타민의 양전하 아미노산 C-말단을 가진 기질의 전환에 인간 QC가 약간 감소된 특이성을 보이는 것으로 나타났다. 명백히, 감소된 특이성은 주로 더 작은 전환 수에 기인하였다. 이러한 효과는 식물 효소에 대한 경우에는 없었다.
인간 및 파파야 QC의 펩타이드 기질의 역학적 평가
기질 인간 QC 파파야 QC
KM(μM) kcat
(s-1)		 Ki * (mM) k cat / K M
( mM -1 s -1 ) 		KM(μM) kcat
(S-1)		 Ki *
(mM)		 k cat / K M
( mM -1 s -1 )
H-Gln-OH n.r. n.r. n.d. n.r. n.d. n.d. n.d. 0.23±0.1
H-Gln-AMC 54±2 5.3±0.1 n.d. 98±2 42±1 39.4±0.4 n.d. 938±13
H-Gln-βNA 70±3 20.6±0.5 1.21±
0.07		 294±6 38±3 51.4±1.4 1.20±0.08 1353±70
H-Gln-OtBu 1235±74 6.7±0.2 n.i. 5.4±0.2 223±9 49.4±0.6 n.i. 222±6
H-Gin-NH2 409±40 12.8±0.5 n.i. 31±2 433±13 44.8±0.4 n.i. 103±2
H-Gin-Gly-OH 247±10 13.2±0.2 n.i. 53±1 641±20 45.8±0.4 n.i. 71±2
H-Gln-Ala-OH 232±5 57.2±0.4 n.i. 247±4 158±8 69.8±1.0 n.i. 442±16
H-Gln-Gln-OH 148±5 20.7±0.2 n.i. 140±2 44±3 43.2±0.7 n.i. 982±51
H-Gln-Glu-OH 359±10 24.7±0.2 n.i. 58±1 106±5 50.3±0.6 n.i. 475±17
H-Gln-Val-OH 196±5 17.2±0.1 n.i. 88±2 n.d. n.d. n.i. n.d.
H-Gln-Tyr-OH 211±5 94±1 n.i. 446±6 n.d. n.d. n.i. n.d.
H-Gln-Gln-Tyr-NH2 79±2 45.1±0.4 n.i. 524±8 103±4 53.6±0.7 n.i. 520±13
H-Gln-Gly-Pro-OH 130±5 25.3±0.2 n.i. 195±7 333±15 41.7±0.5 n.i. 125±4
H-Gln-Tyr-Ala-OH 101±4 125±1 n.i. 930±27 63±3 104.0±1.0 n.i. 1650±63
H-Gln-Phe-Ala-NH2 69±3 109±1 n.i. 1811±64 111±5 132.1±0.6 n.i. 1190±48
H-Gln-Trp-Ala-NH2 50±2 47.0±0.7 n.i. 940±24 78±5 151.8±2.6 n.i. 1946±91
H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2 143±4 33.5±0.4 n.i. 234±4 123±10 49.2±1.7 n.i. 400±19
H-Gln-Asn-Gly-Ile-NH2 172±5 56.6±0.5 n.i. 329±7 153±9 51.4±0.9 n.i. 336±14
H-Gln-Ser-Tyr-Phe-NH2 55±3 52.8±0.8 n.i. 960±38 135±6 64.9±1.0 n.i. 481±14
H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2 55±2 29.6±0.3 n.i. 538±14 124±6 48.9±0.7 n.i. 394±13
H-Gln-Pro-Tyr-Phe-NH2 1889±
152		 31.7±1.2 n.i. 17±1 149±14 18.8±0.6 n.i. 126±8
H-Gln-His-Tyr-Phe-NH2 68±3 55.4±0.7 n.i. 815±26 92±7 75.9±1.4 n.i. 825±48
H-Gln-Gln-Tyr-Phe-NH2 41±2 41.4±0.4 n.i. 1010±40 45±2 52.9±0.7 n.i. 1176±37
H-Gln-Glu-Tyr-Phe-NH2 47±4 46±1 n.i. 979±62 100±4 54.6±0.6 n.i. 546±16
H-Gln-Glu-Ala-Ala-NH2 77±4 46±1 n.i. 597±18 102±4 53.7±0.6 n.i. 526±15
H-Gln-Glu-Tyr-Ala-NH2 69±2 42.1±0.4 n.i. 610±12 113±5 44.7±0.5 n.i. 396±13
H-Gln-Glu-Ala-Phe-NH2 39±3 39±1 n.i. 1000±51 81±3 48.5±0.45 n.i. 599±17
H-Gln-Glu-Asp-Leu-NH2 55±2 45.8±0.5 n.i. 833±21 107±6 58.5±0.4 n.i. 547±27
H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2 54±3 33.4±0.5 n.i. 619±25 118±6 48.2±0.8 n.i. 408±14
(기질 저해와 관련하여, n.r., 비반응; n.i., 저해없음; n.d., 미결정; *)
테트라펩타이드로 얻은 결과는 또한 또 다른 결론을 가져왔다. 이미 지적한 바와 같이, 파파야 QC는 디펩타이드에 대해 더 높은 선택성을 나타냈다. 몇몇 테트라펩타이드의 경우, 그러나, 표 6에 주어진 데이터의 그래프를 제공하고 있는 도 4에 나타난 바와 같이, 두 번째 아미노산 위치에서 글루타메이트를 포함하는 한 세트의 펩타이드에 대하여, 인간 QC에는 더 높은 특이성 상수를 관찰하였다. 더 나아가, 사슬 길이가 디- 에서 테트라펩타이드로 증가함에 따라, 인간 QC의 선택성은, 파파야 QC로 얻은 결과와는 반대로 증가하였다. 또한, 인간 QC의 가장 높은 선택성은 3번째 및 4번째 아미노산 위치에서 거대한 소수성 잔기를 포함하는 펩타이드에 대하여 기록한바, 이는 효소와의 소수성 상호작용을 가리킨다. 각 펩타이드에 대한 역학적 파라미터를 비교하여, 변화는 주로 더 낮은 KM-값에 기인하는 것으로 보이며, 펩타이드의 전환에 대한 턴오버 수가 유사한 것을 밝혔다. 따라서, 더 긴 펩타이드에 대한 인간 QC의 더 높은 선택성은 더 소수성인 기질이 효소에 더 견고하게 결합하는 결과인 것으로 생각된다.
3번째 및 4번째 위치에서 소수성 아미노산을 포함하는 펩타이드로 관찰된 인간 및 식물 QC간의 차이점은, 또한 H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2 및 H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2 또는 H-Gln-Gln-OH 및 H-Gln-Gln-Tyr-Phe-OH를 향한 효소의 특이성 상수를 비교함으로써 명백해진다.
인간 QC는 또한 N-말단 Gln을 포함하는 동족 기질에 대해 더욱 선택적인 것을 밝혀냈다(표 7). 인간 QC의 선택성이 기질 길이에 따라 증가하는 반면, 파파야 QC에는 그러한 경향이 없었다. 인간 QC가 서열에서 Ser 잔기를 포함하는 펩타이드에 덜 특이적이기 때문에, 측쇄의 성질이 또한 중요한 것으로 보였다(표 6).
인간 및 파파야 QC 활성에 대한 기질 길이의 영향
기질 인간 QC 파파야 QC
KM
(μM)		 kcat (S-1) k cat / K M
( mM -1 S -1 ) 		KM(μM) kcat(S-1) k cat / K M
mM -1 S -1 )
H-Gln-Ala-NH2 155±9 40.1±0.9 259±9 212±21 62.8±3.0 296±15
H-Gln-Ala-Ala-NH2 87±3 76.3±0.7 877±22 164±6 83.2±1.0 507±12
H-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-NH2 65±3 60.5±0.7 1174±43 197±8 74.6±1.0 379±10
H-Gln-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-NH2 79±6 55.3±1.6 700±33 216±6 78.5±1.0 363±5
촉매작용에 대한 이온 강도의 영향
기질 특이성에 대한 영향에 대하여 조사한 또 다른 파라미터는 이온강도였다. 이를 위해, 몇몇 기질의 고리화에 대한 역학적 파라미터를 0.5 M KCl 존재 및 부존재 하에 결정하였다(표 8 및 9). 놀랍게도, 비하전된 백본(backbone)을 가진 기질에 대한 선택성은 파파야 라텍스로부터의 QC 및 인간 QC의 경우, 염의 추가로 유의하게 변화하지 않았다. H-Gln-Ala-OH 및 H-Gln-Glu-OH에 대한 인간 QC의 특이성 상수는, 그러나, KCl 첨가에 의해 감소하였다. 개별적 역학적 파라미터에 의해 나타나는 바와 같이, 이러한 효과는 증가하는 KM 및 약간만 감소하는 kcat-값에 의한 것이다. 파파야 QC의 경우, 어떠한 변수에도 이러한 효과가 검출되지 않았다. 상기 효과는 음하전된 기질로 인한 것으로는 보이지 않는데, 비하전된 파라미터들이 음하전된 펩타이드 H-Gln-Glu-Asp-Leu-NH2에 대하여 발견되었기 때문이다. 염 첨가의 흥미로운 효과는 양하전된 기질 H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2 및 H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2에 대하여 발견되었다. 식물 및 인간 QC의 경우, 촉매 작용에 대한 양성적 효과는 주로 더 작은 KM 값 및 약간 더 큰 턴오버 수로 인하여 결정하였다.
파파야 QC의 촉매작용에 대한 이온 강도의 영향
기질 0.05 M 트리신-NaOH, pH 8.0 0.05 M 트리신-NaOH, pH 8.0, 0.5 M KCl







파파야
QC		 KM(mM) kcat
(s-1)		 kcat/KM
(mM-1s-1)		 Ki(mM) KM(mM) kcat
(s-1)		 kcat/KM
(mM-1s-1)		 Ki(mM)
H-Gln-NH2 0.434
±0.015		 43.4
±0.4		 100±3 n.i. 0.446
±0.010		 45.2
±0.3		 101±2 n.i.
H-Gln-βNA 0.036
±0.002		 48.8
±1.0		 1356±50 1.14
±0.05		 0.032
±0.002		 47.2
±0.8		 1475±70 1.33
±0.07
H-Gln-Ala-OH 0.137
±0.007		 69.7
±.9		 509±19 n.i. 0.143
±0.005		 68.1
±0.6		 480±12 n.i.
H-Gln-Glu-OH 0.098
±0.005		 45.0
±0.5		 459±18 n.i. 0.094
±0.003		 44.4
±0.3		 472±12 n.i.
H-Gln-Trp-Ala-NH2 0.079
±0.005		 138±3 1747±73 n.i. 0.072
±0.004		 133±3 1847±61 n.i.
H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2 0.106
±0.008		 52.9
±1.2		 499±26 n.i. 0.065
±0.005		 48.4
±1.0		 745±42 n.i.
H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2 0.102
±0.007		 50±1 493±22 n.i. 0.053
±0.002		 58.1
±0.7		 1096±28 n.i.
H-Gln-Glu-Asp-Leu-NH2 0.109
±0.005		 52.4
±0.7		 481±16 n.i. 0.094
±0.003		 53.6
±0.5		 570±13 n.i.
인간 QC의 촉매작용에 대한 이온 강도의 영향
0.05 M 트리스-HCl, pH 8.0 0.05 M 트리스-HCl, pH 8.0,
0.5 M KCl







인간 QC		 Km(mM) Kca
H-Gln-NH2 0.442
±0.030		 12.8
±0.3		 29±1 n.i. 0.401
±0.014		 12.2
±0.1		 30±1 n.i.
H-Gln-βNA 0.076
±0.004		 21.7
±0.5		 285±8 1.39
±0.08		 0.063
±0.003		 20.0
±0.4		 318±9 0.97
±0.04
H-Gln-Ala-OH 0.269
±0.007		 54.4
±0.5		 202±3 n.i. 0.357
±0.012		 47.6
±0.6		 133±3 n.i.
H-Gln-Glu-OH 0.373
±0.015		 21.4
±0.3		 57±2 n.i. 0.607
±0.036		 18.9
±0.5		 31±1 n.i.
H-Gln-Trp-Ala-NH2 0.054
±0.003		 50.8
±0.6		 941±41 n.i. 0.056
±0.002		 50.0
±0.4		 893±25 n.i.
H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2 0.166
±0.013		 31±1 187±9 n.i. 0.091
±0.005		 29.8
±0.5		 327±12 n.i.
H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2 0.051
±0.003		 29.4
±0.5		 577±24 n.i. 0.034
±0.001		 31.6
±0.3		 929±19 n.i.
H-Gln-Glu-Asp-Leu-NH2 0.060
±0.002		 46.6
±0.5		 777±18 n.i. 0.061
±0.002		 45.6
±0.5		 748±16 n.i.
생리학적 기질
초기의 연구에서, QC에 의한 [Gln1]-TRH 및 [Gln1]-GnRH의 전환은 이미 소 및 돼지의 뇌하수체로부터 얻은 QC에서 나타났다(Busby, W. H. J. 등. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. 및 Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3628-3632). 이미 조사된 이러한 뇌하수체 호르몬 이외에도, 인간 QC의 세 가지 잠재적인 생리학적 기질들, 이름하여 Gln1-가스트린, Gln1-뉴로텐신, 및 Gln1-FPP을 합성하였고 전환시 시험하였다. 이들의 전환에 대한 역학적 파라미터를 표 1에 열거하였다. 흥미롭게도, 글루타미닐 펩타이드들이 각각 피로글루타밀 펩타이드들로 전환되는데, 그들의 크기, 즉, 17개 아미노산을 가진 가장 큰 펩타이드 프로-가스트린 뒤에, 프로-뉴로텐신, 프로-GnRH, 프로-TRH 및 프로-FPP가 뒤따르는 크기에 의존하여 특이성 상수가 증가하였다. 이러한 발견은 합성 펩타이드들에게서 얻은 데이터와 상응하였다.
놀랍게도, 더 긴 기질들은 또한 더 높은 선택성으로 식물효소에 의해 전환되며, 이는 더 짧은 올리고펩타이드에서의 발견과 부분적으로 배치되었다. 아마도, 활성부위와 멀리 떨어져서, 기질과 효소간의 제2의 결합 상호작용이 있었을 수 있다.
변형된 아미노산을 포함하는 펩타이드
QC의 특이성 및 선택성을 추가로 조사하기 위해, N-말단 글루타미닐 잔기 또는 두 번째 위치에서 변형된 아미노산을 포함하는 펩타이드를 합성하였다. MALDI-TOF 질량분광분석으로 이러한 펩타이드들의 전환을 정성적으로 분석하였다(실시예 3 참조). 각각 글루타미닐 잔기 또는 이의 유사체의 고리화로 인하여, 촉매작용의 기질 및 생성물의 질량차이를 검출하였다. 기질 몰당 1 몰의 암모니아 방출의 경우, 또한 분광분석법으로 정성적으로 분석하였다.
H- Gln - Lys ( Gln )- Arg - Leu - Ala - NH 2 . 펩타이드- 및 부분적인 이소펩타이드 결합을 통해 리실 잔기에 결합된 N-말단에 두 개의 글루타미닐 잔기를 포함하는, 이러한 N-말단 분지된 펩타이드는 동일한 방식으로 인간(도 5) 및 파파야 QC (미도시)에 의해 전환하였다. 일치하는 기질 전환(도 5)에 의해 나타난 바와 같이, 구별되는 잔기에 대한 어떠한 검출할만한 선호도 없이, 글루타미닐 잔기 둘 다 피로글루탐산으로 전환하였다. 따라서, 상이하게 결합된 글루타미닐 잔기에 대한 QC의 선택성은 기본적으로 다르지 않았다.
H- Gln ( NMe )- Phe - Lys - Ala - Glu - NH 2 . 메틸화된 글루타미닐 잔기는 파파야 QC에 의해 오로지 피로글루타밀 잔기로만 전환되었다(도 6). 또한, 펩타이드에 의한 인간 QC의 저해는 검출되지 않았는데, 이는 메틸화된 잔기가 인간 QC에 의해 인지되지 않음을 가리킨다.
H- Glu ( OMe )-β NA 및 H- Glu -β NA. 이들 화합물 어느 것도 파파야 또는 인간 QC에 의해 전환되지 않았다. 이러한 형광발생성 기질들은 피로글루타밀 아미노펩티다제를 보조 효소로 사용하여, 형광광도법로 분석하였다. O-메틸화 글루타메이트 잔기들은, 그러나, 트리스 및 트리신 완충액 둘 다에서, 비-효소성으로 촉매되는 고리화의 경향을 보이는, 매우 불안정함을 나타냈다. 더 나아가, 기질로서 H-Gln-AMC에 대한 양쪽 QC 활성은 더 긴 펩타이드들 H-Glu(OMe)-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2 또는 H-Glu-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2에 의해 저해되지 않았고, 이는 글루탐산 또는 유도체가 양쪽 QC 형태에 의해 인지되지 않았음을 나타낸다. 더 나아가, 그 결과는 글루탐산 잔기의 음하전이 활성 부위로부터 펩타이드를 배척하는 유일한 이유가 아님을 알려준다.
H- Gln -사이클로(Nε- Lys - Arg - Pro - Ala - Gly - Phe ). 분자 내부의 부분적인 이소펩타이드 결합을 가지는, H-Gln-사이클로(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe)의 전환을 정량적으로 분석하였고, 인간 및 파파야 QC에 대해 각각 240±14 μM 및 133±5 μM의 KM-값이 나타났다. 인간 QC (22.8±0.6 s-1)에 비해 파파야 QC(49.4±0.6 s-1)에 의한 전환의 더 높은 턴오버 수로 인하여, 식물 효소는 인간 QC보다 약 4배 더 높은 kcat/KM-값인 372±9 mM-1min- 1를 나타냈다. 따라서, 파파야 QC의 경우 특이성 상수는 H-Gln-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-NH2와 같이 유사한 크기를 가지는 기질에 비해 약간만 작을 뿐이었다. 인간 QC에 대한 kcat/KM 값은, 그러나, 95±3 mM-1s- 1를 가지는 것으로 나타났고 이는 유사한 크기의 기질에 비해 약 1차수 크기가 작은 것이었다(표 5).
H-β호모 Gln - Phe - Lys - Arg - Leu - Ala - NH 2 . N-말단 β-호모글루타미닐 잔기를 각각 인간 및 파파야 QC의 촉매작용에 의해 5-원 락탐 고리로 전환시켰다. 동시에 일어나는 암모니아의 배출은 분광분석적으로 및 전술한 바와 같은 MALDI-TOF 분석에 의해 분석하였다. QC를 빼거나 가열하였을 때, 암모니아 배출이 검출되지 않았고, 이는 고리화의 특이적 촉매작용을 가리킨다. 흥미롭게는, C. 파파야 (KM = 3.1±0.3 mM, kcat = 4.0±0.4 S-1) 및 인간 (KM = 2.5±0.2 mM, kcat = 3.5±0.1 S-1)로부터의 QC는 각각 거의 동일한 1.4±0.1 및 1.3±0.1 mM-1s-1의 kcat/KM 값을 가지고 이러한 펩타이드 전환을 촉매하였다. 따라서, β-호모글루타민 잔기의 고리화를 N-말단에서 글루타미닐 잔기를 포함하는 유사한 크기의 펩타이드에 비해 약 1000배 감소한 효율로 촉매하였다. 이는 기질의 α-탄소의 구성이 QC 형태에 의한 기질 인식에 중요하지만 필수적이지는 않다는 것을 나타낸다. 기질이 되기 위한 필수적 요건은 고리화하기 쉬운 거리와 각도에 있는 γ-아마이드기와 비양성자화된 N-말단 아미노기이었고, 이는 N-말단 글루타미닐 및 β-호모-글루타미닐 잔기에 의해 수행되는 요건이다.
실시예 6: QC 기질의 합성
올리고펩타이드류. 펩타이드 합성기(Labortec SP650, Bachem, Switzerland)를 사용하여, 전술한 바와 같이(Schilling, S. 등. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857) 펩타이드를 0.5 mmol 스케일로 반자동으로 합성하였다. 자동화 심포니 펩타이드(Symphony Peptide) 합성기(Rainin Instrument Co.)를 사용하여, 기재된 바와 같이(Manhart, S. 등. 2003 Biochemistry 42,3081-3088) 더 긴 펩타이드를 25 μmol 스케일로 합성하였다. 모든 펩타이드 짝결합(coupling)에 대해서, 고체상 펩타이드 합성의 변경된 Fmoc-프로토콜을, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU; Novabiochem)/염기(디이소프로필 에틸아민 또는 N-메틸-모르폴린; Merck)를 사용하여 적용하였고, 어려운 짝결합의 경우, N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄암미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드 (4,5) (HATU; Applied Biosystems)/디이소프로필 에틸아민을 활성화 시약으로서 사용하였다. 트리플루오로아세트 산 (TFA; Merck) 함유 칵테일로 수지로부터 절단한 후, 미정제 펩타이드를 추가의 N-말단 글루타민의 고리화를 피하기 위해 산이 없는 용매를 사용하여 예비 HPLC로 정제하였다. 물에 함유된 직선 구배의 아세토니트릴(Merck) (40분에 걸쳐 5 내지 40 % 또는 65 % 아세토니트릴)을 250-21 Luna RP18 컬럼(Phenomenex) 상에 사용하여 예비 HPLC를 수행하였다. 펩타이드 순도 및 정체(identity)를 확인하기 위해, 분석 HPLC 및 ESI-MS를 사용하였다.
Glu ( NH - NH 2 )- Ser - Pro - Thr - Ala - NH 2 . 직선 전구체 펩타이드(Fmoc-Glu-Ser-Pro-Thr-Ala-NH2)를 표준 Fmoc-과정 (Schilling, S. 등. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857)에 따라 Rink 아마이드 MBHA 수지(Novabiochem) 상에서 합성하였다. 수지로부터 Fmoc-보호 펩타이드를 절단한 후, 펩타이드를 디에틸 에테르 (Merck)로 침전시켜, 여과 및 건조시켰다. 디클로로메탄(DCM, Merck)에서 HMBA-AM 수지(1.16 mmol/g, Novabiochem)를 전구체 펩타이드(3 eq.)의 글루탐산의 γ-카복실산기의 짝결합에 사용하였다. 디사이클로헥실카보디이미드(DCC, Serva)(4 eq.) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP, Aldrich)(0.1 eq)을 짝결합 시약으로 사용하였다. 12시간 후, 수지를 여과하고, DCM로 세척하고 반응을 반복하였다. 20% 피페리딘을 함유한 DMF 용액을 사용하여(3 x 5 min) N-말단 Fmoc-기를 탈보호한 후, 펩타이드 수지를 5% 히드라진 용액(20 ml/g)으로 1.5시간 동안 처리하였다. 수지를 여과하고 디메틸포름아마이드(DMF, Roth, Germany) 및 TFA로 세척하였다. 증발 후, 미가공(crude) 펩타이드를 에테르로 침전시켜 76 % 수율로 얻었다.
H- Gln - Lys ( Gln )- Arg - Leu - Ala - NH 2 . 표준 Fmoc/tBu-과정에 따라, 상기 선형 펩타이드를 Rink 아마이드 MBHA(Schilling, S. 등. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857) 상에서 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH를 끝에서 두 번째 아미노산 짝결합으로서 사용하여 합성하였다. 20 % 피페리딘(Merck)을 함유한 DMF를 사용하여 리신의 두 개 아미노 보호기를 탈보호시킨 후, 4 eq. Fmoc-Gln(Trt)-OH을 짝결합하였다. 표준 절단 과정으로 95% 수율을 얻었다.
H- Gln ( NMe )- Phe - Lys - Ala - Glu - NH 2 . Fmoc-MI-AM (Novabiochem) 수지 상에 적재된 Fmoc-Glu-OtBu로부터 시작하여, Fmoc-Gln(NMe)-OH를 합성하였다. DCM로 부풀린 후, 수지(0.5 g)를 DMF로 세척하고 20 % 피페리딘 용액을 함유한 DMF으로 탈보호시켰다. 수지를 5 ml DMF에 넣은 후, 5 eq. Fmoc-Glu-OtBu, 5 eq. HATU 및 10 eq. DIPEA를 첨가하여 6시간 동안 흔들었다. 여과 및 세척 후, 생성물을 표준 TFA 절단 조건에 따라 절단하였다. 펩타이드 H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2를, 기재한 바와 같이(Schilling, S. 등. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857) 합성하였다. Fmoc-Gln(NMe)-OH를 HATU/DIPEA와 밤새 짝결합시켰다. 표준 절단 과정으로 미가공 펩타이드를 78% 수율로 수득하였다.
H- Glu ( OMe )-β- 나프틸아마이드 , H- Gln - Val - OH , H- Gln - Tyr - OH. Boc-보호된 디펩타이드를 이소부틸 클로로카보네이트 (Merck)를 사용하여 표준 혼합 무수물 과정에 따라 합성하였다. C-말단 메틸에스테르 Boc-Gln-Tyr-OMe 및 Boc-Gln-Val-OMe를 1 N NaOH를 함유한 디옥산을 사용하여 사포닌화시켰다. Boc-보호된 펩타이드를 HCl/디옥산 용액으로 10분간 탈보호시켰다. 증발 후, 잔류물을 수 개의 용매들을 사용하여 결정화시켜 60 내지 70 %의 고체 화합물을 얻었다.
H- Gln -사이클로(Nε- Lys - Arg - Pro - Ala - Gly - Phe ). 산성 민감성 2-클로로트리틸 수지상에서 선형 전구체 Boc-Gln(Trt)-Lys-Arg(Pmc)-Ala-Gly-Phe-OH를 합성하였다. Fmoc-Lys(Mtt)-OH를 사용하여 Fmoc/tBu-전략의 표준 프로토콜에 따라 짝결합을 수행하였다. 3 % TFA 용액 함유 DCM으로 절단 후(10번, 5분), 그 용액을 10 % 피리딘(Merck) 함유 메탄올(MeOH; Merck)로 중화시키고, DCM 및 MeOH로 3번 세척하였으며, 5 %의 부피로 증발시켜 미가공 펩타이드를 빙냉수로 침전시켰다. 그 다음, 상기 미가공 펩타이드를 DCC/N-히드록시벤조트리아졸(HOBt; Aldrich) 활성화를 이용하여 고리화시켰다. 미가공 펩타이드를 건조 디클로로메탄(0.2 mmol/50 ml)에 용해하고, 0.2 mmol N-메틸모르폴린 및 0.4 mmol 1-히드록시벤조트리아졸을 첨가하였다. 이 용액을 0 ℃에서 0.4 mmol 디사이클로헥실카보디이미드를 함유한 250 ml 디클로로메탄용액에 적가하였다. 실온에서 밤새 교반하면서 반응을 완결하였다. N,N'-디사이클로헥실우레아의 여과 후, 용매를 증발 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해하고 1N HCl, NaHCO3 및 물의 포화용액으로 수 회 세척하였다. 용액을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 및 진공에서 증발 건조시켰다.
실시예 7: QC 이펙터의 특성화
이미다졸 유도체
5-원 고리의 상이한 위치에서 치환체를 가지고 있는 이미다졸 및 벤즈이미다졸 유도체를 QC의 저해제로서 시험하였다(표 3). 숫자의 구성은 이미다졸 고리를 의미한다. 적용된 방법은 실시예 2에 기재하였다.
C-4(5) 및 C-4,5 유도체. 이미다졸 고리의 구성적으로 등가의 4- 또는 5-위치 중 어느 하나 또는 둘 다의 위치에서 치환체를 가지는 화합물은, 인간 QC의 저해에 대해 감소된 효능을 나타냈다. 그러나, 예외적으로, N-ω-아세틸화된 히스타민은 가장 유력한 저해 화합물 중 하나로 판명되었다. 이러한 위치에서 작은 치환체들은 5-히드록시메틸-4-메틸-이미다졸의 유사한 저해 상수에 의해 나타난 바와 같이, 이미다졸에 비해 결합에 영향을 거의 끼치지 못했다. 이러한 부위에 부착된 더 크고 더 거대한 기들은 효소에 의한 화합물 결합을 감소시키거나 없애버렸다. 시험된 다른 몇몇 치환체들은 이미다졸 고리에서 전자밀도를 감소시킬 수 있는, 음성적 유도(inductive) 또는 공명(mesomeric) 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있으며, 또한 결합상수를 더 약하게 했다. L-히스티딘 및 히스티딘아마이드의 Ki-값의 차이는 또한 결합에 대한 전하의 몇몇 영향을 나타냈다. 하전된 기질의 정전기적 배척에 대한 증거는 이미 기질 특이성 연구에서 나타났다, 즉 글루타민아마이드는 쉽게 인간 QC에 의해 전환되나, 기질로서 자유 글루타민에 대해서는 아무런 반응성도 관측되지 않았다.
C-2 유도체. 시험된 모든 유도체들은 QC를 이미다졸로서 더 약하게 저해하였다. 양성자보다 더 큰 임의의 치환은 적절한 QC-결합을 방해하였다. 오직 2-메틸-벤즈이미다졸에서의 메틸기로 인해, 저해 상수가 약 1차수 크기로 감소하였다. 매우 유사한 관계가 벤즈이미다졸과 2-아미노-벤즈이미다졸에 대한 Ki-값들을 비교함으로써 나타났다. 또한, 그 결과는 상기 영향이 전자적 변경과는 무관함을 알려주었다.
N-1 유도체. 인간 QC 저해에 대해 시험된 이미다졸 유도체들 중에서, 이미다졸에 비해 향상된 Ki-값을 가지는 대부분 화합물은 하나의 질소 원자에서 변경을 나타냈다. 이러한 화합물은 또한 가장 효과적인 QC 저해제들 중의 하나, 1-벤질이미다졸을 포함한다. 흥미롭게도, 실험 조건하에 불활성인, 1-벤조일이미다졸 및 페닐이미다졸에 대해 나타날 수 있는 바와 같이, 이러한 구조를 조금만 변경해도 저해 특성을 상실하게 하였다. 또한 이러한 경우, 관측된 변화는 페닐기의 음성적 공명(mesomeric) 효과로 인해 이미다졸 고리의 감소된 전자 밀도로만 야기된 것으로 보이지 않았는데, 이는 또한 양성적 유도 효과를 나타내는 거대 트리메틸-실릴기가 다른 잔기에 비해 감소된 결합을 보이기 때문이었다. 흥미롭게도, 이러한 기의 덜 효과적인 화합물들 중 하나는 1-아미노프로필-이미다졸이었다. 이 화합물의 작은 효능은 염기성 아미노기에 의해 야기되는 것으로, 공간적으로 유사한 화합물들인 1-메틸이미다졸 및 1-비닐이미다졸이 활성 부위에 대해 향상된 결합을 보이기 때문이었다. 따라서, 양하전 아미노기는 더 작은 Ki-값을 나타내며, N-ω-아세틸화된 히스타민(표 3) 및 히스타민(표 4)의 Ki-값을 비교함으로써 확증하였다.
3,4 및 3,5 유도화의 효과. 위치 4(5) 또는 둘 다에서 치환체를 포함하는 이미다졸 유도체는 효소에의 결합에 제한된 효율을 가지고 있는 것으로 나타났다. 특이적 치환체의 효과는 L-히스타민 및 히스타민의 생물학적 분해에서의 두 중간체인, 3-메틸-4-히스타민과 3-메틸-5-히스타민의 저해 상수를 비교함으로써 명확해졌다(표 4). L-히스타민은 그것의 아세틸화된 상응물에 비해 약 1차수 크기인 작은 Ki 값을 나타냈다. 하나의 질소를 메틸화하면 3-메틸-4-히스타민의 경우 상당한 효능 개선을 가져왔다. 3-메틸-5-히스타민으로 이끄는 메틸화는, 그러나, 저해 활성을 완전히 잃게 하였다. 따라서, 관측된 효과는 염기성 질소에 인접한 탄소의 유도화로 인한 결합의 공간적 장애(sterical hindrance)에 의해 주로 나타나는 것으로 보였다. 추측으로는, 염기성 질소가 효소와의 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 보였다.
실시예 8: Aβ(3-40/42) 유도체의 형성
측정은 세 번째 위치에서 글루탐산 잔기 대신 글루타민을 포함하는 Aβ(3-40/42)의 두 개의 짧은 N-말단 펩타이드 서열, Gln3-Aβ(1-11)(서열: DAQFRHDSGYE) 및 Gln3-Aβ(3-11)a 을 가지고 수행하였다. DP Ⅳ에 의한 절단 및 상기 두 개의 펩타이드의 QC에 의한 N-말단 글루타민 잔기의 고리화를 MALDI-TOF 질량분광 분석으로 시험하였다. 측정은 정제된 DP Ⅳ(돼지 신장) 또는 미가공 돼지 뇌하수체 분쇄물을 QC 출처로서 및 연속적인 촉매작용을 측정하기 위한 효소원으로 사용하여 수행하였다.
결과
1. DP Ⅳ에 의해 촉매된 Gln3-Aβ1-11a로부터의 Gln3-Aβ(3-11)a의 형성 및 DP Ⅳ-저해제 Val-피롤리다이드(Val-Pyrr)에 의한 이의 방지
DP Ⅳ 또는 DP Ⅳ-유사 활성은 Gln3-Aβ(1-11)a를 절단하여 Gln3-Aβ(3-11)a를 형성하였다(도 7). 세 번째 위치의 잔기는 이러한 절단에 의해 노출되고 따라서 다른 효소들, 즉, QC에 의한 변경이 접근 가능해졌다. 예상되는 바로는, 촉매작용은 Val-Pyrr에 의해 완전히 방지될 수 있다(도 8).
2. 뇌하수체 분쇄물에서의 QC의 촉매작용에 의한 Gln3-Aβ(3-11)a로부터의 pGlu3-Aβ(3-11)a의 형성 및 1,10-페난트롤린에 의한 방지
돼지 뇌하수체의 분쇄물에 있는 글루타미닐 사이클라제는 Gln3-Aβ(3-11)a에서 [pGlu3]-Aβ(3-11)a로의 전환을 촉매하였다(도 9). [pGlu3]Aβ(3-11)a의 형성은 1,10-페난트롤린의 첨가로 저해되었다(도 10).
3. [pGlu3]Aβ(3-11)a의 형성을 결과하는 DP Ⅳ 및 QC의 연속적 촉매작용 및 Val-Pyrr과 1,10-페난트롤린에 의한 방지
Gln3-Aβ(1-11)a로부터 [pGlu3]Aβ(3-11)a의 형성은, 돼지 신장에서 얻은 DP Ⅳ가 첨가된 돼지 뇌하수체의 분쇄물에서 측정되는 바와 같이, DP Ⅳ 및 QC의 연속적인 촉매작용 후에 일어났다(도 11). [pGlu3]Aβ(3-11)a는 QC-저해제 1,10-페난트롤린 (도 12) 또는 DP Ⅳ-저해제 Val-Pyrr(도 13)이 첨가될 때에는 형성되지 않았다. [pGlu3]Aβ(3-11)a의 약한 출현은, [Gln3]Aβ(2-11)a의 형성으로 나타난 바와 같이, 아미노펩티다제 절단 및 후속적인 글루타민 잔기의 고리화에 의한 것이었다.
4. 미가공 뇌하수체 분쇄물에서의 아미노펩티다제(들)의 촉매작용에 의한 [pGlu3]Aβ(3-11)a의 형성
DP Ⅳ 촉매작용에 의존하지 않는 [pGlu3]Aβ(3-11)a의 형성으로 인하여, DP Ⅳ의 없이, 미가공 뇌하수체 분쇄물에서 [Gln3]Aβ(1-11)a의 분해를 조사하였다(도 14). 섹션 4의 데이터에서 예상되는 바와 같이, [pGlu3]Aβ(3-11)a 형성을 관측하였다. 이 데이터는 Gln3-Aβ(1-11)a의 분해가 또한 아미노펩티다제(들)에 의해 촉매될 수 있고, [pGlu3]Aβ(3-11)a을 형성하는 결과를 낳는다는 것을 나타낸다. 따라서, 그 결과는 이러한 조직에서, 피로글루타밀 형성이 N-말단 펩타이드 분해의 종점이라는 것을 나타내며, 추가로 플라크 형성에서의 QC의 역할을 지지한다.
실시예 9: 재조합 인간 QC 에 의한 Gln 3 -Aβ(3-11)a; (3-21)a 및 (3-40)의 턴오버
시험된 모든 Gln3-Aβ 유도 펩타이드는 인간 QC에 의해 상응하는 피로글루타밀 형태로 효과적으로 전환시켰다(표 8 및 9). Gln3-Aβ(3-21)a 및 Gln3-Aβ(3-40)이 수성 용액에서 용해도가 낮기 때문에, 1% DMSO 존재 하에서 결정을 수행하였다. 그러나, Gln3-Aβ(3-11)a의 더 나은 용해도 때문에, DMSO의 존재 및 부존재 하에 QC-촉매 턴오버의 역학적 분석이 가능했다(표 8 및 9). 종합하면, 8, 18 및 37개 아미노산의 사슬길이를 가진 QC-기질로서 Aβ 펩타이드를 조사한 결과(표 10 참조)는 인간 QC-활성은 그것의 기질의 길이와 같이 증가한다는 관측을 확증하였다. 따라서, Gln1-가스트린, Gln1-뉴로텐신, 및 Gln1-GnRH는, 특이성 상수를 고려할 때, QC-기질들 중 최고이다. 유사하게, 지금까지 조사된 가장 큰 QC-기질인 Gln3-Aβ(3-40) 및 글루카곤은 1 % DMSO의 존재 하에서조차 높은 2차 속도 상수를 보였다(각각, 449 mM-1s-1 및 526 mM-1s-1)(표 10).
흥미롭게도, 조사된 아밀로이드 펩타이드의 전환에 대한 역학적 파라미터는 크기의 증가에 대해 급격하게 변화하지 않았으며, 이는 QC 촉매작용에 대한 Aβ의 C-말단 부분의 온건한 효과만을 제시한다. 그러므로, 더 나은 용해도 및 실험 취급(handling)으로 인해, 이러한 펩타이드들의 N-말단 아미노펩티다제 프로세싱에 관하여 Aβ의 더 작은 단편, Gln3-Aβ(1-11)a, Gln3-Aβ(3-11)a 및 Aβ(3-11)a을 사용하여 조사하였다.
1% DMSO 펩타이드 함유 완충용액에서의 재조합 인간 QC에 의한 N-말단 Gln-함유 펩타이드의 전환에 대한 역학적 파라미터
펩타이드 KM(μM) kcat(s-1) kcat/KM(mM-1s-1)
[Gln3]Aβ3-11a 87±3# 55±1# 632±10#
[Gln3]Aβ3-11a 155±4 41.4±0.4 267±4
[Gln3]Aβ3-21a 162±12 62±3 383±10
[Gln3]A3-40 89±10 40±2 449±28
글루카곤(3-29) 19±1 10.0±0.2 526±17
#DMSO 부재시 결정됨
실시예 10: 재조합 인간 QC 에 의한 Aβ(3-11)a 및 Aβ(3-21)a의 턴오버
QC 존재 하에 Aβ(3-11)a 및 Aβ(3-21)a의 항온처리로, 이전의 결과와는 달리, 글루타메이트-포함 펩타이드들이 또한 QC-기질로서 작용한다는 것을 밝혀냈다(도 15C 및 D). [pGlu3]Aβ(3-11)a 및 [pGlu3]Aβ(3-21)a의 QC-촉매 형성을 각각 pH 5.2 및 6.5에서 조사하였다. QC 첨가로 분석을 시작하기 전, 용액에 QC-저해제 벤즈이미다졸을 첨가하면, [pGlu3]Aβ(3-11)a 또는 [pGlu3]Aβ(3-21)a를 초래하는 기질 전환이 억제되었다(도 15E 및 F). QC를 첨가전에 가열하면, pGlu-펩타이드의 형성은 무시될 수 있을 정도였다(도 15A 및 B).
실시예 11: 파파야 QC - 촉매하 Gln -β NA 및 Glu -β NA 의 고리화의 pH -의존성
파파야 QC는 미카엘리스-멘텐 역학에 따라 Glu-βNA를 최대 2 mM의 농도 범위로(이는 기질 용해도로 제한하였다) 전환시켰다(도 16). pH 6.1 및 8.5 사이에서 연구된, Glu-βNA의 QC-촉매된 전환에 대한 턴오버 대 기질 농도 도식을 연구한 결과, 이러한 Glu-기질에 대해, 두 가지 파라미터, KM 및 kcat은 모두 pH-의존성 방식으로 변화한다는 것을 밝혔다(도 16). 이것은, KM에서의 변화는 주어진 pH 범위에 걸쳐 관측된다는 이전에 설명된 QC-촉매된 글루타민 고리화와는 대비되는 것이었다 (Gololobov, M. Y., Song, I., Wang, W., 및 Bateman, R. C. (1994) Arch Biochem Biophys 309,300-307).
후속적으로, Glu- 및 Gln-고리화 동안 양성자 농도의 충격(impact)을 연구하기 위해, 1차 속도 법칙 조건(즉, KM-값 훨씬 아래의 기질 농도)하에 Glu-βNA 및 Gln-βNA의 고리화의 pH-의존성을 조사하였다(도 17). 글루타민의 고리화는 pH 8.0에서 pH-최적성을 가지며, 이는 pH 6.0에서 pH 최적성을 보이는 글루탐산의 고리화와는 대비되었다. 각각의 최적 pH에서의 특이성 상수가 약 80,000 배 차이가 나는 반면, pH 6.0 근처에서의 QC 대 EC 활성의 비는 고작 약 8,000이었다.
Gln-βNA로부터의 비효소성 pGlu-형성은 pH 6.0에서 조사하였고, 4주 후 1차 속도 상수가 1.2*10-7s-1임을 밝혔다. 그러나, 동일 기간동안 Glu-βNA로부터 어떠한 pGlu-βNA도 형성되지 않았고, 이는 턴오버에 대한 제한 속도 상수가 1.0*10-9s-1임을 추정할 수 있었다.
실시예 12: 효소 불활성화/재활성화 과정
인간 QC의 분배물(0.1-0.5 mg, 1 mg/ml)을 5 mM 1,10-페난트롤린 또는 5 mM 디피콜린산(dipicolinic acid) 함유 0.05 M Bis-Tris/HCl, pH 6.8의 3000배 초과량에 대해 밤새 투석하여 불활성화시켰다. 후속적으로, 불활성화 제제를 1 mM EDTA를 함유한 0.05 M Bis-Tris/HCl, pH 6.8에 대하여 샘플을 투석시킴으로써 (3회, 2000배 초과용량) 조심스럽게 제거하였다. Zn++, Mn++, Ni++, Ca++, K+ 및 Co++ 이온들을, 0.5 mM EDTA를 함유한 0.025 M Bis-Tris, pH 6.8에서, 1.0, 0.5, 0.25 mM의 농도로 사용하여, 실온에서 15분간 재활성 실험을 수행하였다. 완충액 용액에 존재 하는 미량 금속 이온들에 의한 급속한 활성화를 피하기 위해, QC 활성 분석을 2 mM EDTA 함유 0.05 M Tris/HCl, pH 8.0에서 수행하였다.
1,10-페난트롤린에 의한 돼지 QC의 저해는 이미 기재되어 있다(Busby, W. H. J. 등. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536, Bateman, R. C. J. 등. 2001 Biochemistry 40). 그러나, EDTA가 QC 촉매작용에 활성화 효가를 가지는 것으로 나타난 사실은 페난트롤린에 의한 저해가 금속 킬레이션에 의한 것이 아니라는 것을 제시하였다(Busby, W. H. J. 등. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536, Bateman, R. C. J. 등. 2001 Biochemistry 40). 또한, 1,10-페난트롤린에 의해 저해될 뿐 아니라, 인간 QC 촉매된 기질 고리화는 금속효소의 다른 저해제인 디피콜린산 및 8-히드록시퀴놀린의 존재 하에서 없어졌다. 이러한 킬레이터들은 경쟁적 및 시간-의존성 방식으로 QC를 저해하였다. 즉, 이미 경쟁적으로 저해된 초기 활성은 상기 화합물들과 오래 항온처리한 후에 더 감소된다는 것이 나타났다(도 18, 19). 흥미롭게도, EDTA는 항온처리 시간에 관계없이 또는 임의의 조건하에 현저한 저해를 나타내지 않았다.
인간 QC는 5 mM 1,10-페난트롤린 또는 5 mM 디피콜린산에 대하여 막대한 양으로 투석한 후에 거의 완전히 불활성화되었다. 킬레이터가 없는 완충용액에 대해 밤새 반복적으로 투석한 후, QC 활성은 부분적으로 50-60%까지 재활성화되었다. 그러나, 1 mM EDTA 함유 완충액에 대해 투석시, 아무런 재활성화가 관측되지 않았다.
디피콜린산 또는 1,10-페난트롤린에 의한 불활성화 후 QC 활성의 거의 전면적인 복구가 상기 단백질을 0.5 mM EDTA 존재 하에 0.5 mM ZnS04와 10분간 항온처리함으로써 달성하였다(도 20). 유사하게, QC 활성의 부분적인 복구는 재활성화를 위해 Co++ 및 Mn++ 이온을 사용하여 달성하였다. 심지어 0.25 mM Zn++의 존재 하에서도, 원래 활성의 25 %까지 재활성화가 가능하였다. Ni++, Ca++ 또는 K+ 이온들을 적용하면 재활성화가 관측되지 않았다. 유사하게, 이러한 이온들과 완전히 활성인 QC은 항온처리하면 효소 활성에 영향이 없었다.
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  1. Aβ(아밀로이드β)3-40/42 및 [Gln3]Aβ3-40/42의 N-말단에서 글루탐산 또는 글루타민의 피로글루탐산 잔기로의 전환을 저해하는 글루타미닐 사이클라제(QC) 저해제를 포함하는, 알츠하이머병 또는 다운증후군의 치료를 위한 비경구, 소화관 내 또는 경구 투여용 약학적 조성물에 있어서,
    상기 글루타미닐 사이클라제(QC) 저해제가 1,10-페난트롤린 또는 디피콜린산인 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 글루타미닐 사이클라제(QC) 저해제가 적어도 하나의 통상의 담체 또는 부형제 또는 담체 및 부형제와 함께 사용되는 것인 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 글루타미닐 사이클라제(QC) 저해제가 경쟁적 저해제인 것인 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 경구 투여용인 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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