EA010108B1 - Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз - Google Patents

Abstract

Предлагаются новые физиологические субстраты глутаминилциклазы (QC, КФ 2.3.2.5) млекопитающих, новые эффекторы QC и применение указанных эффекторов и фармацевтических композиций, содержащих эффекторы, для лечения заболеваний, которые можно лечить путем модуляции активности QC, например заболеваний, выбранных из группы, включающей рак двенадцатиперстной кишки, связанный или не связанный с заражением Heliobacter pylori, колоректальный рак, синдром Золлингера-Эллисона, семейная британская деменция и семейная датская деменция.

Description

Настоящее изобретение относится к глутаминилциклазе (ОС. КФ 2.3.2.5), которая катализирует внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (5-оксопролин. рС1и*) и выделением в свободном состоянии аммиака и внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамата с образованием пироглутаминовой кислоты и выделением в свободном состоянии воды.

При создании настоящего изобретения были идентифицированы ОС млекопитающих в качестве металлоферментов, выявлены новые физиологические субстраты ОС в организме млекопитающих и разработаны пути применения эффекторов ОС и фармацевтических композиций, содержащих эффекторы ОС, для лечения состояний, которые можно лечить путем модуляции ОС-активности. Кроме того, установлено, что использование взаимодействия с металлом является важным подходом при разработке ингибиторов ОС.

Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является применение эффекторов ОС-активности в сочетании с ингибиторами ΌΡ IV (дипептидилпептидаза IV) или подобных ΌΡ IV ферментов для лечения или облегчения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности ОС и/или ΌΡ IV.

Предложен также способ скрининга для идентификации и отбора эффекторов ОС-активности.

Предпосылки создания изобретения

Глутаминилциклаза (ОС, КФ 2.3.2.5) катализирует внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (рС1и*) с выделением в свободном состоянии аммиака. ОС впервые была выделена Мессером (Меккег) из латекса тропического растения Сапса рарауа в 1963 г. (Меккег М., №11иге 4874, 1963, с. 1299). Спустя 24 года соответствующая ферментативная активность была обнаружена в гипофизе животных (ВикЬу \У.Н.1. и др. I. Βίο1. СЬет. 262, 1987, с. 8532-8536; Иксйет ν.Η. и 8р1екк I., Ргос №111 Асаб 8е1 И8А 84, 1987, с. 3628-3632). Для ОС млекопитающих превращение С1и в рС1и с помощью ОС было обнаружено для предшественников ТКН (тиреолиберин) и СпКН (гонадолиберин) (ВикЬу ν.Η.Ι. и др., I. Βίο1. СЬет. 262, 1987, с. 8532-8536; Иксйет ν.Η. и 8р1екк I., Ргос №11 Асаб 8с1 И8А 84, 1987, с. 3628-3632). Кроме того, предварительные эксперименты по выявлению локализации ОС позволили выявить ее совместную локализацию с предполагаемыми продуктами катализа в бычьем гипофизе, что является дополнительным доказательством ее функции в синтезе пептидных гормонов (Воскегк Т.М. и др., I. №игоепбосгто1. 7, 1995, с. 445-453). В противоположность этому физиологическая функция растительной ОС все еще остается неясной. Предполагается, что фермент из С. рарауа играет роль в защите растений от патогенных микроорганизмов (Е1 Моиккаош А. и др., Се11 Мо1 ЫГе 8с1 58, 2001, с. 556-570). В настоящее время на основе сравнительного анализа последовательностей были выявлены предполагаемые ОС из других растений (ЭаЫ δ.ν. и др., Рго1еш Ехрг РипГ 20, 2000, с. 27-36). Однако физиологическая функция этих ферментов все еще остается неясной.

Известные выделенные из растений и животных ОС обладают строгой специфичностью в отношении Ь-глутамина в Ν-концевом положении субстратов и установлено, что их кинетические характеристики описываются уравнением Михаэлиса-Ментена (Рой1 Т. и др., Ргос №111 Асаб δα И8А 88, 1991, с. 10059-10063; Сопка1уо А.Р. и др., Апа1 Вюсйет 175, 1988, с. 131-138; Со1о1оЬоу М.У. и др., Вю1. СЬет. Норре 8еу1ег 377, 1996, с. 395-398). Однако сравнение первичной структуры ОС из С. рарауа и высококонсервативных ОС млекопитающих не выявило никакой гомологии последовательностей (Эа111 δ.ν. и др., Рго1ет Ехрг РипГ 20, 2000, с. 27-36). В то время как растительные ОС, вероятно, принадлежат к новому семейству ферментов, (Эа111 δ.ν. и др., Рто!еш Ехрг РипГ 20, 2000, с. 27-36), установлено, что ОС млекопитающих обладают выраженной гомологией последовательностей с бактериальными аминопептидазами (Ва!етап К.С. и др., ВюсйетМгу 40, 2001, с. 11246-11250), что позволило сделать заключение о различном эволюционном происхождении ОС из растений и животных.

В ЕР 020113494 описаны полинуклеотиды, кодирующие глутаминилциклазу насекомых, а также кодируемые ими полипептиды. В этом описании рассмотрены также клетки-хозяева, которые содержат экспрессионные векторы, несущие полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении. Выделенные полипептиды и клетки-хозяева, содержащие ОС насекомых, применяют в методах скрининга агентов, которые снижают глутаминилциклазную активность. Установлено, что такие агенты можно применять в качестве пестицидов.

Болезнь Альцгеймера (АБ) характеризуется аномальным накоплением внеклеточных амилоидных бляшек, непосредственно связанных с дистрофичными нейронами, реактивными астроцитами и микроглией (Теггу Β.Ό. и Ка1хтап К., Апп №ито1 14, 1983, с. 497-506; С1еппег С.С. и Vοпд С/ν., Вюсйет Вюрйук Кек Сотт 120, 1984, с. 885-890; !п1адак1 δ. и др., I. №иго1ттипо1 24, 1989, с. 173-182; Еипа!о Н. и др., Ат. I. Ра!йо1. 152, 1998, с. 983-992; 8е1кое Ό.Ι., Рйукю1 Веу 81, 2001, с. 741-766). Амилоид-в-пептиды ((Ав)-пептиды) являются основными компонентами старческих бляшек и считается, что они непосредственно участвуют с патогенезе и развитии АБ, эта гипотеза подтверждается генетическими исследованиями (С1еппег С.С. и Vοпд С/ν., Вюсйет Вюрйук Кек Сотт 120, 1984, с. 885-890; ВогсйеИ Ό.Β. и др.,

- 1 010108

Ыеигоп 17, 1996, с. 1005-1013; Ьетеге С.А. и др., Ыа! Меб 2, 1996, с. 1146-1150; Мапп Ό.Μ. и 1\\ШкиЬо Т. Ыеигобедепегабоп 5, 1996, с. 115-120; Сйгоп М. и др., Ыа! Меб 3, 1997, с. 67-72; 8е1кое Ό. 1., Рйукю1 Неу 81, 2001, сс. 741-766). Αβ образуется в результате протеолитического процессинга β-амилоидного белкапредшественника (ΑΡΡ) (Капд, 1. и др., №1Шге 325, 1987, с. 733-736; 8е1кое Ό.Ι., Тгепбк Се11 Вю1. 8, 1998, с. 447-453), который последовательно расщепляется β-секретазой на Ν-конце и γ-секретазой на С-конце Αβ (Наакк С. и 8е1кое Ό.Ι, Се11 75, 1993, с. 1039-1042; 81топк М. и др., 1. Ыеигока, 16, 1996, с. 899-908). Помимо доминирующих Аβ-пептидов, у которых на Ν-конце находится Ь-Ακρ (Αβ 1-42/40), в старческих бляшках присутствует множество гетерогенных укороченных на Ν-конце форм. Установлено, что такие укороченные пептиды обладают более высокой нейротоксичностью ш уйго и у них существенно быстрее происходит агрегация по сравнению с полноразмерными изоформами (Р1ке С.1. и др., 1. Бю1. Сйет., 270, 1995, с. 23895-23898). Известно, что у пациентов на ранней стадии семейной АБ (САБ) происходит сверхпроизводство укороченных на Ν-конце пептидов (8а1бо Т.С. и др., Ыеигоп 14, 1995, с. 457-466; Никко С. и др., Ыа!иге 405, 2000, с. 531-532), эти пептиды появляются в раннем возрасте в головном мозге пациентов, страдающих синдромом Дауна (ДС), и их количество увеличивается с возрастом (Никко С. и др., ЕЕВ8 Ьей 409, 1997, с. 411-416, Никко С. и др., ЫеигоЫо1 Э1к 8, 2001, с. 173-180; Текшап Т.Ь. и др., 1. Ыеигора1йо1. Ехр. Ыеиго1. 57, 1998, с. 76-94). И, наконец, их количество отражает развитие более серьезной формы заболевания (Никко С. и др., ЕЕВ8 Ьей. 409, 1997, с. 411-416). Дополнительные посттрансляционные процессы могут также модифицировать Ν-конец в результате изомеризации или рацемизации аспартата в положении 1 и 7 и циклизации глутамата на остатках 3 и 11. Пироглутаматсодержащие изоформы в положении 3 |ρ61ιι³’|Αβ(3-40/42) представляют собой доминирующие формы - на их долю приходится примерно 50% общего количества укороченных на Ν-конце видов Αβ в старческих бляшках (Мой Н. и др., 1. Вю1. Сйет. 267, 1992, с. 17082-17086, 8а1бо Т.С. и др., ^шоп 14, 1995, с. 457-466; Никко С. и др., ЕЕВ8 Ьей. 409, 1997, с. 411-416; Текшап Т.Ь. и др., 1. №игора!йо1. Ехр. №иго1. 57, 1998, с. 76-94; Себбек 1А¥. и др., №игоЫо1. Эдтд 20, 1999, с. 75-79; Напдауа Υ. и др., Вюсйет. Вюрйук. Нек. Соттип 276, 2000, с. 422-427), и они присутствуют также в преамилоидных повреждениях (Ьа1о\\'кк| М. и др., 1. Вю1. Сйет. 271, 1996, с. 33623-33631).

Накопление пептидов 115611.6^(1(3-40/42). вероятно, является следствием структурной модификации, которая усиливает агрегацию и придает устойчивость к большинству аминопептидаз (8а1бо Т.С. и др., №игоп 14, 1995, с. 457-466; Текшап Т.Ь. и др., 1. №игосйет. 73, 1999, с. 1584-1589). Эти данные являются ключом к объяснению основной роли пептидов |ρΟ1π³]Αβ(3-40/42) в патогенезе АБ. Однако пока имеется относительно мало сведений об их нейротоксичности и способности к агрегации (Не и Вагго\у С.Е, Вюсйеш1кйу 38, 1999, с. 10871-10877; Текшап Т.Ь. и др., 1 №игосйет 73, 1999, с. 1584-1589). Более того, совершенно нет данных о действии этих изоформ на глиальные клетки и о глиальном ответе на эти пептиды, хотя связь активированной глии со старческими бляшками точно установлена, и глия может активно участвовать в накоплении амилоидных отложений. В современных исследованиях изучали токсичность, агрегацию и катаболизм пептидов А1(1-42), А1(1-40), |ρΟ1υ³]Αβ(3-42) и |ρ61π³]Αβ(3-40) в культурах клеток нейронов и глии и было установлено, что модификация пироглутамата усиливает токсичные свойства Аβ-пептидов и ингибирует также их расщепление культивируемыми астроцитами. 81иго1аш с соавторами (2002) изучали образование пептидов |ρΟ1π³]Αβ в первичных кортикальных нейронах, зараженных вирусом Синдбис ш уйго. Эти авторы сконструировали путем аминокислотной замены и делеции комплементарные ДНК амилоидного белка-предшественника, которые кодировали потенциальный предшественник |ρΟ1π³]Αβ. Для одного из искусственных предшественников, у которого на Ν-конце находился остаток глутамина вместо глутамата, присутствующего во встречающемся в естественных условиях предшественнике, сделано предположение о спонтанном превращении или ферментативном превращении с помощью глутаминилциклазы в пироглутамат. Механизм циклизации Ν-концевого глутамата в положении 3 во встречающемся в естественных условиях предшественнике пептида |ρ61π³]Αβ ш у1уо не выяснен (8й1го!аш К., Ткийик1 8., Бее Н. 1., Магиуата К. и 8а1бо Т.С., №игокс1 Ьей. 327, 2002, с. 25-28).

Семейная британская деменция (СБД)) и семейная датская деменция (СДД) представляют собой проявляющиеся в раннем возрасте аутосомные доминантные нарушения, которые характеризуются прогрессирующим нарушением когнитивной функции, мышечной спастичностью и мозжечковой атаксией (ОЫко 1. и др., Αππ ΝΥ Αсаб 8а 903, 2000, с. 129-137; У1ба1 Н. и др., Уинге 399, 1999, с. 776-781; У1ба1 Н. и др., 1. №игора!йо1. Ехр. №иго1. 63, 2004, с. 787-800). Так же как и при болезни Альцгеймера, у пациентов образуются широко распространенные амилоидные отложения в паренхиме и в сосудах, что сопровождается нейродегенерацией гиппокампа, активацией комплемента и глии (Нок!адпо А. и др., 1. Вю1. Сйет. 277, 2002, с .49782-49790). Причиной этих заболеваний являются различные мутации в гене ВН1 (8\\зккРго1 Ο9Υ287), приводящие к образованию открытой рамки считывания, удлиненной на 11 аминокислот по сравнению с ВН1 дикого типа. В случае СБД замена в ОРС обусловлена мутацией в стоп-кодоне ВН1 (ВН1-Б), в при СДД дупликация-инсерция десяти нуклеотидов приводит к удлинению ВН1 (ВН1-Э) (ОЫко 1. и др., Αту1ο^б 8, 2001, с. 277-284; Нок!адпо А. и др., 1. Вю1. Сйет. 277, 2002, с. 49782-49790). Установлено, что ВН1, представляющий собой трансмембранный белок класса 2, кото

- 2 010108 рый кодируется на хромосоме 13, может процессироваться в С-концевой области с помощью фурина и других прогормональных конвертаз с высвобождением пептида, состоящего из 23 аминокислот (К1т 8.Н. и др., Апп N Υ Асай 8οΐ 920, 2000, с. 93-99; К1т 8.Н. и др., I. Вю1. Сйет. 277, 2002, с. 18721877). Расщепление мутантных белков ВК1, т.е. ВК1-И и ВШ-Ъ. приводит к образованию пептидов (ΑΒτί и АИаи, каждый из которых состоит из 34 аминокислот), обладающих способностью к агрегации, которая приводит к возникновению нефибриллярных отложений, а также амилоидных фибрилл (Е1 АдпаГ О.М. и др., Рто!ет Рер! Ьей. 11, 2002, с. 207-212; Е1 АдпаГ О.М. и др., Вюсйеттйу 40, 2001, с. 3449-3457; Е1 АдпаГ О.М. и др., I. Мо1. Вю1. 310, 2001, с. 157-168; Зптуакап и др., I. Мо1. Вю1. 333, 2003, с. 1003-1023). Пептиды АИаи и АВп содержат идентичные Ν-концевые 22 аминокислоты, но имеют различные С-концевые области. Установлено, что С-концевые области требуются для образования фибрилл и проявления нейротоксичности (Е1 АдпаГ О.М. и др., Рто!еш Рер! Ьей. 11, 2004, с. 207-212).

Установлено, что Ν-конец пептидов АВй и АИап блокируется путем образования пироглутамила. Так же как при болезни Альцгеймера, когда пироглутамил образуется на Ν-конце Ав, рС1и образуется из глутаминовой кислоты (ОЫко I. и др., Ату1о1й 8, 2001; 8а1йо и др., №итоп 14, 1995, с. 457-466). Образование пироглутамила, в свою очередь, стабилизирует устойчивость пептидов к расщеплению большинством аминопептидаз, что провоцирует развитие заболеваний. Установлено, что образование агрегатов происходит вне клеток, но также и в клетках в результате пути секреции (К1т и др., 1. Вю1. Сйет. 277, 2002, с. 1872-1877). Таким образом, подавление образования рС1и на Ν-конце нейротоксичных пептидов АВй и АЭап путем ингибирования глутаминил- и глутаматциклаз является новым подходом к лечению СБД и СДД.

Дипептидилпептидаза IV (ΌΡ IV) представляет собой сериновую протеазу, которая осуществляет расщепление в положении после пролина (в меньшей степени после аланина, после серина или после глицина), обнаруженную в различных тканях организма, включая почку, печень и кишечник, и она отщепляет Ν-концевые дипептиды от пептидной цепи. В настоящее время установлено, что ΌΡ IV играет важную роль в метаболизме нейропептидов, Т-клеточной активации, прикреплении раковых клеток к эндотелию и в проникновении ВИЧ в лимфоидные клетки (см. XVО 02/34242, XVО 02/34243, АО 03/002595 и АО 03/002596).

В АО 99/61431 описаны ингибиторы ΌΡ IV, которые содержат аминокислотный остаток и тиазолидиновую или пирролидиновую группу, а также их соли, прежде всего Ь-треоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-треоизолейцилпирролидин,

Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилпиролидин.

Дополнительными примерами низкомолекулярных ингибиторов дипептидилпептидазы IV являются такие агенты, как тетрагидроизохинолин-3-карбоксамидные производные, Ν-замещенные 2-цианпиролы и пирролидины, №(№-замещенный глицил)-2-цианпирролидины, №(замещенный глицил)тиазолидины, Ν-Оамещенный глицил)-4-циантиазолидины, аминоацилборпролильные ингибиторы, сконденсированные с циклопропилом пирролидины и гетероциклические соединения.

Ингибиторы дипептидилпептидазы IV описаны в И8 6380398; И8 6011155; И8 6107317; И8 6110949; И8 6124305; И8 6172081; АО 95/15309; АО 99/61431; АО 99/67278; АО 99/67279; ИЕ 19834591; АО 97/40832; ИЕ 19616486 С2; АО 98/19998; АО 00/07617; АО 99/38501; АО 99/46272; АО 99/38501; АО 01/68603; АО 01/40180; АО 01/81337; АО 01/81304; АО 01/55105; АО 02/02560 и АО 02/14271; АО 02/04610; АО 02/051836; АО 02/068420; АО 02/076450; АО 02/083128; АО 02/38541; АО 03/000180; АО 03/000181; АО 03/000250; АО 03/002530; АО 03/002531; АО 03/002553; АО 03/002593; АО 03/004496; АО 03/024942 и АО 03/024965, содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки, прежде всего касательно этих ингибиторов, их определения, применения и получения.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к новым физиологическим субстратам ОС в организме млекопитающих, выбранным из группы, включающей О1и¹-АВт1, О1и¹-АПап, С1п³-Ав(3-40/42) и С1п¹-гастрины (17 и 34), и к применению эффекторов ОС и фармацевтических композиций, содержащих эффекторы ОС, для лечения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности ОС, предпочтительно выбранных из группы, включающей рак двенадцатиперстной кишки, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас!ет ру1оп, колоректальный рак, синдром Золлингера-Эллисона (ульцерогенная аденома поджелудочной железы), семейная британская деменция и семейная датская деменция.

С помощью экспериментов по ингибированию установлено, что человеческая ОС представляет собой металлзависимую трансферазу. Апофермент ОС может проявлять наибольшую реакционную способность в присутствии ионов цинка, и металлсвязывающий мотив цинкзависимых аминопептидаз присутствует также в человеческой ОС. Соединения, которые взаимодействуют с активным сайтом связывания металла, являются эффективными ингибиторами ОС.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что рекомбинантная человеческая ОС, а также активность ОС в экстрактах, выделенных из головного мозга, катализирует циклизацию как Ν-концевого глутаминила, так и глутамата. В этом исследовании убедительно доказано, что для катали

- 3 010108 зируемого циклазой О1и¹-превращения оптимальным является значение рН, близкое к 6,0, а для О1п¹-превращения в рО1и-производные оптимальным является значение рН, близкое к 8,0. Поскольку образование пептидов, родственных ρΟ1ιι-Λβ. можно подавлять путем ингибирования рекомбинантной человеческой ОС и ОС-активности экстрактов, выделенных из гипофиза свиньи, согласно настоящему изобретению фермент ОС является мишенью для разработки лекарственных средств, предназначенных для лечения болезни Альцгеймера.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, предназначенным для парентерального, энтерального или орального введения, которые содержат по меньшей мере один эффектор ОС необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами или которые содержат по меньшей мере один эффектор ОС в сочетании по меньшей мере с одним ингибитором ΌΡ IV необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами.

Настоящее изобретение относится к ингибиторам ОС которые в целом описываются формулой 1, или к их фармацевтически приемлемым солям, включая все стереоизомеры:

где рСр⁶ независимо друг от друга обозначают Н либо разветвленную или неразветвленную алкильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкенильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкинильную цепь, карбоцикл, арил, гетероарил, гетероцикл, азааминокислоту, аминокислоту или ее миметик, пептид или его миметик; все вышеперечисленные остатки необязательно могут быть замещены;

η может обозначать 0-2.

Краткое описание чертежей

Эти и другие аспекты настоящего изобретения проиллюстрированы ниже со ссылкой на чертежи, на которых показано:

фиг. 1 - кривые, характеризующие процесс циклизации Н-О1п-А1а-ОН, катализируемой человеческой ОС которую оценивают по снижению абсорбции при 340 нм. Образцы содержали 0,3 мМ НАДН/Н⁺, 14 мМ α-кетоглутаровую кислоту, 30 ед./мл глутаматдегидрогеназы и 1 мМ Н-О1п-А1а-ОН. На кривых А-Г представлены результаты, полученные с использованием различных концентраций ОС: А, 10 мед (0,001 стандартной единицы)/мл; Б, 5 мед/мл; В, 2,5 мед/мл. На кривой Г представлены результаты, полученные без ОС. Обнаружена линейная зависимость полученной активности от концентрации ОС (вклейка);

фиг. 2 - зависимость от рН активности человеческой ОС и ОС из папайи (вставка), которую определяли в условиях скорости реакции первого порядка с использованием в качестве субстрата Ο1η-βΝΑ. Для человеческой ОС использовали буферную систему, обеспечивающую постоянную ионную силу, предложенную ЕШз и Мотзоп, в состав которой входили 25 мМ МЕ8, 25 мМ уксусная кислота и 50 мМ Трис (ЕШз К. I. и Мотзоп I. Е., Ме1йобз Еп7ушо1. 87, 1982, сс. 405-426). Из-за некоторого ингибирующего действия Трис на фермент ОС из папайи изучали с использованием 50 мМ Морз-буфера. Ионную силу доводили до 0,05М, добавляя ЫаС1. Профили скорости реакции оценивали путем аппроксимации с использованием модели, основанной на концепции диссоциирующих групп. Для ОС из папайи при аппроксимации данных с использованием модели однократной диссоциации установлено, что значение рКа составляло 7,13±0,03;

фиг. 3 - данные о воздействии значений рН на стабильность ОС из латекса папайи и человеческой ОС. Маточный раствор фермента разбавляли в 20 раз 0,1М буфером с различными значениями рН (натрий-цитратый буфер, рН 4-7 и натрий-фосфатный буфер, рН 7-10). Растворы ферментов инкубировали при 30°С в течение 30 мин и затем оценивали ферментативную активность согласно стандартному протоколу;

фиг. 4 - результаты сравнения констант специфичности к_са1/К_М для набора субстратов, содержащих глутамат в положении второй аминокислоты. В то время как при переходе от ди- к трипептидам было обнаружено повышение специфичности человеческой ОС никаких изменений в этом варианте не обнаружено для ОС из папайи. Представленные диаграммы получены на основе параметров, приведенных в табл. 3;

фиг. 5 - данные об образовании рО1и-Ту8(р61и)-Агд-Теи-А1а-ПН₂ из Н-О1п-Ту8(61п)-Агд-Теи-А1аΝΉ₂, катализируемом человеческой ОС. Превращение субстрата оценивали по зависящему от времени изменению в соотношении т/ζ, обусловленному выбросом аммиака. Образец имел следующий состав: 0,5 мМ субстрат, 38 нМ ОС в 40 мМ трис/НС1, рН 7,7. В указанные моменты времени образцы изымали

- 4 010108 из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали массспектрометрическому анализу. Очень близкая зависимость обнаружена и для ^С из папайи;

фиг. 6 - данные об образовании р61и-Рйе-Ьу8-А1а-61и-НН₂ из Н-61п(ММе)-Рйе-Ьу8-А1а-61и-№Н₂, катализируемом ^С из папайи. Превращение субстрата оценивали по зависящему от времени изменению в соотношении т/ζ, обусловленному выбросом метиламина. Образец имел следующий состав: 0,5 мМ субстрат, 0,65 мкМ ОС из папайи в 40 мМ Трис/НС1, рН 7,7. В указанные моменты времени образцы изымали из лабораторной пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу. Никакого превращения субстрата не обнаружено в образцах без ОС из папайи или при добавлении к субстрату вплоть до 1,5 мкМ человеческой ОС (данные не представлены);

фиг. 7 - данные об образовании О1п³-АЗ(3-11)а из О1п³-АЗ(1-11)а, катализируемом ΌΡ IV. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;

фиг. 8 - данные о предупреждении расщепления Ο1η³-Λβ(1-11)η с помощью ингибитора ΌΡ IV Vа1-пирролидида Ха1-Ругг). В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;

фиг. 9 - данные об образовании [рО1и³]Ав(3-11)а из О1п³-Ав(3-11)а, катализируемом ОС. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;

фиг. 10 - данные об ингибировании образования [рО1и³]Ав(3-11)а из О1п³-АЗ(3-11)а с помощью ингибитора ОС 1,10-фенантролина. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;

фиг. 11 - данные об образовании [рО1и³]Ав(3-11)а из О1п³-АЗ(1-11)а после последовательного катализа с помощью ΌΡ IV и ОС. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;

фиг. 12 - данные об ингибировании образования [рО1и³]Ав(3-11)а из О1п³-АЗ(1-11)а с помощью ингибитора ОС 1,10-фенантролина в присутствии каталитически активных ΌΡ IV и ОС. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;

фиг. 13 - данные о снижении образования [рО1и³]Ав(3-11)а из О1п³-АЗ(1-11)а с помощью ингибитора ΌΡ IV Уа1-Ругг в присутствии каталитически активных ΌΡ IV и ОС. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;

фиг. 14 -данные об образовании [рО1и³]Ав(3-11)а из О1п³-АЗ(1-11)а после последовательного катализа аминопепетидазой(ами) и ОС. которые присутствовали в гомогенате гипофиза свиньи. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;

фиг. 15 А и Б - масс-спектры Ав(3-11)а и Ав(3-21)а, инкубированных в присутствии рекомбинантной человеческой фС, которую кипятили в течение 10 мин перед применением. На фиг 15 В и Д представлены масс-спектры Ав(3-11)а и Ав(3-21)а в присутствии активной человеческой ОС, что приводило к образованию [рО1и³]Ав(3-11)а и [рО1и³]Ав(3-21)а соответственно. На фиг. Д и Е представлены массспектры Ав(3-11)а и Ав(3-21)а в присутствии активной ОС и 5 мМ бензимидазола, подавляющего образование [р61и³];

фиг. 16 - скорости реакции катализируемого ОС из папайи превращения Ο1π-βΝΑ в зависимости от концентрации субстрата. Начальные скорости оценивали в 0,1М пирофосфатном буфере, рН 6,1 (квадраты), 0,1М фосфатном буфере, рН 7,5 (кружки) и 0,1М боратном буфере, рН 8,5 (треугольники). Значения кинетических параметров: К_М=1,13±0,07 мМ, к_са1= 1,13±0,04 мин^-1 (рН 6,1); КМ=1,45±0,03 мМ, кса1=0,92±0,01 мин^-1 (рН 7,5); КМ=1,76±0,06 мМ, к_са1=0,56±0,01 мин^-1 (рН 8,5);

фиг. 17 - зависимость от рН превращения О1п-вЫА (кружочки) и Ο1π-βΝΑ (квадраты), которую определяли в условиях скорости реакции первого порядка (8<<К_М). Использовали концентрацию субстрата 0,01 и 0,25 мМ соответственно. Для обоих вариантов использовали трехкомпонентную буферную систему, включающую 0,05М уксусную кислоту, 0,05М пирофосфорную кислоту и 0,05М трицин. Все буферы доводили до одинаковой проводимости путем добавления №1С1 для того, чтобы избежать различий в ионной силе. Данные аппроксимировали с помощью уравнений, позволивших установить для двух диссоциирующих групп значения рК_а 6,91±0,02 и 9,5±0,1 для О1п-вЫА и 4,6±0,1 и 7,55±0,02 для ОШ-вЫА. Значения рКа для аминогрупп соответствующего субстрата, которые определяли титрованием, составили 6,97±0,01 (О1п-вЫА) и 7,57±0,05 (ОЫ-вЫА). Все опыты осуществляли при 30°С;

- 5 010108 фиг. 18 - кривые, характеризующие процесс катализируемой человеческой ОС циклизации Η-ΟΙη-ЛМС (7-амино-4-метилкумарин) в присутствии имидазола, дипиколиновой кислоты и без ингибитора. Гиперболическая форма кривой в присутствии дипиколиновой кислоты свидетельствует об удалении иона металла из активного сайта ОС:

фиг. 19 - зависящая от времени инактивация ОС с помощью гетероциклического хелатора 1,10-фенантролина. После инкубации фермента РС с ингибитором в отсутствии субстрата (сплошная линия) обнаружена пониженная ферментативная активность по сравнению с образцами, которые не подвергали предварительной инкубации с ингибитором (пунктирная линия), что свидетельствует об удалении иона металла из активного сайта РС;

фиг. 20 - реактивация человеческой РС ионами одновалентных и двухвалентных металлов. РС инактивировали добавлением 2 мМ дипиколиновой кислоты в 50 мМ бис-Трис-буфере, рН 6,8. Затем фермент подвергали диализу в противотоке 50 мМ бис-Трис-буфера, рН 6,8, содержащего 1,0 мМ ЭДТК. Для реактивации фермента осуществляли инкубацию инактивированного образца фермента с ионами металлов в концентрации 0,5 мМ в присутствии 0,5 мМ ЭДТК для того, чтобы избежать неспецифической реактивации следами ионов металлов, присутствующих в буферных растворах. В качестве контролей использовали содержащие фермент образцы, которые не инактивировали, но также как и инактивированный фермент подвергали диализу в противотоке раствора ЭДТК (+ЭДТК), и образцы фермента, которые подвергали диализу в противотоке буферных растворов, не содержащих ЭДТК (-ЭДТК);

фиг. 21 - сравнительный анализ последовательностей человеческой РС (ΙιΡΟ) и других представителей семейства М28 металлопептидаз С1ап МН. Сравнительный анализ множества последовательностей осуществляли с помощью программы С1и51а1\У в сй.ЕМВпеЕогд с принимаемыми по умолчанию параметрами. Превращение связанных с ионом цинка остатков обнаружено для человеческой РС (ΙιΡΟ; ОепВапк Х71125), Ζη-зависимой аминопептидазы из 81гер1ошусе5 дгкеш (80Λβ; 8\\к5-Рго1 Р80561) и в Ν-ацетилированном-альфа-связанном кислотном дипептидазном домене ^ААЕАПаке I) (остатки 274-587) человеческой глутаматкарбоксипептидазы II (11ССР II; 8\\355-Рго1 Р04609). Аминокислоты, участвующие в связывании металла, выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. В случае человеческой РС эти остатки, вероятно, являются «двойниками» пептидаз;

фиг. 22 - зависимость от рН ингибирования мышиной РС цистеамином (квадраты), диметилцистеамином (кружки) и меркаптоэтанолом (треугольники). Точки подгоняли к уравнениям, в которых рассматривается одна диссоциирующая группа. Кривые имели различную форму, что свидетельствует о том, что зависимость является результатом изменения в состоянии протонирования ингибитора. Кинетически определенные значения рК_а для цистеамина (8,71±0,07) и диметилцистеамина (8,07±0,03) хорошо соответствовали известным из литературы данным для аминогруппы (8,6 и 7,95 соответственно) (Вш81 О.1. и Ьисак Н.1., 1. Ат. Сйет. 8ос. 79, 1957, с. 6157; Еб§а11 1.Т. ВюрйуДса1 СйетМгу. изд-во Асабепйс Рге§8, йс., Νο\ν Уогк, 1958). Соответственно зависимость от рН ингибирования меркаптоэтанолом характеризуется одинаковым наклоном по всей длине, поскольку у него отсутствует способная к диссоциации группа в исследуемом диапазоне значений рН;

фиг. 23 - график зависимости Ыпе^еауег-Вигк кинетических данных, полученных для превращения О1п-АМС (0,25, 0,125, 0,063, 0,031 мМ), катализируемого человеческой РС в присутствии различных концентраций цистеамина (0, 0,25, 0,5, 1 мМ). Данные аппроксимировали с учетом конкурентного ингибирования. Установленное значение К1 составляло 0,037±0,001 мМ.

- 6 010108

Пептидные последовательности

Упомянутые и применяемые согласно настоящему описанию пептиды имеют следующие последовательности:

Αβ(1-42):

Азр-А1а-С1и-РЬе-Агд-Н18-А8р-8ег-С1у-Туг-С1и-Уа1-Н18-Н15-О1п-Ьу5-Ьеи-Уа1-РйеРке-А1а-С1и-А8р-Уа1-С1у-8ег-А8п-Ьу8-С1у-А1а-11е-Пе-Сг1у-Ьеи-Ме(-Уа1-С1у-С1уУа1-Уа1-11е-А1а

Αβ(1-40):

А8р-А1а-С1и-РЬе-Агд-Н1з-А8р-8ег-<л1у-Туг-О1и-Уа1-Н18-Н18-О1п-Ьу5-Ьеи-Уа!-РЬеРЬе-А1а-С1и-Азр-Уа1-С1у-8ег-Азп-Ьу8-С1у-А1а-11е-11е-С1у-Ьеи-Ме1-Уа1-С1у-О1уУа1-Уа1

Αβ(3-42):

(л1и-РЬе-Аг§-Н18-Азр-8ег-О1у-Туг-С1и-Уа1-Н15-Н15-С1п-Ьу8-Ееи-Уа1-РЬе-Р11е-А1аС1и-А8р-Уа1-С1у-8ег-А8п-Еу8-С1у-А1а-11е-11е-О1у-Ееи-Ме1-Уа1-О1у-О1у-Уа1-Уа111е-А1а

Αβ(3-40):

61и-РЬе-Аге-Н18-А8р-8ег-О1у-Туг-61и-Уа1-Н18-Н15-61п-Еуз-Ееи-Уа1-Р11е-Р11е-А1аО1и-А8р-Уа1-01у-8ег-Азп-Еу8-01у-А1а-11е-11е-С1у-Ееи-Ме(-УаЮ1у-01у-Уа1-Уа1

Αβ(1-11)α:

А8р-А1а-С1и-Рйе-Агд-Н18-А8р-8ег-О1у-Туг-О1и-КН₂

Ар(3-!1)а:

<л1и-РЬе-Агд-Н18-Азр-8ег-О1у-Туг-О1и-МН₂

Αβ(1-21)α:

- 7 010108

А8р-А1а-С1и-РЬе-Агд-Н18-А8р-Зег-О1у-Туг-С}1и-Уа1-Н18-Н15-С1п-Ьу8-Ьеи-Уа1’Р11еРйе-А1а-НН₂

Ар(3-21)а:

О1и-РЬе-Аг§-Н18-Азр-8ег-С1у-Туг-<л1и-Уа1-Н18-Н1з-С1п-Еу8-Ееи-Уа1-РЬе-РЬе-А1аΝΗ₂

Ο1η’-Αβ(3-40):

С1п-РЬе-Агд-Н18-Азр-8ег-С11у-Туг-О1и-Уа1-Н18-Н18-О1п-Еуз-Ееи-Уа1-Р11е-Р11е-А1а61и-А8р-Уа1-О1у-8ег-А8п-Еу8-61у-А1а-11е-11е-С1у-Ееи-Ме1-Уа1-С1у-О1у-Уа1-Уа1

С1п³-АР(3-21)а:

О1п-Рке-Аге-Н18-А8р-8ег-О1у-Туг-О1и-Уа1-Н13-Н18-Сг1п-Ьу8-Ееи-Уа1-РЬе-РЬе-А1аΝΗ₂

О1п³-Ар(1-11)а:

Азр-А1а-СИп-Р11е-Аг§-Н18-Азр-8 ег-61у-Т }τ-Ο1ιι-ΝΗ₂

Ο1η³-Αβ(3-11)а:

О1п-РЬе-Аг§-Н15-Азр-8ег-С1у-Тут-С1и-МН₂

АВп рО!и-А1а-8ег-Азп-Су8-РЬе-А1а-11е-Агд-Н18-Р11е-С1и-А8п-Ьу8-Рке-А1а’Уа1-О1и-Т11ГЕеи-Пе-Суз-Зег-Агд-Тйг-УаЕЕуз-Еуз-Азп-Пе-Пе-СЛи-ОШ-Азп

Οΐυ¹-АВп

О1и-А1а-5ег-А8П-Суз-Р11е-А1а-Пе-Агд-Н13-РЬе-С1и-А8П-Еу8-РЬе-А1а-Уа1-С31и-ТЬгЕеи-11е-Су8-8ег-Аг§-ТЬг-Уа1-Еу8-Еу8-А8П-11е-Пе-С1и-О1и-Азп

АОап рС1и-А1а-Зег-А8п-Суз-Р11е-А1а-11е-Аг8-Н15-РЬе-61и-А8п-Еу8-РЬе-А1а-Уа1-С1и-Т11гЕеи-11е-Су5-Р11е-А8п-Ееи-Р11е-Ееи-А8п-8ег-О1п-(31и-Еу8-Н18-Туг

СИи’-АОап

61и-А1а-8ег-А8п-Су8-РЬе-А1а-Пе-Агд-Н18-Рйе-С1и-А5П-Еуз-Р11е-А1а-Уа1-С1и-1'11гЕеи-Пе-Суз-РЬе-А8п-Еец-Рйе-Ееи-Азп-8ег-61п-С]и-Еу5-Н18-Туг

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к эффекторам глутаминилциклазы (ОС), предназначенным:

а) для лечения болезней у млекопитающих, которые можно лечить путем модуляции активности ^С ίη νίνο, и/или

б) для модуляции физиологических процессов, основанных на действии рС1и-содержащих пептидов, которое обусловлено модуляцией активности ОС.

Кроме того, настоящее изобретение относится к соединениям, предназначенным для ингибирования глутаминилциклазы (ОС, КФ 2.3.2.5) и/или ОС-подобных ферментов в организме млекопитающего и к применению ингибиторов ОС-активности для лечения патологических состояний, связанных с ОС-активностью.

- 8 010108

В настоящем изобретении предложен также новый способ лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна. Ν-концы амилоидных β-пептидов, отложение которых происходит в головном мозге при болезни Альцгеймера и синдроме Дауна, несут пироглутаминовую кислоту. Образование рО1и представляет собой важное событие в развитии и прогрессировании заболевания, так как известно, что модифицированные амилоидные β-пептиды характеризуются повышенной тенденцией к агрегации β-амилоидов и токсичностью, чем, вероятно, обусловлено возникновение и прогрессирование заболевания (Риззо С. и др., 1. Ченгосйет 82, 2002, с. 1480-1489).

В противоположность этому во встречающихся в естественных условиях Αβ-пептидах (3-40/42) в качестве Ν-концевой аминокислоты присутствует глутаминовая кислота. К настоящему времени отсутствуют данные о превращении О1ц в рО1ц. Кроме того, пока не обнаружена спонтанная циклизация О1ц-пептидов с образованием рО1ц-пептидов. Таким образом, одним из объектов настоящего изобретения является выяснение роли ОС в развитии болезни Альцгеймера и синдрома Дауна. Эта задача решается с помощью синтеза Αβ(3-11)ί·ι и Αβ(1-11)η. которые содержат аминокислоту глутамин вместо глутаминовой кислоты в положении 3, определения особенностей этих модифицированных амилоидных β-пептидов в качестве субстратов для ОС ΌΡ IV и подобных ΌΡ IV ферментов и аминопептидаз и применения ингибиторов ОС для предупреждения образования рО1ц из Ν-концевого глутаминильного остатка образованных из амилоида β-пептидов (1-11) и (3-11). Результаты описаны в примере 8. Примененный метод описан в примере 3.

К настоящему времени отсутствуют какие-либо сведения об участии ОС в прогрессировании заболеваний, поскольку Ν-концевой аминокислотой в Αβ (3-40/42 или 11-40/42) является глутаминовая кислота. Однако ОС является единственным известным ферментом, который обладает способностью образовывать рО1ц на Ν-конце пептидов. Другие объекты настоящего изобретения касаются следующих данных и открытий:

а) при добавлении к глутамину ОС катализирует циклизацию глутаминовой кислоты с образованием пироглутаминовой кислоты с очень низкой скоростью,

б) глутаминовая кислота ΑΡΡ или образованные из него амилоидные β-пептиды превращаются в глутамин после трансляции с помощью неизвестной ферментативной активности, а на второй стадии ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида,

в) глутаминовая кислота превращается в глутамин после трансляции с помощью химического катализа или автокатализа, а затем ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида,

г) в гене ΑΡΡ присутствуют мутации, которые кодируют амилоидный β-белок, несущий замену О1ц в положении 3 на О1и. После трансляции и процессинга Ν-конца ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты,

д) глутамин включается в образующуюся пептидную цепь ΑΡΡ вследствие функционального нарушения неизвестной ферментативной активности и поэтому ОС катализирует циклизацию Ν-концевого глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида.

ОС участвует в имеющей решающее значение стадии во всех 5 перечисленных выше случаях, а именно в образовании пироглутаминовой кислоты, которая способствует агрегации амилоидных β-пептидов. Таким образом, ингибирование ОС приводит к предупреждению осаждения бляшкообразующих Αβ (3-40/42) или Αβ (11-40/42), что приводит к возникновению и прогрессированию болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, в не зависимости от механизма, посредством которого происходит циклизация.

Глутамат обнаружен в положениях 3, 11 и 22 амилоидного β-пептида. Среди прочего описана мутация, приводящая к замене глутаминовой кислоты (Е) на глутамин (О) в положении 22 (соответствующая изменению в аминокислотной последовательности амилоидного белка-предшественника ΑΡΡ 693, 8^1ззрго1 Ρ05067), в качестве мутации, приводящей к цереброартериальному амилоидозу датского типа.

Установлено, что β-амилоидные пептиды, несущие остаток пироглутаминовой кислоты в положении 3,11 и/или 22, являются более цитотоксическими и гидрофобными по сравнению с Αβ(1-40/42/43) (8а1йо Т.С., Мей1са1 НуроШезез 54(3), 2000, с. 427-429).

Многочисленные Ν-концевые вариации в различных сайтах можно получать с помощью β-секретазы, фермента, расщепляющего β-сайт амилоидного белка-предшественника (ВАСЕ) (Низе Ι.Τ. и др., I. Βίο1. Сйет. 277 (18), 2002, с. 16278-16284), и/или процессинга с помощью аминопептидазы. Во всех случаях циклизация может происходить согласно описанным выше механизмам а)-д).

Таким образом, к настоящему времени отсутствуют экспериментальные данные, подтверждающие ферментативный путь превращения О1ц¹-пептидов в рО1ц-пептиды с помощью неизвестной глутамилциклазы (ЕС), что соответствует механизму а) (Оагйеи ИЛУ., Μογοζ ТЕ., 01еезои 1.М., Иоуй Ρ.Ό., Ь1 Ь.1., ИиЬакЫи 8.8. и 8\\сей1ег IV., I. Ченгосйет. 72, 1999, с. 676-681; Нозойа И. и др., I. №игора1йо1. Ехр.

- 9 010108

ΝοιιγοΙ. 57, 1998, с. 1089-1095). К настоящему времени не была обнаружена такая ферментативная активность, которая может осуществлять циклизацию О1ц¹-пептидов, протонированных на Ν-конце и несущих отрицательно заряженный остаток С1и'γ-карбоксилата, при слабых щелочных значениях рН.

РС-активность в отношении С1п'-субстратов очень резко снижается при значениях рН ниже 7,0. Установлено, что в противоположность этому О1ц¹-превращение может происходить в кислых реакционных средах (ЪтайиЬо Т. и др., Ат. 1. Ра1йо1. 149, 1996, с. 1823-1830; Викко С. и др., РЕВ8 ЬеИ. 409, 1977, с. 411-416; Викко С. и др., №итоЫо1. Όίκ. 8, 2001, с. 173-180; Текшап Т.Ь. и др., 1. №игора!йо1. Ехр. №ито1. 57, 1998, с. 76-94; Викко С. и др., 1. №игосйет. 82, 2002, с. 1480-1489; Нокойа В. и др., 1. №игора11ю1. Ехр. №иго1. 57, 1998, с. 1089-1095; Оагйеп В.\У. и др., 1. №игосйет., 72, 1999, с. 676-681).

При создании настоящего изобретения изучался вопрос о том, может ли РС распознавать и участвовать в превращении образованных из амилоида-в-пептидов в слабо кислых условиях. Для этой цели синтезировали и исследовали в качестве потенциальных субстратов фермента пептиды О1п³-Ав(1-11)а, Ав(3-11)а, Р1п³-Ав(3-11)а, Ав(3-21)а, О1п³-Ав(3-21)а и Ρ1η³-Αβ(3-40). Эти последовательности были выбраны для имитации встречающихся в естественных условиях укороченных на Ν-конце и на С-конце пептидов О1ц³-Ав и пептидов О1п³-Ав, которые могут присутствовать в результате посттрансляционного амидирования О1ц.

При создании настоящего изобретения было установлено, что РС из папайи и человеческая РС катализируют циклизацию как глутаминила, так и глутамила. По-видимому, первичной физиологической функцией рС является прекращение созревания гормонов в эндокринных клетках посредством циклизации глутамина до или во время процесса секреции гормона. Известно, что такие секреторные пузырьки характеризуются кислым значением рН. Таким образом, побочная активность фермента в узком диапазоне значений рН от 5,0 до 7,0 может представлять собой новую, открытую при создании настоящего изобретения глутамилциклазную активность, которая трансформирует также пептиды О1ц-Ав. Однако из-за существенно меньшей скорости О1ц-циклизации по сравнению с О1п-конверсией вопрос о том, может ли циклизация глутамила играть важную физиологическую роль, является спорным. При этом доказано, что циклизация глутамила участвует в патологии нейродегенеративных заболеваний.

При создании настоящего изобретения при изучении зависимости этой ферментативной реакции от значений рН установлено, что непротонированный Ν-конец играет ключевую роль для циклизации О1п¹-пептидов и, соответственно, значение рК_а субстрата идентично значению рК_а при рС-катализе (см. фиг. 17). Таким образом, РС стабилизирует внутримолекулярное нуклеофильное воздействие непротонированной α-аминогруппы на γ-карбонильный углерод, который приобретает электрофильные свойства в результате амидирования (схема 1).

В отличие от одновалентного заряда, присутствующего в пептидах, несущих Ν-концевой глутамин, Ν-концевой остаток О1ц в содержащих О1ц пептидах в большинстве случаев несет двухвалентных заряд при нейтральных значениях рН. Для глутамата характерно значение рК_а примерно 4,2 и 7,5 для γ-карбоксильного остатка и для α-аминогруппы соответственно. Т.е. при нейтральных и щелочных значениях рН, хотя азот α-аминогруппы является частично или полностью непротонированным и нуклеофильным, γ-карбоксильная группа является непротонированной и поэтому не проявляет никакой электрофильной, характерной для карбонила, активности. Поэтому внутримолекулярная циклизация представляется невозможной.

Однако при значениях рН примерно 5,2-6,5, с учетом соответствующих значений рК_а, обе функциональные группы присутствуют в неионизированной форме в концентрациях примерно 1-10% (-ΝΉ₂) или 10-1% (-СООН) от общей массы Ν-концевого содержащего О1и пептида. В результате при слабо кислых значениях рН присутствуют виды Ν-концевых О1ц-пептидов, в которых обе группы являются незаряженными, и поэтому представляется возможным, что РС может стабилизировать промежуточное звено внутримолекулярной циклизации с образованием рО1ц-пептида. Т.е. если γ-карбоксильная группа является протонированной, то углерод карбонила является достаточно электрофильным, что позволяет осуществлять нуклеофильное воздействие на него непротонированной α-аминогруппы. При таких значениях рН ион гидроксила функционирует в качестве уходящей группы (схема 3). Эти предположения подтверждаются данными о зависимости от рН, полученными для катализируемого РС превращения С1и-(^А (см. пример 11). В отличие от превращения с помощью РС глутамина ^1η-βNΑ, оптимум рН катализа сдвигается в кислотный диапазон значений рН, примерно рН 6,0, т.е. диапазон значений рН, при котором одновременно присутствует значительное количество видов молекул субстрата, которые несут протонированную γ-карбоксильную и непротонированную α-аминогруппу. Кроме того, характеризующее кинетическую реакцию конкретное значение рК_а, составляющее 7,55±0,02, очень хорошо согласуется со значением, установленным для α-аминогруппы С1и4^А с помощью титрования (7,57±0,05).

С физиологической точки зрения при рН 6,0 константа скорости реакции второго порядка (или константа специфичности к_са1/К_м) катализируемой РС циклизации глутамата может быть примерно в 8000 раз ниже, чем константа, характеризующая циклизацию глутамина (фиг. 17). Однако не связанное с ферментом превращение обоих модельных субстратов С1и4^А и ^1η-βNΑ является очень небольшим, что согласуется с данными о незначительном образовании рО1ц-пептида, полученными при создании

- 10 010108 настоящего изобретения. Следовательно, из соотношения констант скорости ферментативной и неферментативной реакций (при сравнении констант скорости реакции второго порядка для ферментативного катализа с соответствующими константами скорости реакции первого порядка для неферментативной циклизации коэффициент каталитической эффективности составляет 10⁹-10¹⁰М^-1 для С1и- и С1и-превращения соответственно) можно заключить, что при образовании рС1и с помощью ^С может быть достигнуто ускорение по меньшей мере в 10⁸ раз. Из этих данных можно сделать вывод о том, что ίη νίνο возможным является только ферментативный путь, приводящий к образованию рС1и.

Поскольку ОС присутствует в больших количествах в головном мозге, а также принимая во внимание высокую скорость превращения, составляющую 0,9 мин^-1, которая в последние годы установлена для созревания 30мкМ (О1п-)ТВН-подобного пептида (Ргока1 Ь., РтокайТайш К., Оиуапд X., К1ш Н.8., \Уи \ν.Μ.. 211апкота А. и Вобог Ν., 1 Меб Сйеш 42, 1999, с. 4563-4571), можно предсказать, что время полужизни соответствующего глутаматного субстрата при его циклизации составляет примерно 100 ч, что совпадает с предложенными в настоящем описании реакционными условиями. Кроме того, принимая во внимание компартментализацию и локализацию в головном мозге ОС/ЕС в пути секреции, ίη νί\Ό в неповрежденных клетках фактические концентрации фермента и субстрата и условия реакции могут оказаться еще более оптимальными для ферментативной циклизации. А также, если Ν-концевой С1и заменяют на С1п, то можно ожидать еще более быстрого образования рС1и, опосредуемого ОС. Ιη νίΙΐΌ обе реакции подавлялись при внесении ингибиторов ОС/ЕС-активности (фиг. 9, 10 и 15).

В целом, при создании настоящего изобретения установлено, что человеческая ОС, которая присутствует в больших количествах в головном мозге, вероятно, катализирует образование амилоидогенных пептидов рС1и-Лв из предшественников Ο1ιι-Λβ и С1п-А3, на долю которых приходится более чем 50% отложений бляшек при болезни Альцгеймера. Эти данные позволили установить, что ОС/ЕС участвуют в образовании старческих бляшек и вследствие этого представляют собой новую мишень для разработки лекарственных средств, предназначенных для лечения болезни Альцгеймера.

Второй вариант осуществления настоящего изобретения касается того, что полученные из амилоида-β пептиды являются субстратом для дипептидилпептидазы IV (ЭР IV) или подобных ЭР IV ферментов, предпочтительно дипептидилпептидазы II (ЭР II). ЭР IV, ЭР II или другие подобные ΌΡ IV ферменты высвобождают дипептид из Ν-конца модифицированного амилоидного β-пептида (1-11), что приводит к образованию амилоидного β-пептида (3-11), у которого в качестве Ν-концевого аминокислотного остатка присутствует глутамин. Эти результаты представлены в примере 8.

Перед расщеплением с помощью ЭР II, ЭР IV или другим подобным ЭР IV ферментом пептидная связь между аспарагиновой кислотой (остаток 1 амилоидного β-пептида) и аланином (остаток 2 амилоидного β-пептида) может быть изомеризована с образованием изоаспартильного остатка, что описано в литературе (Кио Υ.-М., Ешшегйпд М.В., -№ооб§ А.8., Собет К.Э., Койег А.Е., ВВКС 237, 1997, с. 188-191; 81ιίιηίζι.ι Т., -№а1апайе А., Ода^ата М., Моп Н. и 81ига5а\\'а Т., Агсй. Вюсйеш. Вюрйук. 381, 2000, с. 225234).

Эти изоаспартильные остатки придают амилоидному β-пептиду устойчивость к расщеплению аминопептидазой и в результате коровьи бляшки содержат более высокие количества изо-А§р¹-амилоидных β-пептидов, что позволяет предположить наличие пониженного превращения на Ν-конце.

Однако в настоящем изобретении впервые продемонстрировано, что под воздействием дипептидилпептидаз может высвобождаться Ν-концевой дипептид Н-изо-А§р¹-А1а²-ОН, прежде всего в кислотных условиях. Кроме того, при создании изобретения было установлено, что изомеризация может предшествовать также расщеплению β-секретазой и что изомеризация может ускорять протеолитическое расщепление, что приводит к выделению в свободном состоянии Ν-концевой изоаспартильной связи изоА§р¹-амилоидных β-пептидов, которые в свою очередь подвергаются превращению с помощью ЭР II, ЭР IV или подобных ЭР IV ферментов (Мотапб I. и С1агке 8., Вюсйетщйу 26, 1987, с. 7798-7805; Кио Υ.-М. и др., ВВКС 237, 1997, с.188-191). Таким образом, ингибирование образования изоаспартила может приводить к снижению расщепления β-секретазой и в свою очередь к пониженному образованию амилоидных β-пептидов. Кроме того, блокада превращения изо-А§р¹-амилоидного β-пептида путем ингибирования ЭР II, ЭР IV или подобных ЭР IV ферментов должна препятствовать катализируемому ОС/ЕС образованию [рС1и³]Аβ из Ο^^β.

Согласно третьему варианту осуществления настоящего изобретения комбинацию ингибиторов активности ЭР IV и ингибиторов ОС можно применять для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.

Совместное действие ЭР IV и/или подобных ЭР IV ферментов и ОС иллюстрируют следующие факты:

а) ЭР IV и/или подобные ЭР IV ферменты расщепляют Аβ(1-40/42), при этом высвобождается дипептид, содержащий Н-А§р-А1а-ОН и Аβ(3-40/42);

б) побочная реакция катализируемой ОС циклизации глутаминовой кислоты с образованием пироглутаминовой кислоты происходит с очень низкой скоростью,

в) глутаминовая кислота превращается в глутамин на Ν-конце после трансляции с помощью неизвестной ферментативной активности, а затем ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием

- 11 010108 пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида;

г) глутаминовая кислота превращается в глутамин после трансляции с помощью химического катализа или автокатализа, а на второй стадии ^С катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида;

д) в гене АРР присутствуют мутации, которые кодируют амилоидный β-белок, что приводит к замене С1и в положении 3 Αβ на С1и. После трансляции и процессинга Ν-конца ^С катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты;

е) глутамин включается в образующуюся пептидную цепь АРР вследствие функционального нарушения неизвестной ферментативной активности, и поэтому ОС катализирует циклизацию Ν-концевого глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β -пептида.

ОС-активность в отношении Ν-концевого С1п может запускаться также действием различных пептидаз. Аминопептидазы могут удалять последовательно Акр и А1а из Ν-конца Αβ(1-40/42), демаскируя тем самым аминокислоту в положении 3, которая может подвергаться циклизации. Дипептидилпептидазы, такие как ИР I, ИР II, ИР IV, ИР 8, ИР 9 и ИР 10, в одну стадию осуществляют удаление дипептида Акр-А1а. Таким образом, ингибирование аминопептидазной или дипептидилпептидазной активности можно применять для предупреждения образования Αβ(3-40/42).

Совместное действие ингибиторов ИР IV и/или подобных ИР IV ферментов и снижающих активность эффекторов ОС можно проиллюстрировать следующим образом:

а) ингибиторы ИР IV и/или подобных ИР IV ферментов ингибируют превращение Αβ(1-40/42) в Αβ(3-40/42),

б) тем самым предотвращается воздействие на Ν-концевую глутаминовую кислоту и не происходит ее превращение либо ферментативным путем, либо с помощью химического катализа в глутамин, что в дальнейшем приводит к образованию пироглутаминовой кислоты,

в) ингибиторы ОС предупреждают также образование пироглутаминовой кислоты из любых молекул Αβ(3-40/42) с модифицированными остатками и тех модифицированных молекул Αβ(3-40/42), которые образуются в результате мутаций гена АРР.

При создании настоящего изобретения аналогичное совместное действие ИР IV или подобных ИР IV ферментов и ОС было продемонстрировано также для других пептидных гормонов, таких как глюкагон, СС-хемокины и вещество Р.

Глюкагон представляет собой состоящий из 29 аминокислот полипептид, который выделяется из альфа-клеток панкреатических островков, и его функцией является поддержание нормальной глицемии путем стимуляции печеночного гликогенолиза и глюконеогенеза. Несмотря на важность этого вопроса, сохраняются противоположные мнения о механизме, ответственном за клиренс глюкагона в организме. РокрШйк с соавторами изучали ферментативный метаболизм глюкагона с помощью высокочувствительных методов масс-спектрометрии для идентификации продукта на молекулярном уровне. Инкубация глюкагона с очищенной свиной дипептидилпептидазой IV (ЭР IV) приводила к последовательному производству глюкагона 3-29 и глюкагонов (5-29). В человеческой сыворотке расщепление до глюкагона 3-29 сопровождалось быстрой Ν-концевой циклизацией глюкагона, что препятствовало дальнейшему опосредуемому ЭР IV гидролизу. Биологический анализ глюкагона после его инкубации с очищенной ЭР IV или нормальной крысиной сывороткой продемонстрировал значительное снижение гипергликемической активности, в то время как аналогичная инкубация с крысиной сывороткой с дефицитом ЭР IV не приводила ни к какому снижению биологической активности глюкагона. Расщепление, для оценки которого применяли масс-спектрометрию и биологический анализ, блокировали с помощью специфического ингибитора ЭР IV изолейцилтиазолидина. Эти результаты свидетельствуют о том, что ЭР IV представляет собой основной фермент, участвующий в расщеплении и инактивации глюкагона. Эти данные нашли важное применение для определения уровней глюкагона в человеческой плазме (РокрШИк и др., Веди1 Рер1, 12, 96, 2001, с. 133-141).

Хемотаксический белок 2 человеческих моноцитов (МСР)-2 впервые был выделен из стимулированных клеток остеосаркомы в качестве хемокина, производимого вместе с МСР-1 и МСР-3. Vаη Со1Ше с соавторами (Уап Со1Ше Е. и др., Вюсйешщйу 37, 1998, с. 12672-12680) клонировали из библиотеки кДНК, созданной на основе кДНК человеческих яичек, МСР-2 с удлинением на 5'-конце. Она кодировала состоящий из 76 остатков белок МСР-2, но отличалась от известной полученной из костного мозга последовательности кДНК МСР-2 кодоном 46, который кодировал Ьук вместо С1п. Осуществляли анализ биологической активности этого варианта МСР-2Ьу846, полученного в результате полиморфизма одного нуклеотида (8ИР), и МСР-2С1п46. Кодирующие области субклонировали в бактериальном экспрессионном векторе рНЕЮ и после трансформации им ЕксйепсНа сой из периплазмы выделяли два варианта белка МСР-2. С помощью расщепления по Эдману было подтверждено наличие на ИН₂-конце остатка С1п вместо рС1и. тМСР-2С1п46 и гМСР-2Ьу846 и копии с циклическим ИН₂-концом оценивали на клетках моноцитов в опытах по мобилизации кальция и оценке хемотаксиса. Между изоформами тМСР-2С1п46 и гМСР-2Ьу846 не было обнаружено никаких различий в биологической активности. Однако для обоих

- 12 010108 вариантов МСР-2 установлено, что наличие ЫН₂-концевого пироглутамата имело решающее значение для хемотаксиса, но не было важно для мобилизации кальция. Укорочение ЫН₂-конца тМСР-2Ьук46 с помощью сериновой протеазы СО26/дипептидилпептидазы IV (СО26/ОРР IV) приводило к высвобождению ИН₂-концевого дипептида С1и-Рго, в то время как синтетический МСР-2, несущий на ИН₂-конце рС1и, остался неповрежденным. Укороченный с помощью СЭ26/ЭРР IV тМСР-2Ьук46(3-76) оказался практически полностью неактивным как в опытах по оценке хемотаксиса, так и в опытах по оценке передачи сигнала. Эти данные свидетельствуют о том, что ИН₂-концевой рС1и в МСР-2 является не только необходимым для хемотаксической активности, но также защищает белок от расщепления с помощью СЭ26/ЭРР IV ^ап Соййе Е. и др., Вюсйетщйу, 37, 1998, с. 12672-12680).

При создании настоящего изобретения с помощью анализа методом жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС) установлено, что образование Ν-концевого остатка пироглутамата в глюкагоне 3-29 (РокрщШк и др., 2001) и в изоформах МСР-2 ^ап Сойке и др., 1998), катализируется ОС.

Кроме того, с помощью ЖХ/МС доказано, что после катализируемого ЭР IV удаления двух дипептидов Ьук-Рто и Агд-Рго из Ν-конца вещества Р, оставшееся [С1п⁵]вещество Р5-11 трансформируется с помощью ОС с образованием [рС1и⁵] вещества Р5-11.

Ингибиторы ЭР IV описаны в АО 99/61431. В частности, описаны ингибиторы ЭР IV, содержащие аминокислотный остаток и тиазолидиновую или пирролидиновую группу и их соли, прежде всего Ь-треоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-треоизолейцилпирролидин,

Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилпирролидин и их соли.

Дополнительными примерами низкомолекулярных ингибиторов дипептидилпептидазы IV являются такие агенты, как тетрагидроизохинолин-3-карбоксамидные производные, Ν-замещенные 2-цианпиролы и пирролидины, №(№-замещенный глицил)-2-цианпирролидины, №(замещенный глицил)тиазолидины, Ν-Оамещенный глицил)-4-циантиазолидины, аминоацилборпролильные ингибиторы, сконденсированные с циклопропилом пирролидины и гетероциклические соединения. Ингибиторы дипептидилпептидазы IV описаны в И8 6380398; И8 6011155; И8 6107317; И8 6110949; И8 6124305; И8 6172081; АО 95/15309; АО 99/61431; АО 99/67278; АО 99/67279; ΌΕ 198 34 591; АО 97/40832; ΌΕ 19616486 С2; АО 98/19998; АО 00/07617; АО 99/38501; АО 99/46272; АО 99/38501; АО 01/68603; АО 01/40180; АО 01/81337; АО 01/81304; АО 01/55105; АО 02/02560 и АО 02/14271; АО 02/04610; АО 02/051836; АО 02/068420; АО 02/076450; АО 02/083128; АО 02/38541; АО 03/000180; АО 03/000181; АО 03/000250; АО 03/002530; АО 03/002531; АО 03/002553; АО 03/002593; АО 03/004496; АО 03/024942 и АО 03/024965, содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки, прежде всего касательно этих ингибиторов, их определения, применения и получения.

Предпочтительными для применения в сочетании с эффекторами ОС являются такие ингибиторы ЭР IV, как

NVР-^РР728А (1-[[[2-[{5-цианпиридин-2-ил}амино]этил]амино]ацетил]-2-циан-(8)-пирролидин) (фирма №уаг115). описанный у Нидйек и др., Вюсйет1кйу 38, 1999, с. 11597-11603;

ЬАЕ-237 (1-[(3-гидроксиадамант-1-иламино)ацетил]пирролидин-2(8)-карбонитрил), описанный у Нидйек и др., Меейпд о£ 1йе Атепсап Э|аЬе1ек Аккошайоп, 2002, реферат № 272 (фирма №уагбк);

Т8Ь-225 (триптофил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота), описанная у Уатаба и др., Вюотд Меб Сйет Ьей 8 , 11998, с. 537-1540;

2-цианпирролидиды и 4-цианпирролидиды, описанные у Ак^ойй и др., Вюотд Меб Сйет Ьей 6, 1996, с. 1163-1166 и с. 2745-2748;

ΕΕ-999011, описанный у 8ибте и др., Э1аЬе1ек 51, 2002, с. 1461-1469 (фирма Еетпд) и соединения, описанные в АО 01/34594 (фирма СшИотб), при их использовании в дозах, которые указаны в приведенных выше ссылках.

Более предпочтительными ингибиторами ЭР IV, которые можно применять в сочетании с эффекторами ОС, являются дипептидные соединения, в которых аминокислоту предпочтительно выбирают из встречающихся в естественных условиях аминокислот, таких, например, как лейцин, валин, глутамин, глутаминовая кислота, пролин, изолейцин, аспарагины и аспарагиновая кислота. Подобные дипептидам соединения, применяемые согласно изобретению, в концентрации (в пересчете на дипептидные соединения) 10 мкМ снижают активность в плазме дипептидилпептидазы IV или ферментов-аналогов ЭР IV по меньшей мере на 10%, прежде всего по меньшей мере на 40%. Часто ш у1уо требуется также снижение активности по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 70%. Предпочтительные соединения могут обладать также способностью снижать активность максимум на 20 или 30%.

Предпочтительными дипептидными соединениями являются Ν-валилпролил,

О-бензоилгидроксиламин, аланилпирролидин, изолейцилтиазолидин, например,

Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-треоизолейцилпирролидин и их соли, прежде всего фумараты, и Ь-аллоизолейцилпирролидин и его соли.

Особенно предпочтительными соединениями являются глутаминилпирролидин и глутаминилтиазолидин, Н-Акп-пирролидин, Н-Акп-тиазолидин, Н-Акр-пирролидин, Н-Акр-тиазолидин, Н-Л5р(ХНОН)пирролидин, Н-Акр(ХНОН)-тиазолидин, Н-С1и-пирролидин, Н-С1и-тиазолидин, Н-С1и(ХНОН)пирролидин, Н-С1и(ЦНОН)-тиазолидин, Н-Н1к-пирролидин, Н-Н1к-тиазолидин, Н-Рго-пирролидин,

- 13 010108

Н-Рго-тиазолидин, Н-11е-азидидин, Н-11е-пирролидин, Н-Ь-алло-Пе-тиазолидин, Н-Уа1-пирролидин и Н-Уа1-тиазолидин и их фармацевтически приемлемые соли. Эти соединения описаны в \УО 99/61431 и ЕР 1304327.

Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение эффекторов ^С в сочетании с пептидными соединениями, аналогичными субстрату, которые можно использовать для конкурентной модуляции катализа, осуществляемого дипептидилпептидазой IV. Предпочтительными пептидными соединениями являются 2-аминооктановая кислота-Рго-11е, АЬи-Рго-11е, А1Ь-Рго-Пе, Ахе-Рго-Пе, Сйа-Рго-Пе, 11е-Нур-11е, 11е-Рго-алло-11е, 11е-Рго-трет-бутил-61у, Пе-РгоАак Ме-Рго-Пе, Ыуа-Рго-11е, Огп-Рго-11е, Рйе-Рго-Не, Рйд-Рго-Не, Р1р-Рго-11е, 8ег(Вх1)-Рго-11е, 8ег(Р)-Рго-Не, 8ег-Рго-Не, трет-бутил-61у-Рго-П^а1, трет-бутил-61у-Рго-61у, трет-бутил-61у-Рго-11е, трет-бутилШу-Рго-Пе-атке, трет-бутил-61у-Рго-третбутил-61у, трет-бутил-61у-Рго^а1, Тйг-Рго-Не, Тю-Рго-Пе, Тгр-Рго-11е, Туг(Р)-Рго-11е, Туг-Рго-алло-11е, Vа!-Р^ο-алло-I1е, Vа!-Р^ο-трет-бутил-61у, να^το-να! и их фармацевтически приемлемые соли, в которых трет-бутил-С1у обозначает

а 8ег(Вх1) и 8ег(Р) обозначают бензилсерин и фосфорилсерин соответственно. Туг(Р) обозначает фосфорилтирозин. Эти соединения описаны в \УО 03/002593.

Другими предпочтительными ингибиторами ЭР IV, которые можно применять согласно настоящему изобретению в сочетании с эффекторами ^С, являются пептидилкетоны, например гидробромид 2-метилкарбонил-1-Ы-[(Е)-аланил-(Е)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-метилкарбонил-1-Ы-[(Е)-валинил-(Е)-пролил-(Е)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-[(ацетилоксиметил)карбонил]-1-Ы-[(Е)-аланил-(Е)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-[(бензоилоксиметил)карбонил]-1-Ы-[{(Е)-аланил}-(Е)-валинил]-(28)-пирролидина, 2-{[(2,6-дихлорбензил)тиометил]карбонил}-1-Ы-[{(Е)-аланил}-(Е)-валинил]-(28)-пирролидин, гидробромид 2-[бензоилоксиметил)карбонил]-1-Ы-[глицил-(Е)-валинил]-(28)-пирролидина, трифторацетат 2-[([1,3]-тиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-Ы-[{(Е)-аланил}-(Е)-валинил]-(28)-пирролидина, трифторацетат 2-[(бензотиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-№[№{(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)пирролидина, трифторацетат 2-[(-бензотиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-№[{(Е)-аланил}глицил]-(28)-пирролидина, трифторацетат 2-[(пиридин-2-ил)карбонил]-1-М-[М-{(Е)-аланил}-(Е)-валинил]-(28)-пирролидина и другие их фармацевтически приемлемые соли.

Эти соединения описаны в \УО 03/033524.

Кроме того, согласно настоящему изобретению в сочетании с эффекторами ^С можно применять замещенные аминокетоны. Предпочтительными замещенными аминокетонами являются хлорид 1-циклопентил-3 -метил-1 -оксо-2-пентанаминия, хлорид 1-циклопентил-3 -метил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 1-циклопентил-3,3-диметил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 1-циклогексил-3,3-диметил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 3-(циклопентилкарбонил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолиния, хлорид Ы-(2-циклопентил-2-оксоэтил)циклогексанаминия и другие их фармацевтически приемлемые соли.

Ранее считалось, что из редкой группы специфических для пролина протеаз ЭР IV является единственным связанным с мембраной ферментом, специфическим для пролина, представляющего собой предпоследний остаток на аминоконце полипептидной цепи. Однако были выявлены другие молекулы, даже не обладающие структурной гомологией с ЭР IV, но обладающие соответствующей ферментативной активностью. Подобные ЭР Ш-ферменты, которые были выявлены к настоящему времени, представляют собой, например, протеин α, участвующий в активации фибробластов, дипептидилпептидазу белок, подобный дипептидиламинопептидазе, Ν-ацетилированную α-связанную кислотную дипептидазу, пролиндипептидазу покоящихся клеток, дипептидилпептидазу II, аттрактин и белок, родственный дипептидилпептидазе IV (ЭРР 8), ЭРЫ (ЭРХ, ЭР6), ЭРЬ2 и ЭРР 9, которые описаны в обзорных статьях 8ейо и Майк (8ейо и Майк, ВюсЫт Вюрйуз Ас1а, 36506, 2001, с. 1-10) и АЬЬой и 6огге11 (АЬЬой С.А. и 6огге11 Μ.Ό. в: Ес1орерййа§е8, под ред. Ьапдпег и Апзогде, изд-во К1итеег Асайет1с/Р1епит РиЫщйега, №те Уогк, 2002, с. 171-195). В настоящее время описано клонирование и характеристики дипептидилпептидазы 10 (ЭРР 10) Ш 8.У. и др., Вюсйет1са1. 1оигпа1 !ттеЙ1а1е РиЬйсайоп, публикация 28 марта 2003 г., рукопись В120021914).

- 14 010108

Эффекторы в контексте настоящего описания обозначают молекулы, которые связываются с ферментом и понижают или повышают его активность ίη νίΐΓΟ и/или ίη νίνο. Некоторые ферменты несут сайты связывания для небольших молекул, которые влияют на их каталитическую активность; молекулустимулятор называют активатором. Ферменты могут нести даже несколько сайтов, которые распознаются более чем одним активатором или ингибитором. Ферменты могут выявлять концентрации различных молекул и использовать эту информацию для изменения собственной активности.

Эффекторы могут модулировать ферментативную активность, поскольку ферменты могут принимать как активную, так и неактивную конформацию: активаторы являются позитивными эффекторами, ингибиторы являются негативными эффекторами. Эффекторы воздействуют не только на активные сайты ферментов, но также на регуляторные сайты или аллостерические сайты, последнее понятие применяют для того, чтобы подчеркнуть, что регуляторный сайт представляет собой элемент фермента, отличный от каталитического сайта, и для того, чтобы отделить эту форму регуляции от конкуренции между субстратами и ингибиторами на каталитическом сайте (Эагпе11 1., ЬоФзй Н. и ВаШшоге Ό., Мо1еси1аг Се11 В1о1оду, 2-е изд., изд-во 8с1епййс Лшепсап Воокз, Хете Уогк, 1990, с. 63).

Предпочтительными эффекторами, предлагаемыми в настоящем изобретении, являются ингибиторы РС- и ЕС-активности. Наиболее предпочтительными являются конкурентные ингибиторы РС- и ЕС-активности.

В соответствующих случаях предпочтительными являются активаторы РС-и ЕС-активности.

В пептидах, предлагаемых в настоящем изобретении, каждый аминокислотный остаток обозначен однобуквенным или трехбуквенным кодом, который соответствует тривиальному названию аминокислоты, общепринятые обозначения которых представлены ниже:

Аминокислота	Однобуквенный символ	Трехбуквенный символ
Аланин	А	А1а
Аргинин	К	Аг§
Аспарагин	N	Азп
Аспарагиновая кислота	ϋ	Азр
Цистеин	С	Суз
Глутамин	Ω	О1п
Глутаминовая кислота	Е	61и
Глицин	С	Сиу
Г истидин	Н	ΗΪ5
Изолейцин	I	Не
Лейцин	ь	Ьеи
Лизин	к	Ьуз
Метионин	м	Ме1
Фенилаланин	Р	РЬе
Пролин	Р	Рго
Серин	8	Зег
Треонин	Т	ТЬг
Триптофан	Ψ	Тгр
Тирозин	У	Туг
Валин	V	Уа1

Понятие «РС» в контексте настоящего описания обозначает глутаминилциклазу (РС) и РС-подобные ферменты. РС и РС-подобные ферменты имеют идентичную или сходную ферментативную активность, обозначенную далее как РС-активность. Следует отметить, что РС-подобные ферменты могут принципиально отличаться от РС по молекулярной структуре.

Понятие «РС-активность» в контексте настоящего описания обозначает внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (рО1и*) или Ν-концевого Б-гомоглутамина или Ε-β-гомоглутамина с образованием циклического пирогомоглутаминового производного с выделением в свободном состоянии аммиака (см. ниже схемы 1 и 2).

- 15 010108

Схема 1. Циклизация глутамина с помощью ОС

Схема 2. Циклизация Ь-гомоглутамина с помощью ОС

Понятие «ЕС» в контексте настоящего описания обозначает побочную активность ОС и ОС-подобных ферментов, таких как глутаматциклаза (ЕС), которая обозначена далее как ЕС-активность.

Понятие «ЕС-активность» в контексте настоящего описания обозначает внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых глутаматных остатков с образованием пироглутаминовой кислоты (рО1и*) с помощью ОС (см. ниже схему 3).

Понятие «металлзависимый фермент» в контексте настоящего описания обозначает фермент(ы), для которого(ых) требуется наличие связанного иона металла для того, чтобы осуществлять присущую ему(им) каталитическую функцию и/или для которого(ых) требуется наличие связанного иона металла для образования каталитически активной структуры.

Схема 3. Ν-концевая циклизация незаряженных глутамильных пептидов с помощью ОС (ЕС)

Следующим объектом настоящего изобретения является идентификация новых физиологических субстратов ОС. Их идентифицировали, осуществляя эксперименты по циклизации, описанные в примере 5, с использованием пептидов млекопитающих. Предварительно человеческую ОС и ОС из папайи выделяли согласно процессу, описанному в примере 1. Применяемые методы описаны в примере 2, а применяемый пептидный синтез изложен в примере 6. Результаты исследования представлены в табл. 1.

- 16 010108

Таблица 1

Новые физиологические субстраты глутаминилциклазы

Субстрат	Человеческая ОС	ОС из папайи
	км (мкМ)	ксас (с'1)	кса1/Км (мМ'1 с'1)	Км (мкМ)	ксаС (с1)	кса|/^М (мМ’1 с1)
[611?]-гастрин	31 +1	54,1 ±0,6	1745,2 ±36,9	34 ±2	25,8 ±0,5	759+30
[61л1]* нейротензин	37 ±1	48,8 ±0,4	1318,9 ±24,8	40 ±3	35,7 ±0.9	893 ±44
[61п1]-ГРР	87 ±2	69,6 ±0,3	800,0 ±14,9	232 ±9	32,5 ±0,4	140 ±4
[бЫ^-ТКН	90 ±4	82,8 ±1,2	920,0 ±27,6	Н.Д.	н.д.	н.д.
[61η*]-6ηΚΗ	53 ±3	69,2 ±1,1	1305,7 ±53,2	169 ±9	82,5 ±1,9	488,2 ±14,8
[01η3]глюкагон(3-29)			*			*
[61η5]вещество Р(5- 11)			♦			♦

количественное определение проведено с помощью экспериментов методом МАЬБТ-ТОГ.

Все анализы осуществляли в оптимальном диапазоне активности и стабильности либо человеческой, либо растительной ОС что продемонстрировано в примере 4.

Аминокислотные последовательности физиологически активных пептидов, несущих Ν-концевой остаток глутамина, и, следовательно, являющихся субстратами для фермента РС, представлены в табл. 2. Таблица 2

Аминокислотные последовательности физиологически активных пептидов с Ν-концевым остатком глутамина, превращающиеся после трансляции в пироглутаминовую кислоту (рС1и)

Пептид	Аминокислотная последовательность	Функция
гастрин 17 5чЙ58-Рго1: Р01350	рбРЗУЬ ЕЕЕЕЕАУбУ/М ЭР (амид)	Гастрин стимулирует слизистую желудка к производству и секреции соляной кислоты и поджелудочную железу к секреции ее пищеварительных ферментов. Он стимулирует также сокращение гладких мышц и усиливает кровоток и секрецию воды в желудке и тонком кишечнике.
нейротензин 8ху158-Рго(: РЗО99О	6ΕΥΕΝΚΡΚΚΡ ΥΙΙ.	Нейротензин играет эндокринную и паракринную роль в регуляции метаболизма жиров. Он вызывает сокращение гладких мышц.
РРР	рЕР (амид)	Трипептид, родственный тнреотропин-рилизингфактору (ТИН), обнаружен в семенной плазме. В: современных исследованиях ίη уИго и ίη νίνο установлено, что ГРР играет важную роль в регуляции фертильности спермы.

- 17 010108

тан ЗМзв-Ргок Р20396	ζ)ΗΡ (амид)	ТЯН функционирует в качестве регулятора биосинтеза Т8Н в передней доле гипофиза и в качестве нейротрансмиттера/нейром одулятора в центральной и периферической нервной системе.
ОпЯН δινίβδ-Ρι-οί: Р01148	ЦНЗУЗУОЬ КР(<Э) (амид)	Стимулирует секрецию гонадотропинов; стимулирует секрецию как лютеинизирующего, так и фолли кул остимулиру ющег о гормона.
ССЫ6 (малый индуцибельный цитокин А16) 8«Й58-Рго1: 015467	ОРКУРЕТУ УЫТРЗТССЪК УУЕКУЬРККЬ ννΟΥΚΚΑΕΝΟ НЬРАПГУТК ΚΝΚΕνΟΤΝΡΝ ϋΟλννΟΕΥΙΚΟ ΡΝΕΡΙΧΡΤΚΝ ЬЗТУКПТАК ΝΟ0Ρ0ΕΕΝ50	Обладает хемотаксической активностью для лимфоцитов и моноцитов, но не для нейтрофилов. Проявляет также высокую миелосупрессорную активностью, подавляет пролиферацию миелоидных клетокпредшественников. Рекомбинантный 8СУА16 обладает хемотаксической активностью для моноцитов и ТНР-1моноцитов, но не для покоящихся лимфоцитов и нейтрофилов. Индуцирует поток кальция в ТНР-1клетках, которые предварительно десенсибилизированы посредством предыдущей экспрессии ΚΑΝΤΕ8.
ССЬ8 (малый индуцибельный цитокин А8) 8М85-Рго1: Р80075	ΟΡϋδνδΙ ΡΙΤΟΟΓΝνίΝ КК1Р1(2КЬЕ$ ΥΤΚΙΤΝΙΟΙ'Ρ КЕАУ1ГКТКК ОКЕУСАОРКЕ К1¥УКОЗМКНЬ ΟςίΓφΝΕΚΡ	Хемотаксический фактор, привлекающий моноциты, лимфоциты, базофилы и эозинофилы. Может играть роль в неоплазии и воспалительных реакциях хозяина. Этот белок может связывать гепарин.

- 18010108

ССЬ2 (малый индуцибельный цитокин А2) 8\¥153-Рго1: Р135ОО	0ΡΓ7ΑΙΝΑ ΡνΤΟσΥΝΡΤΝ ККБУфКЬАЗ УКК1Т88КСР ΚΕΑνίΡΚΤίν АКЕ1САОРК.С) К\УУ<ГО5МОНЬ ϋΚφΤφΤΡΚΤ	Хемотаксический фактор, привлекающий моноциты и базофилы, но не нейтрофилы или эозинофилы. Повышает противоопухолевую активность моноцитов. Участвует в патогенезе заболеваний, характеризующихся инфильтрацией моноцитов, таких как псориаз, ревматоидный артрит или атеросклероз. Может участвовать в рекрутменте моноцитов в стенке артерий в процессе развития атеросклероза. Связывается с ССК2 и ССК4.
ССЫ8 (малый индуцибельный цитокин А18) δτνίδΒ-Ρτοί: Р55774	фУСТЫКЕБС СЬУУТЗУ/ф1Р φΚΕίνϋΥδΕΤ ЗРфСРКРСУ! ььтккокрю ΑϋΡΝΚΚУ/УфК ΥΙδϋΕΚΕΝΑ	Хемотаксический фактор, привлекающий лимфоциты, но не моноциты или гранулоциты. Может участвовать в В-клеточной миграции в В-клеточные фолликулы в лимфатических узлах. Привлекает нестимулированные Тлимфоциты к дендритным клеткам и активированные макрофаги в лимфатические узлы, обладает хемотаксической активностью для нестимулированных Τ'клеток, СЛ4+- и СО8+-Тклеток и поэтому может играть роль как в гуморальных, так и в клеточно-опосредуемых иммунных ответах.

- 19010108

Фракталкин (нейротактин) 8\¥155-Рго1: Р78423	рННОУТ КСМТСЗКМТ ЗК1РУАШН γρςΝρΑδοοκ КАПЬЕТЖЗН КЬРСАОРКЕЦ ХУУКОАМРНЬО ΚρΑΛΑίΤΕΝΟ ОТГЕКЦЮЕУ КРКТТРАА6С МОЕЗУУЬЕРЕ АТСЕ888ЬЕР ТР83<2ЕА(2КА ЬОТЗРЕЬРТО УТО88ОТЕЬР ΡΤΡΚΑςίϋΟΟΡ УОТЕЬЕКУРР У8ТААТ\¥088 АРН9РСРЗЕУ/ АЕАКТ8ЕАР8 ТрОРЗТрАЗТ Α88ΡΑΡΕΕΝΑ Р8ЕО9КУ\УОр Ο08ΡΚΡΕΝ8Ε ЕКЕЕМОРУРА НТОАЕ0О\УСР 63МАНУ8УУР УЗЗЕОТРЗКЕ РУАЗСЗУ/ТРК ΑΕΕΡΙΗΑΤΜϋ РрКЬОУЫТР νΡϋΑΟΑΑΤΚΚ ОАУОЬЬАРЕО ЬЬЕСЬОУАМЕ ТУРЗЬ(?6СРИ КМАОЕМАЕОЬ ΚΥΙΡΗ8€Ό8Ν ЗУУЬУРУ	Растворимая форма является хемотаксической для Т-клеток и моноцитов, но не для нейтрофилов. Связанная с мембраной форма усиливает адгезию таких лейкоцитов с эндотелиальными клетками. Может играть роль в регуляции процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелии. Связывается с схЗсг1.
ССЬ7 (малый индуцибельный цитокин А7) 8νΪ53-ΡΓ0ΐ: Р80098	РРУОШТ ЗТТССУКРПЧ ККЭРКрНЬЕЗ УЕКТТЗЗНСР КЕАУ1ЕКТКЕ ϋΚΕΙΟΑΟΡΤζ) КЛУУООГМКНЬ ЦККТОТРКЬ	Хемотаксической фактор, привлекающий моноциты и эозинофилы, но не нейтрофилы. Усиливает противоопухолевую активность моноцитов. Индуцирует также высвобождение желатиназы В. Этот белок может связывать гепарин. Связывается с ССЕ1, ССК2 и ССКЗ.
Орексин А (гипокретин-1) 8ш185-Рго1 043612	ОРЬРОССКОК ТСЗСКЬУЕЬЬ ΗΟΑΟΝΗΑΑΟΙ ьть	Нейропептид, который играет важную роль в регуляции всасывания пищи и в нарушении сна, вероятно, из-за координации комплекса поведенческих и физиологических реакций этих комплементарных, связанных с гомеостазом функций. Он играет также существенную роль в связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма, нарушении функции вегетативной нервной системы, нарушении гормонального баланса и нарушении регуляции обшей воды организма. Орексин-А связывается как с ОХ1 К, так и с ОХ2К с высок ой аффинностью.
вещество Р	ЕРК РОРРЕОЬМ (циклизация С1п5 после отщепления остатков 1-4)	Принадлежит к тахикининам. Тахикинины представляют собой активные пептиды, которые возбуждают нейроны, вызывают поведенческие реакции, являются эффективными вазодилататорами и усиливающими секрецию факторами и сокращают (прямо или косвенно) целый ряд гладких мышц.

-20010108

Согласно четвертому варианту осуществления изобретения были идентифицированы в качестве новых физиологических субстратов для ОС пептиды С1п'-гастрин (длиной 17 и 34 аминокислоты), С1п^!-нейротензин и С1п¹-ЕРР. Гастрин, нейротензин и ЕРР несут остаток рС1и в Ν-концевом положении. Установлено, что у всех пептидов этот Ν-концевой остаток рС1и образован из Ν-концевого глутамина в результате ОС-катализа. Вследствие этого указанные пептиды активизируются с точки зрения их биологической функции при превращении Ν-концевого остатка глутамина в рС1и.

Клетки, обладающие способностью к трансдукции через эпителий, прежде всего несущие гастрин (С) клетки, осуществляют координацию секреции желудочной кислоты и поступающей в желудок пищи. В современных исследованиях установлено, что из предшественника гастрина образуются продукты, обладающие несколькими видами активности, и что существует целый ряд важных моментов в биосинтезе гастрина. Участвующие в биосинтезе предшественники и промежуточные продукты (прогастрин и С1у-гастрины), возможно, представляют собой факторы роста; их продукты, амидированные гастрины, регулируют пролиферацию эпителиальных клеток, дифференцировку продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцит-подобных клеток (ЕСЬ-клетки), и экспрессию генов, связанных с синтезом и хранением гистамина в ЕСЬ-клетках, а также острую стимуляцию секреции кислоты. Гастрин стимулирует также производство представителей семейства эпидермального фактора роста (ЕСЕ), которые в свою очередь ингибируют функцию париетальных клеток, но стимулируют рост поверхностных эпителиальных клеток. Концентрации гастрина в плазме у пациентов, зараженных НеНсоЬасЮг ру1оп. у которых, как известно, существует повышенный риск возникновения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и рака желудка, повышены (Эоскгау С.Ь, I. РНукиоЬ 15, 1999, с. 315-324).

Известно, что пептидный гормон гастрин, который выделяется из антральных С-клеток, стимулирует синтез и высвобождение гистамина из ЕСЬ-клеток в кислородпродуцирующую слизистую через ССК-2-рецепторы. Мобилизованный гистамин индуцирует секрецию кислоты в результате связывания с Н(2)-рецепторами, локализованными на париетальных клетках. В современных исследованиях сделано предположение о том, что гастрин, как в виде полностью амидированной, так и в виде менее процессированных форм (прогастрин и удлиненный глицином гастрин), также является фактором роста в желудочно-кишечном тракте. Было установлено, что основное трофическое действие амидированного гастрина связано с кислородпродуцирующей слизистой желудка, где он вызывает повышенную пролиферацию стволовых клеток желудка и ЕСЬ-клеток, что приводит к увеличению массы париетальных и ЕСЬ-клеток. С другой стороны, основной мишенью трофического действия менее процессированного гастрина (например удлиненного глицином гастрина), вероятно, является слизистая оболочка ободочной кишки (Ко1 Т.Ь и С1еп, Ό., Иещ.11. Рер1. 93, 2000, с. 337-344).

Согласно пятому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение повышающих активность эффекторов ОС для стимуляции пролиферации клеток желудочно-кишечного тракта, прежде всего пролиферации слизистых клеток желудка, пролиферации эпителиальных клеток, дифференцировки продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцит-подобных клеток (ЕСЬ) и экспрессии генов, связанных с синтезом и хранением гистамина в ЕСЬ-клетках, а также для стимуляции острой секреции кислоты у млекопитающих путем поддерживания или повышения концентрации активного |рС1и'| гастрина.

Согласно шестому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение понижающих активность эффекторов ОС для лечения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и рака желудка, связанного или не связанного с Не1юЬас1ет ру1ог1, и синдрома Золлингера-Эллисона у млекопитающих путем снижения скорости превращения неактивного С1п-гастрина в активный [рС1и¹]гастрин.

Нейротензин (НТ) представляет собой нейропептид, участвующий в патофизиологии шизофрении, который специфически модулирует системы нейротрасмиттеров (нейромедиаторов), регуляция которых, как продемонстрировано ранее, нарушается при этом заболевании. Клинические исследования, при которых определяли концентрации НТ в спиномозговой жидкости (СМЖ), позволили выявить группу страдающих шизофренией пациентов с пониженными концентрациями НТ в СМЖ, которые восстанавливались при эффективном лечении с помощью антипсихотических лекарственных средств. Известны также данные, которые подтверждают роль НТ-систем в механизме действия антипсихотических лекарственных средств. Поведенческие и биохимические реакции при введении НТ в центральную нервную систему очень сходны с реакциями на системное введение антипсихотических лекарственных средств, и антипсихотические лекарственные средства повышают нейротрансмиссию НТ. Совокупность этих данных привела к гипотезе о том, что НТ функционирует в качестве эндогенного антипсихотического агента. Кроме того, обычные и атипичные антипсихотические лекарственные средства по-разному изменяют нейротрансмиссию НТ в области черного тела и в мезолимбических допаминсодержащих конечных областях, и эти эффекты обусловливают способность вызывать побочные действия и эффективность соответственно (Втбет Е.В. и др., Вю1 РкусЫаЦу, 50, 2001, с. 856-872).

Согласно седьмому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение повышающих активность эффекторов ОС для приготовления антипсихотических лекарственных средств и/или для лечения шизофрении у млекопитающих. Эффекторы ОС либо поддерживают, либо повышают

- 21 010108 концентрацию активного [рС1и¹]нейротензина.

Стимулирующий оплодотворение пептид (ЕРР), трипептид, родственный тиреотропин-рилизингфактору (ТЕН), обнаружен в семенной плазме. Современные исследования ш νίΙΐΌ и ш у1уо позволили установить, что ЕРР играет важную роль в регуляции фертильности спермы. В частности, ЕРР прежде всего стимулирует «включение» неспособных к оплодотворению (неактивных) сперматозоидов и существенно быстрее делает их фертильными, а затем поддерживают эту способность посредством того, что сперматозоиды не подвергаются спонтанной потере акросомы и вследствие этого не теряют способность к оплодотворению. Аденозин, который, как известно, регулирует путь трансдукции сигнала аденилилциклазы (АС)/цАМФ, приводит к аналогичным реакциям и фактически усиливает их. Установлено, что и ЕРР, и аденозин стимулируют производство цАМФ в неактивных клетках, но ингибируют его в активных клетках, причем ЕРР-рецепторы каким-то образом взаимодействуют с аденозиновыми рецепторами и С-протеинами для осуществления регуляции АС. Эти события влияют на состояние фосфорилирования тирозина различных белков, некоторые из которых важны для начального «включения», другие, вероятно, участвуют в самой реакции акросомы. Кальцитонин и ангиотензин II, также обнаруженные в семенной плазме, оказывают аналогичные действия ш ν 11го на неактивные сперматозоиды и могут усиливать реакции на ЕРР. Эти молекулы оказывают аналогичные действия ш νίνΌ, оказывая влияние на фертильность путем стимуляции и затем поддержания способности к оплодотворению. Любое уменьшение доступности ЕРР, аденозина, кальцитонина и ангиотензина II или дефекты в их рецепторах приводят к развитию мужского бесплодия (Егакег Ь.Е. и Айеоуа-Оыдиуа 8.А., УПаш Ногт 63, 2001, с. 1-28).

Согласно восьмому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение понижающих активность эффекторов ОС для приготовления препятствующих оплодотворению лекарственных средств и/или для снижения фертильности у млекопитающих. Понижающие активность эффекторы ОС снижают концентрацию активного [рС1и¹]ЕРР, что приводит к предупреждению способности к оплодотворению спермы и к дезактивации сперматозоидов. В противоположность этому установлено, что повышающие активность эффекторы ОС могут стимулировать фертильность особей мужского пола и их можно применять для лечения бесплодия.

Согласно девятому варианту осуществления настоящего изобретения были идентифицированы дополнительные физиологические субстраты ОС. Они представляют собой С1п¹-ССЬ2, О1п¹-ССЬ7, О1п¹-ССЬ8, С1п¹-ССЬ16, О1п¹-ССЬ18 и О1п¹-фракталкин (более подробные характеристики приведены в табл. 2). Эти полипептиды играют важную роль в таких патофизиологических состояниях, как подавление пролиферации миелодных клеток-предшественников, неоплазии, воспалительных реакций хозяина, рака, псориаза, ревматоидного артрита, атеросклероза, гуморальных и клеточно-опосредуемых иммунных ответов, процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, а также воспалительных процессов, связанных с болезнью Альцгеймера, СБД и СДД.

В настоящее время в клинических опытах изучено несколько цитотоксических вакцин на основе Т-лимфоцитарных пептидов против гепатита В, вируса иммунодефицита человека и меланомы. Одной из перспективных вакцин против меланомы, которую применяют индивидуально или в сочетании с другими опухолевыми антигенами, является декапептид ЕЬА. Этот пептид является аналогом иммунодоминантного пептида антигена Ме1ап-А/МАВТ-1, который несет Ν-концевую глутаминовую кислоту. Известно, что аминогруппа и гамма-карбоксильная группа глутаминовых кислот, а также аминогруппа и гамма-карбоксамидная группа глутаминов легко конденсируются с образованием пироглутаминовых производных. Для решения указанных проблем, связанных со стабильностью, было разработано несколько пептидов, представляющих интерес с фармацевтической точки зрения, которые содержали пироглутаминовую кислоту вместо Ν-концевого глутамина или глутаминовой кислоты без потери фармакологических свойств. Однако по сравнению с ЕЬА у производного пироглутаминовой кислоты (РутЕЬА), а также Ν-концевого кэппированного ацетилом производного (АсЕЬА) не удалось сохранить цитотоксическую активность, присущую Т-лимфоцитами (СТЬ). Несмотря на то, что в РутЕЬА и АсЕЬА были внесены кажущиеся очень небольшими модификации, эти два производных, вероятно, обладают более низкой аффинностью по сравнению с ЕЬА к специфическому классу I главного комплекса гистосовместимости. Следовательно, для того чтобы полностью сохранить активность ЕЬА, следует избегать образования РутЕЬА (Веск А. и др., I. Рер!. Еек. 57, 2001, с. 528-538.). В последние годы установлено, что при меланомах происходит также сверхэкспрессия глутаминилциклазы (РС) (Еокк Ό.Τ. и др., №11 Сепе! 24, 2000, с. 227-235).

Согласно десятому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение эффекторов ОС для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патофизиологических состояний, например, для подавления пролиферации миелоидных клеток-предшественников, неоплазии, воспалительных реакций хозяина, рака, злокачественного метастаза, меланомы, псориаза, ревматоидного артрита, атеросклероза, нарушенных гуморальных и клеточно-опосредуемых иммунных ответов, процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, а также воспалительных процессов, связанных с болезнью Альцгеймера, СБД и СДД.

Согласно одиннадцатому вариант осуществления настоящего изобретения был идентифицирован С1п'-орексин А в качестве физиологического субстрата РС. Орексин А представляет собой нейропептид,

- 22 010108 который играет важную роль в регуляции всасывания пищи и нарушении сна, вероятно, в результате координации комплекса поведенческих и физиологических реакций этих комплементарных связанных с гомеостазом функций. Он играет также существенную роль в связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма, функции вегетативной нервной системы, гормональном балансе и регуляции общей воды организма.

Согласно двенадцатому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение эффекторов ОС для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения нарушенного всасывания пищи и сна, нарушенной связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма, нарушенной функции вегетативной нервной системы, нарушенного гормонального баланса и нарушенной регуляции общей воды организма.

Экспансия полиглутамина в некоторые белки приводит к возникновению нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Кеннеди. Их механизм пока остается неясным. Биохимические свойства полиглутаминовых повторов позволяют дать одно из возможных объяснений: эндолитическое расщепление связи глутаминил-глутаминил с последующим образованием пироглутамата может принимать участие в патогенезе в результате повышения катаболитической стабильности, гидрофобности, амилоидогенеза и нейротоксичности полиглутаминильных белков (8а1бо Т., Меб. НуроЛекек, 54(3), март 2000, с. 427-429).

Таким образом, согласно тринадцатому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение эффекторов ОС для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения болезни Паркинсона и болезни Гентингтона.

Согласно четырнадцатому варианту осуществления настоящего изобретения предложен общий путь снижения или ингибирования ферментативной активности ОС. Предложены также репрезентативные ингибиторы.

Первоначально в качестве ингибиторов ОС млекопитающих были описаны только

1.10- фенантролин и восстановленный 6-метилптерин (ВикЬу ν.Η.Ι., и др., I. Вю1. СЬет. 262, 1987, с. 8532-8536). ЭДТК не ингибирует ОС, из чего было сделано заключение, что ОС не представляет собой металлзависимый фермент (ВикЬу ν.Η.Ι, и др., I. Вю1. СЬет. 262, 1987, с. 8532-8536; Ва!етап К.С.1., и др., ВюсЬетМгу 40, 2001, с. 11246-11250; ВооЛ К.Е. и др., ВМС Вю1оду 2, 2004). Однако при создании настоящего изобретения установлено, что человеческая ОС и другие ОС животного происхождения являются металлзависимыми ферментами, что доказано по характеристиками ингибирования ОС

1.10- фенантролином, дипиколиновой кислотой, 8-гидроксихинолином и другими хелаторами (фиг. 18, 19) и по реактивации ОС ионами переходных металлов (фиг. 20). И, наконец, зависимость от металлов обнаруживается при сравнении с последовательностями других зависимых от металлов ферментов, что свидетельствует о превращении хелатирующих аминокислотных остатков также и в человеческой ОС (фиг. 21). Взаимодействие соединений с ионом металла, связанным с активным сайтом, представляет собой общий путь ингибирования ОС-активности.

При создании настоящего изобретения установлено, что имидазольные производные являются эффективными ингибиторами ОС. С помощью непрерывного анализа (подробно описанного в примере 2), проанализирован целый ряд имидазольных производных в плане их способности ингибировать человеческую ОС в качестве представителя высококонсервантивных ОС млекопитающих.

Таким образом, в настоящем изобретении предложены имидазольные производные, а также гистидин и его производные в качестве понижающих активность эффекторов ОС и описаны их характеристики с точки зрения типа ингибирования и эффективности. Структуры и значения К₁ представлены в табл. 3 и 4. Результаты подробно описаны в примере 7.

- 23 010108

Таблица 3

Константы ингибирования имидазольных производных в катализируемой человеческой ОС реакции. Опыты проводили при 30°С в 0,05М Трис-НС1-буфере, рН 8,0, содержащем 5 мМ ЭДТК
Соединение Структуры ядра	Значение К; (мМ) Структура
имидазол	0,103 ±0,004
бензимидазол	0,138 ±0,005
Α-7-производпые
1 -бензи лим идазол	0,0071 ± 0,0003
1 -метилимидазол	0,030 ± 0,001
1 -винилимидазол	0,049 ± 0,002
диимидазолидид щавелевой кислоты	0,078 ± 0,002
29-ацетилимидазол	0,107 ±0,003
АГ-(триметилсилил)имидазол	0,167 ±0,007
¥-бензоилимидазол	0,174 ±0,007
1-(2-оксо-2- фенилэтил)имидазол	0,184 ±0,005
1 -(З-аминопропил)имидазол	0,41± 0,01
1 -фени лим идазол	ингибирование отсутствует
1,1 '-сульфонилдиимидазол	ингибирование отсутствует
С-4(5)-производные
У-омега-ацетиягистамин	0,017 ±0,001
Ь-гистидинамид	0,56 ± 0,04
Н-Н18-Тгр-ОН	0,60 ± 0,03
Ь-гистидинол	1,53 ±0,12
Ь-гистидин	4,4 ± 0,2
4-имидазолкарбоксальдегид	7,6 ± 0,7
метиловый эфир имидазол- 4-карбоновой кислоты	14,5 ± 0,6
Ь-гистамин	0,85 ± 0,04

С-4,5-производные

5-гидроксиметил-4-метилимидазол амид 4-аминоимидазол-5карбоновой кислоты

4.5- дифенилимидазол

4.5- дицианимидазол

С-2-производные

2-метилбензилимидазол

2-этил-4-метилимидазол

2-аминобензимидазол

2-хлор-1 Н-бензим идазол

0,129 ±0,005

15,5 ± 0,5 ингибирование отсутствует ингибирование отсутствует

0,165 ± 0,004

0,58 ± 0,04

1,8 ± 0,1 ингибирование отсутствует

Прочие

3-(1Н-имидазол-1-ил)-1-(3- 0,0025 ± 0,0001 метилбензо [Ъ]тиофен-2ил)пропан-1-он

- 24 010108

4-[(1-метил-1Н-имидазол-5- 0,0067± 0,0003 ил)метил]-3пропилдигидрофуран-2(ЗН)-он

4-[2-( 1 Н-имидазол-1 ил)этокси]бензойная кислота

0,0034 ± 0,0001

3-(3-(1 Н-имидазол-1 ил)пропил]-2тиоксоимидазолидин-4-он

0,00081 ±0,00001

-нитро-2- [2-([ {3 -(1Нимидазол-1ил)пропил}амино] карбонил)фенил]фурамид

0,0066 ± 0,0004

Лй(4-х лорфени л)-АГ- [2-( 1Нимидазол-1- 0,00165 ± 0,00007 ил)этил]тиомочевина метиловый эфир 2-[(5имидазол-1- 0,0322 ± 0,0007 илметилпирролидин-2карбонил)амино]пропионов ой кислоты метиловый эфир 2-[(5- н.д имидазол-1 -и лметил-2,3 дигидро-1Н-пиррол-2карбонил)амино]пропионов ой кислоты

имидазо<1.5а>пиридин 0,0356 ± 0,0005 метил-(25)-2-{ [(25)-2- 0,164 ±0,004 амино-5 -(1 Н-имидазол-1 иламино)-5оксопентаноил]амино} -3 метилбутаноат

- 25 010108

Таблица 4

Ингибирование РС Ь-гистамином и его двумя биологическими метаболитами (также называемыми телеметилгистаминами)

Соединение	Значение К, (мМ)	Структура
Ь-гистамин	0,85 ± 0,04	-ΝΗ
3-метил-4-(/7аминоэтил)имидазол	0,120 ±0,004
1 -метил-4-(/Ь	ингибирование
аминоэтил)имидазол	отсутствует
		н/г

Согласно пятнадцатому варианту осуществления изобретения предложены новые ингибиторы РС и РС-подобных ферментов, на основе цистеамина.

Помимо имидазольных производных и гидроксаматов в качестве ингибиторов металлзависимых ферментов часто упоминают тиольные реагенты (ЬоМйег ^.Т. и Маййе^к, В.\У.. Сйет. Веу. 102, 2002, с. 4581-4607; ЫрксотЬ ^.Ν. и §!га!ег Ν., Сйет. Веу. 96, 1996, с. 2375-2433). Тиольные пептиды описаны также в качестве ингибиторов родственной РС аминопептидазы С1ап МН (Нипйпроп К.М., Вюсйепййгу 38, 1998, с. 15587-15596). Хотя эти ингибиторы являются неактивными в отношении РС млекопитающих, можно предположить, что выделенные цистеаминные производные будут представлять собой эффективные конкурентные ингибиторы РС (фиг. 23).

Настоящее изобретение относится к ингибиторам РС, которые в целом описываются формулой 1, или их фармацевтически приемлемым солям, включая все стереоизомеры:

где В^!-В⁶ независимо друг от друга обозначают Н или разветвленную или неразветвленную алкильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкенильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкинильную цепь, карбоцикл, арил, гетероарил, гетероцикл, азааминокислоту, аминокислоту или ее миметик, пептид или его миметик; все вышеперечисленные остатки необязательно могут быть замещены;

п может обозначать 0, 1, 2, предпочтительно 1, наиболее предпочтительно 2.

В контексте настоящего описания и в формуле изобретения понятие «алкил» может обозначать С1-С₅₀алкильную группу, предпочтительно С1-С₃₀алкильную группу, прежде всего С₁-С₁₂- или С1-С8алкильную группу; например, алкильная группа может обозначать метильную, этильную, пропильную, изопропильную или бутильную группу.

Понятие «алк», например в понятии «алкокси», и понятие «алкан», например в понятии «алканоил», имеют значения, указанные для «алкила»; ароматические («арильные») соединения обозначают предпочтительно замещенные или необязательно незамещенные фенильную, бензильную, нафтильную, бифенильную или антраценовую группы, которые предпочтительно содержат по меньшей мере 8 атомов С; понятие «алкенил» может обозначать С₂-С₃₀алкенильную группу, предпочтительно С₂-С₆алкенильную группу, которая имеет двойную(ые) связь(и) в любом требуемом положении и может быть замещенной или незамещенной; понятие «алкинил» может обозначать С₂-С1₀алкинильную группу, предпочтительно С2-С6алкинильную группу, которая имеет тройную(ые) связь(и) в любом требуемом положении и может быть замещенной или незамещенной; понятие «замещенный» или «заместитель» может обозначать любое требуемое замещение одной или несколькими, предпочтительно одной или двумя алкильными, алкенильными, алкинильными, одно- или мультивалентными ацильными, алканоильными, алкоксиалканоильными или алкоксиалкильными группами; вышеуказанные заместители в свою очередь могут нести одну или несколько (но предпочтительно не нести вообще) алкильных, алкенильных, алкинильных, од

- 26 010108 но- или мультивалентных ацильных, алканоильных, алкоксиалканоильных или алкоксиалкильных групп в качестве боковых групп.

В контексте настоящего описания и в формуле изобретения понятие «ацил» может означать С1-С₂оацильный фрагмент, предпочтительно С1-С₈ацильный фрагмент и особенно предпочтительно С1-С₄ацильный фрагмент; и «карбоцикл» может обозначать С₃-С₁₂карбоциклический фрагмент, предпочтительно С₄-, С₅-или Сбкарбоциклический фрагмент. «Гетероарил» имеет значения, указанные для арила, в котором 1-4 и более предпочтительно 1, 2 или 3 кольцевых атома заменены гетероатомами типа Ν, 8 или О. «Гетероцикл» имеет значения, указанные для циклоалкила, в котором 1, 2 или 3 кольцевых атома заменены гетероатомами типа Ν, 8 или О.

Понятие «пептидные миметики» само по себе является известным специалисту в данной области. Предпочтительно оно относится к соединениям, которые имеют вторичную структуру типа пептида и необязательно дополнительные структурные характеристики; их механизм действия в основном аналогичен или идентичен механизму действия нативного пептида; однако их активность (например, в качестве антагониста или ингибитора) может быть изменена по сравнению с нативным пептидом, прежде всего относительно рецепторов или ферментов. Кроме того, они могут имитировать действие нативного пептида (агонист). Примерами пептидных миметиков являются миметики-носители, непептидные миметики, пептоиды, нуклеиновые кислоты пептида, олигопирролиноны, винилогпептиды и олигокарбаматы. Определение таких пептидных миметиков см. в Ьех1коп бег Сйеш1е, изд-во 8рек1гнт Лкабспщейсг Усг1ад. Не1бе1Ьегд, Вегйп, 1999.

Понятие «азааминокислота» обозначает аминокислоту, в которой хиральная α-СН-группа заменена атомом азота, в то время как «азапептид» обозначает пептид, в котором хиральная α-СН-группа одного или нескольких аминокислотных остатков в пептидной цепи заменена атомом азота.

Роль тиольной и аминогруппы можно понять путем сравнения ингибирующей активности диметилцистеамина, цистеамина, меркаптоэтанола, этилендиамина, этаноламина, данные о которой представлены в табл. 5. Только соединения, несущие амино- и тиольную группу, обладали эффективностью, удаление или модификация любой из групп приводила к снижению ингибирующей активности.

Кроме того, зависимость от рН ингибирования мышиной ОС цистеамином, диметилцистеамином и меркаптоэтанолом характеризуется различиями, которые свидетельствуют о том, что статус протонирования ингибитора влияет на связывание ингибитора с активным сайтом (фиг. 22).

Таблица 5

Сравнение эффективности соединений-производных цистеамина, в отношении ингибирования ОС («н.и.» обозначает, что ингибирование не обнаружено в концентрации 5 мМ, рН 8,0, 30°С и концентрации субстрата в образце, составляющей 1 К_м

Соединение	Значение К, (мМ)	Структура
Цистеамин	0,043±0,002	нз.	^νη2
Диметилцистеамин	0,0190±0,0002	Н8. .	1
Д иэти лцистеам ин	0,0109±0,0004	НЗ----'
Меркаптоэтанол	3,91 ±0,08	Н5.	^он
Этилмеркаптан	н.д.
Этиленднамин	Н.И.	Η2Ν. -
Этаноламин	н.и.	Н<Х .	Д1Н2

н.д. обозначает «не делали».

При создании изобретения в процессе изучения ферментативной активности неожиданно было установлено, что помимо Ν-концевого глутаминильного остатка, Ν-концевые β-гомоглутаминильные остатки удовлетворяют характеристикам в качестве субстратов ОС из растений и млекопитающих, Ν-концевой β-гомоглутаминильный остаток превращался в 5-членное лактамовое кольцо посредством

- 27 010108 реакции, катализируемой человеческой ОС и ОС из папайи соответственно. Результаты описаны в примере 5. Применяемый метод проиллюстрирован в примере 2, а пептидный синтез осуществляли согласно методу, описанному в примере 6.

Еще один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способам скрининга эффекторов ОС.

Предпочтительный способ скрининга для идентификации модифицирующих активность эффекторов ОС из группы соединений, предусматривает стадии, которые заключаются в том, что:

а) приводят в контакт соединения с ОС в условиях, которые позволяют осуществлять их связывание;

б) добавляют субстрат ОС;

в) оценивают превращение субстрата или необязательно определяют остаточную ОС-активность;

г) количественно оценивают изменения в превращении субстрата и/или ферментативной активности ОС для идентификации модифицирующего активность эффектора.

Другой предпочтительный способ скрининга аналогичен методу идентификации и отбора эффекторов, которые взаимодействуют непосредственно или опосредованно с ионом металла, связанным с активным сайтом ОС, и он предусматривает стадии, которые заключаются в том, что:

а) приводят в контакт соединения с ОС в условиях, которые позволяют осуществлять их связывание;

б) добавляют субстрат 00 который подвергается превращению с помощью ОС;

в) оценивают превращение субстрата или необязательно определяют остаточную ОС-активность; и

г) количественно оценивают изменения в превращении субстрата и/или ферментативной активности ОС, где изменения можно использовать для идентификации модифицирующего активность эффектора.

Предпочтительными для применения в вышеуказанных методах скрининга являются ОС млекопитающих или ОС из папайи. Особенно предпочтительной является ОС млекопитающих, так как эффекторы, идентифицированные с помощью указанных способов скрининга, можно использовать для лечения болезней млекопитающих, прежде всего человека.

Эти агенты, отобранные с помощью описанных выше способов скрининга, могут осуществлять снижение превращения по меньшей мере одного из субстратов ОС (негативные эффекторы, ингибиторы) или путем увеличения превращения по меньшей мере одного субстрата ОС (позитивные эффекторы, активаторы).

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть превращены в кислотноаддитивные соли, прежде всего фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли.

Соли соединений, предлагаемых в изобретении, могут находиться в форме неорганических или органических солей.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно превращать и применять в форме кислотно-аддитивных солей, прежде всего в форме фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей. Фармацевтически приемлемая соль, как правило, находится в форме, в которой основная боковая цепь протонирована неорганической или органической кислотой. Репрезентативными органическими или неорганическими кислотами являются соляная, бромисто-водородная, перхлорная, серная, азотная, фосфорная, уксусная, пропионовая, гликолевая, молочная, янтарная, малеиновая, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, бензойная, миндальная, метансульфоновая, гидроксиэтансульфоновая, бензолсульфоновая, щавелевая, памоновая, 2-нафталинсульфоновая, паратолуолсульфоновая, циклогексансульфамовая, салициловая, сахариновая или трифторуксусная кислоты. Подразумевается, что все формы соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, в виде кислотно-аддитивных солей подпадают под объем настоящего изобретения.

Учитывая близкое сходство соединений в свободной форме и соединений в форме соли, следует иметь в виду, что когда в настоящем описании упоминается соединение, то при этом подразумевается соответствующая его соль, при условии, что существует возможность ее получения и применения в определенных условиях.

Если соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют по меньшей мере один хиральный центр, то они могут существовать в виде энантиомеров. Если соединения имеют два или более хиральных центра, то они могут, кроме того, существовать в виде диастереоизомеров. Следует иметь в виду, что все такие изомеры и их смеси подпадают под объем настоящего изобретения. Кроме того, некоторые кристаллические формы соединений могут существовать в полиморфной форме, и такие соединения подпадают под объем настоящего изобретения. Кроме того, некоторые соединения могут образовывать сольваты с водой (т.е. гидраты) или с обычными органическими растворителями, и подразумевается, что такие сольваты также подпадают под объем настоящего изобретения.

Соединения, включая их соли, можно получать также в форме гидратов или в форме, содержащей другие растворители, применяемые для их кристаллизации.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу предупреждения или лечения состояния, опосредуемого модуляцией активности фермента ОС у индивидуума, нуждающегося в этом, который заключается в том, что вводят любое из соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, или содержащих их фармацевтических композиций в количестве и согласно схеме приема лекарственного средства, которая обеспечивает терапевтическую эффективность для лечения состояния. Кро

- 28 010108 ме того, под объем настоящего изобретения подпадает применение соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, и их соответствующих фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей для приготовления лекарственного средства, предназначенного для предупреждения или лечения состояния у индивидуума, опосредуемого модуляцией активности ОС. Соединение можно вводить пациенту с помощью любого стандартного пути введения, включая (но не ограничиваясь ими) внутривенное, оральное, подкожное, внутримышечное, внутрикожное, парентеральное введение и их комбинации.

Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения являются фармацевтические композиции, представляющие собой лекарственные средства, которые содержат по меньшей мере одно соединение, предлагаемое в изобретение, или его соль необязательно в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или растворителями.

Фармацевтические композиции могут иметь, например, форму препаратов для парентерального или энтерального введения и содержать соответствующие носители, или могут иметь форму препаратов для орального введения, которые могут содержать соответствующие носители, пригодные для орального введения. Предпочтительно они находятся в форме препаратов для орального введения.

Эффекторы ОС-активности, вводимые согласно изобретению, можно применять в составе фармацевтических препаратов или комплексов препаратов в качестве ингибиторов ОС- и ЕС-активности, предпочтительно конкурентных ингибиторов, или в сочетании с ингибиторами ферментов, конкурентными ингибиторами ферментов, субстратами, псевдосубстратами, ингибиторами экспрессии ОС, связывающимися белками или антителами к таким белковым ферментам, которые снижают концентрацию белка ОС в организме млекопитающих. Соединения, предлагаемые в изобретении, позволяют регулировать лечение применительно к конкретным пациентам и заболеваниям, в частности при их использовании можно избегать индивидуальной непереносимости, аллергии и побочных действий.

Соединения обладают также различной зависимостью активности от времени. Таким образом, у врача, осуществляющего лечение, имеется возможность различного подхода к индивидуальному состоянию пациента: он может точно регулировать, с одной стороны, быстроту начала действия и, с другой стороны, продолжительность действия и прежде всего интенсивность действия.

Предпочтительный способ лечения, предлагаемый в изобретении, представляет собой новый подход к лечению или предупреждению состояния, опосредуемого модуляцией активности фермента ОС у млекопитающих. Его преимущество заключается в том, что он является простым, пригодным для коммерческого применения и удобным для применения, прежде всего при лечении заболеваний, которые обусловлены нарушением баланса концентрации физиологически активных субстратов ОС, например перечисленных в табл. 1 и 2, при лечении млекопитающих, прежде всего при лечении человека.

Соединения предпочтительно можно вводить, например, в форме фармацевтических препаратов, которые содержат действующее вещество в сочетании с общепринятыми добавками, такими как разбавители, эксципиенты и/или носители, известные в данной области техники. Их можно вводить, например, парентерально (например, ί.ν. в физиологическом растворе) или энтерально (например, орально в виде композиции со стандартными носителями).

В зависимости от их эндогенной стабильности и биологической доступности можно вводить одну или несколько доз соединений в день для достижения требуемой нормализации уровней глюкозы в крови. Такие дозы для человека могут составлять, например, примерно от 0,01 до 250,0 мг в день, предпочтительно примерно от 0,01 до 100 мг соединения на 1 кг веса тела.

Путем введения млекопитающим эффекторов ОС-активности можно предупреждать или облегчать или лечить такие состояния, как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, семейная британская деменция (СБД), семейная датская деменция (СДД), язвенная болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением ^^Ьа^ег ру1оп, колоректальный рак, синдром Золлингера-Эллисона, патогенные психические состояния, шизофрения, бесплодие, неоплазия, воспалительные реакции хозяина, рак, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушенный сон, нарушенная связанная с гомеостазом регуляция энергетического метаболизма, нарушенная функция вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенная регуляция общей воды организма.

Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов ОС-активности можно стимулировать пролиферацию клеток желудочно-кишечного тракта, предпочтительно пролиферацию слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острую секрецию кислоты и дифференцировку продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцит-подобных клеток.

Кроме того, введение млекопитающему ингибиторов ОС может приводить к потере функции сперматозоидов, подавляя тем самым мужскую фертильность. Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ регуляции и контроля мужской фертильности и применение понижающих ОСактивность эффекторов для приготовления контрацептивных лекарственных средств для особей мужского пола.

Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов ОС-активности можно подавлять пролиферацию миелоидных клеток-предшественников.

- 29 010108

Соединения, применяемые согласно изобретению, можно включать хорошо известным методом в состав стандартных композиций, таких, например, как таблетки, капсулы, драже, пилюли, суппозитории, гранулы, аэрозоли, сиропы, жидкие, твердые и кремообразные эмульсии и суспензии и растворы, с использованием инертных нетоксичных фармацевтически приемлемых носителей и добавок или растворителей. В каждой из таких композиций обладающие терапевтической эффективностью соединения предпочтительно присутствуют в концентрации примерно от 0,1 до 80 мас.%, более предпочтительно от 1 до 50 мас.% в пересчете на общую массу смеси, т.е. в количествах, достаточных для обеспечения требуемого диапазона доз.

Субстанции можно применять в качестве лекарственных средств в форме драже, капсул, содержащих две таблетки капсул, жевательных капсул, таблеток, капель, сиропов или также в виде суппозиториев или в виде назальных спреев.

Композиции можно предпочтительно приготавливать, например, путем разбавления действующего вещества растворителями и/или носителями необязательно с применением эмульгаторов и/или диспергирующих агентов, например, в том случае, когда в качестве разбавителя используют воду, необязательно можно применять в качестве вспомогательных растворителей органические растворители.

Примерами эксципиентов, которые можно применять согласно настоящему изобретению, являются вода, нетоксичные органические растворители, такие как парафины (например, фракции нефтепродуктов);

растительные масла (например, рапсовое масло, арахисовое масло, кунжутное масло);

спирты (например, этиловый спирт, глицерин);

гликоли (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль);

твердые носители, такие, например, как природные измельченные в порошок минералы (например, высокодисперсный диоксид кремния, силикаты);

сахара (например, сахар-сырец, лактоза и декстроза);

эмульгаторы, такие как неионные и анионные эмульгаторы (например, эфиры полиоксиэтилена и жирной кислоты, простые эфиры полиоксиэтилена и жирного спирта, алкилсульфонаты и арилсульфонаты);

диспергирующие агенты (например, лигнин, сульфитный щелок, метилцеллюлоза, крахмал и поливинилпирролидон) и замасливатели (например, стеарат магния, тальк, стеариновая кислота и лаурилсульфат натрия) и необязательно корригенты.

Введение можно осуществлять стандартным методом, предпочтительно энтерально или парентерально, прежде всего орально. При энтеральном введении таблетки могут содержать в дополнение к указанным носителям дополнительные добавки, такие как цитрат натрия, карбонат кальция и фосфат кальция, наряду с различными добавками, такими как крахмал, предпочтительно картофельный крахмал, желатин и т.п. Кроме того, дополнительно в процессе таблетирования можно применять замасливатели, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. В случае водных суспензий и/или элексиров, предназначенных для орального введения, можно добавлять к действующим веществам, помимо вышеуказанных эксципиентов, различные корригенты или красители.

В случае парентерального введения можно применять растворы действующих веществ с использованием пригодных жидких носителей. Было установлено, что, как правило, в случае внутривенного введения предпочтительно вводить количества, составляющие примерно от 0,01 до 2,0 мг/кг, предпочтительно примерно от 0,01 до 1,0 мг/кг веса тела в день, а в случае энтерального введения доза составляет примерно от 0,01 до 2 мг/кг, предпочтительно примерно от 0,01 до 1 мг/кг веса тела в день.

Тем не менее, в некоторых случаях необходимо отступать от указанных количеств в зависимости от веса тела экспериментального животного или пациента или от пути введения, а также в зависимости от вида животного и его индивидуальной реакции на лекарственное средство или от интервала, с которым осуществляют введение. Следовательно, в определенных случаях может оказаться достаточным приме нять дозы, меньшие, чем указанные выше минимальные количества, в то время как в других случаях указанный верхний предел может быть превышен. В случаях, когда требуется вводить относительно большие количества, может оказаться целесообразным разделять эти количества на несколько однократных доз, вводимых в один день. Для применения для лечения человека можно использовать тот же самый диапазон доз. Вышеуказанные комментарии применимы также и в этом случае.

Примеры фармацевтических композиций

1. Капсулы, содержащие по 100 мг соединения, предлагаемого в изобретении, на капсулу.

Для получения примерно 10000 капсул приготавливают раствор, имеющий следующий состав:

Соединение, предлагаемое в изобретении 1,0 кг

Глицерин

Полиэтиленгликоль Вода Всего

0,5 кг

3,0 кг

0,5 кг

5,0 кг

- 30 010108

Раствор вносят в мягкие желатиновые капсулы хорошо известным методом. Капсулы можно при менять путем разжевывания или проглатывания.

2. Таблетки или таблетки с покрытием или драже, содержащие по 100 мг соединения, предлагаемого в изобретении.

Для приготовления 100000 таблеток используют следующее количество ингредиентов:

Соединение, предлагаемое в изобретении, тонкоизмельченное 10,0 кг

Глюкоза 4,35 кг

Лактоза 4,35 кг

Крахмал 4,50 кг

Целлюлоза, тонкоизмельченная 4,50 кг

Указанные выше компоненты смешивают и затем добавляют раствор, содержащий:

Поливинилприрролидон	2,0 кг
Полисорбат	0,1 кг
и воду	примерно 5,0 кг

и гранулируют хорошо известным методом путем пропускания влажной массы через решетчатую мельницу, после чего добавляют 0,2 кг стеарата магния и сушат. Конечную смесь для таблеток массой 30,0 кг подвергают обработке с получением выпуклых таблеток массой 300 мг. В идеальном случае на таблетки можно наносить покрытие или сахарное покрытие хорошо известным методом.

Целесообразно, чтобы фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, содержали комбинацию по меньшей мере одного эффектора ОС-активности и по меньшей мере одного ингибитора ЭР IV. Такие фармацевтические композиции можно применять для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.

Пример 1. Получение человеческой ОС и ОС из папайи.

Штаммы-хозяева и среды.

Штамм РюЫа ракЮпк Х33 (АОХ1, АОХ2), который применяли для экспрессии человеческой ОС, выращивали, трансформировали и анализировали согласно инструкциям производителя (фирма Ыуйгодеп). Среды, необходимые для Р. раккопк, т.е. забуференную глицерином (ВМОУ) сложную среду или метанольную (ВММУ) сложную среду и базальную (минимальную) солевую среду для ферментации готовили согласно рекомендациям производителя.

Молекулярное клонирование плазмидных векторов, кодирующих человеческую ОС.

Все процедуры клонирования осуществляли с помощью стандартных методов молекулярной биологии. Для экспрессии в дрожжах использовали вектор рРIСΖаВ (фирма Iην^ΐ^одеη). Вектор рОЕ-31 (фирма О1адеп) применяли для экспрессии человеческой ОС в Е. сой. кДНК зрелой ОС, начинающуюся с кодона 38, сливали в рамке считывания с плазмидой, кодирующей метку 6хН1к. После амплификации с использованием праймеров рОСус-1 и рОСус-2 и субклонирования фрагмент встраивали в экспрессионный вектор, используя сайты рестрикции 8рЫ и НшбШ.

Трансформация Р. ракЮпк и экспрессия в небольших объемах (маломасштабная экспрессия).

Плазмидную ДНК амплифицировали в штамме Е. сой 1М109 и очищали согласно рекомендациям производителя (фирма О1адеп). В применяемой для экспрессии плазмиде рРIСΖαВ существуют 3 сайта рестрикции, пригодные для линеаризации. Поскольку ЗаЫ и ВкΐXI осуществляют расщепление внутри кДНК ОС, для линеаризации был выбран сайт РтеТ 20-30 мкг плазмидной ДНК линеаризовали с помощью Ртек осаждали этанолом и растворяли в стерильной деионизированной воде. Затем 10 мкг ДНК использовали для трансформации компетентных клеток Р. раккопк путем электропорации согласно инструкциям производителя (фирма ВюВаб). Отбор осуществляли на планшетах, содержащих 150 мкг/мл зеоцина. Одна трансформация с использованием линеаризованной плазмиды позволяла получать несколько сотен трансформантов.

Для тестирования рекомбинантных клонов дрожжей в отношении экспрессии ОС рекомбинанты выращивали в течение 24 ч в 10-миллилитровых конических пробирках, содержащих 2 мл среды ВМСУ. Затем дрожжи центрифугировали и ресуспендировали в 2 мл среды ВММУ, содержащей 0,5% метанола. Эту концентрацию поддерживали, добавляя метанол каждые 24 ч в течение вплоть до 72 ч. Затем определяли ОС-активность в супернатанте. Присутствие слитого белка подтверждали с помощью Вестернблоттинга, используя антитело к 6хН1к-метке (фирма О1адеп). Клоны, проявляющие наиболее высокую ОС-активность, отбирали для дополнительных экспериментов и ферментации.

Крупномасштабная экспрессия в ферментере.

Экспрессию ОС осуществляли в 5-литровом реакторе (модель Вюккак В, фирма В. Вгаип Ьюкесй), практически в соответствии с руководством «РюЫа Гегтепкайоп ргосекк дшбейпек» (фирма й1уЦгодеп). В целом, метод состоял в следующем: клетки выращивали в базальной солевой среде для ферментации, дополненной следовыми количествами солей и глицерином в качестве единственного источника углеро

- 31 010108 да (рН 5,5). В процессе фазы начальной загрузки, продолжительностью примерно 24 ч, и последующей фазы с периодической подпиткой, продолжительностью примерно 5 ч, проходило накопление клеточной массы. После достижения массы клеток во влажном состоянии 200 г/л осуществляли индукцию экспрессии ОС, применяя трехстадийную метанольную подпитку, так чтобы полное время ферментации составляло примерно 60 ч. Затем клетки удаляли из содержащего ОС супернатанта путем центрифугирования при 6000хд, 4°С, в течение 15 мин. Значение рН доводили до 6,8, добавляя ΝηΟΗ, и образовавшийся мутный раствор центрифугировали при 37000хд, 4°С в течение 40 мин. Если раствор оставался мутным, применяли дополнительную стадию фильтрации через целлюлозную мембрану (размер пор 0,45 мкм).

Очистка меченной с помощью 6 остатков гистидина (6хН1з) ОС, экспрессированной в Ρ. Ρазΐο^^з.

Меченную с помощью Н1з ОС сначала очищали с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованном металле (ИМАХ). Для осуществления общепринятой очистки 1000 мл супернатанта культуры вносили на содержащую Νί²⁺ хелатирующую сефарозную ЕЕ колонку (1,6х20 см, фирма Ρйа^тас^а), которую уравновешивали 50 мМ фосфатным буфером, рН 6,8, содержащим 750 мМ №С1, со скоростью потока 5 мл/мин. После промывки колонки уравновешивающим буфером, взятом в объеме, равном 10 объемам колонки, и уравновешивающим буфером, содержащим 5 мМ гистидин, взятом в объеме, равном 5 объемам колонки, связанный белок элюировали путем замены на 50 мМ фосфатный буфер, рН 6,8, содержащий 150 мМ №101 и 100 мМ гистидин. Полученный элюат подвергали диализу в противотоке 20 мМ бис-Трис/НС1-буфера, рН 6,8, при 4°С в течение ночи. Затем ОС дополнительно очищали с помощью анионообменной хроматографии на колонке типа Мопо 06 (фирма ВюЯай), уравновешенной буфером для диализа. Содержащую ОС фракцию вносили на колонку при скорости потока 4 мл/мин. Затем колонку промывали уравновешивающим буфером, содержащим 100 мМ №С1. Элюцию осуществляли с использованием двух градиентов с применением уравновешивающего буфера, который содержал 240 мМ и 360 мМ №С1, взятого в объеме, равном 30 или 5 объемом колонки соответственно. Собирали фракции объемом 6 мл и чистоту анализировали с помощью ДСН-ПААГ. Фракции, содержащие гомогенную ОС, объединяли и концентрировали с помощью ультрафильтрации. Для длительного хранения (-20°С) добавляли глицерин до конечной концентрации 50%. Проводили количественную оценку белка методами Бредфорда или Гилла и Гиппеля (ВгайТогй М.М., Α^1. ВюсНет. 72, 1976, с. 248-254; 6111 8.С. и уоп Н1рре1 ΡΉ., Α^Ε Вюсйет. 182, 1989, с. 319-326.).

Экспрессия и очистка ОС в Е. со11.

Конструкцией, кодирующей ОС, трансформировали клетки линии М15 (фирма О1адеп) и выращивали на планшетах в селективной агаровой ЬВ-среде при 37°С. Для экспрессии белка при комнатной температуре использовали ЬВ-среду, содержащую 1% глюкозы и 1% этанола. Когда значение оптической плотности (ОП₆₀₀) культуры достигало примерно 0,8, экспрессию индуцировали в течение ночи с помощью 0,1 мМ ИПТГ (изопропилтиогалактозид). После одного цикла замораживания и оттаивания клетки лизировали при 4°С, добавляли 2,5 мг/мл лизоцима в 50 мМ фосфатном буфере, рН 8,0, содержащем 300 мМ №1С1 и 2 мМ гистидин, в течение примерно 30 мин. Раствор осветляли путем центрифугирования при 37000хд, 4°С в течение 30 мин с последующей фильтрацией с использованием стеклянной фритты (отделение ДНК) и двух дополнительных стадий фильтрации с использованием целлюлозных фильтров для неочищенных и тонких осадков. Супернатант (примерно 500 мл) вносили на №²⁺-колонку для аффинной хроматографии (1,6х20 см) со скоростью потока 1 мл/мин. Элюцию ОС осуществляли с помощью 50 мМ фосфатного буфера, содержащего 150 мМ №10’1 и 100 мМ гистидин. Содержащую ОС фракцию концентрировали ультрафильтрацией.

Очистка ОС из латекса папайи.

ОС из латекса папайи получали, используя систему ВюСЛЭ 700Е (фирма Еегзерруе Вюзуз1етз, Висбаден, Германия) с помощью модифицированной версии ранее описанного метода (2егйоиш 8. и др., ВюсЫт Вюрйуз Ααη 138, 1989, с. 275-290). 50 г латекса растворяли в воде и центрифугировали согласно описанному методу. Для инактивации протеаз применяли 8-метилметантиосульфонат и полученный неочищенный экстракт подвергали диализу. После диализа весь супернатант вносили на колонку (21х2,5 см внутренний диаметр (ί.ά.)) из 8Ρ-сефарозы, которую можно применять при высокой скорости потока (Еаз! Е1оте, ЕЕ), уравновешенную 100 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 5,0 (скорость потока 3 мл/мин). Элюцию осуществляли в три стадии, повышая концентрацию натрий-ацетатного буфера, при скорости потока 2 мл/мин. На первой стадии использовали линейный градиент от 0,1 до 0,5М ацетатного буфера, взятого в объеме, равном 0,5 объема колонки. На второй стадии использовали линейное повышение концентрации буфера от 0,5 до 0,68М в 4 объемах колонки. Во время последней стадии элюции использовали 0,85М буфер в 1 объеме колонки. Объединяли фракции (6 мл) с наиболее высокой ферментативной активностью. При ультрафильтрации осуществляли замену концентрации и буфера на 0,02М Трис/НС1, рН 8,0 (фирма Лт^сοη; мембрана с пределом пропускания молекулярной массы 10 кДа).

Добавляли сульфат аммония к концентрированному ферменту из папайи, полученному после стадии ионообменной хроматографии, до получения конечной концентрации 2М. Этот раствор вносили на Еаз! Е1о^-колонку (21х2,5 см ί.ά.), заполненную бутилсефарозой 4 (скорость потока 1,3 мл/мин), уравновешенную 2М сульфатом аммония, 0,02М Трис/НС1, рН 8,0. Элюцию осуществляли в три стадии пони

- 32 010108 жающимися концентрациями сульфата аммония. На первой стадии использовали линейный градиент от 2 до 0,6М сульфата аммония, 0,02М Трис/НС1, рН 8,0 в объеме, равном 0,5 объема колонки, при скорости потока 1,3 мл/мин. На второй стадии использовали линейный градиент от 0,6 до 0М сульфата аммония, 0,02М Трис/НС1, рН 8,0 в объеме, равном 5 объемам колонки, при скорости потока 1,5 мл/мин. Последнюю стадию элюции осуществляли, используя 0,02М Трис/НС1, рН 8,0, в объеме, равном 2 объемам колонки, при скорости потока 1,5 мл/мин. Все содержащие ОС-активность фракции объединяли и концентрировали ультрафильтрацией. Полученную гомогенную ОС хранили при -70°С. Конечные концентрации белка определяли методом Брэдфорда, осуществляя сравнение со стандартными кривыми, полученными для бычьего сывороточного альбумина.

Пример 2. Анализы глутаминилциклазной активности.

Флуорометрические анализы.

Все измерения осуществляли с использованием ридера для биологических анализов (ВюАккау Веабег) типа НТ8-7000Р1ик для микропланшетов (фирма Регкт Е1тег) при 30°С. Активность ОС оценивали флуорометрически с использованием в качестве субстрата Н-С1η-βNΑ. Образцы содержали 0,2 мМ флуорогенный субстрат, 0,25 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма Иш/уте, Хорсгольм, Дания) в 0,2М Трис/НС1, рН 8,0, содержащем 20 мМ ЭДТК, и аликвоту соответствующим образом разбавленной ОС в конечном объеме 250 мкл. Длины волны возбуждения/испускания составляли 320/410 нм. Предназначенные для анализа реакции инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность ОС определяли из стандартной кривой для β-нафтиламина в условиях анализа. За единицу принимали количество образовавшего в результате катализа ОС 1 мкмоля рС1и-βNΑ из Н-С1η-βNΑ в 1 мин в указанных условиях.

Во втором флуорометрическом анализе активность ОС определяли, используя в качестве субстрата Н-С1п-АМС. Реакции осуществляли при 30°С с помощью ридера типа ΝΟΥΟδΙηΓ для микропланшетов (фирма ВМС 1аЫес11по1ощек). Образцы содержали различные концентрации флуорогенного субстрата, 0,1 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма О1адеп) в 0,05М Трис/НС1, рН 8,0, содержащем 5 мМ ЭДТК, и аликвоту соответствующим образом разбавленной ОС в конечном объеме 250 мкл. Длины волны возбуждения/испускания составляли 380/460 нм. Предназначенные для анализа реакции инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность ОС определяли из стандартной кривой для 7-амино-4-метилкумарина в условиях анализа. Результаты кинетических анализов обрабатывали с помощью программы СгаЕй.

Спектрофотометический анализ ОС.

Этот новый анализ применяли для оценки кинетических параметров большинства субстратов ОС. Активность ОС анализировали спектрофотометрически с помощью непрерывного анализа, разработанного посредством адаптации ранее описанного дискретного анализа (Ва1етап В. С.1, I. №игокс1 МеЛобк 30, 1989, с. 23-28), основанного на использовании глутаматдегидрогеназы в качестве вспомогательного фермента. Образцы содержали соответствующий субстрат ОС, 0,3 мМ НАД-Н, 14 мМ α-кетоглутаровую кислоту и 30 ед./мл глутаматдегидрогеназы в конечном объеме 250 мкл. Реакции инициировали, добавляя ОС и оценивали по снижению абсорбции при 340 нм в течение 8-15 мин. Типичные зависимости образования продукта от времени представлены на фиг. 1.

Оценивали начальные скорости и ферментативную активность определяли из стандартных кривых для аммиака в условиях анализа. Все образцы оценивали при 30°С с использованием ридера для микропланшетов либо типа 8РЕСТВАЕ1иог Р1ик, либо типа 8иппке (оба фирмы ТЕСАН). Данные кинетических анализов обрабатывали с помощью программы СгаЕб.

Анализ ингибирования.

При анализе ингибирования состав образца соответствовал описанному выше, за исключением того, что в него добавляли предполагаемый ингибитор. Для быстрой оценки ингибирования ОС использовали образцы, содержащие 4 мМ соответствующий ингибитор и субстрат в концентрации, соответствующей 1 К_М. Для более детального исследования ингибирования и определения значений К₁ оценивали влияние ингибитора на вспомогательные ферменты. В каждом случае не было выявлено никакого влияния на любые другие применяемые ферменты, что позволяет достоверно оценивать ингибирование ОС. Константу ингибирования определяли путем аппроксимации набора характеризующих процесс кривых с помощью общего уравнения для конкурентного ингибирования с использованием программы СгаЕб.

Пример 3. Масс-спектрометрия типа МАЬОкТОЕ.

Масс-спектрометрию на основе определения времени пролета с использованием опосредуемой матрицей лазерной десорбции/ионизации осуществляли с помощью системы НеМеб-Раскагб С2025 ЬО-ТОЕ с линейным анализатором времени пролета. Прибор был снабжен лазером на азоте, работающим при 337 нм, потенциальным источником ускорения (5 КВ) и трубой для измерения пролета длиной 1,0 м. Детектор был установлен для работы в моде с положительно заряженными ионами и сигналы регистрировали и осуществляли их фильтрацию с помощью цифрового запоминающего осциллоскопа типа ЬеСгоу 9350М, соединенного с персональным компьютером. Образцы (5 мкл) смешивали с равными объемами раствора матрицы. В качестве матрицы применяли раствор ДГАФ/ВКАЦ, полученный путем растворения 30 мг 2',6'-дигидроксиацетофенона (фирма А1бпс11) и 44 мг вторичного кислого цитрата ам

- 33 010108 мония (фирма Е1ика) в 1 мл смеси ацетонитрил/0,1% ТФК в воде (1:1, об./об.). Небольшой объем (»1 мкл) матричной аналитической смеси вносили в верхний конец зонда и сразу же испаряли в вакуумной камере (оборудование для анализа образцов типа Неу1е!!-Раскагй С2024А) для гарантии быстрой и гомогенной кристаллизации образца.

Для продолжительной оценки С1и¹-циклизации пептиды, полученные из Ав, инкубировали в 100 мкл 0,1М натрий-ацетатного буфера, рН 5,2 или 0,1М бис-Трис-буфера, рН 6,5 при 30°С. Пептиды вносили в концентрации 0,5 мМ Ав(3-11)а или 0,15 мМ Ав(3-21)а и 0,2 ед. РС вносили в течение всех 24 ч. В случае Ав(3-21)а образцы для анализа содержали 1% ДМСО. В различные моменты времени образцы удаляли из аналитической пробирки, пептиды экстрагировали с помощью 21рТ1рк (фирма М1Шроге) согласно рекомендациям производителя, смешивали с раствором матрицы (1:1 об./об.) и после этого определяли масс-спектры. Отрицательный контроль либо не содержал РС совсем, либо содержал дезактивированный тепловой обработкой фермент. Состав образца при исследовании ингибиторов соответствовал описанному выше, за исключением того, что в него вносили ингибитор (5 мМ бензимидазол или 2 мМ 1,10-фенантролин).

Пример 4. Зависимость от рН.

Зависимость от рН катализа человеческой РС и РС из папайи изучали в условиях скорости реакции первого порядка, что отражает воздействие концентрации протонов на константу специфичности кса!/КМ. Для этой цели применяли парный ферментативный анализ, основанный на использовании пироглутамиламинопептидазы в качестве вспомогательного фермента и С1η-βNΑ в качестве субстрата. Известно, что пироглутамиламинопептидаза является активной и стабильной при рН 5,5-8,5 (Ткиги Ό. и др., I. Вюсйет. (Токио), 84, 1978, с. 467-476). Следовательно, анализ позволяет оценивать катализ с помощью РС в этом диапазоне значений рН. Полученные профили скоростей аппроксимировали с помощью классических колоколообразных кривых, как проиллюстрировано на фиг. 2. Человеческая РС характеризуется зависимостью от рН в очень узком диапазоне с оптимумом примерно при рН 7,8-8,0. Скорости имеют тенденцию к снижению при более щелочных значениях рН. В противоположность этому профиль скоростей, полученных для РС из папайи, свидетельствует об отсутствии снижения активности вплоть до рН 8,5 (фиг. 2, вставка). Однако оптимальным для проявления специфичности обоих ферментов является рН 8. При создании изобретения неожиданно было установлено, что анализ кривых свидетельствует об идентичных значениях рК_а в кислотном диапазоне значений рН 7,17±0,02 и 7,15±0,02 для человеческой РС и РС из папайи соответственно.

Очевидно, что снижение активности человеческой РС при основных значениях рН, по-видимому, является результатом диссоциации группы, что характеризуется значением рК_а примерно 8,5. Для РС из папайи не были получены в достаточном объеме данные при основных значениях рН, которые могли бы позволить достоверно определить второе значение рК_а. Это подтверждается подгонкой данных к модели однократной диссоциации, дающей практически идентичное значение рК_а (рК_а 7,13±0,03), при сравнении с подгонкой данных к модели двойной диссоциации. Это свидетельствует о том, что оба значения рК_а являются весьма различными.

Стабильность при различных значениях рН.

Стабильность глутаминилциклаз оценивали, осуществляя инкубацию ферментов растительного и животного происхождения при 30°С в течение 30 мин при различных значениях рН в диапазоне от 4 до 10. После этого активность РС определяли в стандартных условиях. Результаты представлены на фиг. 3.

РС из латекса папайи оказалась стабильной в изученном диапазоне значений рН без заметной тенденции к снижению стабильности в кислом или основном диапазоне. В противоположность этому для человеческой РС сопоставимая стабильность обнаружена только при рН 7-8,5, что свидетельствует о выраженном снижении стабильности при значениях рН выше 8 и ниже 6. Таким образом, значения рН, близкие к 8, вероятно, являются оптимальными для активности и стабильности растительной и человеческой рС и приемлемыми значениями рН для сравнения субстратной специфичности различных РС.

Пример 5. Определение субстратной специфичности ОС.

Спектрофотометрический анализ.

Осуществляли непрерывный спектрофотометрический анализ, описанный в примере 2. Согласно этому анализу об активности РС свидетельствует снижение абсорбции при 340 нм, вызванное высвобождением аммиака и последующим поглощением НАДН/Н⁺ из-за образования глутамата из α-кетоглутаровой кислоты. Как видно из фиг. 1, были получены линейные графики и была выявлена линейная зависимость между измеренной активностью и концентрацией РС. Кроме того, кинетические параметры, полученные для Н-С1п-С1п-ОН с использованием непрерывного описанного выше анализа (табл. 6), хорошо согласуются с данными, полученными с использованием дискретного анализа (КМ=175±18мкМ, кса!=21,3±0,6 с^-1). Помимо этого, кинетические параметры для превращения субстратов Н-С1п-А1а-ОН, Н-С1п-С1и-ОН, Н-С1п-С1п-ОН, Н-С1п-О!Ви и Н-С1п-NН2 с помощью РС из папайи, представленные в табл. 1, хорошо коррелируют с данными, которые были получены с помощью прямого метода при рН 8,8 и 37°С (Сο1ο1οЬον МА. и др., Вю1. Сйет. Норре 8еу1ег 377, 1996, с. 395-398). Таким образом, очевидно, что новый непрерывный анализ позволяет получать надежные результаты.

- 34 010108

Ди-, трипептиды и дипептидные заместители.

Используя описанный выше новый непрерывный анализ примерно 30 соединений, были изучены в качестве потенциальных субстратов ОС из С. рарауа и человеческой ОС. Результаты представлены в табл. 6. Путем сравнения специфичности установлено, что практически все короткие пептидные субстраты более эффективно превращаются под действием ОС из папайи по сравнению с человеческим ферментом. Заслуживает внимания тот факт, что для обоих ферментов более эффективными являются субстраты с крупными гидрофобными остатками во втором положении, что обнаружено по специфичности в отношении Н-С1п-Туг-А1а-ОН, Н-С1п-Р11е-Л1а^Н₂ и Н-С1п-Тгр-Л1а^Н₂ при сравнении с другими трипептидами или по реактивности хромофорных субстратов Н-С1п-АМС, Η-С1η-βNА и Н-С1п-Туг-ОН по сравнению с дипептидными субстратами. Для ОС из папайи эти данные согласуются с ранее полученными результатами, свидетельствующими о том, что специфичность коррелирует с размером второго аминокислотного остатка (Со1о1оЬоу Μ.Υ. и др., Вю1. СНет. Норре 8еу1ег 377, 1996, с. 395-398). Единственное выраженное различие в специфичности ОС растительного и животного происхождения обнаружено в случае Н-С1п-О1Ви. В то время как этот сложный эфир превращается при использовании ОС из папайи со специфичностью, характерной для дипептидных субстратов, его превращение при использовании человеческой ОС происходит примерно на порядок медленнее.

Олигопептиды.

Помимо нескольких дипептидов и трипептидов была изучена способность ОС из папайи и человеческой ОС превращать целый ряд олигопептидов (табл. 6). Заслуживает внимания тот факт, что общее различие в специфичности между человеческой и растительной ОС для ряда тетрапептидов оказалось не столь заметным, как для дипептидных и трипептидных субстратов. Это свидетельствует о том, что аминокислоты в 3- и 4-м положениях все еще оказывают влияние на кинетические характеристики, прежде всего человеческой ОС. Однако исключением являются пептиды, несущие остаток пролина в положении второй аминокислоты, для которых обнаружено заметное снижение значений к_са1/К_М в ряду тетрапептидов, имеющих строение Н-С1п-Х,,,-Туг-Р11е^Н₂ (табл. 6). Снижение специфичности более выражено для человеческой ОС, и это приводит примерно к 8-кратным различиям в значении к_са1/К_М по сравнению с ОС из папайи.

Небольшое снижение специфичности человеческой ОС обнаружено также в случае превращения субстратов с положительно заряженным С-концевым аминокислотным остатком глутамина, что обнаружено по специфичности в отношении Н-61п-Агд-Туг-Рйе-№₂, Н-61п-Агд-Туг-Рйе-Ж₂ и Н-С1п-Ьу8-АгдЬеи-Ν^ по сравнению с другими тетрапептидами. Очевидно, что пониженная специфичность, прежде всего, является следствием меньшего индекса превращения. Этот эффект не выявлен для растительного фермента.

Таблица 6

Кинетические параметры пептидных субстратов для человеческой ОС и ОС из папайи

Субстрат	Человеческая ОС	ОС из папайи
	Кн (мкМ)	кса( (с*')	к,* (мМ)	Еса?Км (мМ'1 с' ’)	Км (мкМ)	(сЛ)	К,* (мМ)	кса(/Км (мМ1 с ')
Н-61П-0Н	н.р.	Н.р.	н.д.	н.р.	н.д.	Н.д.	н.д.	0,23 ±0.1
Н-61П-АМС	54 ±2	5,3 ±0,1	н.д.	98 ±2	42 ±1	39,4 ±0,4	н.д.	938 ±13
Η-61η-βΝΑ	70 ±3	20,6 ±0,5	1,21 ±0,07	294 ±6	38 ±3	51,4 ±1,4	1,20 ±0,08	1353 ±70
Н-О1п-О1Ви	1235 ±74	6,7 ±0,2	н.и.	5,4 ±0,2	223 ±9	49,4 ±0,6	н.и.	222 ±6
Η-Ο1η-ΝΗ2	409 ±40	12,8 ±0,5	н.и.	31 ±2	433 ±13	44,8 ±0,4	н.и.	103±2
Н-С1п-61у-0Н	247 ±10	13,2 ±0,2	н.и.	53 ±1	641 ±20	45,8 ±0,4	н.и.	71 ±2
Н-О1п-А1а-ОН	232 ±5	57,2 ±0,4	н.и.	247 ±4	158 ±8	69,8 ±1,0	н.и.	442 ±16

- 35 010108

Н-61П-61П-0Н	148 ±5	20,7 ±0,2	н.и.	140 ±2	44 ±3	43,2 ±0,7	Н.И.	982+51
Н-С1п-СИи-ОН	359 ±10	24,7 ±0,2	Н.И.	58 ±1	106 ±5	50,3±0,6	н.и.	475 ±17
Н-С1п-Уа1-ОН	196 ±5	17,2 ±0,1	н.и.	88 ±2	Н.д.	Н.д.	н.и.	н.д.
Η-σΐη-Туг-ОН	211 ±5	94 ±1	н.и.	446±6	Н.д.	Н.д.	н.и.	н.д.
Н-С1п-С1и-Туг- νη2	79 ±2	45,1 ±0,4	н.и.	524±8	103 +4	53,6 ±0,7	н.и.	520 ±13
Н-О1п-С1у-Рго- ОН	130 ±5	25,3 ±0,2	н.и.	195 ±7	333 ±15	41,7 ±0,5	н.и.	125 +4
Н-О1п-Туг-А1аон	101 ±4	125 ±1	н.и.	930 ±27	63 ±3	104,0 ±1,0	н.и.	1650 ±63
Н-СИп-Р11е-А1а- νη2	69 ±3	109 ±1	н.и.	1811 ±64	111 ±5	132,1 ±0,6	н.и.	1190 ±48
Н-С1п-Тгр-А1а- νη2	50 ±2	47,0 ±0,7	н.и.	940 ±24	78 ±5	151,8 ±2,6	н.и.	1946 ±91
Н-СИп-Агд- Ο1γ-Ι1β-ΝΗ2	143 ±4	33,5 ±0,4	н.и.	234+4	123 ±10	49,2 ±1,7	н.и.	400 ±19
Η-αΐη-Αδη<Э1у-Пе-ЫН2	172 ±5	56,6 +0,5	н.и.	329 ±7	153 ±9	51,4 ±0,9	н.и.	336 ±14
Н-61п-8ег-ТугРйе-ИНг	55 ±3	52,8 ±0,8	н.и.	960 ±38	135 ±6	64,9 ±1,0	н.и.	481 ±14
Н-(31п-Агд-Туг- РЬе-МН2	55 ±2	29,6 ±0,3	н.и.	538 ±14	124 ±6	48,9 ±0,7	н.и.	394 ±13
Н-С1п-Рго-Туг- Рйе-ЫН2	1889 ±152	31,7 ±1,2	н.и.	17 ±1	149 ±14	18,8 ±0,6	н.и.	126 ±8
Н-СИп-НБ-ТугРйе-ЫНг	68 ±3	55,4 ±0,7	н.и.	815 ±26	92 ±7	75,9 ±1,4	н.и.	825 ±48
Н-61п-01п-Туг- ΡΒβ-ΝΗ2	41 ±2	41,4 ±0,4	н.и.	1010 ±40	45 ±2	52,9 ±0,7	н.и.	1176 ±37
Н-С1п-С1и-Туг- РЬе-ИН2	47 ±4	46 ±1	н.и.	979 ±62	100 ±4	54,6 ±0,6	н.и.	546 ±16
Н-С1п-С1и-А1а- Α1η-ΝΗ2	77 ±4	46 ±1	н.и.	597 ±18	102 ±4	53,7 ±0,6	н.и.	526 ±15
Н-О1п-С1и-Туг- Α1η-ΝΗ2	69 ±2	42,1 ±0,4	н.и.	610 ±12	ИЗ ±5	44,7 ±0,5	н.и.	396 ±13
Н-О1п-С1и-А1а- ΡΗ6-ΝΗ2	39 ±3	39 ±1	н.и.	1000 ±51	81 ±3	48,5 ±0,45	н.и.	599 ±17
Н-С1п-С1и- Азр-Ьеи-ЫНз	55 ±2	45,8 ±0,5	н.и.	833 ±21	107 ±6	58,5 ±0,4	н.и.	547 ±27
Н-СИп-Ьуз- Аг§-Ьеи-14Н2	54 ±3	33,4 ±0,5	н.и,	619 ±25	118 ±6	48,2 ±0,8	н.и.	408 ±14

н.р. - отсутствие реактивности;

н.и. - отсутствие ингибирования;

н.д. - не делали;

*для ингибирования субстрата.

Результаты, полученные с использованием тетрапептидов, позволяют сделать еще одно заключение. Как уже отмечалось, ОС из папайи обладает высокой селективностью в отношении дипептидов. Однако для некоторых тетрапептидов при использовании человеческой ОС были получены более высокие значения констант специфичности, что видно из графика, представленного на фиг. 4, для построения которого использовали некоторые данные из табл. 6, касающиеся ряда пептидов, которые содержат глутамат в положении второй аминокислоты. Кроме того, по мере того, как длина цепи возрастает от ди- к тетрапептидам, селективность человеческой ОС повышается, в отличие от результатов, полученных с использованием ОС из папайи. Кроме того, наиболее высокая селективность человеческой ОС обнаружена в отношении пептидов, несущих крупные гидрофобные остатки аминокислот в 3- и 4-м положениях, что свидетельствует о гидрофобных взаимодействиях с ферментом. При сравнении кинетических параметров, характеризующих взаимодействие с соответствующими пептидами, изменения, вероятно,

- 36 010108 прежде всего, связаны с более низкими значениями КМ, установлено, что индексы превращения пептидов являются близкими. Таким образом, более высокая селективность человеческой ОС в отношении пептидов с более длинной цепью, вероятно, является результатом более прочного связывания более гидрофобных субстратов с ферментом.

Обнаруженные различия между человеческой и растительной ОС в отношении пептидов, содержащих гидрофобные аминокислоты в 3-м и 4-м положении, также становятся очевидными при сравнении констант специфичности ферментов в отношении Н-61п-Агд-О1у-11е-Ж₂ и Н-О1п-Агд-Туг-Рйе-Ж₂ или Н-С1п-С1п-ОН и Н-61п-О1п-Туг-Рйе-ОН.

Было установлено также, что человеческая ОС обладает большей селективностью в отношении гомологичных субстратов, содержащих Ν-концевой С1п и увеличенное количество С-концевых остатков А1а (табл. 7). В то время как селективность человеческой ОС повышается с увеличением длины цепи субстрата, такая тенденция не обнаружена для ОС из папайи. Поскольку человеческая ОС обладает меньшей специфичностью в отношении пептидов, которые имеют в последовательности остаток 8ет, можно предположить, что природа боковой цепи также является важной (табл. 7).

Таблица 7 Влияние длины субстрата на активность человеческой ОС и ОС из папайи

Субстрат	Человеческая ОС	ОС из папайи
	Км (мкМ)	кса( (с'1)	кса^Км (мМ’1 с'1)	Км (мкМ)	кса( (с'1)	кСа[/Км (мМ'1 с'1)
Н-С1п-А1а -ΝΗ2	155 ±9	40,1 ±0,9	259 ±9	212 ±21	62,8 ±3,0	296 ±15
Η-σΐη-Α1α-Α1α-ΝΗ2	87 ±3	76,3 ±0,7	877 ±22	164 ±6	83,2 ±1,0	507 ±12
Н-<31п-А1а-А1а-А1а-А1а- νη2	65 ±3	60,5 ±0,7	1174 +43	197 ± 8	74,6 ±1,0	379 ±10
Н-О1п-А1а-А1а-Зег-А1а- Α1η-ΝΗ2	79 + 6	55,3 ±1,6	700 ±33	216 ±6	78,5 ±1,0	363 ±5

Воздействие ионной силы на катализ.

Другой параметр, действие которого на субстратную специфичность было изучено, представляет собой ионную силу. Для этой цели определяли кинетические параметры для циклизации нескольких субстратов в присутствии 0,5М КС1 и без соли (табл. 8). При создании изобретения неожиданно было установлено, что специфичность в отношении субстратов с незаряженным каркасом при добавлении соли не изменялась в значительной степени как в случае ОС из латекса папайи, так и человеческой ОС. Однако константы специфичности человеческой ОС в отношении Н-С1п-А1а-ОН и Н-С1п-С1и-ОН снижались при добавлении КС1. Как видно из данных, приведенных для каждого из кинетических параметров, это было обусловлено увеличением значения КМ и только небольшим снижением значения к_са1. В случае ОС из папайи не обнаружено воздействия ни на один из изученных параметров. Это явление, вероятно, не связано с самим отрицательно заряженным субстратом, так как для отрицательно заряженного пептида Н-С1п-С1и-А5р-Сеи-ХН₂ не обнаружено изменение этих параметров. Представляющее интерес действие соли дополнительно было выявлено для положительно заряженных субстратов Н-С1п-Агд-С1у-11е-ХН_; и Н-С1п-Су5-Агд-Сеи-ХН₂. Установлено, что положительное действие на катализ как растительной, так и человеческой ОС, прежде всего, обусловлено более низким значением КМ и несколько повышенным индексом превращения.

- 37 010108

Таблица 8

Влияние ионной силы на катализ человеческой ОС и ОС из папайи

	Субстрат	0.05М трицин-ИаОН, рН 8,0	0.05М трнцин-ИаОН, рН 8,0, 0,5М КС1
5 «5 С «3 С X о О'		Км (ММ)	кса((с ’)	кС!ц/Км (мМ с	К] (мМ)	Км (мМ)	кса!О ’)	кса(/К.м (мМ с *)	К; (мМ)
Η-61Π-ΝΗ2	0,434 ±0,015	43,4 ±0,4	100 ±3	Н.И.	0.446 ±0,010	45,2 ±0,3	101 ±2	ни.
Η-ΟΙη-^ΝΑ	0,036 ±0,002	48,8 ±1,0	1356 ±50	1,14 ±0,05	0,032 ±0,002	47,2 ±0,8	1475 ±70	1,33 ±0,07
Н-61п-А1а-0Н	0,137 ±0,007	69,7 ±0,9	509 ±19	н.и.	0,143 ±0,005	68,1 ±0,6	480 ±12	н.и.
Н-О1п-С1и-ОН	0,098 ±0,005	45,0 ±0,5	459±18	ни.	0,094 ±0,003	44,4 ±0,3	472 ± 12	II. н.
Н-С1п-Тгр-Л1а- ΝΗ2	0,079 ±0,005	138 ±3	1747 ±73	н.и.	0,072 ±0,004	133 ±3	1847 ±61	н.и.
Н-С1п-Агй-С1у Ι1ε-ΝΗ2	0,106 ±0,008	52,9 ±1,2	499 ±26	н.и.	0,065 ±0,005	48,4 ±1,0	745 ±42	н.и.
Η-ΟΙη-ίγί-Αι-βЬеи-ЫНг	0,102 ±0,007	50 ±1	493 ±22	н.и.	0,053 ±0,002	58,1 ±0,7	1096 ±28	н.и.
Н-С1п-С1и-А8рίειι-ΝΗ2	0,109 ±0,005	52,4 ±0,7	481 ±16	н,и.	0,094 ±0,003	53,6 ±0,5	570 ±13	н.и.

Человеческая С»С		0.05М трис-НС1, рН 8,0	0,05М трис-НС1, рН 8,0, 0,5М КС1
Η-<31η-ΝΗ2	0,442 ±0,030	12,8 ±0,3	29±1	н.н.	0,401 ±0,014	12,2 ±0,1	30±1	Н.И.
Η-ΟΙη-^ΝΑ	0,076 ±0,004	21,7 ±0,5	285±8	1,39 ±0,08	0,063 ±0,003	20.0 ±0,4	318 ±9	0,97 ±0,04
Н-61п-А1а-0Н	0,269 ±0,007	54,4 ±0,5	202±3	Н.И.	0,357 ±0,012	47,6 ±0,6	133 ±3	Н.И.
Н-О1п-а1и-ОН	0,373 ±0,015	21,4 ±0,3	57±2	н.и.	0,607 ±0,036	18,9 ±0,5	31 ±1	н.и.
П-С1п-Тгр-А1аΝΗ2	0,054 ±0,003	50,8 ±0,6	941 ±41	н.и.	0,056 ±0,002	50,0 ±0,4	893±25	н.и.
Н-О1пАг§-С1у[Ιε-ΝΗ2	0,166 ±0,013	31 ±1	187 ±9	н.и.	0,091 ±0,005	29,8 ±0,5	327 ±12	н.и.
Н-О1п-Ьу8-Аг5- Ьеи-ЦН2	0,051 ±0,003	29,4 ±0,5	577 ±24	н.и.	0,034 ±0,001	31,6 ±0,3	929 ±19	н.и.
Н-С1п-С1и-А8рίβιι-ΝΗ2	0,060 ±0,002	46,6 ±0,5	777 ±18	ни.	0,061 ±0,002	45,6 ±0,5	748 ±16	н.н.

Физиологические субстраты.

В проведенных ранее исследованиях уже доказано превращение |С1п¹] ТНН и [61п¹]-6πНН с помощью ОС с использованием бычьей ОС и ОС из гипофиза свиней (ВикЬу ХУ.Н.Б и др., I. Вю1. Сйет. 262, 1987, с. 8532-8536; Иксйег №.Н. и 8р1екк I., Ргос. №!1. Αсаб. 8с1 υ8Α 84, 1987, с. 3628-3632). Помимо этих уже изученных гормонов гипофиза, были синтезированы три потенциальных физиологических субстрата человеческой ОС и изучено их превращение, а именно |О1п¹]гастрин, |С1п¹] нейротензин и |С1п¹]РРР. Кинетические параметры, характеризующие их превращение, представлены в табл. 1. Важно отметить тот факт, что превращение глутаминильных пептидов в соответствующие пироглутамильные пептиды характеризуется увеличением значения констант специфичности в зависимости от размера, т.е. первым в этом ряду стоит наиболее крупный пептид прогастрин, состоящий из 17 аминокислот, за ним следуют пронейротензин, про-СпНН, про-ТНН и про-РРР. Эти результаты соответствуют данным, полученным при использовании синтетических пептидов.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что превращение растительным ферментом субстратов с более длинной цепью также является высоко селективным, что частично противоречит данным, касающимся более коротких олигопептидов. Возможно, существует вторичные взаимодействия, обусловливающие связывание субстрата и фермента, которые удалены от активного сайта.

Пептиды, содержащие модифицированные аминокислоты

С целью дальнейшего изучения специфичности и селективности ОС синтезировали пептиды, содержащие либо модифицированный Ν-концевой глутаминильный остаток, либо модифицированную аминокислоту во втором положении. Превращение этих пептидов оценивали количественно с помощью

- 38 010108

МАЬЭ1-Т0Р-масс-спектрометрии (см. также пример 3). Циклизация глутаминильного остатка или его аналога соответственно обусловливает различие в массе субстрата и продукта катализа. В случае, когда происходит выделение 1 моль аммиака в свободном состоянии на 1 моль субстрата, превращение также можно анализировать количественно с помощью спектрофотометрического анализа.

Н-61п-Ьук(61п)-Агд-Ьеи-А1а-МН₂.

Превращение этого разветвленного на Ν-конце пептида, который содержит два глутаминильных остатка на Ν-конце, связанные с лизильным остатком через пептидную и частично изопептидную связь, с помощью человеческой ОС (фиг. 5) и ОС из папайи (данные не приведены), по-видимому, происходит одинаковым образом. Оба глутаминильных остатка превращаются в пироглутаминовую кислоту без какого-либо заметного предпочтения в отношении конкретного остатка, что следует из данных о соответствующем превращении субстрата (фиг. 5). Таким образом, селективность различных ОС в отношении по-разному связанных глутаминильных остатков не имеет существенных различий.

Н-61п(ММе)-Рйе-Ьук-А1а-61ц-МН₂.

Метилированный глутаминильный остаток превращается в пироглутамильный остаток только с помощью ОС из папайи (фиг 6). Кроме того, не обнаружено ингибирование человеческой ОС пептидом, что свидетельствует о том, что метилированный остаток не распознается человеческой ОС.

Н-61и(0Ме)^А и Н-61и^А.

Ни одно из этих соединений не подвергалось каталитическому превращению с помощью ОС из папайи или человеческой ОС. Эти флуорогенные субстраты анализировали флуорометрически, используя пироглутамиламинопептидазу в качестве вспомогательного фермента. Однако у О-метилированного глутаматного остатка обнаружено выраженное отсутствие стабильности как в Трис-буфере, так и в трициновом буфере, что свидетельствует о наличии у них тенденции к циклизации, катализируемой не ферментативным путем. Кроме того, активность обеих ОС в отношении Н-С1п-АМС в качестве субстрата не ингибировалась более длинными пептидами Н-61ц(0Ме)-Рйе-Ьук-Агд-Ьеи-А1а-МН₂ или Н-61и-РйеЬук-Агд-Ьеи-А1а-НН₂, эти данные свидетельствуют о том, что глутаминовая кислота или ее производные не распознаются обеими формами ОС. Кроме того, результаты свидетельствуют о том, что не только отрицательный заряд остатка глутаминовой кислоты является причиной отталкивания пептида от активного сайта.

Н-61п-цикло(№-Ьук-Агд-Рго-А1а-61у-Рйе).

Превращение субстрата Н-61п-цикло(№-Ьук-Агд-Рго-А1а-61у-Рйе), который содержит внутримолекулярную частичную изопептидную связь, анализировали количественно, при этом установлено, что значения К_М составляют 240±14 и 133±5 мкМ для человеческой ОС и ОС из папайи соответственно. Установлено, что вследствие более высокого индекса превращения с помощью ОС из папайи (49,4±0,6 с¹) по сравнению с человеческой ОС (22,8±0,6 с^-1) для растительного фермента значение кса1/КМ составляет 372±9 мМ^-1 мин^-1, что примерно в 4 раза выше, чем для человеческой ОС. Таким образом, константа специфичности в случае ОС из папайи только немного ниже, чем для субстратов, имеющий меньший размер, таких как Н-61п-А1а-А1а-8ег-А1а-А1а-ИН2. Однако установлено, что значение к_са1/К_М для человеческой ОС составляет 95±3 мМ^-1 с-¹, что примерно на порядок ниже по сравнению со значениями, полученными для субстратов близкого размера (табл. 6).

Н-в-гомо-61п-Рйе-Ьук-Агд-Ьеи-А1а-МН₂.

Ν-концевой β-гомоглутаминильный остаток превращали в 5-членное лактамовое кольцо посредством катализа с использованием человеческой ОС и ОС из папайи соответственно. Сопровождающее этот процесс выделение в свободном состоянии аммиака анализировали спектрофотометрически и с помощью описанного выше МАЬП1-Т0Р-анализа. Не обнаружено выделение в свободном состоянии аммиака, если ОС отсутствовала или ее подвергали кипячению, что свидетельствует о специфичности катализа циклизации. Интересным представляется тот факт, что ОС из С. рарауа (К_М=3,1±0,3 мМ, к_са1=4,0±0,4 с^-1) и человеческая ОС (КМ=2,5±0,2 мМ, кса1=3,5±0,1 с^-1) катализируют превращение этого пептида с практически идентичными значениями кса1/К_М, составляющими 1,4±0,1 и 1,3±0,1 мМ^-1 с-¹ соответственно. Таким образом, циклизация β-гомоглутаминового остатка катализируется с примерно в 1000 раз меньшей эффективностью по сравнению с катализом пептидов такого же размера, которые содержат глутаминильный остаток на Ν-конце. Это свидетельствует о том, что наличие α-углерода субстрата является для распознавания субстрата формами ОС важным, но не основным фактором. Основным требованием к субстрату является наличие γ-амидной группы и непротонированной Ν-концевой аминогруппы на расстоянии и под углом, необходимом для циклизация, это требование удовлетворяется наличием Νконцевых глутаминильных и β-гомоглутаминильных остатков.

Пример 6. Синтез субстратов ОС.

Олигопептиды. Пептиды синтезировали полуавтоматически в количестве порядка 0,5 ммолей с помощью пептидного синтезатора (ЬаЬойес 8Р650, Бахем, Швейцария) согласно описанному ранее методу (8сй1Шпд 8. и др., Вюсйетщйу 41, 2002, с. 10849-10857). Более длинные пептиды синтезировали в количестве порядка 25 мкмолей с помощью автоматического пептидного синтезатора типа 8утрйопу (фирма Ватт 1пк1гитеп1 Со.) согласно описанному методу (МапйаЛ 8. и др., Вюсйетгкйу 42, 2003, с. 3081-3088).

- 39 010108

Для всех пептидных сочетаний применяли основанные на использовании Ртос модифицированные протоколы твердофазного пептидного синтеза, предусматривающие применение тетрафторбората 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3,-тетраметилурония (ТБТУ; фирма №уаЬюс11ет)/основания (диизопропилэтиламина или Ν-метилформолина; фирма Мегск), или в случае затрудненного сочетания применение Ν-оксида гексафторфосфата №[(диметиламино)-1Н-1,2,3,-триазоло[4,5-Ь]пиридин-1илметилен]-Ы-метилметанамминия (4,5) (ГАТУ; фирма АррНеб ВюкуйеткУдиизопропилэтиламина в качестве активирующих реагентов. После отщепления от смолы с помощью содержащей трифторуксусную кислоту (ТФК; фирма Мегск) смеси неочищенные пептиды очищали с помощью препаративной ЖХВР с использованием не содержащих кислоту растворителей для того, чтобы исключать дальнейшую циклизацию Ν-концевого глутамина. Препаративную ЖХВР осуществляли с использованием линейного градиента ацтонитрила (фирма Мегск) в воде (5-40% или 65% ацетонитрила в течение 40 мин) на колонке типа 250-21 Ьипа КР18 (фирма Рйепотепех). Для подтверждения чистоты и идентификации пептидов использовали аналитическую ЖХВР и ЕЛ-МС.

61и(МН-МН₂)-8ег-Рго-ТЬг-А1а-МН₂.

Линейный пептид-предшественник (Втос-С1и-8ег-Рго-ТНг-А1а-НН_;) синтезировали согласно стандартным методам, основанным на применении Ршос (8сЫШпд 8. и др., ВюсйетщЦу 41, 2002, с. 1084910857) на амидной МВНА-смоле Ринка (фирма ШуаЬюсНет). После отщепления защищенного с помощью Ртос пептида от смолы пептид осаждали с помощью диэтилового эфира (фирма Мегск), фильтровали и сушили. Смолу НМВА-АМ (1,16 ммоля/г, фирма №уаЬюс11ет) применяли для сочетания кислотной γ-карбоксильной группы глутаминовой кислоты пептида-предшественника (3 экв.) в дихлорметане (ДХМ, фирма Мегск). В качестве агентов для сочетания применяли дициклогексилкарбодиимид (ДЦК, фирма 8егуа) (4 экв.) и диметиламинопиридин (ДМАП, фирма АИпсй) (0,1 экв.). Через 12 ч смолу фильтровали, промывали ДХМ и реакцию повторяли. После удаления Ν-концевой Ртос-группы с помощью 20% пиперидина в ДМФ (3x5 мин) несущую пептид смолу обрабатывали 5% раствором гидразина (20 мл/г) в течение 1,5 ч. Смолу фильтровали и промывали диметилформамидином (ДМФ, фирма КоШ, Германия) и ТФК. После спаривания неочищенный пептид осаждали простым эфиром, выход 76%.

Н-61п-Ьу8(61п)-Агд-Ьеи-А1а-МН₂.

Линейный пептид синтезировали с помощью стандартной процедуры, основанной на использовании Ршос/ШЬ, на амидной МВНА-смоле Ринка (8сЫШпд 8. и др., ВюсНешЩгу 41, 2002, с. 10849-10857), при этом для сочетания применяли предпоследнюю аминокислоту Ртос-Ьу8(Ршос)-ОН. 4 экв. Ртос-61п(Таг1)-ОН подвергали сочетанию после удаления двух аминозащитных групп лизина с помощью 20% пиперидина (фирма Мегск) в ДМФ. Выход после стандартного процесса расщепления составлял 95%.

Н-61п^Ме)-Рйе-Ьу8-А1а-61и-МН₂.

Ршос-61п(ЫМе)-ОН синтезировали, начиная процесс с Ршос-61и-О1Ви на смоле Ршос-МВАМ (фирма ШуаЫосНет). После добавления ДХМ для набухания смолу (0,5 г) промывали ДМФ и удаляли защитные группы с помощью 20% раствора пиперидина в ДМФ. Смолу вносили в 5 мл ДМФ и последовательно добавляли 5 экв. Ртос-61и-О1Ви, 5 экв. ГАТУ и 10 экв. ДИПЭА и встряхивали в течение 6 ч. После фильтрации и промывки продукт отщепляли в условиях стандартного расщепления с помощью ТФК. Пептид Н-61п(ММе)-Рйе-Ьу8-А1а-61и-МН₂ синтезировали с помощью известного метода (8сЫШпд 8. и др., ВюсНешЩгу 41, 2002, с. 10849-10857). Осуществляли сочетание Втос-С1п(АМе)-ОН с ГАТУ/ДИПЭА в течение ночи. После стандартного процесса расщепления выход неочищенного пептида составлял 78%.

Н-61и(ОМе)-в-нафтиламид, Н-С1пАа1-ОН, Н-61п-Туг-ОН.

Защищенные с помощью Вос дипептиды синтезировали стандартным методом, основанным на применении смешанного ангидрида с использованием изобутилхлоркарбоната (фирма Мегск). С-концевые сложные метиловые эфиры Вос-С1п-Туг-ОМе и Вос-С1пАа1-ОМе омыляли с помощью 1н. №ОН в диоксане. У защищенных с помощью Вос пептидов удаляли защитную группу, обрабатывая раствором НС1/диоксан в течение 10 мин. После упаривания остаток кристаллизовали с помощью нескольких растворителей с получением твердого соединения, выход 60-70%.

Н-61п-цикло(№-Ьу8-Агд-Рго-А1а-61у-Рйе).

Линейный предшественник Вос-61п(Тг1)-Ьу8-Агд(Ртс)-А1а-61у-Рйе-ОН синтезировали на чувствительной к действию кислот 2-хлортритильной смоле. Сочетание осуществляли с помощью стандартного протокола, основанного на применении Ртос/Ви, с использованием Ртос-Ьу8(Мй)-ОН. После расщепления с помощью 3% раствора ТФК в ДХМ (10 раз по 5 мин), раствор нейтрализовали 10% раствором пиридина (фирма Мегск) в метаноле (МеОН; фирма Мегск), трижды промывали ДХМ и МеОН, упаривали до 5% от исходного объема и неочищенный пептид осаждали с помощью охлажденной на льду воды. После этого неочищенный пептид подвергали циклизации, используя активацию смесью ДЦК/Νгидроксибензотриазол (ГОБТ; фирма АИпсй). Неочищенный пептид растворяли в безводном дихлорметане (0,2 ммоль/50 мл), добавляли 0,2 ммоль Ν-метилморфолина и 0,4 ммоль 1-гидроксибензотриазола. Этот раствор добавляли по каплям к раствору, содержащему 0,4 ммоль дициклогексилкарбодиимида в

- 40 010108

250 мл дихлорметана, при 0°С. Реакцию прекращали путем перемешивания в течение ночи при комнатной температуре. После фильтрации Ν,Ν'-дициклогексилмочевины растворитель удаляли выпариванием. Остаток растворяли в этилацетате и промывали несколько раз 1н. НС1, насыщенным раствором NаНСΟз и водой. Раствор сушили над безводным №₂8О₊ фильтровали и упаривали досуха в вакууме.

Пример 7. Характеристики эффекторов ОС.

Имидазольные производные.

Имидазольные и бензимидазольные производные, замещенные в различных положениях 5-членного кольца, тестировали в качестве ингибиторов ОС (табл. 3). Порядок нумерации относится к имидазольному кольцу. Применяемые методы описаны в примере 2.

С-4(5)- и С-4,5-производные.

Установлено, что соединения, имеющие замены в любом из структурно эквивалентных положений 4 или 5 имидазольного кольца или в обоих положениях, обладали пониженной способностью к ингибированию человеческой ОС. При этом существует одно исключение, поскольку Ν-ω-ацетилированный гистамин является одним из наиболее эффективных ингибиторов. Небольшие заместители в этих положениях оказывали незначительное воздействие на связывание, о чем свидетельствуют близкие значения константы ингибирования для 5-гидроксиметил-4-метилимидазола при сравнении с имидазолом. Более крупные и имеющие больший объем группы, присоединенные к этим сайтам, снижают или устраняют связывание соединения ферментом. Для некоторых других изученных заместителей известно, что они проявляют отрицательное индукционное или мезомерное действие, что может снижать электронную плотность в имидазольном кольце, это тоже приводит к ухудшению связывания, соответственно значений констант связывания. Различия в значениях К₁ Ь-гистидина и гистидинамида также свидетельствуют о некотором воздействии заряда на связывание. Данные об электростатическом отталкивании заряженных субстратов были получены ранее при оценке субстратной специфичности, т.е. глутаминамид эффективно превращался в продукты с помощью человеческой ОС, но никакой реактивности не обнаружено при использовании свободного глутамина в качестве субстрата.

С-2-производные.

Все изученные производные ингибировали ОС слабее, чем имидазол. Любая замена, превышающая по размеру протон, мешала соответствующему связыванию с ОС. В случае 2-метилбензимидазола только из-за введения метильной группы значение константы ингибирования снижалось примерно на один порядок. Очень близкая взаимосвязь обнаружена при сравнении значений К₁ для бензимидазола и

2- аминобензимидазола. Кроме того, эти результаты свидетельствуют о том, что это воздействие не связано с электронными изменениями.

Ν-1-производные.

Из изученных в качестве ингибиторов человеческой ОС имидазольных производных у большинства соединений, обладающих повышенными значениями К₁ по сравнению с имидазолом, обнаружены изменения на одном атоме азота. К этим соединениям относится также один из наиболее эффективных ингибиторов ОС 1-бензилимидазол. Важным представляется тот факт, что лишь незначительные изменения этой структуры приводят к потере ингибирующей активности, это можно обнаружить при сравнении 1-бензоилимидазола и фенилимидазола, последний из которых не проявлял активности в экспериментальных условиях. В этом случае также выявленные изменения, вероятно, связаны не только со сниженной электронной плотностью имидазольного кольца из-за отрицательного мезомерного действия фенильной группы, поскольку у более объемной триметилсилильной группы, проявляющей положительное индукционное действие, обнаружена также пониженная способность к связыванию по сравнению с другими остатками. Важным представляется тот факт, что одним из наименее эффективных соединений в этой группе является 1-аминопропилимидазол. Низкая эффективность этого соединения обусловлена наличием основной аминогруппы, поскольку у соединений с близким стерическим строением 1-метилимидазола и 1-винилимидазола выявлена повышенная способность к связыванию с активным сайтом. Таким образом, положительно заряженная аминогруппа ответственна за более низкое значение К₁, этот результат подтверждается при сравнении значений К₁ Ν-ω-ацетилированного гистамина (табл. 3) и гистамина (табл. 4).

Роль 3,4- и 3,5-дериватизации.

Установлено, что имидазольные производные, которые имеют заместителей в положениях 4 (5) или в обоих положениях, обладают ограниченной эффективностью в отношении связывания с ферментом. Роль конкретных замен выявляли путем сравнения констант ингибирования Ь-гистамина и двух промежуточных продуктов биологического расщепления гистамина, 3-метил-4-гистамина и

3- метил-5-гистамина (табл. 4). Для Ь-гистамина установлено, что значение К₁ примерно на порядок ниже, чем для ацетилированного аналога. Метилирование атома азота приводит к значительному повышению эффективности в случае 3-метил-4-гистамина. Однако метилирование, приводящее к получению 3-метил-5-гистамина, приводит к полной потере ингибирующей активности. Таким образом, выявленный эффект, вероятно, прежде всего связан со стерическим препятствием связыванию из-за дериватизации атома углерода, примыкающего к основному азоту. Вероятно, основный азот играет основную роль в

- 41 010108 связывании с ферментом.

Пример 8. Образование Ав(3-40/42)-производных.

Исследования проводили с использованием двух коротких Ν-концевых пептидных последовательностей Ав(3-40/42), таких как С1п³-Ав(1-11)а (последовательность: ^А^РКΗ^§СΥЕ) и С1п³-Ав(3-11)а, которая содержит глутамин вместо глутаминовой кислоты в 3-м положении. Расщепление с помощью ЭР IV и циклизацию Ν-концевого остатка глутамина с использованием ОС этих двух пептидов оценивали с помощью МЛЬОРТОР-масс-спектрометрии.

Опыты проводили с использованием очищенной ЭР IV (свиная почка) или неочищенного гомогената свиного гипофиза в качестве источника ОС, а также обоих ферментах в опытах по оценке последовательного катализа.

Результаты.

1. Образование С1п³-Ав(3-11)а из С1п³-Ав(1-11)а, катализируемое ЭР IV, и его предупреждение с помощью ингибитора ЭР IV Vа1-пирролидида (Уа1-Ругг).

ЭР IV или подобная ЭР IV активность приводила к расщеплению С1п³-Ав(1-11)а с образованием С1п³-Ав(3-11)а (фиг. 7). Остаток в третьем положении не затрагивался при этом расщеплении и поэтому становился более пригодным для модификации другими ферментами, т.е. ОС. Как и ожидалось, катализ можно было полностью подавлять с помощью Уа1-Ругг (фиг. 8).

2. Образование рС1и³-Ав(3-11)а из С1п³-Ав(3-11)а посредством ОС-катализа в гомогенатах гипофиза и его предупреждение с помощью 1,10-фенантролина.

Глутаминилциклаза, присутствующая в гомогенате свиного гипофиза, катализирует превращение С1п³-Ав(3-11)а в [рС1и³]Ав(3-11)а (фиг. 9).

Образование [рС1и³]Ав(3-11)а ингибировалось при добавлении 1,10-фенантролина (фиг. 10).

3. Последовательный ЭР IV- и ОС-катализ, приводящий в образованию [рС1и³)Ав(3-11)а, и его предупреждение с помощью Уа1-Ругг и 1,10-фенантролина.

Образование [рС1и³]Ав(3-11)а из С1п³-Ав(1-11)а происходило после последовательного катализа с помощью ЭР IV и ОС при оценке в неочищенном гомогенате свиного гипофиза с добавлением ЭР IV из свиной почки (фиг. 11).

Образования [рС1и³]Ав(3-11)а не происходило, когда добавляли ингибитор ОС 1,10-фенантролин (фиг. 12) или ингибитор ЭР IV Уа1-Ругг (фиг. 13). При аминопептидазном расщеплении и последующей циклизации остатка глутамина происходит образование небольших количеств [рС1и³]Ав(3-11)а, о чем свидетельствует образование С1п³-Ав(2-11)а.

4. Образование [рС1и³]Ав(3-11)а в неочищенном гомогенате гипофиза в результате катализа аминопептидазой(ами).

Из-за образования [рС1и³]Ав(3-11)а, не зависящего от ЭР Ш-катализа, изучали расщепление С1п³-Ав(1-11)а в неочищенном гомогенате гипофиза без добавления ЭР IV (фиг. 14). Как и ожидалось, из данных, представленных в разделе 4, было обнаружено образование [рС1и³]Ав(3-11)а. Эти данные свидетельствуют о том, что расщепление С1п³-Ав(1-11)а может являться также результатом катализа аминопептидазой(ами), что приводит к образованию [рС1и³]Ав(3-11)а. Таким образом, результаты, свидетельствующие о том, что в этой ткани образование пироглутамила является конечной точкой расщепления Ν-концевых пептидов, подтверждают также роль ОС в формировании бляшек.

Пример 9. Превращение С1п³-Ав(3-11)а; -(3-21)а и -(3-40) с помощью рекомбинантной человеческой ОС.

Все изученные полученные из С1п³-Ав пептиды эффективно превращались с помощью человеческой ОС в соответствующие пироглутамильные формы (табл. 9). Из-за плохой растворимости С1п³-Ав(3-21)а и С1п³-Ав(3-40) в водном растворе, их изучение проводили в присутствии 1% ДМСО. Однако более высокая растворимость С1п³-Ав(3-11)а позволила проводить кинетический анализ катализируемого ОС превращения в присутствии ДМСО и без него (табл. 9). Взятые в совокупности результаты изучения Ав-пептидов, состоящих из 8, 18 и 37 аминокислот, в качестве субстратов ОС (см. табл. 9) подтвердили данные о том, что активность человеческой ОС повышается с увеличением длины ее субстратов. Таким образом, на основе данных о значении констант специфичности можно заключить, что С1п¹-гастрин, С1п^!-нейротензин, С^-СпКИ являются одними из лучших субстратов ОС. Аналогично этому установлено, что для С1п³-Ав(3-40) и глюкагона, которые являются наиболее крупными из изученных субстратов ОС, обнаружены высокие значения констант скорости реакции второго порядка (449 и 526 мМ^-1 с^-1 соответственно) даже в присутствии 1% ДМСО (табл. 9).

Важным представляет тот факт, что кинетические параметры, характеризующие превращение изученных амилоидных пептидов, не изменялись существенно с увеличением размера, что позволяет предположить не очень существенную роль С-концевой части Ав в ОС-катализе. Таким образом, из-за лучшей растворимости и простоты использования в экспериментах дополнительные изучения, касающиеся Ν-концевого аминопептидазного процессинга этих пептидов, проводили с применением фрагментов Ав меньшего размера, таких как С1п³-Ав(1-11)а, С1п³-Ав(3-11)а и Ав(3-11)а.

- 42 010108

Таблица 9

Кинетические параметры, характеризующие превращение Ν-концевых содержащих С1п пептидов с помощью рекомбинантной человеческой ОС в буферном растворе, содержащем 1% ДМСО

Пептид	Км (мкМ)	)	ксаТ/Км (мМ'с1)
Ο1η3-Αβ(3-11)а	87 ±3*	55 ± 1*	632 ± 10#
О1п3-Ар(3-11)а	155 ± 4	41,4 ±0,4	267 ± 4
Сг1п3-Ар(3-21)а	162 ± 12	62 ±3	383 ± 10
Ο1η3-Αβ(3-40)	89 ± 10	40 ±2	449 ± 28
глюкагон(3-29)	19 ± 1	10,0 ±0,2	526 ± 17

Определение проводили в отсутствие ДМСО.

Пример 10. Превращение А[3(3-11)а и А[3(3-21)а с помощью рекомбинантной человеческой ОС.

Инкубация А[3(3-11)а и А[3(3-21)а в присутствии ОС позволила установить, что в отличие от данных, приведенных в ранее опубликованных работах, содержащие глутамат пептиды также могут служить в качестве субстратов ОС (фиг. 15В и Г). Катализируемое ОС образование [рС1и³]Ав(3-11)а и [рС1ц³]Лв(3-21)а изучали при рН 5,2 и 6,5 соответственно. Если в раствор добавляли ингибитор ОС бензимидазол до начала добавления ОС то превращение субстрата, приводящее к образованию [рС1и³]Ав(3-11)а или [рС1и³]Ав(3-21)а, подавлялось (фиг. 15Д и Е). Если ОС кипятили перед внесением, то образование рС1ц-пептидов было незначительным (фиг. 15А и Б).

Пример 11. Зависимость от рН циклизации Ο1η-βΝΑ и Ο1π-βΝΑ, катализируемой ОС из папайи.

Превращение с помощью ОС из папайи Ο1π-βΝΑ при концентрации вплоть до 2 мМ (что ограничено растворимостью субстрата) удовлетворяет уравнению скорости ферментативной реакции МихаэлисаМентена (фиг. 16). Изучение зависимости превращения от концентрации субстрата для катализируемого ОС превращения Ο1π-βΝΑ, проведенное при рН 6,1-8,5, позволило установить, что для этого содержащего С1и субстрата оба кинетических параметра, т.е. К_м и к_са1, изменялись в зависимости от рН (фиг. 16). Этот результат противоречит данным, описанным ранее для катализируемой ОС циклизации глутамина, согласно которым в данном диапазоне значений рН происходит изменения только значений К_м (Οο1ο1οϋον Μ.Υ., 8опд I., ^апд V. и Ва1етап В.С., АгсН Вюсйет Вюрйук, 309, 1994, с. 300-307).

Поэтому было проведено изучение влияния концентрации протонов на С1ц-и С1п-циклизацию, зависимости от значений рН циклизации С1и-βNΑ и С1η-βNΑ в условиях скорости реакции первого порядка (т.е. при использовании концентраций субстрата существенно более низких, чем значения К_м) (фиг. 17). Для циклизации глутамина рН-оптимум соответствовал рН 8,0, в отличие от циклизации глутаминовой кислоты, для которой рН-оптимум находился при рН 6,0. Поскольку константы специфичности в соответствующих рН-оптимумах различались примерно в 80000 раз, соотношение активности ОС и ЕС при значении рН, близком к рН 6,0, составляло примерно 8000.

Изучение неферментативного образования рС1н из С1η-βNΑ при рН 6,0 осуществляли в течение 4 недель, и при этом было установлено, что значение константы скорости реакции первого порядка равно 1,2х10^-7 с^-1. Однако за этот же промежуток времени не обнаружено никакого образования рС1и-βNΑ из С1и-βNΑ, что позволяет оценить, что константа скорости, ограничивающая это превращение, составляет 1,0х10^-9 с^-1.

Пример 12. Процессы инактивации/реактивации фермента.

Аликвоту человеческой ОС (0,1-0,5 мг, 1 мг/мл) инактивировали в течение ночи путем диализа в противотоке 3000-кратного избытка 5 мМ 1,10-фенантролина или 5 мМ дипиколиновой кислоты в 0,05М бис-Трис/НС1-буфере, рН 6,8. Затем инактивирующий агент тщательно удаляли путем диализа (3 цикла, 2000-кратный избыток) образцов в противотоке 0,05М бис-Трис/НС1-буфера, рН 6,8, содержащего 1 мМ ЭДТК. Эксперименты по реактивации осуществляли при комнатной температуре в течение 15 мин, используя ионы Ζη⁴⁴, Μη⁺⁺, Νί'3 Са, К⁺ и Со⁴⁴ в концентрациях 1,0, 0,5, 0,25 мМ в 0,025М бис-Трис-буфере, рН 6,8 содержащем 0,5мМ ЭДТК. Анализ активности ОС проводили в 0,05М Трис/НС1-буфере, рН 8,0, содержащем 2 мМ ЭДТК, для исключения быстрой реактивации следовыми количествами ионов металлов, присутствующих в буферных растворах.

Ингибирование свиной ОС 1,10-фенантролином уже было описано ранее (ВизЬу ^.Н.Т, и др., I. Βίο1. СТеш. 262, 1987, с. 8532-8536, Ваΐетаη К..СЭ, и др., ВюсйетщОу 40, 2001). Однако тот факт, что ЭДТК оказывает активирующее действие на рС-катализ, позволяет предположить, что ингибирование фенантролином не обусловлено образованием хелатных комплексов с металлами (ВикЬу ХУ.Н.Т и др., I. Вю1. СТеш. 262, 1987, с. 8532-8536, Βаΐетаη К..С.Т, и др., ВюсйетщОу 40, 2001). Помимо ингибирования 1,10-фенантролином катализируемая человеческой ОС циклизация субстрата снижалась в присутствии дипиколиновой кислоты и 8-гидроксихинолина, других ингибиторов металлоферментов. Эти хелаторы конкурентно и в зависимости от времени ингибировали ОС, т.е. было обнаружено конкурентное ингибирование активности уже в начале реакции, и активность продолжала снижаться при пролонгированной инкубации с соединениями (фиг. 18, 19). Важным представляется тот факт, что ЭДТК не обладает замет

- 43 010108 ным ингибированием, вне зависимости от продолжительности инкубации или любых иных условий.

Человеческая ОС практически полностью инактивировалась после продолжительного диализа в противотоке 5 мМ 1,10-фенантролина или 5 мМ дипиколиновой кислоты. После повторного диализа в течение ночи в противотоке не содержащих хелатор буферных растворов активность ОС частично реактивировалась, достигая 50-60%. Однако при диализе в противотоке буферов, содержащих 1 мМ ЭДТК, не происходило никакой реактивации.

Практически полное восстановление активности ОС после инактивации либо дипиколиновой кислотой, либо 1,10-фенантролином, достигали путем инкубации белка в течение 10 мин с 0,5 мМ Ζη8Ο₄ в присутствии 0,5 мМ ЭДТК (фиг. 20). Частичное восстановление активности ОС было получено также с использованием для реактивации ионов Со⁴⁴ и Мп⁴⁴. Даже в присутствии 0,25 мМ Ζη⁺⁺ могла проходить реактивация вплоть до 25% от исходной активности. Никакой реактивации не происходило при использовании ионов Νί'\ Са⁺⁺ или К⁺⁺. Аналогично этому инкубация полностью активной ОС с этими ионами не оказывала никакого воздействия на ферментативную активность.

Claims (30)

1. Применение ингибитора глутаминилциклазы (ОС) для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания, выбранного из группы, включающей семейную британскую деменцию и семейную датскую деменцию, отличающееся тем, что ингибируют превращение остатка глутаминовой кислоты в остаток пироглутаминовой кислоты на Ν-конце по меньшей мере одного субстрата ОС, выбранного из ОШ’-АЭап и С1и'-АВг1.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что ингибитор ОС имеет общую формулу 1 включая все фармацевтически приемлемые соли и стереоизомеры, где К¹-Я⁶ независимо друг от друга обозначают Н либо разветвленную или неразветвленную алкильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкенильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкинильную цепь, карбоцикл, арил, гетероарил, гетероцикл, азааминокислоту, аминокислоту или ее миметик, пептид или его миметик; все вышеперечисленные остатки необязательно могут быть замещены и п может обозначать 0 или 2.

3. Применение ингибитора ОС для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания, выбранного из группы, включающей рак двенадцатиперстной кишки, связанный или не связанный с заражением Не1юЬае1ег ру1оп, колоректальный рак и синдром Золлингера-Эллисона, отличающееся тем, что ингибируют превращение остатка глутамина в остаток пироглутаминовой кислоты на Ν-конце по меньшей мере одного субстрата ОС, выбранного из О1и¹-гастринов (17 и 23).

4. Применение по п.3, отличающееся тем, что ингибитор ОС имеет общую формулу 1 включая все фармацевтически приемлемые соли и стереоизомеры, где Я¹-Я⁶ независимо друг от друга обозначают Н либо разветвленную или неразветвленную алкильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкенильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкинильную цепь, карбоцикл, арил, гетероарил, гетероцикл, азааминокислоту, аминокислоту или ее миметик, пептид или его миметик; все вышеперечисленные остатки необязательно могут быть замещены и п может обозначать 0-2, при условии, что соединение \УЯ1065 формулы исключается.

- 44 010108

5. Применение по одному из предыдущих пунктов, в котором ингибитор ОС представляет собой соединение, выбранное из

6. Применение по одному из предыдущих пунктов, в котором ингибитор ОС применяют в сочетании по меньшей мере с одним общепринятым носителем и/или эксципиентом.

7. Применение по одному из предыдущих пунктов, в котором ингибитор ОС применяют в сочетании с ингибитором ЭР IV.

8. Применение по одному из предыдущих пунктов, в котором ингибитор ЬР IV выбирают из группы, включающей Ь-треоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилтиазолидин,

Ь-треоизолейцилпирролидин, Ь-аллоизолейцилпирролидин, NVР-^РР728А (1-[[[2-[{5-цианпиридин-2ил}амино]этил]амино]ацетил]-2-циан-(8)-пирролидин), БАР-237 (1-[(3-гидроксиадамант-1иламино)ацетил]пирролидин-2(8)-карбонитрил), Т8Ь-225 (триптофил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3карбоновая кислота), РЕ-999011, Ν-валилпролил, О-бензоилгидроксиламин, аланилпирролидин, Н-Акппирролидин, Н-Акп-тиазолидин, Н-Акр-пирролидин, Н-Акр-тиазолидин, Н-Акр(ИНОН)-пирролидин, Н-Акр(ИНОН)-тиазолидин, Н-О1и-пирролидин, Н-О1и-тиазолидин, Н-61и(ХНОН)-пирролидин, Н-61и(ХНОН)-тиазолидин, Н-Н1к-пирролидин, Н-Н1к-тиазолидин, Н-Рго-пирролидин, Н-Рго-тиазолидин, Н-Пе-азидидин, Н-Пе-пирролидин, Н-Ь-алло-Пе-тиазолидин, НАаЪпирролидин и НАаЪтиазолидин, 2-аминооктановая кислота-Рго-Пе, АЬи-Рго-Пе, А1Ь-Рго-Пе, А/е-Рго-Пе, Сйа-Рго-Пе, Пе-Нур-Пе, Пе-Ргоалло-Пе, Пе-Рго-трет-бутил-61у, Пе-РгоАа1, Ме-Рго-Пе, Жа-Рго-Пе, Огп-Рго-Пе, Рйе-Рго-Пе, Рйд-Рго-Пе, Р1р-Рго-Пе, 8ег(В71)-Рго-Пе, 8ег(Р)-Рго-Пе, 8ег-Рго-Пе, трет-бутил-61у-Рго-0Аа1, трет-бутил-61у-Рго-01у, трет-бутил-61у-Рго-Пе, трет-бутил-61у-Рго-Пе-ат1бе, трет-бутил-61у-Рго-трет-бутил-01у, трет-бутил-О1уРгоАа1, ТЬг-Рго-Не, Тю-Рго-Пе, Тгр-Рго-Пе, Туг(Р)-Рго-Пе, Туг-Рго-алло-Пе, Vа1-Р^о-алло-I1е, Vа1-Р^о-третбутил-О1у, Vа1-Р^о-Vа1 или их фармацевтически приемлемые соли.

9. Применение по одному из предыдущих пунктов, в котором ингибитор ЬР IV выбирают из группы, включающей гидробромид 2-метилкарбонил-1-И-[(Ь)-аланил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-метилкарбонил-1-И-[(Ь)-валинил-(Ь)-пролил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-[(ацетилоксиметил)карбонил]-1-И-[(Ь)-аланил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-[бензоилоксиметил)карбонил]-1-Ы-[{(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, 2-{[(2,6-дихлорбензил)тиометил]карбонил}-1-Н-[{(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидин, гидробромид 2-[бензоилоксиметил)карбонил]-1-Ы-[глицил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, трифторацетат 2-[([1,3]-тиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-Ы-[{(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)пирролидина, трифторацетат 2-[(бензотиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-Ы-[Ж{(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)пирролидина, трифторацетат 2-[(бензотиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-Ы-[{(Ь)-аланил}глицил]-(28)-пирролидина, трифторацетат 2-[(пиридин-2-ил)карбонил]-1-Ы-[№{(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, хлорид 1-циклопентил-3-метил-1-оксо-2-пентанаминия, хлорид 1-циклопентил-3-метил-1-оксо-2-бутанаминия, хлорид 1-циклопентил-3,3-диметил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 1-циклогексил-3,3-диметил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 3-(циклопентилкарбонил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолиния, хлорид Ж(2-циклопентил-2-оксоэтил)циклогексанаминия или другие их фармацевтически приемлемые соли.

10. Применение по одному из пп.1-6, в котором ингибитор ОС используют в сочетании с ингибитором подобного ЬР IV ферментом, выбранным из группы, включающей протеин α, участвующий в активации фибробластов, дипептидилпептидазу IV β, белок, подобный дипептидиламинопептидазе, Ν-ацетилированную α-связанную кислотную дипептидазу, пролиндипептидазу покоящихся клеток, дипептидилпептидазу II, аттрактин, белок, родственный дипептидилпептидазе IV (ЬРР 8), ЭРЫ (ЬРХ, ЭР6), ОРЬ2, ЬРР 9 и дипептидилпептидазу 10.

- 45 010108

11. Применение по одному из предыдущих пунктов, в котором ингибитор РС представляет собой конкурентный ингибитор.

12. Применение по одному из предыдущих пунктов для парентерального, энтерального или орального введения.

13. Применение по одному из предыдущих пунктов для орального введения.

14. Способ лечения заболевания, выбранного из группы, включающей семейную британскую деменцию и семейную датскую деменцию, который заключается в том, что млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ингибитора РС, отличающийся тем, что ингибируют превращение остатка глутаминовой кислоты в остаток пироглутаминовой кислоты на Ν-конце по меньшей мере одного субстрата РС, выбранного из С1и'-АЭап и С1и¹-АВг1.

15. Способ по п.14, в котором ингибитор РС имеет общую формулу включая все фармацевтически приемлемые соли и стереоизомеры, где К¹-К⁶ независимо друг от друга обозначают Н либо разветвленную или неразветвленную алкильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкенильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкинильную цепь, карбоцикл, арил, гетероарил, гетероцикл, азааминокислоту, аминокислоту или ее миметик, пептид или его миметик; все вышеперечисленные остатки необязательно могут быть замещены и п может обозначать 0, 1 или 2.

16. Способ лечения заболевания, выбранного из группы, включающей рак двенадцатиперстной кишки, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас!ег ру1оп, колоректальный рак и синдром Золлингера-Эллисона, который заключается в том, что млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество ингибиора РС, отличающийся тем, что ингибируют превращение остатка глутамина в остаток пироглутаминовой кислоты на Ν-конце по меньшей одного субстрата РС, выбранного из С1и¹-гастринов (17 и 34).

17. Способ по п.16, в котором ингибитор РС имеет общую формулу включая все фармацевтически приемлемые соли и стереоизомеры, где К¹-К⁶ независимо друг от друга обозначают Н либо разветвленную или неразветвленную алкильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкенильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкинильную цепь, карбоцикл, арил, гетероарил, гетероцикл, азааминокислоту, аминокислоту или ее миметик, пептид или его миметик; все вышеперечисленные остатки необязательно могут быть замещены и п может обозначать 0, 1 или 2, при условии, что соединение АК1065 формулы исключается.

- 46 010108

18. Способ по одному из пп.14-17, в котором ингибитор ОС представляет собой соединение, выбранное из

19. Способ лечения заболевания, выбранного из группы, включающей семейную британскую деменцию и семейную датскую деменцию у млекопитающего, который заключается в том, что млекопитающему вводят фармацевтическую композицию, где фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один ингибитор ОС необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами.

20. Способ по п.19, в котором ингибитор ОС имеет общую формулу 1 включая все фармацевтически приемлемые соли и стереоизомеры, где К¹-К⁶ независимо друг от друга обозначают Н либо разветвленную или неразветвленную алкильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкенильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкинильную цепь, карбоцикл, арил, гетероарил, гетероцикл, азааминокислоту, аминокислоту или ее миметик, пептид или его миметик; все вышеперечисленные остатки необязательно могут быть замещены и п может обозначать 0, 1 или 2.

21. Способ лечения заболевания, выбранного из группы, включающей рак двенадцатиперстной кишки, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас1ег ру1оп, колоректальный рак и синдром Золлингера-Эллисона, у млекопитающего, который заключается в том, что млекопитающему вводят фармацевтическую композицию, где фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один ингибитор ОС необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами.

22. Способ по п.21, в котором ингибитор ОС имеет общую формулу 1 включая все фармацевтически приемлемые соли и стереоизомеры, где К¹-К⁶ независимо друг от друга обозначают Н либо разветвленную или неразветвленную алкильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкенильную цепь, разветвленную или неразветвленную алкинильную цепь, карбоцикл, арил, гетероарил, гетероцикл, азааминокислоту, аминокислоту или ее миметик, пептид или его миметик; все вышеперечисленные остатки необязательно могут быть замещены и п может обозначать 0, 1 или 2, при условии, что соединение ХК1065 формулы исключается.

- 47 010108

Н-Αзр-тиазолидин,

Н-61и-тиазолидин, Н-Н1з-тиазолидин, аланилпирролидин, НАзп-пирролидин, Н-Αзη-тиазолидин,

Н-Αзр(NНΟН)-пирролидин,

Н-С1ц(ЧН0Н)-пирролидин,

Н-Ρ^ο-пирролидин, Н-Ρ^ο-тиазолидин,

Н-Αзр(NНΟН)-тиазолидин,

Н-61и(ЧН0Н)-тиазолидин,

Н-11е-азидидин,

23. Способ по одному из пп.14-22, в котором ингибитор ОС вводят в сочетании с ингибитором ΌΡ IV.

24. Способ по одному из пп.14-23, в котором ингибитор ΌΡ IV выбирают из группы, включающей

Ь-треоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-треоизолейцилпирролидин,

Ь-аллоизолейцилпирролидин, NVЕ-^ΡΡ728Α (1-[[[2-[{5-цианпиридин-2-ил}амино]этил]амино]ацетил]-2циан-(8)-пирролидин), ΕΑΕ-237 (1-[(3-гидроксиадамант-1-иламино)ацетил]пирролидин-2(8)карбонитрил), Τ8Ό-225 (триптофил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота), ЕЕ-999011, Ν-валилпролил, О-бензоилгидроксиламин, НАзр-пирролидин, Н-61и-пирролидин, Н-Н1з-пирролидин,

Н-Пе-пирролидин, Н-Ь-алло-Пе-тиазолидин, Н-Уа1-пирролидин и Н^а1-тиазолидин, 2-аминооктановая кислота-Его-Ие, ΑЬи-Ρ^ο-I1е, Α^Ь-Ρ^ο-I1е, Αζе-Ρ^ο-I1е, ΟНа-Е^ο-I1е. Пе-Нур-Пе, Ие-Его-алло-Ие, Ие-Его-третбутил-О1у, I1е-Ρ^ο-Vа1, Ν^-Ριό-[^, Nνа-Ρ^ο-I1е, Ο^η-Ρ^ο-I1е, ЕНе-Е^ο-I1е. ΡЬд-Ρ^ο-I1е, Ρ^р-Ρ^ο-I1е, 8е1Х^1)ΡΐΌ-Пе, 8е^(Ρ)-Ρ^ο-I1е, 8е^-Ρ^ο-I1е, трет-бутил-61у-Ρ^ο-^-Vа1, трет-бутил-61у-Ρ^ο-61у, '^τ^τμ-Ο^-ΡιόПе, трет-бутил-61у-Ρ^ο-I1е-ат^άе, трет-бутил-61у-Ρ^ο-трет-бутил-61у, трет-бутил-61у-Ρ^ο-Vа1, ΤН^-Е^ο-I1е. Τ^с-Ρ^ο-I1е, Τ^р-Ρ^ο-I1е, Τу^(Ρ)-Ρ^ο-I1е, Τу^-Ρ^ο-алло-I1е, Vа1-Ρ^ο-алло-I1е, Vа1-Ρ^ο-трет-бутил-61у, Vа1-Ρ^ο-Vа1 или их фармацевтически приемлемые соли.

25. Способ по одному из пп.14-23, в котором ингибитор ΌΡ IV выбирают из группы, включающей гидробромид 2-метилкарбонил-1-Н-[(Ь)-аланил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-метилкарбонил-1-Н-[(Ь)-валинил-(Ь)-пролил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-[(ацетилоксиметил)карбонил]-1-Н-[(Ь)-аланил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-[бензоилоксиметил)карбонил]-1-Ы-[ {(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, 2-{[(2,6-дихлорбензил)тиометил]карбонил}-1-Н-[{(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидин, гидробромид 2-[бензоилоксиметил)карбонил]-1-Ы-[глицил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, трифторацетат пирролидина, трифторацетат

2-[([1,3]-тиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-Н-[{(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)2-[(бензотиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-Ы-|П-{(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)пирролидина, трифторацетат 2-[(бензотиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-Ы-[{(Ь)-аланил}глицил]-(28)-пирролидина, трифторацетат 2-[(пиридин-2-ил)карбонил]-1-Н-[№{(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, хлорид 1-циклопентил-3-метил-1-оксо-2-пентанаминия, хлорид 1-циклопентил-3-метил-1-оксо-2-бутанаминия, хлорид 1-циклопентил-3,3-диметил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 1-циклогексил-3,3-диметил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 3 -(циклопентилкарбонил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолиния, хлорид №(2-циклопентил-2-оксоэтил)циклогексанаминия или другие их фармацевтически приемлемые соли.

26. Способ по одному из пп.14-22, в котором ингибитор ОС вводят в сочетании с ингибитором подобного ΌΡ IV фермента, выбранным из группы, включающей протеин α, участвующий в активации фибробластов, дипептидилпептидазу IV β, белок, подобный дипептидиламинопептидазе, Ν-ацетилированную α-связанную кислотную дипептидазу, пролиндипептидазу покоящихся клеток, дипептидилпептидазу II, аттрактин, белок, родственный дипептидилпептидазе IV (ΌΡΡ 8), ΌΡΌ1 (ΌΡΧ, ΌΡ6), ΌΡΌ2, ΌΡΡ 9 и дипептидилпептидазу 10.

27. Способ по одному из пп.14-26, в котором ингибитор ОС представляет собой конкурентный ингибитор.

28. Способ по одному из пп.14-27, в котором млекопитающее представляет собой человека.

29. Способ по одному из пп.14-28, в котором ингибитор ОС или фармацевтическую композицию вводят парентерально, энтерально или орально.

30. Способ по одному из пп.14-29, в котором ингибитор ОС или фармацевтическую композицию вводят орально.