EA016584B1 - Новые гены, родственные гену глутаминилциклазы - Google Patents

Новые гены, родственные гену глутаминилциклазы Download PDF

Info

Publication number
EA016584B1
EA016584B1 EA200900404A EA200900404A EA016584B1 EA 016584 B1 EA016584 B1 EA 016584B1 EA 200900404 A EA200900404 A EA 200900404A EA 200900404 A EA200900404 A EA 200900404A EA 016584 B1 EA016584 B1 EA 016584B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
human
impaired
polypeptide
activity
Prior art date
Application number
EA200900404A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200900404A1 (ru
Inventor
Штефан Шиллинг
Хольгер Цинис
Йенс-Ульрих Рафельд
Ханс-Ульрих Демут
Original Assignee
Пробиодруг Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Пробиодруг Аг filed Critical Пробиодруг Аг
Publication of EA200900404A1 publication Critical patent/EA200900404A1/ru
Publication of EA016584B1 publication Critical patent/EA016584B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/56—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring carbon atoms
    • C07D233/61—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring carbon atoms with hydrocarbon radicals, substituted by nitrogen atoms not forming part of a nitro radical, attached to ring nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D235/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings
    • C07D235/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D235/04—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles
    • C07D235/06—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Abstract

В патенте описаны новые белки, напоминающие глутаминилпептидциклотрансферазу (QPCTL), которые являются изозимами глутаминилциклазы (QC, К.Ф. 2.3.2.5), и выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие эти изозимы, которые все можно применять для выявления новых терапевтических агентов, измерения циклазной активности и для определения ингибирующей активности соединений в отношении этих изозимов глутаминилциклазы.

Description

Изобретение относится к новым белкам, напоминающим глутаминилпептидциклотрансферазу (ОРСТЬ), которые представляют собой изозимы глутаминилциклазы (ОС. К.Ф. 2.3.2.5), и к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим эти изозимы, которые все можно применять для разработки новых терапевтических агентов, для оценки циклазной активности и для определения ингибирующей активности соединений в отношении этих изозимов глутаминилциклазы.
Предпосылки создания изобретения
Глутаминилциклаза (ОС, К.Ф. 2.3.2.5) катализирует внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (рС1и*) с выделением в свободном состоянии аммиака. ОС впервые была выделена Меккег из латекса тропического растения Сапса рарауа в 1963 г. (Меккег М., №а!иге 4874, 1963, с. 1299). Спустя 24 года соответствующая ферментативная активность была обнаружена в гипофизе животных (ВикЬу \. Н. 1. и др., 1 Βίο1 Сйеш 262, 1987, сс. 8532-8536; Иксйег \. Н. и 8р1екк 1., Ргос №111 Асаб δα И8А 84, 1987, сс. 3628-3632). Касательно ОС млекопитающих, превращение С1и в рС1и с помощью ОС было обнаружено для предшественников ТЯН (тиреолиберин) и СпКН (гонадолиберин) (ВикЬу \. Н. 1. и др., 1 Βίο1 Сйеш 262, 1987, сс. 8532-8536; Иксйег \. Н. и 8р1екк 1., Ргос №а!1 Асаб δα И8А 84, 1987, сс. 3628-3632). Кроме того, первые эксперименты по выявлению локализации ОС позволили обнаружить ее совместную локализацию с предполагаемыми продуктами катализа в бычьем гипофизе, что является дополнительным доказательством ее участия в синтезе пептидных гормонов (Воскегк Т. М. и др. 1. №еигоепбосгшо1 7, 1995, сс. 445-453). В противоположность этому, физиологическая функция растительной ОС является менее изученной. Предполагается, что фермент из С. рарауа играет роль в защите растений от патогенных микроорганизмов (Е1 Моиккаош А. и др., Се11 Мо1 ЫГе δα 58, 2001, сс. 556-570). В настоящее время на основе сравнительного анализа последовательностей были выявлены предполагаемые ОС из других растений (ИаЫ δ. \. и др., Рго1еш Ехрг РипГ 20, 2000, сс. 27-36). Однако физиологическая функция этих ферментов все еще остается неясной.
Известные выделенные из растений и животных ОС обладают строгой специфичностью в отношении Ь-глутамина в Ν-концевом положении субстратов, и установлено, что их кинетические характеристики описываются уравнением Михаэлиса-Ментен (РоЫ Т. и др., Ргос №а!1 Асаб δα υδΑ 88, 1991, сс. 10059-10063; Сопкако А. Р. и др., Апа1 Вюсйеш 175, 1988, сс. 131-138; Со1о1оЬоу М. Υ. и др., Вю1 Сйеш Норре δеу1е^ 377, 1996, сс. 395-398). Однако сравнение первичных структур ОС из С. рарауа и высококонсервативных ОС млекопитающих не выявило никакой гомологии последовательностей (ИаЫ δ. \. и др., Рго1еш Ехрг РипГ 20, 2000, сс. 27-36). В то время как растительные ОС, вероятно, принадлежат к новому семейству ферментов (ИаЫ δ. \. и др., Рго1еш Ехрг РипГ 20, 2000, сс. 27-36), установлено, что ОС млекопитающих обладают выраженной гомологией последовательностей с бактериальными аминопептидазами (Ва1ешап К. С. и др., ВюсйешщБу 40, 2001, сс. 11246-11250), это позволило сделать заключение о различном эволюционном происхождении ОС из растений и животных.
В настоящее время установлено, что не рекомбинантная человеческая ОС, а обладающие ОСактивностью экстракты, выделенные из головного мозга, катализируют циклизацию как Ν-концевого глутаминила, так и глутамата. Более конкретно, установлено, что для катализируемого циклазой С1щпревращения оптимальным является значение рН, близкое к 6,0, а для С1П1-превращения в рС1ипроизводные оптимальным является значение рН, близкое к 8,0. Поскольку образование пептидов, родственных рС1и-Ав, можно подавлять путем ингибирования рекомбинантной человеческой ОС и ОСактивности экстрактов, выделенных из гипофиза свиньи, то фермент ОС является мишенью для разработки лекарственных средств, предназначенных для лечения болезни Альцгеймера.
В ЕР 02011349.4 описаны полинуклеотиды, кодирующие глутаминилциклазу насекомых, а также кодируемые ими полипептиды. В этой заявке описаны также клетки-хозяева, которые содержат экспрессионные векторы, несущие полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении. Выделенные полипептиды и клетки-хозяева, содержащие ОС насекомых, применяют в методах скрининга агентов, которые снижают глутаминилциклазную активность. Такие агенты можно применять в качестве пестицидов.
Ингибиторы ОС, которые можно применять также в качестве ингибиторов изозимов ОС, описаны в \\'О 2004/098625, \\'О 2004/098591, \\'О 2005/039548 и \\'О 2005/075436, которые полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки, прежде всего в части, касающейся структуры ингибиторов, их применения и получения.
Определения Ингибиторы ферментов
Обратимые ингибиторы ферментов: включают конкурентные ингибиторы, неконкурентные обратимые ингибиторы, медленно связывающиеся или прочно связывающиеся ингибиторы, аналоги переходного состояния и мультисубстратные аналоги.
Для конкурентных ингибиторов характерно:
I) нековалентные взаимодействия с ферментом,
II) конкуренция с субстратом за активный сайт фермента.
Основной механизм действия обратимого ингибитора фермента и определение константы диссоциации можно проиллюстрировать с помощью следующей схемы:
- 1 016584
Е-5
Е-Р
Образование комплекса фермент-ингибитор [Е-Ι] препятствует связыванию субстратов, в результате не может происходить реакция с образованием обычного физиологического продукта, Р. Более высокая концентрация ингибитора [I] приводит к более высокой концентрации [Е-Ι], что обусловливает снижение уровня свободного фермента, с которым субстрат может связываться.
Для неконкурентных ингибиторов характерно:
I) связывание в сайте, отличном от активного сайта (аллостерический сайт связывания),
II) способность вызывать конформационное изменение в ферменте, которое снижает или прекращает каталитическую активность.
Для медленно связывающихся или прочно связывающихся ингибиторов характерно:
I) они представляют собой конкурентные ингибиторы, для которых характерно медленное достижение равновесия между ингибитором и ферментом,
II) величина ко|| соответствует медленному процессу, вероятно из-за конформационных изменений, которые должны происходить в ферменте или ингибиторе,
а) они часто представляют собой аналоги переходного состояния,
б) они обладают эффективностью при концентрации, близкой к концентрации фермента (субнаномолярные значения Кс),
в) из-за того, что значения ко££ являются слишком низкими, эти типы ингибиторов являются практически (почти) необратимыми.
Аналоги переходного состояния
Представляют собой конкурентные ингибиторы, которые имитируют переходное состояние фермента, катализирующего реакцию. Происходит ферментный катализ, приводящий к снижению энергии переходного состояния, в результате этого связывание в переходном состоянии является предпочтительным по сравнению со связыванием с субстратом.
Мультисубстратные аналоги
Для реакции, включающей два или большее количество субстратов, можно создавать конкурентный ингибитор или аналог переходного состояния, который имеет структурные характеристики, сходные с характеристиками двух или большего количества субстратов.
Необратимые ингибиторы ферментов
Во всех случаях сдвигают равновесие между несвязанным ферментом и ингибитором и комплексом фермент-ингибитор (Е+I θ ЕП) в сторону образования ковалентной связи (~100 ккал/моль), что делает ингибирование необратимым.
Агенты, действие которых основано на аффинности
Необратимые ингибиторы, связывающиеся с активным сайтом (мишенью которых является активный сайт) (конкурентные необратимые ингибиторы), распознаются ферментом (обратимое специфическое связывание) с последующим формированием ковалентной связи и
I) они обладают структурным сходством с субстратом, переходным состоянием или продуктом, что позволяет осуществлять специфическое взаимодействие между лекарственным средством и ферментом мишенью,
II) содержат реактивную функциональную группу (например, нуклеофил, -СОСН2Вг), что позволяет осуществлять формирование ковалентной связи.
Приведенная ниже реакционная схема описывает взаимодействие реагента, связывающегося с активным сайтом, с ферментом-мишенью, где Кс обозначает константу диссоциации и кинак1ивации (к;пас«уайОп) обозначает скорость образования ковалентной связи.
Е + [£ 1
Инактиваторы, действие которых основано на механизме, связанном с ферментом (называемые также ингибиторы-самоубийцы), представляют собой связывающиеся с активным сайтом реагенты
- 2 016584 (нереактивные), которые связываются с активным сайтом фермента, где они трансформируются в реактивную форму (активированную форму) под воздействием каталитической активности фермента. После активации формируется ковалентная связь между ингибитором и ферментом.
На приведенной ниже реакционной схеме показан механизм действия инактиватора, действие которого основано на механизме, связанном с ферментом, где Кс обозначает комплекс диссоциации, к2 обозначает скорость активации ингибитора после связывания с ферментом, к3 обозначает скорость диссоциации активированного ингибитора, Р, из фермента (продукт может еще сохранять реактивность) и к4 обозначает скорость формирования ковалентной связи между активированным ингибитором и фермен том.
*3 ν
Е + Р
Инактивация (формирование ковалентной связи, к4) должна происходить до диссоциации (к3), в противном случае реактивный ингибитор будет высвобождаться в окружающую среду. Коэффициент распределения, т.е. к3/к4: т.е. соотношение высвободившегося продукта и инактивированного продукта, должен быть минимизирован для эффективной инактивации системы и получения минимальных нежелательных побочных реакций. Высокое значение коэффициента распределения (преобладающая диссоциация) приводит к неспецифическим реакциям.
Неконкурентные ингибиторы ферментов
Исходя из определения неконкурентного ингибитора (ингибитор, который связывается только с ЕЯкомплексами (субстрат-фермент)), можно вывести следующее уравнение:
Кз к2 Е+ 8 ЕЗ------Е + Р +
I
К|
Е81
Для диссоциации субстрата из ЕЯ-комплекса характерно значение константы диссоциации, равное К,, в то время как диссоциация комплекса ЕЯ1 не происходит (т.е. значение К, равно нулю). Ожидается, что значения Кт для ферментов, действие которых удовлетворяет уравнению скорости ферментативной реакции Михаэлиса-Ментен, будет пониженным. Повышение концентрации субстрата приводит к повышению концентрации ЕЯ1 (из комплекса не может происходить образование продуктов реакции), поэтому не происходит прекращение ингибирования.
Предпочтительными согласно настоящему изобретению являются конкурентные ингибиторы ферментов. Наиболее предпочтительными являются обратимые конкурентные ингибиторы ферментов.
Понятия к1 или К; и Кс относятся к константам связывания, которые характеризуют связывание ингибитора с ферментом и последующее высвобождение из фермента. Другой мерой является значение 1С50, отражающее концентрацию ингибитора, которая при данной концентрации субстрата приводит к 50%-ному ингибированию активности фермента.
Понятие ОС в контексте настоящего описания обозначает глутаминилциклазу (ОС), синонимом которой является глутаминилпептидциклотрансфераза (ОРСТ); и ОС-подобные ферменты, синонимом которых являются белки, напоминающие глутаминилпептидциклотрансферазу (ОРСТЬ). ОС и ОСподобные ферменты имеют идентичную или сходную ферментативную активность, обозначенную далее как ОС-активность. Следует отметить, что ОС-подобные ферменты могут принципиально отличаться от ОС по молекулярной структуре.
Понятие ОС-активность в контексте настоящего описания обозначает каталитическую активность как глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ), так и ОС-подобных ферментов (ОРСТЬ). Эти ферменты обнаружены в различных тканях организма млекопитающих, включая почку, печень, кишечник, головной мозг и жидкости организма, такие как СМЖ (спинномозговая жидкость), где они осуществляют высоко специфическую циклизацию глутамина или глутамата на Ν-конце биологически активных пептидов.
В частности, понятие ОС-активность в контексте настоящего описания обозначает внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (рС1и*) или Ν-концевого Ь-гомоглутамина или Ε-β-гомоглутамина с образованием циклического пирогомоглутаминового производного с выделением в свободном состоянии аммиака (см. ниже схемы 1 и 2).
- 3 016584
Схема 1. Циклизация глутамина с помощью ОС
Схема 2. Циклизация Ь-гомоглутамина с помощью ОС
Понятие ЕС в контексте настоящего описания относится к побочной активности глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ) и ОС-подобных ферментов (ОРСТЬ), таких как глутаматциклаза (ЕС), которая обозначена далее как ЕС-активность.
Понятие ЕС-активность в контексте настоящего описания обозначает внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых глутаматных остатков с образованием пироглутаминовой кислоты (рС1и*) с помощью глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ) и ОС-подобных ферментов (ОРСТЬ) (см. ниже схему 3).
Схема 3. Ν-Концевая циклизация незаряженных глутамильных пептидов с помощью ОС (ЕС)
Понятие ингибитор ОС или ингибитор глутаминилциклазы хорошо известно специалистам в данной области и означает ферментные ингибиторы, которые ингибируют каталитическую активность глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ) или ОС-подобных ферментов (ОРСТЬ) или их глутамилциклазную (ЕС) активность, предпочтительно путем непосредственного взаимодействия ингибитора с ферментом.
Понятие избирательный ОС-ингибитор в контексте настоящего описания обозначает ферментные ингибиторы, которые ингибируют каталитическую активность глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ), но не ингибируют или ингибируют с меньшей эффективностью по меньшей мере один из ОС-подобных ферментов (ОРСТЬ). Предпочтительными являются избирательные ОС-ингибиторы, ингибирование которыми глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ) характеризуется значением к1, которое на один порядок ниже значения к1, характеризующего ингибирование по меньшей мере одного из ОС-подобных ферментов (ОРСТЬ). Более предпочтительно значение к1 для избирательного ОС-ингибитора, характеризующее ингибирование глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ), на два порядка ниже значения к1, характеризующего ингибирование по меньшей мере одного из ОС-подобных ферментов (ОРСТЬ). Еще более предпочтительно значение к1 для избирательных ОС-ингибиторов, характеризующее ингибирование глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ), на три порядка ниже значения к1, характеризующего ингибирование по меньшей мере одного из ОС-подобных ферментов (ОРСТЬ). Наиболее предпочтительными являются избирательные ОСингибиторы, которые не ингибируют ОС-подобные ферменты (ОРСТЬ).
Понятие избирательный ОРСТЬ-ингибитор в контексте настоящего описания обозначает ферментные ингибиторы, которые ингибируют каталитическую активность по меньшей мере одного ОСподобного фермента (ОРСТЬ), но не ингибируют или ингибируют с меньшей эффективностью активность глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ). Предпочтительными являются ОРСТЬ-ингибиторы, ингибирование которыми по меньшей мере одного ОС-подобного фермента (ОРСТЬ) характеризуется значением к1, которое на один порядок ниже значения к1, характеризующего ингибирование глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ). Более предпочтительно значение к1 для избирательного ОРСТЬ-ингибитора, характеризующее ингибирование по меньшей мере одного ОС-подобного фермента (ОРСТЬ), на два порядка ниже значе
- 4 016584 ния к;, характеризующего ингибирование глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ). Еще более предпочтительно значение к1 для избирательных ОРСТЬ-ингибиторов, характеризующее ингибирование по меньшей мере одного ОС-подобного фермента (ОРСТЬ), на три порядка ниже значения к1, характеризующего ингибирование глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ). Наиболее предпочтительными являются избирательные ОРСТЬ-ингибиторы, которые не ингибируют активность глутаминилциклазы (ОС, ОРСТ).
Эффективность ингибирования ОС
С учетом корреляции с ингибированием ОС в предпочтительных вариантах осуществления изобретения, заявляемом способе и при медицинском применении используют агент, ингибирование которым ОС характеризуется значением К1 10мкм или менее, более предпочтительно 1мкМ или менее, еще более предпочтительно 0,1мкМ или менее или 0,01мкМ или менее или наиболее предпочтительно 0,01мкМ или менее. Фактически, рассматриваются ингибиторы, для которых значения К1, составляют менее микромоля, предпочтительно находятся на наномолярном уровне или еще более предпочтительно на пикомолярном уровне. Таким образом, хотя представленные в настоящем описании активные агенты для удобства обозначены как ОС-ингибиторы, должно быть очевидно, что согласно изобретению такая номенклатура не ограничена каким-либо конкретным механизмом действия.
Молекулярная масса ингибиторов ОС
В целом, ингибиторы ОС, которые используют в заявляемом способе или в медицине, должны представлять собой небольшие молекулы, например, с молекулярной массой 1000 г/моль или менее, 500 г/моль или менее, предпочтительно 400 г/моль или менее и еще более предпочтительно 350 г/моль или менее и наиболее предпочтительно 300 г/моль или менее.
Понятие индивидуум в контексте настоящего описания относится к животному, предпочтительно млекопитающему, наиболее предпочтительно человеку, которого подвергают лечению, наблюдению или экспериментальной обработке.
Понятие терапевтически эффективное количество в контексте настоящего описания означает количество действующего вещества или фармацевтического агента, вызывающее биологический или медицинский ответ в тканевой системе животного или человека, который требуется получить исследователю, ветеринару или врачу или другому клиницисту, включающий облегчение симптомов заболевания или нарушения, подлежащего лечению.
В контексте настоящего описания понятие фармацевтически приемлемый относится к применению, как для лечения человека, так и в ветеринарии: например, к фармацевтически приемлемым относятся приемлемое для ветеринарии соединение или соединение, приемлемое для медицины и медикосанитарной помощи человеку.
Синдром Гийена-Барре (СВ8)
Другими названиями являются синдром Ландри-Гийена-Барре, острый идиопатический полиневрит, инфекционный полиневрит или острая воспалительная полиневропатия.
Синдром Гийена-Барре представляет собой серьезное нарушение, которое возникает, когда защитная (иммунная) система организма ошибочно атакует часть нервной системы. Это приводит к воспалению нервов, что вызывает мышечную слабость, которая продолжает усугубляться.
Синдром Гийена-Барре представляет собой аутоиммунное нарушение. Точная причина синдрома Гийена-Барре неизвестна. Синдром может возникать в любом возрасте, но наиболее часто им страдают люди обоих полов в возрасте от 30 до 50 лет. Он часто возникает после небольшой инфекции, как правило, респираторной (легочной) инфекции или желудочно-кишечной (кишечной) инфекции. Обычно признаки первичной инфекции исчезают до возникновения симптомов синдрома Гийена-Барре. Синдром Гийена-Барре связан с воспалением, которое поражает часть нервов. Это поражение нервов вызывает покалывание, мышечную слабость и паралич. Воспаление, как правило, поражает покрытие нерва (миелиновую оболочку). Такое поражение называют демиелинизацией. Демиелинизация замедляет передачу сигналов нервом. Поражение других частей нервной системы может вызывать прекращение работы нерва.
Симптомы синдрома Гийена-Барре очень быстро развиваются. Для достижения наиболее серьезных симптомов может потребоваться всего несколько часов. Мышечная слабость или потеря мышечной функции (паралич) поражает обе стороны тела. Если мышечная слабость сначала появляется в ногах и затем быстро распространяется на руки, то ее называют восходящим параличом.
Пациенты могут ощущать покалывание, боль в ногах или руках и ощущение неповоротливости. По мере потери мышечной функции пациентам может потребоваться вспомогательное дыхание.
В настоящее время не существует путей исцеления синдрома Гийена-Барре. Однако многие варианты лечения могут способствовать снижению симптомов, лечению осложнений и ускорению восстановления. Когда симптомы являются серьезными, пациента необходимо помещать в больницу для осуществления вспомогательного дыхания, лечения и физиотерапии. Метод, называемый плазмофорез, применяют для изъятия у пациента крови и замены ее на внутривенные жидкости или донорскую кровь, свободную от антител. Лечение высокими дозами иммуноглобулинов представляет собой еще одну процедуру, которую применяют для снижения серьезности и продолжительности синдрома Гийена-Барре. Другие варианты лечения направлены на предупреждение осложнений.
- 5 016584
Хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия (СШР)
Заболевание, напоминающее СВ8, но характеризующееся хроническим течением, называют хронической воспалительной демиелинизирующей полирадикулоневропатий (СШР). Пока не существует общепринятого определения СШР за исключением того, что установлено, что в отличие от СВ8. фаза развития продолжается более 4 недель, часто более 6 месяцев, и что дефекты у пациентов часто сохраняются. Механизм, обусловливающий серьезный парез при СВ8 и СШР, вероятно, включает иммунную реакцию и воспаление, опосредуемое Т-лимфоцитами, после чего возникает демиелинизация периферических нервов. Это предположение подтверждается тем, что в сыворотке и спинномозговой жидкости страдающих СВ8 пациентов обнаружены повышенные количества комплементов и цитокинов. Процесс демиелинизации, прежде всего в области нервных корешков, в настоящее время рассматривается как имеющий решающее значение механизм в развитии блокады нервной проводимости. Одна из теорий основана на том, что нарушение барьерной функции крови/спинномозговой жидкости (СМЖ) (гемато/СМЖ-барьер) рассматривается как относительно ранняя важная стадия развития заболевания. Другая теория основана на предположении, что в результате заболевания в гемато/СМЖ-барьере образуются протечки, и это приводит к повышенному содержанию белков в СМЖ. В любом варианте неспецифические компоненты сыворотки, не имеющие прямого отношения к иммунной системе, могут проникать в СМЖ из крови, вызывая дисфункции нейронов или глии и/или модификацию нейронной активности. Альтернативный механизм заключается в снижении скорости потока СМЖ, что может объяснять повышенное содержание белка в СМЖ. Такая интерпретация не предусматривает никакого нарушения или модификации избирательности гемато/СМЖ-барьера. Хотя все указанные выше явления могут быть важными для развития СВ8 и СШР, их точная роль в развитии симптомов пока остается не ясной. Пока не удалось установить связь между повышенными концентрациями белков в СМЖ и специфическими электрофизиологическими параметрами или клинической картиной. Недавно описаны факторы, присутствующие в СМЖ страдающих СВ8 пациентов и страдающих рассеянным склерозом пациентов, которые связаны с зависящими от потенциала натриевыми каналами (νϋζ и др., Ми5с1е апб Ыегуе 18, 1995, сс. 772-781). Вгшкше1ег (Вгшкше1ег и др., Ми§с1е апб Ыегуе 19, 1996, сс. 54-62) установили, что эти факторы имеют молекулярную массу менее 3 кДа, а при использовании более строгих условий оценки менее 1 кДа. На основе этого наблюдения и данных о том, что активность факторов не снижается существенно даже после инкубации СМЖ с протеазами, вышеуказанные авторы сделали заключение о том, что факторы не представляют собой ни антитела, ни цитокины.
Рассеянный склероз (М8)
Рассеянный склероз представляет собой аутоиммунное заболевание, которое поражает центральную нервную систему (головной мозг и спинной мозг). Рассеянный склероз, как правило, чаще поражает женщин, чем мужчин. Нарушение наиболее часто начинается между 20 и 40 годами, но может возникать в любом возрасте. Точная его причина неизвестна, но, вероятно, М8 является результатом поражение миелиновой оболочки, защитного материала, окружающего нервные клетки. Он представляет собой прогрессирующее заболевание, т.е. поражение усиливается с течением времени. Воспаление разрушает миелин, оставляя многочисленные области рубцовой ткани (склероз). Воспаление возникает, когда собственные иммунные клетки организма атакуют нервную систему. Воспаление приводит к тому, что нервные импульсы замедляются или блокируются, что приводит к симптомам М8. Повторяющиеся эпизоды или внезапное обострение воспаления может происходить в любой области головного и спинного мозга. Симптомы варьируются, поскольку локализация и степень атаки каждый раз изменяются. Как правило, эпизоды, сохраняющиеся в течение дней, недель или месяцев, чередуются с периодами со сниженными симптомами или бессимптомными периодами (ремиссия). Рецидивы являются обычными, хотя также может иметь место не прекращающееся развитие без периодов ремиссии.
Не ясно, что инициирует атаки. Пациенты, страдающие М8, как правило, имеют более высокое содержание иммунных клеток по сравнению со здоровым человеком, это позволяет предположить, что может играть роль иммунный ответ. Наиболее распространенные теории основываются на связанном с вирусами или генном дефекте или на комбинации их обоих. Существует также вероятность того, что заболевание имеет генетическую природу. М8 существенно чаще встречается в северной Европе, северных Соединенных Штатах, южной Австралии и Новой Зеландии, чем в других зонах. Географические исследования свидетельствуют о возможном участии факторов окружающей среды. Люди с семейным анамнезом М8 и живущие в географической зоне, в которой более высокая встречаемость М8, имеют более высокий риск возникновения заболевания.
К настоящему времени отсутствуют данные об исцелении рассеянного склероза. Однако ряд путей лечения могут замедлять развитие заболевания. Целью лечения является контроль симптомов и поддержание нормального качества жизни.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к белкам, обладающим глутаминилциклазной активностью, которые являются новыми представителями семейства белков, родственных глутаминилциклазе, включая полноразмерные белки, формы, полученные в результате альтернативного сплайсинга, субъединицы и мутанты, а также к нуклеотидным последовательностям, кодирующим их. Настоящее изобретение отно
- 6 016584 сится также к способам скрининга субстратов, взаимодействующих белков, агонистов, антагонистов или ингибиторов вышеуказанных белков, а также к фармацевтическим композициям, которые содержат белки и/или их мутанты, производные и/или аналоги и/или лиганды.
Эти новые белки, имеющие последовательности, практически подобные последовательности глутаминилциклазы (нуклеотидная последовательность представлена в БЕЦ ТО N0: 1, белковая последовательность представлена в БЕЦ ТО N0: 10), представляют собой белки (ЦРСТЬ), полученные из организма человека (обозначены также как человеческий боЦС) (СепБапк, регистрационный № ΝΜ_017659), мыши (СепБапк, регистрационный №. ΝΜ_027455), Масаса Га5С1си1ап5 (макак-крабоед) (СепБапк, регистрационный № АВ 168255), Масаса тц1айа (макак-резус) (СепВапк, регистрационный № ХМ_001110995), кошки (СепВапк, регистрационный № ХМ_541552), крысы (СепВапк, регистрационный № ХМ_001066591), коровы (СепВапк, регистрационный № ВТ026254), или их аналоги, последовательности которых идентичны/подобны по меньшей мере на 50/75% указанным последовательностям, предпочтительно идентичны/подобны на 70/85%, наиболее предпочтительно идентичны/подобны на 90/95%.
Белковые последовательности представлены в БЕЦ ТО N0: 11-18. Кроме того, описаны нуклеотидные последовательности, кодирующие эти белки (БЕЦ ПЭ N0: 2-9). В табл. 1 проиллюстрировано подобие между новыми белками и известной глутаминилциклазой. В табл. 2 проиллюстрирована идентичность между новыми белками и известной глутаминилциклазой.
Таблица 1. Подобие белковых последовательностей новых напоминающих глутаминилпептидциклотрансферазу белков и глутаминилциклазы
Источник ЦРСТЬ Человеческий белок 1зоЦС (БЕЦ ГО N0:11) Человеческая ЦС (БЕЦ ГО N0: 10)
человеческий белок 1зоЦС (БЕЦ ТО N0: И) 71,98%
М. /а5С1си1аг1к (БЕЦ ТО N0: 13) 99,48% 72,24%
Μ. ηιιιίαίίο (БЕЦ ПЭ ΝΟ: 14) 99,48% 72,24%
С. /ат г Папе (БЕЦ 10 N0: 15) 95,82% 72,31%
Источник ЦРСТЬ Человеческий белок 15оЦС (БЕЦ ΙϋΝΟ: 11) Человеческая ЦС (БЕЦ ΙϋΝΟ: 10)
К.погуе^Тсиз (БЕЦ ГО ΝΟ: 16) 95,30% 70,77%
М.тияси1из (БЕЦ ТО ΝΟ: 17) 95,04% 70,77%
В. Гаигиз (БЕЦ ΙΟ ΝΟ: 18) 96,08% 72,31%
Таблица 2. Идентичность белковых последовательностей новых напоминающих глутаминилпептидциклотрансферазу белков и глутаминилциклазы
Источник ЦРСТЬ Человеческий белок 1ноЦС (БЕЦ 10 N0: 11) Человеческая ЦС (БЕЦ Ю N0:10)
человеческий белок 18оЦС (БЕЦ ГО ΝΟ: 11) 45,24%
М. /акс1си1аг!к (БЕЦ Ш N0: 13) 98,17% 44,99%
Μ. ΜΐιΙαΙΙο (БЕЦ Ю N0: 14) 98,17% 44,99%
С. /атШаня (БЕЦ ΙΟ ΝΟ: 15) 88,51% 45,13%
В.погуе&си.з (БЕЦ ТО ΝΟ: 16) 84,33% 45,38%
М.тихси1их (БЕЦ ΙΏΝ0: 17) 84,07% 44,62%
В. (аигик (БЕЦ ТО ΝΟ: 18) 84,60% 45,64%
- 7 016584
Обнаружена высокая степень подобия, находящаяся на уровне 95-99%, и высокая степень идентичности, находящаяся на уровне 84-98%, между ОРСТЕ из различных источников (см. фиг. 2). На основе подобия последовательностей человеческой и мышиной глутаминилциклазы (см. фиг. 1), можно предположить, что эти ОРСТЕ должны иметь функции, которые включают (но, не ограничиваясь только ими) их роль в качестве ферментов. Характеристики, полученные при клонировании, экспрессии, биохимическом и молекулярном анализе, подтверждают эту гипотезу.
Схема экспрессии ОРСТЕ в ткани головного мозга, предстательной железы и легкого согласуется с их ролью в описанных ниже заболеваниях.
Ферментативная активность в качестве глутаминилциклазы демонстрирует, что активирующие или ингибирующие ОРСТЕ молекулы должны найти различное терапевтическое применение, что будет описано ниже.
Различные виды активности ОРСТЕ. представленные в настоящем описании, и схемы их экспрессии сопоставимы с их функциональными ролями в качестве физиологических регуляторов иммунной и нейроэндокринной систем посредством ферментативной модификации биохимических медиаторов типа гормонов, пептидов и хемокинов. Многочисленные функции ОС, описанные ранее на основе применения ингибиторов, могут быть частично обусловлены ее активностью и активностью подобных ей белков типа ОРСТЕ. Таким образом, исследование избирательных и эффективных ингибиторов ОС, ОРСТЕ и других родственных ферментов считается основным для достижения эффективного и безопасного фармацевтического применения этих и любых, вновь идентифицированных глутаминилпептидциклотрансфераз, а также других активных соединений, которые модифицируют функцию(и) этих белков.
Таким образом, изобретение относится к новым белкам или полипептидам, кодирующим их нуклеиновым кислотам, клеткам, модифицированным нуклеиновой кислотой таким образом, чтобы они экспрессировали указанные белки, антителам к этим белкам, способу скринингу для выявления новых терапевтических агентов, которые ингибируют активность этих белков (или которые являются ингибиторами ОС, а не этих белков), и к терапевтическим агентам, обнаруженным с помощью указанных способов скрининга. Новые белки и кодирующие их нуклеиновые кислоты можно применять для выявления новых терапевтических агентов, предназначенных для лечения определенных болезней, таких, например, как нейродегенеративных, репродуктивных, воспалительных и метаболических нарушений, а также для получения антител, имеющих терапевтическое или диагностическое значение.
Одним из объектов настоящего изобретения являются новые, зрелые, обладающие биологической активностью белки, предпочтительно человеческого происхождения. Такие белки можно выделять в небольших количествах из тканей или биологических жидкостей пригодного животного (включая человека) с помощью стандартных методов; однако более крупные количества принято получать в культурах клеток, генетически модифицированных с целью экспрессии белка.
Другим объектом настоящего изобретения являются выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, включая мРНК, ДНК, кДНК, геномные ДНК.
Следующим объектом настоящего изобретения являются также нуклеиновые кислоты-зонды, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, длина которых является достаточной для того, чтобы гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, предлагаемыми в настоящем изобретении.
Еще одним объектом настоящего изобретения являются способы применения методов рекомбинации для получения указанных полипептидов, которые можно применять для научный исследований ίη νίΐτο, например синтеза ДНК и создания ДНК-векторов. Пути получения указанных полипептидов включают культивирование рекомбинантных прокариотических и/или эукариотических клеток-хозяев, трансфектированных ДНК-векторами, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие указанный полипептид и/или зрелый белок, в условиях, усиливающих экспрессию указанного белка, и последующее выделение указанного белка или фрагмента экспрессируемого продукта.
И еще одним объектом изобретения являются способы применения полипептидов и полинуклеотидов ОРСТЕ для лечения болезней.
Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ применения указанных полипептидов или полинуклеотидов, кодирующих указанные полипептиды, для выявления соединений, которые ингибируют биологическую активность зрелых белков, например, активность ОС или активность ЕС, а также сами указанные ингибиторы.
Более конкретным объектом изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует (а) полипептид ОРСТЕ, выбранный из 8Е0 ΙΌ N0: 11-18, или (б) полипептид, аминокислотная последовательность которого подобна указанным по меньшей мере примерно на 75%, и обладающий такой же биологической функцией, или полученный в результате альтернативного сплайсинга вариант одной из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 2-9, или представляет собой зонд, содержащий по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, указанные в (а) или (б), или является комплементарной одной из вышеуказанных нуклеиновых кислот.
Следующим конкретным объектом изобретения является полипептид, который необязательно может быть гликозилированным и который (а) имеет аминокислотную последовательность зрелого белка,
- 8 016584 представленную в одной из 8ЕО ГО N0: 10-18; предпочтительно зрелого белка, последовательность которого представлена в одной из 8Е0 ГО N0: 11-18, (б) имеет аминокислотную последовательность зрелого белка, подобную по меньшей мере примерно на 75% последовательности зрелого белка, представленной в (а), и который обладает такой же биологической функцией; (в) имеет аминокислотную последовательность зрелого белка, идентичную по меньшей мере примерно на 50% последовательности зрелого белка, представленной в одной из 8Е0 ГО N0: 10-18; предпочтительно зрелого белка, последовательность которого представлена в одной из 8Е0 ГО N0: 11-18, или (д) представляет собой иммунологически реактивный фрагмент полипептида, указанного в (а).
Еще одним конкретным объектом изобретения является способ скрининга соединений, обладающих способностью ингибировать ферментативную активность по меньшей мере одного зрелого белка, предлагаемого в настоящем изобретении, предпочтительно выбранного из белков, последовательность которых представлена в 8Е0 ГО N0: 11-18, где способ заключается в том, что инкубируют зрелый белок и приемлемый субстрат для зрелого белка в присутствии одного или нескольких тестируемых соединений или их солей, оценивают ферментативную активность зрелого белка, сравнивают активность с аналогичной активностью, определенной в отсутствии тестируемого соединения, и оценивают тестируемое соединение или соединения, которое(ые) снижают ферментативную активность.
Кроме того, настоящее изобретение относится к диагностическим наборам и способам, основанным на применении ОС-ингибитора, избирательного ОС-ингибитора или избирательного ОРСТЬ-ингибитора.
Эти и другие объекты настоящего изобретения должны стать очевидными специалистам в данной области из приведенного ниже подробного описания изобретения.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - сравнительный анализ первичной структуры последовательностей человеческой ОС (ЙОС), человеческой 1коОС (Й1коОС), мышиной ОС (тОС) и мышиной коОС ОЫкоОС). Множественный сравнительный анализ первичной структуры последовательностей осуществляли с помощью программы С1ик1а1^, представленной на сайте РВ1Ь (фирма Ро1е ВютГогтаЫ|ие Ьуоппа15) (Ййр://ирка-рЫ1.1Ьср.Гг), с установкой принятых по умолчанию параметров. Консервативные связывающиеся с ионами цинка остатки выделены жирным шрифтом и подчеркнуты в человеческой ОС (ЙОС; СеиВаик Х71125, 8Е0 ГО N0: 10), человеческой 1коОС (Й1коОС, СеиВаик NΜ_017659, 8Е0 ГО N0: 11), мышиной ОС (тОС, СеиВаик НМ-027455, 8Е0 ГО N0: 79) и мышиной 1коСС (ткоОС, СеиВаик ВС058181, 8Е0 ГО N0: 17);
на фиг. 2 - сравнительный анализ первичной структуры последовательностей коОС из Ното кар1еик (ЫкоОС, СеиВаик НМ_017659, 8Е0 ГО N0: 11), Масаса ГакЫсЫапк (М_Гакс1си1апк, СеиВаик АВ168255, 8Е0 ГО N0: 13), Масаса ти1айа (М_ти1а11а, СеиВаик ХМ_001110995, 8Е0 ГО N0: 14), Сашк ГатШапк (С_ГатШаг18, СеиВаик ХМ541552, 8Е0 ГО N0: 15), Кайик иогуедкик (К_иогуед1сик, СеиВаик ХМ_001066591, 8Е0 ГО N0: 16), Мик тикси1ик (М_тикси1ик, СеиВаик ВС058181, 8Е0 ГО N0: 17) и Вок 1аигик (В_1аишк, СеиВаик ВТ026254, 8Е0 ГО N0: 18). Множественный сравнительный анализ первичной структуры последовательностей осуществляли с помощью программы С1ик1а1^, представленной на сайте РВ1Ь (фирма Ро1е ВютГогтаШ|ие Еуоииахк) (Ййр://ирка-рЫ1.1Ьср.Гг), с установкой принятых по умолчанию параметров. Аминокислоты, имеющие консервативные связывающиеся с ионами цинка остатки, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом;
на фиг. 3 - сравнительный анализ первичной структуры последовательностей человеческой ОС (ЙОС, 8Е0 ГО N0: 10) и человеческой 1коОС (ЫкоОС, 8Е0 ГО N0: 12) и других представителей М28семейства металлопептидаз С1аи МН. Множественный сравнительный анализ первичной структуры последовательностей осуществляли с помощью программы С1ик1а1^, представленной на сайте сй.ЕМВпекогд. с установкой принятых по умолчанию параметров. Консервативные связывающиеся с ионами цинка остатки выявлены в человеческой ОС (ЙОС; 8\\1кк-Рго1 016769, 8Е0 ГО N0: 10), в человеческой 1коОС (1коОС; 8\\1кк-Рго1 О53НЕ4, 8Е0 ГО N0: 12) (остатки 19-382), в Ζπ-зависимой аминопептидазе из 81тер1отусек дпкеик (8САР; 8\\1кк-Рго1 Р80561, 8Е0 ГО N0: 80) и в зрелой Ζн-зависимой лейциламинопептидазе из У1Ьтю рто1ео1уйсик (УрАР; 8\\1кк-Рго1 001693 , 8Е0 ГО N0: 81). Соответствующие аминокислотные остатки подчеркнуты и выделены жирным шрифтом;
на фиг. 4 - сравнительный анализ первичной структуры последовательностей человеческой ОС (ЙОС, 8Е0 ГО N0: 10) и человеческой 1коОС (ЫкоОС, 8Е0 ГО N0: 11), показаны два предполагаемых сайта инициации трансляции (метионина I - выделен жирным шрифтом, подчеркнут; метионина II - выделен жирным шрифтом). Множественный сравнительный анализ первичной структуры последовательностей осуществляли с помощью программы С1ик1а1^, представленной на сайте РВ1Ь (фирма Ро1е ВюшГогта1к|ие Еуоииахк) (Ййр://ирка-рЫ1лЬср.Гг), с установкой принятых по умолчанию параметров. Трансмембранный домен, присутствующий в ОС, обозначен черной полосой;
на фиг. 5 - сравнительный анализ первичной структуры последовательностей человеческой ОС (ЙОС, 8Е0 ГО N0: 10) и человеческой 1коОС (ЫкоОС, 8Е0 ГО N0: 12), начиная с метионина II (выделен жирным шрифтом). Множественный сравнительный анализ первичной структуры последовательностей осуществляли с помощью программы С1ик1а1^, представленной на сайте сЙ.ЕМВиеЕогд, с установкой принятых по умолчанию параметров. Аминокислоты, участвующие в связывании металлов, подчеркнуты
- 9 016584 и выделены жирным шрифтом. Трансмембранный домен, присутствующий в ОС, обозначен черной полосой;
на фиг. 6 - анализ экспрессии ХоОС с помощью ОТ-ПЦР. Осуществляли обнаружение в линиях клеток 8Η-8Υ5Υ, ΤΝ405, НаСаТ и Нер-02. Полосы: количество пар оснований, ДНК-стандарт; 1, амплифицированный ПЦР-продукт человеческой ХоОС из 8Η-8Υ5Υ; 2, амплифицированный ПЦР-продукт человеческой ХоОС из ΤΝ405; 3, амплифицированный ПЦР-продукт человеческой ХоОС из НаСаТ; 4, амплифицированный ПЦР-продукт человеческой коОС из Нер-02;
на фиг. 7 - анализ субклеточной локализации ХоОС (Ме1 I, 8ЕО ГО N0: 11) с помощью иммуногистохимии. Человеческую ХоОС, начинающуюся с метионина I (см. фиг. 5), экспрессировали в виде слитого белка с Е0ТР (ХоОС (МеП) Е0ЕР) в ΕΝ 405. Осуществляли контрастное окрашивание маннозидазы II с помощью АВ3712 (фирма СНеписоп). Совмещение представляет собой наложение окрашивания ХоОС (МеИ)-ЕОЕР и маннозидазы II;
на фиг. 8 - анализ субклеточной локализации ХоОС (Ме1 I, 8Е0 ГО N0: 11) с помощью иммуногистохимии. Человеческую ХоОС начинающуюся с метионина I (см. фиг. 5), экспрессировали в виде слитого белка с Е0ЕР (ХоОС (МеП) Е0ЕР) в ΕΝ 405. Осуществляли контрастное окрашивание митохондрий с помощью МАВ1273 (фирма СНеписоп). Совмещение представляет собой наложение окрашивания ХоОС (МеП)-ЕОЕР и митохондрий;
на фиг. 9 - анализ субклеточной локализации ХоОС (Ме1 II, 8Е0 ГО N0: 12) с помощью иммуногистохимии. Человеческую ХоОС, начинающуюся с метионина II, экспрессировали в виде слитого белка с Е0ЕР (ХоОС (МеШ) Е0ЕР) в ΕΝ 405. Осуществляли контрастное окрашивание маннозидазы II с помощью АВ3712 (фирма СНеписоп). Совмещение представляет собой наложение окрашивания ХоОС (МеШ)-ЕОЕР и маннозидазы II;
на фиг. 10 - анализ субклеточной локализации ХоОС (Ме1 II, 8Е0 ГО Ν0: 12) с помощью иммуногистохимии. Человеческую ХоОС, начинающуюся с метионина II, экспрессировали в виде слитого белка с Е0ЕР (ХоОС (МеШ) Е0ЕР) в ΕΝ 405. Осуществляли контрастное окрашивание митохондрий с помощью МАВ1273 (фирма СНеписоп). Совмещение представляет собой наложение окрашивания ХоОС (МеШ)Е0ЕР и митохондрий;
на фиг. 11 - анализ субклеточной локализации ХоОС (Ме1 I, 8Е0 ГО Ν0: 11) с помощью иммуногистохимии. Человеческую ХоОС начинающуюся с метионина I, экспрессировали в виде слитого белка с Е0ЕР (ХоОС (МеП) Е0ЕР) в С08-7. Осуществляли контрастное окрашивание маннозидазы II с помощью АВ3712 (фирма СНеписоп). Совмещение представляет собой наложение окрашивания ХоОС (МеП)Е0ЕР и маннозидазы II;
на фиг. 12 - анализ субклеточной локализации ХоОС (Ме1 I, 8Е0 ГО Ν0: 11) с помощью иммуногистохимии. Человеческую ХоОС начинающуюся с метионина I, экспрессировали в виде слитого белка с Е0ЕР (ХоОС (МеП) Е0ЕР) в С08-7. Осуществляли контрастное окрашивание митохондрий с помощью МАВ1273 (фирма СНеписоп). Совмещение представляет собой наложение окрашивания ХоОС (МеП)Е0ЕР и митохондрий;
на фиг. 13 - анализ субклеточной локализации ХоОС (Ме1 II, 8Е0 ГО Ν0: 12) с помощью иммуногистохимии. Человеческую ХоОС, начинающуюся с метионина II, экспрессировали в виде слитого белка с Е0ЕР (ХоОС (МеШ) Е0ЕР) в С08-7. Осуществляли контрастное окрашивание маннозидазы II с помощью АВ3712 (фирма СНеписоп). Совмещение представляет собой наложение окрашивания ХоОС (МеШ)-ЕОЕР и маннозидазы II;
на фиг. 14 - анализ субклеточной локализации ХоОС (Ме1 II, 8Е0 ГО Ν0: 12) с помощью иммуногистохимии. Человеческую ХоОС, начиная с метионина II, экспрессировали в виде слитого белка с Е0ЕР (ХоОС (МеШ) Е0ЕР) в С08-7. Осуществляли контрастное окрашивание митохондрий с помощью МАВ1273 (фирма СНеписоп). Совмещение представляет собой наложение окрашивания ХоОС (МеШ)Е0ЕР и митохондрий;
на фиг. 15 - ингибирование катализируемого человеческой ХоОС превращения Н-01п-АМС в р01иАМС с помощью ингибитора Р150/03. Данные оценивали на основе кинетической модели МихаэлисаМентена, рассматривая линейное конкурентное ингибирование. Применяли следующие концентрации ингибиторов:
Установлено, что значение К1, составляло 240 ± 8нМ;
на фиг. 16 - катализируемое человеческой ХоОС превращение Н-01п-А1а-ОН в р01и-А1а-0Н, определенное с помощью спектрофотометрического анализа. Данные оценивали на основе кинетической мо
- 10 016584 дели Михаэлиса-Ментен. Кинетические параметры составляли 324 ± 28мкМ и 7,4 ± 0,2нМ/мин для значений КМ и Утах соответственно;
на фиг. 17 - схематическое изображение конструкций человеческого белка БоРС которые экспрессировали гетерологично в дрожжах Р. райогб. В некоторые белки интродуцировали две мутации, приводящие к получению сайта гликозилирования в положении 55 (Ι55Ν) и мутантного остатка цистеина в положении 351 (С351А). Для экспрессии Ν-конец, содержащий трансмембранный домен, заменяли сигналом секреции из дрожжей (Υ88). Конструкции, содержащие Ν-концевой сигнал секреции, должны эффективно секретироваться в среду;
на фиг. 18 - данные об активности РС, которую определяли в среде дрожжевых клеток, в которых происходила экспрессиия. Из-за присутствия трансмембранного домена нативные конструкции не секретировались в среду (не применяли). В результате гликозилирования (Ι55Ν) белки наиболее эффективно секретировались. Мутация С351А приводила также к более высокой активности РС, обнаруженной в среде. Конструкции представлены на фиг. 17;
на фиг. 19 - очистка человеческой боРС, включенной в конструкцию Υ88Ы8Ο^СI55NС351А С-Ηίδ, из среды, в которой выращивали трансгенный штамм Р.райогб. РС очищали путем комбинации 1МАС (аффинная хроматография на иммобилизованном металле, полоса 3), Н1С (хроматография, основанная на гидрофобном взаимодействии, полоса 4) и обессоливания (полоса 5). Гликозилирование фермента подтверждали с помощью ферментативного дегликозилирования, что приводило к сдвигу миграции белка (полоса 6). Полоса 1, стандарт белка; полоса 2, среда до очистки;
на фиг. 20 - очистка человеческой боРС включенной в конструкцию С8Т-Н|5оРС С-Ηίδ, из клеточного гомогената трансформированных Е. сой. Белок боРС очищали путем комбинации 1МАС (аффинная хроматография на иммобилизованном металле, полоса 3), хроматографии на основе С8Т-аффинности (полоса 4), обессоливания (полоса 5) и ионообменной хроматографии (полоса 6). Полоса 1, стандарт белка; полоса 2, клеточный гомогенат до очистки. Различие в молекулярной массе Н^оРС, которую экспрессировали в дрожжах и Е. сой, обусловлено наличием слияния на Ν-конце с О8Т-меткой. Экспрессируемая конструкция схематически представлена в верхней части чертежа;
на фиг. 21 - константы специфического превращения дипептидов-заменителей (суррогатов), дипептидов и олигопептидов с помощью человеческой БоРС (Υ88Ы8Ο^СI55NС351А С-Ηίδ; ср. фиг. 17), О8ТНБоРС и человеческой РС. Специфичность С8Т-1и5оРС оказалась наименьшей, далее в порядке повышения специфичности следовала Υ88Н^5Ο^СI55NС351 А С-Нб. Наиболее высокая специфичность обнаружена у человеческой РС, что свидетельствует о более высокой общей ферментативной активности;
на фиг. 22 - зависимость катализа от значения рН, изученная с применением человеческой боРС (Н|5оРС), которую экспрессировали в дрожжах, и человеческой РС (НРС). Для обоих белков оптимум рН обнаружен между рН 7 и 8. Подбор кривых был основан на трех полученных в результате диссоциации группах, которые влияют на катализ, одна при кислом значении рН, две при основном значении рН;
на фиг. 23 - анализ превращения глутаминовой кислоты, которая присутствует на Ν-конце родственного амилоиду-β пептида Ав(3-11). Анализ осуществляли с использованием Ма1б1-То£-массспектрометрии (времяпролетная масс-спектрометрия с использованием опосредуемой матрицей лазерной десорбции/ионизации), при этом различие в соотношении молекулярной массы/заряда субстрата и продукта соответствовало несущей один заряд молекуле с молекулярной массой примерно 18 Да, представляющей собой массу высвободившейся воды. В обоих случаях в образце концентрация белка была одинаковой, что с большой долей вероятности позволяет предположить, что человеческая боРС превращает также Ν-концевую глутаминовую кислоту, но медленнее, чем человеческая РС;
на фиг. 24 - распределение в тканях мышиной РС (трС, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 79) и ее изозима тбоРС (8Ер ΙΌ ΝΟ: 17), проанализированное с помощью ПЦР в реальном времени. Оба фермента экспрессировались в анализируемых органах. Однако уровень экспрессии трС был выше в головном мозге по сравнению с периферическими органами. В отличие от этого, уровень экспрессии тбоРС во всех анализируемых органах и тканях оказался близким, что свидетельствует о том, что этом фермент представляет собой повсеместно распространенный белок домашнего хозяйства (конститутивный белок);
на фиг. 25 - зависящее от времени ингибирование человеческой боРС (НбоРС) соединениями, образующими хелатные комплексы с металлами, такими как 1,10-фенантролин (окружности) и ЭДТК (квадраты). Остаточную НбоРС-активность определяли непосредственно после добавления (закрашенные символы) или предварительной инкубации НбоРС с соответствующим реагентом в течение 15 мин при 30°С (незакрашенные символы);
на фиг. 26 - биохимический анализ субклеточной локализации рС-активности после экспрессии рсДНК и нативных ферментов НбоРС (Ме1 I, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 11), НбоРС (Ме1 II, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 12) и НРС (8Ер ΙΌ ΝΟ: 10) в НЕК293-клетках. (А)-удельная активность в клеточных фракциях в мкмолях /мин / г. (Б)-абсолютная активность в нМ/мин. (В) Экспрессия Н-боРС (Ме1 Ι, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 11), Н-боРС (Ме1 ΙΙ, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 12) и НРС (8Ер ΙΌ ΝΟ: 10), несущих С-концевую ЕБАО-метку, в НЕК293-клетах в сравнении с трансфектированным контролем вектором (рсДНК), изученная с помощью анализа методом Вестерн-блоттинга с использованием специфических антител либо к ЕБАО эпитопу (антитело к
- 11 016584
ΌΎΚΌΌΌΌΚ, фирма Се11 81дпа1шд), либо белку массой 65 кДа человеческих митохондрий (антитело к человеческим митохондриям, фирма СЬеткоп), либо к сиалилтрансферазе 8Т1САБ3 (фирма ЛЬпоуа);
на фиг. 27 - субклеточная локализация человеческой ЬоОС (ЫкоОС), несущей сигнальные последовательности (27 А) метионин I - серин 53 и (27Б) метионин II - серин 53, слитые с ЕСЕР (1, 4). Комплекс Гольджи окрашивали с помощью антитела к маннозидазе II (2), а митохондрии окрашивали с использованием антитела к белку массой 65 кДа человеческих митохондрий (5). Совместную локализацию выявляли с помощью наложения ЕСЕР-флуоресценции и Кеб Х-флуоресценции (3, 6);
на фиг. 28 - основная структура человеческой ЬоОС (ЫкоОС) и мышиной ЬоОС (шйоОС) в сравнении с опубликованными последовательностями человеческих гликозилтрансфераз: альфа-Νацетилгалактозаминид-альфа-2,6-сиалилтрансфераза 1 (8Т6СаШАС1; К.Ф. 2.4.99.3); бета-1,4-галактозилтрансфераза 1 (Ь4Са1-Т1, К.Ф. 2.4.1.-); галактозид-3(4)-Ь-фукозилтрансфераза (ЕисТ-Ш; К.Ф. 2.4.1.65) и гликопротеин-фукозилгалактозид-альфа-№ацетилгалактозаминилтрансфераза (Ν АСАТ, К.Ф.2.4.1.40). Количество аминокислот указано под колонками. Цитозольная часть затенена, трансмембранная спираль окрашена черным цветом, а находящая в полости часть обозначена белым цветом;
на фиг. 29 - количественная оценка мРНК человеческой ЬоОС (ОРСТЬ) в различных линиях клеток карциномы. Экспрессию ОРСТЬ стандартизовали относительно 50 нг общей РНК. Черными полосами внутри прямоугольников обозначены соответствующие медианы;
на фиг. 30 - количественная оценка экспрессии мРНК человеческой ЬоОС (ОРСТЬ) в различных линиях клеток меланомы. Экспрессию ОРСТЬ стандартизовали относительно 50 нг общей РНК;
на фиг. 31 - количественная оценка экспрессии мРНК человеческой ЬоОС (ОРСТЬ) в образцах карциномы мягких тканей, карциномы желудка и карциномы щитовидной железы различных пациентов. Экспрессию ОРСТЬ стандартизовали относительно 50 нг общей РНК. Черными полосами внутри прямоугольников обозначены соответствующие медианы;
на фиг. 32 - количественная оценка экспрессии мРНК человеческой ЬоОС (ОРСТЬ) в различных желудочных карциномах на различных стадиях дифференцировки. Экспрессию ОРСТЬ стандартизовали относительно 50 нг общей РНК. Черными полосами внутри прямоугольников обозначены соответствующие медианы;
на фиг. 33 - сравнение экспрессии мРНК человеческой ОС (ОРСТ) в различных карциномах щитовидной железы. Экспрессию ОРСТ стандартизовали относительно 50 нг общей РНК. Черными полосами внутри прямоугольника обозначены соответствующие медианы (ЕТС: фолликулярный рак щитовидной железы; РТС: папиллярный рак щитовидной железы; ИТС: недифференцированный рак щитовидной железы);
на фиг. 34 - сравнение уровней экспрессии мРНК человеческой ЬоОС (ОРСТЬ) в различных карциномах щитовидной железы. Экспрессию ОРСТ стандартизовали относительно 50 нг общей РНК. Черными полосами внутри прямоугольников обозначены соответствующие медианы (ЕТС: фолликулярный рак щитовидной железы; РТС: папиллярный рак щитовидной железы; ИТС: недифференцированный рак щитовидной железы);
на фиг. 35 - влияние различных стимулов на экспрессию мРНК человеческой ОС (ОРСТ), человеческой ЬоОС (ОРСТЬ) и ССЬ2 в НЕК293-клетках. Количество транскриптов обозначено относительно основного уровня экспрессии без стимулов. Применяемая концентрация стимула показана на оси абсцисс;
на фиг. 36 - влияние различных стимулов на экспрессию мРНК человеческой ОС (ОРСТ), человеческой ЬоОС (ОРСТЬ) и ССЬ2 в ЕТС-133-клетках. Количество транскриптов обозначено относительно основного уровня экспрессии без стимулов. Применяемая концентрация стимула показана на оси абсцисс;
на фиг. 37 - влияние различных стимулов на экспрессию мРНК человеческой ОС (ОРСТ), человеческой ЬоОС (ОРСТЬ) и ССЬ2 в ТНР-1-клетках. Количество транскриптов обозначено относительно основного уровня экспрессии без стимулов. Применяемая концентрация стимула показана на оси абсцисс;
на фиг. 38 - влияние различных стимулов на экспрессию мРНК человеческой ОС (ОРСТ), ССЬ2, ССЬ7, ССЬ8 и ССЬ13 в ТНР-1-клетках. Количество транскриптов обозначено относительно основного уровня экспрессии без стимулов. Применяемая концентрация стимула показана на оси абсцисс;
на фиг. 39 - влияние гипоксии на уровень мРНК человеческой ОС (ОРСТ), человеческой ЬоОС (ОРСТЬ) и ШЕ1а в НЕК29- (А), ЕТС-133- (Б) и ТНР-1-клетках (В).
- 12 016584
Перечень последовательностей
8ЕВ Ιϋ ΝΟ Описание
1 человеческая ВС, нуклеиновая кислота
2 человеческая 150ВС Ме1 I, нуклеиновая кислота
3 человеческая ЬоВС Ме1 II, нуклеиновая кислота
4 Масаса (азсгсгйапа ВРСТЬ, нуклеиновая кислота
5 Масаса тп/аг(а ВРСТЬ, нуклеиновая кислота
6 Сси-ιίχ/атШапз ВРСТЬ, нуклеиновая кислота
7 крысиная ВРСТЬ, нуклеиновая кислота
8 мышиная ВРСТЬ, нуклеиновая кислота
9 бычья ВРСТЬ, нуклеиновая кислота
10 человеческая ВС, белок
И человеческая ίβοΒΟ Ме( I, белок
12 человеческая ЕоВС Ме1 И, белок
13 Масаса [аасгсМаггз ВРСТЬ, белок
14 Масаса ти1аИа ВРСТЬ, белок
15 Сатх /атШапх ВРСТЬ, белок
16 крысиная ВРСТЬ, белок
17 мышиная ВРСТЬ, белок
18 бычья ВРСТЬ, белок
19 человеческая 1зорС, полученная в результате сплайсинга форма 1, нуклеиновая кислота
20 человеческая 15ОРС, полученная в результате сплайсинга форма 2, нуклеиновая кислота
21 человеческая 1зоВС, полученная в результате сплайсинга форма 1, белок
22 человеческая 18ОВС, полученная в результате сплайсинга форма 2, белок
23 амилоидный бета-пептид (Абета) (1-42)
24 Абета (1-40)
25 Абета (3-42)
26 Абета (3-40)
27 Абета (11-42)
28 Абета (11-40)
29 р61и3-Абета (3-42)
30 рО1и3-Абета (3-40)
31 рО1и3-Абета(11~42)
32 р<31и3-Абета (11-40)
33 АЬп
34 Абап
35 гастрин 17
36 гастрин 34
37 р61и-АЬп
38 рСИи-Абап
39 рО1и-гастрин 17
40 рО1и-гастрин 34
41 нейротензин
42 СиКН
43 ССЫ6
44 ССЬ8
45 ССЬ2
46 ССЬ18
47 фракталкин
48 ССЬ7
49 орексин А
50 вещество Р
51 ΒΥΝΑϋ
52 рСНи-ΥΝΑϋ
53 человеческой 1зоВС «прямой» праймер, применяемый для | скрининга клеточных линий
- 13 016584 человеческой ЬоОС «обратный» праймер, применяемый для скрининга клеточных линий
55 «прямой» праймер, применяемый для выделения человеческой 1зоОС
56 «обратный» праймер, применяемый для выделения человеческой 1зо()С
57 «прямой» праймер, применяемой для клонирования человеческой 18оЦС (изоформа Ме11) в векторе ρΕΟΡΡ-Ν3
58 «обратный» праймер, применяемый для клонирования человеческой ЕорС (изоформа Ме1 II) в векторе ρΕΟΡΡ-Ν3
59 «обратный» праймер, применяемый для клонирования человеческой 150<2С (изоформы Ме11 и Ме( II) в векторе ρΕΟΡΡ-Ν3
60 «прямой» праймер, применяемый для клонирования человеческой ЕоОС в векторе рЕТ41а
61 «обратный» праймер, применяемый для клонирования человеческой ЕоЦС в векторе рЕТ41а
62 «прямой» праймер, применяемый для клонирования человеческой 1зорС в векторе ρΡΙ€ΖπΑ с С-концевой гистидиновой меткой
63 «прямой» праймер, применяемый для клонирования человеческой 13о(}С в векторе ρΡΙΟΖαΑ с Ν-концевой гистидиновой меткой
64 «обратный» праймер, применяемый для клонирования человеческой 1зорС в векторе ρΡΙΟΖαΑ с Ν-концевой гистидиновой меткой
65 «прямой» праймер для анализа 1зо<2С с помощью ПЦР в реальном времени
66 «обратный» праймер, применяемый для клонирования человеческой 130<2С в векторе ρΡΙΟΖαΑ с С-концевой гистидиновой меткой
67 «обратный» для анализа с помощью ПЦР в реальном времени 18ОЦС
68 «прямой» праймер, применяемый для клонирования кДНК МЫШИНОЙ 13О<2С
69 «обратный» праймер, применяемый для клонирования кДНК мышиной 1зоОС
70 «прямой» праймер, применяемый для клонирования кДНК мышиной 1зо<2С
71 «прямой» праймер для анализа мышиной (}С с помощью ПЦР в реальном времени
72 «обратный» праймер для анализа мышиной с помощью ПЦР в реальном времени
73 «прямой» праймер для анализа мышиной рС с помощью ПЦР в реальном времени
74 «обратный» праймер для анализа мышиной ¢0 с помощью ПЦР в реальном времени
75 «прямой» праймер для сайт-направленного мутагенеза ЬЕоОС Ι55Ν
76 «обратный» праймер для сайт-направленного мутагенеза ЫзоЦС Ι55Ν
77 «прямой» праймер для сайт-направленного мутагенеза УпзоОС С351А
78 «обратный» праймер для сайт-направленного мутагенеза ЫзорС С351А
79 белок мышиной глутаминилциклазы '
80 80АР 81гер1отусе5 %ггхеиз
81 УрАР ΚίδΗο рго1ео1уНсия
82 «прямой» праймер для встраивания нативной ЬЦС в ροϋΝΑ 3.1
83 «обратный» праймер для встраивания нативной ЬОС в ρεΠΝΛ 3.1
84 «обратный» праймер для амплификации ЫзорС, включая стопкодон для инсерции в рсОКА 3.1
85 «прямой» праймер для амплификации ЕОРР
86 «обратный» праймер для амплификации ЕОРР
87 «обратный» праймер для амплификации Ν-концевой последовательности ЫзоОС для слияния с ЕОРР
88 «обратный» праймер для амплификация 11ЦС С-РЬАО для встраивания в ροΟΝΑ 3.1
89 «обратный» праймер для амплификации ЫзоС)С С-РЬАО для встраивания в ρεΙΙΝΑ 3.1
Подробное описание изобретения
Одним из объектов настоящего изобретения являются выделенные нуклеотидные последовательности (полинуклеотиды), представленные в ЯЕЦ ΙΌ N0: 2-9, 19 и 20, которые кодируют зрелые полипептиды, имеющие выведенные аминокислотные последовательности ОРСТЬ из различных источников (8Е0
- 14 016584
ΙΌ N0: 11-18,21 и 22).
Предпочтительными согласно настоящему изобретению являются выделенные нуклеотидные последовательности (полинуклеотиды), представленные в БЕО ΙΌ N0: 2 и 3, 19 и 20, которые кодируют зрелые полипептиды, имеющие выведенные аминокислотные последовательности человеческих ОРСТЬ (БЕО Ш N0: 11 и 12, 21 и 22).
Более предпочтительными согласно настоящему изобретению являются выделенные нуклеотидные последовательности (полинуклеотиды), представленные в БЕО Ш N0: 2 и 3, которые кодируют зрелые полипептиды, имеющие выведенные аминокислотные последовательности человеческих ОРСТЬ, представленные в БЕО ΙΌ N0: 11 и 12.
Еще более предпочтительными согласно настоящему изобретению являются выделенные нуклеотидные последовательности (полинуклеотиды), представленные в БЕО ΙΌ N0: 19 и 20, которые кодируют зрелые полипептиды, имеющие выведенные аминокислотные последовательности, которые представляют собой полученные в результате альтернативного сплайсинга формы последовательностей человеческих, представленные в ОРСТЬ БЕО ΙΌ N0: 21 и 22.
Наиболее предпочтительной согласно настоящему изобретению является выделенная нуклеотидная последовательность (полинуклеотид) БЕО Ш N0: 2, которая кодирует зрелый полипептид, имеющий выведенную аминокислотную последовательность человеческой ОРСТЬ, представленную в БЕО ΙΌ N0: 11.
Еще более предпочтительной согласно настоящему изобретению является выделенная нуклеотидная последовательность (полинуклеотид) БЕО ΙΌ N0: 3, которая кодирует зрелый полипептид, имеющий выведенную аминокислотную последовательность человеческой ОРСТЬ, представленную в БЕО ΙΌ N0: 12.
Указанные выше варианты осуществления изобретения и их предпочтительные варианты относятся к нуклеиновым кислотам ОРСТЬ, а также к белкам ОРСТЬ и к любому требуемому способу их применения для диагностики, лечения, скрининга, в качестве эффекторов, ингибиторов и в других вариантах применения и согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении.
Полинуклеотиды, предлагаемые в настоящем изобретении, открыты на основе изучения подобия с использованием программы для поиска нуклеотидов ВЬАБТ фирмы NСΒI (1Шр://\\л\лу.псЫ.п1т.пП1.доу/ ВЬАБТ/) с использованием человеческой ОС в качестве матрицы. Поиск привел к открытию предполагаемой ОРСТЬ на хромосоме 19, кодирующая область которой представляет собой 19с|13.32. На основе поиска были сконструированы праймеры для скрининга человеческой ВоОС в клеточных линиях (табл. 4). Выделенная кДНК человеческой ОРСТЬ содержит открытую рамку считывания, кодирующую состоящий из 382 аминокислот белок, родственный человеческой ОС, последовательность которого идентична ей на 45,24% и подобна на 71,98%. Применение различных биоинформационных алгоритмов (\\л\л\'.ехра5у.с11) для предсказания субклеточной локализации не привело к получению достоверного результата. В соответствии с прогнозом, вероятно, местом локализации является комплекс Гольджи или митохондрии.
Сравнительный анализ первичной структуры аминокислотной последовательности человеческой ОРСТЬ и других представителей М28-семейства металлопептидаз С1ап МН позволил установить, что белок человеческой ОРСТЬ гомологичен на уровне всей последовательности и структуры с человеческой и мышиной ОС (фиг. 1) и с бактериальными аминопептидазами (фиг. 3). Поиск в базах данных дополнительных генов, родственных генам человеческой ОРСТЬ, показал присутствие ОРСТЬ у грызунов, обезьян, коров и собак. Сравнительный анализ первичной структуры этих последовательностей и новой человеческой ОРСТЬ показал, что они обладают выраженной гомологией с их человеческой копией. Образующие комплексы с цинком остатки человеческой ОС (Л5р-С1и-НВ) являются консервативными в ОРСТЬ различного происхождения (фиг. 2).
Ген человеческой коОС содержит по меньшей мере 8 экзонов. Последовательность, кодирующая человеческий белок коОС, локализована на экзонах 1-7. Человеческая ВоОС картируется на хромосоме 19 в положении 19с.|13.32. Скрининг клеточных линий в отношении человеческой ВоОС доказал наличие транскриптов в клетках, полученных из печени (Нер-02, печеночно-клеточная карцинома), кожи (НаСаТ, кератиноциты) и нейронной ткани (ЬШ05. астроцитома; БН-БУ5У, нейробластома) (фиг. 6).
Функциональную экспрессию выделенной кДНК ОРСТЬ оценивали в нескольких хозяевах, в которых имела место экспрессия. Экспрессия в Р. раЧогВ, которую с успехом применяли для человеческой ОС, не позволила получить обладающий ферментативной активностью белок. Экспрессия в клетках млекопитающих привела к получению активности, однако уровни экспрессии оказались очень низкими. Таким образом, выделение обладающего ферментативной активностью белка оказалось невозможным на основе известных в данной области данных. Обладающий ферментативной активностью белок выделяли только после экспрессии слитого белка СБТ-ОРСТЬ в Е. со11 с использованием нетрадиционных условий экспрессии: экспрессия в течение 4 ч при 37°С в присутствии 1% глюкозы, индукция экспрессии с помощью 20мкМ ИПТГ.
Эти условия экспрессии позволили получить экспрессию невысокого уровня в Е со11, необходимую для функциональной складчатости пептидной цепи.
- 15 016584
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения являются животные с выключенной ЭРСТЕ предпочтительно крысы или мыши. Использование мышей с выключенной РРСТЬ для дополнительного анализа функции генов ЭРСТЬ является ценным инструментом.
Полинуклеотиды. предлагаемые в настоящем изобретении. могут иметь форму РНК или форму ДНК; следует понимать. что ДНК включают кДНК. геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной и. если является одноцепочечной. может представлять собой кодирующую цепь или некодирующую (антисмысловую) цепь. Кодирующая последовательность. которая кодирует зрелый полипептид. может быть идентична кодирующей последовательности. представленной в 8ЕС ΙΌ N0: 2-9. или может отличаться от кодирующей последовательности. которая кодирует такой же зрелый полипептид. в результате избыточности или вырожденности генетического кода или полиморфизма одного нуклеотида. Например. она может представлять собой также РНК-транскрипт. который включает полноразмерную любую из последовательностей. представленных в 8ЕС ΙΌ N0: 1118.
Полинуклеотиды. которые кодируют зрелые белки. имеющие последовательность. представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 2-9. могут включать (но. не ограничиваясь только ими) кодирующую последовательность только зрелого белка; кодирующую последовательность зрелого полипептида плюс дополнительную кодирующую последовательность. например лидерную или секреторную последовательность. или последовательность пробелка; и кодирующую последовательность зрелого белка (и необязательно дополнительную кодирующую последовательность) плюс некодирующую последовательность. например. интроны или некодирующую последовательность на 5'- и/или З'-конце кодирующей последовательности зрелого белка.
Таким образом. следует понимать. что понятие полинуклеотид. кодирующий полипептид или нуклеиновая кислота. кодирующая полипептид относится к полинуклеотиду или нуклеиновой кислоте. который/которая включает только кодирующую последовательность зрелого белка. а также который/которая включает дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность. Понятие полинуклеотиды и нуклеиновые кислоты используют взаимозаменяемо.
Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам. в которых кодирующая последовательность зрелого белка может быть слита в одной и той же рамке считывания с полинуклеотидной последовательностью. которая способствует экспрессии и секреции полипептида из клетки-хозяина; например. может быть слита с лидерной последовательностью. которая функционирует в качестве секреторной последовательности для контроля транспорта полипептида из клетки-хозяина. Полипептид. несущий указанную лидерную последовательность. обозначают как пребелок и препробелок. и он может иметь лидерную последовательность. которая отщепляется под воздействием клетки-хозяина с образованием зрелой формы белка. Эти полинуклеотиды могут иметь удлиненную 5'-область. в результате чего они кодируют пробелок. представляющий собой зрелый белок плюс дополнительные аминокислотные остатки на Ν-конце. Экспрессионный продукт. имеющий такую пропоследовательность. обозначают как пробелок. который представляет собой неактивную форму зрелого белка; однако после расщепления пропоследовательности остается зрелый белок. Так. например. полинуклеотиды. предлагаемые в настоящем изобретении. могут кодировать зрелые белки или белки. имеющие пропоследовательность. или белки. имеющие и пропоследовательность. и препоследовательность (лидерная последовательность).
Полинуклеотиды. предлагаемые в настоящем изобретении. могут иметь также кодирующую последовательность. слитую в рамке считывания с маркерной последовательностью. которая позволяет осуществлять очистку полипептидов. предлагаемых в настоящем изобретении. Маркерная последовательность может представлять собой полигистидиновую метку. гемагглютининовую (НА) метку. с-тус-метку или У5-метку. когда в качестве хозяина применяют клетку млекопитающего. например С08-1-клетки.
НА-метка должна соответствовать эпитопу. выведенному из белка гемагглютинина гриппа (ΧνίΕοη I. и др.. Се11. 37. 1984. с. 767). а с-тус-метка может представлять собой эпитоп из человеческого Мусбелка (Еуапк 6. I. и др.. Μοί. Се11. Βίο1.5. 1985. сс. 3610-3616).
Понятие ген означает сегмент ДНК. участвующий в образовании полипептидной цепи; он включает области. расположенные перед кодирующей областью и позади нее (лидер и хвост). а также последовательности (интроны). лежащие между индивидуальными кодирующими сегментами (экзоны).
Понятие выраженная гомология последовательностей означает. что по меньшей мере 25%. предпочтительно по меньшей мере 40%. аминокислотных остатков являются консервативными и что из неконсервативных остатков по меньшей мере 40% представляют собой консервативные замены.
Фрагменты полноразмерных генов. предлагаемых в настоящем изобретении. можно использовать в качестве зондов для гибридизации библиотек кДНК с целью выделения полноразмерной кДНК. а также выделения других кДНК. которые имеют выраженную гомологию последовательностей с геном и должны кодировать белки или полипептиды. имеющие сходную биологическую активность или функцию. Под сходной биологической активностью или функцией для целей настоящего описания понимают способность образовывать пироглутамат из Ν-концевого глутамина или глутаминовой кислоты пептидов. белков. гормонов или других субстратов. т.е. РС- и ЕС-активность соответственно. Указанный зонд такого типа содержит по меньшей мере 14 оснований (по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов из одной
- 16 016584 из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 2-9), предпочтительно по меньшей мере 30 оснований, и может содержать, например, 50 или большее количество оснований. Предпочтительными являются зонды, имеющие последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 53-61. Такой зонд можно применять также для идентификации клона кДНК, соответствующего первичному транскрипту и/или геномному клону или клонам, которые содержат полный ген, включая регуляторные и промоторные области, экзоны и интроны. Меченые олигонуклеотиды, имеющие последовательность, комплементарную последовательности гена, предлагаемого в настоящем изобретении, применяют для скрининга библиотеки человеческих кДНК, геномных ДНК или мРНК или подобных библиотек из других источников или животных для локализации представителей библиотек, с которыми зонд гибридизуется. Например, известную последовательность ДНК можно применять для синтеза олигонуклеотидного зонда, который затем используют для скрининга библиотеки с целью выделения кодирующей области представляющего интерес гена.
Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, которые гибридизуются с указанными выше последовательностями, если существует по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 90% и более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность или подобие между последовательностями, и в результате кодируют белки, обладающие сходной биологической активностью. Кроме того, как известно в данной области, существует подобие между двумя полипептидами, когда аминокислотные последовательности содержат одинаковые или консервативные замены каждого индивидуального остатка в последовательности. Идентичность и подобие можно оценивать с помощью программы для анализа последовательностей (например, С1и51а1\У фирмы РВ1Ь (Ро1е ВютГогта1к|ие Ьуоппай) 1Шр://пр5а-рЫ1аЬср.Гг). Настоящее изобретение относится, в частности, к таким полинуклеотидам, которые гибридизуются в строгих условиях с вышеописанными полинуклеотидами. В контексте настоящего описания понятие строгие условия означает условия, обеспечивающие гибридизацию между полинуклеотидными последовательностями и полинуклеотидными последовательностями, представленными в 8Е0 ΙΌ N0: 2-9, когда имеет место по меньшей мере примерно 70% идентичность.
Приемлемые по строгости условия можно определять, например, по концентрациям соли или формамида в растворе до гибридизации и в растворе для гибридизации или по температуре гибридизации, и они хорошо известны в данной области. В частности, строгость можно повышать путем снижения концентрации соли, повышения концентрации формамида и/или повышения температуры гибридизации.
Например, для гибридизации в строгих условиях можно применять формамид в концентрации примерно 50% при температуре примерно от 37 до 42°С, а для гибридизации в условиях пониженной строгости можно применять формамид в концентрации примерно от 35 до 25% при температуре примерно от 30 до 35°С. Один из конкретных вариантов условий для гибридизации в строгих условиях предусматривает использование температуры 42°С, 50%-ного формамида, 5х88РЕ, 0,3% ДСН и 200 мкг/мл фрагментированной и денатурированной ДНК спермы лосося. Для гибридизации в условиях пониженной строгости можно применять условия, аналогичные вышеуказанным, но используя 35%-ный формамид при пониженной температуре 35°С. Диапазон температур, соответствующий конкретному уровню строгости, можно дополнительно сужать, рассчитывая соотношение пуриновых и пиримидиновых оснований в представляющей интерес нуклеиновой кислоте и регулируя соответствующим образом температуру. Вариации вышеуказанных диапазонов и условий хорошо известны в данной области. Предпочтительно гибридизация должна происходить только в том случае, когда имеет место по меньшей мере 95% и более предпочтительно по меньшей мере 97% идентичность последовательностей. Полинуклеотиды, которые гибридизуются с описанными выше полинуклеотидами, в предпочтительном варианте осуществления изобретения кодируют полипептиды, которые обладают практически такой же биологической функцией или активностью, что и зрелый белок, кодируемый одной из кДНК, последовательность которых представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 2-9.
Как отмечалось ранее, приемлемый полинуклеотидный зонд может иметь по меньшей мере 14 оснований, предпочтительно 30 оснований и более предпочтительно по меньшей мере 50 оснований и должен гибридизоваться с полинуклеотидом, предлагаемым в настоящем изобретении, который идентичен ему, как указано выше, и который может сохранять или не сохранять активность. Например, указанные полинуклеотиды можно применять в качестве зонда для гибридизации с полинуклеотидами, последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 2- 9 соответственно, например, для выделения указанного полинуклеотида, или в качестве диагностического зонда или в качестве ПЦР-праймера. Таким образом, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, идентичным по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 90% и более предпочтительно по меньшей мере на 95% полинуклеотиду, который кодирует полипептиды, последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 11-18 соответственно, а также их фрагментам, где фрагменты предпочтительно имеют по меньшей мере 30 оснований и более предпочтительно по меньшей мере 50 оснований, и к полипептидам, кодируемым указанными полинуклеотидами.
Как хорошо известно в данной области, генетический код является избыточным в том смысле, что определенные аминокислоты кодируются более чем одним нуклеотидным триплетом (кодон), и изобретение относится к тем полинуклеотидным последовательностям, которые кодируют одни и те же аминокислоты с помощью кодонов, отличных от тех, которые в качестве конкретного примера указаны в при- 17 016584 веденных в описании последовательностях. Указанные полинуклеотидные последовательности обозначают как эквивалентные полинуклеотидные последовательности. Настоящее изобретение включает также варианты описанных выше полинуклеотидов, которые кодируют фрагменты, такие как часть или весь зрелый белок, аналоги и производные одного из полипептидов, имеющих выведенные аминокислотные последовательности, представленные в 8Е0 Ш N0: 11-18. Варианты полинуклеотидов могут представлять собой встречающийся в естественных условиях аллельный вариант полинуклеотидов или не встречающийся в естественных условиях аллельный вариант полинуклеотидов. Например, вариант нуклеиновой кислоты может просто иметь различие в последовательности кодона аминокислоты, являющееся результатом вырожденности генетического кода, или может представлять собой полученные в результате делеции варианты, полученные в результате замены варианты или полученные в результате инсерции варианты. Как известно в данной области, аллельный вариант представляет собой альтернативную форму полинуклеотидной последовательности, которая может иметь замену, делецию или добавление одного или нескольких нуклеотидов, которые не приводят к заметному изменению биологической функции кодируемого полипептида.
Настоящее изобретение относится также к полипептидам, которые имеют выведенную аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 Ш N0: 11-18, а также к фрагментам, аналогам и производным таких полипептидов. Понятия фрагмент, производное и аналог касательно полипептидов, последовательности которых представлены в 8Е0 Ш N0: 11-18, означает полипептиды, которые сохраняют в основном такую же биологическую функцию или активность указанных полипептидов. Аналог может, например, включать пробелок, которые может активироваться в результате отщепления участка пробелка с образованием активного зрелого белка. Полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой рекомбинантные полипептиды, встречающиеся в естественных условиях полипептиды или синтетические полипептиды; однако они предпочтительно представляют собой рекомбинантные полипептиды, гликозилированные или негликозилированные.
Фрагмент, производное или аналог полипептида, которые соответствуют одной из последовательностей, представленных в 8Е0 Ш N0: 11-18, может представлять собой (I) фрагмент, производное или аналог полипептида, в котором один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком) и такой замененный аминокислотный остаток может кодироваться или не кодироваться одним генетическим кодом, или (II) в котором один или несколько аминокислотных остатков включает группузаместитель, или (III) в котором дополнительные аминокислоты слиты со зрелым белком, такие как лидерная или секреторная последовательность, или последовательность, которую применяют для очистки зрелого полипептида или последовательности пробелка. Подразумевается, что такие фрагменты, производные и аналоги, известные в данной области, можно получать на основе данных, приведенных в настоящем описании.
Полипептиды и полинуклеотиды, предлагаемые в настоящем изобретении, могут находиться в выделенной форме и предпочтительно их очищают до практически гомогенного или чистого состояния. Под практически гомогенным состоянием подразумевают чистоту, составляющую по меньшей мере примерно 85%.
Понятие выделенный применяют для обозначения того, что материал удален из его естественного окружения (например, его природного окружения, если он встречается в естественных условиях). Например, встречающийся в естественных условиях полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом организме, не рассматривается как выделенный, но этот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от практически всех совместно существующих материалов в естественной системе, рассматривается как выделенный. Для ДНК понятие включает, например, рекомбинантную ДНК, включенную в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус или в геномную ДНК прокариот или эукариот; или существующую в виде индивидуальной молекулы (например, фрагмент кДНК или фрагмент геномной ДНК, полученный с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или расщепления рестриктазами), не зависящей от других последовательностей. Понятие включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительную полипептидную последовательность, например слитый белок. Оно включает также рекомбинантную ДНК, которая несет фрагмент нуклеотидов, представленных в 8Е0 Ш N0: 2-9, который кодирует полученный в результате альтернативного сплайсинга вариант ОРСТЕ. Примеры различных полученных в результате альтернативного сплайсинга вариантов представлены в 8Е0 Ш N0: 19-22.
Полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, включают любой из полипептидов, представленных в 8Е0 Ш N0: 11-18 (в частности, зрелые белки), а также полипептиды, подобные по меньшей мере на 75% (например, идентичные предпочтительно по меньшей мере на 50% и более, предпочтительно по меньшей мере на 70%) одному из полипептидов, представленных в 8Е0 Ш N0: 11-18, более предпочтительно подобные по меньшей мере на 85% (например, предпочтительно идентичные по меньшей мере на 70%) одному из полипептидов, представленных в 8Е0 Ш N0: 11-18, и наиболее предпочтительно подобные по меньшей мере на 95% (например, идентичные предпочтительно по меньшей мере на 90%) одному из полипептидов, представленных в 8Е0 Ш N0: 11-18. Кроме того, они должны предпоч
- 18 016584 тительно включать правильные участки указанных полипептидов, содержащих последовательность, состоящую по меньшей мере из 30 аминокислот и более, предпочтительно по меньшей мере из 50 аминокислот.
Фрагменты или участки полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, можно применять в качестве промежуточных продуктов для получения соответствующих полноразмерных полипептидов путем пептидного синтеза. Фрагменты или участки полинуклеотидов, предлагаемых в настоящем изобретении, можно применять также для синтеза полноразмерных полинуклеотидов, предлагаемых в настоящем изобретении.
Настоящее изобретение относится также к векторам, которые включают указанные полинуклеотиды, клеткам-хозяевам, которые создают с помощью генной инженерии с использованием указанных векторов, и к получению полипептидов методами рекомбинации с использованием вышеуказанных векторов. Клетки-хозяемва создают методами генной инженерии (путем трансдукции или трансформации или трансфекции) с использованием таких векторов, которые могут представлять собой, например, клонирующий вектор или экспрессионный вектор. Вектор может иметь, например, форму плазмиды, вирусной частицы, фага и т.д. Сконструированные клетки-хозяева можно культивировать в общепринятых питательных средах, модифицированных при необходимости для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, предлагаемых в настоящем изобретении. Условия культивирования, такие как температура, значение рН и т.п., представляют собой условия, обычно применяемые для клеток-хозяев, отобранных для экспрессии, которые также хорошо известны обычным специалистам в данной области.
Полинуклеотиды, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для получения полипептидов методами рекомбинации. Так, например, полинуклеотиды можно встраивать в любой из широкого разнообразия экспрессионных векторов с целью экспрессии полипептидов. Указанные векторы включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, например производные δν40; бактериальные плазмиды; фаговые ДНК; бакуловирусы; плазмиды на основе дрожжей; векторы, полученные из комбинаций плазмид и фаговых ДНК, вирусные ДНК, такие как вирус кори, аденовирус, вирус оспы птиц и вирус псевдобешенства. Однако можно применять любой другой вектор, если он обладает способностью реплицироваться и является жизнеспособным в хозяине.
Соответствующую последовательность ДНК можно встраивать в вектор с помощью любой из широкого разнообразия процедур. В целом, последовательность ДНК встраивают в соответствующий(ие) сайт(ы), распознаваемый(ые) рестриктазами, с помощью методик, которые должны быть известны специалистам в данной области.
Последовательность ДНК в экспрессионном векторе функционально связывают с соответствующей(ими), контролирующей(ими) экспрессию последовательностью(ями) (промотор) для обеспечения синтеза мРНК. Репрезентативными примерами таких промоторов, которые следует упомянуть, являются: промотор ЬТК или δν40, промотор Е. сой 1ас или 1гр, промотор фага лямбда Р.киЬ.Ь и другие промоторы, для которых известна способность контролировать экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах.
Экспрессионные векторы должны содержать также сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор может содержать также соответствующие последовательности для амплификации экспрессии. Кроме того, экспрессионные векторы предпочтительно содержат один или несколько селектируемых маркерных генов для придания фенотипического признака для отбора трансформированных клеток-хозяев, такие как ген дегидрофолатредуктазы и ген, обусловливающий устойчивость к неомицину, для культуры эукариотических клеток, или гены, обусловливающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину, для Е. сой.
Вектор, содержащий соответствующую последовательность ДНК, указанную выше, а также соответствующий промотор или контролирующую последовательность, можно применять для трансформации соответствующей клетки-хозяина с целью экспрессии белка. В качестве репрезентативных примеров соответствующих хозяев следует упомянуть: клетки бактерий, такие как Е. сой, δΐ^ерΐοтусек, δа1тοηе11а (урЫтигшт; клетки грибов, такие как дрожжи; клетки насекомых, такие как Огокорййа δ2 и δрοбοрΐе^а δΓ9; клетки животных, такие как СНО, СОδ или меланома Боуэса; аденовирусы; клетки растений и т.д. Выбор соответствующего хозяина должен быть очевиден специалистам в данной области на основе представленной в настоящем описании информации.
Получение нуклеотидных последовательностей с помощью синтеза хорошо известно в данной области, в частности описано в каталоге фирмы СЬО№ТЕСН 95/96, сс. 215-216, СЬО№ТЕСН, 1020 Еак! Меаботе С1гс1е, Ра1о Айо, СайГ. 94303. Таким образом, настоящее изобретение относится также к экспрессионным векторам, которые можно применять для получения белков, предлагаемых в настоящем изобретении. Настоящее изобретение относится также к рекомбинантным конструкциям, содержащим одну или несколько последовательностей, которые в целом описаны выше. Конструкции могут содержать вектор, такой как плазмидный или вирусный вектор, в который встроена последовательность, предлагаемая в изобретении, в прямой или обратной ориентации. В предпочтительном аспекте этого варианта осуществления изобретения конструкция содержит также регуляторные последовательности, включая,
- 19 016584 например, промотор, функционально связанный с последовательностью. Специалистам в данной области известно широкое разнообразие приемлемых векторов и промоторов, и они поступают в продажу. В качестве примера можно упомянуть следующие векторы: бактериальные: рЦЕ70, рЦЕ60, рЦЕ-9 (фирма Ц1адеп), рВ8, рЭ10. рНадехспрГ р§1Х174, рЫиекспр! 8К, рЬккк, рNΗ8Α, рЯН16а, рNΗI8Α, рЯН46А (фирма 8!га!адепе), р!гс99а, рКК223-3, рКК233-3, рЭК540 и рШТ5 (фирма Рйагтааа); и эукариотические: рУЬХЕ0, р8У2САТ, р0С44, рХТ1, р8С (фирма 8!га!адепе), р8УК3, рВРУ, рМ8С и р8УЪ (фирма Рбагтас1а). Однако можно применять любую другую приемлемую плазмиду или вектор, если они обладают способностью реплицироваться и обладают жизнеспособностью в хозяине.
Промоторные области можно выбирать из любого требуемого гена, используя несущие САТ (хлорамфениколацетилтрансфераза) векторы или другие векторы, содержащие селектируемые маркеры.
Двумя приемлемыми векторами являются рКК232-8 и рСМ7. Среди бактериальных промоторов следует упомянуть 1ас1, 1ас2, Т3, Т7, др!, лямбда Р.киЬ.К, Р.киЬ.Ь и !гр. Эукариотические промоторы представляют собой немедленно ранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, ранний и поздний промотор 8У40, промотор ЬТК из ретровирусов и промотор мышиного металлтионеина-Ι. Выбор соответствующего вектора и промотора находится в компетенции обычного специалиста в данной области.
Компоненты экспрессионного вектора могут, как правило, представлять собой: 1) ген неомицинфосфотрансферазы (С418) или фосфотрансферазы гигромиина В (Нуд) в качестве маркера для селекции, 2) сайт инициации репликации Е со11, 3) промоторные последовательности фага Т7 и 8Р6, 4) операторные последовательности 1ас, 5) ген-репрессор оперона лактозы (1аск|) и
6) линкерную область множественного сайта клонирования. Указанный сайт инициации репликации (опС) можно выводить из рИС19 (фирма ЬТ1, Геттисберг, шт. Мэриленд).
Нуклеотидную последовательность, кодирующую один из полипептидов, представленных в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2-9, которая несет соответствующий сайт рестрикции, создают, как правило, с помощью ПЦРпротокола, описанного ниже в примерах 1 и 2, используя ПЦР-праймеры, несущие сайты рестрикции, распознаваемые ЕсоК Ι (в качестве 5'-праймера) и 8а1 Ι (в качестве 3'-праймера), для клонирования 18оЦС-Ме! Ι и -Ме! ΙΙ в векторе ЕСЕР-Ы3, или сайтов, распознаваемых 8ре Ι (в качестве 5'- праймера) и ЕсоК Ι (в качестве 3'-праймера), для клонирования 1§оЦС в вектор рЕТ41а. ПЦР-вставки очищают на геле и расщепляют соответствующими рестриктазами. Вставку и вектор лигируют с помощью стандартных протоколов.
Следующим вариантом осуществления настоящего изобретения являются клетки-хозяева, содержащие вышеописанные конструкции. Клетка-хозяин может представлять собой клетку высшего эукариотического организма, такую как клетка млекопитающего, или клетку низшего эукариотического организма, такую как клетка дрожжей, или клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку, такую как бактериальная клетка. Интродукцию конструкции в клетку-хозяина можно осуществлять с помощью трансфекции с использованием фосфата кальция, опосредуемой ДЭАЭ ((диэтиламино)этилцеллюлоза)-декстраном трансфекции, с помощью липофектина или путем электропорации (Ωηνίδ Ь., О1Ьпег М., Вайеу Ι., ВаДс МеШоШ ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1986).
Такие конструкции в клетке-хозяине предпочтительно применяют общепринятым образом для получения генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В другом варианте полипептиды, предлагаемые в изобретении, можно получать путем синтеза с помощью обычных пептидных синтезаторов или путем химического лигирования приемлемых фрагментов, полученных таким образом.
Зрелые белки можно экспрессировать в клетках млекопитающих, дрожжей, бактерий или в других клетках под контролем соответствующих промоторов. Для получения указанных белков можно применять также бесклеточные системы трансляции, используя РНК, выведенные из конструкций ДНК, предлагаемых в настоящем изобретении. Соответствующие клонирующие и экспрессионные векторы, предназначенные для применения в сочетании с прокариотическими и эукариотическими хозяевами, описаны у 8атЬгоок и др., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаШгу Мапиа1, 2-ое изд., изд-во Со1б 8ргтд НагЬог, N. Υ., 1989.
Транскрипцию ДНК, кодирующей полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, в высших эукариотических организмах повышают путем встраивания в вектор энхансерной последовательности.
Энхансеры включают цис-активные элементы ДНК, как правило, состоящие примерно из 10-300 пар оснований, которые оказывают воздействие на промотор, повышая транскрипцию. Их примерами являются энхансер 8У40 на удаленной стороне сайта инициации репликации длиной 100-270 пар оснований, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер промотора полиомы на удаленной стороне сайта инициации репликации и энхансеры аденовирусов.
Как правило, рекомбинантные экспрессионные векторы должны включать сайты инициации репликации и селектируемые маркеры, обеспечивающие трансформацию клетки-хозяина, например, ген, обусловливающий устойчивость к ампициллину, в Е. сой и ген ТКР1 8. сегеу1Дае, и промотор, выведенный из гена с высоким уровнем экспрессии для обеспечения транскрипции расположенной в прямом направ
- 20 016584 лении структурной последовательности. Такие промоторы можно выводить из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как (но, не ограничиваясь только ими) 3-фосфоглицераткиназа (РСК), альфа-фактор, кислая фосфатаза или белки теплового шока. Гетерологичную структурную последовательность собирают на соответствующей фазе с последовательностями инициации и терминации трансляции и предпочтительно лидерной последовательностью, обладающей способностью обеспечивать секрецию транслированного белка в периплазматическое пространство или внеклеточную среду. Необязательно гетерологичная последовательность может кодировать слитый белок, включающий Ν-концевой идентифицирующий пептид, придающий требуемые характеристики, например стабилизацию или упрощение очистки экспрессируемого рекомбинантного продукта.
Приемлемые экспрессионные векторы, предназначенные для использования в бактериях, конструируют путем встраивания последовательности структурной ДНК, кодирующей требуемый белок, в сочетании с приемлемыми сигналами инициации и терминации трансляции в функциональной рамке считывания с использованием функционального промотора.
Вектор должен содержать один или несколько фенотипических селектируемых маркеров и сайт инициации репликации для гарантии сохранения вектора и при необходимости для обеспечения амплификации в хозяине. Пригодные для трансформации прокариотические хозяева представляют собой Е. сой, ВасШик киЬййк, 8а1топе11а 1ур1итипит и различные виды родов Ркеиботопак, 81гер1отусе§ и 81арйу1ососси5, хотя можно применять также отобранные другие виды.
Репрезентативные экспрессионные векторы, которые можно применять в бактериях, могут содержать (но, не ограничиваясь только ими) селектируемый маркер и бактериальный сайт инициации репликации, выведенный из поступающих в продажу плазмид, которые содержат генетические элементы хорошо известного клонирующего вектора рВК322 (АТСС 37017). Такими поступающими в продажу векторами являются, например, рКК223-3 (фирма РНагтааа Ете СйеткаЕ, Уппсала, Швеция) и СЕМ1 (фирма Рготеда Вю1ес, Мэдисон, шт. Висконсин, США). Эти каркасные секции рВК322 объединяют с соответствующим промотором и структурной последовательностью, подлежащей экспрессии.
После трансформации приемлемого штамма-хозяина и выращивания штамма-хозяина до соответствующей клеточной плотности индуцируют выбранный промотор соответствующими средствами (например, изменением температуры или путем химической индукции) и клетки культивируют в течение дополнительного периода времени.
Клетки, как правило, собирают центрифугированием и затем разрушают физическими или химическими средствами, а полученный неочищенный экстракт сохраняют для дополнительной очистки.
Микробные клетки, применяемые для экспрессии белков, можно разрушать любым традиционным методом, включая циклы замораживания-оттаивания, обработку ультразвуком, механическое разрушение и применение лизирующих клетки агентов; указанные методы хорошо известны специалистам в данной области.
Для экспрессии рекомбинантного белка можно применять также различные культуральные системы клеток млекопитающих. Примерами систем экспрессии на основе клеток млекопитающих являются фибробласты почки обезьяны линии СО8-7, описанные СШ/тап, Се11, 23, 1981, с. 175. Другие клеточные линии, которые могут экспрессировать совместимый с ними вектор, включают, например, клеточные линии С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК. Экспрессионные векторы млекопитающих должны содержать, как правило, сайт инициации репликации, приемлемый промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донор и акцептор сплайсинга, последовательности терминаторов транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. Последовательности ДНК, выведенные из сайта сплайсинга 8У40, и сайты полиаденилирования можно применять для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов.
Полипептиды можно выделять и очищать из рекомбинантных клеточных культур такими методами, как осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракция кислотами, анионо- или катионообменная хроматография, хроматография на фосфоцеллюлозе, хроматография на основе гидрофобных взаимодействий, аффинная хроматография, хроматография на гидроксилапатите и хроматография на лектине. Выделение может облегчаться, если полипептид экспрессируется на поверхности клеток, но это не является необходимым условием. Может требоваться также выделение расщепленных продуктов, которые расщепляют после экспрессии более длинной формы полипептида. При необходимости можно использовать стадии повторной укладки белка, известные в данной области, для завершения конфигурации зрелого белка. Для конечных стадий очистки можно использовать жидкостную хроматографию высокого разрешения (ЖХВР).
Полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой очищенные натуральные продукты или продукты, полученные с помощью методов рекомбинации, из прокариотического или эукариотического хозяина (например, с использованием культур клеток бактерий, дрожжей, высших растений, насекомых или млекопитающих). В зависимости от применяемого хозяина в процессе рекомбинантного получения полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть гликозилированными или не гликозилированными. Полипептиды, предлагаемые в изобретении, могут включать также остаток метионина в качестве начального аминокислотного остатка.
- 21 016584
В предпочтительном варианте осуществления изобретения белки, предлагаемые в изобретении, выделяют и очищают так, чтобы они практически не содержали других белковых загрязнителей. Например, на долю белков, предлагаемых в изобретении, должно приходиться по меньшей мере 80 мас.% от общего содержания белка в образце, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 98 мас.% от общего содержания белка.
Эти белки могут иметь форму раствора в воде, другом приемлемом растворителе, таком как диметилсульфоксид (ДМСО) или этанол, или в смеси приемлемых растворителей.
Примерами смесей растворителей являются смеси, включающие 10 мас.% этанола в воде и 2 мас.% ДМСО в воде. Раствор может содержать также соли, забуферивающие агенты, хаотропные агенты, детергенты, консерванты и т.п. В другом варианте белки могут находиться в форме твердого вещества, такого как лиофилизированный порошок или кристаллическое твердое вещество, которое может включать остаточные количества растворителя, соль или т.п.
В контексте настоящего описания понятие антитела включает поликлональные антитела, очищенные на основе аффинности поликлональные антитела, моноклональные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, такие как протеолитические Е(аЬ')2- и ЕаЬ'-фрагменты. Под определение подпадают также созданные с помощью генной инженерии интактные антитела или фрагменты, такие как химерные антитела, Εν-фрагменты, одноцепочечные антитела и т.п., а также синтетические антигенсвязывающие пептиды и полипептиды. Нечеловеческие антитела можно гуманизировать путем трансплантации нечеловеческих СЭК. в человеческие каркасные и константные области или путем включения полных нечеловеческих вариабельных областей (необязательно маскируя их с помощью поверхности, напоминающей человеческую, путем замены выставленных напоказ (презентуемых) остатков, результатом чего является облицованное антитело). В некоторых случаях гуманизированные антитела могут сохранять нечеловеческие остатки в каркасных участках человеческой вариабельной области для усиления соответствующих характеристик связывания. Благодаря гуманизации антител можно повышать биологическое время полужизни и снижать возможные отрицательные иммунные реакции при введении человеку.
Другие методы создания или отбора антител, которые можно применять согласно настоящему изобретению, включают обработку ίπ ν 11го лимфоцитов человеческим белком или пептидом ХоОС и отбор презентующих антитела библиотек в фаговых или подобных векторах (например, путем применения иммобилизованного или меченого человеческого белка или пептида ХоОС).
Гены, кодирующие полипептиды, которые несут потенциальные домены связывания с человеческим полипептидом ХоОС, можно получать путем случайного скрининга презентующих пептиды фаговых (фаговая презентация) или бактериальных (например, с использованием Е. со11) библиотек. Нуклеотидные последовательности, кодирующие указанные полипептиды, можно получать различными путями, известными в данной области.
Как должно быть очевидно обычному специалисту в данной области, поликлональные антитела можно получать путем введения различным теплокровным животным, таким как лошади, коровы, козы, овцы, куры, кролики, мыши и крысы, человеческого полипептида ХоОС или его фрагмента. Иммуногенность человеческого полипептида ХоОС можно повышать с помощью адъюванта, такого как квасцы (гидроксид алюминия) или полного или неполного адъюванта Фрейнда, или поверхностно-активных веществ, таких как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, КЬН или динитрофенол. Среди адъювантов, которые можно применять для введения человеку, наиболее предпочтительными являются БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена) и СогупеЬас!егшш ранит. Полипептиды, которые можно применять для иммунизации, включают слитые полипептиды, такие как слияния полипептида ХоОС или его участка с полипептидом иммуноглобулина или связывающим мальтозу белком. Иммуногенный полипептид может представлять собой полноразмерную молекулу или ее часть. Если полипептидный участок является гаптенподобным, то такой участок для иммунизации может оказаться целесообразным соединять или сцеплять с макромолекулярным носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (КЬН), бычий сывороточный альбумин (БСА) или токсоид столбняка. Антитела к ХоОС можно создавать также с помощью методов, хорошо известных в данной области. Такие антитела могут представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) поликлональные, моноклональные, химерные и одноцепочечные антитела, ЕаЬ-фрагменты и фрагменты, полученные с помощью экспрессионных библиотек ЕаЬ-фрагментов.
Нейтрализующие антитела (т.е. антитела, которые блокируют или модифицируют взаимодействия на активных сайтах) являются наиболее предпочтительными для терапевтического применения.
Для получения антител, связывающих белков или пептидов, которые специфически связываются с ОРСТБ, можно подвергать скринингу библиотеки одноцепочечных антител, ЕаЬ-фрагментов, других фрагментов антител, белковых доменов субстанций, не относящихся к антителам, или пептидов. Библиотеки можно создавать с помощью фаговой презентации, других методов рекомбинантной ДНК или пептидного синтеза (УаидНап Т. 1. и др., №1Шге Вю1есНпо1оду 14, 1966, сс. 309-314). Такие библиотеки, как правило, подвергают скринингу с использованием методов, которые хорошо известны в данной области, для идентификации последовательностей, для которых характерно специфическое связывание с ОРСТБ.
- 22 016584
Предпочтительно олигопептиды, пептиды или их фрагменты, применяемые для индукции антител к РРСТЬ, имеют аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере примерно из 5 аминокислот и более предпочтительно по меньшей мере примерно из 10 аминокислот. Предпочтительно также эти олигопептиды, пептиды или фрагменты идентичны части аминокислотной последовательности встречающегося в естественных условиях белка. Короткие участки аминокислотной последовательности ОРСТЬ можно также сливать с другим белком, таким как КЬН, и получать в результате антитела к химерной молекуле.
Моноклональные антитела к ОРСТБ можно получать с помощью любого хорошо известного метода, обеспечивающего получение молекул антител с помощью непрерывных культур клеточных линий. Они включают (но, не ограничиваясь только ими) метод гибридом, метод человеческих В-клеточных гибридом и метод на основе ЕВУ-гибридом, хотя предпочтительными являются моноклональные антитела, полученные с помощью клеток гибридом.
Кроме того, можно применять методы, разработанные для производства химерных антител, такие как сплайсинг мышиных генов антител с генами человеческих антител с получением молекулы с соответствующей антигенспецифичностью и биологической активностью (см. №иЬегдег М. 8. и др., №1иге 312, 1984, сс. 604-608). В другом варианте методики, описанные для производства одноцепочечных антител, можно адаптировать, используя известные в данной области методы, для получения рРСТЬспецифических одноцепочечных антител. Антитела с родственной специфичностью, но с различным идиотипическим составом можно создавать путем перестановки цепи из произвольных комбинаторных библиотек иммуноглобулинов (Вийоп Ό. К., Ргос. №И. Асаб. 8с! 88, 1991, сс. 11120-11123).
Антитела можно получать также путем индукции ίη νίνο производства в популяции лимфоцитов или путем скрининга библиотек иммуноглобулинов или панелей высоко специфических связывающихся реагентов согласно известным из литературы методам (0г1апб1 К. и др., Ргос. №11. Асаб. 8с1. 86, 1989, сс. 3833-3837).
Можно создавать также фрагменты антител, которые содержат специфические сайты связывания ОРСТС Например, такие фрагменты включают (но, не ограничиваясь только ими) Е(аЬ')2-фрагменты, которые образуются в результате расщепления пепсином молекулы антитела, и ЕаЬ-фрагменты, которые образуются при восстановлении дисульфидных мостиков Е(аЬ')2-фрагментов. В другом варианте можно конструировать экспрессионные библиотеки ЕаЬ-фрагментов, что позволяет быстро и просто идентифицировать моноклональные ЕаЬ-фрагменты с требуемой специфичностью (Нике V. Ό. и др., 8с1епсе 254, 1989, сс. 1275-1281).
Различные иммуноанализы можно применять для идентификации антител, имеющих требуемую специфичность. В данной области хорошо известны многочисленные протоколы конкурентного связывания или иммунорадиометрических анализов, в которых используют либо поликлональные, либо моноклональные антитела с установленной специфичностью. Такие иммуноанализы, как правило, включают оценку комплексообразования между ОРСТЕ и специфическим для него антителом. Предпочтительным является двусайтовый, основанный на применении моноклональных антител, реактивных к двум не взаимодействующим эпитопам ОРСТЕ. но можно применять также анализ, основанный на конкурентном связывании.
Как отмечалось ранее, ОРСТЕ можно применять для лечения болезней.
Фармацевтические композиции, приемлемые для применения в этом объекте изобретения, включают композиции, в которых действующие вещества присутствуют в эффективных касательно одного из заболеваний количествах для достижения поставленной цели. Определение терапевтически эффективной дозы находится в компетенции специалистов в данной области и ее можно определять первоначально либо с помощью анализов в клеточных культурах, например в неопластических клетках, или на моделях, созданных на животных, как правило, таких как мыши, крысы, кролики, собаки или свиньи. Созданную на животном модель можно применять также для определения соответствующего диапазона концентраций и пути введения, указанную информацию затем, как правило, используют для определения доз и путей введения, которые можно применять на людях.
Терапевтически эффективная доза означает количество действующего вещества, например, ОРСТЕ или фрагмента, антител к ЭРЕР или агониста, антагониста или ингибитора ОРСТЬ, которое облегчает конкретные симптомы или состояния заболевания. Например, количество, подлежащее введению, может обладать эффективностью в отношении циклизации N-концевого С1и или С1п требуемого субстратамишени при контакте с ним. Терапевтическую эффективность и токсичность можно определять также стандартными фармацевтическими процедурами в культурах клеток или на экспериментальных животных, например, статистически рассчитывая значение ΈΌ50 (доза, обладающая терапевтической эффективностью в отношении 50% популяции) или ЬП50 (доза, смертельная для 50% популяции). Соотношение доз, вызывающих токсическое и терапевтическое действие, представляет собой терапевтический индекс, и его можно выражать в виде соотношения ΕΌ50/ΈΌ50. Фармацевтические композиции, для которых характерен высокий терапевтический индекс, являются предпочтительными. Данные, полученные с помощью анализов клеточных культур и в опытах на животных, применяют при определении диапазона входящих в препаративную форму доз для применения на человеке. Доза, входящая в такие композиции,
- 23 016584 предпочтительно соответствует диапазону присутствующих в кровотоке концентраций. которые включают ΕΌ50. обладающих невысокой токсичностью или не обладающих токсичностью. Уровень доз в указанном диапазоне зависит от применяемой формы лекарственного средства. чувствительности пациента и пути введения.
Точную дозу. как правило. должен определять специалист в области медицины с учетом таких факторов. как индивидуум. подлежащий лечению. при этом дозу и ее применение регулируют для обеспечения достаточного уровня активного фрагмента или поддержания требуемого действия. Факторы. которые следует учитывать. включают серьезность болезненного состояния. общее состояние здоровья индивидуума. возраст. вес и пол индивидуума. диету. время и частоту введения. комбинацию(и) лекарственных средств. реакцию чувствительности. переносимость/ответ на терапию. Фармацевтические композиции пролонгированного действия можно вводить каждые 3-4 дня. каждую неделю или даже каждые две недели в зависимости от времени полужизни и скорости клиренса конкретной формы.
Еще одним объектом изобретения являются молекулы полинуклеотидов. имеющие последовательности. которые являются антисмысловыми относительно мРНК-транскриптов полинуклеотидов. представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 2-9. Введение молекулы антисмыслового полинуклеотида может блокировать производство белка. кодируемого генами ОРСТЕ последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 2-9. Методы получения молекул антисмысловых полинуклеотидов и введение таких молекул известно в данной области. Например. молекулы антисмысловых полинуклеотидов можно капсулировать в липосомах для слияния с клетками.
В частности. экспрессия генов ОРСТЕ последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 29. в ткани головного мозга. предстательной железы. легкого. сердца. печени. селезенки и почки свидетельствует о ее возможной роли в патофизиологии указанных ниже болезней. Таким образом. следующим объектом изобретения являются диагностические анализы. предназначенные для выявления болезней. ассоциированных с неадекватной активностью или уровнем экспрессии ОРСТЕ Антитела. которые специфически связываются с ОРСТЕ можно применять для диагностики нарушений. характеризующихся экспрессией ОРСТЕ или в анализах. предназначенных для выявления пациентов. которых можно лечить с помощью ЭРСТЬ или агонистов или антагонистов (ингибиторов) ОРСТЕ Антитела. которые можно применять для целей диагностики. можно получать аналогично методам. описанным выше для получения терапевтических агентов. Диагностические анализы. предназначенные для выявления ОРСТЕ основаны на методах. которые предусматривают применение антитела и метки для выявления ЭРСТЬ в общей воде организма человека или в экстрактах клеток или тканей. Антитела можно применять с модификацией или без модификаций и их можно метить путем ковального или нековалентного связывания с репортерной молекулой. В данной области известно широкое разнообразие репортерных молекул. Рекомбинантные белки ОРСТЕ модифицированные так. чтобы они становились каталитически неактивными. можно применять также в качестве доминантных ингибиторов отрицательного действия. Такие модификации включают. например. мутацию активного сайта.
В данной области известны различные протоколы для оценки ОРСТЕ включая ΕΕΙ8Ά. РИА и ЕЛС8. и они являются основой для диагностирования измененных или аномальных уровней экспрессии ОРСТЕ Нормальные или стандартные значения уровня экспрессии ОРСТЬ определяют. объединяя общую воду организма или клеточные экстракты. взятые у здоровых млекопитающих. предпочтительно людей. с антителом к ОРСТЬ в условиях. приемлемых для образования комплекса. Метод выявления ЭРСТЬ в биологическом образце должен включать стадии. на которых а) получают биологический образец; б) объединяют биологический образец с антителом к ЭРСТЬ в условиях. приемлемых для образования комплекса между ЭРСТЬ и антителом; и в) выявляют образование комплекса между ОРСТЬ и антителом. выявляя тем самым присутствие ЭРСТЬ в биологическом образце.
Уровень комплексообразования затем можно оценивать количественно различными методами. предпочтительно фотометрически. Уровни ОРСТЕ экспрессируемые в индивидууме. контроле и образце пораженной болезнью ткани. полученном с помощью биопсии. сравнивают со стандартным значением. Различие между стандартными и полученными для индивидуума значениями представляет собой параметры. позволяющие диагностировать болезнь.
В другом варианте осуществления изобретения полинуклеотиды. кодирующие ОРСТЕ применяют для диагностических целей. при этом полинуклеотиды могут включать олигонуклеотидные последовательности. комплементарные молекулам РНК и ДНК. а также ПНК. Эти полинуклеотиды можно применять для выявления и количественной оценки экспрессии гена в полученных путем биопсии тканях. в которых экспрессия ОРСТЬ может коррелировать с одним из заболеваний. Диагностический анализ можно применять для выявления отсутствия. присутствия или избыточного уровня экспрессии ЭРСТЬ и для мониторинга регуляции уровней ЭРСТЬ в процессе терапевтического вмешательства. Кроме того. фармакогеномный. основанный на полиморфизмах одного нуклеотида (8№) анализ генов ОРСТЬ можно применять в качестве метода скрининга мутаций. свидетельствующих о предрасположенности к заболеванию или измененному ответу на лекарственные средства.
Полинуклеотидные и полипептидные последовательности ОРСТЕ их фрагменты. антитела к ЭРСТЬ и агонисты. антагонисты или ингибиторы ОРСТЬ можно применять в качестве диагностических
- 24 016584 инструментов для идентификации случаев молекулярного распознавания и белков, полипептидов и пептидов, которые взаимодействуют с белками ОРСТЬ. Конкретным примером являются фаговые дисплейные пептидные библиотеки, содержащие более 108 пептидных последовательностей, которые можно подвергать скринингу в одном цикле пэннинга. Такие методы, а также другие, известные в данной области, можно использовать для идентификации соединений, которые ингибируют или усиливают активность одной из ОРСТЬ. представленных в 8ЕО ГО N0: 11-18.
Полученные в результате сочетания связи представляют собой функциональные взаимодействия, такие как комплексы или каскады реакций, и белки, которые взаимодействуют с ОРСТЬ, можно идентифицировать с помощью дрожжевой двухгибридой системы, такой как протеомикс (дифференциальный анализ в 20-гелях и масс-спектрометрия), и геномный анализ (дифференциальный анализ генной экспрессии с помощью микромассива или серийный анализ генной экспрессии (8АСЕ)).
Белки, идентифицированные в качестве функционально связанных с ОРСТЬ, и процессы их взаимодействия составляют основу методов скрининга ингибиторов, агонистов и антагонистов и модуляторов этих взаимодействий ОРСТЬ-белок.
Понятие антагонист в контексте настоящего описания относится к молекуле-ингибитору, которая при связывании с ОРСТЬ снижает уровень или продолжительность действия биологической или иммунологической активности ОРСТЬ, например, снижая ферментативную активность пептидазы в отношении циклизации остатков С1и или С1п на Ν-конце субстратов ОРСТЬ. Антагонисты могут представлять собой белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, антитела или любые другие молекулы, которые снижают действие ОРСТЬ; например, они могут представлять собой небольшие молекулы и органические соединения, которые связываются с ОРСТЬ и инактивируют их путем механизма конкурентного или неконкурентного типа. Предпочтительными являются небольшие молекулы-ингибиторы ОРСТЬ. Наиболее предпочтительными являются конкурентные небольшие молекулы-ингибиторы ОРСТЬ.
Специфические примеры ингибиторов ферментативной активности ОРСТЬ представлены в примере 4. Ингибиторы могут представлять собой, например, ингибиторы циклазной активности ОРСТЬ или в другом варианте ингибиторы активности связывания ОРСТЬ с белками, с которыми они взаимодействуют. Конкретными примерами указанных ингибиторов могут являться, например, антитела к ОРСТЬ антитела, пептиды, белковые фрагменты или небольшие ингибиторы пептидилпротеаз, или небольшие непептидные органические молекулы-ингибиторы, которые приготавливают в среде, которую можно интродуцировать в требуемый тип клеток. В другом варианте указанные ингибиторы можно присоединять к обеспечивающим направленный перенос лигандам для интродукции путем опосредуемого клеткой эндоцитоза и других опосредуемых рецептором событий. Указанные методы описаны дополнительно ниже и их могут использовать на практике специалисты в данной области с учетом данных о нуклеотидных и аминокислотных последовательностях ОРСТЬ, представленных в настоящем описании.
Еще одним вариантом применения ОРСТЬ является скрининг потенциальных антагонистов для применения в качестве терапевтических агентов, например для ингибирования связывания с ОРСТЕ а также скрининг агонистов. Таким образом, ОРСТЬ, ее иммуногенные фрагменты или олигопептиды можно применять для скрининга библиотек соединений, которые являются перспективными агонистами или антагонистами, с использованием любого из разнообразных методов скрининга лекарственных средств. Фрагмент, применяемый для указанного скрининга, может присутствовать в растворе в свободном состоянии, может фиксироваться на твердой подложке, находиться на клеточной поверхности или может иметь внутриклеточную локализацию. Затем оценивают образование полученных путем связывания комплексов между ОРСТЬ и агентом, подлежащим тестированию. Другие анализы, предназначенные для выявления антагонистов, которые должны ингибировать ОРСТЬ, представлены в заявках на патент XVО 2004/098625, XVО 2004/098591 и ХУО 2005/075436, в которых описаны ингибиторы ОС и которые полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. Другим вариантом применения этих ОРСТЬ, который следует отметить, является скрининг ингибиторов ОС, осуществляемый для того, чтобы продемонстрировать, что они не обладают нежелательными побочными действиями, путем ингибирования также одной или нескольких ОРСТЬ.
Метод, предложенный для скрининга библиотек небольших молекул с целью идентификации молекулы, которая связывается с ОРСТЬ, как правило, заключается в том, что: а) получают библиотеку небольших молекул; б) объединяют библиотеку небольших молекул с полипептидом, последовательность которого представлена в одной из 8Е0 ГО NО: 11-18, или его фрагментом в условиях, которые являются пригодными для образования комплекса; и в) выявляют образование комплекса, при этом присутствие такого комплекса позволяет идентифицировать небольшую молекулу, которая связывается с ОРСТЬ.
Один из методов идентификации антагониста заключается в том, что вводят небольшую молекулу, которая связывается с ОРСТЬ, в экстракты клеток, трансформированных вектором, который экспрессирует ОРСТЬ, наряду с хромогенным субстратом (например, А1а-Рго-АЕС или А1а-Рго-АМС) в условиях, в которых в норме должно происходить расщепление, а затем оценивают ингибирование расщепления ферментом по изменениям флуоресценции или абсорбции УФ-света, с помощью спектрофотометрии для идентификации молекул, которые ингибируют расщепление. Пониженная скорость реакции или общий уровень флуоресценции или абсорбции УФ-света в присутствии молекулы свидетельствуют о том, что
- 25 016584 небольшая молекула является антагонистом, который снижает каталитическую/ферментативную активность ОРСТЕ После идентификации таких молекул их можно вводить для снижения или ингибирования циклизации находящихся на Юконце остатков С1и или С1п с помощью ОРСТЕ
Еще одним конкретным объектом изобретения является способ скрининга соединений, обладающих способностью ингибировать ферментативную активность по меньшей мере одного зрелого белка, предлагаемого в настоящем изобретении, предпочтительно выбранного из белков, последовательности которых представлены в 8ЕО ΙΌ N0: 11-18, где способ заключается в том, что инкубируют зрелый белок и приемлемый субстрат зрелого белка в присутствии одного или нескольких тестируемых соединений или их солей, оценивают ферментативную активность зрелого белка, сравнивают указанную активность с соответствующей активностью, определенной в отсутствие тестируемого соединения, и отбирают тестируемое соединение или соединения, которое(ые) снижает(ют) ферментативную активность.
Изобретение относится также к способу скрининга избирательных ОС-ингибиторов, т.е. соединений, обладающих способностью ингибировать ферментативную активность ОС, где ОС предпочтительно представляет собой белок, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 10, который не ингибирует ферментативную активность по меньшей мере одного зрелого белка, предлагаемого в настоящем изобретении, предпочтительно выбранного из белков, последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 11-18, где способ заключается в том, что инкубируют указанный зрелый белок и приемлемый субстрат в присутствии одного или нескольких ингибиторов ОС или их солей, оценивают ферментативную активность зрелого белка, сравнивают указанную активность с соответствующей активностью, определенной в отсутствие ингибитора ОС, и отбирают соединение, которое не снижает ферментативную активность зрелого белка.
Изобретение относится также к способу скрининга избирательных рРСТЬ-ингибиторов, т.е. соединений, обладающих способностью ингибировать ферментативную активность по меньшей мере одного белка ОРСТЕ который предпочтительно выбирают из белков, последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 11-18; которые не ингибируют ферментативную активность ОС, где ОС предпочтительно представляет собой белок, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 10, где способ заключается в том, что инкубируют указанный белок ОС и приемлемый субстрат в присутствии одного или нескольких ингибиторов ОРСТЕ или их солей, оценивают ферментативную активность ОС, сравнивают указанную активность с соответствующей активностью, определенной в отсутствие ингибитора ОРСТЕ, и отбирают соединение, которое не снижает ферментативную активность указанного белка РРОТЕ
Ценные ингибиторы ОС, которые можно применять также в качестве ингибиторов ОРСТЕ, описаны в \\'0 2004/098625, \\'0 2004/098591, \\'0 2005/039548 и \\'0 2005/075436, которые полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки, прежде всего касательно структуры ингибиторов и их получе ния.
Примеры ОРСТЬ-ингибиторов
Потенциальные рРСТЕ-ингибиторы, которые пригодны для применения, и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, описаны в А0 2005/075436, которая полностью включена в настоящее описание касательно структуры, синтеза и методов применения ОС-ингибиторов.
В частности, приемлемым является соединение формулы 1*:
В другом варианте осуществления изобретения ингибиторы ОРСТЕ могут представлять собой соединения формулы 1а,
в которой В имеет значения, указанные в примерах 1-53.
- 26 016584
Пример К Е81-МС (М+Н)
1 метил 199,3
2 /ире/м-бутил 241,4
3 бензил 275,4
4 фенил 261,4
5 4-(фтор)фенил 279,35
6 4-(хлор)фенил 295,80
7 4-(этил)фенил 289,41
8 4-(трифторметил)фенил 329,4
9 4-(метоксикарбонил)фенил 319,4
10 4-(ацетил)фенил 303,4
11 4-(метокси)фенил 291,4
12 бицикло[2.2.1 ]гепт-5-ен-2-ил 277,5
13 3,4-(диметокси)фенил 321,5
14 2,4-(диметокси)фенил 321,5
15 3,5-(диметокси)фенил 321,5
16 2-(метоксикарбонил)фенил 319,4
17 4-(оксазол-5-ил)фенил 328,5
18 4-(пиразол-1 -ил)фенил 327,4
19 4-(изопропил)фенил 303,5
20 4-(пиперидин-1-сульфонил)фенил 408,6
21 4-(морфолин-4-ил)фенил 346,5
22 4-(циан)фенил 286,4
23 2,3 - диги дробензо[ 1,4]диоксин-6-ил 319,4
24 бензо[1,3]диоксол-5-ил 305,4
25 3,4,5(триметокси)фенил 351,5
26 3-(метокси)фенил 291,4
27 4-(этокси)фенил 305,5
28 4-(бензилокси)фенил 367,5
29 4-(метокси)бензил 305,5
30 3,4-(диметокси)бензил 335,5
31 2-(метоксикарбонил)- тиофен-3-ил 325,5
32 3-{этоксикарбонил)-4,5,6,7- тетрагидробензоГЬ1тиофен-2-ил 392,6
33 2-(метоксикарбонил)-4(метил)тиофен-З-ил 339,5
34 бензо[с][1,2,5]тиазол-4-ил 319,5
35 бензо[с][1,2,5]тиазол-5-ил 319,5
36 5-(метил)-3-(фенил)изооксазол-4-ил 342,5
37 3,5-(диметил)изооксазол-4-ил 280,4
38 4-(йод)фенил 387,3
39 4-(бром)фенил 340,3
40 4-(метил)фенил 275,4
41 нафталин-1 -ил 311,5
42 4-(нитро)фенил 306,4
43 бутил 241,4
44 циклооктил 295,5
45 фуран-2-илметил 265,4
46 тетрагидрофуран-2-илмегил 269,4
47 бензо[1,3]диоксол-5-илметил 319,4
48 2-(морфолин-4-ил)этил 298,5
49 4“(метилсульфанил)фенил 307,5
50 4-(диметиламино)фенил 304,5
51 4-(трифторметокси)фенил 345,4
52 бензоил 288,3
53 пири.дин-4-ил 261,1
- 27 016584
Другими приемлемыми ингибиторами ОРСТЬ могут быть соединения формула 1Ь,
в которой К1 и К2 имеют значения, указанные в примерах 54-95
Пример К1 к2
54 циан метил
55 циан 3,4-(диметокси)фенил
56 циан 2,4-(диметокси)фенил
57 циан 3,5-(диметокси)фенил
58 циан 2,3- дигидробензо[Ь] [ 1,4]диокс ин- 7-ил
59 циан бензо[0][1?3]диоксол-6-ил
60 циан 3,4,5-(триметокси)фенил
61 циан 3-(метокси)фенил
62 циан 4-(этокси)фенил
63 циан 4-(бензилокси)фенил
64 циан фенил
65 циан 4-(метокси)фенил
66 циан 4-(ацетил)фенил
67 циан 4-(нитро)-фенил
68 циан бензил
69 циан нафталин-1-ил
70 циан 4-(фтор)фенил
71 циан 4-(йод)фенил
72 циан 4-(бром)фенил
73 циан циклооктил
74 циан трет-бутил
75 циан 4-(метил)фенил
76 циан 4-(метидтиоо)-фенил
77 циан 4-(этил)фенил
78 циан 4-(диметиламино)фенил
79 циан бутил
80 циан тритил
81 циан (бензо [с1] [ 1,3]диоксол-6нл)метил
82 циан (тетрагидрофуран-2ил)метил
83 циан 4-(трифторметил)фенил
84 циан (фуран-2-ил)метил
85 циан 2-(морфолин-4-ил)этил
86 циан 4-(оксазол-5 -ил)фенил
87 циан пиридин-3-ИЛ
88 циан 4-(циан)фенил
89 циан 4-(трифторметокси)фенил
90 циан 4(пиперидиносульфонил)фе НИЛ
91 циан 4-( 1 Н-пиразол- 1-ил)фенил
92 н 3,4-(диметокси)фенил
93 метил 3,4-(диметокси)фенил
94 циан 2,3,4-(триметокси)фени л
95 циан циклогептил
- 28 016584
Другими приемлемыми ингибиторами ОРСТЬ могут быть соединения формулы 1с,
в которой К3 имеет значения, указанные в примерах 96-102.
Пример К3 Е81-МС (М+Н)
96 этил 197,3
97 6-фтор-4Н-бензо[<1] [ 1,3 ]диоксин-8-ил 321,4
98 3-(циклопентилокси)-4(метокси)фенил 359,4
99 4-(гептилокси)фенил 359,5
100 3,4-дигидро-2Н-бензо[Ь] [1,4]диоксипин-7-ил 317,4
101 4-(бутокси)фенил 317,4
102 3,4-(диметокси)фенил 305,4
Другими приемлемыми ингибиторами ОРСТЬ могут быть соединения формулы 16,
в которой положение в кольце указано в примерах 103-105.
Пример Положение замещения в бензиле Е81-МС (М+Н)
103 2 383,5
104 3 383,5
105 4 383,5
Другими приемлемыми ингибиторами ОРСТЬ могут быть соединения формулы 1е,
в которой К4 и К5 имеют значения, указанные в примерах 106-109.
Пример К4 к5 Е81-МС (М+Н)
106(5) Н метил 335,5
107(К) метил н 335,5
108 метил метил 349,5
109 -сн2-сн2- 347,5
Другими приемлемыми ингибиторами ОРСТЬ могут быть соединения формулы 1£,
в которой К6 имеет значения, указанные в примерах 110-112.
Пример К6 Е81-МС (М+Н)
110 Н 259,4
111 хлор 293,8
112 метокси 289,4
Другими приемлемыми ингибиторами ОРСТЬ могут быть соединения формулы 1д,
- 29 016584
в которой К7, К8 и К9 имеют значения, указанные в примерах 113-132.
Пример К7 К8 к9 Е81-МС (М+Н)
ИЗ фенил Н и 260,4
114 тиофен-2-ил Н н 266,5
115(К) фенил метил н 274,5
116(3) фенил н метил 274,5
117 фенил н этил 288,5
118 фенил н фенил 336,5
119 3,4- (диметокси)фенил н Н 320,5
120 3,4- (диметокси)фенил метил метил 347,2
121 4-(хлор)фенил -СН2-СН2-СН2- 334,9
122 4-(хлор)фенил -СН2-С2Н4 -СН2- 349,0
123 4-(метокси)фенил -СН2-С3Н6 -СН2- 358,6
124 4-(метокси)фенил -СН2-СН2- 316,5
125 3,4- (диметокси)фенил -СН2-СН2- 346,5
126 3,4,5- (триметокси)фенил -СН2-СН2- 376,6
127 2,3,4- (триметокси)фенил -СН2-СН2- 376,6
128 2-(метокси)фенил -сн2-сн2- 316,5
129 3-(метокси)фенил -сн2-сн2- 316,5
130 2,3- (диметокси)фенил -СН2-СН2- 346,5
131 3,5- (диметокси)фенил -СН2-СН2- 346,5
132 2,5- 1 (диметокси)фенил -СН2-СН2- 346,5
Другими приемлемыми ингибиторами РРСТБ могут быть соединения формулы 1Н,
в которой η имеет значения, указанные в примерах 133-135.
Пример η Е81-МС (М+Н)
133 3 306,4
134 4 320,5
135 5 334,5
Другими приемлемыми ингибиторами РРСТБ могут быть соединения формулы 11,
в которой т имеет значения, указанные в примерах 136-137.
Пример ш Е81-МС (М+Н)
136 2 307,4
137 4 335,5
Другими приемлемыми ингибиторами РРСТБ могут быть соединения, формулы которых представлены в примерах 138-141.
- 30 016584
Пример Структура Е81-МС (Μ+Η)
138 0 347,5
139 Х^ХХ° 347,2
140 ^·νο2 \ 1 η η 226,3
141 __ζ°όη, X 370,4
Понятие агонист в контексте настоящего описания относится к молекуле, которая при связывании с ОРСТЬ усиливает или пролонгирует действие ОРСТЬ.
Агонисты могут представлять собой белки, нуклеиновые кислоты, углеводы или любые другие молекулы, которые связываются и модулируют действие ОРСТЬ. Хотя маловероятно, что небольшие молекулы могут являться эффективными агонистами ОРСТЬ, способ идентификации указанных небольших молекул, которые связываются с ОРСТЬ, в качестве агонистов заключается в том, что интродуцируют хромогенную форму небольшой молекулы, которая связывается с ОРСТЬ, в клетки, трансформированные вектором, который экспрессирует ОРСТЬ, и анализируют изменение флуоресценции или абсорбции УФ-света с помощью спектрофотометрии. Повышенные уровни УФ-абсорбции или флуоресценции свидетельствуют о том, что небольшая молекула является агонистом, который повышает активность ОРСТЬ.
Другой метод скрининга лекарственных средств, который можно применять для масштабного скрининга соединений, имеющих приемлемую аффинность связывания с представляющим интерес белком, описан в опубликованной заявке РСТ XV0 84/03564. Согласно этому методу большое количество различных небольших исследуемых соединений синтезируют на твердом субстрате, таком как пластиковые иголки или некоторые другие поверхности. Исследуемые соединения подвергают взаимодействию с белком ОРСТЬ или его фрагментами, а затем отмывают. Затем связанный белок ОРСТЬ выявляют методами, хорошо известными в данной области. Очищенный белок ОРСТЬ можно также непосредственно наносить на планшеты для применения в вышеуказанных методах скрининга лекарственных средств. В другом варианте не обладающие нейтрализующей способностью антитела можно применять для захвата пептида и иммобилизации его на твердой подложке.
В другом варианте осуществления изобретения можно использовать анализы, основанные на конкурентном скрининге лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, обладающие способностью связывать ОРСТЬ, специфично конкурируют с исследуемыми соединением за связывание с ОРСТЕ. В этом методе антитела можно применять для выявления присутствия любого пептида, который имеет одну или несколько антигенных детерминант, общих с ОРСТЬ.
Как указано выше, путем исследования сайтов связывания можно создавать лиганды, которые, например, обладают более выраженным взаимодействием с белком ОРСТЬ, чем его присутствующие в естественных условиях лиганды. Такие обладающие антагонистическим действием лиганды должны связываться с ОРСТЕ с большей аффинностью и поэтому функционировать в качестве конкурентных лигандов. В другом варианте можно создавать синтетические или рекомбинантные белки, гомологичные или аналогичные сайту связывания лиганда нативного белка ОРСТЬ, которые могут представлять собой другие молекулы, обладающие высокой аффинностью к ОРСТЬ. Такие молекулы должны также обладать способностью замещать ОРСТЬ и обеспечивать защитное действие.
Как указано выше, данные о структурах ОРСТЕ позволяют создавать гомологичные или аналогичные синтетические сайты связывания. Такие молекулы могут значительно облегчать использование способности к связыванию с представляющими собой мишень потенциальных терапевтических агентов и их можно также применять для скрининга потенциальных терапевтических агентов. Кроме того, их можно применять в качестве иммуногенов при производстве моноклональных антител, причем сами эти антитела можно применять для диагностики/терапии согласно описанным выше методам.
Терапевтические применения
В данной области известно, что амилоидные пептиды, например, Абета 1-42 (8ЕО ГО N0: 23) и Абета 1-40 (8Е0 ГО N0: 24) укорачиваются на №конце с помощью протеолитических ферментов, таких, например, как аминопептидазы или дипептидиламинопептидазы, что приводит к образованию Абета
- 31 016584 пептидов 3-42 (8Ер ΙΌ N0: 25), 3-40 (5ЕО ΙΌ N0: 26), 11-42 (5ЕО ΙΌ N0: 27) и 11-40 (5ЕО ΙΌ N0: 28). В этих укороченных Абета-пептидах первым Тконцевым остатком является остаток глутамата, и поэтому они представляют собой субстраты для ОС (см. также XV0 2004/09862), а возможно также для ОРСТЬ, последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 11-18, 21 и 22, предпочтительно для человеческих 15оОС, последовательности которых представлены в 8Е0 Ю N0: 11, 12, 21 и 22, наиболее предпочтительно человеческих 15оОС, последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 11 и 12. Образовавшиеся рС1и-Абета-пептиды, последовательности которых представлены в ЗЕЬ ΙΌ N0: 29-32, являются существенно более гидрофобными по сравнению с непироглутаматными пептидами, в большей степени способны к образованию агрегатов А-бета-пептидов, таких как олигомеры и фибриллы, и, как установлено, обладают более высокой нейротоксичностью. И, наконец, Абета-пептиды, последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 29-32, играют основную роль в развитии болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
Таким образом, ингибиторы ОРСТЬ, последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 1118, 21 и 22, предпочтительно человеческих 15оОС, последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 11, 12, 21 и 22, наиболее предпочтительно человеческих ЬоОС последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 11 и 12, можно применять для лечения связанных с амилоидным пептидом заболеваний, прежде всего нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
Другими потенциальными физиологическими субстратами ОРТСЬ у млекопитающих являются субстраты, выбранные из группы, включающей С1и'-ЛВп (8Е0 ΙΌ N0: 33), С1и'-Л0аи (8Е0 ΙΌ N0: 34) и С1и1-гастрины (17 и 34) (8Е0 ΙΌ N0: 35 и 36). Их пироглутаматные формы (8Е0 ΙΌ N0: 37-40) вызывают патологии, например, выбранные из группы, включающей рак двенадцатиперстной кишки, связанный и несвязанный с заражением Не11соЬас1ет ру1оп5. колоректальный рак, синдром Золлингера-Эллисона, семейную британскую деменцию (СБД) и семейную датскую деменцию (СДД). Таким образом, ингибиторы ОРСТЬ можно применять для лечения указанных патологий.
Другие потенциальные физиологические субстраты ОРСТЬ представлены в табл. 3.
Таблица 3. Аминокислотные последовательности физиологически активных пептидов с Тконцевым остатком глутамина
Пептид Аминокислотная последовательность Функция
гастрин 17 8\у155-Рго1: Р01350 ΟΟΡΧνί. ΕΕΕΕΕΑΥΟΨΜ БЕ (амид) Гастрин стимулирует слизистую желудка к производству и секреции соляной кислоты и поджелудочную железу к секреции ее пищеварительных ферментов. Он стимулирует также сокращение гладких мышц и усиливает кровоток и секрецию воды в желудке и тонком кишечнике.
нейротензин 8ννί8&-Ρτοΐ: Р30990 ΟΕΥΕΝΚΡΚΚ.Ρ У1Ь Нейротензин играет эндокринную и паракринную роль в регуляции метаболизма жиров. Он вызывает сокращение гладких мышц.
РРР С^ЕР (амид) Трипептид, родственный тиреотропин-рилизингфактору (ТКН), обнаружен в семенной плазме. В современных исследованиях ΐη νίίΓΟ и ίη νϊνο установлено, что РРР играет важную роль в регуляции фертильности спермы.
ткн 8\νΪ85-Ριχ>(: Р20396 рНР (амид) ТК.Н функционирует в качестве регулятора биосинтеза Т8Н в передней доле гипофиза и в качестве нейротрансмиттера/нейромо дулятора в центральной и периферической нервной системе.
ОпКН 5ινίί5-ΡΓ0ί: РО1148 ОНи’ЗУСЬ КР(О) (амид) Стимулирует секрецию гонадотропинов; стимулирует секрецию, как лютеинизирующего, так и 1 фолликулостимулирующего гормона.
- 32 016584
ССЫ6 (малый индуцибельный цитокин А16) 5\νΪ58-ΡΐΌί: 015467 рРКУРЕ^ УКТРЯТССЕК УУЕКУЬРКкЬ ννΟΥΚΚΛΕΝΟ НЬРАПРУТК ΚΝΚΕνΟΤΝΡΝ 1ЛЖ\'0ЕУ1КО ΡΝΕΡΕΕΡΤΚΝ ί8ΤνΚΙΙΤΑΚ ЖКЛ’ОЫ.МКО Обладает хемотаксической 1 активностью для лимфоцитов и моноцитов, но не для нейтрофилов. Проявляет также высокую миелосупрессорную активностью, подавляет пролиферацию миелоидных клеток-предшественников. Рекомбинантный 8СУА16 обладает хемотаксической активностью для моноцитов и ΤΗΡ-1-моноцнтов, но не для покоящихся лимфоцитов и нейтрофилов. Индуцирует поток кальция в ΊΉΡ-1 -клетках, которые предварительно десенсибилизированы посредством предыдущей экспрессии ΚΑΝΤΕ8.
ССЬ8 (малый индуцибельный цитокин А8) 5ννΪ55-ΡΓ0ΐ: Р80075 0ΡΟ8ν8Ι ΡΙΤσΰΡΝνίΝ ККНЧ0КЕЕ8 ΥΤΚΙΤΝΚΧ'Ρ К ЕАУ1ГКТК К 6ΚΕУСАГЯ'КЕ КХУКОВМКНЬ ΟΠΙΡΟΝΕΚΡ Хемотаксический фактор, привлекающий моноциты, лимфоциты, базофилы и эозинофилы. Может играть роль в неоплазии и воспалительных реакциях хозяина. Этот белок может связывать гепарин.
ССЕ2 (малый индуцибельный цитокин А2) 8и153-Рго1: Р13500 ΟΡΟΑΙΝΛ ΡνΤΕΕΥΝΓΤΝ ΚΚΙ8Υ0ΚΕΑ8 УКК1Т88КСР ΚΕΑνίΡΚΤίν ΑΚΕΙΟΑϋΡΚς ку/усдамонь οκρτοτρκτ Хемотаксический фактор, привлекающий моноциты и базофилы, но не нейтрофилы или эозинофилы. Повышает противоопухолевую активность моноцитов. Участвует в патогенезе заболеваний, характеризующихся инфильтрацией моноцитов, таких как псориаз, ревматоидный артрит или атеросклероз. Может участвовать в рекрутменте моноцитов в стенке артерий в процессе развития атеросклероза. Связывается с ССК2 и ССК4.
ССЫ8 (малый индуцибельный цитокин А18) 8νμΐδ8-ΡΓ0ί: Р55774 (^νΟΤΝΚΕΙΧ СЬУУТ83Ур1Р ςκρινϋΥδΕΤ 8Р<}сркр6у1 ЕЬТКВ.ОК.01С ΑΟΡΝΚΚννςΚ ΥΙ8Ε)ΕΚΕΝΑ Хемотаксический фактор, привлекающий лимфоциты, но не моноциты или гранулоциты. Может участвовать в В-клеточной миграции в В-клеточные фолликулы в лимфатических узлах. Привлекает нестимулированные Тлимфоциты к дендритным клеткам и активированные макрофаги в лимфатические узлы, обладает хемотаксической активностью для нестимулированных Тклеток, СО4+- и СО8+-Тклеток и поэтому может играть роль, как в гуморальных, так и в клеточио-опосредуемых иммунных ответах.
- 33 016584
фракталкин (нейротактин) 8\νΪ85'ΡΓ0ΐ: Р78423 ОННОУТ ксыггсзкмт 8К1РУАЬЕШ Υ()(}Ν9Α8ΟΟΚ КАПЕЕТКрЦ КТ.ГСАПРКГ.р λννΚϋΑΜΟΗΕϋ К()АА А1.ТК№ ОТРЕКОЮЕУ КРКТТРААСО МОЕЗУУЬЕРЕ АТОЕЗЗЗЕЕР ТР88(2ЕА(}КА ЬСТЗРЕЬРТО УТС88ОТКЕР ΡΤΡΚΑρϋΟΟΡ νΟΤΕυΚΎΡΡ \'8ТААТ\ДО88 ΑΡΗρΡΟΡδΙΛν АЕАКТ8ЕАР8 ΤΟϋΡδΤΙ^ΑδΓ Α88ΡΑΡΕΕΝΑ РЗЕСОКУ'УСО С<28РВРЕ№Ь ЕКЕЕМСРУРА НТПАГрОУ-ОР С8МАНУ8УУР У88ЕСТР8КЕ ΡνΑ8Ο8ΨΤΡΚ ΑΕΕΡΙΗΑΤΜΒ Р9КЕ<ЗУЫТР УРОАОААТВК ΟΑνΟίΕΑΓίΟ ЬЕРСЕОУАМЕ ТУОЗЬООСРК КМАОЕМАЕСЬ ΚΥΙΡΚΒΰΟδΝ 8ΥνΕνΡν Растворимая форма является хемотаксической для Т-клеток и моноцитов, но не для нейтрофилов. Связанная с мембраной форма усиливает адгезию таких лейкоцитов с эндотелиальными клетками. Может играть роль в регуляции процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелии. Связывается с схЗсгЕ
ССЬ7 (малый индуцибелъный цитокин А7) 8\νί55-ΡΓοί: Р80098 ΟΡΥΟΙΝΤ зттссук™ ΚΚΙΡΚί^ΚίΕδ ΥΕΕΤΤ85ΗΟΡ ΚΕΑνίΓΚΤΚΕ ϋΚΕίΕΛϋΡΤρ Κ\νν(?ΟΓΜΚΙ1Ε ОККТрТРКЬ Хемотаксической фактор, привлекающий моноциты и эозинофилы, но не нейтрофилы. Усиливает противоопухолевую активность моноцитов. Индуцирует также высвобождение желатиназы В. Этот белок может связывать гепарин. Связывается с ССК.1, ССК2 и ССКЗ.
орекеин А (гипокретин-1) 8\νΪ55-ΡΓθΐ 043612 0РЬРОССВ.0К ТСЗСкЕУЕЬЬ ΗΟΑΟΝΗΑΑΟΙ ЕТЬ Нейропептид, который играет важную роль в регуляции всасывания пищи и в нарушении сна, вероятно, из-за координации комплекса поведенческих и физиологических реакций этих комплементарных, связанных с гомеостазом функций. Он играет также существенную роль в связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма, нарушении функции вегетативной нервной системы, нарушении гормонального баланса и нарушении регуляции общей воды организма. Орексин-А связывается как с 0X1 К, так и с ОХ2Е с высокой аффинностью.
вещество Р К.РК ΡΡΟΓΓΟίΜ (циклизация О!п5 после отщепления остатков 1-4) Принадлежит к тахикининам. Тахикинины представляют собой активные пептиды, которые возбуждают нейроны, вызывают поведенческие реакции, являются эффективными вазодилататорами и усиливающими секрецию факторами и сокращают (прямо или косвенно) целый ряд гладких мышц.
В качестве новых физиологических субстратов для ОРСТБ идентифицированы пептиды 01 п1гастрин (длиной 17 и 34 аминокислоты), 01п!-нейротензин и 01п1-ЕРР. Гастрин, нейротензин и ЕРР несут остаток рО1и в Ν-концевом положении. Установлено, что у всех пептидов этот Ν-концевой остаток рО1и может быть образован из Ν-концевого глутамина в результате ОРСТЬ-катализа. Вследствие этого указанные пептиды активизируются с точки зрения их биологической функции при превращении Νконцевого остатка глутамина в рО1и.
Клетки, обладающие способностью к трансдукции через эпителий, прежде всего несущие гастрин (О) клетки, осуществляют координацию секреции желудочной кислоты с поступающей в желудок пи
- 34 016584 щей. В современных исследованиях установлено, что из предшественника гастрина образуются продукты, обладающие несколькими видами активности, и что существует целый ряд важных моментов в биосинтезе гастрина. Участвующие в биосинтезе предшественники и промежуточные продукты (прогастрин и С1у-гастрины), возможно, представляют собой факторы роста; их продукты, амидированные гастрины, регулируют пролиферацию эпителиальных клеток, дифференцировку продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцит-подобных клеток (Е0^-клетки), и экспрессию генов, связанных с синтезом и хранением гистамина в ЕСЬ-клетках, а также острую стимуляцию секреции кислоты. Гастрин стимулирует также производство представителей семейства эпидермального фактора роста (ЕСГ), которые, в свою очередь, ингибируют функцию париетальных клеток, но стимулируют рост поверхностных эпителиальных клеток. Концентрации гастрина в плазме у пациентов, зараженных Не11соЬас(ет ру1оп, у которых, как известно, существует повышенный риск возникновения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и рака желудка, повышены (Эосктау С.Г, I Рку8ю1, 15, 1999, сс. 315-324).
Известно, что пептидный гормон гастрин, который выделяется из антральных С-клеток, стимулирует синтез и высвобождение гистамина из ЕСЬ-клеток в кислородпродуцирующую слизистую через ΟΟΚ-2-рецепторы. Мобилизованный гистамин индуцирует секрецию кислоты в результате связывания с Н(2)-рецепторами, локализованными на париетальных клетках. В современных исследованиях сделано предположение о том, что гастрин, как в виде полностью амидированной, так и в виде менее процессированных форм (прогастрин и удлиненный глицином гастрин), также является фактором роста в желудочно-кишечном тракте. Было установлено, что основное трофическое действие амидированного гастрина связано с кислородпродуцирующей слизистой оболочкой желудка, где он вызывает повышенную пролиферацию стволовых клеток желудка и ЕСЬ-клеток, что приводит к увеличению массы париетальных и ЕСЬ-клеток. С другой стороны, основной мишенью трофического действия менее процессированного гастрина (например, удлиненного глицином гастрина), вероятно, является слизистая оболочка ободочной кишки (Кок ТЕ и Скеп Ό., Веди1 Рер( 93, 2000, сс. 337-344).
Согласно следующему варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение повышающих активность эффекторов ОРСТЕ для стимуляции пролиферации клеток желудочнокишечного тракта, прежде всего пролиферации слизистых клеток желудка, пролиферации эпителиальных клеток, дифференцировки продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцит-подобных клеток (ЕСЬ) и экспрессии генов, связанных с синтезом и хранением гистамина в ЕСЬ-клетках, а также для стимуляции острой секреции кислоты у млекопитающих путем поддерживания или повышения концентрации активного рС1и1-гастрина (8ЕО ΙΌ N0: 39 и 40).
Согласно следующему варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение ингибиторов ОРСТЕ для лечения у млекопитающих язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и рака желудка, связанного или не связанного с заражением Не1юЬас(ег ру1оп, путем снижения скорости превращения неактивного С1п1-гастрина (8Е0 ΙΌ N0: 35 и 36) в активный рС1и'-гастрин (8Е0 ΙΌ N0: 30 и 40).
Нейротензин (НТ) (8Е0 ΙΌ N0: 41) представляет собой нейропептид, участвующий в патофизиологии шизофрении, который специфически модулирует системы нейротрасмиттеров (нейромедиаторов), регуляция которых, как продемонстрировано ранее, нарушается при этом заболевании. Клинические исследования, при которых определяли концентрации НТ в спинномозговой жидкости (СМЖ), позволили выявить группу страдающих шизофренией пациентов с пониженными концентрациями НТ в СМЖ, которые восстанавливались при эффективном лечении с помощью антипсихотических лекарственных средств. Известны также данные, которые подтверждают роль НТ-систем в механизме действия антипсихотических лекарственных средств. Поведенческие и биохимические реакции при введении НТ в центральную нервную систему очень сходны с реакциями на системное введение антипсихотических лекарственных средств, и антипсихотические лекарственные средства повышают нейротрансмиссию НТ. Совокупность этих данных привела к гипотезе о том, что НТ функционирует в качестве эндогенного антипсихотического агента. Кроме того, обычные и атипичные антипсихотические лекарственные средства по-разному изменяют нейротрансмиссию НТ в области черного тела и в мезолимбических допаминсодержащих конечных областях, и эти эффекты обусловливают способность вызывать побочные действия и эффективность соответственно (Втбег Е. В. и др., Вю1 Р§усЫа(гу, 50, 2001, сс. 856-872).
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению повышающих активность эффекторов ОРСТЕ для приготовления антипсихотических лекарственных средств и/или для лечения шизофрении у млекопитающих. Эффекторы ОРСТЕ либо поддерживают, либо повышают концентрацию активного рС1ц!-нейротензина.
Стимулирующий оплодотворение пептид (ГРР), трипептид, родственный тиреотропин-рилизингфактору (ТВН), обнаружен в семенной плазме. Современные исследования т ν^(^ο и ш νί\Ό позволили установить, что ГРР играет важную роль в регуляции фертильности спермы. В частности, ГРР прежде всего стимулирует включение неспособных к оплодотворению (неактивных) сперматозоидов и существенно быстрее делает их фертильными, а затем поддерживают эту способность посредством того, что сперматозоиды не подвергаются спонтанной потере акросомы и вследствие этого не теряют способность
- 35 016584 к оплодотворению. Аденозин который, как известно, регулирует путь транедукции сигнала аденилилциклазы (АС)/цАМФ, приводит к аналогичным реакциям и фактически усиливает их. Установлено, что и ЕРР, и аденозин стимулируют производство цАМФ в неактивных клетках, но ингибируют его в активных клетках, причем ЕРР-рецепторы каким-то образом взаимодействуют с аденозиновыми рецепторами и С-протеинами для осуществления регуляции АС. Эти события влияют на состояние фосфорилирования тирозина различных белков, некоторые из которых важны для начального включения, другие, вероятно, участвуют в самой реакции акросомы. Кальцитонин и ангиотензин II, также обнаруженные в семенной плазме, оказывают аналогичные действия ш ν Иго на неактивные сперматозоиды и могут усиливать реакции на ЕРР. Эти молекулы оказывают аналогичные действия ш νίνο, оказывая влияние на фертильность путем стимуляции и затем поддержания способности к оплодотворению. Любое уменьшение доступности ЕРР, аденозина, кальцитонина и ангиотензина II или дефекты в их рецепторах приводят к развитию мужского бесплодия (Егакег Ь.К. и Абеоуа-0кщи\уа 8. А., УНат Ногт 63, 2001, сс. 1-28).
Следующим вариантом осуществления настоящего изобретения является применение ингибиторов ОРСТЬ для приготовления препятствующих оплодотворению лекарственных средств и/или для снижения фертильности у млекопитающих. Ингибиторы ОРСТЬ снижают концентрацию активного рС1и-ЕРР, что приводит к предупреждению способности к оплодотворению спермы и к инактивации сперматозоидов. В противоположность этому установлено, что повышающие активность эффекторы ОС могут стимулировать фертильность особей мужского пола и их можно применять для лечения бесплодия.
Следующим вариантом осуществления настоящего изобретения являются дополнительные идентифицированные физиологические субстраты ОРСТЬ. Они представляют собой О1п1-ССЬ2 (8ЕО ГО N0: 45), 01п1-ССЬ7 (81Т) ГО N0: 48), 01п1-ССЬ8 (8ЕО ГО N0: 44), 01п1-ССЬ16 (81Т) ГО N0: 43), 01п1-ССЬ18 (8Е0 ГО N0: 46) и С1п1-фракталкин (8Е0 ГО N0: 47) (более подробные характеристики приведены в табл. 3). Эти полипептиды играют важную роль в таких патофизиологических состояниях, как подавление пролиферация миелодных клеток-предшественников, неоплазии, воспалительные реакции хозяина, рак, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий.
В настоящее время в клинических опытах изучено несколько цитотоксических вакцин на основе Тлимфоцитарных пептидов против гепатита В, вируса иммунодефицита человека и меланомы. Одной из перспективных вакцин против меланомы, которую применяют индивидуально или в сочетании с другими опухолевыми антигенами, является декапептид ЕЬА. Этот пептид является аналогом иммунодоминантного пептида антигена Ме1ап-А/МАКТ-1, который несет №концевую глутаминовую кислоту. Известно, что аминогруппа и гамма-карбоксильная группа глутаминовых кислот, а также аминогруппа и гамма-карбоксамидная группа глутаминов легко конденсируются с образованием пироглутаминовых производных. Для решения указанных проблем, связанных со стабильностью, было разработано несколько пептидов, представляющих интерес с фармацевтической точки зрения, которые содержали пироглутаминовую кислоту вместо №концевого глутамина или глутаминовой кислоты без потери фармакологических свойств. Однако по сравнению с ЕЬА у производного пироглутаминовой кислоты (РугЕЬА), а также №концевого кэппированного ацетилом производного (АсЕЬА) не удалось сохранить цитотоксическую активность, присущую Т-лимфоцитами (СТЬ). Несмотря на то, что в РугЕЬА и АсЕЬА были внесены кажущиеся очень небольшими модификации, эти два производных, вероятно, обладают более низкой аффинностью по сравнению с ЕЬА к специфическому классу I главного комплекса гистосовместимости. Следовательно, для того, чтобы полностью сохранить активность ЕЬА, следует избегать образования РугЕЬА (Веск А. и др., ί Рер1 Кек 57, 2001, сс. 528-538). В последние годы установлено, что при меланомах происходит также сверхэкспрессия глутаминилциклазы (ОС) (Кокк И.Т. и др., №11 Сепе! 24, 2000, сс. 227-235).
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению ингибиторов ОРСТЬ для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патофизиологических состояний, например для подавления пролиферации миелоидных клеток-предшественников, неоплазии, воспалительных реакций хозяина, рака, злокачественного метастаза, меланомы, псориаза, ревматоидного артрита, атеросклероза, нарушенных гуморальных и клеточно-опосредуемых иммунных ответов, процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий.
Кроме того, при создании настоящего изобретения С1п'-орексин А (8Е0 ГО N0: 49) был идентифицирован в качестве физиологического субстрата ОРСТЬ. Орексин А представляет собой нейропептид, который играет важную роль в регуляции всасывания пищи и нарушении сна, вероятно, в результате координации комплекса поведенческих и физиологических реакций этих комплементарных связанных с гомеостазом функций. Он играет также определенную роль в связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма, функции вегетативной нервной системы, гормональном балансе и регуляции общей воды организма.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является применение ингибиторов ОРСТЬ для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения нарушенного всасывания пищи и сна, нарушенной, связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма, нарушенной функции вегетативной нервной системы, нарушенного гормонального баланса и нарушенной
- 36 016584 регуляции общей воды организма.
Экспансия полиглутамина в некоторые белки приводит к возникновению нейродегенеративных заболеваний. таких как болезнь Паркинсона и болезнь Кеннеди. Их механизм пока остается неясным. Биохимические свойства полиглутаминовых повторов позволяют дать одно из возможных объяснений: эндолитическое расщепление связи глутаминил-глутаминил с последующим образованием пироглутамата может принимать участие в патогенезе в результате повышения катаболитической стабильности. гидрофобности. амилоидогенности и нейротоксичности полиглутаминильных белков (8а16о Т.. Меб. НуроЮе5е5. 54(3). март 2000. сс. 427-429). Таким образом. настоящее изобретение относится также к применению ингибиторов ОРСТБ для приготовления лекарственного средства. предназначенного для лечения болезни Паркинсона и болезни Гентингтона.
Еще одним субстратом ОРТСБ является пептид ^ΥNΑ^ (8ЕО ΙΌ N0: 51). Его пироглутаматная форма рС1и-Туг-Л8п-Л1а-Л8р (рΕΥNΑ^) (8Е0 ΙΌ N0: 52) является эффективным агентом. который обладает блокирующим действием на потенциалзависимые натриевые каналы. Натриевые каналы экспрессируются с высокой плотностью в миелинированных аксонах и являются необходимыми для проведения потенциалов действия вдоль аксонов в головном и спинном мозге млекопитающих. Таким образом. можно предположить. что они участвуют в некоторых аспектах патофизиологии рассеянного склероза (Μ8). синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полирадикулоневропатии.
Следующим вариантом осуществления настоящего изобретения является применение ингибиторов ОРСТБ для приготовления лекарственного средства. предназначенного для лечения воспалительных аутоиммунных заболеваний. прежде всего рассеянного склероза. синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полирадикулоневропатии. при этом ингибируется блокирующий образование потенциалзависимых натриевых каналов пептид рΕΥNΑ^.
Кроме того. настоящее изобретение относится к диагностическому анализу с использованием 0Сингибитора.
Следующим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ диагностики любого из перечисленных выше заболеваний и/или состояний. заключающийся в том. что осуществляют стадии. на которых получают образец из индивидуума. который. как ожидается. поражен указанным заболеванием и/или состоянием.
приводят образец в контакт с ОС-ингибитором и определяют. поражен ли индивидуум указанным заболеванием и/или состоянием.
Предпочтительно образец. применяемый в указанном способе диагностики. представляет собой образец крови. образец сыворотки. образец спинномозговой жидкости или образец мочи.
Предпочтительно индивидуум в указанном способе диагностики. представляет собой человека.
Предпочтительно ОС-ингибитор. применяемый в указанном способе диагностики. представляет собой избирательный ОС-ингибитор.
Предпочтительно также в указанном диагностическом анализе используют избирательные ОРСТЬингибиторы.
Настоящее изобретение относится также к диагностическому набору. предназначенному для осуществления способа диагностики. который содержит средства выявления. указанные выше для диагностического анализа. и средства измерения.
Пример 1. Получение человеческой 15оОС.
Клеточные линии и среды
Клеточную линию почки зеленой африканской мартышки С08-7. клеточную линию человеческой нейробластомы 8-8Υ5Υ. клеточную линию человеческой астроцитомы £N405. клеточную линию человеческой кератокарциномы НаСаТ и клеточную линию человеческой печеночноклеточной карциномы Нер-С2 культивировали в соответствующих средах для клеточных культур (ΌΜΕΜ. 10% ФБС для Со§-7. 8Η-8Υ5Υ. £N405. НаСаТ). (№ΜΙ 1640. 10% ФБС для Нер-62). в увлажненной атмосфере. содержащей 5% С02 (НаСаТ. Нер-62. С08-7) или 10% СО2 (8Η-8Υ5Υ. 1Ν405) при 37°С.
Анализ экспрессии человеческой ЪоОС с помощью ОТ-ПЦР
Общую РНК выделяли из клеток линий 8Η-8Υ5Υ. £N405. НаСаТ и Нер-62 с помощью набора К№а§у Μίηί Кй (фирмы О1адеп) и подвергали обратной транскрипции с помощью 8ирег5спр1 ΙΙ (фирма Шуйгодеп). Затем человеческую йоОС амплифицировали. используя разведение 1:12.5 полученного кДНК-продукта. в 25 мкл реакционной смеси. содержащей ДНК-полимеразу типа Негси1а§е ЕпНапсеб (фирма 81га1адепе). используя праймеры 15оОСН-1 (смысловой. 8Е0 ΙΌ N0: 53) и йоОС11-2 (антисмысловой. 8Е0 ΙΌ N0: 54). ПЦР-продукт Нер-62 очищали с помощью набора для очистки 81га1аргер РСК. (фирма 81га1адепе) и подтверждали секвенированием.
Результаты
Анализ экспрессии человеческой ЬоОС с помощью ОТ-ПЦР
Установлено. что транскрипты человеческой йоОС присутствуют в клеточных линиях 8Н-8Υ5Υ (фиг. 6. полоса 1). £N405 (фиг. 6. полоса 2). НаСаТ (фиг. 6. полоса 3) и Нер-62 (фиг. 6. полоса 4). ПЦР
- 37 016584 продукт подтверждали секвенированием.
Выделение человеческой ЪоЦС
Полноразмерную кДНК человеческой 1§оЦС выделяли их клеток линии Нер-С2 с помощью ОТПЦР. В целом, метод состоял в следующем: общую РНК клеток Нер-С2 подвергали обратной транскрипции с помощью 8ирег8спр! ΙΙ (фирма Шуйгодеп). Затем человеческую 1§оЦС амплифицировали, используя разведение 1:12,5 полученного кДНК-продукта, в 25 мкл реакционной смеси, содержащей ДНКполимеразу типа Негси1азе Епйапсеб (фирма 8!га!адепе), используя праймеры 18оЦС6и-1 (смысловой, 8ЕЦ ΙΌ N0: 55) и 18оЦС6и-2 (антисмысловой, 8ЕЦ ΙΌ N0: 56). Образовавшийся ПЦР-продукт субклонировали в векторе рРСК8спр! САМ 8К (+) (фирма 8!га!адепе) и подтверждали секвенированием.
Пример 2. Получение и экспрессия человеческой 1§оЦС в культуре клеток млекопитающих.
Молекулярное клонирование плазмидных векторов, кодирующих слитый белок, содержащий человеческий белок ЪоЦС-ЕСГР
Все процедуры клонирования осуществляли с помощью стандартных методов молекулярной биологии. Для экспрессии слитого белка, содержащего человеческий белок 18оЦС-ЕСРР, в человеческих клетках применяли вектор рЕСРР-М (фирма Iпν^!^одеп). кДНК нативного человеческого белка 18оЦС, начинающегося либо с метионина Ι, либо с метионина ΙΙ, сливали на Мконце в рамке считывания с плазмидой, кодирующей усиленный зеленый флуоресцентный белок (ЕСРР). Праймеры 1§оЦС ЕСРР-1 Ме! Ι (8ЕЦ ΙΌ N0: 57) и 1§оЦС ЕСРР-3 (8ЕЦ ΙΌ N0: 59) применяли для амплификации белка человеческой щоЦС, начинающегося с метионина Ι, а праймеры 1§оЦС ЕСРР-2 Ме! ΙΙ (8ЕЦ ΙΌ N0: 58) и щоЦС ЕСРР-3 (8ЕЦ ΙΌ N0: 59) применяли для амплификации белка человеческой 18оЦС, начинающегося с метионина ΙΙ. Фрагмент встраивали в вектор рЕСРР-М (фирма Iпν^!^одеп), используя сайты рестрикции ЕсоК1апб 8аП, и правильность вставки подтверждали секвенированием. Затем векторы выделяли для культивирования клеток с помощью набора ЕпбоРгее Мах1 (фирма Ц1адеп).
Процедура клонирования Ν-концевых последовательностей ЫзоЦС
Кроме того, ЕСРР-последовательность вектора рЕСРР-М (фирма Шуйгодеп) интродуцировали в вектор рсЭНА 3.1 (фирма Шуйгодеп), используя для амплификации праймеры ЕСРР-1 (смысловой) (8ЕЦ ΙΌ N0: 85) и ЕСРР-2 (антисмысловой) (8ЕЦ ΙΌ N0: 86). Фрагмент интродуцировали в сайт ХМ рсЭНА 3.1. Мконцевые последовательности ЫкоЦС, начинающиеся с метионина Ι и ΙΙ, каждая из которых заканчивалась серином 53, сливали на С-конце с ЕСРР в векторе рсЭНА 3.1, используя праймеры щоЦС ЕСРР-1 Ме! Ι (смысловой, 8ЕЦ ΙΌ N0: 57) и ЫкоЦС 88 ЕСРР рсЭНА (антисмысловой) (8ЕЦ ΙΌ N0: 87) для Мконцевого фрагмента ЫкоЦС, начинающегося с метионина Ι, и 1§оЦС ЕСРР-2 Ме! ΙΙ (смысловой, 8ЕЦ ΙΌ N0: 58) и ЫкоЦС 88 ЕСРР рсЭНА (антисмысловой) (8ЕЦ ΙΌ N0: 87) для Мконцевого фрагмента ЫкоЦС, начинающегося с метионина ΙΙ. Фрагменты встраивали в сайты рестрикции ЕсоК! и МП вектора рсЭНА 3.1. Затем векторы выделяли для культивирования в клетках с помощью набора ЕпбоРгее Мах1 (фирма Ц1адеп).
Процедура клонирования для экспрессии нативных ЫзоЦС и НЦС
Нативную НОС встраивали в сайты рестрикции НтбШ и МП, а нативную ЫкоЦС встраивали в сайты рестрикции ЕсоШ и Μ!Ι вектора рсЭНА 3.1 (+) (фирма Шуйгодеп) после амплификации с использованием праймеров НОС-1 (смысловой) (8Е0 ΙΌ N0: 82) и НОС-2 (антисмысловой) (8Е0 ΙΌ N0: 83) для ПОС, 18оОС ЕСРР-1 Ме! Ι (смысловой) (8Е0 ΙΌ N0: 57) и НЬоОС рсЭНА (антисмысловой) (8Е0 ΙΌ N0: 84) для белка ЫзоОС, начинающегося с метионина Ι, и ЬоОС ЕСРР-2 Ме! ΙΙ (смысловой) (8Е0 ΙΌ N0: 58) и НпоСС рсЭНА (антисмысловой) (8Е0 ΙΌ N0: 84) для белка ЫзоОС, начинающегося с метионина ΙΙ.
Процедура клонирования меченных с помощью ЕЬАС ЫзоЦС и НЦС
Человеческую ОС клонировали с С-концевой РЬАС-меткой после амплификации с использованием праймеров НОС-1 (смысловой) (8Е0 ΙΌ N0: 82) и НОС С-РЬАС рсЭНА (антисмысловой) (8Е0 ΙΌ N0: 88) в сайтах рестрикции НшбШ и МП вектора рсЭНА 3.1. Последовательность человеческой МОС встраивали в сочетании с С-концевой РЬАС-меткой в рсЭНА 3.1 после амплификации с использованием праймеров ЬоОС ЕСРР-1 Ме! Ι (смысловой) (8Е0 ΙΌ N0: 57) и НЬоОС С-РЬаС рсЭНА (антисмысловой) (8Е0 ΙΌ N0: 89) для белка ЫзоОС, начинающегося с метионина 1, и праймеров ЬоОС ЕСРР-2 Ме! ΙΙ (смысловой) (8Е0 ΙΌ N0: 58) и НЬоОС С-РЬАС рсЭНА (антисмысловой) (8Е0 ΙΌ N0: 89) для белка ЫзоОС, начинающегося с метионина 2.
Пример 3. Иммуногистохимическое окрашивание человеческой ЬоОС в клетках млекопитающих.
Трансфекция и гистохимическое окрашивание клеток линий СО8-7 и ΕΝ405
Для экспрессии слитых белков, содержащих человеческий белок ЬоОС-ЕСЕР (слитый белок: человеческий 18оОС-ЕСРР), начинающийся либо с метионина Ι, либо с метионина ΙΙ, клетки линии С08-7 и ЬМ05 культивировали в 6-луночных планшетах, снабженных покровными стеклами. Клетки выращивали до достижения 80%-ной конфлюэнтности, трансфектировали липофектамином 2000 (фирма Iпν^ί^одеп) согласно руководству производителя и инкубировали в растворе для трансфекции в течение 5 ч. Затем раствор заменяли соответствующими средами для роста и клетки выращивали в течение ночи.
На следующий день клетки отмывали дважды Ό-ЗФР (фирма Iпν^ί^одеп) и фиксировали в охлажденном на льду метаноле в течение 10 мин при -20°С, а затем подвергали трем стадиям отмывки с использованием Ό-ЗФР в течение 10 мин при комнатной температуре. Для окрашивания зоны комплекса
- 38 016584
Гольджи клетки линии СО8-7 и ΌΝ405 инкубировали с кроличьим поликлональным антителом к маннозидазе II (фирма Сбетюоп), используя антитело в разведении 1:50 в Ό-ЗФР, в течение 3 ч. Для окрашивания митохондрий в клетках СО8-7 и ΌΝ405 клетки инкубировали с мышиным моноклональным антителом к человеческим митохондриям (фирма Сбетюоп), используя антитело в разведении 1:100 в Ό-ЗФР, в течение 3 ч при комнатной температуре. Затем клетки отмывали трижды в Ό-ЗФР в течение 10 мин. Клетки с окрашенной зоной комплекса Гольджи инкубировали с используемым в качестве вторичного антитела козьим антикроличьим конъюгированным с красителем Кбобатш-КебХ (фирма О1апоуа), в течение 45 мин при комнатной температуре в темноте. Клетки с окрашенными митохондриями инкубировали с используемым в качестве вторичного антитела козьим антимышиным конъюгированным с красителем Кбобатш-КебХ (фирма О1апоуа), в течение 45 мин при комнатной температуре в темноте. Затем клетки отмывали трижды Ό-ЗФР в течение 5 мин при комнатной температуре и в завершение наносили на покровные стекла, которые помещали на предметные стекла для микроскопа, используя заливочная среду С1бР1оиг. Клетки оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа (фирма Саг1-2е155).
Результаты
1. Трансфекция и гистохимическое окрашивание клеток ΌΝ405.
Экспрессия слитого белка: человеческий 18оОС-ЕСГР, начинающегося с метионина I и метионина II, в клетках линии ΌΝ405 (зеленая флуоресценция) приводила к компартментализации образовавшегося белка. Контрастное окрашивание зоны комплекса Гольджи в клетках ΌΝ405 с помощью антитела к маннозидазе II (красная флуоресценция) и последующее наложение окрашивания слитого белка: человеческий коОС-ЕСГР и маннозидазы II позволяет предположить, что слитый белок: человеческий боОСЕСГР локализован в комплексе Гольджи (желтое окрашивание совмещенных изображений (фиг. 7, 9). При этом установлено, что окрашивание человеческого белка коОС, начинающегося с метионина II, является достаточным для того, чтобы доказать локализацию в комплексе Гольджи слитого белка, содержащего человеческий белок коОС.
Экспрессия слитого белка: человеческий коОС-ЕСРР, начинающегося с метионина I и II (зеленая флуоресценция), и контрастное окрашивание митохондрий (красная флуоресценция) не доказало локализацию слитого белка: человеческий коОС-ЕСРР, начинающегося с метионина I или II, в митохондриях из-за отсутствия желтого окрашивания совмещенных изображений после наложения окрашивания (фиг. 8, 10).
2. Трансфекция и гистохимическое окрашивание клеток СО8-7.
Аналогично экспрессии слитого белка: человеческий коОС-ЕСРР, начинающегося с метионина I и метионина II, в клетках линии ΌΝ405, экспрессия слитого белка: человеческий коОС-ЕСРР, начинающегося с метионина I и метионина II, в клетках линии СО8-7 приводила к компартментализации образовавшегося белка (зеленая флуоресценция). Контрастное окрашивание зоны комплекса Гольджи в клетках линии СО8-7 с помощью антитела к маннозидазе II (красная флуоресценция) и последующее наложение окрашивания слитого белка: человеческий коОС-ЕСРР и маннозидазы II позволяет предположить, что слитый белок: человеческий коОС-ЕСРР локализован в комплексе Гольджи в клетках линии СО8-7 (желтое окрашивание совмещенных изображений (фиг. 11, 13). И в этом случае установлено, что окрашивание слитого белка: человеческий коОС-ЕСРР, начинающегося с метионина II, является достаточным для того, чтобы доказать его локализацию в комплексе Гольджи в клетках линии СО8-7.
Как и ожидалось, экспрессия слитого белка: человеческий коОС-ЕСРР, начинающегося с метионина I и II, в клетках линии СО8-7 (зеленая флуоресценция), и контрастное окрашивание митохондрий (красная флуоресценция) не позволила выявить локализацию слитого белка: человеческий коОС-ЕСРР, начинающегося с метионина I или II, в митохондриях из-за отсутствия желтого окрашивания совмещенных изображений после их наложения (фиг. 12, 14).
Пример 4. Экспрессия и очистка человеческой коОС в Е. соб.
Штаммы-хозяева и среды
Штамм ЕксбепсЫа соб ΌΗ5α применяли для размножения плазмид, а штамм Е. соб ВЬ21 применяли для экспрессии человеческой коОС. Штаммы Е. соб выращивали, трансформировали и анализировали согласно инструкциям производителя (фирма О1адеп (ΌΗ5α), фирма 8йа1адепе (ВЬ21)). Среды, необходимые для Е. соб, т.е. среду Луриа-Бертани (ЬВ), получали согласно рекомендациям производителя.
Молекулярное клонирование плазмидных векторов, кодирующих человеческую ОС
Все процедуры клонирования осуществляли, применяя стандартные методы молекулярной биологии. Для экспрессии в Е. соб ВЬ21 использовали вектор рЕТ41а (фирма №уадеп). кДНК зрелого белка человеческой коОС, начинающуюся с кодона 30 (считая от метионина II), сливали в рамке с плазмидой, кодирующей С8Т-метку. После амплификации с использованием праймеров бкоОС рЕТ41а-1 (8ЕО ГО NО: 60) и 1и5оОС рЕТ41а-2 (8ЕО ГО NО: 61) (табл. 4) интродуцировали Ν-концевой протеазный сайт расщепления, распознаваемый энтерокиназой, и С-концевую (Нк)6-метку. После субклонирования фрагмент встраивали в экспрессионный вектор, используя сайты рестрикции 8ре I и ЕсоК I.
Экспрессия и очистка в штамме Е. соб ВЬ21
Конструкцией, кодирующей человеческую коОС, трансформировали ВЬ21-клетки (фирма
- 39 016584
81га1адепе) и выращивали на агаровых планшетах с селективной ЬВ-средой при 37°С. Экспрессию белка осуществляли в ЬВ-среде, содержащей 1% глюкозы, при 37°С. После достижения значения ОП600 приблизительно 0,8, экспрессию ВоОС индуцировали с помощью 20мкМ ИПТГ в течение 4 ч при 37°С. Клетки отделяли от среды центрифугированием (4000хд, 20 мин), ресуспендировали в ЗФР (140 мМ №1С1. 2,7мМ КС1, 10мМ Ыа2НРО4, 1,8мМ КН2РО4, рН 7,3) и лизировали с помощью одного цикла замораживания и оттаивания с последующим одним циклом обработки с использованием устройства типа Егепсй Рге§8. Клеточный лизат разводили до конечного объема 1,5 л с помощью содержащего фосфат буфера (50мМ Ыа2НРО4, 500мМ ЫаС1, рН 7,3) и центрифугировали при 13400хд при 4°С в течение 1 ч. После центрифугирования определяли концентрацию белка образовавшегося супернатанта методом Брэдфорда. При необходимости раствор еще раз разводили до получения конечной концентрации общего белка 0,6 мг/мл. Слитый белок С8Т-йоОС очищали с помощью 4-стадийного протокола (табл. 5). Очистка с помощью метода ДСН-ПААГ проиллюстрирована на фиг. 20.
Пример 5. Анализ глутаминилциклазной активности.
Флуорометрические анализы
Все измерения осуществляли с использованием с помощью ридера типа Ν0ν08ΐ3Γ для микропланшетов (фирма ВМС ЬаЫесйпо1од1е8) при 30°С. Активность ОС оценивали флуорометрически с использованием в качестве субстрата Η-ΟΙη-βΝΑ. Образцы содержали 0,2мМ флуорогенный субстрат, 0,25 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма О|адеп, Гильден, Германия) в 0,05М Трис/НС1, рН 8,0 и аликвоту соответствующим образом разбавленной ОС в конечном объеме 250 мкл. Длины волны возбуждения/испускания составляли 320/410 нм. Предназначенные для анализа реакции инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность ОС определяли из стандартной кривой для β-нафтиламина в условиях анализа. За единицу принимали количество ОС, катализирующее образование 1 мкмоль ρΟ1ι.ι-βΝΑ из НΟ1η-βΝΑ в мин в описанных условиях.
Во втором флуорометрическом анализе активность ОС определяли, используя в качестве субстрата Н-С1п-АМС. Реакции осуществляли при 30°С с помощью ридера типа Ν0ν08ΐ3Γ для микропланшетов (фирма ВМС ЬаЫесйпо1од1е8). Образцы содержали различные концентрации флуорогенного субстрата, 0,1 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма 01адеп) в 0,05М Трис/НС1, рН 8,0 и аликвоту соответствующим образом разбавленной ОС в конечном объеме 250 мкл. Длины волны возбуждения/испускания составляли 380/460 нм. Предназначенные для анализа реакции инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность ОС определяли из стандартной кривой для 7-амино-4-метилкумарина в условиях анализа. Результаты кинетических анализов обрабатывали с помощью программы ОгаЕй.
Спектрофотометрический анализ БоОС
Этот анализ применяли для оценки кинетических параметров большинства субстратов ОС. Активность ОС анализировали спектрофотометрически с помощью непрерывного анализа (8сЫ11тд 8. и др., Вю1 Сйет 384, 2003, сс. 1583-1592) с использованием глутаматдегидрогеназы в качестве вспомогательного фермента. Образцы содержали соответствующий субстрат ОС, 0,3мМ НАД-Н, 14мМ αкетоглутаровую кислоту и 30 ед./мл глутаматдегидрогеназы в конечном объеме 250 мкл. Реакции инициировали, добавляя ОС, и оценивали снижение абсорбции при 340 нм в течение 8-15 мин.
Оценивали начальные скорости и ферментативную активность определяли из стандартных кривых для аммиака в условиях анализа. Все образцы оценивали при 30°С с использованием ридера для микропланшетов типа 8ипп5е. Данные кинетических анализов обрабатывали с помощью программы ОгаЕй.
Анализ ингибирования
При анализе ингибирования состав образца соответствовал описанному выше, за исключением того, что в него добавляли предполагаемый ингибитор. Для быстрой оценки ингибирования ОС использовали образцы, содержащие 4мМ соответствующий ингибитор и субстрат в концентрации, соответствующей 1 КМ. Для более детального исследования ингибирования и определения значений К1 сначала оценивали влияние ингибитора на вспомогательные ферменты. В каждом случае не было выявлено никакого влияния на любые другие применяемые ферменты, что позволяет достоверно оценивать ингибирование ОС. Константу ингибирования определяли путем аппроксимации набора характеризующих процесс кривых с помощью общего уравнения для конкурентного ингибирования с использованием программы ОгаЕй.
Результаты
Оценивали ряд различных субстратов в отношении превращения с помощью человеческой ВоОС (табл.3). Для всех анализируемых субстратов характерно превращение под действием ВоОС, что свидетельствует об относительно невысокой общей специфичности, что свойственно также и человеческой ОС (8сЫ11шд 8. и др., Вю1 Сйет 384, 2003, сс. 1583-1592). Как установлено ранее для человеческой ОС (8сЫ11шд 8. и др., Вю1 Сйет 384, 2003, сс. 1583-1592), наиболее высокие константы специфичности (кса1/КМ) выявлены для субстратов, несущих крупные гидрофобные аминокислоты, расположенные по соседству с Ν-концевым глутаминильным остатком, например, С1п-АМС. В противоположность этому, присутствие отрицательно заряженных остатков в этом положении приводило к резкому снижению специфичности, что установлено для О1п-О1и, что свидетельствует о том, что активный сайт ВоОС несет
- 40 016584 отрицательный заряд. По сравнению с человеческой ОС обе рекомбинантные ЬоОС обладали более низкой ферментативной активностью (фиг. 21). Различие достигало одного порядка. На основе данных о специфичности ЬоОС можно предположить, что этот фермент ответственен за превращение различных субстратов ίη νίνο, т.е. 15оОС участвует в образовании многих различных физиологических субстратов.
Активность человеческой 15оОС конкурентно ингибировалась имидазольными производными (табл. 6, фиг. 15). Константы ингибирования К1, для имидазола и бензимидазола оказались очень близки к значению, ранее полученному для человеческой ОС. Однако для эффективного ингибитора ОС Р150/03 обнаружено 10-кратное снижение значения К1. Таким образом, механизм связывания хелатирующего фрагмента, т. е. имидазольного кольца, по-видимому, является очень похожим. Вероятно, это является результатом образования комплекса между активным сайтом иона цинка ОС и ЬоОС и основным азотом имидазола. Различия в значения К1 для Р150/03 ясно демонстрирует, что активные сайты обоих ферментов характеризуются тонкими различиями. Таким образом, можно создавать ингибиторы, обладающие избирательным действием в отношении одной изоформы фермента. Избирательные ингибиторы являются важными для лечения заболеваний.
Таблица 3. Кинетическая оценка пептидных субстратов человеческой ОС и человеческой 15оОС. Человеческую 15оОС экспрессировали в Е. сой ВЬ21 (НЬоОСб!) или Р. раМогЬ (УЯЯЫкоОС). Субстраты обозначены с помощью однобуквенного кода аминокислот
Субстрат Км (мМ) Ь|8О0СЙ( Км (мМ) У55ЫзоОС <4« (с1) 1115О(?С61 (С’1) У58Ы8о(}С ^са/Км (мМ-'хс’1) Ы5О(ЭС(11 Ца(/Км (мМ'Чс·1) ΥδδΙιϊϋοΟΟ
Ο-βΝΑ 0,0310,002 0,03510,0005 3,3710,12 8,1610,87 93,26+6,68 228,70122,22
ОАМС 0,01 ±0,0009 0,0310,0064 1,07+0,03 3,7210,44 62,5715,68 102,87129,22
00 0,11+0,027 0,1110,007 2,72+0,25 6,08+0,17 24,50+4,009 54,32+4,61
ОЕ 0,710,13 0,6110,064 2,6410,21 5,3310,43 3,85+0,56 8,7510,87
ОС 0,4210,04 0,3610,047 1,6510,04 3,2410,18 3,9310,31 9,0111,75
ООР 0,2110,016 0,2310,02 4,0110,14 8,98+0,07 18,82+1,26 38,4213,55
ΟΥΑ 0,2210,01 0,08+0,022 7,710,4 16,4710,72 66,48113,07 206,9157,54
ОГА 0,11+0,016 0,10410,025 7,4910,28 11,68+2,39 33,0312,38 116,99+34,37
ΟΕΥΡ 0,0310,004 0,04+0,004 3,3410,15 5,6410,39 109,57121,03 122,5615,6
ОЕОЬ 0,63+0,052 0,16+0,01 6,4110,15 9,24+0,65 10,210,84 55,04+5,14
Таблица 4. Используемые праймеры
Праймер Последовательность 5’4 3’ Применение
150<2СЬ-1 (8Е<? ΙΟΝΟ: 53) ССТСТАСАССАТТТОСАССОССТССС Скрининг клеточных линий
гворСИ-2 (8Е0 ΙΟ ΝΟ: 54) баСТТСОААОТАСАТСАСТТССТСОСб Скрининг клеточных линий
- 41 016584
15офСЪи-1 (5Е<2 1ϋ ΝΟ; 55) АССАТСсаттссоосаоссосооо Выделение ЫзоОС
150<ЭСки-2 (8Е<3 Ю ΝΟ: 56) АСССТАСА0ССССА0СТАТТСА6ССА0 Выделение ЮзсИ^С
1зо<ЗС ЕСГР-1 Μβΐ ι (БЕЦ ГО ΝΟ: 57) АТАТАТ0ААТТСАТСССТТССС6ССССССС Клонирование человеческой 1зорС (Ме11) в векторе ΡΕ6ΡΡ-Ν3
150рС ЕСРР-2 Ме111 (8Е0 ГО ΝΟ; 58) АТАТАТОААТТСАТОСАОССАСТСТТСССОССО Клонирование человеческой 13оОС (Ме111) в векторе ΡΕ0ΕΡ-Ν3
1яорС ЕОРР-3 (5Ер Ιϋ ΝΟ: 59) АТАТАТОТСОАС6А6ССССАООТАТТСА6ССАО Клонирование человеческой 15офС (Ме1 I и Ме( П) в векторе ρΕ0ΡΡ·Ν3
Ь1зорС рЕТ41а-1 (8Ер 10 N0: 60) АТАТАСТАСТСАТСАССАС САСААСТТСТАСАССАТТТССАССС Клонирование человеческой 1зорС в векторе рЕТ41а
ЫзорС рЕТ41а-2 (5Е9 10 ΝΟ: 61) ТАТАОААТТССТАОТОАТООТ С АТССТОАТС6А6ССССАС СТАТТСАСС Клонирование человеческой 1зо()С в векторе рЕТ41а
Ызо<}С ΗΙ8 С- Тегт ρΡΙΟΖΑΑ-Ι (8ЕЦ ГО ΝΟ: 62) АТА ТСА АТТ СТТ СТА САС САТ ТТС ОАО С Клонирование человеческой 15о()С в векторе ΡΡΙΟΖαΑ
Ь|яорС Н18 ΝТегт рР1С2АА-1 ГЧРП ТП МП· АТА ТСА АТТ ССА ТСА ССА ТСА ССА ТСА СТТ СТА САС САТ ТТС ОАО ССО С Клонирование человеческой 15оС>С (ι □рртлпд РРГ(~,7гнД
ЫзорС ΗΙ8 Ν- Тепп ρΡΙΟΖΑΑ-2 (8Е<? Ю N0: 64) 5’- АТА ТАТ ССС ОСС ССС ТАС АСС ССС АСС ТАТ ТСА СС-3’ Клонирование человеческой 1зоОС в векторе ΡΡΙΟΖαΑ
13орСт КТ а (смысловой) (8Е0 ΙΟΝΟ: 65) ССА ССА ТСС АСС СТА ТТС АС ПЦР-анализ в реальном времени 13о(?С
Ы5О0С ΗΙ3 с- Тегт ρΡΙΟΖΑΑ-2 (БЕО ΙΟΝΟ: 66) АТА ТАТ ССС ССС ССС ТАС ТСА ТСС ТСА ТСС ТСА ТСС АСС ССС АСС ТАТ ТСА ССС АС Клонирование человеческой 150рС в векторе ΡΡΙΟΖαΑ
(зоОСт КТ аз (антисмысловой) (БЕО Ю N0: 67) ТТС САС АСС ССС ССС ССС С ПЦР-анализ в реальном времени 1500С
18оОСш Ме(1 а (8Е0 ГО ΝΟ: 68) АТС АСТ ССС СОС АСС ССС Клонирование кДНК мышиной 1зорС
1зорСгп Ме11 аз (8Ер ΙΟ ΝΟ: 69) СТА ОАО ТСС САС СТА СТС Клонирование кДНК мышиной 13оОС
15орСт квгг з (8ЕР ΙΟΝΟ: 70) АСТ ТСС ТСС ССС ТСС ТСС тс Клонирование кДНК мышиной 1300С
тОС КТ з (8Е0 ГО ΝΟ: 71) АТС ААС АСС САС САА ССА АС ПЦР-анализ в реальном времени трС
трС КТ аз (8Е0 ΙΟ N0: 72) СТС САТ ААТ АТТ ТСС АТА С ПЦР-анализ в реальном времени т()С
- 42 016584
трС КТ Ν-конц. 8 (8Е0 ΙΟΝΟ: 73) АСА ОСТ 606 ААТ СТ6 А6Т С ПЦР~анализ в реальном времени т(?С
тС)С КТ Ν-конц. аа (8Еф ΟΝΟ: 74) ОАО САО ААТ ДОС ТТС СОО ОСО ПЦР-анализ в реальном времени трС
18Ο-Ι55Ν8 (5Е(? ГО N0: 75) СТ6 СОО ОТС ССА ТТО ААС 66А АОС СТС ССС ОАА Сайтнаправленный мутагенез Ь|зо(}С Ι55Ν
150-15514 аз (5Е0 ΙΠΝ0: 76) ТТС 600 ОАО ОСТ ТСС ОТТ САА ТСС САС ССС САС Сайтнаправленный мутагенез МзоОС Ι55Ν
18О-С351 аз (8Ер ΙΟ ΝΟ: 77) АСО СТА САС ААС ТТС ССС ССС АТТ СТС ОСТ ОТС Сайтнаправленны й мутагенез Ь|зофС С351А
)зо-С351Ааз (КЕС? 10 N0: 78) САС А6С САО ААТ ССО ООС САА СТТ ОТС ТАС СОТ Сайтнаправленный мутагенез ЫзорС С351А
НфС-1 (8Еф 1О N0: 82) АТАТАТААССТТАТСОСА66СОСААОАСАС Инсерция нативного белка ЬрС в рсОЫА 3.1
Ь<ЗС-2 (8Е0 ГО N0: 83) АТАТССССССССТТАСАААТСАА6АТАТТСС Инсерция нативного белка РОС в ροϋΝΑ 3.1
ЫзофС ρεϋΝΑ аз (5Е0 Ю N0: 84) АТАТАТСССОСССССТАСАСССССАООТАТТСАОС Амплификация ЫзорС, включая стоп-кодон для инсерцин в ροΟΝΑ 3.1
ЕОРР-1 (8Еф 1ΟΝΟ 85) АТАТСТССАСТССАТССССАССАТ66Т6АОС Амплификация Е6ГР
Е6РР-2 (8Е0 ГО N0: 86) АТАТСТССА6ТТАСТТСТАСА 6СТС6ТССАТ Амплификация ЕОРР
Ь1зоОС 58 ЕОРР ροϋΝΑ аз (8Εφ ГОРЮ: 87) АТАТССССССОСАТСТСОАСССТССАААТССТСТАСААССС Амплификация Ν-концевоЙ последовательности ЫзорС
Ь<}С С-РЬАО ροΟΝΑ аз (8Еф Ю N0: 88) АТАТОСО6ССССТТАСТТ6ТСАТСОТСАТССТТ6ТААТС САААТС А АСАТАТТССАА Амплификация С-ЕЬАС
ЫзоОС С-РЬАО ροΟΝΑ аз (8Е<5 ГО ΝΟ: 89) АТАТОССОССОССТАСТТОТСАТСОТСАТССТТСТА АТССАСССССАСОТАТТСАСС Амплификация Ь(зорС С-Е1а§
Нз ОРСТ 1 80 ОиапНТес! Рптег Аззау (200), фирма СИадеи, Гильден цПЦРьос
На фРСТЬ 1 80 ОиапИТесС Рптег Аазау (200), фирма (Щадеп, Гильден цПЦР Ь-15оОС
ССЕ2-Р (8Еф ΙΟΝΟ: 90) ССЬ2-К (8Е0 ΙΟΝΟ: 91) СССТССАССАТОАААОТСТС САСАТСТССТТССССАСААТ ЧПЦР ССЬ2
ССЬ7-Р (8Еф ГОМО: 92) ССТ7-К (8Е0 ГО ΝΟ. 93) АТОАААОССТСТОСАОСАСТ ТСССТАСТССТ06ТССТТСТ дПЦР ССЕ7
- 43 016584
ССБ8-Р (БЕ<5 ГО N0: 94) ССД8-К. (5Е0 ГО N0: 95) ТСАССТОСТОСТТТААСОТО АТСССТОАСССАТСТСТССТ ЧПЦР ССЬ8
ССЫЗ-Р (5Е(} ГО N0: 96) ССЕ13-К (5Е<5 ГО N0: 97) АТСТССТТССАОАОССТСАА АСААСАСОАОаССАСАОбАС ЧПЦР ССЕ13
ΗΙΡΙα-Ρ (8Е0 Ю N0: 98) ΗΙΡΙα-Κ (ЯЕр ГО ΝΟ: 99) САСАСАААТСОССТТСТСАА ССААССАОСТСАТАОСТСОТ <|ПЦР ΗΙΡΙα
А1М1-Р (3Ε0 ГО N0:100) ΑΙΜ1-Κ (ЗЕР ГО N0:101) ТССТТТСАТССТООААССТО С6ССТСТТСТ0ТТТСАССТС ЧПЦР ΑΙΜ1
А1М2-Р (8ЕС) ГО N0:102) ΑΙΜ2-Κ (8Е0 ГО N0:103) ААСС0СТСТТТ6ССАСТТАТ САСАСОТОАООСССТАТТТА дПЦР ΑΙΜ2
МАОЕА1-Р (5Е<3 Ю N0:104) МАСЕА1-К (8Е0 ГО N0:105) СТСААСА6АТССТССССА0А САОСАТТТСТ6ССТТТ6ТОА ЧПЦР МА6ЕА1
МАСЕА2-Р (8Е<3 ГО N0:106) МАОЕА2-К (8Е0 ГО N0:107) АССТОбАОАОССТСАйОААТ стсасатсстАсттотсАос ЧПЦР МАСЕА2
МАОЕАЮ-Р (8Е0 ГО N0:108) МАСЕА10-К. (5Е0 ГО N0:109) ААО СО АООТТСТСОТТСТОА ТОАССТСТТОСТСТСССТОТ ЧПЦР МАОЕАЮ
МАОЕВ2-Р (8Е0 ГО N0:110) ΜΑΟΕΒ2-Κ |'8Ер ГО N0:111) СТТСААССТСТССТОСТОСТ СО АСССТОАСТТССТО ОТТА ЯПЦР МАСЕВ2
МАЯТ1-Р (5Е9 10 N0:112) МАКТ1-К. (5Ер Ю N0:113) сстсАтсоостаттсатАтт АТААССАССТССАС САТТС С цПЦР МАЙ.Т1
мсы-р (5Е0 ГО N0:114) мсы-к (БЕО ΙΟ N0:115) АТОСТТСОСАААСТОСАСАТ АТООТТСОАТССАОСТТТСТ дПЦР мсы
ΤΥΚ-Ρ Ι8Ρ.0 ГО N0:116) ΤΥΚ-Κ (8Е<? ГО N0:117) ТАСОСССТААТССТООАААС АТТСТССАТОСТССТТТСАО дГЩР ТУК
ΤΥΚΡ1-Ρ (8Е() 10 N0:118) ΤΥΚΡ1-Κ (8Е0 ГО N0:119) ССОАААСАСАОТООААООТТ ТСТОТОААООТСТОСАООАО дПЦР ΤΥΚΡ1
ΤΥΚΡ2-Ρ (ЗЕ<Э ГО N0:120) ΤΥΚΡ2-Κ (8Е0 ГО N0:121) ООТТССТТТСТТСССТССАС ААССАААОССАССАСТОТТС дПЦР ΤΥΚ.Ρ2
- 44 016584
Таблица 5. Очистка слитого белка С8Т-1коОС после экспрессии в Е. сой. Очищенный слитый белок использовали для определения ОС-активности
Стадия очистки 1 2 3 4
Метод Νϊ2*-ΙΜΑ€ (ЕВА) 08Т-метка АС ОР (обессоливание) ΙΕΧ 1 (ΠΝΟ 5)
Тип колонки хелатирующая глутатион сефадекс Матрикс типа
(фирма АтегзЬат сефароза сефароза 0-25 Рте «непрерывного
Вю8С1епсе8 АВ, Швеция) Еаз( Ρ1ο\ν 4 Раз! Ρ1ο<ν слоя» (фирма ВЮ-Ка^)
Размер колонки <1=2,5 см 4=1,6 см <1=2,6 см ά=Ι,2 см
1=42 см 1=10 см 1=10 см 1=5,3 см
СУ—206 см1 СУ=20 см3 СУ=53 см3 СУ=6 см3
Уравновешивающий буфер ЗФР ЗФР 25мМ Мез 25мМ Мел
рН 7,3 7,3 6,0 6,0
Объем ЮСУ ЮСУ ЮСУ ЮСУ
Промежуточный буфер (буфер для отмывки) ЗФР, 0,5мМ гистидин ЗФР 25мМ Мез
рн 7,3 7,3 6,0
Объем ЮСУ ЮСУ ЮСУ
Буфер для элюции ЗФР, 100мМ гистидин 50мМ Трис, ЮмМ глутатион (восстановленный) 25мМ Мея 25мМ Мез, элюция в градиенте ИаС1
рн 7,3 «,0 6,0 6,0
Объем 1,5 СУ («обратный» поток 1 СУ СУ
Таблица 6. Значения К1, характеризующие конкурентное ингибирование человеческой ОС и человеческой 1коОС имидазольными производными.Человеческую 1коОС экспрессировали в Е. сой ВЬ21 (ЫкоОСЫ) или Р. рак!опк (У88ЫкоОС).
Ингибитор К, (мкМ) Й150ЦС<Й К, (мкМ) У85Ызо0С К, (мкМ) ЙЦС
имидазол 220 ± 1 235+ 13 103 + 2
бензимидазол 200 ±8 250 ±5 138 ± 4
1 -бензил имидазол 7,3 + 0,5 6,2 ± 0,2 7,1 + 0,1
1 -метилимидазол 80 ±5 82 ±3 39,7 ± 0,2
ΡΒϋ150 1-(3,4диметоксифенил)-3(3 -имидазол-1 -илпропил)тиомочевина 0,48 + 0,03 0,519 + 0,001 0,0584 ± 0,0002
Пример 6. Экспрессия и очистка человеческой 1коОС в Р. рак!опк.
Штаммы-хозяева и среды
Штамм ЕксЙепсЫа сой ΌΗ5α применяли для размножения плазмид, а штамм Р. рак1ог1к Х-33 применяли для экспрессии человеческой 1коОС в дрожжах. Штаммы Е. сой и Р. рак(ог1к выращивали, трансформировали и анализировали согласно инструкциям производителя (фирма О1адеи (ΌΗ5α), фирма [иу!1годеи (Х-33)). Среды, необходимые для Е. сой, т.е. среду Луриа-Бертани (ЬВ) получали согласно рекомендациям производителя. Среды, необходимые для РюЫа рак1ог1к, т.е. ВММУ, ВМСУ, УРЭ, УРЭ8, включающие требуемую концентрацию антибиотиков, т.е. зеоцина, приготавливали согласно методу, описанному в руководстве для РюЫа (фирма I^нν^ΐ^оден, каталожный номер. К1740-01). В руководстве представлены также все необходимые требования по работе с дрожжами.
Молекулярное клонирование плазмидных векторов, кодирующих человеческую ОС
Все процедуры клонирования осуществляли согласно стандартным методам молекулярной биологии. Для экспрессии в РюЫа рак1ог1к Х-33 использовали рР^СΖαА (фирма Iнνй^оден). кДНК зрелого белка человеческой 1коОС, начинающуюся с кодона 30 (считая от метионина II), сливали в рамке считывания с плазмидой, кодирующей α-фактор, что обеспечивало секреторный путь для белка. После амплификации с использованием праймеров ЫкоОС Ш8 С-Тегт рРIСΖАА-1 (8Е0 ГО N0: 62) или ЫкоОС Ш8 N Тегт рРIСΖАА-1 (8Е0 Ю N0: 63) в качестве смысловых праймеров и ЫкоОС Ш8 Н-Тегт рРIСΖАА-2 (8Е0 Ю N0: 64) и ЫкоОС Ш8 С-Тегт рРIСΖАА-2 (8Е0 ГО N0: 66) (табл. 4) в качестве антисмысловых праймеров фрагмент встраивали в экспрессионный вектор с помощью сайтов рестрикции ШИ и ЕсоК I. В зависимости от конструкции интродуцировали мутации в кодоны 55 (Не) и 351 (Сук). Мутагенез осуществляли с помощью стандартного метода ПЦР с последующим расщеплением родительской ДНК с помощью ЭрЫ (набор для сайтнаправленного мутагенеза типа ^и^к-сйанде II, фирма 817313^1^, каталожный номер 200524). Созданные конструкции проиллюстрированы схематически на фиг. 17.
- 45 016584
Трансформация Р. раЧопх и маломасштабная экспрессия
Плазмидную ДНК (1-2 мкг) применяли для трансформации компетентных клеток Р. раЧопк путем электропорации согласно инструкциям производителя (фирма ВюИаф. Отбор осуществляли на планшетах, содержащих 100 мкг/мл зеоцина. Для оценки рекомбинантных клонов дрожжей в отношении экспрессии юОС рекомбинанты выращивали в течение 24 ч в 10-миллилитровых конических пробирках, содержащих 2 мл ВМСУ. После этого дрожжи центрифугировали и ресуспендировали в 2 мл среды ΒΜΜΥ, содержащей 0,5% метанола. Эту концентрацию поддерживали, добавляя метанол каждые 24 ч в течение примерно 72 ч. Затем определяли активность ОС в супернатанте. Клоны, характеризующиеся наиболее высокой активностью, отбирали для дополнительных экспериментов и ферментации. В зависимости от экспрессируемой конструкции активность ЬоОС в среде оказалась различной (фиг. 18).
Экспрессия и очистка ЫкоОС в Р. раЧопх
Для крупномасштабной экспрессии юоОС в Р1сЫа ракопк сохраняли условия, описанные для маломасштабной экспрессии, однако используемый общий объем составлял 8 л. Экспрессию осуществляли во встряхиваемых колбах. После экспрессии клетки отделяли от среды центрифугированием (1500хд, 20 мин) и дебрис отбрасывали. Значение рН супернатанта доводили до нейтрального, вновь центрифугировали и использовали для первой стадии очистки. Белок юоОС очищали с помощью трехстадийного протокола (табл. 7). Результаты очистки продемонстрированы по данным ДСН-ПААГ на фиг. 19.
Таблица 7. Очистка НюоОС (А881и8оОС№5[С351А С-НЬ) после экспрессии в Р. раЧопк. Очищенный белок использовали для определения ОС-активности и зависимости от значения рН.
Стадия очистки 1 2 3
Метод Ы12+-1МАС Н1С ОР (обессоливание
Тип колонки (фирма АтегзЬат Вюзсиепсез АВ, Швеция) хелатирующая сефароза Ρ1ο\ν бутил-сефароза 4Ра&1 ΡΙονν сефадекс 6-25 Ρίηδ
Размер колонки ¢1-2,5см 1=42 см СУ-206 см3 [)-1,6 см 1=15,5 см СУ=23см3 ά=2,6 см 1=10 см СУ=53 см3
Уравновешивающий буфер рН Объем 50мМ ΝβΗ2ΡΟ4 7,0 ЮСУ ЗОмМ ΝηΗ2ΡΟ4 1М (ΝΗ4)25Ο4 7,0 ЮСУ 50мМ бис-Трис ЮОмМ ИаС1 6,8 ЮСУ
Промежуточный буфер (для отмывки) рН Объем 50мМ ΝίΐΗ,ΡΟ., 0,5 мМ гистидин 7,0 ЮСУ ЗОмМ ЦаНгРО, 1Μ(ΝΗ4)28Ο4 7,0 6СУ -
Буфер для элюции рн Объем 50мМ ИаНзРО, ЮОмМ гистидин 7,0 1,5 СУ 30μΜΝ3Η2ΡΟ4 7,0 5 СУ 50мМ бис-Трис ЮОмММаС! 6,8 1СУ
Результаты
Человеческую юоОС можно успешно экспрессировать в метилтрофных дрожжах Р. раЧопк. Создавали несколько различных конструкций для выбора наилучших условий экспрессии в дрожжах (фиг. 17). Как проиллюстрировано на фиг. 18, активность ОС, которая экспрессируется и присутствует в среде экспрессирующих клеток, варьирует в зависимости от экспрессируемой конструкции. Интродукция сайта гликозилирования приводила к правильной секреции, что можно обнаружить при использовании конструкций Υ§§Ыκо^СN55IС351А С-НЬ и Υ§§Ыκо^СN55I С-Н18. Поскольку конструкция ΥδδΗί8оОС№5[С351А С-Н18 обладала наиболее высокой активностью в среде, осуществляли ее крупномасштабную экспрессию и очищали. Очистку проводили согласно схеме, представленной в табл. 7, выход очищенного продукта составлял 59%. Белок, кажущийся гомогенным, был гликозилированным, что установлено по сдвигу миграции в сторону, соответствующую более низкой молекулярной массе (фиг. 19). Гликозилирование не влияло на каталитическую активность фермента.
Пример 7. Зависимость от каталитической активности ЫкоОС от значения.
Флуорометрический анализ с использованием Н-С1п-вНА (описанный в примере 5) применяли для изучения зависимости каталитической специфичности от значения рН. Реакции осуществляли при концентрации субстрата 7мкМ, т.е. при [8]<<ΚΜ. При этом, установленные константы специфичности можно непосредственно выводить из начальной скорости, определенной с помощью кривых превращения субстрата. В этом исследовании реакционный буфер содержал 0,075 М уксусную кислоту, 0,075 М Мек и 0,15 М Трис, при этом для достижения требуемого значения рН использовали НС1 или №10Н. Буфер гарантировал постоянную ионную силу в широком диапазоне значений рН. Оценку полученных кинетических данных для фермента осуществляли с помощью следующего уравнения:
кса1/Км(рН) = кса(/Км(предел)х1/(1 + [Н+]/Кнз + КЕ ι/[Η+] + КЕ1/[Н+]хКЕ2/[Н+]),
- 46 016584 в котором кса!/КМ(рН) обозначает зависимый от значения рН (измеренный) кинетический параметр, ксЕц/КМ(предел) обозначает независящее от значения рН (ограничивающее, предельное) значение, КН8, КЕ1 И КЕ2 обозначают константы диссоциации диссоциирующей группы при кислых значения рН и двух диссоциирующих групп фермента соответственно. Оценку всех кинетических данных осуществляли с помощью программы СгаЕй кой^аге (версия 5.0.4. для фирма ЕКГГНАСи8 80ЕТVАКΈ Иб.,
Хорлей, Великобритания).
Результаты
Для 1лкоОС оптимум специфичности обнаружен при значении рН 7-8. Такие оптимальные для катализа значения рН очень близки к значениям, установленным для человеческой ОС. Подгонка данных к соответствующей модели, включающей в качестве основы три диссоциирующих группы, позволил получать легко объяснимую зависимость от значений рН 1нкоОС и НОС (фиг. 22). Так, на катализ обеих ферментативных реакций оказывают влияние сходные диссоциирующие группы, что позволяет предположить наличие сходного механизма катализа в целом.
Определенные значения рКа представлены в табл. 8. Очевидно, что существенное различие значения рКа между 1нкоОС и НОС обнаружено только в одном случае. Для НОС рКа соответствует рКа константы диссоциации субстрата. Возможно, очень небольшие различия между НОС и 1нкоОС вызываются структурными изменениями, имеющими место при катализе с помощью 1коОС (вызванные подгонкой), которые влияют на зависимость от рН.
Пример 8. Изучение глутамилциклазной активности.
Известно, что человеческая ОС представляет собой фермент, который катализирует циклизацию N концевой глутаминовой кислоты в пироглутаминовую кислоту. Таким образом, ОС принимает участие в образовании модифицированных рС1и амилоидных пептидов.
Для изучения циклизации глутаминовой кислоты человеческую ОС и человеческую 1коОС очищали и оценивали образование модифицированного рС1и амилоида β(3-11) [рС1и-Ав(3-11)] из Λβ(3-11). Реакционные смеси содержали 20 мкл субстрата (А β(3-11), 2,5мМ маточный раствор в 50 мМ Мек-буфере, рН 6,5) и 80 мкл фермента (маточный раствор НОС, 0,62 мг/мл; маточный раствор ккоОС, 0,61 мг/мл, в 50 мМ Мек, рН 6,5). Образцы (15 мкл) отбирали через 0 ч, 6 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч и кипятили в течение 5 мин для прекращения реакции. Анализ превращения субстрата осуществляли с помощью Ма1б1-Той-массспектрометрии. Субстрат и продукт отличались по молекулярной массе на 18 Да, т.е. на массу воды, высвобождающейся в процессе циклизации.
Как видно из фиг. 23, человеческая ОС и человеческая 1коОС (У88Н|коОС[55НС351А С-Н1к) катализировали превращение Ав(3-11) в рС1и-Ав(3-11). Однако с учетом одинаковых концентраций белков в обоих образцах можно заключить, что превращение №концевой глутаминовой кислоты с помощью Н1коОС является существенно более медленным по сравнению с НОС. Так, более низкие константы специфичности, характеризующие превращение глутаминильных субстратов, обнаружены также при использовании глутамильных субстратов. В этих условиях при использовании неактивированного фермента не обнаружено никакой циклизации (8сН1Шпд 8. и др., ЕЕВ8 Ьей. 563, 2004, сс. 191-196).
Пример 9. Тканеспецифичность мышиной 1коОС.
Оценивали распределение в тканях мышиной ОС и мышиной 1коОС с использованием количественной ПЦР в реальном времени. Перед анализом кДНК из нескольких различных органов и тканей открытую рамку считывания мышиной 1коОС выделяли с помощью специфических праймеров (НкоОСт МеЙ к (8ЕО ГО N0: 68), 1коОСт Мей ак (8ЕО ГО N0: 69) (табл. 4), которые выводили из хромосомной кодирующей области мышиной 1коОС.
Открытую рамку считывания клонировали в векторе рРСК-8сйр1 САМ 8К (+) (набор РСЕ-8спр1 САМ С1ошпд, фирма 81га1адепе) и применяли в качестве положительного контроля для оценки с помощью ПЦР в реальном времени и построения стандартной кривой для условий анализа.
Для характеризации тканеспецифичности экспрессии пнкоОС применяли кДНК 3-6-месячных мышей. Общую РНК выделяли из 30 мг ткани с помощью набора для выделения РНК (КЫА-1ко1айоп кй II) (фирмы МасНегеу и №ще1). Концентрацию и чистоту РНК оценивали с помощью гель-электрофореза (агарозный гель) и спектрофотометрии. Для синтеза кДНК использовали 1 мкг РНК. Для осуществления реакции применяли обратную транскриптазу 8ирегкспр1 II КТ (фирма Iην^ί^οдеη) согласно рекомендациям поставщика, кДНК хранили при -80°С.
Количественный анализ концентрации транскриптов в различных тканях осуществляли с помощью термоячейки ЬщН1 Сус1ег (фирма СогЬей гекеагсН), используя набор ОнаШНес! 8УВК Сгееп РСК (фирма О|адеп). Для количественной оценки применяли ДНК-стандарт (клонированная кДНК мышиной 1коОС). Количество копий рассчитывали согласно следующему уравнению: (Хг/мкл ДНК)/(длина плазмиды в парах нуклеотидовх660)х6,022х1023 = Умолекул/мкл. ДНК-стандарт применяли в 4 концентрациях в диапазоне 107-10! молекул/мкл и предельной концентрации (10°). Протокол реакции приведен в табл. 8. Результаты представлены на фиг. 24.
Для амплификации мышиной ОС применяли такой же протокол, используя праймеры тОС КТ N 1егтта1 к (8ЕО ГО N0: 73) и тОС КТ №1егтта1 ак (8Е0 ГО N0: 74).
- 47 016584
Таблица 8. Протокол реакции ПЦР в реальном времени с использованием Ко1о-6епе К6 3000 (фирма СогЬеН Кезеагсй)
Результаты
Как видно из фиг. 24. мышиная ОС и мышиная 18оОС экспрессировались во всех изученных органах. По сравнению с мышиной ОС различия в экспрессии мышиной йоОС между различными органами оказались менее выраженными. что свидетельствует о меньшей строгости регуляции транскрипции. Данные об экспрессии тОС соответствовали данным. полученным ранее для бычьей ОС. которую анализировали с помощью Нозерн-блоттинга (Рой. Т. и др.. Ргос №111 Лсаб 8а и 8 А 88. 1991. сс. 1005910063). Наиболее высокие уровни экспрессии ОС обнаружены в таламусе. гиппокампе и коре головного мозга. Таким образом. экспрессия ОС обнаружена прежде всего в нервной ткани. Невысокий уровень экспрессии ОС выявлен в периферических органах. таких как селезенка и почки. пизоОС также экпрессировалась в нервной ткани. но уровни оказались более низкими по сравнению с тОС. При этом уровни экспрессии йоОС и ОС в периферических органах оказались очень близкими.
На основе результатов о концентрации транскриптов можно заключить. что общая активность (18оОС и ОС) должна быть самой высокой в головном мозге. Так. наиболее высокие уровни белка ОС присутствуют в органах. пораженных амилоидозами типа болезни Альцгеймера. семейной британской деменции и семейной датской деменции.
Пример 10. Ингибирование человеческой 18оОС гетероциклическими хелаторами.
Результаты
Ранее было изучено зависящее от времени ингибирование ОС из различных источников гетероциклическими хелаторами. такими как 1.10-фенантролин и дипиколиновая кислота (6.9). Аналогично этому ййоОС также ингибировалась в зависимости от времени гетероциклическими хелаторами 1.10фенантролином (фиг. 25) и дипиколиновой кислотой (данные не представлены). что убедительно доказывает ее зависящую от металла активность. Кроме того. ЫзоОС ингибировалась также ЭДТК (фиг. 25). Это является резким отличием от различных ОС. поскольку установлено. что ни человеческая ОС. ни свиная ОС. ни мышиная ОС не ингибировались в заметной степени ЭДТК. Однако ингибирование ЫзоОС ЭДТК с еще большей уверенностью позволяет предположить зависимость катализа от металлов.
Пример 11. Субклеточная локализация ЫзоОС. изученная с помощью фракционирования клеток.
Фракционирование клеток
Через 1 день после трансфекции НЕК293-клетки. в которых проходила экспрессия. отмывали ΌЗФР и собирали центрифугированием при 500хд в течение 5 мин при 4°С. Затем Ό-ЗФР отбрасывали и клетки ресупендировали в 1 мл буфера для расщепления (50мМ Трис. 50мМ КС1. 5мМ ЭДТК. 2мМ ΜдС12. рН 7.6. значение рН в котором доводили до требуемого с помощью НС1) и разрушали 30 ударами в гомогенизаторе Поттера для клеток. Суспензию центрифугировали при 700хд в течение 10 мин при 4°С. Полученный клеточный дебрис ресуспендировали в 300 мкл буфера для расщепления и обозначали как фракция дебриса (Ό). Образовавшийся супернатант дополнительно центрифугировали при 20000хд в течение 30 мин при 4°С. Клеточный дебрис включал мембраны тяжелой фракции (НМ) и его ресуспендировали в 200 мкл буфера для расщепления. Образовавшийся супернатант центрифугировали при 100000хд в течение 1 ч при 4°С с помощью ультрацентрифуги (фирма Весктапп). Образовавшийся клеточный дебрис ресуспендировали в 200 мкг буфера для расщепления и обозначили его как мембраны легкой фракции φΜ). Супернатант обозначили как растворимая фракция (8). Дебрис. тяжелую мембранную и легкую мембранную фракции обрабатывали ультразвуком в течение 10 с и содержание белка во всех фракциях определяли методом Брэдфорда. Затем фракции анализировали в отношении ОСактивности и окрашивали для выявления маркерных белков с помощью Вестерн-блоттинга.
Результаты
Для дополнительного подтверждения осуществляли биохимический анализ распределения активности ОС. полученной в результате экспрессии ЫзоОС и 11ОС. Нативную ЫзоОС. начинающуюся на метионине Ι и ΙΙ. и КОС экспрессировали соответственно в НЕК293-клетках. После фракционирования клеток определяли ОС-активность в каждой фракции с помощью анализа флуоресценции с использованием Н-61η-βNА в качестве субстрата. В клетках. трансфектированных незагруженным вектором (рс^NА). специфическая ОС-активность трудно поддавалась оценке. При экспрессии нативной ЫзоОС ^еП) и ЫзоОС (ΜеΐII) ОС-активность легко выявлялась. при этом наиболее высокая удельная активность обнаружена в мембранах тяжелой фракции (ΜеΐI: 40 ± 2 мкмолей/мин/г; ΜеΐII: 36 ± 1.5 мкмоля/мин/г) и в среде (ΜοΐΙ: 30 ± 2 мкмолей/мин/г; ΜеΐII: 54 ± 3 мкмоля/мин/г). В отличие от этого. при оценке ЙОС ус
- 48 016584 тановлено, что наиболее высокая удельная ОС-активность присутствует в среде (1339 ± 76 мкмолей/мин/г), далее в порядке убывания следуют мембраны тяжелой фракции (251 ±21 мкмоль/мин/г) (фиг. 26А).
Кроме того, рассчитывали абсолютные активности, иллюстрирующие, что экспрессия ΙιίδοΟί.' (МеП) и ΙιίδοΟί.' (МеШ) приводила главным образом к повышению внутриклеточной ОС-активности, а именно в дебрисе (МеП: 1032 ± 9нМ/мин; МеШ: 1110 ± 10нМ/мин) и мембранах тяжелой фракции (МеП: 374 ± 20нМ/мин; МеШ: 281 ± 12нМ/мин). Лишь незначительная ОС-активность обнаружена в среде (МеП: 27 ± 2нМ/мин; МеШ: 53 ± 3нМ/мин). В отличие от этого ОС-активность, полученная в результате экспрессии 11ОС. оказалась наиболее высокой в среде (1138 ± 65нМ/мин) и во внутриклеточных компартментах (дебрис: 1089 ± 14нМ/мин; мембраны тяжелой фракции: 583 ± 38нМ/мин), что подтверждает локализацию ΙιίδοΟί.' в комплексе Гольджи, что установлено с помощью гистохимического анализа (фиг. 26Б).
Данные, полученные с помощью экспрессии нативных ферментов, дополнительно подтверждены с помощью экспрессии ΙιίδοΟί.’ (МеП и МеШ) и ЙОС, несущих С-концевую ЕЬАС-метку (фиг. 26В). Анализ методом Вестерн-блоттинга образовавшихся меченных с помощью РЬАС белков в сравнении с маркерными белками для комплекса Гольджи и митохондрий позволил установить преимущественно внутриклеточную локализацию Ш^ОС^еП) и ΙιίδοΟί.’ (МеШ) в дебрисе и мембранах тяжелой фракции, в то время как наиболее высокое содержание ЙОС обнаружено в среде, но также этот фермент обнаружен в дебрисе и мембранах тяжелой фракции. Визуализация маркерных белков комплекса Гольджи (8Т1САБ3) и митохондрий показала присутствие этих компартментов в дебрисе и мембранах тяжелой фракции. Кроме того, митохондриальный белок молекулярной массы 65 кДа обнаружен в меньшем количестве в растворимой фракции.
Пример 12. Анализ сохранения сигнала ΙιίδοΟί.' в комплексе Гольджи.
Для дополнительного доказательства того, что предсказанная Ν-концевая трансмембранная спираль ответственна за сохранение ΙιίδοΟί.' в комплексе Гольджи, сигнальные пептиды, начинающиеся на МеП и МеШ, включая трансмембранную спираль, клонировали в рамке считывания с ЕСРР. Образовавшиеся векторы 1ιΪ8οΟΠ' (МеП) 88 ЕСЕР и Й^8Ο^С (МеШ) 88 ЕСЕР экспрессировали в ЬШ05-клетках и оценивали аналогично полноразмерным слитым белкам ΙιίδοΟί.' ЕСЕР, с помощью конфокального лазерсканирующего микроскопа. Экспрессия Й^8Ο^С (МеП) 88 ЕСЕР приводила к такой же локализации в комплексе Гольджи, которая была обнаружена для полноразмерного слитого белка ΙιίδοΟί.’ (МеП) ЕСЕР. И в этом случае транспорт ΙιίδοΟί.’ (МеП) 88 ЕСЕР в митохондрии не обнаружен (фиг. 27А). Кроме того, экспрессия укороченного на Ν-конце пептида ΙιίδοΟί.' (МеШ) 88 ЕСЕР также приводила к повышенному содержанию белка в комплексе Гольджи. Аналогично ΙιίδοΟί.' (МеП) 88 ЕСЕР, в митохондриях не обнаружено ЕСЕР-флуоресценции (фиг. 27Б). Следовательно, Ν-концевая последовательность ΙιίδοΟί.’ обеспечивала котрансляционную транслокацию белка мембраны эндоплазматического ретикулума (ЕВ) и сохранение в комплексе Гольджи. Кроме того, в результате экспрессии ЫюОС (МеШ) 88 ЕСЕР сохраненный сигнал в комплексе Гольджи в основном картировался на остатке между метионином 19 и серином 53 (положение аминокислот, начиная с МеП).
Дополнительный топологический анализ позволил установить возможность функциональной гомологии Ν-конца ЫюОС и гликозилтрансфераз. Гликозилтрансферазы представляют собой трансмембранные белки типа II, несущие короткую цитоплазматическую последовательность, за которой следует трансмембранная спираль и крупный полостной каталитический домен. Очевидно, что это практически такая же структура, которая обнаружена для ιηίδοΟί.' и ΙιίδοΟί.' (фиг. 28). Для большинства гликозилтрансфераз обнаружен сохраненный сигнал в трансмембранном домене, находящемся в комплексе Гольджи. Кроме того, для некоторых из этих ферментов обнаружено, что укорочение цитоплазматической последовательности не влияет на активность или локализацию белка. В целом, получено доказательство того, что ΙιίδοΟί.' относится к трансмембранному белку типа II, для которого сохранение в комплексе Гольджи аналогично сохранению, характерному для гликозилтрансфераз.
Пример 13. Выявление мРНК ОРСТЬ в различных клеточных линиях человеческой карциномы и в тканях.
ОПЦР -анализ
Анализ экспрессии человеческой ОРСТЬ в линиях клеток человеческой карциномы осуществляли с помощью количественной ПЦР в реальном времени (дПЦР), в основном согласно методу, описанному в примере 9. Для оценки мРНК ОРСТЬ применяли праймеры из набора праймеров для анализа ОиаиПТее1®, перекрывающие экзон/экзонную область, для исключения совместной амплификации геномной ДНК. ОРСВ осуществляли согласно рекомендациям производителя. Реакционная смесь представлена в табл., ПЦР-программа проиллюстрирована в табл. 8.
- 49 016584
Таблица 9. Состав смеси для с.|ПЦР
Компонент Объем в мкл
2х мастер-смесь типа ОиапОТеС! 8ΥΒΚ. Сгееп РСК. (2,5мМ МйС12) 7,5
10* набор типа Оиал11Тес( Рпшег Аззау 1,5
кДНК (<100 нг/КеакПоп) 1
вода бидистиллированная 5
Для количественного анализа концентрации транскриптов в различных тканях применяли термоячейку Ыд1И Сус1ег (фирма СогЬеО гекеагсй), используя набор ОнапбТес! 8УВК Сгееп РСК (фирма О|адеп). Для количественной оценки применяли ДНК-стандарт (клонированная кДНК человеческой ЕоОС). Количество копий рассчитывали согласно следующему уравнению:
(Χ6/μι ДНК)/(длина плазмиды в парах нуклеотидовх660)х6,022х1023=Умолекул/мкл.
ДНК-стандарт применяли в 4 концентрациях в диапазоне 107-10! молекул/мкл и предельной концентрации (10°). Результаты с.|ПЦР оценивали с помощью операционного программного обеспечения для устройства Ко(ог-Сепе (фирма СогЬеП гекеагсй).
Результаты Экспрессия ОРСТЬ в различных линиях клеток карциномы
Из изученных раковых линий клеток клетки человеческой меланомы характеризовались наиболее высоким уровнем экспрессии СРСТЕ-транскриптов (примерно 7000 копий/50 нг общей РНК), в то время как в линиях клеток саркомы мягких тканей обнаружен самый низкий уровень экспрессии ОРСТЕ (365 копий/50 нг общей РНК). В карциноме поджелудочной железы обнаружено в среднем 2100 копий, в карциноме щитовидной железы 3500 копий и в карциноме желудка обнаружено 4100 копий (фиг. 29).
Экспрессия ОРСТЕ в различных линиях клеток меланомы.
В современных исследованиях доказано, что клетки меланомы отличаются сопоставимым высоким уровнем экспрессии ОРСТ (СШ18 Ι.8., I. Тгап§1. Меб. 4, 2006, сс. 4-27). Поэтому при создании настоящего изобретения анализировали экспрессию ОРСТЕ в различных линиях клеток меланомы. Как показано на фиг. 30, экспрессия ОРСТЕ обнаружена во всех проанализированных клетках меланомы. Уровни экспрессии в различных линиях клеток были разными, они составляли от 2025 копий/50 нг общей РНК в линии Ме1_2Ь_11 до 18043 копий/50 нг общей РНК в линии Ме1_2Ь12.
Таблица 10. Корреляция между уровнем ОРСТ и ОРСТЕ и ассоциированными с опухолью антигенами (1аа) и корреляция 1аа между собой
Корреляция Значимость Корреляция Значимость
ОРСТ - МА6ЕВ2 0,0436 ΑΙΜ1 - МСЬ1 0,0163
ОРСТ - МАЮТ 0,0020 МАОЕА1 - МАОЕА2 0,00002
ОРСТ - ΤΥΚ 0,0023 МАОЕА1 - МАСЕВ2 0,0058
ОРСТ - МАОЕА1 0,0591 ΤΥΚΡ2 - МАКТ1 0,0042
ОРСТЬ - МАЮТ 0,0008 ΤΥΚ - МАК.Т1 0,0335
ΤΥΚ - ΤΥΚΡ2 0,0408
ΑΙΜ1 - ΑΙΜ2 0,0082 ΤΥΚ - МСЕ-1 0,0151
Кроме того, экспрессия ОРСТ и ОРСТЕ коррелировала с экспрессией ассоциированных с опухолью антигенов ((аа). Специфические для меланомы ассоциированные с опухолью антигены выбирали путем исследования баз данных и получали из опубликованных сведений. Среди прочего, ΑΙΜ1 и ΑΙΜ2 (отсутствуют в меланомах), МАСЕА1, -А2, -А10 и МАСЕВ2 (антиген меланом, принадлежащий к семейству А и В), МАКТ1 (антиген меланом, распознаваемый Т-клетками), ТУК (тирозиназа), ТУКР1 и ТУКР2 (родственный тирозиназе белок) и МС.Т-1 (белок миелобластного лейкоза) представляют собой ассоциированные с опухолью антигены в меланомах. Данные сравнивали с помощью программы для статистического анализа 8Р88.
Корреляция между ОРСТ и МАСЕВ2 оказалась значимой (р=0,0436). Кроме того, корреляция между ОРСТ и МАКТ1 (р=0,002), ОРСТЕ и МАКТ1 (р = 0,008) и ОРСТ и ТУК (р = 0,0023) оказалась также выражено статистически значимой. Корреляции свидетельствуют о наличии прямой зависимости, а именно: более высокие уровни экспрессии ОРСТ/ОРСТЕ соответствуют более высоким уровням экспрессии ассоциированных с опухолью антигенов. Единственным исключением являлась корреляция между ТУК и МСЬ1, свидетельствующая об обратной зависимости.
Экспрессия ОРСТ и ОРСТЕ в различных опухолевых тканях.
Экспрессию ОРСТ и ОРСТЕ оценивали в следующих опухолевых тканях: саркома мягких тканей, желудочная карцинома и карцинома щитовидной железы. Наиболее высокий уровень экспрессии ОРСТ обнаружен в карциноме щитовидной железы, далее в порядке убывания следовали желудочная карцинома и карцинома мягких тканей (табл. 11). Такой же порядок обнаружен для экспрессии ОРСТЕ, однако количество копий ОРСТЬ-транскриптов во всех случаях оказалось ниже по сравнению с количеством копий ОРСТ-транскриптов, что доказано с помощью (-критерия Стьюдента (ркарцинома мягких тканей 0,001; ржелудочная карцинома 4,8Е-7, ркарцинома щитовидной железы = 0,04) (табл. 11; фиг. 31).
- 50 016584
Таблица 11. Сравнение экспрессии ОРСТ и ОРСТЬ в различных опухолевых тканях
Саркома мягких тканей (119 образцов) Желудочная карцинома (47 образцов) Карцинома щитовидной железы (29 образцов)
рРСТ 1293 2985 8303
Орсть 170 469 2540
Дополнительные исследования уровня экспрессии ОРСТ и ОРСТЬ позволили установить наличие значимой двухсторонней корреляции при оценке с помощью критерия Пирсона для саркомы мягких тканей (р = 2Е-31) и желудочной карциномы (р = 0,015). Обнаружено отсутствие корреляции между уровнем экспрессии ОРСТ и ОРСТЬ при карциноме щитовидной железы (р = 0,46).
Экспрессия ОРСТЬ зависит от стадии дифференцировки желудочной карциномы
Исследовали экспрессию ЭРСТЬ в образцах желудочных карцином, соответствующих разным стадиям дифференцировки опухолей. Контролем служила окружающая опухоль здоровая ткань. Сравнение здоровой и опухолевой ткани позволило выявить существенно более высокий уровень экспрессии ЭРСТЬ (р = 0,04) в опухолевых тканях. В недифференцированных желудочных карциномах обнаружен более низкий уровень экспрессии ОРСТЕ чем в здоровой ткани. В мало дифференцированной и хорошо или средне дифференцированных желудочных карциномах не обнаружено различий в медианных значениях по сравнению со здоровой тканью (фиг. 32).
Экспрессия ЦРСТ и ЦРСТЬ на различных стадиях карциномы щитовидной железы
На различных стадиях карциномы щитовидной железы исследовали уровни экспрессии ОРСТ и ОРСТЕ Стадии классифицировали согласно номенклатуре Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) как фолликулярный рак щитовидной железы (ЕТС), папиллярный рак щитовидной железы (РТС), недифференцированный рак щитовидной железы (ИТС). В качестве контроля служили образцы, полученные из организма пациентов с зобом.
Уровень мРНК ОРСТ (медианный) при дифференцированных карциномах щитовидной железы типа ЕТС (6700 копий/50 нг общей РНК) и РТС (16000 копий/50 нг общей РНК) оказался более высоким, чем в не пораженной опухолью ткани (зоб: 2100 копий/50 нг общей РНК). При ИТС уровень составлял 5400 копий/50 нг общей РНК, и этот показатель оказался в 2,5 раза выше, чем обнаруженный в зобе. Количество копий мРНК ОРСТ при всех опухолях щитовидной железы был существенно выше, чем при зобе (р = 0,04, ΐ-критерий Стьюдента) (фиг. 33).
Уровни мРНК ЭРСТЬ при карциномах щитовидной железы были однородными. В образцах, полученных из ЕТС (2600 копий/50 нг общей РНК) и ИТС (2500 копий/50 нг общей РНК), уровни оказались почти такими же, как и в зобе (2500 копий/50 нг общей). Экспрессия ЭРСТЬ в образцах РТС оказалась несколько пониженной до 1900 копий/50 нг общей РНК (фиг. 34).
В заключение следует отметить, что уровень экспрессии ОРСТ и ОРСТЬ в зобе оказался одинаковым. Однако в опухолевый тканях экспрессия ОРСТ возрастала, а экспрессия ОРСТЬ оставалась стабильной.
Пример 14. Исследование экспрессии ОРСТ и ОРСТЬ в человеческих линиях клеток после инкубации с различными стимулами.
Линии клеток и среды
Эксперименты по стимуляции осуществляли с использованием линии клеток почки человеческого эмбриона НЕК293, линии клеток человеческого острого моноцитарного лейкоза ТНР-1 и линии клеток фолликулярного рака щитовидной железы ЕТС-133. Клетки выращивали в соответствующих культуральных средах (ЭМЕМ, 10% ФБС для НЕК293, ИРМ! 1640, 10% ФБС для ТНР-1 и ПМЕМ/Е12, 10% ФБС для ЕТС-133) в увлажненной атмосфере при 37°С и 5% СО2.
Стимуляция с использованием биологически активных пептидов, химических агентов или ЬР8
Клетки линии НЕК293 и ЕТС-133 культивировали в виде прикрепленных культур, а клетки линии ТНР-1 выращивали в суспензии. Для анализа стимуляции 2х105 клеток ЕТС-133 и НЕК293 переносили в 24-луночные планшеты. При использовании клеток НЕК293 планшеты покрывали коллагеном ! для гарантии соответствующего прилипания. Кроме того, 2х106 клеток ТНР-1 выращивали в 24-луночных планшетах для суспензионных культур. Все эксперименты по стимуляции проводили в бессывороточной среде. Клетки ЕТС-133 выращивали в течение ночи. После этого клетки адаптировали к бессывороточной среде в течение еще 24 ч и стимуляцию начинали, заменяя кондиционированную среду на свежую бессывороточную среду. Клетки НЕК293 выращивали в течение ночи и после этого начинали стимуляцию соответствующими агентами без адаптации к бессывороточной среде из-за морфологических изменений, происходящих, если клетки культивировали в бессывороточной среде в течение более 24 ч. Клетки высевали в бессывороточную среду в сочетании с соответствующим агентом. Применяемые стимулы и их конечные концентрации представлены в табл. 12.
- 51 016584
Таблица 12. Стимулы, применяемые в исследованиях по регуляции НОС и НЬоОС в человеческих клеточных линиях
Название стимула Конечная концентрация
масляная кислота (ВА) 2мМ
фактор роста гепатоцитов (НОР) 10 нг/мл
липоолисахарид (ЬР8) 1,10 мкг/мл
трансформирующий фактор роста β (ΤΟΡβ) 10, 100 нг/мл
фактор некроза опухоли α (ΤΝΕα) 10, 100 нг/мл
Клетки инкубировали с соответствующим стимулом в течение 24 ч. После этого выделяли из клеток общую РНК с помощью набора М.1с1со-Ярт® ΚΝΑ II (фирма Мас11егеу-№де1) и хранили вплоть до осуществления дПЦР-анализа.
Стимуляция с помощью гипоксии
Клетки ТНР-1, НЕК293 и ЕТС-133 высевали каждую на два матраса для культуры ткани площадью 25 см2 соответственно. Затем один матрас с каждой клеточной линией, который служил в качестве отрицательного контроля, культивировали в нормальных условиях выращивания в течение 24 с. Другие матрасы помещали в анаэробный контейнер, содержащий анаэробный реагент (АпаегосиЙ® Р, фирма Мегск) и индикатор. Контейнер запечатывали для гарантии непроницаемости для воздуха. Клетки выращивали также в течение 24 ч и затем выделяли с помощью набора Шс1ео-8рт® ΚΝΑ II (фирма Мас11егеу-№ще1) и хранили вплоть до осуществления с.|ПЦР-анализа.
Результаты
Основной уровень экспрессии ОРСТ и ОРСТЬ в клетках НЕК293, РТС-133 и ТНР-1
Основной уровень экспрессии в применяемых клеточных линиях НЕК293, ЕТС-133 и ТНР-1 оценивали при подготовке к проведению последующих экспериментов по стимуляции. Количество копий транскриптов ОРСТ и ОРСТЬ обобщено в табл. 13.
Таблица 13. Основной уровень экспрессии ОРСТ и ОРСТЬ в различных линиях клеток
линия клеток Абсолютное количество копий мРНК на 50 вг общей РНК
<2РСТ фРСТБ
НЕК-293 (8 образцов) 37196 +18928 3206 + 855
ЕТС-133 (8 образцов) 24790 + 7605 10262Ш899
ТНР-1 (8 образцов) 3588 + 853 6725 + 1763
Воздействие выбранных стимулов на экспрессию ОРСТ и ОРСТЬ
К настоящему времени не были описаны регуляторные сайты связывания промоторов ОРСТ и ОРСТЬ и пути трансдукции сигналов, приводящие к их регулированию. Поэтому были проведены эксперименты по стимулированию с использованием различных клеточных линий и стимулов. Уровни мРНК ОРСТ в НЕК293-клетках повышались при стимуляции с помощью ΊΝΕ-α, НОЕ и масляной кислоты. Кроме того, была изучена регуляция ССЬ2 в качестве субстрата ОРСТ/ОРСТЬ. Стимуляция Т№-а и масляной кислотой приводила к повышению. Количества ССЬ2-транскриптов в клетках НЕК293. НОЕ не оказывал воздействие на экспрессию ССЬ2. В отличие от этого ОРСТЬ не регулировалась ΈΝΕ-ο., НОЕ и масляной кислотой (фиг. 35).
Кроме того, клетки ЕТС-133 стимулировали с помощью ЬРЯ и ТОЕ-β и оценивали регуляцию ОРСТ, ОРСТЬ и ССЬ2. В клетках ЕТС-133 ЬРЯ и ТОЕ-β стимулировали экспрессию мРНК ОРСТ, но не индуцировали экспрессию ОРСТЬ и ССЬ2 (фиг. 36).
Результаты этих экспериментов согласовывались также с данными о стимуляции клеток ТНР-1 с помощью ЬРЯ (1 мкг/мл), ЬРЯ (10 мкг/мл), ТОЕ-β и Т№-а. Как установлено при использовании клеток линии ЕТС-133 и НЕК293, экспрессию ОРСТ можно индуцировать, используя различные стимулы. Кроме того, экспрессию ССЬ2 индуцировали с помощью ЬРЯ и Т№-а. И в этом случае не обнаружено ни индукции, ни подавления мРНК ОРСТЬ (фиг. 37).
Таким образом, из этих экспериментов следует, что ОРСТ можно регулировать с помощью набора стимулов в различных линиях клеток (ЬРЯ, Т№-а, НОЕ, масляная кислота и др.). В противоположность этому, ОРСТЬ не удалось ни стимулировать, ни подавлять с помощью изученных стимулов, это позволяет предположить, что функция ОРСТЬ является конститутивной.
Влияние выбранных стимулов на экспрессию ОРСТ и ее субстратов
Поскольку экспрессия ОРСТ индуцировалась рядом стимулов, возникал вопрос о том, может ли индукция ОРСТ иметь место в сочетании с индукцией субстратов ОРСТ ССЬ2, ССЬ7, ССЬ8 и ССЬ13. Для этой цели осуществляли стимуляцию с помощью ЬРЯ (1 мкг/мл), ЬРЯ (10 мкг/мл), ТОЕ-β (100 нг/мл) и Т№-а (100 нг/мл) соответственно с использованием моноцитов линии ТНР-1. Для клеток линии ТНР-1
- 52 016584 характерен основной уровень экспрессии всех хемокинов, что важно для сравнения стимулированных клеток с отрицательным контролем.
Обработка ЬР8 и ΨΝΡ-α приводила к заметной индукции всех изученных хемокинов и ОРСТ в клетках ТНР-1. ТСР-β оказался менее эффективным в качестве стимула и индуцировал экспрессию ОРСТ, ССЬ2, ССЬ7 и ССЬ8 максимум в 2 раза. ССЬ13 подавлялся при стимуляции ТСР-Р (фиг. 38).
Стимуляция экспрессии ОРСТ и ОРСТЬ с помощью гипоксии
Экспрессия ОРСТЬ не регулировалась химическими агентами, биологически активными пептидами или ЬР8. В связи с этим при создании изобретения оценивали, можно ли регулировать экспрессию ОРСТЬ с помощью гипоксии. Как обобщено на фиг. 39, гипоксия избирательно индуцировала экспрессию ОРСТЬ, но не ОРСТ. Для сравнения, индуцируемый гипоксией фактор 1а (НГР1а) подавлялся на 15% (фиг. 39А) и 45% (фиг. 39В). Эти данные позволяют предположить связь ОРСТЬ с гипоксией.
Синтез ингибиторов
Схема синтеза 1. Синтез соединений, представленных в примерах 1-53, 96-102,136-137
Реагенты и условия: (а) NаΗ, ДМФ, 4 ч, КТ.; (б), 8 ч, 100°С; (в) Η2Ν-ΝΗ2, ЕЮН, 8 ч, кипячение с обратным холодильником, затем 4н. НС1, 6 ч, кипячение с обратным холодильником, (г) К3АСО, ЕЮН, 6 ч, кипячение с обратным холодильником; (д) 3,4 диметоксифенилизотиоцианат.
Схема синтеза 2. Синтез соединений, представленных в примерах 54-95
Реагенты и условия: (а) КАСЕ ЕЮН, 6 ч, кипячение с обратным холодильником; (б) водорастворимый карбодиимид (ВРКД), 1Н-имидазол-1-пропанамин, ДМФ, 2 ч, КТ.
Схема синтеза 3. Синтез соединений, представленных в примерах 103-105
Реагенты и условия: (а) NаΗ, ДМФ, КТ., 3 ч; (б) Ь1А1Н4, диоксан, кипячение с обратным холодильником, 1 ч; (в) КАСЕ ЕЮН, кипячение с обратным холодильником 6 ч.
Схема синтеза 4: Синтез соединений, представленных в примерах 106-109
Реагенты и условия: (а) ЕЮН, 2 ч, кипячение с обратным холодильником.
Схема синтеза 5. Синтез соединений, представленных в примерах 110-112
Реагенты и условия: (а) 1Н-имидазол-1-пропанамин, триэтиламин, толуол, 12 ч, кипячение с обратным холодильником.
- 53 016584
Схема синтеза 6. Синтез соединений, представленных в примерах 113-132 з
Реагенты и условия: (а) САШЕ, 1Н-имидазол-1-пропанамин, диоксан, 0°С, 12 ч; (б) реагент Лавессона, Е1ОН, кипячение с обратным холодильником, 8 ч.
Схема синтеза 7. Синтез соединений, представленных в примерах 133-135
Реагенты и условия: (а) хлорангидрид 1Н-имидазол-1-пропана, СН2С12, - 10°С, 1 ч; (б) реагент Лавессона, диоксан, кипячение с обратным холодильником, 8 ч.
Схема синтеза 8. Синтез соединения, представленного в примере 138
Реагенты и условия: (а) Е1ОН, кипячение с обратным холодильником, 8 ч.
Схема синтеза 9. Синтез соединения, представленного в примере 139 о
Реагенты и условия: (а) 75% конц. Н28О4, 4 ч.
Схема синтеза 10. Синтез соединения, представленного в примере 140
Реагенты и условия: (а) ацетонитрил, кипячение с обратным холодильником 2 ч.
Схема синтеза 11. Синтез соединения, представленного в примере 141
Реагенты и условия: (а) NаН, ДМФ, 4 ч, КТ; (б) 8 ч, 100°С; (в) Н^-Ж2, ЕЮН, 8 ч, кипячение с обратным холодильником, затем 4н. НС1, 6 ч, кипячение с обратным холодильником, (г) 3,4 диметоксифенилизотиоцианат, ЕЮН, 6 ч, кипячение с обратным холодильником.
Аналитические методы
ЕЗЕмасс-спектры получали с помощью спектрометра типа 8СШХ АИ 365 (фирма Регкш Е1тег). 1Н-ЯМР (500 МГц) данные получали с помощью устройства типа ВКИКЕК АС 500, используя ДМСО-Э6 в качестве растворителя. Химические сдвиги выражали в частях на миллион (част./млн) относительно обработки тетраметилсиланом. Схемы расщепления обозначали следующим образом: к (синглет), б (дублет), бб (двойной дублет), ΐ (триплет), т (мультиплет) и Ьг (широкий сигнал).
Подробное описание синтеза
Примеры 1-12 и 14-53.
1Н-Имидазол-1-пропанамин подвергали взаимодействию с соответствующим изотиоцианатом в этаноле при температуре дефлегмации в течение 8 ч. Затем растворитель удаляли и оставшееся масло растворяли в метиленхлориде. Органический слой промывали дважды насыщенным раствором NаНСОз, а затем NаН8О4 и соляным раствором, сушили и упаривали.
Оставшийся твердый продукт перекристаллизовывали из этилацетата, получая конкретную тимочевину, выход 80-98%.
Пример 13. 1-(3-(1Н-Имидазол-1 -ил)пропил)-3 -(3,4-диметоксифенил)тиомочевина.
4,0 ммоль 3,4-диметоксифенилизотиоцианата и 4,0 ммоль 3-(1Н-имидазол-1-ил)алкил-1-амина растворяли в 10 мл абсолютного этанола. После перемешивания в течение 2 ч при температуре дефлегмации растворитель выпаривали и образовавшийся твердый продукт перекристаллизовывали из этанола.
- 54 016584
Выход: 0,66 г (51,3%); !пл: 160,0-161,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,8 - 2,0 (т, 2Н), 3,4 - 3,5 (т, 2Н), 3,75 (8, 6Н), 3,9 - 4,0 (т, 2Н), 6,7 - 6,8 (т, 1Н), 6,9 (Ьг т, 2Н), 6,95 (з, 1Н), 7,15 (з, 1Н), 7,55 (Ьг 8, 1Н), 7,6 (з, 1Н), 9,3 (з, 1Н); МС т/ζ 321,2 (М+Н), 253,3 (МСэНэМ·).
Примеры 96-102.
Н-Имидазол-1-пропанамин подвергали взаимодействию с соответствующим изоцианатом в этаноле при температуре дефлегмации в течение 8 ч. Затем растворитель удаляли и оставшееся масло растворяли в метиленхлориде. Органический слой промывали дважды насыщенным раствором NаНС0з, а затем NаН804 и соляным раствором, сушили и упаривали. Оставшийся твердый продукт перекристаллизовывали из этилацетата, получая конкретную мочевину, выход 85-90%.
Примеры 136, 137.
1Н-Имидазол-1-алкиламины получали с помощью известных из литературы методов из ωбромалкилфталимидов и соли имидазолия с последующим гидролизом. Образовавшиеся продукты трансформировали в тиомочевины согласно методу, изложенному в примерах 1-53, выход 88% (пример 136) и 95% (пример 137).
Примеры 54-95.
Во всех примерах из соответствующих тиомочевин путем взаимодействия с водорастворимым карбодиимидом (ВРКД) и 1Н-имидазол-1-пропанамидом в безводном диметилформамиде в течение 24 ч при комнатной температуре (КТ) получали тризамещенные гуанидины, выход 40-87%.
Примеры 103-105.
Имидазол подвергали взаимодействию с соответствующим брометилфенилцианидом в ДМФ, используя 1 эквивалент NаН, в течение 3 ч при КТ, получая 1Н-имидазол-1-метилфенилцианиды. Растворитель удаляли и образовавшееся масло повторно растворяли в диоксане. Цианиды превращали в соответствующие амины, используя 1 эквивалент Ь1А1Н4. После добавления насыщенного раствора КН804 диоксан выпаривали и водный слой экстрагировали СНС13. Органический слой концентрировали в вакууме и амин превращали в вакууме и амин превращали в соответствующие тиомочевины с помощью методов, изложенных в примерах 1-53, выход 78% (пример 103) и 65% (пример 104) и 81% (пример 105).
Примеры 106-109.
Используя в качестве исходных продуктов соответствующие метансульфонат-2-метилпропилфталимиды, амины синтезировали согласно методам, описанным для аминов в примерах 136-137. Образовавшиеся продукты трансформировали в тиомочевины с помощью методов, изложенных в примерах 153, общие выходы продуктов из примеров 106-109 составляли 25-30%.
Примеры 110-112.
1Н-Имидазол-1-пропанамин подвергали взаимодействию с соответствующим 2-хлорбензо[б]тиазолом в толуоле в течение 24 ч при температуре 130°С. После удаления растворителя и перекристаллизации из метанола получали продукты из примеров 110-112, выход 55-65%.
Примеры 113-118, 120-124 и 126-132.
1Н-Имидазол-1-пропанамин подвергали взаимодействию с соответствующей 2-фенилуксусной кислотой в безводном диоксане путем добавления эквивалента САГВЕ и Мметилморфолина при температуре 0°С. После этого смеси давали нагреться в течение 2 ч до К.Т. и смесь перемешивали в течение 12 ч. После удаления растворителя образовавшееся масло повторно растворяли в метиленхлориде и органический слой промывали водным раствором NаНС0з и водой, сушили и растворитель выпаривали. Оставшееся масло растворяли в диоксане, добавляя реагент Лавессона. После перемешивания в течение 12 ч добавляли насыщенный раствор NаНС0з.
Диоксан выпаривали и водный слой экстрагировали этилацетатом. Органический слой отделяли, сушили и растворитель выпаривали. Оставшийся твердый продукт кристаллизовали из этилацетата/простого эфира, получая продукты из примеров 113-118, 120-124 и 126-132, общие выходы 62-85%.
Пример 119. М(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-2-(3,4-диметоксифенил)этантиоамид.
Смесь, содержащую 4,0 ммоль триэтиламина и 4,0 ммоль 3-(1Н-имидазол-1-ил)алкил-1-амина в 20 мл диоксана, добавляли по каплям при перемешивании к охлажденному на льду раствору, содержащему 4,0 ммоль 2-(3,4-диметоксифенил)ацетилхлорида в 30 мл диоксана. Смеси давали нагреться до К.Т. и затем перемешивали в течение 1 ч. После удаления растворителя при пониженном давлении остаток повторно растворяли в 50 мл дихлорметана. Органический слой промывали с помощью 30 мл насыщенного водного раствора NаНС0з и воды. Органический раствор сушили, фильтровали и растворитель удаляли при пониженном давлении. После повторного растворения в 50 мл безводного диоксана добавляли 2,2 ммоль реагента Лавессона и смесь нагревали до 90°С и перемешивали в течение 8 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток повторно растворяли в 50 мл дихлорметана. Органический слой промывали трижды насыщенным водным раствором NаНС0з, а затем трижды водой, сушили, фильтровали и затем органический растворитель удаляли. Соединение очищали хроматографией, используя устройство для хроматографии с центрифугой (фирма Натзоп КезеагсН Ь!б.) с применением силикагелевых пластинок с толщиной слоя 2 мм и градиент СНС13/МеОН в качестве системы для элюирования.
- 55 016584
Выход: 0.14 г (10.6 %); (пл: 148.0-150.0°С
Ή-ЯМР δ 2.0 - 2.15 (Ьг т. 2Н). 3.4 - 3.5 (т. 2Н). 3.7 (з. 6Н). 6.75 - 6.8 (т. 2Н). 4.1 - 4.2 (т. 2Н). 6.8 6.9 (т. 2Н). 6.95 - 7.0 (т. 1Н). 7.4 (з. 1Н). 7.75 - 7.85 (Ьг т. 1Н). 8.6 (з. 1Н). 10.2 (з. 1Н); МС т/ζ 320.2 (М+Н). 252.2 (Μ-СЩ^^).
Пример 125. №(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-1-(3.4-диметоксифенил)циклопропанкарботиоамид.
11.06 ммоль 3.4-диметоксифенилацетонитрила. 34.8 ммоля 2-бром-1-хлорэтанола и 1.16 ммоль гидрохлорида триэтилбензиламмония растворяли в 10 мл водного раствора К0Н (60%). Смесь переносили в баню для обработки ультразвуком и интенсивно перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Образовавшуюся суспензию разводили 40 мл воды и экстрагировали трижды 20 мл дихлорметана. Объединенные органические слои промывали водным раствором соляной кислоты (1н.). сушили над №ь80.-| и растворитель удаляли при пониженном давлении. Оставшееся масло очищали экспрессхроматографией на силикагеле. используя в качестве системы для элюирования этилацетат/гептан. получая 0.81 г (34.4%) 1-(3.4-диметоксифенил)циклопропанкарбонитрила. 3.9 ммоль 1-(3.4-диметоксифенил) циклопропанкарбонитрила и 11.2 ммоль К0Н суспендировали в 80 мл этиленгликоля. Смесь перемешивали в течение 12 ч при температуре дефлегмации. Затем добавляли 80 мл воды и водный слой экстрагировали дважды простым эфиром. После доведения значения рН до 4-5 с помощью НС1 (1н.) водный слой экстрагировали трижды простым эфиром. затем объединенные органические слои сушили над №ь804 и растворитель удаляли. получая 0.81 г (93.5%) 1-(3.4-диметоксифенил)циклопропанкарбоновой кислоты.
3.44 ммоль 1-(3.4-диметоксифенил)циклопропанкарбоновой кислоты. 3.5 ммоль №метилморфолина и 3.5 ммоль изобутилхлормиата растворяли в безводном тетрагидрофуране перемешивали в течение 15 мин при -15°С. Затем добавляли 3.5 ммоль 3-(1Н-имидазол-1-ил)алкил-1-амина и смеси давали нагреться до 0°С и перемешивали в течение 12 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении и оставшееся масло повторно растворяли в хлороформе. Затем органический слой промывали дважды насыщенным водным раствором NаНС03. затем сушили над №2804 и растворитель удаляли. Очистку осуществляли с помощью хроматографии с центрифугой на устройстве типа С11гота1о1гоп® (фирма Натзоп Кезеагсй Ы6.). применяя силикагелевые пластинки с толщиной слоя 2 мм и градиент СНС13/МеОН в качестве системы для элюирования. получая 0.671 г (59.3%) №(3-(1Н-имидазол-1-ил)пропил)-1-(3.4-диметоксифенил)циклопропанкарбоксамида.
После повторного растворения в 30 мл безводного диоксана добавляли 1.43 ммоль реагента Лавессона и смесь нагревали до 90°С и перемешивали в течение 8 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении. остатку давали раствориться в 50 мл дихлорметана. Органический слой промывали трижды насыщенным водным раствором NаНС03. а затем трижды водой. сушили. фильтровали и затем органический растворитель удаляли. Соединение очищали с помощью устройства для хроматографии с центрифугой (фирма Натзоп Кезеагсй Ы6.). применяя силикагелевые пластинки с толщиной слоя 2 мм и градиент СНС13/МеОН в качестве системы для элюирования.
Выход: 0.33 г (46.2 %); (пл: 127.0-127.5°С.
Ή-ЯМР δ 1.1 - 1.2 (ΐ. 2Н). 1.55 - 1.6 (ΐ. 2Н). 2.0 - 2.1 (т. 2Н). 3.5 - 3.6 (т. 2Н). 3.7 - 3.8 (з. 6Н). 4.1 -
4.2 (ΐ. 2Н). 6.8 - 6.9 (т. 3Н). 7.65 (з. 1Н). 7.75 (з. 1Н). 8.8 (т. 1Н). 9.05 (з. 1Н); МС т/ζ 346.0 (М+Н). 278.2 ^-03¾¾^. 177.1 (М-СбН8^8).
Примеры 133-135.
Смесь. содержащую 1 эквивалент триэтиламина и 3.4-диметоксианилина в диоксане. добавляли при перемешивании к раствору соответствующего ω-бромалкилхлорангидрида при температуре 0°С. Раствору давали нагреться до К.Т. и перемешивали в течение 2 ч. Растворитель выпаривали и оставшееся масло повторно растворяли в дихлорметане. Органический слой промывали водой. сушили. фильтровали и растворитель удаляли при пониженном давлении.
Имидазол и гидрид натрия суспендировали и смесь перемешивали в инертных условиях при К.Т. в течение 3 ч. Добавляли ш-бром-№(3.4-диметоксифенил)алкиламид и смесь нагревали до 100°С и перемешивали в течение 8 ч. Затем растворитель выпаривали. добавляли горячий толуол и раствор фильтровали. Затем растворитель удаляли при пониженном давлении. Трансформацию в тиоамиды осуществляли согласно методам. описанным в примерах 113-132. с помощью реагента Лавессона. получая соединения. указанные в примерах 133-135. общие выходы которых составляли 13-20%.
Для других указанных в примерах соединений. которые синтезировали с помощью описанных выше общих схем синтеза. получены следующие аналитические данные.
Пример 1. 1-(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-3-метилтиомочевина.
V 122-122.5°С.
Ή-ЯМР δ 1.85 - 1.95 (т. 2Н). 2.8 (з. 3Н). 3.2 - 3.5 (Ьг 6. 2Н). 3.8 - 3.9 (т. 2Н). 6.85 (6. 1Н). 7.15 (6. 1Н). 7.3 - 7.5 (Ьг 6. 2Н). 7.65 (з. 1Н); МС т/ζ 199.1 (М+Н). 221.3 (Μ+№). 131.0 (Μ-ΌΉ^·)
Пример 2. 1-(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-3-трет-бутилтиомочевина.
V 147.0-147.5°С.
1Н-ЯМР δ 1.3 - 1.4 (з. 9Н). 1.85 -1.95 (т. 2Н). 3.5 (ΐ. 2Н). 3.8 (ΐ. 2Н). 6.85 (6. 1Н). 7.15 (6. 1Н). 7.3 - 7.5 (Ьг 6. 2Н). 7.65 (з. 1Н); МС т/ζ 241.1 (М+Н). 173.1 (М-С3Н-№).
- 56 016584
Пример 3. 1-(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-3-бензилтиомочевина.
I : 127,0-128,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,85 - 1,95 (т, 2Н), 3,2 - 3,5 (Ьг б, 2Н), 3,8 - 3,9 (т, 2Н), 4,6 (8, 2Н), 6,8 (б, 1Н), 7,15 (б, 1Н), 7,19 - 7,35 (т, 5Н), 7,5 - 7,6 (Ьг б, 2Н), 7,85 (8, 1Н); МС т/ζ 275,3 (М+Н), 207,1 (М-С3Н3Ю·).
Пример 5. 1-(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-3-фенилтиомочевина.
1пл: 166,5-167,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,95 - 2,05 (т, 2Н), 3,3 - 3,5 (Ьг б, 2Н), 3,9 - 4,0 (т, 2Н), 6,85 (б, 1Н), 7,05 (т, 1Н) 7,15 (б, 1Н), 7,25 (т, 2Н), 7,35 (т, 2Н), 7,6 (8, 1Н), 7,8 (Ьг 8, 1Н), 9,5 (Ьг 8, 1Н); МС т/ζ 261,1 (М+Н), 193,2 (МС3Н3Ю·).
Пример 6. 1-(3 -(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-3-(4-фторфенил)тиомочевина.
1пл: 147,0-148,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,95 - 2,05 (т, 2Н), 3,3 - 3,5 (Ьг б, 2Н), 3,9 - 4,05 (т, 2Н), 6,85 (б, 1Н), 7,05 - 7,15 (т, 3Н),
7,3 - 7,4 (т, 2Н), 7,6 (8, 1Н), 7,7 - 7,8 (Ьг 8, 1Н), 9,4 (Ьг 8, 1Н); МС т/ζ 279,3 (М+Н), 211,2 (М-С3ВДХ2·).
Пример 7. 1-(3-(1Н-Имидазол-1 -ил)пропил)-3-(4-этилфенил)тиомочевина.
1пл: 100,0- 100,5°С.
Ή-ЯМР δ 1,15 - 1,2 (ΐ, 3Н), 1,9 - 2,0 (т, 2Н), 2,5 - 2,6 (т, 2Н), 3,3 - 3,5 (Ьг б, 2Н), 3,9 - 4,05 (т, 2Н), 6,85 (б, 1Н), 7,1 - 7,2 (т, 3Н), 7,25 - 7,3 (т, 2Н), 7,6 (8, 1Н), 7,7 - 7,8 (Ьг 8, 1Н), 9,4 (Ьг 8, 1Н); МС т/ζ 289,3 (М+Н), 221,1 (М-С3Н3Ю·).
Пример 8. 1-(3 -(1Н-Имидазол-1 -ил)пропил)-3-(4-(трифторметил)фенил)тиомочевина.
1пл: 154,5-155,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,9 - 2,1 (Ьг т, 2Н), 3,4 - 3,6 (Ьг б, 2Н), 3,95 - 4,1 (Ьг т, 2Н), 6,85 (б, 1Н), 7,2 (б, 1Н), 7,6 -
7.8 (т, 5Н), 8,2 (Ьг 8, 1Н), 9,9 (Ьг 8, 1Н); МС т/ζ 329,3 (М+Н), 261,2 (М-С3Н3Ю·).
Пример 10. 1-(3 -(1Н-Имидазол-1 -ил)пропил)-3 -(4-ацетилфенил)тиомочевина.
1пл: 170,0-171,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,9 - 2,1 (Ьг т, 2Н), 2,4 - 2,5 (8, 3Н), 3,2 - 3,5 (Ьг т, 2Н), 3,9 - 4,1 (т, 2Н), 6,85 (б, 1Н), 7,15 (б, 1Н), 7,5 - 7,65 (Ьг т, 3Н), 7,8 - 7,9 (т, 2Н), 8,1 (т, 2Н), 9,8 (Ьг 8, 1Н); МС т/ζ 303,2 (М+Н), 235,1 (МС3Н3Ю·).
Пример 11. 1-(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-3-(4-метоксифенил)тиомочевина.
1пл: 125,0-125,5°С.
Ή-ЯМР δ 1,8 - 2,0 (Ьг т, 2Н), 3,2 - 3,5 (Ьг т, 2Н), 3,7 (8, 3Н), 3,9 - 4,0 (т, 2Н), 6,7 - 6,9 (т, 3Н), 7,1 -
7.2 (т, 3Н), 7,5 (8, 1Н), 7,6 (8, 1Н), 9,2 (8, 1Н); МС т/ζ 291,1 (М+Н), 223,2 (М-С3Н3Ю).
Пример 14. 1-(3-(1Н-Имидазол-1 -ил)пропил)-3 -(2,4-диметоксифенил)тиомочевина.
1пл: 120,0-120,5°С.
Ή-ЯМР δ 1,8 - 2,0 (Ьг т, 2Н), 3,4 - 3,5 (Ьг т, 2Н), 3,75 (8, 6Н), 3,9 - 4,0 (т, 2Н), 6,5 (б, 1Н), 6,6 (8, 1Н), 6,9 (8, 1Н), 7,15 (8, 1Н), 7,3 (б, 1Н), 7,5 (Ьг 8, 1Н), 7,6 (8, 1Н), 9,75 (8, 1Н); МС т/ζ 321,2 (М+Н), 253,3 (М-С3Н3Ю·).
Пример 15. 1-(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-3-(3,5-диметоксифенил)тиомочевина.
1пл: 142,0 -143,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,8 - 2,0 (Ьг т, 2Н), 3,4 - 3,5 (Ьг т, 2Н), 3,6 (8, 6Н), 3,95 - 4,0 (т, 2Н), 6,25 (т, 1Н), 6,6 (т, 2Н), 6,9 (8, 1Н), 7,2 (8, 1Н), 7,6 (8, 1Н), 7,8 (8, 1Н), 9,5 (8, 1Н); МС т/ζ 321,2 (М+Н), 253,3 (М-С3Н3Ю·).
Пример 23. 1-(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-3-(2,3-дигидробензо[Ь][1,4]диоксин-7-ил)тиомочевина.
1пл: 103,0-103,5°С.
Ή-ЯМР δ 1,9 - 2,0 (Ьг т, 2Н), 3,3 - 3,5 (Ьг б, 2Н), 3,9 - 4,0 (т, 2Н), 4,2 - 4,3 (т, 4Н), 6,7 (т, 1Н), 6,8 -
6.8 (т, 1Н), 6,9 (т, 2Н), 7,2 (8, 1Н), 7,6 (т, 2Н), 9,3 (8, 1Н); МС т/ζ 319,3 (М+Н), 251,3 (М-С3Н3Ю·).
Пример 24:1 -(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-3-(бензо[б][1,3]диоксол-6-ил)тиомочевина.
1пл: 115,0-115,6°С.
Ή-ЯМР δ 1,9 - 2,1 (Ьг т, 2Н), 3,4 - 3,5 (Ьг б, 2Н), 4,05 - 4,15 (т, 2Н), 6,0 (8, 2Н), 6,7 (т, 1Н), 6,8 - 6,85 (т, 1Н), 6,95 (б, 1Н), 7,25 (8, 1Н), 7,45 (8, 1Н), 7,7 (Ьг 8, 1Н), 8,5 (Ьг 8, 1Н), 9,4 (Ьг 8, 1Н); МС т/ζ 305,2 (М+Н), 237,2 (М-С3Н3Ю·).
Пример 25. 1-(3-(1Н-Имидазол-1 -ил)пропил)-3 -(3,4,5-триметоксифенил)тиомочевина.
1пл: 124,5-125,5°С.
Ή-ЯМР δ 1,8 - 2,0 (т, 2Н), 3,4 - 3,5 (Ьг т, 2Н), 3,6 (8, 3Н), 3,7 (8, 6Н), 3,9 -4,0 (т, 2Н), 6,65 (т, 2Н), 6,85 (8, 1Н), 7,2 (8, 1Н), 7,6 (8, 1Н), 7,7 (Ьг 8, 1Н), 9,4 (8, 1Н); МС т/ζ 351,3 (М+Н), 283,2 (М-С3Н3Ю·).
Пример 26. 1-(3 -(1Н-Имидазол-1 -ил)пропил)-3 -(3-метоксифенил)тиомочевина.
Ю: 89,5-90,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,9 - 2,1 (Ьг т, 2Н), 3,4 - 3,5 (Ьг т, 2Н), 3,7 (8, 3Н), 3,9 - 4,0 (т, 2Н), 6,6 - 6,7 (т, 1Н), 6,8 -
6.9 (т, 2Н), 7,1 (т, 2Н), 7,15 - 7,25 (Ьг т, 1Н), 7,6 (8, 1Н), 7,8 (Ьг 8, 1Н), 9,5 (8, 1Н); МС т/ζ 291,1 (М+Н),
223.2 (М-С3Н3Ю·).
Пример 27. 1-(3-(1Н-имидазол-1-ил)пропил)-3-(4-этоксифенил)тиомочевина 1||л: 126,0-126,5°С.
- 57 016584
Ή-ЯМР δ 1,5 (Ьг т, 3Н), 1,9 - 2,0 (Ьг т, 2Н), 3,4 - 3,5 (Ьг т, 2Н), 3,9 - 4,0 (Ьг т, 4Н), 6,8 - 6,9 (т, 2Н), 6,95 (8, 1Н), 7,15 - 7,2 (т, 2Н), 7,25 (8, 1Н), 7,55 -7,6 (Ьг 8, 1Н), 7,8 (8, 1Н), 9,3 (8, 1Н); МС т/ζ 305,2 (М+Н),
237.2 (М-С3Нз^·).
Пример 33. 1-(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-3-(4-(метилтио)фенил)тиомочевина.
I : 140,0-140,5°С.
Ή-ЯМР δ 1,8 - 2,05 (Ьг т, 2Н), 2,5 (8, 3Н), 3,3 - 3,5 (Ьг т, 2Н), 3,9 - 4,1 (т, 2Н), 6,9 (т, 1Н), 7,1 - 7,3 (Ьг т, 5Н), 7,6 (8, 1Н), 7,75 (Ьг 8, 1Н), 9,4 (8, 1Н); МС т/ζ 307,2 (М+Н), 239,2 (М-С3Н;№·).
Пример 42. 1-(3-(1Н-Имидазол-1 -ил)пропил)-3 -(4-нитрофенил)тиомочевина.
I : 165,0-166,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,9 - 2,05 (т, 2Н), 3,3 - 3,5 (Ьг й, 2Н), 3,95 - 4,05 (т, 2Н), 6,85 (й, 1Н), 7,15 (й, 1Н), 7,6 (й, 1Н), 7,7 (т, 2Н), 8,1 (т, 2Н), 8,3 (Ьг 8, 1Н), 10,1 (Ьг 8, 1Н); МС т/ζ 306,2 (М+Н), 237,9 (М-С3Н№·).
Пример 50. 1-(3-(1Н-Имидазол-1 -ил)пропил)-3 -(4-(диметиламино)фенил)тиомочевина.
I : 146,5 -147,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,9 - 2,0 (т, 2Н), 2,9 (8, 6Н), 3,4 (т, 2Н), 3,9 - 4,0 (т, 2Н), 6,7 (т, 2Н), 6,9 (8, 1Н), 7,05 - 7,1 (т, 2Н), 7,15 (8, 1Н), 7,4 (Ьг 8, 1Н), 7,6 (8, 1Н), 9,2 (8, 1Н); МС т/ζ 304,2 (М+Н), 236,0 (М-С3Н^2·).
Пример 102. 1-(3 -(1Н-Имидазол-1 -ил)пропил)-3 -(3,4-диметоксифенил)мочевина.
I : 114,5-115,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,7 - 1,9 (т, 2Н), 2,9 - 3,1 (т, 2Н), 3,7 (28, 6Н), 3,9 - 4,0 (т, 2Н), 6,1 (!, 1Н), 6,7 (8, 2Н), 6,8 (8, 1Н), 7,15 (й, 2Н), 7,6 (8, 1Н), 8,2 (8, 1Н); МС т/ζ 321,2 (М+Н), 253,3 (М-С3Н;№).
Пример 106. 1-((8)-3 -(1Н-Имидазол-1 -ил)-2-метилпролил)-3 -(3,4-диметоксифенил)тиомочевина.
I : 150,5- 151,5°С.
Ή-ЯМР δ 0,9 (й, 3Н), 2,3 - 2,4 (т, 2Н), 2,5 (8, 1Н), 3,7 (й, 6Н), 4,0 - 4,1 (Ьг т, 1Н), 4,15 - 4,25 (Ьг т, 1Н), 6,75 - 6,8 (т, 1Н), 6,85 (т, 1Н), 6,9 - 7,0 (т, 1Н), 7,65 (8, 1Н), 7,75 (8, 2Н), 9,1 (8, 1Н), 9,5 (8, 1Н); МС т/ζ 335,6 (М+Н), 267,1 (М-С3Н^2).
Пример 107. 1-((К)-3-(1Н-Имидазол-1-ил)-2-метилпропил)-3-(3,4-диметоксифенил)тиомочевина.
I : 155,0-157,5°С.
Ή-ЯМР δ 0,9 (й, 3Н), 2,3 - 2,4 (т, 2Н), 2,5 (8, 1Н), 3,7 (й, 6Н), 4,0 - 4,1 (Ьг т, 1Н), 4,15 - 4,25 (Ьг т, 1Н), 6,75 - 6,8 (т, 1Н), 6,85 (т, 1Н), 6,9 - 7,0 (т, 1Н), 7,65 (8, 1Н), 7,75 (8, 2Н), 9,1 (8, 1Н), 9,5 (8, 1Н); МС т/ζ 335,4 (М+Н), 267,2 (М-С3Н^2).
Пример 109. 1 -((1 -((1Н-Имидазол-1 -ил)метил)циклопропил)метил)-3 -(3,4-диметоксифенил)тиомочевина.
I : 166,5-168,5°С.
Ή-ЯМР δ 0,7 - 0,8 (Ьг т, 2Н), 1,85 - 1,9 (т, 1Н), 2,15 - 2,2 (т, 1Н), 2,2 - 2,3 (т, 1Н), 3,4 - 3,5 (т, 1Н), 3,7 (й, 6Н), 4,2 (8, 1Н), 4,95 (8, 1Н), 6,75 - 6,8 (Ьг т, 1Н), 6,85 - 6,9 (Ьг т, 1Н), 7,0 (8, 1Н), 7,5 (т, 1Н), 7,6 (т, 1Н), 7,7 (8, 0,5Н), 7,8 (8, 0,5Н), 8,85 (8, 0,5Н), 9,1 (8, 0,5Н), 9,35 (8, 0,5Н), 9,45 (8, 0,5Н); МС т/ζ 347,2 (М+Н), 279,2 (М-С3Н^2), 137,5 (М-С9Н13^8).
Пример 110. №(3-(1Н-Имидазол-1-ил-)пропил)бензо[й]тиазол-2-амин.
Ή-ЯМР δ 1,95 - 2,15 (т, 2Н), 3,25 - 3,35 (т, 2Н), 4,0 - 4,1 (!, 2Н), 6,9 (8, 1Н), 6,95 - 7,05 (!, 1Н), 7,15 -
7.2 (т, 2Н), 7,35 - 7,4 (й, 1Н), 7,60 - 7,70 (т, 2Н), 8,0 - 8,1 (Ьг 8, 1Н); МС т/ζ 259,4 (М+Н), 191,3 (МС3Щ^·).
Пример 111. №(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-6-хлорбензо[й]тиазол-2-амин.
Ή-ЯМР δ 1,95 - 2,15 (т, 2Н), 3,25 - 3,35 (т, 2Н), 4,0 - 4,1 (!, 2Н), 6,9 (8, 1Н), 7,1 - 7,2 (й, 2Н), 7,3 - 7,4 (й, 1Н), 7,65 (8, 1Н), 7,8 (8, 1Н), 8,2 (8, 1Н); МС т/ζ 293,3 (М+Н), 225,3 (М-С3Н;№·).
Пример 112. №(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-6-метоксибензо[й]тиазол-2-амин.
Ή-ЯМР δ 1,9 - 2,05 (т, 2Н), 3,2 - 3,3 (т, 2Н), 3,7 (8, 3Н), 4,0 - 4,1 (!, 2Н), 6,7 - 6,8 (й, 1Н), 6,9 (8, 1Н), 7,15 - 7,2 (8, 1Н), 7,2 - 7,3 (т, 2Н), 7,65 (8, 1Н), 7,8 (8, 1Н); МС т/ζ 289,1 (М+Н), 221,4 (М-С3Н^2·).
Пример 115. (К)-Ы-(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-2-фенилпропантиоамид.
I : 82,0 - 82,5°С.
Ή-ЯМР δ 1,4 - 1,55 (й, 3Н), 1,9 - 2,0 (т, 2Н), 3,4 - 3,5 (т, 2Н), 3,85 - 3,95 (т, 2Н), 4,0 - 4,1 (φ 1Н), 6,8
- 6,9 (8, 1Н), 7,1 (8, 1Н), 7,15 - 7,2 (т, 1Н), 7,2 - 7,3 (т, 2Н), 7,35 - 7,4 (т, 2Н), 7,55 (8, 1Н), 10,1 (8, 1Н); МС т/ζ 274,4 (М+Н), 206,3 (М-С3Н^2·).
Пример 116. (8)-Ы-(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-2-фенилпропантиоамид.
!пл:82,5-83,5°С.
Ή-ЯМР δ 1,4 - 1,55 (й, 3Н), 1,9 - 2,0 (т, 2Н), 3,4 - 3,5 (т, 2Н), 3,85 - 3,95 (т, 2Н), 4,0 - 4,1 (φ 1Н), 6,8
- 6,9 (8, 1Н), 7,1 (8, 1Н), 7,15 - 7,2 (т, 1Н), 7,2 - 7,3 (т, 2Н), 7,35 - 7,4 (т, 2Н), 7,55 (8, 1Н), 10,1 (8, 1Н); МС т/ζ 274,4 (М+Н), 206,3 (М-С3Н^2·).
Пример 121. №(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-1-(4-хлорфенил)циклобутанкарботиоамид.
I : 137,5-139,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,55 - 1,75 (Ьг т, 2Н), 1,85 - 1,95 (Ьг т, 2Н), 2,4 - 2,5 (Ьг т, 2Н), 2,7 - 2,85 (Ьг т, 2Н), 3,3 3,5 (Ьг т, 2Н), 3,8 (т, 2Н), 6,9 (8, 1Н), 7,0 (8, 1Н), 7,3 (т, 2Н), 7,45 (8, 1Н), 7,5 (т, 2Н), 9,6 (!, 1Н); МС т/ζ
- 58 016584
334,3 (М+Н), 266,1 (М-С3Н^2).
Пример 122. N-(3 -(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)- 1-(4-хлорфенил)циклопентанкарботиоамид.
V 140,0-141,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,5 - 1,65 (Ьг т, 4Н), 1,8 - 1,9 (т, 2Н), 2,0 - 2,1 (т, 2Н), 2,6 (т, 2Н), 3,4 - 3,5 (т, 2Н), 3,7 -
3,8 (т, 2Н), 6,85 (8, 1Н), 7,0 (8, 1Н), 7,35 (т, 2Н), 7,4 (т, 2Н), 7,5 (8, 1Н), 9,4 (ΐ, 1Н); МС т/ζ 348,2 (М+Н),
280.2 (М-С3Н3К2·).
Пример 123. №(3-(1Н-Имидазол-1-ил)пропил)-1-(4-метоксифенил)циклогексанкаботиоамид.
1пл: 162,5-164,0°С.
Ή-ЯМР δ 1,2 - 1,3 (т, 1Н), 1,35 - 1,5 (Ьг т, 5Н), 1,85 - 2,0 (Ьг т, 4Н), 2,4 -2,6 (Ьг т, 2Н), 3,4 - 3,5 (т, 2Н), 3,7 (8, 3Н), 3,8 (т, 2Н), 6,8 (т, 3Н), 7,0 (8, 1Н), 7,3 (т, 2Н), 7,5 (8, 1Н), 9,2 (ΐ, 1Н); МС т/ζ 358,3 (М+Н), 290,3 (М-С3Н3к·).
Пример 124. Ν-(3-(1 Н-Мидазол-1 -ил)пропил)-1 -(4-метоксифенил)циклопропанкарботиоамид.
V 129,0-129,5°С.
Ή-ЯМР δ 1,0 - 1,1 (т, 2Н), 1,5-1,6 (т, 2Н), 1,9 - 2,0 (Ьг т, 2Н), 3,4 - 3,5 (т, 2Н), 3,7 (8, 3Н), 3,9 (т, 2Н), 6,9 (т, 3Н), 7,1 (8, 1Н), 7,2 - 7,3 (т, 2Н), 7,6 (8, 1Н), 8,9 (Ьг 8, 1Н); МС т/ζ 316,0 (М+Н), 248,4 (МС3Щ^·).
Пример 134. 5-(1Н-Имидазол-1-ил)-№(3,4-диметоксифенил)пентантиоамид.
V 128,0-128,5°С.
Ή-ЯМР δ 1,65-1,70 (т, 2Н), 1,75-1,80 (т, 2Н), 2,7-2,75 (т, 2Н), 3,7 (8, 3Н), 3,75 (8, 3Н), 4,0 - 4,05 (ΐ, 2Н), 6,9 - 7,0 (т, 2Н), 7,2 (8, 1Н), 7,3 (6, 1Н), 7,5 (8, 1Н), 7,75 (8, 1Н), 11,0 (8, 1Н); МС т/ζ 320,2 (М+Н),
252.2 (М-С3Н^2·).
Пример 136. 1-(2-(1Н-Имидазол-1-ил)этил)-3-(3,4-диметоксифенил)тиомочевина.
V 157,5-159,0°С.
Ή-ЯМР δ 3,7 (28, 6Н), 3,8 (т, 2Н), 4,2 (т, 2Н), 6,7 (т, 1Н), 6,85 (т, 1Н), 6,9 (т, 2Н), 7,15 (8, 1Н), 7,5 (Ьг 8, 1Н), 7,6 (8, 1Н), 9,5 (8, 1Н); МС т/ζ 307,2 (М+Н), 239,1 (М-С3Н^2·).
Сокращения °С - градус Цельсия;
А, А1а - аланин;
Ав - амилоидный-в-пептид;
АВп - амилоидный пептид, обнаруженный при семейной британской деменции;
АС - аденилилциклаза;
АЭап - амилоидный пептид, обнаруженный при семейной датской деменции;
А1М - отсутствует в меланоме;
АМС - аминометилкумарин;
а8 - антисмысловой;
А8р - аспартат;
βΝΑ - бета-нафтиламин;
ВА - масляная кислота;
Ьр - пара оснований;
БСА - бычий сывороточный альбумин;
С - цистеин;
САТ - хлорамфениколацетилтрансфераза;
цАМФ - циклический аденозинмонофосфат;
ССЬ2 - МСР-1, миноцитарный хемоаттрактантный белок 1;
ССЬ7 - МСР-3, миноцитарный хемоаттрактантный белок 3;
ССЬ8 - МСР-2, миноцитарный хемоаттрактантный белок 2;
ССЬ13 - МСР-4, миноцитарный хемоаттрактантный белок 4;
кДНК - комплементарная ДНК;
С-Н18 - С-концевая гистидинова метка;
СЮР - хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия;
С1 - хлор;
С8Е - спинномозговая жидкость;
С-конец - карбоксиконец;
СТЬ - цитотоксический Т-лимфоцит;
СV - объем колонки;
- диаметр;
Да - Дальтон;
ДМСО - диметилсульфоксид;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
Е - фермент;
ЕВV - вирус Эпштейна-Барра;
- 59 016584
ЕСЬ - энтерохромаффиноцит-подобный;
Е. οοΐί - ЕксйепсЫа οοΐί;
ЕС - глутамилциклаза;
ЕЭ - эффективная доза;
ЕСЕР - усиленный зеленый флуоресцентный белок;
Е8 - комплекс фермент-субстрат;
ЕРР - стимулирующий оплодотворение пептид;
ЕТС - фолликулярный рак щитовидной железы;
д - относительная центробежная сила;
СВ8 - синдром Гийена-Барре;
СЕ - гель-фильтрация;
С1п - глутамин;
С1и - глутаминовая кислота;
СпВН - гонадотропин-релизинг гормон (гонадолиберин);
С8Т - глутатион-8-трансфераза;
Н- водород;
й - человеческий, час
НСЕ - фактор роста гепатоцитов;
ШС - хроматография, основанная на гидрофобном взаимодействии;
НГЕ1а - индуцирующий гипоксию фактор 1а;
Н18 - гистидин;
ЖХВР - жидкостная хроматография высокого разрешения;
I - ингибитор, изолейцин;
ГО - идентификация;
ГМАС - аффинная хроматография на иммобилизованном металле;
ИПТГ - изопропил-З-Э-тиогалактопиранозид;
К - калий;
к - константа;
кДа - килодальтон;
к1 - константа ингибирования;
КЬН - гемоцианин лимфы улитки;
- длина;
ЬВ - Луриа-Бертани;
БЭ - смертельная доза;
ЬР8 - липополисахарид;
М - молярный;
мкл - микролитр;
мкМ - микромолярный;
МАСЕА - антиген меланомы семейства А;
МАСЕВ - антиген меланомы семейства В;
МаИЕФЕ - времяпролетная масс-спектрометрия с использованием опосредуемой матрицей лазерной десорбции/ионизации;
МАВТ1 - антиген меланомы, распознаваемый Т-клетками;
тах - максимум;
МСЬ-1 - белок миелобластного лейкоза 1;
Ме1 - метионин;
Мин - минуты;
мМ - миллимолярный;
М8 - рассеянный склероз;
мРНК - матричная РНК;
N - аспарагин;
Ν;·ι - натрий;
НАД-Н - никотинамидадениндинуклеотид;
нм - нанометр;
ΝΟ - номер;
НТ - нейротензин;
Ν-конец - аминоконец;
О - кислород;
ОП - оптическая плотность;
Р - продукт, фосфор;
ЗФР - забуференный фосфатом физиологический раствор;
- 60 016584
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
рС1и - прироглутаминовая кислота;
рН - водородный показатель;
Рго - пролин;
РТС - папиллярный рак щитовидной железы;
Руг - пироглутамат;
ОС - глутаминилциклаза (глутаминилпептидциклотрансфераза);
с.|ПЦР - количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; ОРСТЬ - напоминающий глутаминилпептидциклотрансферазу белок;
РНК - рибонуклеиновая кислота;
ОТ - обратная транскрипция; обратная транскриптаза;
- субстрат;
к - смысловой;
8АСЕ - серийный анализ генной экспрессии;
ДСН - додецилсульфат натрия;
ДСН-ПААГ - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН;
8САР - аминопептидаза 8!гер!отусек дпкенк;
8ЕО - последовательность;
8NР - полиморфизм одного нуклеотида;
1аа - ассоциированный с опухолью антиген;
ТСЕ-β - трансформирующий фактор роста бета;
Т>-а - фактор некроза опухоли альфа;
ТКН - тиреотропин-рилизинг-фактор (тиреолиберин);
Т8Н - тиреостимулирующий гормон;
ТУК - тирозиназа;
ТУКР - родственный тирозиназе белок;
Ед. - единица;
ИТС - недифференцированный рак щитовидной железы;
УФ - ультрафиолетовый;
У - скорость;
УрАР - аминопептидаза У1Ьгю рго1ео1уНса;
Υ88 - сигнальная последовательность дрожжей;
Ζπ - цинк.
- 61 016584
Перечень последовательностей <110> ПРОБИОДРУГ АГ <120> Новые гены, родственные гену глутаминилциклазы <1зо> РВО 0006 о/ио <150> из 60/846,244 <151> 2006-09-21 <150> из 60/947,780 <151> 2007-07-03 <160> 121 <170> РасепС1п версия 3.1 <210> 1 <211> 1086 <212> ДНК <213> человек <400> 1 абддсаддсд даадасассд дсдсдбсдЬд ддсасссЁсс ассСдсСдсС дс^ддСддсс 60
у <_ иг и.' ϊ_ у и с ί- уууиаси_ау уууууи^ауи эиуауоуиио ^.яуиииуу ии <»У «УУ<=»У ««у 120
ааССассасс адссадссаС. ЕХИдааШзса бсддсбсЬбс ддсаааСИдс адааддсасс 180
адбабсЬсСд аааЕдЬддса ааабдасЬЬа садссаЬЬдс ЬдаЬададсд аЬасссддда 240
ИссссЪддаа дсба^дсбдс ЪсдЪсадсас аЪсабдсадс дааСЬсадад дс^Ссаддсб 300
дасДдддбсЬ Ьддааабада сассЪИсбЬд адрсадасас сс£а1:дддЬа ссддЬСЬСОС 360
Ссааа^аСса Ссадсасссб саа^сссасЬ дсбааасдас аССбддбссЬ сдссЬдссас 420
СаЬдасЬсса адЬаСЬССбс ссасСддаас аасададЪдЬ ЪЁдбаддадс сасрдассса 4Θ0
дссдЬдссаЬ дедсааедаи дбсддаасс): дсесдкдссб Ъадасаадаа асбсс££(:сс 540
СГааадасСд СССсадасбс саадссадаС СЬдбсасбсс адсЬдаЪсЪ12 сбЬЬдаЪддС 600
даададдсСЪ ЬссИсасбд дксЬссРсаа даРСсСсЬсе абдддЁсСсд асасСИадсС 660
дсааадаСдд саЁсдасссс дсасссассь ддадсдадад дсассадсса асСдсабддс 720
асддаеоьаь бддЬсЕЕаЪб ддаЬЬЬдаЬЕ ддадсЪссаа асссаасдЬС ЪсссааЬЬбС 730
ЬКЬссааасЬ садссаддЬд дСРсдааада сЪЬсаадсаа ЪЬдааса&да асЪСсаСдаа 840
- 62 016584
ЪЬдддЪЪЪдс СсааддаИса сЪсНЬЬддад дддсддьасс £ссадаа£Ха садЁНаЬдда 900
ддИдС-даЬЕс аддаидасса ЬЬаадаадад дЪд^Сссад!: ссЕдсаЕсед 960
аСассдСс^с сЬССсссИда ад^сЬддсас асоаеддаЬ.д асааЬдаада аааЕССдда1: 1020
дааисаасса ЬЕдасааСсС ааасааааНс с^асаадьси £Ид£дЕГ.дда а^аИс^СсаЬ 1080
1066 <210> 2 <211> 1149 <212> ДНК <213> человек <400> 2
аСдсдСЬссд ддддссдсдд дсдассссдс сЪдсддсОдд дддаасдЬдд СС^саЬддад 60
ссасССССдс сдссдаадсд ссдссСдсДа ссдсдддОСс ддсСсОИдсс (зсОдС^дсИд 120
дсдсЪддссд ^дддсесддс деесСасасс ассгддадсд дседдсаасд саддассдад 180
дадсЬдссдс сдддссддда дсгдсддд!:с ссаОСдасед даадсс^ссс сдаадсссдд 240
сьдсддаддд ^дд^дддаса асЬддаЕсса садсдСсЬсС ддадсасИСа ЪсЪдсдсссс 300
сЬдсЬддСЬд сдсдаасссс дддсадсссд ддаааСсССС аадьсадааа дсъсс£ддад 360
дссасдсодс ддЬсссЪдас адсаддЬЪдд сасдЬддадс ЬддаЪсссДЪ сасадсс^са 420
асассес^дд ддссад1:дда сЪ^ОддсааЬ д£дд£ддсса сасЕддассс аадддседсс 480
сдЕсассСса сссССдссЪд осаосасдас Ъсдаадсνοϋ Ьсссасссдд аЮдассссс 640
ЫСдеадддд ссасддае^с ддс^дедссс Ьд^дсосгдс Пдс^ддадсС ддеесаадса 600
сССдасседд адсЬдадсад ддссаааааа саддсадссс сддС.дасссЬ дсаасХдсСс 660
ЫсЬСддаЬд дьдаададдс дс^дааддад Ьддддассса аддас£ссс£ ££асдд££сс 720
сддсасседд сссадсЬсаК ддадСсЬаЬа ссЬсасадсс ссддссссас саддаС.ссад 780
дсдаД^дадс ПсПХИаОдсЕ есеьдаСссс сЬдддадссс ссааНсссас сОСсЪасадс 040
сассессс^о дсасддСссд сСддСЬссаЪ сддсЬдадда дсаьс.дадаа дсдЪсЪдсас 900
сдССЪдаасс ЬдсЬдсадЬс Ьса^ссссад даадЬдаЪдЬ асЬЪссаасс сддддадссс 960
ЪЪСддс^сЪд Ъддаадасда ссасаСсссс ССсс^ссдса даддддИасс сдсдсиссак 1020
сосаЬсосса сдсссТХссс ЬдссдЬсЬдд сасассес^д сддасассда дд£саа£с£с 1080
- 63 016584
абдсдббссд ддддссдсдд дсдассссдс сЬдсддсЕдд дддаасдедд абддадссас 60
ЬсЬЬдссдсс даадсдссдс сЕдсбассдс дддСЬсддсЬ сЬЬдссбсЬд Ыдсбддсдс 120
бддссдьддд сЬсддсдббс Ьасассаббб ддадсддсЕд дсассдсадд асЬдаддадс 180
ЬдссдсЬддд ссдддадсбд сдддСсссаС: Сдабсддаад ссСссссдаа дсссддсбдс 240
дцадддСддб дддасаасЬд дабссасадс дЬсбсЬддад сасССабсЪд сдсссссЬдс 300
ьддссдьдсд аассссдддс адсссдддаа аЕсЕссаадС садааадЕЬс сбддаддсса 360
сдссдсддЬс ссСдасадса ддССддсасд СддадсСдда ссссбСсаса дссЬсаасас 420
ассбддддсс адЕддасЬЫ: ддсааЕдбдд ЕддссасасЬ ддасссаадд дсСдсссдбс 480
ассЪсасссЬ ЕдссЬдссаЬ СаЕдасЬсда адсЬсЕЕссс асссддаьсд асссссЬСЬд 540
Ьаддддссас ддаССсддсС дбдсссбдсд сссСдсСдсС ддадседдсс саадсасССд 500
ассЬддадсЕ дадсадддсс аааааасадд садссссддЬ дасссбдсаа СЬдсЬсЕЬсЬ 660
сддасддбда ададдсдсЕд ааддадСддд дасссаадда сбсссЕЕЕас ддСбсссддс 720
ассИддссса дсСсаЬддад Ьс1:а1сассЪс асадссссдд ссссассадд аЕссаддсЬа 780
ССдадсСсбЧ баСдсССсЬб дабсСссПдд дадсссссаа ЬсссассЬЕс ГасадссасЬ 840
Есссбсдсас ддбссдсбдд ЬСссаЬсддс ЬдаддадсаЬ ЬдадаадсдП сСдсассдПП 900
ЪдаассЕдсЕ дсадбсЮсаЪ ссссаддаад бдаЪсЪасЬЪ ссаасссддд дадсссЬЬЬд 960
дсбсСдбдда адасдассас абссссебсс пссдсададд ддЬасссдЕд сЬссабсЕса 1020
ЕсЬссасдсс сЫгсссбдсЬ дбсЕддсаса ссссбдсдда сассдаддЪс ааЪсЪссасс 10Θ0
сасссасддС асасаасСЪд бдссдсаббс СсдсЕдсдсб ссЕддсЕдаа ЬассСддддс 1140
ЬсЬад 1145
- 64 016584 <210>4 <211=·1149 <212> ДНК <213> Масаса Еазс1си1аг1з <400>4
аСдсдСЪссд ддддссдсдд дсддссссдс сЬдсддсСад дддаасдЬдд сдССаЕддад 60
ссасЬсЕЕдс ссссдаадсд ссдссЬдсйа ссдсдддИЬс ддсЬсЬЬдсс ссЬдСЬдсЕд 120
дсдседдссд СдддсСсддс дССсСасасс аСССддадсд дсСддсассд саддассдад 180
дадсГдссдс Едддссддда дсГдсдддСс ссдССдаЕсд даадссЕСсс сдаадсссдд 240
сСдсддаддд ьддьдддаса асЕддассса садсдЬсЬсЬ ддддсасЫа ЕсЕдсдсссс 300
сСдссддеьд Сдсдаасссс аддсадсссд ддаааСсСсс аадЕсадааа дЕ£ссЕ.ддад 360
дссасдсЁдс ддЪсссЕдас адсаддеедд сасдЬддадс ЬддаьссссЪ сасадссСсд 420
асдссссЬдд ддссадСдда сСССддсаас длддьддсса сдсСддассс дддддсЬдсс 480
сдЕсассЕса сссЕЬдссЬд ссаЕЬаЬдас ЕсдаадсЬсЕ Ьсссасссдд аесдассссд 540
ССЕдкадддд ссасддасЕс ддсСдСдссс СдСдсссЬдс СдсСддадсЕ ддсссаддса 600
сЕЕдассСдд адсСдадсад ддссааадаа саддсадссс сддСдасссЬ дсаасСдсЬс 660
ЬЬссЬддаЕд д&даададдс дсЬдааддад ьддддассса аддасЬсссС ЫасддЕЪсс 720
сддсассЪдд сссадсЬсаЪ ддадСсЬаЬа ссЬсаЬадсс ссддссссас саддаЕссад 780
дсЕаСЕдадс Есессасдси сссьдаъссс ссдддадссс асааЬсссас сссссасадс 840
сасЕЬсссЬс дсасддЬссд сЬддЕЕссаЬ сддсСдадаа дсаЬЕдадаа дсдЕсЬдсас 900
сдШдаасс СдсЕдсадЬс ЬсаЬссссад даадЕдаЬд! асЪЕссаасс сддддадссс 960
ЕСсддсПсСд Сддаадасда ссасаЬсссс ЕСссСссдса даддддСссс сдСдсСасаЬ 1020
сьсассъсса сдсссЕСссс ЕдссдЕсСдд сасассссЕд сддасасада ддссааСсЬс 1080
сасссдссса сддСасасаа сЫаадссдс асЪсЕддссд ЕдЬЕссЬддс ЬдааЬассЕд 1140
дддсЬссад 1149
<210>5 <2]1>1149 <212> ДНК <213> Масаса тиТаСЕа
- 65 016584 <400> 5
аЪдсдЬЬссд ддддссдсдд дсддссссдс сСдсддсЬад дддаасдГдд сд^СаСддад €0
ссасЬсЬЬдс ссссдаадсд ссдссЬдсЕа ссдсдддЬЬс ддсЕсЕЬдсс сссдгедссд 120
дсдсСддссд СдддсЕсддс дСЕсЕасасс аЬЬеддадсд дсСддсассд саддасРдад 180
дадсЬдссдс Едддссддда дсСдсдддЬс ссдССдаСсд даадссЬСсс сдаадсссдд 240
сСдсддаддд сддсяддаса асСддассса садсдссСсР ддддсасСРа РсРдсдсссс 300
сЬдсЬддЬЪд Едсдаасссс аддсадсссд ддаааЪсЬсс аадЪсадааа дЬЬссЬддад 360
дссасдсбдс ддЬсссЬдас адсаддр-едд сасдьддадс СддаЬсссСС сасадссСсд 420
асдссссСдд дсссадСдда сСРРддсааР д^ддьддсса сдседдассс дддддссдсс 480
сдссассЬса сссСРдссСд сса^Ьаедас СсдаадсЬсС Ьсссасссдд аЕсдассссд 540
ЫЬдЬадддд ссасадасЕс ддсьдСдсса ЪдЬдсссЬдс едседдадсЪ ддсссаддса 600
сЬЕдассЬдд адссдадсад ддссааадаа саддсадссс сддрдасссе дсааседсРс 660
РРссЬддасд дСдаададдс дсРдааддад Сддддассса аддасЬсссЬ ЬЬасддЪЬсс 720
сддсасссдд сссадсъсас ддадссгаиа ссгсасадсс ссддссссас саддасссад 780
дсЪаЪЪдадс ЬстеЪаьдсР ссРЬдаЬсСс сЪдддадссс ссааЬсссас сСбсЬасадс 840
сасеессссс дсасддбссд ссддсессас сддседадаа дсаССдадаа дсдЕсЬдсас 900
сдессдаасс ГдсСдсадес СсаЕссссад даадЬдаСдЁ асЕЬссаасс сддддадссс 960
е^ддсЕсЬд Ьддаадасда ссасаЬсссс ССссСссдса даддддЬссс сдЁдсЕссаЬ 1020
сЬсаЬсСсЪа сдсссЕЬссс ЬдсСдЬс^дд сасассссЪд сддасасада ддссааЬсЕс 1080
сасссдссса сддьасасаа сРЪаадссдс аССседдссд Сдеессьддс РдааРассЬд 1140
дддсЕсСад1149 <210> 6 <211>1152 <212> ДНК <213=· Сап1з ЕагсШапз <400>6
асдссеессд ддддссдсдд дсддСсссдд сеасддспсд дддаасд^дд ссссеъддад 60
ссдсссъссс сдсссаадсд ссдссЬдс^с ссдсдддсдс асССсЬЬдсс СсСдсС&сЬд 120
- 66 016584
сСддсссЬдд ссссддсСЬс ддсдасссас ассаСсСдда дсддсЬддса ссассадасС 1В0
даддадсЬдс сдсддддссд ддадсСдсдд ддссдсееда есддаадссь сСссдаадсс 240
сддсЕдсддс ЗЗдЬддСддд дсаасЬддас ссасассдСс ЬсСддаасас с^аъсидсдс зоа
ссссСдсСдд ССдГдсддас сссдддсадс сссддсааЬс ЕссаадЬсад ааадЕЕссЬд 360
даддсЕасас ьасддассЫ дасадсаддс ЬддсаЬдЬдд аасЕддасса сЬСсасадсс 420
СЬдасасссс ьддддссась ддасЪЬЬддс ааЬдГддЪдд ссасдсЕдда сссаддддсЕ 480
дсссдЬсасс ЕсасссЕЬдс сЬдссаЫаЬ дасЕссаадс ЪсЫсдсаЬс ЬдадЕсддЪЕ 540
сссСЫдЬдд дддсаасада ЬЬсддсЬдЬа ссСЬдсдссс ЬдседсЕдда дсЕддс^сад 600
дсссЬсдаса дддадьедад Ьадддссаад дадсаддаад ссссддЬдас ЪсЁдсадсЬд 660
сЬсЕЫЫздд аеддЬдаада адсассдаад дадсддддас ссасадасЕс ссСсСаЬддс 720
Ьсссддсасс СддсссадсЕ сасддадЕсЪ дсассссаса дсссдддссс сассаддаЬс 780
саддсЬаЬсд адсЬсЫсаЬ дсЬссЫдаЬ сЬссСдддЕд ссссдааЬсс ааасСЪсЪас 840
адЬсааЫсс сСсаЬасадс ссдсЬддсЕс саСсддсЕда ддадсаСсда даадсдссСС 900
сассдсаЬда ассЬдсТдса дСсЬсаЕссс саддаадЬда ЬдСасЫсса дсссддддад 960
сссссЬддСГ сьдсддаада Сдассасаьс ссссессЕсс дссдаддддС ссс^дедсЪс 1020
сассСсаЕсС ссаедсссЬЬ ссссЕссдЬс еддсасассс ссдаЬдасЬс едаддссаас 1080
сЬдсасссас ссассдЕаса сааес^дадс сдсаЬссесд ссдЬдЬессЬ ддссдаайаЪ 1140
седдддсссе ад 1152
<210 =7 <211>1152 <212> ДНК <213 > КаЬЬиз погуедхсие <400>7
аЬдадСссдд ссадссдсдд дсддЕсгсдд садсддсГсд дддаьсдсдд ссСсаСдааа 60
ссасссСсас ссессаадсд ссдСсСесЪд ссдсдддСдс адсЬссСдсс сседсЬдсСд 120
с^ддсдсСдд ссссдддссС ддссееььас ассдсссдда асадсьддса ссеЬддддЫ 180
даддаддСае сасддадссд ддаСседсдд дСсссдседа СсддаадссС ЬЬсадаадсс 240
- 67 016584
аадсЕдсддс дсадсСддае ссасадсдьс СсСддддаас С ¢. ЬГсЬдсдЬ 300
сссЕЬдЕЬда 1;ЕдЕа.сда.сс сссаддЕадк ссбддсааЬс ЬссаадЬдад ааадЬЬссЬд 360
даддсЬасдЬ ^дсадЬсссЬ аЬсддсаддс ЬддсасдЬдд аасЕддассс аЬЪсасадсс 420
Ъсаасссссь йддддссасЪ ддасЬЬсддд аасдЪддЬдд ссассс^'Еда сссаддадсь 480
дсссдЬсасс СсасссСсдс сСдссаССаС дасссСаадЬ ЬсСЬСССЕСС СдддССассс 540
ссссььдсдд дддссасада ЬСсадссдРд сссЪдСдссс сдсгсседда дГЬадЬссад 600
дсссЕЬдаЬд ЬсаЬдсСдад садааЬсаад садсаддсад сассадСдас ссОдсадсед 660
сЬсСЬсЕЁдд асддддадда ддсасЪдаад дадсддддас саааддасЕс ссЬсСаЕддЬ 720
Есссддсасс СадсСсадаС саЬддадСсС аСассдсаса дсссСддссс сассаддаес 780
саддсСаССд адсъс^ъхдх сссьсЬЬдас сССсСдддад сдсссадссс аапссесссс 840
адесаспссс сссдсасадс ссдссддсьс саасдасСдс ддадсассда даадсдссСЬ 900
сассдЬсГда ассЬас&дса дЬсСсасссс саддаадьда ЕдЕасЬксса асссддддад 960
сссссьддсс сьдьддаада ОдассасаЬс ессъсссЬСс дсададдддь сссддодсьс 1020
сассЕсаЬЬд сдаЬдссс^Ъ сссЕдссдЬд Ьддсасасас сЬдсЬдасас ЕдаддсЬаас 1080
сЬссасссдс ссасддкдса саассЬдадс сдсаЪссЕсд ссдЬдЬЬссЬ ддсЪдадЬас 1140
сСдддСсЬсс ад 1152
<210> 8
<211> 1152
<212> ДНК
<213> Миз тизсиХиэ
<4 00·» 8
аЁ.дад£сссд ддадссдсдд дсддссссдд садсддсЬсд аддаОсдЬдд ссЬсаЬдааа 60
ссасос^сас ЕЕЕссаадсд ссдЬсЕЕсЕд ссдсдадЬдс адЬЕссЬдсс ссЬдс1:дс^д 120
с£ддсдс£дд сЁаЬдддсЬЪ ддсГЬЬсСаЬ аЕсдСсЬдда асадсЬддса сссЕдддд^Е 180
даддада^дц сасддадссд дда^с^дсдд дЬссадс^да ЬсддаадссЮ ЪСсадаадсс 240
аадсЪдсддс ЕддЪддЬадд дсадсЬддаЬ ссдсадсдЬс ЬсЕддддаас ЁЪ£сс£дсдЪ 300
СссЕЕа^Еда е^дСдсдасс сссдддсадЕ есЬддсааЬс СссаадЕдад ааадЕЕсс^д 360
даддсТзасдЬ Ьдсад^ссс!: дЪсддсаддс СддсаЕдЬЪд аасЬддассс аЪЪсасддсс 420
- 68 016584
ЕсаасссссЕ ЕддддссасЕ ддасЕЕсддд аасдЕддЕдд ссасасЕЕда сссаддадсЕ 450
дсссдЕсасс ЕсасссЕсдс сЕдссаЕЕаЕ дасЕсЕаадЕ ЕсЕЕСССЕсС ддддЕЕдссс 540
сссЕЕЕдЕдд дддссасада ЕЕсадсЕдЕд сссЕдЕдссс ЕдсЕЕсЕдда дЕЕддЕссад 600
дсссЕЕдаЕд ссаЕдсЕдад садааЕсаад садсаддсад сассддЕдас ссЕдсадсЕд 660
сЕЕЕЕсЕЕдд аЕддддадда ддсасЕдаад дадЬддддас саааддасЕс ссЕсЕаЕддс 720
Есссддсасс ЕадсЕсадаЕ саЕддадЕсЕ аЕассасаса дсссЕддссс сассаддаЕс 780
саддсЕаЕЕд адсЕсЕЕЕдЕ ссЕссЕсдас сЕЕсЕдддад саЕссадЕсс даЕсЕЕсЕЕс 840
адЕсасЕЕсс сСсдсасадс ссдсЕддЕЕс садсдасЕда ддадсаЕЕда даадсдссЕЕ 900
сассддсЕда ассЕасЕдаа дЕсЕсасссс саддаадЕда ЕдсасЕЕсса асссддддад 960
ссссссддсс сЕдЕддаада Едассасасс СССЕЕССЕЕС дсададдддЕ сссддЕдсЕс 1020
сассЕсаЕЕд ссасдсссЕЕ сссЕдсЕдЕд Еддсасасас сЕдсЕдасас сдаддссаас 1080
сЕссасссас ссасЕдЕдса ЕаассЕдадс сдсаЕссЕЕд сЕдЕдЕЕссЕ ддссдадЕас 1140
сЕдддасЕсЕ ад 1152
<210 = 9 <211 = 1152
<212 = <213=· ДНК ВОЗ Еаигче
<400 = 9
аЕдссЕЕссд ддддссдсдд дсддссссдд сЕссаддЕсд дддааедсад ссЕЕЕЕддад 60
сдасссЕсас сдсссаадсд ссдссЕдаЕа ссдсдддсас адсЕдЕЕдсс ссадсЕдсЕд 120
сЕддсЕсЬда сддсадссЪс ддЕдЕЕсЕаЕ ассаЕЕЕдда ддаЕсЕддса ЕадссадасЕ 180
даададсЕас сдс^ддддсд ддадсЕдсдд ддсссЕЕЕда ЕсддаадссЕ ссссдаадсЕ 240
сдддЕдсдда дддЕадЕддд дсаасЕддас ссЕсассдЕс ЕсЕддаасас ЕЕЕссЕдсдС 300
ссЕсЕдсЕдд ЕЕдЕасддас Ессдддсадс ссдддсааЕс ЕссаадЕдад ааадЕЕссЕд 360
даддсЕасдс ЕдсддасасЕ ЕЕсадсаддс ЕддсаЕаЕад аасЕсдасЕс сСЕсасЕдсс 420
Ессасасссд ЕддддссаЕЕ ддасЕЕсадс ааЕдЕддЕдд ссасдсЕдда сссаддддсЕ 480
дсссдссасс ЕЕасссЕЕдс сЕдссаЕЕаЕ дасЕссаадс ЕсЕЕСССаЕе ЕдасЕсадсс 540
- 69 016584
сссГСЬдЬдд дддссасдда СЬсддсадСд ссЕСдсЕссс СдсЕасЕдда дсЕддсссаа 600
дсссССдасо аддадсСддд сааадссаад дададддсад сдссаасдас сЕСдсадсьд 660
аЪс'ЬЕсС'Ьдд аЬддЕдаада ддсассдаад садЬддддас ссааддасРс дсЬСЬаЬддс 720
Есссддсасс ЕддсссадсЕ саьддадесС асассссасд дссСдддсСс сассаддаЬс 730
саддсЕаЕЕд адсРсЬЕЪаЬ дсЕЕсОЕдаЬ сесссдддад сссссаассс дассСРсЬас 840
адЬсасЬЕсс сЬсдсасддс ссдсЬддЬЬс саЕсддсРса ддадсаЬЬда даадсдссЕд 900
сассдПсСда ассСссЕдса дЕсСсаРссС ЬдддаадЬда ЕдЬасЬЬсса дассддддад 960
ссссссддсс ссдрддаада сдассасаЕс ссдЕЕссЕсс дссдаддадЕ ЕсссдЬдсЬс 1020
сассЕсабсд ссасасссСС ссссСсСдбс СддсасасдЬ ссдаЕдасес сдаддссаас 1030
сСдсасссас ссасддСаса саассЕдадс сдсаСссСдд ссдСдЕЬсеЕ ддсСдадЕас 1140
сьддддсьсъ ад 1152
<210> 10 <Ξ11> 361 <212? РКТ <213> человек
<400> 10
МеЬ А1а С1у С1у Агд ΗΪ5 Агд Агд
1 5
Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а Ьеи Рго Тгр
20
А1а Зег А1а Тгр Рго СЯи 01и Ъуз
35 40
Авп Зег Зег А1а Ьеи Агд (31п Не
50 55
МеГ Тгр <31п Аэп Аар ьеи С1П Рго
65 70
Зег Рго О1у Зег туг А1а А1а Агд
85
Уа1 Уа1 10 31у Ткг Ьеи Н1Б Ьеи 15 Ьеи
А1а Зег Агд О1у Уа1 Зег Рго Зег
25 30
Аз η Туг Н18 б1п Рго А1а Не Ьеи
45
А1а О1и <31у Т11Г Зег 11е Зег О1и
60
Ьеи Ьеи 11е С1и Агд Туг Рго С1у
75 80
С1п Н13 11е КеЬ С1п Агд 11е С1п
90 95
- 70 016584
Агд Беи С1п А1а Азр 100 Тгр Уа1 Беи 61и 105 11е Азр Ткг Рке Беи 110 Зег <31п
Ткг Рго туг С1у Туг Агд Зег Рке Зег Аз П Не Не Зег ткг Беи Азп
115 120 125
Рго Ткг А1а Буз Агд Ηίβ Беи Уа1 Ьеи А1а Суз Н13 Туг Азр Зег Буз
130 135 140
Туг Рке Зег Н13 Тгр Аз η Азп Агд Уа1 Рке Уа1 С1у А1а ткг Аер Бег
145 150 155 160
А1а Уа1 Рго Суз А1а Мев Мек Беи С1и Беи А1а Агд А1а Беи Азр Буз
165 170 175
Вуз Беи Веи Зег Ьеи Буз Ткг Уа1 Зег Азр Зег Буз РГО Азр Веи Бег
160 185 190
Веи □ 1п Ъеи Не Рке Рке Азр <31у 01и С1и А1а Рке Беи Ηίε Тгр Зег
195 200 205
Рго 01п Азр Зег Ьеи туг 01у Зег Агд ΗΪΞ Веи А1а А1а Буз Мер А1а
210 215 220
Зег ткг РГО Н1з Рго Рго (31у А1а Агд <31у Ткг Зег (31п Беи ΉΪ3 <31у
225 230 235 240
Мер Азр Веи Ьеи Уа1 Беи Беи Азр Ьеи Не С1у А1а Рго Азп Рго Ткг
245 250 255
Рке Рго Аап Рке Рке Рго Азп Зег А1а Агд Тгр Рке С1и Агд Беи б1п
260 265 270
А1а Не С1и Ηί8 <31и Ьеи Н13 Й1и Ьеи С1 у Беи Беи Вуз Азр Ηί з Зег
275 230 285
Ьеи С1и С1у Агд Туг Рке С1П Азп Туг Зег Туг С1у С1у Уа1 Не С1п
290 295 300
- 71 016584
Азр 305 Азр Н13 Не Рго РЬе 310 Ьеи Агд Агд С1у Уа1 315 Рго Уа1 Ьеи Н1з Ьеи 320
Не Рго Зег Рго РЬе Рго <31и Уа1 Тгр Η1Ξ ТЬг мес Азр Азр Азп 51и
325 330 335
<31и Азп Ьеи Азр <31и 8ег ТЬг Не Азр Аз η Ьеи Азп Ьуз Не Ьеи С1п
340 345 350
Уа1 РЬе Уа1 ьеи <31и Туг Ьеи Н18 ьеи
355 360
<210> 11
<211> 302
<212> РКТ
<213> человек
<400> 11
меЪ 1 Агд Зег 61у С1у Агд 5 51 у Агд Рго Агд 10 Ьеи Агд Ьеи 61у С1и 15 Агд
<31у Ьеи МеЬ С1и Рго Ьеи Ьеи Рго Рго Ьуз Агд Агд Ьеи Ьеи Рго Агд
20 25 30
Уа1 Агд Ьеи Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьеи А1а Ьеи А1а Уа1 С1 у Зег А1а РЬе
35 40 45
Туг ТЬг Не Тгр Зег <31у Тгр Н18 Агд Агд ТЬг С1и □1и Ьеи Рго Ьеи
50 55 60
С1у Агд С1и Ьеи Агд νβΐ Рго Ьеи Не <31у Зег Ьеи Рго С1и А1а Агд
65 70 75 80
Ьеи Агд Агд Уа1 Уа1 С1у 51П Ьеи Азр Рго С1п Агд Ьеи Тгр Зег ТЬг
05 90 95
Туг Ьеи Агд Рго Ьеи Ьеи Уа1 Уа1 Агд ТЬг Рго <31у йег Рго С1у Азп
100 105 110
- 72 016584
Ьеи С1п Уа1 115 Агд Ьуз рье Ьеи 01У А1а 120 ТЦг Ьеи Агд 5ег 125 Ьеи ТЪг А1а
С1у Тгр ΗΪ3 Уа1 С1и Ьеи Азр Рго Рйе ТЪг А1а Зег ткг Рго Ьеи С1у
130 135 140
Рго νβΐ Азр РНе С1у Аз П νβΐ Уа1 А1а ТНг Ьеи Азр Рго Агд А1а А1а
145 150 155 160
Агд ΗΪΞ Ьеи ТИг Ьеи А1а Суз Н13 Туг Азр Зег Ьуз Ьеи РЪе Рго Рго
165 170 175
С1у зег тЬг РГО РЪе Уа1 С1у А1а тпг Азр Зег А1а Уа1 Рго суэ А1а
180 185 190
Ьеи Ьеи Ьеи □1и Ьеи А1а <31п А1а Ьеи Азр Ьеи а1и Ьеи Зег Агд А1а
195 200 205
Ьуз ьуз Θΐη А1а А1а Рго Уа1 Т11Г Ьеи <31п Ьеи Ьеи Рке Ьеи Азр С1у
210 215 220
С1и 51и А1а Ьеи Ьуз С1и Тгр С1у Рго ьуз Азр Зег Ьеи Туг (31 у Зег
225 230 235 240
Агд Н1з Ьеи А1а <31п Ьеи МеЬ О1и Зег 11е Рго Н1з Зег Рго <31у Рго
245 250 255
ТЬг Агд Не С1п А1а Не С1и Ьеи Р1»е МеС Ьеи Ьеи Азр Ьеи Ьеи О1у
260 265 270
А1а Рго Аз П Рго ТЬг рье Туг Зег Н1з РЬе Рго Агд ТЦг Уа1 Агд Тгр
275 280 285
РИе ΗΪ3 Агд ьеи. Агд зе? 11е О1и Ьуз Агд Ьеи Н1з Агд Ьеи Азп Ьеи
290 295 300
ьеи С1п Зег Н1з Рго С1п О1и Уа1 Меи Туг РЬе С1п РГО <31у <31и Рго
305 310 315 320
- 73 016584
Р11е С1у Зег Уа1 С1и Азр Азр 325 Н13 Не Рго 330 РЬе Беи Агд Агд (31у 335 Уа1
Рго Уа1 Беи ΗΪ3 Беи Не Зег ТЬг Рго РЬе Рго А1а Уа1 Тгр Н13 ТЬг
340 345 350
Рго А1а Азр ТЪг (31и Уа1 Азп Беи Н13 Рго РГО ТЬг Уа1 Н13 Азп Беи
353 360 365
Суз Агд Не Беи А1а Уа1 РЬе Беи А1а С1и Туг Ъеи С1у Ъеи
370 375 380 <210> 12 <211> 364 <212> ΡΕΤ <213> человек <400з 12
МеЬ 1 С1и Рго Беи Беи 5 Рго Рго Був Агд Агд 10 Беи Беи Рго Агд Уа1 15 Агд
Беи Беи Рго Беи Беи Беи А1а ъеи А1а Уа1 51у Зег А1а РЬе туг ТЬг
20 25 30
11е Тгр Зег 51 у Тгр Н13 Агд Агд ТЬг 51и С1и Беи Рго Беи 51 у Агд
35 40 45
С1и Беи Агд Уа1 Рго Беи Не О1у Зег Беи Рго 51и А1а Агд Беи Агд
50 Е5 60
Агд νβΐ Уа1 51у О1п Беи Азр РГО С1п Агд Беи тгр Зег тьг Туг Беи
65 70 75 ао
Агд ЕГО Беи Беи Уа1 Уа1 Агд ТЬг Рго 61у зег Рго 61у АЗП Беи 51п
85 90 95
Уа1 Агд Буз РЬе Беи 51и А1а ТЬг Беи Агд Зег Беи ТЬг А1а <31у Тгр
100 105 110
- 74 016584
ΗίΞ Уа1 С1и 115 Беи Авр Рго РНе ТНг 120 А1а Зег ТНг Рго Беи 125 О1у Рго Уа1
Авр РНе С1у Аз η Уа1 Уа1 А1а ТНг Беи Азр Рго Агд А1а А1а Агд Ηί з
130 135 140
Беи ТНг Беи А1а Суз ΗΪ3 Туг Азр Зег Буз Беи Рке Рго Рго 01у Зег
145 150 155 160
ТНг Рго РНе Уа1 С1у А1а ТНг Аер Зег А1а Уа1 Рго Суз А1а Беи Беи
165 170 175
Беи С1и Беи А1а (31п А1а Беи Айр Беи <31и Беи Зег Агд А1а Буе Вуз
160 185 190
61п А1а А1а Рго Уа1 ТНг Беи С1п Беи Беи РНе Беи Азр 01у <31и О1и
195 200 205
А1а Беи Буз с1и Тгр С1у Рго Бу 8 Азр Зег Беи Туг <Э1у Зег Агд ΗΪ5
210 215 220
Беи А1а С1п Беи Мер С1и Зег Не Рго ΗΪ3 Зег Рго С1у Рго ТНг Агд
225 230 235 240
Не С1П А1а Не С1и Беи РНе Мен Беи Беи Авр Беи Беи <31у А1а Рго
245 250 255
Азп Рго ТНг РНе Туг Зег ΗΪΞ РНе Рго Агд ТНг Уа1 Агд Тгр РНе Н13
260 265 270
Агд Беи Агд Зег Не 01и Буз Агд Беи ΗΪ3 Агд Беи Аяп Беи Беи 61(1
275 280 285
Зег Ηί3 Рго <31п С1и Уа1 МеЬ туг РНе 61п Рго «1у <31и Рго РНе С1у
290 295 300
Зег Уа1 <31и Авр Авр Η1Ξ Не Рго РНе Беи Агд Агд С1у Уа1 Рго Уа1
305 310 315 320
- 75 016584
Ьеи Н1з Ьеи Не Зег 325 ТЬг Рго РЬе Рго А1а 330 Уа1 Тгр ΗΪΞ ТЬг Рго 335 А1а
Азр ТЬг 51и ν&1 Азп Ьеи ΗΪ3 РГО РГО ТЬг Уа1 Н1з АЗП Ьеи Суз Агд
340 345 350
Не Ьеи А1а Уа! РЬе Ьеи А1а С1и Туг Ьеи 51у Ьеи
355 360 <210>13 е211>382 <212> РКТ <213> Масаса 1азс1си1аг1з <400>13
Мее 1 Агд Зет С1у <31у 5 Агд С1у Агд РГО Агд 10 ьеи Агд ьеи <31у <31и 15 Агд
С1у Уа1 Мес С1и Рго Ьеи Ьеи Рго Рго Ьув Агд Агд ьеи Ьеи Рго Агд
20 25 30
Уа1 Агд Ьеи Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьеи А1а Ьеи А1а Уа1 <Э1у Зег А1а РЬе
35 40 45
Туг ТЬг Не Тгр Зег С1у Тгр Н13 Агд Агд ТЬг <Пи С1и Ьеи Рго Ьеи
50 55 60
<31у Агд <31и Ьеи Агд ν&ι Рго Ьеи Не 31у Зег Ьеи РГО 51и А1а Агд
65 70 75 80
Ьеи Агд Агд 7а1 Уа1 С1у С1п Ьеи Аер Рго С1п Агд ьеи Тгр С1у ТЬг
85 90 95
Туг Ьеи Агд Рго Ьеи Ьеи ν&ι Уа1 Агд ТЬг Рго <31у Зег Рго <31у Азп
100 105 но
Ьеи О1п Уа1 Агд Ьуз РЬе Ьеи С1и А1а ТЬг Ьеи Агд Зег Ьеи ТЬг А1а
115 120 125
С1у Тгр Шз Уа1 О1и Ьеи Азр Рго РЬе ТЬг А1а Зег ТЬг Рго Ьеи 51у
- 76 016584
130 135 140
Рго 145 Уа1 Авр РЬе <31у Азп 150 Уа1 Уа1 А1а ТЬг Ьеи 155 Азр Рго <31у А1а А1а 160
Агд Н13 Ьеи ТЬг Ьеи А1а Су 8 Н13 Туг Азр Зег Ьуз Ьеи РЬе Рго Рго
165 170 175
С1у Зег ТЬг Рго РЬе Уа1 С1у А1а ТЬг Авр Зег А1а Уа1 Рго Суз А1а
180 185 190
Ьеи Ьеи Ьеи С1и Ьеи А1а С1п А1а Ьеи Азр Ьеи С1и Ьеи Зег Агд А1а
195 200 205
Ьув С1и С1п А1а А1а Рго Уа1 ТЬг Ьеи С1п Ьеи Ьеи РЬе Ьеи Авр С1у
210 215 220
<3111 С1и А1а Ьеи Ьув <31и Тгр С1у Рго Ьуз Аэр Зег Ьеи Туг (31у Зег
225 230 235 240
Агд Н13 ьеи А1а С1П Ьеи меи С1и Зег Не РГО Н13 Зег РГО 61у Рго
245 250 255
ТЬг Агд Не <31п А1а Не <31и Ьеи РЬе МеС Ьеи Ьеи Авр Ьеи Ьеи С1у
260 265 270
А1а Рго Ав η Рго ТЬг РЬе Туг Зег ΗΪΞ РЬе Рго Агд ТЬг Уа1 Агд Тгр
275 280 285
РЬе ΗΪ8 Агд Ьеи Агд Зег 11е <31и Ьуз Агд Ьеи ΗΪΞ Агд Ьеи Азп Ьеи
290 295 300
Беи С1п Зег ΗΪ5 Рго □1п С1и Уа1 Мес туг РЬе σΐη РГО С1у 61и РГО
305 310 315 320
РЬе <31у Зег Уа1 <31и Авр Авр Н13 Не Рго РЬе Ьеи Агд Агд <31у Уа1
325 330 335
Рго Уа1 Ьеи ΗΪ8 Ьеи Не Зег ТЬг Рго РЬе Рго А1а Уа1 Тгр ΗΪΒ ТЬг
- 77 016584
340 345 350
РГО А1а Авр Т11Г (31и А1а АвП Ьеи Ηίβ Рго Рго ТЪг Уа1 Ηίβ Авп Ьеи
355 360 365
Зег Агд Не Ьеи А1а Уа1 Рке ьеи А1а Й1и туг Ьеи С1у Ьеи
370 375 380
<210>14 <211>382 <212> РЕТ <213> Масаса ти1аеса <400>14
МеЬ 1 Агд Зег (31у 31у 5 Агд 01у Агд Рго Агд 10 ней Агд Ьеи <31у 01и 15 Агд
С1у Уа1 МеЬ Рго Ьеи Ьеи Рго Рго Ьув Агд Агд Ьеи Ьеи Рго Агд
20 25 30
Уа1 Агд Неи Ьеи рго Ьеи ьеи ьеи А1а Ьеи А1а Уа1 С1у Зег А1а РЬе
35 40 45
Туг ТИг 11е Тгр Зег <31у тгр Ηίβ Агд Агд ТЪг С1и <31и 1>еи Рго Ьеи
50 55 60
б1у Агд С1и Ьеи Агд Уа1 Рго Ьеи Не <31у Зег Ьеи Рго О1и А1а Агд
65 70 75 80
Неи Агд Агд Уа1 Уа1 <31 у С1П Ьеи Авр Рго С1п Агд Ьеи Тгр С1у ТАг
85 90 95
Туг Ьеи Агд Рго Ьеи Ьеи Уа1 Уа1 Агд ΤΪ1Γ РГО О1у Зег Рго <31у АЗП
100 105 110
Ьеи С1п Уа1 Агд ъув РНе Ьеи □ 1и А1а тНг Ьеи Агд Зег Ьеи ТЪг А1а
115 120 125
<31у Тгр Η15 Уа1 С1и Ееи Аар Рго РАе ТЪг А1а Зег ТЬг Рго Ьеи <31у
130 135 140
- 78 016584
Рго Уа1 Азр Рке 31у Азп Уа1 Уа1 А1а Ткг Ьеи Азр РГО С1у А1а А1а
145 150 155 160
Агд ΗΪ3 Беи ткг ьеи А1а суз Н13 Туг Азр Зег Вуз Ьеи Рке Рго Рго
165 170 175
61у Зег ткг Рго Рке Уа1 О1у А1а Ткг Азр Зег А1а Уа1 Рго Суз А1а
180 185 190
Беи Беи Ьеи 61и Ьеи А1а 61п А1а Ьеи Азр Ьеи 61и Ьеи Зег Агд А1а
195 200 205
Буз С1и О1п А1а А1а РГО Уа1 ткг Ьеи 61п Ьеи Ьеи Рке Ьеи Азр 61у
210 215 220
С1и с1и А1а ьеи Буз С1и ТГр <31у Рго Буз Азр Зег Ьеи Туг 61у Зег
225 230 235 240
Агд Ηί5 Беи А1а 61п Ьеи Мер 61и Зег Не Рго ΗΪ5 Зег Рго 61у Рго
245 250 255
Ткг Агд Не 61п А1а 11е 61 и Беи Рке Мес Ьеи Ьеи Азр Беи Ьеи С1у
280 265 270
А1а Рго Азп Рго Ткг Рке Туг Зег ΗΪ3 Рке Рго Агд Ткг Уа1 Агд Тгр
275 280 285
Рке Н1з Агд Беи Агд Зег Не С1и Буз Агд Беи Ηίθ Агд Беи Азп Беи
290 295 300
Беи 61п Зег Н1з Рго 61п 61и Уа1 МеС Туг Рке 61п РГО 61у 61и Рго
305 310 315 320
Рке С1у Зег Уа1 61и Азр Азр ΗΪ3 11е Рго Рке Ьеи Агд Агд С1у Уа1
325 330 335
Рго Уа1 Ьеи Ηΐε Ьеи 11е Зег Ткг Рго Рке Рго А1а Уа1 Тгр Н18 Ткг
340 345 350
- 79 016584
Рго
Ткг
355
Уа1
365
А8П ней
Беи
370
375
380 <210> 15 <211> 383 <212> РКТ <213> Сайге £ат11гаг1з <400> 15
МеЪ 1 Рю Бег С1у □ 1у 5 Агд С1у Агд Бег Агд 10 Беи Агд Беи 01у С1и 15 Агд
С1у Беи Беи С1и РЮ РЮ Бег Рго Рго Бу 5 Агд Агд Беи ьеи Рго Агд
20 25 30
А1а Н18 РЬе Беи Рю Беи Беи Беи Беи А1а Беи А1а Беи А1а Бег А1а
35 40 45
Ткг Туг ТБ г Не Тгр Зег <31у Тгр Н18 Н13 <31п ТНг 61и б!и Ьеи Рго
50 55 60
Агд В1у Агд 01и Беи Агд 31у Агд Беи Не С1у Бег Беи Бег О1и А1а
65 70 75 80
Агд Беи Агд Агд Уа1 Уа1 <31у С1П Беи Аэр Рго Н18 Агд Беи Тгр А8П
85 ЭО 95
ΤΪ1Γ туг Беи Агд РЮ Беи Беи Уа1 Уа1 Агд ТНг Рго С1у Бег Рго 01у
100 105 НО
Азп Беи С1п Уа1 Агд Буе РЬе Беи С1и А1а Т11Г Беи Агд ТЪг Ьеи ТЬг
115 120 125
А1а С1у Тгр Н1а Уа1 01и Беа Авр РГО рке Ткг А1а Беи ТЪг Рго Беи
130 135 140
- 80 016584
<31у Рго Беи Авр Рке С1у Аап Уа1 Уа1 А1а ТНг Беи Азр Рго С1у А1а
145 150 155 160
А1а АГд ΗΪΘ Беи ТЬг Беи А1а суе Н13 Туг Азр Зег Буа Беи РНе А1а
165 170 175
Зег 01и Зег Уа1 Рго РЪе Уа1 С1у А1а ТЬг Аар Зег А1а Уа1 Рго Суз
180 1Θ5 190
А1а Беи Беи Беи С1и Беи А1а з1п А1а Беи Азр Агд С1и Беи Зег Агд
195 200 205
А1а Буз <3111 О1П 61и А1а Рго Уа1 Т11г Беи 51П Беи Беи РНе Беи Аар
210 215 220
(31у (31и 0111 А1а Беи Буз С1и тгр С31у Рго ТНг Аар Зег Беи Туг С1у
225 230 235 240
Зег Агд Ηίβ Беи А1а <31п Беи МеЕ С1и Зег А1а Рго Н1з Зег Рго С1у
245 250 255
Рго Ткг Агд 11е С1п А1а Не (Э1и Беи рНе Мек Беи Беи Аар Беи Ь&и
260 265 270
С1у А1а Рго Аап. Рго Азп РЬе Туг Зег Ηϊβ РНе Рго Н1з ТА г А1а Агд
275 280 285
Тгр РНе Н18 Агд Беи Агд Зег 11е С1и ьуа Агд Беи ΗΪΞ Агд Мек Акп
290 295 300
Беи Беи С1п Зег Н13 Рго С1п 31 и Уа1 меЕ Туг РНе Я1п Рго С31у 01и
305 310 315 320
Рго Рго <31у Зег 7а1 С1и Азр Аар Н1е 11е Рго РНе Беи Агд Агд 61у
325 330 335
Уа1 Рго Уа1 Беи Ηίθ Беи 11е Зег меб Рго РНе Рго Зег Уа1 Тгр ΗΪ3
340 345 350
- 81 016584
ТЬг Его Азр Азр Зег С1и А1а Азп Беи Нгз Рго Рго ТЬг Уа1 Нгз Азп
355 360 365
Беи Зег Агд 11е Беи А1а '7а 1 РЬе Беи А1а 61и Туг Беи С1у Беи
370 375 380 <210> 16 <211> зез <212> РЕТ <213> КаЬСиз погуедгсиз <400> 16
Ме1= 1 Зег Рго А1а Зег 5 Агд <31у Агд Зег Агд 10 <31п Агд Беи 61у Азр 15 Агд
<31у Беи МеЬ Буз Рго Рго Зег Беи Зег Буз Агд Агд Беи Беи Рго Агд
20 25 30
Уа1 61п Беи Беи Рго Беи Беи Беи Беи А1а Беи А1а Беи 61у Беи А1а
35 40 45
РЬе Туг Не Уа1 Тгр Азп Зег Тгр ΗΪ3 Рго 61 у Уа1 <31и 61 и Уа1 Зег
50 55 60
Агд Зег Агд Азр Беи Агд Уа1 Рго Беи 11е 01у Зег Беи Зег 61и А1а
65 70 75 80
Буе Беи Агд Беи Уа1 Уа1 С1у С1п Беи Азр Рго О1п Агд Беи Тгр 61у
85 90 95
ТЬг РЬе Беи Агд Рго Беи Беи Не Уа1 Агд РГО Рго С1у зег РГО 61у
100 105 но
Азп Беи 61п ναΐ Агд Буз РЬе Беи 61и А1а ТЬг Беи 51п Зег Беи Зег
115 120 125
А1а С1у Тгр Н13 Уа1 С1и Беи Азр Рго РЬе ТЬг А1а Зег ТЬг Рго Беи
130 135 140
- 82 016584
31у 145 Рго Беи Азр РЬе О1у 150 Азп Уа1 Уа1 А1а ткг 155 Ьеи Азр Рго С1у А1а 160
А1а Агд ΗΪΒ Беи ТЬг Ьеи А1а Суз ΗΪ8 Туг Азр Зег Буе РЬе РЬе Рго
165 170 175
Рго С1у Беи Рго Рго РИе Уа1 61у А1а ТЬг Аер Зег А1а Уа1 Рго Суз
180 185 190
А1а Ьеи Ьеи Беи С1и Беи Уа1 С1п А1а Ьеи Аер Уа1 мер Ьеи Зег Агд
195 200 205
Г1е Буя <31п С1п А1а А1а Рго Уа1 Ткг Беи С1п Ьеи Ьеи Рке Ьеи Азр
210 215 220
С1у С1и С1и А1а Беи Буе С1и Тгр С1у Рго Ьуз Азр Зег Ьеи Туг С1у
225 230 235 240
Зег Агд ΗΪ3 Беи А1а С1п 11е Мер С1и Зег Не РГО ΗΪ6 Зег Рго С1у
245 250 255
Рго Ткг Агд Не <31П А1а 11е <31и Ьеи РКе Уа1 Ьеи Ьеи Азр Ьеи Ьеи
260 265 270
С1у А1а Рго Зег Рго Не Рке Рке Зег Н1з Рке Рго Агд Ткг А1а Агд
275 280 285
Тгр Рке С1п Агд Ьеи Агд Зег 11е <31и Буе Агд Ьеи Н13 Агд Ьеи Аеп
290 295 300
Ьеи Беи С1п Зег Н15 Рго 61 η <31и Уа1 Мер Туг Рке С1п Рго С1у С1и
305 310 315 320
Рго Рго О1у Рго Уа1 С1и Азр Аер Н1з Не Рго РЬе Ьеи Агд Агд (Э1у
325 330 335
Уа1 Рго Уа1 Ьеи ΗΪ3 Беи 11е А1а Мер Рго Рке Рго А1а Уа1 Тгр ΗΪ3
340 345 350
ΤΪ1Γ Рго А1а 355 Азр тНг Е1и А1а Азп 360 Ьеи Η18 РГО РГО ТЬг 365 Уа1 Н13 АЗП
Ьеи Зег Агд Не Ьеи А1а Уа1 РЬе Ьеи А1а 01 и Туг Ьеи С1у Ьеи
370 375 380
<210> 17
<211=> 383
<212> РЕТ
<213> Миг тиБси1из
<400> 17
Ме1 Зег Рго 61у Зег Агд 01у Агд Рго Агд <31п Агд Ьеи 01и Азр Агд
1 5 10 15
<31у ьеи Меи Ьуз Рго Рго Зег Ьеи зег ьуз Агд Агд Ьеи ьеи Рго Агд
20 25 30
Уа1 С1п РЬе Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи А1а Ьеи А1а Меи С1у Ьеи А1а
35 40 45
РЪе Туг 11е Уа1 Тгр Азп Зег Тгр Н13 Рго 01у Уа1 С1и С1и Меи Зег
50 55 60
Агд Зег Агд Азр Ьеи Агд Уа1 Рго Ьеи Т1е С1у Зег Ьеи Зег С1и А1а
65 70 75 80
Ьуз Ьеи Агд Ьеи Уа1 Θ5 Уа1 <31у 01П Ьеи Азр 90 Рго С1П Агд ьеи Тгр 95 С1у
ТЬг РЬе Ьеи Агд Рго Ьеи Ьеи 11е Уа1 Агд Рго Рго <51У Зег Зег 01у
100 105 но
АЗП Ьеи С1п Уа1 Агд Ьуз РИе Ьеи 01и А1а ТЬг Ьеи С1П Зег Ьеи Зег
115 120 125
А1а <31у Тгр Н13 Уа1 С1и Ьеи Азр РГО РЬе ТПг А1а Зег ТКг Рго ьеи
130 135 140
О1у Рго Ьеи Азр РИе С1у Аеп Уа1 Уа1 А1а ТЬг Ьеи Азр Рго С1у А1а
- 84 016584
145 150 155 160
А1а Агд Βίε Ьеи ТЬг 165 Ьеи А1а Суз Н1Б Туг 170 Азр Зег Ьуз РЬе РЬе 175 Рго
Рго С1у Ьеи Рго Рго РЬе Уа1 <Э1у А1а ТЬг Азр Зег А1а Уа1 Рго Суз
180 185 190
А1а Ьеи Ьеи Ьеи 01и Ьеи Уа1 С1п А1а Ьеи Азр А1а Мес Ьеи Зег Агд
195 200 205
11е ЬуЗ С1П С1п А1а А1а Рго Уа1 ТЬг Ьеи С1п Ьеи Ьеи РЬе Ьеи Авр
210 215 220
<31у С1и С1и А1а Ьеи Ьуз О1и Тгр С1у Рго Ьуз Азр Зег Ьеи Туг С1у
225 230 235 240
Зег Агд Н1з ьеи А1а <31п 11е МеС О1и Зег 11е Рго Н13 Зег Рго □1у
245 250 255
Рго ТЬг Агд 11е 51П А1а 11е <31и Ьеи РЬе Уа1 ьеи Ьеи Азр ьеи Ьеи
260 265 270
51 у А1а Зег Зег Рго 11е РЬе РЬе Зег Н1в РЬе Рго Агд ТЬг А1а Агд
275 280 285
Тгр РЬе С1П Агд Ьеи Агд Зег 11е С1и Ьуз Агд Ьеи Н1з Агд Ьеи Азп
290 295 300
Ьеи ьеи С1п Зег Н13 Рго <31п 61и Уа1 МеС Туг РЬе С1П Рго 51у С1и
305 310 315 320
Рио РГО 51у Рго Уа1 С1и Азр Азр н!з 11е Рго РЬе Ьеи Агд Агд С1у
325 330 335
νβΐ Рго Уа1 Ьеи Н13 Ьеи 11е А1а ТЬг Рго РЬе Рго А1а Уа1 Тгр ΗΪ3
340 345 350
ТЬг Рго А1а Азр ТЫ С1и А1а Азп Ьеи ΗΪΞ Рго Рго ТЬг Уа1 Ηίβ Азп
- 85 016584
355 360355
Беи Зег Агд Не Беи А1а Уа1 РЪе Беи А1а 31и Тут Беи С1у Беи
370 375330 <210> 18 <211>383 < 212 > РКТ <213> Вов Ьаигив <400=·18
МеЬ 1 Рго Зег С1у <31у Агд 5 Сг1у Агд Рго Агд 10 Беи <31п Уа1 С1у <31и 15 Агд
Зег Беи Беи 31и Агд РГО Зег Рго Рго Буз Агд Агд Беи Не Рго Агд
20 25 30
А1а С1п Беи Беи Рго С1п Беи Беи Беи А1а Беи ТЬг Уа1 А1а Зег Уа1
35 40 45
РЬе Туг ТЬг Не Тгр Агд 11е Тгр ΗΪ5 Зег С1п ТЬг С1и С1и Беи Рго
50 55 60
Беи С1у Агд С1и Беи Агд С1у Рго Беи Не <31у Зег Беи Рго С1и А1а
65 70 75 80
Агд Ча! Агд Агд Уа1 Уа1 <31у С1П Беи Авр Рго Н13 Агд Беи Тгр Азп
85 90 95
ТЬг РЬе Беи Агд Рго Беи Беи Уа1 Уа1 Агд ТЬг Рго С1у Зег Рго <31у
100 105 110
Азп Беи С1п Уа1 Агд Бу в РЬе Беи <31 и А1а ТЫ Беи Агд ТЬг Беи Зег
115 120 125
А1а С1у Тгр Н13 Не С1и Беи Азр Зег РЬе ТЬг А1а 5ег ТЬг Рго Уа1
130 135 140
31у Рго Беи Авр РЬе Зег АВП Уа1 Уа1 А1а ТЬг Беи АЗр РГО <31у А1а
14 5 150 155 160
- 86 016584
А1а Агд Ньэ Ьеи ТЬг Ьеи А1а сув Ηίε Туг Азр Зег Ьуз Ьеи РЬе Рго
165 170 175
Зег Азр Зег А1а Рго РЬе Уа1 <31у А1а ТЬг Азр Зег А1а Уа1 Рго Су в
180 185 190
Зег Ьеи Ьеи Ьеи С1и Ьеи А1а 51п А1а Ьеи Азр 51п 51и Ьеи С1у Ьуз
195 200 205
А1а Ьуз С1и Агд А1а А1а Рго МеЬ ТЬг Ьеи С1п Ьеи Не РЬе Ьеи Азр
210 215 220
01у С1и С1и А1а Ьеи Ьуз С1П Тгр С1у Рго ьуз Азр Зег Ьеи Туг 51у
225 230 235 240
Зег Агд Н13 Ьеи А1а <31п Ьеи МеС <31и Зег ТЬг Рго ΗΪ3 <31у Ьеи С1у
245 250 255
Зег ТНг Агд Не 51П А1а Не <31и Ьеи РЬе МеЬ ьеи Ьеи Азр Ьеи Ьеи
260 265 270
О1у А1а Рго Азп РГО ТЬг РЬе Туг Зег Н13 РЬе Рго Агд ТЬг А1а Агд
275 280 285
Тгр РЬе Н13 Агд Ьеи Агд Зег Не <31и Ьуз Агд Ьеи Н13 Агд Ьеи Азп
290 295 300
ьеи Ьеи 51П Бег НЬз Рго Тгр С1и Уа1 МеС Туг РЬе С1п ТЬг 51у С1и
305 310 315 320
Рго Рго <31у Зег νβΐ 01и Азр Азр ΗΪ3 Не Рго РЬе Ьеи Агд Агд 01у
325 330 335
Уа1 Рго 1/а1 Ьеи Н1з Ьеи Не А1а ТЬг Рго РЬе Рго Зег Уа1 Тгр Н18
340 345 350
ТЬг Зег Азр Азр Зег С1и А1а Азп Ьеи ΗΪ3 Рго Рго ТЬг Уа1 ΗΪ5 Азп
355 360 365
- 87 016584 ьеи Бег Агд Не ьеи А1а Уа1 Рке Ьеи А1а С1и Туг ьеи О1у ьеи
370 375380 <210>19 <211>1457 <212> ДНК <213> человек <400>19
дЬсВддкаса ддьввсаддд сааадсддсс ардсдССссд ддддссдсдд дсдассссдс 60
сРдсддсЬдд дддаасдрдд ссвсаьддад ссасрсЬЬдс сдссдаадсд ссдссВдсВа 120
ссдсдддЬЕ-с ддсВсЬСдсс ВсСдССдсСд дсдсВддссд СдддсСсддс дЬЬсВасасс 180
аЬЬСддадсд дсрддсассд саддасСдад дадсЬдссдс кдддссддда дсЕдсдддьс 240
ссаЪЬдаЬсд даадссВссс сдаадсосдд сЬдсддаддд Вддрдддаса асВддаксса 300
садсдьсЪск ддадсасЬЬа ВсЬдсдсссс сЬдсЬддВВд Ьдсдаасссс дддсадсссд 360
ддаааЪсЬсс аадЬсадааа дЫссВддад дссасдсЬдс ддЬсссЬдас адсаддЫдд 420
сасдЪддадс ЬддаЪсссЬЬ сасадссЬса асасссскдд ддссадрдда стддсааР 480
дрддрддсса сасРддассс аадддсЪдсс сдВсассВса сссЬЬдссЬд ссаВРаЬдас 540
ЪсдаадсбсВ Ьсссасссдд аЬсдассссс ВГВдрадддд ссасддаЪВс ддсВдрдссс 600
ьдьдсссЕдс ЬдсЬддадск ддсссаадса сВЬдассЬдд адсЬдадсад ддссаааааа 660
саддсадссс сддСдасссС дсаасВдсСс СВсСВддаСд дкдаададдс дсСдааддад 720
рддддассса аддасЬсссЪ РЛасддЫсс сддсассрдд сссадсЕсаВ ддадЬсРаВа 780
ссЬсасадсс ссддссссас саддаРссад дсРаЬЬдадс ВсриЬаЬдсЬ ЬСРВдаЬсВс 840
срдддадссс ссааВсссас сЫсЬасадс сасВЬсссЬс дсасддВссд сРддВЬссаЬ 900
сддсСдадда дсаВСдадаа дсдссВдсас сдРСЕдаасс ЬдсЬдсадЬс Ьсассоссад 960
даадрдардр асЬРссаасс сддддадссс СССддсЬсВд сддаадасда ссасаВсссс 1020
РВссРссдса даддддЬасс сдРдсРссаВ сСсаВсЪсса сдсссЬЬссс ВдсВдВсРдд 1080
сасассссЬд сддасассда ддВсааРсВс сасссассса сддвасасаа сЬЪдВдссдс 1140
аРЕсВсдссд кдьссссддс ВдааСасскд дддсЬСЕадс дрдсВВддсс аавдаскдед 1200
- 88 016584
дададдасЕд Сдадададаа ддСсссадсд ддддссадсд аадсСсаддс аддаЬсЕдсс 1260
СадддСдедс сддсьъдссс СССЬсаЬасс ЬССдСсЬссЕ ааЬЕдЬдсСа сааСЬддаад 1320
ассССсСССс сгседаъсдс стсаадсьдс сасссССсаа ддасадддаа дадассасСд 1380
ьдддаС9аса дссададдаа Саадаасссд сссссссссс ададдСааас асСЬддСсса 1440
ааддьсгдса дддасса 1457
<210> 20 <211> 1088 <212> ДНК <213> человек <400> 20
адсддссаЬд сдСЬссдддд дссдсдддсд ассссдссЬд сддсЬддддд аасдСддссЪ 60
саСддадсса ссиссдссдс сдаадсдссд ссСдсСассд сдддессддс СсЬСдссссс 120
дССдсСддсд ссддссдСдд дсЬсддсдСС сЬасассаЬЬ СддадсддсС ддсассдсад 180
дасСдаддад сСдссдсЬдд дссдддадсЬ дсдддЬссса ЕЕда&сддаа дссЬссссда 240
адсссддсЬд сддадддЬдд СдддасаасЬ ддаЬссасад сдЬсСсСдда дсасЬЬаСсТ 300
дсдсссссСд сЬддСЬдсдс даассссддд садсссддда ааесСссаад Ьсадаааддс 360
адссссддСд асссСдсаас ЬдсЬсЬСсСЬ ддаЬддЬдаа даддсдсЬда аддадЬдддд 420
асссааддас СсссЕЬЬасд дЬСсссддса ссСддсссад сЕсаЕддадЕ сЕаЬассСса 460
садссссддс сссассадда ЬссаддсЬаС (здадсЬсссс аСдсССсССд аСссссСддд 540
адсссссаас сссассССсе асадссасЕС сссСсдсасд дСссдсСддС СссаСсддсС 600
даддадсаЬС дадаадсдСс ЬдсассдЫС даассЬдсСд садЬсСсаЬс сссаддаадЕ 660
дасдсасЬЬс саасссдддд адсссСССдд сСсЪдСддаа дасдассаса ЬссссССССС 720
ссдсададдд дСасссдЬдс ЬссаЬсСсаЕ сЬссасдссс ССсссЬдсСд ЬсЬддсасас 780
сссЬдсддас ассдаддЪса аЕсЕссассс асссасддСа сасаасЕЬдЬ дссдсаЬЕсЕ 840
сдсСдЕдпес сЕддсЕдааС ассСддддсС сЕадсдЕдсЕ ЬддссааЕда сСдСддадад 900
дасбдСдада дадааддЕсс садсдддддс садСдаадсС саддсаддаЬ ссдссЬаддд 960
СдЕдсСддЬе СдЬссССЬСс аСассЬССдС сЬссЬааСЕд ЬдсСасааЬЬ ддаадассГХ 1020
сСССсССССд аСЪдЬсЬсаа дсСдссассс ЧЧсааддаса дддаададас сасСдСддда 1080
- 89 016584
Сдасадсс
10ВВ <210> 21 ¢211^ 481 <212> РКТ <213> человек <400> 21
νβΐ 1 Тгр Туг Агд РЬе 5 С1П С1у Ьуз А1а А1а 10 Мес Агд зег οΐγ С1у 15 Агд
С1у Агд Рго Агд Ьеи Агд Ьеи 01у С1и Агд <31у Ьеи МеС С1и Рго Ьеи
20 25 30
Беи Рго Рго ьув Агд Агд Беи Ьеи Рго Агд Уа1 Агд Ьеи Ьеи Рго Ьеи
35 40 45
Беи Ьеи А1а Ьеи А1а Уа1 <31у Зег А1а РЬе Туг Т11Г 11е Тгр Зег С1у
50 55 60
Тгр Ηίε Агд Агд ТЬг 01и О1и ьеи Рго Беи С1у Агд 61и Ьеи Агд Уа1
65 70 75 80
Рго Ьеи 11е <31у Зег Ьеи Рго □1и А1а Агд Ьеи Агд Агд Уа1 νβΐ С1у
85 90 95
С1п Беи Авр Рго 31п Агд Ьеи Тгр Зег ТЬг Туг Ьеи Агд Рго Ьеи Ьеи
100 105 но
Уа1 νβΐ Агд ТЬг Рго С1у Зег Рго С1у АЗП Ьеи С1п Уа1 Агд Буе ₽Ие
115 120 125
Беи <31и А1а ТЙГ Беи Агд Зег Беи ТКг А1а С1у Тгр Шз νβΐ <31и Ьеи
130 135 140
Азр Рго Рке ΤΪ1Ε А1а Зег ткг Рго Ьеи <Э1у Рго Уа1 Азр Рке 01у Αεη
145 150 155 160
Уа1 Уа1 А1а ТЬг Ьеи Азр Рго Агд А1а А1а Агд Н15 Ьеи ТНг Ьеи А1а
- 90 016584
165 170 175
Суз Ηί 3 Туг АЗр Зег ьуз Ьеи РЬе Рго РГО 61у Зег ТЫ Рго РЬе Уа1
180 185 190
61у А1а ТЫ Азр Зег А1а Уа1 Рго Суз А1а Ьеи Ьеи Ьеи 61и Ьеи А1а
195 200 205
61п А1а Ьеи Азр Ьеи 61и Ьеи Зег Агд А1а Ьуз Ьуз 61п А1а А1а Рго
210 215 220
Уа1 ТЬг Ьеи 61п Ьеи Ьеи РЬе Ьеи Азр О1у 61и 61и А1а Ьеи Ьуз С1и
225 230 235 240
Тгр 61у Рго Ьуз Азр Зег Ьеи Туг 61у Зег Агд ΗΪ3 Ьеи А1а С1п Ьеи
245 250 255
меь 6111 Зег не Рго Η13 Зег РГО 61у Рго ТЬг Агд Не 61п А1а 11е
260 265 270
61 и Беи РЬе нес Ьеи ьеи Азр Ьеи ьеи 61у А1а Рго Азп Рго ТЬг РЬе
275 280 285
Туг Зег Н13 РЬе Рго Агд ТЬг Уа1 Агд тгр РЬе Н13 Агд Ьеи Агд Зег
290 295 300
Не 61и Ьуз Агд Ьеи Н13 Агд Ьеи Азп ьеи Ьеи 61п Зег ΗΪ8 Рго 61п
305 310 315 320
С1и Уа1 меь Туг РЬе С1п Рго С1у С1и РГО РЬе 61у Зег Уа1 61и Азр
325 330 335
Авр 11е Рго РЬе Ьеи Агд Агд 61у уа! Рго Уа1 Ьеи Н1з Ьеи Не
340 34 5 350
Зег ТЬг Рго ₽Ье РГО А1а Уа1 Тгр ΗΪ8 ТЬг Рго А1а Авр ТЬг <31и Уа1
355 360 365
Азп Ьеи ΗΪ3 Рго Рго ТЬг Уа1 н±з Азп Ьеи Суз Агд 11е Ьеи А1а Уа1
- 91 016584
370 375 380
РНе Беи А1а (31 и Туг Беи С1у Беи Агд А1а Тгр Рго Мер ТНг Уа1 <31и
385 390 395 400
Агд ТНг Уа1 Агд (31и Буе Уа1 Рго А1а <31у А1а Зег (31и А1а (31п А1а
405 410 415
С1у Зег А1а 01у Уа1 Беи Уа1 Су а Рго РНе Н13 ТНг РНе Уа1 Зег Беи
420 425 430
Суз Туг Азп Тгр Буз ТНг РНе РНе Беи Беи 11е Уа1 Зег зег Суз ΗΪΞ
435 440 445
Рго Бег Агд ТНг <31у Буз Агд РГО Беи Тгр Азр Азр Зег С1п Агд Аз η
450 455 460
Бу 8 Азп Беи Беи РГО Рго 01п Агд ТНг Беи <31у Рго Буз Уа1 Суэ Агд
465 470 475 480
Аар <210> 22 е211> 359 <212> РЕТ <213> человек <400> 22
А1а А1а 1 МеЬ Агд Зег 5 С1у С1у Агд С1у Агд 10 Рго Агд Беи Агд Беи 15 <31у
(31и Агд О1у Беи МеЬ (31и Рго Беи Беи РГО Рго Буз Агд Агд Беи Беи
20 25 30
РГО Агд Уа1 Агд Беи Беи Рго Беи Беи Беи А1а Беи А1а Уа1 С1у Зег
35 40 45
А1а РНе Туг ТНг 11е Тгр Зег С1у Тгр Н1з Агд Агд ТНг <31и <31и Беи
50 55 60
- 92 016584
Рго 65 Ьеи 01у Агд <31и Ьеи 70 Агд Уа1 Рго Ьеи 11е 75 С1у Зег Ьеи Рго С1и 80
А1а Агд Ьеи Агд Агд Уа1 Уа1 01у <31п Ьеи Азр Рго 31п Агд Ьеи Тгр
85 90 95
Зег ТЫ Туг Ьеи Агд Рго Ьеи Ьеи Уа1 Уа1 Агд ТЬг Рго <31у Зег Рго
100 105 НО
<31у Азп Ьеи С1п Уа1 Агд Ьуз А1а А1а Рго Уа1 ТЬг Ьеи С1ь Ьеи Ьеи
115 120 125
РЬе Ьеи Азр С1у <31и О1и А1а Ьеи Ьуз С1и Тгр <31у Рго Ьуз Азр Зег
130 135 140
Ьеи Туг О1у Зег Агд Ηίδ Ьеи А1а С1п Ьеи мес О1и Зег Не Рго Н13
145 150 155 160
Зег РГО <Э1у Рго ТЬг Агд Не <31п А1а 11е □ 1и Ьеи РЬе МеС Ьеи Ьеи
165 170 175
Азр Ьеи Ьеи О1у А1а Рго Азп Рго ТЬг РЬе Туг Зег Ηίβ РЬе Рго Агд
1Θ0 185 190
ТЬг Уа1 Агд Тгр РЬе Ηίε Агд Ьеи Агд Зег Не <31и Ьуз Агд Ьеи Н13
195 200 205
Агд Ьеи АЗП ьеи Ьеи С1п Зег Ηίε Рго <31п <31и Уа1 мес Туг РЬе С1п
210 215 220
Рго С1у С1и Рго РЬе С1у Зег Уа1 31и Азр Азр ΗΪ3 Не Рго РЬе Ьеи
225 230 235 240
Агд Агд <31у Уа1 Рго Уа1 Ьеи Н1з Ьеи 11е Зег ТЬг Рго РЬе Рго А1а
245 250 255
Уа1 Тгр Н13 ТЬг Рго А1а Азр ТЬг О1и Уа1 Азп Ьеи Н13 Рго Рго ТЬг
260 265 270
- 93 016584
Уа1 Н13 Азп 275 Беи Суз Агд Не Беи 230 А1а Уа1 РЪе Беи А1а 285 С1и Туг Беи
<31у Беи Агд А1а тгр Рго МеБ тЪ.г Уа1 С1и Агд ткг Уа1 Агд <31и Буз
290 295 300
Уа1 Рго А1а 01у А1а Зег (31и А1а С1п А1а <Э1у Зег А1а О1у Уа1 Беи
305 310 315 320
Уа1 Суз РГО РПе Ηΐθ ТЬг ръе Уа1 Зег Беи суз Туг Авп. Тгр Буз ТЬг
325 330 335
РЬе ₽Ь.е Беи Беи Не Уа1 Зег Зег Су 5 ΗΪ8 РГО Зег Агд ΤΪ1Γ С1у Був
340 345 350
Агд рго Беи Тгр Авр Авр Зег
355
<210> 23
<211> 42
<212> РКТ
<213> Ното заргепз
<400> 23
АЗр А1а С1и Рке Агд ΗΪ3 Авр Зег С1у туг □1 и Уа1 Ηίβ Н13 С1п Бу 3
1 5 10 15
Беи 7а1 Рке ₽Ье А1а О1и Авр Уа1 С1у Зег Азп Буз О1у А1а Не Не
20 25 30
С1у Беи МеС Уа1 С1у (31у Уа1 Уа1 Не А1а
35 40
<210> 24
<211:. 40
<212э РЕТ
<213> Ното зархепэ
<400:. 24
- 94 016584
Авр А1а 1 61 и РЬе Агд 5 Ηίβ Авр Зег 61у Туг 10 С1и Уа1 Η1Ξ Ηίβ 61 η 15 ьув
Ьеи Уа1 РЬе РЬе А1а 61и Авр Уа1 61у Зег Азп Ьуз 61у А1а 11е Не
20 25 30
61у Веи МеС Уа1 61у 61у Уа1 Уа1
35 40
<210> 25
<211> 40
<212> РКТ
<213> Ното аархепа
<400> 25
61и РЬе Агд Ηίβ Авр Зег 61у Туг 61и Уа1 Ηίβ Ηίβ 61п Ьуз Ьеи Уа1
1 5 10 15
РЬе РЬе А1а 61 и Авр Уа1 61у Зег Ав η Ьув 61у А1а 11е 11е 61у Ъеи
20 25 30
Мес 7а1 С1у 61у Уа1 Уа1 11е А1а
35 40
<210> 26
<211> зе
<212> РЕТ
<213> Ното зар!епз
<400> 26
<31 и РЬе Агд Ηίβ Авр Зег 61у Туг 61и Уа1 Ηίβ Ηίβ 61п ъуз ьеи 7а1
1 5 10 15
РЬе РЬе А1а 61и Авр Уа1 61у Зег АвП Ьув 61у А1а 11е Не 61у Ьеи
20 25 30
Мес Уа1 С1у 61у Уа1 Уа1
<210> 27 <211> 32
- 95 016584 <212> ΡΗΤ <213> искусственная последовательность <220>
<223> синтетический пептид <400> 27
С1и Уа1 Ηίθ Ηίδ <31п Ьуз Ьей Уа1 Рке РЬе А1а <31и Азр Уа1 О1у Зег
1 5 10 15
Азп Ьуз С1у А1а 11е 11е С1у Ьей МеЬ Уа1 С1у С1у Уа1 Уа1 Не А1а
20 25 30
<210> 28
<211^ 30
<212> РКТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический пептид
<400> 28
□1и Уа1 Н15 Н18 С1п ьуз ьей \га! РЬе РИе А1а С1и Азр Уа1 С1у Зег
1 5 10 15
Азп Ьуз 61у
А1а
Не 11е С1у
Ъеи
МеЬ
Уа1
Уа1
<210> 29
<211> 40
<212> РКТ
<213> человек
<220>
<221> МОО_КЕ8
<222> {1}-, ίΐ)
<223> пирролидонкарбоновая кислота
<400> 29
С1и РЬе Агд ΗΪ3 Азр Зег С1у Туг С1и Уа1 Ηιξ Н1е С1п Ьуя Ъеи \Га1
10 15
РИе РНе А1а <31и Азр Уа1 б1у Зег Азп. Ьуе С1у А1а Не 11е С1у Ьей
25 30
- 96 016584
Мер Уа1 <31у <31у Уа1 Уа1 11е А1а
3540 <210>30 <211>38 <212> РНТ <213> человек <220>
<221> Μ0ϋ_ΚΕ3 <222> (1).,(1) <223> пирролидонкарбоновая кислота <4005 30
61и Рке 1 Агд Н13 Азр 5 Зег <31у Туг О1и Уа1 10 Н1е Н13 С1п Ьуз ьеи Уа1 15
Рке Рке А1а <31и Аер νβΐ <31у Зег Азп Ьуз С1у А1а Не Не 61у Ьеи
20 25 30
Мер Уа1 <31у 61у Уа1 Уа1
35
<210> 31
<211> 32
<212> РКТ
<213> человек
<220>
<221> М0П_КЕ5
<222> (1) - - (1)
<223> пирролидонкарбоновая кислота
<400> 31
С1и УаЗ . Н1Э Н1з С1п ьуз Ьеи Уа1 Рке Рке А1а 61и Азр νβΐ <31у Зег
1 5 10 15
Аеп Буе 61у А1а Σ1 е 11е С1у Ьеи меб Уа1 С1у <31у Уа1 Уа1 11е А1а
20 25 30
- 97 016584 <210> 32 <211> 30 <212> РИТ <213> человек <220>
<221> М0Ь_КЕЕ <222> (1)..(1) <223> пирролидонкарвоновая кислота <400>32 <3111 Уа1 Ηίβ Н1з 51п Ьуз Ьеи Та1
Азп Ьуз Б1у А1а 11е 11е 51у Ьеи
20
<210> 33
<211> 34
<212> РЕТ
= 213> Ното зарХепз
<400> 33
С1и А1а Йег Ави Суз РЬе А1а 11е
1 5
Уа1 С1и ТЬг Ьеи 11е Суз Зег Агд
РЬе РЬе А1а 10 С1и Азр Уа1 С1у Зег 15
Уа1 Б1у <31у Уа1 Уа1
25 30
Агд Н1з РЬе С1и Азп Ьуз РЬе А1а
10 15
ТЬг Уа1 Ьуз Ьуз Азп 11е 11е <31и
25 30
С1и Агд <210>34 <211>34 с212> РЕТ
<213> Ното зар1еп8
<400> 34
С1и А1а Зег Азп Суз РЬе А1а Не Агд Н1з РЬе 31и Азп Ьуз РЬе А1а
1 5 10 15
Уа1 С1и ТЬг Ьеи Не Суз Зег Агд ТЬг Уа1 ьуз Ьуз Азп Не Не <31и
- 98 016584
С1и Агд
<210> 35
<211> 17
<212> РКТ
<213> Ното заргепз
<220>
<221> ΜΟϋ_ КЕЗ
<222> (17) * . (17)
<223> амидирование
<400>
С1п С1у Рго Тгр
Ьеи <31и <31и
О1и
О1и
0111
А1а
Туг
С1у
Тгр
Меи
Авр
РЬе <210>
<211>
<212>
РЕТ <213>
человек <400>
О1п
Ьеи О1у
Рго
01п
О1у
Рго
Рго
Н1з
Ьеи
Уа1
А1а
Азр
Рго £ег
Ьуз
Ьуз <31п 01у
Рго
Тгр
Ьеи
01и
01и
01и
С1и
С1и
А1а
Туг
С1у
Тгр
МеЬ
Авр
РЬе
<210> 37
<211> 34
<212> РЕТ
<213> Ното зар1епз
- 99 016584 <220 = <221 = МОЦ_КЕЗ <222= (1} . . (1) <223 = пирролидонкарбоновая кислота <400=37
(31и 1 А1а Зег Азп Суз 5 РУ1е А1а Не Агд Η1Ξ 10 РНе (31и Азп Буз РНе 15 А1а
Уа1 С1и ТНг Беи 11е Суе Зег Агд ТНг Уа1 Буз Буз Азп 11е 11е <31 и
20 25 30
С1и Агд
<210 = 38
<211 = 34
<212 = РКТ
<213 = Ното зар1епз
<220 =
<221 = МОБ_ КЕЗ
<222 = (1) · . (1)
<223> пирролидонкарбоновая кислота
<400 =38 <31и А1а Зег Азп Суз РНе А1а Не Агд Н1з РНе 61и Азп Буз РНе А1а
1015
Уа1 <51и ТНг
Беи
11е Суз Зег
Агд ТНг
Уа1
Буз
Буз
Азп
11е
Т1е
О1и
С1и Агд
<210 = 39
<211 = 17
<212 = РЕТ
<213 = человек
<220 =
<221 = МОЗ_КЕЗ
- 100 016584 <222 = (1)..(1) <223> пирролидонкарбоновая кислота <400 =39
С1п <31у Рго Тгр Бен С1и С1и С1и С1и С1и А1а Туг С1у Тгр МеС Азр
1015
РНе <210 =40 <211 =34 <212> РКТ <213> человек <220 = <221= МОБ-НЕЗ <222> (1)..(1) <2 23> пирролидонкарбоновая кислота <400= 40
О1п 1 Беи О1у Рго С1П 5 61у Рго Рго
ьуз С1П С1у Рго 20 Тгр Беи С1и αία
ΗΪ3 Беи 10 Уа1 А1а Аер Рго 5ег 15 Буз
С1и О1и О1и А1а Туг О1у Тгр мес
25 30
Азр РЬе
<210> 41
<211> 13
<212? РРТ
<Ξ13> Ното заргепБ
<400> 41
<31п Беи Туг С1и Лап Ьуа Рго Агд
1 5
<210? 42
<211> 10
Агд Рго Туг 11е Беи
- 101 016584 <212> РЕТ <213? Ното зархепз <220?
<221> МООКЕЗ <222> (10)..(101 <223> амидирование <400> 42
31п 1 Н1з Тгр Зег Туг 5 <31у Беи Агд
<210 43
<211> ! 37
<212> ! РЕТ
<213 > Ното зархепз
<400> - 43
С1п Рго Буз Уа1 Рго О1и Тгр Уа1
1 5
Буе Туг Туг С1и Буз Уа1 Беи Рго
20
Буе А1а Беи Азп Суз Η1Ξ Беи Рго
35 40
Азп Агд С1и Уа1 Суз ТНг Азп Рго
50 55
11е Буз Азр Рго Азп Беи Рго Беи
65 70
Уа1 Буз 11е 11е ТНг А1а Буз Азп
85
С1п
Рго О1у
Азп ТНг 10 Рго Зег ТНг Суз Суз 15 Беи
Агд 25 Агд Беи Уа1 Уа1 <31у 30 Туг Агд
А1а 11е 11е РНе Уа1 45 ТНг Буз Агд
Азп Азр Азр Тгр 60 Уа1 <31п О1и Туг
Беи Рго ТНг 75 Агд Азп Беи Зег ТНг 80
С1у С1п 90 Рго С1п Беи Беи Азп 95 Зег
<210> 44 <211> 76
- 102 016584 <212> РЕТ <213> Ното заргепз <400> 44
С1п Рго Азр 1 Зег Уа1 5 Зег Не Рго Не ТЬг 10 Суз Суз РЬе Азп Уа1 15 Не
Ляп Агд Ьуз 11е Рго Не С1п Агд Ьеи С1и Зег Туг ТЬг Агд 11е ТЬг
20 25 30
Азп Не <31п Суз его Ьуз С1и А1а Уа1 Не РЬе Ьуз ТЬг Ьуз Агд С1у
35 40 45
Ьуз 01и Уа1 Суз А1а Азр Рго Ьуз С1и Агд Тгр 17а 1 Агд Азр Зег МеЬ
50 55 60
Ьуз Ηί3 Ьеи Азр С1П Не РЬе С1п АЗП Ьеи Ьуз Рго
65 70 75
<210> 45
<211> 76
<212> РКТ
<213э 1 Ното аартепз
=4 0 0 > ' 45
СЬп. Рго Азр А1а 11е Азп А1а Рго Уа1 ТЬг Суз Суз Туг Азп РЬе ТЬг
1 5 10 15
Азп Агд Ьуз Не Зег Уа1 51П Агд Ьеи А1а Зег Туг Агд Агд Не ТЬг
20 25 30
Зег Зег ьуз Суз Рго Ьуз С1и А1а Уа1 Не РЬе ьуз ТЬг Не Уа1 А1а
35 40 45
Ьуз О1и Не Суз А1 а Азр Рго Ьуз 51п Ьуз Тгр 17а1 αΐη Азр Бег МеЬ
50 55 60
Азр ΗΪ3 Ьеи Азр Ьуз 51п ТЬг 51п ТЬг Рго Ьуз ТЬг
65 70 75
- 103 016584 <210>46 <2115·68 <212> РКТ <213> Ното зарБепе <4005. 46
С1П 1 Уа1 (31у ТкГ Азп 5 Ьуз 61и Ьеи Суз Суз 10 Ьеи Уа1 Туг Ткг Зег 15 Тгр
е1п Не Рго С1п Ьуз Рке 11е Уа1 Азр Туг Бег С1и Ткг Зег Рго 01П
20 25 30
Сув РГО Ьув Рго С1у Уа1 11е Беи Ьеи Ткг ьуз Агд С1у Агд С1П Не
35 40 45
Суз А1а Азр рго Азп Ьуз Бу в Тгр Уа1 С1п Ьуз Туг Не Зег Азр Беи
50 55 60
ьуз Беи Αεη А1а
<210э47 <211>373 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 47
С1п 1 ΗΪΒ Ηίε С1у Уа1 5 Ткг Буэ Суз Аеп Не 10 Ткг Сув Бег Ьуз Мее 15 Ткг
Зег Ьуз Не РГО Уа1 А1а Ьеи Ьеи Не Н13 Туг 61п С1п Авп □ 1п А1а
20 25 30
Зег Суз (31у Ьуз Агд А1а Не Не Ьеи Е1и Ткг Агд С1п Ηίε Агд Ьеи
35 40 45
Рке Суз А1а Азр Рго Ьуз 61и О1П Тгр Уа1 Ьуз Авр А1а МеС С1п Н1з
50 55 60
Беи Азр Агд <31п А1а А1а А1а ьеи Ткг Агд Азп С1у <31у Ткг Рке а1и
65 70 75 80
- 104 016584
Ьуз 01п Не С1у а1и иа1 Ьуз Рго Агд ТЬг ТЬг Рго А1а А1а □1у (31у
35 90 95
МеС Азр С1и Зег Уа1 Уа1 Ьеи Й1и Рго <31 и А1а ТЬг С1у С1и Зег Зег
100 105 110
Зег Ьеи 01и Рго ТЬг Рго Зег Зег 61п О1и А1а 61п Агд А1а Ьеи 61у
115 120 125
ТЬг Зег Рго 61и. Ьеи Рго Ткг 61у Уа1 ТЬг О1у Зег Зег <31у Ткг Агд
130 135 140
Ьеи Рго Рго ТЬг Рго Ьуз А1а С1п Азр С1у С1у Рго Уа1 <31у Ткг О1и
145 150 155 160
Ьеи РЬе Агд Уа1 Рго Рго Уа1 зег ТЬг А1а А1а ткг Тгр 31п Зег Зег
165 170 175
А1а Рго ΗΪ3 (Нп Рго С1у Рго Зет Ьеи Тгр А1а 01и А1а Ьуе Ткг Зег
100 185 190
С1и А1а Рго Зег ТЬг С11п Азр Рго Зег ТЬг С1п А1а Зег ТЬг А1а Зег
195 200 205
Зег Рго А1а Рго С1и <31и Азп А1а Рго Зег С1и 61у <31п Агд Уа1 Тгр
210 215 220
С1у С1П С1у <31п Зег Рго Агд Рго (Ни Азп Зег ьеи О1и Агд <31и С1и
225 230 235 240
нес С1у РГО Уа1 Рго А1а Η1Ξ тьг Азр А1а РЬе О1п Азр Тгр 61у Рго
245 250 255
51у зег МеГ А1а ΗΪ3 Уа1 Зег Уа1 Уа1 Рго Уа1 Зег Зег (31и 61у ТЬг
260 265 270
Рго Зег Агд 01и Рго Уа1 А1а Зег С1у зег Тгр Ткг Рго Ьуз А1а С1и
275 280 285
- 105 016584
С1и Рго 290 Не Н1Б А1а ТЬг МеЪ 295 Азр Рго <31п Агд Ьеи 300 С1у Уа1 Ьеи Не
ТЬг Рго Уа1 Рго Азр А1а <31п А1а А1а Ткг Агд Агд С1п А1а Уа1 О1у
305 310 315 320
Ьеи Ьеи А1а Рке Ьеи <Э1у Ьеи Ьеи Рке Суз Ьеи <31у Уа1 А1а МеЪ Рке
325 330 335
Ткг Туг С1п Зег Ьеи 31п <31у Суз Рго Агд Ьуз Меи А1а С1у <31и Мек
340 345 350
А1а 01и Е1у Ьеи Агд Туг Не Рго Агд 8ег Суз С1у Зег Азп Зег Туг
355 360 365
Уа1 Ьеи Уа1 Рго Уа1
370
<210>48 <211>76 <212> РКТ <213> Ното зар!епз <400>48
С1п 1 Рго Уа1 СЯу Не 5 Азп Ткг Зег Ткг Ткг 10 Суз Суз Туг Агд Рке 15 11е
Азп Ьув Ьуз Не Рго ьуз 31п Агд Ьеи <31и Зег Туг Агд Агд Ткг Ткг
20 25 30
Зег Зег Н18 Суз Рго Агд 01и А1а Уа1 Не Рке Ьуз Ткг Ьуз Ьеи Азр
35 40 45
Ьуз С1и Не Суз А1а Азр Рго Ткг <31п Ьуз Тгр Уа1 61п Азр Рке МеЬ
50 55 60
Ьуз Η1Ξ Ьеи Азр Ьуз Ьуз Ткг αΐη ткг Рго Ьуз Ьеи
- 106 016584
<210> 49
33
<212> РЕТ
<213> Ното зархепз
<400> 49
О1п Рго Ьей Рго Азр суз Суз Агд
1 5
Туг <31и . Ьей Ьей ΗΪ8 О1у А1а 61у
20
Ьей
<210> 50
<211> 11
с212> РЕТ
<213> Ното зар1епз
<40О> 50
Агд Рго Ьуз Рго (31п С1п РЪе Р11Й
1 5
<31у Ьей Мес
О1П Ъуз 10 ТЪг Суз Бег Суз Агд 15 Ьей
АЭП Н1з А1а А1а 01у 11е Ьей ТЬг
25 30
<2Ю> 51 <211> 5 <212> РЕТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> синтетический пептид <400> 51
61п Туг Азп А1а Айр
5
<210> 52
<211> 5
<212> РКТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический пептид
- 107 016584 <220>
<221> МОП_КЕЗ
<222> (1) . (1)
<2Ξ3> пирролидонкарбоновая кислота
<400> 52
61η Туг Азп А1а Азр
1 5
<210> 53
<211> 26
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический нуклеотид
<400> 53
ддбсЬасасс асссддадсд дсСддс 26
<210> 54
<211> 27
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический нуклеотид
<40О> 54
дддЬЬддаад СасаСсасСС ссЬдддд 27
<210> 55
<211> 24
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический нуклеотид
<400> 55
ассабдсдЬЬ ссдддддссд сддд 24
<210? 56
<211> 27
<212> ДНК
- 108 016584 <213> искусственная последовательность <220?
<223> синтетический нуклеотид <400>56 асдсьададс сссаддСаСС садссад27 <210>57 <211>30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> синтетический нуклеотид <400>57 аСаСаСдааС СсаСдсдССс сдддддссдсзо <210>58 <211>33 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> синтетический нуклеотид <400>58 аСасаСдааС ЬсаСддадсс асСсССдссд ссд33 <210>55 <211>33 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> синтетический нуклеотид <400> 59 аЕаЕасдссд асдадсссса ддЬаССсадс сад 33
е210> 60
<211> 44
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический нуклеотид
- 109 016584
<400> 60
аЬаСае ЬадС дасдасдасд
<210> 61
<211> 49
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> синтетический
<400> €1
последовательность асаадЬСсЬа сассаЪРЬдд нуклеотид
ЕаС-адааЕ адсд
дСаСЬсадс <210>
<211>
<213>
ДНК искусственная последовательность
4220» <223> пцр-πрайшер <400> 62 аЬаСдааЬСс ЬСсЬасасса СССддадс
<210> 63
<211> 49
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
=220>
<223> ПЦР-праймер
<400> 63
аСаЕдааСЬс саЬсассаДс ассабсасбб сбасассаСЁ ^ддадсддс
<210> 64
<211> 35
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер
<400> 64
аСаСаСдсдд ссдссЪадад ссссаддЪаЪ Ьсадс 35
- 110 016584
<210> 65
<211^ 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220.»
<223> ПЦР-праймер
<400> 65
ссаддаБсса ддсЪаБЬдад 20
<210> 66
<211> 56
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер
<400^ 66
аБаЪаБдсдд ссдссьадБд аЬддБдаБдд БдаЪддадсс ссаддБаББс адссад 56
<210> 67
> 1 1 1 ь
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220=·
<223> ПЦР-праймер
<400> 67
ББссасаддд ссддддддс 19
<210> 68
<211> 18
<212> ДЕК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> ПРЦ праймер
<400> 63
аСдадБсссд ддадссдс 13
<210> 69
<211> 18
<212> ДНК
- 111 016584 <213>
искусственная последовательность <220 = <223>
ПЦР-праймер <400>
сЕададЕссс аддЕасЕс <210= 70 <211 = 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220 = <223> ПЦР-праймер <400>70 аддЕссЕдсс ссЕдсЕдсЕд20 <210>71 <211= 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220 = <22 3> ПЦР-праймер <400 = аБсаададдс ассаассаас <210= 72 <211= 19 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220 = <223> ПЦР-праймер <400=72 сЕддаРааЕа ЕЛсссаЕад19 <210=73 <211>19 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220 = <223> ПЦР-праймер
- 112 016584 <400?73 асадсрддда абсРдадЕс19 <210?74 <211;» 21 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
<223> ПЦР-праймер <400?74 дадсадааРа дсРРссдддс д21 <210?75 <211?33 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
<223> ПЦР-праймер <400?75 срдсдддрсс саЬРдаасдд аадссРсссс даа <210?76 <211?33 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
<223> ПЦР-праймер <400?76
ЕЪсддддадд сРЬссдРЬса ардддасссд сад <210?77 <211?33 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
<223> ПЦР-праймер <400? 77 асддРасаса асыддсссд саРСсРсдсЬ дрд зз
- 113 016584 <210 = 73 <211= 33 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220 = <223> ПЦР-праймер <400> 78 сасадсдада аЕдсдддсса адСЕдЕдЕас сдЕ 33
<210 = 79
<211 = 362
<212 = РНТ
<213 = Миз тизсШиз
<400 = 79
меЕ 1 А1а С1у Бег С1и 5 Азр Вуз Беи Уа1 уа1 10 О1у ТЬг Беи ΗΪ3 Беи 15 Беи
Беи Беи С1п А1а ТЬг Уа1 Беи Зег Беи ТЬг А1а <31у Азп Беи Зег Беи
20 25 30
Уа1 Зег А1а А1а тгр ТЬг С1п С1и Буз Анн Н1з ΗΪ3 С1п Рго А1а Н1Э
35 40 45
Беи Азп Зег Бег Зег Беи αΐη С1п Уа1 А1а С1и С1у ТЬг Зег Не Зег
50 55 60
(31и МеЕ тгр С1п Аз η АЗр Беи Агд Рго Беи Беи Не С1и Агд Туг Рго
65 70 75 80
С1у Бег Рго С1у Зег Туг Зег А1а Агд (31 η ΗΪ3 11е МеЕ 61п Агд 11е
85 90 95
(31п Агд Беи С1п А1а С1и Тгр Уа1 Уа1 С1и Уа1 Азр ТЬг РЬе Беи Зег
100 105 110
Агд ТЬг Рго Туг С1у туг Агд Зег РЬе Зег Аз η Не Не Зег ТЬг Беи
115 120 125
- 114 016584
Азп Рго С1и А1а Ьуз Агд ΗΪΒ Ьеи Уа1 Ьеи А1а Суз Η1Ξ Туг Азр Зег
130 135 140
Ьуз Туг РЬе Рго Агд Тгр Азр Зег Агд Уа1 РЬе Уа1 С1у А1а ТЬг Азр
145 150 155 160
Зег А1а Уа1 Рго Суз А1а мее Мее Ьеи О1и Ьеи А1а Агд А1 а Ьеи Азр
165 170 175
Ьуз Ьуз Ьеи Ηίβ Зег Ьеи Ьуз Азр Уа1 Зег С1у Зег ьуз Рго Азр Ьеи
180 185 190
Зег Ьеи Агд Ьеи 11е РЬе РЬе Азр (31у О1и <31и А1а РЬе Н1з ΗΪ.3 Тгр
195 200 205
Зег Рго 61п Азр Зег Ьеи Туг С1у Зег Агд Н1з Ьеи А1а С1п Ьуз мее
210 215 220
А1а Зег Зег Рго Ηίε Рго Рго <31у Зег Агд <з1у ТЬг Азп <31п Ьеи Азр
225 230 235 240
О1у МеЕ Азр Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи Азр Ьеи 11е С1у А1а А 1а Азп Рго
245 250 255
ткг РЬе Рго Азп РЬе РЬе Рго Ьуз ТЬг ТЬг Агд Тгр РЬе Азп Агд Ьеи
260 265 270
О1п А1а 11е <31 и Ьуз <31и Ьеи Туг <31и Ьеи С1у Ьеи Ьеи Ьуз Азр Н18
275 280 285
Зег Ьеи С1и Агд Ьуз Туг РЬе <31п Азп РЬе С1у Туг С1у Азп 11е 11е
290 295 300
С1п Азр Азр ΗΪ3 11е Рго РЬе Ьеи Агд Ьуз С1у νβΐ Рго Уа1 Ьеи Н13
305 310 315 320
Ьеи Не А1а Зег Рго РЬе Рго <31 и Уа1 Тгр Н13 ТЬг Мее Азр Азр Азп
325 330 335
- 115 016584
С1и С1и Авп Беи ΗΪΞ А1а 5ег ТЬг 11е Авр Азп Беи Азп Був 11е Не
340 345 350
С1п Уа1 РЬе Уа1 Беи С1и Туг Беи ΗΪ3 Беи
355
<210=· 80
<211=· 284
<212> РКТ
<213> ЗСгерготусез
<400> 80
А1а 1 Рго Азр Не Рго 5 Беи А1а Азп Уа1 Ьуз 10 А1а Нгз Беи ТЬг О1п 15 Беи
Нег ТНг 11е А1а А1а Азп Азп 01у 01у Ά5Π Агд А1а Н1з <31у Агд Рго
20 25 30
01у туг Буз А1а Зег Уа1 Азр Туг Уа1 Ьуз А1а Буз Беи Азр А1а А1а
35 40 45
С1у туг ТНг ТЬг Ткг Беи <31п С1п РНе ТНг Зег <31у 01у А1а ТНг С1у
50 55 ео
Туг АЗП Беи Не А1а Азп Тгр Рго <31у С1у Азр Рго Азп Був Уа1 Беи
65 70 75 80
Мер А1а 01у А1а ΗΪ3 Беи Азр 5ег Уа1 5ег Зег С1у А1а С1у 11е Азп
85 90 95
Авр Азп С1у Зег С1у Зег А1а А1а Уа1 Ееи С1и ткг А1а Беи А1а Уа1
100 105 но
5ег Агд А1а С1у Туг 01п Рго Азр Буз Н15 Беи Агд РЬе А1а Тгр Тгр
115 120 125
<31у А1а С1и <31и Беи С1у Беи Не С1у Зег Був РНе Туг Уа1 Азп Азп
130 135 140
Беи рго Зег А1а Азр Агд Зег Буз Беи А1а С1у Туг Беи Азп РЬе Азр
- 116 016584
145 150 155 160
МеЕ Не С1у Зег Рго Азп Рго С1у туг РНе Уа1 Туг Аар Азр Азр Рго
165 170 175
Уа1 11е С1и Буз ТНг РНе Буз Азп туг РНе А1а С1у Беи АЗП Уа1 рго
180 185 190
ТНг С1и Не С1и ТНг С1и <31у Азр <31у Агд Зег Азр нбз А1а Рго РНе
195 200 205
Буе Азп Уа1 С1у Уа1 Рго Уа1 а1у С1у Беи РНе ТНг С1у А1а <31у Туг
210 215 220
ТНг Буз Зег А1а А1а С1п А1а <31п Буз тгр О1у С1у ТНг А1а С1у С1п
225 230 235 240
А1а РНе Азр Агд Суз Туг ΗΪ3 Зег Зег Суз Азр Зег Беи Зег Азп 11е
245 250 255
Азп Азр ТНг А1а Беи Азр Агд Азп Зег Азр А1а А1а А1а Н13 А1а 11е
260 265 270
Тгр ТНг Беи Зег Зег <31у ТНг С1у С1и Рго Рго ТНг
275 280
<210 = 81
<211> 299
<212 = РКТ
<213 = У1Ьг1о ргоЕеоБуЕ1сиз
<400> 81
Мек Рго Рго Не ТНг С1п С1п А1а ТНг Уа1 ТНг А1а Тгр Беи Рго О1п
1 5 10 15
Уа1 Азр А1а Зег С1п 11е ТНг С1у ТНг 11е Зег Зег Беи С 1и Зег РНе
20 25 30
ТНг Азп Агд РНе Туг ТНг ТНг ТНг Зег С1у А1а С1п А1а Зег Азр тгр
40 45
- 117 016584
Не А1а 50 Зег С1и Тгр С1п А1а 55 Ьеи Зег А1а Зег Ьеи 60 Рго Азп А1а Зег
Уа1 Ьув <31п \га1 Зег ΗΪ3 Зег (31у Туг Азп <31п Ьуз Зег Уа1 Уа1 Мес
65 70 75 80
ТЬг Не ТЬг (31у Зег 61и А1а Рго Азр 61и Тгр 11е Уа1 Не С1у 61у
85 90 95
Н1з Ьеи Азр Зег ТЬг 11е С1у Йег Н1в ТЬг Азп С1и 61п Зег Уа1 А1а
100 105 но
Рго С1у А1а Азр Азр Азр А1а Зег С1у Не А1а А1а Уа1 ТЬг <31и Уа1
115 120 125
Не Агд Уа1 Ьеи Зег 61и Азп Азп РЬе С1п Рго Ьуз Агд Зег 11е А1а
130 135 140
РЬе Мес А1а Туг А1а А1а 61и 61и Уа1 С1у Ьеи Агд <31у Зег <31п Азр
145 150 155 160
Ьеи А1а Азп С1п Туг Ьуз Зег С1и 61у Ьуз Азп Уа1 Уа1 Зег А1а ьеи
165 170 175
(31п Ьеи Азр МеЬ ТЬг Азп Туг Ьуз С1у Зег А1а С1п Азр Уа1 Уа1 РЬе
180 185 190
Не ТЬг Азр Туг ТЬг Азр Зег Азп РЬе ТЬг <31п Туг Ьеи ТЬг 61П Ьеи
195 200 205
мес Азр С1и Туг ьеи рго Зег Ьеи ТЬг туг (31у РЬе Азр ТЬг Суз С1у
210 215 220
Туг А 1а Суз Зег Азр Иге А1а Зег тгр Н1а Аеп А1а 61у туг Рго А1а
225 230 235 240
А1а мес РГО РЬе С1и Зег Ьуз РЬе Азп Азр Туг Азп Рго Агд 11е Н13
245 250 255
- 118 016584
Ткг ТЬг С1П Азр 260 Ткг Ьеи А1а Азп
Ьуз Дув Рке Ткг С1п Ьеи С1у ьеи
275 280
А1а Ткг <31у Азр Ткг Рго Ткг РГО
290 295
Зег Азр 265 Рго Ткг С1у Зег 270 Н1в А1а
А1а Туг А1а Не <31и Мер С1у Зег
285
<Э1у Азп 61п
<210> 82 <211= 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> праймер для клонирования <400>82 авасаваадс ВсаВддсадд сддаадасас30 <210183 <211>31 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> праймер для клонирования <400> 83 аВаВдсддсс дсВВасаааВ даадаГаЬВс с <210>
<211>
<212
днк <213>
искусственная последовательность <220>
<223> ПНР-праймер с400> 34 аВаВаВдсдд ссдссСадад ссссаддВаВ всаде <210> В5 <211> 31
- 119 016584 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
<223> ПЦР-праймер <400>85 аЪаьсЪсдад ЬссаЬсдсса ссаЬддРдад с31 <210? 86 <211?31 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
<223> ПЦР-праймер <400?86 аЬаЬсЬсдад ОРасЪЕдРас адсЬсдЪсса Р31 <210>87 <211541 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
<223> ПЦР-праймер <400?87 абаьдсддсс дсабдрсдас дсбссааанд дсдсадаасд с41 <210? 88 <211?57 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
<223> ПЦР-праймер <400>88 аЬаЕдсддсс дсЫасЫдД саРсдРсаЬс сРЬдПааЬсс аааЕдаадаь аЫссаа57 <210?89 <211?57 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
- 120 016584 <223> ПЦР-праймер <400?89 аСасдсддсс дссбасссдь саЬсдЪсаСс сЬЬдЬаабсд адссссаддь аЬЬсадс57 <210?90 <211? 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
<223> ПЦР-праймер <400?90 дссЬссадса ЬдааадбсЪс20 <210?91 <211? 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
<223? СА6АТСТССТТ5СССАСААТ <400?91 садаЬсЬссЬ Ьддссасаак20 <210?92 <211? 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
<223> ПЦР-праймер <400?92 аЬдааадссЬ сЬдсадсасб20 <210?93 <211? 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220?
<223> ПЦР-праймер <400? 93
ЬддсбасЬдд СддЬссЬЬсС 20
- 121 016584 <210> 94 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400>94 ьсасссдсСд сьььаасдед20 <210=·95 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400>
аЕсссЬдасс саРсЬсЪссЬ <210=· 96 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400>96 аЬсЬссИдс ададдсСдаа20 <210>97 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400>
адаададдад дссададдад <210>
<211>
- 122 016584 <212>
ДНК <213>
искусственная последовательность <220>
<223>
ПЦР-праймер <400>
сасадаааед дссеедедаа
<210 = 99
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> ПЦР-праймер
<400> 99
последовательность ссаадсаддЬ саЬаддСдде <210 =
100 <211>
<212>
днк <213>
искусственная последовательность <220>
<223>
ПЦ₽-праймер <400 =
100
ЕссьдесаЬс седдаассЬд <210>
101 <211 = <212>
ДНК <213>
искусственная последовательность <220=· <223>
ПЦР-праймер <400>
101 сдссЬсЬБсЬ дЬЬксассЬс <210> 102 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220 =
- 123 016584 <223> ПЦР-праймер с400>102 аадсдсЪдЫ ЪдссадЬЬаВ20 <210=·103 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400>103 сасасдЬдад дсдсЪаССЬа20 <210>104 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400>104 дСсаасадаС ссСссссада20 <210>105 <211=· 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 105 садсаВЬСсД дссВЬЬдЬда 20 <210> 106 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 106 аддьддадад ссРдаддааЬ 20
- 124 016584
1>
ДНК
искусственная последовательность
223
ПЦР-праймер
СсцЗЗ^ссР асиддСсадс <210> 108 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<22 3> ПЦР- праймер <400> 108 аадсдаддСД сисдЬДсЬда
<
>
ДНК
искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 109
ЬдассЬсиид сисЬсссЬдС <210? 110 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400>110 сиисаадсЬс ЬссЦдсЬдсР20 <210>111 <211>20
- 125 -
<212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 111 сдасссЬдас ББссБддББа 20 <210> 112 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<22 3> ПЦР-праймер <400>112 дсЬсаБсддс ЬдББддБаБЬ20 <210>113 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<22 3> ПЦР-праймер <400>113 аБаадсаддЬ ддадсаБХдд20 <210>114 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400>114 аддсБЬсдда аасьддасаБ20 <210>115 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
- 126 016584
- 127 016584 <210> 120 <21Ι> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400>120 ддЪСссСЪСс ЬЬссссссад20 <21О>121 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 121 адссааадсс ассадЪд&сс 20

Claims (43)

1. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует (а) полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая представлена в одной из 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 11-18, или (б) полипептид, аминокислотная последовательность которого подобна указанным выше последовательностям по меньшей мере на 75%, и который обладает такой же биологической функцией; или полученный в результате альтернативного сплайсинга вариант одной из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2-9; или которая представляет собой зонд, содержащий по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, указанные в (а) или (б), или которая является комплементарной любой из вышеуказанных нуклеиновых кислот.
2. Выделенная нуклеиновая кислота по п.1, которая представляет собой ДНК или РНК.
3. Выделенная нуклеиновая кислота по п.1, которая представляет собой ДНК-транскрипт, включающий одну из полноразмерных последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2-9, или которая является комплементарной полной кодирующей области одной из последовательностей, представленных в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2-9.
4. Антисмысловой олигонуклеотид к ДНК по п.3.
5. Выделенная нуклеиновая кислота по п.1, которая представляет собой РНК-транскрипт, включающий одну из полноразмерных последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2-9.
6. Выделенная нуклеиновая кислота по п.1, которая представляет собой полученный в результате альтернативного сплайсинга вариант одной из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2-9.
7. Полученный в результате альтернативного сплайсинга вариант по п.6, соответствующий 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 19 или 20.
8. Полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.6 или 7.
9. Выделенная нуклеиновая кислота по п.1, которая кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого подобна по меньшей мере на 85% одной из последовательностей, представленных в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 11-18.
10. Выделенная нуклеиновая кислота по п.1, которая кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого подобна по меньшей мере на 95% одной из последовательностей, представленных в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 11-18.
11. Выделенная нуклеиновая кислота по п.1, которая кодирует полипептид, идентичный по меньшей мере на 50% одной из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 11-18.
12. Нуклеиновая кислота-зонд по п.1, содержащая по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов одной из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2-9.
13. Нуклеиновая кислота-зонд по п.12, соответствующая одной из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 53-61.
14. Выделенная рекомбинантная полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1 плюс контролирующие экспрессию элементы, функционально связанные с нуклеиновой кислотой для обеспечения ее экспрессии.
15. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1, кодирующую полипептид, который имеет полную аминокислотную последовательность, представленную в одной из 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 11-18, функционально связанную с промотором, где экспрессионный вектор присутствует в совместимой клетке-хозяине.
16. Клетка-хозяин млекопитающего, насекомого или бактерии, созданная с помощью генной инже
- 128 016584 нерии путем инсерции нуклеиновой кислоты по п.1, которая кодирует по меньшей мере часть зрелого белка, соответствующего одной из аминокислотных последовательностей, представленных в ЗЕО ΙΌ NО: 11-18.
17. Способ получения полипептида, включающего часть зрелого белка, соответствующего одной из последовательностей, представленных в ЗЕО ΙΌ NО: 11-18, заключающийся в том, что культивируют клетку-хозяина по п.16 в условиях, достаточных для получения указанного полипептида.
18. Способ по п.17, в котором полипептид экспрессируют на поверхности указанной клетки и который дополнительно включает стадию, на которой выделяют полипептид или его фрагмент из культуры.
19. Полипептид, который может быть необязательно гликозилированным и который (а) имеет аминокислотную последовательность зрелого белка, представленную в одной из ЗЕО ΙΌ NО: 11-18; (б) имеет аминокислотную последовательность зрелого белка, подобную по меньшей мере на 75% одному из зрелых белков, указанных в (а), и который обладает такой же биологической функцией; (в) имеет аминокислотную последовательность зрелого белка, которая по меньшей мере на 50% идентична зрелому белку, представленному в одной из ЗЕО ΙΌ NО: 11-18; или (г) представляет собой иммунологически реактивный фрагмент белка, указанного в (а).
20. Полипептид по п.19, представляющий собой зрелый белок, подобный по меньшей мере на 85% зрелому белку, указанному в (а).
21. Полипептид по п.19, представляющий собой зрелый белок, подобный по меньшей мере на 95% зрелому белку, указанному в (а).
22. Полипептид по п.19, имеющий аминокислотную последовательность зрелого белка, представленную в одной из 8ЕО ΙΌ NО: 11-18, или его фрагмент, обладающий такой же биологической функцией, что и соответствующий зрелый белок.
23. Антитело, которое распознает полипептид или его фрагмент по одному из пп.19-22.
24. Антитело по п.23, которое распознает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в одной из ЗЕО ΙΌ NО: 11-18.
25. Способ скрининга соединения, которое обладает способностью ингибировать ферментативную активность по меньшей мере одного зрелого белка по п.19, заключающийся в том, что инкубируют зрелый белок и приемлемый субстрат для зрелого белка в присутствии одного или нескольких исследуемых соединений или их солей, оценивают ферментативную активность зрелого белка, сравнивают активность с соответствующей активностью, определенной в отсутствие исследуемого соединения, и отбирают исследуемое(ые) соединение или соединения, которое(ые) снижает(ют) ферментативную активность.
26. Способ скрининга избирательного ингибитора глутамилциклазы, который не ингибирует ферментативную активность по меньшей мере одного зрелого белка по п.19, заключающийся в том, что ингибируют зрелый белок и приемлемый субстрат для зрелого белка в присутствии одного или нескольких ингибиторов глутамилциклазы или их солей, оценивают ферментативную активность зрелого белка, сравнивают активность с соответствующей активностью, определенной в отсутствие ингибитора глутамилциклазы, и отбирают соединение, которое не снижает ферментативную активность зрелого белка.
27. Способ скрининга избирательного ингибитора белка глутаминилпептидциклотрансферазы, который не ингибирует ферментативную активность глутамилциклазы, заключающийся в том, что инкубируют глутамилциклазы в присутствии одного или нескольких ингибиторов белка глутаминилпептидциклотрансферазы или их солей, оценивают ферментативную активность глутамилциклазы, сравнивают активность с соответствующей активностью, определенной в отсутствие ингибитора белка глутаминилпептидциклотрансферазы, и отбирают соединение, которое не снижает ферментативную активность белка глутаминилпептидциклотрансферазы.
28. Антагонист белка глутаминилпептидциклотрансферазы, который ингибирует биологическую функцию одного из зрелых белков по одному из пп.19-22.
29. Антагонист белка глутаминилпептидциклотрансферазы по п.28, который представляет собой низкомолекулярный ингибитор.
30. Ингибитор по п.29, идентифицированный с помощью способа скрининга по п.25 или 27.
31. Избирательный ингибитор глутамилциклазы, идентифицированный с помощью способа скрининга по п.26.
32. Фармацевтическая композиция, предназначенная для парентерального, энтерального или орального введения, содержащая по меньшей мере один ингибитор белка глутаминилпептидциклотрансферазы или его фармацевтически приемлемую соль, необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами.
33. Применение фармацевтической композиции по п.32 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для предупреждения или лечения заболевания, выбранного из группы, включающей болезнь Альцгеймера, семейную британскую деменцию, семейную датскую деменцию, синдром Дауна, болезнь Гентингтона, болезнь Кеннеди, язвенную болезнь, рак двенадцатиперстной кишки, связанный и несвязанный с заражением Не1юоЬас!ег ру1оп8, колоректальный рак, синдром ЗоллингераЭллисона, рак желудка, связанный и несвязанный с заражением Не1юоЬас!ег ру1оп, патогенные психические состояния, шизофрению, бесплодие, неоплазию, воспалительные реакции хозяина, рак, злокачест
- 129 016584 венные метастазы, меланому, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушенный сон, нарушенная связанная с гомеостазом регуляция энергетического метаболизма, нарушенная функция вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенная регуляция общей воды организма, рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре и хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулоневропатию.
34. Применение ингибитора белка глутаминилпептидциклотрансферазы или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления лекарственного средства, предназначенного для предупреждения или лечения заболевания, выбранного из группы, включающей болезнь Альцгеймера, семейную британскую деменцию, семейную датскую деменцию, синдром Дауна, болезнь Гентингтона, болезнь Кеннеди, язвенную болезнь, рак двенадцатиперстной кишки, связанный и несвязанный с заражением НеИсоЬас1ег ру1оп8, колоректальный рак, синдром Золлингера-Эллисона, рак желудка, связанный и несвязанный с заражением НеИсоЬас1ег ру1оп, патогенные психические состояния, шизофрению, бесплодие, неоплазию, воспалительные реакции хозяина, рак, злокачественные метастазы, меланому, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушенный сон, нарушенная связанная с гомеостазом регуляция энергетического метаболизма, нарушенная функция вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенная регуляция общей воды организма, рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре и хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулоневропатию.
35. Применение по одному из пп.33-34, где ингибитор белка глутаминилпептидциклотрансферазы представляет собой конкурентный ингибитор.
36. Применение по одному из пп.33-35, где ингибитор белка глутаминилпептидциклотрансферазы связывается с активным сайтом белка глутаминилпептидциклотрансферазы, связанным с ионом металла.
37. Применение по одному из пп.33-36, где последовательность белка глутаминилпептидциклотрансферазы выбрана из одной из последовательностей, представленных в ЯЕО Ш ΝΟ: 11-18, 21 и 22.
38. Применение по п.37, где последовательность белка глутаминилпептидциклотрансферазы выбрана из одной из последовательностей, представленных в ЯЕО Ш ΝΟ: 11 и 12.
39. Применение по одному из пп.33-38, в которых применяют ингибитор по одному из пп.28-30.
40. Способ диагностики заболевания и/или состояния, выбранного из группы, включающей болезнь Альцгеймера, семейную британскую деменцию, семейную датскую деменцию, синдром Дауна, болезнь Гентингтона, болезнь Кеннеди, язвенную болезнь, рак двенадцатиперстной кишки, связанный и несвязанный с заражением Не1юоЬас1ег ру1оп8, колоректальный рак, синдром Золлингера-Эллисона, рак желудка, связанный и несвязанный с заражением Не11соЬас1ег ру1оп, патогенные психические состояния, шизофрению, бесплодие, неоплазию, воспалительные реакции хозяина, рак, злокачественные метастазы, меланому, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточноопосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушенный сон, нарушенная связанная с гомеостазом регуляция энергетического метаболизма, нарушенная функция вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенная регуляция общей воды организма, рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре и хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулоневропатию, включающий этапы получения образца из индивидуума, который, как ожидается, поражен указанным заболеванием и/или состоянием, контактирования с ингибитором глутаминилпептидциклотрансферазы и определения, поражен ли индивидуум указанным заболеванием и/или состоянием.
41. Способ по п.40, в котором индивидуум представляет собой человека.
42. Способ по п.40 или 41, в котором образец представляет собой образец крови, образец сыворотки, образец спинно-мозговой жидкости или образец мочи.
43. Диагностический набор для осуществления способа по пп.40-42, содержащий в качестве средства выявления набор для диагностического анализа, включающий ингибитор белка, подобного глутаминилпептидциклотрансферазе, и средства измерения.
EA200900404A 2006-09-21 2007-09-21 Новые гены, родственные гену глутаминилциклазы EA016584B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US84624406P 2006-09-21 2006-09-21
US94778007P 2007-07-03 2007-07-03
PCT/EP2007/060013 WO2008034891A2 (en) 2006-09-21 2007-09-21 Novel genes related to glutaminyl cyclase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200900404A1 EA200900404A1 (ru) 2009-10-30
EA016584B1 true EA016584B1 (ru) 2012-06-29

Family

ID=38779576

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200900404A EA016584B1 (ru) 2006-09-21 2007-09-21 Новые гены, родственные гену глутаминилциклазы

Country Status (13)

Country Link
US (3) US20080249083A1 (ru)
EP (2) EP2581449B1 (ru)
JP (1) JP2010504088A (ru)
KR (1) KR101432848B1 (ru)
AU (1) AU2007298929B2 (ru)
BR (1) BRPI0718507A2 (ru)
CA (1) CA2663635A1 (ru)
EA (1) EA016584B1 (ru)
HK (1) HK1136603A1 (ru)
IL (2) IL197090A (ru)
MX (1) MX2009003090A (ru)
NZ (2) NZ590631A (ru)
WO (1) WO2008034891A2 (ru)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101837127A (zh) * 2003-05-05 2010-09-22 前体生物药物股份公司 谷氨酰胺酰基和谷氨酸环化酶效应物的应用
EA016584B1 (ru) * 2006-09-21 2012-06-29 Пробиодруг Аг Новые гены, родственные гену глутаминилциклазы
US8889709B2 (en) 2006-09-21 2014-11-18 Probiodrug Ag Use of isoQC inhibitors in the treatment and prevention of inflammatory diseases or conditions
US9277737B2 (en) 2006-09-21 2016-03-08 Probiodrug Ag Mouse models carrying a knock-out mutation of the QPCTL-gene
US8420684B2 (en) * 2006-11-09 2013-04-16 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2008055945A1 (en) * 2006-11-09 2008-05-15 Probiodrug Ag 3-hydr0xy-1,5-dihydr0-pyrr0l-2-one derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase for the treatment of ulcer, cancer and other diseases
EP2086960B1 (en) * 2006-11-09 2014-03-05 Probiodrug AG Novel inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2008065141A1 (en) * 2006-11-30 2008-06-05 Probiodrug Ag Novel inhibitors of glutaminyl cyclase
ES2372229T3 (es) * 2007-01-19 2012-01-17 Probiodrug Ag Modelos de selección in vivo para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer y otros trastornos relacionados con qpct.
US20120070444A1 (en) 2007-01-19 2012-03-22 Probiodrug Ag IN VIVO SCREENING MODELS FOR TREATMENT OF isoQC-RELATED DISORDERS
JP5612860B2 (ja) * 2007-03-09 2014-10-22 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのイミダゾ［１，５−ａ］ピリジン誘導体
JP5667440B2 (ja) * 2007-04-18 2015-02-12 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのチオ尿素誘導体
ES2474693T3 (es) * 2007-04-18 2014-07-09 Probiodrug Ag Derivados de ciano-guanidina como inhibidores de glutaminil ciclasa
WO2008128986A1 (en) * 2007-04-18 2008-10-30 Probiodrug Ag Urea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
JP5675344B2 (ja) * 2007-04-18 2015-02-25 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのニトロビニルジアミン誘導体
JP5675340B2 (ja) * 2007-04-18 2015-02-25 プロビオドルグ エージー 新規阻害剤
EP2160389B1 (en) * 2007-04-18 2014-03-12 Probiodrug AG Thioxoquinazolinone derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
WO2008128984A1 (en) * 2007-04-20 2008-10-30 Probiodrug Ag Aminopyrimidine derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
CA2696934A1 (en) * 2007-09-12 2010-02-16 Probiodrug Ag Transgenic mice
JP2011511622A (ja) * 2008-01-14 2011-04-14 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼ遺伝子のノックアウト変異を有するマウスモデル
US20100028918A1 (en) * 2008-07-31 2010-02-04 Probiodrug Ag Glutaminyl cyclase as a diagnostic/prognostic indicator for neurodegenerative diseases
WO2010026209A1 (en) * 2008-09-04 2010-03-11 Probiodrug Ag Use of isoQC inhibitors
US8962860B2 (en) * 2008-09-04 2015-02-24 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase
SG176164A1 (en) * 2009-05-19 2011-12-29 Probiodrug Ag Mouse models carrying a knock-out mutation of the qpctl-gene
WO2011101433A1 (en) * 2010-02-18 2011-08-25 Probiodrug Ag Methods of diagnosing inflammatory diseases by determining pyroglutamate-modified mcp-1 and screening methods for inhibitors of glutaminyl cyclase
EP2606129B1 (en) 2010-08-19 2015-03-25 Probiodrug AG Crystal structure of glutaminyl cyclase
US8741614B2 (en) 2010-11-02 2014-06-03 Probiodrug Ag Crystal structure of isoglutaminyl cyclase
JP6397407B2 (ja) 2012-07-19 2018-09-26 ドレクセル ユニバーシティ 細胞タンパク質ホメオスタシスを調節するためのシグマ受容体リガンド
US20180318260A1 (en) * 2015-11-04 2018-11-08 The Scripps Research Institute Compositions and methods for treating cystic fibrosis
AU2018308191B2 (en) * 2017-07-24 2023-12-21 Scenic Immunology B.V. Treating pathological conditions by direct and indirect targeting of SIRPa - CD47 interaction
US11117870B2 (en) 2017-11-01 2021-09-14 Drexel University Compounds, compositions, and methods for treating diseases
GB201918108D0 (en) * 2019-12-10 2020-01-22 Vib Vzw Improved aminopeptiadases for single molecule peptide sequencing

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004098625A2 (en) * 2003-05-05 2004-11-18 Probiodrug Ag Medical use of inhibitors of glutaminyl and glutamate cyclases
WO2004098591A2 (en) * 2003-05-05 2004-11-18 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase and their use in the treatment of neurological diseases
WO2005039548A2 (en) * 2003-10-15 2005-05-06 Probiodrug Ag Use of effectors of glutaminyl and glutamate cyclases
WO2005049025A1 (en) * 2003-11-19 2005-06-02 Acrux Dds Pty Ltd Method and composition for treatment of cutaneous lesions
WO2005075436A2 (en) * 2004-02-05 2005-08-18 Probiodrug Ag Novel inhibitors of glutaminyl cyclase

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
IT1183575B (it) 1985-05-08 1987-10-22 Eurand Spa Formulazione deodorando ad effetto modulante sulla trfaspirazione
DD293584A5 (de) 1990-03-23 1991-09-05 Adw,Zi Fuer Organische Chemie,De Verfahren zur herstellung von neuen 3,5,5-trisubstituierten 1-(benzimidazol-2-yl)-imidazolidin-2,4-dionen bzw. -4-on-2-thionen
US20040006011A1 (en) * 1996-07-12 2004-01-08 Gour Barbara J. Peptidomimetic modulators of cell adhesion
US6247293B1 (en) * 1998-11-03 2001-06-19 Klockner Bartelt, Inc. Modular packaging machine with web tension control
FR2796945B1 (fr) 1999-07-30 2002-06-28 Sod Conseils Rech Applic Nouveaux derives d'hydantoines, de thiohydantoines, de pyrimidinediones et de thioxopyrimidinones, leurs procedes de preparation et leur application a titre de medicaments
WO2001053331A2 (en) 2000-01-24 2001-07-26 Adherex Technologies, Inc. Peptidomimetic modulators of cell adhesion
FR2808711B1 (fr) * 2000-05-10 2002-08-09 Poudres & Explosifs Ste Nale Procede de fabrication d'elements composites etain-tungstene de faible epaisseur
EP1388107A1 (en) * 2001-05-11 2004-02-11 Swisscom Mobile AG Method for transmitting an anonymous request from a consumer to a content or service provider through a telecommunication network
US6948038B2 (en) * 2001-07-24 2005-09-20 Microsoft Corporation System and method for backing up and restoring data
KR100474689B1 (ko) * 2001-08-30 2005-03-08 삼성전자주식회사 이동통신 시스템에서 소프트 핸드오프 도중의 전력제어 방법
AU2002359474A1 (en) * 2001-11-26 2003-06-10 Exelixis, Inc. MBMs AS MODIFIERS OF BRANCHING MORPHOGENESIS AND METHODS OF USE
US7677859B2 (en) 2002-07-22 2010-03-16 Brooks Automation, Inc. Substrate loading and uploading station with buffer
GB0220501D0 (en) * 2002-09-04 2002-10-09 Hall Geoffrey W Push 22
US20040098591A1 (en) * 2002-11-15 2004-05-20 Fahrny James W. Secure hardware device authentication method
US6851324B2 (en) * 2002-12-16 2005-02-08 Delphi Technologies, Inc. Non-contacting compliant torque sensor
US8338120B2 (en) * 2003-05-05 2012-12-25 Probiodrug Ag Method of treating inflammation with glutaminyl cyclase inhibitors
US7732162B2 (en) * 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
CN101837127A (zh) * 2003-05-05 2010-09-22 前体生物药物股份公司 谷氨酰胺酰基和谷氨酸环化酶效应物的应用
US7192995B2 (en) * 2003-10-03 2007-03-20 Virginia Commonwealth University Homogenous compositions of polymers and crystalline solids or cross-linking agents and methods of making the same
ZA200603165B (en) * 2003-11-03 2007-07-25 Probiodrug Ag Combinations useful for the treatment of neuronal disorders
US20050171112A1 (en) * 2003-11-03 2005-08-04 Probiodrug Ag Combinations useful for the treatment of neuronal disorders
US7667044B2 (en) * 2003-11-03 2010-02-23 Probiodrug Ag Compounds for the treatment of neurological disorders
WO2005108415A2 (en) * 2004-04-30 2005-11-17 Biogen Idec Ma Inc. Membrane associated molecules
ATE506602T1 (de) * 2004-07-01 2011-05-15 Micro Motion Inc Coriolis durchflussmessgerät mit aufgeteilten auswucht-gewichten zur beseitigung des dichteeffekts auf gemessene durchflüsse
US7663268B2 (en) * 2006-08-30 2010-02-16 The Regents of the University of Cailfornia Converters for high power applications
EA016584B1 (ru) 2006-09-21 2012-06-29 Пробиодруг Аг Новые гены, родственные гену глутаминилциклазы
JP5456479B2 (ja) 2006-11-09 2014-03-26 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの新規阻害剤
WO2008128984A1 (en) * 2007-04-20 2008-10-30 Probiodrug Ag Aminopyrimidine derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004098625A2 (en) * 2003-05-05 2004-11-18 Probiodrug Ag Medical use of inhibitors of glutaminyl and glutamate cyclases
WO2004098591A2 (en) * 2003-05-05 2004-11-18 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase and their use in the treatment of neurological diseases
WO2005039548A2 (en) * 2003-10-15 2005-05-06 Probiodrug Ag Use of effectors of glutaminyl and glutamate cyclases
WO2005049025A1 (en) * 2003-11-19 2005-06-02 Acrux Dds Pty Ltd Method and composition for treatment of cutaneous lesions
WO2005075436A2 (en) * 2004-02-05 2005-08-18 Probiodrug Ag Novel inhibitors of glutaminyl cyclase

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUCHHOLZ MIRKO ET AL.: "The first potent inhibitors for human glutaminyl cyclase: Synthesis and structure-activity relationship" JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 49, no. 2, January 2006 (2006-01), pages 664-677, XP002462493 ISSN: 0022-2623 the whole document *
DATABASE CA [Online] CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE, COLUMBUS, OHIO, US; 2005, OHSUGI, TADANORI ET AL: "Anti-platelet aggregation and anti-blood coagulation activities of dipicolinic acid, a sporal component of Bacillus subtilis natto" XP002462497 retrieved from STN Database accession no. 145:369541 abstract & FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY RESEARCH (2005), 11(3), 308-310 CODEN: FSTRFS; *
DATABASE EMBL 26 May 2006 (2006-05-26), SUZUKI Y. ET AL.: "Homo sapiens mRNA for glutaminyl-peptide cyclotransferase-like variant" XP002462494 Database accession no. AK222636 nucleic acid sequence *
DATABASE GENESEQ 29 July 2004 (2004-07-29), PENN S.G. ET AL.: "Human genome derived single exon probe" XP002462496 Database accession no. ACH86904 abstract *
DATABASE UniProt 5 September 2006 (2006-09-05), SUZUKI Y. ET AL.: "Glutaminyl-peptide cyc1otransferase-like variant" XP002462495 Database accession no. Q53HE4 amino acid sequence *
ISSN: 1344-6606, 2005, *
SCHILLING S. ET AL.: "Identification of human glutaminyl cyclase as a metalloenzyme. POTENT INHIBITION BY IMIDAZOLE DERIVATIVES AND HETEROCYCLIC CHELATORS" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOCHEMICAL BIOLOGISTS, BIRMINGHAM, US, vol. 278, no. 50, 12 December 2003 (2003-12-12), pages 49773-49779, XP002324506 ISSN: 0021-9258 abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
IL214820A (en) 2016-06-30
BRPI0718507A2 (pt) 2013-11-12
NZ590631A (en) 2011-12-22
EP2082041A2 (en) 2009-07-29
JP2010504088A (ja) 2010-02-12
CA2663635A1 (en) 2008-03-27
HK1136603A1 (zh) 2010-07-02
EP2082041B1 (en) 2018-03-14
AU2007298929B2 (en) 2012-09-27
IL197090A0 (en) 2011-08-01
WO2008034891A3 (en) 2008-05-08
US8647834B2 (en) 2014-02-11
KR101432848B1 (ko) 2014-08-27
EA200900404A1 (ru) 2009-10-30
EP2581449B1 (en) 2016-09-14
US20120183974A1 (en) 2012-07-19
NZ575727A (en) 2011-12-22
WO2008034891A2 (en) 2008-03-27
US20080249083A1 (en) 2008-10-09
AU2007298929A1 (en) 2008-03-27
US20100009337A1 (en) 2010-01-14
MX2009003090A (es) 2009-04-02
IL214820A0 (en) 2011-09-27
EP2581449A3 (en) 2013-07-31
IL197090A (en) 2016-03-31
KR20090059163A (ko) 2009-06-10
EP2581449A2 (en) 2013-04-17
US8129160B2 (en) 2012-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA016584B1 (ru) Новые гены, родственные гену глутаминилциклазы
van der Horst et al. Targeting of αv-integrins in stem/progenitor cells and supportive microenvironment impairs bone metastasis in human prostate cancer
JP2011504461A (ja) Ｗｎｔ活性を測定するためのおよびｗｎｔ関連がんを処置するための方法および組成物
Alford et al. Targeting the hemopexin-like domain of latent matrix metalloproteinase-9 (proMMP-9) with a small molecule inhibitor prevents the formation of focal adhesion junctions
EP3271338A1 (en) Triazole derivatives and their use as pde4 activators
Lo et al. Host-Derived Matrix Metalloproteinase-13 Activity Promotes Multiple Myeloma–Induced Osteolysis and Reduces Overall Survival
JP5788320B2 (ja) イソｑｃ阻害剤の使用
JP2006524496A (ja) 骨関節炎の診断および処置のためのチロシンキナーゼを標的化する方法および組成物
CN101573450B (zh) 与谷氨酰环化酶相关的新基因
EA028135B1 (ru) Мутанты c-raf, придающие резистентность к ингибиторам raf
JP2000050885A (ja) カテプシンに対する抗体およびそれらの利用
AU2012241108B2 (en) Novel genes related to glutaminyl cyclase
WO2016098042A1 (en) Use of ceritinib (ldk-378) in the treatment of fes or fer mediated disorders, in particular proliferative disorders
US11186874B2 (en) ERK1 and ERK2 mutations that confer resistance to MAPK pathway inhibitors
US20020173020A1 (en) 26886, a novel carnitine acyltransferase family member and uses therefor
Zeng et al. Adenosine diphosphate ribose cyclase: An important regulator of human pathological and physiological processes
JP4634302B2 (ja) テトラヒドロ葉酸合成酵素遺伝子
Ferreri et al. Signaling to and through the endothelial adherens junction
CN114450027A (zh) 用cdc42特异性抑制剂治疗受试者的方法
KR101462329B1 (ko) 디스코이딘 도메인 리셉터 2의 ｊｍ2 도메인의 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
JP2007319009A (ja) 間質性肺疾患治療剤
JP2005511513A (ja) 新規ヒトアミノプロテアーゼファミリーメンバー２２４１７を使用する方法
JP2005509174A (ja) ヒトアミノペプチダーゼファミリーメンバーである４８１４９を使用する方法
WO2002057448A1 (fr) Nouveaux peptides et leurs activites

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KZ

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU