EA009291B1 - Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз - Google Patents

Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз Download PDF

Info

Publication number
EA009291B1
EA009291B1 EA200501700A EA200501700A EA009291B1 EA 009291 B1 EA009291 B1 EA 009291B1 EA 200501700 A EA200501700 A EA 200501700A EA 200501700 A EA200501700 A EA 200501700A EA 009291 B1 EA009291 B1 EA 009291B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
activity
impaired
cells
acid
substrate
Prior art date
Application number
EA200501700A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501700A1 (ru
Inventor
Ханс-Ульрих Демут
Торстен Хоффманн
Андре И. Нистрой
Штефан Шиллинг
Ульрих Хайзер
Original Assignee
Пробиодруг Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Пробиодруг Аг filed Critical Пробиодруг Аг
Publication of EA200501700A1 publication Critical patent/EA200501700A1/ru
Publication of EA009291B1 publication Critical patent/EA009291B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4178—1,3-Diazoles not condensed 1,3-diazoles and containing further heterocyclic rings, e.g. pilocarpine, nitrofurantoin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4188—1,3-Diazoles condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. biotin, sorbinil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4192—1,2,3-Triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/12—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/06—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/572—Five-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/576—Six-membered rings
    • C07F9/59—Hydrogenated pyridine rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6503—Five-membered rings
    • C07F9/6506—Five-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings

Abstract

В изобретении описаны новые физиологические субстраты глутаминилциклазы млекопитающих (QC, КФ 2.3.2.5), новые эффекторы QC, способы скрининга таких эффекторов и применение указанных эффекторов и фармацевтических композиций, содержащих такие эффекторы, для лечения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности QC. Предпочтительные композиции дополнительно содержат ингибиторы DP IV или подобных DP IV ферментов для лечения или облегчения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности QC и DP IV.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к глутаминилциклазе (ОС. КФ 2.3.2.5), которая катализирует внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (5-оксопролин, рО1и*) с выделением в свободном состоянии аммиака и внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамата с образованием пироглутаминовой кислоты с выделением в свободном состоянии воды.
При создании настоящего изобретения были идентифицированы ОС млекопитающих в качестве металлоферментов, выявлены новые физиологические субстраты ОС в организме млекопитающих и разработаны пути применения эффекторов ОС и фармацевтических композиций, содержащих эффекторы ОС. для лечения состояний, которые можно лечить путем модуляции ОС-активности. Кроме того, установлено, что взаимодействие с металлом является важным подходом для создания ингибиторов ОС.
Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является применение эффекторов ОС-активности в сочетании с ингибиторами ΌΡ IV (дипептидилпептидаза IV) или ΌΡ ΐν-подобных ферментов для лечения или облегчения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности ОС и/или ΌΡ IV.
Предложен также способ скрининга для идентификации и отбора эффекторов ОС-активности.
Предпосылки создания изобретения
Глутаминилциклаза (ОС, КФ 2.3.2.5) катализирует внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (5-оксопролин, рО1и*) с выделением в свободном состоянии аммиака. ОС впервые была выделена Меззег из латекса тропического растения Сапса рарауа в 1963г. (Меззег М. №Шге 4874, 1963, с. 1299). Спустя 24 года соответствующая ферментативная активность была обнаружена в гипофизе животных (ВизЬу Л.Н.1. и др. 1. Βίο1. Сйет. 262, 1987, сс. 8532-8536; Изсйет XV. Н. и 8р1езз 1. Ргос. №Й. Асаб. 8с1. И8А 84, 1987, сс. 3628-3632). Для ОС млекопитающих превращение О1п в рО1и с помощью ОС было обнаружено для предшественников ТКН (тиреолиберин) и ОпКН (гонадолиберин) (ВизЬу Л.Н.1. и др. 1. Βίο1. Сйет. 262, 1987, сс. 8532-8536; Изсйет Л.Н. и 8р1езз 1. Ргос. №11. Асаб. 8ст И8А 84, 1987, сс. 3628-3632). Кроме того, предварительные эксперименты по выявлению локализации ОС позволили выявить ее совместную локализацию с предполагаемыми продуктами катализа в бычьем гипофизе, что является дополнительным доказательством ее функции в синтезе пептидных гормонов (Воскегз Т.М. и др. 1. №игоепбосгшо1. 7, 1995, сс. 445-453). В противоположность этому, физиологическая функция растительной ОС все еще остается неясной. Предполагается, что фермент из С. рарауа играет роль в защите растений от патогенных микроорганизмов (Е1 Моиззаош А. и др. Се11 Мо1. Ь1Ге 8с1. 58, 2001, сс. 556-570). В настоящее время на основе сравнительного анализа последовательностей были выявлены предполагаемые ОС из других растений (ЭаЫ 8.XV. и др., Рто1еш Ехрг. РипГ. 20, 2000, сс. 27-36). Однако физиологическая функция этих ферментов все еще остается неясной.
Известные выделенные из растений и животных ОС обладают строгой специфичностью в отношении Ь-глутамина в Ν-концевом положении субстратов, и установлено, что их кинетические характеристики описываются уравнением Михаэлиса-Ментена (Рой1 Т. и др., Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 88, 1991, сс. 10059-10063; Сопзако А.Р. и др., Апа1. Вюсйет. 175, 1988, сс. 131-138; Со1о1оЬоу М.У. и др., Вю1. Сйет. Норре. 8еу1ег. 377, 1996, сс. 395-398). Однако сравнение первичной структуры ОС из С. рарауа и высококонсервативных ОС млекопитающих не выявило никакой гомологии последовательностей (Эай1 8.Л. и др., Рто1еш Ехрг. РипГ. 20, 2000, сс. 27-36). В то время, как растительные ОС, вероятно, принадлежат к новому семейству ферментов (ЭаЫ 8.Л. и др., Рто1еш Ехрг. РипГ. 20, 2000, сс. 27-36), установлено, что ОС млекопитающих обладают выраженной гомологией последовательностей с бактериальными аминопептидазами (Ва1етап К.С. и др., Вюсйет1з1ту 40, 2001, сс. 11246-11250), что позволило сделать заключение о различном эволюционном происхождении ОС из растений и животных.
В ЕР 02011349.4 описаны полинуклеотиды, кодирующие глутаминилциклазу насекомых, а также кодируемые ими полипептиды. В этой заявке описаны также клетки-хозяева, которые содержат экспрессионные векторы, несущие полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении. Выделенные полипептиды и клетки-хозяева, содержащие ОС насекомых, применяют в методах скрининга агентов, которые снижают глутаминилциклазную активность. Установлено, что такие агенты можно применять в качестве пестицидов.
Болезнь Альцгеймера (АБ) характеризуется аномальным накоплением внеклеточных амилоидных бляшек, непосредственно связанных с дистрофичными нейронами, реактивными астроцитами и микроглией (Теггу Β.Ό. и Ка1/тап К., Апп. №иго1. 14, 1983, сс. 497-506; О1еппет О.О. и Лопд С.Л., Вюсйет. Вюрйуз. Кез. Сотт. 120, 1984, сс. 885-890; 1п1адак1 8. и др. 1. №иго1ттипо1. 24, 1989, сс. 173-182; Еипа1о Н. и др., Ат. 1. Ра1йо1. 152, 1998, сс. 983-992; 8е1кое Ό.Ι., Рйузю1. Неу. 81, 2001, сс. 741-766). Амилоид-βпептиды (Λβ-пептиды) являются основными компонентами старческих бляшек, и считается, что они непосредственно участвуют с патогенезе и развитии АБ, эта гипотеза подтверждается генетическими исследованиями (О1епиег О.О. и Лопд С.Л., Вюсйет. Вюрйуз. Кез. Сотт. 120, 1984, сс. 885-890; Вогсйе11 Ό.Β. и др., №игоп. 17, 1996, сс. 1005-1013; Ьетете С. А. и др., №1. Меб. 2, 1996, сс. 1146-1150; Мапп О.М. и 1теа1зиЬо Т. №итобедепега1юп 5, 1996, сс. 115-120; Сйтоп М. и др., №1. Меб. 3, 1997, сс. 67-72; 8е1кое Ό.Ι., Рйузю1. Неу. 81, 2001, сс. 741-766 ). Ав образуется в результате протеолитического процессинга βамилоидного белка-предшественника (АРР) (Капд, 1. и др., №1ите 325, 1987, сс. 733-736; 8е1кое Ό.Ι.,
- 1 009291
Тгепбз Се11 ΒιοΙ. 8, 1998, сс. 447-453), который последовательно расщепляется β-секретазой на Ν-конце и γ-секретазой на С-конце Αβ (Наазз С. и 8е1кое Ό.Ι., Се11 75, 1993, сс. 1039-1042; 81топз М. и др., 1. №итозс1. 16, 1996, сс. 899-908). Помимо доминирующих Ав-пептидов, у которых на Ν-конце находится Ь-Азр (Ав 1-42/40), в старческих бляшках присутствует множество гетерогенных укороченных на Ν-конце форм. Установлено, что такие укороченные пептиды обладают более высокой нейротоксичностью ίη νίίτο и у них существенно быстрее происходит агрегация по сравнению с полноразмерными изоформами (Р1ке С.1. и др., 1. Βίο1. СЬет. 270, 1995, сс. 23895-23898). Известно, что у пациентов на ранней стадии семейной АБ (СБА) происходит сверхпроизводство укороченных на Ν-конце пептидов (8а1бо Т.С. и др., №итоп. 14, 1995, сс. 457-466; Виззо С. и др., №1Шге 405, 2000, сс. 531-532), эти пептиды появляются в раннем возрасте в головном мозге пациентов, страдающих синдромом Дауна (ДС), и их количество увеличивается с возрастом (Виззо С. и др. ΡΕΒ8 Ьей. 409, 1997, сс. 411-416, Виззо С. и др., №итоЬю1. Ό13. 8, 2001, сс. 173-180; Тектап Т.Ь. и др., 1. №игора(Ьо1. Ехр. №ито1. 57, 1998, сс. 76-94). И, наконец, их количество отражает развитие более серьезной формы заболевания (Виззо С. и др., ΡΕΒ8 Ьей. 409, 1997, сс. 411-416). Дополнительные посттрансляционные процессы могут также модифицировать Ν-конец в результате изомеризации или рацемизации аспартата в положении 1 и 7 и циклизации глутамата на остатках 3 и 11. Пироглутаматсодержащие изоформы в положении 3 |ρΟ1υ3’|Αβ3-40/42| представляют собой доминирующие формы на их долю приходится примерно 50% общего количества укороченных на Ν-конце видов Ав в старческих бляшках (Мой Н. и др., 1. Βώ! СЬет. 267, 1992, сс. 17082-17086, 8а1бо Т.С. и др., №итоп. 14, 1995, сс. 457-466; Виззо С. и др., ΡΕΒ8 Ьей. 409, 1997, сс. 411-416; Тектап Т.Ь. и др., 1. №итора1Ьо1. Ехр. №ито1. 57, 1998, сс. 76-94; Себбез 1.А. и др., №итоЬю1. АДпд 20, 1999, сс. 75-79; Напдауа Υ. и др., Β^οсЬет. ЕюрЬуз. Вез. Соттип. 276, 2000, сс. 422-427), и они присутствуют также в преамилоидных повреждениях (Ьа1о\\'зк| М. и др., 1. ΒώΙ СЬет. 271, 1996, сс. 33623-33631). Накопление пептидов ΑβΝ3φΕ), вероятно, является следствием структурной модификации, которая усиливает агрегацию и придает устойчивость к большинству аминопептидаз (8а1бо Т.С. и др., №итоп. 14, 1995, сс. 457-466; Тектап Т.Ь. и др., 1. №итосЬет. 73, 1999, сс. 1584-1589). Эти данные являются ключом к объяснению основной роли пептидов ΑβΝ3φΕ) в патогенезе АБ. Однако пока имеется относительно мало сведений об их нейротоксичности и способности к агрегации (Не А. и Еаггслу С.Е, Β^οсЬет^зί^у 38, 1999, сс. 10871-10877; Тектап Т.Ь. и др., 1. №игосЬет. 73, 1999, сс. 1584-1589). Более того, совершенно нет данных о действии этих изоформ на глиальные клетки и о глиальном ответе на эти пептиды, хотя связь активированной глии со старческими бляшками точно установлена и глия может активно участвовать в накоплении амилоидных отложений. В современных исследованиях изучали токсичность, агрегацию и катаболизм пептидов Αβ142, Αβ1-40, |ρΟ1υ3]Αβ3-42 и [р61и3]Αβ3-40 в культурах клеток нейронов и глии, и было установлено, что модификация пироглутамата усиливает токсичные свойства Αβ-пептидов и ингибирует также их расщепление культивируемыми астроцитами. 8Ыто1аш с соавторами изучали образование пептидов |ρΟ1π3]Αβ в первичных кортикальных нейронах, зараженных вирусом Синбис ш \йго. Эти авторы сконструировали путем аминокислотной замены и делеции комплементарные ДНК амилоидного белка-предшественника, которые кодировали потенциальный предшественник |ρΟ1π3]Αβ. Для одного из искусственных предшественников, у которого на Ν-конце находился остаток глутамина вместо глутамата, присутствующего во встречающемся в естественных условиях предшественнике, сделано предположение о спонтанном превращении или ферментативном превращении с помощью глутаминилциклазы в пироглутамат. Механизм циклизации Ν-концевого глутамата в положении 3 во встречающемся в естественных условиях предшественнике пептида |ρ61и3]Αр ш νί\Ό не выяснен (8Ыго1аш К., ТзиЬик1 8., Бее Н.Е, Магиуата К. и 8а1бо Т.С., №итозск Ьей. 327, 2002, сс. 25-28).
Дипептидилпептидаза IV (ЭР IV) представляет собой осуществляющую расщепление в положении после пролина (в меньшей степени после аланина, после серина или после глицина) сериновую протеазу, обнаруженную в различных тканях организма, включая почку, печень и кишечник, и она отщепляет Νконцевые дипептиды от пептидной цепи. В настоящее время установлено, что ЭР IV играет важную роль в метаболизме нейропептидов, Т-клеточной активации, прикреплении раковых клеток к эндотелию и в проникновении ВИЧ в лимфоидные клетки (см. АО 02/34242, АО 02/34243, АО 03/002595 и АО 03/002596).
Известно, что ингибиторы ΌΡ IV можно применять для лечения нарушенной толерантности к глюкозе и сахарного диабета (международная заявка на патент, публикация АО 99/61431, Ребегзоп В.А. и др., Э1аЬе1ез 47, 1998, сс. 1253-1258 и Раи1у В.Р. и др., Ме1аЬоЬзт 48, 1999, сс. 385-389). В частности, в АО 99/61431 описаны ингибиторы ЭР IV, содержащие аминокислотный остаток и тиазолидиновую или пирролидиновую группу, и их соли, прежде всего Ь-треоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-треоизолейцилпирролидин, Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилпиролидин и их соли.
Дополнительными примерами низкомолекулярных ингибиторов дипептидилпептидазы IV являются такие агенты, как тетрагидроизохинолин-3-карбоксамидные производные, Ν-замещенные 2-цианпиролы и -пирролидины, №(№-замещенный глицил)-2-цианпирролидины, №(замещенный глицил)тиазолидины, №(замещенный глицил)-4-циантиазолидины, аминоацилборпролильные ингибиторы, сконденсированные с циклопропилом пирролидины и гетероциклические соединения. Ингибиторы дипептидилпептидазы IV описаны в И8 6380398, И8 6011155; И8 6107317; И8 6110949; И8 6124305; И8 6172081; АО
- 2 009291
95/15309, АО 99/61431, АО 99/67278, АО 99/67279, ΌΕ 19834591, АО 97/40832, ΌΕ 19616486 С2, АО 98/19998, АО 00/07617, АО 99/38501, АО 99/46272, АО 99/38501, АО 01/68603, АО 01/40180, АО 01/81337, АО 01/81304, АО 01/55105, АО 02/02560 и АО 02/14271, АО 02/04610, АО 02/051836, АО 02/068420, АО 02/076450; АО 02/083128, АО 02/38541, АО 03/000180, АО 03/000181, АО 03/000250, АО 03/002530, АО 03/002531, АО 03/002553, АО 03/002593, АО 03/004496, АО 03/024942 и АО 03/024965, содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки, прежде всего, касательно этих ингибиторов, их определения, применения и получения.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к новым физиологическим субстратам ОС в организме млекопитающих, таким как Άβ3-40/42, [Ο1η3]Άβ3-40/42, [Ο1υ11]Άβ11-40/42, [Ο1η11]Άβ11-40/42, [С1и1]гастрин, [С1и1]нейротензин, [С1и1]ЕРР, [С1и1]ССЬ 2, [С1и1]ССЬ 7, [С1и1]ССЬ 8, [С1и1]ССЬ 16, [С1и1]ССЬ 18, [С1и1]фракталкин, [С1и!]орексин А, [С1и3]глюкагон3-29 и [С1и5] субстанция Р5-11, и к применению эффекторов ОС и фармацевтических композиций, содержащих эффекторы ОС. для лечения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности ОС.
С помощью экспериментов по ингибированию установлено, что человеческая ОС представляет собой металлзависимую трансферазу. Апофермент ОС может проявлять наибольшую реакционную способность в присутствии ионов цинка, и металлсвязывающий мотив цинкзависимых аминопептидаз присутствует также в человеческой ОС. Соединения, которые взаимодействуют с активным сайтом связывания металла, являются эффективными ингибиторами.
При создании изобретения неожиданно было установлено, что рекомбинантная человеческая ОС, а также активность ОС в экстрактах, выделенных из головного мозга, катализирует циклизацию как Ν’концевого глутаминила, так и глутамата. В этом исследовании убедительно доказано, что для катализируемого циклазой С1и1-превращения оптимальным является значение рН, близкое к 6,0, а для С1и'превращения в рС1и-производное оптимальным является значение рН, близкое к 8,0. Поскольку образование пептидов, родственных рС1и-Ав, можно подавлять путем ингибирования рекомбинантной человеческой ОС и ОС-активности экстрактов, выделенных из гипофиза свиньи, фермент ОС является мишенью для разработки пути лечения болезни Альцгеймера.
Путем введения млекопитающим эффекторов ОС-активности можно предупреждать, или облегчать, или лечить такие состояния, как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, язвенная болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас!ет ру1ог1, патогенные психические состояния, шизофрения, бесплодие, неоплазия, воспалительные реакции хозяина, рак, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенная связанная с гомеостазом регуляция энергетического метаболизма, нарушенная функция вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенная регуляция общей воды организма.
Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов ОС-активности можно стимулировать пролиферацию клеток желудочно-кишечного тракта, предпочтительно пролиферацию слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острую секрецию кислоты и дифференцировку продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток.
Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов ОС-активности можно подавлять пролиферацию миелоидных клеток-предшественников.
Путем введения ингибиторов ОС можно также подавлять мужскую фертильность.
Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является применение эффекторов ОС-активности в сочетании с ингибиторами ΌΡ IV или ферментов, подобных ΌΡ IV, для лечения или облегчения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности ОС и/или ΌΡ IV.
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, предназначенным для парентерального, энтерального или орального введения, которые содержат по меньшей мере один эффектор ОС необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами или которые содержат по меньшей мере один эффектор РС в сочетании по меньшей мере с одним ингибитором ΌΡ IV необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами.
Разработаны также способы скрининга для идентификации и отбора эффекторов ОС.
Краткое описание чертежей
Эти и другие аспекты настоящего изобретения проиллюстрированы ниже со ссылкой на чертежи, на которых показано:
на фиг. 1 - кривые, характеризующие процесс циклизации Н-С1и-А1а-ОН, катализируемой человеческой ОС по снижению абсорбции при 340 нм. Образцы содержали 0,3 мМ НАДН/Н+, 14 мМ α-кетоглутаровую кислоту, 30 ед./мл глутаматдегидрогеназы и 1 мМ Н-С1и-А1а-ОН. На кривых Ά-Г представлены результаты, полученные с использованием различных концентраций ОС: Ά, 10 мед. (0,001 стандартной единицы)/мл, Б, 5 мед./мл, В, 2,5 мед./мл. На кривой Г представлены результаты, полученные без ОС. Обнаружена линейная зависимость полученной активности от концентрации ОС (вклейка);
на фиг. 2 - зависимость от рН активности человеческой ОС и ОС из папайи (вставка), которую опре
- 3 009291 деляли в условиях скорости реакции первого порядка с использованием в качестве субстрата ΟΙη-βΝΆ. Для человеческой ^С использовали буферную систему, обеспечивающую постоянную ионную силу, предложенную ЕШк и Мотков, в состав которой входили 25 мМ МЕ8, 25 мМ уксусная кислота и 50 мМ Трис (ЕШк К.1. и Мотков 1.Р., Ме1йобк Εηζνιηοΐ. 87, 1982, сс. 405-426). Из-за некоторого ингибирующего действия Трис на фермент ОС из папайи изучали с использованием 50 мМ Морк-буфера. Ионную силу доводили до 0,05М, добавляя №С1. Профили скорости реакции оценивали путем аппроксимации с использованием модели, основанной на концепции диссоциирующих групп. Для ОС из папайи при аппроксимации данных с использованием модели однократной диссоциации установлено, что значение рКа составляло 7,13±0,03;
на фиг. 3 - данные о воздействии значений рН на стабильность ОС из латекса папайи и человеческой ОС. Маточный раствор фермента разбавляли в 20 раз 0,1М буфером с различными значениями рН (натрийцитратый буфер, рН 4-7 и натрийфосфатный буфер, рН 7-10). Растворы ферментов инкубировали при 30°С в течение 30 мин и затем оценивали ферментативную активность согласно стандартному протоколу;
на фиг. 4 - результаты сравнения констант специфичности кса1/КМ для набора субстратов, содержащих глутамат в положении второй аминокислоты. В то время, как при переходе от ди- к трипептидам было обнаружено повышение специфичности человеческой ОС. никаких изменений в этом варианте не обнаружено для ОС из папайи. Представленные диаграммы получены на основе параметров, приведенных в табл. 3;
на фиг. 5 - данные об образовании рС1и-Еук(рС1и)-Агд-Ееи-А1а^Н2 из Н-С1п-Еук(С1п)-Агд-Еев-А1аΝΗ2, катализируемом человеческой ОС. Превращение субстрата оценивали по зависящему от времени изменению в соотношении т/ζ, обусловленному выбросом аммиака. Образец имел следующий состав: 0,5 мМ субстрат, 38 нМ ОС в 40 мМ трис/НС1, рН 7,7. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали массспектрометрическому анализу. Очень близкая зависимость обнаружена и для ОС из папайи;
на фиг. 6 - данные об образовании рС1и-Р11е-Еу8-А1а-С1и^Н2 из Н-СЕч^МерРйе-Еук-Ака-Ск^Н^ катализируемом ОС из папайи. Превращение субстрата оценивали по зависящему от времени изменению в соотношении т/ζ, обусловленному выбросом метиламина. Образец имел следующий состав: 0,5 мМ субстрат, 0,65 мкМ ОС из папайи в 40 мМ Трис/НС1, рН 7,7. В указанные моменты времени образцы изымали из лабораторной пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу. Никакого превращения субстрата не обнаружено в образцах без РС из папайи или при добавлении к субстрату вплоть до 1,5 мкМ человеческой ОС (данные не представлены);
на фиг. 7 - данные об образовании [Ο1η3]-Άβ3-11 из [Ο1η3]Άβ1-11, катализируемом ΌΡ IV. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 8 - данные о предупреждении расщепления |С1п3|Ав1-11 с помощью ингибитора ΌΡ IV Уа1пирролидида Жа1-Ругг). В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 9 - данные об образовании [рО1и3]Ав3-11 из [Ο1η3]Άβ3-11, катализируемом ОС. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 10 - данные об ингибировании образования [рС1и3]Ав3-11 из [Ο1η3]Άβ3-11 с помощью ингибитора ОС 1,10-фенантролина. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 11 - данные об образовании [ρ61υ3]Άβ3-11 из [С1ηз]Άβ1-11 после последовательного катализа с помощью ΌΡ IV и ОС. В указанные моменты времени образцы изымали из лабораторной пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 12 - данные об ингибировании образования [ρΟ1υ3]Άβ3-11 из [С1η3]Άβ1-11 с помощью ингибитора ОС 1,10-фенантролина в присутствии каталитически активных ΌΡ IV и ОС. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 13 - данные о снижении образования [ρΟ1υ3]Άβ3-11 из [С1η3]Άβ1-11 с помощью ингибитора ΌΡ IV Уа1-Бугг в присутствии каталитически активных ΌΡ IV и ОС. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 14 - данные об образовании [р61и3]Άβ-пептид3-11 из [С1η3]Άβ1-11 после последовательного катализа аминопепетидазой(ами) и ОС, которые присутствовали в гомогенате гипофиза свиньи. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 15 Ά и Б - масс-спектры Άβ3-11α и Άβ3-2Ετ инкубированных в присутствии рекомбинантной человеческой ОС, которую кипятили в течение 10 мин перед применением. На фиг. 15 В и Д представлены масс-спектры Άβ3-11 и Ά β3-21а в присутствии активной человеческой ОС, что приводило к образованию [р61и3]Άβ3-11а и [р61и3]Άβ3-21а, соответственно. На фиг. 15 Д и Е представлены масс-спектры Άβ3-11 а и Άβ3-21 а в присутствии активной ОС и 5 мМ бензимидазола, подавляющего образование [рО1и3];
- 4 009291 на фиг. 16 - скорости реакции катализируемого ОС из папайи превращения Ο1υ-β-ΝΑ в зависимости от концентрации субстрата. Начальные скорости оценивали в 0,1М пирофосфатном буфере, рН 6,1 (квадраты), 0,1М фосфатном буфере, рН 7,5 (кружки) и 0,1М боратном буфере, рН 8,5 (треугольники). Значения кинетических параметров: КМ=1,13±0,07 мМ, кса1= 1,13±0,04 мин-1 (рН 6,1); КМ=1,45±0,03 мМ, кса1=0,92±0,01 мин-1 (рН 7,5); КМ=1,76±0,06 мМ, кса1=0,56±0,01 мин-1 (рН 8,5);
на фиг. 17 - зависимость от рН превращения Ο1η-βΝΑ (кружочки) и Ο1υ-βΝΑ (квадраты), которую определяли в условиях скорости реакции первого порядка (8«КМ). Использовали концентрацию субстрата 0,01 и 0,25 мМ, соответственно. Для обоих вариантов использовали трехкомпонентную буферную систему, включающую 0,05М уксусную кислоту, 0,05М пирофосфорную кислоту и 0,05М трицин. Все буферы доводили до одинаковой проводимости путем добавления №1С1 для того, чтобы избежать различий в ионной силе. Данные аппроксимировали с помощью уравнений, позволивших установить для двух диссоциирующих групп значения рКа 6,91±0,02 и 9,5±0,1 для ΟΙη-βΝΑ и 4,6±0,1 и 7,55±0,02 для ΟΙυβΝΑ. Значения рКа для аминогрупп соответствующего субстрата, которые определяли титрованием, составили 6,97±0,01 (ΟΙη-βΝΑ) и 7,57±0,05 (ΟΙυβΝΑ). Все определения осуществляли при 30°С;
на фиг. 18 - кривые, характеризующие процесс катализируемой человеческой ОС циклизации Η-Ο1ηЛМС в присутствии имидазола, дипиколиновой кислоты и без ингибитора. Гиперболическая форма кривой в присутствии дипиколиновой кислоты свидетельствует об удалении иона металла из активного сайта ОС;
на фиг. 19 - зависящая от времени инактивация ОС с помощью гетероциклического хелатора 1,10фенантролина. После инкубации фермента ОС с ингибитором в отсутствие субстрата (сплошная линия) обнаружена пониженная ферментативная активность по сравнению с образцами, которые не подвергали предварительной инкубации с ингибитором (пунктирная линия), что свидетельствует об удалении иона металла из активного сайта ОС;
на фиг. 20 - реактивация человеческой ОС ионами одновалентных и двухвалентных металлов. ОС инактивировали добавлением 2 мМ дипиколиновой кислоты в 50 мМ бис-трис-буфере, рН 6,8. Затем фермент подвергали диализу в противотоке 50 мМ бис-трис-буфера, рН 6,8, содержащего 1,0 мМ ЭДТК. Для реактивации фермента осуществляли инкубацию инактивированного образца фермента с ионами металлов в концентрации 0,5 мМ в присутствии 0,5 мМ ЭДТК для того, чтобы избежать неспецифической реактивации следами ионов металлов, присутствующих в буферных растворах. В качестве контролей использовали содержащие фермент образцы, которые не инактивировали, но так же, как и инактивированный фермент, подвергали диализу в противотоке раствора ЭДТК (+ЭДТК), и образцы фермента, которые подвергали диализу в противотоке буферных растворов, не содержащих ЭДТК (-ЭДТК);
на фиг. 21 - сравнительный анализ последовательностей человеческой ОС (11ОС) и других представителей семейства М28 металлопептидаз С1ан МН. Сравнительный анализ множества последовательностей осуществляли с помощью программы С1и51а1\У в с11.ЕМВпс1.огд с принимаемыми по умолчанию параметрами. Превращение связанных с ионом цинка остатков обнаружено для человеческой ОС (11ОС; ΟепΒаηк Х71125), Ζη-зависимой аминопептидазы из 81гер1ошусе5 §Г15СИ5 (8ΟΑΡ; 8\\'155-Рго1 Р80561) и в Ν-ацетилированном-альфа-связанном кислотном дипептидазном домене (ΝΑΑΕΑΌ;·ι^ I) (остатки 274587) человеческой глутаматкарбоксипептидазы II (ЮСР II; 8\νί55-ΡΐΌΐ 004609). Аминокислоты, участвующие в связывании металла, выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. В случае человеческой ОС эти остатки, вероятно, являются «двойниками» пептидаз.
Пептидные последовательности
Упомянутые и применяемые согласно настоящему описанию пептиды имеют следующие последовательности.
Αβ1-42:
Α5ρ-Α1;·ι-Ο1ιι-Ρ1κ-ΑΓ8-Ηί5-Α5ρ-8οΟΕ·-Τ\·Γ-Ο1ιι-ν;·ι1-Ηί5-Ηί5-Ο1η-ΕΎ5-ΕΌΐι-ν;·ι1-Ρ1κ-Ρ1κ-Α1;·ι-Ο1ιι-Α5ρVа1-Ο1у-8е^-Α5п-^у5-Ο1у-Α1а-I1е-I1е-Ο1у-^еи-Меι-Vа1-Ο1у-Ο1у-Vа1-Vа1-I1е-Α1а
Αβ1-40:
Α8р-Α1а-Ο1и-Ρйе-Α^д-Η^8-Α8р-8е^-Ο1у-Τу^-Ο1и-Vа1-Η^8-Η^8-Ο1η-^у8-^еи-Vа1-Ρйе-Ρйе-Α1а-Ο1и-Α8рVа1-Ο1у-8е^-Α5п-^у5-Ο1у-Α1а-I1е-I1е-Ο1у-^еи-Меι-Vа1-Ο1у-Ο1у-Vа1-Vа1
Αβ3-42:
01и-Ρйе-Α^д-Η^8-Α8р-8е^-01у-Τу^-01и-Vа1-Η^8-Η^8-01η-^у8-^еи-Vа1-Ρйе-Ρйе-Α1а-01и-Α8р-Vа1-01у8е^-Α8η-^у8-Ο1у-Α1а-I1е-I1е-Ο1у-^еи-Меΐ-Vа1-Ο1у-Ο1у-Vаΐ-Vа1-I1е-Α1а
Αβ3-40:
01и-Ρйе-Α^д-Η^8-Α8р-8е^-01у-Τу^-01и-Vа1-Η^8-Η^8-01η-^у8-^еи-Vа1-Ρйе-Ρйе-Α1а-01и-Α8р-Vа1-01у8е^-Α8η-^у8-Ο1у-Α1а-I1е-I1е-Ο1у-^еи-Меΐ-Vа1-Ο1у-Ο1у-Vа1-Vа1
Αβ1-11Β:
Α8р-Α1а-Ο1и-Ρйе-Α^д-Η^8-Α8р-8е^-Ο1у-Τу^-Ο1и-NΗ2
Аβ3-11а:
Ο1ιι-Ρ1κ-ΑΓ8-Ηί5-Α5ρ-8οΟ1\·-Τ\τ-Ο1ιι-ΝΗ2
Αβ1-21Β:
Α8р-Α1а-Ο1и-Ρйе-Α^д-Η^8-Α8р-8е^-Ο1у-Τу^-Ο1и-Vа1-Η^8-Η^8-Ο1η-^у8-^еи-Vа1-Ρйе-Ρйе-Α1а-NΗ2
- 5 009291
Ав3-21а:
С1и-Р11с-Аг8-Н|5-А5р-8сг-С1у-Туг-С1и-Уа1-Н|5-Н|5-С1п-Еу5-Еси-Уа1-Р11с-Р11с-А1а-НН;
61η3-Αβ3-40:
С1п-Р11с-Аг8-Н|5-А5р-8сг-С1у-Туг-С1и-Уа1-Н|5-Н|5-С1п-Р.у5-Рси-Уа1-Р11с-Р11с-А1а-С1и-А5р-Уа1-С1у§ег-А8п-Ьу8-61у-А1а-11е-11е-61у-Ьеи-Ме!-Уа1-61у-61у-Уа1-Уа1
61п3-Ав3-21а:
61п-Рйе-Агд-Н18-А8р-§ег-61у-Туг-61и-Уа1-Н18-Н18-61п-Ьу8-Ьеи-Уа1-Рйе-Рйе-А1а-НН2
61п3-Ав1-11а:
А8р-А1а-61п-Рйе-Агд-Н18-А8р-§ег-61у-Туг-61и-ИН2
61п3-Ав3-11а:
С1п-Р11е-Агд-Н|5-А5р-8ег-С1у-Туг-С1и-НН2
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к эффекторам глутаминилциклазы (ОС), предназначенным:
а) для лечения болезней у млекопитающих, которые можно лечить путем модуляции активности ОС 1п νίνο;
б) и/или для модуляции физиологических процессов, основанных на действии рО1и-содержащих пептидов, обусловленном модуляцией активности ОС.
Кроме того, настоящее изобретение относится к соединениям, предназначенным для ингибирования глутаминилциклазы (ОС, КФ 2.3.2.5) и/или ОС-подобных ферментов в организме млекопитающего и к применению ингибиторов ОС-активности для лечения патологических состояний, связанных с ОС-активностью.
В настоящем изобретении предложен также новый способ лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна. Ν-концы амилоидных β-пептидов, отложение которых происходит в головном мозге при болезни Альцгеймера и синдроме Дауна, несут пироглутаминовую кислоту. Образование рО1и представляет собой важное событие в развитии и прогрессировании заболевания, так как известно, что амилоидные β-пептиды характеризуются повышенной тенденцией к агрегации β-амилоидов и токсичностью, чем, вероятно, обусловлено начало и развитие болезни (Ριΐδδο С. и др., 1. №игосйет. 82, 2002, сс. 1480-1489).
В противоположность этому, во встречающихся в естественных условиях Ав-пептидах (3-40/42) в качестве Ν-концевой аминокислоты присутствует глутаминовая кислота. К настоящему времени отсутствуют данные о превращении О1и в рО1и. Кроме того, пока не обнаружена спонтанная циклизация О1ипептидов в рО1ц-пептиды. Таким образом, одним из объектов настоящего изобретения является выяснение роли ОС в болезни Альцгеймера и синдроме Дауна. Эта задача решается с помощью синтеза А(33-11 и Ав 1-11, которые содержат аминокислоту глутамин вместо глутаминовой кислоты в положении 3, определения особенностей этих модифицированных амилоидных β-пептидов в качестве субстратов для ОС/ ΌΡ 1У и ΌΡ 1У-подобных ферментов и аминопептидаз и применения ингибиторов ОС для предупреждения образования рО1и из Ν-концевого глутаминильного остатка выведенных из амилоида β-пептидов 111 и 3-11. Результаты описаны в примере 8. Примененный метод описан в примере 3.
К настоящему времени отсутствуют какие-либо сведения об участии ОС в развитии заболевания, поскольку Ν-концевой аминокислотой в Аβ (3-40/42 или 11-40/42) является глутаминовая кислота. Однако ОС является единственным известным ферментом, который обладает способностью образовывать рО1и на Ν-конце пептидов. Другие объекты настоящего изобретения касаются следующих данных и открытий:
а) побочная реакция катализируемой ОС циклизации глутаминовой кислоты с образованием пироглутаминовой кислоты происходит с очень низкой скоростью,
б) глутаминовая кислота β-амилоидного белка-предшественника (АРР) или образованные из нее амилоидные β-пептиды превращаются в глутамин после трансляции с помощью неизвестной ферментативной активности, а на второй стадии ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида,
в) глутаминовая кислота превращается в глутамин после трансляции с помощью химического катализа или автокатализа, а затем ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида,
г) в гене АРР присутствуют мутации, которые кодируют амилоидный β-белок, что приводит к замене О1и в положении 3 на О1п. После трансляции и процессинга Ν-конца ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты,
д) глутамин включается в возникающую пептидную цепь АРР вследствие функционального нарушения неизвестной ферментативной активности, и поэтому ОС катализирует циклизацию Ν-концевого глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида.
ОС участвует в имеющей решающее значение стадии во всех 5 перечисленных выше случаях, а именно в образовании пироглутаминовой кислоты, которая способствует агрегации амилоидных β-пептидов. Таким образом, ингибирование ОС приводит к предупреждению осаждения бляшкообразующих Аβ3-40/41/43 или Аβ 11-40/41/43, вызывая появление и прогрессирование болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, в независимости от механизма, посредством которого происходит циклизация.
- 6 009291
Глутамат обнаружен в положениях 3, 11 и 22 амилоидного β-пептида. Среди прочего описана мутация, приводящая к замене глутаминовой кислоты (Е) на глутамин (О) в положении 22 (соответствующая амилоидному белку-предшественнику АРР 693, 8\\звврго1 Р05067), в качестве мутации, приводящей к цереброартериальному амилоидозу датского типа.
Установлено, что β-амилоидные пептиды, несущие остаток пироглутаминовой кислоты в положении 3, 11 и/или 22, являются более цитотоксическими и гидрофобными по сравнению с Ав 1-40/42/43 (8а1бо Т.С., Мебюа1 НуроШевев 54(3), 2000, сс. 427-429).
Многочисленные Ν-концевые вариации в различных местоположениях β-сайта можно получать с помощью β-секретазы, фермента, расщепляющего β-сайт амилоидного белка-предшественника (ВАСЕ) (Ниве ТТ. и др., 1. Вю1. СНет. 277 (18), 2002, сс. 16278-16284), и/или процессинга с помощью аминопептидазы. Во всех случаях циклизация может происходить согласно описанным выше механизмам а)-д).
Таким образом, к настоящему времени отсутствуют экспериментальные данные, подтверждающие ферментативный путь превращения С1и1-пептидов в рС1и-пептиды с помощью неизвестной глутамилциклазы (ЕС), что соответствует механизму а) (Сагбеп Β.ν., Μογοζ Т.Р., С1еевоп 1.М., Г1оуб Ρ.Ό., Ы Ь.Т, ВиЬакЫи 8.8. и 8\\себ1ег ТУ. 1. №игосйет. 72, 1999, сс. 676-681; Новоба В. и др. 1. №игора1йо1. Ехр. №иго1. 57, 1998, сс. 1089-1095). К настоящему времени не была обнаружена такая ферментативная активность, которая может осуществлять циклизацию С1и1-пептидов, протонированных на Ν-конце и несущих отрицательно заряженный остаток С1и1у-карбоксилата, при слабых щелочных значениях рН.
ОС-активность в отношении С1п1-субстратов очень резко снижалась при значениях рН ниже 7,0. В противоположность этому, установлено, что превращение С1И1 может происходить в кислых реакционных средах (1\ха1виЬо Т., 8а1бо Т.С., Мапп Ό.Μ., Ьее У.М. и Тго)апо\\'вк| 1.О., Ат. 1. Ра1йо1. 149, 1996, сс. 18231830; Вивво С., 8а1бо Т.С., ЭеВивк Ь.М., ТаЬаЮп М., СатЬеШ Р. и Те11ег ГК., ΓΕΒ8 Ьей. 409, 1977, сс. 411416; Влево С., 8айв 8., ПоШш V., Vеηеζ^а V., 8опд Х.Н., Те11ег 1.К. и 8сйей!ш С., №игоЬю1. Όίβ. 8, 2001, сс. 173-180; Текшап Т.Ь., 8а1бо Т.С., МагкевЬегу ν.Β., Вивве11 М.1., '№екв!ет Ό.Β., Ра1е1 Е. и Себбев IV., 1. №игора1йо1. Ехр. №иго1. 57, 1998, сс. 76-94; Вивво С., Ую1аш Е., 8айв 8., Сег^а V., Эо1сйй V., ЭатоЩе С., ВепаШ и., ЭАггщо С., Районе Е., Саг1о Р. и 8сйейш1 С., 1. №игосйет. 82, 2002, сс. 14801489; Новоба В., 8а1бо Т.С., О1уов Ь., 1г., Ага1 Т., Мапп Ό.Μ., Ьее V.М., Тго)апо\\'вк| 1.0. и ЕсайиЬо Т., 1. №игора1йо1. Ехр. №иго1. 57, 1998, сс. 1089-1095; Сагбеп Β.ν., Мо^оζ Т.Р., С1еевоп ГМ., Г1оуб РГО., Ы Ь.Т, ВиЬакЫп 8.8. и 8\\себ1ег ГМ, 1. №игосйет. 72, 1999, сс. 676-681).
При создании настоящего изобретения изучался вопрос о том, может ли ОС распознавать и участвовать в превращении выведенных из амилоида-β пептидов в слабокислых условиях. Для этой цели синтезировали и исследовали в качестве потенциальных субстратов фермента пептиды [С1η3]Аβ1-11а, Аβ3-11а, [С1п3]Аβ3-11а, Αβ3-2^, [С1п3]Аβ3-21а и [С1п3]Аβ3-40. Эти последовательности были выбраны для имитации встречающихся в естественных условиях укороченных на Ν-конце и на С-конце пептидов |С1и3|А β и пептидов [Ώ^ΙΑβ, которые могут присутствовать в результате посттрансляционного амидирования С1и.
При создании настоящего изобретения было установлено, что ОС из папайи и человеческая ОС катализируют циклизацию как глутаминила, так и глутамила. По-видимому, первичной физиологической функцией ОС является прекращение созревания гормонов в эндокринных клетках посредством циклизации глутамина до или во время процесса секреции гормона. Известно, что такие секреторные пузырьки характеризуются кислым значением рН. Таким образом, побочная активность фермента в узком диапазоне значений рН от 5,0 до 7,0 может представлять собой открытую при создании настоящего изобретения глутамилциклазную активность, которая трансформирует также пептиды 01ιι-Αβ. Однако из-за существенно меньшей скорости С1и-циклизации по сравнению с С1п-конверсией вопрос о том, может ли циклизация глутамила играть важную физиологическую роль, является спорным. При этом циклизация глутамила участвует в патологии нейродегенеративных заболеваний.
При создании настоящего изобретения при изучении зависимости этой ферментативной реакции от значений рН установлено, что непротонированный Ν-конец играет ключевую роль для циклизации С1п1-пептидов и, соответственно, значение рКа субстрата идентично значению рКа при ОС-катализе (см. фиг. 17). Таким образом, ОС стабилизирует внутримолекулярное нуклеофильное воздействие непротонированной α-аминогруппы на у-карбонильный углерод, который приобретает электрофильные свойства в результате амидирования (схема 1).
В отличие от одновалентного заряда, присутствующего в пептидах, несущих Ν-концевой глутамин, Ν-концевой остаток С1и в содержащих С1и пептидах в большинстве случаев несет двухвалентных заряд при нейтральных значениях рН. Для глутамата характерно значение рКа примерно 4,2 и 7,5 для у-карбоксильного остатка и для α-аминогруппы, соответственно. То есть при нейтральных и щелочных значениях рН хотя азот α-аминогруппы является частично или полностью непротонированным и нуклеофильным, у-карбоксильная группа является непротонированной и поэтому не проявляет никакой электрофильной, характерной для карбонила, активности. Поэтому внутримолекулярная циклизация представляется невозможной.
Однако при значениях рН примерно 5,2-6,5, с учетом соответствующих значений рКа, обе функциональные группы присутствуют в неионизированной форме в концентрациях примерно 1-10% (-ИН2) или 10-1% (-СООН) от общей массы Ν-концевого содержащего С1и пептида. В результате при слабокислых значениях рН присутствуют виды Ν-концевых С1и-пептидов, в которых обе группы являются неза
- 7 009291 ряженными, и поэтому представляется возможным, что ОС может стабилизировать промежуточное звено внутримолекулярной циклизации с образованием рО1и-пептида. То есть, если γ-карбоксильная группа является протонированной, то углерод карбонила является достаточно электрофильным, что позволяет осуществлять нуклеофильное воздействие на него непротонированной α-аминогруппы. При таких значения рН ион гидроксила функционирует в качестве уходящей группы (схема 3). Эти предположения подтверждаются данными о зависимости от рН, полученными для катализируемого ОС превращения О1иβΝΑ (см. пример 11). В отличие от превращения с помощью ОС глутамина ΟΙη-βΝΑ, оптимум рН катализа сдвигается в кислотный диапазон значений рН, примерно рН 6,0, т.е. диапазон значений рН, при котором одновременно присутствует значительное количество видов молекул субстрата, которые несут протонированную γ-карбоксильную и непротонированную α-аминогруппу. Кроме того, характеризующее кинетическую реакцию конкретное значение рКа, составляющее 7,55±0,02, очень хорошо согласуется со значением, установленным для α-аминогруппы Ο1π-βΝΑ с помощью титрования (7,57±0,05).
С физиологической точки зрения, при рН 6,0 константа скорости реакции второго порядка (или константа специфичности кса1/КМ) катализируемой ОС циклизации глутамата может быть примерно в 8000 раз ниже, чем константа, характеризующая циклизацию глутамина (фиг. 17). Однако не связанное с ферментом превращение обоих модельных субстратов Ο1π-βΝΑ и Ο1η-βΝΑ является очень незначительным, что согласуется с данными о незначительном образовании рО1и-пептида, полученными при создании настоящего изобретения. Следовательно, из соотношения констант скорости ферментативной и неферментативной реакций (при сравнении констант скорости реакции второго порядка для ферментативного катализа с соответствующими константами скорости реакции первого порядка для неферментативной циклизации коэффициент каталитической эффективности составляет 109-1010М-1 для Ο1η- и О1и-превращения, соответственно) можно оценить, что для образования рО1и с помощью ОС может быть достигнуто ускорение по меньшей мере в 108 раз. Из этих данных можно сделать вывод о том, что ίη νίνο возможным является только ферментативный путь, приводящий к образованию рО1и.
Поскольку ОС присутствует в больших количествах в головном мозге, а также принимая во внимание высокую скорость превращения, составляющую 0,9 мин-1, которая в последние годы установлена для созревания 30 мкМ (О1п-)ТВН-подо6ного пептида (Ргока1 Ь., РгокаъТайш К., Оиуаид X., К1т Н.8., XVи ХУ.М.. ΖΙκιπΕονη А. и Вобог Ν., 1. Меб. СЬет. 42, 1999, сс. 4563-4571), можно предсказать, что время полужизни соответствующего глутаматного субстрата при его циклизации составляет примерно 100 ч, что совпадает с предложенными в настоящем описании реакционными условиями. Кроме того, принимая во внимание компартментализацию и локализацию в головном мозге ОС/ЕС в пути секреции, ίη νίνο в неповрежденных клетках фактические концентрации фермента и субстрата и условия реакции могут оказаться еще более оптимальными для ферментативной циклизации. А также, если Ν-концевой О1ц заменяют на 01η, то можно ожидать еще более быстрое образование рО1и, опосредуемое ОС. Ιη νίΐτο обе реакции подавлялись при внесении ингибиторов ОС/ЕС-активности (фиг. 9, 10 и 15).
В целом, при создании настоящего изобретения установлено, что человеческая ОС, которая присутствует в больших количествах в головном мозге, вероятно, катализирует образование амилоидогенных пептидов из предшественников Ο1π-Αβ и Ο1η-Αβ, на долю которых приходится более чем 50% отложений бляшек при болезни Альцгеймера. Эти данные позволили установить, что ОС/ЕС участвуют в образовании старческих бляшек и вследствие этого представляют собой новую мишень для разработки лекарственных средств, предназначенных для лечения болезни Альцгеймера.
Второй вариант осуществления настоящего изобретения касается того, что выведенные из амилоида-β пептиды являются субстратом для дипептидилпептидазы IV (ΌΡ IV) или подобных ΌΡ IV ферментов, предпочтительно дипептидилпептидазы II (ΌΡ II). ΌΡ IV, ΌΡ II или другие подобные ΌΡ IV ферменты высвобождают дипептид из Ν-конца модифицированного амилоидного β-пептида (1-11), что приводит к образованию амилоидного β-пептида (3-11), у которого в качестве Ν-концевого аминокислотного остатка присутствует глутамин. Эти результаты представлены в примере 8.
Перед расщеплением с помощью ΌΡ II, ΌΡ IV или другого подобного ΌΡ IV фермента пептидная связь между аспарагиновой кислотой (остаток 1 амилоидного β-пептида) и аланином (остаток 2 амилоидного β-пептида) может быть изомеризована с образованием изоаспартильного остатка, что описано в литературе (Кио Υ.-М., Еттебшд М.В., Χνοο6δ Α.8., СоИег В.1., РоЬег Α.Ε., ВВВС 237, 1997, сс. 188-191; δΐιίιηίζιι Т., VаΐаηаЬе Α., Одаиага М., Моп Н. и ЗЫгакаиа Т., Лгск ВюсЬет. ВюрЬук. 381, 2000, сс. 225-234).
Эти изоаспартильные остатки придают амилоидному β-пептиду устойчивость к расщеплению аминопептидазой, и в результате коровые бляшки содержат более высокие количества изо Αφ1 -амилоидных β-пептидов, что позволяет предположить пониженное превращение на Ν-конце.
Однако в настоящем изобретении впервые продемонстрировано, что под воздействием дипептидилпептидаз может высвобождаться Ν-концевой дипептид Н-изоΑ8р1-Α1а2-ОН, прежде всего, в кислотных условиях. Кроме того, при создании изобретения было установлено, что изомеризация может предшествовать также расщеплению β-секретазой и что изомеризация может ускорять протеолитическое расщепление, что приводит к выделению в свободном состоянии Ν-концевой изоаспартильной связи (Γ^Αφ1амилоидных β-пептидов, которые, в свою очередь, являются объектом для обновления с помощью ΌΡ II,
- 8 009291
ΌΡ IV или подобных ΌΡ IV ферментов (Мотапб I. и С1агке 8., ВюскеппЧгу 26, 1987, сс. 7798-7805; Кио Υ.-М., Еттетйпд М.В., ХУообк А.8., Собег КД., Войег А.Е., ВВВС 237, 1997, сс. 188-191). Таким образом, ингибирование образования изоаспартила может приводить к снижению расщепления β-секретазой и, в свою очередь, к пониженному образованию амилоидных β-пептидов. Кроме того, блокада превращения изоАкр'-амилоидного β-пептидов путем ингибирования ΌΡ II, ΌΡ IV или подобных ΌΡ IV ферментов должна препятствовать катализируемому ОС/ЕС образованию |рС1и3|Аβ из |01υ3|Αβ.
Согласно третьему варианту осуществления настоящего изобретения комбинацию ингибиторов активности ΌΡ IV и ингибиторов ОС можно применять для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
Совместное действие ΌΡ IV и/или подобных ΌΡ IV ферментов и ОС иллюстрируют следующие факты:
а) ΌΡ IV и/или подобные ΌΡ IV ферменты расщепляют Аβ 1-40/42, при этом высвобождается дипептид, содержащий Н-Акр-А1а-ОН и Аβ3-40/42,
б) побочная реакция катализируемой ОС циклизации глутаминовой кислоты с образованием пироглутаминовой кислоты происходит с очень низкой скоростью,
в) глутаминовая кислота превращается в глутамин на Ν-конце после трансляции с помощью неизвестной ферментативной активности, а затем ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида,
г) глутаминовая кислота превращается в глутамин после трансляции с помощью химического катализа или автокатализа, а на второй стадии ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида,
д) в гене АРР присутствуют мутации, которые кодируют амилоидный β-белок, что приводит к замене С1и в положении 3Аβ С1п. После трансляции и процессинга Ν-конца ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты,
е) глутамин включается в возникающую пептидную цепь АРР вследствие функционального нарушения неизвестной ферментативной активности, и поэтому ОС катализирует циклизацию Ν-концевого глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида.
ОС-активность в отношении Ν-концевого С1п может запускаться также действием различных пептидаз. Аминопептидазы могут удалять последовательно Акр и А1а из Ν-конца Аβ 1-40/41/43, демаскируя тем самым аминокислоту в положении 3, которая может подвергаться циклизации. Дипептидилпептидазы, такие как ΌΡ I, ΌΡ II, ΌΡ IV, ΌΡ 8, ΌΡ 9 и ΌΡ 10, в одну стадию осуществляют удаление дипептида Акр-А1а. Таким образом, ингибирование аминопептидазной или дипептидилпептидазной активности можно применять для предупреждения образования Аβ3-40/41/43.
Совместное действие ингибиторов ΌΡ IV и/или подобных ΌΡ IV ферментов и снижающих активность эффекторов ОС можно проиллюстрировать следующим образом:
а) ингибиторы ΌΡ IV и/или подобных ΌΡ IV ферментов ингибируют превращение Аβ 1-40/42 в Аβ3-40/42,
б) тем самым предотвращается воздействие на Ν-концевую глутаминовую кислоту и не происходит ее превращение в глутамин либо ферментативным путем, либо с помощью химического катализа, что в дальнейшем делает возможным образование пироглутаминовой кислоты,
в) ингибиторы ОС предупреждают также образование пироглутаминовой кислоты из любых молекул Аβ3-40/42 с модифицированными остатками и тех модифицированных молекул Аβ3-40/42, которые образуются в результате мутаций гена АРР.
При создании настоящего изобретения аналогичное совместное действие ΌΡ IV или подобных ΌΡ IV ферментов и ОС было продемонстрировано также для других пептидных гормонов, таких как глюкагон, СС-хемокины и вещество Р.
Глюкагон представляет собой состоящий из 29 аминокислот полипептид, который выделяется из альфа-клеток панкреатических островков, и его функцией является поддержание нормальной глицемии путем стимуляции печеночного гликогенолиза и глюконеогенеза. Несмотря на важность этого вопроса, сохраняются противоположные мнения о механизме, ответственном за клиренс глюкагона в организме. Ρокр^к^1^к с соавторами изучали ферментативный метаболизм глюкагона с помощью высокочувствительных методов масс-спектрометрии для идентификации продукта на молекулярном уровне. Инкубация глюкагона с очищенной свиной дипептидилпептидазой IV (ΌΡ IV) приводила к последовательному производству глюкагона 3-29 и глюкагона 5-29. В человеческой сыворотке расщепление до глюкагона 3-29 сопровождалось быстрой Ν-концевой циклизацией глюкагона, что препятствовало дальнейшему опосредуемому ΌΡ IV гидролизу. Биологический анализ глюкагона после его инкубации с очищенной ΌΡ IV или нормальной крысиной сывороткой продемонстрировал значительное снижение гипергликемической активности, в то время как аналогичная инкубация с крысиной сывороткой с дефицитом ΌΡ IV не приводила ни к какому снижению биологической активности глюкагона. Расщепление, для оценки которого применяли масс-спектрометрию и биологический анализ, блокировали с помощью специфического ингибитора ΌΡ IV изолейцилтиазолидина. Эти результаты свидетельствуют о том, что ΌΡ IV представляет собой основной фермент, участвующий в расщеплении и инактивации глюкагона. Эти данные нашли важное применение для определения уровней глюкагона в человеческой плазме ^окр^Ик и др., Веди1. Ρерΐ., 12; 96(3), январь 2001, сс. 133-41).
Хемотаксический белок человеческих моноцитов (МСР)-2 впервые был выделен из стимулирован
- 9 009291 ных клеток остеосаркомы в качестве хемокина, производимого вместе с МСР-1 и МСР-3. Уоп Со1Ше с соавторами (Уаи Со1Ше Е. и др., В1оейеш181гу 37, 1998, сс. 12672-12680) клонировали из библиотеки кДНК человеческих яичек кДНК МСР-2 с удлинением на 5'-конце. Она кодировала состоящий из 76 остатков белок МСР-2, но отличалась от известной полученной из костного мозга последовательности кДНК МСР-2 кодоном 46, который кодировал Ьу§ вместо О1и. Осуществляли анализ биологической активности этого варианта МСР-2Ьу§46, полученного в результате полиморфизма одного нуклеотида (8ΝΡ), и МСР-2О1и46. Кодирующие области субклонировали в бактериальном экспрессионном векторе ρΗΕΝ1 и после трансформации им ЕксйепсШа сой из периплазмы выделяли два варианта белка МСР-2. С помощью расщепления по Эдману подтвердили наличие на Ν^-конце остатка О1и вместо рО1и. гМСР2О1и46 и тМСР-2Ьу846 и копии с циклическим Ν^-концом оценивали на клетках моноцитов в опытах по мобилизации кальция и оценке хемотаксиса. Никаких различий в биологической активности не обнаружено между изоформами гМСР-2О1и46 и тМСР-2Ьу546. Однако для обоих вариантов МСР-2 установлено, что наличие Ν^-концевого пироглутамата имело решающее значение для хемотаксиса, но не было важно для мобилизации кальция. Укорочение Ν^-конца тМСР-2Ьу546 с помощью сериновой протеазы СЭ26/дипептидилпептидазы 1У (СЭ26/ЭРР 1У) приводило к высвобождению Ν^-концевого дипептида О1и-Рто, в то время как синтетический МСР-2, несущий на Ν^-конце рО1и, остался неповрежденным. Укороченный с помощью СЭ26/ЭРР 1У гМСР-2Ьу §46(3-76) оказался практически полностью неактивным как в опытах по оценке хемотаксиса, так и в опытах по оценке передачи сигнала.
Эти данные свидетельствуют о том, что ИН2-концевой рО1и в МСР-2 является не только необходимым для хемотаксической активности, но также защищает белок от расщепления с помощью СЭ26/ЭРР 1У (уаи Со1Ше Е. и др., Вюсйеш1§1ту, 37, 1998, сс. 12672-80).
При создании настоящего изобретения с помощью анализа методом жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС) установлено, что образование Ν-концевого остатка пироглутамата в глюкагоне 3-29 (Ро§р1§111к и др., 2001) и в изоформах МСР-2 (уаи Со1Ше и др., 1998), катализируется ОС.
Кроме того, с помощью ЖХ/МС доказано, что после катализируемого ЭР 1У удаления двух дипептидов Ьу§-Рто и Агд-Рго из Ν-конца вещества Р оставшееся [Ο1η5] вещество Р5-11 трансформируется с помощью ОС с образованием [рО1и5] вещества Р5-11.
Ингибиторы ЭР 1У описаны в АО 99/61431. В частности, описаны ингибиторы ЭР 1У, содержащие аминокислотный остаток и тиазолидиновую или пирролидиновую группу, и их соли, прежде всего Ьтреоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-треоизолейцилпирролидин, Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилпирролидин и их соли.
Дополнительными примерами низкомолекулярных ингибиторов дипептидилпептидазы 1У являются такие агенты, как тетрагидроизохинолин-3-карбоксамидные производные, Ν-замещенные 2-цианпиролы и -пирролидины, №(№-замещенный глицил)-2-цианпирролидины, №(замещенный глицил)тиазолидины, Ν-Оамещенный глицил)-4-циантиазолидины, аминоацилборпролильные ингибиторы, сконденсированные с циклопропилом пирролидины и гетероциклические соединения. Ингибиторы дипептидилпептидазы 1У описаны в И8 6380398, И8 6011155; И8 6107317; И8 6110949; И8 6124305; И8 6172081; АО 95/15309, АО 99/61431, АО 99/67278, АО 99/67279, ΌΕ 19834591, АО 97/40832, ΌΕ 19616486 С2, АО 98/19998, АО 00/07617, АО 99/38501, АО 99/46272, АО 99/38501, АО 01/68603, АО 01/40180, АО 01/81337, АО 01/81304, АО 01/55105, АО 02/02560 и АО 02/14271, АО 02/04610, АО 02/051836, АО 02/068420, АО 02/076450; АО 02/083128, АО 02/38541, АО 03/000180, АО 03/000181, АО 03/000250, АО 03/002530, АО 03/002531, АО 03/002553, АО 03/002593, АО 03/004496, АО 03/024942 и АО 03/024965, содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки, прежде всего касательно этих ингибиторов, их определения, применения и получения.
Предпочтительными для применения в сочетании с эффекторами ОС являются такие ингибиторы ЭР 1У, как ХУР-ЭРР728А (1-[[[2-[{5-цианпиридин-2-ил}амино]этил]амино]ацетил]-2-циан-(8)-пирролидин) (фирма №уаП1§), описанный у Нидйе§ и др., ВюсйетМгу 38, 1999, сс. 11597-11603, ЬАР-237 (1-[(3гидроксиадамант-1-иламино)ацетил]пирролидин-2(8)-карбонитрил), описанный у Нидйе§ и др., Меейид ок 1Не Ашепсаи Э|аЬе1е§ А§§ос1абоп, 2002, реферат № 272 (фирма №уатб§), Т8Ь-225 (триптофил-1,2,3,4тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота), описанная у Уашаба и др., Вюотд. Меб. Сйеш. Ьеб. 8, 1998, сс. 537-1540, 2-цианпирролидиды и 4-цианпирролидиды, описанные у А§^от1й и др., Вюотд. Меб. Сйеш. Бей. 6, 1996, сс. 1163-1166 и сс. 2745-2748 , РЕ-999011, описанный у 8ибте и др., Э|аЬе1е§ 51, 2002, сс. 1461-1469 (фирма Ретид), и соединения, описанные в АО 01/34594 (фирма Оибкотб), при их использовании в дозах, которые указаны в приведенных выше ссылках.
Более предпочтительными ингибиторами ЭР 1У, которые можно применять в сочетании с эффекторами ОС, являются дипептидные соединения, в которых аминокислоту предпочтительно выбирают из встречающихся в естественных условиях аминокислот, таких, например, как лейцин, валин, глутамин, глутаминовая кислота, пролин, изолейцин, аспарагины и аспарагиновая кислота. Подобные дипептидам соединения, применяемые согласно изобретению, в концентрации (в пересчете на дипептидные соединения) 10 мкМ снижают активность в плазме дипептидилпептидазы 1У или ферментов-аналогов ЭР 1У по меньшей мере на 10%, прежде всего по меньшей мере на 40%. Часто ίη у1уо требуется также снижение активности по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 70%. Предпочтительные соединения могут
- 10 009291 обладать также способностью снижать активность, максимум, на 20 или 30%.
Предпочтительными дипептидными соединениями являются Ν-валилпролил, О-бензоилгидроксиламин, аланилпирролидин, изолейцилтиазолидин, например Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-треоизолейцилпирролидин и их соли, прежде всего фумараты, и Ь-аллоизолейцилпирролидин и его соли. Особенно предпочтительными соединениями являются глутаминилпирролидин и глутаминилтиазолидин, Н-Акппирролидин, Н-Акп-тиазолидин, Н-Акр-пирролидин, Н-Акр-тиазолидин, Н-А8р(КНОН)-пирролидин, НА5р(кНОН)-тиазолидин. Н-С1и-пирролидин, Н-С1и-тиазолидин, Н-С1и(NНОН)-пирролидин, Н-С1и(NНОН)тиазолидин, Н-Н1к-пирролидин, Н-Н1к-тиазолидин, Н-Рго-пирролидин, Н-Рго-тиазолидин, Н-йе-азидидин, Н-Пе-пирролидин, Н-Ь-алло-йе-тиазолидин, Н-Уа1-пирролидин и Н-Уа1-тиазолидин и их фармацевтически приемлемые соли. Эти соединения описаны в \УО 99/61431 и ЕР 1304327.
Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение эффекторов ОС в сочетании с напоминающими субстрат пептидными соединениями, которые можно использовать для конкурентной модуляции катализа, осуществляемого дипептидилпептидазой IV. Предпочтительными пептидными соединениями являются 2-аминооктановая кислота-Рго-11е, АЬи-Рго-11е, А1Ь-Рго-11е, Ахе-Рго-Пе, Ска-Рго-йе, Ие-Нур11е, 11е-Рго-алло-11е, 11е-Рго-трет-бутил-С1у, Пе-Рго-Уа1, Ше-Рго-йе, №а-Рго-Пе, От-Рго-11е, Рке-Рго-йе, РкдРго-11е, Р1р-Рго-11е, 8ег(Вх1)-Рго-11е, 8ег(Р)-Рго-Пе, 8ег-Рго-11е, трет-бутил-С1у-Рго-Э-Уа1, трет-бутил-С1у-РгоС1у, трет-бутил-С1у-Рго-11е, трет-бутил-С1у-Рго-11е-амид, трет-бутил-С1у-Рго-трет-бутил-С1у, трет-бутилС1у-Рго-Уа1 Ткг-Рго-йе, Т1с-Рго-11е, Тгр-Рго-11е, Туг(Р)-Рго-11е, Туг-Рго-алло-11е, Vа1-Р^о-алло-I1е, Уа1-Рготрет-бутил-С1у, Уа1-Рго-Уа1 и их фармацевтически приемлемые соли, в которых трет-бутил-С1у обозначает
а 8ег(Вх1) и 8ег(Р) обозначают бензилсерин и фосфорилсерин, соответственно. Туг(Р) обозначает фосфорилтирозин. Эти соединения описаны в \УО 03/002593.
Другими предпочтительными ингибиторами ЭР IV, которые можно применять согласно настоящему изобретению в сочетании с эффекторами ОС, являются пептидилкетоны, например гидробромид 2-метилкарбонил-1-№[(Е)-аланил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-метилкарбонил-1-№[(Е)-валинил-(Е)-пролил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-[(ацетилоксиметил)карбонил]-1-№[(Е)-аланил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-[бензоилоксиметил)карбонил]-1-№[{(Е)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, 2-{[(2,6-дихлорбензил)тиометил]карбонил}-1-№[{(Е)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидин, гидробромид 2-[бензоилоксиметил)карбонил]-1-№[глицил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, трифторацетат 2-[([1,3]-тиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-№[{(Е)-аланил}-(Е)-валинил]-(28)-пирролидина, трифторацетат 2-[(бензотиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-№[№{(Е)-аланил}-(Е)-валинил]-(28)-пирролидина, трифторацетат 2-[(-бензотиазолетиазол-2-ил)карбонил] -1-№[{(Ъ)-аланил}глицил] -(2 8)-пирролидина, трифторацетат 2-[(пиридин-2-ил)карбонил]-1-№[№{(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина и другие их фармацевтически приемлемые соли. Эти соединения описаны в \УО 03/033524.
Кроме того, согласно настоящему изобретению в сочетании с эффекторами ОС можно применять замещенные аминокетоны. Предпочтительными замещенными аминокетонами являются хлорид 1-циклопентил-3 -метил-1 -оксо-2-пентанаминия, хлорид 1-циклопентил-3 -метил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 1-циклопентил-3,3-диметил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 1-циклогексил-3,3-диметил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 3-(циклопентилкарбонил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолиния, хлорид №(2-циклопентил-2-оксоэтил)циклогексанаминия и другие их фармацевтически приемлемые соли.
Ранее считалось, что из редкой группы специфических для пролина протеаз ЭР IV является единственным связанным с мембраной ферментом, специфическим для пролина в качестве предпоследнего остатка на аминоконце полипептидной цепи. Однако были выявлены другие молекулы, даже не обладающие структурной гомологией ЭР IV, но обладающие соответствующей ферментативной активностью. Подобные ЭР I У-ферменты, которые были выявлены к настоящему времени, представляют собой, например, протеин α, участвующий в активации фибробластов, дипептидилпептидазу IV β, белок, подобный дипептидиламинопептидазе, Ν-ацетилированная α-связанная кислотная дипептидаза, пролиндипептидаза покоящихся клеток, дипептидилпептидаза II, аттрактин и белок, родственный дипептидилпептидазе IV (ЭРР 8), ЭРЫ (ЭРХ, ЭР6), ЭРЬ2 и ЭРР 9, которые описаны в обзорных статьях 8ебо и Майк (8ебо и Ма11к, ВюсЫт. Вюркук. Ас1а., 36506, 2001, сс. 1-10) и АЬЬой и Согге11 (АЬЬой С.А. и Согге11 Μ.Ό. в: ЕсЮрерПбакек, под ред. Ьапдпег и Апкогде, изд-во К1и\тег Асабетю/Р1епит РиЬкккегк, Νο\ν Уотк, 2002, сс. 171-195). В настоящее время описано клонирование и характеристики дипептидилпептидазы 10 (ЭРР 10) (Οί 8.Υ. и др., Вюскетюа! 1оита1 Iттеά^аΐе РиЬксайоп, публикация 28 марта 2003г., рукопись В120021914).
- 11 009291
Эффекторы в контексте настоящего описания обозначают молекулы, которые связываются с ферментом и понижают или повышают его активность ίη νίίτο и/или ίη νίνο. Некоторые ферменты несут сайты связывания для небольших молекул, которые влияют на их каталитическую активность; молекулустимулятор называют активатором. Ферменты могут нести даже несколько сайтов, которые распознаются более чем одним активатором или ингибитором. Ферменты могут обнаруживать концентрации различных молекул и использовать эту информацию для изменения собственной активности.
Эффекторы могут модулировать ферментативную активность, поскольку ферменты могут принимать как активную, так и неактивную конформацию: активаторы являются позитивными эффекторами, ингибиторы являются негативными эффекторами. Эффекторы воздействуют не только на активные сайты ферментов, но также на регуляторные сайты или аллостерические сайты, последнее понятие применяют для того, чтобы подчеркнуть, что регуляторный сайт представляет собой элемент фермента, отличный от каталитического сайта, и для того, чтобы отделить эту форму регуляции от конкуренции между субстратами и ингибиторами на каталитическом сайте (Эагпе11 ί.. Ьоб18Й Н. и ВаШшоге Ό., Мо1еси1аг Се11 Βίοίοβν. 2-ое изд., изд-во 8с1еп6Пс Лшепсап Воокк, Ыете Уогк, 1990, с 63).
В пептидах, предлагаемых в настоящем изобретении, каждый аминокислотный остаток обозначен однобуквенным или трехбуквенным кодом, который соответствует тривиальному названию аминокислоты, общепринятые обозначения которых представлены ниже.
Аминокислота Однобуквенный символ Трехбуквенный символ
Аланин А А1а
Аргинин К Аге
Аспарагин N А$п
Аспарагиновая кислота Ц Авр
Цистеин С Су8
Глутамин <3 О1п
Глутаминовая кислота Е О1и
Глицин а О1у
Гистидин н ΗΪ5
Изолейцин I Не
Лейцин ь Ьеи
Лизин к Ьуз
Метионин м Ме»
Фенилаланин Р РЬе
Пролин Р Рго
Серин 8 8ег
Треонин т ТЬг
Триптофан V/ Тгр
Тирозин Υ Туг
Валин V Уа1
Понятие «ОС» в контексте настоящего описания обозначает глутаминилциклазу (ОС) и ОС-подобные ферменты. ОС и ОС-подобные ферменты имеют идентичную или сходную ферментативную активность, обозначенную далее как ОС-активность. Следует отметить, что ОС-подобные ферменты могут принципиально отличаться от ОС по молекулярной структуре.
Понятие «ОС-активность» в контексте настоящего описания обозначает внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (рС1ц*), или Ν’концевого Ь-гомоглутамина, или Ε-β-гомоглутамина с образованием циклического пирогомоглутаминового производного с выделением в свободном состоянии аммиака (см. ниже схемы 1 и 2).
Схема 1
Циклизация глутамина с помощью ОС
пептид | пептид
ΝΗ Ϊ ΗΝ
Н,М._ X. \_=о
О ΝΗ3 ή /ΝΗ
Ο;>^ΝΗ2 ОС ч О
- 12 009291
Схема 2
Циклизация Ь-гомоглутамина с помощью ^С
Понятие «ЕС» в контексте настоящего описания обозначает побочную активность ОС и ОС-подобных ферментов, таких как глутаматциклаза (ЕС), которая обозначена далее как ЕС-активность.
Понятие «ЕС-активность» в контексте настоящего описания обозначает внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых глутаматных остатков с образованием пироглутаминовой кислоты (рО1и*) с помощью ОС (см. ниже схему 3).
Понятие «металлзависимый фермент» в контексте настоящего описания обозначает фермент(ы), который (ые) связывает(ют) ион металла для того, чтобы осуществлять присущую ему(им) каталитическую функцию и/ или для которого(ых) требуется связывание иона металла для формирования каталитически активной структуры.
Молекулы, которые связываются с ферментами и понижают или повышают их активность, называют «эффекторы». Эффекторы могут модифицировать ферментативную активность, поскольку ферменты могут иметь как активную, так и неактивную конформацию: активаторы являются позитивными эффекторами; ингибиторы являются негативными эффекторами. Эффекторы связываются с регуляторными сайтами или аллостерическими сайтами (от греческого «другая форма»), это понятие применяют для того, чтобы подчеркнуть, что регуляторный сайт представляет собой элемент фермента, отличный от каталитического сайта, и для того, чтобы отделить эту форму регуляции от конкуренции между субстратами и ингибиторами на каталитическом сайте.
Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения предпочтительными могут являться либо активаторы, либо ингибиторы.
Схема 3
Ν-концевая циклизация незаряженных глутамильных пептидов с помощью ОС (ЕС)
Следующим объектом настоящего изобретения является идентификация новых физиологических субстратов ОС. Их идентифицировали, осуществляя эксперименты по циклизации, описанные в примере 5, с использованием пептидов млекопитающих. Предварительно человеческую ОС и ОС из папайи выделяли согласно процессу, описанному в примере 1. Применяемые методы описаны в примере 2, а применяемый пептидный синтез изложен в примере 6. Результаты исследования представлены в табл. 1.
Таблица 1 Новые физиологические субстраты глутаминилциклазы (*, количественное определение проведено с помощью ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ-экспериментов)
Субстрат Человеческая ОС ОС из папайи
км (мкМ) ^са! (с’*) мМ'1 с'1) Км (мкМ) ^са1 (с'*) кса(/Км (мМ-1 с'1)
[(ЛпУгастрин 31 ±1 54,1 ±0,6 1745,2 +36,9 34 ±2 25,8 +0,5 759 ±30
[ОП^-нейротензин 37 ±1 48,8 +0,4 1318,9 ±24,8 40 ±3 35,7 ±0.9 893 +44
[ΟΙη'ΐ-ΓΡΡ 87 ±2 69,6 +0,3 800,0 ±14,9 232 ±9 32,5 +0,4 140+4
[О1п']-ТКН 90 +4 82,8 ±1,2 920,0 ±27,6 н.д. Н.д. Н.д.
[СИп’рСпКН 53 ±3 69,2 + 1,1 1305,7 ±53,2 169 ±9 82,5 ±1,9 488,2 +14,8
[СИп ]-глюкагон(3- 29) * *
[611?]-вещество Р(5- 11) * *
- 13 009291
Все анализы осуществляли в оптимальном диапазоне активности и стабильности либо человеческой, либо растительной ОС что продемонстрировано в примере 4.
Άминокислотные последовательности физиологически активных пептидов, несущих Ν-концевой остаток глутамина и, следовательно, являющихся субстратами для фермента РС, представлены в табл. 2.
Таблица 2 Лминокислотные последовательности физиологически активных пептидов с Ν-концевыми остатками глутамина
Пептид Аминокислотная последовательность Функция
гастрин 17 Змбзв-Рго!: Р01350 ()ЮР 9/1. ΕΕΕΕΕΑΥΩλΥΜ ОГ (амид) Гастрин стимулирует слизистую желудка к производству и секреции соляной кислоты и поджелудочную железу к секреции ее пищеварительных ферментов. Он стимулирует также сокращение гладких мышц и усиливает кровоток и секрецию воды в желудке и тонком кишечнике.
нейротензин 3\νΐ85-ΡΓ0ΐ: Р30990 ΟίΥΕΝΚΡΚΒ.Ρ У1Ь Нейротензин играет эндокринную и паракринную роль в регуляции метаболизма жиров Он вызывает сокращение гладких мышц.
РРР ОЕР амид Трипептид, родственный тиреотропин-рилизингфактору (ТКН), обнаружен в семенной плазме. В современных исследованиях /и νίζτο и ίη νϊνο установлено, что ГРР играет важную роль в регуляции фертильности спермы.
ткн 8уу183-Рго1: Р20396 С)НР амид ТКН функционирует в качестве регулятора биосинтеза Т8Н в передней доле гипофиза и в качестве нейротрансмиттера/нейром одулятора в центральной и периферической нервной системе.
ОпКН 5Мз8-Рго1: Р01148 ОШУКУбЬ КР(О) амид Стимулирует секрецию гонадотропинов; стимулирует секрецию, как лютеинизирующего, так и фолликулостимулируьощег о гормона.
ССИ6 (малый индуцибельный цитокин А16) 8м0зз-Рго1: 015467 рРКУРЕ1У УЫТРЗТССЬК УУЕКУБРККЕ ννΟΥΚΚΑίΝΟ НЬРАПЕУТК ΚΝΚΕΥΟΤΝΡΝ ГЮУАОЕУТКП ΡΝΕΡΕΕΡΤΚΝ БЗТУКПТАК ΝΟ<2Ρ()ΕΕΝ8ζ> Обладает хемотаксической активностью для лимфоцитов и моноцитов, но не для нейтрофилов. Проявляет также высокую миелосупрессорную активностью, подавляет пролиферацию миелоидных клеток-предшественников. Рекомбинантный 8СУА16 обладает хемотаксической активностью для моноцитов и ТНР-1моноцитов, но не для покоящихся лимфоцитов и нейтрофилов. Индуцирует поток кальция в ТНР-1клетках, которые предварительно десенсибилизированы посредством предыдущей экспрессии ΚΑΝΤΕ8.
- 14 009291
1ССЬ8 (малый индуцибельный цитокин А8) 8тйП88-Рго1: Р80075 (}РО8У81 ΡΙΤΟΟΡΝνίΝ КЮРК/ЖЬЕЗ ΥΤΚΙΤΝΙΟΟΡ ΚΕΑνίΡΚΤΚΚ СКЕУСАОРКЕ ΚΐννΚΟ8ΜΚΗΕ ϋΟΙΓρΝΙ,ΚΡ Хемотаксический фактор, привлекающий моноциты, лимфоциты, базофилы и эозинофилы. Может играть роль в неоплазии и воспалительных реакциях хозяина. Этот белок может связывать гепарин.
ССЬ2 (малый индуцибельный цитокин А2) 5\νίδ8-ΡΓοί: Р13500 ΟΡΟΑΙΝΑ ΡνΤίΧΎΝΕΤΝ КК18У(}КЕА8 УК.К1Т88КСР ΚΕΑνίΓΚΤίν АКЕ1САБРК0 ΚΛνν<2Ο8ΜϋΗΕ СКОТрТРКТ Хемотаксический фактор, привлекающий моноциты и базофилы, но не нейтрофилы или эозинофилы. Повышает противоопухолевую активность моноцитов. Участвует в патогенезе заболеваний, характеризующихся инфильтрацией моноцитов, таких как псориаз, ревматоидный артрит или атеросклероз. Может участвовать в рекрутменте моноцитов в стенке артерий в процессе развития атеросклероза. Связывается с ССВ.2 и ССК4.
ССЫ8 (малый индуцибельный цитокин А18) 8твз-Рго1: Р55774 рУОТИКЕБС ουνγτεν/οιρ ΟΚΡίνϋΥΚΕΤ 8Р(2СРКР6У1 ЬЕТККОКр1С ΑΟΡΝΚΚ\νν(2Κ ΥΙδΏΕΚΕΝΑ Хемотаксический фактор, привлекающий лимфоциты, но не моноциты или гранулоциты. Может участвовать в В-клегочной миграции в В-клеточные фолликулы в лимфатических узлах Привлекает нестимулированные Τ’лимфоциты к дендритным клеткам и активированные макрофаги в лимфатические узлы, обладает хемотаксической активностью для нестимулированных Тклеток, СЭ4+- и СО8+-Т клеток и поэтому может играть роль, как в гуморальных, так и в клеточно-опосредуемых иммунных ответах.
Фракталкин (нейротактин) 8ш13в-Рго1: Р78423 С)НН6УТ КСЬПТСЗКМТ ЗИРУАЬЫН Υ(}<3Ν(2Α8Γ6Κ КАПЬЕТ^Н КЕРСАОРКЕЦ ХУУКОАМрНЬО Κζ>ΑΑΑΕΤΚΝ<3 СТРЕКрЮЕУ ΚΡ ΚΤΤΡΑАСС ΜΌΕ8ννΐ_ΕΡΕ АТОЕ888ЬЕР ΤΡ88ς>ΕΑς>ΚΑ ШТ8РЕЕРТС νΤ6886ΤΚΕΡ ΡΤΡΚΑΟϋΟΟΡ УСТЕЬРКУРР У8ТААТ1¥С>88 ΛΡΗΓ)Ρ<3Ρ8ΤΛν ΑΕΑΚΤ5ΕΑΡ8 Т(?ОР8ТС)А8Т Α88ΡΑΡΕΕΝΑ Ρ8Ε09Κνλν09 698ΡΚΡΕΝ8Ε ЕКЕЕМСРУРА ΗΤΠΑΡΟΓΑνΟΡ σδΜΑΗνεννρ У88ЕОТР8КЕ РУА8С8\УТРК ΑΕΕΡΙΗΑΤΜΟ Р9аЬОУЫТР νΡϋΑςΑΑΤΚΚ ΟΑνσίΧΑΡΕΟ ЬЬРСЬОУАМР ТУО81.ОС1СРК КМАОЕМАЕСЬ ΚΥΙΡΚ80Ο8Ν зууьуру Растворимая форма является хемотаксической для Т-клеток и моноцитов, но не для нейтрофилов. Связанная с мембраной форма усиливает адгезию таких лейкоцитов с эндотелиальными клетками. Может играть роль в регуляции процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелии. Связывается с схЗсг!.
- 15 009291
ССЬ7 (малый индуцибельный цитокин А7) 5М88-Рго{: Р80098 ζ)ΡνθΙΝΤ 8ТТССΥΚΡΙΝ КК1РК0КБЕ8 УКЕТТЗЗНСР ΚΕΑνίΓΚΤΚΧ Γ)Κ.ΕΙ€ΑϋΡΤζ> КШ'ООЕМКНЬ ОККТОТРКГ Хемотаксической фактор, привлекающий моноциты и эозинофилы, но не нейтрофилы. Усиливает противоопухолевую активность моноцитов. Индуцирует также высвобождение желатиназы В. Этот белок может связывать гепарин. Связывается с ССК.1, ССР2 и ССКЗ.
орексин А (гипокретин-1) 5\νΪ88-ΡΓθΙ 043612 ОРБРОССКрК ТСЗСКЬУЕЬЬ ΗΟΑΟΝΗΑΑΟΙ ЬТБ Нейропептид, который играет важную роль в регуляции всасывания пищи и в нарушении сна, вероятно» из-за координации комплекса поведенческих и физиологических реакций этих комплементарных, связанных с гомеостазом функций. Он играет также существенную роль в связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма» нарушении функции вегетативной нервной системы, нарушении гормонального баланса и нарушении регуляции общей воды организма. Орексин-А связывается как с 0X1 К, так и с 0Х2К с высокой (7) аффинностью.
вещество Р КРК Р<2<)ЕЕ<ЗЬМ Принадлежит к тахикинам. Тахикины представляют собой активные пептиды, которые возбуждают нейроны, вызывают поведенческие реакции, являются эффективными вазодилататорами и усиливающими секрецию факторами и сокращают (прямо или косвенно) целый ряд гладких мышц.
Согласно четвертому варианту осуществления изобретения были идентифицированы в качестве новых физиологических субстратов ОС пептиды |С1п'|гастрин (длиной 17 и 34 аминокислоты), |С1п'|нейротензин и |С1п'|ЕРР. Гастрин, нейротензин и ЕРР несут остаток рО1и в Ν-концевом положении. Установлено, что у всех пептидов этот Ν-концевой остаток рО1и образован из Ν-концевого глутамина с помощью ОС-катализа. В результате эти пептиды активизируются с точки зрения их биологической функции при превращении Ν-концевого остатка глутамина в рО1и.
Клетки, обладающие способностью к трансдукции через эпителий, прежде всего несущие гастрин (О) клетки, осуществляют координацию секреции желудочной кислоты и поступающей в желудок пищи. В современных исследованиях установлено, что из предшественника гастрина образуются продукты с множеством видов активности и что существует целый ряд важных моментов в биосинтезе гастрина. Участвующие в биосинтезе предшественники и промежуточные продукты (прогастрин и О1у-гастрины), возможно, представляют собой факторы роста; их продукты, амидированные гастрины, регулируют пролиферацию эпителиальных клеток, дифференцировку продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток (ЕСЬ-клеток) и экспрессию генов, связанных с синтезом и хранением гистамина в ЕСЬ-клетках, а также острую стимуляцию секреции кислоты. Гастрин стимулирует также производство представителей семейства эпидермального фактора роста (ЕОЕ), которые, в свою очередь, ингибируют функцию париетальных клеток, но стимулируют рост поверхностных эпителиальных клеток. Концентрации гастрина в плазме у пациентов, зараженных Не11соЬас1ег ру1оп, у которых, как известно, существует повышенный риск возникновения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и рака желудка, повышены (Эоскгау О.1., 1. Рйузю1. 15, 1999, сс 315-324).
Известно, что пептидный гормон гастрин, который выделяется из антральных О-клеток, стимули
- 16 009291 рует синтез и высвобождение гистамина из ЕСЬ-клеток в кислородпродуцирующую слизистую через ССК-2-рецепторы. Мобилизованный гистамин индуцирует секрецию кислоты в результате связывания с Н(2)-рецепторами, локализованными на париетальных клетках. В современных исследованиях сделано предположение о том, что гастрин, как в виде полностью амидированной, так и в виде менее процессированных форм (прогастрин и удлиненный глицином гастрин), также является фактором роста в желудочно-кишечном тракте. Было установлено, что основное трофическое действие амидированного гастрина связано с кислородпродуцирующей слизистой желудка, где он вызывает повышенную пролиферацию стволовых клеток желудка и ЕСЬ-клеток, что приводит к увеличению массы париетальных и ЕСЬ-клеток. С другой стороны, основной мишенью трофического действия менее процессированного гастрина (например, удлиненного глицином гастрина), вероятно, является слизистая ободочной кишки (Кой Т.1. и Сйеи, И., Кеди1. Рер1. 93, 2000, сс. 37-44).
Согласно пятому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение повышающих активность эффекторов ОС для стимуляции пролиферации клеток желудочно-кишечного тракта, прежде всего пролиферации слизистых клеток желудка, пролиферации эпителиальных клеток, дифференцировки продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток (ЕСЬ) и экспрессии генов, связанных с синтезом и хранением гистамина в ЕСЬ-клетках, а также для стимуляции острой секреции кислоты у млекопитающих путем поддерживания или повышения концентрации активного |рС1и'| гастрина.
Согласно шестому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение понижающих активность эффекторов ОС для лечения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и рака желудка, связанного или не связанного с Нейойас1ег ру1оп. у млекопитающих путем снижения скорости превращения неактивного [01η1] гастрина в активный |рС1и'| гастрин.
Нейротензин (НТ) представляет собой нейропептид, участвующий в патофизиологии шизофрении, который специфически модулирует системы нейротрасмиттеров (нейромедиаторов), регуляция которых, как продемонстрировано ранее, нарушается при этом заболевании. Клинические исследования, при которых определяли концентрации НТ в спинно-мозговой жидкости (СМЖ), позволили выявить группу страдающих шизофренией пациентов с пониженными концентрациями НТ в ЦСЖ, которые восстанавливались при эффективном лечении с помощью антипсихотических лекарственных средств. Известны также данные, которые являются важным подтверждением роли НТ-систем в механизме действия антипсихотических лекарственных средств. Поведенческие и биохимические реакции при введении НТ в центральную нервную систему очень сходны с реакциями на системное введение антипсихотических лекарственных средств, и антипсихотические лекарственные средства повышают нейротрансмиссию НТ. Совокупность этих данных привела к гипотезе о том, что НТ функционирует в качестве эндогенного антипсихотического агента. Кроме того, обычные и атипичные антипсихотические лекарственные средства по-разному изменяют нейротрансмиссию НТ в области черного тела и в мезолимбических допаминсодержащих конечных областях, и эти эффекты обусловливают способность вызывать побочные действия и эффективность, соответственно (Вшйег Е.В. и др., Вю1. РкусЫайу, 50, 2001, сс. 856-872).
Согласно седьмому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение повышающих активность эффекторов ОС для приготовления антипсихотических лекарственных средств и/или для лечения шизофрении у млекопитающих. Эффекторы ОС либо поддерживают, либо повышают концентрацию активного [р01и1]нейротензина.
Стимулирующий оплодотворение пептид (ЕРР), трипептид, родственный тиреотропин-рилизингфактору (ТИН), обнаружен в семенной плазме. Современные исследования ίη νίΐτο и ίη νίνο позволили установить, что ЕРР играет важную роль в регуляции фертильности спермы. В частности, ЕРР, прежде всего, стимулирует «включение» не способных к оплодотворению (неактивных) сперматозоидов и существенно быстрее делает их фертильными, а затем поддерживают эту способность посредством того, что сперматозоиды не подвергаются спонтанной потере акросомы и вследствие этого не теряют способность к оплодотворению. Аденозин, который, как известно, регулирует путь трансдукции сигнала аденилилциклазы (АС)/цАМФ, приводит к аналогичным реакциям и фактически усиливает их. Установлено, что и ЕРР, и аденозин стимулируют производство цАМФ в неактивных клетках, но ингибируют его в активных клетках, причем ЕРР-рецепторы каким-то образом взаимодействуют с аденозиновыми рецепторами и 0-протеинами для осуществления регуляции АС. Эти события влияют на состояние фосфорилирования тирозина различных белков, некоторые из которых важны для начального «включения», другие, вероятно, участвуют в самой реакции акросомы. Кальцитонин и ангиотензин II, также обнаруженные в семенной плазме, оказывают аналогичные действия ίη νίίτο на неактивные сперматозоиды и могут усиливать реакции на ЕРР. Эти молекулы оказывают аналогичные действия ίη νίνο, оказывая влияние на фертильность путем стимуляции и затем поддержания способности к оплодотворению. Любое уменьшение доступности ЕРР, аденозина, кальцитонина и ангиотензина II или дефекты в их рецепторах участвуют в развитии мужского бесплодия (Егакег Ь.И. и Айеоуа-Оыдита 8. А., Уйаш. Ногт. 63, 2001, сс. 1-28).
Согласно восьмому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение понижающих активность эффекторов ОС для приготовления препятствующих оплодотворению лекарственных средств и/или для снижения фертильности у млекопитающих. Понижающие активность эффек
- 17 009291 торы ОС снижают концентрацию активного |рС1и'|ЕРР. что приводит к предупреждению способности к оплодотворению спермы и к дезактивации сперматозоидов. В противоположность этому, установлено, что повышающие активность эффекторы ОС могут стимулировать фертильность особей мужского пола и их можно применять для лечения бесплодия.
Согласно девятому варианту осуществления настоящего изобретения были идентифицированы дополнительные физиологические субстраты ОС. Они представляют собой [С1п1]ССЬ2, [С1п1]ССЬ7, [С1п1]ССЬ8, [С1п1]ССЬ16, [С1п1]ССЬ18 и [С1п!]фракталкин (более подробные характеристики приведены в табл. 2). Эти полипептиды играют важную роль в таких физиологических состояниях, как подавление пролиферации миелоидных клеток-предшественников, неоплазии, воспалительных реакций хозяина, рака, псориаза, ревматоидного артрита, атеросклероза, гуморальных и клеточно-опосредуемых иммунных ответов, процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий.
В настоящее время в клинических опытах изучено несколько цитотоксических вакцин на основе пептидов Т-лимфоцитов против гепатита В, вируса иммунодефицита человека и меланомы. Одной из перспективных вакцин против миеломы, которую применяют индивидуально или в сочетании с другими опухолевыми антигенами, является декапептид ΕΕΑ. Этот пептид является аналогом иммунодоминантного пептида антигена Ме1аη-Α/МΑВТ-1 с Ν-концевой глутаминовой кислотой. Известно, что аминогруппа и гамма-карбоксильная группа глутаминовых кислот, а также аминогруппа и гамма-карбоксамидная группа глутаминов легко конденсируются с образованием пироглутаминовых производных. Для решения указанных проблем, связанных со стабильностью, было разработано несколько пептидов, представляющих интерес с фармацевтической точки зрения, которые содержали пироглутаминовую кислоту вместо Ν-концевого глутамина или глутаминовой кислоты без потери фармакологических свойств. Однако по сравнению с ΕΕΑ у производного пироглутаминовой кислоты (Ρу^Ε^Α), а также Ν-концевого кэппированного ацетилом производного (ΑсΕ^Α) не удалось сохранить цитотоксическую активность, присущую Т-лимфоцитами (СТЬ). Несмотря на то, что в Ρу^Ε^Α и ΑсΕ^Α были внесены кажущиеся очень небольшими модификации, эти два производных, вероятно, обладают более низкой аффинностью по сравнению с ΕΕΑ к специфическому классу I главного комплекса гистосовместимости. Следовательно, для того, чтобы полностью сохранить активность ΕΕΑ, следует избегать образования Ρу^Ε^Α (Беск А. и др., I. Рер! Вез. 57(6), 2001, сс. 528-38.). В последние годы установлено, что при меланомах происходит также сверхэкспрессия глутаминилциклазы (ОС) (Возз Э.Т. и др., №11. Сепе! 24, 2000, сс. 227-235).
Согласно десятому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение эффекторов ОС для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патофизиологических состояний, например для подавления пролиферации миелоидных клеток-предшественников, неоплазии, воспалительных реакций хозяина, рака, злокачественного метастаза, меланомы, псориаза, ревматоидного артрита, атеросклероза, нарушенных гуморальных и клеточно-опосредуемых иммунных ответов, процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий.
Согласно одиннадцатому варианту осуществления настоящего изобретения был идентифицирован [С1п!]орексин в качестве физиологического субстрата ОС. Орексин А представляет собой нейропептид, который играет важную роль в регуляции всасывания пищи и нарушения сна, вероятно, в результате координации комплекса поведенческих и физиологических реакций этих комплементарных связанных с гомеостазом функций. Он играет также существенную роль в связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма, функции вегетативной нервной системы, гормональном балансе и регуляции общей воды организма.
Согласно двенадцатому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение эффекторов ОС для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения нарушенного всасывания пищи и сна, нарушенной связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма, нарушенной функции вегетативной нервной системы, нарушенного гормонального баланса и нарушенной регуляции общей воды организма.
Экспансия полиглутамина в некоторые белки приводит к возникновению нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Кеннеди. Их механизм пока остается неясным. Биохимические свойства полиглутаминовых повторов предполагает наличие одного из возможных объяснений: эндолитическое расщепление связи глутаминил-глутаминил с последующим образованием пироглутамата может принимать участие в патогенезе в результате повышения катаболитической стабильности, гидрофобности, амилоидогенеза и нейротоксичности полиглутаминильных белков (8а1бо Т., Меб. Нуро(Ьезез, 54(3), март 2000, сс. 427-429).
Таким образом, согласно тринадцатому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение эффекторов ОС для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения болезни Паркинсона и болезни Гентингтона.
Согласно четырнадцатому варианту осуществления настоящего изобретения предложен общий путь снижения или ингибирования ферментативной активности ОС. Предложены также репрезентативные ингибиторы.
Первоначально в качестве ингибиторов ОС млекопитающих был описан только 1,10-фенантролин и восстановленный 6-метилптерин (Ъи8Ьу А.Н.1. и др., I. Βώ! СЬет. 262, 1987, сс. 8532-8536). ЭДТК не ингибирует ОС, из чего было сделано заключение, что ОС не представляет собой металлзависимый фермент (Лизку А.Н.1. и др., I. Βώ! СЬет. 262, 1987, сс. 8532-8536, Βаΐетаη В.С.1. и др., Β^οсЬет^зί^у 40, 2001, сс. 11246-11250, ΒοοίЬ ВЛ. и др., ВМС Βώ^^ 2, 2004). Однако при создании настоящего изобретения
- 18 009291 установлено, что человеческая ОС и другие ОС животного происхождения являются металлзависимыми ферментами, что доказано по характеристикам ингибирования ОС 1,10-фенантролином, дипиколиновой кислотой, 8-гидроксихинолином и другими хелаторами (фиг. 18, 19) и по реактивации ОС ионами переходных металлов (фиг. 20). И, наконец, зависимость от металлов вытекает при сравнении с последовательностями других зависимых от металлов ферментов, что свидетельствует о превращении хелатирующих аминокислотных остатков также и в человеческой ОС (фиг. 21). Взаимодействие соединений с ионом металла, связанным с активным сайтом, представляет собой общий путь ингибирования ОС-активности.
При создании настоящего изобретения установлено, что имидазольные производные являются эффективными ингибиторами ОС. С помощью непрерывного анализа (подробно описанного в примере 2) проанализирован целый ряд имидазольных производных в плане их способности ингибировать человеческую ОС в качестве представителя высококонсервантивных ОС млекопитающих.
Таким образом, в настоящем изобретении предложены имидазольные производные, а также гистидин и его производные в качестве понижающих активность эффекторов ОС и описаны их характеристики с точки зрения типа ингибирования и эффективности. Структуры и значения К1 представлены в табл. 3 и 4. Результаты подробно описаны в примере 7.
Таблица 3
Константы ингибирования имидазольных производных в катализируемой человеческой ОС реакции (Опыты проводили при 30°С в 0,05М трис-НС1-буфере, рН 8,0, содержащем 5 мМ ЭДТК)
Структура
Значение К·. (мМ)
1,1 -сульфонилдиимидазол
4,5-дицианоимидазол ингибирование отсутствует ингибирование отсутствует ингибирование отсутствует ингибирование отсутствует ингибирование отсутствует
С-4(5)-производные
Ν-омега-ацетилгистамин
Ь-гистидинамид
С-2-производные
2-метилбензилимидазол
2-этил-4-метилимидазол
2-аминобензимидазол
2-хлор-1 Н-бензимидазол
Ь-гистидинол
Ь-гистидин
4-имидазолкарбоксальдегид метиловый эфир имидазол4-карбоновои кислоты
Е-гистамин
С-4,5-производные
5-гидроксиметил-4-метилимидазол амид 4-аминоимидазол-5карбоновой кислоты
4,5-дифенилимидазол
Прочие
3-(1Н-имидазол-1-ил)-1-(3метилбензо|Ь]тиофен-2ил)пропан-1-он
Соединение
Структуры ядра имидазол бензимидазол ^-/-производные
1-бензимидазол
I -метилиммидазол
1-винилимидазол диимидазолидид щавелевой кислоты /ν-ацетилимидазол
А-(триметилсилил)имилазол /У-бензоилимидазол
1-(2-оксо-2(Ьенилэтил)имидазол
-(З-аминопропил)имидазол
-фенилимидазол
- 19 009291
4-[(1-метил-1Н-имидазол-5 ил)метил]-3пропилдигидрофуран-2(ЗН)-он
- 0,0067± 0,0003
4-(2-(1 //-имидазо л-1 ил)этокси]бензойная кислота
0,0034 ± 0,0001
3-[3-(1Н-имидазол-1ил)пропил]-2тиоксоимидазолидин-4-он
0,00041 ± 0,00001
5-нитро-2-[2-([ {3-( ΊΗимидазол-!ил)пропил } амино] карбонил)фения]фурамид
0,0066 ± 0,0004
М-(4-хлорфенил)-Ы'-[2-(1Н· имидазол-1 ил)этил]тиомочевина
0,00165 ± 0,00007 метиловый эфир 2-[(5имидазол-1- 0,0322 ± 0,0007 илметилпирролидин-2карбонил)амино]пропионово й кислоты
метиловый эфир 2-[(5- н.д имидазол-1 -илметил-2,3дигидро-1Н-пиррол-2карбонил)амино]пропионово й кислоты
имидазо<1.5а>пиридин 0,0356 ± 0,0005 метил-(25’)-2-{[(25)-2-амино- 0,164 ± 0,004
5-( 1Я-имидазол-1-иламино)5-оксопентаноил]амино}-3метилбутаноат
Таблица 4
Ингибирование ОС Ь-гистамином и его двумя биологическими метаболитами (также называемыми телеметилгистаминами)
- 20 009291
При создании изобретения в процессе изучения ферментативной активности неожиданно было установлено, что помимо Ν-концевого глутаминильного остатка, Ν-концевые β-гомоглутаминильные остатки удовлетворяют характеристикам в качестве субстратов ОС из растений и млекопитающих. Ν-концевой β-гомоглутаминильный остаток превращался в 5-членное лактамовое кольцо посредством реакции, катализируемой человеческой ОС и ОС из папайи, соответственно. Результаты описаны в примере 5. Применяемый метод проиллюстрирован в примере 2, а пептидный синтез осуществляли согласно методу, описанному в примере 6.
Еще один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способам скрининга эффекторов ОС.
Предпочтительный способ скрининга для идентификации модифицирующих активность эффекторов ОС из группы соединений, предусматривает стадии, которые заключаются в том, что:
а) приводят в контакт соединения с ОС в условиях, которые позволяют осуществлять их связывание;
б) добавляют субстрат ОС;
в) оценивают превращение субстрата или необязательно определяют остаточную ОС-активность; и
г) количественно оценивают изменения в превращении субстрата и/или ферментативной активности ОС для идентификации модифицирующего активность эффектора.
Другой предпочтительный способ скрининга аналогичен методу идентификации и отбора эффекторов, которые взаимодействуют непосредственно или опосредованно с ионом металла, связанным с активным сайтом ОС, и он предусматривает стадии, которые заключаются в том, что:
а) приводят в контакт соединения с ОС в условиях, которые позволяют осуществлять их связывание;
б) добавляют субстрат ОС который подвергается превращению с помощью ОС;
в) оценивают превращение субстрата или необязательно определяют остаточную ОС-активность; и
г) количественно оценивают изменения в превращении субстрата и/или ферментативной активности ОС, где изменения можно использовать для идентификации модифицирующего активность эффектора.
Предпочтительными для применения в вышеуказанных методах скрининга являются ОС млекопитающих или ОС из папайи. Особенно предпочтительной является ОС млекопитающих, так как эффекторы, идентифицированные с помощью указанных способов скрининга, можно использовать для лечения болезней млекопитающих, прежде всего человека.
Эти агенты, отобранные с помощью описанных выше способов скрининга, могут осуществлять снижение превращения по меньшей мере одного из субстратов ОС (негативные эффекторы, ингибиторы) или путем увеличения превращения по меньшей мере одного субстрата ОС (позитивные эффекторы, активаторы).
Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть превращены в кислотно-аддитивные соли, прежде всего фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли.
Соли соединений, предлагаемых в изобретении, могут находиться в форме неорганических или органических солей.
Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно превращать и применять в форме кислотно-аддитивных солей, прежде всего в форме фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей. Фармацевтически приемлемая соль, как правило, находится в форме, в которой основная боковая цепь протонирована неорганической или органической кислотой. Репрезентативными органическими или неорганическими кислотами являются соляная, бромисто-водородная, перхлорная, серная, азотная, фосфорная, уксусная, пропионовая, гликолевая, молочная, янтарная, малеиновая, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, бензойная, миндальная, метансульфоновая, гидроксиэтансульфоновая, бензолсульфоновая, щавелевая, памоновая, 2-нафталинсульфоновая, паратолуолсульфоновая, циклогексансульфамовая, салициловая, сахариновая или трифторуксусная кислота. Подразумевается, что все формы соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, в виде кислотно-аддитивных солей подпадают под объем настоящего изобретения.
Учитывая близкое сходство соединений в свободной форме и соединений в форме соли, следует иметь в виду, что когда в настоящем описании упоминается соединение, то при этом подразумевается соответствующая его соль, при условии, что существует возможность ее получения и применения в определенных условиях.
Если соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют по меньшей мере один хиральный центр, то они могут существовать в виде энантиомеров. Если соединения имеют два или более хиральных центра, то они могут, кроме того, существовать в виде диастереоизомеров. Следует иметь в виду, что все такие изомеры и их смеси подпадают под объем настоящего изобретения. Кроме того, некоторые кристаллические формы соединений могут существовать в полиморфной форме, и такие соединения подпадают под объем настоящего изобретения. Кроме того, некоторые соединения могут образовывать сольваты с водой (т.е. гидраты) или с обычными органическими растворителями, и подразумевается, что такие сольваты также подпадают под объем настоящего изобретения.
Соединения, включая их соли, можно получать также в форме гидратов или в форме, содержащей другие растворители, применяемые для их кристаллизации.
- 21 009291
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу предупреждения или лечения состояния, опосредуемого модуляцией активности фермента ОС у индивидуума, нуждающегося в этом, который заключается в том, что вводят любое из соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, или содержащих их фармацевтических композиций в количестве и согласно схеме приема лекарственного средства, терапевтически эффективных для лечения состояния. Кроме того, под объем настоящего изобретения подпадает применение соединений, предлагаемых настоящем изобретении, и их соответствующих фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей для приготовления лекарственного средства, предназначенного для предупреждения или лечения состояния у индивидуума, опосредуемого модуляцией активности фермента ОС. Соединение можно вводить пациенту с помощью любого стандартного пути введения, включая (но не ограничиваясь ими) внутривенное, оральное, подкожное, внутримышечное, внутрикожное, парентеральное введение и их комбинации.
Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения являются фармацевтические композиции, представляющие собой лекарственные средства, которые содержат по меньшей мере одно соединение, предлагаемое в изобретение, или его соль необязательно в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или растворителями.
Фармацевтические композиции могут находиться, например, в форме препаратов для парентерального или энтерального введения и содержать соответствующие носители или могут находиться в форме препаратов для орального введения, которые могут содержать соответствующие носители, пригодные для орального введения. Предпочтительно они находятся в форме препаратов для орального введения.
Эффекторы ОС-активности, вводимые согласно изобретению, можно применять в составе фармацевтических препаратов или комплексов препаратов в качестве ингибиторов или в сочетании с ингибиторами, субстратами, псевдосубстратами, ингибиторами экспрессии ОС, связывающимися белками или антителами к таким белковым ферментам, которые снижают концентрацию белка ОС в организме млекопитающих. Соединения, предлагаемые в изобретении, позволяют осуществлять регулирование лечения применительно к конкретным пациентам и заболеваниям, в частности при их использовании можно избегать индивидуальной непереносимости, аллергии и побочных действий.
Соединения обладают также различной зависимостью активности от времени. Таким образом, у врача, осуществляющего лечение, имеется возможность различного подхода к индивидуальному состоянию пациента: он может точно регулировать, с одной стороны, быстроту начала действия и, с другой стороны, продолжительность действия и, прежде всего, интенсивность действия.
Предпочтительный способ, предлагаемый в изобретении, представляет собой новый подход к лечению или предупреждению состояния, опосредуемого модуляцией активности фермента ОС у млекопитающих. Его преимущество заключается в том, что он является простым, пригодным для коммерческого применения и удобным для применения, прежде всего, при лечении заболеваний, которые обусловлены нарушением баланса концентрации физиологически активных субстратов ОС, например перечисленных в табл. 1 и 2, прежде всего, для лечения млекопитающих, прежде всего, для лечения человека.
Соединения предпочтительно можно вводить, например, в форме фармацевтических композиций, которые содержат действующее вещество в сочетании с общепринятыми добавками, такими как разбавители, эксципиенты и/или носители, известне в данной области техники. Их можно вводить, например, парентерально (например, ί.ν. в физиологическом растворе) или энтерально (например, орально в виде композиции со стандартными носителями).
В зависимости от их эндогенной стабильности и биологической доступности можно вводить одну или несколько доз соединений в день для достижения требуемой нормализации уровней глюкозы в крови. Такие дозы для человека могут составлять, например, от примерно 0,01 до 250,0 мг в день, предпочтительно от примерно 0,01 до 100 мг соединения на кг веса тела.
Путем введения млекопитающим эффекторов ОС-активности можно предупреждать, или облегчать, или лечить такие состояния, как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, язвенная болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас1ег ру1оп, патогенные психические состояния, шизофрения, бесплодие, неоплазия, воспалительные реакции хозяина, рак, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенная связанная с гомеостазом регуляция энергетического метаболизма, нарушенная функция вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенная регуляция общей воды организма.
Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов ОС-активности можно стимулировать пролиферацию клеток желудочно-кишечного тракта, предпочтительно пролиферацию слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острую секрецию кислоты и дифференцировку продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток.
Кроме того, введение млекопитающему эффекторов ОС-активности может приводить к потере функции сперматозоидов, подавляя тем самым мужскую фертильность. Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ регуляции и контроля мужской фертильности и применение понижающих ОС-активность эффекторов для приготовления контрацептивных лекарственных средств для особей
- 22 009291 мужского пола.
Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов ОС-активности можно подавлять пролиферацию миелоидных клеток-предшественников.
Соединения, применяемые согласно изобретению, можно включать хорошо известным методом в состав стандартных композиций, таких, например, как таблетки, капсулы, драже, пилюли, суппозитории, гранулы, аэрозоли, сиропы, жидкие, твердые и кремообразные эмульсии и суспензии и растворы, с использованием инертных нетоксичных фармацевтически приемлемых носителей и добавок или растворителей. В каждой из таких композиций обладающие терапевтической эффективностью соединения предпочтительно присутствуют в концентрации примерно от 0,1 до 80 мас.%, более предпочтительно от 1 до 50 мас.% в пересчете на общую массу смеси, т.е. в количествах, достаточных для обеспечения требуемого диапазона доз.
Субстанции можно применять в качестве лекарственных средств в форме драже, капсул, жевательных капсул, таблеток, капель, сиропов или также в виде суппозиториев или в виде назальных спреев.
Композиции можно предпочтительно приготавливать, например, путем разбавления действующего вещества растворителями и/или носителями необязательно с применением эмульгаторов и/или диспергаторов, например, в том случае, когда в качестве разбавителя используют воду, необязательно можно применять в качестве вспомогательных растворителей органические растворители.
Примерами эксципиентов, которые можно применять согласно настоящему изобретению, являются вода, нетоксичные органические растворители, такие как парафины (например, фракции нефтепродуктов), растительные масла (например, рапсовое масло, арахисовое масло, кунжутное масло), спирты (например, этиловый спирт, глицерин), гликоли (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль); твердые носители, такие, например, как природные измельченные в порошок минералы (например, высокодисперсный диоксид кремния, силикаты), сахара (например, сахар-сырец, лактоза и декстроза); эмульгаторы, такие как неионные и анионные эмульгаторы (например, эфиры полиоксиэтилена и жирной кислоты, простые эфиры полиоксиэтилена и жирного спирта, алкилсульфонаты и арилсульфонаты), диспергаторы (например, лигнин, сульфитный щелок, метилцеллюлоза, крахмал и поливинилпирролидон) и замасливатели (например, стеарат магния, тальк, стеариновая кислота и лаурилсульфат натрия) и необязательно корригенты.
Введение можно осуществлять стандартным методом, предпочтительно энтерально или парентерально, прежде всего, орально. При энтеральном введении таблетки могут содержать в дополнение к указанным носителям дополнительные добавки, такие как цитрат натрия, карбонат кальция и фосфат кальция, наряду с различными добавками, такими как крахмал, предпочтительно картофельный крахмал, желатин и т.п. Кроме того, дополнительно в процессе таблетирования можно применять замасливатели, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. В случае водных суспензий и/или эликсиров, предназначенных для орального введения, можно добавлять к действующим веществам помимо вышеуказанных эксципиентов различные корригенты или красители.
В случае парентерального введения можно применять растворы действующих веществ с использованием пригодных жидких носителей. Было установлено, что, как правило, в случае внутривенного введения предпочтительно вводить количества, составляющие примерно от 0,01 до 2,0 мг/кг, предпочтительно примерно от 0,01 до 1,0 мг/кг веса тела в день, и в случае энтерального введения доза составляет примерно от 0,01 до 2 мг/кг, предпочтительно примерно от 0,01 до 1 мг/кг веса тела в день.
Тем не менее, в некоторых случаях необходимо отступать от указанных количеств в зависимости от веса тела экспериментального животного или пациента или от пути введения, а также в зависимости от вида животного и его индивидуальной реакции на лекарственное средство или от интервала, с которым осуществляют введение. Следовательно, в определенных случаях может оказаться достаточным применять дозы, меньшие, чем указанные выше минимальные количества, в то время как в других случаях указанный верхний предел может быть превышен. В случаях, когда требуется вводить относительно большие количества, может оказаться целесообразным разделять эти количества на несколько однократных доз, вводимых в один день. Для применения для лечения человека можно использовать тот же самый диапазон доз. Вышеуказанные комментарии применимы также и в этом случае.
Примеры фармацевтических композиций
1. Капсулы, содержащие по 100 мг соединения, предлагаемого в изобретении, на капсулу.
Для получения примерно 10000 капсул приготавливают раствор, имеющий следующий состав.
Соединение, предлагаемое в изобретении 1,0 кг
Глицерин 0,5 кг
Полиэтиленгликоль 3,0 кг
Вода 0,5 кг
5,0 кг
Раствор вносят в мягкие желатиновые капсулы хорошо известным методом. Капсулы можно применять путем разжевывания или проглатывания.
2. Таблетки или таблетки с покрытием или драже, содержащие по 100 мг соединения, предлагаемого в изобретении.
- 23 009291
Для приготовления 100000 таблеток используют следующее количество ингредиентов.
Соединение, предлагаемое в изобретении, тонкоизмельченное 10,00 кг
Глюкоза 4,35 кг
Лактоза 4,35 кг
Крахмал 4,50 кг
Целлюлоза, тонкоизмельченная 4,50 кг
Указанные выше компоненты смешивают и затем добавляют раствор, содержащий
Поливинилпирролидон 2,0 кг
Полисорбат 0,1 кг
Вода Примерно 5,0 кг и гранулируют хорошо известным методом путем пропускания влажной массы через решетчатую мельницу, после чего добавляют 0,2 кг стеарата магния и сушат. Конечную смесь для таблеток массой 30,0 кг подвергают обработке с получением выпуклых таблеток массой 300 мг. В идеальном случае, на таблетки можно наносить покрытие или сахарное покрытие хорошо известным методом. Целесообразно, чтобы фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, содержали комбинацию по меньшей мере одного эффектора ОС-активности и по меньшей мере одного ингибитора ΌΡ IV. Такие фармацевтические композиции можно применять для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
Пример 1. Получение человеческой ОС и ОС из папайи.
Штаммы-хозяева и среды.
Штамм Р1сЫа раЧоШ Х33 (АОХ1, АОХ2), который применяли для экспрессии человеческой ОС, выращивали, трансформировали и анализировали согласно инструкциям производителя (фирма Ιηνίίτο^η). Среды, необходимые для Р. райогщ, т.е. забуференную глицерином (ВМСУ) сложную среду или метанольную (ΒΜΜΥ) сложную среду и базальную (минимальную) соляную среду для ферментации, готовили согласно рекомендациям производителя.
Молекулярное клонирование плазмидных векторов, кодирующих человеческую ОС.
Все процедуры клонирования осуществляли с помощью стандартных методов молекулярной биологии. Для экспрессии в дрожжах использовали вектор рР1С2аВ (фирма ΙηνίίΓο^η). Вектор рОЕ-31 (фирма 0|аде1'1) применяли для экспрессии человеческой ОС в Е. сой. кДНК зрелой ОС, начинающуюся с кодона 38, сливали в рамке считывания с плазмидой, кодирующей метку 6хН18. После амплификации с использованием праймеров рОСус-1 и рОСус-2 (табл. 1) и субклонирования фрагмент встраивали в экспрессионный вектор, используя сайты рестрикции 8рЫ и ΗίηάΙΙΙ.
Трансформация Р. раЧопк и экспрессия в небольших объемах (маломасштабная экспрессия).
Плазмидную ДНК амплифицировали в штамме Е. со11 ΙΜ109 и очищали согласно рекомендациям производителя (фирма 0|аде1'1). В применяемой для экспрессии плазмиде рР1С2аВ существуют 3 сайта рестрикции, пригодных для линеаризации. Поскольку 8ас1 и Вк!Х1 осуществляют расщепление внутри кДНК ОС, для линеаризации был выбран сайт Рте1. 20-30 мкг плазмидной ДНК линеаризовали с помощью Рте1, осаждали этанолом и растворяли в стерильной деионизированной воде. Затем 10 мкг ДНК использовали для трансформации компетентных клеток Р. раЧопк путем электропорации согласно инструкциям производителя (фирма ВюИаб). Отбор осуществляли на планшетах, содержащих 150 мкг/мл зеоцина. Одна трансформация с использованием линеаризованной плазмиды позволяла получать несколько сотен трансформантов.
Для тестирования рекомбинантных клонов дрожжей в отношении экспрессии ОС рекомбинанты выращивали в течение 24 ч в 10-мл конических пробирках, содержащих 2 мл среды ΒΜСΥ. Затем дрожжи центрифугировали и ресуспендировали в 2 мл среды ВММ^, содержащей 0,5% метанола. Эту концентрацию поддерживали, добавляя метанол каждые 24 ч в течение вплоть до 72 ч. Затем определяли ОС-активность в супернатанте. Присутствие слитого белка подтверждали с помощью Вестерн-блоттинга, используя антитело к 6хН18-метке (фирма 0|аде1'1). Клоны, проявляющие наиболее высокую ОСактивность, отбирали для дополнительных экспериментов и ферментации.
Крупномасштабная экспрессия в ферментере.
Экспрессию ОС осуществляли в 5-л реакторе (модель В1о8(а( В, фирма В. Вгннп Ыо1есй.), практически в соответствии с руководством «Рю1па ίοΓηκηΐΗΐίοη ргосекк §шбе1ше8» (фирма ΙηνίΙτο^η). В целом, метод состоял в следующем: клетки выращивали в базальной солевой среде для ферментации, дополненной следовыми количествами солей и глицерином в качестве единственного источника углерода (рН 5,5). В процессе фазы начальной загрузки продолжительностью примерно 24 ч и последующей фазы с периодической подпиткой продолжительностью примерно 5 ч проходило накопление клеточной массы. После достижения массы клеток во влажном состоянии 200 г/л осуществляли индукцию экспрессии ОС, применяя трехстадийную метанольную подпитку, так, чтобы полное время ферментации составляло примерно 60 ч. Затем клетки удаляли из содержащего ОС супернатанта путем центрифугирования при 6000хд, 4°С в течение 15 мин. Значение рН доводили до 6,8, добавляя №1ОН и образовавшийся мутный раствор центрифугировали при 37000х д, 4°С в течение 40 мин. Если раствор оставался мутным, приме
- 24 009291 няли дополнительную стадию фильтрации через целлюлозную мембрану (размер пор 0,45 мкм). Очистка меченной с помощью 6 остатков гистидина (бхНщ) ОС. экспрессированной в Р. райотк. Меченную с помощью Нщ ^С сначала очищали с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованном металле (ИМАХ). Для осуществления общепринятой очистки 1000 мл супернатанта культуры вносили на содержащую Νί2+ хелатирующую сефарозную ЕЕ колонку (1,6х20 см. фирма Рйаттас1а), которую уравновешивали 50 мМ фосфатным буфером, рН 6,8, содержащим 750 мМ №С1, со скоростью потока 5 мл/мин. После промывки колонки уравновешивающим буфером, взятым в объеме, равном 10 объемам колонки, и уравновешивающим буфером, содержащим 5 мМ гистидин, взятым в объеме, равном 5 объемам колонки, связанный белок элюировали путем замены на 50 мМ фосфатный буфер, рН 6,8, содержащий 150 мМ Ναί'Ί и 100 мМ гистидин. Полученный элюат подвергали диализу в противотоке 20 мМ бистрис/НС1-буфера, рН 6,8, при 4°С в течение ночи. Затем ОС дополнительно очищали с помощью анионообменной хроматографии на колонке типа Мопо 06 (фирма ВюКаб), уравновешенной буфером для диализа. Содержащую ОС фракцию вносили на колонку при скорости потока 4 мл/мин. Затем колонку промывали уравновешивающим буфером, содержащим 100 мМ №С1. Элюцию осуществляли с использованием двух градиентов с использованием уравновешивающего буфера, содержащего 240 и 360 мМ №С1, взятого в объеме, равном 30 или 5 объемом колонки, соответственно. Собирали фракции объемом 6 мл и чистоту анализировали с помощью ДСН-ПААГ. Фракции, содержащие гомогенную ОС, объединяли и концентрировали с помощью ультрафильтрации. Для длительного хранения (-20°С) добавляли глицерин до конечной концентрации 50%. Проводили количественную оценку белка методами Бредфорда или Гилла и Гиппеля (ВтабТотб М.М., Апа1. Вюсйет. 72, 1976, сс. 248-254; ОШ Б.С. и νοη Н1рре1 Р.Н., Апа1. Вюсйет. 182, 1989, сс. 319-326).
Экспрессия и очистка ОС в Е. со11.
Конструкцией, кодирующей ОС, трансформировали клетки линии М15 (фирма 01адеп) и выращивали на планшетах в селективной агаровой ЬВ-среде при 37°С. Для экспрессии белка при комнатной температуре использовали ЬВ-среду, содержащую 1% глюкозы и 1% этанола. Когда значение оптической плотности (ОП600) культуры достигало примерно 0,8, экспрессию индуцировали в течение ночи с помощью 0,1 мМ ИНТГ (изопропилтиогалактозид). После одного цикла замораживания и оттаивания клетки лизировали при 4°С, добавляли 2,5 мг/мл лизоцима в 50 мМ фосфатном буфере, рН 8,0, содержащем 300 мМ №1С1 и 2 мМ гистидин, в течение примерно 30 мин. Раствор осветляли путем центрифугирования при 37000хд, 4°С в течение 30 мин с последующей фильтрацией с использованием стеклянной фритты (отделение ДНК) и двух дополнительных стадий фильтрации с использованием целлюлозных фильтров для неочищенных и тонких осадков. Супернатант (примерно 500 мл) вносили на ΝΓ'-ко.тонку для аффинной хроматографии (1,6x20 см) со скоростью потока 1 мл/мин. Элюцию ОС осуществляли с помощью 50 мМ фосфатного буфера, содержащего 150 мМ №1С1 и 100 мМ гистидин. Содержащую ОС фракцию концентрировали ультрафильтрацией.
Очистка ОС из латекса папайи.
ОС из латекса папайи получали, используя систему ВюСАЭ 700Е (фирма РегеерШ'е Вюкуйетк, Висбаден, Германия) с использованием модифицированной версии ранее описанного метода (2етйоиш Б. и др., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а. 138, 1989, сс. 275-290). 50 г латекса растворяли в воде и центрифугировали согласно описанному методу. Для инактивации протеаз применяли Б-метилметантиосульфонат и полученный неочищенный экстракт подвергали диализу. После диализа весь супернатант вносили на колонку (21x2,5 см внутренний диаметр (ί.ά.)) из БР-сефарозы, которую можно применять при высокой скорости потока (Еа§1 Е1оте, ЕЕ), уравновешенную 100 мМ натрийацетатным буфером, рН 5,0 (скорость потока 3 мл/мин). Элюцию осуществляли в три стадии, повышая концентрацию натрийацетатного буфера, при скорости потока 2 мл/мин. На первой стадии использовали линейный градиент от 0,1 до 0,5М ацетатного буфера, взятого в объеме, равном 0,5 объема колонки. На второй стадии использовали линейное повышение концентрации от 0,5 до 0,68М в 4 объемах колонки. Во время последней стадии элюции использовали 0,85М буфер в 1 объеме колонки. Объединяли фракции (6 мл) с наиболее высокой ферментативной активностью. При ультрафильтрации осуществляли замену концентрации и буфера на 0,02М трис/НС1, рН 8,0 (фирма Атюоп; мембрана с пределом пропускания молекулярной массы 10 кДа).
Добавляли сульфат аммония к концентрированному ферменту из папайи, полученному после стадии ионообменной хроматографии, до получения конечной концентрации 2М. Этот раствор вносили на Еа§1 Е1оте-колонку (21x2,5 см ί.ά.), заполненную бутилсефарозой 4 (скорость потока 1,3 мл/мин), уравновешенную 2М сульфатом аммония, 0,02М трис/НС1, рН 8,0. Элюцию осуществляли в три стадии понижающимися концентрациями сульфата аммония. На первой стадии использовали линейный градиент от 2 до 0,6М сульфата аммония, 0,02М трис/НС1, рН 8,0 в объеме, равном 0,5 объема колонки, при скорости потока 1,3 мл/мин. На второй стадии использовали линейный градиент от 0,6 до 0М сульфата аммония, 0,02М трис/НС1, рН 8,0 в объеме, равном 5 объемам колонки, при скорости потока 1,5 мл/мин. Последнюю стадию элюции осуществляли, используя 0,02М трис/НС1, рН 8,0, в объеме, равном 2 объемам колонки, при скорости потока 1,5 мл/мин. Все содержащие ОС-активность фракции объединяли и концентрировали ультрафильтрацией. Полученную гомогенную ОС хранили при -70°С. Конечные концентрации белка определяли методом Брэдфорда, осуществляя сравнение со стандартными кривыми, получен
- 25 009291 ными для бычьего сывороточного альбумина.
Пример 2. Анализы глутаминилциклазной активности.
Флуорометрические анализы.
Все измерения осуществляли с использованием ридера для биологических анализов (ВюАввау Веабег) типа НТ8-7000Р1ив для микропланшетов (фирма Регкт Е1тег) при 30°С. Активность ОС оценивали флуорометрически с использованием в качестве субстрата Н-С1η-βNΑ. Образцы содержали 0,2 мМ флуорогенный субстрат, 0,25 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма υη^ζуте, Хорсгольм, Дания) в 0,2М трис/НС1, рН 8,0, содержащем 20 мМ ЭДТК, и аликвоту соответствующим образом разбавленной ОС в конечном объеме 250 мкл. Длины волны возбуждения/испускания составляли 320/410 нм. Предназначенные для анализа реакции инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность ОС определяли из стандартной кривой для β-нафтиламина в условиях анализа. За единицу принимали количество образовавшего в результате катализа ОС 1 мкМ в мин рС1и-βNΑ из Н-С1η-βNΑ в указанных условиях.
Во втором флуорометрическом анализе активность ОС определяли, используя в качестве субстрата Н-С1п-АМС. Реакции осуществляли при 30°С с помощью ридера типа NОVО8ίа^ для микропланшетов (фирма ВМС 1аЫесйио1од1ев). Образцы содержали различные концентрации флуорогенного субстрат, 0,1 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма О1адеп) в 0,05М трис/НС1, рН 8,0, содержащем 5 мМ ЭДТК, и аликвоту соответствующим образом разбавленной ОС в конечном объеме 250 мкл. Длины волны возбуждения/испускания составляли 380/460 нм. Предназначенные для анализа реакции инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность ОС определяли из стандартной кривой для 7-амино-4метилкумарина в условиях анализа. Результаты кинетических анализов обрабатывали с помощью программы СгаЕй.
Спектрофотометический анализ ОС.
Этот новый анализ применяли для оценки кинетических параметров большинства субстратов ОС. Активность ОС активность анализировали спектрофотометрически с помощью непрерывного анализа, разработанного посредством адаптации ранее описанного дискретного анализа (ВаГетап В.С.1., 1. №иговск МеШобв 30, 1989, сс. 23-28), основанного на использовании глутаматдегидрогеназы в качестве вспомогательного фермента. Образцы содержали соответствующий субстрат ОС, 0,3 мМ НАД-Н, 14 мМ αкетоглутаровую кислоту и 30 ед./мл глутаматдегидрогеназы в конечном объеме 250 мкл. Реакции инициировали, добавляя ОС, и оценивали по снижению абсорбции при 340 нм в течение 8-15 мин. Типичные зависимости образования продукта от времени представлены на фиг. 1.
Начальные скорости оценивали и ферментативную активность определяли из стандартных кривых для аммиака в условиях анализа. Все образцы оценивали при 30°С с использованием ридера для микропланшетов либо типа 8РЕСТВАЕ1иог Р1ив, либо типа 8иппве (оба фирмы ТЕСАК). Данные кинетических анализов обрабатывали с помощью программы СгаЕй.
Анализ ингибирования.
При анализа ингибирования состав образца соответствовал описанному выше, за исключением того, что в него добавляли предполагаемый ингибитор. Для быстрой оценки ингибирования ОС использовали образцы, содержащие 4 мМ соответствующий ингибитор и субстрат в концентрации, соответствующей 1 КМ. Для более детального исследования ингибирования и определения значений К1 оценивали влияние ингибитора на вспомогательные ферменты. В каждом случае не было выявлено никакого влияния на какие-либо другие применяемые ферменты, что позволяет достоверно оценивать ингибирование ОС. Константу ингибирования определяли путем аппроксимации набора характеризующих процесс кривых с помощью общего уравнения для конкурентного ингибирования с использованием программы СгаЕй.
Пример 3. Масс-спектрометрия типа МАЬО1-ТОЕ.
Масс-спектрометрию на основе определения пролета с использованием опосредуемой матрицей лазерной десорбции/ионизация осуществляли с помощью системы Не\\'1е11-Раскагб С2025 ЬО-ТОЕ с линейным анализатором времени пролета. Прибор был снабжен лазером на азоте, работающим при 337 нм, потенциальным источником ускорения (5 кВ) и трубой для измерения пролета длиной 1,0 м. Детектор был установлен для работы в моде с положительно заряженными ионами, и сигналы регистрировали и осуществляли их фильтрацию с помощью цифрового запоминающего осциллоскопа типа ЬеСгоу 9350М, соединенного с персональным компьютером. Образцы (5 мкл) смешивали с равными объемами раствора матрицы. В качестве матрицы применяли раствор ДГАФ/ВКАЦ, полученный путем растворения 30 мг 2,6'-дигидроксиацетофенона (фирма А1бпс11) и 44 мг вторичного кислого цитрата аммония (фирма Ника) в 1 мл смеси ацетонитрил/0,1% ТФК в воде (1:1, об./об.). Небольшой объем (»1 мкл) матричной аналитической смеси вносили в верхний конец зонда и сразу же испаряли в вакуумной камере (оборудование для анализа образцов типа Не\\'1е11-Раскагб С2024А) для гарантии быстрой и гомогенной кристаллизации образца.
Для продолжительной оценки С1и1-циклизации выведенные из Аβ пептиды инкубировали в 100 мкл 0,1М натрий-ацетатного буфера, рН 5,2 или 0,1М бис-трис-буфера, рН 6,5 при 30°С. Пептиды вносили в концентрации 0,5 мМ [Аβ3-11а] или 0,15 мМ [Аβ3-21а] и 0,2 ед. ОС вносили в течение всех 24 ч. В случае Аβ3-21а образцы для анализа содержали 1% ДМСО. В различные моменты времени образцы удаляли из аналитической пробирки, пептиды экстрагировали с помощью 21рТ1рв (фирма М1Шроге) согласно ре- 26 009291 комендациям производителя, смешивали с раствором матрицы (1:1 об./об.) и после этого определяли масс-спектры. Отрицательный контроль либо не содержал ОС совсем, либо содержал дезактивированный тепловой обработкой фермент. Для исследования ингибиторов состав образца соответствовал описанному выше, за исключением того, что в него вносили ингибитор (5 мМ бензимидазол или 2 мМ 1,10фенантролин).
Пример 4. Зависимость от рН.
Зависимость от рН катализа человеческой ОС и ОС из папайи изучали в условиях скорости реакции первого порядка, что отражает воздействие концентрации протонов на константу специфичности кса1/КМ. Для этой цели применяли парный ферментативный анализ, основанный на использовании пироглутамиламинопептидазы в качестве вспомогательного фермента и Ο1η-βΝΛ в качестве субстрата. Известно, что пироглутамиламинопептидаза является активной и стабильной при рН 5,5-8,5 (Ткиги Ό. и др., 1. Вюскет. (Токио), 84, 1978, сс. 467-476). Следовательно, анализ позволяет оценивать катализ с помощью ОС в этом диапазоне значений рН. Полученные профили скоростей аппроксимировали с помощью классических колоколообразных кривых, как проиллюстрировано на фиг. 2. Человеческая ОС характеризуется зависимостью от рН в очень узком диапазоне с оптимумом примерно при рН 7,8-8,0. Скорости имеют тенденцию к снижению при более щелочных значениях рН. В противоположность этому, профиль скоростей, полученных для ОС из папайи, свидетельствует об отсутствии снижения активности вплоть до рН 8,5 (фиг. 2, вставка). Однако оптимальным для проявления специфичности обоих ферментов является рН 8. При создании изобретения неожиданно было установлено, что анализ кривых свидетельствует об идентичных значениях рКа в кислотном диапазоне значений рН 7,17±0,02 и 7,15±0,02 для человеческой ОС и ОС из папайи, соответственно.
Очевидно, что снижение активности человеческой ОС при основных значениях рН, по-видимому, является результатом диссоциации группы, что характеризуется значением рКа примерно 8,5. Для ОС из папайи не были получены данные при основных значениях рН, которые могли бы позволить достоверно определить второе значение рКа. Это подтверждается подгонкой данных к модели однократной диссоциации, дающей практически идентичное значение рКа (рКа 7,13±0,03), про сравнению с подгонкой данных к модели двойной диссоциации. Это свидетельствует о том, что оба значения рКа являются весьма различными.
Стабильность при различных значениях рН.
Стабильность глутаминилциклаз оценивали, осуществляя инкубацию ферментов растительного и животного происхождения при 30°С в течение 30 мин при различных значениях рН в диапазоне от 4 до 10. После этого активность ОС определяли в стандартных условиях. Результаты представлены на фиг. 3.
ОС из латекса папайи оказалась стабильной в изученном диапазоне значений рН без заметной тенденции к снижению стабильности в кислом или основном диапазоне. В противоположность этому, для человеческой ОС сопоставимая стабильность обнаружена только при рН 7-8,5, что свидетельствует о выраженном снижении стабильности при значениях рН выше 8 и ниже 6. Таким образом, значения рН, близкие к 8, вероятно, являются оптимальными для активности и стабильности растительной и человеческой ОС и приемлемыми значениями рН для сравнения субстратной специфичности различных ОС.
Пример 5. Определение субстратной специфичности ОС.
Спектрофотометрический анализ.
Осуществляли непрерывный спектрофотометрический анализ, описанный в примере 2. Согласно этому анализу об активности ОС свидетельствует снижение абсорбции при 340 нм, вызванное высвобождением аммиака и последующим поглощением НАДН/Н+ из-за образования глутамата из α-кетоглютаровой кислоты. Как видно из фиг. 1, были получены линейные графики и была выявлена линейная зависимость между измеренной активностью и концентрацией ОС. Кроме того, кинетические параметры, полученные для Н-О1п-О1п-ОН с использованием непрерывного описанного выше анализа (табл. 1), хорошо согласовались с данными, полученными с использованием дискретного анализа (КМ=175±18 мкМ, кеа1=21,3±0,6 с-1). Помимо этого, кинетические параметры для превращения субстратов Н-О1п-А1а-ОН, НО1п-О1и-ОН, Н-О1п-О1п-ОН, Н-О1п-О1Ви и Н-61п-ЯН2 с помощью ОС из папайи, представленные в табл. 1, хорошо коррелируют с данными, которые были получены с помощью прямого метода при рН 8,8 и 37°С (Со1о1оЬоу М.У. и др., Вю1. Скет. Норре. 8еу1ет. 377, 1996, сс. 395-398). Таким образом, очевидно, что новый непрерывный анализ позволяет получать надежные результаты.
Ди-, трипептиды и дипептидные заместители.
При использовании описанного выше нового непрерывного анализа примерно 30 соединений были изучены в качестве потенциальных субстратов ОС из С. рарауа и человеческой ОС. Результаты представлены в табл. 5. Путем сравнения специфичности установлено, что практически все короткие пептидные субстраты более эффективно превращаются под действием ОС из папайи по сравнению с человеческим ферментом. Заслуживает внимания тот факт, что для обоих ферментов более эффективными являются субстраты с крупными гидрофобными остатками во втором положении, что обнаружено по специфичности в отношении Н-О1п-Тут-А1а-ОН, Н-О1п-Рке-А1а-МН2 и Н-О1п-Ттр-А1а-МН2 при сравнении с другими трипептидами или по реактивности хромотропных субстратов Н-О1п-АМС, Н-С1п-вНА и Н-О1п
- 27 009291
Туг-ОН по сравнению с дипептидными субстратами. Для ОС из папайи эти данные согласуются с ранее полученными результатами, свидетельствующими о том, что специфичность коррелирует с размером второго аминокислотного остатка (Οο1ο^ον Μ.Υ. и др., Βίο1. С1ет. Норре. 8еу1ег. 377, 1996, сс. 395398). Единственное выраженное различие в специфичности ОС растительного и животного происхождения обнаружено в случае Η-Ο1η-ΟίΒυ. В то время, как этот сложный эфир превращается при использовании ОС из папайи со специфичностью, характерной для дипептидных субстратов, его превращение при использовании человеческой ОС происходит на порядок медленнее.
Олигопептиды.
Помимо нескольких дипептидов и трипептидов была изучена способность ОС из папайи и человеческой ОС превращать целый ряд олигопептидов (табл. 5). Заслуживает внимания тот факт, что общее различие в специфичности между человеческой и растительной ОС для ряда тетрапептидов оказалось не столь заметным, как для дипептидных и трипептидных субстратов. Это свидетельствует о том, что аминокислоты в 3-м и 4-м положениях все еще оказывают влияние на кинетические характеристики, прежде всего, человеческой ОС. Однако исключением являются пептиды, несущие остаток пролина в положении второй аминокислоты, для которых обнаружено заметное снижение значений кса1/КМ в ряду тетрапептидов, имеющих строение Η-Ο1η-Χ,ι,ι-ΤνΓ-Ρ1κ-ΝΗ2 (табл. 5). Снижение специфичности более выражено для человеческой ОС, и это приводит примерно к 8-кратным различиям в значении кса1/КМ по сравнению с ОС из папайи.
Небольшое снижение специфичности человеческой ОС обнаружено также в случае превращения субстратов с положительно заряженным С-концевым аминокислотным остатком глутамина, что обнаружено по специфичности в отношении Η-Ο1π-Αγ§^γ-Ρ^-ΝΗ2, Η-Ο1π-Αγ§^γ-Ρ^-ΝΗ2 и Η-Ο1η^8-ΛΓ§^υ-ΝΗ2 по сравнению с другими тетрапептидами. Очевидно, что пониженная специфичность, прежде всего, является следствием меньшего индекса превращения. Этот эффект не выявлен для растительного фермента.
Таблица 5 Кинетические параметры пептидных субстратов для человеческой ОС и ОС из папайи (н.р. - отсутствие реактивности; н.и. - отсутствие ингибирования; н.д. - не делали; * - для ингибирования субстрата)
Субстрат Человеческая ОС ОС из папайи
Км (мкМ) (с’1) К|* (мМ) кса/Км (мМ1 с’1) Км (мкМ) (с-1) К|* (мМ) кса^Км (мМ 1 с
Η-ΟΙη-ΟΗ н.р. Н.р. Н.Д. н.р. н.д. н.д. н.д. 0,23 ±0.1
Н-СИп-АМС 54 ±2 5,3 ±0,1 Н.д. 98 ±2 42 ±1 39,4 ±0,4 н.д. 938 ±13
Н-СНп-βΝΑ 70 ±3 20,6 ±0,5 1,21 ±0,07 294 ±6 38 ±3 51,4 ±1,4 1,20 ±0,08 1353 ±70
Н-(31п-О1Ви 1235 ±74 6,7 ±0,2 Н.И. 5,4 ±0,2 223 ±9 49,4 +0,6 Н.И. 222 ±6
Η-Ο1η-ΝΗ2 409 ±40 12,8 ±0,5 н.и. 31 ±2 433 ±13 44,8 ±0,4 н.и. 103±2
Н-О1п-О1уОН 247 ±10 13,2 ±0,2 н.и. 53 ±1 641 ±20 45,8 ±0,4 н.и. 71 +2
Н-С1п-А1аОН 232 ±5 57,2 ±0,4 н.и. 247 ±4 158 ±8 69,8 ±1,0 н.и. 442 ±16
Η-αΐη-ΟΙηОН 148 ±5 20,7 ±0,2 н.и. 140+2 44 ±3 43,2 ±0,7 и.и. 982 +51
Н-61п-(31иОН 359 ±10 24,7 ±0,2 н.и. 58 ±1 106 ±5 50,3±0,6 н.и. 475 ±17
Н-О1п-Уа1ОН 196 ±5 17,2 ±0,1 н.и. 88 ±2 Н.д. н.д. н.и. н.д.
Н-СНп-ТугОН 211 ±5 94 ±1 н.и. 446±6 Н.д. н.д. н.и. Н.Д.
Н-С1п-С1и- Туг-ЫН2 79 ±2 45,1 ±0,4 н.и. 524±8 103 ±4 53,6 ±0,7 н.и. 520+13
Н-С1п-С1уРго-ОН 130 ±5 25,3 ±0,2 н.и. 195 ±7 333 ±15 41,7 ±0,5 н.и. 125 ±4
Н-СИп-ТугА1а-ОН 101 ±4 125 ±1 н.и, 930 +27 63 ±3 104,0 ±1,0 н.и. 1650 ±63
Н-СНп-Рйе- Α1α-ΝΗ2 69 ±3 109 ±1 н.и. 1811 ±64 111 ±5 132,1 ±0,6 н.и. 1190 ±48
Η-ΟΙη-Тгр- Α1η-ΝΗ2 50 ±2 47,0 ±0,7 н.и. 940 ±24 78 ±5 151,8 ±2,6 н.и. 1946 ±91
Н-С1п-Аг£СИу-Пе-ЫНг 143 ±4 33,5 ±0,4 н.и. 234 ±4 123 ±10 49,2 ±1,7 н.и. 400 ±19
Η-ΟΙη-Ακηαΐγ-ιΐβ-ΝΗ2 172 ±5 56,6 ±0,5 н.и. 329 ±7 153 ±9 51,4 ±0,9 н.и. 336 ±14
Т1-С1п-8ег- Туг-РЬе-ЫНг 55 ±3 52,8 +0,8 н.и. 960 ±38 135 +6 64,9 ±1,0 н.и. 481 ±14
- 28 009291
Н-О1п-Ат§Туг-Р11е-ЫН2 55 ±2 29,6 ±0,3 н.и. 538 ±14 124 ±6 48,9 ±0,7 Н.И. 394+13
Η-ΟΙη-Рго- Туг-РЬе-ИН2 1889 +152 31,7 ±1,2 н.и. 17 ±1 149 ±14 18,8 ±0,6 н.и. 126 ±8
Η-Ο1η-Ηίί· Туг-РЬе-ЫН2 68 ±3 55,4 ±0,7 н.и. 815 ±26 92 ±7 75,9 ±1,4 н.и. 825 +48
Н-61П-61П- Туг-РНе-М12 41 ±2 41,4 ±0,4 н.и. 1010 +40 45 ±2 52,9 ±0,7 н.и. 1176 +37
Н-О1п-О1ц- Туг-РЬе-ЫН2 47 ±4 46 ±1 н.и. 979 ±62 100 +4 54,6 ±0,6 н.и. 546 ±16
Н-О1п-О1и- А1а-А1а-ЧН2 77 ±4 46 ±1 н.и. 597 ±18 102 ±4 53,7 +0,6 н.и. 526 ±15
Н-<31п-С1и- Туг-А1а-МН2 69+2 42,1 ±0,4 н.и. 610 ±12 ИЗ ±5 44,7 ±0,5 н.и. 396 ±13
Н-С1п-О1иА1а-Р11е-ХН2 39 +3 39 ±1 н.и. 1000 ±51 81 ±3 48,5 ±0,45 н.и. 599 ±17
Н-О1п-О1иΑίρΈευ-ΝΗί 55 ±2 45,8 ±0,5 н.и. 833 +21 107 +6 58,5 ±0,4 н.и. 547 ±27
Н-О1п-Ьу8Аг8-Ьеи-МН2 54 +3 33,4 ±0,5 н.и. 619+25 118 ±6 48,2 ±0,8 н.и. 408 ±14
Результаты, полученные с использованием тетрапептидов, позволяли сделать еще одно заключение. Как уже отмечалось, ОС из папайи обладает высокой селективностью в отношении дипептидов. Однако для некоторых тетрапептидов при использовании человеческой ОС были получены более высокие значения констант специфичности, что видно из графика, представленного на фиг. 4, для построения которого использовали некоторые данные из табл. 5, касающиеся ряда пептидов, которые содержат глутамат в положении второй аминокислоты. Кроме того, по мере того, как длина цепи возрастает от ди- к трипептидам, селективность человеческой ОС повышается, в отличие от результатов, полученных с использованием ОС из папайи. Кроме того, наиболее высокая специфичность человеческой ОС обнаружена в отношении пептидов, несущих крупные гидрофобные остатки аминокислот в 3-м и 4-м положениях, что свидетельствует о гидрофобных взаимодействиях с ферментом. При сравнении кинетических параметров, характеризующих взаимодействие с соответствующими пептидами, изменения, вероятно, прежде всего, связаны с более низкими значениями Км, установлено, что индексы превращения пептидов являются близкими. Таким образом, более высокая селективность человеческой ОС в отношении пептидов с более длинной цепью, вероятно, является результатом более прочного связывания более гидрофобных субстратов с ферментом.
Обнаруженные различия между человеческой и растительной ОС в отношении пептидов, содержащих гидрофобные аминокислоты в 3-м и 4-м положении, также становятся очевидными при сравнении констант специфичности ферментов в отношении Н-61и-Атд-61у-Пе-ХН2 и Н-61и-Агд-Туг-Рйе-ХН2 или Н-61и-О1и-ОН и Н-61и-61и-Тут-РЬе-ОН.
Было установлено также, что человеческая ОС обладает большей селективностью в отношении гомологичных субстратов, содержащих Ν-концевой О1и и увеличенное количество С-концевых остатков А1а (табл. 6). В то время, как селективность человеческой ОС повышается с увеличением длины субстрата, такая тенденция не обнаружена для ОС из папайи. Поскольку человеческая ОС обладает меньшей специфичностью в отношении пептидов, которые имеют в последовательности остаток 8ет, можно предположить, что природа боковой цепи также является важной (табл. 6).
Таблица 6
Влияние длины субстрата на активность человеческой ОС и ОС из папайи
Субстрат Человеческая ОС ОС из папайи
Км (мкМ) кса1 (С1) к<а(/Км (мМ' 'с'1) Км (мкМ) кса1 (с‘1) кса|/КМ (мМ‘ 'с'1)
Н-О1п-А1а -ΝΗ2 155 +9 40,1 +0,9 259 ±9 212 ±21 62,8 ±3,0 296+15
Н-а1п-А1а-А1а-ЧН2 87 +3 76,3 ±0,7 877 ±22 164 ±6 83,2 +1,0 507 ±12
Н-О1п-А1а-А1а-А1а- А1а-ИН2 65 ±3 60,5 ±0,7 1174 ±43 197 + 8 74,6 ±1,0 379 + 10
Н-С1п-А1а-А1а-8ег- Α1α-Α13-ΝΗ2 79 ±6 55,3 ±1,6 700 +33 216±6 78,5 + 1,0 363 ±5
Воздействие ионной силы на катализ.
Другой параметр, действие которого на субстратную специфичность изучено, представляет собой ионную силу. Для этой цели определяли кинетические параметры для циклизации нескольких субстратов
- 29 009291 в присутствии 0,5М КС1 и без соли (табл. 7). При создании изобретения неожиданно было установлено, что специфичность в отношении субстратов с незаряженным каркасом при добавлении соли не изменялась в значительно степени как в случае ОС из латекса папайи, так и человеческой ОС. Однако константы специфичности человеческой ОС в отношении Η-01η-Α1Β-0Η и Н-О1п-О1и-ОН снижались при добавлении КС1. Как видно из индивидуальных кинетических параметров, это было обусловлено увеличением значения КМ и только небольшим снижением значения кса1. В случае ОС из папайи не обнаружено воздействия ни на один из изученных параметров. Это явление, вероятно, не связано с самим отрицательно заряженным субстратом, так как для отрицательно заряженного пептида 4-0111-0111^5):)^^11^42 не обнаружено изменение этих параметров. Представляющее интерес действие соли дополнительно было выявлено для положительно заряженных субстратов 4-0111^12-0114^^42 и Η-Ο1η-^у5-Α^д-^еи-NΗ2. Установлено, что положительное действие на катализ, как для растительной, так и для человеческой ОС, прежде всего, обусловлено более низким значением КМ и несколько повышенным индексом превращения.
Таблица 7
Влияние ионной силы на катализ человеческой ОС и ОС из папайи
Субстрат 0.05М трицин-ИаОН, рН 8,0 0,05М трицин-ИаОН, рН 8,0, 0.5М КС1
Б Л Е га Е ί“1 Б О' Км (мМ) кса! (с'1) кса/Км (мМ *с ’) К) (мМ) Км (мМ) кса! Ή') кСа|/Км (мМ''с’ ‘) К; (мМ)
Η-ΟΙη-ΝΗ2 0,434 ±0,015 43,4 ±0,4 100 ±3 н.и. 0,446 +0,010 45,2 +0,3 101 +2 н.и.
Н-О1П-Д4А 0,036 ±0,002 48,8 ±1,0 1356±50 1,14 ±0,05 0,032 ±0,002 47,2 +0,8 1475 ±70 1,33 ±0,07
Н-С!п-А1а-0Н 0,137 ±0,007 69,7 ±0,9 509 ±19 н.и. 0,143 ±0,005 68,1 ±0,6 480 +12 н.и.
Н-<з1п-<31и-0Н 0,098 ±0,005 45,0 ±0,5 459 ±18 н.и. 0,094 ±0,003 44,4 ±0,3 472 ±12 н.и.
Η-ΟΙη-Ττρ- А1а-ЯН2 0,079 ±0,005 138 ±3 1747 ±73 н.и. 0,072 ±0,004 133 ±3 1847 ±61 и.к.
Н-01п-Аг§- С1у-11е-ЫН2 0,106 ±0,008 52,9 ±1,2 499 ±26 н.и. 0,065 ±0,005 48,4 ±1,0 745 ±42 н.и.
Н-С1п-Ьу5- Ат§-Ьеи-ГГН2 0,102 ±0,007 50 ±1 493 ±22 н.и. 0,053 +0,002 58,1 ±0,7 1096 ±28 н.и.
Н-01п-С1и- А5р-Ьеи-МН2 0,109 ±0,005 52,4 ±0,7 481 +16 н.и. 0,094 ±0,003 53,6 ±0,5 570 ±13 н.и.
Человеческая ОС 0,05М трис-НС1, рН 8,0 0.05М трис-НС1, рН 8,0, 0.5М КС1
Η-61η-ΝΗ2 0,442 ±0,030 12,8 ±0,3 29±1 н.и. 0,401 ±0,014 12,2 ±0,1 30+1 н.и.
Η-61Π-/7ΝΑ 0,076 ±0,004 21,7 ±0,5 285±8 1,39 ±0,08 0,063 ±0,003 20,0 ±0,4 318 ±9 0,97 +0,04
Н-61п-А1а-0Н 0,269 ±0,007 54,4 ±0,5 202+3 н.и. 0,357 ±0,012 47,6 ±0,6 133 +3 Н.И.
Н-61п-01и-0Н 0,373 ±0,015 21,4 ±0,3 57±2 н.и. 0,607 ±0,036 18,9 +0,5 31 ±1 н.н.
Н-61п-Тгр- Α13-ΝΗ2 0,054 ±0,003 50,8 ±0,6 941 ±41 н.и. 0,056 ±0,002 50,0 ±0,4 893+25 н.и.
Н-61п-Аг£61у-Пе-ИН2 0,166 ±0,013 31 ±1 187 ±9 н.и. 0,091 ±0,005 29,8 ±0,5 327 +12 н.и.
Н-Оп-ЬузАг£,-Ееи-ЫН2 0,051 ±0,003 29,4 ±0,5 577 ±24 н.и. 0,034 ±0,001 31,6 ±0,3 929 ±19 н.и.
Н-С.1л-С11и- Азр-Ьеи-йНг 0,060 ±0,002 46,6 ±0,5 777 ±18 н.и. 0,061 ±0,002 45,6 ±0,5 748 ±16 н.и.
Физиологические субстраты.
В проведенных ранее исследованиях уже доказано превращение |01η'|-ΤΡ4 и [01п1]-0иКН с помощью ОС с использованием бычьей ОС и ОС из гипофиза свиней (ВикЬу ν.Η.Ρ и др., 1. Вю1. СЬет. 262, 1987, сс. 8532-8536; РЬсЬег ν.Η. и 8р1е55 1., Ριυα №111. Αсаб. 8с1. υδΑ 84, 1987, сс. 3628-3632). Помимо этих уже изученных гормонов гипофиза были синтезированы три потенциальных физиологических субстрата человеческой ОС и изучено их превращение, а именно 1011/11361)111^ [01η1]нейротензин и [01η1]ΡΡΡ. Кинетические параметры, характеризующие их превращение, представлены в табл. 1. Представляет интерес тот факт, что превращение глутаминильных пептидов в соответствующие пироглутамильные пептиды характеризуется увеличением значения констант специфичности в зависимости от размера, т. е. первым в этом ряду стоит наиболее крупный пептид прогастрин, состоящий из 17 аминокислот, за ним следуют пронейротензин, про-0иКН, про-ΤΚΗ и про-ΡΡΡ. Эти результаты соответствуют
- 30 009291 данным, полученным при использовании синтетических пептидов.
При создании изобретения неожиданно было установлено, что превращение растительным ферментом более длинных субстратов также является высоко селективным, что частично противоречит данным, касающимся более коротких олигопептидов. Возможно, существуют вторичные взаимодействия, обусловливающие связывание субстрата и фермента, которые удалены от активного сайта.
Пептиды, содержащие модифицированные аминокислоты.
С целью дальнейшего изучения специфичности и селективности ОС синтезировали пептиды, содержащие либо модифицированный Ν-концевой глутаминильный остаток, либо модифицированную аминокислоту во втором положении. Превращение этих пептидов оценивали количественно с помощью МАЬО1-ТОЕ-масс-спектрометрии (см. также пример 3). Циклизация глутаминильного остатка или его аналога,, соответственно обусловливает различие в массе субстрата и продукта катализа. В случае, когда происходит выделение 1 моля аммиака в свободном состоянии на 1 моль субстрата, превращение также можно анализировать количественно с помощью спектрофотометрического анализа.
Н-61п-Ьу8(61п)-Агд-Ьеи-А1а-Ж2.
Превращение этого разветвленного на Ν-конце пептида, который содержит два глутаминильных остатка на Ν-конце, связанных с лизильным остатком через пептидную и частично изопептидную связь, с помощью человеческой ОС (фиг. 5) и ОС из папайи (данные не приведены), по-видимому, происходит одинаковым образом. Оба глутаминильных остатка превращаются в пироглутаминовую кислоту без какого-либо заметного предпочтения в отношении конкретного остатка, что следует из данных о соответствующем превращении субстрата (фиг. 5). Таким образом, селективность различных ОС в отношении по-разному связанных глутаминильных остатков не имеет существенных различий.
Н-61п(ММе)-Рйе-Ьу8-А1а-61и-МН2.
Метилированный глутаминильный остаток превращается в пироглутамильный остаток только с помощью ОС из папайи (фиг. 6). Кроме того, не обнаружено ингибирование человеческой ОС пептидом, что свидетельствует о том, что метилированный остаток не распознается человеческой ОС.
Н-61и(ОМе)^А и Η-Ο1υ-βΝΑ.
Ни одно из этих соединений не подвергалось каталитическому превращению с помощью ОС из папайи или человеческой ОС. Эти флуорогенные субстраты анализировали флуорометрически, используя пироглутамиламинопептидазу в качестве вспомогательного фермента. Однако у О-метилированного глутаматного остатка обнаружено выраженное отсутствие стабильности как в трис-, так и в трициновом буфере, что свидетельствует о наличии у них тенденции к циклизации, катализируемой не ферментативным путем. Кроме того, активность обеих ОС в отношении Н-О1п-АМС в качестве субстрата не ингибировалась более длинными пептидами Н-61и(ОМе)-Рйе-Ьу8-Агд-Ьеи-А1а-ЫН2 или Н-61и-Рйе-Ьу8-Агд-ЬеиА1а-№Н2, эти данные свидетельствуют о том, что глутаминовая кислота или ее производные не распознаются обеими формами ОС. Кроме того, результаты свидетельствуют о том, что не только отрицательный заряд остатка глутаминовой кислоты является причиной отталкивания пептида от активного сайта.
Н-61п-Цикло(№-Ьу8-Агд-Рго-А1а-61у-Рйе).
Превращение субстрата Н-61п-цикло(№-Ьу8-Агд-Рго-А1а-61у-Рйе), который содержит внутримолекулярную частичную изопептидную связь, анализировали количественно, при этом установлено, что значения КМ составляют 240±14 мкМ и 133±5 мкМ для человеческой ОС и ОС из папайи, соответственно. Установлено, что вследствие более высокого индекса превращения с помощью ОС из папайи (49,4±0,6 с-1) по сравнению с человеческой ОС (22,8±0,6 с-1) для растительного фермента значение кса1/КМ составляет 372±9 мМ-1 мин-1, что примерно в 4 раза выше, чем для человеческой ОС. Таким образом, константа специфичности в случае ОС из папайи только немного ниже, чем для субстратов, имеющих меньший размер, таких как Н-О1п-А1а-А1а-8ег-А1а-А1а-ХН2. Однако установлено, что значение кса1/КМ для человеческой ОС составляет 95±3 мМ-1с-1, что примерно на 1 порядок ниже по сравнению со значениями, полученными для субстратов близкого размера (табл. 5).
Н-вГомо61п-Рйе-Ьу8-Агд-Ьеи-А1а-МН2.
Ν-концевой β-гомоглутаминильный остаток превращали в 5-членное лактамовое кольцо посредством катализа с использованием человеческой ОС и ОС из папайи, соответственно. Сопровождающее этот процесс выделение в свободном состоянии аммиака анализировали спектрофотометрически и с помощью описанного выше МАЬП1-ТОЕ-анализа. Не обнаружено выделение в свободном состоянии аммиака, если ОС отсутствовала или ее подвергали кипячению, что свидетельствует о специфичности катализа циклизации. Интересным представляется тот факт, что ОС из С. рарауа (КМ=3,1±0,3 мМ, кса1=4,0±0,4 с-1) и человеческая ОС (КМ=2,5±0,2 мМ, кса1=3,5±0,1 с-1) катализируют превращение этого пептида с практически идентичными значениями кса1/КМ 1,4±0,1 и 1,3±0,1 мМ-1с-1, соответственно. Таким образом, циклизация β-гомоглутаминового остатка катализируется с примерно в 1000 раз меньшей эффективностью по сравнению с катализом пептидов такого же размера, которые содержат глутаминильный остаток на Νконце. Это свидетельствует о том, что наличие α-углерода субстрата является для распознавания субстрата формами ОС важным, но не основным фактором. Основным требованием к субстрату является наличие γ-амидной группы и непротонированной Ν-концевой аминогруппы на расстоянии и под углом,
- 31 009291 необходимыми для циклизации, это требование удовлетворяется наличием Ν-концевых глутаминильных и β-гомоглутаминильных остатков.
Пример 6. Синтез субстратов ОС.
Олигопептиды.
Пептиды синтезировали полуавтоматически в количестве порядка 0,5 мМ с помощью пептидного синтезатора (ЪаЬойес 8Р650, Бахем, Швейцария) согласно описанному ранее методу (ЗсйПНнд 8. и др., ВюсйетШгу 41, 2002, сс. 10849-10857). Более длинные пептиды синтезировали в количестве порядка 25 мкМ с помощью автоматического пептидного синтезатора типа 8утрйо^ (фирма Ρηίηίη ШкйитеШ Со.) согласно описанному методу (Маикай 8. и др., Вюсйетщйу 42, 2003, сс. 3081-3088). Для всех пептидных сочетаний применяли основанные на использовании Етос модифицированные протоколы твердофазного пептидного синтеза, предусматривающие применение тетрафторбората 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3тетраметилурония (ТБТУ, фирма NονаЬ^οсйет)/основания (диизопропилэтиламина или Ν-метилформолина; фирма Мегск) или в случае затрудненного сочетания применение Ν-оксида гексафторфосфата Ν[(диметиламино)-1Н-1,2,3,-триазоло [4,5-Ь]пиридин-1 -илметилен]-Ы-метилметанаммония (4,5) (ГАТУ, фирма Аррйей ВюкуйетО/диизопропилэтиламина в качестве активирующих реагентов. После отщепления от смолы с помощью содержащей трифторуксусную кислоту (ТФК, фирма Мегск) смеси неочищенные пептиды очищали с помощью препаративной ЖХВР с использованием не содержащих кислоту растворителей для того, чтобы исключать дальнейшую циклизацию Ν-концевого глутамина. Препаративную ЖХВР осуществляли с использованием линейного градиента ацтонитрила (фирма Мегск) в воде (540% или 65% ацетонитрила в течение 40 мин) на колонке типа 250-21 Ьииа ИР18 (фирма Рйеηοтеηеx). Для подтверждения чистоты и идентификации пептидов использовали аналитическую ЖХВР и Е8ГМС.
О1и(МН-МН2)-8ег-Рго-Тйг-А1а-МН2.
Линейный пептид-предшественник (Етос-С1и-8ег-Рго-Тйг-А1а-НН2) синтезировали согласно стандартным методам, основанным на применении Етос (8сй111шд 8. и др., ВюсйетШгу 41, 2002, сс. 1084910857) на амидной МВНА-смоле Ринка (фирма №уаЬюс11ет). После отщепления защищенного с помощью Етос пептида от смолы пептид осаждали с помощью диэтилового эфира (фирма Мегск), фильтровали и сушили. Смолу НМВА-АМ (1,16 мМ/г, фирма НоуаЬюсйет) применяли для сочетания кислотной γ-карбоксильной группы глутаминовой кислоты пептида-предшественника (3 экв.) в дихлорметане (ДХМ, фирма Мегск). В качестве агентов для сочетания применяли дициклогексилкарбодиимид (ДЦК, фирма 8егуа) (4 экв.) и диметиламинопиридин (ДМАП, фирма А1йпсй) (0,1 экв.). Через 12 ч смолу фильтровали, промывали ДХМ и реакцию повторяли. После удаления Ν-концевой Етос-группы с помощью 20% пиперидина в ДМФ (3x5 мин) несущую пептид смолу обрабатывали 5% раствором гидразина (20 мл/г) в течение 1,5 ч. Смолу фильтровали и промывали диметилформамидом (ДМФ, фирма Ио11г Германия) и ТФК. После упаривания неочищенный пептид осаждали простым эфиром, выход 76%.
Н-бШ-ЬуЦб^-Агд-Ьеи-АИ-МН^
Линейный пептид синтезировали с помощью стандартной процедуры, основанной на использовании ЕтосДВи, на амидной МВНА-смоле Ринка (8сй111тд 8. и др., Вюсйетщйу 41, 2002, сс. 10849-10857), при этом для сочетания применяли предпоследнюю аминокислоту Етос-Ьу8(Етос)-ОН. 4 экв. ЕтосС1п(Тг1)-ОН подвергали сочетанию после удаления двух аминозащитных групп лизина с помощью 20% пиперидина (фирма Мегск) в ДМФ. Выход после стандартного процесса расщепления составлял 95%.
Н-бЬ^Ме^Рйе-Вук-АИ-ОШ-МН^
Етос-ОШ/ЫМе^ОН синтезировали, начиная процесс с Етос-61и-О1Ви на смоле Етос-МГАМ (фирма НоуаЬюсйет). После добавления ДХМ для набухания смолу (0,5 г) промывали ДМФ и удаляли защитные группы с помощью 20% раствора пиперидина в ДМФ. Смолу вносили в 5 мл ДМФ и последовательно добавляли 5 экв. Етос-О1и-О1Ви, 5 экв. ГАТУ и 10 экв. ДИПЭА и встряхивали в течение 6 ч. После фильтрации и промывки продукт отщепляли в условиях стандартного расщепления с помощью ТФК. Пептид Н-б^ММе^Рйе-Ьук-АИ-ОШ-МН синтезировали с помощью известного метода (8сй111шд 8. и др., ВюсйетШгу 41, 2002, сс. 10849-10857). Осуществляли сочетание Етос-ОШ/ЫМе^ОН с ГАТУ/ДИПЭА в течение ночи. После стандартного процесса расщепления выход неочищенного пептида составлял 78%.
Н-О1и(ОМе)-в-нафтиламид, Н-ОЫ-УаГОН, Н-С1п-Туг-ОН.
Защищенные с помощью Вос дипептиды синтезировали стандартным методом, основанным на применении смешанного ангидрида с использованием изобутилхлоркарбоната (фирма Мегск). С-концевые сложные метиловые эфиры Вос-ОШ-Туг-ОМе и Вос-С1г1-Уа1-ОМе омыляли с помощью 1н. №ОН в диоксане. У защищенных с помощью Вос пептидов удаляли защитную группу, обрабатывая раствором НС1/диоксан в течение 10 мин. После упаривания остаток кристаллизовали с помощью нескольких растворителей с получением твердого соединения, выход 60-70%.
Н-бШ-цикло^е-Ьук-Агд-Рго-АЦ-б^-Рйе).
Линейный предшественник Вос-СкйТгВ-куъ-АгЦРтсрАЫ-СК-Рйе-ОН синтезировали на чувствительной к действию кислот 2-хлортритильной смоле. Сочетание осуществляли с помощью стандартного протокола, основанного на применении Етос/Ви, с использованием Етос-Ьу8(Мй)-ОН. После расщепления с помощью 3% раствора ТФК в ДХМ (10 раз по 5 мин) раствор нейтрализовали 10% раствором
- 32 009291 пиридина (фирма Мегск) в метаноле (МеОН; фирма Мегск), трижды промывали ДХМ и МеОН, упаривали до 5% от исходного объема и неочищенный пептид осаждали с помощью охлажденной на льду воды. После этого неочищенный пептид подвергали циклизации, используя активацию смесью ДЦК/Ы-гидроксибензотриазол (ГОБТ, фирма Α16γΚΗ). Неочищенный пептид растворяли в безводном дихлорметане (0,2 ммоля/50 мл), добавляли 0,2 ммоля Ν-метилморфолина и 0,4 ммоля 1-гидроксибензотриазола. Этот раствор добавляли по каплям к раствору, содержащему 0,4 ммоля дициклогексилкарбодиимида в 250 мл дихлорметана, при 0°С. Реакцию прекращали путем перемешивания в течение ночи при комнатной температуре. После фильтрации Ν,Ν'-дициклогексилмочевины растворитель удаляли выпариванием. Остаток растворяли в этилацетате и промывали несколько раз 1н. НС1, насыщенным раствором NаНСОз и водой. Раствор сушили над безводным №28О4, фильтровали и упаривали досуха в вакууме.
Пример 7. Характеристики эффекторов ОС.
Имидазольные производные.
Имидазольные и бензимидазольные производные, имеющие заместители в различных положениях 5-членного кольца, тестировали в качестве ингибиторов ОС (табл. 3). Порядок нумерации относится к имидазольному кольцу. Применяемые методы описаны в примере 2.
С-4(5)- и С-4,5-производные.
Установлено, что соединения, имеющие замены в любом из структурно эквивалентных положений 4 или 5 имидазольного кольца или в обоих положениях, обладали пониженной способностью к ингибированию человеческой ОС. При этом существует одно исключение, поскольку Ν-ω-ацетилированный гистамин является одним из наиболее эффективных ингибиторов. Небольшие заместители в этих положениях оказывали незначительное воздействие на связывание, о чем свидетельствуют близкие значения константы ингибирования для 5-гидроксиметил-4-метилимидазола при сравнении с имидазолом. Более крупные и имеющие больший объем группы, присоединенные к этим сайтам, снижают или устраняют связывание соединения ферментом. Для некоторых других изученных заместителей известно, что они проявляют отрицательное индукционное или мезомерное действие, что может снижать электронную плотность в имидазольном кольце, это тоже приводит к ухудшению связывания, соответственно, значений констант связывания. Различия в значениях К1 Ь-гистидина и гистидинамида также свидетельствуют о некотором воздействии заряда на связывание. Данные об электростатическом отталкивании заряженных субстратов были получены ранее при оценке субстратной специфичности, т.е. глутаминамид эффективно превращался в продукты с помощью человеческой ОС, но никакой реактивности не обнаружено при использовании свободного глутамина в качестве субстрата.
С-2-производные.
Все изученные производные ингибировали ОС слабее, чем имидазол. Любая замена, превышающая по размеру протон, мешала соответствующему связыванию с ОС. В случае 2-метилбензимидазола только из-за введения метильной группы значение константы ингибирования снижалось примерно на один порядок. Очень близкая взаимосвязь обнаружена при сравнении значений К1 для бензимидазола и 2-аминобензимидазола. Кроме того, эти результаты свидетельствуют о том, что это воздействие не связано с электронными изменениями.
Ν-1-производные.
Из изученных в качестве ингибиторов человеческой ОС имидазольных производных у большинства соединений, обладающих повышенными значениями К1 по сравнению с имидазолом, обнаружены изменения на одном атоме азота. К этим соединениям относится также один из наиболее эффективных ингибиторов ОС 1-бензилимидазол. Важным представляется тот факт, что лишь незначительные изменения этой структуры приводят к потере ингибирующей активности, это можно обнаружить при сравнении 1бензоилимидазола и фенилимидазола, последний из которых не проявлял активности в экспериментальных условиях. В этом случае также выявленные изменения, вероятно, связаны не только со сниженной электронной плотностью имидазольного кольца из-за отрицательного мезомерного действия фенильной группы, поскольку у более объемной триметилсилильной группы, проявляющей положительное индукционное действие, обнаружена также пониженная способность к связыванию по сравнению с другими остатками. Важным представляется тот факт, что одним из наименее эффективных соединений в этой группе является 1-аминопропилимидазол. Низкая эффективность этого соединения обусловлена наличием основной аминогруппы, поскольку у соединений с близким стерическим строением 1-метилимидазола и 1-винилимидазола выявлена повышенная способность к связыванию с активным сайтом. Таким образом, положительно заряженная аминогруппа ответственна за более низкое значение К1, этот результат подтверждается при сравнении значений К1 Ν-ω-ацетилированного гистамина (табл. 3) и гистамина (табл. 4).
Роль 3,4- и 3,5-дериватизации.
Установлено, что имидазольные производные, которые имеют заместителей в положениях 4(5) или в обоих положениях, обладают ограниченной эффективностью в отношении связывания с ферментом. Роль конкретных замен выявляли путем сравнения констант ингибирования Ь-гистамина и двух промежуточных продуктов биологического расщепления гистамина, 3-метил-4-гистамина и 3-метил-5-гистамина
- 33 009291 (табл. 4). Для Ь-гистамина установлено, что значение К1 примерно на порядок ниже, чем для ацетилированного аналога. Метилирование атома азота приводит к значительному повышению эффективности в случае 3-метил-4-гистамина. Однако метилирование, приводящее к получению 3-метил-5-гистамина, приводит к полной потере ингибирующей активности. Таким образом, выявленный эффект, вероятно, прежде всего, связан со стерическим препятствием связыванию из-за дериватизации атома углерода, примыкающего к основному азоту. Вероятно, основный азот играет основную роль в связывании с ферментом.
Пример 8. Образование Аβ3-40/42-производных.
Исследования проводили с использованием двух коротких Ν-концевых пептидных последовательностей Аβ3-40/42, таких как [С1η3]-Аβ 1-11 (последовательность: ΟΛ0ΕΚΗΟ8ΟΥΕ) и [С1η3]Аβ3-11, содержащая глутамин вместо глутаминовой кислоты в 3-м положении. Расщепление с помощью ΌΡ IV и циклизацию Ν-концевого остатка глутамина с помощью ОС этих двух пептидов оценивали методом МАЬПСТОЕ-масс-спектрометрии. Опыты проводили с использованием очищенной ΌΡ IV (свиная почка) или неочищенного гомогената свиного гипофиза в качестве источника ОС, а также для обоих ферментов в опытах по оценке последовательного катализа.
Результаты.
1. Образование [С1η3]Аβ3-11а из [С1п3]Аβ1-11а, катализируемое ΌΡ IV, и его предупреждение с помощью ингибитора ΌΡ IV Vа1-пирролидида £731^14).
ΌΡ IV или подобная ΌΡ IV активность приводила к расщеплению [С1η3]Λβ1-11а с образованием [С1п3]Аβ3-11а (фиг. 7). Остаток в 3-м положении не затрагивался при этом расщеплении и поэтому становился более пригодным для модификации другими ферментами, т.е. ОС. Как и ожидалось, катализ можно было полностью подавлять с помощью 731^134 (фиг. 8).
2. Образование [рС1и3]Λβ3-11а из [С1η3]Λβ3-11а посредством катализа ОС в гомогенатах гипофиза и предупреждение его с помощью 1,10-фенантролина.
Глутаминилциклаза, присутствующая в гомогенате свиного гипофиза, катализирует превращение [С1η3]Λβ3-11а в [рС1и3]Λβ3-11а (фиг. 9). Образование [рС1и3]Аβ3-11а ингибировалось при добавлении
1.10- фенантролина (фиг. 10).
3. Последовательный катализ ΌΡ IV и ОС, приводящий в образованию [рС1и3]Аβ3-11а, и его предупреждение с помощью 731-Ρυγγ и 1,10-фенантролина.
Образование [рС1и3]Аβ3-11а из [С1η3]Λβ1-11а происходило после последовательного катализа с помощью ΌΡ IV и ОС при оценке в неочищенном гомогенате свиного гипофиза с добавлением ΌΡ IV из свиной почки (фиг. 11). Образования [рС1и3]Аβ3-11а не происходило, когда добавляли ингибитор ОС
1.10- фенантролин (фиг. 12) или ингибитор ΌΡ IV Vа1-Ρу^^ (фиг. 13). При аминопептидазном расщеплении и последующей циклизации остатка глутамина происходит образование небольших количеств [рС1и3]Λβ311а, о чем свидетельствует образование [С1η3]Λβ2-11а.
4. Образование [рС1и3]Λβ3-11а в неочищенном гомогенате гипофиза в результате катализа аминопептидазой(ами).
Из-за образования [рС1и3]Аβ3-11а, не зависящего от ΌΡ Ш-катализа, изучали расщепление [С1η3]Λβ1-11а в неочищенном гомогенате гипофиза без добавления ΌΡ IV (фиг. 14). Как и ожидалось из данных, представленных в разделе 4, было обнаружено образование [рС1и3]Аβ3-11а. Эти данные свидетельствуют о том, что расщепление [С1η3]Λβ1-11а может являться также результатом катализа аминопептидазой(ами), что приводит к образованию [рС1и3]Аβ3-11а. Таким образом, результаты, свидетельствующие о том, что в этой ткани образование пироглутамила является конечной точкой расщепления Νконцевых пептидов, подтверждают также роль ОС в формировании бляшек.
Пример 9. Превращение [С1η3]Аβ3-11а; 3-21а и 3-40 с помощью рекомбинантной человеческой ОС.
Все изученные выведенные из [Ο^^β пептиды эффективно превращались с помощью человеческой ОС в соответствующие пироглутамильные формы (табл. 8). Из-за плохой растворимости [С1η3]Λβ321а и [С1п3]Λβ3-40 в водном растворе их изучение проводили в присутствии 1% ДМСО. Однако более высокая растворимость [С1ηз]Λβ3-11а позволила проводить кинетический анализ катализируемого ОС превращения в присутствии ДМСО и без него (табл. 8). Взятые в совокупности, результаты изучения Аβпептидов, состоящих из 8, 18 и 37 аминокислот, в качестве субстратов ОС (см. табл. 8) подтвердили данные о том, что активность человеческой ОС повышается с увеличением длины ее субстратов. Таким образом, на основе данных о значении констант специфичности можно заключить, что О1п1-гастрин, С1п'нейротензин, С1п1-СиВН являются одними из лучших субстратов ОС. Аналогично этому установлено, что для [С1п3]Аβ3-40 и глюкагона, которые являются наиболее крупными из изученных субстратов ОС, обнаружены высокие значения констант скорости реакции второго порядка (449 мМ-1с-1 и 526 мМ-1с-1, соответственно) даже в присутствии 1% ДМСО (табл. 8).
Важным представляется тот факт, что кинетические параметры, характеризующие превращение изученных амилоидных пептидов, не изменялись существенно с увеличением размера, что позволяет предположить не очень существенную роль С-концевой части Аβ в ОС-катализе. Таким образом, из-за
- 34 009291 лучшей растворимости и простоты использования в экспериментах дополнительные изучения, касающиеся Ν-концевого аминопептидазного процессинга этих пептидов, проводили с применением фрагментов Ав меньшего размера, таких как [С1п3]Ав 1-11а, [С1п3]Ав3-11а и Ав3-11а.
Таблица 8 Кинетические параметры, характеризующие превращение Ν-концевых содержащих С1п пептидов с помощью рекомбинантной человеческой ОС в буферном растворе, содержащем 1% ДМСО
Пептид Км (мкМ) кса1 (с'*) кса(/Км (мЬГ’с·1)
[С1п3]АрЗ-11а 87 ± 3# 55 ± 1* 632 ± 10*
[Сл1п3] Αβ3-11 а 155 ±4 41,4 ±0,4 267 ±4
[О1п3]АрЗ-21а 162 ± 12 62 ±3 383 ± 10
[Ο1η3]Αβ3-40 89 ± 10 40 ± 2 449 ± 28
глюкагон(3-29) 19± 1 10,0 ±0,2 526 ± 17
#Определение проводили в отсутствие ДМСО.
Пример 10. Превращение Ав3-11а и Ав3-21а с помощью рекомбинантной человеческой ОС.
Инкубация Ав3-11а и Ав3-21а в присутствии ОС позволила установить, что, в отличие от данных, приведенных в ранее опубликованных работах, содержащие глутамат пептиды также могут служить в качестве субстратов ОС (фиг. 15В и Г). Катализируемое ОС образование [рС1и3]Ав3-11а и [рС1и3]Ав321а изучали при рН 5,2 и 6,5, соответственно. Если в раствор добавляли ингибитор ОС бензимидазол до начала добавления ОС, то превращение субстрата, приводящее к образованию [рС1и3]Ав3-11а или [рО1и3]Ав3-21а, подавлялось (фиг. 15Д и Е). Если ОС кипятили перед внесением, то образование рС1ипептидов было незначительным (фиг. 15А и Б).
Пример 11. Зависимость от рН катализируемой ОС из папайи циклизации Ο1π-βΝΛ и 01ιι-βΝΛ.
Превращение ОС из папайи Ск-вНА при концентрации вплоть до 2 мМ (что ограничено растворимостью субстрата) удовлетворяет уравнению скорости ферментативной реакции Михаэлиса-Ментена (фиг. 16). Изучение зависимости превращения от концентрации субстрата для катализируемого ОС превращения С1и-βNА, проведенное при рН 6,1-8,5, позволило установить, что для этого содержащего С1и субстрата оба кинетических параметра, т.е. КМ и кса1, изменялись в зависимости от рН (фиг. 16). Этот результат противоречит данным, описанным ранее для катализируемой ОС циклизации глутамина, согласно которым в данном диапазоне значений рН происходит изменения только значений КМ (Со1о1оЬоу М.У., 8опд I., Лапд V. и Ва1етап К.С., Агсй. Вюсйет. Вюрйуз. 309, 1994, сс. 300-307).
Поэтому было проведено изучение влияния концентрации протонов при С1и-и С1п-циклизации, зависимости от рН-циклизации С1и-βNА и С1п-βNА в условиях скорости реакции первого порядка (т.е. при использовании концентраций субстрата существенно более низких, чем значения КМ) (фиг. 17). Для циклизации глутамина рН-оптимум соответствовал рН 8,0, в отличие от циклизации глутаминовой кислоты, для которой рН-оптимум находился при рН 6,0. Поскольку константы специфичности в соответствующих рН-оптимумах различались примерно в 80000 раз, соотношение активности ОС и ЕС при значении рН, близком к рН 6,0, составляло примерно 8000.
Изучение неферментативного образования рС1и из С1η-βNА при рН 6,0 осуществляли в течение 4 недель, и при этом было установлено, что значение константы скорости реакции первого порядка равно 1,2х10-7с-1. Однако за этот же промежуток времени не обнаружено никакого образования рС1и-βNА из С1и-βNА, что позволяет оценить, что константа скорости, ограничивающая это превращение, составляет порядка 1,0х10-9с-1.
Пример 12. Процессы инактивации/реактивации фермента.
Аликвоту человеческой ОС (0,1-0,5 мг, 1 мг/мл) инактивировали в течение ночи путем диализа в противотоке 3000-кратного избытка 5 мМ 1,10-фенантролина или 5 мМ дипиколиновой кислоты в 0,05М бис-трис/НС1-буфере, рН 6,8. Затем инактивирующий агент тщательно удаляли путем диализа (3 цикла, 2000-кратный избыток) образцов в противотоке 0,05М бис-трис/НС1-буфера, рН 6,8, содержащего 1 мМ ЭДТК. Эксперименты по реактивации осуществляли при комнатной температуре в течение 15 мин, используя ионы Ζη, Мп++, Νί++, Са++, К++ и Со++ в концентрациях 1,0, 0,5, 0,25 мМ в 0,025М бис-трисбуфере, рН 6,8, содержащем 0,5 мМ ЭДТК. Анализ активности ОС проводили в 0,05М трис/НС1-буфере, рН 8,0, содержащем 2 мМ ЭДТК, для исключения быстрой реактивации следовыми количествами ионов металлов, присутствующих в буферных растворах.
Ингибирование свиной ОС 1,10-фенантролином уже было описано ранее (ВизЬу Л.НЭ. и др., 1. Вю1. Сйет. 262, 1987, сс. 8532-8536, Ва1етап К.СЭ. и др., Вюсйет1з1гу 40, 2001). Однако тот факт, что ЭДТК оказывает активирующее действие на ОС-катализ, позволяет предположить, что ингибирование фенантролином обусловлено образованием хелатных комплексов с металлами (ВизЬу Л.НЭ. и др., 1. Вю1. Сйет. 262, 1987, сс. 8532-8536, Ва1етап К.СЭ. и др., Вюсйет1з1гу 40, 2001). Помимо ингибирования
1,10-фенантролином катализируемая человеческой ОС циклизация субстрата снижалась в присутствии дипиколиновой кислоты и 8-гидроксихинолина, других ингибиторов металлоферментов. Эти хелаторы
- 35 009291 конкурентно и в зависимости от времени ингибировали ОС, т.е. было обнаружено конкурентное ингибирование активности уже в начале реакции и активность продолжала снижаться при пролонгированной инкубации с соединениями (фиг. 18, 19). Важным представляется тот факт, что ЭДТК не обладает заметным ингибированием, вне зависимости от продолжительности инкубации или любых иных условий.
Человеческая ОС практически полностью инактивировалась после продолжительного диализа в противотоке 5 мМ 1,10-фенантролина или 5 мМ дипиколиновой кислоты. После повторного диализа в течение ночи в противотоке не содержащих хелатор буферных растворов активность ОС частично реактитвировалась вплоть до 50-60%. Однако при диализе в противотоке буферов, содержащих 1 мМ ЭДТК, не происходило никакой реактивации.
Практически полного восстановления активности ОС после инактивации либо дипиколиновой кислотой, либо 1,10-фенантролином достигали путем инкубации белка в течение 10 мин с 0,5 мМ ΖΝ8Ο4 в присутствии 0,5 мМ ЭДТК (фиг. 20). Частичное восстановление активности ОС было получено также с использованием для реактивации ионов Со++ и Мп++. Даже в присутствии 0,25 мМ Ζπ могла проходить реактивация вплоть до 25% от исходной активности. Никакой реактивации не происходило при использовании ионов Νί++, Са++ или К++. Аналогично этому инкубация полностью активной ОС с этими ионами не оказывала никакого воздействия на ферментативную активность.

Claims (42)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение эффекторов глутаминилциклазы (ОС) для приготовления лекарственного средства, предназначенного для:
    в) лечения болезней у млекопитающих, которые можно лечить путем модуляции ОС-активности ш νίνο, и/или
    г) модуляции физиологических процессов, основанных на действии рО1и-содержащих пептидов, обусловленной модуляцией ОС-активности.
  2. 2. Применение по п.1 для изменения превращения Ν-концевых остатков глутаминовой кислоты или глутамина в остатки пироглутаминовой кислоты по меньшей мере в одном субстрате ОС, который выбран из ряда, включающего Аβ3-40/42, [61η3]Αβ3-40/42, [61и11]Αβ11-40/42, [61η11]Αβ11-40/42, |С1п||гастрины (17 и 34), [61п!] нейротензин, [О1п1]БРР, [61п1]ТЕН, [61п1]0пКН, [61п1]ССЬ 2, [61п1]ССЬ 7, [О1п1]ССЬ 8, [О1п1]ССЬ 16, [О1п1]ССЬ 18, [61п1]ЕЬА, [О1п1]фракталкин, [61п!]орексин А, [О1п3] глюкагон 3-29 и [О1п5] вещество Р5-11.
  3. 3. Применение по п.1 для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
  4. 4. Применение по п.1 для регуляции и/или контроля мужской фертильности.
  5. 5. Применение по п.1 для лечения заболевания, выбранного из ряда, включающего язвенную болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас!ет ру1оп, патогенные психические состояния, шизофрению, бесплодие, неоплазию, воспалительные реакции хозяина, рак, злокачественный метастаз, меланому, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенную связанную с гомеостазом регуляцию энергетического метаболизма, нарушенную функцию вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенную регуляцию общей воды организма.
  6. 6. Применение по п.1 для стимуляции пролиферации клеток желудочно-кишечного тракта, предпочтительно пролиферации слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острой секреции кислоты и дифференцировки, продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток.
  7. 7. Применение по п.1 для подавления пролиферации миелоидных клеток-предшественников.
  8. 8. Применение по п.1 для лечения заболевания, выбранного из болезни Гентингтона и болезни Кеннеди.
  9. 9. Применение по одному из предыдущих пунктов, где эффектор ОС вводят в сочетании с ингибитором ΌΡ 1У или ΌΡ 1У-подобными ферментами и/или ингибитором аминопептидазы.
  10. 10. Применение по п.9, где блокируют активность подобного ΌΡ 1У фермента, приводящую к образованию Н-изоА§р-А1а-ОН.
  11. 11. Применение по п.9 или 10, где ΌΡ 1У-подобный фермент представляет собой ΌΡ II.
  12. 12. Фармацевтическая композиция для парентерального, энтерального или орального введения, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере один эффектор ОС необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами.
  13. 13. Фармацевтическая композиция для парентерального, энтерального или орального введения, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере один эффектор ОС в сочетании по меньшей мере с одним ингибитором ΌΡ 1У или ΌΡ 1У-подобными ферментами и/или по меньшей мере с одним ингибитором аминопептидазы необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами.
  14. 14. Применение фармацевтических композиций по п.12 или 13 для модуляции ш νίνο ферментативной активности ОС и/или ΌΡ 1У и ΌΡ 1У-подобных ферментов и/или аминопептидаз.
    - 36 009291
  15. 15. Применение по п.14, где блокируют активность ЭР Ш-подобного фермента, приводящую к образованию Н-изоАкр-А1а-ОН.
  16. 16. Применение по п.14 или 15, где ЭР Ш-подобный фермент представляет собой ЭР II.
  17. 17. Применение по одному из пп.14-16 для изменения превращения Ν-концевых остатков глутаминовой кислоты или глутамина в пироглутамильные (5-оксопролильные) остатки по меньшей мере в одном субстрате ОС, который выбран из ряда, включающего Άβ3-40/42, [С1п3]Ав3-40/42, [С1ип]Ав 11-40/42, |С1п|Ав11-40/42, |С1п'|гастрины (17 и 34), |С1п'|нейротензин, [С1п']ЕРР, [С1пП]ТВН, [С1п1]СпКН, [С1п']ССЬ 2, [С1п1]ССЬ 7, [С1п1]ССЬ 8, [С1п1]ССЬ 16, [С1п1]ССЬ 18, [С1п1]ЕЬА, [С1п1]фракталкин, [С1п1]орексин А.
  18. 18. Применение по одному из пп.14-16 для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
  19. 19. Применение по одному из пп.14-16 для модуляции мужской фертильности путем введения эффекторов ОС.
  20. 20. Применение по одному из пп.14-16 для лечения заболевания, выбранного из ряда, включающего язвенную болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас1ег ру1оп, патогенные психические состояния, шизофрению, бесплодие, неоплазию, воспалительные реакции хозяина, рак, злокачественный метастаз, меланому, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенную связанную с гомеостазом регуляцию энергетического метаболизма, нарушенную функцию вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенную регуляцию общей воды организма.
  21. 21. Применение по одному из пп.14-16 для стимуляции пролиферации клеток желудочнокишечного тракта, предпочтительно пролиферации слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острой секреции кислоты и дифференцировки, продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток.
  22. 22. Применение по одному из пп.14-16 для подавления пролиферации миелоидных клетокпредшественников.
  23. 23. Способ скрининга для идентификации и отбора эффекторов ОС, предусматривающий следующие стадии:
    а) контактирование соединения с ОС млекопитающего в условиях, которые позволяют осуществлять их связывание;
    б) добавление субстрата ОС млекопитающего;
    в) оценка превращения субстрата или необязательное определение остаточной активности ОС млекопитающего и
    г) количественная оценка изменения в превращении субстрата и/или ферментативной активности ОС млекопитающего для идентификации модифицирующего активность ОС эффектора.
  24. 24. Способ скрининга для идентификации и отбора эффекторов, которые непосредственно или опосредовано взаимодействуют с ионом металла, связанным с активным сайтом ОС млекопитающего, предусматривающий следующие стадии:
    а) контактирование соединения с ОС млекопитающего в условиях, которые позволяют осуществлять их связывание;
    б) добавление субстрата ОС млекопитающего;
    в) оценка превращения субстрата или необязательное определение остаточной активности ОС млекопитающего и
    г) количественная оценка изменения в превращении субстрата и/или ферментативной активности млекопитающего ОС для идентификации модифицирующего активность ОС эффектора.
  25. 25. Эффекторы ОС млекопитающего, идентифицированные с помощью способов скрининга по п.23 или 24.
  26. 26. Способ лечения заболеваний у млекопитающих, которые можно лечить:
    а) путем модуляции активности ОС ш νί\Ό и/или
    б) путем модуляции физиологических процессов, основанных на действии рС1и-содержащих пептидов, обусловленном модуляцией ОС-активности, который заключается в том, что млекопитающим вводят терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного эффектора глутаминилциклазы (ОС) для модуляции активности ОС в отношении содержащих С1п или С1и пептидов.
  27. 27. Способ по п.26, в котором модуляция активности ОС приводит к изменению превращения Νконцевых остатков глутаминовой кислоты или глутамина в остатки пироглутаминовой кислоты по меньшей мере в одном субстрате ОС, который выбран из ряда, включающего Λβ3-40/42, [С1п3]Ав3-40/42, [С1ип]Ав11-40/42, [С1п11]Ав 11-40/42, [С1п1]гастрины (17 и 34), [С1п1]нейротензин, [С1п1]ЕРР, [С1п1]ТВН, [С1п1]СпЯН, [С1п']ССЬ 2, [С1п']ССЬ 7, [С1п']ССЬ 8, [С1п']ССЬ 16, [С1п']ССЬ 18, [С1п1]ЕЬА, [С1п1 ]фракталкин, [С1п']орексин А, [С1п3] глюкагон 3-29 и [С1п5] вещество Р5-11.
  28. 28. Способ по п.26 для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
    - 37 009291
  29. 29. Способ по п.26, в котором модуляция активности рС включает регуляцию и/или контроль мужской фертильности.
  30. 30. Способ по п.26, в котором заболевание выбрано из ряда, включающего язвенную болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас1ег ру1оп, патогенные психические состояния, шизофрению, бесплодие, неоплазию, воспалительные реакции хозяина, рак, злокачественный метастаз, меланому, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточноопосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенную связанную с гомеостазом регуляцию энергетического метаболизма, нарушенную функцию вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенную регуляцию общей воды организма.
  31. 31. Способ по п.26, в котором лечение приводит к стимуляции пролиферации клеток желудочнокишечного тракта, предпочтительно пролиферации слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острой секреции кислоты и дифференцировки, продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток.
  32. 32. Способ по п.26, в котором лечение приводит к подавлению пролиферации миелоидных клетокпредшественников.
  33. 33. Способ по одному из пп.26-32, в котором эффектор рС вводят в сочетании с ингибитором БР IV или БР Ιν-подобными ферментами и/или ингибитором аминопептидазы.
  34. 34. Способ по п.33, в котором блокируют активность БР Ιν-подобного фермента, приводящую к образованию Н-изоЛзр-Л1а-ОН.
  35. 35. Способ лечения по п.34, в котором БР Ιν-подобный фермент представляет собой БР ΙΙ.
  36. 36. Способ лечения болезней у млекопитающих, которые можно лечить:
    а) путем модуляции активности рС ίη νίνο и/или
    б) путем модуляции физиологических процессов, основанных на действии рО1и-содержащих пептидов, обусловленном модуляцией активности рС, и/или активности БР Ιν и БР Ιν-подобных ферментов, и/или активности аминопептидазы ίη νίνο, который заключается в том, что млекопитающим вводят фармацевтические композиции по п.12 или 13.
  37. 37. Способ по п.36 изменения превращения Ν-концевых остатков глутаминовой кислоты или глутамина в пироглутамильные (5-оксопролильные) остатки по меньшей мере в одном субстрате рС, который выбран из ряда, включающего Ар3-40/42, [01η3]Αβ3-40/42, [О1и11]Лр 11-40/42, [Ο1η11]Αβ 11-40/42, [01η1]гастрины (17 и 34), [СЬ^нейротензин, [С1п1]РРР, [С1п1]ТКН, [С1п1]ОпЕН, [С1п1]ССЬ 2, [С1п1]ССЬ 7, [С1п1]ССЬ 8, [С1п1]ССЬ 16, [С1п1]ССЬ 18, [С1п1]ЕЬА, [С^фракталкин, [С^орексин А.
  38. 38. Способ по п.36 для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
  39. 39. Способ по п.36 для модуляции мужской фертильности.
  40. 40. Способ по п.36 для лечения заболевания, выбранного из ряда, включающего язвенную болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас1ег ру1ог1, патогенные психические состояния, шизофрению, бесплодие, неоплазию, воспалительные реакции хозяина, рак, злокачественный метастаз, меланому, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточноопосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенную связанную с гомеостазом регуляцию энергетического метаболизма, нарушенную функцию вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенную регуляцию общей воды организма.
  41. 41. Способ по п.36 для стимуляции пролиферации клеток желудочно-кишечного тракта, предпочтительно пролиферации слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острой секреции кислоты и дифференцировки, продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток.
  42. 42. Способ по п.36 для подавления пролиферации миелоидных клеток-предшественников.
EA200501700A 2003-05-05 2004-05-05 Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз EA009291B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46801403P 2003-05-05 2003-05-05
US46804303P 2003-05-05 2003-05-05
US51203803P 2003-10-15 2003-10-15
PCT/EP2004/004778 WO2004098625A2 (en) 2003-05-05 2004-05-05 Medical use of inhibitors of glutaminyl and glutamate cyclases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501700A1 EA200501700A1 (ru) 2006-06-30
EA009291B1 true EA009291B1 (ru) 2007-12-28

Family

ID=42827350

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501700A EA009291B1 (ru) 2003-05-05 2004-05-05 Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP1620082B9 (ru)
JP (1) JP5690463B2 (ru)
CN (1) CN1784220B (ru)
AT (1) ATE464889T1 (ru)
AU (2) AU2004237408C9 (ru)
BR (1) BRPI0410078A (ru)
CA (1) CA2524009C (ru)
DK (1) DK1620082T3 (ru)
EA (1) EA009291B1 (ru)
HK (1) HK1089964A1 (ru)
IL (2) IL171339A (ru)
MX (1) MXPA05011861A (ru)
NZ (1) NZ543146A (ru)
PL (1) PL1620082T3 (ru)
WO (1) WO2004098625A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2542994C2 (ru) * 2009-12-04 2015-02-27 Эббви Инк. Bcl-2-селективные апоптоз-индуцирующие средства для лечения рака и иммунных заболеваний

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2206496B1 (en) * 2003-05-05 2014-09-17 Probiodrug AG Screening of inhibitors of formation of pyroglutamic acid in amyloid beta peptide
BRPI0415409A (pt) 2003-10-15 2006-12-05 Probiodrug Ag uso de efetuadores de ciclases de glutaminila e glutamato
EP1680120A2 (en) * 2003-11-03 2006-07-19 Probiodrug AG Combinations useful for the treatment of neuronal disorders
CN1918131B (zh) * 2004-02-05 2011-05-04 前体生物药物股份公司 谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂
ATE541835T1 (de) * 2004-02-05 2012-02-15 Probiodrug Ag Neue inhibitoren von glutaminylcyclase
WO2007033350A1 (en) 2005-09-14 2007-03-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors for treating diabetes
EP1924567B1 (en) 2005-09-16 2012-08-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Process for the preparation of pyrimidinedione derivatives
US7572614B2 (en) 2006-02-24 2009-08-11 Academia Sinica Crystal structure of soluble glutaminyl cyclase
WO2007112347A1 (en) 2006-03-28 2007-10-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
JP5203360B2 (ja) 2006-06-23 2013-06-05 アボット・ラボラトリーズ ヒスタミンｈ３受容体調節剤としてのシクロプロピルアミン誘導体
US9108948B2 (en) 2006-06-23 2015-08-18 Abbvie Inc. Cyclopropyl amine derivatives
US9277737B2 (en) 2006-09-21 2016-03-08 Probiodrug Ag Mouse models carrying a knock-out mutation of the QPCTL-gene
NZ590631A (en) * 2006-09-21 2011-12-22 Probiodrug Ag Novel genes related to glutaminyl cyclase
US8889709B2 (en) 2006-09-21 2014-11-18 Probiodrug Ag Use of isoQC inhibitors in the treatment and prevention of inflammatory diseases or conditions
WO2008055945A1 (en) 2006-11-09 2008-05-15 Probiodrug Ag 3-hydr0xy-1,5-dihydr0-pyrr0l-2-one derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase for the treatment of ulcer, cancer and other diseases
TW200838536A (en) 2006-11-29 2008-10-01 Takeda Pharmaceutical Polymorphs of succinate salt of 2-[6-(3-amino-piperidin-1-yl)-3-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydro-2H-pyrimidin-1-ylmethy]-4-fluor-benzonitrile and methods of use therefor
ZA200904353B (en) * 2007-01-19 2010-09-29 Probiodrug Ag In vivo screening models for treatment of alzheimer's disease and other Qpct-related disorders
EP2481408A3 (en) 2007-03-01 2013-01-09 Probiodrug AG New use of glutaminyl cyclase inhibitors
JP5612860B2 (ja) 2007-03-09 2014-10-22 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのイミダゾ［１，５−ａ］ピリジン誘導体
DK2142514T3 (da) 2007-04-18 2015-03-23 Probiodrug Ag Thioureaderivater som glutaminylcyclase-inhibitorer
WO2009034158A2 (en) * 2007-09-12 2009-03-19 Probiodrug Ag Transgenic mice
NZ586665A (en) 2008-01-14 2011-12-22 Probiodrug Ag MOUSE MODELS CARRYING A KNOCK-OUT MUTATION OF THE GLUTAMINYL CYCLASE GENE (Qpct)
EA025107B1 (ru) * 2008-07-31 2016-11-30 Пробиодруг Аг Способ диагностирования болезни альцгеймера, нейродегенерации при синдроме дауна или легкого когнитивного нарушения у субъекта (варианты) и набор для осуществления способа
US8288591B2 (en) 2008-11-20 2012-10-16 Designer Molecules, Inc. Curing agents for epoxy resins
US9186353B2 (en) 2009-04-27 2015-11-17 Abbvie Inc. Treatment of osteoarthritis pain
AU2010294214B2 (en) 2009-09-11 2015-05-07 Vivoryon Therapeutics N.V. Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
US20110091910A1 (en) * 2009-09-18 2011-04-21 Probiodrug Ag Novel assay
WO2011076854A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Probiodrug Ag CLEAVAGE OF β-AMYLOID PRECURSOR PROTEIN
JP2013519891A (ja) * 2010-02-18 2013-05-30 プロビオドルグ エージー ピログルタミン酸修飾ｍｃｐ−１を決定することにより炎症性疾患を診断する方法及びグルタミニルシクラーゼの阻害剤のスクリーニング方法
JP6026284B2 (ja) 2010-03-03 2016-11-16 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤
AU2011226074B2 (en) 2010-03-10 2015-01-22 Vivoryon Therapeutics N.V. Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (QC, EC 2.3.2.5)
US20130012620A1 (en) * 2010-03-17 2013-01-10 Designer Molecules, Inc. Curing agents for epoxy resins
EP2560953B1 (en) 2010-04-21 2016-01-06 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2012022804A1 (en) 2010-08-19 2012-02-23 Probiodrug Ag Crystal structure of glutaminyl cyclase
JP2013541938A (ja) 2010-09-02 2013-11-21 プロビオドルグ エージー アイソｑｃ関連障害の治療のためのインビボスクリーニングモデル
WO2012037258A1 (en) 2010-09-16 2012-03-22 Abbott Laboratories Processes for preparing 1,2-substituted cyclopropyl derivatives
BR112013021056B1 (pt) * 2011-02-17 2022-03-29 Pujirebio Diagnostics, Inc Anticorpo monoclonal, kit, e, método para diagnosticar um indivíduo com câncer ovariano
JP6050264B2 (ja) 2011-03-16 2016-12-21 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤としてのベンゾイミダゾール誘導体
WO2013024043A2 (en) 2011-08-12 2013-02-21 Probiodrug Ag In vivo screening models for treatment of qc-related disorders
US9138393B2 (en) * 2013-02-08 2015-09-22 The Procter & Gamble Company Cosmetic compositions containing substituted azole and methods for improving the appearance of aging skin
SG11201506609VA (en) * 2013-03-15 2015-09-29 Probiodrug Ag Novel inhibitors
JP6902416B2 (ja) * 2016-07-05 2021-07-14 ライオン株式会社 睡眠評価用マーカー及びその用途
EP3747437A1 (en) 2017-07-24 2020-12-09 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Treating pathological conditions by direct and indirect targeting of sirpa - cd47 interaction
PL3461819T3 (pl) 2017-09-29 2020-11-30 Probiodrug Ag Inhibitory cyklazy glutaminylowej
IT202100012173A1 (it) * 2021-05-12 2022-11-12 Univ Degli Studi Roma La Sapienza Composizioni per l’uso nel trattamento di disabilità intellettiva e di malattie neurodegenerative in un soggetto con Sindrome di Down
AU2022298746A1 (en) 2021-06-24 2023-11-30 Insilico Medicine Ip Limited Beta-lactam derivatives for the treatment of diseases

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993020061A1 (en) * 1992-04-01 1993-10-14 The University Of Toledo 4-[4'-piperidinyl or 3'-pirrolidinyl] substituted imidazoles as h3-receptor antagonists and therapeutic uses thereof
US5552426A (en) * 1994-04-29 1996-09-03 Eli Lilly And Company Methods for treating a physiological disorder associated with β-amyloid peptide
WO1999041224A1 (en) * 1998-02-13 1999-08-19 Merck Frosst Canada & Co. Biaryl-acetic acid derivatives and their use as cox-2 inhibitors
WO2001034594A1 (en) * 1999-11-12 2001-05-17 Guilford Pharmaceuticals, Inc. Dipeptidyl peptidase iv inhibitors and methods of making and using dipeptidyl peptidase iv inhibitors
WO2002013821A1 (en) * 2000-08-17 2002-02-21 Gliatech, Inc. Novel alicyclic imidazoles as h3 agents
WO2003040174A2 (en) * 2001-11-09 2003-05-15 Probiodrug Ag Substituted amino ketone compounds
WO2004089366A1 (en) * 2003-04-10 2004-10-21 Pfizer Japan, Inc. Bicyclic compounds as nr2b receptor antagonists

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL111785A0 (en) 1993-12-03 1995-01-24 Ferring Bv Dp-iv inhibitors and pharmaceutical compositions containing them
WO1995022327A1 (en) * 1994-02-22 1995-08-24 Knoll Ag Use of 1-(arylalkylaminoalkyl) imidazoles for treating neurological damage
NZ308931A (en) * 1995-05-30 2001-10-26 Gliatech Inc 1H-4(5)-substituted imidazole derivatives useful as a histamine H3 receptor antagonist
DE122010000020I1 (de) 1996-04-25 2010-07-08 Prosidion Ltd Verfahren zur Senkung des Blutglukosespiegels in Säugern
TW492957B (en) 1996-11-07 2002-07-01 Novartis Ag N-substituted 2-cyanopyrrolidnes
US6011155A (en) 1996-11-07 2000-01-04 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-2-cyanopyrrolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
AU766219B2 (en) 1998-02-02 2003-10-09 1149336 Ontario Inc. Method of regulating glucose metabolism, and reagents related thereto
JP2002506075A (ja) 1998-03-09 2002-02-26 フォンダテッヒ・ベネルクス・ナムローゼ・フェンノートシャップ セリンペプチダーゼ調節剤
DE19823831A1 (de) 1998-05-28 1999-12-02 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Neue pharmazeutische Verwendung von Isoleucyl Thiazolidid und seinen Salzen
DE19828114A1 (de) 1998-06-24 2000-01-27 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Produgs instabiler Inhibitoren der Dipeptidyl Peptidase IV
DE19828113A1 (de) 1998-06-24 2000-01-05 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Prodrugs von Inhibitoren der Dipeptidyl Peptidase IV
DE19834591A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Verfahren zur Steigerung des Blutglukosespiegels in Säugern
AU5027299A (en) 1998-07-31 2000-02-28 Novo Nordisk A/S Use of glp-1 and analogues for preventing type ii diabetes
US6172081B1 (en) 1999-06-24 2001-01-09 Novartis Ag Tetrahydroisoquinoline 3-carboxamide derivatives
US6110949A (en) 1999-06-24 2000-08-29 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-4-cyanothiazolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
US6107317A (en) 1999-06-24 2000-08-22 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-thiazolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
GB9928330D0 (en) 1999-11-30 2000-01-26 Ferring Bv Novel antidiabetic agents
US6380398B2 (en) 2000-01-04 2002-04-30 Novo Nordisk A/S Therapeutically active and selective heterocyclic compounds that are inhibitors of the enzyme DPP-IV
EP1254113A1 (en) 2000-01-24 2002-11-06 Novo Nordisk A/S N-substituted 2-cyanopyroles and -pyrrolines which are inhibitors of the enzyme dpp-iv
US6395767B2 (en) 2000-03-10 2002-05-28 Bristol-Myers Squibb Company Cyclopropyl-fused pyrrolidine-based inhibitors of dipeptidyl peptidase IV and method
GB0010188D0 (en) 2000-04-26 2000-06-14 Ferring Bv Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV
GB0010183D0 (en) 2000-04-26 2000-06-14 Ferring Bv Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV
MXPA02012272A (es) 2000-07-04 2003-04-25 Novo Nordisk As Compuestos heterociclicos que son inhibidores de la enzima dipeptidilpeptidasa-iv.
AU2001269123A1 (en) 2000-07-10 2002-01-21 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human dipeptidyl-peptidase iv-like enzyme
EP1950199B1 (en) 2000-08-10 2009-12-02 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Proline derivatives and use thereof as drugs
CN101143217A (zh) 2000-10-27 2008-03-19 前体生物药物股份有限公司 神经性和神经心理性疾病的治疗方法
TWI243162B (en) 2000-11-10 2005-11-11 Taisho Pharmaceutical Co Ltd Cyanopyrrolidine derivatives
JPWO2002051836A1 (ja) 2000-12-27 2004-04-22 協和醗酵工業株式会社 ジペプチジルペプチダーゼ−ｉｖ阻害剤
PT1368349E (pt) 2001-02-24 2007-04-30 Boehringer Ingelheim Pharma Derivados de xantina, sua preparação e sua utilização como medicamento
ATE395912T1 (de) 2001-03-27 2008-06-15 Merck & Co Inc Dipeptidylpeptidase-hemmer für die behandlung oder prävention von diabetes
US6573287B2 (en) 2001-04-12 2003-06-03 Bristo-Myers Squibb Company 2,1-oxazoline and 1,2-pyrazoline-based inhibitors of dipeptidyl peptidase IV and method
US20030013177A1 (en) * 2001-05-23 2003-01-16 Ebens Allen J. Polynucleotides encoding insect glutaminyl cyclase and uses thereof
JP2005500308A (ja) 2001-06-20 2005-01-06 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 糖尿病を治療するためのジペプチジルペプチダーゼ阻害剤
CA2450579A1 (en) 2001-06-20 2003-01-03 Merck & Co., Inc. Dipeptidyl peptidase inhibitors for the treatment of diabetes
GB0115517D0 (en) 2001-06-25 2001-08-15 Ferring Bv Novel antidiabetic agents
ATE370943T1 (de) 2001-06-27 2007-09-15 Smithkline Beecham Corp Fluoropyrrolidine als dipeptidyl-peptidase inhibitoren
DE10150203A1 (de) 2001-10-12 2003-04-17 Probiodrug Ag Peptidylketone als Inhibitoren der DPIV
IL158923A0 (en) 2001-06-27 2004-05-12 Smithkline Beecham Corp Fluoropyrrolidines as dipeptidyl peptidase inhibitors
CA2419888A1 (en) 2001-06-27 2003-01-09 Probiodrug Ag Peptide structures useful for competitive modulation of dipeptidyl peptidase iv catalysis
JP4300108B2 (ja) 2001-06-27 2009-07-22 スミスクライン ビーチャム コーポレーション ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤としてのピロリジン類
WO2003002595A2 (en) 2001-06-27 2003-01-09 Probiodrug Ag Dipeptidyl peptidase iv inhibitors and their uses as anti-cancer agents
EP1404675B1 (en) 2001-07-03 2008-03-12 Novo Nordisk A/S Dpp-iv-inhibiting purine derivatives for the treatment of diabetes
TWI246510B (en) 2001-09-14 2006-01-01 Mitsubishi Pharma Corp Thiazolidine derivatives and pharmaceutical uses thereof
WO2003024965A2 (en) 2001-09-19 2003-03-27 Novo Nordisk A/S Heterocyclic compounds that are inhibitors of the enzyme dpp-iv
GB0704100D0 (en) 2006-03-17 2007-04-11 Vodafone Plc Improvements in an ehspa architecture
WO2010051836A1 (de) 2008-11-05 2010-05-14 Osram Gesellschaft mit beschränkter Haftung Vor kurzschluss geschützte halbbrückenschaltung mit halbleiterschaltern
US8049427B2 (en) 2008-11-25 2011-11-01 Lutron Electronics Co., Inc. Load control device having a visual indication of energy savings and usage information

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993020061A1 (en) * 1992-04-01 1993-10-14 The University Of Toledo 4-[4'-piperidinyl or 3'-pirrolidinyl] substituted imidazoles as h3-receptor antagonists and therapeutic uses thereof
US5552426A (en) * 1994-04-29 1996-09-03 Eli Lilly And Company Methods for treating a physiological disorder associated with β-amyloid peptide
WO1999041224A1 (en) * 1998-02-13 1999-08-19 Merck Frosst Canada & Co. Biaryl-acetic acid derivatives and their use as cox-2 inhibitors
WO2001034594A1 (en) * 1999-11-12 2001-05-17 Guilford Pharmaceuticals, Inc. Dipeptidyl peptidase iv inhibitors and methods of making and using dipeptidyl peptidase iv inhibitors
WO2002013821A1 (en) * 2000-08-17 2002-02-21 Gliatech, Inc. Novel alicyclic imidazoles as h3 agents
WO2003040174A2 (en) * 2001-11-09 2003-05-15 Probiodrug Ag Substituted amino ketone compounds
WO2004089366A1 (en) * 2003-04-10 2004-10-21 Pfizer Japan, Inc. Bicyclic compounds as nr2b receptor antagonists

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MISQUITTA S.A. ET AL.: "CHARACTERIZATION OF THE INHIBITION OF GLUTAMINYL CYCLASE BY IMIDAZOLE DERIVATIVES AND PHENANTHROLINES", FEDERATION OF AMERICAN SOCIETIES FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY. ANNUAL MEETING. ABSTRACTS OF PAPERS, vol. 16, no. 4, 20 March 2002 (2002-03-20), page A157, XP009034877, abstract *
MISQUITTA S.A. ET AL.: "INHIBITION STUDIES OF GLUTAMINYL CYCLASE", FASEB JOURNAL (FEDERATION OF AMERICAN SOCIETIES FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY), BETHESDA, US, vol. 15, no. 5, 8 March 2001 (2001-03-08), page A1159, XP009034875, ISSN: 0892-6638, abstract *
SCHILLING S. ET AL.: "Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions", FEBS LETTERS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 563, no. 1-3, 9 April 2004 (2004-04-09), pages 191-196, XP004501117, ISSN: 0014-5793, see abstract *
SCHILLING S. ET AL.: "Identification of human glutaminyl cyclase as a metalloenzymesee", J. BIOL. CHEM., vol. 278, no. 50, 12 December 2003 (2003-12-12), pages 49773-49779, XP002324506, see abstract *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2542994C2 (ru) * 2009-12-04 2015-02-27 Эббви Инк. Bcl-2-селективные апоптоз-индуцирующие средства для лечения рака и иммунных заболеваний

Also Published As

Publication number Publication date
IL171339A (en) 2011-11-30
ATE464889T1 (de) 2010-05-15
HK1089964A1 (en) 2006-12-15
EA200501700A1 (ru) 2006-06-30
AU2004237408C1 (en) 2010-04-01
IL206009A (en) 2017-09-28
CA2524009C (en) 2014-04-29
AU2004237408C9 (en) 2010-04-15
AU2009227925A1 (en) 2009-11-12
NZ543146A (en) 2008-09-26
PL1620082T3 (pl) 2010-10-29
JP5690463B2 (ja) 2015-03-25
IL206009A0 (en) 2010-11-30
EP1620082B9 (en) 2010-08-25
EP1620082A2 (en) 2006-02-01
AU2004237408A1 (en) 2004-11-18
CN1784220B (zh) 2011-08-03
BRPI0410078A (pt) 2006-05-16
DK1620082T3 (da) 2010-08-16
WO2004098625A2 (en) 2004-11-18
MXPA05011861A (es) 2006-02-17
EP1620082B1 (en) 2010-04-21
CN1784220A (zh) 2006-06-07
AU2004237408B2 (en) 2009-10-01
JP2006525278A (ja) 2006-11-09
WO2004098625A3 (en) 2005-06-23
AU2009227925B2 (en) 2011-12-15
CA2524009A1 (en) 2004-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009291B1 (ru) Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз
EA010108B1 (ru) Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз
EP2206496B1 (en) Screening of inhibitors of formation of pyroglutamic acid in amyloid beta peptide
AU2013211539A1 (en) Use of effectors of glutaminyl and glutamate cyclases
AU2011265545A1 (en) Use of effectors of glutaminyl and glutamate cyclases

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY RU