CN1784220B - 谷氨酰胺酰基和谷氨酸环化酶效应物的应用 - Google Patents

谷氨酰胺酰基和谷氨酸环化酶效应物的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN1784220B
CN1784220B CN2004800123862A CN200480012386A CN1784220B CN 1784220 B CN1784220 B CN 1784220B CN 2004800123862 A CN2004800123862 A CN 2004800123862A CN 200480012386 A CN200480012386 A CN 200480012386A CN 1784220 B CN1784220 B CN 1784220B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pro
ile
gln
gly
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2004800123862A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1784220A (zh
Inventor
汉斯-乌尔里希·德穆特
托尔斯滕·霍夫曼
安德烈·J.·尼斯特罗杰
斯特凡·席林
乌尔里希·海泽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vivoyon Treatment Public Ltd
Original Assignee
Probiodrug AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Probiodrug AG filed Critical Probiodrug AG
Publication of CN1784220A publication Critical patent/CN1784220A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1784220B publication Critical patent/CN1784220B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4178—1,3-Diazoles not condensed 1,3-diazoles and containing further heterocyclic rings, e.g. pilocarpine, nitrofurantoin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4188—1,3-Diazoles condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. biotin, sorbinil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4192—1,2,3-Triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/12—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/06—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/572—Five-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/576—Six-membered rings
    • C07F9/59—Hydrogenated pyridine rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6503—Five-membered rings
    • C07F9/6506—Five-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings

Abstract

本发明提供了哺乳动物谷氨酰胺酰基环化酶(QC，EC 2.3.2.5)的新生理底物、QC的新效应物、筛选该效应物的方法、该效应物以及包含该效应物的药物组合物在治疗可通过调节QC活性治疗的疾病中的应用。优选的组合物还包括DP IV或DP IV样酶抑制剂以治疗或减轻可通过调节QC和DP IV活性治疗的疾病。

Description

谷氨酰胺酰基和谷氨酸环化酶效应物的应用
技术领域
本发明涉及谷氨酰胺酰基环化酶(glutaminyl cyclase)(QC，EC2.3.2.5)，其催化N-末端谷氨酰胺残基转化为焦谷氨酸(5-氧代-脯氨酸，pGlu*)同时释放氨的分子内环化反应和N-末端谷氨酸残基转化为焦谷氨酸同时释放水分子的分子内环化反应。
本发明确认了哺乳动物的QC为金属酶，提供了新型的哺乳动物QC的生理底物和QC效应物的应用、用于治疗可通过调节QC活性治疗的疾病的包含QC效应物的药物组合物。此外，已发现金属相互作用(metalinteraction)是开发QC抑制剂的一种有效途径。
在一个优选的具体实施方案中，本发明提供将QC活性的效应物与DP IV或DP IV样酶(DP IV-like enzyme)的抑制剂相联合在治疗或减轻可通过调节QC和/或DP IV活性治疗的疾病中的应用。
本发明还提供一种鉴定和选择QC活性的效应物的筛选方法。
背景技术
谷氨酰胺酰基环化酶(QC，EC 2.3.2.5)催化N-末端谷氨酰胺残基转化为焦谷氨酸(pGlu*)同时释放氨的分子内环化反应。1963年，Messer首次由热带植物番木瓜(Carica papaya)胶乳中分离得到QC(Messer，M.1963 Nature 4874，1299)。24年后，在动物垂体中发现了一种相应的酶活性(Busby，W.H.J.等，1987 J Biol Chem 262，8532-8536；Fischer；W.H.和Spiess，J.1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84，3628-3632)。对于哺乳动物的QC，通过QC的Gln至pGlu的转化可见于TRH和GnRH前体(Busby，W.H.J.等，1987 J Biol Chem 262，8532-8536；Fischer， W.H.和Spiess，J.1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84，3628-3632)。此外，最初的QC定位试验显示其与催化作用的推断(putative)产物共存于牛垂体中，进一步提高所提出的于肽类激素合成中的功能(Bockers，T.M.等，1995 J Neuroendocrinol 7，445-453)。相反，植物QC的生理功能较不明显。就来自番木瓜的酶而言，据认为其在植物防御病原微生物具有一定作用(EI Moussaoui，A.等，2001 Cell Mol Life Sci 58，556-570)。最近通过序列对比确定了来自其它植物的推断QC(Dahl，S.W.等，2000 Protein Expr Purif 20，27-36)。然而，这些酶的生理功能仍然不明确。
来自植物和动物的已知QC在底物的N-末端部位对L-谷氨酰胺有严格的特异性，并且发现它们的动力学行为符合Michaelis-Menten方程(Pohl，T.等，1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88，10059-10063；Consalvo，A.P.等，1988 Anal Biochem 175，131-138；Gololobov，M.Y.等，1996 BiolChem Hoppe Seyler 377，395-398)。然而，对比来自番木瓜的QC和哺乳动物高度保守的(highly conserved)QC的一级结构却并未发现任何序列同源性(Dahl，S.W.等，2000 Protein Expr Purif 20，27-36)。其中植物的QC似乎属于一类新的酶家族(Dahl，S.W.等，2000 Protein ExprPurif 20，27-36)，而且发现哺乳动物的QC与细菌氨肽酶具有显著的序列同源性(Bateman，R.C.等，2001 Biochemistry 40，11246-11250)，从而得出植物和动物的QC具有不同的进化起源的结论。
EP 02 011 349.4公开编码昆虫谷氨酰胺酰基环化酶的多核苷酸，及其所编码的多肽。该申请进一步提供包含表达载体的宿主细胞，该表达载体包含本发明的多核苷酸。所分离的多肽和包含昆虫QC的宿主细胞可用于筛选降低谷氨酰胺酰基环化酶活性的药物的方法中。据记载，这种药物可用作杀虫剂。
阿尔茨海默症(AD)是以与营养不良的神经元、反应性星形胶质细胞以及小胶质细胞紧密相关的细胞外淀粉样斑块(amyloidotic plaque) 的异常堆积为特征(Terry，R.D.和Katzman，R.1983 Ann Neurol 14，497-506；Glenner，G.G.和Wong，C.W.1984 Biochem Biophys Res Comm120，885-890；Intagaki，S.等，1989 J Neuroimmunol 24，173-182；Funato，H.等，1998 Am J Pathol 152，983-992；Selkoe，D.J.2001 Physiol Rev 81，741-766)。β淀粉样(Amyloid-β，Aβ)肽是老年斑的主要成分，并且被认为与AD发病机理及进展直接相关，该假设得到遗传学研究的支持(Glenner，G.G.和Wong，C.W.1984 Biochem Biophys Res Comm 120，885-890；Borchelt，D.R.等，1996 Neuron 17，1005-1013；Lemere，C.A.等，1996 Nat Med 2，1146-1150；Mann，D.M.和Iwatsubo，T.1996Neurodegeneration 5，115-120；Citron，M.等，1997 Nat Med 3，67-72；Selkoe，D.J.2001 Physiol Rev 81，741-766)。Aβ是由β-淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解生成(Kang，J.等，1987 Nature 325，733-736；Selkoe，D.J.1998 Trends Cell Biol 8，447-453)，它通过Aβ的N-末端的β-分泌酶和C-末端的γ-分泌酶顺序切割(Haass，C.和Selkoe，D.J.1993Cell 75，1039-1042；Simons，M.等，1996 J Neurosci 16 899-908)。除了在N-末端始于L-Asp的优势Aβ肽(Aβ-1-42/40)之外，老年斑中存在很多异质性N-末端截短的形式。据报道这种被截短的肽在体外具有更强的神经毒性并且比全长的同工型更迅速聚集(Pike，C.J.等，1995 J BiolChem 270 23895-23898)。已知N端截短的肽是在早期发作的家族性AD(FAD)患者中过度产生(Saido，T.C.等，1995 Neuron 14，457-466；Russo，C.等，2000 Nature 405，531-532)，并已知在唐氏综合征(DS)患者的脑中于早期出现并且随年龄增长而增加(Russo，C.等，1997 FEBSLett 409，411-416，Russo，C.等，2001 Neurobiol Dis 8，173-180；Tekirian，T.L.等，1998 J Neuropathol Exp Neurol 57，76-94)。最后，其数量反映了疾病进行性的严重程度(Russo，C.等，1997 FEBS Lett 409，411-416)。额外的翻译后过程可能通过1位与7位天冬氨酸的异构化或外消旋化以及残基3和11的谷氨酸的环化进一步修饰N-末端。3位含焦谷氨酰胺 的同工型[pGlu3]Aβ3-40/42]代表老年斑中N-端截短的物质的显著形式-大约占Aβ总量的50％(Mori，H.等，1992 J Biol Chem 267，17082-17086，Saido，T.C.等，1995 Neuron 14，457-466；Russo，C.等，1997 FEBS Lett409，411-416；Tekirian，T.L.等，1998 J Neuropathol Exp Neurol 57，76-94；Geddes，J.W.等，1999 Neurobiol Aging 20，75-79；Harigaya，Y.等，2000Biochem Biophys Res Commun 276，422-427)，并且它们同样存在于前淀粉样病变(pre-amyloid lesion)中(Lalowski，M.等，1996 J Biol Chem 271，33623-33631)。AβN3(pE)肽的堆积很可能是由于增强聚集和赋予对大多数氨肽酶的抵抗性的结构修饰所致(Saido，T.C.等，1995 Neuron 14，457-466；Tekirian，T.L.等，1999 J Neurochem 73，1584-1589)。该证据为AD发病机理中AβN3(pE)肽的关键作用提供了线索。然而，关于其神经毒性和聚集性方面却了解得很少(He，W.和Barrow，C.J.1999Biochemistry 38，10871-10877；Tekirian，T.L.等，1999 J Neurochem 73，1584-1589)。此外，尽管活性神经胶质确实与老年斑有关并且可能对淀粉样沉积(amyloid deposit)具有积极作用，但这些同工型对神经胶质细胞的作用及神经胶质对这些肽的反应完全未知。在最近的研究中，在神经元和神经胶质细胞培养物中研究了Aβ1-42、Aβ1-40、[pGlu3]Aβ3-42和[pGlu3]Aβ3-40肽的毒性、聚集性以及分解代谢，表明焦谷氨酸的修饰加剧了Aβ-肽的毒性，同时还抑制其被经培养的星形胶质细胞降解。Shirotani等人在体外研究了感染辛德毕斯病毒(Sindbis Virus)的原代皮质神经元(primary cortical neuron)中[pGlu3]Aβ肽的生成。它们构建了通过氨基酸取代和缺失编码[pGlu3]Aβ的潜在前体的淀粉样前体蛋白互补DNA。对于始于N-末端谷氨酰胺残基而不是天然前体中的谷氨酸的人工前体而言，提示存在通过谷氨酰胺酰基环化酶自发地转化或酶促地转化为焦谷氨酸。尚未在体内确定[pGlu3]Aβ天然前体的3位N-末端谷氨酸的环化机制(Shirotani，K.，Tsubuki，S.，Lee，H.J.，Maruyama，K.，和Saido，T.C.(2002)Neurosci Lett 327，25-28)。
二肽基肽酶IV(DP IV)是在机体的多种组织包括肾脏、肝脏和肠中发现的脯氨酸后(在较小程度上为丙氨酸后、丝氨酸后或甘氨酸后)切割丝氨酸蛋白酶，并且可将N-末端的二肽从肽链上切割下来。最近已发现DP IV在神经肽的新陈代谢、T细胞活化、癌细胞对内皮的附着以及HIV进入淋巴样细胞方面起着重要的作用。参见WO 02/34242、WO02/34243、WO 03/002595以及WO 03/002596。
已知DP IV抑制剂可用于治疗葡萄糖耐受性受损以及糖尿病(国际专利申请，公开号WO 99/61431，Pederson，R.A.等，1998 Diabetes 47，1253-1258和Pauly，R.P.等，1999 Metabolism 48，385-389)。特别是WO 99/61431公开了包含氨基酸残基和噻唑烷或吡咯烷基团的DP IV抑制剂及其盐，尤其是L-苏-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-苏-异亮氨酰吡咯烷、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰吡咯烷及其盐。
低分子量的二肽基肽酶IV抑制剂的进一步实例为以下物质，如四氢异喹啉-3-甲酰胺衍生物、N-取代的2-氰基吡咯和2-氰基吡咯烷、N-(N′-取代的甘氨酰基)-2-氰基吡咯烷、N-(取代的甘氨酰基)-噻唑烷、N-(取代的甘氨酰基)-4-氰基噻唑烷、氨基-酰基-二羟硼基-脯氨酰-抑制剂、环丙基稠合的吡咯烷和杂环化合物。二肽基肽酶IV抑制剂记载于US6,380,398、US 6,011,155、US 6,107,317、US 6,110,949、US 6,124,305、US 6,172,081、WO 95/15309、WO 99/61431、WO 99/67278、WO 99/67279、DE 198 34 591、WO 97/40832、DE 196 16 486 C 2、WO 98/19998、WO00/07617、WO 99/38501、WO 99/46272、WO 99/38501、WO 01/68603、WO 01/40180、WO 01/81337、WO 01/81304、WO 01/55105、WO 02/02560以及WO 02/14271、WO 02/04610、WO 02/051836、WO 02/068420、WO02/076450、WO 02/083128、WO 02/38541、WO 03/000180、WO 03/000181、WO 03/000250、WO 03/002530、WO 03/002531、WO 03/002553、WO03/002593、WO 03/004496、WO 03/024942以及WO 03/024965，其教导，尤其是涉及这些抑制剂、其定义、应用及其制备的教导全文并入此处作为参考。
发明内容
本发明提供哺乳动物中新的QC生理底物Aβ3-40/42、[Gln3]Aβ3-40/42、[Glu11]Aβ11-40/42、[Gln11]Aβ11-40/42、[Gln1]胃泌素、[Gln1]神经降压肽、[Gln1]FPP、[Gln1]CCL 2、[Gln1]CCL 7、[Gln1]CCL 8、[Gln1]CCL 16、[Gln1]CCL 18、[Gln1]分形素([Gln1]Fractalkine)、[Gln1]胖素A([Gln1]Orexin A)、[Gln3]胰高血糖素3-29及[Gln5]物质P5-11，以及QC的效应物的应用及用于治疗可通过调节QC活性治疗的疾病的包含QC效应物的药物组合物。
通过抑制试验发现，人QC是金属依赖性转移酶。QC脱辅基酶通过锌离子可最有效地被再活化，并且锌依赖性氨肽酶的金属结合基序同样存在于人QC中。与活性位点结合金属相互作用的化合物为有效的抑制剂。
出乎意料的是，研究表明重组人QC和源自大脑提取物的QC活性催化N-末端谷氨酰胺酰基的环化作用以及谷氨酸的环化作用。更惊人的发现是，环化酶催化的Glu1转化在pH 6.0左右有利，而Gln1至pGlu-衍生物的转化的最适pH在8.0左右。由于pGlu-Aβ相关肽的形成可通过抑制重组人QC及源自猪垂体提取物的QC活性而得以抑制，因此酶QC为研发阿尔茨海默症治疗药物的目标之一。
通过向哺乳动物给药QC活性的效应物，可能预防或减轻或治疗如下疾病：阿尔茨海默症、唐氏综合征、伴随或不伴随幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染的溃疡病和胃癌、病原性精神病(pathogenicpsychotic condition)、精神分裂症、不育症、瘤形成、炎性宿主应答(inflammatory host response)、癌症、银屑病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化症、体液和细胞介导的免疫应答障碍、内皮中白细胞的粘着和 迁移过程、摄食障碍(impaired food intake)、睡眠觉醒障碍(impairedsleep-wakefulness)、能量代谢平衡调节障碍、自主功能障碍(impairedautonomic function)、激素平衡障碍以及体液调节障碍。
此外，通过向哺乳动物给药QC活性效应物，可能刺激胃肠道细胞优选为胃粘膜细胞、上皮细胞的增殖、急性酸分泌以及产酸性壁细胞及分泌组胺的肠嗜铬样细胞的分化。
此外，通过向哺乳动物给药QC活性的效应物，可能抑制髓祖细胞(myeloid progenitor cell)的增殖。
另外，给药QC抑制剂能引起男性生殖力的抑制。
在一个优选的具体实施方案中，本发明提供将QC活性的效应物与DP IV或DP IV样酶抑制剂相联合在治疗或减轻可通过调节QC和/或DP IV活性治疗的疾病中的应用。
本发明提供用于非胃肠道、肠道或口服给药的药物组合物，其包括至少一种任选地与常规载体和/或赋形剂相结合的QC效应物；或包括至少一种任选地与常规载体和/或赋形剂相结合并与至少一种DP IV抑制剂相联合的QC效应物。
本发明还提供了鉴定和选择QC效应物的筛选方法。
附图说明
通过参考下列各图可进一步理解本发明的这些方面及其它方面，其中：
图1显示人QC催化的H-Gln-Ala-OH环化的进程曲线，其中于340nm处监测吸光度的减小。各样品包括0.3mM NADH/H+、14mMα-酮戊二酸、30U/ml谷氨酸脱氢酶以及1mM H-Gln-Ala-OH。从曲线A到D，应用不同浓度的QC：A，10mU/ml，B，5mU/ml，C，2.5mU/ml。在曲线D中，未加入QC。QC浓度与测得的活性之间呈线性关系(插图)。
图2显示在一级速率条件下使用Gln-βNA作为底物所确定的人和木瓜QC的pH依赖性(插图)。就人QC而言，使用根据Ellis和Morrison的由25mM MES、25mM乙酸和50mM Tris(Ellis，K.J.和Morrison，J.F.1982 Methods Enzymol.87，405-426)组成的提供恒定离子强度的缓冲系统。由于Tris的轻微抑制效应，使用50mM Mops缓冲液来研究木瓜QC。通过加入NaCl调节离子强度为0.05M。通过以基于离解基团(dissociating group)的模型拟合对速率特征进行评价。就木瓜QC而言，通过以单一离解模型(single dissociation model)拟合数据得到pKa值为7.13±0.03。
图3显示pH对人QC和源自木瓜胶乳的QC稳定性的影响。在不同pH值的0.1M缓冲液(pH 4-7的柠檬酸钠、pH 7-10的磷酸钠)中将酶储备溶液稀释20倍。将酶溶液在30℃下温育30分钟后接着按照标准方案分析酶的活性。
图4显示第2个氨基酸位置含谷氨酰胺的一组底物的专一性常数kcat/KM的对比。其中从二肽至四肽发现人QC的特异性有所提高，然而在木瓜QC中未观察到任何变化。此处呈现的数据是表3所给参数的重制曲线(replot)。
图5显示人QC催化的从H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2至pGlu-Lys(pGlu)-Arg-Leu-Ala-NH2的形成。通过因释放氨引起的m/z比的时间依赖性变化监测底物的转化。样品组成为0.5mM底物、38nM QC的40mM Tris/HCl溶液，pH 7.7。在所示的时间处，将样品从试管中除去，与基质溶液(1∶1 v/v)混合并接着记录质谱。在木瓜QC中观察到非常相似的依赖性。
图6显示木瓜QC催化的源自H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2的pGlu-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2的形成。通过因释放甲胺引起的m/z比的时间依赖性变化监测底物的转化。样品组成为0.5mM底物、0.65μM木瓜QC的40mM Tris/HCl溶液，pH 7.7。在所示的时间处，将样品从试管中 除去，与基质溶液(1∶1v/v)混合并接着记录质谱。在不含木瓜QC或向底物应用低于1.5μM人QC的样品中未观察到底物的转化(未显示)。
图7显示DP IV催化的从[Gln3]Aβ1-11到[Gln3]-Aβ3-11的形成。在所示的时间处，将样品从试管中除去，与基质溶液混合(1∶1v/v)并接着记录质谱。
图8显示DP IV抑制剂Val-吡咯烷酰胺(Val-Pyrrolidide，Val-Pyrr)对[Gln3]Aβ1-11的切割的阻碍作用。在所示的时间处，将样品从试管中移除，与基质溶液(1∶1v/v)混合并接着记录质谱。
图9显示QC催化的从[Gln3]Aβ3-11到[pGlu3]-Aβ3-11的形成。在所示的时间处，将样品从试管中移除，与基质溶液(1∶1v/v)混合并接着记录质谱。
图10显示QC抑制剂1，10-二氮杂菲对由[Gln3]Aβ3-11生成[pGlu3]-Aβ3-11的抑制作用。在所示的时间处，将样品从试管中移除，与基质溶液混合(1∶1v/v)并接着记录质谱。
图11显示连续以DP IV和QC催化后，从[Gln3]Aβ1-11到[pGlu3]-Aβ3-11的形成。在所示的时间处将样品从试管中移除，与基质溶液混合(1∶1v/v)并接着记录质谱。
图12显示在具有催化活性的DP IV和QC存在下，QC抑制剂1，10-二氮杂菲对由[Gln3]Aβ1-11生成[pGlu3]Aβ3-11的抑制作用。在所示的时间处将样品从试管中移除，与基质溶液混合(1∶1v/v)并接着记录质谱。
图13显示在具有催化活性的DP IV和QC存在下，DP IV抑制剂Val-Pyrr对从[Gln3]Aβ1-11形成[pGlu3]Aβ3-11的还原作用。在所示的时间处将样品从试管中移除，与基质溶液混合(1∶1v/v)并接着记录质谱。
图14显示在连续经存在于猪垂体匀浆中的氨肽酶和QC催化后，由[Gln3]Aβ1-11到[pGlu3]Aβ肽3-11的形成。在所示的时间处将样品从试管中移除，与基质溶液混合(1∶1v/v)并接着记录质谱。
图15A和B显示与使用前煮沸10分钟的重组人QC一同温育的Aβ3-11a和Aβ3-21a的质谱图。C和D显示当存在导致分别形成[pGlu3]Aβ3-11a和[pGlu3]Aβ3-21a的活性人QC时Aβ3-11和Aβ3-21a的质谱图。E和F显示当存在活性QC及5mM抑制[pGlu3]形成的苯并咪唑时Aβ3-11a和Aβ3-21a的质谱图。
图16显示对底物浓度作图的木瓜QC催化的Glu-βNA-转化的反应速率。在0.1M焦磷酸盐缓冲液，pH 6.1(正方形)、0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.5(圆形)以及0.1M硼酸盐缓冲液，pH 8.5(三角形)中测定初始速率。动力学参数如下：KM＝1.13±0.07mM，kcat＝1.13±0.04min-1 (pH 6.1)；KM＝1.45±0.03mM，kcat＝0.92±0.01min-1(pH 7.5)；KM ＝1.76±0.06mM，kcat＝0.56±0.01min-1(pH 8.5)。
图17显示在一级速率定律条件(S＜＜KM)下确定的Gln-βNA(圆形)和Glu-βNA(正方形)转化的pH依赖性。底物浓度分别为0.01mM和0.25mM。两次测定均应用由0.05M乙酸、0.05M焦磷酸和0.05M三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)组成的三元缓冲系统。为避免离子强度不同，所有缓冲液均通过加入NaCl调节至相同的电导率。这些数据用双离解基团方程拟合，揭示Gln-βNA的pKa值为6.91±0.02和9.5±0.1，Glu-βNA的pKa值为4.6±0.1和7.55±0.02。通过滴定法确定各底物中氨基的pKa值为6.97±0.01(Gln-βNA)和7.57±0.05(Glu-βNA)。所有测定均在30℃下进行。
图18显示当存在咪唑、吡啶二羧酸且不含抑制性化合物时人QC催化的H-Gln-AMC环化的进程曲线。在吡啶二羧酸存在下曲线的双曲线形状表明金属离子从QC活性位点移除。
图19显示杂环螯合剂1，10-二氮杂菲对QC灭活的时间依赖性。在不含底物时将QC酶与抑制剂一同温育之后(连续曲线)，与未与抑制剂一同预温育的样品(点线)相比可观察到酶活性降低，这表明金属离子从QC活性位点移除。
图20表明单价和二价金属离子对人QC的再活化作用。通过加入含2mM吡啶二羧酸的50mM Bis-Tris溶液，pH 6.8灭活QC。随后，使该酶对包含1.0mM EDTA的50mM Bis-Tris，pH 6.8透析。通过将灭活的酶样品与0.5mM浓度的金属离子一同温育可实现酶的再活化，同时在0.5mM EDTA存在下以避免缓冲液中痕量金属离子引起的非特异性再活化。对照为：未灭活，但同样对EDTA溶液透析的酶样品作为灭活酶(+EDTA)以及对未加入EDTA的缓冲液透析的酶样品(-EDTA)。
图21人QC(hQC)和金属肽酶Clan MH的其它M28家族成员的序列对比。使用于ch.EMBnet.Org中的ClustalW以默认设置进行多重序列对比。在人QC(hQC；GenBank X71125)、源自灰色链霉菌(Streptomycesgriseus，SGAP；Swiss-Prot P80561)的锌依赖性氨肽酶、以及在人谷氨酸羧肽酶II(hGCP ll；Swiss-Prot Q04609)的N-乙酰化-α-连接的酸性二肽酶(NAALADase I)域(残基274-587)中发现锌离子连接残基的保守。涉及金属结合的氨基酸以粗体和下划线形式打出。就人QC而言，这些残基为肽酶的推断对应物(counterpart)。
肽序列
此处所述及使用的肽具有以下序列：
Aβ1-42：
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
Aβ1-40：
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
Aβ3-42：
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
Aβ3-40：
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
Aβ1-11a：
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2
Aβ3-11a：
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2
Aβ1-21a：
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH2
Aβ3-21a：
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH2
Gln3-Aβ3-40：
Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
Gln3-Aβ3-21a：
Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH2
Gln3-Aβ1-11a：
Asp-Ala-Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2
Gln3-Aβ3-11a：
Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2
具体实施方式
本发明提供谷氨酰胺酰基环化酶(QC)的效应物，其用于
a)治疗可通过调节体内QC活性治疗的哺乳动物疾病和/或
b)由QC活性调节引起的基于含pGlu的肽的作用的生理过程的调节。
此外，本发明提供抑制哺乳动物中谷氨酰胺酰基环化酶(QC，EC2.3.2.5)和/或QC样酶的化合物，以及QC活性抑制剂在治疗与QC活性相关的病理状况中的应用。
本发明还提供一种治疗阿尔茨海默症和唐氏综合征的新方法。沉积在阿尔茨海默症和唐氏综合征大脑中的淀粉样β-肽的N-端携带焦谷氨酸。由于修饰的淀粉样β-肽对β-淀粉样聚集及毒性呈现增强的趋势，很可能会恶化疾病的发作和进展，因此pGlu的生成在疾病的发展和进展中是一重要事件(Russo，C.等2002 J Neurochem 82，1480-1489)。
相反，在天然Aβ-肽(3-40/42)中，谷氨酸是作为N-末端氨基酸存在。到目前为止还未发现Glu到pGlu的酶促转化。此外，至今尚未观察到Glu肽到pGlu肽的自发性转化。因此，本发明一方面旨在确定QC在阿尔茨海默症和唐氏综合征中的作用。这一方面的研究包括合成在3位包含的氨基酸为谷氨酰胺而不是谷氨酸的Aβ3-11和Aβ1-11、这些修饰的淀粉样β-肽对QC、DP IV和DP IV样酶及氨肽酶的底物特征的确定、以及QC抑制剂在防止从淀粉样β-衍生肽1-11和3-11的N-末端谷氨酰胺酰基残基形成pGlu中的应用。所得结果见实施例8。所应用的方法记载于实施例3。
至今，没有迹象显示QC与疾病进展有关，因为在Aβ(3-40/42，或11-40/42)中谷氨酸为N-末端氨基酸。但是，QC是唯一已知的能在肽的N-末端形成pGlu的酶。本发明其它方面涉及以下结果和发现：
a)在副反应中，QC催化谷氨酸以极低速率转化为焦谷氨酸的环化反应，
b)APP或其后形成的淀粉样β-肽的谷氨酸通过未知的酶活性经翻译后加工转化为谷氨酰胺，并且在另一步骤中，QC在淀粉样β-肽N-末端加工后催化谷氨酰胺环化为焦谷氨酸，
c)谷氨酸通过化学催化或自身催化经翻译后加工转化为谷氨酰胺，随后QC在淀粉样β-肽N-末端加工后催化谷氨酰胺环化为焦谷氨酸，
d)编码淀粉样β蛋白的APP基因中发生突变，导致在3位Gln代替Glu。在翻译及N-末端加工后，QC催化谷氨酰胺环化为焦谷氨酸，
e)由于未知酶活性障碍，谷氨酰胺被并入到APP的初生肽链中，随后QC在淀粉样β-肽N-末端加工后催化谷氨酰胺N-末端环化为焦谷氨酸。
QC涉及上述所有五种情况下的关键步骤，即有利于淀粉样β-肽聚集的焦谷氨酸的形成。因此，与环化反应发生的机制无关，对QC的抑制会防止导致阿尔茨海默症和唐氏综合征发作和进展的斑块形成性Aβ3-40/41/43或Aβ11-40/41/43的沉积。
谷氨酸存在于淀粉样β-肽的3、11和22位。其中22位从谷氨酸(E)到谷氨酰胺(Q)的突变(对应于淀粉样前体蛋白APP 693，SwissprotP05067)被记载为所谓的Dutch型脑动脉淀粉样病变突变(Dutch typecerebroarterial amyloidosis mutation)。
在3、11和/或22位含焦谷氨酸残基的β-淀粉样肽被描述为比Aβ1-40/42/43更具细胞毒性和疏水性(Saido T.C.2000 MedicalHypotheses 54(3)：427-429)。
可通过不同位点的β-分泌酶β-位点淀粉样前体蛋白切割酶(BACE)(Huse J.T.等2002 J.Biol.Chem.277(18)：16278-16284)和/或通 过氨肽酶加工产生多种N-末端变异。在所有情况下，环化反应均可按照上述a)-e)发生。
迄今为止，没有实验证据支持对应于途径a)的未知谷氨酰环化酶(EC)催化的Glu1-肽向pGlu-肽的酶促转化(Garden，R.W.，Moroz，T.P，Gleeson，J.M.，Floyd，P.D.，Li，L.J.，Rubakhin，S.S.，和Sweedler，J.V.(1999)J Neurochem 72，676-681，Hosoda R.等，(1998)J Neuropathol ExpNeurol.57，1089-1095)。到目前还未鉴定出这种能环化Glu1-肽的酶活性，所述Glu1-肽经N-末端质子化并在温和的碱性pH条件下拥有荷负电的Glu1γ-羧基基团。
pH值低于7.0时对Gln1-底物的QC活性显著降低。相反，似乎Glu1 转化可在酸性反应条件下发生(Iwatsubo，T.，Saido，T.C.，Mann，D.M.，Lee，V.M.，和Trojanowski，J.Q.(1996)Am J Pathol 149，1823-1830；Russo，C.，Saido，T.C.，DeBusk，L.M.，Tabaton，M.，Gambetti，P.，和Teller，J.K.(1977)FEBS Lett 409，411-416；Russo，C.，Salis，S.，Dolcini，V.，Venezia，V.，Song，X.H.，Teller，J.K.，和Schettini，G.(2001)Neurobiol Dis8，173-180；Tekirian，T.L.，Saido，T.C.，Markesbery，W.R.，Russell，M.J.，Wekstein，D.R.，Patel，E.，和Geddes，J.W.(1998)J Neuropathol ExpNeurol.57，76-94；Russo，C.，Violani，E.，Salis，S.，Venezia，V.，Dolcini，V.，Damonte，G.，Benatti，U.，DArrigo，C.，Patrone，E.，Carlo，P.，和Schettini，G.(2002)J Neurochem 82，1480-1489；Hosoda，R.，Saido，T.C.，Otvos，L.，Jr.，Arai，T.，Mann，D.M.，Lee，V.M.，Trojanowski，J.Q.，和Iwatsubo，T.(1998)J Neuropathol Exp Neurol.57，1089-1095；Garden，R.W.，Moroz，T.P.，Gleeson，J.M.，Floyd，P.D.，Li，L.J.，Rubakhin，S.S.，和Sweedler，J.V.(1999)J Neurochem 72，676-681)。
按照本发明研究了QC能否在温和的酸性条件下识别并转化(turnover)淀粉样β衍生肽。因此，合成并研究了作为酶潜在底物的肽[Gln3]Aβ1-11a、Aβ3-11a、[Gln3]Aβ3-11a、Aβ3-21a、[Gln3]Aβ3-21a以 及[Gln3]Aβ3-40。选择这些序列以模仿可能因翻译后Glu酰胺化出现的天然的N-末端和C-末端截短的[Glu3]Aβ肽和[Gln3]Aβ肽。
在本发明中已发现木瓜和人QC既催化谷氨酰胺酰基环化也催化谷氨酰环化。显然，QC的主要生理功能是在激素分泌过程之前或期间通过谷氨酰胺环化反应完成内分泌细胞中的激素成熟。已知这种分泌小泡的pH值呈酸性。因而，在5.0到7.0的窄pH范围内所述酶的副活性可能是其新发现的也转化Glu-Aβ肽的谷氨酰基环化酶活性。然而，由于Glu-环化远远慢于Gln-转化，谷氨酰基环化是否起到重要的生理作用值得怀疑。但是，在神经退行性病变的病理学中，与谷氨酰基环化有关。
通过研究该酶促反应的pH依赖性，我们发现未质子化的N-末端对于Gln1肽的环化是必需的，并相应地发现底物的pKa值与QC催化的pKa 值一致(见图17)。因此，QC可稳定未质子化α-氨基基团对通过酰胺化亲电地活化的γ-羰基碳的分子内亲核进攻(路线1)。
与含N-末端谷氨酰胺的肽上存在的单价电荷相比，含Glu的肽的N-末端Glu残基在约中性pH条件下主要带二价电荷。谷氨酸γ-羧基和α-氨基基团的pKa值分别约为4.2和7.5。即，在中性及中性以上的pH条件下，尽管α-氨基氮部分或完全未质子化且具有亲核性，γ-羧基为未质子化并因此不能发挥羰基的亲电性。因此，不可能发生分子内环化反应。
然而，在它们各自的pKa值之间大约5.2-6.5的pH范围内，含N-末端Glu的肽总浓度的大约1-10％(-NH2)或10-1％(-COOH)浓度的两官能团均呈现非离子化形式。结果，在温和的酸性pH范围内，存在其所携两官能团均未带电荷的N-末端Glu-肽，从而QC可能稳定分子内环化为pGlu肽的中间体。即，如果γ-羧基被质子化，则羰基碳有足够的亲电性以允许未质子化的α-氨基进行亲核进攻。在该pH值时，羟基离子作为离去基团(路线3)。通过QC催化的Glu-βNA转化所获得的pH依赖性数据确证了这些假设(见实施例11)。与通过QC催化的Gln-βNA的谷氨酰胺转化相比，催化作用的最适pH值转移至pH约6.0的酸性 范围，即该pH范围内底物分子同时富含质子化的γ-羧基和未质子化的α-氨基。此外，动力学测定的pKa值7.55±0.02与通过滴定所测定的Glu-βNA的α-氨基的值(7.57±0.05)非常一致。
从生理学上讲，pH值6.0时QC催化的谷氨酸环化反应的二级速率常数(或专一性常数，Kcat/KM)可能在比谷氨酰胺环化反应的二级常数慢8,000倍的范围内(图17)。然而，两种模型底物Glu-βNA和Gln-βNA的非酶促转化可以忽略不计，这与本发明所观察到的pGlu肽的形成可忽略相吻合。因此，对于通过QC催化的pGlu生成，根据酶促与非酶促速率常数的比值可估计速率的增加至少为108(将酶催化反应的二级速率常数与相应的非酶促环化反应一级速率常数进行比较，Gln和Glu转化的催化能力因子(catalytic proficiency factor)分别为109-1010M-1)。从这些数据得出的结论是，体内很可能仅有一条酶促途径导致pGlu生成。
由于QC在脑内非常丰富，并且考虑到最近发现的30μM(Gln-)TRH样肽的突变的转化率高达0.9min-1(Prokai，L，Prokai-Tatrai，K.，Ouyang，X.，Kim，H.S.，Wu，W.M.，Zharikova，A.，和Bodor，N.(1999)J MedChem 42，4563-4571)，可以预言对于适当的谷氨酸底物，如果提供相似的反应条件，其环化反应半衰期大约为100小时。此外，考虑到分泌途径中脑部QC/EC的区室化和定位，实际上在体内酶和底物的浓度及反应条件可能更有利于完整细胞中的酶促环化作用。而且，如果N-末端Glu被转化为Gln，则可预期QC介导的更加迅速的pGlu形成。在体外，两种反应均受应用QC/EC活性抑制剂的抑制(图9、10和15)。
总而言之，本发明指出富含于大脑中的人QC很可能是从占存在于阿尔茨海默症中的斑块沉积的50％以上的由Glu-Aβ和Gln-Aβ前体生成淀粉样病变形成性(amyloidogenic)pGlu-Aβ肽的催化剂。这些发现确定QC/EC参与了老年斑的形成并因此可作为治疗阿尔茨海默症的新型药物靶标。
在本发明的第二个具体实施方案中，发现淀粉样β衍生肽是二肽基肽酶IV(DP IV)或DP IV样酶、优选为二肽基肽酶II(DP II)的底物。DP IV、DP II或其它DP IV样酶可从修饰的淀粉样β-肽(1-11)的N-末端释放二肽，生成以谷氨酰胺作为N-末端氨基酸残基的淀粉样β-肽(3-11)。结果如在实施例8中所示。
如在文献中所述，在被DP II、DP IV或其它DP IV样酶切割之前，天冬氨酸(淀粉样β-肽的残基1)和丙氨酸(淀粉样β-肽的残基2)之间的肽键可异构化产生异天冬氨酰残基(Kuo，Y.-M，Emmerling，M.R.，Woods，A.S.，Cotter，R.J.，Roher，A.E.(1997)BBRC 237，188-191；Shimizu，T.，Watanabe，A.，Ogawara，M.，Mori，H.和Shirasawa，T.(2000)Arch.Biochem.Biophys.381，225-234)。
这些异天冬氨酰残基造成淀粉样β-肽抵抗氨肽酶降解，从而使中心斑块包含大量异Asp1-淀粉样β-肽，表明N-末端转化减少。
然而，本发明首次证明了尤其在酸性条件下，N-末端二肽H-异Asp1-Ala2-OH可通过二肽基肽酶得以释放。此外，已发现异构化也可先于β-分泌酶切割，并且异构化可加速蛋白水解进程，从而导致随后经DPII、DP IV或DP IV样酶转化的异Asp1-淀粉样β-肽N-末端异天冬氨酰键的释放(Momand，J.和Clarke，S.(1987)Biochemistry 26，7798-7805；Kuo，Y.-M.，Emmerling，M.R.，Woods，A.S.，Cotter，R.J.，Roher，A.E.(1997)BBRC 237，188-191)。因此，抑制异天冬氨酰形成可降低被β-分泌酶的切割，其又减少淀粉样β-肽的形成。此外，通过抑制DP II、DP IV或DP IV样酶阻断异Asp1-淀粉样β-肽的转化可防止[Glu3]Aβ被QC/EC催化生成[pGlu3]Aβ。
在本发明的第三个具体实施方案中，DP IV活性抑制剂和QC抑制剂的组合可用于治疗阿尔茨海默症和唐氏综合征。
DP IV和/或DP IV样酶与QC的组合效应阐述如下：
a)DP IV和/或DP IV样酶切割Aβ1-40/42，释放出包含H-Asp-Ala-OH的二肽和Aβ3-40/42，
b)在副反应中，QC催化谷氨酸以极低速率环化为焦谷氨酸，
c)通过未知的酶活性经翻译后加工于N-末端将谷氨酸转化为谷氨酰胺，并且随后，QC在淀粉样β-肽N-末端的加工后催化谷氨酰胺环化为焦谷氨酸，
d)通过化学催化或自身催化经翻译后加工将谷氨酸转化为谷氨酰胺，并且在另一步骤中，QC在淀粉样β-肽N-末端加工后催化谷氨酰胺环化为焦谷氨酸，
e)编码淀粉样β蛋白的APP基因存在突变，导致Aβ的3位由Gln代替Glu。在翻译及N-末端加工后，QC催化谷氨酰胺环化为焦谷氨酸，
f)由于未知酶活性障碍，谷氨酰胺被并入APP初生肽链，且随后QC在淀粉样β-肽N-末端加工后催化谷氨酰胺N-末端环化为焦谷氨酸。
不同的肽酶活性也可触发使N-末端Gln暴露于QC活性。氨肽酶能依次将Asp和Ala从Aβ1-40/41/43的N-末端除去，从而暴露易于环化的氨基酸三。二肽基肽酶如DP I、DP II、DPIV、DP 8、DP 9以及DP 10可一步去除二肽Asp-Ala。因此，氨肽酶活性或二肽基肽酶活性的抑制可用于防止Aβ3-40/41/43的形成。
DP IV和/或DP IV样酶抑制剂以及QC下调效应物(loweringeffector)活性的组合效应阐述如下：
a)DP IV和/或DP IV样酶抑制剂抑制Aβ1-40/42转化为Aβ3-40/42。
b)从而防止谷氨酸N-末端的暴露并且无论是通过酶促催化还是化学催化都不可能转化为谷氨酰胺，从而导致焦谷氨酸的形成。
c)另外QC抑制剂可防止APP基因突变产生的残基修饰的Aβ3-40/42分子和那些修饰的Aβ3-40/42分子形成焦谷氨酸。
本发明中，类似的DP IV或DP IV样酶与QC的联合作用已用其他肽类激素如胰高血糖素，CC趋化因子以及P物质。
胰高血糖素是通过刺激糖原分解和糖原异生起维持正常血糖(euglycemia)作用的自胰岛α-细胞释放的29个氨基酸的多肽。尽管胰高血糖素很重要，但关于体内胰高血糖素的清除机制仍存在争议。Pospisilik等用灵敏的质谱技术评估了胰高血糖素的酶促代谢以确定分子产物。将胰高血糖素以纯化的猪二肽基肽酶IV(DP IV)温育可顺序生成胰高血糖素3-29和胰高血糖素5-29。在人血清中，胰高血糖素降解为胰高血糖素3-29之后迅速发生N-末端环化，从而防止DP IV介导的进一步水解。与纯化的DP IV或正常大鼠血清一起温育后对胰高血糖素的生物测定显示高血糖活性明显丧失，而在缺少DP IV的小鼠血清中进行类似的温育未显示胰高血糖素的生物活性有任何丧失。通过质谱和生物测定监测发现，降解反应被特异性DP IV抑制剂异亮氨酰噻唑烷阻断。这些结果确定DP IV是涉及胰高血糖素降解和失活的主要酶。这些发现为测定人血浆胰高血糖素水平提供了重要线索(Pospisilik等，Regul Pept2001 Jan 12；96(3)：133-41)。
人单核细胞趋化蛋白(MCP)-2最初从受激的骨肉瘤细胞中作为与MCP-1和MCP-3一同生成的趋化因子分离得到。Von Coillie等(VanCoillie，E.等，1998 Biochemistry 37，12672-12680)从人睾丸cDNA库中克隆了5′-端延长的MCP-2 cDNA。它编码76个残基MCP-2蛋白，但与已报道的源自骨髓的MCP-2 cDNA序列的密码子46不同，其编码Lys而非Gln。这一由单核苷多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)引起的MCP-2Lys46变异体(variant)在生物学上与MCP-2Gln46相当。编码区被亚克隆到细菌表达载体pHEN1上，并且在大肠杆菌转化后，将这两个MCP-2蛋白变异体从周质中回收。Edman降解显示NH2端为Gln残基而不是pGlu。在钙动员和趋化试验中于单核细胞上检测rMCP-2Gln46和rMCP-2Lys46以及NH2-端的环状对应物。在rMCP-2Gln46和rMCP-2Lys46同工型之间未观察到任何生物活性的显著差别。然而，对于这两种MCP-2变异体，NH2-末端的焦谷氨酸是趋化性 而非钙动员所必需的。通过丝氨酸蛋白酶CD26/二肽基肽酶IV(CD26/DPP IV)NH2-端截短rMCP-2Lys46导致NH2-端Gln-Pro二肽的释放，而含氨基端pGlu的合成MCP-2未受影响。CD26/DPP IV剪除的rMCP-2Lys46(3-76)在趋化性试验和信号传导试验(signaling assay)中几乎完全没有活性。这些观察结果表明MCP-2中NH2-端pGlu对趋化活性是必需的，并且它还保护该蛋白不受CD26/DPP IV的降解(vanCollie，E..等Biochemistry 1998，37，12672-80)。
本发明中，通过LC/MS分析确定，在胰高血糖素3-29(Pospisilik等，2001)和MCP-2同工型(van Coillie等，1998)中测定的N-末端焦谷氨酰胺残基的形成是由QC催化的。
此外，通过LC/MS研究证明，在将两个二肽Lys-Pro和Arg-Pr从P物质经N-末端DP IV催化除去后剩余的[Gln5]物质P5-11被QC转化为[pGlu5]物质P5-11。
DP IV抑制剂在WO 99/61431中已公开。具体而言，已公开DP IV抑制剂包含氨基酸残基和噻唑烷或吡咯烷基及其盐，尤其是L-苏-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-苏-异亮氨酰吡咯烷、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰吡咯烷及其盐。
低分子量的二肽基肽酶IV抑制剂的更多实例为下列物质，如四氢异喹啉-3-甲酰胺衍生物、N-取代的2-氰基吡咯及2-氰基-吡咯烷、N-(N′-取代的甘氨酰基)-2-氰基吡咯烷、N-(取代的甘氨酰基)噻唑烷、N-(取代的甘氨酰基)-4-氰基噻唑烷、氨基-酰基-二羟硼基-脯氨酰-抑制剂、环丙基稠合的吡咯烷以及杂环化合物。二肽基肽酶IV抑制剂记载于US6,380,398；US 6,011,155；US 6,107,317；US 6,110,949；US 6,124,305；US 6,172,081；WO 95/15309、WO 99/61431、WO 99/67278、WO 99/67279、DE 198 34 591、WO 97/40832、DE 196 16 486 C 2、WO 98/19998、WO00/07617、WO 99/38501、WO 99/46272、WO 99/38501、WO 01/68603、WO 01/40180、WO 01/81337、WO 01/81304、WO 01/55105、WO 02/02560 和WO 02/14271、WO 02/04610、WO 02/051836、WO 02/068420、WO02/076450；WO 02/083128、WO 02/38541、WO 03/000180、WO 03/000181、WO 03/000250、WO 03/002530、WO 03/002531、WO 03/002553、WO03/002593、WO 03/004496、WO 03/024942和WO 03/024965、其尤其是涉及这些抑制剂、其定义、用途及其产品的教导全文并入此处作为参考。
优选与QC效应物联合使用的为DPIV抑制剂如Hughes等在1999Biochemistry 38 11597-11603所公开的NVP-DPP728A(1-[[[2-[{5-氰基吡啶-2-基}氨基]乙基]氨基]乙酰基]-2-氰基-(S)-吡咯烷)(Novartis)；Hughes等在Meeting of the American Diabetes Association 2002，Abstract no.272(Novartis)所公开的LAF-237(1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-腈)；Yamada等在1998 Bioorg Med Chem Lett 8，1537-1540所公开的TSL-225(色氨酰基-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)；Asworth等在1996 Bioorg Med Chem Lett 6，1163-1166及2745-2748所公开的2-氰基吡咯烷酰胺和4-氰基吡咯烷酰胺；Sudre等在2002 Diabetes 51，1461-1469(Ferring)所公开的FE-999011以及在WO 01/34594(Guilford)中所公开的化合物，并且所用剂量如以上参考文献中所述。
用于与QC效应物联合使用的更优选的DPIV抑制剂为二肽化合物，其中氨基酸优选为选自天然氨基酸如亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸。根据本发明使用的二肽样化合物当浓度(二肽化合物的浓度)为10μM时，血浆二肽基肽酶IV或DPIV样酶的活性下降至少10％，尤其为至少40％。通常也期望体内活性下降至少60％或至少70％。优选的化合物也可表现为活性最多下降20％或30％。
优选的二肽化合物为：N-缬氨酰-脯氨酰、O-苯甲酰羟胺、丙氨酰吡咯烷、异亮氨酰噻唑烷样L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-苏-异亮氨酰吡咯烷及其盐，尤其是反丁烯二酸盐和L-别-异亮氨酰吡咯烷及其盐。特别优选的化合物为：谷氨酰胺酰基吡咯烷和谷氨酰胺酰基噻唑烷、H-Asn-吡咯烷、H-Asn-噻唑烷、H-Asp-吡咯烷、H-Asp-噻唑烷、H-Asp(NHOH)-吡咯烷、H-Asp(NHOH)-噻唑烷、H-Glu-吡咯烷、H-Glu-噻唑烷、H-Glu(NHOH)-吡咯烷、H-Glu(NHOH)-噻唑烷、H-His-吡咯烷、H-His-噻唑烷、H-Pro-吡咯烷、H-Pro-噻唑烷、H-Ile-azididine、H-Ile-吡咯烷、H-L-别-Ile-噻唑烷、H-Val-吡咯烷和H-Val-噻唑烷，及其药物学可接受的盐。这些化合物记载于WO 99/61431及EP 1 304 327中。
此外，本发明提供QC效应物与底物样(substrate-like)肽类化合物联合在竞争性调节二肽基肽酶IV催化中的应用。优选的肽类化合物为：2-氨基辛酸-Pro-Ile、Abu-Pro-Ile、Aib-Pro-Ile、Aze-Pro-Ile、Cha-Pro-Ile、Ile-Hyp-Ile、Ile-Pro-别-Ile、Ile-Pro-叔丁基-Gly、Ile-Pro-Val、Nle-Pro-Ile、Nva-Pro-Ile、Orn-Pro-Ile、Phe-Pro-Ile、Phg-Pro-Ile、Pip-Pro-Ile、Ser(Bzl)-Pro-Ile、Ser(P)-Pro-Ile、Ser-Pro-Ile、叔丁基-Gly-Pro-D-Val、叔丁基-Gly-Pro-Gly、叔丁基-Gly-Pro-Ile、叔丁基-Gly-Pro-Ile-酰胺、叔丁基-Gly-Pro-叔丁基-Gly、叔丁基-Gly-Pro-Val、Thr-Pro-Ile、Tic-Pro-Ile、Trp-Pro-Ile、Tyr(P)-Pro-Ile、Tyr-Pro-别-Ile、Val-Pro-别-Ile、Val-Pro-叔丁基-Gly、Val-Pro-Val及其药物学可接受的盐，其中叔丁基-Gly定义为：
而Ser(Bzl)和Ser(P)分别定义为苄基丝氨酸和磷酰基丝氨酸。Tyr(P)定义为磷酰基酪氨酸。这些化合物公开于WO 03/002593中。
根据本发明可与QC效应物联合使用的其他优选的DPIV抑制剂为肽基酮，例如：
2-甲基羰基-1-N-[(L)-丙氨酰-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，2-甲基羰基-1-N-[(L)-缬氨酰-(L)-丙氨酰-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，
2-[(乙酰基-氧-甲基)羰基]-1-N-[(L)-丙氨酰-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，
2-[(苯甲酰-氧-甲基)羰基]-1-N-[{(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，
2-{[(2，6-二氯苄基)硫甲基]羰基}-1-N-[{(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷，
2-[(苯甲酰-氧-甲基)羰基]-1-N-[甘氨酰-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，
2-[([1，3]-噻唑噻唑-2-基)羰基]-1-N-[{(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸盐，
2-[(苯并噻唑噻唑-2-基)羰基]-1-N-[N-{(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸盐，
2-[(苯并噻唑噻唑-2-基)羰基]-1-N-[{(L)-丙氨酰}-甘氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸盐，
2-[(吡啶-2-基)羰基]-1-N-[N-{(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸盐
以及它们的其它药物学可接受的盐。这些化合物于WO 03/033524中已公开。
此外，根据本发明取代的氨基酮可与QC效应物联合使用。优选的取代的氨基酮为：
1-环戊基-3-甲基-1-氧代-2-戊烷氯化铵，
1-环戊基-3-甲基-1-氧代-2-丁烷氯化铵，
1-环戊基-3，3-二甲基-1-氧代-2-丁烷氯化铵，
1-环己基-3，3-二甲基-1-氧代-2-丁烷氯化铵，
3-(环戊基羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉氯化物，
N-(2-环戊基-2-氧乙基)环己烷氯化铵
以及它们的其它药物学可接受的盐。
在罕见的脯氨酸特异性蛋白酶中，DP IV最初被认为是唯一的作为多肽链氨基末端倒数第二个残基的脯氨酸特异性膜结合酶。然而，其它分子，甚至是那些结构与DP IV非同源但有相应活性的分子也已确定。迄今所确定的DP IV样酶包括如Sedo和Malik(Sedo和Malik 2001，Biochim Biophys Acta，36506，1-10)及Abbott和Gorrell(Abbott，C.A.和Gorrell，M.D.2002 In：Langner & Ansorge(ed.)，Ectopeptidases.KluwerAcademic/Plenum Publishers，New York，171-195)在综述文章中所记载的成纤维细胞激活蛋白α、二肽基肽酶IV β、二肽基氨肽酶样蛋白、N-乙酰化的α-连接的酸性二肽酶、休眠细胞脯氨酸二肽酶、二肽基肽酶II、吸引素(attractin)和二肽基肽酶IV相关蛋白(DPP 8)、DPLl(DPX，DP6)、DPL2以及DPP 9。最近报道了二肽基肽酶10(DPP 10)的克隆及特性(Qi，S.Y.等，Biochemical Journal Immediate Publication.Published on 28 Mar 2003 as manuscript BJ20021914)。
此处所用的术语效应物定义为与酶结合并提高或降低其体外和/或体内活性的分子。某些酶具有影响其催化活性的小分子的结合位点；刺激分子(stimulator molecule)被称为激活剂。酶甚至具有识别多于一种激活剂或抑制剂的多个结合位点。酶可探测(detect)多种分子的浓度并利用该信息改变其自身活性。
由于酶既可呈现活性构象也可呈现非活性构象，因此效应物可以调节酶活性：激活剂是正效应物，抑制剂是负效应物。效应物不仅在酶的活性位点起作用，而且还在调节位点或变构位点起作用，这些术语是用于强调调节位点是不同于催化位点的酶的要素，并用于区分这种调节形式与催化位点的底物和抑制剂间的竞争(Darnell，J.，Lodish，H.和Baltimore，D.1990，Molecular Cell Biology 2nd Edition，Scientific AmericanBooks，New York，63页)。
根据以下常规列表，本发明肽中的每个氨基酸残基都用对应于该氨基酸俗名的一个字母或三个字母名称来表示：
此处所用的术语“QC”包括谷氨酰胺酰基环化酶(QC)和QC样酶。QC和QC样酶具有相同或相似的酶活性，进一步定义为QC活性。在这一方面，QC样酶在分子结构上可根本不同于QC。
此处所用的术语“QC活性”定义为N-末端谷氨酰胺残基转化为焦谷氨酸(pGlu*)或N-末端L-高谷氨酰胺或L-β-高谷氨酰胺转化为环状焦-高-谷氨酰胺衍生物，同时释放出氨的的分子内环化作用。参见路线1和2。
路线1：QC对谷氨酰胺的环化
路线2：QC对L-高谷氨酰胺的环化
此处所用术语“EC”包括QC和QC样酶如谷氨酸环化酶(EC)的副活性，进一步定义为EC活性。
此处所用术语“EC活性”定义为N-末端谷氨酸残基被QC转化为焦谷氨酸(pGlu*)的分子内环化作用。参见路线3。
此处所用术语“金属依赖性酶”定义为需结合的金属离子以实现其催化功能和/或需结合的金属离子以形成催化活性结构的酶。
与酶结合并提高或降低其活性的分子被称为“效应物”。由于酶既可呈活性构象又可呈非活性构象，因此效应物可改变酶活性：激活剂是正效应物，抑制剂是负效应物。效应物在调节位点或变构位点(来自希腊语“另一种形状”)结合，这一术语是用于强调调节位点是不同于催化位点的酶的要素，并用于区分这种调节形式与催化位点的底物和抑制剂间的竞争。根据本发明的个别具体实施方案，优选为激活剂或抑制剂。
路线3：QC(EC)对不带电荷的谷氨酰肽的N-末端环化
Figure G04812386219960424D000281
本发明另一方面是鉴定新的QC生理底物。如实施例5所述，通过以哺乳动物肽进行的环化实验鉴定它们。如实施例1所述，之前已分离得到人QC和木瓜QC。所应用的方法如实施例2中所述，而所应用的肽合成如实施例6中所概述。研究结果见表1。
表1：谷氨酰胺酰基环化酶的新生理底物(*，通过MALDI-TOF实验定性地测定)
如实施例4所示，所有试验均在人或植物QC活性和稳定性的最佳范围内进行。
具有N-末端谷氨酰胺残基并因此为QC酶底物的生理学活性的肽的氨基酸序列列于表2：
表2：具有N-末端谷氨酰胺残基的生理学活性的肽的氨基酸序列
  肽  氨基酸序列   功能   胃泌素17  Swiss-Prot：  P01350 QGPWL EEEEEAYGWM DF(酰胺)   胃泌素刺激胃粘膜产生并分泌盐酸并刺激  胰腺分泌消化酶。胃泌素还刺激平滑肌收缩  和增加血液循环及胃肠道分泌水分。   神经降压肽  Swiss-Prot：  P30990 QLYENKPRRP YIL   神经降压肽在调节脂肪代谢中起内分泌或  旁分泌的作用。它引起平滑肌收缩。   FPP  QEP酰胺   在精液浆中发现的与促甲状腺素释放激素  (TRH)有关的三肽。最近获得的体外和体  内证据表明FPP在调节精子生育能力方面  起重要作用。   TRH  Swiss-Prot：  P20396  QHP酰胺   TRH在前脑垂体腺中起着TSH生物合成的  调节剂的功能，并在中枢和外周神经系统中  起着神经递质/神经调质的功能。   GnRH  Swiss-Prot：  P01148  QHWSYGL RP(G) 酰胺   刺激促性腺激素分泌；刺激黄体化  (luteinizing)及促卵泡激素的分泌。   CCL16(小的  可诱导细胞  因子A16)  Swiss-Prot：  O15467 QPKVPEW VNTPSTCCLK YYEKVLPRRL YYGYRKALNC HLPAIIFVTK RNREVCTNPN DDWVQEYIKD PNLPLLPTRN LSTVKIITAK NGQPQLLNSQ  对淋巴细胞和单核细胞但不对嗜中性粒细  胞表现趋化活性。也表现强效的骨髓抑制  (myelosuppressive)活性，抑制髓祖细胞增  殖。重组SCYA16对单核细胞和THP-1单  核细胞但不对静息淋巴细胞和嗜中性粒细  胞表现趋化活性。诱导经预先表达RANTES  脱敏的THP-1细胞的钙流。   CCL8(小的  可诱导的细  胞因子A8)  Swiss-Prot：  P80075 QPDSVSI PITCCFNVIN RKIPIQRLES YTRITNIQCP KEAVIFKTKR GKEVCADPKE RWVRDSMKHL DQIFQNLKP  吸引单核细胞、淋巴细胞、嗜碱细胞和嗜曙  红细胞的趋化因子。可能在瘤形成和炎症宿  主应答中起作用。该蛋白可结合肝素  (heparin)。   CCL2(小的  可诱导细胞  因子A2)  Swiss-Prot：  P13500 QPDAINA PVTCCYNFTN RKISVQRLAS YRRITSSKCP KEAVIFKTIV AKEICADPKQ KWVQDSMDHL DKQTQTPKT  吸引单核细胞和嗜碱细胞但不吸引嗜中性  粒细胞或嗜曙红细胞的趋化因子。增强单核  细胞的抗肿瘤活性。有涉及在以单核细胞渗  透为特征的疾病如银屑病、类风湿性关节炎  或动脉粥样硬化症的发病机理的迹象。可能  涉及动脉粥样硬化症期间将单核细胞募集  到动脉壁上。与CCR2及CCR4结合。   CCL18  (可诱导的  小细胞因子  A18)  Swiss-Prot：  P55774  QVGTNKELC CLVYTSWQIP QKFIVDYSET SPQCPKPGVI LLTKRGRQIC ADPNKKWVQK YISDLKLNA  吸引淋巴细胞但不吸引嗜单核细胞或粒细  胞的趋化因子。可能涉及B细胞迁移进入淋  巴结中的B细胞小囊内。吸引幼T淋巴细  胞至淋巴结中的树枝状细胞及活化的巨噬  细胞，对幼T细胞、CD4+和CD8+T细胞  有趋化活性并因此可能在体液和细胞介导
    的免疫应答中起作用。   分形素  (神经趋化  素，  neurotactin)  Swiss-Prot：  P78423   QHHGVT KCNITCSKMT  SKIPVALLIH YQQNQASCGK  RAIILETRQH RLFCADPKEQ  WVKDAMQHLD RQAAALTRNG  GTFEKQIGEV KPRTTPAAGG  MDESYYLEPE ATGESSSLEP  TPSSQEAQRA LGTSPELPTG  VTGSSGTRLP PTPKAQDGGP  VGTELFRVPP VSTAATWQSS  APHQPGPSLW AEAKTSEAPS  TQDPSTQAST ASSPAPEENA  PSEGQRVWGQ GQSPRPENSL  EREEMGPVPA HTDAFQDWGP  GSMAHVSVVP SSEGTPSRE  PVASGSWTPK AEEPIHATMD  PQRLGVLITP VPDAQAATRR  QAVGLLAFLG LLFCLGVAMF  TYQSLQGCPR KMAGEMAEGL  RYIPRSCGSN SYVLVPV  可溶形式对T细胞和单核细胞但不对嗜中  性粒细胞有趋化性。膜结合形式促进白细胞  粘附于内皮细胞。可能在调节白细胞粘附于  内皮和迁移过程中起作用。与cx3cr1结合。   CCL7(小的可  诱导的细胞  因子A7)  Swiss-Prot：  P80098  QPVGINT STTCCYRFIN  KKIPKQRLES YRRTTSSHCP  REAVIFKTKL DKEICADPTQ  KWVQDFMKHL DKKTQTPKL  吸引单核细胞和嗜曙红细胞但不吸引嗜中  性粒细胞的趋化因子。增强单核细胞的抗肿  瘤活性。也促进白明胶酶B的释放。该蛋白  可键合肝磷脂。键合于CCR1、CCR2以及  CCR3。   胖素A(下丘  泌素-1)  Swiss-Prot：  043612  QPLPDCCRQK TCSCRLYELL  HGAGNHAAGILTL  可能通过协调这些互补的平衡功能的复杂  行为和生理应答而在调节食物摄取和失眠  中起到显著作用的神经肽。它在能量代谢、  自主功能、激素平衡以及体液调节的平衡调  节方面还起到更广泛的作用。胖素-A以高  亲合力与OX1R及OX2R结合。   P物质   RPK PQQFFGLM   属于速激肽。速激肽是兴奋神经元、唤醒行  为应答的活性肽，是强效的血管扩张剂和促  分泌素，并且可以收缩(直接或间接)很多  平滑肌。
在第四个具体实施方案中，肽[Gln1]胃泌素(17和34个氨基酸长度)、[Gln1]神经降压肽以及[Gln1]FPP被确定为新的QC生理底物。胃泌素、神经降压肽以及FPP在它们的N-末端位置均含pGlu残基。对所有的肽来说，经发现该N-末端pGlu残基是通过QC催化由N-末端谷氨酰胺生成。结果，将N-末端谷氨酰胺残基转化为pGlu时，这些肽的生物学功能就被激活。
跨上皮信号传导细胞(transepithelial transducing cell)，尤其是胃泌素(G)细胞在食物进入胃后共同调节胃酸的分泌。最近的研究表明胃泌素前体产生多种活性产物，并且胃泌素的生物合成中有多个控制点。生物合成的前体和中间体(前胃泌素和Gly-胃泌素)是推断的生长因子；其产物，酰胺化的胃泌素调节上皮细胞增殖、产酸性(acid-producing)壁细胞和分泌组胺的肠嗜铬细胞样(ECL)细胞的分化、以及与ECL细胞内的组胺合成及贮存有关的基因表达，以及剧烈刺激酸分泌。胃泌素还刺激表皮生长因子(EGF)家族成员的生成，其又抑制壁细胞功能而刺激表面表皮细胞的生长。血浆胃泌素浓度在具有幽门螺杆菌的患者中升高，已知这些患者有较高的患十二指肠溃疡和胃癌的风险(Dockray，G.J.1999 J Physiol 15 315-324)。
已知由胃窦G细胞释放的肽激素胃泌素可以通过CCK-2受体刺激自泌酸粘膜中ECL细胞合成并释放组胺。经动员的组胺通过结合位于壁细胞上的H(2)受体诱导酸分泌。最近的研究表明，胃泌素无论是完全酰胺化形式还是加工较少的形式(前胃泌素和甘氨酸延长的胃泌素)，都是胃肠道的生长因子。已经确定酰胺化的胃泌素的主要营养作用是针对胃泌酸粘膜，其中胃泌素引起胃干细胞和ECL细胞的增殖提高，结果导致壁细胞和ECL细胞质量增加。另一方面，加工较少的胃泌素(例如，甘氨酸延长的胃泌素)的主要营养靶标似乎是结肠粘膜(Koh，T.J.和Chen，D.2000 Regul Pept 9337-44)。
在第五个具体实施方案中，本发明提供活性增强的QC效应物在刺激胃肠道细胞尤其是胃粘膜细胞及上皮细胞增殖、生酸壁细胞和分泌组胺的肠嗜铬细胞样(ECL)细胞的分化、与ECL细胞内组胺合成及贮存 有关的基因表达、以及在通过维持或提高活性[pGlu1]胃泌素的浓度刺激哺乳动物剧烈分泌酸中的应用。
在第六个具体实施方案中，本发明提供活性减弱的QC效应物在通过降低无活性的[Gln1]胃泌素向活性[pGlu1]胃泌素的转化率治疗哺乳动物中伴随或不伴随幽门螺杆菌的十二指肠溃疡和胃癌中的应用。
神经降压肽(NT)是与精神分裂症病理生理学相关的神经肽，它能特异性调节以前已证明在该病症中被误调整的神经递质系统。其中测定脑脊液(CSF)NT浓度的临床研究表明CSF NT浓度降低的一亚类精神分裂症患者通过有效的抗精神病药物治疗得以恢复。同样存在大量证据表明在抗精神病药物作用机制中涉及NT系统。中枢给药NT与全身给药抗精神病药物在行为和生物化学效应上非常相似，并且抗精神病药物可提高NT神经传递。这一连串的发现使得可假设NT起着内源性抗精神病药物的作用。此外，典型和非典型的抗精神病药物能区别地改变黑质纹状区和中脑缘多巴胺末端区域中的NT神经传递，并且这些作用分别是副反应倾向及效力的先兆(Binder，E.B.等，2001 Biol Psychiatry 50856-872)。
在第七个具体实施方案中，本发明提供QC的活性增强效应物在制备抗精神病药物和/或在治疗哺乳动物的精神分裂症中的应用。QC效应物维持或提高活性[pGlu1]神经降压肽的浓度。
在精液浆中发现了一种与促甲状腺素释放激素(TRH)相关的三肽，受精促进肽(FPP)。最近获得的体外和体内的证据表明FPP在调节精子生育力方面发挥重要作用。具体而言，FPP最初刺激无剩余力的(无能力的)精子“接通(switch on)”，使之更快地具有生育力，但之后获得能育力致使精子不会自发产生顶体损失并因此不会失去受精能力。通过已知能调节腺苷酰基环化酶(AC)/cAMP信号转导途径的腺苷可以模拟甚至事实上放大这些应答。已发现FPP和腺苷两者都能刺激无生育力的细胞中cAMP的生成但在有生育力的细胞中抑制其生成，而FPP受体可以某种方式与腺苷受体和G蛋白相互作用以实现对AC的调控。这些事件能影响各种蛋白的酪氨酸磷酸化状况，其中某些在最初的“接通”中很重要，另一些可能与顶体反应本身有关。在精液浆中还发现了降钙素和血管紧张素II，它们在体外对无生育能力的精子有相似的作用，并且可以放大对FPP的应答。这些分子在体内具有类似的作用，通过刺激然后维持生育能力从而影响生育力。是FPP、腺苷、降钙素以及血管紧张素II的可用性降低或其受体的缺陷促成了男性不育症(Fraser，L.R.和Adeoya-Osiguwa，S.A.2001 Vitam Horm 63，1-28)。
在第八个具体实施方案中，本发明提供QC的活性降低效应物在制备避孕药物和/或在降低哺乳动物的生育力中的应用。QC的活性降低效应物可降低活性[pGlu1]FPP的浓度，抑制精子的能育力以及导致精细胞失活。相反，已发现QC的活性增强效应物能刺激男性生育力并治疗不育症。
在第九个具体实施方案中，本发明中鉴定了更多的QC生理底物。它们是[Gln1]CCL2、[Gln1]CCL7、[Gln1]CCL8、[Gln1]CCL16、[Gln1]CCL18以及[Gln1]分形素。具体参见表2。这些多肽在诸如髓祖细胞的增殖、瘤形成、炎性宿主应答、癌症、银屑病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化症、体液及细胞介导的免疫应答、内皮中白细胞的粘附及迁移过程等病理生理状态中发挥重要作用。
最近的临床试验研究了几种抗肝炎B、人免疫缺陷病毒和黑素瘤的细胞毒性T淋巴细胞肽基疫苗。令人感兴趣的一种可单独使用或与其它肿瘤抗原联合使用的黑素瘤候选疫苗为十肽ELA。该肽是具有N-末端谷氨酸的Melan-A/MART-1抗原免疫显性肽类似物。已报道谷氨酸的氨基和γ-羧基以及谷氨酰胺的氨基和γ-羧酰胺基团很容易缩合生成焦谷氨酸衍生物。为克服这一稳定性问题，已开发若干用焦谷氨酸代替N-末端谷 氨酰胺或谷氨酸而不损失药理学性质的有药物学意义的多肽。不幸的是与ELA相比，焦谷氨酸衍生物(PyrELA)及N-末端乙酰化封端的衍生物(AcELA)不能引发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。尽管在PyrELA和AcELA引入貌似很小的修饰，但这两种衍生物很可能对特定的I类(specific class I)主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex)比ELA具有更低的亲和力。因此，为保存完整的ELA活性，必须避免生成PyrELA(Beck A.等2001，J Pept Res 57(6)：528-38)。最近已发现谷氨酰胺酰基环化酶(QC)在黑素瘤中也过度表达(Ross D.T等，2000，Nat Genet 24：227-35)。
在第十个具体实施方案中，本发明提供QC效应物在制备用于治疗病理生理状态如髓祖细胞增殖抑制、瘤形成、炎性宿主应答、癌症、恶性转移(malign metastasis)、黑素瘤、银屑病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化症、体液和细胞介导的免疫应答障碍、内皮中白细胞的粘附及迁移过程的药物中的应用。
在第十一个具体实施方案中，本发明确定[Gln1]胖素A为QC的生理底物。胖素A是一种可能通过协调这些互补的平衡功能(complementaryhomeostatic function)的复杂行为及生理反应而在调节食物摄取和睡眠觉醒中起重要作用的神经肽。它还在能量代谢、自主功能、激素平衡和体液调节等平衡调节中起作用。
在第十二个具体实施方案中，本发明提供QC效应物在制备用于治疗食物摄取障碍及睡眠觉醒障碍、能量代谢平衡调节障碍、自主功能障碍、激素平衡障碍和体液调节障碍的药物中的应用。
若干蛋白中的多聚谷氨酰胺的扩展导致神经退行性疾病，如帕金森氏症和肯尼迪症。其机制在很大程度上仍然未知。多聚谷氨酰胺复制的生化性质提出一种可能的解释：焦谷氨酸形成之前谷氨酰胺酰基-谷氨酰胺酰基键的内分解断裂可能通过增加多聚谷氨酰胺酰基蛋白的分解代谢稳定性、疏水性、淀粉样变性生成(amyloidogenicity)和神经毒性从而有助于发病机制的形成(Saido，T；Med Hypotheses(2000)Mar，54(3)：427-9)。因此在第十三个具体实施方案中，本发明提供QC效应物在制备治疗帕金森氏症和亨廷顿舞蹈症(Huntingon’s disease)的药物中的应用。
在第十四个具体实施方案中，本发明提供一种降低或抑制QC酶活性的一般方法。还提供抑制性化合物的实例。
哺乳动物QC的抑制作用最初仅在1，10-二氮杂菲和还原的6-甲基蝶呤中检测到(Busby，W.H.J.等，1987 J Biol Chem 262，8532-8536)。EDTA并不抑制QC，从而推断QC不是金属依赖性酶(Busby，W.H.J.等，1987 J Biol Chem 262，8532-8536，Bateman，R.C.J.等，2001Biochemistry 40，11246-11250，Booth，R.E.等，2004 BMC Biology 2)。然而，正如通过1，10-二氮杂菲、吡啶二羧酸、8-羟基喹啉及其它螯合剂(图18，19)对QC的抑制特性以及通过过渡金属离子(图20)使QC再活化所揭示，本发明发现人QC和其它动物的QC为金属依赖性酶。最后，通过与其它金属依赖性酶的序列比较展示出金属依赖性，表明人QC中也保存有螯合氨基酸残基(图21)。化合物与活性位点结合金属离子的相互作用代表降低或抑制QC活性的一般方法。
本发明发现咪唑衍生物为强效的QC抑制剂。通过连续试验(详情见实施例2)分析了许多咪唑衍生物抑制作为高度保守的哺乳动物QC的一员的人QC的能力。
因此，本发明提供咪唑衍生物和组氨酸及其衍生物作为QC的活性降低效应物以及它们在抑制类型和效力方面的特征。其结构及Ki值见表3和4。结果详细记载于实施例7中。
表3：人QC催化的反应中咪唑衍生物的抑制常数。在30℃、pH 8.0、含5mM EDTA的0.05M Tris-HCl中进行测定。
Figure G04812386219960424D000361
其它
Figure DEST_PATH_G04812386220061009D000081
表4：L-组胺及其两生物活性代谢物(也称为tele-甲基组胺)对QC的抑制作用。
出人意料的是，在酶活性表征期间发现除N-末端谷氨酰胺酰基残基外，N-末端β-高-谷氨酰胺酰基残基也具有作为植物和动物QC底物的性质。该N-末端-高-谷氨酰胺酰基残基分别被人和木瓜QC催化转化为五元内酰胺环。结果记载于实施例5中。所应用的方法在实施例2中阐明而肽的合成按实施例6所述进行。
本发明另一优选的具体实施方案包括QC效应物的筛选方法。
从一组化合物中鉴别QC的活性修饰效应物的优选筛选方法包括以下步骤：
a)在允许它们相结合的条件下使QC接触所述化合物；
b)加入QC底物；
c)监测底物转化或任选地测定残余的QC活性；以及
d)计算底物转化率和/或QC酶活性的变化以鉴定活性修饰效应物。
另一优选的筛选方法涉及一种鉴定及选择直接或间接与QC活性位点结合的金属离子相互作用的效应物的方法，其包括以下步骤：
a)在允许它们相结合的条件下使QC接触所述化合物；
b)加入可被QC转化的QC底物；
c)监测底物转化或任选地测定残余的QC活性；以及
d)计算底物转化率和/或QC酶活性的变化，其中所述变化可用于鉴定QC的活性修饰效应物。
哺乳动物QC或木瓜QC优选用于上述的筛选方法中。由于这些筛选方法所鉴定的效应物将用于治疗哺乳动物尤其是人的疾病，所以哺乳动物QC尤其优选。
上述筛选方法所选择的药物可通过降低至少一种QC底物的转化(负效应物，抑制剂)，或通过提高至少一种QC底物的转化(正效应物，激活剂)而起作用。
本发明的化合物可被转化为酸加成盐，尤其是药物学可接受的酸加成盐。
本发明化合物的盐可采用无机盐或有机盐的形式。
本发明化合物可被转化为及用作酸加成盐，尤其是药物学可接受的酸加成盐。药物学可接受的酸加成盐一般为其中将碱性侧链以无机酸或有机酸质子化的形式。代表性的有机酸或无机酸包括盐酸、氢溴酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、苦杏仁酸、甲磺酸、羟乙基磺酸、苯磺酸、草酸、哌酸(pamoic acid)、2-萘磺酸、对-甲苯磺酸、环己磺酸、水杨酸、糖精酸或三氟乙酸。本发明化合物的所有药物学可接受的酸加成盐形式均已包含在本发明的范围内。
鉴于游离化合物及其盐形式化合物间的紧密联系，只要是本文所涉及的化合物，若在这种情况下可能或适宜，其相应的盐也同样涵盖在内。
如果本发明的化合物具有至少一个手性中心，它们就可以对映异构体的形式存在。如果化合物具有两个或更多个手性中心，则它们可能额外以非对映异构体形式存在。应理解所有这种异构体及其混合物均涵盖在本发明的范围内。此外，化合物的某些晶体形式可能以多晶型形式存 在，因此同样包含在本发明中。另外，某些化合物可能与水(即水合物)或常规有机溶剂形成溶剂化物，而这种溶剂化物同样也涵盖在本发明范围内。
包括其盐的化合物还可以其水合物的形式获得或包括用于其结晶的其它溶剂。
在另一具体实施方案中，本发明提供一种预防或治疗通过调节有此需要的患者的QC酶活性介导的疾病的方法，其包括以治疗该疾病治疗有效的量和给药方案给药本发明的任意化合物或其药物组合物。此外，本发明包括本发明化合物、及其药物学可接受的酸加成盐形式在制备用于预防或治疗由患者QC活性的调节介导的疾病的药物中的应用。所述化合物可通过任意常规给药途径向患者给药，包括但不限于静脉内、口服、皮下、肌肉内、皮内、非胃肠道及其联合方式。
在另一优选的实施方式中，本发明涉及药物组合物，即药物，其包括至少一种本发明的化合物或其盐，任选地与一种或更多种药物学可接受的载体和/或溶剂相结合。
药物组合物可采用，如非胃肠道或肠道剂型的形式并包含适当的载体，或它们可采用包含适于口服给药的载体的口服剂型的形式。它们优选为采用口服剂型的形式。
按照本发明给药的QC活性效应物可在药物学可给药的剂型或复合剂型(formulation complex)中用作抑制剂或与抑制剂、底物、伪底物(pseudosubstrate)、QC表达抑制剂、结合蛋白或那些降低哺乳动物QC蛋白浓度的酶蛋白抗体联合使用。本发明化合物使根据患者及疾病单独地调整治疗成为可能，尤其是使避免个体不耐受性、过敏和副作用成为可能。
所述化合物还表现出活性程度随时间变化。从而使提供治疗的医生有机会对患者的个别情况作出不同的反应：他能精确调整一方面作用起效速率以及另一方面作用持续时间尤其是作用强度。
按照本发明优选的治疗方法代表预防或治疗由哺乳动物QC酶活性的调整介导的疾病的新方法。它非常简单，易于商业应用并适于尤其用于治疗哺乳动物特别是人类医学中基于生理活性QC底物浓度不平衡的疾病中，如表1和2所列。
该化合物有利地例如采用包含活性成分与常用添加剂如现有技术已知的稀释剂、赋形剂和/或载体相结合的药物制剂的形式给药。例如，它们可通过非胃肠道(例如，i.v.生理盐水溶液)或肠道(例如口服给药，以常规载体配制)给药。
根据其内源稳定性和生物利用度，为达到所期望的血糖正常值标准，每天可给药单剂量或多剂量的所述化合物。例如，在人体中这种剂量范围可在每天大约0.01mg至250.0mg范围内，优选为在每千克体重约0.01至100mg化合物的范围内。
通过向哺乳动物给药QC活性效应物可预防或减轻或治疗选自下列的疾病：阿尔茨海默症、唐氏综合征、伴随或不伴随幽门螺杆菌感染的溃疡和胃癌、致病性精神病、精神分裂症、不育症、瘤形成、炎性宿主应答、癌症、银屑病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化症、体液和细胞介导的免疫应答障碍、内皮中白细胞的粘附和迁移、食物摄取障碍、睡眠觉醒障碍、能量代谢平衡调节障碍、自主功能障碍、激素平衡障碍以及体液调节障碍。
此外，通过向哺乳动物给药QC活性效应物可刺激胃肠道细胞优选为胃粘膜细胞、上皮细胞的增殖、急性酸分泌以及产酸性壁细胞及分泌组胺的肠嗜铬样细胞的分化。
另外，向哺乳动物给药QC抑制剂可导致精细胞功能丧失从而抑制生育力。因此，本发明提供一种调节和控制男性生育力的方法以及QC的活性降低效应物在制备男性避孕药中的应用。
此外，通过向哺乳动物给药QC活性效应物可抑制髓祖细胞增殖。
因此按照本发明使用的化合物能以本身已知的方式利用惰性、无毒、药物学适当的载体和添加剂或溶剂转化为常规制剂，如片剂、胶囊、锭剂、丸剂、栓剂、颗粒剂、气雾剂、糖浆，液体、固体和膏状乳剂(cream-likeemulsion)以及混悬剂和溶液剂。在每种剂型中，治疗有效的化合物优选在总混合物中为大约0.1到80重量％的浓度，更优选为1到50重量％的浓度，也就是说，采用足够获得上述剂量范围的量。
这些物质可作为锭剂、胶囊、可咀嚼胶囊(bitable capsule)、片剂、滴剂、糖浆形式的药物使用，或作为栓剂或鼻喷雾剂使用。
该剂型可便于制备，例如通过以溶剂和/或载体，任选地使用乳化剂和/或分散剂分散活性成分，可例如在将水用作稀释剂的情况下任选地使用有机溶剂作为辅助溶剂(auxiliary solvent)。
与本发明有关的有用的赋形剂的实例包括：水，无毒有机溶剂如石蜡(例如天然石油馏分)、植物油(例如油菜籽油、花生油、芝麻油)、醇(例如乙醇、甘油)、二醇(例如丙二醇、聚乙二醇)；固相载体如粉碎的天然矿物质(例如高分散硅石、硅酸盐)、糖(例如原糖、乳糖和葡萄糖)；乳化剂如非离子型和阴离子型乳化剂(例如聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸酯以及芳基磺酸酯)、分散剂(例如木素、亚硫酸盐溶液、甲基纤维素、淀粉以及聚乙烯吡咯烷酮)以及润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、硬脂酸及月桂基硫酸钠)以及任选的调味剂。
可通过常规方式给药，优选为肠道内或非胃肠道给药，尤其是口服给药。就肠道内给药而言，除上述载体外片剂可包含其他添加剂如柠檬酸钠、碳酸钙及磷酸钙，及其它各种添加剂如淀粉优选为马铃薯淀粉、明胶等。此外，可伴随使用润滑剂如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠及滑石用于压片。就用于口服给药的水混悬剂和/或酏剂而言，除上述赋形剂外，活性成分中可加入各种矫味剂或着色剂。
就非胃肠道给药而言，可以采用使用适当的液体载体的活性成分溶液。一般而言，已发现利于以下述方式给药获得有效的结果，就静脉内给药而言，每天约0.01到2.0mg/kg体重，优选为约0.01到1.0mg/kg体重的剂量，而就肠道内给药而言，剂量则每天约0.01到2mg/kg体重，优选为约0.01到1mg/kg体重。
然而在一些情况下，根据试验动物或患者的体重或给药途径，还基于动物种类及其对药物的个体反应或进行给药的时间间隔，可能需要偏离上述的量。因此，在一些情况下使用少于上述最低的量就足够，而另一些情况下，可能不得不超过所述的上限。在以相对大的量给药的情况下，将那些量分为一天内给药的几个单剂量是明智的。对于人类给药，可使用相同的剂量范围。上述评论类似地适用于该情况。
药物剂型的实例
1.每个胶囊含100mg本发明化合物的胶囊：
制备下列组合物的溶液用于制备约10,000个胶囊：
本发明的化合物            1.0kg
甘油                      0.5kg
聚乙二醇                  3.0kg
水                        0.5kg
5.0kg
将该溶液以本领域已知的方式制成软明胶胶囊。该胶囊适于咀嚼或吞服。
2.包含100mg本发明化合物的片剂或包衣片剂或锭剂：
下述剂量用于制备100,000片片剂：
研细的本发明化合物            10.0kg
葡萄糖                        4.35kg
乳糖                          4.35kg
淀粉                      4.50kg
研细的纤维素              4.50kg
将上述组份混合，然后提供由下列物质制备的溶液，
聚乙烯吡咯烷酮            2.0kg
聚山梨醇酯                0.1kg
以及水                    约5.0kg
并以本领域已知的方式通过过筛(grating)所述湿颗粒，在加入0.2kg硬脂酸镁后进行干燥来进行制粒。已完成的30.0kg片剂混合物加工形成重量为300mg的凸片。理论上，片剂可以本身已知的方式进行包衣或包糖衣。
贯穿本说明书所定义的药物组合物有利地包含至少一种QC活性效应物和至少一种DP IV抑制剂的组合。这种药物组合物尤其适用于阿尔茨海默症和唐氏综合征的治疗。
实施例
实施例1：人和木瓜QC的制备
宿主株和培养基
根据厂商的说明书(Invitrogen)生长、转化并分析用于人QC表达的Pichia pastoris菌株X33(AOX1，AOX2)。根据厂商的建议制备P.pastoris所需的培养基，即缓冲的甘油(BMGY)复合物或甲醇(BMMY)复合物培养基及发酵基础盐培养基。
编码人QC的质粒载体的分子克隆
所有的克隆步骤都应用标准的分子生物学技术进行。载体pPICZαB(Invitrogen)用于在酵母中的表达。pQE-31载体(Qiagen)用于在大肠杆菌(E.coli.)中表达人QC。将由密码子38起始的成熟QC的cDNA 与质粒编码的6×组氨酸标记(tag)符合读框地融合。利用引物pQCyc-1和pQCyc-2(表1)扩增和亚克隆后，利用SphI和HindIII的限制位点将片段插入表达载体中。
P.postoris的转化和小范围表达
根据厂商(Qiagen)的建议在E.coli JM109中扩增和纯化质粒DNA。在所用的表达质粒pPICZαB中，提供了三个限制位点用于线性化。由于SacI和BstXI在QC cDNA内切割，故选择PmeI来线性化。将20-30μg质粒DNA用PmeI进行线性化，经乙醇沉淀，溶于无菌、去离子水中。然后根据厂商(BioRad)说明书，通过电穿孔将10μg的DNA用于适当的(competent)P.pastoris细胞的转化。在含有150μg/ml Zeocin的板上进行选择。一使用线性化质粒的转化可得到几百个转化体。
为测试用于QC表达的重组酵母克隆，将重组体在含有2ml BMGY的10ml圆锥形试管中生长24h。随后，该酵母经离心并重新悬浮于含0.5％甲醇的2ml BMMY中。通过每24h添加甲醇来维持该浓度直到72h。随后测定上清液中QC的活性。利用对准(directed against)6×组氨酸标记(Qiagen)的抗体通过蛋白质印迹免疫分析(Western blot analysis)证实了融合蛋白的存在。选出显示最高QC活性的克隆用于进一步试验和发酵。
发酵罐内的大范围表达
基本如“Pichia fermentation process guidelines”(Invitrogen)所记载，在51反应器(Biostat B，B.Braun biotech)中进行QC的表达。简单地说，细胞是在补充痕量盐并以甘油作为单一的碳源的发酵基础盐培养基中(pH 5.5)培养。在最初的约24h的分批式操作(batch phase)期及随后约5h的流加式操作(fed-batch)期间，细胞质量增加。一旦细胞湿重达到200g/l，使用甲醇利用三步喂养方案在约60h的整个发酵时间内完成QC 表达的诱导。随后，通过以6000×g在4℃离心15min将细胞从含QC的上清液中除去。通过加入NaOH调节pH至6.8，将所得混浊液以37000×g在4℃再次离心40min。如果还混浊，使用纤维素膜(孔径0.45μm)进行额外的过滤步骤。
在P.pastoris中表达的6×组氨酸标记的QC的纯化
将His标记的QC首先通过固定金属亲和色谱(IMAC)进行纯化。在代表性的纯化中，将1000ml培养上清液应用于Ni2+-填充的ChelatingSepharose FF柱(1.6×20cm，Pharmacia)，该柱用含750mM NaCl的50mM，pH 6.8的磷酸盐缓冲液以5ml/min的流速平衡。用10倍柱体积的平衡缓冲液以及5倍柱体积的含5mM组氨酸的平衡缓冲液洗涤后，通过改用含150mM NaCl和100mM组氨酸的50mM，pH 6.8的磷酸盐缓冲液将结合蛋白质洗脱。所得洗脱液用20mM Bis-Tris/HCl，pH 6.8，在4℃进行透析过夜。随后，通过阴离子交换色谱在用透析缓冲液平衡的Mono Q6柱(BioRad)上将QC进行进一步纯化。将含QC的组份以4ml/min的流速上柱。然后将该柱用含100mM NaCl的平衡缓冲液进行冲洗。通过两个梯度完成洗脱，分别得到30或5倍柱体积的含240mM和360mM NaCl的平衡缓冲液。收集6ml馏分并通过SDS-PAGE分析其纯度。合并含同源QC的馏分并通过超滤浓缩。为长期储存(-20℃)，可加入甘油至最终浓度为50％。根据Bradford或Gill和von Hippel(Bradford，M.M.1976 Anal Biochem 72，248-254；Gill，S.C.和von Hippel，P.H.1989 Anal Biochem 182，319-326.)的方法对蛋白进行定量。
大肠杆菌中QC的表达和纯化
将编码QC的构建体(construct)转化进M15细胞(Qiagen)并在选择性LB琼脂板上于37℃下生长。于室温在含1％葡萄糖和1％乙醇的LB培养基上进行蛋白质表达。当培养物的OD600值达到约0.8时，用0.1 mM IPTG诱导表达过夜。经过一个冷冻和融化的循环后，通过加入在含300mM NaCl和2mM组氨酸的50mM、pH 8.0的磷酸盐缓冲液中的2.5mg/ml溶菌酶进行约30min的细胞溶解。通过以37000×g在4℃离心30min使该溶液澄清，随后应用玻璃粉(glass frit)(DNA分离)进行过滤以及应用纤维素过滤器对粗和细沉淀进行两个另外的过滤步骤。该上清液(约500ml)以流速1ml/min应用于Ni2+-亲和柱(1.6×20cm)。用含150mM NaCl和100mM组氨酸的50mM的磷酸盐缓冲液洗脱QC。通过超滤将含QC的馏分浓缩。
来自木瓜胶乳的QC的纯化
根据之前报道的方法(Zerhouni，S.等，1989 Biochim Biophys Acta 138，275-290)的改良版本使用BioCAD 700E(Perseptive Biosystems，Wiesbaden，Germany)进行木瓜胶乳QC的制备。如此处所述，将50g胶乳溶于水并离心。用硫甲磺酸S-甲酯实施蛋白酶的灭活，将所得粗提取物进行透析。透析之后，将整个上清液装在用100mM、pH 5.0的乙酸钠缓冲液平衡的SP琼脂糖凝胶快速柱(SP Sepharose Fast Flowcolumn)(21×2.5cm i.d.)上(流速3ml/min)。以2ml/min的流速通过逐渐增加乙酸钠缓冲液的浓度在三步内完成洗脱。第一步为在0.5柱体积内采用0.1至0.5M乙酸盐缓冲液的线性梯度。第二步为在四个柱体积内以0.5至0.68M的线性增加缓冲液浓度。在最后的洗脱步骤中，应用一个柱体积的0.85M的缓冲液。合并含最高酶活性的馏分(6ml)。通过超滤完成浓缩并将缓冲液变化为0.02M Tris/HCl、pH 8.0(Amicon，膜分子量截留值(cut-off)为10kDa)。
将硫酸铵加入到浓缩的由离子交换色谱步骤所得的木瓜酶中至最终浓度为2M。将该溶液应用于(21×2.5cm i.d.)用2M硫酸铵、0.02MTris/HCl，pH 8.0平衡的丁基琼脂糖凝胶4快速柱(Butyl sepharose 4 FastFlow column)(流速1.3ml/min)上。减少硫酸铵的浓度，在三步内完 成洗脱。第一步中以1.3ml/min的流速应用0.5个柱体积的2至0.6M的硫酸铵、0.02M Tris/HCl，pH 8.0的线性梯度。第二步中以1.5ml/min的流速应用5个柱体积0.6至0M的硫酸铵、0.02M Tris/HCl、pH 8.0的线性梯度。通过以1.5ml/min的流速应用2个柱体积的0.02MTris/HCl、pH 8.0来进行最后的洗脱步骤。合并所有含QC活性的馏分，并通过超滤浓缩。所得的同源QC在-70℃储存。使用Bradford法与由牛血清白蛋白得到的标准曲线相比较测定最终的蛋白浓度。
实施例2：谷氨酰胺酰基环化酶活性的测定
荧光分析
所有的测定在30℃下用BioAssay Reader HTS-7000Plus微孔板读板器(Perkin Elmer)完成。QC活性使用H-Gln-βNA利用荧光测定法评估。该样品是由0.2mM荧光底物、含20mM EDTA的0.2M Tris/HCl、pH 8.0中的0.25U焦谷氨酰氨肽酶(Unizyme， 
Figure G04812386219960424D000481
Denmark)以及最终体积为250μl的适当地稀释的QC等分试样组成。激发/发射波长为320/410nm。通过加入谷氨酰胺酰基环化酶开始分析反应。在分析条件下QC活性由B-萘胺标准曲线来确定。一个单位定义为在所述条件下每分钟催化自H-Gln-βNA生成1μmol pGlu-βNA的QC的量。
在第二种荧光分析中，使用H-Gln-AMC作为底物来测定QC的活性。反应是利用NOVOStar微孔板读板器(BMG labtechnologies)在30℃下进行。该样品是由不同浓度的荧光底物、含5mM EDTA的0.05MTris/HCl、pH 8.0中的0.1U焦谷氨酰氨肽酶(Qiagen)以及最终体积为250μl的适当地稀释的QC等分试样组成。激发/发射波长为380/460nm。通过加入谷氨酰胺酰基环化酶开始分析反应。在分析条件下QC活性由7-氨基-4-甲基香豆素标准曲线来确定。使用GraFit软件评估动力学数据。
QC的分光光度法分析
这种新的试验被用于测定大多数QC底物的动力学参数。QC活性使用源自由先前不连续分析(Bateman，R.C.J.1989 J Neurosci Methods30，23-28)改编的连续方法，利用谷氨酸脱氢酶作为辅助酶(auxiliaryenzyme)进行分光光度分析。该样品是由各自的QC底物、0.3mM NADH、14mMα-酮戊二酸和最终体积为250μl的30U/ml谷氨酸脱氢酶组成。通过加入QC开始反应并通过监测8-15min内340nm处吸光度的减少跟踪(persue)。产物生成的典型的时间过程见图l。
在测定条件下评估最初的速率，从氨气标准曲线来测定酶的活性。所有样品在30℃下使用SPECTRAFluor Plus或使用Sunrise(均来自TECAN)的微孔板读板器进行测定。使用GraFit软件评估动力学数据。
抑制剂试验
对于抑制剂测试，样品成分除了加入推断的抑制化合物外与以上所述的相同。为快速测定QC抑制作用，样品包含4mM的各自的抑制剂和浓度为1KM的底物。为详细研究抑制作用并确定Ki值，首先研究了抑制剂对辅助酶的影响。在所有情况下，未发现对任一种酶产生影响，因此可以可靠地测定QC抑制作用。使用GraFit软件通过用竞争性抑制的通用方程拟合过程曲线来评估抑制常数。
实施例3：MALDI-TOF质谱分析
使用具有线性飞行时间分析器的Hewlett-Packard G2025 LD-TOFSystem来进行基质辅助的激光解吸/电离质谱分析。该装置配备有337nm的氮激光、电压加速源(5kV)和1.0m的飞行管道。检测器为阳离子模式，使用与个人电脑相连接的LeCroy 9350M数字存储示波器来记录和过滤信号。样品(5μl)与等体积的基质溶液混合。对于基质溶液，我们使用通过将30mg 2’，6’-二羟基苯乙酮(Aldrich)和44mg柠檬酸氢二铵(Fluka)溶于1ml乙腈/0.1％TFA的水溶液(1/1，v/v)中制备 的DHAP/DAHC。将小体积(＝1μl)的基质-分析物-混合物转移至探针尖上并在真空室(Hewlett-Packard G2024A样品制备附件)中立即蒸发以确保样品结晶快速而均匀。
为了长期测定Glu1环化作用，于30℃在100μl 0.1M、pH 5.2的乙酸钠缓冲溶液或0.1M Bis-Tris、pH 6.5的缓冲溶液中温育Aβ-衍生的肽。将该肽以0.5mM[Aβ3-11a]或0.15mM[Aβ3-21a]的浓度应用，并在整个24小时加入0.2U QC。就Aβ3-21a而言，该试验包含1％的DMSO。在不同时间，将样品从试管中移出，根据厂商的建议用ZipTips(Millipore)提取的肽与基质溶液混合(1∶1v/v)，并随后记录质谱。阴性对照不包括QC或包含热灭活的酶。用于抑制剂研究的样品成分除了加入抑制化合物(5mM苯并咪唑或2mM 1，10-二氮杂菲)外与上述的相同。
实施例4：pH依赖性
在一级速率条件下研究人和木瓜QC催化作用的pH依赖性，从而反映质子浓度对专一性常数kcat/KM的影响。为了该目的，使用以焦谷氨酰氨肽酶作为辅助酶、Gln-βNA作为底物的偶联酶试验(coupled enzymaticassay)。发现焦谷氨酰氨肽酶在pH 5.5-8.5(Tsuru，D.等，1978 J Biochem(Tokyo)84，467-476)之间有活性且稳定。因此该试验使得可在此pH-范围内进行QC催化的研究。如图2所示，所得速率曲线符合经典钟型曲线。人QC具有非常窄的pH依赖性，其最佳值约为pH 7.8-8.0。在偏碱性pH下速率倾向于减小。这与直到pH 8.5(图2，插图)活性并不下降的木瓜QC观察到的速率曲线形成对比。然而，两种酶在pH 8都具有其最佳特异性。出人意料的是，对曲线的评估显示出人及木瓜QC分别在7.17±0.02和7.15±0.02的酸性范围内具有相同的pKa值。
在碱性pH值下人QC活性明显下降，这是由于pKa值约为8.5的基团的解离所引起。就木瓜QC而言，在碱性pH范围未收集到额外的数据点从而能够可靠地确定第二pKa值。与将数据以双解离模型拟合相比， 将数据以单解离模型拟合得到几乎相同的pKa值(pKa7.13±0.03)，从而支持这一观点。这说明两个pKa值相当独立。
pH稳定性
通过在30℃、pH 4-10之间的不同pH值下温育植物和动物酶30min来研究谷氨酰胺酰基环化酶的稳定性。然后在标准条件下测定QC活性。结果如图3所示。
来自木瓜胶乳的QC在试验pH范围内是稳定的，在酸性或碱性范围内没有明显的不稳定趋势。相反，人QC仅在7和8.5之间的pH范围内显示出相当的稳定性，表明它在pH值大于8.5和小于6时具有显著的不稳定性。因此，pH 8左右的范围似乎对植物和人QC活性和稳定性为最佳，并且是实施QC的底物特异性比较的合适的pH值。
实施例5：QC底物特异性的测定
分光光度试验
按照实施例2所述进行连续分光光度试验。因此，通过在340nm因氨气释放和随后因α-酮戊二酸生成谷氨酸引起NADH/H+的消耗所引起的吸光度降低反映QC活性。如图1所示，监测线性进程曲线，且在所测定的活性和QC浓度之间存在线性关系。此外，使用这里提出的连续试验得到的H-Gln-Gln-OH动力学参数(表1)与使用非连续方法(KM＝175±18μM、kcat＝21.3±0.6s-1)得到的参数非常一致。另外，表1所示的底物H-Gln-Ala-OH、H-Gln-Glu-OH、H-Gln-Gln-OH、H-Gln-OtBu和H-Gln-NH2被木瓜QC转化的动力学参数与使用直接方法在pH 8.8及37℃下(Gololobov，M.Y.等，1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377，395-398)测得的参数非常一致。因此，很明显新的连续试验能提供可靠的结果。
二-、三-和二肽-替代品
利用上述新的连续试验测定了为木瓜和人QC的潜在底物的约30个化合物。结果如表5所示。通过比较其特异性表明，与人酶相比，几乎所有的短肽底物可更有效地由木瓜QC转化。令人感兴趣的是，如通过比较H-Gln-Tyr-Ala-OH、H-Gln-Phe-Ala-NH2和H-Gln-Trp-Ala-NH2与其它三肽的特异性或通过比较发色底物(chromophoric substrate)H-Gln-AMC、H-Gln-βNA和H-Gln-Tyr-OH与二肽底物的反应性所显示，对于在第二位置具有较大疏水性残基的两种酶底物最为有效。对于木瓜QC，该发现与早期发现的特异性与第二氨基酸残基的尺寸有关的结果(Gololobov，M.Y.等，1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377，395-398)相一致。仅在H-Gln-OtBu上观察到植物和动物特异性的显著差别。尽管该酯被木瓜QC以与二肽底物相比相似的特异性所转化，但该转化约比由人QC进行的转化慢一个数量级。
寡肽
除个别二肽和三肽以外，还测试了许多寡肽被木瓜和人QC的转化(表5)。有趣的是，对于一系列的四肽，人和木瓜QC两者间特异性的总体差异没有象在二肽和三肽底物上所观测到的那么大。这显示在第三和第四位的氨基酸仍影响尤其是人QC的动力学行为。然而一个例外为，在结构为H-Gln-Xaa-Tyr-Phe-NH2的一系列四肽中在第二氨基酸位置具有脯氨酸残基的肽显示kcat/KM值显著减小(表5)。人QC特异性降低更为明显，导致与木瓜QC相比kcat/KM值大约相差8倍。
如通过比较H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2、H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2和H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2与其它四肽的特异性所显示，具有荷正电的氨基酸C-端谷氨酰胺的底物的转化中也观测到人QC特异性的略微降低。显然，特异性的降低主要由于较小的转化数。植物酶中不存在这种作用。
表5：人和木瓜QC的肽底物的动力学评估(n.r.，非反应性；n.i.，无 抑制；n.d.未测定；*，底物的抑制)
Figure G04812386219960424D000531
由四肽得到的结果也产生另一种结论。正如已指出的，木瓜QC对二肽显示出较高的选择性。然而，对于在第二氨基酸位置含有谷氨酸的一系列肽，如以表5中数据作图得到的图4所示，观测到人QC对于一些四肽具有较高的专一性常数。此外，与以木瓜QC得到的结果不同，随着链长从二肽增加到四肽，人QC的选择性增加。另外，记录到人QC 对于在第三和第四氨基酸位置含有大体积(bulk)疏水性残基的肽具有最高选择性，提示与该酶具有疏水性相互作用。通过比较各个肽的动力学参数，变化似乎主要由KM值降低引起，而发现肽转化的转化数相似。因此，认为人QC对较长肽的较高选择性是更为疏水的底物与该酶结合更紧密的结果。
通过比较酶对H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2和H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2或H-Gln-Gln-OH和H-Gln-Gln-Tyr-Phe-OH的专一性常数，对在3rd位和4th位含疏水性氨基酸的肽所观测到的人和植物QC之间的差异也变得明显。
还发现对于含有N-端Gln和数量增加的C-端Ala残基的同源底物，人QC具有更大的选择性(表6)。尽管人QC的选择性随底物长度增加而增大，但木瓜QC没有这样的趋势。因为人QC对序列中含有Ser残基的肽具有较小的特异性，因此侧链的种类似乎也很重要(表6)。
表6：底物长度对人和木瓜QC活性的影响
Figure G04812386219960424D000541
离子强度对催化作用的影响
所研究的有关对底物特异性产生影响的另一个参数为离子强度。出于该目的，在含和不含0.5M KCl的条件下测定了几种底物环化的动力学参数(表7)。令人惊奇的是，就来自木瓜胶乳的QC和人的QC而言加入盐不能明显改变具有不荷电的主链的底物的选择性。然而人QC对H-Gln-Ala-OH和H-Gln-Glu-OH的专一性常数随着KCl的加入而减小。 正如个别的动力学参数所显示，这种作用是由于KM的增加和kcat值的略微减少所引起。就木瓜QC而言，对所测的任一参数都没有影响。该作用似乎同样不是由于荷负电的底物所引起，因为对于荷负电的肽H-Gln-Glu-Asp-Leu-NH2未发现参数发生变化。在荷正电的底物H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2和H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2中发现盐的加入可产生有趣的影响。就植物和人QC而言，所测定的对催化作用的正影响主要是因较小的KM值和略微升高的转化数引起的。
表7：离子强度对人和木瓜QC的催化作用的影响
Figure G04812386219960424D000551
Figure G04812386219960424D000552
生理学底物
在早期的研究中，对于来自牛和猪垂体的QC已发现通过QC进行的[Gln1]-TRH和[Gln1]-GnRH的转化(Busby，W.H.J.等，1987 J BiolChem 262，8532-8536；Fischer，W.H.和Spiess，J.1987 Proc Natl Acad SciU S A 84，3628-3632)。除已研究的垂体激素以外，合成了三种可能的人QC的生理学底物，即[Gln1]胃泌素、[Gln1]神经降压肽和[Gln1]FPP，并测试其转化。它们转化的动力学参数在表1中列出。有趣的是，谷氨酰胺酰基肽被转化为根据其尺寸专一性常数增加的各自的焦谷氨酰肽，即首先为最大的具有17个氨基酸的前胃泌素(pro-gastrin)，接着为前神 经降压肽(pro-neurotensin)、pro-GnRH、pro-TRH和pro-FPP。这些发现与由合成肽得到的数据一致。
出人意料地，较长的底物也通过植物酶以较高的选择性进行转化，该结果是与由较短的寡肽得到的结果部分相反。在底物和远离作用位点的酶之间存在次级结合相互作用(secondary binding interaction)。
含经修饰的氨基酸的肽
为了进一步研究QC的特异性和选择性，合成了在第二位含经修饰的N端谷氨酰胺酰基残基或经修饰的氨基酸的肽。利用MALDI-TOF质谱来定性地研究这些肽的转化(仍参见实施例3)。由于谷氨酰胺酰基残基或其类似物的环化，分别探测到底物和催化产物的质量的差别。在每摩尔底物释放一摩尔的氨气的情况下，使用分光光度分析也定量地分析该转化。
H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2。将该N端成支链的在N端含有两个谷氨酰胺酰基残基与赖氨酰残基通过肽-和部分异肽键结合的肽用人(图5)和木瓜QC(没有显示)以表观(apparently)相同的方式进行转化。如一致的底物转化所显示，两种谷氨酰胺酰基残基均转化为焦谷氨酸，对于不同的残基无任何可探测的优先性(图5)。因此对于不同地结合的谷氨酰胺酰基残基来说QC的选择性没有根本的不同。
H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2。甲基化的谷氨酰胺酰基残基只被木瓜QC转化为焦谷氨酰残基(图6)。另外，未监测到人QC被肽抑制，这显示甲基化的残基不能被人QC识别。
H-Glu(OMe)-βNA和H-Glu-βNA。这些化合物都不能被木瓜或人QC转化。利用焦谷氨酰氨肽酶作为辅助酶对这些荧光底物进行荧光分 析。然而，O-甲基化的谷氨酸残基在Tris和Tricine缓冲液中表现出显著的不稳定性，倾向于非酶催化的环化作用。并且，两种QC作为底物对H-Gln-AMC的活性不被较长的肽H-Glu(OMe)-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2或H-Glu-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2抑制，这显示两种QC形式不能识别谷氨酸或衍生物。结果还提示肽自作用部位被排斥的原因不仅仅是谷氨酸残基的负电荷。
H-Gln-环(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe)。对含分子内部分异肽键的H-Gln-环(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe)的转化进行定量分析，揭示对于人和木瓜QC的KM值分别为240±14μM和133±5μM。由于与人QC(22.8±0.6s-1)相比，木瓜QC(49.4±0.6s-1)催化的转化具有较高的转化数，因此植物酶具有372±9mM-1min-1的高于人QC几乎4倍的kcat/KM值。因此，就木瓜QC而言，与具有小尺寸的底物如H-Gln-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-NH2相比，专一性常数仅稍小。然而，发现人QC的kcat/KM 值为95±3mM-1min-1，与小尺寸的底物相比较约小一个数量级(表5)。
H-β高Gln-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2。分别通过人和木瓜QC的催化作用将N-端β-高谷氨酰胺酰基残基转化为五元内酰胺环。通过之前所述的分光光度法及MALDI-tof分析所伴随的氮气释放。当不加入QC或QC被煮沸时未检测到氨气的释放，这表明环化的特异催化作用。有趣的是，来自番木瓜(KM＝3.1±0.3mM，kcat＝4.0±0.4S-1)和人(KM＝2.5±0.2mM，kcat＝3.5±0.1S-1)的QC催化该肽的转化具有几乎一致的kcat/KM 值，分别为1.4±0.1和1.3±0.1mM-1s-1。因而与相似尺寸的在N端含谷氨酰胺酰基残基的肽相比，β-高谷氨酰胺残基被催化的效率大约小1000倍。这显示底物α-碳的构造对于底物被QC形式识别很重要，但不是必需的。在环化的长度和倾斜角度上，作为底物的基本要求为倾向于 环化的γ-酰胺基和未质子化的N端氨基基团，N-端谷氨酰胺酰基和β-高谷氨酰胺酰基残基可以满足这一要求。
实施例6：QC底物的合成
寡肽。按照先前所述(Schilling，S.等，2002 Biochemistry 41，10849-10857)使用肽合成仪(Labortec SP650，Bachem，Switzerland)以0.5mmol的规模半自动化合成肽。较长的肽按照记载(Manhart，S.等，2003 Biochemistry 42，3081-3088)使用自动化Symphony肽合成仪以25μmol的规模进行合成。所有的肽偶联应用改良的固相肽合成的Fmoc方案，使用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基脲(uronium)(TBTU；Novabiochem)/碱(二异丙基乙胺或N-甲基-吗啉；Merck)，或者较难的偶联使用N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3，-三唑[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲烷铵六氟磷酸盐N-氧化物(4、5)(HATU；AppliedBiosystems)/二异丙基乙胺作为活化试剂。在用含有混合物(cocktail)的三氟乙酸(TFA；Merck)从树脂上断裂后，粗肽用制备HPLC使用无酸溶剂系统进行纯化以防止N-端谷氨酰胺的进一步环化。制备HPLC通过250-21 Luna RP18柱(Phenomenex)以乙腈(Merch)/水线性梯度(在40min内乙腈5-40％或65％)实施。应用分析HPLC和ESI-MS确认肽的纯度并鉴定。
Glu(NH-NH2)-Ser-Pro-Thr-Ala-NH2。根据标准的Fmoc-操作(Schilling，S.等，2002 Biochemistry 41，10849-10857)在Rink amideMBHA树脂(Novabiochem)上合成线性肽前体(Fmoc-Glu-Ser-Pro-Thr-Ala-NH2)。Fmoc-保护的肽从树脂上断裂后，将该肽用乙醚(Merck)沉淀、过滤、干燥。在二氯甲烷(DCM，Merck)中应用HMBA-AM树脂(1.16mmol/g，Novabiochem)进行前体肽(3当量)的谷氨酸的γ-羧酸基团的偶联。二环己基碳二亚胺(DCC，Serva)(4当量)和二甲氨基 吡啶(DMAP，Aldrich)(0.1当量)用作偶联剂。12小时后过滤树脂，用DCM冲洗，重复该反应。用20％的哌啶DMF溶液(3×5min)将N端Fmoc基团去保护之后，将肽树脂用5％的肼溶液(20ml/g)处理1.5小时。将树脂过滤、用二甲基甲酰胺(DMF，Roth，Germany)和TFA洗涤。蒸发后，将粗肽用乙醚沉淀，收率为76％。
H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2。根据标准的Fmoc/tBu操作在Rinkamide MBHA(Schilling，S.等，2002 Biochemistry 41，10849-10857)上使用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH作为倒数第二个氨基酸偶联来合成线性肽。用20％的哌啶(Merck)的DMF溶液将赖氨酸的两个氨基保护基去保护之后，4当量的Fmoc-Gln(Trt)-OH得以偶联。标准的断裂操作得到95％的收率。
H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2。从装在Fmoc-MI-AM(Novabiochem)树脂上的Fmoc-Glu-OtBu起始合成Fmoc-Gln(NMe)-OH。用DCM溶胀后，用DMF洗涤树脂(0.5g)、用20％哌啶的DMF溶液脱保护。将树脂倒入5ml DMF中，随后加入5当量Fmoc-Glu-OtBu、5当量HATU和10当量DIPEA，振摇6小时。过滤、洗涤后，以标准的TFA断裂条件来断裂产品。根据记载(Schilling，S.等，2002 Biochemistry 41，10849-10857)合成肽H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2。Fmoc-Gln(NMe)-OH与HATU/DIPEA偶联过夜。标准的断裂操作得到78％的肽粗品。
H-Glu(OMe)-β-萘胺、H-Gln-Val-OH、H-Gln-Tyr-OH。应用标准的混合酸酐操作使用氯甲酸异丁酯(Merck)合成Boc-保护的二肽。通过1N NaOH的二氧六环溶液将C-端甲基酯Boc-Gln-Tyr-OMe和Boc-Gln-Val-OMe进行皂化。使用HCl/二氧六环溶液使Boc-保护的肽 脱保护10分钟。蒸发后将残余物用几种溶剂重结晶得到60-70％的固体化合物。
H-Gln-环(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe)。在酸敏感的2-氯三苯甲基树脂上合成线性前体Boc-Gln(Trt)-Lys-Arg(Pmc)-Ala-Gly-Phe-OH。使用标准的利用Fmoc-Lys(Mtt)-OH的Fmoc/Bu一方案进行偶联。在DCM(10次5min)中用3％的TFA溶液断裂以后，将该溶液在甲醇中(MeOH；Merck)用10％的吡啶(Merck)中和，用DCM和MeOH洗3次，浓缩至体积的5％、粗肽用冰水沉淀。接着使用DCC/N-羟基苯并三唑(HOBt；Aldrich)活化来环化粗肽。将粗肽溶于无水二氯甲烷中(0.2mmol/50ml)中，加入0.2mmol N-甲基吗啉和0.4mmol 1-羟基苯并三唑。在0℃将将该溶液滴加进0.4mmol二环己基碳二亚胺的250ml二氯甲烷溶液中。在室温下搅拌过夜来完成该反应。将N，N′-二环己基脲过滤后，蒸除溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯中，并用1N HCl、NaHCO3饱和溶液及水洗若干次。将该溶液用无水Na2SO4干燥、过滤、在真空下蒸干。
实施例7：QC效应物的特征
咪唑衍生物
测试作为QC抑制剂的在5元环的不同位置含取代基的咪唑及苯并咪唑衍生物(表3)。按照咪唑环编号。在实施例2中记载了所应用的方法。
C-4(5)和C-4，5衍生物。在咪唑环结构等效的4-或5-位或两个位置均带有取代基的化合物显示出对人QC抑制的明显减少。然而唯一的例外为已证明为最有效的抑制化合物之一的N-ω-乙酰化的组胺。正如5-羟甲基-4-甲基-咪唑具有与咪唑类似的抑制常数所显示，在这些位置的小取代基对结合仅有微弱的作用。连接到这些位点上的大基团或更庞大的基团会减弱或破坏酶对化合物的结合。已知所测试的某些其它取代基发 挥能够降低咪唑环的电子云密度的负诱导效应或中介效应，这也促成了较低的结合常数。L-组氨酸和组氨酰胺Ki值的差异也表明了一定的电荷对结合的影响。荷电底物的静电排斥的证据在底物特异性研究中已显示，即谷氨酰胺(glutaminamide)容易被人QC转化为产物，而以游离谷氨酸作为底物未观察到任何活性。
C-2衍生物。所测试的所有衍生物都比咪唑更微弱地抑制QC。比质子更大的任何取代基都能抑制正常的QC结合。仅仅由于2-甲基-苯并咪唑的甲基，抑制常数就下降约一个数量级。比较苯并咪唑和2-氨基-苯并咪唑的Ki值可发现非常类似的关系。此外，该结果表明这种作用与电性变化(electronic alteration)无关。
N-1衍生物。在测试对人QC的抑制作用的咪唑衍生物中，发现与咪唑相比能提高Ki值的大多数化合物在一个氮原子上有变化。这些化合物也包括最有效的QC抑制剂之一，1-苄基咪唑。有趣的是，仅仅对该结构的微小变化都能导致抑制性质的丧失，如在1-苯甲酰咪唑和苯基咪唑中所见，它们在实验条件下无活性。同样在这种情况下，所观测的变化似乎并不仅仅是由于苯基的负中介效应(negative mesomeric effect)导致咪唑环的电子密度降低所引起，因为庞大的显示正诱导效应的三甲基甲硅烷基与其它基团相比同样表现出较低的结合。有趣的是，该组中活性较弱的化合物之一为1-氨基丙基-咪唑。既然立体地(sterically)类似的化合物1-甲基咪唑和1-乙烯基咪唑改善了与活性部位的结合，那么该化合物的功效微弱则是因碱性氨基所引起。因此，荷正电的氨基说明了Ki 值较小的问题，通过比较N-ω-乙酰化的组胺(表3)与组胺(表4)的Ki值确证了这一结果。
3，4和4，5衍生化的作用。在4(5)位或两者皆含取代基的咪唑衍生 物与酶结合的效力有限。通过比较L-组胺以及组胺生物降解中的两种中间体3-甲基-4-组胺和3-甲基-5-组胺的抑制常数可确定特定取代基的作用(表4)。已发现L-组胺的Ki值与其乙酰化的对应物相比要小约一个数量级。就3-甲基-4-组胺而言，一个氮原子的甲基化可使功效显著提高。然而，生成3-甲基-5-组胺的甲基化可导致抑制活性的完全丧失。因此，所观测的结果似乎主要是由于与碱性氮邻接的碳的衍生化导致的结合空间位阻所引起。据推测，该碱性氮在与酶结合中起关键的作用。
实施例8：Aβ3-40/42衍生物的生成
该测定是采用Aβ3-40/42的两种短的N-末端肽序列，在3位包含谷氨酰胺而不是谷氨酸残基的[Gln3]-Aβ1-11(序列：DAQFRHDSGYE)以及[Gln3]Aβ3-11实施。采用MALDL-TOF质谱法来测试DP IV对两种肽的切割作用和QC对这两种肽的N-末端谷氨酰胺残基的环化作用。使用纯化的DP IV(猪肾)或猪垂体匀浆的粗品作为QC的来源实施测定，并测定两种酶的连续催化。
结果
1、通过DPIV催化的由[Gln3]-Aβ1-11a至[Gln3]Aβ3-11a的生成以及DP IV抑制剂Val-吡咯烷酰胺(Val-Pyrr)对其的抑制
DPIV及DPIV样活性切割[Gln3]-Aβ1-11a生成[Gln3]-Aβ3-11a(图7)。第三位置的残基因切割而暴露并因而可被其它酶，即QC修饰。正如所料，催化作用可被Val-Pyrr完全抑制(图8)。
2、垂体匀浆中的QC催化的由[Gln3]Aβ3-11a至[pGlu3]Aβ3-11a的生成以及1，10-二氮杂菲对其的抑制
存在于猪垂体匀浆中的谷氨酰胺酰基环化酶催化[Gln3]Aβ3-11a转化为[pGlu3]Aβ3-11a(图9)。通过加入1，10-二氮杂菲可抑制[pGlu3]Aβ3-11a 的生成。
3、DPIV和QC的连续催化导致生成[pGlu3]Aβ3-11a以及Val-Pyrr和1，10-二氮杂菲对其的抑制
在加入猪肾DPIV的猪垂体匀浆粗品中测定，发现由[Gln3]Aβ3-11a生成[pGlu3]Aβ3-11a发生在DPIV和QC的连续催化之后(图11)。当加入QC抑制剂1，10-二氮杂菲(图12)或DP IV抑制剂Val-Pyrr(图13)时，不生成[pGlu3]Aβ3-11a。如同样由[Gln3]Aβ2-11a的生成所示，出现的少量[pGlu3]Aβ3-11a是因为氨肽酶切割以及随后的谷氨酰胺环化。
4、粗垂体匀浆中由氨肽酶催化的[pGlu3]Aβ3-11a的生成
由于[pGlu3]Aβ3-11a的生成不依赖于DPIV的催化，因此在原生的垂体匀浆中不加入DPIV而研究[Gln3]Aβ1-11a的降解(图14)。正如根据第4节的数据所预料，观察到[pGlu3]Aβ3-11a的生成。该数据表明[Gln3]Aβ1-11a的降解同样可被氨肽酶催化，从而形成[pGlu3]Aβ3-11a。因此，该结果表明焦谷氨酰(pyroglutamyl)的形成是该组织中N-末端肽降解的终点，进一步支持了QC在斑块形成中的作用。
实施例9：重组人QC对[Gln3]Aβ3-11a、3-21a以及3-40的转化
所有所测试的[Gln3]Aβ衍生肽都被人QC高效地转化为相应的焦谷氨酰形式(表8)。由于[Gln3]Aβ3-21a和[Gln3]Aβ3-40在水溶液中的低溶解度，在1％DMSO存在下进行该测定。然而，由于[Gln3]Aβ3-11a具有较好的溶解度，因此允许在存在或不存在DMSO时对QC-催化转化的动力学进行分析(表8)。放在一起考虑，对作为QC底物的链长为8、18及37个氨基酸的Aβ肽的研究(参见表8)证实了人QC活性随着底物长度而增强的发现。因此，考虑到专一性常数，Gln1-胃泌素、Gln1-神经降压肽、Gln1-GnRH都属于最好的QC-底物。类似地，迄今研究的最 大的QC底物[Gln3]Aβ-40以及胰高血糖素，即使在1％DMSO存在下也显示出高的二级速率常数(分别为449mM-1s-1和526mM-1s-1)(表8)。有趣的是，所研究的淀粉样多肽转化的动力学参数并不随着尺寸的增加而显著改变，表明仅Aβ的C-末端部分对QC催化具有中等程度的作用。因此，由于具有较好的溶解度和实验操作性，对涉及这些肽的N-末端氨肽酶加工的进一步研究是通过使用Aβ的更小的片断[Gln3]Aβ1-11a、[Gln3]Aβ3-11a以及Aβ3-11a实施。
表8：在含有1％DMSO的缓冲液中重组人QC转化含有N-末端Gln的肽的动力学参数
肽                KM(μM)   Kcat(s-1)    kcat/KM(mM-1s-1)
[Gln3]Aβ3-11a    87±3#    55±1#       632±10#
[Gln3]Aβ3-11a    155±4    41.4±0.4    267±4
[Gln3]Aβ3-21a    162±12   62±3        383±10
[Gln3]Aβ3-40     89±10    40±2        449±28
胰高血糖素(3-29)  19±1     10.0±0.2    526±17
#在DMSO存在下测定
实施例10：重组人QC对Aβ3-11a和Aβ3-21a的转化
在QC存在下对Aβ3-11a和Aβ3-21a的温育表明，与先前的研究不同，含谷氨酸的肽也能用作QC-底物(图15C和D)。分别在pH 5.2和6.5的条件下研究QC催化的[pGlu3]Aβ3-11a和[pGlu3]Aβ3-21a的生成。如果在加入QC开始试验之前向溶液中加入QC-抑制剂苯并咪唑，则底物生成[pGlu3]Aβ3-11a或[pGlu3]Aβ3-21a的转化受到抑制(图15E和F)。如果QC在加入之前煮沸，则pGlu-肽的生成可忽略不计(图15A和B)。
实施例11：木瓜QC-催化的Gln-βNA和Glu-βNA的环化作用的pH-依赖性
根据Michaelis-Menten动力学木瓜QC在最高2mM(受底物溶解度的限制)的浓度范围内转化Glu-βNA(图16)。检视研究pH 6.1-8.5之间的QC-催化的Glu-βNA转化的转化对底物浓度的图表，发现Glu-底物的两个参数KM和Kcat都是以pH依赖性的方式改变(图16)。这与之前记载的QC-催化的谷氨酸酯环化不同，其中在所给的pH范围内仅观察到KM发生变化(Gololobov，M.Y.，Song，I.，Wang，W.，和Bateman，R.C.(1994)Arch Biochem Biophys 309，300-307)。
随后，为研究Glu-和Gln-环化期间质子浓度的影响，在一级速率定律条件下(即底物浓度远远低于KM值)研究了Glu-βNA和Gln-βNA环化作用的pH依赖性(图17)。与最佳pH为pH 6.0的谷氨酸环化相比，谷氨酰胺环化的最佳pH为pH 8.0。尽管在各自最佳pH下的专一性常数相差约80,000倍，但在pH 6.0左右QC对EC活性的比例仅仅约为8,000。对pH 6.0时无酶催化的由Gln-βNA至pGlu生成的研究持续4周，并发现一级速率常数为1.2×10-7s-1。然而，在同一时期内，并没有pGlu-βNA自Glu-βNA生成，从而可估计对转化的限制性速率常数为1.0×10-9s-1。
实施例12：酶灭活/再活化过程
将人QC的等分试样以3000倍过量的5mM 1，10-二氮杂菲或5mM二吡啶羧酸的pH 6.8的0.05M Bis-Tris/HCI溶液透析过夜进行灭活。随后，通过以包含1mM EDTA的pH 6.8的0.05M Bis-Tris/HCI对样品进行透析(3周期，2000倍过量)，从而将灭活剂小心移除。在室温下使用Zn++、Mn++、Ni++、Ca++、K+和Co++离子在浓度为1.0、0.5、0.25mM的包含0.5mM EDTA的pH 6.8的0.025M Bis-Tris溶液中进行再活化试验15分钟。为避免因缓冲溶液中存在的痕量金属离子引起迅速再活化，QC活性试验是在包含2mM EDTA的pH 8.0的0.05M Tris/HCI溶液中进行。
通过1，10-二氮杂菲抑制猪QC已有记载(Busby，W.H.J.等.1987 JBiol Chem 262，8532-8536，Bateman，R.C.J.等.2001 Biochemistry 40，11246-50)。然而，已发现EDTA对QC催化具有活化作用的事实表明 被二氮杂菲的抑制并不是由于金属螯合作用导致(Busby，W.H.J.等，1987 J Biol Chem 262，8532-8536，Bateman，R.C.J.等，2001 Biochemistry40，11246-50)。同样，除了受1，10-二氮杂菲抑制外，人QC催化的底物环化作用在其它金属酶抑制剂二吡啶羧酸和8-羟基喹啉存在下被彻底革除。这些螯合剂以竞争性和时间依赖性的方式抑制QC，即发现以这些化合物延长温育之后已竞争性地抑制的最初活性会进一步降低(图18、19)。有趣的是，无论温育时间多长或在任何条件下EDTA都不显示显著的抑制作用。
在以5mM 1，10-二氮杂菲或5mM二吡啶羧酸彻底透析之后，人QC几乎完全失活。在以不含螯合剂的缓冲溶液反复整夜透析之后，QC活性部分再活化至50-60％。然而，当以含1mM EDTA的缓冲溶液透析时，观测不到再活化。
通过以0.5mM ZnS04在0.5mM EDTA存在下温育蛋白质10分钟，可在被二吡啶羧酸或1，10-二氮杂菲灭活之后几乎完全恢复QC活性(图20)。类似地，使用Co++和Mn++离子再活化可使QC活性部分恢复。即使在0.25mM Zn++存在下，其活性也可能恢复到初始活性的25％。当应用Ni++、Ca++或K+离子时未观察到再活化作用。类似地，以这些离子温育活性完全的QC对酶活性无任何影响。
序列表
<110>前体生物药物股份公司
 
<120>谷氨酰胺酰基和谷氨酸环化酶效应物的应用
 
<130>14981
 
<140>PCT/EP 2004/004778
<141>2004-05-05
 
<150>US 60/468,043
<151>2003-05-05
 
<150>US 60/468,014
<151>2003-05-05
 
<150>US 60/512,038
<151>2003-10-15
 
<160>28
 
<170>.PatentIn version 3.1
 
<210>1
<211>42
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
 
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
        35                  40
 
<210>2
<211>40
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>2
 
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
        35                  40
 
<210>3
<211>40
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>3
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1               5                   10                  15
Phe  Phe Ala Glu Asp Val  Gly Ser Asn Lys Gly Ala  Ile  Ile Gly Leu
             20                  25                  30
Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
        35                  40
 
<210>4
<211>38
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>4
 
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1               5                   10                  15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
            20                  25                  30
Met Val Gly Gly Val Val
        35
 
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic peptide
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(11)..(11)
<223>AMIDATION
 
<400>5
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu
1               5                   10
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>synthetic peptide
<220>
<221>MOD_RES
<222>(9)..(9)
<223>AMIDATION
 
<400>6
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu
1               5
 
<210>7
<211>21
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>synthetic peptide
<220>
<221>MOD_RES
<222>(21)..(21)
<223>AMIDATION
 
<400>7
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala
            20
 
<210>8
<211>19
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>synthetic peptide
<220>
<221>MOD_RES
<222>(19)..(19)
<223>AMIDATION
 
<400>8
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His  His  Gln Lys Leu Val
1               5                   10                    15
Phe Phe Ala
 
<210>9
<211>38
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>9
Gln Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1               5                   10                  15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
            20                  25                  30
Met Val Gly Gly Val Val
        35
 
<210>10
<211>19
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic peptide
<220>
<221>MOD_RES
<222>(19)..(19)
<223>AMIDATION
 
<400>10
Gln Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1               5                   10                  15
Phe Phe Ala
 
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic peptide
<220>
<221>MOD_RES
<222>(11)..(11)
<223>AMIDATION
 
<400>11
Asp Ala Gln Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu
1               5                   10
 
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic peptide
<220>
<221>MOD_RES
<222>(9)..(9)
<223>AMIDATION
 
<400>12
Gln Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu
1               5
 
<210>13
<211>32
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>synthetic peptide
 
<400>13
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser
1               5                   10                  15
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
            20                  25                  30
 
<210>14
<211>30
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>synthetic peptide
 
<400>14
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser
1               5                   10                  15
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
            20                  25                  30
 
<210>15
<211>33
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>synthetic peptide
<400>15
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser
1               5                   10                  15
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
            20                  25                  30
Thr
 
<210>16
<211>31
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic peptide
 
<400>16
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser
1               5                   10                  15
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile
            20                  25                  30
 
<210>17
<211>39
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>17
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1               5                   10                  15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
            20                  25                  30
Met Val Gly Gly Val Val Ile
        35
<210>18
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(17)..(17)
<223>AMIDATION
 
<400>18
Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp
1               5                   10                  15
Phe
 
<210>19
<211>13
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>19
Gln Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Arg Arg Pro Tyr Ile Leu
1               5                   10
 
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(10)..(10)
<223>AMIDATION
 
<400>20
Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
1               5                   10
 
<210>21
<211>97
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>21
Gln Pro Lys Val Pro Glu Trp Val Asn Thr Pro Ser Thr Cys Cys Leu
1               5                   10                  15
Lys Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg Arg Leu Val Val Gly Tyr Arg
            20                  25                  30
Lys Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala Ile Ile Phe Val Thr Lys Arg
        35                  40                  45
Asn Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn Asp Asp Trp Val Gln Glu Tyr
    50                  55                  60
Ile Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr
65                  70                  75                  80
Val Lys Ile Ile Thr Ala Lys Asn Gly Gln Pro Gln Leu Leu Asn Ser
                85                  90                  95
Gln
 
<210>22
<211>76
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>22
Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile
1               5                   10                  15
Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr
            20                  25                  30
Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly
        35                  40                  45
Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met
    50                  55                  60
Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro
65                  70                  75
<210>23
<211>76
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>23
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr
1               5                   10                  15
Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr
            20                  25                  30
Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala
        35                  40                  45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met
    50                  55                  60
Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr
65                  70                  75
<210>24
<211>68
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>24
Gln Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu Cys Cys Leu Val Tyr Thr Ser Trp
1               5                   10                  15
Gln Ile Pro Gln Lys Phe Ile Val Asp Tyr Ser Glu Thr Ser Pro Gln
            20                  25                  30
Cys Pro Lys Pro Gly Val Ile Leu Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Ile
        35                  40                  45
Cys Ala Asp Pro Asn Lys Lys Trp Val Gln Lys Tyr Ile Ser Asp Leu
    50                  55                  60
Lys Leu Asn Ala
65
 
<210>25
<211>373
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>25
Gln His His Gly Val Thr Lys Cys Asn Ile Thr Cys Ser Lys Met Thr
1               5                   10                  15
Ser Lys Ile Pro Val Ala Leu Leu Ile His Tyr Gln Gln Asn Gln Ala
            20                  25                  30
Ser Cys Gly Lys Arg Ala Ile Ile Leu Glu Thr Arg Gln His Arg Leu
        35                  40                  45
Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Gln Trp Val Lys Asp Ala Met Gln His
    50                  55                  60
Leu Asp Arg Gln Ala Ala Ala Leu Thr Arg Asn Gly Gly Thr Phe Glu
65                  70                  75                  80
Lys Gln Ile Gly Glu Val Lys Pro Arg Thr Thr Pro Ala Ala Gly Gly
                85                  90                  95
Met Asp Glu Ser Val Val Leu Glu Pro Glu Ala Thr Gly Glu Ser Ser
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Pro Thr Pro Ser Ser Gln Glu Ala Gln Arg Ala Leu Gly
        115                 120                 125
Thr Ser Pro Glu Leu Pro Thr Gly Val Thr Gly Ser Ser Gly Thr Arg
    130                 135                 140
Leu Pro Pro Thr Pro Lys Ala Gln Asp Gly Gly Pro Val Gly Thr Glu
145                 150                 155                 160
Leu Phe Arg Val Pro Pro Val Ser Thr Ala Ala Thr Trp Gln Ser Ser
                165                 170                 175
Ala Pro His Gln Pro Gly Pro Ser Leu Trp Ala Glu Ala Lys Thr Ser
            180                 185                 190
Glu Ala Pro Ser Thr Gln Asp Pro Ser Thr Gln Ala Ser Thr Ala Ser
        195                 200                 205
Ser Pro Ala Pro Glu Glu Asn Ala Pro Ser Glu Gly Gln Arg Val Trp
    210                 215                 220
Gly Gln Gly Gln Ser Pro Arg Pro Glu Asn Ser Leu Glu Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Gly Pro Val Pro Ala His Thr Asp Ala Phe Gln Asp Trp Gly Pro
                245                 250                 255
Gly Ser Met Ala His Val Ser Val Val Pro Val Ser Ser Glu Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Ser Arg Glu Pro Val Ala Ser Gly Ser Trp Thr Pro Lys Ala Glu
        275                 280                 285
Glu Pro Ile His Ala Thr Met Asp Pro Gln Arg Leu Gly Val Leu Ile
    290                 295                 300
Thr Pro Val Pro Asp Ala Gln Ala Ala Thr Arg Arg Gln Ala Val Gly
305                 310                 315                 320
Leu Leu Ala Phe Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Gly Val Ala Met Phe
                325                 330                 335
Thr Tyr Gln Ser Leu Gln Gly Cys Pro Arg Lys Met Ala Gly Glu Met
            340                 345                 350
Ala Glu Gly Leu Arg Tyr Ile Pro Arg Ser Cys Gly Ser Asn Ser Tyr
        355                 360                 365
Val Leu Val Pro Val
    370
 
<210>26
<211>76
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>26
Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile
1               5                   10                  15
Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr
            20                  25                  30
Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp
        35                  40                  45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met
    50                  55                  60
Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu
65                  70                  75
<210>27
<211>33
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>27
Gln Pro Leu Pro Asp Cys Cys Arg Gln Lys Thr Cys Ser Cys Arg Leu
1               5                   10                  15
Tyr Glu Leu Leu His Gly Ala Gly Asn His Ala Ala Gly Ile Leu Thr
            20                  25                  30
Leu
 
<210>28
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>28
Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met
1               5                   10

Claims (16)

1.一种用于非胃肠道、肠道或口服给药以预防或治疗选自阿尔茨海默症以及唐氏综合征的疾病的药物组合物，其包含至少一种任选地与常规载体和/或赋形剂相结合的谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂或其药物学可接受的盐，其中所述谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂是通过包括以下步骤的方法鉴别的：
a)在允许其相结合的条件下使所述抑制剂与谷氨酰胺酰基环化酶接触；
b)加入谷氨酰胺酰基环化酶的底物；
c)监测底物转化或任选地测定残余的谷氨酰胺酰基环化酶活性；及
d)计算底物转化和/或谷氨酰胺酰基环化酶酶活性的变化以鉴定谷氨酰胺酰基环化酶的抑制剂。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其另外包含DP IV或DP IV样酶抑制剂和/或氨肽酶抑制剂。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂为竞争性抑制剂。
4.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂选自：
Figure FSB00000380004700011
5.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂与结合于谷氨酰胺酰基环化酶活性位点的金属离子结合。
6.如权利要求1或2所述的药物组合物在制备用于预防或治疗选自以下组中的疾病的药物中的应用：阿尔茨海默症以及唐氏综合征。
7.谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂或其药物学可接受的盐在制备用于预防或治疗选自以下组中的疾病的药物中的应用：阿尔茨海默症以及唐氏综合征，其中所述谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂是通过包括以下步骤的方法鉴别的：
a)在允许其相结合的条件下使所述抑制剂与谷氨酰胺酰基环化酶接触；
b)加入谷氨酰胺酰基环化酶的底物；
c)监测底物转化或任选地测定残余的谷氨酰胺酰基环化酶活性；及
d)计算底物转化和/或谷氨酰胺酰基环化酶酶活性的变化以鉴定谷氨酰胺酰基环化酶的抑制剂。
8.如权利要求7所述的应用，其中所述谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂与DP IV或DP IV样酶的抑制剂和/或氨肽酶抑制剂联合应用。
9.如权利要求6或7所述的应用，其中所述谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂为竞争性抑制剂。
10.如权利要求6或7所述的应用，其中所述谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂选自：
Figure FSB00000380004700031
11.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于至少一种选自以下组中的谷氨酰胺酰基环化酶底物中N-末端谷氨酸或谷氨酰胺残基向焦谷氨酸残基的转化被抑制，其中所述组组成如下：Aβ3-40/42、[Gln3]Aβ3-40/42、[Glu11]Aβ11-40/42、[Gln11]Aβ11-40/42、[Gln1]CCL 2、[Gln1]CCL 7、[Gln1]CCL 8、[Gln1]CCL 16以及[Gln1]CCL 18。
12.如权利要求6或8所述的应用，其中所述DP IV样酶生成H-isoAsp-Ala-OH的活性被阻断。
13.如权利要求6或8所述的应用，其中所述DP IV样酶为DP II。
14.如权利要求6或8所述的应用，其中所述DP IV抑制剂选自以下组中：L-苏-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-苏-异亮氨酰吡咯烷、L-别-异亮氨酰吡咯烷、NVP-DPP728A(1-[[[2-[{5-氰基吡啶-2-基}氨基]乙基]氨基]乙酰基]-2-氰基-(S)-吡咯烷)、LAF-237(1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-腈)、TSL-225(色氨酰基-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)、FE-999011、N-缬氨酰-脯氨酰、O-苯甲酰羟胺、丙氨酰吡咯烷、H-Asn-吡咯烷、H-Asn-噻唑烷、H-Asp-吡咯烷、H-Asp-噻唑烷、H-Asp(NHOH)-吡咯烷、H-Asp(NHOH)-噻唑烷、H-Glu-吡咯烷、H-Glu-噻唑烷、H-Glu(NHOH)-吡咯烷、H-Glu(NHOH)-噻唑烷、H-His-吡咯烷、H-His-噻唑烷、H-Pro-吡咯烷、H-Pro-噻唑烷、H-Ile-吡咯烷、H-L-别-Ile-噻唑烷、H-Val-吡咯烷、H-Val-噻唑烷、2-氨基辛酸-Pro-Ile、Abu-Pro-Ile、Aib-Pro-Ile、Aze-Pro-Ile、Cha-Pro-Ile、Ile-Hyp-Ile、Ile-Pro-别-Ile、Ile-Pro-叔丁基-Gly、Ile-Pro-Val、Nle-Pro-Ile、Nva-Pro-Ile、Orn-Pro-Ile、Phe-Pro-Ile、Phg-Pro-Ile、Pip-Pro-Ile、Ser(Bzl)-Pro-Ile、Ser(P)-Pro-Ile、Ser-Pro-Ile、叔丁基-Gly-Pro-D-Val、叔丁基-Gly-Pro-Gly、叔丁基-Gly-Pro-Ile、叔丁基-Gly-Pro-Ile-酰胺、叔丁基-Gly-Pro-叔丁基-Gly、叔丁基-Gly-Pro-Val、Thr-Pro-Ile、Tic-Pro-Ile、Trp-Pro-Ile、Tyr(P)-Pro-Ile、Tyr-Pro-别-Ile、Val-Pro-别-Ile、Val-Pro-叔丁基-Gly、Val-Pro-Val或其药物学可接受的盐。
15.如权利要求6或8所述的应用，其中所述DP IV抑制剂选自以下组中：
2-甲基羰基-1-N-[(L)-丙氨酰-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，
2-甲基羰基-1-N-[(L)-缬氨酰-(L)-丙氨酰-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，
2-[(乙酰基-氧-甲基)羰基]-1-N-[(L)-丙氨酰-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，
2-[(苯甲酰-氧-甲基)羰基]-1-N-[{(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，
2-{[(2，6-二氯苄基)硫甲基]羰基}-1-N-[{(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷，
2-[(苯甲酰-氧-甲基)羰基]-1-N-[甘氨酰-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，
2-[([1，3]-噻唑噻唑-2-基)羰基]-1-N-[{(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸盐，
2-[(苯并噻唑噻唑-2-基)羰基]-1-N-[N-{(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸盐，
2-[(苯并噻唑噻唑-2-基)羰基]-1-N-[{(L)-丙氨酰}-甘氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸盐，
2-[(吡啶-2-基)羰基]-1-N-[N-{(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸盐，
1-环戊基-3-甲基-1-氧代-2-戊烷氯化铵，
1-环戊基-3-甲基-1-氧代-2-丁烷氯化铵，
1-环戊基-3，3-二甲基-1-氧代-2-丁烷氯化铵，
1-环己基-3，3-二甲基-1-氧代-2-丁烷氯化铵，
3-(环戊基羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉氯化物，以及
N-(2-环戊基-2-氧乙基)环己烷氯化铵，
或它们的其它药物学可接受的盐。
16.如权利要求6或7所述的应用，其中所述谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂与结合于谷氨酰胺酰基环化酶活性位点的金属离子结合。
CN2004800123862A 2003-05-05 2004-05-05 谷氨酰胺酰基和谷氨酸环化酶效应物的应用 Expired - Fee Related CN1784220B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46801403P 2003-05-05 2003-05-05
US46804303P 2003-05-05 2003-05-05
US60/468,014 2003-05-05
US60/468,043 2003-05-05
US51203803P 2003-10-15 2003-10-15
US60/512,038 2003-10-15
PCT/EP2004/004778 WO2004098625A2 (en) 2003-05-05 2004-05-05 Medical use of inhibitors of glutaminyl and glutamate cyclases

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201010168259A Division CN101837127A (zh) 2003-05-05 2004-05-05 谷氨酰胺酰基和谷氨酸环化酶效应物的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1784220A CN1784220A (zh) 2006-06-07
CN1784220B true CN1784220B (zh) 2011-08-03

Family

ID=42827350

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2004800123862A Expired - Fee Related CN1784220B (zh) 2003-05-05 2004-05-05 谷氨酰胺酰基和谷氨酸环化酶效应物的应用

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP1620082B9 (zh)
JP (1) JP5690463B2 (zh)
CN (1) CN1784220B (zh)
AT (1) ATE464889T1 (zh)
AU (2) AU2004237408C9 (zh)
BR (1) BRPI0410078A (zh)
CA (1) CA2524009C (zh)
DK (1) DK1620082T3 (zh)
EA (1) EA009291B1 (zh)
HK (1) HK1089964A1 (zh)
IL (2) IL171339A (zh)
MX (1) MXPA05011861A (zh)
NZ (1) NZ543146A (zh)
PL (1) PL1620082T3 (zh)
WO (1) WO2004098625A2 (zh)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2206496B1 (en) * 2003-05-05 2014-09-17 Probiodrug AG Screening of inhibitors of formation of pyroglutamic acid in amyloid beta peptide
BRPI0415409A (pt) 2003-10-15 2006-12-05 Probiodrug Ag uso de efetuadores de ciclases de glutaminila e glutamato
EP1680120A2 (en) * 2003-11-03 2006-07-19 Probiodrug AG Combinations useful for the treatment of neuronal disorders
CN1918131B (zh) * 2004-02-05 2011-05-04 前体生物药物股份公司 谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂
ATE541835T1 (de) * 2004-02-05 2012-02-15 Probiodrug Ag Neue inhibitoren von glutaminylcyclase
WO2007033350A1 (en) 2005-09-14 2007-03-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors for treating diabetes
EP1924567B1 (en) 2005-09-16 2012-08-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Process for the preparation of pyrimidinedione derivatives
US7572614B2 (en) 2006-02-24 2009-08-11 Academia Sinica Crystal structure of soluble glutaminyl cyclase
WO2007112347A1 (en) 2006-03-28 2007-10-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
JP5203360B2 (ja) 2006-06-23 2013-06-05 アボット・ラボラトリーズ ヒスタミンｈ３受容体調節剤としてのシクロプロピルアミン誘導体
US9108948B2 (en) 2006-06-23 2015-08-18 Abbvie Inc. Cyclopropyl amine derivatives
US9277737B2 (en) 2006-09-21 2016-03-08 Probiodrug Ag Mouse models carrying a knock-out mutation of the QPCTL-gene
NZ590631A (en) * 2006-09-21 2011-12-22 Probiodrug Ag Novel genes related to glutaminyl cyclase
US8889709B2 (en) 2006-09-21 2014-11-18 Probiodrug Ag Use of isoQC inhibitors in the treatment and prevention of inflammatory diseases or conditions
WO2008055945A1 (en) 2006-11-09 2008-05-15 Probiodrug Ag 3-hydr0xy-1,5-dihydr0-pyrr0l-2-one derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase for the treatment of ulcer, cancer and other diseases
TW200838536A (en) 2006-11-29 2008-10-01 Takeda Pharmaceutical Polymorphs of succinate salt of 2-[6-(3-amino-piperidin-1-yl)-3-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydro-2H-pyrimidin-1-ylmethy]-4-fluor-benzonitrile and methods of use therefor
ZA200904353B (en) * 2007-01-19 2010-09-29 Probiodrug Ag In vivo screening models for treatment of alzheimer's disease and other Qpct-related disorders
EP2481408A3 (en) 2007-03-01 2013-01-09 Probiodrug AG New use of glutaminyl cyclase inhibitors
JP5612860B2 (ja) 2007-03-09 2014-10-22 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのイミダゾ［１，５−ａ］ピリジン誘導体
DK2142514T3 (da) 2007-04-18 2015-03-23 Probiodrug Ag Thioureaderivater som glutaminylcyclase-inhibitorer
WO2009034158A2 (en) * 2007-09-12 2009-03-19 Probiodrug Ag Transgenic mice
NZ586665A (en) 2008-01-14 2011-12-22 Probiodrug Ag MOUSE MODELS CARRYING A KNOCK-OUT MUTATION OF THE GLUTAMINYL CYCLASE GENE (Qpct)
EA025107B1 (ru) * 2008-07-31 2016-11-30 Пробиодруг Аг Способ диагностирования болезни альцгеймера, нейродегенерации при синдроме дауна или легкого когнитивного нарушения у субъекта (варианты) и набор для осуществления способа
US8288591B2 (en) 2008-11-20 2012-10-16 Designer Molecules, Inc. Curing agents for epoxy resins
US8563735B2 (en) * 2008-12-05 2013-10-22 Abbvie Inc. Bcl-2-selective apoptosis-inducing agents for the treatment of cancer and immune diseases
US9186353B2 (en) 2009-04-27 2015-11-17 Abbvie Inc. Treatment of osteoarthritis pain
AU2010294214B2 (en) 2009-09-11 2015-05-07 Vivoryon Therapeutics N.V. Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
US20110091910A1 (en) * 2009-09-18 2011-04-21 Probiodrug Ag Novel assay
WO2011076854A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Probiodrug Ag CLEAVAGE OF β-AMYLOID PRECURSOR PROTEIN
JP2013519891A (ja) * 2010-02-18 2013-05-30 プロビオドルグ エージー ピログルタミン酸修飾ｍｃｐ−１を決定することにより炎症性疾患を診断する方法及びグルタミニルシクラーゼの阻害剤のスクリーニング方法
JP6026284B2 (ja) 2010-03-03 2016-11-16 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤
AU2011226074B2 (en) 2010-03-10 2015-01-22 Vivoryon Therapeutics N.V. Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (QC, EC 2.3.2.5)
US20130012620A1 (en) * 2010-03-17 2013-01-10 Designer Molecules, Inc. Curing agents for epoxy resins
EP2560953B1 (en) 2010-04-21 2016-01-06 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2012022804A1 (en) 2010-08-19 2012-02-23 Probiodrug Ag Crystal structure of glutaminyl cyclase
JP2013541938A (ja) 2010-09-02 2013-11-21 プロビオドルグ エージー アイソｑｃ関連障害の治療のためのインビボスクリーニングモデル
WO2012037258A1 (en) 2010-09-16 2012-03-22 Abbott Laboratories Processes for preparing 1,2-substituted cyclopropyl derivatives
BR112013021056B1 (pt) * 2011-02-17 2022-03-29 Pujirebio Diagnostics, Inc Anticorpo monoclonal, kit, e, método para diagnosticar um indivíduo com câncer ovariano
JP6050264B2 (ja) 2011-03-16 2016-12-21 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤としてのベンゾイミダゾール誘導体
WO2013024043A2 (en) 2011-08-12 2013-02-21 Probiodrug Ag In vivo screening models for treatment of qc-related disorders
US9138393B2 (en) * 2013-02-08 2015-09-22 The Procter & Gamble Company Cosmetic compositions containing substituted azole and methods for improving the appearance of aging skin
SG11201506609VA (en) * 2013-03-15 2015-09-29 Probiodrug Ag Novel inhibitors
JP6902416B2 (ja) * 2016-07-05 2021-07-14 ライオン株式会社 睡眠評価用マーカー及びその用途
EP3747437A1 (en) 2017-07-24 2020-12-09 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Treating pathological conditions by direct and indirect targeting of sirpa - cd47 interaction
PL3461819T3 (pl) 2017-09-29 2020-11-30 Probiodrug Ag Inhibitory cyklazy glutaminylowej
IT202100012173A1 (it) * 2021-05-12 2022-11-12 Univ Degli Studi Roma La Sapienza Composizioni per l’uso nel trattamento di disabilità intellettiva e di malattie neurodegenerative in un soggetto con Sindrome di Down
AU2022298746A1 (en) 2021-06-24 2023-11-30 Insilico Medicine Ip Limited Beta-lactam derivatives for the treatment of diseases

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1262552A1 (en) * 2001-05-23 2002-12-04 Genoptera, LLC Polynucleotides encoding insect glutaminyl cyclase and uses thereof

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK118794A3 (en) * 1992-04-01 1995-06-07 Univ Toledo 4(4'-piperidinyl or 3'- pyrrolidinyl) substitutes imidazoles as h3-receptor
IL111785A0 (en) 1993-12-03 1995-01-24 Ferring Bv Dp-iv inhibitors and pharmaceutical compositions containing them
WO1995022327A1 (en) * 1994-02-22 1995-08-24 Knoll Ag Use of 1-(arylalkylaminoalkyl) imidazoles for treating neurological damage
US5552426A (en) * 1994-04-29 1996-09-03 Eli Lilly And Company Methods for treating a physiological disorder associated with β-amyloid peptide
NZ308931A (en) * 1995-05-30 2001-10-26 Gliatech Inc 1H-4(5)-substituted imidazole derivatives useful as a histamine H3 receptor antagonist
DE122010000020I1 (de) 1996-04-25 2010-07-08 Prosidion Ltd Verfahren zur Senkung des Blutglukosespiegels in Säugern
TW492957B (en) 1996-11-07 2002-07-01 Novartis Ag N-substituted 2-cyanopyrrolidnes
US6011155A (en) 1996-11-07 2000-01-04 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-2-cyanopyrrolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
AU766219B2 (en) 1998-02-02 2003-10-09 1149336 Ontario Inc. Method of regulating glucose metabolism, and reagents related thereto
US5994379A (en) * 1998-02-13 1999-11-30 Merck Frosst Canada, Inc. Bisaryl COX-2 inhibiting compounds, compositions and methods of use
JP2002506075A (ja) 1998-03-09 2002-02-26 フォンダテッヒ・ベネルクス・ナムローゼ・フェンノートシャップ セリンペプチダーゼ調節剤
DE19823831A1 (de) 1998-05-28 1999-12-02 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Neue pharmazeutische Verwendung von Isoleucyl Thiazolidid und seinen Salzen
DE19828114A1 (de) 1998-06-24 2000-01-27 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Produgs instabiler Inhibitoren der Dipeptidyl Peptidase IV
DE19828113A1 (de) 1998-06-24 2000-01-05 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Prodrugs von Inhibitoren der Dipeptidyl Peptidase IV
DE19834591A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Verfahren zur Steigerung des Blutglukosespiegels in Säugern
AU5027299A (en) 1998-07-31 2000-02-28 Novo Nordisk A/S Use of glp-1 and analogues for preventing type ii diabetes
US6172081B1 (en) 1999-06-24 2001-01-09 Novartis Ag Tetrahydroisoquinoline 3-carboxamide derivatives
US6110949A (en) 1999-06-24 2000-08-29 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-4-cyanothiazolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
US6107317A (en) 1999-06-24 2000-08-22 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-thiazolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
WO2001034594A1 (en) * 1999-11-12 2001-05-17 Guilford Pharmaceuticals, Inc. Dipeptidyl peptidase iv inhibitors and methods of making and using dipeptidyl peptidase iv inhibitors
GB9928330D0 (en) 1999-11-30 2000-01-26 Ferring Bv Novel antidiabetic agents
US6380398B2 (en) 2000-01-04 2002-04-30 Novo Nordisk A/S Therapeutically active and selective heterocyclic compounds that are inhibitors of the enzyme DPP-IV
EP1254113A1 (en) 2000-01-24 2002-11-06 Novo Nordisk A/S N-substituted 2-cyanopyroles and -pyrrolines which are inhibitors of the enzyme dpp-iv
US6395767B2 (en) 2000-03-10 2002-05-28 Bristol-Myers Squibb Company Cyclopropyl-fused pyrrolidine-based inhibitors of dipeptidyl peptidase IV and method
GB0010188D0 (en) 2000-04-26 2000-06-14 Ferring Bv Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV
GB0010183D0 (en) 2000-04-26 2000-06-14 Ferring Bv Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV
MXPA02012272A (es) 2000-07-04 2003-04-25 Novo Nordisk As Compuestos heterociclicos que son inhibidores de la enzima dipeptidilpeptidasa-iv.
AU2001269123A1 (en) 2000-07-10 2002-01-21 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human dipeptidyl-peptidase iv-like enzyme
EP1950199B1 (en) 2000-08-10 2009-12-02 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Proline derivatives and use thereof as drugs
WO2002013821A1 (en) * 2000-08-17 2002-02-21 Gliatech, Inc. Novel alicyclic imidazoles as h3 agents
CN101143217A (zh) 2000-10-27 2008-03-19 前体生物药物股份有限公司 神经性和神经心理性疾病的治疗方法
TWI243162B (en) 2000-11-10 2005-11-11 Taisho Pharmaceutical Co Ltd Cyanopyrrolidine derivatives
JPWO2002051836A1 (ja) 2000-12-27 2004-04-22 協和醗酵工業株式会社 ジペプチジルペプチダーゼ−ｉｖ阻害剤
PT1368349E (pt) 2001-02-24 2007-04-30 Boehringer Ingelheim Pharma Derivados de xantina, sua preparação e sua utilização como medicamento
ATE395912T1 (de) 2001-03-27 2008-06-15 Merck & Co Inc Dipeptidylpeptidase-hemmer für die behandlung oder prävention von diabetes
US6573287B2 (en) 2001-04-12 2003-06-03 Bristo-Myers Squibb Company 2,1-oxazoline and 1,2-pyrazoline-based inhibitors of dipeptidyl peptidase IV and method
JP2005500308A (ja) 2001-06-20 2005-01-06 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 糖尿病を治療するためのジペプチジルペプチダーゼ阻害剤
CA2450579A1 (en) 2001-06-20 2003-01-03 Merck & Co., Inc. Dipeptidyl peptidase inhibitors for the treatment of diabetes
GB0115517D0 (en) 2001-06-25 2001-08-15 Ferring Bv Novel antidiabetic agents
ATE370943T1 (de) 2001-06-27 2007-09-15 Smithkline Beecham Corp Fluoropyrrolidine als dipeptidyl-peptidase inhibitoren
DE10150203A1 (de) 2001-10-12 2003-04-17 Probiodrug Ag Peptidylketone als Inhibitoren der DPIV
IL158923A0 (en) 2001-06-27 2004-05-12 Smithkline Beecham Corp Fluoropyrrolidines as dipeptidyl peptidase inhibitors
DE10154689A1 (de) * 2001-11-09 2003-05-22 Probiodrug Ag Substituierte Aminoketonverbindungen
CA2419888A1 (en) 2001-06-27 2003-01-09 Probiodrug Ag Peptide structures useful for competitive modulation of dipeptidyl peptidase iv catalysis
JP4300108B2 (ja) 2001-06-27 2009-07-22 スミスクライン ビーチャム コーポレーション ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤としてのピロリジン類
WO2003002595A2 (en) 2001-06-27 2003-01-09 Probiodrug Ag Dipeptidyl peptidase iv inhibitors and their uses as anti-cancer agents
EP1404675B1 (en) 2001-07-03 2008-03-12 Novo Nordisk A/S Dpp-iv-inhibiting purine derivatives for the treatment of diabetes
TWI246510B (en) 2001-09-14 2006-01-01 Mitsubishi Pharma Corp Thiazolidine derivatives and pharmaceutical uses thereof
WO2003024965A2 (en) 2001-09-19 2003-03-27 Novo Nordisk A/S Heterocyclic compounds that are inhibitors of the enzyme dpp-iv
JP2006522794A (ja) * 2003-04-10 2006-10-05 ファイザー株式会社 Ｎｒ２ｂ受容体拮抗物質としての二環系化合物
GB0704100D0 (en) 2006-03-17 2007-04-11 Vodafone Plc Improvements in an ehspa architecture
WO2010051836A1 (de) 2008-11-05 2010-05-14 Osram Gesellschaft mit beschränkter Haftung Vor kurzschluss geschützte halbbrückenschaltung mit halbleiterschaltern
US8049427B2 (en) 2008-11-25 2011-11-01 Lutron Electronics Co., Inc. Load control device having a visual indication of energy savings and usage information

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1262552A1 (en) * 2001-05-23 2002-12-04 Genoptera, LLC Polynucleotides encoding insect glutaminyl cyclase and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
IL171339A (en) 2011-11-30
ATE464889T1 (de) 2010-05-15
HK1089964A1 (en) 2006-12-15
EA200501700A1 (ru) 2006-06-30
AU2004237408C1 (en) 2010-04-01
IL206009A (en) 2017-09-28
CA2524009C (en) 2014-04-29
AU2004237408C9 (en) 2010-04-15
AU2009227925A1 (en) 2009-11-12
NZ543146A (en) 2008-09-26
PL1620082T3 (pl) 2010-10-29
JP5690463B2 (ja) 2015-03-25
EA009291B1 (ru) 2007-12-28
IL206009A0 (en) 2010-11-30
EP1620082B9 (en) 2010-08-25
EP1620082A2 (en) 2006-02-01
AU2004237408A1 (en) 2004-11-18
BRPI0410078A (pt) 2006-05-16
DK1620082T3 (da) 2010-08-16
WO2004098625A2 (en) 2004-11-18
MXPA05011861A (es) 2006-02-17
EP1620082B1 (en) 2010-04-21
CN1784220A (zh) 2006-06-07
AU2004237408B2 (en) 2009-10-01
JP2006525278A (ja) 2006-11-09
WO2004098625A3 (en) 2005-06-23
AU2009227925B2 (en) 2011-12-15
CA2524009A1 (en) 2004-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1784220B (zh) 谷氨酰胺酰基和谷氨酸环化酶效应物的应用
CN101837127A (zh) 谷氨酰胺酰基和谷氨酸环化酶效应物的应用
CN102302781A (zh) 谷氨酰胺酰基环化酶效应物和谷氨酸环化酶效应物的应用
ES2348500T3 (es) Uso medico de inhibidores de glutaminil y glutamato ciclasas para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer y el sindrome de down.
AU2011265545A1 (en) Use of effectors of glutaminyl and glutamate cyclases

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1089964

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1089964

Country of ref document: HK

CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Halle / Saale

Patentee after: Vivoyon Treatment Public Ltd.

Address before: Halle / Saale

Patentee before: PROBIODRUG AG

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20060607

Assignee: SIMCERE PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Assignor: Vivoyon Treatment Public Ltd.

Contract record no.: X2021990000593

Denomination of invention: Application of glutamine acyl and glutamate cyclase effectors

Granted publication date: 20110803

License type: Exclusive License

Record date: 20210927

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20110803

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee