JP2005506838A - ヒトスルファターゼファミリーメンバーmid9002およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規スルファターゼファミリーメンバーをコードする、MID9002核酸分子と称される単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、アンチセンス核酸分子、MID9002核酸分子を含む組換え発現ベクター、この組換え発現ベクターが導入された宿主細胞、およびMID9002遺伝子が導入されたかまたは破壊された非ヒトトランスジェニック動物を提供する。本発明はなおさらに、単離されたMill9002のタンパク質、融合タンパク質、抗原性ペプチドおよび抗Mill9002抗体を提供する。本発明の組成物を利用する診断方法および治療方法もまた、提供される。
Description
【技術分野】
【0001】
(関連技術)
本願は、先願の仮出願番号60/316,710(2001年8月31日出願:表題「Mid 9002,A Human Sulfatase Family Member and Uses Therefor」(係属中))の優先権を主張する。上記で参照される出願の内容全体が、本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【0002】
(発明の背景)
スルファターゼは、広範な種々の基質(例えば、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびデルマタン硫酸)、3β−ヒドロキシステロイド硫酸、およびスルホリピド)中に存在する硫酸エステル結合(O−スルファターゼ活性)の加水分解を触媒する酵素のファミリーである(Parentiら、「The sulfatase gene family」Curr.Opin.Gen.Dev.(1997)7:386〜391;Ballabioら、Steroid sulfatase deficiency and X−linked ichthyosis.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2999−3022,1995)。9つの異なるヒトスルファターゼが、記載されそして特徴付けられている(Ballabioら、Steroid sulfatase deficiency and X−linked ichthyosis.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2999−3022,1995;Kolodnyら、Metachromatic leukodystrophy and multiple sulfatase deficiency:sulfatide lipidosis.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases.Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2693−2741,1995;Neufeldら、The mucopolysaccharidoses.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2645−2494,1995)。スルファターゼの欠損は、少なくとも7つの別個の遺伝性障害に関係している(Kolodnyら、Metachromatic leukodystrophy and multiple sulfatase deficiency:sulfatide lipidosis.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases.Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2693−2741,1995;Neufeldら、The mucopolysaccharidoses.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2645−2494,1995)。既知のスルファターゼタンパク質の全長に沿って、特に、N末端領域において、高度の相同性が存在する(Wilsonら、「Hunter Syndrome:isolation of an iduronate−2−sulfatase cDNA clone and analysis of patient DNA」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8531−8535,1990)。
【0003】
以前から公知のヒトスルファターゼの3つである、アリールスルファターゼA、アリールスルファターゼBおよびアリールスルファターゼC(ARSA、ARSB、およびARSC)は、フェノール環(例えば、p−ニトロカテコールスルフェートまたは4−メチルアンベリフェリルスルフェート(4−methylumbelliferyl sulfate)(4−MUスルフェート))を含む硫酸化人工基質を加水分解することが知られている。ARSCは、より詳細には、ステロイドスルフェートを加水分解するその能力に起因して、ステロイドスルファターゼ(STS)として知られている。ARSA、ARSB、およびARSCの各々は、別個の天然の基質に作用するが、これら全てが、人工基質に対する「無差別な(promiscuous)」活性(すなわち、アリールスルファターゼ活性)を有する。ARSAおよびARSBは、それらの亜細胞局在化におけるリソソーム性であり、酸性の最適pHを有し、一方、ARSCは、ミクロソーム性であり、中性〜アルカリ性の最適pHを有する。リソソームスルファターゼとは異なり、STSは、分解経路ではなく、ステロイドホルモンの合成経路に関与する(Ballabioら、Steroid sulfatase deficiency and X−linked ichthyosis.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,Scriverら編(New York:McGraw−Hill)2999−3022,1995)。
【0004】
新たに同定された3つのスルファターゼファミリーメンバーである、ARSD、ARSEおよびARSFはまた、非リソソーム性であるようである。なぜなら、これらは、小胞体(ARSDおよびARSF)およびGolgiコンパートメント(ARSE)に局在されるからである。ARSEおよびARSFは、蛍光発生的な人工基質である4−MU基質に対して活性であることが示された(Francoら、Cell 81:15−25,1995;Pucaら、Genomics 1997(印刷中))。
【0005】
アリールスルファターゼE(ARSE)は、X連鎖劣性点状骨端形成異常(X−linked recessive chondrodysplasia punctata)、軟骨の障害および骨の発達に関与することが見出されている。用語「点状骨端形成異常(chondrodysplasia punctata)」とは、軟骨内性骨形成の領域における異常なカルシウム沈殿によって特徴付けられる骨格の形成異常の群をいう(Francoら、「A Cluster of Sulfatase Genes on Xp22.3:Mutations in Chondrodysplasia Punctata(CDPX) and Implications for Warfarin Embryopathy」Cell 81:15−25(1995年4月7日))。この異常性の結果から、特有の放射線学的所見が得られ、これは通常、骨端の「斑点」または「ペイントスパッタリングされた(paint−spattered)」カルシウム沈着と呼ばれる。これらのカルシウム沈着は、骨の発達が進行するにつれて、一生の最初の数年以内に消滅する傾向がある。罹患した個体は、重篤な鼻の形成不全、鼻梁の陥没、短い鼻中隔、および鼻翼とその先端部との間の深い溝によって特徴付けられる顔面の異形症を示す。これらはまた、低い身長および遠位指節骨形成不全を有する。
【0006】
スルファターゼによる硫酸エステル結合の加水分解に関与する酵素学的機構に対して、近年、高い注目が払われている。スルファターゼファミリーメンバーの1つの特有の局面は、これら全てが、おそらく小胞体において生じるであろう共通で特有の翻訳時修飾および翻訳後修飾を受けるようであり、この小胞体において、システイン残基が2−アミノ−3−オキソプロピオン酸またはセリンセミアルデヒドに転換されるということである(Schmidtら、Cell 82:271−278,1995)。この翻訳後修飾に関与する機構は、このシステイン残基を含有する保存的直鎖アミノ酸配列によってスルファターゼを認識することであると考えられる。システインのセリンセミアルデヒドへの転換は、触媒活性のために必要とされ、この転換における欠損症は、多発性スルファターゼ欠損症(MSD)(全てのスルファターゼ活性が同時に欠損する稀な疾患)を生じると考えられる(Kolodnyら、Metachromatic leukodystrophy and multiple sulfatase deficiency:sulfatide lipidosis.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases.Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2693−2741,1995)。ARSBの結晶構造の研究は、改変されたシステイン残基および金属イオンが、基質結合ポケットの塩基に位置されることを示している(Bondら、Structure 5:277−289,1997)。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0007】
(発明の要旨)
本発明は、新規スルファターゼファミリーメンバー(本明細書中で「MID9002」と呼ばれる)の発見に、一部基づく。MID9002をコードするcDNAのヌクレオチド配列は、配列番号1に示され、そしてMID9002ポリペプチドのアミノ酸は、配列番号2に示される。さらに、コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号3に示される。
【0008】
従って、1つの局面において、本発明は、MID9002タンパク質またはMID9002ポリペプチドをコードする核酸分子(例えば、MID9002タンパク質の生物学的に活性な部分)を特徴とする。好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。他の実施形態において、本発明は、配列番号1、配列番号3に示されるヌクレオチド配列またはATCC受託番号___で寄託されたプラスミドのDNA挿入物のヌクレオチド配列を有する、単離されたMID9002核酸分子を提供する。なお他の実施形態において、本発明は、配列番号1、配列番号3に示されるヌクレオチド配列またはATCC受託番号___で寄託されたプラスミドのDNA挿入物のヌクレオチド配列に実質的に同一な核酸分子(例えば、天然に存在する対立遺伝子改変体)を提供する。他の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1、配列番号3のヌクレオチド配列またはATCC受託番号___で寄託されたプラスミドのDNA挿入物のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子を提供し、ここで、この核酸分子は、全長MID9002タンパク質またはその活性なフラグメントをコードする。
【0009】
関連した局面において、本発明はさらに、本明細書中に記載されるMID9002核酸分子を含む核酸構築物を提供する。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、ネイティブの調節配列または異種調節配列に作動可能に連結される。本発明のMID9002核酸分子を含むベクターまたは宿主細胞(例えば、ポリペプチドを産生するのに適切な、ベクターおよび宿主細胞)もまた、含まれる。
【0010】
別の関連する局面において、本発明は、MID9002コード核酸の検出のためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして適切な核酸フラグメントを提供する。
【0011】
なお別の関連した局面において、核酸分子をコードするMID9002に対してアンチセンスである単離された核酸分子が、提供される。
【0012】
別の局面において、本発明は、例えば、スルファターゼ関連障害または他のMID9002関連障害の処置および診断に適用可能なアッセイにおける試薬または標的として有用な、MID9002ポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性なフラグメントまたは抗原性フラグメントを特徴とする。別の実施形態において、本発明は、MID9002活性を有するMID9002ポリペプチドを提供する。好ましいポリペプチドは、少なくとも1つのスルファターゼドメインを有するMID9002タンパク質であり、好ましくは、MID9002活性(例えば、本明細書中に記載されるようなMID9002活性)を有するMID9002タンパク質である。
【0013】
別の実施形態において、本発明は、以下を提供する:MID9002ポリペプチド(例えば、配列番号2に示されるアミノ酸配列またはATCC受託番号___で寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によってコードされるアミノ酸配列);配列番号2に示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列またはATCC受託番号___で寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によってコードされるアミノ酸配列;あるいは本明細書中に記載されるようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1もしくは配列番号3のヌクレオチド配列またはATCC受託番号___で寄託されたプラスミドの挿入物のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列(ここで、この核酸は、全長MID9002タンパク質またはその活性化フラグメントをコードする)を有するMID9002ポリペプチド。
【0014】
関連した局面において、本発明は、本明細書中に記載されるMID9002核酸分子を含む核酸構築物をさらに提供する。
【0015】
関連した局面において、本発明は、非MID9002ポリペプチドに作動可能に連結されて融合タンパク質を形成する、MID9002ポリペプチドまたはMID9002フラグメントを提供する。
【0016】
別の局面において、本発明は、MID9002ポリペプチドと反応するか、またはより好ましくは、MID9002ポリペプチドに特異的もしくは選択的に結合する、抗体およびその抗原結合フラグメントを特徴とする。
【0017】
別の局面において、本発明は、MID9002ポリペプチドまたはMID9002核酸の発現または活性を調節する化合物についてスクリーニングする方法を提供する。
【0018】
なお別の局面において、本発明は、例えば、本明細書中に記載され得るスクリーニングにおいて同定される化合物を使用して、MID9002ポリペプチドまたはMID9002核酸の発現または活性を調節するプロセスを提供する。特定の実施形態において、この方法は、MID9002ポリペプチドまたはMID9002核酸の異常な活性または発現に関連した状態(例えば、異常なまたは不十分なスルファターゼの機能または発現を含む状態または障害)の処置を包含する。このような障害の例としては、細胞増殖障害および/または細胞分化障害、骨代謝もしくは軟骨代謝に関連する障害または細胞外マトリクスに関連する障害が挙げられるがこれに限定されない。
【0019】
本発明はまた、生物学的サンプル中の、MID9002ポリペプチドまたはMID9002核酸分子の活性、あるいはMID9002ポリペプチドまたはMID9002核酸分子の存在または非存在を決定するためのアッセイ(疾患診断のためのアッセイを含む)を提供する。
【0020】
さらなる局面において、本発明は、MID9002ポリペプチドまたはMID9002核酸分子中の遺伝的変更の存在または非存在を決定するためのアッセイ(疾患診断のためのアッセイを含む)を提供する。
【0021】
別の局面において本発明は、複数のアドレスを有する二次元アレイを特徴とし、これら複数のアドレスの各アドレスは、位置的に互いに識別可能な複数のアドレスであり、そしてこれら複数のアドレスの各アドレスは、特有の捕捉プローブ(例えば、核酸配列またはペプチド配列)を有する。これら複数のアドレスのうちの少なくとも1つのアドレスは、MID9002分子を認識する捕捉プローブを有する。1つの実施形態において、この捕捉プローブは、核酸(例えば、MID9002核酸配列に相補的なプローブ)である。別の実施形態において、この捕捉プローブは、ポリペプチド(例えば、MID9002ポリペプチドに特異的な抗体)である。前述のアレイにサンプルを接触させてそのサンプルを分析し、そして、そのアレイに対するそのサンプルの結合を検出する方法もまた、特徴として挙げられる。
【0022】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から、明らかとなる。
【0023】
(発明の詳細な説明)
ヒトMID9002配列(図1a;配列番号1))これは、非翻訳領域を含む約1858ヌクレオチド長である)は、終止コドンを含む約1770ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列(図1a中の配列番号1;図1cの配列番号3のコーディングとして示されるヌクレオチド)を含む。このコード配列は、589アミノ酸のタンパク質(配列番号2)をコードする。配列番号2、図1dおよび図2のヒトMID9002タンパク質は、約31アミノ酸のアミノ末端疎水性アミノ酸配列(シグナル配列と一致する)(配列番号2のアミノ酸1〜アミノ酸およそ31,PSORT,NakaiおよびKanehisa(1992)Genomics 14:897〜911)、これは、切断に際して成熟タンパク質形態の生成を生じる)を含む。この成熟タンパク質形態(図1dに配列番号4として示される)は、長さ約558アミノ酸残基である(配列番号2のアミノ酸およそ32〜アミノ酸589)。
【0024】
ヒトMID9002は、以下の領域または他の構造特徴を含む(PFAM識別子、PSprefixドメイン識別番号およびPF prefixドメイン識別番号に関する一般的情報について、Sonnhammerら(1997)Protein 28:405〜420およびhttp://www.psc.edu/general/software/package/pfam/pfam.htmlを参照されたい):
配列番号2のアミノ酸残基およそ38〜520に位置するスルファターゼドメイン(PFAM登録番号PF00884);
配列番号2のアミノ酸残基およそ37〜589に位置するアリールスルファターゼドメイン(ProDom No.PD001700,PD006857,PD208511,PD002587,PD105119,PD345058,PD004614,PD335606,PD105130,PD013467,PD013468,PD016856);
配列番号2のアミノ酸およそ14〜30、227〜249、および291〜307にある3つの膜貫通ドメイン(MEMSAT,Jonesら(1994)Biochemistry 33:3038〜3049により推定される);
配列番号2のアミノ酸およそ137〜147(GYATGLIGKWH)に位置するスルファターゼサイン配列(Prosite PS00149);
配列番号2のアミノ酸およそ84〜96(SLCTPSRAAFLTG)に位置する別のスルファターゼサイン配列(Prosite PS00523);
配列番号2のアミノ酸およそ60〜62(TMR)、95〜97(TGR)および187〜189(SEK)に位置する3つのプロテインキナーゼCリン酸化部位(Prosite PS00005);
配列番号2のアミノ酸およそ154〜157(SASD)、260〜263(TTTE)、410〜413(SLMD)および448〜451(SDHE)に位置する4つのカゼインキナーゼIIリン酸化部位(Prosite PS00006);
配列番号2のアミノ酸およそ131〜138(KILKEKGY)に位置する1つのチロシンキナーゼリン酸化部位(Prosite PS00007);
配列番号2のアミノ酸およそ54〜59(GCYGNN)、73〜78(GVKLTQ)、103〜108(GMVSSI)、117〜122(GASGGL)、172〜177(GMPFSL)、341〜346(GLSNST)、356〜361(GSLENQ)、368〜373(GGWNGI)、381〜386(GGWEGG)、397〜402(GVLPAG)、および488〜493(GAGACY)に位置する11個のN−ミリストイル化部位(Prosite PS00008);
配列番号2のアミノ酸およそ493〜496(YGRK)に位置する1つのアミド部位(Prosite PS00009);ならびに
配列番号2のアミノ酸およそ58〜61(NNTM)、125〜128(NETT)、258〜261(NHTI)および344〜347(NSTL)に位置する4つのN−グリコシル化部位(Prosite PS00009)。
【0025】
ヒトMID9002をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドが、American Type Culture Collection(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110〜2209に、_付けで寄託され、受託番号_を与えられた。この寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って維持される。この寄託物は、当業者にとっての簡便性としてのみなされたものであり、35 U.S.C.§112の下で寄託物が必要とされることの承認ではない。
【0026】
このMID9002タンパク質は、そのスルファターゼファミリーのメンバーと共通する有意な数の構造特徴を含む。用語「ファミリー」は、本発明のタンパク質分子および核酸分子に言及する場合、共通の構造ドメインまたは構造モチーフを有しかつ本明細書中に規定される十分なアミノ酸配列ホモロジーもしくはヌクレオチド配列ホモロジーを有する、2つ以上のタンパク質分子または核酸分子を意味する。このようなファミリーのメンバーは、天然に存在しても天然に存在しなくてもよく、そして同じ種由来または異なる種由来のいずれであってもよい。例えば、ファミリーは、ヒト起源の第1タンパク質およびヒト起源の他の別個のタンパク質を含み得るか、あるいは、非ヒト起源(例えば、ラットタンパク質もしくはマウスタンパク質)のホモログを含み得る。ファミリーのメンバーはまた、共通の機能的特徴を有し得る。
【0027】
本明細書で使用されるように、用語「スルファターゼ」は、硫酸エステルの加水分解を触媒することが可能なタンパク質またはポリペプチドを含む。スルファターゼの基質は、複合体分子(例えば、グルコサミノグルカンおよびスルホリピド)から3β−ヒドロキシステロイドまでの範囲にわたる。スルファターゼは、細胞外マトリックスの分解において重要であると考えられる。アリールスルファターゼEをコードする遺伝子は、軟骨発達および骨発達の障害であるX連鎖劣性点状骨端形成異常(chondrodisplasia punctata)に関与することが示されている。スルファターゼ酵素はまた、少なくとも6つの他の遺伝障害に関連する。以前に記載されたヒトスルファターゼ(アリールスルファターゼA、アリールスルファターゼBおよびアリールスルファターゼC(ARSA、ARSB、ARSC))は、フェノール環(例えば、パラ−ニトロカテコールスルフェートまたは4−メチルウンベリフェリルスルフェート(4−MUスルフェート))を含む硫酸化された人工の基質を加水分解することが可能である。そのステロイドスルファターゼ(STS)を加水分解する能力のために、ARSCは、ステロイドスルファターゼとしてより具体的に知られる。ARSAおよびARSBは、それらの細胞下位置ではリソソームにあり、そして酸性pHの最適条件を有し、一方、ARSCは、ミクロソームであり、そして中性からアルカリpHの最適条件を有する。
【0028】
タンパク質のスルファターゼファミリーのメンバーは、代表的には、その細胞のリソソーム、ミクロソーム、小胞体、またはゴルジ体に関連する。スルファターゼの活性部位は、代表的には、セリンセミアルデヒドおよび金属(例えば、Ca2+)結合部位へ変換されるシステイン残基を有する。活性部位における改変されたシステイン残基(配列番号2に示されるMID9002のCys86)は、基質のスルフェートに共有結合で結合し得、従って、中間体の酵素−スルフェート複合体を形成する。スルファターゼファミリーのメンバーは、タンパク質全長、特にアミノ末端領域に沿って高い割合でアミノ酸類似性を示す。
【0029】
ヒトアリールスルファターゼE前駆体とのMID9002タンパク質の整列は、図5に示されており、そして、2つの配列間で約100%の配列同一性を示す(blosum62.iijマトリックスからmatblasにおいて計算される)。ヒトアリールスルファターゼファミリーメンバー(アリールスルファターゼDおよびアリールスルファターゼF)とのMID9002タンパク質の整列はまた、種々のスルファターゼファミリーメンバー間で、かなりの相同性(67〜74%の配列同一性)を示す。
【0030】
MID9002ポリペプチドは、「スルファターゼドメイン」または「スルファターゼドメイン」と相同性のある領域を含み得る。MID9002ポリペプチドは、「触媒ドメイン」と相同性のあるタンパク質または領域の酵素活性の原因である「触媒ドメイン」をさらに含み得る。
【0031】
本明細書で使用されるように、用語「スルファターゼドメイン」は、約38〜520個のアミノ酸残基長のアミノ酸配列を含み、そして、少なくとも500個、600個、または好ましくは700個のスルファターゼドメイン(HMM)に対する配列の整列についてビットスコア(bit score)を有する。好ましくは、スルファターゼドメインは、硫酸エステルの加水分解を触媒する。好ましくは、スルファターゼドメインは、少なくとも約100〜700個のアミノ酸、より好ましくは、約200〜600個のアミノ酸残基、または約400〜600個のアミノ酸を含み、そして、少なくとも500個,600個,700個,750個,775個,790個、またはそれより多いスルファターゼドメイン(HMM)に対する配列の整列についてビットスコアを有する。「スルファターゼドメイン」はまた、本明細書に記載される特性配列SLCTPSRAAFLTG、[SAP]−[LIVMST]−[CS]−[STAC]−P−[STA]−R−x(2)−[LIVMFW](2)−[TAR]−G、GYATGLIGKWH、またはG−[YV]−x−[ST]−x(2)−[IVAS]−G−K−x(0,1)−[FYWMK]−[HL]の少なくとも1つに対して、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性のスルファターゼ特性配列を含み得る。「スルファターゼドメイン」はまた、システイン残基またはセリンセミアルデヒド(2−アミノ−3−オキソプロピオン酸)に変換されるシステイン残基を含み得る。「スルファターゼドメイン」はまた、金属イオン(Ca2+)結合部位を含み得る。「スルファターゼドメイン」は、スルフェート基質、好ましくはアリールスルフェート基質に結合および/またはその加水分解を触媒する能力を有し得る。
【0032】
スルファターゼドメインは、Prositeスルファターゼ特性配列PS00149、G−[YV]−x−[ST]−x(2)−[IVAS]−G−K−x(0,1)−[FYWMK]−[HL]、またはそれらに対して相同性のある配列を含み得る。スルファターゼドメインはまた、別のPrositeスルファターゼ特性配列PS00523、[SAP]−[LIVMST]−[CS]−[STAC]−P−[STA]−R−x(2)−[LIVMFW](2)−[TAR]−G、またはそれらに対して相同性のある配列を含み得る。本明細書に記載される上記の保存された特性配列、および他のモチーフまたは特性配列において、アミノ酸についての標準的なIUPACの1文字記号が使用される。パターンにおける各要素は、ダッシュ(−)によって分離され;大括弧([ ])は、その位置で受容される特定の残基を示し;xは、任意の残基が、その位置で受容されることを示し;そして、丸括弧(( ))内の数字は、付随するアミノ酸によって代表される残基数を示す。Prosite PS00149スルファターゼ特性配列は、ヒトMID9002ポリペプチドのスルファターゼドメインに位置し、そして、配列番号2のアミノ酸約137〜147(GYATGLIGKWH)に対応する。Prosite PS00523スルファターゼ特性配列はまた、ヒトMID9002ポリペプチドのスルファターゼドメインに位置し、そして、配列番号2のアミノ酸約84〜96(SLCTPSRAAFLTG)に対応する。スルファターゼドメイン(HMM)は、PFAM受託番号PF00884を割り当てられた(http;//genome.wustl.edu/Pfam/.html)。本明細書で使用されるように、「スルファターゼドメイン」は、次のProDomファミリー「アリールスルファターゼ」ドメイン(ProDomain Release 2001.1;http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html、図4a〜4g)の各々または両方に対して、相同性(例えば、少なくとも約69%、70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%、または84%の同一性)のあるヒトMID9002タンパク質の一部である。BLASTサーチモデルより誘導される、PD001700、配列番号XとのヒトMID9002のスルファターゼドメイン(配列番号2のアミノ酸37〜181)の整列は、73%の同一性を示す(blosum62マトリックスからProdomainにおいて計算される、図4a〜4g)。隠されたMrkovモデルから誘導される、Pfamスルファターゼコンセンサスアミノ酸配列(配列番号X)とのヒトMID9002のスルファターゼドメイン(配列番号2のアミノ酸38〜520)の整列が、図3に示される。
【0033】
好ましい実施形態において、MIDポリペプチドまたはタンパク質は、「スルファターゼドメイン」または少なくとも約100〜700個、より好ましくは300〜600個あるいは400〜600個のアミノ酸残基を含み、そして「スルファターゼドメイン」(例えば、ヒトMID9002のスルファターゼドメイン(例えば、配列番号2の残基38〜520))に対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%の相同性を有する領域を有する。
【0034】
MID9002タンパク質配列における「スルファターゼ」ドメインの存在を同定し、そして目的のポリペプチドまたはタンパク質が特定のプロフィールを有することを決定するために、タンパク質のアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを使用し、HMM(例えば、the Pfam database,release2.1)のPfamデータベースに対して検索され得る(http://sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search)。例えば、検索プログラムのHMMERパッケージの一部として入手可能なhmmsfプログラムは、MILPAT0063についてのファミリー特異的な初期プログラムであり、そして15のスコアは、ヒットを決定するためのデフォルト閾値スコアである。あるいは、ヒットを決定するための閾値スコアは、下げられ得る(例えば、8ビットまで)。Pfamデータベースの説明は、Sonhammerら((1997)Proteins 28:405〜420)において見出され得、そしてHMMの詳細な説明は、例えば、以下の文献:Gribskovら(1990)Meth.Enzymol.183:146〜159;Gribskovら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4335〜4358;Kroghら(1994)J.Mol.Biol.235:1501〜1531;およびStultzら(1993)Protein Sci.2:305〜314、において見出され得、その内容は、本明細書で参考として援用される。検索は、HMMデータベースに対して実行され、その結果、配列番号2の残基約38〜520で、ヒトMID9002のアミノ酸配列における「スルファターゼドメイン」ドメインが同定された(図1bを参照のこと)。
【0035】
MID9002タンパク質配列における「スルファターゼ」ドメインの存在を同定し、そして目的のポリペプチドまたはタンパク質が特定のプロフィールを有することを決定するために、タンパク質のアミノ酸配列は、ドメインのデータベース(例えば、ProDomデータベース(Corpetら(1999),Nucl.Acids Res.27:263〜267)に対して検索され得る。ProDomタンパク質ドメインデータベースは、相同性ドメインの自動編集(automatic compilation)からなる。ProDomの現在のバージョンは、SWISSPROT 38およびTREMBLタンパク質データベースの反復的なPSI−BLAST検索(Altschulら(1997)Nucleic Acids Res.25:3389〜3402;Gouzyら(1999)Computers and Chemistry 23:333〜340)を使用して構築される。データベースは、各ドメインに対するコンセンサス配列を自動的に生成する。BLAST検索は、HMMデータベースに対して実行され、その結果、配列番号2の残基約37〜589で、ヒトMID9002のアミノ酸配列における「スルファターゼ」ドメインが同定された(図1bを参照のこと)。
【0036】
MID9002ポリペプチドは、少なくとも1つの、好ましくは2つの「膜貫通ドメイン」または「膜貫通ドメイン」と相同性のある領域を含み得る。本明細書で使用されるように、用語「膜貫通ドメイン」は、約10〜40個のアミノ酸残基長のアミノ酸配列を含み、そして原形質膜に広がる。膜貫通ドメインは、疎水性残基が豊富であり、例えば、膜通過ドメインの少なくとも50%、60%、70%,80%、90%、95%またはそれより多いアミノ酸は、疎水性(例えば、ロイシン、イソロイシン、チロシン、またはトリプトファン)である。膜貫通ドメインは、代表的には、α−ヘリックス構造を有し、例えば、Zagottaら,(1996)Annual Rev.Neurosci.19:235〜263、に記載されており、その内容は、本明細書で参考として援用される。ヒトMID9002の膜貫通ドメインは、配列番号2のおよそ残基227〜249およびおよそ残基291〜307に位置する。
【0037】
好ましい実施形態において、MID9002ポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも1つ、好ましくは2つの「膜貫通ドメイン」または少なくとも約12〜35個、より好ましくは約14〜30個または15〜25個のアミノ酸残基を含む領域を有し、そして「膜貫通ドメイン」(例えば、ヒトMID9002の膜貫通ドメイン(例えば、配列番号2の残基227〜249および残基291〜307))と、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%の相同性を有する。ヒトMID9002の膜貫通ドメインは、ヒドロパシートレースが、大部分は水平線より上である約15〜25個のアミノ酸の領域として、ヒドロパシープロット(図2)において可視化される。
【0038】
MID9002タンパク質配列における「膜貫通」ドメインの存在を同定し、そして目的のポリペプチドまたはタンパク質が特定のプロフィールを有することを決定するために、タンパク質のアミノ酸配列は、トポロジーモデル(MEMSAT,Jonesら,(1994)Biochemistry 33:3038〜3049)の認識に基づいて、内在性膜タンパク質の2次構造およびトポロジーを予測する膜通過予測によって分析され得る。
【0039】
MID9002ポリペプチドは、少なくとも1つ、2つ、好ましくは3つの「非膜貫通領域」を含み得る。本明細書で使用されるように、用語「非膜貫通領域」は、膜貫通領域として同定されないアミノ酸配列を含む。MID9002における非膜貫通領域は、配列番号2のおよそアミノ酸1〜227、アミノ酸249〜291、およびアミノ酸307〜589に位置する。非膜貫通領域は、細胞外、細胞質、または管腔であり得る。3ドメインモデルは、スルファターゼファミリーのメンバーについて提唱されている。2つの管腔に配向したドメインは、逆の方向で2回膜にまたがる疎水性ドメインによって分離される。管腔配向ドメインは、グリコシル化され得る。
【0040】
MID9002の非膜貫通領域は、少なくとも1つ、好ましくは2つの管腔領域を含む。N末端に位置される場合、管腔領域は、本明細書では「N末端管腔ドメイン」として参照される。本明細書で使用されるように、「N末端管腔領域」は、約1〜300個、好ましくは約1〜250個、より好ましくは約1〜225個、またはさらにより好ましくは約1〜200個のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を含み、細胞オルガネラ(例えば、小胞体またはゴルジ体)の管腔の内側に位置する。「N末端管腔ドメイン」のC末端アミノ酸残基は、MID9002タンパク質における膜貫通ドメインのN末端アミノ酸残基に隣接する。例えば、N末端管腔ドメインは、配列番号2のおよそアミノ酸残基1〜227に位置する。
【0041】
好ましい実施形態において、MID9002ポリペプチドまたはタンパク質は、N末端管腔ドメインまたは約1〜300個、好ましくは約1〜250個、およびより好ましくは約1〜200個のアミノ酸残基を含む領域を有し、そして、「N末端管腔ドメイン」(例えば、ヒトMID9002のN末端管腔ドメイン(例えば、配列番号2の残基1〜227))と、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%の相同性を有する。
【0042】
別の実施形態において、MID9002細胞質領域は、少なくとも1つのループを含む。本明細書で使用されるように、用語「ループ」は、リン脂質膜内に含まれないアミノ酸配列を含み、少なくとも約4、好ましくは約5〜50、より好ましくは約6〜45のアミノ酸残基長を有し、そしてタンパク質またはポリペプチド内の2つの膜貫通ドメインと繋がるアミノ酸配列を有する。従って、ループのN末端アミノ酸は、MID9002分子における膜貫通ドメインのC末端アミノ酸に隣接し、そしてループのC末端アミノ酸は、MID9002分子における膜貫通ドメインのN末端アミノ酸に隣接する。本明細書で使用されるように、「ループ」は、細胞のオルガネラの管腔の外側に位置するループまたは細胞の細胞質内のループを含む。例えば、「ループ」は、配列番号2のおよそアミノ酸残基249〜291で見出され得る。
【0043】
好ましい実施形態において、MID9002ポリペプチドまたはタンパク質は、ループまたは少なくとも約4個、好ましくは約5〜50個、およびより好ましくは約6〜45個のアミノ酸残基を含む領域を有し、そして、「ループ」(例えば、ヒトMID9002のループ(例えば、配列番号2の残基249〜291))と、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%の相同性を有する。
【0044】
別の実施形態において、MID9002タンパク質の管腔領域は、C末端を含み得、そして「C末端管腔ドメイン」であり得、また本明細書で「C末端管腔尾部」として参照され得る。本明細書で使用されるように、「C末端管腔ドメイン」は、少なくとも約100、好ましくは約200〜400、より好ましくは約250〜300のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を含み、細胞のオルガネラの管腔の内側に位置する。「C末端管腔ドメイン」のN末端アミノ酸残基は、MID9002タンパク質における膜貫通ドメインのC末端アミノ酸残基に隣接する。例えば、C末端管腔ドメインは、配列番号2のおよそアミノ酸残基307〜589に位置する。
【0045】
好ましい実施形態において、MID9002ポリペプチドまたはタンパク質は、C末端管腔ドメインまたは少なくとも約100、好ましくは約200〜400、そしてより好ましくは約250〜300のアミノ酸残基を含む領域を有し、そして「C末端管腔ドメイン」(例えば、ヒトMID9002のC末端管腔ドメイン(例えば、配列番号2の残基307〜589))と、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%の相同性を有する。
【0046】
ヒトMID9002タンパク質は、スルファターゼ特性配列(例えば、Prosite PS00149およびPS00523)をさらに含み得る。例えば、スルファターゼ特性配列は、配列番号2のおよそアミノ酸残基137〜147および84〜96に位置する。好ましい実施形態において、MID9002ポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも約5、好ましくは約5〜20、そしてより好ましくは約8〜15のアミノ酸残基を含むスルファターゼ特性配列を有し、そしてスルファターゼ特性配列(例えば、ヒトMID9002のスルファターゼ特性配列(例えば、配列番号2の残基137〜147および84〜96))と、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%の相同性を有する。
【0047】
MID9002ファミリーメンバーは、少なくとも1つのスルファターゼドメインを含み得;そして、少なくとも1つ、好ましくは2つの膜貫通ドメインを含み得る。MID9002ファミリーメンバーは、少なくとも1つのスルファターゼ特性配列(Prosite PS00149およびPS00523)を含み得る。さらに、MID9002ファミリーメンバーは、以下を含み得る:少なくとも1つ、2つ、好ましくは3つのプロテインキナーゼCリン酸化部位(Prosite PS00005);少なくとも1つ、2つ、3つ、好ましくは4つのカゼインキナーゼIIリン酸化部位(Prosite PS00006);少なくとも1つ、2つ、3つ、好ましくは4つのN−グリコシル化部位(Prosite PS00001);少なくとも1つチロシンキナーゼリン酸化部位(Prosite PS00007);少なくとも1つのアミド化部位(Prosite PS00009);および少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、および好ましくは11のN−ミリストイル化部位(Prosite PS00008)。
【0048】
本発明のMID9002ポリペプチドが、MID9002媒介活性を調節し得るので、以下に記載されるように、それらは、スルファターゼ関連障害または他のMID9002関連障害のための新規な診断薬および治療薬を開発するために有用であり得る。
【0049】
本明細書で使用されるように、「スルファターゼ関連活性」は、硫酸エステルの加水分解の触媒に関連する活性を含む。「スルファターゼ関連活性」は、細胞外マトリックス(ECM)の成分の分解に関連し得る。スルファターゼファミリーのメンバーは、X連鎖の劣性点状骨端形成異常、骨軟骨異形成症、および末節骨短縮性小人症疾患において役割を果たし得る(Malouら、Arch.Pediatr.8(2):176〜180,2001年2月;Sabarirayan Pediatr.Radiol.29(5):322,1999年5月;Sheffieldら、J.Med.Genet.35(12):1004〜1008,1998年12月;Danieleら Am.J.Hum.Genet.62(3):562〜572,1998年3月;PrentiらAm.J.Med.Genet.73(2):139〜143,1997年12月;Francoら Cell 81(1):15〜25,1995年4月7日;Baitnerら J.Pediatr.Orthop.20(5):594〜605,2000年9月〜10月;Horton Eur.J.Hum.Genet.3(6):357〜373,1995年;Seidelら Clin.Genet.59(2):115〜121,2001年2月)。
【0050】
本明細書で使用されるように、「MID9002活性」、「MID9002の生物学的活性」または「MID9002の機能的活性」は、インビボまたはインビトロで決定されるような、例えば、MID9002応答性細胞に対して、またはMID9002基質(例えば、タンパク質、生体分子、低分子、炭水化物基質)に対してMID9002タンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子によって発揮される活性をいう。1つの実施形態において、MID9002活性は、MID9002標的分子との会合のような直接的な活性である。「標的分子」または「結合パートナー」は、MID9002タンパク質が結合するか、または自然に相互作用する分子である。例示的な実施形態において、MID9002は、スルファターゼ(例えば、アリールスルファターゼファミリーメンバー)であり、従って、それは、基質、好ましくは硫酸エステル部分を含む生体分子と自然に結合および相互作用し、そして硫酸エステル結合の加水分解を触媒する。
【0051】
MID9002活性はまた、間接的な活性(例えば、MID9002レセプターとのMID9002タンパク質の相互作用によって媒介される細胞シグナル伝達活性)であり得る。上記の配列構造および公知の機能的分子との類似性に基づき、本発明のMID9002分子は、スルファターゼファミリーメンバーのと類似の生物学的活性を有し得る。例えば、本発明のMID9002タンパク質は、1以上の以下の活性を有し得る:(1)硫酸エステル(例えば、アリール硫酸エステル)の加水分解を触媒する能力;(2)細胞外マトリックスを分解する能力;(3)硫酸エステルを含む化学化合物と結合する能力;(4)骨および/または軟骨の代謝/形成/破壊に作用する能力;および(5)癌の進行(例えば、浸潤、転移)に作用する能力。
【0052】
本発明のMID9002分子は、それらが発現される組織における細胞の活性を調節し得る。例えば、MID9002mRNAは、腎臓、膵臓、背根神経節、結腸、および肝臓において発現される。従って、本発明のMID9002分子は、腎臓障害、膵臓障害、肝臓障害、神経学的障害、胃腸障害、または結腸障害のための治療薬または診断薬として作用し得る。
【0053】
MID9002mRNAが、結腸、肝臓、腎臓、および膵臓において発現されるので、MID9002分子は、結腸、胃腸系、および腎臓の増殖性障害および/または分化性障害を処置するために使用され得る。細胞増殖性障害および/または分化性障害の例としては、癌(例えば、癌腫、肉腫、転移性障害または造血性新生物性障害(例えば、白血病))が挙げられる。転移性腫瘍は、多数の原発性腫瘍型(前立腺、結腸、肺、乳房、および肝臓起源の原発性腫瘍を含むが、これらに限定されない)から生じ得る。
【0054】
本明細書において使用されるように、用語「癌」(また、用語「過剰増殖性」および「新生物性」と相互変換可能で使用される)は、自立的増殖(すなわち、急速に増殖する細胞増殖によって特徴付けられる異常な状態または状況)の能力を有する細胞をいう。癌性疾患状態は、病理学的な(すなわち、疾患状態を特徴付けるか、または構成する)、例えば、悪性腫瘍増殖として分類され得、あるいは、正常であるが疾患状態に関連しない逸脱(例えば、創傷修復に関連する細胞増殖として分類され得る。用語は、組織病理学型または浸潤の段階に関わりなく、全ての型の癌性増殖または腫瘍形成プロセス、転移性組織または悪性に変換された細胞、組織、あるいは器官を含むことを意味する。用語「癌」は、種々の器官系の悪性疾患(例えば、肺、乳房、甲状腺、リンパ球、胃腸、および尿生殖器系に影響を及ぼす悪性疾患、ならびに大部分の大腸癌のような悪性疾患)を含む腺癌、腎細胞癌、前立腺癌および/または精巣癌、肺の非小細胞癌、小腸癌ならびに食道癌を含む。用語「癌腫(癌)(carcinoma)」は、当該分野で認識され、そして上皮組織または内分泌組織の悪性疾患(呼吸器系癌、胃腸系癌、尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、および黒色腫を含む)をいう。例示的な癌としては、頸部、肺、前立腺、乳房、頭部および頸部、結腸ならびに卵巣の組織から形成される癌が挙げられる。用語「癌(carcinoma)」はまた、例えば、癌性組織および肉腫性組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫を含む。「腺癌」は、腺組織由来の癌、または腫瘍細胞が、認識可能な腺構造体を形成する癌をいう。用語「肉腫」は、当該分野で認識され、間葉起源の悪性腫瘍をいう。
【0055】
本発明のMID9002分子は、種々の増殖性障害をモニター、処置および/または診断するために使用され得る。このような障害としては、造血性新形成障害が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「造血性新形成障害」は、例えば、骨髄系統、リンパ系統もしくは赤血球系統、またはこれらの前駆細胞から生じる、造血起源の過形成/腫瘍性細胞を含む疾患を含む。好ましくは、これらの疾患は、ほとんど分化していない急性白血病(例えば、赤芽球白血病および急性巨核芽球白血病)から生じる。さらなる代表的な骨髄障害としては、急性前骨髄性白血病(APML)、急性骨髄性白血病(AML)、および慢性骨髄性白血病(CML)(Vaickus,(1991)Crit Rev.Oncol./Hemotol.11:267−97において概説されている)が挙げられるがこれらに限定されない;リンパ性悪性疾患としては、急性リンパ芽球性白血病(ALL)(B系統ALLおよびT系統ALLを含む)、慢性リンパ性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(PLL)、ヘアリー細胞白血病(HLL)、およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症(WM)が挙げられるがこれらに限定されない。悪性リンパ腫のさらなる形態としては、非ホジキンリンパ腫およびその改変体、末梢性T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫瘍(ATL)、癌性T細胞リンパ腫(CTCL)、大顆粒性リンパ性白血病(LGF)、ホジキン病、およびリード−スターンバーグ病が挙げられるがこれらに限定されない。
【0056】
従って、MID9002分子は、1つ以上の増殖性および/または分化性障害あるいは他のスルファターゼ障害を制御するための新規な診断標的および治療剤として作用し得る。本明細書中で使用される場合、「スルファターゼ障害」は、その病因が異常なスルファターゼタンパク質機能もしくは発現または欠損性のスルファターゼタンパク質機能もしくは発現によって引き起こされるか、これらに関連するか、あるいはこれらに付随する疾患または障害である。このような障害(例えば、スルファターゼ関連障害または他のMID9002関連障害)の例としては、細胞増殖性障害および/または分化性障害(例えば、線腫、腺癌)、骨代謝に関連する障害、免疫(例えば、炎症)障害、心血管障害、内皮細胞障害、肝臓障害、ウイルス疾患、疼痛または代謝障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【0057】
MID9002分子は、一部、胃腸新生物障害(例えば、線腫、腺癌)を処置するために使用され得る。なぜなら、スルファターゼファミリーのメンバーは、結腸、肝臓、および膵臓において見出されるからである。
【0058】
細胞増殖性障害および/または細胞分化性障害の例としては、癌(例えば、癌腫、肉腫、転移性障害、または造血新生物障害(例えば、白血病)が挙げられる。転移性の腫瘍は、多数の原発性腫瘍型(前立腺起源、結腸起源、肺起源、乳房起源、および肝臓起源の原発性腫瘍型が挙げられるがこれらに限定されない)から生じ得る。
【0059】
本明細書中で使用される場合、用語「癌」(用語「過剰増殖」および「新形成」と互換可能にも使用される)とは、自律増殖能力を有する細胞(すなわち、迅速に増殖する細胞増殖により特徴付けられる異常な状態または状況)を指す。癌性疾患状態は、病的と分類され得る(すなわち、疾患状態(例えば、悪性腫瘍増殖)を特徴付けるかまたは構成する)か、あるいは、非病的と分類され得る(すなわち、正常ではないが疾患状態と関連はない(例えば、創傷修復と関連する細胞増殖))。この用語は、すべての型の癌性増殖または癌原性プロセス、転移性組織または悪性形質転換細胞、悪性形質転換組織、あるいは悪性形質転換器官(組織病理型にも侵襲性の段階にも関わらない)を包含することを意味する。用語「癌」は、種々の器官系の悪性疾患(例えば、肺を冒す悪性疾患、乳房を冒す悪性疾患、甲状腺を冒す悪性疾患、リンパ腺を冒す悪性疾患、胃腸管を冒す悪性疾患および尿生殖器管を冒す悪性疾患、ならびに腺癌(ほとんどの結腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および/または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌および食道の癌のような悪性疾患を包含する)を包含する。用語「癌腫」は、当該分野で認識されており、そしてこの用語は、上皮組織もしくは内分泌組織の悪性疾患(呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、および黒色腫を包含する)を指す。例示的癌腫としては、子宮頸部組織から形成する癌腫、肺組織から形成する癌腫、前立腺組織から形成する癌腫、乳房組織から形成する癌腫、頭部および頸部の組織から形成する癌腫、結腸組織から形成する癌腫、ならびに卵巣組織から形成する癌腫が挙げられる。用語「癌腫」はまた、例えば、癌性組織および肉腫性組織から構成される悪性腫瘍を含む、癌肉腫を包含する。「腺癌」とは、腺組織に由来する癌腫、または認識可能な腺構造をその腫瘍細胞が形成する癌腫をさす。用語「肉腫」は当該分野で認識されており、この用語は、間葉由来物の悪性腫瘍を指す。
【0060】
本発明のMID9002分子は、種々の増殖障害をモニター、処置および/または診断するために使用され得る。そのような障害としては、造血性新形成障害が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「造血性新形成障害」は、造血起源の(例えば、骨髄系列、リンパ系列、もしくは赤血球系列、またはそれらの前駆細胞から生じる)過形成細胞/新形成細胞を含む疾患を包含する。好ましくは、この疾患は、ほとんど分化していない急性白血病(例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病)から生じる。さらなる例示的骨髄性障害としては、急性前骨髄球性白血病(APML)、急性骨髄性白血病(AML)および慢性骨髄性白血病(CML)(Vaickus(1991)Crit Rev.in Oncol./Hemotol.11.267〜97に概説される)が挙げられるが、これらに限定されない;リンパ球性悪性疾患としては、急性リンパ芽球性白血病(ALL)(B系列ALLおよびT系列ALLを包含する)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(PLL)、毛様細胞白血病(HLL)、およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症(WM)が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる悪性リンパ腫形態としては、非ホジキンリンパ腫およびその改変体、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、大型顆粒リンパ球白血病(LGF)、ホジキン病、およびリード−スターンバーグ病が挙げられるが、これらに限定されない。
【0061】
MID9002分子の異常な発現および/または異常な活性は、骨代謝に関係する障害を媒介し得る。「骨代謝」とは、骨構造の形成または変性(例えば、骨形成、骨再吸収など)における、血清中のカルシウム濃度およびリン酸濃度に最終的に影響し得る、直接的効果または間接的効果を指す。この用語はまた、骨細胞(例えば、破骨細胞および骨芽細胞)においてMID9002分子により媒介され、その後骨形成および骨変性を生じ得る、活性を包含する。例えば、MID9002分子は、骨再吸収破骨細胞の種々の活性(例えば、単球および単核食細胞から破骨細胞への分化の刺激)を支持し得る。従って、骨細胞の産生を調節するMID9002分子は、骨形成および骨変性に影響し得、従って骨障害を処置するために使用され得る。このような障害の例としては、骨粗鬆症、骨形成異常、骨軟化症、くる病、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常、骨硬化、鎮痙処置、骨減少症、不完全骨線維形成(fibrogenesis−imperfecta ossium)、続発性副甲状腺機能亢進、副甲状腺機能低下、上皮小体機能亢進、肝硬変、閉塞性黄疸、薬物誘発性代謝、髄様癌、慢性腎疾患、くる病、サルコイドーシス、グルココルチコイド拮抗、吸収不良症候群、脂肪便、熱帯性スプルー、特発性高カルシウム血症、および授乳熱が挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
本発明のMID9002核酸およびタンパク質は、種々の免疫(例えば、炎症(例えば、呼吸器炎症))障害を処置および/または診断するために使用され得る。免疫障害または免疫疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:自己免疫疾患(例えば、真性糖尿病、関節炎(慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む)、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎(アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む)、乾癬、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患(例えば、クローン病および潰瘍性大腸結腸)、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーヴズ病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎および間質性肺線維症が挙げられる)、対宿主移植片病、移植の症例、およびアレルギー(例えば、アトピー)。
【0063】
本明細書中で用いられる場合、心臓に関する障害、すなわち、「心血管疾患」または「心血管障害」は、心血管系(例えば、心臓、血管、および/または血液)に影響を与える、疾患または障害を包含する。心血管障害は、動脈圧力における不均等、心臓の機能不全、または(例えば、血栓による)血管の閉塞によって引き起こされ得る。心血管障害としては、例えば、以下のような障害が挙げられるがこれらに限定されない:動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心肥大、虚血再灌流障害、再狭窄、動脈炎症、血管壁再形成、心室再形成、迅速心室ペーシング、冠状微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧力過剰負荷、大動脈屈曲、冠状動脈結紮、脈管心臓病、弁の疾患(カルシウム沈着によって引き起こされる弁の変性、リウマチ性心疾患、心内膜炎、または人工弁の合併症が挙げられるがこれらに限定されない);心房性細動、長QT症候群(long−QT syndrome)、うっ血性心不全、洞房結節機能不全(sinus node dysfunction)、アンギナ、心不全、高血圧、心房性細動、心房粗動、心膜疾患(心内膜液浸出および心膜炎が挙げられるがこれらに限定されない);心筋症(例えば、拡張型心筋症または特発性心筋症)、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣、虚血性疾患、不整脈、突然の心臓死、および心血管発達障害(例えば、動静脈先天異常、動静脈瘻、レーノー症候群、神経性胸郭出口症候群、カウザルギー/反射性交感神経性ジストロフィー、血管腫、動脈瘤、海綿状様血管腫、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症、房室管、大動脈の縮窄、エブスタイン奇形、左心室発育不全症候群、大動脈弓の中断、僧帽弁逸脱、動脈管、開存性卵円孔、部分肺静脈還流異常(partial anomalous pulmonary venous return)、心室中隔欠損を伴う肺動脈弁閉鎖、心室中隔欠損を伴わない肺動脈弁閉鎖、胎児循環の存続、肺動脈弁狭窄、単心室、総肺静脈還流異常、大血管転位、三尖弁閉鎖、総動脈幹、心室中隔欠損)。心血管疾患または心血管障害はまた、内皮細胞障害を包含し得る。
【0064】
本明細書中で使用される場合、「内皮細胞障害」とは、異常な内皮細胞活性、調節されていない内皮細胞活性、または望ましくない内皮細胞活性(例えば、増殖、移動、新脈管形成、または血管新生)により特徴付けられる障害;あるいは細胞表面接着分子の異常な発現または新脈管形成に関連する遺伝子(例えば、TIE−2、FLTおよびFLK)の異常な発現により特徴付けられる障害を包含する。内皮細胞障害としては、腫瘍形成、腫瘍転移、乾癬、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、グレーヴズ病、虚血性疾患(例えば、アテローム性動脈硬化症)、および慢性炎症疾患(例えば、慢性関節リウマチ)が挙げられる。
【0065】
本明細書中に記載される方法により処置または診断され得る障害としては、肝臓における線維組織の蓄積に関係する障害(例えば、既存の線維の崩壊および変性を伴う細胞外マトリックスの生成と分解との間の不均衡から生じる障害)が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載される方法は、広範な種類の因子(ホメオスタシスを乱すプロセス(例えば、炎症性プロセス)、毒性傷害から生じる組織損傷または肝血流の変化から生じる組織損傷、ならびに感染(例えば、細菌感染、ウイルス感染、および寄生生物感染)を含む)により誘導される肝細胞壊死または肝細胞傷害を診断または処置するために使用され得る。例えば、この方法は、肝傷害(例えば、門脈圧亢進または肝線維症)の早期検出のために使用され得る。さらに、この方法は、先天性代謝異常に起因する肝線維症(例えば、貯蔵障害(例えば、ゴシェ病(脂質異常)、またはグリコーゲン貯蔵病、A1−抗トリプシン欠損)から生じる線維症);外因性物質の蓄積(例えば、貯蔵)を媒介する障害(例えば、ヘモクロマトーシス(鉄過剰負荷症候群)および銅貯蔵病(ウィルソン病))、毒性代謝産物の蓄積を生じる障害(例えば、チロシン血症、果糖血症、およびガラクトース血症)、ならびにペルオキシソーム障害(例えば、ツェルヴェーガー症候群)を検出するために使用され得る。さらに、本明細書中に記載される方法は、種々の化学物質または薬物(例えば、メトトレキサート、イソニアジド(isonizaid)、オキシフェニサチン、メチルドパ、クロロプロマジン、トルブタミドまたはアルコール)の投与と関連する肝傷害、または脈管障害の肝徴候(例えば、肝臓内胆汁流もしくは肝臓外胆汁流のいずれかの閉塞、または例えば、慢性心不全、静脈閉塞疾患、門脈血栓症もしくはバッド−キアーリ症候群から生じる肝臓循環の変化)を示す肝傷害の早期検出および処置のために使用され得る。
【0066】
さらに、MID9002分子は、特定のウイルス疾患(B型肝炎、C型肝炎、および単純ヘルペスウイルス(HSV)が挙げられるが、これらに限定されない)の病因において重要な役割を果たし得る。MID9002活性の調節因子は、ウイルス疾患を制御するために使用され得る。この調節因子は、ウイルス感染組織またはウイルス関連組織の線維症(特に、肝臓および肝臓線維症)の処置および/または診断において使用され得る。また、MID9002調節因子は、ウイルス関連癌腫(特に、肝細胞癌)の処置および/または診断において使用され得る。
【0067】
さらに、MID9002は、代謝の調節または疼痛障害において重要な役割を果たし得る。代謝不均衡の疾患としては、肥満、神経性食欲不振、悪液質、脂質障害、および糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。疼痛障害の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:種々の形態の組織損傷(例えば、炎症、感染および虚血)の間に誘発される疼痛応答(通常、痛覚過敏と称される)(例えば、Fields(1987)Pain,New York:McGraw−Hillに記載される);筋骨格障害に関連する疼痛(例えば、関節痛);歯痛;頭痛;手術に関連する疼痛;過敏性腸症候群に関連する疼痛;または胸部痛。
【0068】
MID9002タンパク質、そのフラグメント、および誘導体、ならびにその配列番号2の配列の他の改変体は、集合的に、「本発明のポリペプチドまたはタンパク質」あるいは「MID9002ポリペプチドまたはMID9002タンパク質」という。このようなポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸分子は、集合的に、「本発明の核酸」または「MID9002核酸」という。
【0069】
本明細書中で使用する場合、用語「核酸分子」は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)、およびRNA分子(例えば、mRNA)、ならびに例えば、ヌクレオチドアナログの使用によって生成される、DNAまたはRNAのアナログを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖DNAである。
【0070】
用語「単離された核酸分子または精製された核酸分子」は、核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子を含む。例えば、ゲノムDNAに関して、用語「単離された」は、そのゲノムDNAが天然で結合している染色体から分離された核酸分子を含む。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムDNAにおいて、その核酸に天然で隣接する配列(すなわち、この核酸の5’末端および/または3’末端に位置する配列)を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムDNAにおいて、天然でその核酸分子に隣接する、約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、または0.1kb未満の5’側および/または3’側のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子(例えば、cDNA分子)は、実質的に、他の細胞物質、または、組換え技術により生成される場合、培養培地を含まなくあり得るか、あるいは、化学合成される場合、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まなくあり得る。
【0071】
本明細書中で使用される場合、用語「低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を実施するための手引きは、Current Protocols in Molecular Biology(1989)John Wiley & Sons,N.Y.,6.3.1−6.3.6(これは、本明細書中で参考として援用される)において見出され得る。水性および非水性の方法は、その参考文献に記載され、そしてそのいずれかが使用され得る。本明細書中で言及される特定のハイブリダイゼーション条件は、以下の通りである:1)約45℃で6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中での低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、その後の少なくとも50℃で0.2×SSC、0.1%SDS中での2回の洗浄(洗浄温度は、低ストリンジェンシーの条件について55℃まで上昇され得る);2)約45℃で6×SSC中での中程度にストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、その後の60℃で0.2×SSC、0.1%SDS中での1回以上の洗浄;3)約45℃で6×SSC中での高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、その後の65℃で0.2×SSC、0.1%SDS中での1回以上の洗浄;そして好ましくは、4)非常に高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、65℃で0.5Mリン酸ナトリウム、7%SDS、その後の65℃で0.2×SSC、1%SDS中での1回以上の洗浄である。非常に高ストリンジェンシー条件(4)が、好ましい条件であり、そして他にそうでないことが示されない限り、使用されるべき条件である。
【0072】
本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子は、天然で生じる(例えば、天然のタンパク質をコードする)ヌクレオチド配列を有するRNA分子またはDNA分子をいう。
【0073】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、MID9002タンパク質、好ましくは、哺乳動物MID9002タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいい、そして非コード調節配列およびイントロンをさらに含み得る。
【0074】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質は、そのタンパク質が由来する細胞または組織供給源由来の細胞物質も他の混入タンパク質も実質的に含まないか、あるいは化学合成された場合に化学前駆体も他の化学物質も実質的に含まない。1つの実施形態において、語「実質的に含まない」は、MID9002タンパク質の調製物が、約30%、20%、10%、およびより好ましくは、5%未満(乾燥重量)の、非MID9002タンパク質(本明細書中で「混入タンパク質」とも呼ばれる)または化学前駆体もしくは非MID9002化学物質を有することを意味する。MID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え生成される場合、それはまた、好ましくは、培養培地を実質的に含まない(すなわち、培養培地は、タンパク質調節物の容量の約20%未満、より好ましくは約10%未満、そして最も好ましくは約5%未満を占める)。本発明は、乾燥重量で、少なくとも0.01、0.1、1.0、および10mgの単離または精製された調製物を含む。
【0075】
「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を喪失することなく、またはより好ましくは、生物学的活性を実質的に変更することなく、MID9002の野生型配列(例えば、配列番号1または配列番号3の配列)から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような変化を生じる。例えば、本発明のポリペプチド間で保存されたアミノ酸残基(例えば、スルファターゼドメインに存在するアミノ酸残基)は、変更に特に影響を受けやすいことが予想される。
【0076】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。従って、MID9002タンパク質中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態において、変異は、例えば、飽和変異誘発によって、MID9002コード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入され得、そして得られる変異体は、活性を保持する変異体を同定するために、MID9002生物学的活性についてスクリーニングされ得る。配列番号1または配列番号3の変異誘発の後、コードされるタンパク質は、組換え発現され得、そしてタンパク質の活性が、決定され得る。
【0077】
本明細書中で使用される場合、MID9002タンパク質の「生物学的に活性な部分」としては、MID9002分子と非MID9002分子との間の相互作用に関与するMID9002タンパク質のフラグメントが挙げられる。MID9002タンパク質の生物学的に活性な部分としては、全長MID9002タンパク質より少ないアミノ酸を含み、かつMID9002タンパク質の少なくとも1つの活性を示す、MID9002タンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号2に示されるアミノ酸配列)に十分に相同であるかまたはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。代表的に、生物学的に活性な部分は、MID9002タンパク質の少なくとも1つの活性(例えば、硫酸エステルの加水分解を触媒する能力、または細胞外マトリクスを分解する能力)を有するドメインまたはモチーフを含む。MID9002タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、10、25、50、100、200またはそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。MID9002タンパク質の生物学的に活性な部分は、MID9002媒介活性(例えば、硫酸エステルの加水分解を触媒する能力、または細胞外マトリクスを分解する能力)を調節する薬剤を開発するための標的として使用され得る。
【0078】
配列間の相同性または配列同一性(これらの用語「相同性」または「同一性」は、本明細書中で交換可能に使用される)の計算は、以下のように実施される。
【0079】
2つのアミノ酸配列、または2つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、これらの配列は、最適な比較目的で整列される(例えば、ギャップは、最適な整列のために、第1および第2のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入され得、そして非相同配列は、比較目的で無視され得る)。好ましい実施形態において、比較目的で整列される参照配列の長さは、参照配列の少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも60%、およびさらにより好ましくは、少なくとも70%、80%、90%、100%の長さである(例えば、589アミノ酸残基を有する第2の配列を配列番号2のMID9002アミノ酸配列と整列する場合、少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも60%、およびさらにより好ましくは少なくとも70%、80%または90%のアミノ酸残基が整列される)。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第1の配列における位置が、第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、これらの分子は、その位置で同一である(本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等しい)。2つの配列間のパーセント同一性は、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数である(ギャップの数、および、2つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のある各ギャップの長さが考慮される)。
【0080】
配列の比較および2つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。好ましい実施形態において、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comから入手可能)においてGPAプログラムに組み込まれたNeedlemanおよびWunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444−453)のアルゴリズムを用い、Blossum 62マトリクスまたはPAM250マトリクスのいずれか、ならびにギャップウェイト16、14、12、10、8、6、または4およびレングスウェイト(length weight)1、2、3、4、5、または6を用いて決定される。さらに別の好ましい実施形態において、2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comから入手可能)のGAPプログラムを用い、NWSgapdna.CMPマトリクスならびにギャップウェイト40、50、60、70、または80およびレングスウェイト1、2、3、4、5、または6を用いて決定される。特に好ましいセットのパラメータ(および分子が、本発明の配列同一性または相同性の限定内にあるか否かを決定するためにどのパラメータが適用されるべきかについて、実施者が判断できない場合に使用されるべきパラメータ)は、Blossum 62スコアリングマトリクス(ギャップペナルティー12、ギャップエクステンドペナルティー4、およびフレームシフトギャップペナルティー5)である。
【0081】
2つのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれたMeyersおよびMiller((1989)CABIOS、4:11−17)のアルゴリズムを用い、PAM120ウェイトレジデューテーブル(weight residue table)、ギャップレングスペナルティー12、およびギャップペナルティー4を用いて決定され得る。
【0082】
本明細書中に記載される核酸配列およびタンパク質配列は、「問い合わせ配列」として使用され、公のデーターベースに対してサーチが実施される(例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために)。このようなサーチは、Altschulら(1990)J.Mol.Biol.215:403−10のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて実施され得る。BLASTヌクレオチドサーチは、NBLASTプログラム、スコア=100、ワードレングス=12を用いて実施されて、本発明のMID9002核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列が獲得され得る。BLASTタンパク質サーチは、XBLASTプログラム、スコア=50、ワードレングス=3を用いて実施されて、本発明のMID9002タンパク質分子に相同なアミノ酸配列が獲得され得る。比較目的でギャップ挿入アラインメント(gapped alignment)を獲得するために、Gapped BLASTが、Altschulら(1997)Nucleic Acids Res.25:3389−3402に記載のように使用され得る。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータが使用され得る。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照のこと。
【0083】
本発明の特定のMID9002ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列の文脈で、用語「実質的に同一」は、i)第2のアミノ酸配列における整列されたアミノ酸残基と同一であるか、またはii)その保存的置換である、十分な数または最小限の数のアミノ酸残基を含む第1のアミノ酸をいうよう本明細書中で使用され、その結果、第1および第2のアミノ酸配列は、共通の構造的ドメインおよび/または共通の機能的活性を有し得る。例えば、配列番号2に対して少なくとも約60%、または65%の同一性、おそらく、75%の同一性、よりおそらくは85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する共通の構造的ドメインを含むアミノ酸配列は、実質的に同一であると言及される。
【0084】
ヌクレオチド配列の文脈において、用語「実質的に同一」は、第2の核酸配列における整列されたヌクレオチドと同一のヌクレオチドの十分な数または最小限の数を含む第1の核酸配列をいうよう本明細書中で使用され、その結果、第1および第2のヌクレオチド配列は、共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするか、または共通の構造的ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードする。例えば、配列番号1または3に対して少なくとも約60%、または65%の同一性、おそらく、75%の同一性、よりおそらくは85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するヌクレオチド配列は、実質的に同一であると言及される。
【0085】
「誤発現または異常な発現」は、本明細書中で使用される場合、RNAまたはタンパク質のレベルでの遺伝子発現の非野生型パターンをいう。これらとしては、以下:非野生型レベルでの発現(すなわち、過剰発現または過少発現);遺伝子が発現される時点または段階の点で野生型と異なる発現パターン(例えば、予め決定された発達期または段階での増加または減少した発現(野生型と比較した場合));予め決定された細胞型または組織型において減少した発現(野生型と比較した場合)の点で野生型と異なる発現パターン;スプライシングサイズ、アミノ酸配列、翻訳後修飾、または発現されたポリペプチドの生物学的活性の点で野生型と異なる発現パターン;遺伝子の発現に対する環境的刺激または細胞外刺激の効果の点で野生型と異なる発現パターン(例えば、刺激の強度における増加または減少の存在下で増加または減少した発現パターン(野生型と比較した場合))、が挙げられる。
【0086】
「被験体」は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物(例えば、ヒト)または実験動物または疾患モデルをいい得る。被験体はまた、非ヒト動物(例えば、ウマ、ウシ、ヤギまたは他の家畜)であり得る。
【0087】
「細胞の精製調製物」は、本明細書中で使用される場合、植物および動物の細胞の場合、細胞のインビトロ調製物をいうのであって、完全にインタクトな植物または動物ではない。培養細胞および微生物細胞の場合、細胞の精製調製物は、被験体細胞の少なくとも10%およびより好ましくは少なくとも50%の調製物からなる。
【0088】
本発明の種々の局面は、以下でさらに詳細に記載される。
【0089】
(単離された核酸分子)
1つの局面において、本発明は、本明細書中に記載されるMID9002ポリペプチド(例えば、全長MID9002タンパク質またはそのフラグメント(例えば、MID9002タンパク質の生物学的に活性な部分))をコードする単離または精製された核酸分子を提供する。ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに適した核酸フラグメント(これらは、例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を同定するために使用され得る)、MID9002 mRNA、およびプライマー(例えば、核酸分子の増幅または変異のためのPCRプライマー)として使用するのに適したフラグメントもまた含まれる。
【0090】
1つの実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号1に示されるヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の任意の一部を含む。1つの実施形態において、この核酸分子は、ヒトMID9002タンパク質をコードする配列(すなわち、配列番号3に示されるような、配列番号1の「コード領域」)、ならびに5’非翻訳配列(配列番号1のヌクレオチド1〜67)および3’非翻訳配列(配列番号1のヌクレオチド1835〜1858)を含む。あるいは、この核酸分子は、配列番号1のコード領域(例えば、配列番号3)のみを含み得、そして例えば、通常対象配列に付随する隣接配列を含まない。別の実施形態において、核酸分子は、配列番号2のアミノ酸約38〜520のタンパク質フラグメントまたは配列番号2のアミノ酸約32〜589の成熟タンパク質に対応する配列をコードする。
【0091】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号1もしくは配列番号3に示されるヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列の任意の一部分に相補的な核酸分子を含む。他の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号1または配列番号3に示されるヌクレオチド配列に十分相補的であり、その結果、配列番号1または3に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得、それによって、安定な二重鎖を形成する。
【0092】
1つの実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号1または3に示されるヌクレオチド配列の全長に対して、少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上相同なヌクレオチド配列、またはその一部(好ましくは、これらのヌクレオチド配列のいずれかの同一の長さのもの)を含む。
【0093】
(MID9002核酸フラグメント)
本発明の核酸分子は、配列番号1または3の核酸配列の一部のみを含み得る。例えば、このような核酸分子は、プローブもしくはプライマーとして使用され得るフラグメントまたはMID9002タンパク質の一部をコードするフラグメント(例えば、MID9002タンパク質の免疫原性部分または生物学的に活性な部分)を含み得る。フラグメントは、ヒトMID9002のスルファターゼドメインをコードする配列番号1のヌクレオチドを含み得る。MID9002遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列により、他のMID9002ファミリーメンバーまたはそのフラグメント、ならびに他の種由来のMID9002ホモログまたはそのフラグメントを同定および/またはクローニングするのに使用するために設計されたプローブおよびプライマーが作製され得る。
【0094】
別の実施形態において、核酸は、コード領域の一部または全てを含み、そして5’または3’のいずれか(または両方)の非コード領域に延びるヌクレオチド配列を含む。他の実施形態は、本明細書中に記載されるアミノ酸フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むフラグメントを含む。核酸フラグメントは、本明細書中に記載される特定のドメインもしくは部位またはそのフラグメント(特に、少なくとも100アミノ酸長のそのフラグメント)をコードし得る。フラグメントはまた、上記の特定のアミノ酸配列に対応する核酸配列またはそのフラグメントを含む。核酸フラグメントは、本発明以前に開示された可能性のあるフラグメントを包含するとみなされるべきでない。
【0095】
核酸フラグメントは、本明細書中に記載されるドメイン、領域、または機能的部位に対応する配列を含み得る。核酸フラグメントはまた、本明細書中に記載される1つ以上のドメイン、領域、または機能的部位を含み得る。従って、例えば、MID9002核酸フラグメントは、本明細書中に記載のスルファターゼドメインに対応する配列を含み得る。
【0096】
MID9002プローブおよびプライマーが提供される。代表的に、プローブ/プライマーは、単離または精製されたオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、代表的に、ストリンジェントな条件下で、配列番号1もしくは配列番号3のセンス配列もしくはアンチセンス配列、または配列番号1もしくは配列番号3の天然に存在する対立遺伝子改変体もしくは変異体の、少なくとも約7、12、または15、好ましくは約20または25、より好ましくは約30、35、40、45、50、55、60、65、または75連続するヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【0097】
好ましい実施形態において、この核酸は、少なくとも5または10、および200未満、より好ましくは、100未満、または50未満の塩基対長である、プローブである。本明細書中に開示された配列と、同一であるか、または1、または5もしくは10塩基対未満で異なるべきである。アライメントが、この比較のために必要とされる場合、この配列は、最大の相同性でアライメントされるべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチ由来の「ループ(looped)」アウト配列は、異なるとみなされる。
【0098】
プローブまたはプライマーは、以下をコードする核酸のセンス鎖またはアンチセンス鎖から誘導され得る:例えば、配列番号2のアミノ酸の約38〜約520のスルファターゼドメイン;配列番号2のアミノ酸の約37〜約589のスルファターゼドメイン;配列番号2のアミノ酸の約32〜約589の成熟タンパク質;配列番号2のアミノ酸の約1〜227のN末端管腔ドメイン(luminal domain);配列番号2のアミノ酸の約227〜249の膜貫通ドメイン;配列番号2のアミノ酸の約249〜291のループドメイン;配列番号2のアミノ酸の約291〜307の膜貫通ドメイン;および配列番号2のアミノ酸の約307〜589のC末端管腔ドメイン。
【0099】
別の実施形態において、一連のプライマー(MID9002配列の選択された領域(例えば、本明細書中に記載される、ドメイン、領域、部位または他の配列)を増幅するために使用され得る、PCRにおいて使用するために適切なプライマー)が、提供される。このプライマーは、少なくとも、5、10、または50の塩基対長、100未満、または200未満の塩基対長であるべきである。このプライマーは、本明細書中に開示される配列もしくは天然に存在する改変体と同一であるか、または本明細書中に開示される配列もしくは天然に存在する改変体と一つの塩基異なるべきである。例えば、以下の領域:配列番号2のアミノ酸の約38〜520のスルファターゼドメイン;配列番号2のアミノ酸の約37〜約589のスルファターゼドメイン;配列番号2のアミノ酸の約32〜約589の成熟タンパク質;配列番号2のアミノ酸の約1〜227のN末端管腔ドメイン;配列番号2のアミノ酸の約227〜249の膜貫通ドメイン;配列番号2のアミノ酸の約249〜291のループドメイン;配列番号2のアミノ酸の約291〜307の膜貫通ドメイン;および配列番号2のアミノ酸の約307〜589のC末端管腔ドメインのいずれかの全てまたはいずれか一部を増幅するのに適したプライマーが、提供される。
【0100】
核酸フラグメントは、本明細書中に記載されるポリペプチドのエピトープ保持領域をコードし得る。
【0101】
「MID9002ポリペプチドの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列の一部を単離すること(このヌクレオチド配列は、MID9002生物学的活性を有するポリペプチドをコードする(例えば、MID9002タンパク質の生物学的活性が、本明細書中に記載されている))、MID9002タンパク質のコード部分を(例えば、インビトロにおける組換え発現によって)発現すること、およびMID9002タンパク質のコード部分の活性を評価することによって調製され得る。例えば、MID9002の生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、スルファターゼドメイン(例えば、配列番号2のアミノ酸残基の約38〜520)を含む。MID9002ポリペプチドの生物学的に活性な活性部分をコードする核酸フラグメントは、300以上のヌクレオチド長を超えるヌクレオチド配列を含み得る。
【0102】
好ましい実施形態において、核酸は、約300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800以上のヌクレオチド長である、ヌクレオチド配列を含み、そして配列番号1または配列番号3の核酸分子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【0103】
(MID9002核酸改変体)
本発明は、さらに、配列番号1または配列番号3に示されるヌクレオチド配列と異なる核酸分子を含む。このような差異は、遺伝コードの縮重に起因し得、そして本明細書中に開示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同一のMID9002タンパク質をコードする核酸を生じる。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号2に示されるアミノ酸配列と、少なくとも1個だが、5、10、20、50、または100個のアミノ酸残基未満で異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。アライメントが、この比較に必要とされる場合、この配列は、最大の相同性でアライメントされるべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチ由来の「ループ」アウト配列は、異なるとみなされる。
【0104】
本発明者らの核酸は、特定の発現系に対して、好ましい、または好ましくない、コドンを有するように選択され得る。例えば、核酸は、その配列がE.coli、酵母、ヒト、昆虫、またはCHO細胞中での発現に対して最適化されるように、少なくとも一つのコドン、好ましくはコドンの少なくとも10%または20%が変更された核酸であり得る。
【0105】
核酸改変体は、天然に存在し得、例えば、対立遺伝子改変体(同一の遺伝子座)、ホモログ(異なる遺伝子座)、およびオルソログ(異なる生物)であり得るか、または天然に存在し得ない。天然に存在しない改変体は、ポリヌクレオチド、細胞、または生物に適用される技術を含む、変異誘発技術により作製され得る。この改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失、転化および挿入を含み得る。改変は、コード領域および非コード領域のいずれかまたは両方に存在し得る。この改変は、保存的アミノ酸置換基および非保存的アミノ酸置換基(コードされた産物と比較した場合)の両方を生じ得る。
【0106】
好ましい実施形態において、核酸は、例えば、以下のように、配列番号1または配列番号3の核酸と異なる:少なくとも1個のヌクレオチドだが、10、20、30、または40個未満のヌクレオチド;少なくとも1個のヌクレオチドだが、目的の核酸の1%、5%、10%または20%未満のヌクレオチド。この分析に必要である場合、この配列は、最大相同性でアライメントされるべきである。欠失、もしくは挿入、またはミスマッチ由来の「ループ」アウト配列は、異なるとみなされる。
【0107】
オルソログ、ホモログ、および対立遺伝子改変体は、当該分野で公知の方法を使用して同定され得る。これらの改変体は、配列番号2に示されるヌクレオチド配列またはその配列のフラグメントに対して、50%、少なくとも約55%、代表的に、少なくとも約70〜75%、より代表的に、少なくとも約80〜85%、そして最も代表的に、少なくとも約90〜95%以上、同一である、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。このような核酸分子は、配列番号2に示されるヌクレオチド配列またはその配列のフラグメントに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るとして、容易に同定され得る。本発明のMID9002 cDNAのオルソログ、ホモログ、および対立遺伝子改変体に対応する核酸分子は、MID9002遺伝子と同一の染色体または遺伝子座にマッピングすることによって、さらに単離され得る。
【0108】
好ましい改変体は、以下のスルファターゼ活性のうちの1つ以上と相関する改変体を含む:(1)硫酸エステル(例えば、アリール硫酸エステル)の加水分解を触媒する能力;(2)細胞外マトリクスを分解する能力;(3)硫酸エステルを含む化合物を結合する能力;(4)骨および/または軟骨の代謝/形成/破壊に影響を及ぼす能力;ならびに(5)癌増殖(例えば、侵襲、転移)に影響を及ぼす能力。
【0109】
MID9002の対立遺伝子改変体(例えば、ヒトMID9002)は、機能的タンパク質および非機能的タンパク質の両方を含む。機能的対立遺伝子改変体は、以下を維持する集団内のMID9002タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体である:(1)硫酸エステル(例えば、アリール硫酸エステル)の加水分解を触媒する能力;(2)細胞外マトリクスを分解する能力;(3)硫酸エステルを含む化合物を結合する能力;(4)骨および/または軟骨の代謝/形成/破壊に影響を及ぼす能力;ならびに/あるいは(5)癌増殖(例えば、侵襲、転移)に影響を及ぼす能力。機能的対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号2の1個以上のアミノ酸の保存的置換基のみ、またはタンパク質の重要ではない領域にある、重要ではない残基の置換、欠失もしくは挿入を含む。非機能的な対立遺伝子改変体は、以下を有さない集団内のMID9002(例えば、ヒトMID9002)タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体である:(1)硫酸エステル(例えば、アリール硫酸エステル)の加水分解を触媒する能力;(2)細胞外マトリクスを分解する能力;(3)硫酸エステルを含む化合物を結合する能力;(4)骨および/または軟骨の代謝/形成/破壊に影響を及ぼす能力;ならびに/あるいは(5)癌増殖(例えば、侵襲、転移)に影響を及ぼす能力。非機能的な対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号2のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失、もしくは挿入、または早熟短縮、あるいはタンパク質の重要な残基または重要な領域の置換、挿入、または欠失を含む。
【0110】
さらに、他のMID9002ファミリーメンバーをコードする核酸分子(従って、配列番号1または配列番号3のMID9002配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子)は、本発明の範囲内であることが意図される。
【0111】
(アンチセンス核酸分子、リボザイムおよび改変されたMID9002核酸分子)
別の局面において、本発明は、MID9002に対してアンチセンスである単離された核酸分子を特徴とする。「アンチセンス」核酸は、例えば、二重鎖cDNA分子のコード鎖に対して相補的であるか、またはmRNA配列に対して相補的である、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的である、ヌクレオチド配列を含み得る。このアンチセンス核酸は、全MID9002コード鎖、またはその一部のみ(例えば、配列番号3に対応する、ヒトMID9002のコード領域)に対して相補的であり得る。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子は、MID9002をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」(例えば、5’非翻訳領域および3’非翻訳領域)に対してアンチセンスである。
【0112】
MID9002mRNAの全コード領域に対して相補的であるように、アンチセンス核酸が、設計され得るが、より好ましくは、MID9002 mRNAのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、MID9002 mRNAの翻訳開始部位を取り囲む領域(例えば、目的の標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10領域と+10領域との間)に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80以上のヌクレオチド長であり得る。
【0113】
本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を使用する化学合成および酵素学的ライゲーション反応を使用して、構築され得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成された二重鎖の物理学的安定性を増加させるように設計された多様に改変されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成され得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが、使用され得る)。アンチセンス核酸がまた、核酸がアンチセンス配向でサブクローニングされた発現ベクターを生物学的に使用して産生され得る(すなわち、挿入された核酸から転写されたRNAは、以下の節でさらに記載されている、目的の標的核酸に対するアンチセンス配向である)。
【0114】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的に、(例えば、組織部位の直接的な注入によって)被験体に投与されるか、またはこれらのアンチセンス核酸分子が、MID9002タンパク質をコードする細胞性mRNAおよび/またはゲノムDNAとハイブリダイズするか、または結合することによって、例えば、転写および/または翻訳を阻害することによって、タンパク質の発現を阻害するように、インサイチュで産生される。あるいは、アンチセンス核酸分子を改変して、選択された細胞を標的し、次いで、全身に投与され得る。全身投与に関して、例えば、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に、アンチセンス核酸分子を連結することによって、このアンチセンス分子が、選択された細胞表面上で発現されたレセプターまたは抗原に特異的または選択的に結合するように改変され得る。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中で記載されるベクターを使用して、細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が、強力なpol IIプロモーターまたはpol IIIプロモーターの制御下で置換されるベクター構築物が、好ましい。
【0115】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的RNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。ここでは、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は互いに対して平行に走る(Gaultierら(1987)Nucleic Acids Res.15:6625−6641)。アンチセンス核酸分子はまた、2’−o−メチルリボヌクレオチド(Inoueら(1987)Nucleic Acids Res.15:6131−6148)またはキメラRNA−DNAアナログ(Inoueら(1987)FEBS Lett.215:327−330)を含み得る。
【0116】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。MID9002コード核酸に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるMID9002 cDNAのヌクレオチド配列(すなわち、配列番号1または配列番号3)に対して相補的な1以上の配列、ならびにmRNAの切断を担う公知の触媒配列を有する配列(米国特許第5,093,246号またはHaselhoffおよびGerlach(1988)Nature 334:585−591を参照のこと)を含み得る。例えば、Tetrahymena L−19 IVS RNAの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列がMID9002コードmRNAにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的であるように構築され得る。例えば、Cechら、米国特許第4,987,071号;およびCechら、米国特許第5,116,742号を参照のこと。あるいは、MID9002 mRNAを使用して、RNA分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNAを選択し得る。例えば、BartelおよびSzostak(1993)Science 261:1411−1418を参照のこと。
【0117】
MID9002遺伝子の発現は、標的細胞中でMID9002遺伝子の転写を阻害する三重ヘリックス構造を形成するために、MID9002の調節領域に相補的なヌクレオチド配列(例えば、MID9002プロモーターまたはエンハンサー)を標的することによって阻害され得る。一般に、Helene(1991)Anticancer Drug Des.6:569−84;Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27−36;およびMaher(1992)Bioassays 14:807−15を参照のこと。三重ヘリックスの形成のために標的され得る潜在的な配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増加され得る。スイッチバック分子は、5’−3’変更方法、3’−5’変更方法で合成され、これらは、二重鎖の一方の鎖と、次いで他方の鎖との対に基づき、プリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸張が、二重鎖の一方の鎖上に存在することの必要性を排除する。
【0118】
本発明はまた、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ分子を提供する。代表的に、このような標識は、化学発光、蛍光、放射活性、または比色分析である。
【0119】
MID9002核酸分子を、塩基部分、糖部分またはホスフェート骨格において改変し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善し得る。例えば、核酸分子のデオキシリボースホスフェート骨格は、ペプチド核酸を生成するために改変され得る(Hyrupら(1996)Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5−23を参照のこと)。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「PNA」は、デオキシリボースホスフェート骨格が偽ペプチド骨格により置換され、そして4つの天然の核酸塩基(nucleobase)のみが保持されている核酸模倣物(例えば、DNA模倣物)をいう。PNAの中性の骨格は、低イオン強度の条件下で、DNAおよびRNAに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にし得る。PNAオリゴマーの合成は、Hyrupら(1996)前出;Perry−O’Keefeら、(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:14670−675に記載のような、標準的固相ペプチド合成プロトコルを使用して実施され得る。
【0120】
MID9002核酸分子のPNAは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、PNAは、遺伝子発現の配列特異的調節(例えば、転写または翻訳の停止を誘導すること、または複製を阻害することによる)のためのアンチセンス剤またはアンチジーン(antigene)剤として使用され得る。MID9002核酸分子のPNAはまた、例えば、PNA指向PCRクランピング(PNA−directed PCR clamping)による遺伝子内の一塩基対変異の分析において、他の酵素(例えば、S1ヌクレアーゼ)と組み合わせて使用される場合の「人工制限酵素」として(Hyrupら(1996)、前出);またはDNA配列決定またはハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrupら(1996)、前出;Perry−O’Keefe前出)使用され得る。
【0121】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基(例えば、インビボにおける宿主細胞レセプターを標的するため)、または細胞膜(例えば、Letsingerら、(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6553−6556;Lemaitreら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:648−652;PCT公開番号WO88/09810を参照のこと)もしくは血液脳関門(例えば、PCT公開番号WO89/10134を参照のこと)を通過する輸送を容易にする試薬を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションにより誘発される切断試薬(例えば、Krolら(1988)Bio−Techniques 6:958−976を参照のこと)、挿入剤(例えば、Zon(1988)Pharm.Res.5:539−549を参照のこと)を用いて改変され得る。この目的のために、このオリゴヌクレオチドは、別の分子(例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘発切断剤)に結合体化され得る。
【0122】
本発明はまた、本発明のMID9002核酸に対して相補的である少なくとも一つの領域を有する、分子ビーコンオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ分子を含み、2つの相補的な領域は、一つの蛍光団および一つのクエンチャーを有し、この分子ビーコンは、サンプル中で本発明のMID9002核酸の存在をクエンチするために有用である。分子ビーコン核酸は、例えば、Lizardiら、米国特許第5,854,033号;Nazarenkoら、米国特許第5,866,336号、およびLivakら,米国特許第5,876,930号に記載されている。
【0123】
(単離されたMID9002ポリペプチド)
別の局面において、本発明は、抗−MID9002抗体を惹起するか、または試験する(またはより一般的には、この抗体に結合する)免疫原または抗原として使用するための、単離されたMID9002タンパク質、またはフラグメント(例えば、生物学的に活性な部分)を特徴とする。MID9002タンパク質はまた、標準的なタンパク質精製技術を使用して、細胞供給源または組織供給源から単離され得る。MID9002タンパク質またはそのフラグメントを、組換えDNA技術によって産生または化学的に合成し得る。
【0124】
本発明のポリペプチドは、複数の遺伝子の存在の結果、代替の翻訳事象、代替のRNAスプライシング事象、ならびに代替の翻訳事象および翻訳後事象を惹起するポリペプチドを含む。ポリペプチドは、ポリペプチドがネイティブ細胞中で発現される場合に存在する翻訳後改変と実質的に同一の翻訳後改変を生じる系(例えば、培養細胞)か、またはネイティブ細胞中に存在する翻訳後改変(例えば、グリコシル化または切断)の代替または欠損を生じる系において発現され得る。
【0125】
好ましい実施形態において、MID9002ポリペプチドは、以下の特徴の一つ以上を有する:
硫酸エステル(例えば、アリール硫酸エステル)の加水分解を触媒する能力を有すること;
細胞外マトリックスまたはその成分を分解する能力を有すること;
硫酸エステルを含む化学化合物に結合する能力を有すること;
骨および/または軟骨の代謝/形成/分解に影響する能力を有すること:ならびに
癌の進行(例えば、侵襲性、転移性)に影響する能力を有すること;
好ましくは、MID9002ポリペプチド(例えば、配列番号2のポリペプチド)の、翻訳後修飾、アミノ酸組成または他の物理学的特性の任意の寄与を無視する分子重量(例えば、推定分子量)を有すること;
配列番号2のポリペプチドと、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、90%、または95%の全体的な配列類似性を有すること;
少なくとも以下のヒト組織および細胞株において発現されること:高レベルで腎臓、膵臓、結腸、肝臓、および中程度のレベルで脊髄神経節;
配列番号2のアミノ酸残基約38〜520および37〜589に対して好ましくは約70%、80%、90%または95%同一であるスルファターゼドメインを有すること;
配列番号2のアミノ酸残基約227〜249または291〜307に対して好ましくは約70%、80%、90%または95%同一である膜貫通ドメインを有すること;ならびに
ネイティブタンパク質のアミノ酸配列において見出されるシステインのうち、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、好ましくは少なくとも16個、そして最も好ましくは少なくとも17個を有すること。
【0126】
好ましい実施形態において、MID9002タンパク質、またはそのフラグメントは、配列番号2の対応する配列と異なる。一つの実施形態において、少なくとも1個であるが、15個未満、10個未満または5個未満のアミノ酸残基だけ異なる。別の実施形態において、少なくとも1個の残基が配列番号2の対応する配列と異なるが、20%未満、15%未満、10%未満、または5%未満の残基だけ、配列番号2の対応する配列と異なる。(この比較が、アライメントを必要とする場合、この配列は、最大相同性についてアライメントされるべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチ由来の「ループ」アウト配列が、差異とみなされる)。この差異は、好ましくは、非必須残基または保存的置換基における差異または変化である。好ましい実施形態において、この差異は、配列番号2の残基約38〜520におけるスルファターゼドメインにはない。別の実施形態において、1以上の差異は、配列番号2の残基約38〜520におけるスルファターゼドメインにはない。
【0127】
他の実施形態は、アミノ酸配列の一つ以上の変化(例えば、活性に関して本質的ではないアミノ酸残基の変化)を含有するタンパク質を含む。このようなMID9002タンパク質は、配列番号2由来のアミノ酸配列において異なるが、なお生物学的活性を保持する。
【0128】
一つの実施形態において、このタンパク質は、配列番号2に対して、少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%以上相同なアミノ酸配列を含む。
【0129】
タンパク質またはフラグメントにおいて、少なくとも1個であるが、15個未満、10個未満または5個未満のアミノ酸残基だけの約1〜38および/または520〜589にによって規定される領域において、配列番号2の配列と異なるが、約38〜520によって規定される領域において、配列番号2と異ならない、MID9002タンパク質またはフラグメントが、提供される。(この比較が、アライメントを必要とする場合、この配列は、最大相同性についてアライメントされるべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチ由来の「ループ」アウト配列が、差異とみなされる)。いくつかの実施形態において、この差異は、非必須残基にあるか、または保存的置換である一方で、他の実施形態においては、この差異は、必須残基にあるか、または非保存的置換である。
【0130】
一つの実施形態において、MID9002タンパク質の生物学的に活性な部分は、スルファターゼドメインを含む。さらに、他の生物学的に活性な部分(ここで、タンパク質の他の領域は、欠失される)は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブMID9002タンパク質の機能的な活性の1以上について評価され得る。
【0131】
好ましい実施形態において、MID9002タンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、MID9002タンパク質は、配列番号2と実質的に同一である。なお別の実施形態において、MID9002タンパク質は、上記の節で詳細に記載したように、配列番号2と十分にまたは実質的に同一であり、そして配列番号2のタンパク質の機能的な活性を保持する。
【0132】
(MID9002キメラタンパク質または融合タンパク質)
別の局面において、本発明は、MID9002キメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、MID9002「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非MID9002ポリペプチドに連結したMID9002ポリペプチドを含む。「非MID9002ポリペプチド」は、MID9002タンパク質と実質的に相同性でないタンパク質(例えば、MID9002タンパク質と異なるタンパク質)および同一の生物または異なる生物由来のタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。融合タンパク質のMID9002ポリペプチドは、全てまたは一部(例えば、本明細書中に記載のMID9002アミノ酸配列のフラグメント)に対応し得る。好ましい実施形態において、MID9002融合タンパク質は、MID9002タンパク質の少なくとも1個(または2個)の生物学的に活性な部分を含む。非MID9002ポリペプチドは、MID9002ポリペプチドのN末端またはC末端に融合され得る。
【0133】
この融合タンパク質は、リガンドに対して高度の親和性を有する部分を含み得る。例えば、この融合タンパク質は、MID9002配列がGST配列のC末端に対して融合される、GST−MID9002融合タンパク質であり得る。このような融合タンパク質は、組換えMID9002の精製を容易にし得る。あるいは、この融合タンパク質は、そのN末端において、異種シグナル配列を含むMID9002タンパク質であり得る。特定の宿主細胞(例えば、哺乳動物の宿主細胞)において、MID9002の発現および/または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増強され得る。
【0134】
融合タンパク質は、血清タンパク質(例えば、免疫グロブリン(例えば、IgG、IgAまたはIgE)の一部、例えば、免疫グロブリンまたはヒト血清アルブミンのFc領域ならびに/もしくはヒンジC1配列およびヒンジC2配列)の全てまたは一部を含み得る。
【0135】
本発明のMID9002融合タンパク質は、薬学的組成物に取り込まれ得、そしてインビボで被験体に投与され得る。MID9002融合タンパク質は、MID9002基質のバイオアベイラビリティーに影響を与えるために使用され得る。MID9002融合タンパク質は、例えば、以下の(i)、(ii)および(iii)によって生じる障害の処置のために治療学的に有用であり得る:(i)MID9002タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または変異;(ii)MID9002遺伝子の誤調節;および(iii)MID9002タンパク質の異常な翻訳後改変。
【0136】
さらに、本発明のMID9002融合タンパク質は、被験体において抗MID9002抗体を産生して、MID9002リガンドを精製するための免疫原として使用され得、およびMID9002とMID9002基質との相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。
【0137】
融合部分(例えば、GSTポリペプチド)をすでにコードする発現ベクターが、市販されている。AMID9002をコードする核酸は、このような発現ベクター中にクローニングされ得、その結果、融合部分がMID9002タンパク質にインフレームで連結される。
【0138】
(MID9002タンパク質の改変体)
別の局面において、本発明はまた、MID9002ポリペプチドの改変体(例えば、アゴニスト(模倣物)またはアンタゴニストとして機能する)を特徴とする。MID9002タンパク質の改変体は、変異誘発(例えば、不連続な点変異)、配列の挿入もしくは欠失、またはMID9002タンパク質の短縮(truncation)によって作製され得る。MID9002タンパク質のアゴニストは、MID9002タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性と実質的に同一の活性またはサブセットを残存し得る。MID9002タンパク質のアンタゴニストは、例えば、MID9002タンパク質のMID9002媒介活性を競合的に調節することによって、MID9002タンパク質の天然に存在する形態の活性の1つ以上を阻害し得る。よって、特定の生物学的効果は、種々の限定された機能を用いる処置によって誘導され得る。好ましくは、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体を用いる被験体の処置は、MID9002タンパク質の天然に存在する形態での処置と比較して被験体におけるわずかな副作用を有する。
【0139】
MID9002タンパク質の改変体は、MID9002タンパク質の変異体(例えば、短縮型変異体)のコンビナトリアルライブラリーをアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって同定され得る。
【0140】
MID9002タンパク質をコードする配列のフラグメント(例えば、N末端フラグメント、C末端フラグメントまたは内部フラグメント)のライブラリーを使用して、MID9002タンパク質の改変体のスクリーニング、続く選択のための多彩なフラグメント集団を作製し得る。
【0141】
システイン残基が付加または欠失されている改変体、あるいはグリコシル化されている残基が付加または欠失されている改変体が、特に好ましい。
【0142】
点変異または短縮によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする方法、および選択された特性を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングするための方法が、当該分野において公知である。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を高める新たな技術である機能的集合変異誘発(recursive ensemble mutagenesis)(REM)をスクリーニングアッセイと組合わせて使用して、MID9002改変体を同定し得る(ArkinおよびYourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7811−7815;Delgraveら(1993)Protein Engineering 6:327−331)。
【0143】
多彩なMID9002ライブラリーを分析するために、細胞ベースのアッセイが利用され得る。例えば、発現ベクターのライブラリーが、細胞株(例えば、通常、基質依存的様式でMID9002に応答する細胞株)にトランスフェクトされ得る。次いで、トランスフェクトされた細胞は、MID9002と接触させられ、そしてMID9002基質によるシグナル伝達に対する変異体発現の効果が、(例えば、内因的にまたは外因的に与えられえる硫酸エステルの加水分解を測定することによって)検出され得る。次いで、プラスミドDNAは、MID9002基質によるシグナル伝達の阻害または増強を記録する細胞から回収され得、そして個々のクローンがさらに特徴付けられ得る。
【0144】
別の局面において、本発明は、MID9002ポリペプチド(例えば、非野生型活性を有するペプチド、例えば、天然に存在するMID9002ポリペプチドのアンタゴニスト、アゴニストもしくはスーパーアゴニスト、例えば、天然に存在するMID9002ポリペプチド)を作製する方法を特徴とする。本方法は、以下の工程を包含する:MID9002ポリペプチドの配列を変更する工程(例えば、本明細書中に開示される非保存領域、ドメインまたは残基の1つ以上の残基の置換または欠失によって配列を変更する工程);および所望の活性について変更されたポリペプチドを試験する工程。
【0145】
別の局面において、本発明は、天然に存在するMID9002ポリペプチドの生物学的活性を有するMID9002ポリペプチドのフラグメントまたはアナログを作製する方法を特徴とする。本方法は、以下の工程を包含する:例えば、1つ以上の残基の置換または欠失によってMID9002ポリペプチドの配列を変更する工程(例えば、本明細書中に記載される非保存領域またはドメインもしくは残基を変更する工程);および、所望の活性について変更されたポリペプチドを試験する工程。
【0146】
(抗MID9002抗体)
別の局面において、本発明は、抗MID9002抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子またはその免疫学的に活性な部分(すなわち、抗原結合部分)をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、scFVフラグメントおよびdcFVフラグメント、FabフラグメントおよびF(ab’)2フラグメントが挙げられ、これらは、抗体を酵素(それぞれ、例えば、パパインまたはペプシン)で処理することにより生成され得る。
【0147】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体(例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体)、完全ヒト抗体、非ヒト抗体(例えば、マウス抗体)または、短鎖抗体であり得る。好ましい実施形態において、抗体はエフェクター機能を有し、そして補体を固定し得る。抗体は、毒素または画像化剤と結合され得る。
【0148】
全長MID9002タンパク質、またはMID9002の抗原性ペプチドフラグメントは、免疫原として使用され得るか、または他の免疫原(例えば、細胞、膜調製物など)を用いて作製された抗MID9002抗体を同定するために使用され得る。MID9002の抗原性ペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列のうち少なくとも8個のアミノ酸残基を有するべきであり、そしてMID9002のエピトープを含む。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも10個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも15個のアミノ酸残基、なおより好ましくは少なくとも20個のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも30個のアミノ酸残基を含む。
【0149】
配列番号2の残基約50〜70、約145〜193、約250〜265、約275〜285、約315〜325、約345〜385、約435〜450、約455〜470、約505〜515または約525〜545を含むMID9002のフラグメントは、MID9002の親水性領域(図2を参照のこと)に対する抗体を作製するために使用され得る(例えば、抗原として使用されるか抗体の特異性を特徴付けるために使用される)。同様に、配列番号2の残基約1〜22、約32〜45、約185〜248、約265〜275、約282〜300、約428〜438、または約566〜575を含むMID9002のフラグメントは、MID9002の疎水性領域に対する抗体を作製するために使用され得る;配列番号2の残基約1〜227、約249〜291、約307〜589またはそのサブセット(例えば、配列番号2の残基約1〜31、残基約32〜227、残基約32〜100、残基約100〜227、残基約307〜400、残基約400〜589)を含むMID9002のフラグメントは、MID9002タンパク質の管腔領域または管腔外領域に対する抗体を作製するために使用され得る;配列番号2の残基約38〜520、または約37〜589を含むMID9002のフラグメントは、MID9002のスルファターゼ領域に対する抗体を作製するために使用され得る。
【0150】
これらの領域または本明細書中に記載される他の領域もしくはドメインと反応性、または特異的もしくは選択的な抗体が提供される。
【0151】
抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面上に位置するMID9002の領域(例えば、親水性領域)、および高い抗原性を有する領域である。例えば、ヒトMID9002タンパク質配列のEmini表面確率解析を使用して、MID9002タンパク質の表面に局在化される確率の特に高い領域、従って、抗体産生を標的化するのに有用な表面残基を構築する可能性のある領域を示し得る。
【0152】
好ましい実施形態において、抗体は、MID9002タンパク質の管腔部分に結合し得る。別の実施形態において、抗体は、MID9002タンパク質の管腔外領域に結合する。
【0153】
好ましい実施形態において、抗体は、本明細書中に記載されるMID9002タンパク質上の任意のドメインまたは領域上のエピトープに結合する。
【0154】
さらに、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒトの抗体もまた、本発明の範囲内である。キメラ抗体、ヒト抗体、最も好ましくは完全ヒト抗体は、繰り返し投与を含む適用(例えば、ヒト患者の治療的処置、およびいくつかの診断的適用)に好ましい。
【0155】
キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体(ヒト部分および非ヒト部分の両方を含む)は、標準的な組換えDNA技術を使用して作製され得る。このようなキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、以下に記載される方法を使用して、当該分野で公知の組換えDNA技術により産生され得る(Robinsonら、国際特許出願PCT/US86/02269;Akiraら、欧州特許出願184,187;Taniguchi,欧州特許出願171,496;Morrisonら、欧州特許出願173,494;Neubergerら、PCT国際公開WO86/01533;Cabillyら、米国特許第4,816,567号;Cabillyら、欧州特許出願125,023;Betterら(1988)Science 240:1041−1043);Liuら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439−3443;Liuら、(1987)J.Immunol.139:3521−3526;Sunら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214−218;Nishimuraら (1987),Canc.Res.47:999−1005;Woodら(1985)Nature 314:446−449;ならびにShawら(1988),J.Natl.Cancer Inst.80:1553−1559を参照のこと)。
【0156】
ヒト化抗体または相補性決定領域(CDR)グラフト化抗体は、ドナーCDRと置換された少なくとも1つまたは2つ(しかし、一般に3つ全て)のレシピエント(重鎖免疫グロブリン鎖および/または軽鎖免疫グロブリン鎖の)CDRを有する。抗体は、非ヒトCDRの少なくとも一部と置換され得るか、またはCDRの一部のみが、非ヒトCDRで置換され得る。MID9002またはそのフラグメントに対するヒト化抗体の結合に必要とされるCDRの数を置換することだけが必要である。好ましくは、ドナーは、げっ歯類抗体(例えば、ラット抗体またはマウス抗体)であり、そしてレシピエントは、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークである。代表的に、CDRを提供する免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、そしてフレームワークを提供する免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。1つの実施形態において、ドナー免疫グロブリンは、非ヒト(例えば、げっ歯類)である。アクセプターフレームワークは、天然に存在する(例えば、ヒト)フレームワークまたはコンセンサスフレームワーク、あるいはこれらに約85%以上、好ましくは、90%、95%、99%以上同一である配列である。
【0157】
本明細書中で使用される場合、用語「コンセンサス配列」は、あるファミリーの関連する配列において最も頻繁に生じるアミノ酸(またはヌクレオチド)から形成される配列をいう(例えば、Winnaker,(1987)From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germanyを参照のこと)。あるファミリーのタンパク質において、コンセンサス配列中の各位置が、そのファミリー中のその位置で最も頻繁に存在するアミノ酸によって占められる。2つのアミノ酸が同等に頻繁に生じる場合、いずれもコンセンサス配列中に含まれ得る。「コンセンサスフレームワーク」は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域をいう。
【0158】
抗体は、当該分野において公知の方法によってヒト化され得る。ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与しないFv可変領域の配列をヒトFv可変領域からの等価な配列で置換することによって生成され得る。ヒト化抗体を生成するための一般的な方法は、Morrison(1985)Science 229:1202−1207、Oiら、(1986)BioTechniques 4:214、ならびにQueenら米国特許第5,585,089号,同第5,693,761号および同第5,693,762号(これらの全ての内容が、本明細書中に参考として援用される)によって提供される。これらの方法は、重鎖および軽鎖のうちの少なくとも1つからの免疫グロブリンFv可変領域の全てまたは一部をコードする核酸配列を単離する工程、操作する工程、および発現する工程を包含する。このような核酸の供給源は、当業者に周知であり、例えば、MID9002ポリペプチドまたはそのフラグメントに対する抗体を産生するハイブリドーマより取得され得る。次いで、ヒト化抗体をコードする組換えDNAまたはそのフラグメントは、適切な発現ベクター中にクローニングされ得る。
【0159】
ヒト化抗体またはCDR移植された抗体は、CDR移植またはCDR置換によって産生され得、ここで、免疫グロブリン鎖のCDRのうち1つ、2つまたは全てが置換され得る。例えば、米国特許第5,225,539号;Jonesら(1986)Nature 321:552−525;Verhoeyanら 1988 Science 239:1534;Beidlerら(1988)J.Immunol.141:4053−4060;Winter 米国特許第5,225,539号(これら全ての内容が本明細書中に参考として明らかに援用される)を参照のこと。Winterは、本発明のヒト化抗体を調製するために使用され得るCDR移植方法を記載する(1987年3月26日に出願されたUK特許出願GB2188638A;Winter 米国特許第5,225,539号(この内容は参考として明らかに援用される)。
【0160】
特定のアミノ酸が置換、欠失または付加されているヒト化抗体はまた、本発明の範囲内である。好ましいヒト化抗体は、例えば、抗原に対する結合を改善するようにフレームワーク領域にアミノ酸置換を有する。例えば、ヒト化抗体は、ドナーフレームワーク残基に同一のフレームワーク残基を有するか、またはレシピエントフレームワーク残基以外の別のアミノ酸に同一のフレームワーク残基を有する。このような抗体を生成するために、ヒト化免疫グロブリン鎖の選択された少数のアクセプターフレームワーク残基は、対応するドナーアミノ酸で置換され得る。好ましい置換の位置は、CDRに隣接するアミノ酸残基またはCDRと相互作用し得るアミノ酸残基を含む(例えば、米国特許第5,585,089号を参照のこと)。ドナーからアミノ酸を選択するための基準は、米国特許第5,585,089号(例えば、米国特許第5,585,089号の12〜16欄、例えば、米国特許第5,585,089号の12〜16欄(この内容は、本明細書中に参考として援用される))に記載される。ヒト化抗体のための他の技術は、Padlanら、EP519596 A1(1992年12月23日公開)に記載される。
【0161】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置のために特に望ましい。このような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて生成され得る。例えば、LonbergおよびHuszar(1995,Int.Rev.Immunol.13:65−93);ならびに米国特許第5,625,126号;米国特許第5,633,425号;米国特許第5,569,825号;米国特許第5,661,016号;および米国特許第5,545,806号を参照のこと。さらに、Abgenix,Inc.(Fremont,CA)およびMedarex,Inc.(Princeton,NJ)のような会社は、上記に記載の技術に類似の技術を使用する選択された抗原に対して指向されるヒト抗体を提供することを保証し得る。
【0162】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「導かれた選択」として言及される技術を用いて生成され得る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体(例えば、マウス抗体)を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導く。この技術は、Jespersら(1994)Bio/Technology 12:899−903に記載される。
【0163】
抗MID9002抗体は、単鎖抗体であり得る。単鎖抗体(scFV)は、例えば、Colcherら(1999)Ann.NY Acad.Sci.880:263−80;およびReiter(1996)Clin.Cancer Res.2:245−52に記載されるように操作され得る。単鎖抗体は、同じ標的MID9002タンパク質の異なるエピトープに対する特異性を有する多価抗体を生成するために二量体化または多量体化され得る。
【0164】
好ましい実施形態において、抗体は、Fcレセプターに結合する低下した能力を有するかまたはその能力を有さない。例えば、これは、Fcレセプターに対する結合を支持しない、アイソタイプまたはサブタイプ、フラグメントまたは他の変異体である(例えば、変異誘発したかまたは欠失したFcレセプター結合領域を有する)。
【0165】
抗体(またはそのフラグメント)は、治療部分(例えば、細胞毒、治療剤または放射性イオン)に結合体化され得る。細胞毒または細胞毒性剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。例としては、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド(例えば、メイタンシノール(米国特許第5,208,020号を参照のこと)、CC−1065(米国特許第5,475,092号、同第5,585,499号、同第5,846,545号を参照のこと)およびこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗物質(例えば、メトキサレート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパ(thioepa)クロラムブシル、CC−1065、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシン(streptozotocin)、マイトマイシンC、およびシス−ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前は、ダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前は、アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、および抗分裂薬剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソールおよびメイタンシノイド)が挙げられるがこれらに限定されない。放射性イオンとしては、ヨウ素、イットリウム、およびプラセオジムが挙げられるがこれらに限定されない。
【0166】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を調節するために使用され得、薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定するように解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所定の生物学的応答を保持するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、トキシン(例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、またはジフテリアトキシン);タンパク質(例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子;または生物学的応答変更因子(例えば、リンホカイン、インターロイキン−1(「IL−1」)、インターロイキン−2(「IL−2」)、インターロイキン−6(「IL−6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM−CSF」)、顆粒球コロニー刺激因子(「G−CSF」)、あるいは他の増殖因子が挙げられ得る。
【0167】
あるいは、抗体は、二次抗体と結合され、Segal(米国特許第4,676,980号)によって記載されるような抗体へテロ結合体を形成し得る。
【0168】
抗MID9002抗体(例えば、モノクローナル抗体)を使用して、標準的技術(例えば、アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降)によってMID9002を単離し得る。さらに、抗MID9002抗体を使用して、このタンパク質発現の多さおよびパターンを評価するために、(例えば、細胞溶解物または細胞上清において)MID9002タンパク質を検出し得る。抗MID9002抗体を診断的に使用して、臨床試験手順の一部として(例えば、所定の処置レジメンの効率を決定するために)組織中のタンパク質レベルをモニタリングし得る。検出は、抗体を検出可能な物質に結合すること(すなわち、抗体標識)によって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ;適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられ;適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオロセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ;発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ;生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ;そして適切な放射活性物質の例としては、125I、131I、35Sまたは3Hが挙げられる。
【0169】
好ましい実施形態において、抗体は、精製されたMID9002抗原またはそのフラグメント(例えば、本明細書中に記載されるフラグメント)、膜結合抗原、組織(例えば、粗製組織調製物)、細胞全体、好ましくは生存細胞、溶解した細胞、または細胞画分(例えば、膜画分)を用いて免疫することにより作成され得る。
【0170】
ネイティブMID9002タンパク質のみに結合するか、変性したかもしくは他の非ネイティブMID9002タンパク質のみに結合するか、または両方に結合する抗体は、本発明の範囲内である。線状エピトープまたはコンホメーションエピトープを有する抗体は、本発明の範囲内である。コンホメーションエピトープは、ネイティブMID9002タンパク質に結合するが変性MID9002タンパク質に結合しない抗体を同定することにより同定され得る。
【0171】
(組換え発現ベクター、宿主細胞および遺伝子操作された細胞)
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、好ましくは、発現ベクターを含む。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子をいい、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターを含み得る。ベクターは、自律的な複製を行い得るか、または宿主DNA内に組み込み得る。ウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。
【0172】
ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適切な形態でMID9002核酸を含み得る。好ましくは、組換え発現ベクターは、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結された1つ以上の調節配列を含む。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含む。調節配列は、核酸配列の構成的発現、ならびに組織特異的調節および/または誘導性配列を指向する配列を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質発現レベルなどのような因子に依存し得る。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入され得、これにより本明細書中に記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチド(融合タンパク質またはポリペプチドを含む)(例えば、MID9002タンパク質、MID9002タンパク質の変異形態、融合タンパク質など)を産生し得る。
【0173】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるMID9002タンパク質の発現のために設計され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、E.coli、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、さらにGoeddel,(1990)Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CAに議論される。あるいは、組換え発現ベクターは、(例えば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを使用して)インビトロで転写および翻訳され得る。
【0174】
原核生物におけるタンパク質発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、ほとんどE.coliにて行われる。融合ベクターは、多くのアミノ酸を個々でコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、典型的に以下の3つの目的で働く:1)組換えタンパク質の発現を増加させるため;2)組換えタンパク質の溶解度を増加させるため;および3)アフィニティ精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製における補助のため。しばしば、タンパク質分解性切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との連結部に導入され、そして組換えタンパク質の融合部分からの分離、続く融合タンパク質の精製を可能にする。このような酵素およびこれらの同族認識配列は、第Xa因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、pGEX(Pharmacia Biotech Inc;SmithおよびJohnson(1988)Gene 67:31−40),pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)およびpRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)(これらはそれぞれ、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAを標的組換えタンパク質に融合する)が挙げられる。
【0175】
精製された融合タンパク質は、MID9002活性アッセイ(例えば、以下に詳細に記載される直接アッセイまたは競合アッセイ)において、またはMID9002タンパク質に特異的または選択的な抗体を生成するために使用され得る。好ましい実施形態において、本発明のレトロウイルス発現ベクターにおいて発現される融合タンパク質を使用して、骨髄細胞を感染し続いて照射したレシピエントに移植し得る。次いで、被験体レシピエントの病理学は、十分な時間が経過した後(例えば、6週間)に試験される。
【0176】
E.coliにおける組換えタンパク質発現を最大化することは、その組換えタンパク質をタンパク質分解性切断する減弱した能力を有する宿主細菌中でタンパク質を発現することである(Gottesman(1990)Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,California 119−128)。別のストラテジーは、各アミノ酸に対する個々のコドンがE.coli中で優先的に利用されるものであるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変更することである(Wadaら(1992)Nucleic Acids Res.20:2111−2118)。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的DNA合成技術によって行われ得る。
【0177】
MID9002発現ベクターは、酵母発現ベクター、昆虫細胞内での発現のためのベクター(例えば、バキュロウイルス発現ベクター)または哺乳動物細胞内での発現に適切なベクターであり得る。
【0178】
哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによってしばしば提供され得る。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40由来である。
【0179】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向し得る(例えば、組織特異的調節エレメントが核酸の発現に使用される)。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的;Pinkertら(1987)Genes Dev.1:268−277)、リンパ特異的プロモーター(CalameおよびEaton(1988)Adv.Immunol.43:235−275)、T細胞レセプターの特定のプロモーター(WinotoおよびBaltimore(1989)EMBO J.8:729−733)、および免疫グロブリン(Banerjiら(1983)Cell 33:729−740;QueenおよびBaltimore(1983)Cell 33:741−748)、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター;ByrneおよびRuddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473−5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlundら(1985)Science 230:912−916)、および乳腺特異的プロモーター(例えば、乳清ホエープロモーター;米国特許第4,873,316号および欧州特許出願公開番号264,166号)が挙げられる。発生的に調節されるプロモーター(例えば、マウスhoxプロモーター(KesselおよびGruss(1990)Science 249:374−379)およびα−フェトプロテインプロモーター(CampesおよびTilghman(1989)Genes Dev.3:537−546))がまた、含まれる。
【0180】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。種々の細胞型のアンチセンスRNAの、構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指示する、アンチセンスの向きでクローニングされた核酸に対して作動可能に連結された調節配列(例えば、ウイルスプロモーターおよび/またはエンハンサー)が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、Weintraubら、(1986)Reviews−Trends in Genetics 1:1を参照のこと。
【0181】
本発明の別の局面は、本明細書中に記載された核酸分子(例えば、組換え発現ベクター内のMID9002核酸分子、またはMID9002核酸分子が宿主細胞ゲノムの特定の部位中に相同的に組換えることを可能とする配列を含むMID9002核酸分子)を含有する宿主細胞を提供する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をいう。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において存在し得るので、このような子孫は、実際、親の細胞と同一でなくてもよいが、なお、本明細書中で使用されるようなこの用語の範囲内に含まれる。
【0182】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、MID9002タンパク質は、細菌細胞(例えば、E.coli)、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)またはCV−1を起源とするSV40(COS)細胞)で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【0183】
ベクターDNAは、従来的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して宿主細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸(例えば、DNA)を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。
【0184】
本発明の宿主細胞を使用して、MID9002タンパク質を生成(すなわち、発現)し得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用してMID9002タンパク質を生成するための方法を提供する。1つの実施形態において、この方法は、MID9002タンパク質が生成されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞(この中に、MID9002タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている)を培養する工程を、包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞からMID9002タンパク質を単離する工程を包含する。
【0185】
別の局面において、本発明は、細胞、またはMID9002トランスジーンを含有する細胞もしくはそれ以外にMID9002を誤って発現する(misexpress)細胞からの精製調製物を特徴とする。この細胞調製物は、ヒト細胞または非ヒト細胞(例えば、げっ歯類細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)、ウサギ細胞、またはブタ細胞)からなり得る。好ましい実施形態において、細胞はMID9002トランスジーン(例えば、MID9002の異種形態、例えば、(非ヒト細胞の場合の)ヒト由来の遺伝子)を、含有する。このMID9002トランスジーンは、誤って発現(例えば、過剰発現または寡少発現(underexpress))され得る。別の好ましい実施形態において、細胞は、内在性MID9002を誤って発現する遺伝子(例えば、遺伝子発現が損なわれる遺伝子(例えば、ノックアウト))を含有し得る。このような細胞は、変異したMID9002対立遺伝子、または誤って発現されたMID9002対立遺伝子に関係する障害を研究するためのモデル、または薬物スクリーニングにおける使用のためのモデルとして使用され得る。
【0186】
別の局面において、本発明は、本発明のMID9002ポリペプチドをコードする核酸で形質転換されたヒト細胞(例えば、血球幹細胞)を、特徴とする。
【0187】
また、細胞、好ましくはヒト細胞(例えば、ヒト血球系細胞または線維芽細胞)が提供され、この細胞中では、内因性MID9002が、正常では内因性MID9002遺伝子の発現を制御しない調節配列の制御下にある。細胞(例えば、細胞株または微生物)中の内因性遺伝子の発現特徴は、挿入された調節エレメントが内因性MID9002遺伝子に作動可能に連結されるように、細胞のゲノム中に異種性のDNA調節エレメントを挿入することによって改変され得る。例えば、「転写的にサイレント」(例えば、正常では発現されない)であるか、または極低レベルでのみ発現される内因性MID9002遺伝子を、その細胞中で正常に発現される遺伝子産物の発現を促進し得る調節性エレメントを挿入することによって、活性化し得る。標的化相同組換えのような技術を使用して、例えば、1991年5月16日に発行されたChappel、米国特許第5,272,071号;WO 91/06667に記載されるように、異種性DNAを挿入し得る。
【0188】
(トランスジェニック動物)
本発明は、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。このような動物は、MID9002タンパク質の機能および/または活性を研究するため、ならびにMID9002の活性の調節因子を同定および/または評価するために、有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、その動物の細胞の1つ以上がトランスジーンを含有する、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットもしくはマウスにようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。トランスジーンとは、トランスジェニック動物の細胞のゲノム中に組み込まれるか、またはゲノム中に生じる、外因性DNAまたは再配置(例えば、内因性染色体DNAの欠失)である。トランスジーンは、トランスジェニック動物の1つ以上の細胞型もしくは組織においてコードされる遺伝子産物の発現を指令し得、他のトランスジーン(例えば、ノックアウト)は、発現を減少させる。従って、トランスジェニック動物は、内因性MID9002遺伝子が、例えば、内因性遺伝子と、その動物の発生前にその動物の細胞(例えば、動物の胚細胞)中に導入された外因性DNAとの間の相同組換えによって、変更された動物である。
【0189】
イントロン配列およびポリアデニル化シグナルはまた、トランスジーンの発現の効率を増加させるためにトランスジーン中に含まれ得る。組織特異的調節配列は、特定の細胞に対してMID9002タンパク質の発現を指向するために、本発明のトランスジーンに作動可能に連結され得る。トランスジェニック創始動物は、そのゲノムにおけるMID9002トランスジーンの存在および/またはこの動物の組織もしくは細胞におけるMID9002 mRNAの発現に基づいて、同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物を使用して、トランスジーンを保有するさらなる動物を育種する。さらにMID9002タンパク質をコードするトランスジーンを保有するトランスジェニック動物は、さらに、他のトランスジーンを有する他のトランスジェニック動物と交配され得る。
【0190】
MID9002タンパク質またはMID9002ポリペプチドは、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物において発現され得る(例えば、このタンパク質またはペプチドをコードする核酸が、動物のゲノム中に導入され得る)。好ましい実施形態において、この核酸を、組織特異的なプロモーター(例えば、母乳特異的プロモーターまたは卵特異的プロモーター)の制御下に配置し得、そして動物により産生される母乳または卵から回収され得る。適切な動物は、マウス、ブタ、ウシ、ヤギおよびヒツジである。
【0191】
本発明はまた、例えば、以下に考察されるような、トランスジェニック動物由来の細胞集団を包含する。
【0192】
(使用)
本明細書中に記載される核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、および抗体は、以下の方法の1以上に使用され得る:a)スクリーニングアッセイ;b)予測的な医薬品(例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験のモニタリング、および薬理遺伝学);ならびにc)処置方法(例えば、治療および予防)。
【0193】
本発明の単離された核酸分子を使用して、MID9002タンパク質を(例えば、遺伝子治療の適用における、宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して)発現し得、(例えば、生物学的サンプル中の)MID9002 mRNAを検出し得、またはMID9002遺伝子中の遺伝子の変更を検出し得、そして以下にさらに記載されるように、MID9002の活性を調節し得る。MID9002タンパク質を使用して、MID9002基質の不十分な産生もしくは過剰な産生またはMID9002インヒビターの産生によって特徴付けられる障害を処置し得る。さらに、MID9002タンパク質を使用して、天然に存在するMID9002の基質についてスクリーニングし得、MID9002活性を調節する薬物または化合物をスクリーニングし得、ならびにMID9002野生型タンパク質と比較して、減少した活性、異常な活性または所望されない活性(例えば、異常または欠損したスルファターゼの機能または発現)を有する、MID9002タンパク質またはMID9002タンパク質形態の生成物の不十分な生成または過剰な生成によって特徴付けられる障害(例えば、肺癌、結腸癌および乳癌を含む、細胞増殖、細胞分化障害)を、処置し得る。さらに、本発明の抗MID9002抗体を使用して、MID9002タンパク質を検出および単離し得、MID9002タンパク質の生物利用能を調節し得、そしてMID9002活性を調節し得る。
【0194】
例えば、本発明のMID9002ポリペプチドと相互作用する(例えば、結合する)能力について化合物を評価する方法を提供する。この方法は、以下を包含する:本発明のMID9002ポリペプチドと化合物とを接触させる工程;および化合物がこの本発明のMID9002ポリペプチドと相互作用する(例えば、結合するか、または複合体を形成する)能力を評価する工程。この方法は、インビトロ(例えば、無細胞系)でか、またはインビボ(ツーハイブリッド相互作用トラップアッセイ)で実施され得る。この方法を使用して、本発明のMID9002ポリペプチドと相互作用する、天然に存在する分子を同定し得る。またこの方法を使用して、本発明のMID9002ポリペプチドの天然インヒビターまたは合成インヒビターを見出し得る。スクリーニング方法を、以下により詳細に考察する。
【0195】
(スクリーニングアッセイ)
本発明は、MID9002タンパク質に結合するか、例えばMID9002発現もしくはMID9002活性に対する刺激作用もしくは阻害作用を有するか、または例えばMID9002基質の発現または活性化に対する刺激作用または阻害作用を有する、モジュレーター、すなわち候補または試験の化合物または因子(例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、低分子または他の薬物)を同定するための方法(本明細書中でスクリーニングアッセイともいわれる)を提供する。このように、同定された化合物を使用して、治療プロトコル中で標的遺伝子産物(例えば、MID9002遺伝子)の活性を調節し得るか、標的遺伝子産物の生物学的機能を調節し得るか、または正常な標的遺伝子の相互作用を破壊(disrupt)する化合物を、同定し得る。
【0196】
1つの実施形態において、本発明は、MID9002タンパク質もしくはMID9002ポリペプチド、またはその生物学的に活性な部分の基質である、候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、MID9002タンパク質もしくはMID9002ポリペプチド、またはその生物学的に活性な部分に結合するかまたはその活性を調節する、候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【0197】
本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー方法(生物学的ライブラリー;ペプトイドライブラリー(ペプチドの機能を有するが、酵素的分解に対して耐性であるがそれでもなお生物学的に活性なままである、新規の非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー;例えば、Zuckermannら(1994)J.Med.Chem.37:2678−85を参照のこと);空間的にアドレス可能な並行の固相または溶液相ライブラリー;デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法;「1ビーズ1化合物」ライブラリー法;およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法を含む)における任意の多くのアプローチを使用して獲得され得る。生物学的ライブラリーアプローチおよび、ペプチドライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されず、一方、他の4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12:145)。
【0198】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、例えば、以下において、当該分野で見出され得る:DeWittら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909−13;Erbら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422−426;Zuckermannら(1994)、J.Med.Chem.37:2678−85;Choら(1993)Science 261:1303;Carrellら(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carellら(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;およびGallopら(1994)J.Med.Chem.37:1233−51。
【0199】
化合物のライブラリーは、溶液中に存在し得るか(例えば、Houghten(1992)Biotechniques 13:412〜421)、ビーズ上(Lam(1991)Nature 354:82〜84)、チップ上(Fodor(1993)Nature 364:555〜556)、細菌上(Ladner、米国特許第5,223,409号)、芽胞上(Ladner、米国特許第5,223,409号)、プラスミド上(Cullら(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:1865〜1869)またはファージ上(ScottおよびSmith(1990)Science 249:386〜390;Devlin(1990)Science 249:404〜406;Cwirlaら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:6387〜6382;Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301〜310;Ladner 前出)であり得る。
【0200】
1つの実施形態では、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、ここでMID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞を、試験化合物と接触させ、そして試験化合物がMID9002活性を調節する能力を決定する。試験化合物がMID9002活性を調節する能力の決定を、例えば、スルファターゼ機能をモニターすることによって成し得る。例えばこの細胞は、哺乳動物由来(例えば、ヒト)であり得る。
【0201】
試験化合物が化合物(例えば、MID9002基質)に結合するMID9002を調節する能力、またはMID9002に結合する能力をまた、評価し得る。このことは、例えば、化合物(例えば、基質)を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせることによって達成され得、その結果、複合体中の標識された化合物(例えば、基質)を検出することによって、化合物(例えば、基質)のMID9002への結合を決定し得る。あるいは、MID9002を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせて、複合体中で試験化合物がMID9002基質に結合するMID9002を調節する能力をモニタリングし得る。例えば、化合物(例えば、MID9002基質)を、125I、14C、35S、または3Hで、直接的または間接的のいずれかで標識し得、そしてこの放射性同位体が、放射線放射の直接的な計数によってか、またはシンチレーション計数によってかで検出され得る。あるいは、化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そして適切な基質産物への変換を定量することによって、この酵素標識を検出し得る。
【0202】
化合物(例えば、MID9002基質)が、任意の相互作用体(interactant)の標識化を有するMID9002またはこれを有さないMID9002と相互作用する能力を、評価し得る。例えば、微小生理機能測定器(microphysiometer)を使用して、化合物またはMID9002のいずれかの、標識化を有さないMID9002との化合物の相互作用を測定し得る。McConnellら(1992)Science 257:1906−1912。本明細書中で使用される場合、「微小生理機能測定器」(例えば、Cytosensor)は、光でアドレス可能な電位差測定センサー(LAPS)を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する、分析装置である。この酸性化速度の変化は、化合物とMID9002との間の相互作用の指標として使用され得る。
【0203】
なお別の実施形態において、MID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、そして試験化合物がMID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力を評価する、無細胞アッセイを提供する。本発明のアッセイに使用するためのMID9002タンパク質の好ましい生物学的に活性な部分としては、非MID9002分子と相互作用する役割を持つフラグメント(例えば、高い表面存在可能性スコアを有するフラグメント)が挙げられる。
【0204】
本発明の無細胞アッセイにおいて、単離したタンパク質(例えば、MID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分)の可溶性形態および/または膜結合形態を、使用し得る。膜結合形態のタンパク質を使用する場合、可溶化剤を利用することが望ましい。このような可溶化剤の例としては、以下のような非イオン性界面活性剤が挙げられる:n−オクチルグルコシド、n−ドデシルグルコシド、n−ドデシルマルトシド、オクタノイル−N−メチルグルカミド、デカノイル−N−メチルグルカミド、Triton(登録商標)X−100、Triton(登録商標)X−114、Thesit(登録商標)、イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)n(Isotridecypoly(ethylene glycol ether)n)、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホネート(3−[(3−cholamidopropyl)dimethylamminio]−1−propane sulfonate)(CHAPS)、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート(3−[(3−cholamidopropyl)dimethylamminio]−2−hydroxy−1−propane sulfonate)(CHAPSO)、またはN−ドデシル=N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート。
【0205】
無細胞アッセイは、2つの成分が相互作用しそして結合し、従って除去および/または検出され得る複合体を形成し得る条件下かつそのために十分な時間をかけて、標的遺伝子タンパク質および試験化合物の反応混合物を調製する工程を、包含する。
【0206】
2つの分子間の相互作用をまた、例えば、蛍光エネルギー転移(FET)を使用して検出し得る(例えば、Lakowiczら、米国特許第5,631,169号;Stavrianopoulosら、米国特許第4,868,103号を参照のこと)。第1標識「ドナー」分子上のフルオロフォアは、その放射した蛍光エネルギーが、第2「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収され、次いで吸収エネルギーに起因して蛍光発光し得るように、選択される。あるいは、この「ドナー」タンパク質分子は、単に、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用してもよい。異なる光波長を放射する標識を選択して、その結果、「アクセプター」分子標識は、「ドナー」分子標識から識別され得る。これら標識間のエネルギー転移の効率は、分子を隔てる距離の関係するので、これら分子間の空間関係を評価し得る。2つの分子間で結合が生じる状態では、このアッセイにおいて「アクセプター」分子標識の蛍光放射は最大となるはずである。FET結合事象を、当該分野で周知の標準的な蛍光検出手段を介して(例えば、蛍光測定器を用いて)、簡便に測定し得る。
【0207】
別の実施形態において、MID9002タンパク質が標的分子に結合する能力の決定を、リアルタイムの生体分子相互作用分析(Biomolecular Interaction Analysis)(BIA)を使用して達成し得る(例えば、SjolanderおよびUrbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338〜2345、ならびにSzaboら(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699〜705を参照のこと)。「表面プラズモン共鳴(surface plasmon resonance)」または「BIA」は、いずれの相互作用物(例えば、BIAcore)も標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する。結合表面の質量の変化(結合事象を表す)は、表面付近の光の屈折率の変化(表面プラズモン共鳴の光学的現象(optical phenomenon)(SPR))を生じ、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として使用され得る、検出可能なシグナルを生じる。
【0208】
1つの実施形態において、標的遺伝子産物または試験基質を、固相上に係留する(anchor)。固相上に係留した標的遺伝子産物/試験化合物の複合体を、反応終了時に検出し得る。好ましくは、標的遺伝子産物を固相表面上に係留し得、そして(係留されていない)試験化合物を、本明細書中で考察される検出可能な標識で、直接的または間接的のいずれかで標識し得る。
【0209】
MID9002、抗MID9002抗体またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合体化形態からの複合体化形態の分離を容易にし、そしてこのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物のMID9002タンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下でのMID9002タンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するのに適切な任意の容器内で成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。1つの実施形態において、そのタンパク質の一方または両方をマトリックスに結合することを可能にするドメインを追加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/MID9002の融合タンパク質またはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ/標的の融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical、St.Louis、MO)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで、これらを、試験化合物と混ぜ合わせるか、あるいは試験化合物および非吸着の標的タンパク質またはMID9002タンパク質のいずれかと混ぜ合わせ、そしてこの混合物を、複合体形成に貢献する条件下(例えば、塩およびpHに関して生理学的条件)でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば、上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ得、そしてMID9002結合レベルまたはMID9002活性レベルを標準的な技術を使用して決定し得る。
【0210】
MID9002タンパク質または標的分子のいずれかをマトリックス上に固定するための他の技術としては、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を使用することが挙げられる。ビオチン化されたMID9002タンパク質または標的分子を、当該分野において公知の技術を使用して、ビオチン−NHS(N−ヒドロキシスクシンイミド)から調製し得(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals、Rockford、IL)、そしてストレプトアビジンでコーティングした96ウェルのプレート(Pierce Chemical)のウェル中に固定し得る。
【0211】
このアッセイを行うために、非固定化成分を、係留された成分を含むコーティングされた表面に添加する。反応の完了後、形成された任意の複合体が固相表面上で依然として固定化されているような条件下で、未反応成分を取り除く(例えば、洗浄によって)。固相表面上に係留された複合体の検出を、多く方法で達成し得る。これまで固定化されない成分を予め標識する場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されることを示す。これまで固定化されない成分が予め標識されない場合、間接標識を使用して、表面上に係留された複合体を検出し得る:例えば、固定化成分に特異的または選択的な標識抗体の使用(次いで、この抗体は、直接的にか、または例えば標識された抗Ig抗体で間接的に標識され得る)。
【0212】
1つの実施形態において、MID9002タンパク質または標的分子と反応性であるが、MID9002タンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体を利用して、アッセイを実施する。このような抗体は、プレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはMID9002タンパク質が、抗体の結合体化によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、GST固定化複合体に関しての上記のものに加えて、MID9002タンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびにMID9002タンパク質または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【0213】
あるいは、無細胞アッセイを液相中で行い得る。このようなアッセイにおいて、以下に挙げられる任意の多くの標準的な技術によって、反応生成物を未反応成分から分離するが、これらに限定されない:差次的遠心分離(例えば、RivasおよびMinton(1993)Trends Biochem Sci 18:284−7を参照のこと);クロマトグラフィー(ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー);電気泳動(例えば、Ausubelら編(1999)、Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiley;New York.を参照のこと);および免疫沈降(例えば、Ausubelら、編(1999)Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiley:New Yorkを参照のこと)。このような樹脂およびクロマトグラフィー技術は当業者に公知である(例えば、Heegaard(1998)J Mol Recognit 11:141−8;HageおよびTweed(1997)J Chromatogr B Biomed Sci Appl.699:499−525を参照のこと)。さらに、蛍光エネルギー転移をまた、本明細書中に記載されるように、うまく使用して、溶液からの複合体のさらなる精製なしに結合を検出し得る。
【0214】
好ましい実施形態において、このアッセイは、MID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分を、MID9002を結合する公知化合物と接触させてアッセイ混合物を形成する工程、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、および試験化合物がMID9002タンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、試験化合物がMID9002タンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、公知化合物と比較した場合、試験化合物が、好ましくMID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力、または標的分子の活性を調節する能力を決定する工程を包含する。
【0215】
本発明の標的遺伝子産物は、インビボで、1つ以上の細胞性高分子または細胞外高分子(例えば、タンパク質)と相互作用し得る。この考察の目的のために、このような細胞性高分子および細胞外高分子は、本明細書中で、「結合パートナー」といわれる。このような相互作用を無効化する化合物は、標的遺伝子産物の活性を調節するのに有用であり得る。このような化合物としては、抗体、ペプチドおよび低分子のような分子が挙げられ得るが、これらに限定されない。この実施形態における使用のための好ましい標的遺伝子/生成物は、本明細書中で同定されたMID9002遺伝子である。代替の実施形態において、本発明は、試験化合物が、MID9002標的分子の下流のエフェクターの活性の調節を介して、MID9002タンパク質の活性を調節する能力を決定するための方法を、提供する。例えば、これまでに記載されたように、適切な標的に対するエフェクター分子の活性を決定し得るか、またはエフェクターの適切な標的に対する結合を決定し得る。
【0216】
標的遺伝子産物と、その細胞性結合パートナーまたは細胞外結合パートナーとの間の相互作用を妨害する化合物を同定するために、標的遺伝子産物および結合パートナーを含有する反応混合物を、2つの成分が複合体を形成し得るような条件下かつそのために十分な時間をかけて、調製する。阻害性因子を試験するために、反応混合物を試験化合物の存在下および非存在下で提供する。試験化合物は、最初に、反応混合物中に含まれ得るか、またはある時点で添加され得、続いて標的遺伝子およびその細胞性結合パートナーまたは細胞外結合パートナーを添加する。コントロールの反応混合物を、試験化合物なしでかまたはプラセボと一緒にインキュベートする。次いで、標的遺伝子産物と、細胞性結合パートナーまたは細胞外結合パートナーとの間の任意の複合体の形成を検出する。コントロール反応中で複合体を形成するが、試験化合物を含有する反応混合物中では複合体を形成しないことは、化合物が標的遺伝子産物と相互作用性結合パートナーとの相互作用を妨害することを示す。さらに、試験化合物および正常な標的遺伝子産物を含有する反応混合物中の複合体形成をまた、試験化合物および変異体標的遺伝子産物を含有する反応混合物中の複合体形成と比較し得る。この比較は、変異体標的遺伝子産物の相互作用を無効化するが、正常な標的遺伝子産物の相互作用は無効化しない化合物を同定することが望ましい場合に、重要であり得る。
【0217】
これらのアッセイは、不均一形式または均一形式で行われ得る。不均一系アッセイは、標的遺伝子産物またはその結合パートナーのいずれかを固相上に係留する工程、および反応終了時に固相上に係留された複合体を検出する工程を、包含する。均一系アッセイにおいて、全反応を液相中で実行する。別のアプローチにおいて、試験される化合物についての差次的な情報を獲得するために、反応物の添加の順序を変化し得る。例えば、標的遺伝子産物とその結合パートナーとの間の相互作用を、例えば、競合によって妨害する試験化合物を、試験基質の存在下で反応を行うことによって同定し得る。あるいは、形成された複合体を無効化する試験化合物(例えば、複合体から成分のうちの1つを置き換える、より高い結合定数を有する化合物)を、複合体が形成した後に反応混合物中に試験化合物を添加することによって試験し得る。種々の形式を、以下に簡潔に記載する。
【0218】
不均質のアッセイ系において、標的遺伝子産物または反応性(interactive)細胞結合パートナーもしくは細胞外結合パートナーのいずれかは、固体表面(例えば、マイクロタイタープレート)上に固着され、一方で非固着種が直接または間接的に標識される。固着種は、非共有結合または共有結合によって固定され得る。あるいは、固着される種に特異的または選択的な固定化抗体は、固体表面への種の固着のために使用され得る。
【0219】
アッセイを行うために、固定化種のパートナーは、試験化合物でコーティングされた表面か、試験化合物でコーティングされていない表面に曝露される。反応が完結した後、未反応の成分が除去され(例えば、洗浄によって)、そして任意の形成された複合体は、固体表面上に固定化されたままである。非固定化種が前標識される場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。非固定化種が前標識されていない場合、間接標識は、表面に固着された複合体を検出するために使用され得る;例えば、始めに非固定化種に特異的または選択的な標識抗体を用いて(次いで、抗体は、例えば、標識化抗Ig抗体で直接標識され得るかまたは間接的に標識され得る)。反応成分の添加の順番に依存して、複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を破壊する試験化合物が、検出され得る。
【0220】
あるいは、この反応は、試験化合物の存在下または非存在下で液体層で実行され得、反応産物は、未反応成分から分離され、そして複合体が検出される;例えば、溶液中で形成される任意の複合体を固着させる結合成分の1つに特異的または選択的な固定化抗体、および固着された複合体を検出する他のパートナーに特異的または選択的な標識化抗体を用いて。再度、液相への反応物の添加の順番に依存して、複合体を阻害するか、または予め形成された複合体を破壊する試験化合物が、同定され得る。
【0221】
本発明の代替の実施形態において、均質のアッセイが使用され得る。例えば、標的遺伝子産物のおよび反応性細胞結合パートナー産物または細胞外結合パートナー産物の予め形成された複合体は、標的遺伝子産物が標識されるか、またはその結合パートナーが標識されるかのいずれかで調製されるが、標識によって生成されるシグナルは、複合体形成に起因してクエンチされる(このアプローチを免疫アッセイのために利用する米国特許第4,109,496号を参照のこと)。予め形成された複合体由来の種の1つと競合し、そして置換する試験物質の添加は、バックグラウンドを上回るシグナルの生成を生じる。この方法において、標的遺伝子産物結合パートナー相互作用を破壊する試験物質が、同定され得る。
【0222】
なお別の局面において、MID9002タンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ(例えば、米国特許第5,283,317号;Zervosら、(1993)Cell 72:223〜232;Maduraら(1993)J.Biol.Chem.268:12046〜12054;Bartelら(1993)Biotechniques 14:920〜924;Iwabuchiら(1993)Oncogene 8:1693−1696;およびBrent WO94/10300を参照のこと)において「ベイト(bait)タンパク質」として使用されて、MID9002(「MID9002−結合タンパク質」または「MID9002−bp」)と結合または相互作用し、そしてMID9002活性に関する他のタンパク質を同定し得る。このようなMID9002−bpは、例えば、MID9002媒介性シグナル伝達経路の下流エレメントのような、MID9002タンパク質またはMID9002標的によるシグナルのアクティベーターまたはインヒビターであり得る。
【0223】
ツーハイブリッドシステムは、大半の転写因子のモジュラー性質に基づき、これは別個のDNA結合ドメインおよび活性化ドメインからなる。手短には、このアッセイは、2つの異なるDNA構築物を利用する。1つの構築において、MID9002タンパク質をコードする遺伝子は、公知の転写因子(例えば、GAL−4)のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他の構築において、同定されていないタンパク質(「プレイ(prey)」または「サンプル」)をコードするDNA配列のライブラリー由来のDNA配列は、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。(あるいは:MID9002タンパク質は、活性化ドメインに融合され得る)。「ベイト」タンパク質および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してMID9002依存性複合体を形成し得る場合、転写因子のDNA結合ドメインおよび活性化ドメインは、密接に近くにされる。このように近くにすることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子(例えば、lacZ)の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現は検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーは、単離され得、そしてMID9002タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用され得る。
【0224】
別の実施形態において、MID9002発現のモジュレーターが、同定される。例えば、細胞または細胞を含有しない混合物は、候補化合物と接触させられ、そしてMID9002mRNAまたはタンパク質の発現は、候補化合物の非存在下でMID9002mRNAまたはタンパク質の発現のレベルに相関して上昇した。MID9002mRNAまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりもその存在下で大きい場合、候補化合物は、MID9002mRNAまたはタンパク質発現の刺激因子として同定される。あるいは、MID9002mRNAまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりもその存在下でより少ない(統計学的に有意に少ない)場合、候補化合物は、MID9002mRNAまたはタンパク質発現のインヒビターとして同定される。MID9002mRNAまたはタンパク質発現のレベルが、MID9002mRNAまたはタンパク質の検出について本明細書中に記載される方法によって決定され得る。
【0225】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるアッセイの2つ以上の組み合わせに関する。例えば、調節剤は、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを用いて同定され得、そしてMID9002タンパク質の活性を調節する因子の能力は、例えば、動物(例えば、肺癌、結腸癌および乳癌を含む、細胞増殖障害または細胞分化障害のための動物モデル)においてインビボで確認され得る。
【0226】
本発明は、さらに上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤に関する。従って、このような薬剤での処置の効果、毒性、副作用、または作用機構を決定するための適切な動物モデルにおいて、本明細書中で記載されるように同定された薬剤(例えば、MID9002調節剤、アンチセンスMID9002核酸分子、MID9002特異的抗体、またはMID9002結合パートナー)をさらに使用することは本発明の範囲内である。さらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤は、本明細書中で使用される処置のために使用され得る。
【0227】
(検出アッセイ)
本明細書中で同定された核酸配列の一部またはフラグメントは、ポリヌクレオチド試薬として使用され得る。例えば、これらの配列は、以下のために使用され得る:(i)染色体上のその各々の遺伝子をマップするため(例えば、遺伝性疾患に関連する遺伝子領域を位置決めするため、またはMID9002と疾患を関係付けるため);(ii)わずかな生物学的サンプルからの個体を同定するため(組織タイピング);および(iii)生物学的サンプルの法医学的同定における補助。これらの適用は、以下の小節に記載される。
【0228】
(染色体マッピング)
MID9002ヌクレオチド配列またはその一部は、MID9002遺伝子の位置を染色体上にマッピングするために使用され得る。このプロセスは、染色体マッピンングといわれる。染色体マッピングは、疾患と関連する遺伝子とMID9002配列との相関において有用である。
【0229】
手短には、MID9002遺伝子は、MID9002ヌクレオチド配列からPCRプライマー(好ましくは15−25 bp長)を調製することによって染色体にマッピングされ得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングについて有用であり得る。MID9002配列に対応するヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが、増幅したフラグメントを産生する。
【0230】
各細胞株が、単一のヒト染色体、または少数のヒト染色体、および完全なセットのマウス染色体のいずれかを含む、体細胞ハイブリッドのパネルは、特定のヒト染色体に対する個々の遺伝子の容易なマッピングを可能にし得る(D’Eustachioら(1983)Science 220:919−924)。
【0231】
他のマッピングストラテジー(例えば、インサイチュハイブリダイゼーション(Fanら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6223−27に記載される)、標識化フローソート染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションによる事前選択)は、染色体の位置に対するMID9002のマッピングのために使用され得る。
【0232】
中期染色体拡散(spread)に対するDNA配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、1工程にて正確な染色体位置を提供するためにさらに使用され得る。このFISH技術は、500塩基または600塩基程度の短さのDNA配列を用いて使用され得る。しかし、1,000塩基よりも大きいクローンは、特有の染色体位置に結合する傾向が高く、簡単な検出のために十分なシグナル強度を有する。好ましくは、1,000塩基、より好ましくは2,000塩基が、適切な時間で良好な結果をえるために十分である。この技術の概説について、Vermaら(1988)Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques(Pergamon Press,New York)を参照のこと。
【0233】
染色体マッピングのための試薬は、単一の染色体またはその染色体の単一部位をマークするために個々に使用され得るか、または試薬のパネルが複数の部位および/または複数の染色体をマークするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際にマッピングの目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内でより保存されがちであり、従って、染色体マッピング中のクロスハイブリダイゼーションの機会を増加させる。
【0234】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理学的位置は、遺伝子マップデータと相関し得る(このようなデータは、例えば、McKusick,Mendelian Inheritance in Man,Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを介してオンラインで利用可能)。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係は、例えば、Egelandら(1987)Nature,325:783−787に記載される、連鎖分析(物理学的に隣接した遺伝子の共同遺伝(co−inheritance))によって同定され得る。
【0235】
さらに、MID9002遺伝子に関する疾患に罹患した個体と罹患していない個体との間のDNA配列における相違が、決定され得る。変異が、いくつかまたは全ての罹患した患者において見出されるが、罹患していない患者では見出されない場合、変異は、特定の疾患の原因因子であるようである。罹患した個体および罹患していない個体の比較は、最初に一般に、染色体における構造的改変(例えば、そのDNA配列に基づくPCRを用いて染色体拡散から観察可能であるか、または検出可能である欠失または転座)を探すことを含む。最終的に、いくらかの個体由来の遺伝子の完全な配列決定は、変異の存在を確認するため、および多型から変異を区別するために実行され得る。
【0236】
(組織タイピング)
MID9002配列は、例えば、制限フラグメント長多型(RFLP)を用いて生物学的サンプルから個体を同定するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムDNAは、1つ以上の制限酵素で消化され、フラグメントは分離され(例えば、サザンブロットにて)、そしてプローブされて同定のためのバンドを産生する。本発明の配列は、RFLPのためのさらなるDNAマーカーとして有用である(米国特許第5,272,057号に記載される)。
【0237】
さらに、本発明の配列はまた、個体のゲノムの選択された部分の実際の1塩基ずつのDNA配列を決定するために使用され得る。従って、本明細書中に記載されるMID9002ヌクレオチド配列は、その配列の5’末端および3’末端から2つのPCRプライマーを調製するために使用され得る。次いで、これらのプライマーは、個体のDNAを増幅し、次いでその配列を決定するために使用され得る。この様式で調製された個体由来の対応するDNA配列のパネルは、特有の個体識別子を提供し得る。なぜならば、それぞれの個体は、対立遺伝子の差異に起因してこのようなDNA配列の特有のセットを有するからである。
【0238】
対立遺伝子改変体は、これらの配列のコード領域においてある程度まで生じ、そして非コード領域でかなりの程度生じる。いくつかの程度に対して、本明細書中に記載される配列の各々は、ある程度まで標準として使用され得、この基準に対して個体由来のDNAが同定の目的のために比較され得る。より多くの数の多型が、非コード領域で生じるために、より少ない配列しか、個体を区別するために必要でない。配列番号1の非コード配列は、それぞれ100塩基の非コード増幅配列を産生する約10〜1,000個のプライマーのパネルを用いて、ポジティブな個体の同定を提供し得る。予測されるコード配列(例えば、配列番号3の配列)が使用される場合、ポジティブな個体の同定のためにより適した数のプライマーは、500〜2,000である。
【0239】
本明細書中に記載されるMID9002ヌクレオチド配列由来の試薬のパネルが、個体について特有の識別データベースを作成するために使用される場合、これらの同様の試薬が、個体から組織を同定するために後に使用され得る。特有の同定データベースを用いると、生きていても、死んでいても、個体のポジティブな同定は、非常に小さい組織サンプルからなされ得る。
【0240】
(法医学的生物学における部分的MID9002配列の使用)
DNAベースの同定技術はまた、法医学的生物学において使用され得る。このような同定をするために、PCR技術は、組織(例えば、毛髪および皮膚)、または体液(例えば、犯罪現場で見出された血液、唾液、もしくは精液)のような非常に小さい生物学的サンプルから得られたDNA配列を増幅するために使用され得る。次いで、増幅された配列は、標準と比較され得、これによって生物学的サンプルの起源の同定を可能にする。
【0241】
本発明の配列は、ポリヌクレオチド試薬(例えば、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座に標的化されるPCRプライマー)を提供するために使用され得、これは、例えば、別の「同定マーカー」(すなわち、特定の個体に特有の別のDNA配列)を提供することによってDNAベースの法医学的識別子の信頼性を増強し得る。上述のように、実際の塩基配列情報は、制限酵素生成フラグメントによって形成されたパターンに対する正確な代替として、同定のために使用され得る。配列番号1の非コード領域に標的化された配列(例えば、少なくとも20塩基、好ましくは少なくとも30塩基の長さを有する配列番号1の非コード領域由来のフラグメント)は、特にこの使用に適切である。
【0242】
本明細書中に記載されるMID9002ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド試薬(例えば、特定の組織を同定するために例えば、インサイチュハイブリダイゼーション技術で使用され得る標識化プローブまたは標識可能プローブ)を提供するためにさらに使用され得る。これは、法医学者が、未知の起源の組織が示される場合において非常に有用であり得る。このようなMID9002プローブのパネルは、種および/または器官型によって組織を同定するために使用され得る。
【0243】
類似の様式において、これらの試薬(例えば、MID9002プライマーまたはプローブは、汚染について組織培養をスクリーニングするために使用され得る(すなわち、培養物中の異なる型の細胞の混合物の存在についてのスクリーニング)。
【0244】
(予測医学)
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイおよび治験のモニタリングが、それによって個体を処置するために予後(予測)目的で使用される、予測医学の分野に関する。
【0245】
一般に、本発明は、被験体が、病巣に関連する障害についての危険性があるか、またはMID9002をコードする遺伝子のミス発か否かを決定する方法を提供する。
【0246】
このような障害としては、例えば、MID9002遺伝子のミス発現に関する障害;胃腸系の障害が挙げられる。
【0247】
この方法は、以下の1つ以上を包含する:
被験体の組織において、MID9002遺伝子の発現に影響する変異の存在または非存在を検出する工程、または遺伝子の発現を制御する領域における変異(例えば、5’制御領域における変異)の存在または非存在を検出する工程;
被験体の組織において、MID9002遺伝子の構造を改変する変異の存在または非存在を検出する工程;
被験体の組織において、mRNAレベルでMID9002遺伝子のミス発現を検出する工程(例えば、非野生型のmRNAレベルを検出する工程);
被験体の組織において、タンパク質レベルで遺伝子のミス発現を検出する工程(例えば、非野生型のMID9002ポリペプチドレベルを検出する工程)。
【0248】
好ましい実施形態において、この方法は、以下の少なくとも1つの存在を確証する工程を包含する:MID9002遺伝子由来の1つ以上のヌクレオチドの欠失;遺伝子への1つ以上のヌクレオチドの挿入、点変異(例えば、遺伝子の1つ以上のヌクレオチドの置換、遺伝子の全体の染色体再配列(例えば、転座、逆位、または欠失)。
【0249】
例えば、遺伝的病巣を検出するための工程としては、以下が挙げられる:(i)配列番号1由来のセンス配列もしくはアンチセンス配列または天然に存在するその変異体、またはMID9002遺伝子と天然に会合する5’もしくは3’の隣接配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ/プライマー、を提供する工程;(ii)プローブ/プライマーを、組織の核酸に曝露する工程;ならびに核酸に対するプローブ/プライマーのハイブリダイゼーション(例えば、インサイチュハイブリダイゼーション)によって、遺伝的病巣の存在または非存在を検出する工程。
【0250】
好ましい実施形態において、ミス発現を検出する工程は、以下の少なくとも1つの存在を確認する工程を包含する:MID9002遺伝子のメッセンジャーRNA転写のレベルにおける改変;遺伝子のメッセンジャーRNA転写の非野生型スプライシングパターンの存在;または非野生型のMID9002レベル。
【0251】
本発明の方法は、出生前か、または被験体の子孫が障害の危険性を有するか否かを決定するために使用され得る。
【0252】
好ましい実施形態において、本方法は、MID9002遺伝子の構造、障害の危険性について指標である異常な構造を決定する工程を包含する。
【0253】
好ましい実施形態において、本方法は、被験体由来のサンプルを、MID9002タンパク質に対する抗体またはその遺伝子と特異的にハイブリダイズする核酸と接触させる工程を包含する。これらおよび多の実施形態は以下に考察される。
【0254】
(診断および予後アッセイ)
生物学的サンプル中のMID9002タンパク質または核酸の存在、レベル、または非存在は、試験被験体から生物学的サンプルを得ることおよび生物学的サンプル中でMID9002タンパク質または核酸の存在が検出されるように、その生物学的サンプルをMID9002タンパク質またはMID9002タンパク質をコードする核酸(例えば、mRNA、ゲノムRNA)を検出し得る化合物または薬剤と接触させることによって評価され得る。用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織、細胞および生物学的流体、ならびに被験体中に存在する組織、細胞、および流体を含む。好ましい生物学的サンプルは、血清である。MID9002遺伝子の発現のレベルは、多くの方法で測定され得、この方法として以下が挙げられるがこれらに限定されない:MID9002遺伝子にコードされるmRNAを測定する方法;MID9002遺伝子にコードされるタンパク質の量を測定する方法;またはMID9002遺伝子にコードされるタンパク質の活性を測定する方法。
【0255】
MID9002遺伝子に対応する細胞内のmRNAのレベルは、インサイチュ形式およびインビトロ形式の両方によって決定され得る。
【0256】
単離されたmRNAは、ハイブリダイゼーションアッセイあるいは増幅アッセイ(サザン解析またはノザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応解析およびプローブアレイを含むがこれらに限定されない)において使用され得る。mRNAレベルの検出のための一つの好ましい診断方法は、単離されたmRNAを、検出される遺伝子によってコードされるmRNAにハイブリダイズし得る核酸分子(プローブ)と接触させる工程を包含する。核酸プローブは、例えば、全長のMID9002核酸(例えば、配列番号1の核酸)、またはその部分(例えば、少なくとも7、15、30、50、100、250、または500ヌクレオチドの長さであり、そしてストリンジェント条件下でMID9002mRNAまたはMID9002ゲノムDNAに特異的にハイブリダイズするために十分なオリゴヌクレオチド)であり得る。診断アッセイにおける用途のための他の適切なプローブが、本明細書中に記載される。
【0257】
一つの形式において、mRNA(またはcDNA)は、例えば、単離されたmRNAをアガロースゲルで電気泳動し、ゲルからニトロセルロースのような膜にmRNAを移すことによって表面に固定され、そしてプローブに接触させられる。別の形式において、例えば、下に記載の2次元遺伝子チップアレイにおいて、このプローブは、表面に固定され、そしてmRNA(またはcDNA)が、プローブに接触させられる。当業者は、MID9002遺伝子にコードされるmRNAのレベルを検出する用途のために、公知のmRNA検出方法を採用し得る。
【0258】
MID9002の1つにコードされるmRNAのサンプル中のレベルは、例えば、rtPCR(Mullis(1987)米国特許第4,683,202号)、リガーゼ連鎖反応(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189〜193)、自己持続性(self sustained)配列複製(Guatelliら、(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874〜1878)、転写性増幅システム(Kwohら、(1989)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173〜1177)、Q−Beta Replicase(Lizardiら、(1988)Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークル複製(Lizardiら、米国特許第5,854,033号)または任意の他の核酸増幅方法による核酸増幅(当該分野で公知の技術を使用する増幅化分子の検出が続く)で評価され得る。本明細書中で使用される場合、増幅プライマーは、遺伝子の5’または3’領域(それぞれプラス鎖およびマイナス鎖、またはその逆も同様)にアニ−ルし得、そして間に短い領域を有する核酸分子の対として規定される。一般に、増幅プライマーは、約10〜30ヌクレオチド長であり、約50〜200ヌクレオチド長の領域に隣接する。このようなプライマーは、適切な条件下そして適切な試薬を用いて、プライマーに隣接されるヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【0259】
インサイチュ方法に関して、細胞サンプルまたは組織サンプルは、調製/処理され、そして支持体(代表的にはスライドガラス)に固定され、そして次いで、解析されるMID9002遺伝子をコードするmRNAにハイブリダイズし得るプローブと接触させられ得る。
【0260】
別の実施形態において、この方法は、コントロールサンプルを、MID9002mRNAまたはゲノムDNAを検出し得る化合物または薬剤と接触させ、そしてコントロールサンプル中のMID9002mRNAまたはゲノムDNAの存在を試験サンプル中のMID9002mRNAまたはゲノムDNAの存在と比較する工程をさらに含む。
【0261】
MID9002にコードされるタンパク質のレベルを決定するために、種々の方法が使用され得る。一般に、これらの方法は、サンプル中のタンパク質レベルを評価するために、このタンパク質に選択的に結合する薬剤(例えば、抗体)をサンプルと接触させる工程を含む。好ましい実施形態において、この抗体は、検出可能な標識を有する。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、FabまたはF(ab’)2)が使用され得る。プローブまたは抗体に関して、用語「標識された」は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする(すなわち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、および検出可能な物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を含むことが意図される。検出可能な物質の例は、本明細書中に提供される。
【0262】
この検出方法は、インビトロおよびインビボで生物学的サンプル中のMID9002タンパク質を検出するために使用され得る。MID9002タンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、免疫沈降、免疫蛍光、酵素免疫アッセイ(EIA)、放射性免疫アッセイ(RIA)、およびウエスタンブロット解析が挙げられる。MID9002タンパク質の検出のためのインビボ技術としては、被験体中に標識化抗MID9002抗体を導入する技術が挙げられる。例えば、この抗体は、被験体中の存在および位置が標準的な画像化技術によって検出され得る放射活性マーカーで標識され得る。
【0263】
別の実施形態において、この方法は、コントロールサンプルを、MID9002タンパク質を検出し得る化合物あるいは薬剤と接触させ、そしてコントロールサンプル中のMID9002タンパク質の存在を、試験サンプル中のMID9002タンパク質の存在と比較する工程をさらに含む。
【0264】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるMID9002の存在を検出するためのキットを含む。例えば、このキットは、生物学的サンプル中のMID9002タンパク質またはMID9002 mRNAを検出し得る化合物または薬剤;および標準物質を備え得る。この化合物または薬剤は、適切な容器に充填され得る。このキットはMID9002タンパク質またはMID9002核酸を検出するためにキットを使用するための指示書をさらに備え得る。
【0265】
抗体ベースのキットに関して、このキットは、以下を備え得る:(1)本発明のマーカーに相当するポリペプチドに結合する(例えば、固体支持体に結合された)第1抗体、および、必要に応じて(2)このポリペプチドまたは第1抗体のいずれかに結合し、検出可能な薬剤に結合体化されている、別の第2抗体。
【0266】
オリゴヌクレオチドベースのキットに関して、このキットは、以下を備え得る:(1)本発明のマーカーに相当するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド(例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド)、または(2)本発明のマーカーに相当する核酸分子を増幅するために有用なプライマーの対。このキットはまた、緩衝剤、防腐剤、またはタンパク質安定化剤を備え得る。このキットはまた、検出可能な薬剤(例えば、酵素または基質)を検出するために必要な構成要素を備え得る。このキットはまた、コントロールサンプルまたはコントロールサンプルの系列を備え得、これらのコントロールサンプルは、アッセイされ得、そして備えられた試験サンプルと比較され得る。このキットの各構成要素は、個々の容器内に封入され得、そして種々の容器は全て、このキットを使用して実施されるアッセイの結果を説明するための指示書とともに、単一の包装内であり得る。
【0267】
本明細書中に記載される診断方法は、誤って発現された(misexpressed)か、または異常であるかまたは望まれないMID9002発現もしくはMID9002活性に関連する、疾患または障害を有する被験体、あるいはこれらの疾患または障害を発生する危険性が高い被験体を、同定し得る。本明細書中で使用される場合、用語「望まれない」は、疼痛または制御を外れた(deregulated)細胞分化のような生物学的応答に関連する望まれない現象を含む。
【0268】
一つの実施形態において、異常であるかまたは望まれない、MID9002発現もしくはMID9002活性に関連する疾患あるいは障害が、同定される。試験サンプルが、被験体から得られ、そしてMID9002タンパク質またはMID9002核酸(例えば、mRNAまたはゲノムDNA)が評価される。ここで、MID9002タンパク質またはMID9002核酸のレベル(例えば、存在または非存在)は、異常であるかまたは望まれないMID9002発現もしくはMID9002活性に関連する疾患あるいは障害を有する被験体、あるいはこれらの疾患または障害を発生する危険性が高い被験体について、診断的である。本明細書中で使用される場合、「試験サンプル」は、目的の被験体から得られる生物学的サンプル(生物学的流体(例えば、血清)、細胞サンプル、または組織を含む)をいう。
【0269】
本明細書中に記載される予後アッセイは、被験体に、異常であるかまたは望まれないMID9002発現もしくはMID9002活性に関連する疾患あるいは障害を処置するための薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬剤候補)を投与し得るかどうか決定するために使用され得る。例えば、このような方法は、被験体が増殖性障害/分化障害(例えば、結腸癌)のための薬剤で効果的に処置され得るかどうか決定するために使用され得る。
【0270】
本発明の方法はまた、MID9002遺伝子の遺伝子変化を検出し、それによって、その変化した遺伝子を有する被験体が、MID9002タンパク質活性の調節不全またはMID9002核酸発現の調節不全により特徴付けられる障害(例えば、増殖障害/分化障害(例えば、結腸癌))の危険性があるか否かを決定するためにも、使用され得る。好ましい実施形態において、この方法は、被験体由来のサンプルにおいて、MID9002タンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響する変化またはMID9002遺伝子の誤発現のうちの少なくとも1つにより特徴付けられる遺伝子変化の存在もしくは非存在を、検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝子変化は、以下のうちの少なくとも1つの存在を確認することによって検出され得る:1)MID9002遺伝子からの1つ以上のヌクレオチドの欠失;2)MID9002遺伝子に対する1つ以上のヌクレオチドの付加;3)MID9002遺伝子の1つ以上のヌクレオチドの置換;4)MID9002遺伝子の染色体再配置;5)MID9002遺伝子のメッセンジャーRNA転写物レベルの変化;6)MID9002遺伝子の異常改変(例えば、ゲノムDNAのメチル化パターンの異常改変);7)MID9002遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の非野生型巣プライシングパターンの存在;8)非野生型のMID9002タンパク質レベル;9)MID9002遺伝子の対立遺伝子喪失;および10)MID9002タンパク質の不適切な翻訳後修飾。
【0271】
変化は、ポリメラーゼ連鎖反応(例えば、アンカーPCRまたはRACE PCR)またはライゲーション連鎖反応(LCR)においてプローブ/プライマーを用いずに検出され得、後者は、MID9002遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る。この方法は、被験体から細胞サンプルを収集する工程、そのサンプルから核酸(例えば、ゲノム、mRNA、または両方)を単離する工程、その核酸サンプルを、MID9002遺伝子に特異的にハイブリダイズする1つ以上のプライマーと、そのMID9002遺伝子(存在する場合に)のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じる条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在または非存在を検出するか、またはその増幅産物のサイズを検出してコントロールサンプルと長さを比較する工程を包含し得る。本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかと組み合わせて、予備増幅工程として使用するためにPCRおよび/またはLCRが望ましくあり得ることが、認識される。あるいは、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知の他の増幅方法が、使用され得る。
【0272】
別の実施形態において、サンプル細胞由来のMID9002遺伝子における変異が、制限酵素切断パターンの変化を検出することによって同定され得る。例えば、サンプルDNAおよびコントロールDNAが、単離され、(必要に応じて)増幅され、1つ以上の制限エンドヌクレアーゼにより消化され、そしてフラグメント長のサイズが(例えば、ゲル電気泳動により)決定され、そして比較される。サンプルDNAとコントロールDNAとの間のフラグメント長のサイズの差異は、そのサンプルDNA中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第5,498,531号を参照のこと)の使用が、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特定の変異の存在について記録するために使用され得る。
【0273】
他の実施形態において、MID9002における遺伝子変異が、サンプル核酸とコントロール核酸(例えば、DNAまたはRNA)とをハイブリダイズすること、2次元アレイ(たとえば、チップベースアレイ)により同定され得る。そのようなアレイは、複数のアドレス(address)を備え、そのアドレスの各々は、他と位置的に区別可能である。異なるプローブが、その複数のアドレスのうちの各々のアドレスに位置する。そのアレイは、高密度のアドレスを有し得、例えば、数百個または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含み得る(Croninら(1996)Human Mutation 7:244〜255;Kozalら(1996)Nature Medicine 2:753〜759))。例えば、MID9002における遺伝子変化が、Cronin,M.T.ら(前出)に記載されるように、光発生DNAプローブを含む2次元アレイ中で同定され得る。簡単に述べると、プローブの第1ハイブリダイゼーションアレイが、連続的に重複するプローブの直線状アレイを作製することによって、配列間の塩基変化を同定するために、サンプルとコントロール中の長いDNAストレッチに添って走査するために使用され得る。この工程により、点変異の同定が可能になる。この工程の後に、第2のハイブリダイゼーションアレイが使用される。この第2のハイブリダイゼーションアレイは、検出されるすべての改変体または変異に対して相補的なより小さい特化したプローブアレイを使用することによって特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、並列プローブセットから構成されており、1つのプローブセットは、野生型遺伝子と相補的であり、他方のプローブセットは、変異体遺伝子と相補的である。
【0274】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかが、MID9002遺伝子を直接配列決定し、そしてサンプルMID9002の配列を対応する野生型(コントロール)配列と比較することにより変異を検出するために、使用され得る。自動配列決定手順(質量分析計による配列決定を含む)が、診断アッセイを実施する場合に利用され得る(Naeveら(1995)Biotechniques 19:448〜53)。
【0275】
MID9002遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、RNA/RNAヘテロ二重鎖またはRNA/DNAヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出するために切断剤からの保護が使用される方法が、挙げられる(Myersら(1985)Science 230:1242;Cottonら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4397;Saleebaら(1992)Methods Enzymol.217:286〜295)。
【0276】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、細胞サンプルから得たMID9002 cDNAにおける点変異を検出してマッピングするための規定された系において、二本鎖DNAにおけるミスマッチ塩基対を認識する1つ以上のタンパク質(いわゆる「DNAミスマッチ修復」酵素)を使用する。例えば、E.coliのmutY酵素は、G/AミスマッチのAを切断し、そしてHeLa細胞由来のチミジンDNAグリコシラーゼは、G/TミスマッチのTを切断する(Hsuら(1994)Carcinogenesis 15:1657〜1662;米国特許第5,459,039号)。
【0277】
他の実施形態において、電気泳動移動度の変化が、MID9002遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンフォメーション多型(SSCP)が、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動移動度の差異を検出するために使用され得る(Oritaら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA:86:2766、Cotton(1993)Mutat.Res.285:125〜144;およびHayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.9:73〜79もまた参照のこと)。サンプルおよびコントロールのMID9002核酸の一本鎖DNAフラグメントは、変性され、そして再生させられる。一本鎖核酸の二次構造は、配列により変化し、生じる電気泳動度変化により、一塩基変化さえも検出可能となる。そのDNAフラグメントは、標識プローブを用いて標識または検出され得る。そのアッセイの感度は、(DNAではなく)RNAを使用することにより増強され得、そのRNAにおいて、二次構造が配列変化に対してDNAよりも感受性である。好ましい実施形態において、本方法は、電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離するためにヘテロ二重鎖分析を使用する(Keenら(1991)Trends Genet 7:5)。
【0278】
なお別の実施形態において、変性剤勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおける変異体フラグメントまたは野生型フラグメントの移動が、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)を使用してアッセイされる(Myersら(1985)Nature 313:495)。DGGEが分析方法として使用される場合、DNAは、そのDNAが完全には変性しないことを確実にするように、例えば、約40bpの高融解GCリッチDNAのGCクランプをPCRにより付加することによって、改変される。さらなる実施形態において、温度勾配が、コントロールDNAの移動度とサンプルDNAの移動度の差異を同定するために、変性勾配の代わりに使用される(RosenbaumおよびReissner(1987)Biophys Chem 265:12753)。
【0279】
点変異を検出するための他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられるが、これらに限定されない(Saikiら(1986)Nature 324:163;Saikiら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 86:6230)。
【0280】
あるいは、選択的PCR増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術が、本発明と組み合わせて使用され得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように)その分子の中心に目的の変異を保有し得る(Gibbsら(1989)Nucleic Acids Res.17:2437〜2448)か、または1つのプライマーの最も3’側の端部(適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を防止または減少させ得る場所である)に目的の変異を保有し得る(Prossner(1993)Tibtech 11:238)。さらに、切断ベースの検出を生成するために変異領域中に新規な制限部位を導入することが、望ましくあり得る(Gaspariniら(1992)Mol.Cell Probes 6:1)。特定の実施形態において、増幅用のTaqリガーゼを使用して増幅も実施され得ることが、予期される(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88:189〜93)。このような場合、5’配列の3’端に完全な一致が存在する場合にのみライゲーションが生じ、増幅の存在または非存在を検索することによって特定の部位における既知の変異の存在を検出することが可能になる。
【0281】
本明細書中で記載される方法は、例えば、本明細書中に記載される少なくとも1つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実行され得、これは、例えば、MID9002遺伝子に関与する疾患または疾病の症状または家族の病歴を示す患者を診断するための臨床状況において、便利に使用され得る。
【0282】
(代理マーカーとしてのMID9002分子の使用)
本発明のMID9002分子はまた、障害または疾患状態のマーカーとして、疾患状態の前駆体についてのマーカーとして、疾患状態の素因についてマーカーとして、薬物活性のマーカーとして、または被験体の薬理ゲノム学的プロフィールのマーカーとして有用である。本明細書中に記載される方法を使用して、本発明のMID9002分子の存在、非存在および/または量が検出され得、そしてインビボでの1つ以上の生物学的状態と関連付けされ得る。例えば、本発明のMID9002分子は、1つ以上の障害または疾患状態についての代理マーカーまたは疾患状態を導く状態についての代理マーカーとして作用し得る。本明細書中で使用される場合、「代理マーカー」は、疾患または障害の非存在もしくは存在、または疾患もしくは障害の進行(例えば、腫瘍の存在または非存在を伴う)と相関する客観的生物学的マーカーである。このようなマーカーの存在または量は、疾患に依存しない。従って、これらのマーカーは、特定の処置経過が、疾患状態または障害の減少において有効であるか否かを示すために作用し得る。代理マーカーは、疾患状態もしくは障害の存在もしくは程度が、標準的な方法論(例えば、初期段階腫瘍)を介して評価することが困難な場合、または疾患進行の評価が、潜在的に危険な臨床的終点が達成される前に所望される場合に特に有用である(例えば、心筋梗塞または十分に進行したAIDSの望ましくない臨床的結果が進行する十分に前に、心臓血管疾患の評価が、代理マーカーとしてコレステロールレベルを使用してなされ得、そしてHIV感染の分析が、代理マーカーとしてHIV RNAレベルを使用してなされ得る)。当該分野における代理マーカーの使用の例としては、以下が挙げられる:Koomenら(2000)J.Mass.Spectrom. 35:258−264;およびJames(1994)AIDS Treatment News Archive 209。
【0283】
本発明のMID9002分子はまた、薬力学的マーカーとして有用である。本明細書中で使用される場合、「薬力学的マーカー」は、薬物の効果に特異的に関連する客観的な生化学的マーカーである。薬力学的マーカーの存在または量は、薬物が投与される疾患の状態または障害には関連せず、それ故、このマーカーの存在または量は、被験体における薬物の存在または活性を示す。例えば、薬力学的マーカーは、そのマーカーが、薬物のレベルに関連して、この組織の中で、発現するかもしくは転写されるか、または発現も転写もされないかのいずれかであるという点で、生物学的組織における薬物の濃度を示し得る。この様態において、薬物の分布または摂取は、薬力学的マーカーによってモニターされ得る。同様に、薬力学的マーカーの存在または量は、薬物の代謝生成物の存在または量に関連し得、その結果、マーカーの存在または量は、インビボでの薬物の相対的分解速度を示す。薬力学的マーカーは、薬物効果の検出の感度の増加において、特に薬物が低用量で投与される場合に、特に有用である。少量の薬物でさえ、複数回マーカー(例えばMID9002マーカー)の転写または発現を、活性化するために十分であり得るので、増幅されたマーカーは、薬物そのものよりも容易に検出される量で存在し得る。また、マーカーは、マーカーそのものの性質に起因してより容易に検出され得る;例えば、本明細書中に記載される方法を使用して、抗MID9002抗体は、MID9002タンパク質マーカーのための免疫ベースの検出系にて使用され得るか、またはMID9002特異的放射標識プローブは、MID9002 mRNAマーカーを検出するために使用され得る。さらに、薬力学的マーカーの使用は、直接観測が可能な範囲を超える薬物処置に起因する危険性の機構ベースの予測を提供し得る。当該分野における薬力学的マーカーの使用の例としては、Matsudaら、米国特許第6,033,862号;Hattisら、(1991)Env.Health Perspect.90:229−238;Schentag(1999)Am.J.Health−Syst.Pharm.56 補遺3:S21−S24;およびNicolau(1999)Am,J.Health−Syst.Pharm.56 補遺3:S16−S20が挙げられる。
【0284】
本発明のMID9002分子はまた、薬力学的マーカーとして有用である。本明細書中で使用される場合、「薬力学的マーカー」は、被験体における特定の臨床的薬物応答または薬物感受性と関連する客観的な生物学的マーカーである(例えば、McLeodら、(1999)Eur.J.Cancer 35:1650−1652を参照のこと)。薬力学的マーカーの存在または量は、薬物の投与前に、特定の薬物または薬物のクラスに対して予測される被験体の応答に関連する。被験体における1つ以上の薬力学的マーカーの存在または量を評価することによって、被験体に対して最も適切であるか、またはより大きな成功の程度を有すると予測される薬物療法が、選択され得る。例えば、被験体における特定の腫瘍マーカーについての、RNAまたはタンパク質(例えば、MID9002タンパク質またはMID9002 RNA)の存在または量に基づいて、被験体中に存在する可能性のある特定の腫瘍の処置に対して最適化された、薬物または処置経過が選択され得る。同様に、MID9002 DNAにおける特定の配列の変異の存在または非存在は、MID9002薬物応答に関連し得る。従って、薬力学的マーカーの使用によって、治療を施与する必要なしに、各被験体に対して最も適切な治療の適用が可能になる。
【0285】
(薬学的組成物)
本発明の核酸およびポリペプチド、これらのフラグメント、ならびに抗MID9002抗体(本明細書中では、「活性化合物」ともいわれる)は、薬学的組成物に組込まれ得る。このような組成物は、代表的には、核酸分子、タンパク質、または抗体および薬学的に受容可能なキャリアを包含する。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与と適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。補充活性化合物もまた、組成物に組込まれ得る。
【0286】
薬学的組成物は、その意図される投与の経路に適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口投与(例えば、静脈投与)、皮内投与、皮下投与、経口(例えば、吸入)投与、経皮(局所的)投与、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用に使用される溶液または懸濁物は、以下の成分を含み得る:滅菌希釈液(例えば、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒);抗菌剤(例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン);抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム);キレート剤(例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸);緩衝液(例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸)および張度の調整のための薬剤(例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース)。pHは、酸または塩基(例えば、塩酸または水酸化ナトリウム)で調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラス製もしくはプラスチック製の複数用量バイアル中に封入され得る。
【0287】
注射用途に適する薬学的組成物としては、滅菌水溶液(水溶性の場合)または滅菌分散物および滅菌注射可能な溶液または滅菌注射可能な分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理学的食塩水、静菌性水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)またはリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌状態でなければならず、容易に注射可能である程度の流体であるべきである。この組成物は、製造および貯蔵の状態下で安定であるべきであり、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング(例えば、レシチン)の使用、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザールなど)によって達成され得る。多くの場合、等張剤(例えば、糖、ポリアルコール(例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム)を組成物中に含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤(例えば、ステアリン酸モノアルミニウムおよびゼラチン)を組成物中に含有することによって、引き起こされ得る。
【0288】
滅菌注射可能な溶液は、上に列挙される成分の1つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に、必要な量で活性な化合物を組込むことによって(必要な場合、その後、濾過滅菌することによって)調製され得る。一般的に、分散物は、基本分散媒体および上に列挙される成分からの他の必要な成分を含有する安定なビヒクルに、活性な化合物を組込むことによって調製される。滅菌注入可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これらは、前に濾過滅菌されたその溶液から、活性な成分および任意のさらに所望される成分の粉末を得る。
【0289】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈物または食用キャリアを含む。経口治療投与の目的について、活性な化合物は、賦形剤に組込まれ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤(例えば、ゼラチンカプセル剤)の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての用途のための流体キャリアを使用して、調製され得る。薬学的に適合可能な結合剤および/またはアジュバント物質が、組成物の一部として含有され得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分または類似した性質の化合物のいずれかを含み得る:結合剤(例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン);賦形剤(例えば、スターチまたはラクトース)、崩壊剤(例えば、アルギン酸、Primogel、またはコーンスターチ);潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはSterote);流動促進剤(例えば、コロイド状二酸化ケイ素);甘味料(例えば、スクロースまたはサッカリン);あるいは香味料(例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、または、オレンジ香味料。
【0290】
吸入による投与について、化合物は、加圧された容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレーの形態で送達され、これらの加圧された容器またはディスペンサーは、適切な噴射体(例えば、二酸化炭素のような気体)、または噴霧器を備える。
【0291】
全身投与はまた、経粘膜的手段または経皮的手段によってであり得る。経粘膜的投与または経皮的投与について、浸透されるべき障害に適切な浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般的に当該分野で公知であり、例えば、経皮的投与のための界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜的投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を介して達成され得る。経皮的投与について、活性な化合物は、当該分野で一般的に公知なように、軟膏(ointment)、軟膏剤(salve)、ゲル、またはクリームに処方される。
【0292】
化合物はまた、直腸送達のための坐剤(例えば、従来の坐剤基剤(例えば、ココアバターおよび他のグリセリド)を用いる)または停留浣腸の形態で調整され得る。
【0293】
1つの実施形態において、活性な化合物は、キャリアと共に調製され、このキャリアは、身体からの迅速な排泄に対して化合物を保護し、例えば、徐放性処方物(移植片および微小カプセル化送達系を含む)である。生体分解性の生体適合性ポリマー(例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸)が、使用され得る。このような処方物の調製方法は、当業者に明らかである。これらの材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁物(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に対して標的化されたリポソームを含む)はまた、薬学的受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【0294】
投与の容易さおよび投与用量の一様性のために、投与単位形態での経口組成物または非経口組成物を処方することは有利である。本明細書中で使用される場合、投与単位形態は、処置される被験体に対する単一投与量として適切な、物理的に別個の単位をいい;各単位は、必要な薬学的なキャリアに関連する所望の治療効果を生成するように計算された所定の量の活性な化合物を含む。
【0295】
このような化合物の毒性および治療効率は、例えば、LD50(集団の50%に対して致死性である量)およびED50(集団の50%における治療有効用量)を決定することについて、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、そしてこの比は、比LD50/ED50として示され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用され得る一方で、非感染細胞に対する潜在的な傷害を最小化するための罹患組織の部位にこのような化合物を標的化する送達システムを設計するために注意を払い、それによって副作用を減少するべきである。
【0296】
細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける用途のための一定範囲の投与量を処方することにおいて使用され得る。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんどかまたは全く有さずに、ED50を含む循環濃度の範囲内に入る。投与量は、使用される用量形態または使用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから見積もられ得る。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養物において決定されるIC50(すなわち、症状の最高阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように処方され得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【0297】
本明細書中に定義される場合、治療有効量のタンパク質またはポリペプチド(すなわち、有効投与量)は、約0.001〜30mg/体重1kg、好ましくは約0.01〜25mg/体重1kg、より好ましくは約0.1〜20mg/体重1kg、およびさらにより好ましくは約1〜10mg/体重1kg、2〜9mg/体重1kg、3〜8mg/体重1kg、4〜7mg/体重1kg、または5〜6mg/体重1kgの範囲にある。このタンパク質またはポリペプチドは、1週間に1回、約1〜10週間の間、好ましくは2〜8週間の間、より好ましくは3〜7週間、およびさらにより好ましくは約4週間、5週間または6週間投与され得る。当業者は、特定の因子が、被験体を有効に処置するために必要な投与量およびタイミングに影響し得ること、これらの因子としては、疾患または障害の重篤度、以前の処置、被験体の全身健康状態および/または被験体の年齢、および他に存在する疾患が挙げられるがこれらに限定されないことを、認識する。さらに、本明細書中に記載されるような、非結合体化または結合体化されている、治療有効量のタンパク質、ポリペプチド、または抗体での被験体の処置は、単一処置を含み得るか、または好ましくは、一連の処置を含み得る。
【0298】
抗体について、好ましい投与量は、0.1mg/体重1kg(一般的に、10mg/kg〜20mg/kg)である。抗体が脳において作用する場合、50mg/kg〜100mg/kgの投与量が、通常好ましい。一般的に、部分的ヒト抗体および完全なヒト抗体は、人体内で他の抗体より長い半減期を有する。従って、より低い投与量およびより少ない投与頻度が、しばしば可能である。改変(例えば、脂質化)は、抗体を安定化させ、そして取り込みおよび(例えば、脳への)組織浸透を強化するために使用され得る。抗体の脂質化のための方法は、Cruikshankら、((1997)J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193)によって記載される。
【0299】
本発明は、発現または活性を調節する薬剤を包含する。薬剤は、例えば低分子であり得る。例えば、このような低分子としては、ペプチド、ペプチド模倣物(ペプトイド)、アミノ酸、アミノ酸類似物、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似物、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似物、1モル当たり約10,000gより低い分子量を有する有機化合物または無機化合物(すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む)、1モル当たり約5,000gより低い分子量を有する有機化合物または無機化合物、1モル当たり約1,000gより低い分子量を有する有機化合物または無機化合物、1モル当たり約500gより低い分子量を有する有機化合物または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に受容可能な形態が挙げられるが、これらに限定されない。
【0300】
例示的な用量は、被験体1kgまたはサンプル1kg当たりのミリグラムまたはマイクログラム量の低分子を含む(例えば、約1μg/kg〜約500mg/kg、約100μg/kg〜約5mg/kg、または約1μg〜約50μg/kg)。さらに、低分子の適切な用量は、調節されるべき発現または活性という点で低分子の効力に依存する。1つ以上のこれらの低分子が本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために動物(例えば、ヒト)に投与される場合、医師、獣医師、または研究者は、例えば、まず相対的に低い用量を処方し、続いて適切な応答が得られるまで用量を増加し得る。さらに、任意の特定の動物被験体に対する特定の用量レベルが、使用される特定の化合物の活性、被験体の年齢、体重、全身健康状態、性別、および食事、投与時間、投与経路、排泄速度、任意の薬物の組み合わせ、ならびに調節されるべき発現または活性の程度を含む、種々の因子に依存することが理解される。
【0301】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与(米国特許第5,328,470号を参照のこと)または定位注射(例えば、Chenら、(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3054−3057を参照のこと)によって、被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞(例えば、レトロウイルスベクター)からインタクトに産生され得る場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する1つ以上の細胞を含み得る。
【0302】
薬学的組成物は、投与のための指示書と共に、容器、パック、またはディスペンサー中に含まれ得る。
【0303】
(処置方法)
本発明は、異常型または望まれないMID9002の発現または活性に関連する障害の危険性を有する(またはそれに対して感受性である)被験体もしくはその障害を有する被験体を処置する、予防法または治療法の両方を提供する。本明細書中に使用される場合、用語「処置」は、患者に対する治療剤の適用または投与、患者から単離された組織または細胞株に対する治療剤の適用または投与として定義され、この患者は、疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を有し、この目的は、その疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を、治療、回復、緩和、軽減、改変、矯正、寛解、改善するかまたはこれに影響を与えることである。治療剤としては、低分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【0304】
処置の予防法および治療法の両方に関して、このような処置は、薬理ゲノム学の分野から得られる知識に基づいて、特異的に合わせられるかまたは改変され得る。本明細書中で使用される場合、「薬理ゲノム学」は、臨床的開発および市場における薬物に対する、ゲノム技術(例えば、遺伝子配列決定)、統計遺伝学、および遺伝子発現分析の適用をいう。より具体的には、この用語は、患者の遺伝子が薬物に対するその患者の応答(例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」)をどのように決定するかの研究をいう。従って、本発明の別の局面は、個体の薬物応答遺伝子型に従って、本発明のMID9002分子またはMID9002調節因子のいずれかでの個体の予防処置または治療処置を調整するための方法を提供する。薬理ゲノム学は、臨床医または医師に、予防処置または治療処置を、最も治療の恩恵を受ける患者に対して向けさせ、そして毒性薬物関連副作用を受ける患者の処置を避け得るようにさせる。
【0305】
1つの局面において、本発明は、MID9002またはMID9002発現または少なくとも1つのMID9002活性を調節する薬剤を被験体に投与することによって、異常または望まれないMID9002の発現または活性に関連する疾患または状態を、被験体において予防する方法を提供する。異常または望まれないMID9002の発現または活性によって引き起こされるまたはそれに起因する疾患に対する危険性がある被験体は、例えば、本明細書中に記載されるような診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定され得る。予防剤の投与は、MID9002異常型に特徴的な症状の発症の前に行われ、その結果、疾患または障害は、予防されるか、あるいは、その進行が遅延される。MID9002の異常型に依存して、例えば、MID9002、MID9002アゴニストまたはMID9002アンタゴニスト剤が、被験体を処置するために使用され得る。適切な薬剤は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
【0306】
いくつかのMID9002障害は、異常なレベルの遺伝子産物または異常な活性を示す遺伝子産物の存在によって、少なくとも部分的に引き起こされ得ることが可能である。そういうものとして、このような遺伝子産物のレベルおよび/または活性の減少は、障害の症状の改善を引き起こす。
【0307】
このMID9002分子は、上記に記載される細胞増殖障害および/または細胞分化障害のうちの1つ以上を制御するための新規な診断標的および治療剤として作用し得る。本発明の分子はまた、骨代謝に関連する障害、免疫(例えば、炎症)障害、心血管障害、内皮細胞障害、肝障害、ウイルス疾患、疼痛障害および代謝障害のうちの1つ以上を制御するための新規な診断標的および治療剤としても作用し得る。
【0308】
細胞増殖障害および/または分化障害の例としては、癌(例えば、癌腫)、肉腫、転移障害または造血新形成障害(例えば、白血病)が挙げられる。転移腫瘍は、多くの原発性腫瘍型(前立腺起源、結腸起源、肺起源、乳房起源および肝臓起源が挙げられるが、これらに限定されない)から生じ得る。
【0309】
本明細書中で使用される場合、用語「癌」(用語「過剰増殖」および「新形成」と互換可能に使用される)は、自律増殖(すなわち、迅速に増殖する細胞増殖により特徴付けられる異常な状態または状況)についての能力を有する細胞を指す。癌性疾患状態は、病的と分類され得る(すなわち、疾患状態(例えば、悪性腫瘍増殖)を特徴付けるかまたは構成する)か、あるいは、非病的と分類され得る(すなわち、正常からの偏位であるが疾患状態と関連はない(例えば、創傷修復と関連する細胞増殖))。この用語は、すべての型の癌性増殖または癌原性プロセス、転移性組織または悪性形質転換細胞、悪性形質転換組織、もしくは悪性形質転換器官(組織病理型にも侵襲性の段階にも関わらない)を包含することになっている。この用語「癌」は、種々の器官系の悪性疾患(例えば、肺を冒す悪性疾患、乳房を冒す悪性疾患、甲状腺を冒す悪性疾患、リンパ腺を冒す悪性疾患、胃腸管を冒す悪性疾患および尿生殖器管を冒す悪性疾患)、ならびに腺癌(ほとんどの結腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および/または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌および食道の癌のような悪性疾患を包含する)を包含する。用語「癌腫」は、当該分野で認識されており、そしてこの用語は、上皮組織もしくは内分泌組織の悪性疾患(呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、および黒色腫を包含する)を指す。例示的癌腫としては、子宮頸部組織から形成する癌腫、肺組織から形成する癌腫、前立腺組織から形成する癌腫、乳房組織から形成する癌腫、頭部および頸部の組織から形成する癌腫、結腸組織から形成する癌腫、ならびに卵巣組織から形成する癌腫が挙げられる。用語「癌腫」はまた、例えば、癌性組織および肉腫性組織から構成される悪性腫瘍を含む、癌肉腫を包含する。「腺癌」とは、腺組織に由来する癌腫、または認識可能な腺構造をその腫瘍細胞が形成する癌腫をさす。用語「肉腫」は当該分野で認識されており、この用語は、間葉由来物の悪性腫瘍を指す。
【0310】
本発明のMID 9002分子は、種々の増殖障害をモニター、処置および/または診断するために使用され得る。そのような障害としては、造血性新形成障害が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「造血性新形成障害」は、造血起源の(例えば、骨髄系列、リンパ系列、もしくは赤血球系列、またはそれらの前駆細胞から生じる)過形成細胞/新形成細胞を含む疾患を包含する。好ましくは、この疾患は、ほとんど分化していない急性白血病(例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病)から生じる。さらなる例示的骨髄性障害としては、急性前骨髄球性白血病(APML)、急性骨髄性白血病(AML)および慢性骨髄性白血病(CML)(Vaickus(1991)Crit Rev.in Oncol./Hemotol.11.267〜97に概説される)が挙げられるが、これらに限定されない;リンパ球性悪性疾患としては、急性リンパ芽球性白血病(ALL)(B系列ALLおよびT系列ALLを包含する)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(PLL)、毛様細胞白血病(HLL)、およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症(WM)が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる悪性リンパ腫形態としては、非ホジキンリンパ腫およびその改変体、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、大型顆粒リンパ球白血病(LGF)、ホジキン病、およびリード−スターンバーグ病が挙げられるが、これらに限定されない。
【0311】
MID 9002分子の異常な発現および/または異常な活性は、骨代謝に関係する障害を媒介し得る。「骨代謝」とは、骨構造の形成または変性(例えば、骨形成、骨再吸収など)における、血清中のカルシウム濃度およびリン酸濃度に最終的に影響し得る、直接的効果または間接的効果を指す。この用語はまた、骨細胞(例えば、破骨細胞および骨芽細胞)においてMID 9002分子により媒介され、その後骨形成および骨変性を生じ得る、活性を包含する。例えば、MID 9002分子は、骨再吸収破骨細胞の種々の活性(例えば、単球および単核食細胞から破骨細胞への分化の刺激)を支持し得る。従って、骨細胞の産生を調節するMID 9002分子は、骨形成および骨変性に影響し得、従って骨障害を処置するために使用され得る。このような障害の例としては、骨粗鬆症、骨形成異常、骨軟化症、くる病、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常、骨硬化、鎮痙処置、骨減少症、不完全骨線維形成(fibrogenesis−imperfecta ossium)、続発性副甲状腺機能亢進、副甲状腺機能低下、上皮小体機能亢進、肝硬変、閉塞性黄疸、薬物誘発性代謝、髄様癌、慢性腎疾患、くる病、サルコイドーシス、グルココルチコイド拮抗、吸収不良症候群、脂肪便、熱帯性スプルー、特発性高カルシウム血症、および授乳熱が挙げられるが、これらに限定されない。
【0312】
本発明のMID 9002核酸およびタンパク質は、種々の免疫(例えば、炎症(例えば、呼吸器炎症))障害を処置および/または診断するために使用され得る。免疫障害または免疫疾患および炎症性障害または炎症性疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:自己免疫疾患(例えば、真性糖尿病、関節炎(慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む)、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎(アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む)、乾癬、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患(例えば、クローン病および潰瘍性大腸結腸)、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーヴズ病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎および間質性肺線維症が挙げられる)、対宿主移植片病、移植の症例、およびアレルギー(例えば、アトピー)。
【0313】
本明細書中で用いられる場合、心臓に関する障害、すなわち、「心血管疾患」または「心血管障害」は、心血管系(例えば、心臓、血管、および/または血液)に影響を与える、疾患または障害を包含する。心血管障害は、動脈圧力における不均等、心臓の機能不全、または(例えば、血栓による)血管の閉塞によって引き起こされ得る。心血管障害としては、例えば、以下のような障害が挙げられるがこれらに限定されない:動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心肥大、虚血再灌流障害、再狭窄、動脈炎症、血管壁再形成、心室再形成、迅速心室ペーシング、冠状微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧力過剰負荷、大動脈屈曲、冠状動脈結紮、脈管心臓病、弁の疾患(カルシウム沈着によって引き起こされる弁の変性、リウマチ性心疾患、心内膜炎、または人工弁の合併症が挙げられるがこれらに限定されない);心房性細動、長QT症候群(long−QT syndrome)、うっ血性心不全、洞房結節機能不全(sinus node dysfunction)、アンギナ、心不全、高血圧、心房性細動、心房粗動、心膜疾患(心内膜液浸出および心膜炎が挙げられるがこれらに限定されない);心筋症(例えば、拡張型心筋症または特発性心筋症)、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣、虚血性疾患、不整脈、突然の心臓死、および心血管発達障害(例えば、動静脈先天異常、動静脈瘻、レーノー症候群、神経性胸郭出口症候群、カウザルギー/反射性交感神経性ジストロフィー、血管腫、動脈瘤、海綿状様血管腫、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症、房室管、大動脈の縮窄、エブスタイン奇形、左心室発育不全症候群、大動脈弓の中断、僧帽弁逸脱、動脈管、開存性卵円孔、部分肺静脈還流異常(partial anomalous pulmonary venous return)、心室中隔欠損を伴う肺動脈弁閉鎖、心室中隔欠損を伴わない肺動脈弁閉鎖、胎児循環の存続、肺動脈弁狭窄、単心室、総肺静脈還流異常、大血管転位、三尖弁閉鎖、総動脈幹、心室中隔欠損)。心血管疾患または心血管障害はまた、内皮細胞障害を包含し得る。
【0314】
本明細書中で使用される場合、「内皮細胞障害」とは、異常な内皮細胞活性、調節されていない内皮細胞活性、または望ましくない内皮細胞活性(例えば、増殖、移動、新脈管形成、または血管新生)により特徴付けられる障害;あるいは細胞表面接着分子の異常な発現または新脈管形成に関連する遺伝子(例えば、TIE−2、FLTおよびFLK)の異常な発現により特徴付けられる障害を包含する。内皮細胞障害としては、腫瘍形成、腫瘍転移、乾癬、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、グレーヴズ病、虚血性疾患(例えば、アテローム性動脈硬化症)、および慢性炎症疾患(例えば、慢性関節リウマチ)が挙げられる。
【0315】
本明細書中に記載される方法により処置または診断され得る障害としては、肝臓における線維組織の蓄積に関係する障害(例えば、既存の線維の崩壊および変性を伴う細胞外マトリックスの生成と分解との間の不均衡から生じる障害)が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載される方法は、広範な種類の因子(ホメオスタシスを破壊するプロセス(例えば、炎症性プロセス)、毒性傷害から生じる組織損傷または肝血流の変化から生じる組織損傷、ならびに感染(例えば、細菌感染、ウイルス感染、および寄生生物感染)を含む)により誘導される肝細胞壊死または肝細胞傷害を診断または処置するために使用され得る。例えば、この方法は、肝傷害(例えば、門脈圧亢進または肝線維症)の早期検出のために使用され得る。さらに、この方法は、先天性代謝異常に起因する肝線維症(例えば、貯蔵障害(例えば、ゴシェ病(脂質異常)、またはグリコーゲン貯蔵病、A1−抗トリプシン欠損)から生じる線維症);外因性物質の蓄積(例えば、貯蔵)を媒介する障害(例えば、ヘモクロマトーシス(鉄過剰負荷症候群)および銅貯蔵病(ウィルソン病))、毒性代謝産物の蓄積を生じる障害(例えば、チロシン血症、果糖血症、およびガラクトース血症)、ならびにペルオキシソーム障害(例えば、ツェルヴェーガー症候群)を検出するために使用され得る。さらに、本明細書中に記載される方法は、種々の化学物質または薬物(例えば、メトトレキサート、イソニアジド(isonizaid)、オキシフェニサチン、メチルドパ、クロロプロマジン、トルブタミドまたはアルコール)の投与と関連する肝傷害、または脈管障害の肝徴候(例えば、肝臓内胆汁流もしくは肝臓外胆汁流のいずれかの閉塞、または例えば、慢性心不全、静脈閉塞疾患、門脈血栓症もしくはバッド−キアーリ症候群から生じる肝臓循環の変化)を示す肝傷害の早期検出および処置のために使用され得る。
【0316】
さらに、MID 9002分子は、特定のウイルス疾患(B型肝炎、C型肝炎、および単純ヘルペスウイルス(HSV)が挙げられるが、これらに限定されない)の病因において重要な役割を果たし得る。MID 9002活性の調節因子は、ウイルス疾患を制御するために使用され得る。この調節因子は、ウイルス感染組織またはウイルス関連組織線維症(特に、肝臓および肝臓線維症)の処置および/または診断において使用され得る。また、MID 9002調節因子は、ウイルス関連癌腫(特に、肝細胞癌)の処置および/または診断において使用され得る。
【0317】
さらに、MID 9002分子は、代謝障害または疼痛障害の調節において、重要な役割を果たし得る。代謝不均等の疾患としては、肥満症、神経性食欲不振、悪質液、脂質障害、および糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。疼痛障害の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:種々の形態の組織損傷(例えば、炎症、感染および虚血)の間に誘発される疼痛応答(通常、痛覚過敏と称される)(例えば、Fields,H.L.(1987)Pain,New York:McGraw−Hillに記載される);筋骨格障害に関連する疼痛(例えば、関節痛);歯痛;頭痛;手術に関連する疼痛;過敏性腸症候群に関連する疼痛;または胸部痛。
【0318】
議論されるように、MID 9002障害の首尾よい処置は、標的遺伝子産物の発現または活性を阻害する役目を果たす技術によって、もたらされ得る。例えば、ネガティブな調節性活性を示すことが証明されている化合物(例えば、上記のアッセイを使用して同定される因子)が、本発明に従って使用され、MID 9002障害の症状を予防および/または回復し得る。このような分子としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない:ペプチド、ホスホペプチド、有機低分子または無機低分子、あるいは抗体(例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、または単鎖抗体、ならびにFab、F(ab’)2およびFab発現ライブラリーフラグメント、scFV分子、ならびにそれらのエピトープ結合フラグメントを含む)。
【0319】
さらに、標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス分子およびリボザイム分子もまた、本発明に従って使用され、標的遺伝子発現レベルを低下させ得、それによって、標的遺伝子活性レベルは、効果的に減少される。なおさらに、三重らせん分子が、標的遺伝子活性レベルを低下させる際に利用され得る。アンチセンス分子、リボザイム分子および三重らせん分子は、上で議論されている。
【0320】
変異体遺伝子発現を低下または阻害するための、アンチセンス分子、リボザイム分子および/または三重らせん分子の使用もまた、正常な標的遺伝子の対立遺伝子によって産生されるmRNAの転写(三重らせん)および/または翻訳(アンチセンス、リボザイム)を低下または阻害し得、その結果、存在する正常な標的遺伝子産物の濃度が、正常な表現型で必要とされる濃度よりも低くあり得る可能性がある。このような場合、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子は、遺伝子治療法によって、細胞に導入され得る。あるいは、この標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする例において、正常な標的遺伝子タンパク質を、細胞または組織に同時に投与して、必要な細胞活性レベルまたは組織標的遺伝子活性レベルを維持することが、好ましくあり得る。
【0321】
核酸分子が、MID9002発現によって特徴付けられる疾患を処置または予防する際に利用され得る別の方法は、MID9002タンパク質に特異的なアプタマー分子の使用を介する。アプタマーは、タンパク質リガンドに特異的または選択的に結合することを可能にする、三次構造を有する核酸分子である(例えば、Osborneら、(1997)Curr.Opin.Chem Biol.1:5−9;およびPatel(1997)Curr Opin Chem Biol 1:32−46を参照のこと)。核酸分子は、多くの場合において、治療タンパク質分子が標的細胞に導入され得るよりも、より簡便に標的細胞に導入され得るので、アプタマーは、多能性効果を有し得る薬物または他の分子を導入することなく、MID9002タンパク質活性が特異的に低下し得る方法を提供する。
【0322】
標的遺伝子産物に特異的であり、かつ標的遺伝子産物活性を低下させる抗体が、作製され得る。従って、このような抗体は、ネガティブな調節技術が、MID9002障害の処置に適している場合に投与され得る。抗体の記載については、上記の抗体の節を参照のこと。
【0323】
抗体産生を刺激するために、MID9002タンパク質またはエピトープで、動物またはヒト被験体を注射することが、被験体に対して有害である環境下において、抗イディオタイプ抗体の使用によって、MID9002に対する免疫応答を生じさせることが可能である(例えば、Herlyn,D.(1999)Ann Med 31:66−78;ならびにBhattacharya−Chatterjee,M.およびFoon(1998)Cancer Treat Res.94:51−68を参照のこと)。抗イディオタイプ抗体が哺乳動物またはヒト被験体に導入される場合、MID9002タンパク質に特異的であるべき、抗−抗イディオタイプ抗体の産生が刺激されるはずである。MID9002発現によって特徴付けられる疾患に対するワクチンもまた、この様式で作製され得る。
【0324】
標的抗原が細胞内であり、かつ全抗体が使用される例において、内部移行抗体が好ましくあり得る。リポフェクチンまたはリポソームを使用して、標的抗原に結合するFab領域の抗体またはフラグメントを細胞内に送達し得る。抗体のフラグメントが使用される場合、標的抗原に結合する最小の阻害性フラグメントが、好ましい。例えば、抗体のFv領域に対応するアミノ酸配列を有するペプチドが、使用され得る。あるいは、細胞内標的抗原に結合する単鎖中和抗体もまた、投与され得る。このような単鎖抗体は、例えば、標的細胞集団内の単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現させることによって、投与され得る(例えば、Marascoら、(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889−7893を参照のこと)。
【0325】
標的遺伝子発現、合成および/または活性を阻害する、同定された化合物は、MID9002障害を予防、処置または回復するのに治療学的に有効な用量で、患者に投与され得る。治療学的に有効な用量とは、その障害の症状を回復させるのに十分な、化合物の量をいう。このような化合物の毒性および治療効果は、上記のような標準的な薬理学的手順によって、決定され得る。
【0326】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を処方する際に、使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど有さないかまたは全く有さないED50を含む循環濃度範囲内にある。投薬量は、用いられる投薬形態および用いられる投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療学的に有効な用量は、細胞培養アッセイから、最初に確立され得る。用量は、細胞培養物中で決定されるようなIC50(すなわち、症状の最大半減阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲に達するように、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定し得る。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、測定され得る。
【0327】
個体に対する有効な用量を決定する別の例は、試験被験体の血清中の「遊離」化合物および「結合」化合物のレベルを直接的にアッセイする能力である。このようなアッセイは、分子のインプリンティング技術によって作製される抗体模倣物および/または「バイオセンサ」を使用し得る。MID9002活性を調節し得る化合物は、テンプレート、または「インプリンティング分子」として使用され、この化合物の触媒試薬との重合化の前に、重合可能なモノマーを空間的に組織化する。インプリントされた分子のその後の除去は、化合物の繰り返し「ネガ(negative image)」を含むポリマーマトリクスを残し、そして生物学的アッセイ条件下で、分子に選択的に再結合することができる。この技術の詳細な総説は、Ansellら(1996)Current Opinion in Biotechnology 7:89−94およびShea(1994)Trends in Polymer Science 2:166−173において参照され得る。このような「インプリントされた」アフィニティーマトリクスは、リガンド結合アッセイに適合し、これによって、固定化モノクローナル抗体の構成要素は、適切にインプリントされたマトリクスによって置き換えられる。この方法における、このようなマトリクスの使用の例は、Vlatakisら(1993)Nature 361:645−647において参照され得る。同位体標識の使用によって、MID9002の発現または活性を調節する化合物の「遊離」濃度は、容易にモニタリングされ得、そしてIC50の算出に使用され得る。
【0328】
このような「インプリントされた」アフィニティーマトリクスはまた、光子放射特性が標的化合物の局在性および選択的結合によって測定可能に変化する蛍光群を含むように設計され得る。これらの変化は、適切な光ファイバーデバイスを使用し、次いで、試験被験体における用量を、その個々のIC50に基づいて迅速に最適化することによって、実時間で容易にアッセイされ得る。このような「バイオセンサ」の基本的な例は、Krizら(1995)Analytical Chemistry 67:2142−2144において議論されている。
【0329】
本発明の別の局面は、治療目的のための、MID9002発現または活性を調節する方法に関する。従って、例示的な実施形態において、本発明の調節方法は、細胞を、MID9002またはこの細胞に関連するMID9002タンパク質活性の1つ以上の活性を調節する因子と接触させる工程を包含する。MID9002タンパク質活性を調節する因子は、本明細書中に記載されるような因子(例えば、核酸またはタンパク質、MID9002タンパク質の天然に存在する標的分子(例えば、MID9002基質またはレセプター)、MID9002抗体、MID9002アゴニスまたはアンタゴニスト、MID9002アゴニストもしくはアンタゴニストのペプチド模倣物、または他の低分子)であり得る。
【0330】
1つの実施形態において、この因子は、1つ以上のMID9002活性を刺激する。このような刺激性因子の例としては、活性なMID9002タンパク質およびMID9002をコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この因子は、1つ以上のMID9002活性を阻害する。このような阻害因子の例としては、アンチセンスMID9002核酸分子、抗MID9002抗体、およびMID9002インヒビターが挙げられる。これらの調節方法は、インビトロにおいてか(例えば、この因子とともに細胞を培養することによって)、またはインビボにおいて(例えば、この因子を被験体に投与することによって)行われ得る。このように、本発明は、MID9002タンパク質または核酸分子の、異常なまたは望ましくない発現または活性によって特徴付けられる疾患または障害に罹患している個体を処置する方法を提供する。1つの実施形態において、この方法は、因子(例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される因子)、またはMID9002発現もしくは活性を調節する(例えば、アップレギュレートするかまたはダウンレギュレートする)因子の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、MID9002タンパク質または核酸分子を、低下した、異常なまたは望ましくないMID9002発現または活性を補償する治療として、投与する工程を包含する。
【0331】
MID9002活性の刺激は、MID9002が異常にダウンレギュレートする状況、および/またはMID9002活性の増加が有利な効果を有するようである状況において、望ましい。例えば、MID9002活性の刺激は、MID9002がダウンレギュレートする状況、および/またはMID9002活性の増加が有利な効果を有するようである状況において、望ましい。同様に、MID9002活性の阻害は、MID9002が異常にアップレギュレートする状況、および/またはMID9002活性の低下が有利な効果を有するようである状況において、望ましい。
【0332】
(薬理ゲノム学(pharmacogenomics))
本発明のMID9002分子、および因子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるような、MID9002活性(例えば、MID9002遺伝子発現)に対する刺激効果もしくは阻害効果を有するモジュレーターは、異常なMID9002活性または望ましくないMID9002活性に関連するMID9002関連障害(例えば、スルファターゼの異常な機能もしくは発現、またはスルファターゼの機能もしくは発現の欠損を含む))を(予防的にかまたは治療的に)処置するために、個体に投与され得る。このような処置とともに、薬理ゲノム学(すなわち、個体の遺伝子型と、外来性化合物もしくは薬物に対するその個体の応答との間の関係の研究)が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療不全を導き得る。従って、医師または臨床医は、MID9002分子を投与するかMID9002モジュレーターを投与するかを決定し、そしてMID9002分子またはMID9002モジュレーターでの処置における、投薬量および/または治療レジメンを変更する際に、関連する薬理ゲノム学研究において得られた知識を適用することを考慮し得る。
【0333】
薬理ゲノム学は、変更された薬物配置および罹患した個人の異常な活性に起因する薬物に対する応答における、臨床学的に有意な遺伝的変異を処置する。例えば、Eichelbaumら、(1996)Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23:983−985およびLinderら、(1997)Clin.Chem.43:254−266を参照のこと。一般に、2つの型の薬理ゲノム学条件は、異なり得る。遺伝的条件は、薬物が身体に作用する様式を変更する(変更された薬物作用)単一因子として普及したか、または遺伝的条件は、身体が薬物に作用する様式を変更する(変更された薬物代謝)単一因子として普及した。これらの薬理ゲノム学条件は、稀なゲノム欠損としてかまたは天然に存在する多型としてかの、いずれかとして生じ得る。例えば、グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠損(G6PD)は、一般的な遺伝性酵素病であり、ここで、主な臨床学的合併症は、酸化薬剤(抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン)の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
【0334】
「ゲノムワイドアソシエーション(genome−wide association)」として知られている、薬物応答を予測する遺伝子を同定するための、1つの薬理ゲノム学アプローチは、すでに知られているゲノム関連マーカー(例えば、「二座対立遺伝子」ゲノムマーカーマップ(これは、ヒトゲノム上の60,000〜100,000の多型または可変部位からなり、これらの各々が、2つの改変体を有する))からなるヒトゲノムの高解像度マップに、主に依存する。このような高解像度ゲノムマップは、特定の観察された薬物応答または副作用に関連したマーカーを同定するために、第II期/第III期の薬物試行に参加した統計学的に有意な数の患者の各々のゲノムのマップと比較され得る。あるいは、このような高解像度マップは、ヒトゲノムにおいて、数千万の公知の一塩基多型(SNP)の組み合わせから生じ得る。本明細書中で使用される場合、「SNP」は、DNAの伸張において、単一ヌクレオチド塩基において生じる一般的な変更である。例えば、SNPは、DNAの1000塩基毎に1回起こり得る。SNPは、疾患プロセスに関与し得るが、大部分は、疾患に関連し得ない。このようなSNPの発生に基づく遺伝マップが与えられると、個体は、個々のゲノムにおいて、SNPの特定のパターンに依存して、遺伝のカテゴリーに分類され得る。このような様式において、処置レジメンは、遺伝的に類似の個体の間で共通であり得る特性を考慮して、このようなゲノム学的に類似の個体の群に対して変更され得る。
【0335】
あるいは、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法は、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。この方法に従って、薬物の標的をコードする遺伝子が既知である場合(例えば、本発明のMID9002タンパク質)、その遺伝子の全ての共通の改変体は、その集団においてかなり容易に同定され得、そして別の遺伝子バージョンに対する1つの遺伝子バージョンが特定の薬物応答に関連するか否かが決定され得る。
【0336】
あるいは、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法が、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。例えば、薬物(例えば、本発明のMID9002分子またはMID9002モジュレーター)を投薬された動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路がオンになったか否かの指標を与え得る。
【0337】
1より多い上記薬理ゲノム学アプローチから得られる情報を使用して、個体の予防的処置または治療的処置のための、適切な投薬量および処置レジメンを決定し得る。この知識は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害反応または治療不全を回避し得、それによって、MID9002分子またはMID9002モジュレーター(例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイのうちの1つによって同定されるモジュレーター)で被験体を処置する場合、治療効果または予防効果を増強させる。
【0338】
本発明はさらに、本発明のMID9002遺伝子の1つ以上によってコードされる遺伝子産物の1つ以上の活性を調節する因子の同定に基づく、新たな因子、または組み合わせを同定するための方法を提供し、ここで、これらの産物は、治療因子に対する細胞の耐性に関連し得る。詳細には、本発明のMID9002遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は、因子の耐性を克服するために、因子を同定するための基礎として使用され得る。耐性タンパク質の1つ以上の活性をブロックすることによって、標的細胞(例えば、ヒト細胞)は、未改変標的細胞が耐性である因子を用いた処置に対して感受性になる。
【0339】
MID9002タンパク質の発現または活性に対する、因子(例えば、薬物)の影響のモニタリングが、臨床試験において適用され得る。例えば、MID9002遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたMID9002活性を増加させるために、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される因子の効果は、MID9002遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたMID9002活性の低下を示す被験体の臨床試験において、モニタリングされ得る。あるいは、MID9002遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたMID9002活性を低下させるために、スクリーニングアッセイによって決定される因子の効果は、MID9002遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたMID9002活性の増加を示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。このような臨床試験において、MID9002遺伝子の発現または活性、好ましくは、例えば、スルファターゼ関連障害またはMID9002関連障害に関与している他の遺伝子の発現または活性は、「読み出し(read out)」または特定の細胞の表現型のマーカーとして、使用され得る。
【0340】
(他の実施形態)
別の局面において、本発明は、複数の捕捉プローブの分析方法を特徴とする。この方法は、例えば、遺伝子発現を分析するのに有用である。この方法は、複数のアドレスを有する二次元アレイを提供する工程(複数のアドレスの各アドレスは、複数のアドレスの互いのアドレスと位置的に識別可能であり、複数のアドレスの各アドレスは、固有の捕捉プローブ(例えば、核酸またはペプチド配列)を有し、捕捉プローブは、MID 9002を発現する細胞または被験体由来であるかまたはMID 9002媒介応答が誘発される細胞または被験体由来である);このアレイをMID 9002核酸(好ましくは精製されたもの)、MID 9002ポリペプチド(好ましくは精製されたもの)、または抗MID 9002抗体と接触させる工程、およびそれによって複数の捕捉プローブを評価する工程、を包含する。結合(例えば、核酸の場合、複数のアドレスのうちの1つのアドレスにおける捕捉プローブとのハイブリダイゼーション)は、例えば、MID 9002核酸、MID 9002ポリペプチド、またはMID 9002抗体に結合された標識から生成されるシグナルによって検出される。
【0341】
捕捉プローブは、選択されたサンプル由来の核酸のセット(例えば、コントロールまたは未刺激組織もしくは細胞由来の核酸のサンプル)であり得る。
【0342】
この方法は、複数の捕捉プローブを有する第1のアレイおよび異なる複数の捕捉プローブを有する第2のアレイと、MID 9002核酸、MID 9002ポリペプチド、またはMID 9002抗体とを接触させる工程を包含し得る。各々のハイブリダイゼーションの結果は、例えば、第1のサンプルと第2のサンプルとの間の発現における差を分析するために比較され得る。第1の複数の捕捉プローブは、コントロールサンプル(例えば、野生型サンプル、正常サンプル、または非疾患サンプル、非刺激サンプル(例えば、生物学的流体サンプル、組織サンプル、または細胞サンプル))由来であり得る。第2の複数の捕捉プローブは、実験サンプル(例えば、変異型サンプル、危険サンプル、疾患状態サンプルもしくは障害状態サンプル、または刺激サンプル(例えば、生物学的流体サンプル、組織サンプル、または細胞サンプル))由来であり得る。
【0343】
複数の捕捉プローブは、複数の核酸プローブであり得、それらの各々は、MID 9002の対立遺伝子と特異的にハイブリダイズする。このような方法は、例えば、疾患または障害の危険を評価するために、被験体に対する選択された処置の感度を評価するために、被験体が疾患または障害を有するか否かを評価するために、被験体を診断するのに使用され得る。
【0344】
この方法は、上記のようにSNPを検出するのに使用され得る。
【0345】
別の局面において、本発明は、MID 9002を分析する(例えば、構造、機能または他の核酸配列もしくはアミノ酸配列との関連を分析する)方法を特徴とする。この方法は、MID 9002核酸配列またはMID 9002アミノ酸配列を提供する工程;MID 9002配列と、配列の集合(例えば、核酸またはタンパク質の配列データベース)からの1つ以上の(好ましくは複数の)配列とを比較する工程、を包含し、それによってMID 9002を分析する。
【0346】
この方法は、MID 9002配列とデータベース配列との間の配列同一性を評価する方法を包含し得る。この方法は、第2の位置の(例えば、インターネットを通じて)データベースにアクセスすることによって実施され得る。好ましいデータベースとしては、GenBankTMおよびSwissProtが挙げられる。
【0347】
別の局面において、本発明は、例えば、SNPを同定するのにまたはMID 9002の特定の対立遺伝子を同定するのに有用なオリゴヌクレオチドのセットを特徴とする。このセットは、複数のオリゴヌクレオチドを含み、その各々は、尋問位置(interrogation position)(例えば、SNPまたは変異部位)に異なるヌクレオチドを有する。好ましい実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、互いに配列において同一である(長さの差を除く)。オリゴヌクレオチドには、異なる標識が提供され得、その結果、1つの対立遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、第2の対立遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと識別可能なシグナルを提供する。
【0348】
MID 9002分子の配列は、その使用を容易にするため、種々の媒体において提供される。配列は、単離された核酸分子またはアミノ酸分子ではなく、MID 9002分子を含む製品として提供され得る。このような製品は、天然で存在するようにまたは精製された形態で、ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列、またはそのサブセットを試験するのに直接的に適用可能でない手段を用いる製品の試験を可能にする形式で、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列(例えば、オープンリーディングフレーム)を提供し得る。
【0349】
MID 9002ヌクレオチド配列またはMID 9002アミノ酸配列は、コンピュータ読み取り可能媒体に記録され得る。本明細書中で使用する場合、「コンピュータ読み取り可能媒体」は、コンピュータによって直接読み取りおよびアクセス可能な任意の媒体をいう。このような媒体としては、磁気記録媒体(例えば、フロッピー(登録商標)ディスク、ハードディスク記録媒体、および磁気テープ);光学記録媒体(例えば、コンパクトディスクおよびCD−ROM);電子記録媒体(例えば、RAM、ROM、EPROM、EEPROMなど);ならびに一般的なハードディスクおよびこれらのカテゴリーのハイブリッド(例えば、磁気/光学記録媒体)が挙げられるがこれらに限定されない。媒体は、その中に、本発明のMID 9002配列情報を有するよう適合または構成される。
【0350】
本明細書中で使用される場合、用語「電子装置」は、データもしくは情報を記録するために構成もしくは適合された他のデバイスの任意の適切な計算装置もしくは処理装置を包含するように意図される。本発明における使用に適切な電子装置の例としては、独立型計算装置;ネットワーク(ローカルエリアネットワーク(LAN)、ワイドエリアネットワーク(WAN)インターネット、イントラネット、およびエクストラネット(Extranet)を含む);電子アプライアンス(例えば、パーソナルディジタルアシスタント(PDA)、携帯電話、ポケットベルなど);ならびにローカル処理システムおよび分散処理システムが挙げられる。
【0351】
本明細書中で使用される場合、「記録される」とは、電子装置読取り可能媒体へと情報を記録またはコードするためのプロセスをいう。当業者は、公知の媒体に情報を記録してMID 9002配列情報を含む製品を作製するために現在公知の方法のいずれかを容易に採用し得る。
【0352】
本発明のMID 9002ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が記録されたコンピュータ読取り可能な媒体を作製するために、種々のデータ保存構造体が、当業者に利用可能である。データ保存構造体の選択は、一般に、保存される情報にアクセスするために選択される手段に基づく。さらに、種々のデータ処理プログラムおよび形式を用いて、本発明のヌクレオチド配列情報をコンピュータ読取り可能媒体に記録し得る。この配列情報は、ワード処理テキストファイルで表されてもよく、市販のソフトウェア(例えば、WordPerfectおよびMicrosoft Word)の形式にされてもよく、またはデータベースアプリケーション(例えば、DB2、Sybase、Oracleなど)に記録されるASCIIファイル形式で表されてもよい。当業者は、多数のデータ処理構造形式(例えば、テキストファイルまたはデータベース)を容易に採用して、本発明のヌクレオチド配列情報が記録されたコンピュータ読取り可能な媒体を作製し得る。
【0353】
本発明のMID 9002のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列をコンピュータ読取り可能な形式で提供することによって、当業者は、種々の目的でその配列情報に慣用的にアクセスし得る。例えば、当業者は、本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列をコンピュータ読取り可能な形式で用いて、標的配列または標的構築モチーフと、データ記憶手段内に記録された配列情報とを比較し得る。検索を用いて、特定の標的配列または標的モチーフと一致する、本発明の配列のフラグメントまたは領域を同定する。
【0354】
それゆえ、本発明は、被験体がスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害を有するかあるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対する素因を有するか否かを決定するための方法を実施するための指示書を保持するための媒体を提供し、ここで、この方法は、その被験体に関連したMID 9002配列情報を決定し、そしてこのMID 9002配列情報に基づいて、この被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害を有するか否かを決定する工程、ならびに/あるいはその疾患、障害または疾患前状態について特定の処置を推奨する工程を包含する。
【0355】
本発明はさらに、電子システムおよび/またはネットワークにおいて、被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害あるいはMID 9002に関連した疾患に対する素因を有するか否かを決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、その被験体に関連したMID 9002配列情報を決定し、そしてこのMID 9002配列情報に基づいて、この被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対する素因を有するか否かを決定する工程、ならびに/あるいはその疾患、障害または疾患前状態について特定の処置を推奨する工程を包含する。この方法はさらに、その被験体に関連した表現型情報を受け取る工程、および/またはネットワークから、その被験体に関連した表現型情報を獲得する工程を含み得る。
【0356】
本発明はまた、ネットワークにおいて、被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害に対する素因または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対する素因を有するか否かを決定するための方法を提供し、この方法は、MID 9002配列情報をこの被験体および/またはそれに関連した情報から受け取る工程、この被験体に関連した表現型情報を受け取る工程、このネットワークから、MID 9002に対応する情報および/あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対応する情報を獲得する工程、ならびにこの表現型情報、MID 9002情報(例えば、配列情報および/またはそれに関連した情報)、および獲得された情報のうちの1以上に基づいて、この被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害に対する素因または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対する素因を有するか否かを決定する工程を包含する。この方法は、この疾患、障害または疾患前状態について特定の処置を推奨する工程をさらに包含し得る。
【0357】
本発明はまた、被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害、あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害に対する素因または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対する素因を有するか否かを決定するためのビジネス方法を提供し、この方法は、MID 9002に関連する情報(例えば、配列情報および/またはそれに関連した情報)を受け取る工程、この被験体に関連した表現型情報を受け取る工程、このネットワークから、MID 9002に関連した情報および/あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に関連した情報を獲得する工程、ならびに、表現型情報、MID 9002情報、および獲得した情報のうちの1以上に基づいて、この被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害、あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害に対する素因または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対する素因を有するか否かを決定する工程を包含する。この方法は、この疾患、障害または疾患前状態について特定の処置を推奨する工程をさらに包含し得る。
【0358】
本発明はまた、本発明のMID9002配列を含むアレイを含む。このアレイは、アレイ中の1つ以上の遺伝子の発現をアッセイするために使用され得る。1実施形態において、このアレイは、アレイ中の遺伝子の組織特異性を確認するために、組織における遺伝子の発現をアッセイするために使用され得る。この様式において、約7600個までの遺伝子を、発現について同時にアッセイし得、そのうちの1つがMID9002であり得る。このことは、1つ以上の組織において特異的に発現される遺伝子の組を示すプロファイルが作成されることを可能にする。
【0359】
このような定性的情報に加えて、本発明は、遺伝子発現の定量を可能にする。従って、組織特異性だけではなく、組織中の遺伝子の組の発現レベルもまた、確認され得る。従って、遺伝子は、その組織発現自体およびその組織における発現レベルに基づいて、分類され得る。これは、例えば、その組織における遺伝子発現の関連性を確認する際に有用である。従って、1つの組織が混乱され得、第二の組織における遺伝子発現に対するその影響が、決定され得る。この文脈において、生物学的刺激に応答した、別の細胞型に対する1つの細胞型の影響が決定され得る。この文脈において、生物学的刺激に応答した、別の細胞型に対する1つの細胞型の影響が決定され得る。このような決定は、例えば、遺伝子発現のレベルで、細胞−細胞相互作用の効果を知るために有用である。ある薬剤が、1つの細胞型を処置するために治療的に投与されるが、別の細胞型に対して望まれない影響を有する場合、本発明は、所望でない影響の分子基礎を決定するためのアッセイを提供し、従って、相殺する薬剤を同時投与する機会またはそうでなければ所望でない効果を処理する機会を提供する。同様に、単一細胞型内でさえ、所望でない生物学的効果が、分子レベルで決定され得る。従って、標的遺伝子以外の遺伝子の発現に対する薬剤の影響が、確認および相殺され得る。
【0360】
別の実施形態において、このアレイは、アレイ中の1つ以上の遺伝子の発現の時間過程をモニタリングするために使用され得る。これは、本明細書中に開示されるような種々の生物学的文脈(例えば、スルファターゼ関連または別のMID9002関連の疾患または障害の発症、スルファターゼ関連または別のMID9002関連の疾患または障害の進行、およびスルファターゼ関連または別のMID9002関連の疾患または障害に関連する細胞形質転換のようなプロセス)において生じ得る。
【0361】
このアレイはまた、同じ細胞または異なる細胞における他の遺伝子の発現に対する、ある遺伝子の発現の影響を確認するため(例えば、他の遺伝子の発現に対する、MID9002発現の影響を確認するため)に有用である。このことは、例えば、最終的な標的または下流の標的が調節され得ない場合に、治療的介入についての代替的分子標的の選択を提供する。
【0362】
このアレイはまた、正常細胞および異常細胞における1つ以上の遺伝子の差示的発現パターンを確認するために有用である。このことは、診断または治療的介入のための分子標的として作用し得る遺伝子の組(例えば、MID9002を含む)を提供する。
【0363】
本明細書中で使用する場合、「標的配列」は、6個以上のヌクレオチドの任意のDNA配列または2個以上のアミノ酸の任意のアミノ酸配列であり得る。当業者は、標的配列が長くなるほど、標的配列がデータベース中のランダムな存在として存在する可能性が低くなることを、容易に認識し得る。標的配列の代表的な長さは、約10〜100アミノ酸、または約30〜300ヌクレオチド残基である。しかし、商業的に重要なフラグメント(例えば、遺伝子発現およびタンパク質プロセシングに関与する配列フラグメント)は、より短い長さのものであり得ることが、充分認識される。
【0364】
分析および他の配列との比較のために、コンピュータ読出し可能な媒体中に提供される配列情報に、当業者がアクセスすることを可能にするコンピュータソフトウェアが、公に利用可能である。種々の公知のアルゴリズムが公に公開されており、そして検索手段を実行するための種々の市販のソフトウェアが、本発明のコンピュータベースのシステムにおいて使用され得る。このようなソフトウェアの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:MacPattern(EMBL)、BLASTNおよびBLASTX(NCBI)。
【0365】
従って、本発明は、コンピュータ読出し可能なマトリクスに配列を記録する工程を包含する、MID9002配列のコンピュータ読出し可能な配列の記録を作成する方法を特徴とする。好ましい実施形態において、この記録は、以下のうちの1つ以上を含む:ORFの同定;ドメイン、領域または部位の同定;転写開始の同定;転写ターミネーターの同定;タンパク質またはその成熟形態の全長アミノ酸配列;翻訳領域の5’末端。
【0366】
別の局面において、本発明は、配列を分析する方法を特徴とする。この方法は、以下:コンピュータ読出し可能な形態で、MID9002配列または記録を提供する工程;このMID9002配列に対して第二の配列を比較する工程を包含し、それによって、配列を分析する。比較は、配列の正体について配列と比較する工程、または1つの配列が他の配列内に含まれるか否かを決定する工程(例えば、MID9002配列が、比較される配列に含まれるか否かを決定する工程)を包含し得る。好ましい実施形態において、MID9002配列または第二の配列は、第一のコンピュータ(例えば、第一のサイト)に記憶され、そしてこの比較は、第二のコンピュータ(例えば、第二のサイト)で実施されるか、読み出されるか、または記録される。例えば、MID9002配列または第二の配列は、公に記憶され得るか、または1つのコンピュータ中の専有データベース中に記憶され得、そして比較の結果は、第二のコンピュータで実施されるか、読み出されるか、または記録される。好ましい実施形態において、記録は、以下のうちの1つ以上を含む:ORFの同定;ドメイン、領域または部位の同定;転写開始の同定;転写ターミネーターの同定;タンパク質またはその成熟形態の全長アミノ酸配列;翻訳領域の5’末端。
【0367】
本発明は、以下の実験によってさらに例示され、これらは、限定として解釈されるべきではない。
【0368】
(実験)
(遺伝子発現分析)
総RNAを、製造業者(TelTest,Inc.)の指示に従ってRNA STAT−60を使用して、単一工程の抽出によって、種々のヒト組織から調製した。各RNA調製物を、37℃で1時間にわたって、DNase I(Ambion)で処理した。内部アンプリコン参照としてβ−2ミクログロブリンを使用して、蛍光の閾値レベルに到達するために、サンプルが少なくとも38サイクルのPCR増幅を必要とした場合に、DNase I処理が完了したと決定した。DNase I処理後のRNAサンプルの完全性を、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色によって確認した。フェノール抽出後、cDNAを、製造業者(GibcoBRL)の指示に従ってSuperScriptTMChoice Systemを使用して、サンプルから調製した。逆転写酵素を有さないネガティブコントロールのRNAが、各RNAサンプルについての逆転写されたモックであった。
【0369】
ヒトMID9002発現を、種々の正常および疾患(例えば、癌性の)ヒト組織または細胞株から調製されたcDNAにおいて、TaqMan(登録商標)定量的PCR(Perkin Elmer Applied Biosystems)によって測定した。
【0370】
プローブを、ヒトMID9002遺伝子の配列に基づいて、PrimerExpressソフトウェア(PE Biosystems)によって設計した。各ヒトMID9002遺伝子プローブを、FAM(6−カルボキシフルオレセイン)を使用して標識し、そしてβ2−ミクログロブリン参照プローブを、異なる蛍光色素VICで標識した。従って、標的遺伝子および内部参照遺伝子の差示的標識化は、同じウェル中での測定を可能にした。β2−ミクログロブリンおよび標的遺伝子の両方についての順方向および逆方向のプライマーおよびプローブを、TaqMan(登録商標)Universal PCR Master Mix(PE Applied Biosystems)に添加した。プライマーおよびプローブの最終濃度は異なり得るが、各々が、所定の実験内では内的に一貫していた。代表的な実験は、200nMの順方向および逆方向のプライマー+β−2ミクログロブリンについてのプローブ100nM、ならびに600nMの順方向および逆方向のプライマー+標的遺伝子についてのプローブ200nMを含んだ。TaqManマトリックス実験を、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(PE Applied Biosystems)で実施した。サーマルサイクラーの条件は、以下の通りであった:50℃で2分間、そして95℃で10分間維持、次いで(95℃で15秒間次いで60℃で1分間)×40サイクルの、2工程PCR。
【0371】
以下の方法を使用して、同じ組織中のβ−2ミクログロブリン発現と比較して、種々の組織においてヒトMID9002遺伝子の発現を定量的に計算した。閾値サイクル(Ct)値を、蛍光における統計的に有意な増加が検出されるサイクルとして定義する。より低いCt値は、より高いmRNA濃度を示す。ヒトMID9002遺伝子のCt値を、β−2ミクログロブリン遺伝子のCt値を差し引くことによって正規化し、以下の式を使用してΔCt値を得る:ΔCt=Ctヒト59914および59921−Ctβ−2ミクログロブリン。次いで、発現を、比較的低いレベルのヒトMID9002遺伝子の発現を示すcDNAサンプルに対して較正する。次いで、標準サンプルについてのΔCt値を、以下の式に従って、各組織サンプルについてのΔCtから差し引く:ΔΔCt=ΔCt−サンプル−ΔCt−標準。次いで、相対的な発現を、2−ΔΔCtによって与えられる演算式を使用して較正する。次いで、試験した各組織中の標的ヒトMID9002遺伝子の発現を、以下により詳細に考察されるように、グラフにより示す。
【0372】
これらの結果は、腎臓、膵臓、脊髄神経節、結腸および肝臓、ならびに結腸癌における有意なMID9002発現を示す(以下の表を参照のこと)。
【0373】
【表1】
【0374】
【表2】
【0375】
【表3】
【0376】
【表4】
【0377】
【表5】
本願を通じて引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【0378】
(等価物)
当業者は、慣用的にすぎない実験を使用して、本明細書中に記載される発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するかまたは確認し得る。
【図面の簡単な説明】
【0379】
【図1a】図1a〜1dは、ヒトMID9002のcDNA配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。ヒトMID9002のメチオニンで開始するオープンリーディングフレーム(配列番号1の5’非翻訳領域および3’非翻訳領域を含まない)もまた、コード配列として示される(配列番号3)。シグナル配列が除去されたこのタンパク質の成熟形態が、配列番号4として示される。
【図1b】図1a〜1dは、ヒトMID9002のcDNA配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。ヒトMID9002のメチオニンで開始するオープンリーディングフレーム(配列番号1の5’非翻訳領域および3’非翻訳領域を含まない)もまた、コード配列として示される(配列番号3)。シグナル配列が除去されたこのタンパク質の成熟形態が、配列番号4として示される。
【図1c】図1a〜1dは、ヒトMID9002のcDNA配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。ヒトMID9002のメチオニンで開始するオープンリーディングフレーム(配列番号1の5’非翻訳領域および3’非翻訳領域を含まない)もまた、コード配列として示される(配列番号3)。シグナル配列が除去されたこのタンパク質の成熟形態が、配列番号4として示される。
【図1d】図1a〜1dは、ヒトMID9002のcDNA配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。ヒトMID9002のメチオニンで開始するオープンリーディングフレーム(配列番号1の5’非翻訳領域および3’非翻訳領域を含まない)もまた、コード配列として示される(配列番号3)。シグナル配列が除去されたこのタンパク質の成熟形態が、配列番号4として示される。
【図2】図2は、ヒトMID9002のヒドロパシープロットを示す。比較的疎水性の残基が、水平な点線の上にある。比較的親水性の残基が、水平な点線の下にある。システイン残基(cys)が、ヒドロパシートレースの直下に短い垂直線により示される。ヒトMID9002のアミノ酸配列に対応する数が、示される。本発明のポリペプチドは、以下:疎水性配列のすべてまたは一部(例えば、点線の上の配列、例えば、配列番号2のアミノ酸およそ1〜22の配列、配列番号2のアミノ酸およそ32〜45の配列、配列番号2のアミノ酸およそ185〜248の配列、配列番号2のアミノ酸およそ265〜275の配列、配列番号2のアミノ酸およそ282〜300の配列、配列番号2のアミノ酸およそ428〜438の配列、および配列番号2のアミノ酸およそ566〜575の配列);親水性配列のすべてまたは一部(例えば、点線の下の配列、例えば、配列番号2のアミノ酸およそ50〜70の配列、配列番号2のアミノ酸およそ145〜193の配列、配列番号2のアミノ酸およそ250〜265の配列、配列番号2のアミノ酸およそ275〜285の配列、配列番号2のアミノ酸およそ315〜325の配列、配列番号2のアミノ酸およそ345〜385の配列、配列番号2のアミノ酸およそ435〜450の配列、配列番号2のアミノ酸およそ455〜470の配列、配列番号2のアミノ酸およそ505〜515の配列、および配列番号2のアミノ酸およそ525〜545の配列;Cysまたはグリコシル化部位を含む配列を含む、フラグメントを包含する。
【図3】図3は、ヒトMID9002のスルファターゼドメインと、PFAMからの隠れMarkovモデル(HMM)から誘導されたコンセンサスアミノ酸配列とのアライメントを示す。上側の配列は、コンセンサスアミノ酸配列(配列番号X)であり、一方、下側のアミノ酸配列は、配列番号2のアミノ酸38〜520に対応する。
【図4】図4a〜fは、ヒトMID9002アリールスルファターゼドメインと、ProDomainデータベースから誘導したドメインのコンセンサスアミノ酸配列(「Arylsulfatase hydrolase」、No.PD001700、PD006857,PD208511,PD002587,PD345058,PD004614,PD335606,PD105130,PD013467,PD013468,PD016856;ProDomain Release 2001.1;http://www.toulouse.inra.fr/prodom.hyml)とのBLASTアライメントを示す。下側の配列は、ProDomainデータベースからのコンセンサス配列のアミノ酸残基であり、一方上側のアミノ酸配列は、ヒトMID9002のアリールスルファターゼドメインまたはその一部に相当する。このBLASTアルゴリズムは、このコンセンサスアミノ酸配列とヒトMID9002との間の多重局所アライメントを同定する。
【図5】図5は、ヒトMID9002とヒトアリールスルファターゼE前駆体(ARSE;Genbank P51690中の登録番号)とのGAPアライメントを示す。この図の上側の配列は、ヒトMID9002(配列番号2)のアミノ酸68〜1834であり、一方、下側の配列は、ARSE(P51690)(配列番号X)のアミノ酸1〜589である。GAPアライメントは、blosum62.iijからのmatblasにより作製されたマトリックスを使用する。
【0001】
(関連技術)
本願は、先願の仮出願番号60/316,710(2001年8月31日出願:表題「Mid 9002,A Human Sulfatase Family Member and Uses Therefor」(係属中))の優先権を主張する。上記で参照される出願の内容全体が、本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【0002】
(発明の背景)
スルファターゼは、広範な種々の基質(例えば、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびデルマタン硫酸)、3β−ヒドロキシステロイド硫酸、およびスルホリピド)中に存在する硫酸エステル結合(O−スルファターゼ活性)の加水分解を触媒する酵素のファミリーである(Parentiら、「The sulfatase gene family」Curr.Opin.Gen.Dev.(1997)7:386〜391;Ballabioら、Steroid sulfatase deficiency and X−linked ichthyosis.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2999−3022,1995)。9つの異なるヒトスルファターゼが、記載されそして特徴付けられている(Ballabioら、Steroid sulfatase deficiency and X−linked ichthyosis.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2999−3022,1995;Kolodnyら、Metachromatic leukodystrophy and multiple sulfatase deficiency:sulfatide lipidosis.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases.Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2693−2741,1995;Neufeldら、The mucopolysaccharidoses.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2645−2494,1995)。スルファターゼの欠損は、少なくとも7つの別個の遺伝性障害に関係している(Kolodnyら、Metachromatic leukodystrophy and multiple sulfatase deficiency:sulfatide lipidosis.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases.Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2693−2741,1995;Neufeldら、The mucopolysaccharidoses.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2645−2494,1995)。既知のスルファターゼタンパク質の全長に沿って、特に、N末端領域において、高度の相同性が存在する(Wilsonら、「Hunter Syndrome:isolation of an iduronate−2−sulfatase cDNA clone and analysis of patient DNA」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8531−8535,1990)。
【0003】
以前から公知のヒトスルファターゼの3つである、アリールスルファターゼA、アリールスルファターゼBおよびアリールスルファターゼC(ARSA、ARSB、およびARSC)は、フェノール環(例えば、p−ニトロカテコールスルフェートまたは4−メチルアンベリフェリルスルフェート(4−methylumbelliferyl sulfate)(4−MUスルフェート))を含む硫酸化人工基質を加水分解することが知られている。ARSCは、より詳細には、ステロイドスルフェートを加水分解するその能力に起因して、ステロイドスルファターゼ(STS)として知られている。ARSA、ARSB、およびARSCの各々は、別個の天然の基質に作用するが、これら全てが、人工基質に対する「無差別な(promiscuous)」活性(すなわち、アリールスルファターゼ活性)を有する。ARSAおよびARSBは、それらの亜細胞局在化におけるリソソーム性であり、酸性の最適pHを有し、一方、ARSCは、ミクロソーム性であり、中性〜アルカリ性の最適pHを有する。リソソームスルファターゼとは異なり、STSは、分解経路ではなく、ステロイドホルモンの合成経路に関与する(Ballabioら、Steroid sulfatase deficiency and X−linked ichthyosis.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,Scriverら編(New York:McGraw−Hill)2999−3022,1995)。
【0004】
新たに同定された3つのスルファターゼファミリーメンバーである、ARSD、ARSEおよびARSFはまた、非リソソーム性であるようである。なぜなら、これらは、小胞体(ARSDおよびARSF)およびGolgiコンパートメント(ARSE)に局在されるからである。ARSEおよびARSFは、蛍光発生的な人工基質である4−MU基質に対して活性であることが示された(Francoら、Cell 81:15−25,1995;Pucaら、Genomics 1997(印刷中))。
【0005】
アリールスルファターゼE(ARSE)は、X連鎖劣性点状骨端形成異常(X−linked recessive chondrodysplasia punctata)、軟骨の障害および骨の発達に関与することが見出されている。用語「点状骨端形成異常(chondrodysplasia punctata)」とは、軟骨内性骨形成の領域における異常なカルシウム沈殿によって特徴付けられる骨格の形成異常の群をいう(Francoら、「A Cluster of Sulfatase Genes on Xp22.3:Mutations in Chondrodysplasia Punctata(CDPX) and Implications for Warfarin Embryopathy」Cell 81:15−25(1995年4月7日))。この異常性の結果から、特有の放射線学的所見が得られ、これは通常、骨端の「斑点」または「ペイントスパッタリングされた(paint−spattered)」カルシウム沈着と呼ばれる。これらのカルシウム沈着は、骨の発達が進行するにつれて、一生の最初の数年以内に消滅する傾向がある。罹患した個体は、重篤な鼻の形成不全、鼻梁の陥没、短い鼻中隔、および鼻翼とその先端部との間の深い溝によって特徴付けられる顔面の異形症を示す。これらはまた、低い身長および遠位指節骨形成不全を有する。
【0006】
スルファターゼによる硫酸エステル結合の加水分解に関与する酵素学的機構に対して、近年、高い注目が払われている。スルファターゼファミリーメンバーの1つの特有の局面は、これら全てが、おそらく小胞体において生じるであろう共通で特有の翻訳時修飾および翻訳後修飾を受けるようであり、この小胞体において、システイン残基が2−アミノ−3−オキソプロピオン酸またはセリンセミアルデヒドに転換されるということである(Schmidtら、Cell 82:271−278,1995)。この翻訳後修飾に関与する機構は、このシステイン残基を含有する保存的直鎖アミノ酸配列によってスルファターゼを認識することであると考えられる。システインのセリンセミアルデヒドへの転換は、触媒活性のために必要とされ、この転換における欠損症は、多発性スルファターゼ欠損症(MSD)(全てのスルファターゼ活性が同時に欠損する稀な疾患)を生じると考えられる(Kolodnyら、Metachromatic leukodystrophy and multiple sulfatase deficiency:sulfatide lipidosis.In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases.Scriverら編(New York:McGraw−Hill),2693−2741,1995)。ARSBの結晶構造の研究は、改変されたシステイン残基および金属イオンが、基質結合ポケットの塩基に位置されることを示している(Bondら、Structure 5:277−289,1997)。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0007】
(発明の要旨)
本発明は、新規スルファターゼファミリーメンバー(本明細書中で「MID9002」と呼ばれる)の発見に、一部基づく。MID9002をコードするcDNAのヌクレオチド配列は、配列番号1に示され、そしてMID9002ポリペプチドのアミノ酸は、配列番号2に示される。さらに、コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号3に示される。
【0008】
従って、1つの局面において、本発明は、MID9002タンパク質またはMID9002ポリペプチドをコードする核酸分子(例えば、MID9002タンパク質の生物学的に活性な部分)を特徴とする。好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。他の実施形態において、本発明は、配列番号1、配列番号3に示されるヌクレオチド配列またはATCC受託番号___で寄託されたプラスミドのDNA挿入物のヌクレオチド配列を有する、単離されたMID9002核酸分子を提供する。なお他の実施形態において、本発明は、配列番号1、配列番号3に示されるヌクレオチド配列またはATCC受託番号___で寄託されたプラスミドのDNA挿入物のヌクレオチド配列に実質的に同一な核酸分子(例えば、天然に存在する対立遺伝子改変体)を提供する。他の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1、配列番号3のヌクレオチド配列またはATCC受託番号___で寄託されたプラスミドのDNA挿入物のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子を提供し、ここで、この核酸分子は、全長MID9002タンパク質またはその活性なフラグメントをコードする。
【0009】
関連した局面において、本発明はさらに、本明細書中に記載されるMID9002核酸分子を含む核酸構築物を提供する。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、ネイティブの調節配列または異種調節配列に作動可能に連結される。本発明のMID9002核酸分子を含むベクターまたは宿主細胞(例えば、ポリペプチドを産生するのに適切な、ベクターおよび宿主細胞)もまた、含まれる。
【0010】
別の関連する局面において、本発明は、MID9002コード核酸の検出のためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして適切な核酸フラグメントを提供する。
【0011】
なお別の関連した局面において、核酸分子をコードするMID9002に対してアンチセンスである単離された核酸分子が、提供される。
【0012】
別の局面において、本発明は、例えば、スルファターゼ関連障害または他のMID9002関連障害の処置および診断に適用可能なアッセイにおける試薬または標的として有用な、MID9002ポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性なフラグメントまたは抗原性フラグメントを特徴とする。別の実施形態において、本発明は、MID9002活性を有するMID9002ポリペプチドを提供する。好ましいポリペプチドは、少なくとも1つのスルファターゼドメインを有するMID9002タンパク質であり、好ましくは、MID9002活性(例えば、本明細書中に記載されるようなMID9002活性)を有するMID9002タンパク質である。
【0013】
別の実施形態において、本発明は、以下を提供する:MID9002ポリペプチド(例えば、配列番号2に示されるアミノ酸配列またはATCC受託番号___で寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によってコードされるアミノ酸配列);配列番号2に示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列またはATCC受託番号___で寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によってコードされるアミノ酸配列;あるいは本明細書中に記載されるようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1もしくは配列番号3のヌクレオチド配列またはATCC受託番号___で寄託されたプラスミドの挿入物のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列(ここで、この核酸は、全長MID9002タンパク質またはその活性化フラグメントをコードする)を有するMID9002ポリペプチド。
【0014】
関連した局面において、本発明は、本明細書中に記載されるMID9002核酸分子を含む核酸構築物をさらに提供する。
【0015】
関連した局面において、本発明は、非MID9002ポリペプチドに作動可能に連結されて融合タンパク質を形成する、MID9002ポリペプチドまたはMID9002フラグメントを提供する。
【0016】
別の局面において、本発明は、MID9002ポリペプチドと反応するか、またはより好ましくは、MID9002ポリペプチドに特異的もしくは選択的に結合する、抗体およびその抗原結合フラグメントを特徴とする。
【0017】
別の局面において、本発明は、MID9002ポリペプチドまたはMID9002核酸の発現または活性を調節する化合物についてスクリーニングする方法を提供する。
【0018】
なお別の局面において、本発明は、例えば、本明細書中に記載され得るスクリーニングにおいて同定される化合物を使用して、MID9002ポリペプチドまたはMID9002核酸の発現または活性を調節するプロセスを提供する。特定の実施形態において、この方法は、MID9002ポリペプチドまたはMID9002核酸の異常な活性または発現に関連した状態(例えば、異常なまたは不十分なスルファターゼの機能または発現を含む状態または障害)の処置を包含する。このような障害の例としては、細胞増殖障害および/または細胞分化障害、骨代謝もしくは軟骨代謝に関連する障害または細胞外マトリクスに関連する障害が挙げられるがこれに限定されない。
【0019】
本発明はまた、生物学的サンプル中の、MID9002ポリペプチドまたはMID9002核酸分子の活性、あるいはMID9002ポリペプチドまたはMID9002核酸分子の存在または非存在を決定するためのアッセイ(疾患診断のためのアッセイを含む)を提供する。
【0020】
さらなる局面において、本発明は、MID9002ポリペプチドまたはMID9002核酸分子中の遺伝的変更の存在または非存在を決定するためのアッセイ(疾患診断のためのアッセイを含む)を提供する。
【0021】
別の局面において本発明は、複数のアドレスを有する二次元アレイを特徴とし、これら複数のアドレスの各アドレスは、位置的に互いに識別可能な複数のアドレスであり、そしてこれら複数のアドレスの各アドレスは、特有の捕捉プローブ(例えば、核酸配列またはペプチド配列)を有する。これら複数のアドレスのうちの少なくとも1つのアドレスは、MID9002分子を認識する捕捉プローブを有する。1つの実施形態において、この捕捉プローブは、核酸(例えば、MID9002核酸配列に相補的なプローブ)である。別の実施形態において、この捕捉プローブは、ポリペプチド(例えば、MID9002ポリペプチドに特異的な抗体)である。前述のアレイにサンプルを接触させてそのサンプルを分析し、そして、そのアレイに対するそのサンプルの結合を検出する方法もまた、特徴として挙げられる。
【0022】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から、明らかとなる。
【0023】
(発明の詳細な説明)
ヒトMID9002配列(図1a;配列番号1))これは、非翻訳領域を含む約1858ヌクレオチド長である)は、終止コドンを含む約1770ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列(図1a中の配列番号1;図1cの配列番号3のコーディングとして示されるヌクレオチド)を含む。このコード配列は、589アミノ酸のタンパク質(配列番号2)をコードする。配列番号2、図1dおよび図2のヒトMID9002タンパク質は、約31アミノ酸のアミノ末端疎水性アミノ酸配列(シグナル配列と一致する)(配列番号2のアミノ酸1〜アミノ酸およそ31,PSORT,NakaiおよびKanehisa(1992)Genomics 14:897〜911)、これは、切断に際して成熟タンパク質形態の生成を生じる)を含む。この成熟タンパク質形態(図1dに配列番号4として示される)は、長さ約558アミノ酸残基である(配列番号2のアミノ酸およそ32〜アミノ酸589)。
【0024】
ヒトMID9002は、以下の領域または他の構造特徴を含む(PFAM識別子、PSprefixドメイン識別番号およびPF prefixドメイン識別番号に関する一般的情報について、Sonnhammerら(1997)Protein 28:405〜420およびhttp://www.psc.edu/general/software/package/pfam/pfam.htmlを参照されたい):
配列番号2のアミノ酸残基およそ38〜520に位置するスルファターゼドメイン(PFAM登録番号PF00884);
配列番号2のアミノ酸残基およそ37〜589に位置するアリールスルファターゼドメイン(ProDom No.PD001700,PD006857,PD208511,PD002587,PD105119,PD345058,PD004614,PD335606,PD105130,PD013467,PD013468,PD016856);
配列番号2のアミノ酸およそ14〜30、227〜249、および291〜307にある3つの膜貫通ドメイン(MEMSAT,Jonesら(1994)Biochemistry 33:3038〜3049により推定される);
配列番号2のアミノ酸およそ137〜147(GYATGLIGKWH)に位置するスルファターゼサイン配列(Prosite PS00149);
配列番号2のアミノ酸およそ84〜96(SLCTPSRAAFLTG)に位置する別のスルファターゼサイン配列(Prosite PS00523);
配列番号2のアミノ酸およそ60〜62(TMR)、95〜97(TGR)および187〜189(SEK)に位置する3つのプロテインキナーゼCリン酸化部位(Prosite PS00005);
配列番号2のアミノ酸およそ154〜157(SASD)、260〜263(TTTE)、410〜413(SLMD)および448〜451(SDHE)に位置する4つのカゼインキナーゼIIリン酸化部位(Prosite PS00006);
配列番号2のアミノ酸およそ131〜138(KILKEKGY)に位置する1つのチロシンキナーゼリン酸化部位(Prosite PS00007);
配列番号2のアミノ酸およそ54〜59(GCYGNN)、73〜78(GVKLTQ)、103〜108(GMVSSI)、117〜122(GASGGL)、172〜177(GMPFSL)、341〜346(GLSNST)、356〜361(GSLENQ)、368〜373(GGWNGI)、381〜386(GGWEGG)、397〜402(GVLPAG)、および488〜493(GAGACY)に位置する11個のN−ミリストイル化部位(Prosite PS00008);
配列番号2のアミノ酸およそ493〜496(YGRK)に位置する1つのアミド部位(Prosite PS00009);ならびに
配列番号2のアミノ酸およそ58〜61(NNTM)、125〜128(NETT)、258〜261(NHTI)および344〜347(NSTL)に位置する4つのN−グリコシル化部位(Prosite PS00009)。
【0025】
ヒトMID9002をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドが、American Type Culture Collection(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110〜2209に、_付けで寄託され、受託番号_を与えられた。この寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って維持される。この寄託物は、当業者にとっての簡便性としてのみなされたものであり、35 U.S.C.§112の下で寄託物が必要とされることの承認ではない。
【0026】
このMID9002タンパク質は、そのスルファターゼファミリーのメンバーと共通する有意な数の構造特徴を含む。用語「ファミリー」は、本発明のタンパク質分子および核酸分子に言及する場合、共通の構造ドメインまたは構造モチーフを有しかつ本明細書中に規定される十分なアミノ酸配列ホモロジーもしくはヌクレオチド配列ホモロジーを有する、2つ以上のタンパク質分子または核酸分子を意味する。このようなファミリーのメンバーは、天然に存在しても天然に存在しなくてもよく、そして同じ種由来または異なる種由来のいずれであってもよい。例えば、ファミリーは、ヒト起源の第1タンパク質およびヒト起源の他の別個のタンパク質を含み得るか、あるいは、非ヒト起源(例えば、ラットタンパク質もしくはマウスタンパク質)のホモログを含み得る。ファミリーのメンバーはまた、共通の機能的特徴を有し得る。
【0027】
本明細書で使用されるように、用語「スルファターゼ」は、硫酸エステルの加水分解を触媒することが可能なタンパク質またはポリペプチドを含む。スルファターゼの基質は、複合体分子(例えば、グルコサミノグルカンおよびスルホリピド)から3β−ヒドロキシステロイドまでの範囲にわたる。スルファターゼは、細胞外マトリックスの分解において重要であると考えられる。アリールスルファターゼEをコードする遺伝子は、軟骨発達および骨発達の障害であるX連鎖劣性点状骨端形成異常(chondrodisplasia punctata)に関与することが示されている。スルファターゼ酵素はまた、少なくとも6つの他の遺伝障害に関連する。以前に記載されたヒトスルファターゼ(アリールスルファターゼA、アリールスルファターゼBおよびアリールスルファターゼC(ARSA、ARSB、ARSC))は、フェノール環(例えば、パラ−ニトロカテコールスルフェートまたは4−メチルウンベリフェリルスルフェート(4−MUスルフェート))を含む硫酸化された人工の基質を加水分解することが可能である。そのステロイドスルファターゼ(STS)を加水分解する能力のために、ARSCは、ステロイドスルファターゼとしてより具体的に知られる。ARSAおよびARSBは、それらの細胞下位置ではリソソームにあり、そして酸性pHの最適条件を有し、一方、ARSCは、ミクロソームであり、そして中性からアルカリpHの最適条件を有する。
【0028】
タンパク質のスルファターゼファミリーのメンバーは、代表的には、その細胞のリソソーム、ミクロソーム、小胞体、またはゴルジ体に関連する。スルファターゼの活性部位は、代表的には、セリンセミアルデヒドおよび金属(例えば、Ca2+)結合部位へ変換されるシステイン残基を有する。活性部位における改変されたシステイン残基(配列番号2に示されるMID9002のCys86)は、基質のスルフェートに共有結合で結合し得、従って、中間体の酵素−スルフェート複合体を形成する。スルファターゼファミリーのメンバーは、タンパク質全長、特にアミノ末端領域に沿って高い割合でアミノ酸類似性を示す。
【0029】
ヒトアリールスルファターゼE前駆体とのMID9002タンパク質の整列は、図5に示されており、そして、2つの配列間で約100%の配列同一性を示す(blosum62.iijマトリックスからmatblasにおいて計算される)。ヒトアリールスルファターゼファミリーメンバー(アリールスルファターゼDおよびアリールスルファターゼF)とのMID9002タンパク質の整列はまた、種々のスルファターゼファミリーメンバー間で、かなりの相同性(67〜74%の配列同一性)を示す。
【0030】
MID9002ポリペプチドは、「スルファターゼドメイン」または「スルファターゼドメイン」と相同性のある領域を含み得る。MID9002ポリペプチドは、「触媒ドメイン」と相同性のあるタンパク質または領域の酵素活性の原因である「触媒ドメイン」をさらに含み得る。
【0031】
本明細書で使用されるように、用語「スルファターゼドメイン」は、約38〜520個のアミノ酸残基長のアミノ酸配列を含み、そして、少なくとも500個、600個、または好ましくは700個のスルファターゼドメイン(HMM)に対する配列の整列についてビットスコア(bit score)を有する。好ましくは、スルファターゼドメインは、硫酸エステルの加水分解を触媒する。好ましくは、スルファターゼドメインは、少なくとも約100〜700個のアミノ酸、より好ましくは、約200〜600個のアミノ酸残基、または約400〜600個のアミノ酸を含み、そして、少なくとも500個,600個,700個,750個,775個,790個、またはそれより多いスルファターゼドメイン(HMM)に対する配列の整列についてビットスコアを有する。「スルファターゼドメイン」はまた、本明細書に記載される特性配列SLCTPSRAAFLTG、[SAP]−[LIVMST]−[CS]−[STAC]−P−[STA]−R−x(2)−[LIVMFW](2)−[TAR]−G、GYATGLIGKWH、またはG−[YV]−x−[ST]−x(2)−[IVAS]−G−K−x(0,1)−[FYWMK]−[HL]の少なくとも1つに対して、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性のスルファターゼ特性配列を含み得る。「スルファターゼドメイン」はまた、システイン残基またはセリンセミアルデヒド(2−アミノ−3−オキソプロピオン酸)に変換されるシステイン残基を含み得る。「スルファターゼドメイン」はまた、金属イオン(Ca2+)結合部位を含み得る。「スルファターゼドメイン」は、スルフェート基質、好ましくはアリールスルフェート基質に結合および/またはその加水分解を触媒する能力を有し得る。
【0032】
スルファターゼドメインは、Prositeスルファターゼ特性配列PS00149、G−[YV]−x−[ST]−x(2)−[IVAS]−G−K−x(0,1)−[FYWMK]−[HL]、またはそれらに対して相同性のある配列を含み得る。スルファターゼドメインはまた、別のPrositeスルファターゼ特性配列PS00523、[SAP]−[LIVMST]−[CS]−[STAC]−P−[STA]−R−x(2)−[LIVMFW](2)−[TAR]−G、またはそれらに対して相同性のある配列を含み得る。本明細書に記載される上記の保存された特性配列、および他のモチーフまたは特性配列において、アミノ酸についての標準的なIUPACの1文字記号が使用される。パターンにおける各要素は、ダッシュ(−)によって分離され;大括弧([ ])は、その位置で受容される特定の残基を示し;xは、任意の残基が、その位置で受容されることを示し;そして、丸括弧(( ))内の数字は、付随するアミノ酸によって代表される残基数を示す。Prosite PS00149スルファターゼ特性配列は、ヒトMID9002ポリペプチドのスルファターゼドメインに位置し、そして、配列番号2のアミノ酸約137〜147(GYATGLIGKWH)に対応する。Prosite PS00523スルファターゼ特性配列はまた、ヒトMID9002ポリペプチドのスルファターゼドメインに位置し、そして、配列番号2のアミノ酸約84〜96(SLCTPSRAAFLTG)に対応する。スルファターゼドメイン(HMM)は、PFAM受託番号PF00884を割り当てられた(http;//genome.wustl.edu/Pfam/.html)。本明細書で使用されるように、「スルファターゼドメイン」は、次のProDomファミリー「アリールスルファターゼ」ドメイン(ProDomain Release 2001.1;http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html、図4a〜4g)の各々または両方に対して、相同性(例えば、少なくとも約69%、70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%、または84%の同一性)のあるヒトMID9002タンパク質の一部である。BLASTサーチモデルより誘導される、PD001700、配列番号XとのヒトMID9002のスルファターゼドメイン(配列番号2のアミノ酸37〜181)の整列は、73%の同一性を示す(blosum62マトリックスからProdomainにおいて計算される、図4a〜4g)。隠されたMrkovモデルから誘導される、Pfamスルファターゼコンセンサスアミノ酸配列(配列番号X)とのヒトMID9002のスルファターゼドメイン(配列番号2のアミノ酸38〜520)の整列が、図3に示される。
【0033】
好ましい実施形態において、MIDポリペプチドまたはタンパク質は、「スルファターゼドメイン」または少なくとも約100〜700個、より好ましくは300〜600個あるいは400〜600個のアミノ酸残基を含み、そして「スルファターゼドメイン」(例えば、ヒトMID9002のスルファターゼドメイン(例えば、配列番号2の残基38〜520))に対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%の相同性を有する領域を有する。
【0034】
MID9002タンパク質配列における「スルファターゼ」ドメインの存在を同定し、そして目的のポリペプチドまたはタンパク質が特定のプロフィールを有することを決定するために、タンパク質のアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを使用し、HMM(例えば、the Pfam database,release2.1)のPfamデータベースに対して検索され得る(http://sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search)。例えば、検索プログラムのHMMERパッケージの一部として入手可能なhmmsfプログラムは、MILPAT0063についてのファミリー特異的な初期プログラムであり、そして15のスコアは、ヒットを決定するためのデフォルト閾値スコアである。あるいは、ヒットを決定するための閾値スコアは、下げられ得る(例えば、8ビットまで)。Pfamデータベースの説明は、Sonhammerら((1997)Proteins 28:405〜420)において見出され得、そしてHMMの詳細な説明は、例えば、以下の文献:Gribskovら(1990)Meth.Enzymol.183:146〜159;Gribskovら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4335〜4358;Kroghら(1994)J.Mol.Biol.235:1501〜1531;およびStultzら(1993)Protein Sci.2:305〜314、において見出され得、その内容は、本明細書で参考として援用される。検索は、HMMデータベースに対して実行され、その結果、配列番号2の残基約38〜520で、ヒトMID9002のアミノ酸配列における「スルファターゼドメイン」ドメインが同定された(図1bを参照のこと)。
【0035】
MID9002タンパク質配列における「スルファターゼ」ドメインの存在を同定し、そして目的のポリペプチドまたはタンパク質が特定のプロフィールを有することを決定するために、タンパク質のアミノ酸配列は、ドメインのデータベース(例えば、ProDomデータベース(Corpetら(1999),Nucl.Acids Res.27:263〜267)に対して検索され得る。ProDomタンパク質ドメインデータベースは、相同性ドメインの自動編集(automatic compilation)からなる。ProDomの現在のバージョンは、SWISSPROT 38およびTREMBLタンパク質データベースの反復的なPSI−BLAST検索(Altschulら(1997)Nucleic Acids Res.25:3389〜3402;Gouzyら(1999)Computers and Chemistry 23:333〜340)を使用して構築される。データベースは、各ドメインに対するコンセンサス配列を自動的に生成する。BLAST検索は、HMMデータベースに対して実行され、その結果、配列番号2の残基約37〜589で、ヒトMID9002のアミノ酸配列における「スルファターゼ」ドメインが同定された(図1bを参照のこと)。
【0036】
MID9002ポリペプチドは、少なくとも1つの、好ましくは2つの「膜貫通ドメイン」または「膜貫通ドメイン」と相同性のある領域を含み得る。本明細書で使用されるように、用語「膜貫通ドメイン」は、約10〜40個のアミノ酸残基長のアミノ酸配列を含み、そして原形質膜に広がる。膜貫通ドメインは、疎水性残基が豊富であり、例えば、膜通過ドメインの少なくとも50%、60%、70%,80%、90%、95%またはそれより多いアミノ酸は、疎水性(例えば、ロイシン、イソロイシン、チロシン、またはトリプトファン)である。膜貫通ドメインは、代表的には、α−ヘリックス構造を有し、例えば、Zagottaら,(1996)Annual Rev.Neurosci.19:235〜263、に記載されており、その内容は、本明細書で参考として援用される。ヒトMID9002の膜貫通ドメインは、配列番号2のおよそ残基227〜249およびおよそ残基291〜307に位置する。
【0037】
好ましい実施形態において、MID9002ポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも1つ、好ましくは2つの「膜貫通ドメイン」または少なくとも約12〜35個、より好ましくは約14〜30個または15〜25個のアミノ酸残基を含む領域を有し、そして「膜貫通ドメイン」(例えば、ヒトMID9002の膜貫通ドメイン(例えば、配列番号2の残基227〜249および残基291〜307))と、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%の相同性を有する。ヒトMID9002の膜貫通ドメインは、ヒドロパシートレースが、大部分は水平線より上である約15〜25個のアミノ酸の領域として、ヒドロパシープロット(図2)において可視化される。
【0038】
MID9002タンパク質配列における「膜貫通」ドメインの存在を同定し、そして目的のポリペプチドまたはタンパク質が特定のプロフィールを有することを決定するために、タンパク質のアミノ酸配列は、トポロジーモデル(MEMSAT,Jonesら,(1994)Biochemistry 33:3038〜3049)の認識に基づいて、内在性膜タンパク質の2次構造およびトポロジーを予測する膜通過予測によって分析され得る。
【0039】
MID9002ポリペプチドは、少なくとも1つ、2つ、好ましくは3つの「非膜貫通領域」を含み得る。本明細書で使用されるように、用語「非膜貫通領域」は、膜貫通領域として同定されないアミノ酸配列を含む。MID9002における非膜貫通領域は、配列番号2のおよそアミノ酸1〜227、アミノ酸249〜291、およびアミノ酸307〜589に位置する。非膜貫通領域は、細胞外、細胞質、または管腔であり得る。3ドメインモデルは、スルファターゼファミリーのメンバーについて提唱されている。2つの管腔に配向したドメインは、逆の方向で2回膜にまたがる疎水性ドメインによって分離される。管腔配向ドメインは、グリコシル化され得る。
【0040】
MID9002の非膜貫通領域は、少なくとも1つ、好ましくは2つの管腔領域を含む。N末端に位置される場合、管腔領域は、本明細書では「N末端管腔ドメイン」として参照される。本明細書で使用されるように、「N末端管腔領域」は、約1〜300個、好ましくは約1〜250個、より好ましくは約1〜225個、またはさらにより好ましくは約1〜200個のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を含み、細胞オルガネラ(例えば、小胞体またはゴルジ体)の管腔の内側に位置する。「N末端管腔ドメイン」のC末端アミノ酸残基は、MID9002タンパク質における膜貫通ドメインのN末端アミノ酸残基に隣接する。例えば、N末端管腔ドメインは、配列番号2のおよそアミノ酸残基1〜227に位置する。
【0041】
好ましい実施形態において、MID9002ポリペプチドまたはタンパク質は、N末端管腔ドメインまたは約1〜300個、好ましくは約1〜250個、およびより好ましくは約1〜200個のアミノ酸残基を含む領域を有し、そして、「N末端管腔ドメイン」(例えば、ヒトMID9002のN末端管腔ドメイン(例えば、配列番号2の残基1〜227))と、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%の相同性を有する。
【0042】
別の実施形態において、MID9002細胞質領域は、少なくとも1つのループを含む。本明細書で使用されるように、用語「ループ」は、リン脂質膜内に含まれないアミノ酸配列を含み、少なくとも約4、好ましくは約5〜50、より好ましくは約6〜45のアミノ酸残基長を有し、そしてタンパク質またはポリペプチド内の2つの膜貫通ドメインと繋がるアミノ酸配列を有する。従って、ループのN末端アミノ酸は、MID9002分子における膜貫通ドメインのC末端アミノ酸に隣接し、そしてループのC末端アミノ酸は、MID9002分子における膜貫通ドメインのN末端アミノ酸に隣接する。本明細書で使用されるように、「ループ」は、細胞のオルガネラの管腔の外側に位置するループまたは細胞の細胞質内のループを含む。例えば、「ループ」は、配列番号2のおよそアミノ酸残基249〜291で見出され得る。
【0043】
好ましい実施形態において、MID9002ポリペプチドまたはタンパク質は、ループまたは少なくとも約4個、好ましくは約5〜50個、およびより好ましくは約6〜45個のアミノ酸残基を含む領域を有し、そして、「ループ」(例えば、ヒトMID9002のループ(例えば、配列番号2の残基249〜291))と、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%の相同性を有する。
【0044】
別の実施形態において、MID9002タンパク質の管腔領域は、C末端を含み得、そして「C末端管腔ドメイン」であり得、また本明細書で「C末端管腔尾部」として参照され得る。本明細書で使用されるように、「C末端管腔ドメイン」は、少なくとも約100、好ましくは約200〜400、より好ましくは約250〜300のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を含み、細胞のオルガネラの管腔の内側に位置する。「C末端管腔ドメイン」のN末端アミノ酸残基は、MID9002タンパク質における膜貫通ドメインのC末端アミノ酸残基に隣接する。例えば、C末端管腔ドメインは、配列番号2のおよそアミノ酸残基307〜589に位置する。
【0045】
好ましい実施形態において、MID9002ポリペプチドまたはタンパク質は、C末端管腔ドメインまたは少なくとも約100、好ましくは約200〜400、そしてより好ましくは約250〜300のアミノ酸残基を含む領域を有し、そして「C末端管腔ドメイン」(例えば、ヒトMID9002のC末端管腔ドメイン(例えば、配列番号2の残基307〜589))と、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%の相同性を有する。
【0046】
ヒトMID9002タンパク質は、スルファターゼ特性配列(例えば、Prosite PS00149およびPS00523)をさらに含み得る。例えば、スルファターゼ特性配列は、配列番号2のおよそアミノ酸残基137〜147および84〜96に位置する。好ましい実施形態において、MID9002ポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも約5、好ましくは約5〜20、そしてより好ましくは約8〜15のアミノ酸残基を含むスルファターゼ特性配列を有し、そしてスルファターゼ特性配列(例えば、ヒトMID9002のスルファターゼ特性配列(例えば、配列番号2の残基137〜147および84〜96))と、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%の相同性を有する。
【0047】
MID9002ファミリーメンバーは、少なくとも1つのスルファターゼドメインを含み得;そして、少なくとも1つ、好ましくは2つの膜貫通ドメインを含み得る。MID9002ファミリーメンバーは、少なくとも1つのスルファターゼ特性配列(Prosite PS00149およびPS00523)を含み得る。さらに、MID9002ファミリーメンバーは、以下を含み得る:少なくとも1つ、2つ、好ましくは3つのプロテインキナーゼCリン酸化部位(Prosite PS00005);少なくとも1つ、2つ、3つ、好ましくは4つのカゼインキナーゼIIリン酸化部位(Prosite PS00006);少なくとも1つ、2つ、3つ、好ましくは4つのN−グリコシル化部位(Prosite PS00001);少なくとも1つチロシンキナーゼリン酸化部位(Prosite PS00007);少なくとも1つのアミド化部位(Prosite PS00009);および少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、および好ましくは11のN−ミリストイル化部位(Prosite PS00008)。
【0048】
本発明のMID9002ポリペプチドが、MID9002媒介活性を調節し得るので、以下に記載されるように、それらは、スルファターゼ関連障害または他のMID9002関連障害のための新規な診断薬および治療薬を開発するために有用であり得る。
【0049】
本明細書で使用されるように、「スルファターゼ関連活性」は、硫酸エステルの加水分解の触媒に関連する活性を含む。「スルファターゼ関連活性」は、細胞外マトリックス(ECM)の成分の分解に関連し得る。スルファターゼファミリーのメンバーは、X連鎖の劣性点状骨端形成異常、骨軟骨異形成症、および末節骨短縮性小人症疾患において役割を果たし得る(Malouら、Arch.Pediatr.8(2):176〜180,2001年2月;Sabarirayan Pediatr.Radiol.29(5):322,1999年5月;Sheffieldら、J.Med.Genet.35(12):1004〜1008,1998年12月;Danieleら Am.J.Hum.Genet.62(3):562〜572,1998年3月;PrentiらAm.J.Med.Genet.73(2):139〜143,1997年12月;Francoら Cell 81(1):15〜25,1995年4月7日;Baitnerら J.Pediatr.Orthop.20(5):594〜605,2000年9月〜10月;Horton Eur.J.Hum.Genet.3(6):357〜373,1995年;Seidelら Clin.Genet.59(2):115〜121,2001年2月)。
【0050】
本明細書で使用されるように、「MID9002活性」、「MID9002の生物学的活性」または「MID9002の機能的活性」は、インビボまたはインビトロで決定されるような、例えば、MID9002応答性細胞に対して、またはMID9002基質(例えば、タンパク質、生体分子、低分子、炭水化物基質)に対してMID9002タンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子によって発揮される活性をいう。1つの実施形態において、MID9002活性は、MID9002標的分子との会合のような直接的な活性である。「標的分子」または「結合パートナー」は、MID9002タンパク質が結合するか、または自然に相互作用する分子である。例示的な実施形態において、MID9002は、スルファターゼ(例えば、アリールスルファターゼファミリーメンバー)であり、従って、それは、基質、好ましくは硫酸エステル部分を含む生体分子と自然に結合および相互作用し、そして硫酸エステル結合の加水分解を触媒する。
【0051】
MID9002活性はまた、間接的な活性(例えば、MID9002レセプターとのMID9002タンパク質の相互作用によって媒介される細胞シグナル伝達活性)であり得る。上記の配列構造および公知の機能的分子との類似性に基づき、本発明のMID9002分子は、スルファターゼファミリーメンバーのと類似の生物学的活性を有し得る。例えば、本発明のMID9002タンパク質は、1以上の以下の活性を有し得る:(1)硫酸エステル(例えば、アリール硫酸エステル)の加水分解を触媒する能力;(2)細胞外マトリックスを分解する能力;(3)硫酸エステルを含む化学化合物と結合する能力;(4)骨および/または軟骨の代謝/形成/破壊に作用する能力;および(5)癌の進行(例えば、浸潤、転移)に作用する能力。
【0052】
本発明のMID9002分子は、それらが発現される組織における細胞の活性を調節し得る。例えば、MID9002mRNAは、腎臓、膵臓、背根神経節、結腸、および肝臓において発現される。従って、本発明のMID9002分子は、腎臓障害、膵臓障害、肝臓障害、神経学的障害、胃腸障害、または結腸障害のための治療薬または診断薬として作用し得る。
【0053】
MID9002mRNAが、結腸、肝臓、腎臓、および膵臓において発現されるので、MID9002分子は、結腸、胃腸系、および腎臓の増殖性障害および/または分化性障害を処置するために使用され得る。細胞増殖性障害および/または分化性障害の例としては、癌(例えば、癌腫、肉腫、転移性障害または造血性新生物性障害(例えば、白血病))が挙げられる。転移性腫瘍は、多数の原発性腫瘍型(前立腺、結腸、肺、乳房、および肝臓起源の原発性腫瘍を含むが、これらに限定されない)から生じ得る。
【0054】
本明細書において使用されるように、用語「癌」(また、用語「過剰増殖性」および「新生物性」と相互変換可能で使用される)は、自立的増殖(すなわち、急速に増殖する細胞増殖によって特徴付けられる異常な状態または状況)の能力を有する細胞をいう。癌性疾患状態は、病理学的な(すなわち、疾患状態を特徴付けるか、または構成する)、例えば、悪性腫瘍増殖として分類され得、あるいは、正常であるが疾患状態に関連しない逸脱(例えば、創傷修復に関連する細胞増殖として分類され得る。用語は、組織病理学型または浸潤の段階に関わりなく、全ての型の癌性増殖または腫瘍形成プロセス、転移性組織または悪性に変換された細胞、組織、あるいは器官を含むことを意味する。用語「癌」は、種々の器官系の悪性疾患(例えば、肺、乳房、甲状腺、リンパ球、胃腸、および尿生殖器系に影響を及ぼす悪性疾患、ならびに大部分の大腸癌のような悪性疾患)を含む腺癌、腎細胞癌、前立腺癌および/または精巣癌、肺の非小細胞癌、小腸癌ならびに食道癌を含む。用語「癌腫(癌)(carcinoma)」は、当該分野で認識され、そして上皮組織または内分泌組織の悪性疾患(呼吸器系癌、胃腸系癌、尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、および黒色腫を含む)をいう。例示的な癌としては、頸部、肺、前立腺、乳房、頭部および頸部、結腸ならびに卵巣の組織から形成される癌が挙げられる。用語「癌(carcinoma)」はまた、例えば、癌性組織および肉腫性組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫を含む。「腺癌」は、腺組織由来の癌、または腫瘍細胞が、認識可能な腺構造体を形成する癌をいう。用語「肉腫」は、当該分野で認識され、間葉起源の悪性腫瘍をいう。
【0055】
本発明のMID9002分子は、種々の増殖性障害をモニター、処置および/または診断するために使用され得る。このような障害としては、造血性新形成障害が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「造血性新形成障害」は、例えば、骨髄系統、リンパ系統もしくは赤血球系統、またはこれらの前駆細胞から生じる、造血起源の過形成/腫瘍性細胞を含む疾患を含む。好ましくは、これらの疾患は、ほとんど分化していない急性白血病(例えば、赤芽球白血病および急性巨核芽球白血病)から生じる。さらなる代表的な骨髄障害としては、急性前骨髄性白血病(APML)、急性骨髄性白血病(AML)、および慢性骨髄性白血病(CML)(Vaickus,(1991)Crit Rev.Oncol./Hemotol.11:267−97において概説されている)が挙げられるがこれらに限定されない;リンパ性悪性疾患としては、急性リンパ芽球性白血病(ALL)(B系統ALLおよびT系統ALLを含む)、慢性リンパ性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(PLL)、ヘアリー細胞白血病(HLL)、およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症(WM)が挙げられるがこれらに限定されない。悪性リンパ腫のさらなる形態としては、非ホジキンリンパ腫およびその改変体、末梢性T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫瘍(ATL)、癌性T細胞リンパ腫(CTCL)、大顆粒性リンパ性白血病(LGF)、ホジキン病、およびリード−スターンバーグ病が挙げられるがこれらに限定されない。
【0056】
従って、MID9002分子は、1つ以上の増殖性および/または分化性障害あるいは他のスルファターゼ障害を制御するための新規な診断標的および治療剤として作用し得る。本明細書中で使用される場合、「スルファターゼ障害」は、その病因が異常なスルファターゼタンパク質機能もしくは発現または欠損性のスルファターゼタンパク質機能もしくは発現によって引き起こされるか、これらに関連するか、あるいはこれらに付随する疾患または障害である。このような障害(例えば、スルファターゼ関連障害または他のMID9002関連障害)の例としては、細胞増殖性障害および/または分化性障害(例えば、線腫、腺癌)、骨代謝に関連する障害、免疫(例えば、炎症)障害、心血管障害、内皮細胞障害、肝臓障害、ウイルス疾患、疼痛または代謝障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【0057】
MID9002分子は、一部、胃腸新生物障害(例えば、線腫、腺癌)を処置するために使用され得る。なぜなら、スルファターゼファミリーのメンバーは、結腸、肝臓、および膵臓において見出されるからである。
【0058】
細胞増殖性障害および/または細胞分化性障害の例としては、癌(例えば、癌腫、肉腫、転移性障害、または造血新生物障害(例えば、白血病)が挙げられる。転移性の腫瘍は、多数の原発性腫瘍型(前立腺起源、結腸起源、肺起源、乳房起源、および肝臓起源の原発性腫瘍型が挙げられるがこれらに限定されない)から生じ得る。
【0059】
本明細書中で使用される場合、用語「癌」(用語「過剰増殖」および「新形成」と互換可能にも使用される)とは、自律増殖能力を有する細胞(すなわち、迅速に増殖する細胞増殖により特徴付けられる異常な状態または状況)を指す。癌性疾患状態は、病的と分類され得る(すなわち、疾患状態(例えば、悪性腫瘍増殖)を特徴付けるかまたは構成する)か、あるいは、非病的と分類され得る(すなわち、正常ではないが疾患状態と関連はない(例えば、創傷修復と関連する細胞増殖))。この用語は、すべての型の癌性増殖または癌原性プロセス、転移性組織または悪性形質転換細胞、悪性形質転換組織、あるいは悪性形質転換器官(組織病理型にも侵襲性の段階にも関わらない)を包含することを意味する。用語「癌」は、種々の器官系の悪性疾患(例えば、肺を冒す悪性疾患、乳房を冒す悪性疾患、甲状腺を冒す悪性疾患、リンパ腺を冒す悪性疾患、胃腸管を冒す悪性疾患および尿生殖器管を冒す悪性疾患、ならびに腺癌(ほとんどの結腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および/または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌および食道の癌のような悪性疾患を包含する)を包含する。用語「癌腫」は、当該分野で認識されており、そしてこの用語は、上皮組織もしくは内分泌組織の悪性疾患(呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、および黒色腫を包含する)を指す。例示的癌腫としては、子宮頸部組織から形成する癌腫、肺組織から形成する癌腫、前立腺組織から形成する癌腫、乳房組織から形成する癌腫、頭部および頸部の組織から形成する癌腫、結腸組織から形成する癌腫、ならびに卵巣組織から形成する癌腫が挙げられる。用語「癌腫」はまた、例えば、癌性組織および肉腫性組織から構成される悪性腫瘍を含む、癌肉腫を包含する。「腺癌」とは、腺組織に由来する癌腫、または認識可能な腺構造をその腫瘍細胞が形成する癌腫をさす。用語「肉腫」は当該分野で認識されており、この用語は、間葉由来物の悪性腫瘍を指す。
【0060】
本発明のMID9002分子は、種々の増殖障害をモニター、処置および/または診断するために使用され得る。そのような障害としては、造血性新形成障害が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「造血性新形成障害」は、造血起源の(例えば、骨髄系列、リンパ系列、もしくは赤血球系列、またはそれらの前駆細胞から生じる)過形成細胞/新形成細胞を含む疾患を包含する。好ましくは、この疾患は、ほとんど分化していない急性白血病(例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病)から生じる。さらなる例示的骨髄性障害としては、急性前骨髄球性白血病(APML)、急性骨髄性白血病(AML)および慢性骨髄性白血病(CML)(Vaickus(1991)Crit Rev.in Oncol./Hemotol.11.267〜97に概説される)が挙げられるが、これらに限定されない;リンパ球性悪性疾患としては、急性リンパ芽球性白血病(ALL)(B系列ALLおよびT系列ALLを包含する)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(PLL)、毛様細胞白血病(HLL)、およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症(WM)が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる悪性リンパ腫形態としては、非ホジキンリンパ腫およびその改変体、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、大型顆粒リンパ球白血病(LGF)、ホジキン病、およびリード−スターンバーグ病が挙げられるが、これらに限定されない。
【0061】
MID9002分子の異常な発現および/または異常な活性は、骨代謝に関係する障害を媒介し得る。「骨代謝」とは、骨構造の形成または変性(例えば、骨形成、骨再吸収など)における、血清中のカルシウム濃度およびリン酸濃度に最終的に影響し得る、直接的効果または間接的効果を指す。この用語はまた、骨細胞(例えば、破骨細胞および骨芽細胞)においてMID9002分子により媒介され、その後骨形成および骨変性を生じ得る、活性を包含する。例えば、MID9002分子は、骨再吸収破骨細胞の種々の活性(例えば、単球および単核食細胞から破骨細胞への分化の刺激)を支持し得る。従って、骨細胞の産生を調節するMID9002分子は、骨形成および骨変性に影響し得、従って骨障害を処置するために使用され得る。このような障害の例としては、骨粗鬆症、骨形成異常、骨軟化症、くる病、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常、骨硬化、鎮痙処置、骨減少症、不完全骨線維形成(fibrogenesis−imperfecta ossium)、続発性副甲状腺機能亢進、副甲状腺機能低下、上皮小体機能亢進、肝硬変、閉塞性黄疸、薬物誘発性代謝、髄様癌、慢性腎疾患、くる病、サルコイドーシス、グルココルチコイド拮抗、吸収不良症候群、脂肪便、熱帯性スプルー、特発性高カルシウム血症、および授乳熱が挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
本発明のMID9002核酸およびタンパク質は、種々の免疫(例えば、炎症(例えば、呼吸器炎症))障害を処置および/または診断するために使用され得る。免疫障害または免疫疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:自己免疫疾患(例えば、真性糖尿病、関節炎(慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む)、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎(アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む)、乾癬、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患(例えば、クローン病および潰瘍性大腸結腸)、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーヴズ病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎および間質性肺線維症が挙げられる)、対宿主移植片病、移植の症例、およびアレルギー(例えば、アトピー)。
【0063】
本明細書中で用いられる場合、心臓に関する障害、すなわち、「心血管疾患」または「心血管障害」は、心血管系(例えば、心臓、血管、および/または血液)に影響を与える、疾患または障害を包含する。心血管障害は、動脈圧力における不均等、心臓の機能不全、または(例えば、血栓による)血管の閉塞によって引き起こされ得る。心血管障害としては、例えば、以下のような障害が挙げられるがこれらに限定されない:動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心肥大、虚血再灌流障害、再狭窄、動脈炎症、血管壁再形成、心室再形成、迅速心室ペーシング、冠状微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧力過剰負荷、大動脈屈曲、冠状動脈結紮、脈管心臓病、弁の疾患(カルシウム沈着によって引き起こされる弁の変性、リウマチ性心疾患、心内膜炎、または人工弁の合併症が挙げられるがこれらに限定されない);心房性細動、長QT症候群(long−QT syndrome)、うっ血性心不全、洞房結節機能不全(sinus node dysfunction)、アンギナ、心不全、高血圧、心房性細動、心房粗動、心膜疾患(心内膜液浸出および心膜炎が挙げられるがこれらに限定されない);心筋症(例えば、拡張型心筋症または特発性心筋症)、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣、虚血性疾患、不整脈、突然の心臓死、および心血管発達障害(例えば、動静脈先天異常、動静脈瘻、レーノー症候群、神経性胸郭出口症候群、カウザルギー/反射性交感神経性ジストロフィー、血管腫、動脈瘤、海綿状様血管腫、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症、房室管、大動脈の縮窄、エブスタイン奇形、左心室発育不全症候群、大動脈弓の中断、僧帽弁逸脱、動脈管、開存性卵円孔、部分肺静脈還流異常(partial anomalous pulmonary venous return)、心室中隔欠損を伴う肺動脈弁閉鎖、心室中隔欠損を伴わない肺動脈弁閉鎖、胎児循環の存続、肺動脈弁狭窄、単心室、総肺静脈還流異常、大血管転位、三尖弁閉鎖、総動脈幹、心室中隔欠損)。心血管疾患または心血管障害はまた、内皮細胞障害を包含し得る。
【0064】
本明細書中で使用される場合、「内皮細胞障害」とは、異常な内皮細胞活性、調節されていない内皮細胞活性、または望ましくない内皮細胞活性(例えば、増殖、移動、新脈管形成、または血管新生)により特徴付けられる障害;あるいは細胞表面接着分子の異常な発現または新脈管形成に関連する遺伝子(例えば、TIE−2、FLTおよびFLK)の異常な発現により特徴付けられる障害を包含する。内皮細胞障害としては、腫瘍形成、腫瘍転移、乾癬、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、グレーヴズ病、虚血性疾患(例えば、アテローム性動脈硬化症)、および慢性炎症疾患(例えば、慢性関節リウマチ)が挙げられる。
【0065】
本明細書中に記載される方法により処置または診断され得る障害としては、肝臓における線維組織の蓄積に関係する障害(例えば、既存の線維の崩壊および変性を伴う細胞外マトリックスの生成と分解との間の不均衡から生じる障害)が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載される方法は、広範な種類の因子(ホメオスタシスを乱すプロセス(例えば、炎症性プロセス)、毒性傷害から生じる組織損傷または肝血流の変化から生じる組織損傷、ならびに感染(例えば、細菌感染、ウイルス感染、および寄生生物感染)を含む)により誘導される肝細胞壊死または肝細胞傷害を診断または処置するために使用され得る。例えば、この方法は、肝傷害(例えば、門脈圧亢進または肝線維症)の早期検出のために使用され得る。さらに、この方法は、先天性代謝異常に起因する肝線維症(例えば、貯蔵障害(例えば、ゴシェ病(脂質異常)、またはグリコーゲン貯蔵病、A1−抗トリプシン欠損)から生じる線維症);外因性物質の蓄積(例えば、貯蔵)を媒介する障害(例えば、ヘモクロマトーシス(鉄過剰負荷症候群)および銅貯蔵病(ウィルソン病))、毒性代謝産物の蓄積を生じる障害(例えば、チロシン血症、果糖血症、およびガラクトース血症)、ならびにペルオキシソーム障害(例えば、ツェルヴェーガー症候群)を検出するために使用され得る。さらに、本明細書中に記載される方法は、種々の化学物質または薬物(例えば、メトトレキサート、イソニアジド(isonizaid)、オキシフェニサチン、メチルドパ、クロロプロマジン、トルブタミドまたはアルコール)の投与と関連する肝傷害、または脈管障害の肝徴候(例えば、肝臓内胆汁流もしくは肝臓外胆汁流のいずれかの閉塞、または例えば、慢性心不全、静脈閉塞疾患、門脈血栓症もしくはバッド−キアーリ症候群から生じる肝臓循環の変化)を示す肝傷害の早期検出および処置のために使用され得る。
【0066】
さらに、MID9002分子は、特定のウイルス疾患(B型肝炎、C型肝炎、および単純ヘルペスウイルス(HSV)が挙げられるが、これらに限定されない)の病因において重要な役割を果たし得る。MID9002活性の調節因子は、ウイルス疾患を制御するために使用され得る。この調節因子は、ウイルス感染組織またはウイルス関連組織の線維症(特に、肝臓および肝臓線維症)の処置および/または診断において使用され得る。また、MID9002調節因子は、ウイルス関連癌腫(特に、肝細胞癌)の処置および/または診断において使用され得る。
【0067】
さらに、MID9002は、代謝の調節または疼痛障害において重要な役割を果たし得る。代謝不均衡の疾患としては、肥満、神経性食欲不振、悪液質、脂質障害、および糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。疼痛障害の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:種々の形態の組織損傷(例えば、炎症、感染および虚血)の間に誘発される疼痛応答(通常、痛覚過敏と称される)(例えば、Fields(1987)Pain,New York:McGraw−Hillに記載される);筋骨格障害に関連する疼痛(例えば、関節痛);歯痛;頭痛;手術に関連する疼痛;過敏性腸症候群に関連する疼痛;または胸部痛。
【0068】
MID9002タンパク質、そのフラグメント、および誘導体、ならびにその配列番号2の配列の他の改変体は、集合的に、「本発明のポリペプチドまたはタンパク質」あるいは「MID9002ポリペプチドまたはMID9002タンパク質」という。このようなポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸分子は、集合的に、「本発明の核酸」または「MID9002核酸」という。
【0069】
本明細書中で使用する場合、用語「核酸分子」は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)、およびRNA分子(例えば、mRNA)、ならびに例えば、ヌクレオチドアナログの使用によって生成される、DNAまたはRNAのアナログを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖DNAである。
【0070】
用語「単離された核酸分子または精製された核酸分子」は、核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子を含む。例えば、ゲノムDNAに関して、用語「単離された」は、そのゲノムDNAが天然で結合している染色体から分離された核酸分子を含む。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムDNAにおいて、その核酸に天然で隣接する配列(すなわち、この核酸の5’末端および/または3’末端に位置する配列)を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムDNAにおいて、天然でその核酸分子に隣接する、約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、または0.1kb未満の5’側および/または3’側のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子(例えば、cDNA分子)は、実質的に、他の細胞物質、または、組換え技術により生成される場合、培養培地を含まなくあり得るか、あるいは、化学合成される場合、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まなくあり得る。
【0071】
本明細書中で使用される場合、用語「低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を実施するための手引きは、Current Protocols in Molecular Biology(1989)John Wiley & Sons,N.Y.,6.3.1−6.3.6(これは、本明細書中で参考として援用される)において見出され得る。水性および非水性の方法は、その参考文献に記載され、そしてそのいずれかが使用され得る。本明細書中で言及される特定のハイブリダイゼーション条件は、以下の通りである:1)約45℃で6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中での低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、その後の少なくとも50℃で0.2×SSC、0.1%SDS中での2回の洗浄(洗浄温度は、低ストリンジェンシーの条件について55℃まで上昇され得る);2)約45℃で6×SSC中での中程度にストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、その後の60℃で0.2×SSC、0.1%SDS中での1回以上の洗浄;3)約45℃で6×SSC中での高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、その後の65℃で0.2×SSC、0.1%SDS中での1回以上の洗浄;そして好ましくは、4)非常に高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、65℃で0.5Mリン酸ナトリウム、7%SDS、その後の65℃で0.2×SSC、1%SDS中での1回以上の洗浄である。非常に高ストリンジェンシー条件(4)が、好ましい条件であり、そして他にそうでないことが示されない限り、使用されるべき条件である。
【0072】
本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子は、天然で生じる(例えば、天然のタンパク質をコードする)ヌクレオチド配列を有するRNA分子またはDNA分子をいう。
【0073】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、MID9002タンパク質、好ましくは、哺乳動物MID9002タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいい、そして非コード調節配列およびイントロンをさらに含み得る。
【0074】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質は、そのタンパク質が由来する細胞または組織供給源由来の細胞物質も他の混入タンパク質も実質的に含まないか、あるいは化学合成された場合に化学前駆体も他の化学物質も実質的に含まない。1つの実施形態において、語「実質的に含まない」は、MID9002タンパク質の調製物が、約30%、20%、10%、およびより好ましくは、5%未満(乾燥重量)の、非MID9002タンパク質(本明細書中で「混入タンパク質」とも呼ばれる)または化学前駆体もしくは非MID9002化学物質を有することを意味する。MID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え生成される場合、それはまた、好ましくは、培養培地を実質的に含まない(すなわち、培養培地は、タンパク質調節物の容量の約20%未満、より好ましくは約10%未満、そして最も好ましくは約5%未満を占める)。本発明は、乾燥重量で、少なくとも0.01、0.1、1.0、および10mgの単離または精製された調製物を含む。
【0075】
「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を喪失することなく、またはより好ましくは、生物学的活性を実質的に変更することなく、MID9002の野生型配列(例えば、配列番号1または配列番号3の配列)から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような変化を生じる。例えば、本発明のポリペプチド間で保存されたアミノ酸残基(例えば、スルファターゼドメインに存在するアミノ酸残基)は、変更に特に影響を受けやすいことが予想される。
【0076】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。従って、MID9002タンパク質中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態において、変異は、例えば、飽和変異誘発によって、MID9002コード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入され得、そして得られる変異体は、活性を保持する変異体を同定するために、MID9002生物学的活性についてスクリーニングされ得る。配列番号1または配列番号3の変異誘発の後、コードされるタンパク質は、組換え発現され得、そしてタンパク質の活性が、決定され得る。
【0077】
本明細書中で使用される場合、MID9002タンパク質の「生物学的に活性な部分」としては、MID9002分子と非MID9002分子との間の相互作用に関与するMID9002タンパク質のフラグメントが挙げられる。MID9002タンパク質の生物学的に活性な部分としては、全長MID9002タンパク質より少ないアミノ酸を含み、かつMID9002タンパク質の少なくとも1つの活性を示す、MID9002タンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号2に示されるアミノ酸配列)に十分に相同であるかまたはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。代表的に、生物学的に活性な部分は、MID9002タンパク質の少なくとも1つの活性(例えば、硫酸エステルの加水分解を触媒する能力、または細胞外マトリクスを分解する能力)を有するドメインまたはモチーフを含む。MID9002タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、10、25、50、100、200またはそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。MID9002タンパク質の生物学的に活性な部分は、MID9002媒介活性(例えば、硫酸エステルの加水分解を触媒する能力、または細胞外マトリクスを分解する能力)を調節する薬剤を開発するための標的として使用され得る。
【0078】
配列間の相同性または配列同一性(これらの用語「相同性」または「同一性」は、本明細書中で交換可能に使用される)の計算は、以下のように実施される。
【0079】
2つのアミノ酸配列、または2つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、これらの配列は、最適な比較目的で整列される(例えば、ギャップは、最適な整列のために、第1および第2のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入され得、そして非相同配列は、比較目的で無視され得る)。好ましい実施形態において、比較目的で整列される参照配列の長さは、参照配列の少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも60%、およびさらにより好ましくは、少なくとも70%、80%、90%、100%の長さである(例えば、589アミノ酸残基を有する第2の配列を配列番号2のMID9002アミノ酸配列と整列する場合、少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも60%、およびさらにより好ましくは少なくとも70%、80%または90%のアミノ酸残基が整列される)。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第1の配列における位置が、第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、これらの分子は、その位置で同一である(本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等しい)。2つの配列間のパーセント同一性は、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数である(ギャップの数、および、2つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のある各ギャップの長さが考慮される)。
【0080】
配列の比較および2つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。好ましい実施形態において、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comから入手可能)においてGPAプログラムに組み込まれたNeedlemanおよびWunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444−453)のアルゴリズムを用い、Blossum 62マトリクスまたはPAM250マトリクスのいずれか、ならびにギャップウェイト16、14、12、10、8、6、または4およびレングスウェイト(length weight)1、2、3、4、5、または6を用いて決定される。さらに別の好ましい実施形態において、2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comから入手可能)のGAPプログラムを用い、NWSgapdna.CMPマトリクスならびにギャップウェイト40、50、60、70、または80およびレングスウェイト1、2、3、4、5、または6を用いて決定される。特に好ましいセットのパラメータ(および分子が、本発明の配列同一性または相同性の限定内にあるか否かを決定するためにどのパラメータが適用されるべきかについて、実施者が判断できない場合に使用されるべきパラメータ)は、Blossum 62スコアリングマトリクス(ギャップペナルティー12、ギャップエクステンドペナルティー4、およびフレームシフトギャップペナルティー5)である。
【0081】
2つのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれたMeyersおよびMiller((1989)CABIOS、4:11−17)のアルゴリズムを用い、PAM120ウェイトレジデューテーブル(weight residue table)、ギャップレングスペナルティー12、およびギャップペナルティー4を用いて決定され得る。
【0082】
本明細書中に記載される核酸配列およびタンパク質配列は、「問い合わせ配列」として使用され、公のデーターベースに対してサーチが実施される(例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために)。このようなサーチは、Altschulら(1990)J.Mol.Biol.215:403−10のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて実施され得る。BLASTヌクレオチドサーチは、NBLASTプログラム、スコア=100、ワードレングス=12を用いて実施されて、本発明のMID9002核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列が獲得され得る。BLASTタンパク質サーチは、XBLASTプログラム、スコア=50、ワードレングス=3を用いて実施されて、本発明のMID9002タンパク質分子に相同なアミノ酸配列が獲得され得る。比較目的でギャップ挿入アラインメント(gapped alignment)を獲得するために、Gapped BLASTが、Altschulら(1997)Nucleic Acids Res.25:3389−3402に記載のように使用され得る。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータが使用され得る。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照のこと。
【0083】
本発明の特定のMID9002ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列の文脈で、用語「実質的に同一」は、i)第2のアミノ酸配列における整列されたアミノ酸残基と同一であるか、またはii)その保存的置換である、十分な数または最小限の数のアミノ酸残基を含む第1のアミノ酸をいうよう本明細書中で使用され、その結果、第1および第2のアミノ酸配列は、共通の構造的ドメインおよび/または共通の機能的活性を有し得る。例えば、配列番号2に対して少なくとも約60%、または65%の同一性、おそらく、75%の同一性、よりおそらくは85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する共通の構造的ドメインを含むアミノ酸配列は、実質的に同一であると言及される。
【0084】
ヌクレオチド配列の文脈において、用語「実質的に同一」は、第2の核酸配列における整列されたヌクレオチドと同一のヌクレオチドの十分な数または最小限の数を含む第1の核酸配列をいうよう本明細書中で使用され、その結果、第1および第2のヌクレオチド配列は、共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするか、または共通の構造的ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードする。例えば、配列番号1または3に対して少なくとも約60%、または65%の同一性、おそらく、75%の同一性、よりおそらくは85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するヌクレオチド配列は、実質的に同一であると言及される。
【0085】
「誤発現または異常な発現」は、本明細書中で使用される場合、RNAまたはタンパク質のレベルでの遺伝子発現の非野生型パターンをいう。これらとしては、以下:非野生型レベルでの発現(すなわち、過剰発現または過少発現);遺伝子が発現される時点または段階の点で野生型と異なる発現パターン(例えば、予め決定された発達期または段階での増加または減少した発現(野生型と比較した場合));予め決定された細胞型または組織型において減少した発現(野生型と比較した場合)の点で野生型と異なる発現パターン;スプライシングサイズ、アミノ酸配列、翻訳後修飾、または発現されたポリペプチドの生物学的活性の点で野生型と異なる発現パターン;遺伝子の発現に対する環境的刺激または細胞外刺激の効果の点で野生型と異なる発現パターン(例えば、刺激の強度における増加または減少の存在下で増加または減少した発現パターン(野生型と比較した場合))、が挙げられる。
【0086】
「被験体」は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物(例えば、ヒト)または実験動物または疾患モデルをいい得る。被験体はまた、非ヒト動物(例えば、ウマ、ウシ、ヤギまたは他の家畜)であり得る。
【0087】
「細胞の精製調製物」は、本明細書中で使用される場合、植物および動物の細胞の場合、細胞のインビトロ調製物をいうのであって、完全にインタクトな植物または動物ではない。培養細胞および微生物細胞の場合、細胞の精製調製物は、被験体細胞の少なくとも10%およびより好ましくは少なくとも50%の調製物からなる。
【0088】
本発明の種々の局面は、以下でさらに詳細に記載される。
【0089】
(単離された核酸分子)
1つの局面において、本発明は、本明細書中に記載されるMID9002ポリペプチド(例えば、全長MID9002タンパク質またはそのフラグメント(例えば、MID9002タンパク質の生物学的に活性な部分))をコードする単離または精製された核酸分子を提供する。ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに適した核酸フラグメント(これらは、例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を同定するために使用され得る)、MID9002 mRNA、およびプライマー(例えば、核酸分子の増幅または変異のためのPCRプライマー)として使用するのに適したフラグメントもまた含まれる。
【0090】
1つの実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号1に示されるヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の任意の一部を含む。1つの実施形態において、この核酸分子は、ヒトMID9002タンパク質をコードする配列(すなわち、配列番号3に示されるような、配列番号1の「コード領域」)、ならびに5’非翻訳配列(配列番号1のヌクレオチド1〜67)および3’非翻訳配列(配列番号1のヌクレオチド1835〜1858)を含む。あるいは、この核酸分子は、配列番号1のコード領域(例えば、配列番号3)のみを含み得、そして例えば、通常対象配列に付随する隣接配列を含まない。別の実施形態において、核酸分子は、配列番号2のアミノ酸約38〜520のタンパク質フラグメントまたは配列番号2のアミノ酸約32〜589の成熟タンパク質に対応する配列をコードする。
【0091】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号1もしくは配列番号3に示されるヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列の任意の一部分に相補的な核酸分子を含む。他の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号1または配列番号3に示されるヌクレオチド配列に十分相補的であり、その結果、配列番号1または3に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得、それによって、安定な二重鎖を形成する。
【0092】
1つの実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号1または3に示されるヌクレオチド配列の全長に対して、少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上相同なヌクレオチド配列、またはその一部(好ましくは、これらのヌクレオチド配列のいずれかの同一の長さのもの)を含む。
【0093】
(MID9002核酸フラグメント)
本発明の核酸分子は、配列番号1または3の核酸配列の一部のみを含み得る。例えば、このような核酸分子は、プローブもしくはプライマーとして使用され得るフラグメントまたはMID9002タンパク質の一部をコードするフラグメント(例えば、MID9002タンパク質の免疫原性部分または生物学的に活性な部分)を含み得る。フラグメントは、ヒトMID9002のスルファターゼドメインをコードする配列番号1のヌクレオチドを含み得る。MID9002遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列により、他のMID9002ファミリーメンバーまたはそのフラグメント、ならびに他の種由来のMID9002ホモログまたはそのフラグメントを同定および/またはクローニングするのに使用するために設計されたプローブおよびプライマーが作製され得る。
【0094】
別の実施形態において、核酸は、コード領域の一部または全てを含み、そして5’または3’のいずれか(または両方)の非コード領域に延びるヌクレオチド配列を含む。他の実施形態は、本明細書中に記載されるアミノ酸フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むフラグメントを含む。核酸フラグメントは、本明細書中に記載される特定のドメインもしくは部位またはそのフラグメント(特に、少なくとも100アミノ酸長のそのフラグメント)をコードし得る。フラグメントはまた、上記の特定のアミノ酸配列に対応する核酸配列またはそのフラグメントを含む。核酸フラグメントは、本発明以前に開示された可能性のあるフラグメントを包含するとみなされるべきでない。
【0095】
核酸フラグメントは、本明細書中に記載されるドメイン、領域、または機能的部位に対応する配列を含み得る。核酸フラグメントはまた、本明細書中に記載される1つ以上のドメイン、領域、または機能的部位を含み得る。従って、例えば、MID9002核酸フラグメントは、本明細書中に記載のスルファターゼドメインに対応する配列を含み得る。
【0096】
MID9002プローブおよびプライマーが提供される。代表的に、プローブ/プライマーは、単離または精製されたオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、代表的に、ストリンジェントな条件下で、配列番号1もしくは配列番号3のセンス配列もしくはアンチセンス配列、または配列番号1もしくは配列番号3の天然に存在する対立遺伝子改変体もしくは変異体の、少なくとも約7、12、または15、好ましくは約20または25、より好ましくは約30、35、40、45、50、55、60、65、または75連続するヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【0097】
好ましい実施形態において、この核酸は、少なくとも5または10、および200未満、より好ましくは、100未満、または50未満の塩基対長である、プローブである。本明細書中に開示された配列と、同一であるか、または1、または5もしくは10塩基対未満で異なるべきである。アライメントが、この比較のために必要とされる場合、この配列は、最大の相同性でアライメントされるべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチ由来の「ループ(looped)」アウト配列は、異なるとみなされる。
【0098】
プローブまたはプライマーは、以下をコードする核酸のセンス鎖またはアンチセンス鎖から誘導され得る:例えば、配列番号2のアミノ酸の約38〜約520のスルファターゼドメイン;配列番号2のアミノ酸の約37〜約589のスルファターゼドメイン;配列番号2のアミノ酸の約32〜約589の成熟タンパク質;配列番号2のアミノ酸の約1〜227のN末端管腔ドメイン(luminal domain);配列番号2のアミノ酸の約227〜249の膜貫通ドメイン;配列番号2のアミノ酸の約249〜291のループドメイン;配列番号2のアミノ酸の約291〜307の膜貫通ドメイン;および配列番号2のアミノ酸の約307〜589のC末端管腔ドメイン。
【0099】
別の実施形態において、一連のプライマー(MID9002配列の選択された領域(例えば、本明細書中に記載される、ドメイン、領域、部位または他の配列)を増幅するために使用され得る、PCRにおいて使用するために適切なプライマー)が、提供される。このプライマーは、少なくとも、5、10、または50の塩基対長、100未満、または200未満の塩基対長であるべきである。このプライマーは、本明細書中に開示される配列もしくは天然に存在する改変体と同一であるか、または本明細書中に開示される配列もしくは天然に存在する改変体と一つの塩基異なるべきである。例えば、以下の領域:配列番号2のアミノ酸の約38〜520のスルファターゼドメイン;配列番号2のアミノ酸の約37〜約589のスルファターゼドメイン;配列番号2のアミノ酸の約32〜約589の成熟タンパク質;配列番号2のアミノ酸の約1〜227のN末端管腔ドメイン;配列番号2のアミノ酸の約227〜249の膜貫通ドメイン;配列番号2のアミノ酸の約249〜291のループドメイン;配列番号2のアミノ酸の約291〜307の膜貫通ドメイン;および配列番号2のアミノ酸の約307〜589のC末端管腔ドメインのいずれかの全てまたはいずれか一部を増幅するのに適したプライマーが、提供される。
【0100】
核酸フラグメントは、本明細書中に記載されるポリペプチドのエピトープ保持領域をコードし得る。
【0101】
「MID9002ポリペプチドの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列の一部を単離すること(このヌクレオチド配列は、MID9002生物学的活性を有するポリペプチドをコードする(例えば、MID9002タンパク質の生物学的活性が、本明細書中に記載されている))、MID9002タンパク質のコード部分を(例えば、インビトロにおける組換え発現によって)発現すること、およびMID9002タンパク質のコード部分の活性を評価することによって調製され得る。例えば、MID9002の生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、スルファターゼドメイン(例えば、配列番号2のアミノ酸残基の約38〜520)を含む。MID9002ポリペプチドの生物学的に活性な活性部分をコードする核酸フラグメントは、300以上のヌクレオチド長を超えるヌクレオチド配列を含み得る。
【0102】
好ましい実施形態において、核酸は、約300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800以上のヌクレオチド長である、ヌクレオチド配列を含み、そして配列番号1または配列番号3の核酸分子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【0103】
(MID9002核酸改変体)
本発明は、さらに、配列番号1または配列番号3に示されるヌクレオチド配列と異なる核酸分子を含む。このような差異は、遺伝コードの縮重に起因し得、そして本明細書中に開示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同一のMID9002タンパク質をコードする核酸を生じる。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号2に示されるアミノ酸配列と、少なくとも1個だが、5、10、20、50、または100個のアミノ酸残基未満で異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。アライメントが、この比較に必要とされる場合、この配列は、最大の相同性でアライメントされるべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチ由来の「ループ」アウト配列は、異なるとみなされる。
【0104】
本発明者らの核酸は、特定の発現系に対して、好ましい、または好ましくない、コドンを有するように選択され得る。例えば、核酸は、その配列がE.coli、酵母、ヒト、昆虫、またはCHO細胞中での発現に対して最適化されるように、少なくとも一つのコドン、好ましくはコドンの少なくとも10%または20%が変更された核酸であり得る。
【0105】
核酸改変体は、天然に存在し得、例えば、対立遺伝子改変体(同一の遺伝子座)、ホモログ(異なる遺伝子座)、およびオルソログ(異なる生物)であり得るか、または天然に存在し得ない。天然に存在しない改変体は、ポリヌクレオチド、細胞、または生物に適用される技術を含む、変異誘発技術により作製され得る。この改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失、転化および挿入を含み得る。改変は、コード領域および非コード領域のいずれかまたは両方に存在し得る。この改変は、保存的アミノ酸置換基および非保存的アミノ酸置換基(コードされた産物と比較した場合)の両方を生じ得る。
【0106】
好ましい実施形態において、核酸は、例えば、以下のように、配列番号1または配列番号3の核酸と異なる:少なくとも1個のヌクレオチドだが、10、20、30、または40個未満のヌクレオチド;少なくとも1個のヌクレオチドだが、目的の核酸の1%、5%、10%または20%未満のヌクレオチド。この分析に必要である場合、この配列は、最大相同性でアライメントされるべきである。欠失、もしくは挿入、またはミスマッチ由来の「ループ」アウト配列は、異なるとみなされる。
【0107】
オルソログ、ホモログ、および対立遺伝子改変体は、当該分野で公知の方法を使用して同定され得る。これらの改変体は、配列番号2に示されるヌクレオチド配列またはその配列のフラグメントに対して、50%、少なくとも約55%、代表的に、少なくとも約70〜75%、より代表的に、少なくとも約80〜85%、そして最も代表的に、少なくとも約90〜95%以上、同一である、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。このような核酸分子は、配列番号2に示されるヌクレオチド配列またはその配列のフラグメントに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るとして、容易に同定され得る。本発明のMID9002 cDNAのオルソログ、ホモログ、および対立遺伝子改変体に対応する核酸分子は、MID9002遺伝子と同一の染色体または遺伝子座にマッピングすることによって、さらに単離され得る。
【0108】
好ましい改変体は、以下のスルファターゼ活性のうちの1つ以上と相関する改変体を含む:(1)硫酸エステル(例えば、アリール硫酸エステル)の加水分解を触媒する能力;(2)細胞外マトリクスを分解する能力;(3)硫酸エステルを含む化合物を結合する能力;(4)骨および/または軟骨の代謝/形成/破壊に影響を及ぼす能力;ならびに(5)癌増殖(例えば、侵襲、転移)に影響を及ぼす能力。
【0109】
MID9002の対立遺伝子改変体(例えば、ヒトMID9002)は、機能的タンパク質および非機能的タンパク質の両方を含む。機能的対立遺伝子改変体は、以下を維持する集団内のMID9002タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体である:(1)硫酸エステル(例えば、アリール硫酸エステル)の加水分解を触媒する能力;(2)細胞外マトリクスを分解する能力;(3)硫酸エステルを含む化合物を結合する能力;(4)骨および/または軟骨の代謝/形成/破壊に影響を及ぼす能力;ならびに/あるいは(5)癌増殖(例えば、侵襲、転移)に影響を及ぼす能力。機能的対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号2の1個以上のアミノ酸の保存的置換基のみ、またはタンパク質の重要ではない領域にある、重要ではない残基の置換、欠失もしくは挿入を含む。非機能的な対立遺伝子改変体は、以下を有さない集団内のMID9002(例えば、ヒトMID9002)タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体である:(1)硫酸エステル(例えば、アリール硫酸エステル)の加水分解を触媒する能力;(2)細胞外マトリクスを分解する能力;(3)硫酸エステルを含む化合物を結合する能力;(4)骨および/または軟骨の代謝/形成/破壊に影響を及ぼす能力;ならびに/あるいは(5)癌増殖(例えば、侵襲、転移)に影響を及ぼす能力。非機能的な対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号2のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失、もしくは挿入、または早熟短縮、あるいはタンパク質の重要な残基または重要な領域の置換、挿入、または欠失を含む。
【0110】
さらに、他のMID9002ファミリーメンバーをコードする核酸分子(従って、配列番号1または配列番号3のMID9002配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子)は、本発明の範囲内であることが意図される。
【0111】
(アンチセンス核酸分子、リボザイムおよび改変されたMID9002核酸分子)
別の局面において、本発明は、MID9002に対してアンチセンスである単離された核酸分子を特徴とする。「アンチセンス」核酸は、例えば、二重鎖cDNA分子のコード鎖に対して相補的であるか、またはmRNA配列に対して相補的である、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的である、ヌクレオチド配列を含み得る。このアンチセンス核酸は、全MID9002コード鎖、またはその一部のみ(例えば、配列番号3に対応する、ヒトMID9002のコード領域)に対して相補的であり得る。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子は、MID9002をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」(例えば、5’非翻訳領域および3’非翻訳領域)に対してアンチセンスである。
【0112】
MID9002mRNAの全コード領域に対して相補的であるように、アンチセンス核酸が、設計され得るが、より好ましくは、MID9002 mRNAのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、MID9002 mRNAの翻訳開始部位を取り囲む領域(例えば、目的の標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10領域と+10領域との間)に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80以上のヌクレオチド長であり得る。
【0113】
本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を使用する化学合成および酵素学的ライゲーション反応を使用して、構築され得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成された二重鎖の物理学的安定性を増加させるように設計された多様に改変されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成され得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが、使用され得る)。アンチセンス核酸がまた、核酸がアンチセンス配向でサブクローニングされた発現ベクターを生物学的に使用して産生され得る(すなわち、挿入された核酸から転写されたRNAは、以下の節でさらに記載されている、目的の標的核酸に対するアンチセンス配向である)。
【0114】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的に、(例えば、組織部位の直接的な注入によって)被験体に投与されるか、またはこれらのアンチセンス核酸分子が、MID9002タンパク質をコードする細胞性mRNAおよび/またはゲノムDNAとハイブリダイズするか、または結合することによって、例えば、転写および/または翻訳を阻害することによって、タンパク質の発現を阻害するように、インサイチュで産生される。あるいは、アンチセンス核酸分子を改変して、選択された細胞を標的し、次いで、全身に投与され得る。全身投与に関して、例えば、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に、アンチセンス核酸分子を連結することによって、このアンチセンス分子が、選択された細胞表面上で発現されたレセプターまたは抗原に特異的または選択的に結合するように改変され得る。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中で記載されるベクターを使用して、細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が、強力なpol IIプロモーターまたはpol IIIプロモーターの制御下で置換されるベクター構築物が、好ましい。
【0115】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的RNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。ここでは、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は互いに対して平行に走る(Gaultierら(1987)Nucleic Acids Res.15:6625−6641)。アンチセンス核酸分子はまた、2’−o−メチルリボヌクレオチド(Inoueら(1987)Nucleic Acids Res.15:6131−6148)またはキメラRNA−DNAアナログ(Inoueら(1987)FEBS Lett.215:327−330)を含み得る。
【0116】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。MID9002コード核酸に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるMID9002 cDNAのヌクレオチド配列(すなわち、配列番号1または配列番号3)に対して相補的な1以上の配列、ならびにmRNAの切断を担う公知の触媒配列を有する配列(米国特許第5,093,246号またはHaselhoffおよびGerlach(1988)Nature 334:585−591を参照のこと)を含み得る。例えば、Tetrahymena L−19 IVS RNAの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列がMID9002コードmRNAにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的であるように構築され得る。例えば、Cechら、米国特許第4,987,071号;およびCechら、米国特許第5,116,742号を参照のこと。あるいは、MID9002 mRNAを使用して、RNA分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNAを選択し得る。例えば、BartelおよびSzostak(1993)Science 261:1411−1418を参照のこと。
【0117】
MID9002遺伝子の発現は、標的細胞中でMID9002遺伝子の転写を阻害する三重ヘリックス構造を形成するために、MID9002の調節領域に相補的なヌクレオチド配列(例えば、MID9002プロモーターまたはエンハンサー)を標的することによって阻害され得る。一般に、Helene(1991)Anticancer Drug Des.6:569−84;Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27−36;およびMaher(1992)Bioassays 14:807−15を参照のこと。三重ヘリックスの形成のために標的され得る潜在的な配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増加され得る。スイッチバック分子は、5’−3’変更方法、3’−5’変更方法で合成され、これらは、二重鎖の一方の鎖と、次いで他方の鎖との対に基づき、プリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸張が、二重鎖の一方の鎖上に存在することの必要性を排除する。
【0118】
本発明はまた、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ分子を提供する。代表的に、このような標識は、化学発光、蛍光、放射活性、または比色分析である。
【0119】
MID9002核酸分子を、塩基部分、糖部分またはホスフェート骨格において改変し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善し得る。例えば、核酸分子のデオキシリボースホスフェート骨格は、ペプチド核酸を生成するために改変され得る(Hyrupら(1996)Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5−23を参照のこと)。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「PNA」は、デオキシリボースホスフェート骨格が偽ペプチド骨格により置換され、そして4つの天然の核酸塩基(nucleobase)のみが保持されている核酸模倣物(例えば、DNA模倣物)をいう。PNAの中性の骨格は、低イオン強度の条件下で、DNAおよびRNAに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にし得る。PNAオリゴマーの合成は、Hyrupら(1996)前出;Perry−O’Keefeら、(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:14670−675に記載のような、標準的固相ペプチド合成プロトコルを使用して実施され得る。
【0120】
MID9002核酸分子のPNAは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、PNAは、遺伝子発現の配列特異的調節(例えば、転写または翻訳の停止を誘導すること、または複製を阻害することによる)のためのアンチセンス剤またはアンチジーン(antigene)剤として使用され得る。MID9002核酸分子のPNAはまた、例えば、PNA指向PCRクランピング(PNA−directed PCR clamping)による遺伝子内の一塩基対変異の分析において、他の酵素(例えば、S1ヌクレアーゼ)と組み合わせて使用される場合の「人工制限酵素」として(Hyrupら(1996)、前出);またはDNA配列決定またはハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrupら(1996)、前出;Perry−O’Keefe前出)使用され得る。
【0121】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基(例えば、インビボにおける宿主細胞レセプターを標的するため)、または細胞膜(例えば、Letsingerら、(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6553−6556;Lemaitreら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:648−652;PCT公開番号WO88/09810を参照のこと)もしくは血液脳関門(例えば、PCT公開番号WO89/10134を参照のこと)を通過する輸送を容易にする試薬を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションにより誘発される切断試薬(例えば、Krolら(1988)Bio−Techniques 6:958−976を参照のこと)、挿入剤(例えば、Zon(1988)Pharm.Res.5:539−549を参照のこと)を用いて改変され得る。この目的のために、このオリゴヌクレオチドは、別の分子(例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘発切断剤)に結合体化され得る。
【0122】
本発明はまた、本発明のMID9002核酸に対して相補的である少なくとも一つの領域を有する、分子ビーコンオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ分子を含み、2つの相補的な領域は、一つの蛍光団および一つのクエンチャーを有し、この分子ビーコンは、サンプル中で本発明のMID9002核酸の存在をクエンチするために有用である。分子ビーコン核酸は、例えば、Lizardiら、米国特許第5,854,033号;Nazarenkoら、米国特許第5,866,336号、およびLivakら,米国特許第5,876,930号に記載されている。
【0123】
(単離されたMID9002ポリペプチド)
別の局面において、本発明は、抗−MID9002抗体を惹起するか、または試験する(またはより一般的には、この抗体に結合する)免疫原または抗原として使用するための、単離されたMID9002タンパク質、またはフラグメント(例えば、生物学的に活性な部分)を特徴とする。MID9002タンパク質はまた、標準的なタンパク質精製技術を使用して、細胞供給源または組織供給源から単離され得る。MID9002タンパク質またはそのフラグメントを、組換えDNA技術によって産生または化学的に合成し得る。
【0124】
本発明のポリペプチドは、複数の遺伝子の存在の結果、代替の翻訳事象、代替のRNAスプライシング事象、ならびに代替の翻訳事象および翻訳後事象を惹起するポリペプチドを含む。ポリペプチドは、ポリペプチドがネイティブ細胞中で発現される場合に存在する翻訳後改変と実質的に同一の翻訳後改変を生じる系(例えば、培養細胞)か、またはネイティブ細胞中に存在する翻訳後改変(例えば、グリコシル化または切断)の代替または欠損を生じる系において発現され得る。
【0125】
好ましい実施形態において、MID9002ポリペプチドは、以下の特徴の一つ以上を有する:
硫酸エステル(例えば、アリール硫酸エステル)の加水分解を触媒する能力を有すること;
細胞外マトリックスまたはその成分を分解する能力を有すること;
硫酸エステルを含む化学化合物に結合する能力を有すること;
骨および/または軟骨の代謝/形成/分解に影響する能力を有すること:ならびに
癌の進行(例えば、侵襲性、転移性)に影響する能力を有すること;
好ましくは、MID9002ポリペプチド(例えば、配列番号2のポリペプチド)の、翻訳後修飾、アミノ酸組成または他の物理学的特性の任意の寄与を無視する分子重量(例えば、推定分子量)を有すること;
配列番号2のポリペプチドと、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、90%、または95%の全体的な配列類似性を有すること;
少なくとも以下のヒト組織および細胞株において発現されること:高レベルで腎臓、膵臓、結腸、肝臓、および中程度のレベルで脊髄神経節;
配列番号2のアミノ酸残基約38〜520および37〜589に対して好ましくは約70%、80%、90%または95%同一であるスルファターゼドメインを有すること;
配列番号2のアミノ酸残基約227〜249または291〜307に対して好ましくは約70%、80%、90%または95%同一である膜貫通ドメインを有すること;ならびに
ネイティブタンパク質のアミノ酸配列において見出されるシステインのうち、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、好ましくは少なくとも16個、そして最も好ましくは少なくとも17個を有すること。
【0126】
好ましい実施形態において、MID9002タンパク質、またはそのフラグメントは、配列番号2の対応する配列と異なる。一つの実施形態において、少なくとも1個であるが、15個未満、10個未満または5個未満のアミノ酸残基だけ異なる。別の実施形態において、少なくとも1個の残基が配列番号2の対応する配列と異なるが、20%未満、15%未満、10%未満、または5%未満の残基だけ、配列番号2の対応する配列と異なる。(この比較が、アライメントを必要とする場合、この配列は、最大相同性についてアライメントされるべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチ由来の「ループ」アウト配列が、差異とみなされる)。この差異は、好ましくは、非必須残基または保存的置換基における差異または変化である。好ましい実施形態において、この差異は、配列番号2の残基約38〜520におけるスルファターゼドメインにはない。別の実施形態において、1以上の差異は、配列番号2の残基約38〜520におけるスルファターゼドメインにはない。
【0127】
他の実施形態は、アミノ酸配列の一つ以上の変化(例えば、活性に関して本質的ではないアミノ酸残基の変化)を含有するタンパク質を含む。このようなMID9002タンパク質は、配列番号2由来のアミノ酸配列において異なるが、なお生物学的活性を保持する。
【0128】
一つの実施形態において、このタンパク質は、配列番号2に対して、少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%以上相同なアミノ酸配列を含む。
【0129】
タンパク質またはフラグメントにおいて、少なくとも1個であるが、15個未満、10個未満または5個未満のアミノ酸残基だけの約1〜38および/または520〜589にによって規定される領域において、配列番号2の配列と異なるが、約38〜520によって規定される領域において、配列番号2と異ならない、MID9002タンパク質またはフラグメントが、提供される。(この比較が、アライメントを必要とする場合、この配列は、最大相同性についてアライメントされるべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチ由来の「ループ」アウト配列が、差異とみなされる)。いくつかの実施形態において、この差異は、非必須残基にあるか、または保存的置換である一方で、他の実施形態においては、この差異は、必須残基にあるか、または非保存的置換である。
【0130】
一つの実施形態において、MID9002タンパク質の生物学的に活性な部分は、スルファターゼドメインを含む。さらに、他の生物学的に活性な部分(ここで、タンパク質の他の領域は、欠失される)は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブMID9002タンパク質の機能的な活性の1以上について評価され得る。
【0131】
好ましい実施形態において、MID9002タンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、MID9002タンパク質は、配列番号2と実質的に同一である。なお別の実施形態において、MID9002タンパク質は、上記の節で詳細に記載したように、配列番号2と十分にまたは実質的に同一であり、そして配列番号2のタンパク質の機能的な活性を保持する。
【0132】
(MID9002キメラタンパク質または融合タンパク質)
別の局面において、本発明は、MID9002キメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、MID9002「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非MID9002ポリペプチドに連結したMID9002ポリペプチドを含む。「非MID9002ポリペプチド」は、MID9002タンパク質と実質的に相同性でないタンパク質(例えば、MID9002タンパク質と異なるタンパク質)および同一の生物または異なる生物由来のタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。融合タンパク質のMID9002ポリペプチドは、全てまたは一部(例えば、本明細書中に記載のMID9002アミノ酸配列のフラグメント)に対応し得る。好ましい実施形態において、MID9002融合タンパク質は、MID9002タンパク質の少なくとも1個(または2個)の生物学的に活性な部分を含む。非MID9002ポリペプチドは、MID9002ポリペプチドのN末端またはC末端に融合され得る。
【0133】
この融合タンパク質は、リガンドに対して高度の親和性を有する部分を含み得る。例えば、この融合タンパク質は、MID9002配列がGST配列のC末端に対して融合される、GST−MID9002融合タンパク質であり得る。このような融合タンパク質は、組換えMID9002の精製を容易にし得る。あるいは、この融合タンパク質は、そのN末端において、異種シグナル配列を含むMID9002タンパク質であり得る。特定の宿主細胞(例えば、哺乳動物の宿主細胞)において、MID9002の発現および/または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増強され得る。
【0134】
融合タンパク質は、血清タンパク質(例えば、免疫グロブリン(例えば、IgG、IgAまたはIgE)の一部、例えば、免疫グロブリンまたはヒト血清アルブミンのFc領域ならびに/もしくはヒンジC1配列およびヒンジC2配列)の全てまたは一部を含み得る。
【0135】
本発明のMID9002融合タンパク質は、薬学的組成物に取り込まれ得、そしてインビボで被験体に投与され得る。MID9002融合タンパク質は、MID9002基質のバイオアベイラビリティーに影響を与えるために使用され得る。MID9002融合タンパク質は、例えば、以下の(i)、(ii)および(iii)によって生じる障害の処置のために治療学的に有用であり得る:(i)MID9002タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または変異;(ii)MID9002遺伝子の誤調節;および(iii)MID9002タンパク質の異常な翻訳後改変。
【0136】
さらに、本発明のMID9002融合タンパク質は、被験体において抗MID9002抗体を産生して、MID9002リガンドを精製するための免疫原として使用され得、およびMID9002とMID9002基質との相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。
【0137】
融合部分(例えば、GSTポリペプチド)をすでにコードする発現ベクターが、市販されている。AMID9002をコードする核酸は、このような発現ベクター中にクローニングされ得、その結果、融合部分がMID9002タンパク質にインフレームで連結される。
【0138】
(MID9002タンパク質の改変体)
別の局面において、本発明はまた、MID9002ポリペプチドの改変体(例えば、アゴニスト(模倣物)またはアンタゴニストとして機能する)を特徴とする。MID9002タンパク質の改変体は、変異誘発(例えば、不連続な点変異)、配列の挿入もしくは欠失、またはMID9002タンパク質の短縮(truncation)によって作製され得る。MID9002タンパク質のアゴニストは、MID9002タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性と実質的に同一の活性またはサブセットを残存し得る。MID9002タンパク質のアンタゴニストは、例えば、MID9002タンパク質のMID9002媒介活性を競合的に調節することによって、MID9002タンパク質の天然に存在する形態の活性の1つ以上を阻害し得る。よって、特定の生物学的効果は、種々の限定された機能を用いる処置によって誘導され得る。好ましくは、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体を用いる被験体の処置は、MID9002タンパク質の天然に存在する形態での処置と比較して被験体におけるわずかな副作用を有する。
【0139】
MID9002タンパク質の改変体は、MID9002タンパク質の変異体(例えば、短縮型変異体)のコンビナトリアルライブラリーをアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって同定され得る。
【0140】
MID9002タンパク質をコードする配列のフラグメント(例えば、N末端フラグメント、C末端フラグメントまたは内部フラグメント)のライブラリーを使用して、MID9002タンパク質の改変体のスクリーニング、続く選択のための多彩なフラグメント集団を作製し得る。
【0141】
システイン残基が付加または欠失されている改変体、あるいはグリコシル化されている残基が付加または欠失されている改変体が、特に好ましい。
【0142】
点変異または短縮によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする方法、および選択された特性を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングするための方法が、当該分野において公知である。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を高める新たな技術である機能的集合変異誘発(recursive ensemble mutagenesis)(REM)をスクリーニングアッセイと組合わせて使用して、MID9002改変体を同定し得る(ArkinおよびYourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7811−7815;Delgraveら(1993)Protein Engineering 6:327−331)。
【0143】
多彩なMID9002ライブラリーを分析するために、細胞ベースのアッセイが利用され得る。例えば、発現ベクターのライブラリーが、細胞株(例えば、通常、基質依存的様式でMID9002に応答する細胞株)にトランスフェクトされ得る。次いで、トランスフェクトされた細胞は、MID9002と接触させられ、そしてMID9002基質によるシグナル伝達に対する変異体発現の効果が、(例えば、内因的にまたは外因的に与えられえる硫酸エステルの加水分解を測定することによって)検出され得る。次いで、プラスミドDNAは、MID9002基質によるシグナル伝達の阻害または増強を記録する細胞から回収され得、そして個々のクローンがさらに特徴付けられ得る。
【0144】
別の局面において、本発明は、MID9002ポリペプチド(例えば、非野生型活性を有するペプチド、例えば、天然に存在するMID9002ポリペプチドのアンタゴニスト、アゴニストもしくはスーパーアゴニスト、例えば、天然に存在するMID9002ポリペプチド)を作製する方法を特徴とする。本方法は、以下の工程を包含する:MID9002ポリペプチドの配列を変更する工程(例えば、本明細書中に開示される非保存領域、ドメインまたは残基の1つ以上の残基の置換または欠失によって配列を変更する工程);および所望の活性について変更されたポリペプチドを試験する工程。
【0145】
別の局面において、本発明は、天然に存在するMID9002ポリペプチドの生物学的活性を有するMID9002ポリペプチドのフラグメントまたはアナログを作製する方法を特徴とする。本方法は、以下の工程を包含する:例えば、1つ以上の残基の置換または欠失によってMID9002ポリペプチドの配列を変更する工程(例えば、本明細書中に記載される非保存領域またはドメインもしくは残基を変更する工程);および、所望の活性について変更されたポリペプチドを試験する工程。
【0146】
(抗MID9002抗体)
別の局面において、本発明は、抗MID9002抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子またはその免疫学的に活性な部分(すなわち、抗原結合部分)をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、scFVフラグメントおよびdcFVフラグメント、FabフラグメントおよびF(ab’)2フラグメントが挙げられ、これらは、抗体を酵素(それぞれ、例えば、パパインまたはペプシン)で処理することにより生成され得る。
【0147】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体(例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体)、完全ヒト抗体、非ヒト抗体(例えば、マウス抗体)または、短鎖抗体であり得る。好ましい実施形態において、抗体はエフェクター機能を有し、そして補体を固定し得る。抗体は、毒素または画像化剤と結合され得る。
【0148】
全長MID9002タンパク質、またはMID9002の抗原性ペプチドフラグメントは、免疫原として使用され得るか、または他の免疫原(例えば、細胞、膜調製物など)を用いて作製された抗MID9002抗体を同定するために使用され得る。MID9002の抗原性ペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列のうち少なくとも8個のアミノ酸残基を有するべきであり、そしてMID9002のエピトープを含む。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも10個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも15個のアミノ酸残基、なおより好ましくは少なくとも20個のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも30個のアミノ酸残基を含む。
【0149】
配列番号2の残基約50〜70、約145〜193、約250〜265、約275〜285、約315〜325、約345〜385、約435〜450、約455〜470、約505〜515または約525〜545を含むMID9002のフラグメントは、MID9002の親水性領域(図2を参照のこと)に対する抗体を作製するために使用され得る(例えば、抗原として使用されるか抗体の特異性を特徴付けるために使用される)。同様に、配列番号2の残基約1〜22、約32〜45、約185〜248、約265〜275、約282〜300、約428〜438、または約566〜575を含むMID9002のフラグメントは、MID9002の疎水性領域に対する抗体を作製するために使用され得る;配列番号2の残基約1〜227、約249〜291、約307〜589またはそのサブセット(例えば、配列番号2の残基約1〜31、残基約32〜227、残基約32〜100、残基約100〜227、残基約307〜400、残基約400〜589)を含むMID9002のフラグメントは、MID9002タンパク質の管腔領域または管腔外領域に対する抗体を作製するために使用され得る;配列番号2の残基約38〜520、または約37〜589を含むMID9002のフラグメントは、MID9002のスルファターゼ領域に対する抗体を作製するために使用され得る。
【0150】
これらの領域または本明細書中に記載される他の領域もしくはドメインと反応性、または特異的もしくは選択的な抗体が提供される。
【0151】
抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面上に位置するMID9002の領域(例えば、親水性領域)、および高い抗原性を有する領域である。例えば、ヒトMID9002タンパク質配列のEmini表面確率解析を使用して、MID9002タンパク質の表面に局在化される確率の特に高い領域、従って、抗体産生を標的化するのに有用な表面残基を構築する可能性のある領域を示し得る。
【0152】
好ましい実施形態において、抗体は、MID9002タンパク質の管腔部分に結合し得る。別の実施形態において、抗体は、MID9002タンパク質の管腔外領域に結合する。
【0153】
好ましい実施形態において、抗体は、本明細書中に記載されるMID9002タンパク質上の任意のドメインまたは領域上のエピトープに結合する。
【0154】
さらに、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒトの抗体もまた、本発明の範囲内である。キメラ抗体、ヒト抗体、最も好ましくは完全ヒト抗体は、繰り返し投与を含む適用(例えば、ヒト患者の治療的処置、およびいくつかの診断的適用)に好ましい。
【0155】
キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体(ヒト部分および非ヒト部分の両方を含む)は、標準的な組換えDNA技術を使用して作製され得る。このようなキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、以下に記載される方法を使用して、当該分野で公知の組換えDNA技術により産生され得る(Robinsonら、国際特許出願PCT/US86/02269;Akiraら、欧州特許出願184,187;Taniguchi,欧州特許出願171,496;Morrisonら、欧州特許出願173,494;Neubergerら、PCT国際公開WO86/01533;Cabillyら、米国特許第4,816,567号;Cabillyら、欧州特許出願125,023;Betterら(1988)Science 240:1041−1043);Liuら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439−3443;Liuら、(1987)J.Immunol.139:3521−3526;Sunら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214−218;Nishimuraら (1987),Canc.Res.47:999−1005;Woodら(1985)Nature 314:446−449;ならびにShawら(1988),J.Natl.Cancer Inst.80:1553−1559を参照のこと)。
【0156】
ヒト化抗体または相補性決定領域(CDR)グラフト化抗体は、ドナーCDRと置換された少なくとも1つまたは2つ(しかし、一般に3つ全て)のレシピエント(重鎖免疫グロブリン鎖および/または軽鎖免疫グロブリン鎖の)CDRを有する。抗体は、非ヒトCDRの少なくとも一部と置換され得るか、またはCDRの一部のみが、非ヒトCDRで置換され得る。MID9002またはそのフラグメントに対するヒト化抗体の結合に必要とされるCDRの数を置換することだけが必要である。好ましくは、ドナーは、げっ歯類抗体(例えば、ラット抗体またはマウス抗体)であり、そしてレシピエントは、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークである。代表的に、CDRを提供する免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、そしてフレームワークを提供する免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。1つの実施形態において、ドナー免疫グロブリンは、非ヒト(例えば、げっ歯類)である。アクセプターフレームワークは、天然に存在する(例えば、ヒト)フレームワークまたはコンセンサスフレームワーク、あるいはこれらに約85%以上、好ましくは、90%、95%、99%以上同一である配列である。
【0157】
本明細書中で使用される場合、用語「コンセンサス配列」は、あるファミリーの関連する配列において最も頻繁に生じるアミノ酸(またはヌクレオチド)から形成される配列をいう(例えば、Winnaker,(1987)From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germanyを参照のこと)。あるファミリーのタンパク質において、コンセンサス配列中の各位置が、そのファミリー中のその位置で最も頻繁に存在するアミノ酸によって占められる。2つのアミノ酸が同等に頻繁に生じる場合、いずれもコンセンサス配列中に含まれ得る。「コンセンサスフレームワーク」は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域をいう。
【0158】
抗体は、当該分野において公知の方法によってヒト化され得る。ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与しないFv可変領域の配列をヒトFv可変領域からの等価な配列で置換することによって生成され得る。ヒト化抗体を生成するための一般的な方法は、Morrison(1985)Science 229:1202−1207、Oiら、(1986)BioTechniques 4:214、ならびにQueenら米国特許第5,585,089号,同第5,693,761号および同第5,693,762号(これらの全ての内容が、本明細書中に参考として援用される)によって提供される。これらの方法は、重鎖および軽鎖のうちの少なくとも1つからの免疫グロブリンFv可変領域の全てまたは一部をコードする核酸配列を単離する工程、操作する工程、および発現する工程を包含する。このような核酸の供給源は、当業者に周知であり、例えば、MID9002ポリペプチドまたはそのフラグメントに対する抗体を産生するハイブリドーマより取得され得る。次いで、ヒト化抗体をコードする組換えDNAまたはそのフラグメントは、適切な発現ベクター中にクローニングされ得る。
【0159】
ヒト化抗体またはCDR移植された抗体は、CDR移植またはCDR置換によって産生され得、ここで、免疫グロブリン鎖のCDRのうち1つ、2つまたは全てが置換され得る。例えば、米国特許第5,225,539号;Jonesら(1986)Nature 321:552−525;Verhoeyanら 1988 Science 239:1534;Beidlerら(1988)J.Immunol.141:4053−4060;Winter 米国特許第5,225,539号(これら全ての内容が本明細書中に参考として明らかに援用される)を参照のこと。Winterは、本発明のヒト化抗体を調製するために使用され得るCDR移植方法を記載する(1987年3月26日に出願されたUK特許出願GB2188638A;Winter 米国特許第5,225,539号(この内容は参考として明らかに援用される)。
【0160】
特定のアミノ酸が置換、欠失または付加されているヒト化抗体はまた、本発明の範囲内である。好ましいヒト化抗体は、例えば、抗原に対する結合を改善するようにフレームワーク領域にアミノ酸置換を有する。例えば、ヒト化抗体は、ドナーフレームワーク残基に同一のフレームワーク残基を有するか、またはレシピエントフレームワーク残基以外の別のアミノ酸に同一のフレームワーク残基を有する。このような抗体を生成するために、ヒト化免疫グロブリン鎖の選択された少数のアクセプターフレームワーク残基は、対応するドナーアミノ酸で置換され得る。好ましい置換の位置は、CDRに隣接するアミノ酸残基またはCDRと相互作用し得るアミノ酸残基を含む(例えば、米国特許第5,585,089号を参照のこと)。ドナーからアミノ酸を選択するための基準は、米国特許第5,585,089号(例えば、米国特許第5,585,089号の12〜16欄、例えば、米国特許第5,585,089号の12〜16欄(この内容は、本明細書中に参考として援用される))に記載される。ヒト化抗体のための他の技術は、Padlanら、EP519596 A1(1992年12月23日公開)に記載される。
【0161】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置のために特に望ましい。このような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて生成され得る。例えば、LonbergおよびHuszar(1995,Int.Rev.Immunol.13:65−93);ならびに米国特許第5,625,126号;米国特許第5,633,425号;米国特許第5,569,825号;米国特許第5,661,016号;および米国特許第5,545,806号を参照のこと。さらに、Abgenix,Inc.(Fremont,CA)およびMedarex,Inc.(Princeton,NJ)のような会社は、上記に記載の技術に類似の技術を使用する選択された抗原に対して指向されるヒト抗体を提供することを保証し得る。
【0162】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「導かれた選択」として言及される技術を用いて生成され得る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体(例えば、マウス抗体)を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導く。この技術は、Jespersら(1994)Bio/Technology 12:899−903に記載される。
【0163】
抗MID9002抗体は、単鎖抗体であり得る。単鎖抗体(scFV)は、例えば、Colcherら(1999)Ann.NY Acad.Sci.880:263−80;およびReiter(1996)Clin.Cancer Res.2:245−52に記載されるように操作され得る。単鎖抗体は、同じ標的MID9002タンパク質の異なるエピトープに対する特異性を有する多価抗体を生成するために二量体化または多量体化され得る。
【0164】
好ましい実施形態において、抗体は、Fcレセプターに結合する低下した能力を有するかまたはその能力を有さない。例えば、これは、Fcレセプターに対する結合を支持しない、アイソタイプまたはサブタイプ、フラグメントまたは他の変異体である(例えば、変異誘発したかまたは欠失したFcレセプター結合領域を有する)。
【0165】
抗体(またはそのフラグメント)は、治療部分(例えば、細胞毒、治療剤または放射性イオン)に結合体化され得る。細胞毒または細胞毒性剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。例としては、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド(例えば、メイタンシノール(米国特許第5,208,020号を参照のこと)、CC−1065(米国特許第5,475,092号、同第5,585,499号、同第5,846,545号を参照のこと)およびこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗物質(例えば、メトキサレート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパ(thioepa)クロラムブシル、CC−1065、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシン(streptozotocin)、マイトマイシンC、およびシス−ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前は、ダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前は、アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、および抗分裂薬剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソールおよびメイタンシノイド)が挙げられるがこれらに限定されない。放射性イオンとしては、ヨウ素、イットリウム、およびプラセオジムが挙げられるがこれらに限定されない。
【0166】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を調節するために使用され得、薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定するように解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所定の生物学的応答を保持するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、トキシン(例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、またはジフテリアトキシン);タンパク質(例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子;または生物学的応答変更因子(例えば、リンホカイン、インターロイキン−1(「IL−1」)、インターロイキン−2(「IL−2」)、インターロイキン−6(「IL−6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM−CSF」)、顆粒球コロニー刺激因子(「G−CSF」)、あるいは他の増殖因子が挙げられ得る。
【0167】
あるいは、抗体は、二次抗体と結合され、Segal(米国特許第4,676,980号)によって記載されるような抗体へテロ結合体を形成し得る。
【0168】
抗MID9002抗体(例えば、モノクローナル抗体)を使用して、標準的技術(例えば、アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降)によってMID9002を単離し得る。さらに、抗MID9002抗体を使用して、このタンパク質発現の多さおよびパターンを評価するために、(例えば、細胞溶解物または細胞上清において)MID9002タンパク質を検出し得る。抗MID9002抗体を診断的に使用して、臨床試験手順の一部として(例えば、所定の処置レジメンの効率を決定するために)組織中のタンパク質レベルをモニタリングし得る。検出は、抗体を検出可能な物質に結合すること(すなわち、抗体標識)によって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ;適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられ;適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオロセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ;発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ;生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ;そして適切な放射活性物質の例としては、125I、131I、35Sまたは3Hが挙げられる。
【0169】
好ましい実施形態において、抗体は、精製されたMID9002抗原またはそのフラグメント(例えば、本明細書中に記載されるフラグメント)、膜結合抗原、組織(例えば、粗製組織調製物)、細胞全体、好ましくは生存細胞、溶解した細胞、または細胞画分(例えば、膜画分)を用いて免疫することにより作成され得る。
【0170】
ネイティブMID9002タンパク質のみに結合するか、変性したかもしくは他の非ネイティブMID9002タンパク質のみに結合するか、または両方に結合する抗体は、本発明の範囲内である。線状エピトープまたはコンホメーションエピトープを有する抗体は、本発明の範囲内である。コンホメーションエピトープは、ネイティブMID9002タンパク質に結合するが変性MID9002タンパク質に結合しない抗体を同定することにより同定され得る。
【0171】
(組換え発現ベクター、宿主細胞および遺伝子操作された細胞)
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、好ましくは、発現ベクターを含む。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子をいい、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターを含み得る。ベクターは、自律的な複製を行い得るか、または宿主DNA内に組み込み得る。ウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。
【0172】
ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適切な形態でMID9002核酸を含み得る。好ましくは、組換え発現ベクターは、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結された1つ以上の調節配列を含む。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含む。調節配列は、核酸配列の構成的発現、ならびに組織特異的調節および/または誘導性配列を指向する配列を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質発現レベルなどのような因子に依存し得る。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入され得、これにより本明細書中に記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチド(融合タンパク質またはポリペプチドを含む)(例えば、MID9002タンパク質、MID9002タンパク質の変異形態、融合タンパク質など)を産生し得る。
【0173】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるMID9002タンパク質の発現のために設計され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、E.coli、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、さらにGoeddel,(1990)Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CAに議論される。あるいは、組換え発現ベクターは、(例えば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを使用して)インビトロで転写および翻訳され得る。
【0174】
原核生物におけるタンパク質発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、ほとんどE.coliにて行われる。融合ベクターは、多くのアミノ酸を個々でコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、典型的に以下の3つの目的で働く:1)組換えタンパク質の発現を増加させるため;2)組換えタンパク質の溶解度を増加させるため;および3)アフィニティ精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製における補助のため。しばしば、タンパク質分解性切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との連結部に導入され、そして組換えタンパク質の融合部分からの分離、続く融合タンパク質の精製を可能にする。このような酵素およびこれらの同族認識配列は、第Xa因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、pGEX(Pharmacia Biotech Inc;SmithおよびJohnson(1988)Gene 67:31−40),pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)およびpRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)(これらはそれぞれ、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAを標的組換えタンパク質に融合する)が挙げられる。
【0175】
精製された融合タンパク質は、MID9002活性アッセイ(例えば、以下に詳細に記載される直接アッセイまたは競合アッセイ)において、またはMID9002タンパク質に特異的または選択的な抗体を生成するために使用され得る。好ましい実施形態において、本発明のレトロウイルス発現ベクターにおいて発現される融合タンパク質を使用して、骨髄細胞を感染し続いて照射したレシピエントに移植し得る。次いで、被験体レシピエントの病理学は、十分な時間が経過した後(例えば、6週間)に試験される。
【0176】
E.coliにおける組換えタンパク質発現を最大化することは、その組換えタンパク質をタンパク質分解性切断する減弱した能力を有する宿主細菌中でタンパク質を発現することである(Gottesman(1990)Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,California 119−128)。別のストラテジーは、各アミノ酸に対する個々のコドンがE.coli中で優先的に利用されるものであるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変更することである(Wadaら(1992)Nucleic Acids Res.20:2111−2118)。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的DNA合成技術によって行われ得る。
【0177】
MID9002発現ベクターは、酵母発現ベクター、昆虫細胞内での発現のためのベクター(例えば、バキュロウイルス発現ベクター)または哺乳動物細胞内での発現に適切なベクターであり得る。
【0178】
哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによってしばしば提供され得る。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40由来である。
【0179】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向し得る(例えば、組織特異的調節エレメントが核酸の発現に使用される)。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的;Pinkertら(1987)Genes Dev.1:268−277)、リンパ特異的プロモーター(CalameおよびEaton(1988)Adv.Immunol.43:235−275)、T細胞レセプターの特定のプロモーター(WinotoおよびBaltimore(1989)EMBO J.8:729−733)、および免疫グロブリン(Banerjiら(1983)Cell 33:729−740;QueenおよびBaltimore(1983)Cell 33:741−748)、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター;ByrneおよびRuddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473−5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlundら(1985)Science 230:912−916)、および乳腺特異的プロモーター(例えば、乳清ホエープロモーター;米国特許第4,873,316号および欧州特許出願公開番号264,166号)が挙げられる。発生的に調節されるプロモーター(例えば、マウスhoxプロモーター(KesselおよびGruss(1990)Science 249:374−379)およびα−フェトプロテインプロモーター(CampesおよびTilghman(1989)Genes Dev.3:537−546))がまた、含まれる。
【0180】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。種々の細胞型のアンチセンスRNAの、構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指示する、アンチセンスの向きでクローニングされた核酸に対して作動可能に連結された調節配列(例えば、ウイルスプロモーターおよび/またはエンハンサー)が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、Weintraubら、(1986)Reviews−Trends in Genetics 1:1を参照のこと。
【0181】
本発明の別の局面は、本明細書中に記載された核酸分子(例えば、組換え発現ベクター内のMID9002核酸分子、またはMID9002核酸分子が宿主細胞ゲノムの特定の部位中に相同的に組換えることを可能とする配列を含むMID9002核酸分子)を含有する宿主細胞を提供する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をいう。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において存在し得るので、このような子孫は、実際、親の細胞と同一でなくてもよいが、なお、本明細書中で使用されるようなこの用語の範囲内に含まれる。
【0182】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、MID9002タンパク質は、細菌細胞(例えば、E.coli)、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)またはCV−1を起源とするSV40(COS)細胞)で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【0183】
ベクターDNAは、従来的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して宿主細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸(例えば、DNA)を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。
【0184】
本発明の宿主細胞を使用して、MID9002タンパク質を生成(すなわち、発現)し得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用してMID9002タンパク質を生成するための方法を提供する。1つの実施形態において、この方法は、MID9002タンパク質が生成されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞(この中に、MID9002タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている)を培養する工程を、包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞からMID9002タンパク質を単離する工程を包含する。
【0185】
別の局面において、本発明は、細胞、またはMID9002トランスジーンを含有する細胞もしくはそれ以外にMID9002を誤って発現する(misexpress)細胞からの精製調製物を特徴とする。この細胞調製物は、ヒト細胞または非ヒト細胞(例えば、げっ歯類細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)、ウサギ細胞、またはブタ細胞)からなり得る。好ましい実施形態において、細胞はMID9002トランスジーン(例えば、MID9002の異種形態、例えば、(非ヒト細胞の場合の)ヒト由来の遺伝子)を、含有する。このMID9002トランスジーンは、誤って発現(例えば、過剰発現または寡少発現(underexpress))され得る。別の好ましい実施形態において、細胞は、内在性MID9002を誤って発現する遺伝子(例えば、遺伝子発現が損なわれる遺伝子(例えば、ノックアウト))を含有し得る。このような細胞は、変異したMID9002対立遺伝子、または誤って発現されたMID9002対立遺伝子に関係する障害を研究するためのモデル、または薬物スクリーニングにおける使用のためのモデルとして使用され得る。
【0186】
別の局面において、本発明は、本発明のMID9002ポリペプチドをコードする核酸で形質転換されたヒト細胞(例えば、血球幹細胞)を、特徴とする。
【0187】
また、細胞、好ましくはヒト細胞(例えば、ヒト血球系細胞または線維芽細胞)が提供され、この細胞中では、内因性MID9002が、正常では内因性MID9002遺伝子の発現を制御しない調節配列の制御下にある。細胞(例えば、細胞株または微生物)中の内因性遺伝子の発現特徴は、挿入された調節エレメントが内因性MID9002遺伝子に作動可能に連結されるように、細胞のゲノム中に異種性のDNA調節エレメントを挿入することによって改変され得る。例えば、「転写的にサイレント」(例えば、正常では発現されない)であるか、または極低レベルでのみ発現される内因性MID9002遺伝子を、その細胞中で正常に発現される遺伝子産物の発現を促進し得る調節性エレメントを挿入することによって、活性化し得る。標的化相同組換えのような技術を使用して、例えば、1991年5月16日に発行されたChappel、米国特許第5,272,071号;WO 91/06667に記載されるように、異種性DNAを挿入し得る。
【0188】
(トランスジェニック動物)
本発明は、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。このような動物は、MID9002タンパク質の機能および/または活性を研究するため、ならびにMID9002の活性の調節因子を同定および/または評価するために、有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、その動物の細胞の1つ以上がトランスジーンを含有する、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットもしくはマウスにようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。トランスジーンとは、トランスジェニック動物の細胞のゲノム中に組み込まれるか、またはゲノム中に生じる、外因性DNAまたは再配置(例えば、内因性染色体DNAの欠失)である。トランスジーンは、トランスジェニック動物の1つ以上の細胞型もしくは組織においてコードされる遺伝子産物の発現を指令し得、他のトランスジーン(例えば、ノックアウト)は、発現を減少させる。従って、トランスジェニック動物は、内因性MID9002遺伝子が、例えば、内因性遺伝子と、その動物の発生前にその動物の細胞(例えば、動物の胚細胞)中に導入された外因性DNAとの間の相同組換えによって、変更された動物である。
【0189】
イントロン配列およびポリアデニル化シグナルはまた、トランスジーンの発現の効率を増加させるためにトランスジーン中に含まれ得る。組織特異的調節配列は、特定の細胞に対してMID9002タンパク質の発現を指向するために、本発明のトランスジーンに作動可能に連結され得る。トランスジェニック創始動物は、そのゲノムにおけるMID9002トランスジーンの存在および/またはこの動物の組織もしくは細胞におけるMID9002 mRNAの発現に基づいて、同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物を使用して、トランスジーンを保有するさらなる動物を育種する。さらにMID9002タンパク質をコードするトランスジーンを保有するトランスジェニック動物は、さらに、他のトランスジーンを有する他のトランスジェニック動物と交配され得る。
【0190】
MID9002タンパク質またはMID9002ポリペプチドは、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物において発現され得る(例えば、このタンパク質またはペプチドをコードする核酸が、動物のゲノム中に導入され得る)。好ましい実施形態において、この核酸を、組織特異的なプロモーター(例えば、母乳特異的プロモーターまたは卵特異的プロモーター)の制御下に配置し得、そして動物により産生される母乳または卵から回収され得る。適切な動物は、マウス、ブタ、ウシ、ヤギおよびヒツジである。
【0191】
本発明はまた、例えば、以下に考察されるような、トランスジェニック動物由来の細胞集団を包含する。
【0192】
(使用)
本明細書中に記載される核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、および抗体は、以下の方法の1以上に使用され得る:a)スクリーニングアッセイ;b)予測的な医薬品(例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験のモニタリング、および薬理遺伝学);ならびにc)処置方法(例えば、治療および予防)。
【0193】
本発明の単離された核酸分子を使用して、MID9002タンパク質を(例えば、遺伝子治療の適用における、宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して)発現し得、(例えば、生物学的サンプル中の)MID9002 mRNAを検出し得、またはMID9002遺伝子中の遺伝子の変更を検出し得、そして以下にさらに記載されるように、MID9002の活性を調節し得る。MID9002タンパク質を使用して、MID9002基質の不十分な産生もしくは過剰な産生またはMID9002インヒビターの産生によって特徴付けられる障害を処置し得る。さらに、MID9002タンパク質を使用して、天然に存在するMID9002の基質についてスクリーニングし得、MID9002活性を調節する薬物または化合物をスクリーニングし得、ならびにMID9002野生型タンパク質と比較して、減少した活性、異常な活性または所望されない活性(例えば、異常または欠損したスルファターゼの機能または発現)を有する、MID9002タンパク質またはMID9002タンパク質形態の生成物の不十分な生成または過剰な生成によって特徴付けられる障害(例えば、肺癌、結腸癌および乳癌を含む、細胞増殖、細胞分化障害)を、処置し得る。さらに、本発明の抗MID9002抗体を使用して、MID9002タンパク質を検出および単離し得、MID9002タンパク質の生物利用能を調節し得、そしてMID9002活性を調節し得る。
【0194】
例えば、本発明のMID9002ポリペプチドと相互作用する(例えば、結合する)能力について化合物を評価する方法を提供する。この方法は、以下を包含する:本発明のMID9002ポリペプチドと化合物とを接触させる工程;および化合物がこの本発明のMID9002ポリペプチドと相互作用する(例えば、結合するか、または複合体を形成する)能力を評価する工程。この方法は、インビトロ(例えば、無細胞系)でか、またはインビボ(ツーハイブリッド相互作用トラップアッセイ)で実施され得る。この方法を使用して、本発明のMID9002ポリペプチドと相互作用する、天然に存在する分子を同定し得る。またこの方法を使用して、本発明のMID9002ポリペプチドの天然インヒビターまたは合成インヒビターを見出し得る。スクリーニング方法を、以下により詳細に考察する。
【0195】
(スクリーニングアッセイ)
本発明は、MID9002タンパク質に結合するか、例えばMID9002発現もしくはMID9002活性に対する刺激作用もしくは阻害作用を有するか、または例えばMID9002基質の発現または活性化に対する刺激作用または阻害作用を有する、モジュレーター、すなわち候補または試験の化合物または因子(例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、低分子または他の薬物)を同定するための方法(本明細書中でスクリーニングアッセイともいわれる)を提供する。このように、同定された化合物を使用して、治療プロトコル中で標的遺伝子産物(例えば、MID9002遺伝子)の活性を調節し得るか、標的遺伝子産物の生物学的機能を調節し得るか、または正常な標的遺伝子の相互作用を破壊(disrupt)する化合物を、同定し得る。
【0196】
1つの実施形態において、本発明は、MID9002タンパク質もしくはMID9002ポリペプチド、またはその生物学的に活性な部分の基質である、候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、MID9002タンパク質もしくはMID9002ポリペプチド、またはその生物学的に活性な部分に結合するかまたはその活性を調節する、候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【0197】
本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー方法(生物学的ライブラリー;ペプトイドライブラリー(ペプチドの機能を有するが、酵素的分解に対して耐性であるがそれでもなお生物学的に活性なままである、新規の非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー;例えば、Zuckermannら(1994)J.Med.Chem.37:2678−85を参照のこと);空間的にアドレス可能な並行の固相または溶液相ライブラリー;デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法;「1ビーズ1化合物」ライブラリー法;およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法を含む)における任意の多くのアプローチを使用して獲得され得る。生物学的ライブラリーアプローチおよび、ペプチドライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されず、一方、他の4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12:145)。
【0198】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、例えば、以下において、当該分野で見出され得る:DeWittら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909−13;Erbら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422−426;Zuckermannら(1994)、J.Med.Chem.37:2678−85;Choら(1993)Science 261:1303;Carrellら(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carellら(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;およびGallopら(1994)J.Med.Chem.37:1233−51。
【0199】
化合物のライブラリーは、溶液中に存在し得るか(例えば、Houghten(1992)Biotechniques 13:412〜421)、ビーズ上(Lam(1991)Nature 354:82〜84)、チップ上(Fodor(1993)Nature 364:555〜556)、細菌上(Ladner、米国特許第5,223,409号)、芽胞上(Ladner、米国特許第5,223,409号)、プラスミド上(Cullら(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:1865〜1869)またはファージ上(ScottおよびSmith(1990)Science 249:386〜390;Devlin(1990)Science 249:404〜406;Cwirlaら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:6387〜6382;Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301〜310;Ladner 前出)であり得る。
【0200】
1つの実施形態では、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、ここでMID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞を、試験化合物と接触させ、そして試験化合物がMID9002活性を調節する能力を決定する。試験化合物がMID9002活性を調節する能力の決定を、例えば、スルファターゼ機能をモニターすることによって成し得る。例えばこの細胞は、哺乳動物由来(例えば、ヒト)であり得る。
【0201】
試験化合物が化合物(例えば、MID9002基質)に結合するMID9002を調節する能力、またはMID9002に結合する能力をまた、評価し得る。このことは、例えば、化合物(例えば、基質)を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせることによって達成され得、その結果、複合体中の標識された化合物(例えば、基質)を検出することによって、化合物(例えば、基質)のMID9002への結合を決定し得る。あるいは、MID9002を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせて、複合体中で試験化合物がMID9002基質に結合するMID9002を調節する能力をモニタリングし得る。例えば、化合物(例えば、MID9002基質)を、125I、14C、35S、または3Hで、直接的または間接的のいずれかで標識し得、そしてこの放射性同位体が、放射線放射の直接的な計数によってか、またはシンチレーション計数によってかで検出され得る。あるいは、化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そして適切な基質産物への変換を定量することによって、この酵素標識を検出し得る。
【0202】
化合物(例えば、MID9002基質)が、任意の相互作用体(interactant)の標識化を有するMID9002またはこれを有さないMID9002と相互作用する能力を、評価し得る。例えば、微小生理機能測定器(microphysiometer)を使用して、化合物またはMID9002のいずれかの、標識化を有さないMID9002との化合物の相互作用を測定し得る。McConnellら(1992)Science 257:1906−1912。本明細書中で使用される場合、「微小生理機能測定器」(例えば、Cytosensor)は、光でアドレス可能な電位差測定センサー(LAPS)を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する、分析装置である。この酸性化速度の変化は、化合物とMID9002との間の相互作用の指標として使用され得る。
【0203】
なお別の実施形態において、MID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、そして試験化合物がMID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力を評価する、無細胞アッセイを提供する。本発明のアッセイに使用するためのMID9002タンパク質の好ましい生物学的に活性な部分としては、非MID9002分子と相互作用する役割を持つフラグメント(例えば、高い表面存在可能性スコアを有するフラグメント)が挙げられる。
【0204】
本発明の無細胞アッセイにおいて、単離したタンパク質(例えば、MID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分)の可溶性形態および/または膜結合形態を、使用し得る。膜結合形態のタンパク質を使用する場合、可溶化剤を利用することが望ましい。このような可溶化剤の例としては、以下のような非イオン性界面活性剤が挙げられる:n−オクチルグルコシド、n−ドデシルグルコシド、n−ドデシルマルトシド、オクタノイル−N−メチルグルカミド、デカノイル−N−メチルグルカミド、Triton(登録商標)X−100、Triton(登録商標)X−114、Thesit(登録商標)、イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)n(Isotridecypoly(ethylene glycol ether)n)、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホネート(3−[(3−cholamidopropyl)dimethylamminio]−1−propane sulfonate)(CHAPS)、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート(3−[(3−cholamidopropyl)dimethylamminio]−2−hydroxy−1−propane sulfonate)(CHAPSO)、またはN−ドデシル=N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート。
【0205】
無細胞アッセイは、2つの成分が相互作用しそして結合し、従って除去および/または検出され得る複合体を形成し得る条件下かつそのために十分な時間をかけて、標的遺伝子タンパク質および試験化合物の反応混合物を調製する工程を、包含する。
【0206】
2つの分子間の相互作用をまた、例えば、蛍光エネルギー転移(FET)を使用して検出し得る(例えば、Lakowiczら、米国特許第5,631,169号;Stavrianopoulosら、米国特許第4,868,103号を参照のこと)。第1標識「ドナー」分子上のフルオロフォアは、その放射した蛍光エネルギーが、第2「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収され、次いで吸収エネルギーに起因して蛍光発光し得るように、選択される。あるいは、この「ドナー」タンパク質分子は、単に、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用してもよい。異なる光波長を放射する標識を選択して、その結果、「アクセプター」分子標識は、「ドナー」分子標識から識別され得る。これら標識間のエネルギー転移の効率は、分子を隔てる距離の関係するので、これら分子間の空間関係を評価し得る。2つの分子間で結合が生じる状態では、このアッセイにおいて「アクセプター」分子標識の蛍光放射は最大となるはずである。FET結合事象を、当該分野で周知の標準的な蛍光検出手段を介して(例えば、蛍光測定器を用いて)、簡便に測定し得る。
【0207】
別の実施形態において、MID9002タンパク質が標的分子に結合する能力の決定を、リアルタイムの生体分子相互作用分析(Biomolecular Interaction Analysis)(BIA)を使用して達成し得る(例えば、SjolanderおよびUrbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338〜2345、ならびにSzaboら(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699〜705を参照のこと)。「表面プラズモン共鳴(surface plasmon resonance)」または「BIA」は、いずれの相互作用物(例えば、BIAcore)も標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する。結合表面の質量の変化(結合事象を表す)は、表面付近の光の屈折率の変化(表面プラズモン共鳴の光学的現象(optical phenomenon)(SPR))を生じ、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として使用され得る、検出可能なシグナルを生じる。
【0208】
1つの実施形態において、標的遺伝子産物または試験基質を、固相上に係留する(anchor)。固相上に係留した標的遺伝子産物/試験化合物の複合体を、反応終了時に検出し得る。好ましくは、標的遺伝子産物を固相表面上に係留し得、そして(係留されていない)試験化合物を、本明細書中で考察される検出可能な標識で、直接的または間接的のいずれかで標識し得る。
【0209】
MID9002、抗MID9002抗体またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合体化形態からの複合体化形態の分離を容易にし、そしてこのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物のMID9002タンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下でのMID9002タンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するのに適切な任意の容器内で成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。1つの実施形態において、そのタンパク質の一方または両方をマトリックスに結合することを可能にするドメインを追加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/MID9002の融合タンパク質またはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ/標的の融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical、St.Louis、MO)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで、これらを、試験化合物と混ぜ合わせるか、あるいは試験化合物および非吸着の標的タンパク質またはMID9002タンパク質のいずれかと混ぜ合わせ、そしてこの混合物を、複合体形成に貢献する条件下(例えば、塩およびpHに関して生理学的条件)でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば、上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ得、そしてMID9002結合レベルまたはMID9002活性レベルを標準的な技術を使用して決定し得る。
【0210】
MID9002タンパク質または標的分子のいずれかをマトリックス上に固定するための他の技術としては、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を使用することが挙げられる。ビオチン化されたMID9002タンパク質または標的分子を、当該分野において公知の技術を使用して、ビオチン−NHS(N−ヒドロキシスクシンイミド)から調製し得(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals、Rockford、IL)、そしてストレプトアビジンでコーティングした96ウェルのプレート(Pierce Chemical)のウェル中に固定し得る。
【0211】
このアッセイを行うために、非固定化成分を、係留された成分を含むコーティングされた表面に添加する。反応の完了後、形成された任意の複合体が固相表面上で依然として固定化されているような条件下で、未反応成分を取り除く(例えば、洗浄によって)。固相表面上に係留された複合体の検出を、多く方法で達成し得る。これまで固定化されない成分を予め標識する場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されることを示す。これまで固定化されない成分が予め標識されない場合、間接標識を使用して、表面上に係留された複合体を検出し得る:例えば、固定化成分に特異的または選択的な標識抗体の使用(次いで、この抗体は、直接的にか、または例えば標識された抗Ig抗体で間接的に標識され得る)。
【0212】
1つの実施形態において、MID9002タンパク質または標的分子と反応性であるが、MID9002タンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体を利用して、アッセイを実施する。このような抗体は、プレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはMID9002タンパク質が、抗体の結合体化によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、GST固定化複合体に関しての上記のものに加えて、MID9002タンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびにMID9002タンパク質または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【0213】
あるいは、無細胞アッセイを液相中で行い得る。このようなアッセイにおいて、以下に挙げられる任意の多くの標準的な技術によって、反応生成物を未反応成分から分離するが、これらに限定されない:差次的遠心分離(例えば、RivasおよびMinton(1993)Trends Biochem Sci 18:284−7を参照のこと);クロマトグラフィー(ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー);電気泳動(例えば、Ausubelら編(1999)、Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiley;New York.を参照のこと);および免疫沈降(例えば、Ausubelら、編(1999)Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiley:New Yorkを参照のこと)。このような樹脂およびクロマトグラフィー技術は当業者に公知である(例えば、Heegaard(1998)J Mol Recognit 11:141−8;HageおよびTweed(1997)J Chromatogr B Biomed Sci Appl.699:499−525を参照のこと)。さらに、蛍光エネルギー転移をまた、本明細書中に記載されるように、うまく使用して、溶液からの複合体のさらなる精製なしに結合を検出し得る。
【0214】
好ましい実施形態において、このアッセイは、MID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分を、MID9002を結合する公知化合物と接触させてアッセイ混合物を形成する工程、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、および試験化合物がMID9002タンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、試験化合物がMID9002タンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、公知化合物と比較した場合、試験化合物が、好ましくMID9002タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力、または標的分子の活性を調節する能力を決定する工程を包含する。
【0215】
本発明の標的遺伝子産物は、インビボで、1つ以上の細胞性高分子または細胞外高分子(例えば、タンパク質)と相互作用し得る。この考察の目的のために、このような細胞性高分子および細胞外高分子は、本明細書中で、「結合パートナー」といわれる。このような相互作用を無効化する化合物は、標的遺伝子産物の活性を調節するのに有用であり得る。このような化合物としては、抗体、ペプチドおよび低分子のような分子が挙げられ得るが、これらに限定されない。この実施形態における使用のための好ましい標的遺伝子/生成物は、本明細書中で同定されたMID9002遺伝子である。代替の実施形態において、本発明は、試験化合物が、MID9002標的分子の下流のエフェクターの活性の調節を介して、MID9002タンパク質の活性を調節する能力を決定するための方法を、提供する。例えば、これまでに記載されたように、適切な標的に対するエフェクター分子の活性を決定し得るか、またはエフェクターの適切な標的に対する結合を決定し得る。
【0216】
標的遺伝子産物と、その細胞性結合パートナーまたは細胞外結合パートナーとの間の相互作用を妨害する化合物を同定するために、標的遺伝子産物および結合パートナーを含有する反応混合物を、2つの成分が複合体を形成し得るような条件下かつそのために十分な時間をかけて、調製する。阻害性因子を試験するために、反応混合物を試験化合物の存在下および非存在下で提供する。試験化合物は、最初に、反応混合物中に含まれ得るか、またはある時点で添加され得、続いて標的遺伝子およびその細胞性結合パートナーまたは細胞外結合パートナーを添加する。コントロールの反応混合物を、試験化合物なしでかまたはプラセボと一緒にインキュベートする。次いで、標的遺伝子産物と、細胞性結合パートナーまたは細胞外結合パートナーとの間の任意の複合体の形成を検出する。コントロール反応中で複合体を形成するが、試験化合物を含有する反応混合物中では複合体を形成しないことは、化合物が標的遺伝子産物と相互作用性結合パートナーとの相互作用を妨害することを示す。さらに、試験化合物および正常な標的遺伝子産物を含有する反応混合物中の複合体形成をまた、試験化合物および変異体標的遺伝子産物を含有する反応混合物中の複合体形成と比較し得る。この比較は、変異体標的遺伝子産物の相互作用を無効化するが、正常な標的遺伝子産物の相互作用は無効化しない化合物を同定することが望ましい場合に、重要であり得る。
【0217】
これらのアッセイは、不均一形式または均一形式で行われ得る。不均一系アッセイは、標的遺伝子産物またはその結合パートナーのいずれかを固相上に係留する工程、および反応終了時に固相上に係留された複合体を検出する工程を、包含する。均一系アッセイにおいて、全反応を液相中で実行する。別のアプローチにおいて、試験される化合物についての差次的な情報を獲得するために、反応物の添加の順序を変化し得る。例えば、標的遺伝子産物とその結合パートナーとの間の相互作用を、例えば、競合によって妨害する試験化合物を、試験基質の存在下で反応を行うことによって同定し得る。あるいは、形成された複合体を無効化する試験化合物(例えば、複合体から成分のうちの1つを置き換える、より高い結合定数を有する化合物)を、複合体が形成した後に反応混合物中に試験化合物を添加することによって試験し得る。種々の形式を、以下に簡潔に記載する。
【0218】
不均質のアッセイ系において、標的遺伝子産物または反応性(interactive)細胞結合パートナーもしくは細胞外結合パートナーのいずれかは、固体表面(例えば、マイクロタイタープレート)上に固着され、一方で非固着種が直接または間接的に標識される。固着種は、非共有結合または共有結合によって固定され得る。あるいは、固着される種に特異的または選択的な固定化抗体は、固体表面への種の固着のために使用され得る。
【0219】
アッセイを行うために、固定化種のパートナーは、試験化合物でコーティングされた表面か、試験化合物でコーティングされていない表面に曝露される。反応が完結した後、未反応の成分が除去され(例えば、洗浄によって)、そして任意の形成された複合体は、固体表面上に固定化されたままである。非固定化種が前標識される場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。非固定化種が前標識されていない場合、間接標識は、表面に固着された複合体を検出するために使用され得る;例えば、始めに非固定化種に特異的または選択的な標識抗体を用いて(次いで、抗体は、例えば、標識化抗Ig抗体で直接標識され得るかまたは間接的に標識され得る)。反応成分の添加の順番に依存して、複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を破壊する試験化合物が、検出され得る。
【0220】
あるいは、この反応は、試験化合物の存在下または非存在下で液体層で実行され得、反応産物は、未反応成分から分離され、そして複合体が検出される;例えば、溶液中で形成される任意の複合体を固着させる結合成分の1つに特異的または選択的な固定化抗体、および固着された複合体を検出する他のパートナーに特異的または選択的な標識化抗体を用いて。再度、液相への反応物の添加の順番に依存して、複合体を阻害するか、または予め形成された複合体を破壊する試験化合物が、同定され得る。
【0221】
本発明の代替の実施形態において、均質のアッセイが使用され得る。例えば、標的遺伝子産物のおよび反応性細胞結合パートナー産物または細胞外結合パートナー産物の予め形成された複合体は、標的遺伝子産物が標識されるか、またはその結合パートナーが標識されるかのいずれかで調製されるが、標識によって生成されるシグナルは、複合体形成に起因してクエンチされる(このアプローチを免疫アッセイのために利用する米国特許第4,109,496号を参照のこと)。予め形成された複合体由来の種の1つと競合し、そして置換する試験物質の添加は、バックグラウンドを上回るシグナルの生成を生じる。この方法において、標的遺伝子産物結合パートナー相互作用を破壊する試験物質が、同定され得る。
【0222】
なお別の局面において、MID9002タンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ(例えば、米国特許第5,283,317号;Zervosら、(1993)Cell 72:223〜232;Maduraら(1993)J.Biol.Chem.268:12046〜12054;Bartelら(1993)Biotechniques 14:920〜924;Iwabuchiら(1993)Oncogene 8:1693−1696;およびBrent WO94/10300を参照のこと)において「ベイト(bait)タンパク質」として使用されて、MID9002(「MID9002−結合タンパク質」または「MID9002−bp」)と結合または相互作用し、そしてMID9002活性に関する他のタンパク質を同定し得る。このようなMID9002−bpは、例えば、MID9002媒介性シグナル伝達経路の下流エレメントのような、MID9002タンパク質またはMID9002標的によるシグナルのアクティベーターまたはインヒビターであり得る。
【0223】
ツーハイブリッドシステムは、大半の転写因子のモジュラー性質に基づき、これは別個のDNA結合ドメインおよび活性化ドメインからなる。手短には、このアッセイは、2つの異なるDNA構築物を利用する。1つの構築において、MID9002タンパク質をコードする遺伝子は、公知の転写因子(例えば、GAL−4)のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他の構築において、同定されていないタンパク質(「プレイ(prey)」または「サンプル」)をコードするDNA配列のライブラリー由来のDNA配列は、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。(あるいは:MID9002タンパク質は、活性化ドメインに融合され得る)。「ベイト」タンパク質および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してMID9002依存性複合体を形成し得る場合、転写因子のDNA結合ドメインおよび活性化ドメインは、密接に近くにされる。このように近くにすることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子(例えば、lacZ)の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現は検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーは、単離され得、そしてMID9002タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用され得る。
【0224】
別の実施形態において、MID9002発現のモジュレーターが、同定される。例えば、細胞または細胞を含有しない混合物は、候補化合物と接触させられ、そしてMID9002mRNAまたはタンパク質の発現は、候補化合物の非存在下でMID9002mRNAまたはタンパク質の発現のレベルに相関して上昇した。MID9002mRNAまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりもその存在下で大きい場合、候補化合物は、MID9002mRNAまたはタンパク質発現の刺激因子として同定される。あるいは、MID9002mRNAまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりもその存在下でより少ない(統計学的に有意に少ない)場合、候補化合物は、MID9002mRNAまたはタンパク質発現のインヒビターとして同定される。MID9002mRNAまたはタンパク質発現のレベルが、MID9002mRNAまたはタンパク質の検出について本明細書中に記載される方法によって決定され得る。
【0225】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるアッセイの2つ以上の組み合わせに関する。例えば、調節剤は、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを用いて同定され得、そしてMID9002タンパク質の活性を調節する因子の能力は、例えば、動物(例えば、肺癌、結腸癌および乳癌を含む、細胞増殖障害または細胞分化障害のための動物モデル)においてインビボで確認され得る。
【0226】
本発明は、さらに上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤に関する。従って、このような薬剤での処置の効果、毒性、副作用、または作用機構を決定するための適切な動物モデルにおいて、本明細書中で記載されるように同定された薬剤(例えば、MID9002調節剤、アンチセンスMID9002核酸分子、MID9002特異的抗体、またはMID9002結合パートナー)をさらに使用することは本発明の範囲内である。さらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤は、本明細書中で使用される処置のために使用され得る。
【0227】
(検出アッセイ)
本明細書中で同定された核酸配列の一部またはフラグメントは、ポリヌクレオチド試薬として使用され得る。例えば、これらの配列は、以下のために使用され得る:(i)染色体上のその各々の遺伝子をマップするため(例えば、遺伝性疾患に関連する遺伝子領域を位置決めするため、またはMID9002と疾患を関係付けるため);(ii)わずかな生物学的サンプルからの個体を同定するため(組織タイピング);および(iii)生物学的サンプルの法医学的同定における補助。これらの適用は、以下の小節に記載される。
【0228】
(染色体マッピング)
MID9002ヌクレオチド配列またはその一部は、MID9002遺伝子の位置を染色体上にマッピングするために使用され得る。このプロセスは、染色体マッピンングといわれる。染色体マッピングは、疾患と関連する遺伝子とMID9002配列との相関において有用である。
【0229】
手短には、MID9002遺伝子は、MID9002ヌクレオチド配列からPCRプライマー(好ましくは15−25 bp長)を調製することによって染色体にマッピングされ得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングについて有用であり得る。MID9002配列に対応するヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが、増幅したフラグメントを産生する。
【0230】
各細胞株が、単一のヒト染色体、または少数のヒト染色体、および完全なセットのマウス染色体のいずれかを含む、体細胞ハイブリッドのパネルは、特定のヒト染色体に対する個々の遺伝子の容易なマッピングを可能にし得る(D’Eustachioら(1983)Science 220:919−924)。
【0231】
他のマッピングストラテジー(例えば、インサイチュハイブリダイゼーション(Fanら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6223−27に記載される)、標識化フローソート染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションによる事前選択)は、染色体の位置に対するMID9002のマッピングのために使用され得る。
【0232】
中期染色体拡散(spread)に対するDNA配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、1工程にて正確な染色体位置を提供するためにさらに使用され得る。このFISH技術は、500塩基または600塩基程度の短さのDNA配列を用いて使用され得る。しかし、1,000塩基よりも大きいクローンは、特有の染色体位置に結合する傾向が高く、簡単な検出のために十分なシグナル強度を有する。好ましくは、1,000塩基、より好ましくは2,000塩基が、適切な時間で良好な結果をえるために十分である。この技術の概説について、Vermaら(1988)Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques(Pergamon Press,New York)を参照のこと。
【0233】
染色体マッピングのための試薬は、単一の染色体またはその染色体の単一部位をマークするために個々に使用され得るか、または試薬のパネルが複数の部位および/または複数の染色体をマークするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際にマッピングの目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内でより保存されがちであり、従って、染色体マッピング中のクロスハイブリダイゼーションの機会を増加させる。
【0234】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理学的位置は、遺伝子マップデータと相関し得る(このようなデータは、例えば、McKusick,Mendelian Inheritance in Man,Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを介してオンラインで利用可能)。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係は、例えば、Egelandら(1987)Nature,325:783−787に記載される、連鎖分析(物理学的に隣接した遺伝子の共同遺伝(co−inheritance))によって同定され得る。
【0235】
さらに、MID9002遺伝子に関する疾患に罹患した個体と罹患していない個体との間のDNA配列における相違が、決定され得る。変異が、いくつかまたは全ての罹患した患者において見出されるが、罹患していない患者では見出されない場合、変異は、特定の疾患の原因因子であるようである。罹患した個体および罹患していない個体の比較は、最初に一般に、染色体における構造的改変(例えば、そのDNA配列に基づくPCRを用いて染色体拡散から観察可能であるか、または検出可能である欠失または転座)を探すことを含む。最終的に、いくらかの個体由来の遺伝子の完全な配列決定は、変異の存在を確認するため、および多型から変異を区別するために実行され得る。
【0236】
(組織タイピング)
MID9002配列は、例えば、制限フラグメント長多型(RFLP)を用いて生物学的サンプルから個体を同定するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムDNAは、1つ以上の制限酵素で消化され、フラグメントは分離され(例えば、サザンブロットにて)、そしてプローブされて同定のためのバンドを産生する。本発明の配列は、RFLPのためのさらなるDNAマーカーとして有用である(米国特許第5,272,057号に記載される)。
【0237】
さらに、本発明の配列はまた、個体のゲノムの選択された部分の実際の1塩基ずつのDNA配列を決定するために使用され得る。従って、本明細書中に記載されるMID9002ヌクレオチド配列は、その配列の5’末端および3’末端から2つのPCRプライマーを調製するために使用され得る。次いで、これらのプライマーは、個体のDNAを増幅し、次いでその配列を決定するために使用され得る。この様式で調製された個体由来の対応するDNA配列のパネルは、特有の個体識別子を提供し得る。なぜならば、それぞれの個体は、対立遺伝子の差異に起因してこのようなDNA配列の特有のセットを有するからである。
【0238】
対立遺伝子改変体は、これらの配列のコード領域においてある程度まで生じ、そして非コード領域でかなりの程度生じる。いくつかの程度に対して、本明細書中に記載される配列の各々は、ある程度まで標準として使用され得、この基準に対して個体由来のDNAが同定の目的のために比較され得る。より多くの数の多型が、非コード領域で生じるために、より少ない配列しか、個体を区別するために必要でない。配列番号1の非コード配列は、それぞれ100塩基の非コード増幅配列を産生する約10〜1,000個のプライマーのパネルを用いて、ポジティブな個体の同定を提供し得る。予測されるコード配列(例えば、配列番号3の配列)が使用される場合、ポジティブな個体の同定のためにより適した数のプライマーは、500〜2,000である。
【0239】
本明細書中に記載されるMID9002ヌクレオチド配列由来の試薬のパネルが、個体について特有の識別データベースを作成するために使用される場合、これらの同様の試薬が、個体から組織を同定するために後に使用され得る。特有の同定データベースを用いると、生きていても、死んでいても、個体のポジティブな同定は、非常に小さい組織サンプルからなされ得る。
【0240】
(法医学的生物学における部分的MID9002配列の使用)
DNAベースの同定技術はまた、法医学的生物学において使用され得る。このような同定をするために、PCR技術は、組織(例えば、毛髪および皮膚)、または体液(例えば、犯罪現場で見出された血液、唾液、もしくは精液)のような非常に小さい生物学的サンプルから得られたDNA配列を増幅するために使用され得る。次いで、増幅された配列は、標準と比較され得、これによって生物学的サンプルの起源の同定を可能にする。
【0241】
本発明の配列は、ポリヌクレオチド試薬(例えば、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座に標的化されるPCRプライマー)を提供するために使用され得、これは、例えば、別の「同定マーカー」(すなわち、特定の個体に特有の別のDNA配列)を提供することによってDNAベースの法医学的識別子の信頼性を増強し得る。上述のように、実際の塩基配列情報は、制限酵素生成フラグメントによって形成されたパターンに対する正確な代替として、同定のために使用され得る。配列番号1の非コード領域に標的化された配列(例えば、少なくとも20塩基、好ましくは少なくとも30塩基の長さを有する配列番号1の非コード領域由来のフラグメント)は、特にこの使用に適切である。
【0242】
本明細書中に記載されるMID9002ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド試薬(例えば、特定の組織を同定するために例えば、インサイチュハイブリダイゼーション技術で使用され得る標識化プローブまたは標識可能プローブ)を提供するためにさらに使用され得る。これは、法医学者が、未知の起源の組織が示される場合において非常に有用であり得る。このようなMID9002プローブのパネルは、種および/または器官型によって組織を同定するために使用され得る。
【0243】
類似の様式において、これらの試薬(例えば、MID9002プライマーまたはプローブは、汚染について組織培養をスクリーニングするために使用され得る(すなわち、培養物中の異なる型の細胞の混合物の存在についてのスクリーニング)。
【0244】
(予測医学)
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイおよび治験のモニタリングが、それによって個体を処置するために予後(予測)目的で使用される、予測医学の分野に関する。
【0245】
一般に、本発明は、被験体が、病巣に関連する障害についての危険性があるか、またはMID9002をコードする遺伝子のミス発か否かを決定する方法を提供する。
【0246】
このような障害としては、例えば、MID9002遺伝子のミス発現に関する障害;胃腸系の障害が挙げられる。
【0247】
この方法は、以下の1つ以上を包含する:
被験体の組織において、MID9002遺伝子の発現に影響する変異の存在または非存在を検出する工程、または遺伝子の発現を制御する領域における変異(例えば、5’制御領域における変異)の存在または非存在を検出する工程;
被験体の組織において、MID9002遺伝子の構造を改変する変異の存在または非存在を検出する工程;
被験体の組織において、mRNAレベルでMID9002遺伝子のミス発現を検出する工程(例えば、非野生型のmRNAレベルを検出する工程);
被験体の組織において、タンパク質レベルで遺伝子のミス発現を検出する工程(例えば、非野生型のMID9002ポリペプチドレベルを検出する工程)。
【0248】
好ましい実施形態において、この方法は、以下の少なくとも1つの存在を確証する工程を包含する:MID9002遺伝子由来の1つ以上のヌクレオチドの欠失;遺伝子への1つ以上のヌクレオチドの挿入、点変異(例えば、遺伝子の1つ以上のヌクレオチドの置換、遺伝子の全体の染色体再配列(例えば、転座、逆位、または欠失)。
【0249】
例えば、遺伝的病巣を検出するための工程としては、以下が挙げられる:(i)配列番号1由来のセンス配列もしくはアンチセンス配列または天然に存在するその変異体、またはMID9002遺伝子と天然に会合する5’もしくは3’の隣接配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ/プライマー、を提供する工程;(ii)プローブ/プライマーを、組織の核酸に曝露する工程;ならびに核酸に対するプローブ/プライマーのハイブリダイゼーション(例えば、インサイチュハイブリダイゼーション)によって、遺伝的病巣の存在または非存在を検出する工程。
【0250】
好ましい実施形態において、ミス発現を検出する工程は、以下の少なくとも1つの存在を確認する工程を包含する:MID9002遺伝子のメッセンジャーRNA転写のレベルにおける改変;遺伝子のメッセンジャーRNA転写の非野生型スプライシングパターンの存在;または非野生型のMID9002レベル。
【0251】
本発明の方法は、出生前か、または被験体の子孫が障害の危険性を有するか否かを決定するために使用され得る。
【0252】
好ましい実施形態において、本方法は、MID9002遺伝子の構造、障害の危険性について指標である異常な構造を決定する工程を包含する。
【0253】
好ましい実施形態において、本方法は、被験体由来のサンプルを、MID9002タンパク質に対する抗体またはその遺伝子と特異的にハイブリダイズする核酸と接触させる工程を包含する。これらおよび多の実施形態は以下に考察される。
【0254】
(診断および予後アッセイ)
生物学的サンプル中のMID9002タンパク質または核酸の存在、レベル、または非存在は、試験被験体から生物学的サンプルを得ることおよび生物学的サンプル中でMID9002タンパク質または核酸の存在が検出されるように、その生物学的サンプルをMID9002タンパク質またはMID9002タンパク質をコードする核酸(例えば、mRNA、ゲノムRNA)を検出し得る化合物または薬剤と接触させることによって評価され得る。用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織、細胞および生物学的流体、ならびに被験体中に存在する組織、細胞、および流体を含む。好ましい生物学的サンプルは、血清である。MID9002遺伝子の発現のレベルは、多くの方法で測定され得、この方法として以下が挙げられるがこれらに限定されない:MID9002遺伝子にコードされるmRNAを測定する方法;MID9002遺伝子にコードされるタンパク質の量を測定する方法;またはMID9002遺伝子にコードされるタンパク質の活性を測定する方法。
【0255】
MID9002遺伝子に対応する細胞内のmRNAのレベルは、インサイチュ形式およびインビトロ形式の両方によって決定され得る。
【0256】
単離されたmRNAは、ハイブリダイゼーションアッセイあるいは増幅アッセイ(サザン解析またはノザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応解析およびプローブアレイを含むがこれらに限定されない)において使用され得る。mRNAレベルの検出のための一つの好ましい診断方法は、単離されたmRNAを、検出される遺伝子によってコードされるmRNAにハイブリダイズし得る核酸分子(プローブ)と接触させる工程を包含する。核酸プローブは、例えば、全長のMID9002核酸(例えば、配列番号1の核酸)、またはその部分(例えば、少なくとも7、15、30、50、100、250、または500ヌクレオチドの長さであり、そしてストリンジェント条件下でMID9002mRNAまたはMID9002ゲノムDNAに特異的にハイブリダイズするために十分なオリゴヌクレオチド)であり得る。診断アッセイにおける用途のための他の適切なプローブが、本明細書中に記載される。
【0257】
一つの形式において、mRNA(またはcDNA)は、例えば、単離されたmRNAをアガロースゲルで電気泳動し、ゲルからニトロセルロースのような膜にmRNAを移すことによって表面に固定され、そしてプローブに接触させられる。別の形式において、例えば、下に記載の2次元遺伝子チップアレイにおいて、このプローブは、表面に固定され、そしてmRNA(またはcDNA)が、プローブに接触させられる。当業者は、MID9002遺伝子にコードされるmRNAのレベルを検出する用途のために、公知のmRNA検出方法を採用し得る。
【0258】
MID9002の1つにコードされるmRNAのサンプル中のレベルは、例えば、rtPCR(Mullis(1987)米国特許第4,683,202号)、リガーゼ連鎖反応(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189〜193)、自己持続性(self sustained)配列複製(Guatelliら、(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874〜1878)、転写性増幅システム(Kwohら、(1989)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173〜1177)、Q−Beta Replicase(Lizardiら、(1988)Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークル複製(Lizardiら、米国特許第5,854,033号)または任意の他の核酸増幅方法による核酸増幅(当該分野で公知の技術を使用する増幅化分子の検出が続く)で評価され得る。本明細書中で使用される場合、増幅プライマーは、遺伝子の5’または3’領域(それぞれプラス鎖およびマイナス鎖、またはその逆も同様)にアニ−ルし得、そして間に短い領域を有する核酸分子の対として規定される。一般に、増幅プライマーは、約10〜30ヌクレオチド長であり、約50〜200ヌクレオチド長の領域に隣接する。このようなプライマーは、適切な条件下そして適切な試薬を用いて、プライマーに隣接されるヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【0259】
インサイチュ方法に関して、細胞サンプルまたは組織サンプルは、調製/処理され、そして支持体(代表的にはスライドガラス)に固定され、そして次いで、解析されるMID9002遺伝子をコードするmRNAにハイブリダイズし得るプローブと接触させられ得る。
【0260】
別の実施形態において、この方法は、コントロールサンプルを、MID9002mRNAまたはゲノムDNAを検出し得る化合物または薬剤と接触させ、そしてコントロールサンプル中のMID9002mRNAまたはゲノムDNAの存在を試験サンプル中のMID9002mRNAまたはゲノムDNAの存在と比較する工程をさらに含む。
【0261】
MID9002にコードされるタンパク質のレベルを決定するために、種々の方法が使用され得る。一般に、これらの方法は、サンプル中のタンパク質レベルを評価するために、このタンパク質に選択的に結合する薬剤(例えば、抗体)をサンプルと接触させる工程を含む。好ましい実施形態において、この抗体は、検出可能な標識を有する。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、FabまたはF(ab’)2)が使用され得る。プローブまたは抗体に関して、用語「標識された」は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする(すなわち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、および検出可能な物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を含むことが意図される。検出可能な物質の例は、本明細書中に提供される。
【0262】
この検出方法は、インビトロおよびインビボで生物学的サンプル中のMID9002タンパク質を検出するために使用され得る。MID9002タンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、免疫沈降、免疫蛍光、酵素免疫アッセイ(EIA)、放射性免疫アッセイ(RIA)、およびウエスタンブロット解析が挙げられる。MID9002タンパク質の検出のためのインビボ技術としては、被験体中に標識化抗MID9002抗体を導入する技術が挙げられる。例えば、この抗体は、被験体中の存在および位置が標準的な画像化技術によって検出され得る放射活性マーカーで標識され得る。
【0263】
別の実施形態において、この方法は、コントロールサンプルを、MID9002タンパク質を検出し得る化合物あるいは薬剤と接触させ、そしてコントロールサンプル中のMID9002タンパク質の存在を、試験サンプル中のMID9002タンパク質の存在と比較する工程をさらに含む。
【0264】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるMID9002の存在を検出するためのキットを含む。例えば、このキットは、生物学的サンプル中のMID9002タンパク質またはMID9002 mRNAを検出し得る化合物または薬剤;および標準物質を備え得る。この化合物または薬剤は、適切な容器に充填され得る。このキットはMID9002タンパク質またはMID9002核酸を検出するためにキットを使用するための指示書をさらに備え得る。
【0265】
抗体ベースのキットに関して、このキットは、以下を備え得る:(1)本発明のマーカーに相当するポリペプチドに結合する(例えば、固体支持体に結合された)第1抗体、および、必要に応じて(2)このポリペプチドまたは第1抗体のいずれかに結合し、検出可能な薬剤に結合体化されている、別の第2抗体。
【0266】
オリゴヌクレオチドベースのキットに関して、このキットは、以下を備え得る:(1)本発明のマーカーに相当するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド(例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド)、または(2)本発明のマーカーに相当する核酸分子を増幅するために有用なプライマーの対。このキットはまた、緩衝剤、防腐剤、またはタンパク質安定化剤を備え得る。このキットはまた、検出可能な薬剤(例えば、酵素または基質)を検出するために必要な構成要素を備え得る。このキットはまた、コントロールサンプルまたはコントロールサンプルの系列を備え得、これらのコントロールサンプルは、アッセイされ得、そして備えられた試験サンプルと比較され得る。このキットの各構成要素は、個々の容器内に封入され得、そして種々の容器は全て、このキットを使用して実施されるアッセイの結果を説明するための指示書とともに、単一の包装内であり得る。
【0267】
本明細書中に記載される診断方法は、誤って発現された(misexpressed)か、または異常であるかまたは望まれないMID9002発現もしくはMID9002活性に関連する、疾患または障害を有する被験体、あるいはこれらの疾患または障害を発生する危険性が高い被験体を、同定し得る。本明細書中で使用される場合、用語「望まれない」は、疼痛または制御を外れた(deregulated)細胞分化のような生物学的応答に関連する望まれない現象を含む。
【0268】
一つの実施形態において、異常であるかまたは望まれない、MID9002発現もしくはMID9002活性に関連する疾患あるいは障害が、同定される。試験サンプルが、被験体から得られ、そしてMID9002タンパク質またはMID9002核酸(例えば、mRNAまたはゲノムDNA)が評価される。ここで、MID9002タンパク質またはMID9002核酸のレベル(例えば、存在または非存在)は、異常であるかまたは望まれないMID9002発現もしくはMID9002活性に関連する疾患あるいは障害を有する被験体、あるいはこれらの疾患または障害を発生する危険性が高い被験体について、診断的である。本明細書中で使用される場合、「試験サンプル」は、目的の被験体から得られる生物学的サンプル(生物学的流体(例えば、血清)、細胞サンプル、または組織を含む)をいう。
【0269】
本明細書中に記載される予後アッセイは、被験体に、異常であるかまたは望まれないMID9002発現もしくはMID9002活性に関連する疾患あるいは障害を処置するための薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬剤候補)を投与し得るかどうか決定するために使用され得る。例えば、このような方法は、被験体が増殖性障害/分化障害(例えば、結腸癌)のための薬剤で効果的に処置され得るかどうか決定するために使用され得る。
【0270】
本発明の方法はまた、MID9002遺伝子の遺伝子変化を検出し、それによって、その変化した遺伝子を有する被験体が、MID9002タンパク質活性の調節不全またはMID9002核酸発現の調節不全により特徴付けられる障害(例えば、増殖障害/分化障害(例えば、結腸癌))の危険性があるか否かを決定するためにも、使用され得る。好ましい実施形態において、この方法は、被験体由来のサンプルにおいて、MID9002タンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響する変化またはMID9002遺伝子の誤発現のうちの少なくとも1つにより特徴付けられる遺伝子変化の存在もしくは非存在を、検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝子変化は、以下のうちの少なくとも1つの存在を確認することによって検出され得る:1)MID9002遺伝子からの1つ以上のヌクレオチドの欠失;2)MID9002遺伝子に対する1つ以上のヌクレオチドの付加;3)MID9002遺伝子の1つ以上のヌクレオチドの置換;4)MID9002遺伝子の染色体再配置;5)MID9002遺伝子のメッセンジャーRNA転写物レベルの変化;6)MID9002遺伝子の異常改変(例えば、ゲノムDNAのメチル化パターンの異常改変);7)MID9002遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の非野生型巣プライシングパターンの存在;8)非野生型のMID9002タンパク質レベル;9)MID9002遺伝子の対立遺伝子喪失;および10)MID9002タンパク質の不適切な翻訳後修飾。
【0271】
変化は、ポリメラーゼ連鎖反応(例えば、アンカーPCRまたはRACE PCR)またはライゲーション連鎖反応(LCR)においてプローブ/プライマーを用いずに検出され得、後者は、MID9002遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る。この方法は、被験体から細胞サンプルを収集する工程、そのサンプルから核酸(例えば、ゲノム、mRNA、または両方)を単離する工程、その核酸サンプルを、MID9002遺伝子に特異的にハイブリダイズする1つ以上のプライマーと、そのMID9002遺伝子(存在する場合に)のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じる条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在または非存在を検出するか、またはその増幅産物のサイズを検出してコントロールサンプルと長さを比較する工程を包含し得る。本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかと組み合わせて、予備増幅工程として使用するためにPCRおよび/またはLCRが望ましくあり得ることが、認識される。あるいは、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知の他の増幅方法が、使用され得る。
【0272】
別の実施形態において、サンプル細胞由来のMID9002遺伝子における変異が、制限酵素切断パターンの変化を検出することによって同定され得る。例えば、サンプルDNAおよびコントロールDNAが、単離され、(必要に応じて)増幅され、1つ以上の制限エンドヌクレアーゼにより消化され、そしてフラグメント長のサイズが(例えば、ゲル電気泳動により)決定され、そして比較される。サンプルDNAとコントロールDNAとの間のフラグメント長のサイズの差異は、そのサンプルDNA中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第5,498,531号を参照のこと)の使用が、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特定の変異の存在について記録するために使用され得る。
【0273】
他の実施形態において、MID9002における遺伝子変異が、サンプル核酸とコントロール核酸(例えば、DNAまたはRNA)とをハイブリダイズすること、2次元アレイ(たとえば、チップベースアレイ)により同定され得る。そのようなアレイは、複数のアドレス(address)を備え、そのアドレスの各々は、他と位置的に区別可能である。異なるプローブが、その複数のアドレスのうちの各々のアドレスに位置する。そのアレイは、高密度のアドレスを有し得、例えば、数百個または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含み得る(Croninら(1996)Human Mutation 7:244〜255;Kozalら(1996)Nature Medicine 2:753〜759))。例えば、MID9002における遺伝子変化が、Cronin,M.T.ら(前出)に記載されるように、光発生DNAプローブを含む2次元アレイ中で同定され得る。簡単に述べると、プローブの第1ハイブリダイゼーションアレイが、連続的に重複するプローブの直線状アレイを作製することによって、配列間の塩基変化を同定するために、サンプルとコントロール中の長いDNAストレッチに添って走査するために使用され得る。この工程により、点変異の同定が可能になる。この工程の後に、第2のハイブリダイゼーションアレイが使用される。この第2のハイブリダイゼーションアレイは、検出されるすべての改変体または変異に対して相補的なより小さい特化したプローブアレイを使用することによって特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、並列プローブセットから構成されており、1つのプローブセットは、野生型遺伝子と相補的であり、他方のプローブセットは、変異体遺伝子と相補的である。
【0274】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかが、MID9002遺伝子を直接配列決定し、そしてサンプルMID9002の配列を対応する野生型(コントロール)配列と比較することにより変異を検出するために、使用され得る。自動配列決定手順(質量分析計による配列決定を含む)が、診断アッセイを実施する場合に利用され得る(Naeveら(1995)Biotechniques 19:448〜53)。
【0275】
MID9002遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、RNA/RNAヘテロ二重鎖またはRNA/DNAヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出するために切断剤からの保護が使用される方法が、挙げられる(Myersら(1985)Science 230:1242;Cottonら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4397;Saleebaら(1992)Methods Enzymol.217:286〜295)。
【0276】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、細胞サンプルから得たMID9002 cDNAにおける点変異を検出してマッピングするための規定された系において、二本鎖DNAにおけるミスマッチ塩基対を認識する1つ以上のタンパク質(いわゆる「DNAミスマッチ修復」酵素)を使用する。例えば、E.coliのmutY酵素は、G/AミスマッチのAを切断し、そしてHeLa細胞由来のチミジンDNAグリコシラーゼは、G/TミスマッチのTを切断する(Hsuら(1994)Carcinogenesis 15:1657〜1662;米国特許第5,459,039号)。
【0277】
他の実施形態において、電気泳動移動度の変化が、MID9002遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンフォメーション多型(SSCP)が、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動移動度の差異を検出するために使用され得る(Oritaら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA:86:2766、Cotton(1993)Mutat.Res.285:125〜144;およびHayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.9:73〜79もまた参照のこと)。サンプルおよびコントロールのMID9002核酸の一本鎖DNAフラグメントは、変性され、そして再生させられる。一本鎖核酸の二次構造は、配列により変化し、生じる電気泳動度変化により、一塩基変化さえも検出可能となる。そのDNAフラグメントは、標識プローブを用いて標識または検出され得る。そのアッセイの感度は、(DNAではなく)RNAを使用することにより増強され得、そのRNAにおいて、二次構造が配列変化に対してDNAよりも感受性である。好ましい実施形態において、本方法は、電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離するためにヘテロ二重鎖分析を使用する(Keenら(1991)Trends Genet 7:5)。
【0278】
なお別の実施形態において、変性剤勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおける変異体フラグメントまたは野生型フラグメントの移動が、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)を使用してアッセイされる(Myersら(1985)Nature 313:495)。DGGEが分析方法として使用される場合、DNAは、そのDNAが完全には変性しないことを確実にするように、例えば、約40bpの高融解GCリッチDNAのGCクランプをPCRにより付加することによって、改変される。さらなる実施形態において、温度勾配が、コントロールDNAの移動度とサンプルDNAの移動度の差異を同定するために、変性勾配の代わりに使用される(RosenbaumおよびReissner(1987)Biophys Chem 265:12753)。
【0279】
点変異を検出するための他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられるが、これらに限定されない(Saikiら(1986)Nature 324:163;Saikiら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 86:6230)。
【0280】
あるいは、選択的PCR増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術が、本発明と組み合わせて使用され得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように)その分子の中心に目的の変異を保有し得る(Gibbsら(1989)Nucleic Acids Res.17:2437〜2448)か、または1つのプライマーの最も3’側の端部(適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を防止または減少させ得る場所である)に目的の変異を保有し得る(Prossner(1993)Tibtech 11:238)。さらに、切断ベースの検出を生成するために変異領域中に新規な制限部位を導入することが、望ましくあり得る(Gaspariniら(1992)Mol.Cell Probes 6:1)。特定の実施形態において、増幅用のTaqリガーゼを使用して増幅も実施され得ることが、予期される(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88:189〜93)。このような場合、5’配列の3’端に完全な一致が存在する場合にのみライゲーションが生じ、増幅の存在または非存在を検索することによって特定の部位における既知の変異の存在を検出することが可能になる。
【0281】
本明細書中で記載される方法は、例えば、本明細書中に記載される少なくとも1つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実行され得、これは、例えば、MID9002遺伝子に関与する疾患または疾病の症状または家族の病歴を示す患者を診断するための臨床状況において、便利に使用され得る。
【0282】
(代理マーカーとしてのMID9002分子の使用)
本発明のMID9002分子はまた、障害または疾患状態のマーカーとして、疾患状態の前駆体についてのマーカーとして、疾患状態の素因についてマーカーとして、薬物活性のマーカーとして、または被験体の薬理ゲノム学的プロフィールのマーカーとして有用である。本明細書中に記載される方法を使用して、本発明のMID9002分子の存在、非存在および/または量が検出され得、そしてインビボでの1つ以上の生物学的状態と関連付けされ得る。例えば、本発明のMID9002分子は、1つ以上の障害または疾患状態についての代理マーカーまたは疾患状態を導く状態についての代理マーカーとして作用し得る。本明細書中で使用される場合、「代理マーカー」は、疾患または障害の非存在もしくは存在、または疾患もしくは障害の進行(例えば、腫瘍の存在または非存在を伴う)と相関する客観的生物学的マーカーである。このようなマーカーの存在または量は、疾患に依存しない。従って、これらのマーカーは、特定の処置経過が、疾患状態または障害の減少において有効であるか否かを示すために作用し得る。代理マーカーは、疾患状態もしくは障害の存在もしくは程度が、標準的な方法論(例えば、初期段階腫瘍)を介して評価することが困難な場合、または疾患進行の評価が、潜在的に危険な臨床的終点が達成される前に所望される場合に特に有用である(例えば、心筋梗塞または十分に進行したAIDSの望ましくない臨床的結果が進行する十分に前に、心臓血管疾患の評価が、代理マーカーとしてコレステロールレベルを使用してなされ得、そしてHIV感染の分析が、代理マーカーとしてHIV RNAレベルを使用してなされ得る)。当該分野における代理マーカーの使用の例としては、以下が挙げられる:Koomenら(2000)J.Mass.Spectrom. 35:258−264;およびJames(1994)AIDS Treatment News Archive 209。
【0283】
本発明のMID9002分子はまた、薬力学的マーカーとして有用である。本明細書中で使用される場合、「薬力学的マーカー」は、薬物の効果に特異的に関連する客観的な生化学的マーカーである。薬力学的マーカーの存在または量は、薬物が投与される疾患の状態または障害には関連せず、それ故、このマーカーの存在または量は、被験体における薬物の存在または活性を示す。例えば、薬力学的マーカーは、そのマーカーが、薬物のレベルに関連して、この組織の中で、発現するかもしくは転写されるか、または発現も転写もされないかのいずれかであるという点で、生物学的組織における薬物の濃度を示し得る。この様態において、薬物の分布または摂取は、薬力学的マーカーによってモニターされ得る。同様に、薬力学的マーカーの存在または量は、薬物の代謝生成物の存在または量に関連し得、その結果、マーカーの存在または量は、インビボでの薬物の相対的分解速度を示す。薬力学的マーカーは、薬物効果の検出の感度の増加において、特に薬物が低用量で投与される場合に、特に有用である。少量の薬物でさえ、複数回マーカー(例えばMID9002マーカー)の転写または発現を、活性化するために十分であり得るので、増幅されたマーカーは、薬物そのものよりも容易に検出される量で存在し得る。また、マーカーは、マーカーそのものの性質に起因してより容易に検出され得る;例えば、本明細書中に記載される方法を使用して、抗MID9002抗体は、MID9002タンパク質マーカーのための免疫ベースの検出系にて使用され得るか、またはMID9002特異的放射標識プローブは、MID9002 mRNAマーカーを検出するために使用され得る。さらに、薬力学的マーカーの使用は、直接観測が可能な範囲を超える薬物処置に起因する危険性の機構ベースの予測を提供し得る。当該分野における薬力学的マーカーの使用の例としては、Matsudaら、米国特許第6,033,862号;Hattisら、(1991)Env.Health Perspect.90:229−238;Schentag(1999)Am.J.Health−Syst.Pharm.56 補遺3:S21−S24;およびNicolau(1999)Am,J.Health−Syst.Pharm.56 補遺3:S16−S20が挙げられる。
【0284】
本発明のMID9002分子はまた、薬力学的マーカーとして有用である。本明細書中で使用される場合、「薬力学的マーカー」は、被験体における特定の臨床的薬物応答または薬物感受性と関連する客観的な生物学的マーカーである(例えば、McLeodら、(1999)Eur.J.Cancer 35:1650−1652を参照のこと)。薬力学的マーカーの存在または量は、薬物の投与前に、特定の薬物または薬物のクラスに対して予測される被験体の応答に関連する。被験体における1つ以上の薬力学的マーカーの存在または量を評価することによって、被験体に対して最も適切であるか、またはより大きな成功の程度を有すると予測される薬物療法が、選択され得る。例えば、被験体における特定の腫瘍マーカーについての、RNAまたはタンパク質(例えば、MID9002タンパク質またはMID9002 RNA)の存在または量に基づいて、被験体中に存在する可能性のある特定の腫瘍の処置に対して最適化された、薬物または処置経過が選択され得る。同様に、MID9002 DNAにおける特定の配列の変異の存在または非存在は、MID9002薬物応答に関連し得る。従って、薬力学的マーカーの使用によって、治療を施与する必要なしに、各被験体に対して最も適切な治療の適用が可能になる。
【0285】
(薬学的組成物)
本発明の核酸およびポリペプチド、これらのフラグメント、ならびに抗MID9002抗体(本明細書中では、「活性化合物」ともいわれる)は、薬学的組成物に組込まれ得る。このような組成物は、代表的には、核酸分子、タンパク質、または抗体および薬学的に受容可能なキャリアを包含する。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与と適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。補充活性化合物もまた、組成物に組込まれ得る。
【0286】
薬学的組成物は、その意図される投与の経路に適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口投与(例えば、静脈投与)、皮内投与、皮下投与、経口(例えば、吸入)投与、経皮(局所的)投与、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用に使用される溶液または懸濁物は、以下の成分を含み得る:滅菌希釈液(例えば、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒);抗菌剤(例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン);抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム);キレート剤(例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸);緩衝液(例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸)および張度の調整のための薬剤(例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース)。pHは、酸または塩基(例えば、塩酸または水酸化ナトリウム)で調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラス製もしくはプラスチック製の複数用量バイアル中に封入され得る。
【0287】
注射用途に適する薬学的組成物としては、滅菌水溶液(水溶性の場合)または滅菌分散物および滅菌注射可能な溶液または滅菌注射可能な分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理学的食塩水、静菌性水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)またはリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌状態でなければならず、容易に注射可能である程度の流体であるべきである。この組成物は、製造および貯蔵の状態下で安定であるべきであり、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング(例えば、レシチン)の使用、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザールなど)によって達成され得る。多くの場合、等張剤(例えば、糖、ポリアルコール(例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム)を組成物中に含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤(例えば、ステアリン酸モノアルミニウムおよびゼラチン)を組成物中に含有することによって、引き起こされ得る。
【0288】
滅菌注射可能な溶液は、上に列挙される成分の1つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に、必要な量で活性な化合物を組込むことによって(必要な場合、その後、濾過滅菌することによって)調製され得る。一般的に、分散物は、基本分散媒体および上に列挙される成分からの他の必要な成分を含有する安定なビヒクルに、活性な化合物を組込むことによって調製される。滅菌注入可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これらは、前に濾過滅菌されたその溶液から、活性な成分および任意のさらに所望される成分の粉末を得る。
【0289】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈物または食用キャリアを含む。経口治療投与の目的について、活性な化合物は、賦形剤に組込まれ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤(例えば、ゼラチンカプセル剤)の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての用途のための流体キャリアを使用して、調製され得る。薬学的に適合可能な結合剤および/またはアジュバント物質が、組成物の一部として含有され得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分または類似した性質の化合物のいずれかを含み得る:結合剤(例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン);賦形剤(例えば、スターチまたはラクトース)、崩壊剤(例えば、アルギン酸、Primogel、またはコーンスターチ);潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはSterote);流動促進剤(例えば、コロイド状二酸化ケイ素);甘味料(例えば、スクロースまたはサッカリン);あるいは香味料(例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、または、オレンジ香味料。
【0290】
吸入による投与について、化合物は、加圧された容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレーの形態で送達され、これらの加圧された容器またはディスペンサーは、適切な噴射体(例えば、二酸化炭素のような気体)、または噴霧器を備える。
【0291】
全身投与はまた、経粘膜的手段または経皮的手段によってであり得る。経粘膜的投与または経皮的投与について、浸透されるべき障害に適切な浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般的に当該分野で公知であり、例えば、経皮的投与のための界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜的投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を介して達成され得る。経皮的投与について、活性な化合物は、当該分野で一般的に公知なように、軟膏(ointment)、軟膏剤(salve)、ゲル、またはクリームに処方される。
【0292】
化合物はまた、直腸送達のための坐剤(例えば、従来の坐剤基剤(例えば、ココアバターおよび他のグリセリド)を用いる)または停留浣腸の形態で調整され得る。
【0293】
1つの実施形態において、活性な化合物は、キャリアと共に調製され、このキャリアは、身体からの迅速な排泄に対して化合物を保護し、例えば、徐放性処方物(移植片および微小カプセル化送達系を含む)である。生体分解性の生体適合性ポリマー(例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸)が、使用され得る。このような処方物の調製方法は、当業者に明らかである。これらの材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁物(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に対して標的化されたリポソームを含む)はまた、薬学的受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【0294】
投与の容易さおよび投与用量の一様性のために、投与単位形態での経口組成物または非経口組成物を処方することは有利である。本明細書中で使用される場合、投与単位形態は、処置される被験体に対する単一投与量として適切な、物理的に別個の単位をいい;各単位は、必要な薬学的なキャリアに関連する所望の治療効果を生成するように計算された所定の量の活性な化合物を含む。
【0295】
このような化合物の毒性および治療効率は、例えば、LD50(集団の50%に対して致死性である量)およびED50(集団の50%における治療有効用量)を決定することについて、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、そしてこの比は、比LD50/ED50として示され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用され得る一方で、非感染細胞に対する潜在的な傷害を最小化するための罹患組織の部位にこのような化合物を標的化する送達システムを設計するために注意を払い、それによって副作用を減少するべきである。
【0296】
細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける用途のための一定範囲の投与量を処方することにおいて使用され得る。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんどかまたは全く有さずに、ED50を含む循環濃度の範囲内に入る。投与量は、使用される用量形態または使用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから見積もられ得る。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養物において決定されるIC50(すなわち、症状の最高阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように処方され得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【0297】
本明細書中に定義される場合、治療有効量のタンパク質またはポリペプチド(すなわち、有効投与量)は、約0.001〜30mg/体重1kg、好ましくは約0.01〜25mg/体重1kg、より好ましくは約0.1〜20mg/体重1kg、およびさらにより好ましくは約1〜10mg/体重1kg、2〜9mg/体重1kg、3〜8mg/体重1kg、4〜7mg/体重1kg、または5〜6mg/体重1kgの範囲にある。このタンパク質またはポリペプチドは、1週間に1回、約1〜10週間の間、好ましくは2〜8週間の間、より好ましくは3〜7週間、およびさらにより好ましくは約4週間、5週間または6週間投与され得る。当業者は、特定の因子が、被験体を有効に処置するために必要な投与量およびタイミングに影響し得ること、これらの因子としては、疾患または障害の重篤度、以前の処置、被験体の全身健康状態および/または被験体の年齢、および他に存在する疾患が挙げられるがこれらに限定されないことを、認識する。さらに、本明細書中に記載されるような、非結合体化または結合体化されている、治療有効量のタンパク質、ポリペプチド、または抗体での被験体の処置は、単一処置を含み得るか、または好ましくは、一連の処置を含み得る。
【0298】
抗体について、好ましい投与量は、0.1mg/体重1kg(一般的に、10mg/kg〜20mg/kg)である。抗体が脳において作用する場合、50mg/kg〜100mg/kgの投与量が、通常好ましい。一般的に、部分的ヒト抗体および完全なヒト抗体は、人体内で他の抗体より長い半減期を有する。従って、より低い投与量およびより少ない投与頻度が、しばしば可能である。改変(例えば、脂質化)は、抗体を安定化させ、そして取り込みおよび(例えば、脳への)組織浸透を強化するために使用され得る。抗体の脂質化のための方法は、Cruikshankら、((1997)J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193)によって記載される。
【0299】
本発明は、発現または活性を調節する薬剤を包含する。薬剤は、例えば低分子であり得る。例えば、このような低分子としては、ペプチド、ペプチド模倣物(ペプトイド)、アミノ酸、アミノ酸類似物、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似物、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似物、1モル当たり約10,000gより低い分子量を有する有機化合物または無機化合物(すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む)、1モル当たり約5,000gより低い分子量を有する有機化合物または無機化合物、1モル当たり約1,000gより低い分子量を有する有機化合物または無機化合物、1モル当たり約500gより低い分子量を有する有機化合物または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に受容可能な形態が挙げられるが、これらに限定されない。
【0300】
例示的な用量は、被験体1kgまたはサンプル1kg当たりのミリグラムまたはマイクログラム量の低分子を含む(例えば、約1μg/kg〜約500mg/kg、約100μg/kg〜約5mg/kg、または約1μg〜約50μg/kg)。さらに、低分子の適切な用量は、調節されるべき発現または活性という点で低分子の効力に依存する。1つ以上のこれらの低分子が本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために動物(例えば、ヒト)に投与される場合、医師、獣医師、または研究者は、例えば、まず相対的に低い用量を処方し、続いて適切な応答が得られるまで用量を増加し得る。さらに、任意の特定の動物被験体に対する特定の用量レベルが、使用される特定の化合物の活性、被験体の年齢、体重、全身健康状態、性別、および食事、投与時間、投与経路、排泄速度、任意の薬物の組み合わせ、ならびに調節されるべき発現または活性の程度を含む、種々の因子に依存することが理解される。
【0301】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与(米国特許第5,328,470号を参照のこと)または定位注射(例えば、Chenら、(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3054−3057を参照のこと)によって、被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞(例えば、レトロウイルスベクター)からインタクトに産生され得る場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する1つ以上の細胞を含み得る。
【0302】
薬学的組成物は、投与のための指示書と共に、容器、パック、またはディスペンサー中に含まれ得る。
【0303】
(処置方法)
本発明は、異常型または望まれないMID9002の発現または活性に関連する障害の危険性を有する(またはそれに対して感受性である)被験体もしくはその障害を有する被験体を処置する、予防法または治療法の両方を提供する。本明細書中に使用される場合、用語「処置」は、患者に対する治療剤の適用または投与、患者から単離された組織または細胞株に対する治療剤の適用または投与として定義され、この患者は、疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を有し、この目的は、その疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を、治療、回復、緩和、軽減、改変、矯正、寛解、改善するかまたはこれに影響を与えることである。治療剤としては、低分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【0304】
処置の予防法および治療法の両方に関して、このような処置は、薬理ゲノム学の分野から得られる知識に基づいて、特異的に合わせられるかまたは改変され得る。本明細書中で使用される場合、「薬理ゲノム学」は、臨床的開発および市場における薬物に対する、ゲノム技術(例えば、遺伝子配列決定)、統計遺伝学、および遺伝子発現分析の適用をいう。より具体的には、この用語は、患者の遺伝子が薬物に対するその患者の応答(例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」)をどのように決定するかの研究をいう。従って、本発明の別の局面は、個体の薬物応答遺伝子型に従って、本発明のMID9002分子またはMID9002調節因子のいずれかでの個体の予防処置または治療処置を調整するための方法を提供する。薬理ゲノム学は、臨床医または医師に、予防処置または治療処置を、最も治療の恩恵を受ける患者に対して向けさせ、そして毒性薬物関連副作用を受ける患者の処置を避け得るようにさせる。
【0305】
1つの局面において、本発明は、MID9002またはMID9002発現または少なくとも1つのMID9002活性を調節する薬剤を被験体に投与することによって、異常または望まれないMID9002の発現または活性に関連する疾患または状態を、被験体において予防する方法を提供する。異常または望まれないMID9002の発現または活性によって引き起こされるまたはそれに起因する疾患に対する危険性がある被験体は、例えば、本明細書中に記載されるような診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定され得る。予防剤の投与は、MID9002異常型に特徴的な症状の発症の前に行われ、その結果、疾患または障害は、予防されるか、あるいは、その進行が遅延される。MID9002の異常型に依存して、例えば、MID9002、MID9002アゴニストまたはMID9002アンタゴニスト剤が、被験体を処置するために使用され得る。適切な薬剤は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
【0306】
いくつかのMID9002障害は、異常なレベルの遺伝子産物または異常な活性を示す遺伝子産物の存在によって、少なくとも部分的に引き起こされ得ることが可能である。そういうものとして、このような遺伝子産物のレベルおよび/または活性の減少は、障害の症状の改善を引き起こす。
【0307】
このMID9002分子は、上記に記載される細胞増殖障害および/または細胞分化障害のうちの1つ以上を制御するための新規な診断標的および治療剤として作用し得る。本発明の分子はまた、骨代謝に関連する障害、免疫(例えば、炎症)障害、心血管障害、内皮細胞障害、肝障害、ウイルス疾患、疼痛障害および代謝障害のうちの1つ以上を制御するための新規な診断標的および治療剤としても作用し得る。
【0308】
細胞増殖障害および/または分化障害の例としては、癌(例えば、癌腫)、肉腫、転移障害または造血新形成障害(例えば、白血病)が挙げられる。転移腫瘍は、多くの原発性腫瘍型(前立腺起源、結腸起源、肺起源、乳房起源および肝臓起源が挙げられるが、これらに限定されない)から生じ得る。
【0309】
本明細書中で使用される場合、用語「癌」(用語「過剰増殖」および「新形成」と互換可能に使用される)は、自律増殖(すなわち、迅速に増殖する細胞増殖により特徴付けられる異常な状態または状況)についての能力を有する細胞を指す。癌性疾患状態は、病的と分類され得る(すなわち、疾患状態(例えば、悪性腫瘍増殖)を特徴付けるかまたは構成する)か、あるいは、非病的と分類され得る(すなわち、正常からの偏位であるが疾患状態と関連はない(例えば、創傷修復と関連する細胞増殖))。この用語は、すべての型の癌性増殖または癌原性プロセス、転移性組織または悪性形質転換細胞、悪性形質転換組織、もしくは悪性形質転換器官(組織病理型にも侵襲性の段階にも関わらない)を包含することになっている。この用語「癌」は、種々の器官系の悪性疾患(例えば、肺を冒す悪性疾患、乳房を冒す悪性疾患、甲状腺を冒す悪性疾患、リンパ腺を冒す悪性疾患、胃腸管を冒す悪性疾患および尿生殖器管を冒す悪性疾患)、ならびに腺癌(ほとんどの結腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および/または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌および食道の癌のような悪性疾患を包含する)を包含する。用語「癌腫」は、当該分野で認識されており、そしてこの用語は、上皮組織もしくは内分泌組織の悪性疾患(呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、および黒色腫を包含する)を指す。例示的癌腫としては、子宮頸部組織から形成する癌腫、肺組織から形成する癌腫、前立腺組織から形成する癌腫、乳房組織から形成する癌腫、頭部および頸部の組織から形成する癌腫、結腸組織から形成する癌腫、ならびに卵巣組織から形成する癌腫が挙げられる。用語「癌腫」はまた、例えば、癌性組織および肉腫性組織から構成される悪性腫瘍を含む、癌肉腫を包含する。「腺癌」とは、腺組織に由来する癌腫、または認識可能な腺構造をその腫瘍細胞が形成する癌腫をさす。用語「肉腫」は当該分野で認識されており、この用語は、間葉由来物の悪性腫瘍を指す。
【0310】
本発明のMID 9002分子は、種々の増殖障害をモニター、処置および/または診断するために使用され得る。そのような障害としては、造血性新形成障害が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「造血性新形成障害」は、造血起源の(例えば、骨髄系列、リンパ系列、もしくは赤血球系列、またはそれらの前駆細胞から生じる)過形成細胞/新形成細胞を含む疾患を包含する。好ましくは、この疾患は、ほとんど分化していない急性白血病(例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病)から生じる。さらなる例示的骨髄性障害としては、急性前骨髄球性白血病(APML)、急性骨髄性白血病(AML)および慢性骨髄性白血病(CML)(Vaickus(1991)Crit Rev.in Oncol./Hemotol.11.267〜97に概説される)が挙げられるが、これらに限定されない;リンパ球性悪性疾患としては、急性リンパ芽球性白血病(ALL)(B系列ALLおよびT系列ALLを包含する)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(PLL)、毛様細胞白血病(HLL)、およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症(WM)が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる悪性リンパ腫形態としては、非ホジキンリンパ腫およびその改変体、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、大型顆粒リンパ球白血病(LGF)、ホジキン病、およびリード−スターンバーグ病が挙げられるが、これらに限定されない。
【0311】
MID 9002分子の異常な発現および/または異常な活性は、骨代謝に関係する障害を媒介し得る。「骨代謝」とは、骨構造の形成または変性(例えば、骨形成、骨再吸収など)における、血清中のカルシウム濃度およびリン酸濃度に最終的に影響し得る、直接的効果または間接的効果を指す。この用語はまた、骨細胞(例えば、破骨細胞および骨芽細胞)においてMID 9002分子により媒介され、その後骨形成および骨変性を生じ得る、活性を包含する。例えば、MID 9002分子は、骨再吸収破骨細胞の種々の活性(例えば、単球および単核食細胞から破骨細胞への分化の刺激)を支持し得る。従って、骨細胞の産生を調節するMID 9002分子は、骨形成および骨変性に影響し得、従って骨障害を処置するために使用され得る。このような障害の例としては、骨粗鬆症、骨形成異常、骨軟化症、くる病、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常、骨硬化、鎮痙処置、骨減少症、不完全骨線維形成(fibrogenesis−imperfecta ossium)、続発性副甲状腺機能亢進、副甲状腺機能低下、上皮小体機能亢進、肝硬変、閉塞性黄疸、薬物誘発性代謝、髄様癌、慢性腎疾患、くる病、サルコイドーシス、グルココルチコイド拮抗、吸収不良症候群、脂肪便、熱帯性スプルー、特発性高カルシウム血症、および授乳熱が挙げられるが、これらに限定されない。
【0312】
本発明のMID 9002核酸およびタンパク質は、種々の免疫(例えば、炎症(例えば、呼吸器炎症))障害を処置および/または診断するために使用され得る。免疫障害または免疫疾患および炎症性障害または炎症性疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:自己免疫疾患(例えば、真性糖尿病、関節炎(慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む)、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎(アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む)、乾癬、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患(例えば、クローン病および潰瘍性大腸結腸)、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーヴズ病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎および間質性肺線維症が挙げられる)、対宿主移植片病、移植の症例、およびアレルギー(例えば、アトピー)。
【0313】
本明細書中で用いられる場合、心臓に関する障害、すなわち、「心血管疾患」または「心血管障害」は、心血管系(例えば、心臓、血管、および/または血液)に影響を与える、疾患または障害を包含する。心血管障害は、動脈圧力における不均等、心臓の機能不全、または(例えば、血栓による)血管の閉塞によって引き起こされ得る。心血管障害としては、例えば、以下のような障害が挙げられるがこれらに限定されない:動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心肥大、虚血再灌流障害、再狭窄、動脈炎症、血管壁再形成、心室再形成、迅速心室ペーシング、冠状微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧力過剰負荷、大動脈屈曲、冠状動脈結紮、脈管心臓病、弁の疾患(カルシウム沈着によって引き起こされる弁の変性、リウマチ性心疾患、心内膜炎、または人工弁の合併症が挙げられるがこれらに限定されない);心房性細動、長QT症候群(long−QT syndrome)、うっ血性心不全、洞房結節機能不全(sinus node dysfunction)、アンギナ、心不全、高血圧、心房性細動、心房粗動、心膜疾患(心内膜液浸出および心膜炎が挙げられるがこれらに限定されない);心筋症(例えば、拡張型心筋症または特発性心筋症)、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣、虚血性疾患、不整脈、突然の心臓死、および心血管発達障害(例えば、動静脈先天異常、動静脈瘻、レーノー症候群、神経性胸郭出口症候群、カウザルギー/反射性交感神経性ジストロフィー、血管腫、動脈瘤、海綿状様血管腫、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症、房室管、大動脈の縮窄、エブスタイン奇形、左心室発育不全症候群、大動脈弓の中断、僧帽弁逸脱、動脈管、開存性卵円孔、部分肺静脈還流異常(partial anomalous pulmonary venous return)、心室中隔欠損を伴う肺動脈弁閉鎖、心室中隔欠損を伴わない肺動脈弁閉鎖、胎児循環の存続、肺動脈弁狭窄、単心室、総肺静脈還流異常、大血管転位、三尖弁閉鎖、総動脈幹、心室中隔欠損)。心血管疾患または心血管障害はまた、内皮細胞障害を包含し得る。
【0314】
本明細書中で使用される場合、「内皮細胞障害」とは、異常な内皮細胞活性、調節されていない内皮細胞活性、または望ましくない内皮細胞活性(例えば、増殖、移動、新脈管形成、または血管新生)により特徴付けられる障害;あるいは細胞表面接着分子の異常な発現または新脈管形成に関連する遺伝子(例えば、TIE−2、FLTおよびFLK)の異常な発現により特徴付けられる障害を包含する。内皮細胞障害としては、腫瘍形成、腫瘍転移、乾癬、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、グレーヴズ病、虚血性疾患(例えば、アテローム性動脈硬化症)、および慢性炎症疾患(例えば、慢性関節リウマチ)が挙げられる。
【0315】
本明細書中に記載される方法により処置または診断され得る障害としては、肝臓における線維組織の蓄積に関係する障害(例えば、既存の線維の崩壊および変性を伴う細胞外マトリックスの生成と分解との間の不均衡から生じる障害)が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載される方法は、広範な種類の因子(ホメオスタシスを破壊するプロセス(例えば、炎症性プロセス)、毒性傷害から生じる組織損傷または肝血流の変化から生じる組織損傷、ならびに感染(例えば、細菌感染、ウイルス感染、および寄生生物感染)を含む)により誘導される肝細胞壊死または肝細胞傷害を診断または処置するために使用され得る。例えば、この方法は、肝傷害(例えば、門脈圧亢進または肝線維症)の早期検出のために使用され得る。さらに、この方法は、先天性代謝異常に起因する肝線維症(例えば、貯蔵障害(例えば、ゴシェ病(脂質異常)、またはグリコーゲン貯蔵病、A1−抗トリプシン欠損)から生じる線維症);外因性物質の蓄積(例えば、貯蔵)を媒介する障害(例えば、ヘモクロマトーシス(鉄過剰負荷症候群)および銅貯蔵病(ウィルソン病))、毒性代謝産物の蓄積を生じる障害(例えば、チロシン血症、果糖血症、およびガラクトース血症)、ならびにペルオキシソーム障害(例えば、ツェルヴェーガー症候群)を検出するために使用され得る。さらに、本明細書中に記載される方法は、種々の化学物質または薬物(例えば、メトトレキサート、イソニアジド(isonizaid)、オキシフェニサチン、メチルドパ、クロロプロマジン、トルブタミドまたはアルコール)の投与と関連する肝傷害、または脈管障害の肝徴候(例えば、肝臓内胆汁流もしくは肝臓外胆汁流のいずれかの閉塞、または例えば、慢性心不全、静脈閉塞疾患、門脈血栓症もしくはバッド−キアーリ症候群から生じる肝臓循環の変化)を示す肝傷害の早期検出および処置のために使用され得る。
【0316】
さらに、MID 9002分子は、特定のウイルス疾患(B型肝炎、C型肝炎、および単純ヘルペスウイルス(HSV)が挙げられるが、これらに限定されない)の病因において重要な役割を果たし得る。MID 9002活性の調節因子は、ウイルス疾患を制御するために使用され得る。この調節因子は、ウイルス感染組織またはウイルス関連組織線維症(特に、肝臓および肝臓線維症)の処置および/または診断において使用され得る。また、MID 9002調節因子は、ウイルス関連癌腫(特に、肝細胞癌)の処置および/または診断において使用され得る。
【0317】
さらに、MID 9002分子は、代謝障害または疼痛障害の調節において、重要な役割を果たし得る。代謝不均等の疾患としては、肥満症、神経性食欲不振、悪質液、脂質障害、および糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。疼痛障害の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:種々の形態の組織損傷(例えば、炎症、感染および虚血)の間に誘発される疼痛応答(通常、痛覚過敏と称される)(例えば、Fields,H.L.(1987)Pain,New York:McGraw−Hillに記載される);筋骨格障害に関連する疼痛(例えば、関節痛);歯痛;頭痛;手術に関連する疼痛;過敏性腸症候群に関連する疼痛;または胸部痛。
【0318】
議論されるように、MID 9002障害の首尾よい処置は、標的遺伝子産物の発現または活性を阻害する役目を果たす技術によって、もたらされ得る。例えば、ネガティブな調節性活性を示すことが証明されている化合物(例えば、上記のアッセイを使用して同定される因子)が、本発明に従って使用され、MID 9002障害の症状を予防および/または回復し得る。このような分子としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない:ペプチド、ホスホペプチド、有機低分子または無機低分子、あるいは抗体(例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、または単鎖抗体、ならびにFab、F(ab’)2およびFab発現ライブラリーフラグメント、scFV分子、ならびにそれらのエピトープ結合フラグメントを含む)。
【0319】
さらに、標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス分子およびリボザイム分子もまた、本発明に従って使用され、標的遺伝子発現レベルを低下させ得、それによって、標的遺伝子活性レベルは、効果的に減少される。なおさらに、三重らせん分子が、標的遺伝子活性レベルを低下させる際に利用され得る。アンチセンス分子、リボザイム分子および三重らせん分子は、上で議論されている。
【0320】
変異体遺伝子発現を低下または阻害するための、アンチセンス分子、リボザイム分子および/または三重らせん分子の使用もまた、正常な標的遺伝子の対立遺伝子によって産生されるmRNAの転写(三重らせん)および/または翻訳(アンチセンス、リボザイム)を低下または阻害し得、その結果、存在する正常な標的遺伝子産物の濃度が、正常な表現型で必要とされる濃度よりも低くあり得る可能性がある。このような場合、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子は、遺伝子治療法によって、細胞に導入され得る。あるいは、この標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする例において、正常な標的遺伝子タンパク質を、細胞または組織に同時に投与して、必要な細胞活性レベルまたは組織標的遺伝子活性レベルを維持することが、好ましくあり得る。
【0321】
核酸分子が、MID9002発現によって特徴付けられる疾患を処置または予防する際に利用され得る別の方法は、MID9002タンパク質に特異的なアプタマー分子の使用を介する。アプタマーは、タンパク質リガンドに特異的または選択的に結合することを可能にする、三次構造を有する核酸分子である(例えば、Osborneら、(1997)Curr.Opin.Chem Biol.1:5−9;およびPatel(1997)Curr Opin Chem Biol 1:32−46を参照のこと)。核酸分子は、多くの場合において、治療タンパク質分子が標的細胞に導入され得るよりも、より簡便に標的細胞に導入され得るので、アプタマーは、多能性効果を有し得る薬物または他の分子を導入することなく、MID9002タンパク質活性が特異的に低下し得る方法を提供する。
【0322】
標的遺伝子産物に特異的であり、かつ標的遺伝子産物活性を低下させる抗体が、作製され得る。従って、このような抗体は、ネガティブな調節技術が、MID9002障害の処置に適している場合に投与され得る。抗体の記載については、上記の抗体の節を参照のこと。
【0323】
抗体産生を刺激するために、MID9002タンパク質またはエピトープで、動物またはヒト被験体を注射することが、被験体に対して有害である環境下において、抗イディオタイプ抗体の使用によって、MID9002に対する免疫応答を生じさせることが可能である(例えば、Herlyn,D.(1999)Ann Med 31:66−78;ならびにBhattacharya−Chatterjee,M.およびFoon(1998)Cancer Treat Res.94:51−68を参照のこと)。抗イディオタイプ抗体が哺乳動物またはヒト被験体に導入される場合、MID9002タンパク質に特異的であるべき、抗−抗イディオタイプ抗体の産生が刺激されるはずである。MID9002発現によって特徴付けられる疾患に対するワクチンもまた、この様式で作製され得る。
【0324】
標的抗原が細胞内であり、かつ全抗体が使用される例において、内部移行抗体が好ましくあり得る。リポフェクチンまたはリポソームを使用して、標的抗原に結合するFab領域の抗体またはフラグメントを細胞内に送達し得る。抗体のフラグメントが使用される場合、標的抗原に結合する最小の阻害性フラグメントが、好ましい。例えば、抗体のFv領域に対応するアミノ酸配列を有するペプチドが、使用され得る。あるいは、細胞内標的抗原に結合する単鎖中和抗体もまた、投与され得る。このような単鎖抗体は、例えば、標的細胞集団内の単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現させることによって、投与され得る(例えば、Marascoら、(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889−7893を参照のこと)。
【0325】
標的遺伝子発現、合成および/または活性を阻害する、同定された化合物は、MID9002障害を予防、処置または回復するのに治療学的に有効な用量で、患者に投与され得る。治療学的に有効な用量とは、その障害の症状を回復させるのに十分な、化合物の量をいう。このような化合物の毒性および治療効果は、上記のような標準的な薬理学的手順によって、決定され得る。
【0326】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を処方する際に、使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど有さないかまたは全く有さないED50を含む循環濃度範囲内にある。投薬量は、用いられる投薬形態および用いられる投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療学的に有効な用量は、細胞培養アッセイから、最初に確立され得る。用量は、細胞培養物中で決定されるようなIC50(すなわち、症状の最大半減阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲に達するように、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定し得る。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、測定され得る。
【0327】
個体に対する有効な用量を決定する別の例は、試験被験体の血清中の「遊離」化合物および「結合」化合物のレベルを直接的にアッセイする能力である。このようなアッセイは、分子のインプリンティング技術によって作製される抗体模倣物および/または「バイオセンサ」を使用し得る。MID9002活性を調節し得る化合物は、テンプレート、または「インプリンティング分子」として使用され、この化合物の触媒試薬との重合化の前に、重合可能なモノマーを空間的に組織化する。インプリントされた分子のその後の除去は、化合物の繰り返し「ネガ(negative image)」を含むポリマーマトリクスを残し、そして生物学的アッセイ条件下で、分子に選択的に再結合することができる。この技術の詳細な総説は、Ansellら(1996)Current Opinion in Biotechnology 7:89−94およびShea(1994)Trends in Polymer Science 2:166−173において参照され得る。このような「インプリントされた」アフィニティーマトリクスは、リガンド結合アッセイに適合し、これによって、固定化モノクローナル抗体の構成要素は、適切にインプリントされたマトリクスによって置き換えられる。この方法における、このようなマトリクスの使用の例は、Vlatakisら(1993)Nature 361:645−647において参照され得る。同位体標識の使用によって、MID9002の発現または活性を調節する化合物の「遊離」濃度は、容易にモニタリングされ得、そしてIC50の算出に使用され得る。
【0328】
このような「インプリントされた」アフィニティーマトリクスはまた、光子放射特性が標的化合物の局在性および選択的結合によって測定可能に変化する蛍光群を含むように設計され得る。これらの変化は、適切な光ファイバーデバイスを使用し、次いで、試験被験体における用量を、その個々のIC50に基づいて迅速に最適化することによって、実時間で容易にアッセイされ得る。このような「バイオセンサ」の基本的な例は、Krizら(1995)Analytical Chemistry 67:2142−2144において議論されている。
【0329】
本発明の別の局面は、治療目的のための、MID9002発現または活性を調節する方法に関する。従って、例示的な実施形態において、本発明の調節方法は、細胞を、MID9002またはこの細胞に関連するMID9002タンパク質活性の1つ以上の活性を調節する因子と接触させる工程を包含する。MID9002タンパク質活性を調節する因子は、本明細書中に記載されるような因子(例えば、核酸またはタンパク質、MID9002タンパク質の天然に存在する標的分子(例えば、MID9002基質またはレセプター)、MID9002抗体、MID9002アゴニスまたはアンタゴニスト、MID9002アゴニストもしくはアンタゴニストのペプチド模倣物、または他の低分子)であり得る。
【0330】
1つの実施形態において、この因子は、1つ以上のMID9002活性を刺激する。このような刺激性因子の例としては、活性なMID9002タンパク質およびMID9002をコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この因子は、1つ以上のMID9002活性を阻害する。このような阻害因子の例としては、アンチセンスMID9002核酸分子、抗MID9002抗体、およびMID9002インヒビターが挙げられる。これらの調節方法は、インビトロにおいてか(例えば、この因子とともに細胞を培養することによって)、またはインビボにおいて(例えば、この因子を被験体に投与することによって)行われ得る。このように、本発明は、MID9002タンパク質または核酸分子の、異常なまたは望ましくない発現または活性によって特徴付けられる疾患または障害に罹患している個体を処置する方法を提供する。1つの実施形態において、この方法は、因子(例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される因子)、またはMID9002発現もしくは活性を調節する(例えば、アップレギュレートするかまたはダウンレギュレートする)因子の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、MID9002タンパク質または核酸分子を、低下した、異常なまたは望ましくないMID9002発現または活性を補償する治療として、投与する工程を包含する。
【0331】
MID9002活性の刺激は、MID9002が異常にダウンレギュレートする状況、および/またはMID9002活性の増加が有利な効果を有するようである状況において、望ましい。例えば、MID9002活性の刺激は、MID9002がダウンレギュレートする状況、および/またはMID9002活性の増加が有利な効果を有するようである状況において、望ましい。同様に、MID9002活性の阻害は、MID9002が異常にアップレギュレートする状況、および/またはMID9002活性の低下が有利な効果を有するようである状況において、望ましい。
【0332】
(薬理ゲノム学(pharmacogenomics))
本発明のMID9002分子、および因子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるような、MID9002活性(例えば、MID9002遺伝子発現)に対する刺激効果もしくは阻害効果を有するモジュレーターは、異常なMID9002活性または望ましくないMID9002活性に関連するMID9002関連障害(例えば、スルファターゼの異常な機能もしくは発現、またはスルファターゼの機能もしくは発現の欠損を含む))を(予防的にかまたは治療的に)処置するために、個体に投与され得る。このような処置とともに、薬理ゲノム学(すなわち、個体の遺伝子型と、外来性化合物もしくは薬物に対するその個体の応答との間の関係の研究)が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療不全を導き得る。従って、医師または臨床医は、MID9002分子を投与するかMID9002モジュレーターを投与するかを決定し、そしてMID9002分子またはMID9002モジュレーターでの処置における、投薬量および/または治療レジメンを変更する際に、関連する薬理ゲノム学研究において得られた知識を適用することを考慮し得る。
【0333】
薬理ゲノム学は、変更された薬物配置および罹患した個人の異常な活性に起因する薬物に対する応答における、臨床学的に有意な遺伝的変異を処置する。例えば、Eichelbaumら、(1996)Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23:983−985およびLinderら、(1997)Clin.Chem.43:254−266を参照のこと。一般に、2つの型の薬理ゲノム学条件は、異なり得る。遺伝的条件は、薬物が身体に作用する様式を変更する(変更された薬物作用)単一因子として普及したか、または遺伝的条件は、身体が薬物に作用する様式を変更する(変更された薬物代謝)単一因子として普及した。これらの薬理ゲノム学条件は、稀なゲノム欠損としてかまたは天然に存在する多型としてかの、いずれかとして生じ得る。例えば、グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠損(G6PD)は、一般的な遺伝性酵素病であり、ここで、主な臨床学的合併症は、酸化薬剤(抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン)の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
【0334】
「ゲノムワイドアソシエーション(genome−wide association)」として知られている、薬物応答を予測する遺伝子を同定するための、1つの薬理ゲノム学アプローチは、すでに知られているゲノム関連マーカー(例えば、「二座対立遺伝子」ゲノムマーカーマップ(これは、ヒトゲノム上の60,000〜100,000の多型または可変部位からなり、これらの各々が、2つの改変体を有する))からなるヒトゲノムの高解像度マップに、主に依存する。このような高解像度ゲノムマップは、特定の観察された薬物応答または副作用に関連したマーカーを同定するために、第II期/第III期の薬物試行に参加した統計学的に有意な数の患者の各々のゲノムのマップと比較され得る。あるいは、このような高解像度マップは、ヒトゲノムにおいて、数千万の公知の一塩基多型(SNP)の組み合わせから生じ得る。本明細書中で使用される場合、「SNP」は、DNAの伸張において、単一ヌクレオチド塩基において生じる一般的な変更である。例えば、SNPは、DNAの1000塩基毎に1回起こり得る。SNPは、疾患プロセスに関与し得るが、大部分は、疾患に関連し得ない。このようなSNPの発生に基づく遺伝マップが与えられると、個体は、個々のゲノムにおいて、SNPの特定のパターンに依存して、遺伝のカテゴリーに分類され得る。このような様式において、処置レジメンは、遺伝的に類似の個体の間で共通であり得る特性を考慮して、このようなゲノム学的に類似の個体の群に対して変更され得る。
【0335】
あるいは、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法は、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。この方法に従って、薬物の標的をコードする遺伝子が既知である場合(例えば、本発明のMID9002タンパク質)、その遺伝子の全ての共通の改変体は、その集団においてかなり容易に同定され得、そして別の遺伝子バージョンに対する1つの遺伝子バージョンが特定の薬物応答に関連するか否かが決定され得る。
【0336】
あるいは、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法が、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。例えば、薬物(例えば、本発明のMID9002分子またはMID9002モジュレーター)を投薬された動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路がオンになったか否かの指標を与え得る。
【0337】
1より多い上記薬理ゲノム学アプローチから得られる情報を使用して、個体の予防的処置または治療的処置のための、適切な投薬量および処置レジメンを決定し得る。この知識は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害反応または治療不全を回避し得、それによって、MID9002分子またはMID9002モジュレーター(例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイのうちの1つによって同定されるモジュレーター)で被験体を処置する場合、治療効果または予防効果を増強させる。
【0338】
本発明はさらに、本発明のMID9002遺伝子の1つ以上によってコードされる遺伝子産物の1つ以上の活性を調節する因子の同定に基づく、新たな因子、または組み合わせを同定するための方法を提供し、ここで、これらの産物は、治療因子に対する細胞の耐性に関連し得る。詳細には、本発明のMID9002遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は、因子の耐性を克服するために、因子を同定するための基礎として使用され得る。耐性タンパク質の1つ以上の活性をブロックすることによって、標的細胞(例えば、ヒト細胞)は、未改変標的細胞が耐性である因子を用いた処置に対して感受性になる。
【0339】
MID9002タンパク質の発現または活性に対する、因子(例えば、薬物)の影響のモニタリングが、臨床試験において適用され得る。例えば、MID9002遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたMID9002活性を増加させるために、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される因子の効果は、MID9002遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたMID9002活性の低下を示す被験体の臨床試験において、モニタリングされ得る。あるいは、MID9002遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたMID9002活性を低下させるために、スクリーニングアッセイによって決定される因子の効果は、MID9002遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたMID9002活性の増加を示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。このような臨床試験において、MID9002遺伝子の発現または活性、好ましくは、例えば、スルファターゼ関連障害またはMID9002関連障害に関与している他の遺伝子の発現または活性は、「読み出し(read out)」または特定の細胞の表現型のマーカーとして、使用され得る。
【0340】
(他の実施形態)
別の局面において、本発明は、複数の捕捉プローブの分析方法を特徴とする。この方法は、例えば、遺伝子発現を分析するのに有用である。この方法は、複数のアドレスを有する二次元アレイを提供する工程(複数のアドレスの各アドレスは、複数のアドレスの互いのアドレスと位置的に識別可能であり、複数のアドレスの各アドレスは、固有の捕捉プローブ(例えば、核酸またはペプチド配列)を有し、捕捉プローブは、MID 9002を発現する細胞または被験体由来であるかまたはMID 9002媒介応答が誘発される細胞または被験体由来である);このアレイをMID 9002核酸(好ましくは精製されたもの)、MID 9002ポリペプチド(好ましくは精製されたもの)、または抗MID 9002抗体と接触させる工程、およびそれによって複数の捕捉プローブを評価する工程、を包含する。結合(例えば、核酸の場合、複数のアドレスのうちの1つのアドレスにおける捕捉プローブとのハイブリダイゼーション)は、例えば、MID 9002核酸、MID 9002ポリペプチド、またはMID 9002抗体に結合された標識から生成されるシグナルによって検出される。
【0341】
捕捉プローブは、選択されたサンプル由来の核酸のセット(例えば、コントロールまたは未刺激組織もしくは細胞由来の核酸のサンプル)であり得る。
【0342】
この方法は、複数の捕捉プローブを有する第1のアレイおよび異なる複数の捕捉プローブを有する第2のアレイと、MID 9002核酸、MID 9002ポリペプチド、またはMID 9002抗体とを接触させる工程を包含し得る。各々のハイブリダイゼーションの結果は、例えば、第1のサンプルと第2のサンプルとの間の発現における差を分析するために比較され得る。第1の複数の捕捉プローブは、コントロールサンプル(例えば、野生型サンプル、正常サンプル、または非疾患サンプル、非刺激サンプル(例えば、生物学的流体サンプル、組織サンプル、または細胞サンプル))由来であり得る。第2の複数の捕捉プローブは、実験サンプル(例えば、変異型サンプル、危険サンプル、疾患状態サンプルもしくは障害状態サンプル、または刺激サンプル(例えば、生物学的流体サンプル、組織サンプル、または細胞サンプル))由来であり得る。
【0343】
複数の捕捉プローブは、複数の核酸プローブであり得、それらの各々は、MID 9002の対立遺伝子と特異的にハイブリダイズする。このような方法は、例えば、疾患または障害の危険を評価するために、被験体に対する選択された処置の感度を評価するために、被験体が疾患または障害を有するか否かを評価するために、被験体を診断するのに使用され得る。
【0344】
この方法は、上記のようにSNPを検出するのに使用され得る。
【0345】
別の局面において、本発明は、MID 9002を分析する(例えば、構造、機能または他の核酸配列もしくはアミノ酸配列との関連を分析する)方法を特徴とする。この方法は、MID 9002核酸配列またはMID 9002アミノ酸配列を提供する工程;MID 9002配列と、配列の集合(例えば、核酸またはタンパク質の配列データベース)からの1つ以上の(好ましくは複数の)配列とを比較する工程、を包含し、それによってMID 9002を分析する。
【0346】
この方法は、MID 9002配列とデータベース配列との間の配列同一性を評価する方法を包含し得る。この方法は、第2の位置の(例えば、インターネットを通じて)データベースにアクセスすることによって実施され得る。好ましいデータベースとしては、GenBankTMおよびSwissProtが挙げられる。
【0347】
別の局面において、本発明は、例えば、SNPを同定するのにまたはMID 9002の特定の対立遺伝子を同定するのに有用なオリゴヌクレオチドのセットを特徴とする。このセットは、複数のオリゴヌクレオチドを含み、その各々は、尋問位置(interrogation position)(例えば、SNPまたは変異部位)に異なるヌクレオチドを有する。好ましい実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、互いに配列において同一である(長さの差を除く)。オリゴヌクレオチドには、異なる標識が提供され得、その結果、1つの対立遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、第2の対立遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと識別可能なシグナルを提供する。
【0348】
MID 9002分子の配列は、その使用を容易にするため、種々の媒体において提供される。配列は、単離された核酸分子またはアミノ酸分子ではなく、MID 9002分子を含む製品として提供され得る。このような製品は、天然で存在するようにまたは精製された形態で、ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列、またはそのサブセットを試験するのに直接的に適用可能でない手段を用いる製品の試験を可能にする形式で、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列(例えば、オープンリーディングフレーム)を提供し得る。
【0349】
MID 9002ヌクレオチド配列またはMID 9002アミノ酸配列は、コンピュータ読み取り可能媒体に記録され得る。本明細書中で使用する場合、「コンピュータ読み取り可能媒体」は、コンピュータによって直接読み取りおよびアクセス可能な任意の媒体をいう。このような媒体としては、磁気記録媒体(例えば、フロッピー(登録商標)ディスク、ハードディスク記録媒体、および磁気テープ);光学記録媒体(例えば、コンパクトディスクおよびCD−ROM);電子記録媒体(例えば、RAM、ROM、EPROM、EEPROMなど);ならびに一般的なハードディスクおよびこれらのカテゴリーのハイブリッド(例えば、磁気/光学記録媒体)が挙げられるがこれらに限定されない。媒体は、その中に、本発明のMID 9002配列情報を有するよう適合または構成される。
【0350】
本明細書中で使用される場合、用語「電子装置」は、データもしくは情報を記録するために構成もしくは適合された他のデバイスの任意の適切な計算装置もしくは処理装置を包含するように意図される。本発明における使用に適切な電子装置の例としては、独立型計算装置;ネットワーク(ローカルエリアネットワーク(LAN)、ワイドエリアネットワーク(WAN)インターネット、イントラネット、およびエクストラネット(Extranet)を含む);電子アプライアンス(例えば、パーソナルディジタルアシスタント(PDA)、携帯電話、ポケットベルなど);ならびにローカル処理システムおよび分散処理システムが挙げられる。
【0351】
本明細書中で使用される場合、「記録される」とは、電子装置読取り可能媒体へと情報を記録またはコードするためのプロセスをいう。当業者は、公知の媒体に情報を記録してMID 9002配列情報を含む製品を作製するために現在公知の方法のいずれかを容易に採用し得る。
【0352】
本発明のMID 9002ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が記録されたコンピュータ読取り可能な媒体を作製するために、種々のデータ保存構造体が、当業者に利用可能である。データ保存構造体の選択は、一般に、保存される情報にアクセスするために選択される手段に基づく。さらに、種々のデータ処理プログラムおよび形式を用いて、本発明のヌクレオチド配列情報をコンピュータ読取り可能媒体に記録し得る。この配列情報は、ワード処理テキストファイルで表されてもよく、市販のソフトウェア(例えば、WordPerfectおよびMicrosoft Word)の形式にされてもよく、またはデータベースアプリケーション(例えば、DB2、Sybase、Oracleなど)に記録されるASCIIファイル形式で表されてもよい。当業者は、多数のデータ処理構造形式(例えば、テキストファイルまたはデータベース)を容易に採用して、本発明のヌクレオチド配列情報が記録されたコンピュータ読取り可能な媒体を作製し得る。
【0353】
本発明のMID 9002のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列をコンピュータ読取り可能な形式で提供することによって、当業者は、種々の目的でその配列情報に慣用的にアクセスし得る。例えば、当業者は、本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列をコンピュータ読取り可能な形式で用いて、標的配列または標的構築モチーフと、データ記憶手段内に記録された配列情報とを比較し得る。検索を用いて、特定の標的配列または標的モチーフと一致する、本発明の配列のフラグメントまたは領域を同定する。
【0354】
それゆえ、本発明は、被験体がスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害を有するかあるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対する素因を有するか否かを決定するための方法を実施するための指示書を保持するための媒体を提供し、ここで、この方法は、その被験体に関連したMID 9002配列情報を決定し、そしてこのMID 9002配列情報に基づいて、この被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害を有するか否かを決定する工程、ならびに/あるいはその疾患、障害または疾患前状態について特定の処置を推奨する工程を包含する。
【0355】
本発明はさらに、電子システムおよび/またはネットワークにおいて、被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害あるいはMID 9002に関連した疾患に対する素因を有するか否かを決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、その被験体に関連したMID 9002配列情報を決定し、そしてこのMID 9002配列情報に基づいて、この被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対する素因を有するか否かを決定する工程、ならびに/あるいはその疾患、障害または疾患前状態について特定の処置を推奨する工程を包含する。この方法はさらに、その被験体に関連した表現型情報を受け取る工程、および/またはネットワークから、その被験体に関連した表現型情報を獲得する工程を含み得る。
【0356】
本発明はまた、ネットワークにおいて、被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害に対する素因または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対する素因を有するか否かを決定するための方法を提供し、この方法は、MID 9002配列情報をこの被験体および/またはそれに関連した情報から受け取る工程、この被験体に関連した表現型情報を受け取る工程、このネットワークから、MID 9002に対応する情報および/あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対応する情報を獲得する工程、ならびにこの表現型情報、MID 9002情報(例えば、配列情報および/またはそれに関連した情報)、および獲得された情報のうちの1以上に基づいて、この被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害に対する素因または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対する素因を有するか否かを決定する工程を包含する。この方法は、この疾患、障害または疾患前状態について特定の処置を推奨する工程をさらに包含し得る。
【0357】
本発明はまた、被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害、あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害に対する素因または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対する素因を有するか否かを決定するためのビジネス方法を提供し、この方法は、MID 9002に関連する情報(例えば、配列情報および/またはそれに関連した情報)を受け取る工程、この被験体に関連した表現型情報を受け取る工程、このネットワークから、MID 9002に関連した情報および/あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に関連した情報を獲得する工程、ならびに、表現型情報、MID 9002情報、および獲得した情報のうちの1以上に基づいて、この被験体が、スルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害、あるいはスルファターゼ関連疾患もしくはスルファターゼ関連障害に対する素因または別のMID 9002関連疾患もしくは別のMID 9002関連障害に対する素因を有するか否かを決定する工程を包含する。この方法は、この疾患、障害または疾患前状態について特定の処置を推奨する工程をさらに包含し得る。
【0358】
本発明はまた、本発明のMID9002配列を含むアレイを含む。このアレイは、アレイ中の1つ以上の遺伝子の発現をアッセイするために使用され得る。1実施形態において、このアレイは、アレイ中の遺伝子の組織特異性を確認するために、組織における遺伝子の発現をアッセイするために使用され得る。この様式において、約7600個までの遺伝子を、発現について同時にアッセイし得、そのうちの1つがMID9002であり得る。このことは、1つ以上の組織において特異的に発現される遺伝子の組を示すプロファイルが作成されることを可能にする。
【0359】
このような定性的情報に加えて、本発明は、遺伝子発現の定量を可能にする。従って、組織特異性だけではなく、組織中の遺伝子の組の発現レベルもまた、確認され得る。従って、遺伝子は、その組織発現自体およびその組織における発現レベルに基づいて、分類され得る。これは、例えば、その組織における遺伝子発現の関連性を確認する際に有用である。従って、1つの組織が混乱され得、第二の組織における遺伝子発現に対するその影響が、決定され得る。この文脈において、生物学的刺激に応答した、別の細胞型に対する1つの細胞型の影響が決定され得る。この文脈において、生物学的刺激に応答した、別の細胞型に対する1つの細胞型の影響が決定され得る。このような決定は、例えば、遺伝子発現のレベルで、細胞−細胞相互作用の効果を知るために有用である。ある薬剤が、1つの細胞型を処置するために治療的に投与されるが、別の細胞型に対して望まれない影響を有する場合、本発明は、所望でない影響の分子基礎を決定するためのアッセイを提供し、従って、相殺する薬剤を同時投与する機会またはそうでなければ所望でない効果を処理する機会を提供する。同様に、単一細胞型内でさえ、所望でない生物学的効果が、分子レベルで決定され得る。従って、標的遺伝子以外の遺伝子の発現に対する薬剤の影響が、確認および相殺され得る。
【0360】
別の実施形態において、このアレイは、アレイ中の1つ以上の遺伝子の発現の時間過程をモニタリングするために使用され得る。これは、本明細書中に開示されるような種々の生物学的文脈(例えば、スルファターゼ関連または別のMID9002関連の疾患または障害の発症、スルファターゼ関連または別のMID9002関連の疾患または障害の進行、およびスルファターゼ関連または別のMID9002関連の疾患または障害に関連する細胞形質転換のようなプロセス)において生じ得る。
【0361】
このアレイはまた、同じ細胞または異なる細胞における他の遺伝子の発現に対する、ある遺伝子の発現の影響を確認するため(例えば、他の遺伝子の発現に対する、MID9002発現の影響を確認するため)に有用である。このことは、例えば、最終的な標的または下流の標的が調節され得ない場合に、治療的介入についての代替的分子標的の選択を提供する。
【0362】
このアレイはまた、正常細胞および異常細胞における1つ以上の遺伝子の差示的発現パターンを確認するために有用である。このことは、診断または治療的介入のための分子標的として作用し得る遺伝子の組(例えば、MID9002を含む)を提供する。
【0363】
本明細書中で使用する場合、「標的配列」は、6個以上のヌクレオチドの任意のDNA配列または2個以上のアミノ酸の任意のアミノ酸配列であり得る。当業者は、標的配列が長くなるほど、標的配列がデータベース中のランダムな存在として存在する可能性が低くなることを、容易に認識し得る。標的配列の代表的な長さは、約10〜100アミノ酸、または約30〜300ヌクレオチド残基である。しかし、商業的に重要なフラグメント(例えば、遺伝子発現およびタンパク質プロセシングに関与する配列フラグメント)は、より短い長さのものであり得ることが、充分認識される。
【0364】
分析および他の配列との比較のために、コンピュータ読出し可能な媒体中に提供される配列情報に、当業者がアクセスすることを可能にするコンピュータソフトウェアが、公に利用可能である。種々の公知のアルゴリズムが公に公開されており、そして検索手段を実行するための種々の市販のソフトウェアが、本発明のコンピュータベースのシステムにおいて使用され得る。このようなソフトウェアの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:MacPattern(EMBL)、BLASTNおよびBLASTX(NCBI)。
【0365】
従って、本発明は、コンピュータ読出し可能なマトリクスに配列を記録する工程を包含する、MID9002配列のコンピュータ読出し可能な配列の記録を作成する方法を特徴とする。好ましい実施形態において、この記録は、以下のうちの1つ以上を含む:ORFの同定;ドメイン、領域または部位の同定;転写開始の同定;転写ターミネーターの同定;タンパク質またはその成熟形態の全長アミノ酸配列;翻訳領域の5’末端。
【0366】
別の局面において、本発明は、配列を分析する方法を特徴とする。この方法は、以下:コンピュータ読出し可能な形態で、MID9002配列または記録を提供する工程;このMID9002配列に対して第二の配列を比較する工程を包含し、それによって、配列を分析する。比較は、配列の正体について配列と比較する工程、または1つの配列が他の配列内に含まれるか否かを決定する工程(例えば、MID9002配列が、比較される配列に含まれるか否かを決定する工程)を包含し得る。好ましい実施形態において、MID9002配列または第二の配列は、第一のコンピュータ(例えば、第一のサイト)に記憶され、そしてこの比較は、第二のコンピュータ(例えば、第二のサイト)で実施されるか、読み出されるか、または記録される。例えば、MID9002配列または第二の配列は、公に記憶され得るか、または1つのコンピュータ中の専有データベース中に記憶され得、そして比較の結果は、第二のコンピュータで実施されるか、読み出されるか、または記録される。好ましい実施形態において、記録は、以下のうちの1つ以上を含む:ORFの同定;ドメイン、領域または部位の同定;転写開始の同定;転写ターミネーターの同定;タンパク質またはその成熟形態の全長アミノ酸配列;翻訳領域の5’末端。
【0367】
本発明は、以下の実験によってさらに例示され、これらは、限定として解釈されるべきではない。
【0368】
(実験)
(遺伝子発現分析)
総RNAを、製造業者(TelTest,Inc.)の指示に従ってRNA STAT−60を使用して、単一工程の抽出によって、種々のヒト組織から調製した。各RNA調製物を、37℃で1時間にわたって、DNase I(Ambion)で処理した。内部アンプリコン参照としてβ−2ミクログロブリンを使用して、蛍光の閾値レベルに到達するために、サンプルが少なくとも38サイクルのPCR増幅を必要とした場合に、DNase I処理が完了したと決定した。DNase I処理後のRNAサンプルの完全性を、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色によって確認した。フェノール抽出後、cDNAを、製造業者(GibcoBRL)の指示に従ってSuperScriptTMChoice Systemを使用して、サンプルから調製した。逆転写酵素を有さないネガティブコントロールのRNAが、各RNAサンプルについての逆転写されたモックであった。
【0369】
ヒトMID9002発現を、種々の正常および疾患(例えば、癌性の)ヒト組織または細胞株から調製されたcDNAにおいて、TaqMan(登録商標)定量的PCR(Perkin Elmer Applied Biosystems)によって測定した。
【0370】
プローブを、ヒトMID9002遺伝子の配列に基づいて、PrimerExpressソフトウェア(PE Biosystems)によって設計した。各ヒトMID9002遺伝子プローブを、FAM(6−カルボキシフルオレセイン)を使用して標識し、そしてβ2−ミクログロブリン参照プローブを、異なる蛍光色素VICで標識した。従って、標的遺伝子および内部参照遺伝子の差示的標識化は、同じウェル中での測定を可能にした。β2−ミクログロブリンおよび標的遺伝子の両方についての順方向および逆方向のプライマーおよびプローブを、TaqMan(登録商標)Universal PCR Master Mix(PE Applied Biosystems)に添加した。プライマーおよびプローブの最終濃度は異なり得るが、各々が、所定の実験内では内的に一貫していた。代表的な実験は、200nMの順方向および逆方向のプライマー+β−2ミクログロブリンについてのプローブ100nM、ならびに600nMの順方向および逆方向のプライマー+標的遺伝子についてのプローブ200nMを含んだ。TaqManマトリックス実験を、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(PE Applied Biosystems)で実施した。サーマルサイクラーの条件は、以下の通りであった:50℃で2分間、そして95℃で10分間維持、次いで(95℃で15秒間次いで60℃で1分間)×40サイクルの、2工程PCR。
【0371】
以下の方法を使用して、同じ組織中のβ−2ミクログロブリン発現と比較して、種々の組織においてヒトMID9002遺伝子の発現を定量的に計算した。閾値サイクル(Ct)値を、蛍光における統計的に有意な増加が検出されるサイクルとして定義する。より低いCt値は、より高いmRNA濃度を示す。ヒトMID9002遺伝子のCt値を、β−2ミクログロブリン遺伝子のCt値を差し引くことによって正規化し、以下の式を使用してΔCt値を得る:ΔCt=Ctヒト59914および59921−Ctβ−2ミクログロブリン。次いで、発現を、比較的低いレベルのヒトMID9002遺伝子の発現を示すcDNAサンプルに対して較正する。次いで、標準サンプルについてのΔCt値を、以下の式に従って、各組織サンプルについてのΔCtから差し引く:ΔΔCt=ΔCt−サンプル−ΔCt−標準。次いで、相対的な発現を、2−ΔΔCtによって与えられる演算式を使用して較正する。次いで、試験した各組織中の標的ヒトMID9002遺伝子の発現を、以下により詳細に考察されるように、グラフにより示す。
【0372】
これらの結果は、腎臓、膵臓、脊髄神経節、結腸および肝臓、ならびに結腸癌における有意なMID9002発現を示す(以下の表を参照のこと)。
【0373】
【表1】
【0374】
【表2】
【0375】
【表3】
【0376】
【表4】
【0377】
【表5】
本願を通じて引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【0378】
(等価物)
当業者は、慣用的にすぎない実験を使用して、本明細書中に記載される発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するかまたは確認し得る。
【図面の簡単な説明】
【0379】
【図1a】図1a〜1dは、ヒトMID9002のcDNA配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。ヒトMID9002のメチオニンで開始するオープンリーディングフレーム(配列番号1の5’非翻訳領域および3’非翻訳領域を含まない)もまた、コード配列として示される(配列番号3)。シグナル配列が除去されたこのタンパク質の成熟形態が、配列番号4として示される。
【図1b】図1a〜1dは、ヒトMID9002のcDNA配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。ヒトMID9002のメチオニンで開始するオープンリーディングフレーム(配列番号1の5’非翻訳領域および3’非翻訳領域を含まない)もまた、コード配列として示される(配列番号3)。シグナル配列が除去されたこのタンパク質の成熟形態が、配列番号4として示される。
【図1c】図1a〜1dは、ヒトMID9002のcDNA配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。ヒトMID9002のメチオニンで開始するオープンリーディングフレーム(配列番号1の5’非翻訳領域および3’非翻訳領域を含まない)もまた、コード配列として示される(配列番号3)。シグナル配列が除去されたこのタンパク質の成熟形態が、配列番号4として示される。
【図1d】図1a〜1dは、ヒトMID9002のcDNA配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。ヒトMID9002のメチオニンで開始するオープンリーディングフレーム(配列番号1の5’非翻訳領域および3’非翻訳領域を含まない)もまた、コード配列として示される(配列番号3)。シグナル配列が除去されたこのタンパク質の成熟形態が、配列番号4として示される。
【図2】図2は、ヒトMID9002のヒドロパシープロットを示す。比較的疎水性の残基が、水平な点線の上にある。比較的親水性の残基が、水平な点線の下にある。システイン残基(cys)が、ヒドロパシートレースの直下に短い垂直線により示される。ヒトMID9002のアミノ酸配列に対応する数が、示される。本発明のポリペプチドは、以下:疎水性配列のすべてまたは一部(例えば、点線の上の配列、例えば、配列番号2のアミノ酸およそ1〜22の配列、配列番号2のアミノ酸およそ32〜45の配列、配列番号2のアミノ酸およそ185〜248の配列、配列番号2のアミノ酸およそ265〜275の配列、配列番号2のアミノ酸およそ282〜300の配列、配列番号2のアミノ酸およそ428〜438の配列、および配列番号2のアミノ酸およそ566〜575の配列);親水性配列のすべてまたは一部(例えば、点線の下の配列、例えば、配列番号2のアミノ酸およそ50〜70の配列、配列番号2のアミノ酸およそ145〜193の配列、配列番号2のアミノ酸およそ250〜265の配列、配列番号2のアミノ酸およそ275〜285の配列、配列番号2のアミノ酸およそ315〜325の配列、配列番号2のアミノ酸およそ345〜385の配列、配列番号2のアミノ酸およそ435〜450の配列、配列番号2のアミノ酸およそ455〜470の配列、配列番号2のアミノ酸およそ505〜515の配列、および配列番号2のアミノ酸およそ525〜545の配列;Cysまたはグリコシル化部位を含む配列を含む、フラグメントを包含する。
【図3】図3は、ヒトMID9002のスルファターゼドメインと、PFAMからの隠れMarkovモデル(HMM)から誘導されたコンセンサスアミノ酸配列とのアライメントを示す。上側の配列は、コンセンサスアミノ酸配列(配列番号X)であり、一方、下側のアミノ酸配列は、配列番号2のアミノ酸38〜520に対応する。
【図4】図4a〜fは、ヒトMID9002アリールスルファターゼドメインと、ProDomainデータベースから誘導したドメインのコンセンサスアミノ酸配列(「Arylsulfatase hydrolase」、No.PD001700、PD006857,PD208511,PD002587,PD345058,PD004614,PD335606,PD105130,PD013467,PD013468,PD016856;ProDomain Release 2001.1;http://www.toulouse.inra.fr/prodom.hyml)とのBLASTアライメントを示す。下側の配列は、ProDomainデータベースからのコンセンサス配列のアミノ酸残基であり、一方上側のアミノ酸配列は、ヒトMID9002のアリールスルファターゼドメインまたはその一部に相当する。このBLASTアルゴリズムは、このコンセンサスアミノ酸配列とヒトMID9002との間の多重局所アライメントを同定する。
【図5】図5は、ヒトMID9002とヒトアリールスルファターゼE前駆体(ARSE;Genbank P51690中の登録番号)とのGAPアライメントを示す。この図の上側の配列は、ヒトMID9002(配列番号2)のアミノ酸68〜1834であり、一方、下側の配列は、ARSE(P51690)(配列番号X)のアミノ酸1〜589である。GAPアライメントは、blosum62.iijからのmatblasにより作製されたマトリックスを使用する。
Claims (9)
- 病理学的障害に関連する核酸分子を同定するための方法であって、該方法は、以下:
a)核酸分子を含むサンプルを、配列番号1または3の少なくとも25連続するヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブと接触させる工程;および該プローブにハイブリダイズする該サンプル中の核酸分子の存在を検出する工程、ならびに
b)核酸分子を含むサンプルを、第一の増幅プライマーおよび第二の増幅プライマーと接触させる工程であって、該第一のプライマーは、配列番号1または3の少なくとも25連続するヌクレオチドを含み、そして該第二のプライマーは、配列番号1または3の相補体由来の少なくとも25連続するヌクレオチドを含む、工程;核酸増幅を可能にする条件下で該サンプルをインキュベートする工程;ならびに該サンプル中の増幅された核酸分子の存在を検出する工程、
からなる群より選択され、それによって、病理学的障害に関連する核酸分子を同定する、
方法。 - 病理学的障害に関連するポリペプチドを同定する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)ポリペプチドを含むサンプルを、9002結合物質と接触させる工程;および
b)該9002結合物質に結合する、該サンプル中のポリペプチドの存在を検出する工程を包含し、
それによって病理学的障害に関連するポリペプチドを同定する、方法。 - 病理学的障害を有するか、あるいは病理学的障害を発症する危険性のある被験体を同定する方法であって、該方法は、以下:
a)該被験体から得られた、核酸分子を含むサンプルを、配列番号1または3の少なくとも25連続するヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブと接触させる工程;および該プローブにハイブリダイズする、該サンプル中の核酸分子の存在を検出する工程;ならびに
b)該被験体から得られた、核酸分子を含むサンプルを、第一の増幅プライマーおよび第二の増幅プライマーと接触させる工程であって、該第一のプライマーは、配列番号1または3の少なくとも25連続するヌクレオチドを含み、そして該第二のプライマーは、配列番号1または3の相補体由来の少なくとも25連続するヌクレオチドを含む、工程;核酸増幅を可能にする条件下で該サンプルをインキュベートする工程;ならびに該サンプル中の増幅された核酸分子の存在を検出する工程、
からなる群より選択され、それによって、病理学的障害を有するか、あるいは病理学的障害を発症する危険性のある被験体を同定する、
方法。 - 病理学的障害を有するか、あるいは病理学的障害を発症する危険性のある被験体を同定する方法であって、該方法は、以下:
a)該被験体から得たポリペプチドを含むサンプルを、9002結合物質と接触させる工程;および
b)該9002結合物質に結合する、該サンプル中のポリペプチドの存在を検出する工程を包含し、
それによって、病理学的障害を有するか、あるいは病理学的障害を発症する危険性のある被験体を同定する、方法。 - 異常な9002ポリペプチド活性または異常な9002核酸発現によって特徴付けられる病理学的障害を有する被験体、あるいは該病理学的障害を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に9002調節因子を投与する工程を包含し、それによって、該病理学的障害を有する被験体を処置する、方法。
- 前記調節因子が、有機低分子、ペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記病理学的障害が、癌、細胞増殖障害および異常な新脈管形成に関連する障害からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 9002ポリペプチドに結合する薬剤を検出する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)有機低分子、ペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体からなる群より選択される薬剤を合わせる工程;ならびに
b)該9002ポリペプチドに対する薬剤の結合に適切な条件下で、該薬剤と該9002ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出または測定する工程、
を包含し、それによって、該9002ポリペプチドに結合する薬剤を同定する、方法。 - 前記薬剤が、9002ポリペプチド活性の調節因子である、請求項7に記載の方法。
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