ES2566641T3 - Células que co-expresan una enzima que genera a una sulfatasa y una C-formiliglicina y sus métodos y usos - Google Patents

Células que co-expresan una enzima que genera a una sulfatasa y una C-formiliglicina y sus métodos y usos Download PDF

Info

Publication number
ES2566641T3
ES2566641T3 ES10182644.4T ES10182644T ES2566641T3 ES 2566641 T3 ES2566641 T3 ES 2566641T3 ES 10182644 T ES10182644 T ES 10182644T ES 2566641 T3 ES2566641 T3 ES 2566641T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
fge
sulfatase
msd
gene
sumf1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES10182644.4T
Other languages
English (en)
Inventor
Kurt Von Figura
Bernhard Schmidt
Thomas Dierks
Michael W Heartlein
Andrea Ballabio
Maria Pia Cosma
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shire Human Genetics Therapies Inc
Original Assignee
Shire Human Genetics Therapies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shire Human Genetics Therapies Inc filed Critical Shire Human Genetics Therapies Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2566641T3 publication Critical patent/ES2566641T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y108/00—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8)
    • C12Y108/99—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8) with other acceptors (1.8.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
    • C12Y301/06013—Iduronate-2-sulfatase (3.1.6.13)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)

Abstract

Una célula que expresa conjuntamente una sulfatasa y una enzima generadora de Cα-formilglicina (FGE - Cα-formylyglycine generating enzyme) para que la sulfatasa activada sea producida; donde la célula comprende ADN o ARN heterólogo que resulta en una expresión incrementada de la sulfatasas activadas en relación a lo que ocurriría en la ausencia del ADN o ARN heterólogo; Y donde el FGE es un polipéptido con una actividad generadora de Cα-formiliglicina que: a) Tiene una secuencia seleccionada de un grupo que consiste de las IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NÚMEROS 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, o los aminoácidos 34-374 de la IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL NÚMERO 2; o b) Tiene por lo menos el 50% de identidad secuencial de la IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL NÚMERO 2; o c) Tiene una o más mutaciones conservadoras de aminoácidos en relación a un polipéptido tal como se describió en a) o b) d) Es un fragmento de un polipéptido tal como se describió en desde a) a c); o e) Es una proteína de fusión de cualquiera de la a) a la d).

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
imagen7
imagen8
imagen9
imagen10
imagen11
imagen12
imagen13
imagen14
imagen15
imagen16
imagen17
imagen18
imagen19
imagen20
imagen21
imagen22
utilizado. Los residuos 87-367 de la FGE están listados en la base de datos de motivos proteínicos PFAM como un dominio de una función desconocida (PFAM: DUF323). Un análisis de comparación secuencial de la FGE humana y sus ortólogos procariotas identificados en las bases de datos indican que este dominio es compuesto de 3 sub dominios diferentes.
5 Es un dominio de la terminal de N (los residuos 91-154 en la FGE humana) tiene una identificación secuencial del 46% y una similitud del 79% dentro de los 4 ortólogos de la FGE eucariota conocidos. En la FGE humana, este dominio porta el lugar de N-glicosilación en el Asn 141, que es conservado en otros ortólogos. La parte media de la FGE (los residuos 179-308 en la FGE humana) es representada por un sub -dominio rico en triptófano (12
10 triptófanos por 129 residuos). La identidad de los ortólogos procariotas dentro de este sub -dominio es el 57%, la similitud es del 82%. El sub -dominio de la terminal C (residuos 327-366 en laFGE humana) es la secuencia más altamente conservada dentro de la familia de las FGEs. La identidad secuencial del sub -dominio de la terminal C humana con los ortólogos eucariotas (3 secuencias de longitud completa y 8 ESTs) es del 85%, la similitud es del 97%. Dentro de los 40 residuos del sub -dominio 3, 4 residuos de cisteína son conservados completamente. 3 de
15 las cisteínas también son conservadas en los ortólogos FGE procariotas. Los 12 miembros procariotas de la familia de la FGEs (para detalles refiérase al ejemplo 2) comparten la estructura del sub -dominio con FGEs procariotas. Los límites entre los 3 sub -dominios son más evidentes en la familia de las FGEs procariotas debido a que las secuencias no conservadas de longitudes variables que separan a los sub -dominios entre sí. Los genomas de humanos y de ratones codifican 2 homólogos que se relacionan de cerca a la FGE (IDENTIFICACIONES
20 SECUENCIALES NÚMEROS: 43 y 44, cuenta del GenBank (Banco Genético) número NM_015411, en el hombre, y las IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NÚMEROS: 45 y 46, cuenta del GenBank (Banco Genético) número AK076022, en el ratón). Los 2 parálogos son 86% idénticos. Sus genes están ubicados en regiones sintéticas cromosómicas (7q11 en humanos, 5G1 en ratones). Los 2 parálogos comparten con los ortólogos de la FGE la estructura del sub -dominio y son 35% idénticos y tienen un 47% de similitud a la FGE humana. En el 3er sub
25 dominio, que es 100% idéntico en ambos homólogos, falta la cisteína que contiene a una secuencia de un oligómero de 11 subunidades (undecamer) del sub -dominio 3.
Expresión, localización sub -celular y formas moleculares
30 Una sola transcripción de 2.1 kb es detectable por el análisis de Northern blot del ARN total de los fibroblastos de la piel y de poli A+ ARN del corazón, del cerebro, de la placenta, de los pulmones, del hígado, del músculo esquelético, del riñón y del páncreas. En relación al ARN de β-actina la abundancia varía por una orden de magnitud y es más alta en el páncreas y en el riñón y más baja en el cerebro. Varias líneas celulares procariotas o que expresan transitoriamente a la ADNc de la FGE humana o de derivados de la FGE extendidos en la terminal C por una
35 marcación HA-, Myc-o His6 fueron puestos en ensayos para detectar su actividad FGE y su localización sub celular de la FGE. La expresión transitoria de la FGE marcada y no marcada incrementó la actividad de la FGE en unas 1.6-3.9 veces. La expresión estable de la FGE en las células PT67 incrementó la actividad de la FGE en alrededor de 100 veces. La detección de la forma marcada de la FGE por una inmunofluorescencia indirecta en células BHK 21, CHO, y HT1080 mostró una co -localización de varias formas de la FGE marcadas con isomerasas
40 de proteindisulfuro, una proteína luminosa del retículo endoplásmico. Un análisis de Western blot de los extractos de las células BHK 21 transfectadas transitoriamente con la ADNc que codifica a formas marcadas de la FGE mostró una sola banda inmuno -reactiva con un tamaño aparente entre los 42 y los 44 kDa.
El gen de la FGE porta mutaciones en MSD
45 La MSD es causada por una deficiencia para generar residuos de FGly en la sulfatasas (Schmidt, B., et al., Cell (Célula), 1995, 82:271-278). El gen de la FGE es, por lo tanto, un gen candidato para la MSD. Amplificamos y secuenciamos a la ADNc que codifica a la FGE de 7 pacientes de MSD y encontramos 10 mutaciones diferentes que fueron confirmadas al secuenciar al ADN genómico (tabla 1).
50
Tabla 1: mutaciones en pacientes de MSD
55
24
5
15
25
Mutación
Efecto en la Proteína Observaciones Paciente
1076C>A
S359X Truncamiento de 16 residuos de la terminal C 1*
IVS3+5-8 del
Eliminación de los residuos 149-173 -Eliminación en el marco del exón 3 1,2
979C>T
-R327X -Pérdida del sub -dominio 3 2
1045C>T
R349W Sustitución de un residuo conservado en el sub -dominio 3 -3.7
1046G>A
R349Q --Sustitución de un residuo conservado en el sub -dominio 3 4
1006T>C
C336R Sustitución de un residuo conservado en el sub -dominio 3 4
836C>T
A279V Sustitución de un residuo conservado en el sub -dominio 2 5
243delC
Cambio de marco y truncamiento Pérdida de todos los 3 sub -dominios 5
661delG
Cambio de marco y truncamiento Pérdida de la terminal C de la FGE incluyendo a sub -dominio 3 6**
-IVS6-1G>A
Eliminación de los residuos 281-318 - Eliminación en el marco del exón 7 5
*El paciente 1 es el paciente con MSD en Schmidt, B., et al., Cell (célula), 1995, 82:271-278 y Rommerskirch y von Figura, Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos de América, 1992, 89:2561-2565. **El paciente 6 es el paciente con MSD reportado por Burk et al., J. Pediatr., 1984, 104:574-578. Los otros pacientes representan casos no publicados.
Para confirmar la deficiencia de las FGEs como la causa de la inactividad de sulfatasas sintetizadas en MSD, expresamos a la ADNc de las FGE en fibroblastos MSD utilizando una transferencia genética retroviral. Como un control, traducimos al vector retroviral sin una inserción de la ADNc. Para monitorear la complementación del defecto metabólico de la actividad de ASA, de la sulfatasa esteroide (STS -steroid sulfatase) y de la 6-sulfatasa Nacetilgalactosamina (GalNAc6S -N-acetylgalactosamine 6-sulfatase) fueron medidas en los fibroblastos transdúcidos antes o después de la selección. La transducción de la FGE de tipo silvestre restauró parcialmente la actividad catalítica de las 3 sulfatasas en 2 líneas celulares de MSD (tabla 2) y para STS en una 3ª línea celular de MSD. Debe tomarse en cuenta que para ASA y GalNAc6S la restauración fue únicamente parcial después de la
35 selección de los fibroblastos reaccionando a un 20-50% de su actividad normal. Para STS, se descubrió que la actividad fue restaurada a los niveles de los fibroblastos de control después de la selección. La selección incrementó la actividad de ASA y de STS por un 50 a 80% lo cual es compatible con la observación mencionada anteriormente de que un 15 a 50% de los fibroblastos se vuelven transducidos (Lübke et al., Nat. Gen., 2001, 28:73-76). Las actividades de las sulfatasas en los fibroblastos de MSD transducidos con el vector retroviral individualmente (tabla 2) fueron comparables a aquellos en los fibroblastos de MSD que no fueron transducidos (no se muestra). La transducción de la ADNc de la FGE que porta a la mutación IVS3+5-8del no pudo restaurar las actividades de la sulfatasas (tabla 2).
Tabla 2: Complementación de los fibroblastos de MSD por medio de una transducción de la ADNc de la FGE 45 de tipo silvestre o mutante
Fibroblastos Inserción FGE
Sulfatasa ASA1 STS1 Go]NAc6S1
MSD 3*
▪ 1.9 ± 0.2 <3 56.7 ± 32
FGE+
7.9 13.5 n.d.
FGE++
12.2 ± 0.2 75.2 283 ± 42
FGE-IVS3+5-8del+
1.8 <3 n.d.
FGE-IVS3+5-8del++
2.1 <3 98.5
MSD 4°
▪ 1.1 ± 0.3 <3 n.d.
FGE+
4.7 17.0 n.d.
Fibroblastos de control
58 ± 11 66 ± 31 828 ± 426
1 los valores dan una tasa de entre ASA (mU/miligramos de proteína celular), STS (µU/miligramos de proteína celular), GalNAc6S (µU/mg de proteína celular) y aquella de β-hexosaminidasa (U/mg de proteína celular). Para los fibroblastos de control la media y la variación de las líneas celulares 6-11 está dada. En los casos en que se indica, el rango de 2 cultivos traducidos en paralelo es dado para los fibroblastos de MSD. ▪ El número de fibroblastos de MSD se refiere a aquel del paciente en la tabla 1. + Determinación de la actividad previo a la selección. ++ Determinación de la actividad después de la selección. n.d.: No fue determinado
25
imagen23
imagen24
desconocida”, PF03781) con un valor esperado altamente significativo de 7:9.10-114. La semilla PFAM que define a DUF323 consiste de 25 secuencias proteínicas, de las cuales la mayoría son proteínas hipotéticas derivadas de datos de secuenciación. Para analizar la relación entre la FGE humana y DUF323, se realizó una alineación múltiple de la FGEs con las secuencias de la semilla DUF323. Basándose en esto, un árbol filogenético fue construido y 5 completado. 4 de las secuencias hipotéticas (TrEMBL-IDs Q9CK12, Q9I761, 094632 y Q9Y405) tuvieron una divergencia tan fuerte de los otros miembros de la siembra que evitaron una construcción exitosa y tuvieron que ser removidas del conjunto. La figura 2 muestra el árbol construido mostrando la relación entre la FGE humana y las 21 proteínas de semillas restantes de DUF323. El árbol puede ser utilizado para subdividir a los miembros de la siembra en 2 categorías: homólogos relacionados muy de cerca con la FGE humana y el resto, los genes menos
10 relacionados.
Las 7 proteínas superiores tienen una distancia filogenética de entre 0.41 y 0.73 a la FGE humana. Contienen un solo dominio, DUF323. La homología dentro de este grupo se extiende sobre toda la secuencia de aminoácidos, la mayor parte de la cual consiste del dominio DUF323. El dominio DUF323 es fuertemente conservado dentro de este 15 grupo de homólogos, mientras que las otras 15 proteínas de la siembra son menos relacionadas a la FGE humana (la distancia citogenética es de entre 1.14 y 1.93). El sub -dominio DUF323 diverge considerablemente del dominio altamente conservado DUF323 del primer grupo (sección cf. “Sub -dominios de la FGE y mutaciones del gen de la FGE”). La mayoría de estas 15 proteínas son hipotéticas, 6 de ellas han sido investigadas más. Una de ellas, una quinasa de serina/treonina (TrEMBL:O84147) de C. trachomatis contiene otros dominios adicionalmente a DUF323: 20 un dominio de enlaces ATP y un dominio de quinasas. Las secuencias de la R. sphaeroides (TrEMBL: Q9ALV8) y la Pseudomonas sp.(TrEMBL: 052577) codifican a la proteína NirV, un gen co-transcrito con la reductasa de nitrito que contienen cobre nirK (Jain, R. y Shapleigh, J., Microbiology (Microbiología), 2001, 147:25052515). CarC (TrEMBL: Q9XB56) es una oxigenasa involucrada en la síntesis de un antibiótico P-lactámico de la E. carotovora (McGowan, S., et al., Mol Microbial (Microbiana), 1996, 22:415-426; Khaleeli N, T. C., y Busby RW, 25 Biochemistry (Bioquímica), 2000, 39:8666-8673). XylR (TrEMBL: 031397) y BH0900 (TrEMBL: Q9KEF2) son proteínas mejoradoras de enlaces involucradas en la regulación de la utilización de la pentosa (Rodionov, D., et al., FEMS Microbiol Lett., 2001, 205:305-314) en la bacillaceae y la clostridiaceae. La comparación de la FGE y del DUF323 conllevó al establecimiento de un umbral homológico diferenciador de la familia de las FGEs de los homólogos distantes que contienen DUF323 con funciones diferentes. Estos incluyen una quinasa de serina/treonina
30 y XylR, un mejorador de transcripciones, así como la FGE, una enzima generadora de FGly y CarC, una oxigenasa. Tal como se mencionó en otras secciones de este documento, la FGE podría ejercer además su función calificadora de cisteína como una oxigenasa, sugiriendo que los miembros de la FGE y los no miembros de la FGE de las semillas DUF323 podrían compartir una función de oxigenasa.
35 Homólogos de la FGE
La presencia de los homólogos relacionados de cerca a la FGE humana en las semillas DUF323 nos orientaron para buscar homólogos de la FGE humana en la base de datos NR de NCBI (Wheeler et al., Nucleic Acids (Ácidos Nucleicos) Res., 2002, 20:13-16). El umbral de la búsqueda fue escogido de tal forma que todos los 6 homólogos
40 presentes en la siembra de DUF323 y otros homólogos con una relación muy cercana fueron obtenidos sin encontrar los otros miembros de la siembra. Esta búsqueda conllevó a la identificación de 3 ortólogos de la FGE en eucariotas, 12 ortólogos en procariotas y 2 parálogos en el hombre y en el ratón (tabla 3).
45 Tabla 3: La familia genética de la FGEs en eucariotas y procariotas
50
55
28
5
15
25
IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NÚMEROS: NA, AA [GI]
ESPECIES LONGITUD [AA] SUBGRUPO
1/3, 2
Homo sapiens 374 E1
49, 50 [22122361]
Mus musculus 372f E1
51, 52 [20130397]
Drosophila melanogaster 336 E1
53, 54 [21289310]
Anopheles gambiae 290 E1
47, 48 [26344956]
Mus musculus 308 E2
45, 46 [24308053]
Homo sapiens 301 E2
55, 56 [21225812]
Streptomyces coelicolor A3(2) 314 P1
7, 58 [25028125]
Corynebacterium efficiens YS-314 334 P1
59, 60 [23108562]
Novosphingobium aromaticivorans 338 P2
61, 62 [13474559]
Mesorhizobium loti 372 P2
63, 64 [22988809]
Burkholderia fungorum 416 P2
65, 66 [16264068]
Sinorhizobium meliloti 303 P2
67, 68 [14518334]
Microscilla sp. 354 P2
69, 70 [26990068]
Pseudomonas putida KT2440 291 P2
71, 72 [22975289]
Ralstonia metallidurans 259 P2
73, 74 [23132010]
Prochlorococcus marinus 291 P2
75, 76 [16125425]
Caulobacter crescentus CB 15 338 P2
77, 78 [15607852]
Mycobacterium tuberculosis Ht37Rv 299 P2
GI-identificador proteínico del GenBank (Banco Genético protein identifier) NA-ácido nucleico (nucleic acid) AA – aminoácidos E1 -ortólogos eucariotas E2 – parálogos eucariotas P1 -ortólogos procariotas relacionados de cerca P2 -otros ortólogos procariotas f-secuencia proteínica pronosticada erróneamente en el GenBank (Banco Genético)
Nótese que la secuencia de ratón GI 22122361 es pronosticada en el Gen Bank (Banco Genético) para codificar una proteína de 284 aa, aunque la secuencia de la ADNc NM 145937 codifica a una proteína de 372 residuos. Este pronóstico erróneo se basa en la omisión del primer exón del gen de la FGE de ratones. Todas las secuencias encontradas en la base de datos de NR son de eucariotas o procariotas de más alto nivel. Los homólogos de la FGE
35 no fueron detectados en las arqueobacterias o las plantas. Búsquedas con umbrales aún más bajos en genomas completamente secuenciados de las C. elegans y S. cerevisiae y las bases de datos ORF relacionadas no revelaron ningún homólogo. Una búsqueda en las secuencias eucariotas de la base de datos de nucleótidos NT y EST conllevó a la identificación de 8 ESTs ortólogos adicionales de la FGE con fragmentos secuenciales de ADNc de terminal de 3’ que muestran un nivel más alto de concentración en el nivel proteínico que no están listados en la base de datos NR. Estas secuencias no abarcan toda la parte calificadora de las ARNms y todas son de eucariotas más elevadas (tabla 4).
Tabla 4: Fragmentos EST ortólogos de la FGE en eucariotas
45
55
IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NÚMEROS: NA [GB]
ESPECIES
80 [CA379852]
Oncorhynchus mykiss
81 [AI721440]
Danio rerio
82 [BJ505402]
Oryzias latipes
83 [BJ054666]
Xenopus laevis
84 [AL892419]
Silurana tropicalis
85 [CA064079]
Salmo salar
86 [BF189614]
Sus scrofa
87 [AV609121]
Bos taurus
GB -acceso al GenBank (Banco Genético) número; NA -ácido nucleico (nucleic acid)
Alineaciones y construcciones múltiples de un árbol filogenético (utilizando ClustalW) de las secuencias codificadoras de la base de datos NR permitieron la definición de 4 subgrupos de homólogos: ortólogos eucariotas (FGEs humanos, de ratón, de mosquito y de mosca de frutas), parálogos eucariotas (parálogos de la FGE de humanos y de ratones), ortólogos procariotas relacionados de cerca a la FGE (Streptomyces y Corynebacterium) y otros ortólogos procariotas (Caulobacter, Pseudomonas, Mycobacterium, Prochlorococcus, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Novosphingobium, Ralstonia, Burkholderia, y Microscilla). Los ortólogos eucariotas muestran una identidad general en contraste con las FGE humanas de un 87% (ratón), un 48% (mosca de fruta) y un 47% (el anofeles). Aunque los ortólogos de la FGE se encuentran en procariotas y en eucariotas de más alto nivel, estas no 65 están presentes en los genomas completamente secuenciados de eucariotas de más bajo nivel situados genéticamente entre el S. cerevisiae y D. melanogaster. Adicionalmente, los homólogos de la FGE están ausentes
29
imagen25
imagen26
imagen27
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
miligramos/litros de BSA, 0.1 por ciento de Tritón X-100, pH 4.5). 10 µl de cada muestra de I2S fue agregada a la fila superior de una placa Fluorométrica de 96 pozos (Perkin Elmer, Norwalk, CT) y pre-incubada durante 15 minutos a 37 °C. El sustrato fue preparado al disolver sulfato de 4-metil-umbelliferilo (Fluka, Buchs, Suiza) en un amortiguador de sustrato (5 mM de acetato de sodio, 0.5 miligramos/mililitros de BSA, pH 4.5) a una concentración final de 1.5 mg/mililitro. 100 µl de sustrato fueron agregados a cada pozo que contenía la muestra de I2S y la placa fue incubada durante una hora a 37 °C en la oscuridad. Después de su incubación 190 µl de amortiguador de parada (332.5 mM de lisina, 207.5 mM de carbonato de sodio, pH 10.7) se agregó a cada pozo que contenía la muestra. Se preparó 4metilumbeliferona normal (4-MUF, Sigma, St. Louis, MO) como el producto estándar en agua de grado reactivo a una concentración final de 1 µM. 150 µl de 1 µM de 4-MUF normal y 150 µl de amortiguador de parada fueron agregados a un pozo de la fila superior en la placa. 150 µl de amortiguador de parada fueron agregados a cada pozo restante en la placa de 96 pozos. Diluciones seriales de 2 veces fueron hechas a partir de la fila superior de cada columna hasta la última fila de la placa. La placa fue leída en un analizador de micro platos de fusión universal (Packard, Meriden, CT) con una longitud de onda de un filtro de excitación de 330 nm y una longitud de onda de un filtro de emisión de 440 nm. Se generó una curva estándar de micromoles de 4-MUF normal vs. fluorescencia, y se extrapolaron muestras no conocidas a partir de esta curva. Los resultados son reportados como unidades/mililitros donde 1 U de actividad fue igual a 1 µmol de 4-MUF producido por minuto a 37 °C.
6-sulfatasa de N-Acetilgalactosamina (GALNS -N-Acetylgalactosamine 6-Suffatase). El ensayo de la actividad de GALNS aprovecha el sustrato fluorescente 4-metilumbelliferil-β-D-galactopiranósido-6-sulfato (Toronto Research Chemicals Inc., catálogo No.M33448). El ensayo fue conformado de 2 pasos. En el primer paso, 75 µl de 1.3 mM del sustrato preparado en reacción con el amortiguador (0.1M de acetato de sodio, 0.1 M de cloruro de sodio, pH 4.3) fue incubado durante 4 horas a 37 °C con 10 µl del medio/la muestra proteínica o sus diluciones correspondientes. La reacción fue detenida al agregar 5 µl de 2M de fosfato de sodio monobásico para inhibir la actividad de la GALNS. Después de la adición de aproximadamente 500 U de β-galactosidasa de Aspergillus oryzae (Sigma, Catalogue No. G5160), la mezcla de la reacción fue incubada a 37 °C durante una hora adicional para liberar la partícula fluorescente del sustrato. La 2ª reacción fue detenida al agregar 910 µl de una solución de parada (1% de glicina, 1% de carbonato de sodio, pH 10.7). La fluorescencia de la mezcla resultante fue medida utilizando una longitud de onda de medición de 359 nm y una longitud de onda referencial de 445 nm con 4-metilumbeliferona (sal de sodio de Sigma, Catalogue No. M1508) que sirvió como un estándar referencial. 1 U de la actividad corresponde a nmoles de la 4-metilumbeliferona liberada por hora.
Inmunoensayos (ELISA)
2-sulfatasa de iduronato (I2S). Una placa de fondo plano de 96 pozos fue cubierta con un anticuerpo anti-I2S monoclonal de ratón diluido a 10 µg/mililitros en 50 nM de bicarbonato de sodio, pH 926 durante una hora a 37 °C. El anticuerpo anti-I2S monoclonal de ratón fue desarrollado bajo contrato por Maine Biotechnology Services, Inc. (Portland, ME) a un polipéptido I2S humano de longitud completa producido recombinantemente y purificado utilizando tecnología estándar productora de hibridomas. La placa fue lavada 3 veces con 1X PBS que contenía 0.1 por ciento de Tween-20 y bloqueada durante una hora con un 2% de BSA en un amortiguador de lavado a 37 °C. El amortiguador de lavado con un 2% de BSA fue utilizado para diluir las muestras y los estándares. El estándar de I2S fue diluido y utilizado desde 100 ng/mililitros a 1.56 nanogramos/mililitros. Después de la remoción del amortiguador de bloqueo, las muestras y los estándares fueron aplicados a la placa e incubados durante una hora a 37 °C. El anticuerpo de detección, un anticuerpo anti-I2S de ratón conjugado con peroxidasa de rábano, se diluyó 0.15 microgramos/mililitros en un amortiguador de lavado con un 2% de BSA. La placa fue lavada 3 veces, detectando los anticuerpos agregados a la placa, y fue incubada durante 30 minutos a 37 °C. Para desarrollar la placa, se preparó sustrato de TMB (Bio-Rad, Hercules, CA). La placa fue lavada 3 veces, se agregaron 100 µl de sustrato a cada pozo y fue incubado durante 15 minutos a 37 °C. La reacción fue detenida con 2 N de ácido sulfúrico (100 µl/pozo) y la placa fue leída en un lector de placas de micro titulación a 45 nm, utilizando 655 nm como la longitud de onda referencial. 6-sulfatasa de N-Acetilgalactosamina (GALNS). 2 anticuerpos anti-GALNS monoclonales suministraron la base para la ELISA de GALNS. Los anticuerpos anti-GALNS monoclonales de ratón también fueron desarrollados bajo contrato por Maine Biotechnology Services, Inc. (Portland, ME) a un polipéptido de GALNS humano de longitud completa producido recombinantemente y purificado utilizando tecnología estándar de producción de hibridomas. El primer anticuerpo, para la captura de GALNS fue utilizado para cubrir una placa F96 MaxiSorp Nunc-Immuno (Nalge Nunc, catálogo No. 442404) en un amortiguador de recubrimiento (50 mM de bicarbonato de sodio, pH. 6). Después de una incubación durante una hora a 37 °C y de lavarse con un amortiguador de lavado, la placa fue bloqueada con un amortiguador de bloqueo (PBS, 0.05% de Tween-20, 2% de BSA) durante una hora a 37 °C. Muestras experimentales y de control junto con los estándares de GALNS fueron cargados entonces en una placa e incubados aún más durante una hora a 37 °C. Después de lavarse con un amortiguador de lavado, el 2º anticuerpo de detección conjugado a HRP fue aplicado en un amortiguador de bloqueo seguido por 30 minutos de incubación a 37 °C. Después de lavarse la placa nuevamente, el reactivo del sustrato Bio-Rad TMB fue agregado e incubado durante 15 minutos. 2N de ácido sulfúrico fue agregado entonces para detener la reacción y los resultados fueron calificados utilizando espectrofotometría por medio de un dispositivo molecular lector de placas a una longitud de onda de 450 nm.
Debate
33
imagen28
imagen29
5
10
15
20
25
Caso
referencia fenotipo exón cambio de nucleótidos cambio de aminoácidos
1. BA426. 2. BA428 3. BA431 4. BA799 5. BA806 6. BA807 7. BA809 8. BA810 9. BA811 10. BA815 11. BA919 12. BA920
Conary et al, 1988 Burch et al, 1986 Zenger et al, 1989 Burk et al, 1981 No publicado Schmidt et al, 1995 Couchot et al, 1974 No publicado No publicado No publicado No publicado No publicado Moderado Neonatal severo Moderado Leve-moderado Neonatal severo Desconocido Leve-moderado Severo Neonatal severo Moderado Leve-moderado Moderado 3 3 5 1 2 3 3 9 3 9 1 9 3 8 5 6 9 9 5 9 463T>C 463T>C 661delG 2T>G 276delC 463T>C 463T>C 1045T>C c519+4delGTAA ex 3 1076C>A 1A>G 1042G>C 1006T>C 1046G>A c519+4delGTAAex 3 979C>T c.603-6delC 836C>T 1033C>T 1033C>T 653G>A 1033C>T S155P S155P Cambio de marco M1R cambio de marco S155P S155P R349W Saltando S359X MIV A348P C336R R349Q Saltando R327X Ex 6 saltando A279V R345C R345C C218Y R345C
Se identificaron mutaciones en cada paciente con MSD que fue examinado, excluyendo por lo tanto heterogeneidades de locus. Ninguna correlación obvia fue observada entre los tipos de mutaciones identificadas y la severidad del fenotipo reportado en los pacientes, sugiriendo que una variabilidad clínica no es causada por la 30 heterogeneidad de los alelos. En 3 instancias en pacientes diferentes (caso 1 y 4, caso 6 y 9, y el caso 11 y 12 en la tabla 6) se descubrió que portaban la misma mutación. 2 de estos pacientes (el caso 11 y 12) tuvieron origen en el mismo pueblo en Sicilia, sugiriendo la presencia de un efecto fundador que fue confirmado en efecto por un análisis de haplotipos. Sorpresivamente, se descubrió que la mayoría de pacientes eran heterocigotos de compuestos, portando diferentes mutaciones de alelos, mientras que sólo unos pocos fueron homocigotos. Aunque fue
35 consistente con la ausencia de consanguinidad reportada por los padres, este fue un hallazgo algo inesperado para una enfermedad recesiva muy rara tal como la MSD.
El gen y la proteína de la FGE
40 La secuencia de consenso de la ADNc de la FGE humana (también utilizados intercambiablemente en este documento como SUMF1) (IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL NÚMERO: 1) fue armada de algunos clones de marcaciones (EST) secuenciales expresadas y parcialmente de la secuencia genómica correspondiente. El gen contiene 9 exones y se expande aproximadamente por 105 kb (refiérase al ejemplo 1). La comparación secuencial también identificó la presencia de un parálogo genético de la FGE en el cromosoma humano 7 que lo designamos,
45 FGE2 (también utilizado intercambiablemente en este documento, SUMF2) (las IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NÚMEROS: 45, 46).
Complementación funcional de las deficiencias de sulfatasas
50 Fibroblastos de los pacientes (caso 1 y 12 en la tabla 8) con MSD en quienes identificamos mutaciones del gen FGE (SUMF1) (líneas celulares BA426 y BA920) fueron infectadas con virus HSV que contenían formas de tipo silvestre y 2 formas mutadas de la ADNc de la FGW (SUMF1) (R327X y ∆ex3). Las actividades de ARSA, ARSB, y ARSC fueron probadas 72 horas después de la infección. La expresión de la ADNc de FGE (SUMF1) de tipo silvestre resultó en una complementación funcional de las 3 actividades, mientras que en las ADNcs de FGE (SUMF1)
55 mutantes no ocurrió eso (tabla 9). Esta información suministró evidencia concluyente de la identidad de la FGE (SUMF1) puesto que el gen de la MSD y estas prueban una relevancia funcional de las mutaciones encontradas en los pacientes. Éstas mutaciones asociadas con la enfermedad resultan en una deficiencia de sulfatasas, demostrando de esta forma que la FGE (SUMF1) es un factor esencial para la actividad de las sulfatasas.
60 Tabla 9: Complementación funcional de deficiencia de sulfatasas
36
imagen30
5
15
25
35
45
55
65
deficiencias en la MSD (Schmidt, B., et al., Cell (Célula), 1995, 82:271-278). Nuestra información de mutaciones y de funciones suministra una evidencia fuerte de que la FGE (SUMF1) es responsable de esta modificación.
El gen de la FGE (SUMF1) muestra un nivel extremadamente alto de conservación secuencial a lo largo de todas las especies relacionadas distantemente que fueron analizadas, desde las bacterias hasta el hombre. Suministramos evidencia de que el homólogo de la Drosophila en el gen de la FGE (SUMF1) humana es capaz de activar sulfatasas humanas sobre-expresadas, probando que el alto nivel observado de similitud secuencial de los genes de la FGE (SUMF1) de especies relacionadas distantemente tiene una correlación con una conservación funcional impresionante. Una excepción notable es la levadura, que parece no tener al gen de la FGE (SUMF1) así como cualquier gen codificador de sulfatasas, indicando que la función de la sulfatasas no es requerida por este organismo y sugiriendo la presencia de una influencia recíproca en la evolución de los genes de la FGE (SUMP1) y de la sulfatasas.
Interesantemente, existen 2 genes homólogos, la FGE (SUMF1) y la FGE2 (SUMF2), en los genomas de todos los vertebrados analizados, incluyendo a los humanos. Tal como resulta evidente del árbol filogenético, el gen de la FGE2 (SUMF2) parece haber evolucionado independientemente del gen de la FGE (SUMF1). En nuestros ensayos el gen de la FGE (SUMF2) también puede activar sulfatasas, sin embargo, lo hace en una forma mucho menos eficiente en comparación con el gen de la FGE (SUMF1). Esto podría explicar la actividad residual de sulfatasas que se encuentra en los pacientes con MSD y sugiere que una deficiencia completa de sulfatasas sería letal. En este momento, no podemos descartar la posibilidad de que el gen de la FGE2 (SUMF2) tiene una función adicional pero que todavía desconocida.
Impacto de la terapia de enfermedades debido a las deficiencias de sulfatasas
Un fuerte incremento (de hasta 50 veces, de las actividades de sulfatasas fueron observadas en las células que sobre expresaban a la ADNc de la FGE (SUMF1) junto con los ADN es de ARSA, ARSC, o ARSE, en comparación con las células que sobre expresaban una sola sulfatasa individual. En todas las líneas celulares, un efecto sinérgico significativo fue encontrado, indicando que la FGE (SUMF1) es un factor limitante para la actividad de la sulfatasas. Sin embargo, se observó una variabilidad entre las diferentes sulfatasas, debido, posiblemente, a afinidades diferentes de la proteína codificada por la FGE (SUMF1) con las varias sulfatasas. También se observó una variabilidad entre diferentes líneas celulares que podrían tener diferentes niveles de enzimas generadoras de formilglicina endógena. Consistente con estas observaciones, hemos encontrado que la expresión del gen de la MSD varía entre diferentes tejidos, con niveles significativamente altos en los riñones y en el hígado. Esto podría tener implicaciones importantes puesto que los tejidos con bajos niveles de expresión genética de FGE (SUMF1) podrían ser menos capaces de modificar efectivamente a proteínas de sulfatasas entregadas exógenamente (refiérase a secciones posteriores de este documento). Toda esta información sugiere que la función del gen de la FGE (SUMF1) ha evolucionado para lograr un sistema regulatorio dual, en la que cada sulfatasa está siendo controlada por un mecanismo individual, responsable de los niveles de ARNm de cada gen de sulfatasas estructurales, y un mecanismo compartido y común de toda la sulfatasas. Adicionalmente, la FGE2 (SUMF2) suministra una redundancia parcial para la modificación de las sulfatasas.
Esta información tiene implicaciones profundas para la producción en masa de sulfatasas activas que serían utilizadas en las terapias de reemplazo enzimático. Los estudios de reemplazo enzimático han sido reportados en modelos animales de deficiencia sulfatasas, tales como un modelo felino de mucopolisacaridosis VI, que demostró ser efectivo para prevenir y curar algunos síntomas. Ensayos terapéuticos en humanos se están realizando actualmente para 2 enfermedades congénitas debido a deficiencias de sulfatasas, el MPSII (síndrome de Hunter) y MPSVI (el síndrome de Maroteaux-Lamy) y pronto se extenderá a un número grande de pacientes.
Ejemplo 5:
Terapia de reemplazo enzimático con GALNS activada por FGE para la enfermedad de Morquio MPS IVA
La causa principal de la patología esquelética en pacientes de la enfermedad de Morquio es la acumulación del queratán sulfato (KS -keratan sulfate) en los condrocitos disco fisis (cartílago de crecimiento) debido a deficiencias de las sulfatasas de los liposomas, GALNS. El objetivo principal de los estudios de investigación in vivo es determinar si es que la administración intravenosa (IV) de GALNS activadas por la FGE es capaz de penetrar a los condrocitos del ligamento de crecimiento así como otros tipos celulares apropiados en ratones normales. Sin importar, la falta general de anormalidades esqueléticas, un modelo de ratón deficientes de GALNS (Morquio Knock-In -MKI, S. Tomatsu, St. Louis University, MO) también fue utilizado para demostrar la actividad bioquímica in vivo de una administración repetitiva de GALNS activados por la FGE. La falta de patología esquelética en modelos de ratones refleja el hecho de que la KS esquelética ha sido reducida en una forma importante o está ausente en los roedores (Venn G, & Mason RM., Biochem J., 1985, 228:443-450). Estos ratones, sin embargo, demostraron una acumulación detectable de GAG y otras anormalidades celulares en varios órganos y tejidos. Por lo tanto, el objetivo general de los estudios fue el demostrar que las GALNS activadas por FGEs penetran al ligamento de crecimiento (estudio de bio-distribución) y muestran una actividad enzimática funcional de GALNS hacia la remoción de GAGs acumulados en los tejidos afectados (estudio fármaco -dinámico).
38
imagen31

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
    imagen3
ES10182644.4T 2003-02-11 2004-02-10 Células que co-expresan una enzima que genera a una sulfatasa y una C-formiliglicina y sus métodos y usos Expired - Lifetime ES2566641T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44774703P 2003-02-11 2003-02-11
US447747P 2003-02-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2566641T3 true ES2566641T3 (es) 2016-04-14

Family

ID=32869644

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10182644.4T Expired - Lifetime ES2566641T3 (es) 2003-02-11 2004-02-10 Células que co-expresan una enzima que genera a una sulfatasa y una C-formiliglicina y sus métodos y usos
ES10182740.0T Expired - Lifetime ES2555056T3 (es) 2003-02-11 2004-02-10 Diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas y otras usando una enzima generadora de formilglicina (FGE)
ES04709824T Expired - Lifetime ES2380147T3 (es) 2003-02-11 2004-02-10 Diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas y otras usando una enzima generadora de formilglicina(FGE)

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10182740.0T Expired - Lifetime ES2555056T3 (es) 2003-02-11 2004-02-10 Diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas y otras usando una enzima generadora de formilglicina (FGE)
ES04709824T Expired - Lifetime ES2380147T3 (es) 2003-02-11 2004-02-10 Diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas y otras usando una enzima generadora de formilglicina(FGE)

Country Status (18)

Country Link
US (4) US8227212B2 (es)
EP (3) EP1592786B8 (es)
JP (3) JP5241101B2 (es)
CN (4) CN103055306B (es)
AT (1) ATE534730T1 (es)
AU (2) AU2004210936C1 (es)
CA (1) CA2515708A1 (es)
CY (1) CY1117346T1 (es)
DK (2) DK2325302T3 (es)
ES (3) ES2566641T3 (es)
HK (3) HK1090088A1 (es)
HU (1) HUE027210T2 (es)
MX (2) MX345056B (es)
NZ (4) NZ570201A (es)
PT (1) PT1592786E (es)
SI (1) SI2325302T1 (es)
WO (1) WO2004072275A2 (es)
ZA (1) ZA200506378B (es)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE534730T1 (de) * 2003-02-11 2011-12-15 Shire Human Genetic Therapies Diagnose und behandlung von multiplen sulfatase- erkrankungen und anderen mit hilfe eines formylglycin bildenden enzyms
US8741260B2 (en) * 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
EP2051734B1 (en) 2006-08-18 2016-10-05 Armagen Technologies, Inc. Agents for blood-brain barrier delivery
US7985783B2 (en) * 2006-09-21 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
CA2694762A1 (en) * 2007-07-27 2009-02-05 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing alpha-l-iduronidase activity in the cns
RU2499599C2 (ru) 2007-09-28 2013-11-27 Интрексон Корпорейшн Конструкции терапевтического переключения генов и биореакторы для экспрессии биотерапевтических молекул и их применение
DK2245145T3 (en) 2008-01-18 2017-03-20 Biomarin Pharm Inc PREPARATION OF ACTIVE STRENGTH PHOSPHORIALLY HUMAN LYSOSOMAL SULPHATASE ENZYMES AND APPLICATIONS THEREOF
US7722865B2 (en) 2008-01-18 2010-05-25 Biomarin Pharmaceutical Inc. Manufacture of active highly phosphorylated human lysosomal sulfatase enzymes and uses thereof
US8729232B2 (en) * 2008-03-27 2014-05-20 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
US9238878B2 (en) 2009-02-17 2016-01-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
EP2408474B1 (en) 2009-03-18 2019-06-26 Armagen, Inc. Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of igg-decoy receptor fusion proteins
US20120315244A1 (en) 2009-09-30 2012-12-13 President And Fellows Of Harvard College Methods for Modulation of Autophagy Through the Modulation of Autophagy-Inhibiting Gene Products
PL2485761T3 (pl) * 2009-10-09 2019-10-31 Armagen Inc Sposoby i kompozycje do zwiększania aktywności 2-sulfatazy iduronianu w cns
US8351868B2 (en) * 2009-11-20 2013-01-08 Motorola Solutions, Inc. Radio status indicator
EP2394667A1 (en) 2010-06-10 2011-12-14 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Vectors and sequences for the treatment of diseases
AR082319A1 (es) 2010-07-22 2012-11-28 Biomarin Pharm Inc Produccion de una n-acetilgalactosamina-6-sulfatasa humana activa altamente fosforilada y sus usos
KR20140016262A (ko) 2011-01-14 2014-02-07 레드우드 바이오사이언스 인코포레이티드 알데하이드-태깅된 면역글로불린 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
WO2012101671A1 (en) 2011-01-25 2012-08-02 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of human recombinant iduronate 2-sulfatase
KR101158673B1 (ko) 2011-06-24 2012-07-03 주식회사 지씨바이오 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타아제를 포함하는 조성물, 제제 및 이의 제조방법
US20160145589A1 (en) 2011-06-24 2016-05-26 Green Cross Corporation Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof
EP4338797A2 (en) 2011-12-02 2024-03-20 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
JP6124439B2 (ja) 2011-12-20 2017-05-10 Ｊｃｒファーマ株式会社 ホルミルグリシン残基の分析法
WO2013148323A1 (en) * 2012-03-30 2013-10-03 Shire Human Genetic Therapies Methods of analyzing and preparing protein compositions
EP2830642B1 (en) 2012-03-30 2019-08-28 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Subcutaneous administration of iduronate- 2-sulfatase
US9150841B2 (en) * 2012-06-29 2015-10-06 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase
US20140004097A1 (en) * 2012-06-29 2014-01-02 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Method of producing recombinant iduronate-2-sulfatase
KR101380740B1 (ko) 2012-06-29 2014-04-11 쉐어 휴먼 제네텍 세러피스, 인코포레이티드 이듀로네이트-2-설파타제의 정제
WO2014016873A1 (en) 2012-07-26 2014-01-30 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of recombinant human alpha-galactosidase a
JP6692293B2 (ja) * 2013-07-22 2020-05-13 アーマジェン・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ， Ｉｎｃ． Ｃｎｓにおける酵素活性を増大するための方法および組成物
EP3912635A1 (en) * 2014-07-11 2021-11-24 Biostrategies LC Materials and methods for treating disorders associated with sulfatase enzymes
MA41198A (fr) 2014-12-18 2017-10-24 Shire Human Genetic Therapies Essais d'activité enzymatique pour i2s
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
WO2016116966A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins
WO2016121715A1 (ja) * 2015-01-26 2016-08-04 国立大学法人名古屋大学 肺がん患者の予後を評価するための情報を提供する方法、肺がん患者の予後予測方法、内部標準、抗体、肺がん患者の予後予測装置、予後予測装置のプログラム及び記録媒体
CA2973343C (en) 2015-02-05 2023-08-08 R.P. Scherer Technologies, Llc Activated formylglycine-generating enzymes and methods of producing and using the same
WO2017189432A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
EP3519569B1 (en) * 2016-09-30 2020-12-02 Esteve Pharmaceuticals, S.A. Adenoassociated virus vectors for the treatment of mucopolysaccharidoses
CA3048381A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Lyophilized preparation
CA3049449A1 (en) 2017-01-18 2018-07-26 Visterra, Inc. Antibody molecule-drug conjugates and uses thereof
CR20200129A (es) 2017-10-02 2020-08-22 Denali Therapeutics Inc Proteínas de fusión que comprenden enzimas de terapia de reemplazo de enzimas
CN109628426B (zh) * 2019-01-02 2023-05-09 山东大学 一种δ4,5-己糖醛酸-2-o-硫酸酯酶及其编码基因与应用以及同类酶的鉴定方法
CN109781997A (zh) * 2019-01-22 2019-05-21 中国人民解放军总医院 用于诊断粘多糖病ⅱ型的生物标志物及其应用
CN116710146A (zh) 2020-04-03 2023-09-05 威特拉公司 抗体分子-药物偶联物及其用途
IL296986A (en) * 2020-04-06 2022-12-01 Homology Medicines Inc Adeno-associated virus preparations for ids gene transfer and methods of use thereof
CN112630430B (zh) * 2020-11-16 2021-08-27 北京美联泰科生物技术有限公司 一种定量检测uchl-1的试剂盒及其应用

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3307A (en) 1843-10-18 Laben eddy
US307A (en) 1837-07-29 Rqss winans
US3854480A (en) 1969-04-01 1974-12-17 Alza Corp Drug-delivery system
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4675189A (en) 1980-11-18 1987-06-23 Syntex (U.S.A.) Inc. Microencapsulation of water soluble active polypeptides
US4452775A (en) 1982-12-03 1984-06-05 Syntex (U.S.A.) Inc. Cholesterol matrix delivery system for sustained release of macromolecules
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US4748024A (en) 1987-04-06 1988-05-31 Endocon, Inc. Flash flow fused medicinal implants
US5674722A (en) 1987-12-11 1997-10-07 Somatix Therapy Corporation Genetic modification of endothelial cells
ATE189526T1 (de) 1988-10-28 2000-02-15 Genentech Inc Verfahren zum nachweis von aktiven domänen und aminosäureresten in polypeptiden und hormonvarianten
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5133974A (en) 1989-05-05 1992-07-28 Kv Pharmaceutical Company Extended release pharmaceutical formulations
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6270989B1 (en) 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
US5733761A (en) 1991-11-05 1998-03-31 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5932211A (en) * 1991-11-12 1999-08-03 Women's And Children's Hospital Glycosylation variants of iduronate 2-sulfatase
US5407686A (en) 1991-11-27 1995-04-18 Sidmak Laboratories, Inc. Sustained release composition for oral administration of active ingredient
US5645829A (en) 1993-06-18 1997-07-08 Beth Israel Hospital Association Mesothelial cell gene therapy
CA2190121A1 (en) 1994-03-15 1995-09-21 Edith Mathiowitz Polymeric gene delivery system
JPH10500939A (ja) * 1994-03-16 1998-01-27 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 特定のスルファターゼ酵素類および／または硫酸化阻害剤の投与による炎症の治療
US5863782A (en) * 1995-04-19 1999-01-26 Women's And Children's Hospital Synthetic mammalian sulphamidase and genetic sequences encoding same
US5643599A (en) 1995-06-07 1997-07-01 President And Fellows Of Harvard College Intracellular delivery of macromolecules
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
US7368531B2 (en) * 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
AU3382800A (en) * 1999-02-26 2000-09-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Secreted proteins and uses thereof
US7083793B2 (en) 1999-02-26 2006-08-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Tango 243 polypeptides and uses thereof
JP2002017376A (ja) * 1999-07-08 2002-01-22 Herikkusu Kenkyusho:Kk 分泌蛋白質、または膜蛋白質
CA2383800A1 (en) * 1999-09-03 2001-03-15 Human Genome Sciences Inc. 52 human secreted proteins
US6780627B1 (en) 2000-01-31 2004-08-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 22438, 23553, 25278, and 26212 novel human sulfatases
AU2001238488A1 (en) * 2000-02-17 2001-08-27 Incyte Genomics, Inc. Human kinases
CA2400638A1 (en) * 2000-03-17 2001-09-27 Human Genome Sciences, Inc. 7 human ovarian and ovarian cancer associated proteins
CA2405563A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2002052019A2 (en) 2000-12-21 2002-07-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 22437, a human sulfatase and uses therefor
US20030148920A1 (en) * 2000-12-27 2003-08-07 Steven Rosen Sulfatases and methods of use thereof
US20030147875A1 (en) 2000-12-27 2003-08-07 Steven Rosen Sulfatases and methods of use thereof
WO2002098455A2 (en) * 2001-06-07 2002-12-12 Hemebiotech A/S Production of recombinant human arylsulfatase a
EP1427842A4 (en) 2001-08-31 2005-06-15 Millenium Pharmaceuticals Inc MID 9002, MEMBER OF THE HUMAN SULFATASE FAMILY, AND USES THEREOF
ATE534730T1 (de) * 2003-02-11 2011-12-15 Shire Human Genetic Therapies Diagnose und behandlung von multiplen sulfatase- erkrankungen und anderen mit hilfe eines formylglycin bildenden enzyms
US8510225B2 (en) 2004-09-01 2013-08-13 Research In Motion Limited Split channel authenticity queries in multi-party dialog
CN105450838B (zh) 2014-09-01 2019-12-24 联想(北京)有限公司 一种信息处理方法及电子设备

Also Published As

Publication number Publication date
DK1592786T3 (da) 2012-02-13
WO2004072275A3 (en) 2005-04-14
US8227212B2 (en) 2012-07-24
JP2012090630A (ja) 2012-05-17
SI2325302T1 (sl) 2016-05-31
EP1592786B8 (en) 2012-03-21
CN103055306B (zh) 2020-10-27
ZA200506378B (en) 2006-12-27
US20040229250A1 (en) 2004-11-18
HK1152336A1 (en) 2012-02-24
MXPA05008533A (es) 2005-10-20
CN103055306A (zh) 2013-04-24
JP2006517412A (ja) 2006-07-27
ATE534730T1 (de) 2011-12-15
JP5241101B2 (ja) 2013-07-17
EP1592786A2 (en) 2005-11-09
HK1152337A1 (zh) 2012-02-24
AU2004210936B2 (en) 2010-05-13
EP2325302B1 (en) 2016-01-06
NZ542267A (en) 2008-12-24
US20130028881A1 (en) 2013-01-31
AU2010212261C1 (en) 2012-12-06
AU2004210936C1 (en) 2010-12-02
CN101444621B (zh) 2013-11-20
CN110496230A (zh) 2019-11-26
AU2010212261B2 (en) 2012-04-26
EP2325301B1 (en) 2015-09-02
DK2325302T3 (en) 2016-03-14
CY1117346T1 (el) 2017-04-26
US20130172403A1 (en) 2013-07-04
US20160367703A1 (en) 2016-12-22
CN1759176A (zh) 2006-04-12
ES2380147T3 (es) 2012-05-09
ES2555056T3 (es) 2015-12-28
HUE027210T2 (en) 2016-10-28
NZ603330A (en) 2015-02-27
EP1592786B1 (en) 2011-11-23
JP6007203B2 (ja) 2016-10-12
JP5527854B2 (ja) 2014-06-25
AU2004210936A1 (en) 2004-08-26
CN101444621A (zh) 2009-06-03
MX345056B (es) 2017-01-16
EP2325301A1 (en) 2011-05-25
AU2010212261A1 (en) 2010-09-02
NZ570201A (en) 2011-03-31
CN1759176B (zh) 2012-10-03
EP2325302A8 (en) 2012-02-22
JP2014131515A (ja) 2014-07-17
HK1090088A1 (en) 2006-12-15
EP2325302A1 (en) 2011-05-25
WO2004072275A2 (en) 2004-08-26
NZ596420A (en) 2012-11-30
CA2515708A1 (en) 2004-08-26
PT1592786E (pt) 2012-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2566641T3 (es) Células que co-expresan una enzima que genera a una sulfatasa y una C-formiliglicina y sus métodos y usos
Cosma et al. The multiple sulfatase deficiency gene encodes an essential and limiting factor for the activity of sulfatases
Valenci et al. Parkin modulates heteroplasmy of truncated mtDNA in Caenorhabditis elegans
Chalmel et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential
KR20190112004A (ko) Hsd17b13 변종 및 이것의 용도
Wang et al. Identification, expression and tissue distribution of a renalase homologue from mouse
US9862986B2 (en) Muteins of the pyrroline-5-carboxylate reductase 1
AU2012206984A1 (en) Diagnosis and treatment of multiple sulfatase deficiency and other using a formylglycine generating enzyme (FGE)
Dequen et al. The Caenorhabditis elegans FancD2 ortholog is required for survival following DNA damage
Townley et al. A functional link between lariat debranching enzyme and the intron-binding complex is defective in non-photosensitive trichothiodystrophy
US20100291550A1 (en) Methods and compositions for modulating hair growth
ES2392430T3 (es) Uso de productos de proteínas segregadas DG153 para prevenir y tratar enfermedades pancreáticas y/u obesidad y/o síndrome metabólico
Bai et al. TRIB3 Promotes Osteogenic Differentiation of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells Levelled by Posttranscriptional Regulation of miR-24-3p.
Townley Dysregulation of Gene Expression in Non-photosensitive Trichothiodystrophy
Del Grosso Progressive Changes in Global Gene Expression Underpinning Muscle Senescence in Manduca sexta
Han et al. Protein crotonylation promotes osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells via the PI3K–AKT pathway
曹洋 et al. Drosophila Myosin-XX Functions as an Actin-Binding Protein To Facilitate the Interaction Between Zyx102 and Actin
Lennermann et al. Deep phenotyping of two pre-clinical mouse models and a cohort of RBM20 mutation
JP2003199588A (ja) 新規ユビキチン特異プロテアーゼ
JP2006254766A (ja) インスリン生理活性を調節する活性を有するタンパク質