JPH10500939A - 特定のスルファターゼ酵素類および／または硫酸化阻害剤の投与による炎症の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 外傷に伴う炎症、ならびにリウマチ様関節炎、乾せん、インスリン依存性糖尿病、皮膚リンパ腫、十二指腸潰瘍、慢性直腸炎、リンパ球性甲状腺炎、出血性ショック、移植中の再潅流障害および多発性硬化症のようなある種の態様の疾患に伴う炎症を含む各種の症状を治療するため、組成物を患者に（好ましくは、注射で、かつ局所に）投与する。これら組成物は、医薬として許容される担体中に活性成分を含有する医薬として許容される注射用製剤である。その活性成分は、自然の生化学的硫酸化プロセスを阻害する塩素酸塩またはセレン酸塩および／またはＬ−セレクチンに対する自然リガンドの一部分を構成する糖分子の特定位置から硫酸基を外すスルファターゼ酵素である。リガンドから硫酸基を外すと、そのリガンドがその自然受容体（つまり、Ｌ−セレクチン）に結合する性能が妨害されて、炎症をもたらす生化学的連鎖事象が妨害される。

Description

【発明の詳細な説明】特定のスルファターゼ酵素類および／または硫酸化阻害剤の投与による炎症の治 療 相互参照 本願は、本発明の発明者らの先願の出願である１９９２年９月１１日出願の米 国特許出願第０７／９４３，８１７号および１９９３年１１月１９日出願の米国 特許出願第０８／１５５，９４７号の一部継続出願であり、当該両出願はその全 体を本明細書に援用するところであり、また当該出願について本発明の発明者ら は米国特許法第１２０条の規定による優先権を主張するところである。米国政府の権利 米国政府は、米国国立衛生研究所が授与した助成第ＧＭ−２３５４７号に従っ て本願にある種の権利を有しているかも知れない。発明の技術分野 本発明は、概要的には、自然リガンドに対する硫酸基の代謝付加を阻害しおよ び／または自然リガンドの特定位置から硫酸基部分を除くことにより、リガンド が受容体に結合するのを妨害して、炎症を治療することに関する。より具体的に は、本発明は、硫酸基部分がセレクチンリガンドに付加するのを代謝によって阻 害する非毒性塩素酸塩のような化合物を局所投与しおよび／または硫酸基部分を 除去する特定のスルファターゼ化合物を投与して、炎症を軽減する望ましい作用 をもたらすことに関する。発明の背景 生理に関する認識における炭水化物類の役割を研究するいくつもの研究努力が なされている。（Ｂｒａｎｄｌｅｙ，Ｂ．Ｋ．およびＳｃｈｎａａｒ，Ｒ．Ｌ． の論文、Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．（１９８６年）４０巻、９７頁、およびＳｈ ａｒｏｎ，Ｎ．およびＬｉｓ，Ｈ．の論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９年）２４ ６巻、２２７頁を参照）。オリゴ糖類は、細胞表面に配置されかつ構造が多様で あることによって、認識分子として作用するようにうまく配置されている。多数 のオリゴ糖構造体は、小数のグリコシルトランスフェラーゼ類の特異的活性によ って創製することができる。このように、オリゴ糖の多様な構造体は、比較的小 数の遺伝子産物によって生成させることができるので、広範囲の細胞−細胞相互 作用を指示するのに必要な情報を確立するためのもっともらしい機構を提案する 。相互に作用する細胞上での、細胞表面炭水化物類および推定炭水化物結合タン パク質類（レクチン類）の特異的発現の例がすでに報告されている（Ｄｏｄｄ， Ｊ．およびＪｅｓｓｅｌ，Ｔ．Ｍ．の論文、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９８５ 年）５巻、３２７８頁、Ｒｅｇａｎ，Ｌ．Ｊ．他の論文、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６年）８３巻、２２４８頁、Ｃｏｎｓｔａｎ ｔｉｎｅ−Ｐａｔｏｎ，Ｍ．他の論文、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６年）３２４巻、 ４５９頁、およびＴｉｅｍｅｙｅｒ，Ｍ．他の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． （１９８９年）２６３巻、１６７１頁を参照）。 循環白血球が刺激された血管内皮に粘着することが炎症応答の主な事象である 。いくつかの受容体がこの相互作用に関与しており、 その受容体としては、セレクチン類と呼ばれる推定レクチン類のファミリーがあ り、このファミリーにはＬ−セレクチン、ＬＡＭ−１（ｇｐ９０^MEL，Ｌｅｕ８ ）、Ｐ−セレクチン（ＧＭＰ−１４０（ＰＡＤＧＥＭ、ＣＤ６２）およびＥ−セ レクチン（ＥＬＡＭ−１）が含まれる（Ｇｏｎｇ，Ｊ．−Ｇ．他の論文、Ｎａｔ ｕｒｅ（１９９０年）３４３巻、７５７頁、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ．Ｇ．Ｉ．他の論 文、Ｃｅｌｌ（１９８９年）５６巻、１０３３頁、Ｇｅｏｆｆｒｏｙ，Ｊ．Ｓ． およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９８９年） １０９巻、２４６３頁、Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．他の論文、Ｃｅｌｌ（１９８９年 ）５６巻、１０４５頁）。現在知られている３種のセレクチン類は、全て、炭水 化物を認識することが報告されている（Ｌａｓｋｙの論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２ ５８巻、９６４〜９６９頁、１９９２年参照）。これら受容体に対する内因性リ ガンド類は、同定されつつある。 Ｅ−セレクチンすなわちＥＬＡＭ−１は、ＩＬ−１またはＴＮＦに応答して内 皮細胞上で一過的に発現するので、興味深い（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｍ．Ｐ． 他の論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９年）２４３巻、１１６０頁）。この誘発さ れる発現の時間経過（２〜８時間）は、この受容体が感染と損傷に応答して、初 期好中性血液溢出に役割を演じていることを示唆している。さらに、Ｂｅｖｉｌ ａｃｑｕａ他（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｍ．Ｐ．他の論文、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７年）８４巻、９２３８頁を参照）は、ヒ ト好中球またはＨＬ−６０細胞がＥＬＡＭー１受容体をコードするｃＤＮＡを含 有するプラスミドでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に粘着することを実証し た。 最近、いくつかの異なるグループが、Ｅ−セレクチンリガンドと 呼称される、Ｅ−セレクチンすなわちＥＬＡＭ−１のリガンドについて論文を刊 行した。Ｌｏｗｅ他（１９９０年）は、ＨＬ−６０細胞変異体とトランスフェク トされた細胞系のＥ−セレクチン依存性粘着と、これら細胞系の、シアリル Ｌ ｅｗｉｓ Ｘ（ｓＬｅ^x）オリゴ糖すなわちＮｅｕ ＮＡｃ α２−３Ｇａｌ− βｌ−４（Ｆｕｃα１−３）−ＧｌｃＮＡｃそしてより具体的に一般的に示すと Ｓｉａα２−３Ｇａｌβｌ−４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃの発現との間の 正の相関関係を実証した。α（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼを 含有するプラスミドで細胞をトランスフェクトすることによって、Ｌｏｗｅらは 、非骨髄性ＣＯＳまたはＣＨＯ系を、Ｅ−セレクチン依存方式で結合するｓＬｅ^x 陽性細胞(sLe^x-positive cell)に変換することができた。抗ｓＬｅ^x抗体を用い てＥ−セレクチン依存性粘着を遮断する試みは、試験細胞が抗体によって凝集す るため解明できなかった。Ｌｏｗｅらは、シアリル化され、フコシル化されたラ クトサミノグリカン類からなるオリゴ糖のファミリーの１種以上のメンバーは、 Ｅ−セレクチンのレクチンドメインに対するリガンドであると結論している。Ｐ ｈｉｌｉｐｓ他（１９９０年）は、ｓＬｅ^xに対する特異性をもっていることが 報告された抗体を用いて、ＨＬ−６０細胞またはＬＥＣ１１ ＣＨＯ細胞の活性 化内皮細胞へのＥ−セレクチン依存性粘着を阻害した。ｓＬｅ^x末端構造を有す るジフコシル化糖脂質を含有するリポソームは、粘着を阻害したが、非シアリル 化Ｌｅｘ構造を含有するリポソームは部分的に阻害性であった。Ｗａｌｚ他（１ ９９０年）は、Ｅ−セレクチン−ＩｇＧキメラのＨＬ−６０細胞との結合を，ｓ Ｌｅ^xに対するモノクローナル抗体でまたはｓＬｅ^x構造体を有する糖タンパク質 によって阻害できたが、ＣＤ６５抗体またはＣＤ１５抗体による 阻害を実証できなかった。両グループは、ｓＬｅ^x構造体はＥ−セレクチンに対 するリガンドあると結論した。 内皮細胞−白血球粘着分子をコードするＤＮＡ配列に関する情報は、１９９０ 年１１月１５日に公開されたＰＣＴ特許願公開第ＷＯ９０／１３３００号に開示 されている。上記ＰＣＴ公開は、内皮細胞−白血球粘着分子に関する多数の論文 を引用している。このＰＣＴ公開は、Ｅ−セレクチンリガンドの同定方法および これらリガンドを用いて白血球と内皮細胞間の粘着を阻害する方法を特許請求し 、特に白血球の内皮細胞に対する粘着に関与する分子として報告されているＭＩ ＬＡに言及している。 Ｌ−セレクチンすなわちＬＥＣＡＭ−１は、リンパ球と好中球の流入（influx ）に関与しているので、興味深い（Ｗａｔｓｏｎ他の論文、Ｎａｔｕｒｅ、３４ ９巻、１６４〜１６７頁（１９９１年））。Ｌ−セレクチンは、ＨＥＶに結合す る慢性リンパ球白血病細胞に発現された（Ｓｐｅｒｔｉｎｉ他の論文、Ｎａｔｕ ｒｅ、３４９巻、６９１〜６９４頁（１９９１年）を参照）。慢性炎症の部位に おけるＨＥＶ様構造体は、リウマチ様関節炎、乾せんおよび多発性硬化症などの 疾患の症状に関連していると考えられている。 広範囲のＥ−セレクチンリガンドが、ＷＯ９２／０２５２７号（１９９２年２ 月２０日公開）として公開されたＢｒａｎｄｌｅｙ他のＰＣＴ／ＵＳ９１／０５ ４１６号およびＷＯ９０／１３３００号（１９９０年１１月１５日公開）として 公開されたＨｅｓｓｉｏｎ他のＰＣＴ／ＵＳ９０／０２３５７号に開示されてい る。なお、これら両刊行物は、全体を本明細書を援用するものであり、特にオリ ゴ糖構造体が開示され、これらはＥ−セレクチンリガンドおよびＬ−セレクチン リガンドとして作用することが報告されている。 これらのセレクチンは、各種の白血球−内皮の粘着事象を仲介する３種の細胞 −細胞粘着タンパク質のファミリーである（以下の文献で検討されている：Ｌａ ｓｋｙ，Ｌ．Ａ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８巻、９６４〜９６９頁（１９９２年 ）；ＭｃＥｖｅｒ，Ｒ．Ｐ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、４ 巻、８４０〜８４９頁（１９９２年）；Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｍ．Ｐ．および Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９１巻、３７９〜３ ８７頁（１９９３年）；Ｒｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．、Ｓｅｍｉｎ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．、５巻、２３７〜２４９頁（１９９３年）。Ｌ−セレクチンは、白血球の 表面に発現され、高内皮小静脈（ＨＥＶ）の特殊化内皮管壁細胞（Ｓｐｅｃｉａ ｌｉｚｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｎｉｎｇｃｅｌｌ）への結合を仲介 することによって、血管が運ぶリンパ球の末梢リンパ節へのホーミングに関与し ている（Ｇａｌｌａｃｔｉｎ，Ｗ．Ｍ．、Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．およびＢ ｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ、３０３巻、３０〜３４頁（１９８３年 ）；Ｇｅｏｆｆｒｏｙ，Ｊ．Ｓ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０９巻、２４６３〜２４６９頁（１９８９年））。Ｌ−セレクチ ンは、急性炎症の特定部位における好中球と小静脈内皮の旋回相互作用、すなわ ち白血球の最終溢出の必須ステップ、にも関与している（Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎ他 の論文、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８巻、４３１３〜４３２１頁（１９８７年 ）；Ｌｅｙ，Ｋ．、Ｇａｅｈｔｇｅｎｓ、ｐ．、Ｆｅｎｎｉｅ，Ｃ．、Ｓｉｎｇ ｅｒ，Ｍ．Ｓ．、Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｂ ｌｏｏｄ、７７巻、２５５３〜２５５５頁（１９９１年）；Ｖｏｎ Ａｄｒｉａ ｎ，Ｕ．、Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｊ．Ｄ．、ＭｃＥｖｏ ｙ，Ｌ．Ｍ．、Ｂａｒｇａｔｚｅ，Ｒ．Ｆ．、Ａｒｆｏｒｓ，Ｋ．Ｅ．およびＢ ｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．の論文、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ，８８巻、７５３８〜７５４２頁（１９９１年））。残りの２種のセレクチン であるＥ−セレクチンとＰ−セレクチンは、これらセレクチンが、好中球、単球 、およびリンパ球の特定のサブセットへの結合を仲介する内皮細胞上に発現され る。Ｌ−セレクチンは、慢性炎症部位へのリンパ球および単球の浸入に関与して いる（Ｄｏｗｓｏｎ他の論文、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２巻、１６４ ７〜１６５０頁（１９９２年）およびＳｐｅｒｔｉｎｉ他の論文、Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７５巻、１７８９〜１７９２頁（１９９２年））。これらセレクチ ン類は、そのアミノ末端におけるＣ型レクチンドメインによって、その粘着機能 を果たす（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｋ．の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６ ３巻、９５５７〜９５６０頁（１９８８年））。これらドメイン間の配列類似度 が高い（６０〜７０％）ことを反映して、ＨＥＶ上のＬ−セレクチンおよび白血 球上のＥ−セレクチンとＰ−セレクチンの生物学的リガンドは、シアル酸に対す る要求を共有している（Ｖａｒｋｉ，Ａ．の論文、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌ ｌ Ｂｉｏｌ．、４巻、２５７〜２６６頁（１９９２年）で検討されている）。 さらに、各セレクチンは、シアリルＬｅｗｉｓ Ｘ［ｓＬｅ^x、すなわちＮｅｕ ５ＡＣα２→３Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）／ＧｌｃＮＡｃ］および類縁 構造体を認識できる（Ｓｔｏｏｌｍａｎ Ｌ．Ｍ．の論文、「Ｃｅｌｌ Ｓｕｒ ｆａｃｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ ｅｎｔ」、７１〜９７頁（１９９２年）（Ｍ．Ｆｕｋｕｄａ編）、フロリダ州ボ カレートン所在のＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ社発行、で検討さ れている）が、阻害試験の結果は、これら化合物の結合アフィニティが低いこと を示している。Ｌ−セレクチン、すなわちＬＥＣＡＭ−１は、カルシウム型ドメ インを有するレクチン様受容体であるが、これはリンパ球がリンパ節の高内皮小 静脈（ＨＥＶ）に結合するのを仲介する（Ｇａｌｌａｔｉｎ他の論文、Ｎａｔｕ ｒｅ、３０３巻、３０〜３４頁（１９８３年）；Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．の論文、 Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８巻、９６４〜９６９頁（１９９２年）；およびＢｅｖｉ ｌａｃｑｕａ他の論文、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９１巻、３７０〜３８ ７頁（１９９３年））。ｓＬｅ^x類縁構造体がこれらセレクチン類の実際の生物 学的リガンド中に存在していることは、炭水化物特異的抗体の使用に基づいた証 拠がある（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｍ．Ｌ．、Ｎｕｄｅｌｍａｎ，Ｅ．、Ｇａｅｔａ ，Ｆ．、Ｐｅｒｅｚ，Ｍ．、Ｓｉｎｇｈａｌ，Ａ．Ｋ．、Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ ．およびＰａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．の論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５０巻、１１３ ０〜１１３２頁（１９９０年）；Ｗａｌｚ，Ｇ．、Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．、Ｋｏｌ ａｎｕｓ，Ｗ．、Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｍ．およびＳｅｅｄ，Ｂ．の論文、Ｓ ｃｉｅｎｃｅ、２５０巻、１１３２〜１１３５頁（１９９０年）；Ｐｏｌｌｅｙ ，Ｍ．Ｊ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｍ．Ｌ．、Ｗａｙｎｅｒ，Ｅ．、Ｎｕｄｅｌｍ ａｎ，Ｅ．、Ｓｉｎｇｈａｌ，Ａ．Ｋ．、Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．およびＰａｕ ｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．の論文、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ８８巻、６２２４〜６２２８頁（１９９１年）；Ｂｅｒｇ，Ｅ．Ｌ．、Ｙｏｓｈ ｉｎｏ，Ｔ．、Ｒｏｔｔ，Ｌ．Ｓ．、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋ．、Ｗａｒｎｏ ｃｋ，Ｒ．Ａ．、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｋ．、Ｐｉｃｋｅｒ，Ｌ．Ｊ．およ びＢｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．の論文、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ ｄ．、１７４巻、１４６１〜１４６６頁（１９９１年）；Ｓａｗａｄａ，Ｍ．、 Ｔａｋａｄａ，Ａ．、Ｏｈｗａｋｉ，Ｉ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．、Ｔａｔ ｅｎｏ，Ｈ．、Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｊ．およびＫａｎｎａｇｉ，Ｒ．の論文、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９３巻、３３７〜 ３４７頁（１９９３年）；Ｎｏｇａｒｄ，Ｋ．Ｅ．、Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．Ｌ．、Ｄ ｉａｚ，Ｓ．、Ｓｔｕｌｔｓ，Ｎ．Ｌ．、，Ｕｓｈｉｙａｍａ，Ｓ．、ＭｃＥｖ ｅｒ，Ｒ．Ｐ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．およびＶａｒｋｉ，Ａ．の論文、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻、１２７６４〜１２７７４頁（１９９３年 ））。それにもかかわらず、各セレクチンは、一組の好ましい生物学的リガンド を持っている（Ｌａｒｓｅｎ，Ｇ．Ｒ．、Ｓａｋｏ，Ｄ．、Ａｈｅｒｎ，Ｔ．Ｊ ．、Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｍ．、Ｅｒｂａｎ，Ｊ．、Ｓａｊｅｒ，Ｓ．Ａ．、Ｇｉｂ ｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｄ．、Ｆｕｒｉｅ，Ｂ．Ｃ．およびＦｕ ｒｉｅ，Ｂ．の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻、１１１０４〜１１ １１０頁（１９９２年）；Ｂｅｒｇ，Ｅ．Ｌ．、Ｍａｇｎａｎｉ，Ｊ．、Ｗａｒ ｎｏｃｋ，Ｒ．Ａ．、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋ．およびＢｕｔｃｈｅｒ，Ｅ． Ｃ．の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８ ４巻、１０４８〜１０５５頁（１９９２年）が、何が一つのセレクチンのリガン ドを別のセレクチンのリガンドから識別するのかについての情報を欠いている。 現在のところ、最高に特性が解析されているリガンドは、Ｌ−セレクチンに対 するＨＥＶ関連リガンドであり、ＧｌｙＣＡＭ−１（以前は、Ｓｇｐ５０と呼称 ）とＳｇｐ９０として知られている（Ｉｍａｉ，Ｙ．、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｓ． 、Ｆｅｎｎｉｅ，Ｃ．、Ｌ ａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ｌ．、１１３巻、１２１３〜１２２１頁（１９９１年））。これら内皮関連リガ ンドは、硫酸化、シアリル化およびフコシル化されたＯ−結合オリゴ糖連鎖を有 するムチン様糖タンパク質である。これら糖タンパク質は、当初、代謝で³⁵ＳＯ₄ で標識を付けたリンパ節抽出物を、可溶性のＬ−セレクチン／免疫グロブリン キメラで沈降させることによって検出された。上記キメラによって沈降させるこ とはできないが、細胞−細胞結合事象の前後において機能的に重要な相互作用に それでもなお関与している他の低アフィニティのリガンドが存在するかも知れな い（Ｂｅｒｇ，Ｅ．Ｌ．、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋ．、Ｗａｒｎｏｃｋ，Ｒ． Ａ．およびＢｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１ ４巻、３４３〜３４９頁（１９９１年））。ＧｌｙＣＡＭ−１は、培養リンパ節 の調整培地中に、無傷の分子として放出される（Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．、Ｓｉｎ ｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．、Ｄｏｗｂｅｎｋｏ，Ｄ．、Ｉｍａｉ，Ｙ．、Ｈｅｎｚｅｌ， Ｗ．Ｊ．、Ｇｒｉｍｌｅｙ，Ｃ．、Ｆｅｎｎｉｅ，Ｃ．、Ｇｉｌｌｅｔｔ，Ｎ． 、Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｃｅｌｌ、６９ 巻、９２７〜９３８頁（１９９２年）；Ｂｒｕｓｔｅｉｎ，Ｍ．、Ｋｒａａｌ， Ｇ．、Ｍｅｂｉｕｓ，Ｒ．Ｅ．およびＷａｔｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．の論文、Ｊ．Ｅｘ ｐ．Ｍｅｄ．、１７６巻、１４１５〜１４１９頁（１９９２年））が、このこと はＧｌｙＣＡＭ−１が分泌産物および／またはゆるやかに結合した末梢膜の成分 であることを示唆している。これとは対照的に、Ｓｇｐ９０は、膜内在性タンパ ク質であり、抽出するとき界面活性剤が必要である（Ｓ．Ｈｅｍｍｅｒｉｃｈお よびＳ．Ｒｏｓｅｎの未発表の試験結果）。分子分析を 行った結果、ＧｌｙＣＡＭ−１は、新規なムチン様糖タンパク質であることが明 らかになり、そしてさらに最近にＳｇｐ９０もＨＥＶ特異的な糖型のムチンＣＤ ３４であることが分かった、Ｂａｕｍｈｕｅｔｅｒ，Ｓ．、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ． Ｓ．、Ｈｅｎｚｅｌ，Ｗ．、Ｈｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｓ．、Ｒｅｎｚ，Ｍ．、Ｒｏ ｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．およびＬａｓｋｙ．Ｌ．Ａ．の論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２ 巻、４３６〜４３８頁（１９９３年）。ＧｌｙＣＡＭ−１のＯ−連結連鎖は、大 きさと電荷において不均一であることが報告されている（Ｉｍａｉ，Ｙ．および Ｒｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．、１０巻、 ３４〜３９頁（１９９３年））。いくつかのこれら連鎖は、多重電荷（multiple charges）を有しており、主に寄与しているのはシアリル化より硫酸化であるよ うである。ＧｌｙＣＡＭ−１およびＳｇｐ９０の両者とＬ−セレクチンとの相互 作用は、それらのシアリル化に依存しているが、このことは、リンパ節ＨＥＶの シアリダーゼ処理によってリンパ球の付着とリンパ球の流通（trafficking）が 損なわれるという以前の知見を確認している（Ｒｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．、Ｓｉｎｇ ｅｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｙｅｄｎｏｃｋ，Ｔ．Ａ．およびＳｔｏｏｌｍａｎ，Ｌ．Ｍ． の論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８巻、１００５〜１００７頁（１９８５年）；Ｒ ｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．、Ｃｈｉ，Ｓ．Ｉ．、Ｔｒｕｅ，Ｄ．Ｄ．、Ｓｉｎｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．およびＹｅｄｎｏｃｋ，Ｔ．Ａ．の論文、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４ ２巻、１８９５〜１９０２頁（１９８９年））。しかし、完全に脱シリアル化を 行っても、ＧｌｙＣＡＭ−１のリガンド活性を完全には喪失しない。これは、シ アル酸非依存モードの認識も存在することを示唆している（Ｉｍａｉ，Ｙ．、Ｌ ａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文 、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、４巻、３７３〜３８１頁）。ＧｌｙＣＡＭ−１の リガンド結合部位の一部を形成するシアル酸は、α２→３結合にあるようである 。というのは、ニューカッスル病ウイルス由来の連鎖特異的シアリダーゼは、Ｇ ｌｙＣＡＭ−１を部分的にリガンドとして不活性化するからである。さらに、競 合阻害試験と直接結合試験の両者において、ｓＬｅ^x型のオリゴ糖は、Ｌ−セレ クチンに対するリガンド活性を明確に示すが、α２→６結合のＮｅｕ５Ａｃを有 するＬｅｗｉｓ Ｘ型構造体は、不活性である（Ｆｏｘａｌｌ，Ｃ．、Ｗａｔｓ ｏｎ，Ｓ．Ｒ．、Ｄｏｗｂｅｎｋｏ，Ｄ．、Ｆｅｎｎｉｅ，Ｃ．、Ｌａｓｋｙ， Ｌ．Ａ．、Ｋｉｓｏ，Ｍ．、Ｈａｓｅｇａｗａ，Ａ．、Ａｓａ，Ｄ．およびＢｒ ａｎｄｌｅｙ，Ｂ．Ｋ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１７巻、８９５ 〜９０２頁（１９９２年））。フコースからの必須の寄与が考えられる。なぜな らば、シアリルラクトース（すなわちＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌ ｃ）は、ｓＬｅ^xと比べて、Ｌ−セレクチンとの結合の競合体として比較的不活 性であるからである。さらに、フコースは、Ｐ−セレクチンとＥ−セレクチンの 好中球リガンドに対する重要な決定因子であることが分かっている（Ｌａｒｓｅ ｎ，Ｇ．Ｒ．、Ｓａｋｏ，Ｄ．、Ａｈｅｒｎ，Ｔ．Ｊ．、Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｍ． 、Ｅｒｂａｎ，Ｊ．、Ｓａｊｅｒ，Ｓ．Ａ．、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｗａｇ ｎｅｒ，Ｄ．Ｄ．、Ｆｕｒｉｅ，Ｂ．Ｃ．およびＦｕｒｉｅ，Ｂ．の論文、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻、１１１０４〜１１１１０頁（１９９２年）） ので、これらセレクチン類のレクチンドメイン間の配列類似性から見ると、Ｌ− セレクチンのリガンドに対して同様に重要な決定因子と考えられる。 早期の研究は、大部分が、どのオリゴ糖化合物がリガンドとして 作用するかに集中していた。本発明の発明者らは、硫酸基部分のＧｌｙＣＡＭ− １への結合が上記糖タンパク質のリガンドとして作用する性能に大きな効果をも っていることを確認して（Ｉｍａｉ他の論文、Ｎａｔｕｒｅ、３６１巻、５５５ 〜５５７頁（１９９３年））、１９９２年９月１１日出願の同時係属中の米国特 許出願第０７／９４３，８１７号（本明細書に援用）の根拠になっている発明を 開発した（Ｉｍａｉ，Ｙ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｇｌｙｃｏｃｏ ｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．、１０巻、３４〜３９頁（１９９３年）；Ｉｍａｉ，Ｙ． 、Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｎａｔｕｒｅ、３ ６１巻、５５５〜５５７頁も参照）。 シアリルＬｅｗｉｓ Ｘ類縁オリゴ糖、すなわち Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３〕ＧｌｃＮＡｃが、非常に弱 いとはいえ、Ｌ−セレクチンに対してリガンド活性をもっている証拠が提供され ている（Ｆｏｘａｌｌ他の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１７巻、８９５ 〜９０２頁（１９９２年）；Ｂｅｒｇ他の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１８４巻、１０４８〜１０５５頁（１９９２年）およ びＩｍａｉ他の論文、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）。炭水化物特異的抗体による 試験に基いた、内在性ＨＥＶリガンドが実際にシアリルＬｅｗｉｓ Ｘ類縁構造 体をもっている証拠もある（Ｓａｗａｄａ，Ｍ．の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１９３巻、３３７〜３４７頁（１９９３年） ）。スルファチド、フコイジン（Ｉｍａｉ他の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． 、１１１巻、１２２５〜１２３２頁（１９９０年）、類縁糖脂質類（Ｓｕｚｕｋ ｉ他の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ ｓ．Ｃｏｍｍ．、１９０巻、４２６〜４３４頁（１９９３年）、および硫酸化型 のＬｅｗｉｓ Ｘ／ａ、すなわち ＳＯ₄−３Ｇａｌβ１−４／３［Ｆｕｃα１ −３／４］ＧｌｃＮＡｃ（Ｇｒｅｅｎ他の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１８８巻、２４４〜２５１頁（１９９２年））を含め て、各種の硫酸化炭水化物類は、すべて、Ｌ−セレクチンに対してリガンド活性 を有していることが報告されている。これら炭水化物の活性は、その硫酸化に依 存している。 上記に見てきた情報およびその他の情報によって、本発明の発明者らは、以下 に考案する諸出願をなすに至り、硫酸化の重要性を認識し始めて、硫酸化に影響 する方法の研究を開始した。 他の研究者らが、硫酸基部分を粘液糖タンパク質から取り外すグリコスルファ ターゼを単離し、同定している（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ他の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ ．Ｊ．、２９３巻、６８３〜６８９頁（１９９３年）を参照）。さらに、他の研 究者らは、ヒトグルコサミン−６−スルファターゼを単離し、具体的に同定し、 これをコードするｃＤＮＡを得た（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ他の論文、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１５７巻、２１８〜２２４頁（ １９８８年）を参照）。最後に、他の研究者らは、Ｎ−アセチルガラクトース− ６−サルフェートスルファターゼを単離し、具体的に同定することができた（Ｔ ｏｍａｔｓｕ他の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ ｎ．、１８１巻、６７７〜６８３頁（１９９１年）を参照）。 本発明の発明者らの先願の米国特許出願第０７／９４３，８１７号（１９９２ 年９月１１日出願）と同第０８／１５５，９４７号（１９９３年１１月９日出願 ）は、一般にセレクチン類の、特にＬ− セレクチンのリガンドである硫酸化炭水化物の構造体の詳細についてさらに詳し く述べている。本発明は、炎症を治療および／または軽減する具体的な方法を提 供するために本発明の発明者らの先の研究で得られた具体的な情報に乗じたもの である。発明の概要 外傷に伴う炎症、ならびにリウマチ様関節炎、乾せん、インスリン依存性糖尿 病、皮膚リンパ腫、十二指腸潰瘍、慢性直腸炎、リンパ球性甲状腺炎、出血性シ ョック、移植中の再潅流損傷（reperfusion injury）および多発性硬化症のよう なある種の態様の疾患に伴う炎症を含む各種の症状を治療するため、組成物を患 者に（好ましくは、注射で、かつ局所に）投与する。これら組成物は、医薬とし て許容される担体中に活性成分を含有する医薬として許容される注射用製剤であ る。その活性成分は、自然の生化学的硫酸化プロセスを阻害する塩素酸塩または セレン酸塩および／または自然リガンドの一部分を構成する糖分子の特定位置か ら硫酸基を外すスルファターゼ酵素である。リガンドから硫酸基を外すと、その リガンドがその自然受容体に結合する性能が妨害されて、炎症をもたらす生化学 的連鎖事象が妨害される。 本発明の目的は、自然リガンドの一部を構成する糖部分（ガラクトースまたは Ｎ−アセチルグルコサミン）の６位から硫酸基部分を外すスルファターゼ酵素を 含有する医薬として許容される担体を含んでなる医薬製剤を提供することである 。 他の目的は、スルファターゼ酵素がガラクトース−６−サルフェートスルファ ターゼまたはＮ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートスルファターゼであ るような製剤を提供することである。 他の目的は、自然の生化学的硫酸化のプロセスを阻害する塩素酸塩またはセレ ン酸塩の化合物を含有する医薬として許容される担体を含んでなる医薬製剤を提 供することである。 他の目的は、塩素酸塩／セレン酸塩および／または特定のスルファターゼを含 有する医薬として許容される担体を含んでなる製剤を、炎症を予防および／また は軽減するため部位に局所注射するかまたは静脈注射を行うことからなる炎症の 治療方法を提供することである。 本発明の特徴は、使用されるスルファターゼ酵素が、Ｌ−セレクチンの特定の リガンドの特定位置からの硫酸基部分の除去、すなわちＮ−アセチルグルコサミ ンの６位および／またはガラクトースの６位からの硫酸基の除去に対して高度に 特異的であるということである。 本発明の利点は、炎症を低下させる併用効果を、（１）自然のセレクチンリガ ンドに硫酸基部分が付加するのを代謝で阻害する化合物および（２）自然のリガ ンドから硫酸基部分を特異的に除去する酵素を組み合わせて投与することによっ て、得ることができることである。 本発明の重要な一面は、循環している好中球、リンパ球、単球、好酸球および 好塩基球と内皮細胞との相互作用によってもたらされる望ましくない作用を治療 し、予防しおよび／または軽減するのに有用な医薬組成物である。そのような組 成物は、オリゴ糖の特定の位置から硫酸基部分を除くため、塩素酸塩および／ま たはスルファターゼ酵素を含有する医薬として許容される賦形剤の形態の不活性 成分を含有している。 本発明のこれらのおよび他の目的、利点および特徴は、本明細書 の一部を形成する添付図面と一般構造式（全体を通じて同じ記号は同じ分子部分 を示す）を参照して、以下に一層充分に記載する構造体、製剤および使用の詳細 を読めば、当該技術分野の当業者にとって明らかになるであろう。図面の簡単な説明 本発明は、以下の添付図面を参照することによって、当該技術分野の当業者で あれば、一層よく理解されかつその多くの目的、利点および特徴が明らかになる であろう。 図１は、白血球と活性化された内皮細胞との間の相互作用を示す模型的断面図 である。 図２は、本発明のスルファターゼ酵素を用いてどのようにして自然リガンドか ら硫酸基部分を外すことができるかを示す模型的断面図である。発明の実施態様 本発明の塩素酸塩およびスルファターゼ酵素を含有する組成物およびかかる組 成物の使用方法を説明する前に、記載された特別の組成物、方法またはプロセス は、勿論変えることができるので、本発明は、これら特別の組成物、方法または プロセスに限定されないということを理解ておくべきである。また、本明細書に 用いられる用語は、特定の実施態様だけを説明するのを目的とするものであり、 そして本発明の範囲は添付した特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限 定を意図するものではないと解すべきである。 本明細書および付属の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａ ｎ」および「ｔｈｅ」は、明確にことわらない限り、 複数の指称対象を含む。したがって、例えば、「ａ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｌｉｇ ａｎｄ」との指称は、そのようなリガンド複数の混合物を含み、そして「ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ」または「ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ」との指称は、本明 細書に記載されておりおよび／または本明細書の開示などを読めば当該技術分野 の当業者にとって明らかになるであろうタイプの一種または複数種の製剤、方法 および／またはステップを含んでいる。 本明細書に引用されたすべての刊行物は、本明細書に援用するものであり、こ れら刊行物が関連して引用されている主題を記述するものである。 本発明に関連して用いられるいくつかの標準の略語には、次のものがある。す なわち、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；ＤＥＡＥ：ジエチルアミノエチル；ＤＭ ＳＯ：ジメチルスルホキシド；ＥＬＡＭ−１：内皮／白血球粘着分子−１（Ｅ− セレクチンとも呼称）；ＨＰＴＬＣ：高性能薄層クロマトグラフィー；ＬＥＣＡ Ｍ−１：白血球／内皮細胞粘着分子−１（Ｌ−セレクチンとも呼称）；ＭＯＰＳ ：３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸；ＮＡＮＡ：Ｎ−アセチルノイラ ミン酸；ＰＶＣ：ポリ塩化ビニル；ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー；ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸；Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；Ｃ− タイプ：カルシウムタイプ；Ｆｕｃ：フコース；Ｇａｌ：ガラクトース；Ｇｌｃ Ｎ：グルコサミン；ＧａｌＮ：ガラクトサミン；ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグ ルコサミン；ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｇａｌ−６Ｓ：ガラ クトース−６−サルフェート；ＧｌｃＮＡｃ−６Ｓ：Ｎ−アセチルグルコサミン −６−サルフェート；ＧｌｃＵ−Ｓ：グルクロン酸−モノサルフェート；ＨＥＶ ：高内皮小静脈；ＨＰＡＥ Ｃ：高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー；ＬａｃＮＡｃまたはＮ−アセチル ラクトサミン：Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ；Ｍａｎ：マンノース；Ｎｅｕ５Ａ ｃ：Ｎ−アセチルノイラミン酸；シアリルＬｅｗｉｓ ＸまたはｓＬｅ^x；Ｎｅ ｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ；Ｌｅｗｉｓ ＸまたはＬｅ^x：Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ；Ｌｅｗｉ ｓａすなわちＬｅａ：Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃ；ＳＧＮ Ｌ：３−スルホグルクロニルネオラクト糖脂質；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫 酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動；Ｓｇｐ５０：５０ｋＤａの硫 酸化糖タンパク質；Ｓｇｐ９０：９０ｋＤａの硫酸化糖タンパク質である。一般概要 血液中の白血球が、血管内面を覆う内皮細胞に結合する性能は、公知である。 セレクチン受容体に結合して白血球細胞を内皮細胞に結合できるようにするリガ ンドを単離して特性解析を行う実質的な研究を行った。本発明の発明者らの先の 研究によって、Ｌ−セレクチンの自然リガンドは、硫酸基部分を含有しているこ とが実証された。また、本発明の発明者らは、その硫酸基は、一般にリガンドを 含有するオリゴ糖分子の特定の位置に存在し、硫酸基を除くとリガンドがセレク チン受容体に結合する性能を激しく損傷することも見出した。そのような結合性 を損傷すると、過剰な場合に炎症を起こす生化学的連鎖事象が遮断される。この ような事実を相互に関係づけることによって、本発明の発明者らは、二つの方法 で炎症を軽減しおよび／または予防することが可能であると推定した。第一に、 本発明の発明者らは、硫酸化を阻害してすなわち自然のセレクチン リガンドに硫酸基部分が付加するのを阻害してリガンドの完全な形成を防止する 化合物を発見すべく努力した。本発明の発明者らは、塩素酸塩類が作用し、Ｇｌ ｙＣＡＭ−１およびＣＤ３４／Ｓｇｐ９０の生化学的硫酸化を阻害して、これら がＬ−セレクチンに結合する性能を阻害することを見出した。第二に、本発明の 発明者らは、Ｌ−セレクチンに対する自然のリガンド（すなわちＧｌｙＣＡＭ− １）の炭水化物の正確な硫酸基の置換部分を確認すべく努力した。本発明の発明 者らは、ガラクトース−６−硫酸（サルフェート）とＮ−アセチルグルコサミン −６−硫酸（サルフェート）が等しくＧｌｙＣＡＭ−１中に存在することを示し た。したがって、Ｌ−セレクチンのリガンドからこれらの硫酸基修飾部分を除去 する特定のスルファターゼ類は、これらリガンドを不活性化して、Ｌ−セレクチ ンに対する結合性を著しく損う。本発明に関連して用いられる塩素酸塩化合物類 やスルファターゼ酵素のような硫酸化阻害剤を説明する前に、リガンドが生体内 でどのように作動するか説明する。リガンド類の生体内での機能 図１は、血管１の断面図を示す。血管壁２は、内側が内皮細胞３で覆われてい る。白血球６は、図２に表面受容体７として示すＬ−セレクチンを合成し発現す る。赤血球５と白血球６の両者が血管１内を流動している。白血球６は、受容体 ７を示し、その受容体７には内皮細胞３上のリガンド４に結合する化学的特性と 物理的特性がある。受容体７が一旦リガンド４に結合すると、その白血球６は、 白血球細胞６Ａで示すように血管壁２を通過する。周囲の組織８中に入った白血 球６Ｂは、感染と戦うなどの正の作用および炎症のような負の作用をもっている 。炎症は、著しく多数の白血球６Ｂが所 定単位の時間内に組織８に入ることによって起こる。 本発明の発明者らは、自然のリガンド４が特定の位置に硫酸基を含有すること 、そして（１）硫酸化を阻害する塩素酸塩のような競合部分を導入することによ って自然のリガンドの硫酸化を阻害することができかつ（２）特定のスルファタ ーゼ酵素によって硫酸基を特定の位置から取り除いて（外して）、天然リガンド と受容体の結合を左右することができることを発見した。 図２は、硫酸基４Ｂを取り除くと、硫酸化されていないリガンド４Ａの受容体 ７に結合する機能がどのように阻害されるかを示す。したがって、図２は、硫酸 化を阻害するかまたは硫酸基を除去する化合物が、投与されたとき、受容体７（ 白血球６に接続されている）が内皮細胞３上の自然リガンド４に粘着するのをど のように阻害するかを示す。硫酸化を阻害するため医薬として有効量の塩素酸塩 ／セレン酸塩を投与しおよび／または特定位置の硫酸基部分を除くため医薬とし て有効量のスルファターゼ酵素を投与すると、すべてではないがかなりの白血球 が周囲の組織８に到達しない。白血球が周囲の組織に到達する速度を低下させる ことによって、炎症を予防および／または軽減することができる。 上記説明と図１と２に示す模型図に従って、内皮リガンドの硫酸化を妨害する 化合物を添加することにより、リガンド４は硫酸化されず、したがってリガンド ４Ａのような形態になる。このような形態は、受容体７に対して充分に粘着しな い（粘着することはできるが）ので、白血球が内皮細胞に粘着して組織８に入る 速度を低下させ、もって炎症を予防または軽減する。いずれの阻害剤も硫酸化全 体を遮断できないので、阻害剤は、硫酸基を除いて硫酸化されていないリガンド ４Ａを創製して同じ効果を起こさせるため、すなわち リガンド／受容体の結合を妨害するため、スルファターゼとともに使用すること ができる。したがって、塩素酸塩類またはセレン酸ナトリウムなどの阻害剤をス ルファターゼ類と組み合わせることによって、白血球と内皮細胞間のくっ付き防 止について併用効果が得られ、炎症を予防および／または軽減することができる 。硫酸化の重要性 ＨＥＶリガンドが実際に硫酸化されていることが発見される前に、本発明の発 明者らは、ＨＥＶリガンドの作用のために硫酸化が潜在的に重要性であることを 、いくつかの他の硫酸化炭水化物類（例えば、フコイジンすなわちウニのエッグ ゼリーのフカンおよびスルファチド）のＬ−セレクチンに対する強力なリガンド 活性から、気付いていた（Ｓｔｏｏｌｍａｎ，Ｌ．Ｍ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ． Ｄ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、９６巻、７２２〜７２９頁（１９８３ 年）；Ｓｔｏｏｌｍａｎ，Ｌ．Ｍ．、Ｙｅｄｎｏｃｋ，Ｔ．Ａ．およびＲｏｓｅ ｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｂｌｏｏｄ、７０巻、１８４２〜１８５０頁（１９８７年 ）；Ｉｍａｉ，Ｙ．、Ｔｒｕｅ，Ｄ．Ｄ．、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．およびＲｏ ｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１１巻、１２２５〜１ ２３２頁（１９７０年）；Ｔｒｕｅ Ｄ．Ｄ．、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．、Ｌａ ｓｋｙ，Ｌ．Ａ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ．、１１１巻、２７５７〜２７６４頁（１９９０年））。その後、硫酸化の重要 性は知られていなかったが、３−硫酸化Ｌｅ^x／Ｌｅ^a（すなわち、ガラクトース の３位が硫酸化されている）、ＳＧＮＬ、およびその他の硫酸化構造体も、見た ところＬ−セレクチンのＣタイプレクチンドメインとの特異的相互 作用によってＬ−セレクチンに結合できることが実証された（Ｇｒｅｅｎ，Ｐ． Ｊ．、Ｔａｍａｔａｎｉ，Ｔ．、，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．、Ｍｉｙａｓａｋａ ，Ｍ．、Ｈａｓｅｇａｗａ，Ａ．、Ｋｉｓｏ，Ｍ．、Ｙｕｅｎ，Ｃ．Ｔ．、Ｓｔ ｏｌｌ，Ｍ．Ｓ．およびＦｅｉｚｉ，Ｔ．の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８８巻、２４４〜２５１頁（１９９２年）； Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．、Ｔｏｄａ，Ｙ．、Ｔａｍａｔａｎｉ，Ｔ．、Ｗａｔａｎａ ｂｅ，Ｔ．、Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．、Ｎａｋａｏ，Ｔ．、Ｍｕｒａｓｅ，Ｋ．、Ｋ ｉｓｏ，Ｍ．、Ｈａｓｅｇａｗａ，Ａ．、Ｔａｄａｎｏ−Ａｒｉｔｏｍｉ，Ｋ． 、Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｉ．およびＭｉｙａｓａｋａ，Ｍ．の論文、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９０巻、４２６〜４３４頁（ １９９３年）；Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｌ．Ｋ．およびＳｃｈｎａａｒ，Ｒ．Ｌ．の論 文、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、１３５９〜１３ ６３頁（１９９３年））。 これらの各種炭水化物の活性（はたらき）における硫酸化の本質的な役割に基 づいて、本発明の発明者らは、ＧｌｙＣＡＭ−１リガンドの活性に対する硫酸化 の寄与に対して注意を集中した。本発明の発明者らは、（硫酸化の代謝阻害剤と して塩素酸塩を用いて）ＧｌｙＣＡＭ−１の硫酸化が（その全体のシアリル化と フコシル化とは独立して）Ｌ−セレクチンに対するリガンド活性に本質的な役割 を果たしていることを実証した（Ｉｍａｉ，Ｙ．、Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．および Ｒｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｎａｔｕｒｅ、３６１巻、５５５〜５５７頁（１ ９９３年））。硫酸化の重要性は、Ｓｇｐ９０／ＣＤ３４にも当てはまる。他に も、炭水化物の硫酸基による修飾によって定義される生物学的に重要な認識決定 因子の例があ る（Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．、Ｇｒａｂｅｌ，Ｌ．Ｂ．、Ｖａｃｑｕｉｅｒ，Ｖ． Ｄ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、９４巻、 １２３〜１２８頁（１９８２年）；Ｋｊｅｌｌｅｎ，Ｌ．およびＬｉｎｄａｈｌ ，Ｕ．の論文、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６０巻、４４３〜４７５頁 （１９９１年）；Ｒａｐｒａｅｇｅｒ，Ａ．Ｃ．、Ｋｒｕｆｋａ，Ａ．およびＯ ｌｗｉｎ，Ｂ．Ｂ．の論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２巻、１７０５〜１７０８頁 （１９９１年）；Ｒｏｃｈｅ，Ｐ．、Ｄｅｂｅｌｌｅ，Ｆ．、Ｍａｉｌｌｅｔ， Ｆ．、Ｌｅｒｏｕｇｅ，Ｐ．、Ｆａｕｃｈｅｒ，Ｃ．、Ｔｒｕｃｈｅｔ，Ｇ．， Ｄｅｎａｒｉｅ，Ｊ．およびＰｒｏｍｅｍ，Ｊ．Ｃ．の論文、Ｃｅｌｌ、６７巻 、１１３１〜１１４３頁（１９９１年）；Ｆｉｅｔｅ，Ｄ．、Ｓｔｒｉｖａｓｔ ａｖａ，Ｖ．、Ｈｉｎｄｓｇａｕｌ，Ｏ．およびＢａｅｎｚｉｇｅｒ，Ｊ．Ｕ． の論文、Ｃｅｌｌ、６７巻、１１０３〜１１１０頁（１９９１年）；Ｃｅｒａｍ i，Ｃ．、Ｆｒｅｖｅｒｔ，Ｕ．、Ｓｉｎｎｉｓ，Ｐ．、Ｔａｋａｃｓ，Ｂ．、 Ｃｌａｖｉｊｏ，Ｐ．、Ｓａｎｔｏｓ，Ｍ．Ｊ．およびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ ，Ｖ．の論文、Ｃｅｌｌ、７０巻、１０２１〜１０３３頁（１９９２年）；Ｐａ ｎｃａｋｅ，Ｓ．Ｊ．、Ｈｏｌｔ，Ｇ．Ｄ．、Ｍｅｌｌｏｕｋ，Ｓ．およびＨｏ ｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１１７巻、１３５１〜 １３５７頁（１９９２年）；Ｇｕｏ，Ｎ．Ｈ．、Ｋｒｕｔｚｓｃｈ，Ｈ．Ｃ．、 Ｎｅｇｒｅ，Ｅ．、Ｖｏｇｅｌ，Ｔ．、Ｂｌａｋｅ，Ｄ．Ａ．およびＲｏｂｅｒ ｔｓ，Ｄ．Ｄ．の論文、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９ 巻、３０４０〜３０４４頁（１９９２年）；Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｌ．Ｋ．およびＳ ｃｈｎａａｒ，Ｒ．Ｌ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉ ｏｌ．、１２１巻、３９７〜４０８頁（１９９３年））。これらの刊行物は、本 発明の裏にある基本理論を支えるものである。硫酸化の阻害剤 塩素酸塩は、炭水化物硫酸化の代謝阻害剤である（ＢａｅｕｅｒｌｅおよびＨ ｕｔｔｎｅｒの論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、 １４１巻、８７０頁（１９８６年））。したがって、塩素酸塩を使用して、硫酸 化がＧｌｙＣＡＭのリガンド結合活性を得るのに必要かどうか試験した。試験を 行ったところ、リンパ節の臓器培養物中に塩素酸塩（１０ｍＭ）が存在すると、 ＧｌｙＣＡＭとＣＤ３４への³⁵Ｓ−ＳＯ₄の取込みが著しく減少し（約９０％） 、Ｌ−セレクチンに対する結合性が完全になくなった。シアル酸特異的レクチン （ライマックス凝集素（Ｌｉｍａｘ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ））またはフコース 特異的レクチン（アリューリアオーランティア凝集素（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒ ａｎｔｉａ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）に対するＧｌｙＣＡＭの結合性は、変化し なかった。これは、その分子のシアリル化とフコシル化が塩素酸塩の存在で変化 しなかったことを示す。 ＧｌｙＣＡＭ中への［³Ｈ］−フコースの取込みを直接測定することによって 、フコシル化のレベルが塩素酸塩によって影響されないことを直接確認した。ま た、塩素酸塩がＧｌｙＣＡＭまたはＣＤ３４のタンパク質コアの合成速度に影響 しないことも実証した。要約すると、これらの試験結果によって、ＧｌｙＣＡＭ およびＣＤ３４とＬ−セレクチンとの相互作用に対して硫酸基が非常に重要であ ることが確かめられた。シアリル−Ｌｅｗｉｓ Ｘ(すなわち、ｓＬｅ^x)がＬ− セレクチンに対してリガンド活性を有しているので、本 発明の発明者らは、ＧｌｙＣＡＭの主要炭水化物連鎖がｓＬｅ^x様オリゴ糖の硫 酸基修飾部を含有していると推論できた。 硫酸化阻害剤としては、塩素酸ナトリウム（Ｂａｅｎｅｒｌｅ他の論文、Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１４１巻、２号、８７０〜８７７ 頁（１９８６年））およびセレン酸ナトリウム（Ｈｉｌｚ ＆ Ｌｉｐｍａｎｎ の論文、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８０〜８９０頁（ １９５５年）がある。これら阻害剤は、両方とも硫酸化分子の生合成を行うのに 必須である３′−ホスホアデノシン５′−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）の生成を遮断 することによって作用する。 Ｌ−セレクチンに対する内皮リガンドは、非常に限られた量で入手できる。脱 硫酸化によって、これらリガンドのＬ−セレクチンに対するアフィニティーが低 下して、白血球の粘着が遮断される。Ｌ−セレクチンの代謝硫酸化の阻害 マウスのリンパ節のスライスを、１０ｍＭ塩素酸ナトリウムの存在下および非 存在下で³⁵Ｓ−硫酸イオン（³⁵Ｓ−ｓｕｌｆａｔｅ）とともに培養した。デター ジェントライセート（detergent lysate）を調製し、次いでＧｌｙＣＡＭ−１を 認識するいくつかの試薬で沈降させた。ＧｌｙＣＡＭ−１のポリペプチドコアに 結合するペプチド抗体によって、塩素酸塩で処理した上記培養物から免疫沈降さ せた標識ＧｌｙＣＡＭの量は、対照の培養物と比べてかなり減少した。直接シン チレーションカウンティングによって測定したところ、塩素酸塩による処理によ って、ペプチド抗体で免疫沈降された放射能は対照のレベルの１２％まで減少し た。塩素酸塩中での培養によって、ライマックス凝集素およびアリューリアオー レンティアレ クチンそれぞれで沈降した³⁵Ｓ−硫酸イオンの量が同様に減少し、その沈降量は それぞれ対照の１１．４％と１３．７％であった。なお、これらレクチンは、そ れぞれシアル酸およびフコースと反応する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、こ の減少は、ＧｌｙＣＡＭ−１の同等に減少したオートラジオグラフィー強度に反 映されていることが実証された。これらの知見とは対照的に、ＬＥＣ−ＩｇＧす なわちＬ−セレクチンの免疫グロブリンキメラ（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．、Ｉｍ ａｉ，Ｙ．、Ｆｅｎｎｉｅ，Ｃ．、，Ｇｅｏｆｆｒｏｙ，Ｊ．Ｓ．、Ｒｏｓｅｎ ，Ｓ．Ｄ．およびＬａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１ １０巻、２２２１〜２２２９頁（１９９０年））は、塩素酸塩が処理した培養物 から検出可能なＧｌｙＣＡＭ−１バンドを沈降できなかったが、対照には強いバ ンドが見られた。塩素酸塩で処理した培養物からの沈降物には、放射能のバッグ ランドレベル（対照の０．９％）しか測定されなかった。 これらの知見は、塩素酸塩は、硫酸化を全般的に阻害する結果、ペプチド抗体 で沈降されたカウントの比率から推定して、ＧｌｙＣＡＭ−１への硫酸基の取込 みを対照の約１０〜１５％まで減少させたことを示している。その分子の全体の シアリル化またはフコシル化に対する塩素酸塩の明らかな影響は、全くなかった 。というのは、アリユーリアとライマックスで沈降した³⁵Ｓ−ＳＯ₄のカウント の減少は、硫酸イオン取込みの減少と密接に一致していたからである。しかし、 ＬＥＣ−ＩｇＧのＧｌｙＣＡＭとの結合は、問題の機能相互作用を表すものであ るが、塩素酸塩中での培養によって完全に排除された。 塩素酸ナトリウムおよび塩素酸カリウムを含む塩素酸塩のような 阻害剤並びにセレン酸塩のような阻害剤は、硫酸化された生物学的分子を生合成 する場合の硫酸基の一般的ドナーであるＰＡＰＳの生成を阻害することによって 、硫酸化の代謝阻害剤として作用する。したがって、このような阻害剤を使用す ると、硫酸化されなければならない分子の硫酸化を阻害するという点で、他の望 ましくない作用があり得る。したがって、例えば、このような糖タンパク質類の 特定の炭化水素連鎖の硫酸化を阻害する阻害剤を用いることによって、Ｌ−セレ クチンリガンドの硫酸化だけを阻害する硫酸化阻害剤を提供することが望ましい 。具体的に述べると、阻害剤は、Ｌ−セレクチンの内皮リガンド中に存在するガ ラクトースの６位（または、Ｎ−アセチルグルコサミンの６位）に硫酸基が付加 するのを阻害することによって阻害しなければならない。Ｌ−セレクチンに対する塩素酸塩の他の作用 ＧｌｙＣＡＭ−１のフコシル化が塩素酸塩で影響されるかどうかを直接確認す るため、³Ｈ−フコースを代謝前駆物質として利用した。上記ペプチド抗体は、 塩素酸塩と対照培養物から得たデタージェントライセートからほぼ同じｃｐｍ数 を沈降させた。さらに、ＧｌｙＣＡＭ−１成分のオートラジオグラフィの強度は 、両条件で同等であった。しかし、ＬＥＣ−ＩｇＧは対照培養物中のＧｌｙＣＡ Ｍ−１を沈降させたが、ＬＥＣ−ＩｇＧは塩素酸塩で処理された培養物からはバ ックグランドレベルのカウント（対照の７％）しか沈降させず、検出可能なＧｌ ｙＣＡＭ−１は全く存在しなかった。 ＧｌｙＣＡＭ−１のタンパク質コアの合成に対して塩素酸塩がどのように作用 するかを確認するため、本発明の発明者らは、代謝標識として³Ｈ−トレオニン を利用した。調製培地を分析したところ、 ＬＥＣ−ＩｇＧは、対照培養物から著しくＧｌｙＣＡＭ−１成分を沈降させたが 、塩素酸塩が培養物中に存在していた場合はどの成分とも反応しなかった。塩素 酸塩による処理のありまたはなしで、ＧｌｙＣＡＭ−１のコアタンパク質に対す る２種の抗体は、約５０Ｋで走行する広いバンドを沈降させた。 以上をまとめると、これらの試験結果は、塩素酸塩は、ＧｌｙＣＡＭ−１の硫 酸化を実質的に阻害するが、ＧｌｙＣＡＭ−１の炭水化物連鎖のシアリル化とフ コシル化に加えて、タンパク質コアの生合成を正常に進行させることを示してい る。ＬＥＣ−ＩｇＧとの反応性が完全に失われたことは、結合するのに硫酸化が 重要であることを立証している。ＧｌｙＣＡＭ−１のＯ−結合炭水化物連鎖が硫 酸化されていることが分かり、そしてポリペプチドが硫酸基付加のための潜在的 チロシン残基を１個だけもっているので、本発明の発明者らは、重要な硫酸基は 炭水化物連鎖上にあるに違いないと結論した。ＣＤ３４／Ｓｇｐ９０もＬ−セレ クチンの硫酸化リガンドである。この分子の硫酸化が塩素酸塩処理によって阻害 されたとき、この分子がＬ−セレクチンと相互に作用する性能も激しく阻害され た。ＧｌｙＣＡＭ−１の硫酸化オリゴ糖の確認 上述したように、ＧｌｙＣＡＭ−１とＣＤ３４／Ｓｇｐ９０（２種の内皮関連 リガンド）の硫酸化は、これらリガンドがＬ−セレクチンと相互作用を行うのに 必要である。スルファターゼは特異的である（すなわち、特定の位置から硫酸化 を取り除く）ので、これら自然リガンドの炭水化物の正確な硫酸化修飾部分を定 義することが最も重要であった。ＧｌｙＣＡＭ−１を、³⁵ＳＯ₄とトリチウム化 炭 水化物前駆物質のパネルとでリンパ節器官培養において代謝で標識を付けた。硫 酸エステルを分解することなく硫酸化オリゴ糖を放出するゆるやかな加水分解条 件を確立した。ゲル濾過とアニオン交換クロマトグラフィを組み合わせることに よって得られた低分子量で単一電荷のフラグメントを分析した。このフラグメン トの構造同定は、放射能標識を付けた各種の糖前駆物質を用い、次に化学的およ び酵素による加水分解を行い、そして高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー分 析を行うことによって実施した。ＧｌｙＣＡＭ−１の硫酸化成分は、Ｇａｌ−６ −ＳＯ₄、ＧｌｃＮＡｃ−６−ＳＯ₄、（ＳＯ₄−６）Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡ ｃおよびＧａｌβ１→４（ＳＯ₄−６）ＧｌｃＮＡｃであると同定された。 シアル酸とフコースもＧｌｙＣＡＭ−１とＣＤ３４／Ｓｇｐ９０の活性にとっ て不可欠である（Ｉｍａｉ，Ｙ．、Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ ．Ｄ．の論文、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２巻、３７３〜３８１頁（１９９２ 年））。ＧｌｙＣＡＭ−１の硫酸化された単糖と二糖に対するシアル酸とフコー スの関係を定義するため、本発明の発明者らは、特異性が定義されているレクチ ンを特定のエキソ−グリコシダーゼとともに用いて、三つの重要要素をすべて含 有する主要キャッピング構造（major capping structure）を同定した。マーキ ア・アムレンシス（Maackia amurensis）凝集素（Ｋｎｉｂｂｓ，Ｒ．Ｎ．、Ｇ ｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ｊ．、Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ，Ｒ．Ｍ．およびＳｈｉｂｕ ｙａ，Ｎ．の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻、８３〜８８頁（１９ ９１年））と、充分にシアリル化された低硫酸化度のＧｌｙＣＡＭ−１との相補 反応性、並びにサンブクス・ニグラ（Sambucus nigra）凝集素／トリコサンテス ・ジャポニカ（Trichosanthes japonica） 凝集素（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｋ．、Ｕｍｅｔｓｕ，Ｋ．、Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ． およびＯｈｋｕｒａ，Ｔ．の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻、１１６ ４７〜５０頁（１９９２年））と、脱シリアル化されているが正常に硫酸化され たＧｌｙＣＡＭ−１との相補反応性は、末端の６′硫酸化シアリルラクトサミン 、すなわち Ｓｉａα２→３（ＳＯ₄−６）Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃが存在 していることを示している。 フコースの置換を確認するため、本発明の発明者らは、ストレプトマイセスα （１→３／４）フコシターゼ（Ｍａｅｍｕｒａ，Ｋ．およびＦｕｋｕｄａ，Ｍ． の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻、２４３７９〜２４３８６頁（１ ９９２年））を利用した。この酵素は、アシアロ−ＧｌｙＣＡＭ−１からフコー スをほとんど定量的に除去し（取り外し）、一方リコペルシカン・エスクレンタ ム（Lycopersican esculentum）凝集素、すなわちβ１→４結合ＧｌｃＮＡｃに 対して特異性を有するレクチンに対するフコースの結合を実質的に強化する（Ｍ ｅｒｋｌｅ，Ｒ．Ｋ．およびＣｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．、２６２巻、８１７９〜８１８９頁（１９８７年））。これらの試 験結果は、ＧｌｃＮＡｃに対するα１→３結合中にＦｕｃが存在していることを 示す。ＧｌｙＣＡＭ−１の脱フコシル化を達成するために脱シアリル化が厳密に 必要であるという知見は、Ｆｕｃが末端のシアル酸の近くに位置していることを 示す。上記キャッピング基の性質は、さらに、エキソ−β（１→４）ガラクトシ ダーゼ（Ｍａｅｍｕｒｅ，Ｋ．およびＦｕｋｕｄａ，Ｍ．の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻、２４３７９〜２４３８６頁（１９９２年））がＧｌｙ ＣＡＭ−１から［³Ｈ−Ｇａｌ］を放出する性能に対する硫酸化、シア リル化およびフコシル化の作用を試験することによって定義した。これらの試験 結果は、上記の加水分解の分析結果とともに、６′−硫酸化シアリルＬｅｗｉｓ ｘ、すなわち Ｓｉａα２→３（ＳＯ₄−６）Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃαｌ→３）ＧｌｃＮ Ａｃ がＧｌｙＣＡＭ−１の主要キャッピング基であることを示している。この構造は 、シアリルＬｅｗｉｓ ｘの修飾部分であり、Ｌ−セレクチンに対して弱いリガ ンド活性を有することが分かっている（Ｉｍａｉ，Ｙ．、Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ． およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｇｌｙｃｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻，３７ ３〜３８１頁（１９９２年））。上記キャッピング構造体中のＧｌｃＮＡｃが６ 硫酸化で修飾されているのかどうか、またはα（１→３）フコシル化と６−硫酸 化がＧｌｃＮＡｃ残基に対する排他的な置換を相互に示すのかどうかは現在のと ころ分かっていない。可能性がある構造体のリストは、本発明の発明者らの米国 特許出願第０８／１５５，９４７号（１９９３年１１月１９日出願）に記載され ている。 したがって、本発明の発明者らは、下記の二つの構造が、ＧｌｙＣＡＭ−１内 の単糖の主要硫酸化修飾部分を表していると決定した。 （ＳＯ₄−６）Ｇａｌおよび （ＳＯ₄−６）ＧｌｃＮＡｃ 硫酸化は、ＧｌｙＣＡＭ−１のリガンド活性のためには不可欠であるから、生 体内でこれら硫酸基を取り除くため特定のスルファターゼを使用することは、炎 症部位への白血球の侵入を大きく減少させるのに有用である。スルファターゼ酵素類 スルファターゼ酵素類は、公知である。さらに、スルファターゼ酵素類が、天 然起源から抽出するかまたは遺伝子組換え法によって産生させることができるこ とは、公知である。本発明の製剤と方法に用いられるスルファターゼ酵素類は、 天然起源から抽出して精製するかまたは遺伝子組換え法で産生させることができ る。一般に、スルファターゼ酵素の抽出および／または組換え法による産生に続 いて、当該技術分野の当業者にとって公知の方法を用いて精製が行われる。これ らスルファターゼ酵素は、次のような起源から抽出することができる。すなわち 、細菌、真菌、植物、無脊椎動物、哺乳類の起源例えば肝臓、腎臓、胎盤、脳、 白血球または内皮細胞などである。抽出と精製は可能であるが、いくぶん厄介で ある。したがって、組み換法を用いて本発明のスルファターゼ酵素を得ることが 好ましい。 スルファターゼ酵素類は、非常に特異的に作用する。いずれの既知のスルファ ターゼ酵素も、一般に、特定の分子の特定の位置から硫酸基部分を取り除くこと だけに有用である。本発明の発明者らは、硫酸基部分がリガンドの特定の糖分子 の特定の位置に存在していることを確認した（以下参照）ので、本発明を実施す るため、硫酸基部分を除去する特定のスルファターゼ酵素を得ることが必要であ る。抽出されるかまたは組換え法で産生される酵素の機能性は、当該技術分野の 当業者であれば容易に確認することができる。この確認は、酵素を、適当な条件 下で硫酸化セレクチンリガンドと接触させ、次に硫酸基部分のリガンドからの除 去の程度を測定して行った。本明細書の開示にしたがって、硫酸基部分の除去は 、リガンドがセレクチン受容体に結合する性能を実質的に阻害されることに関連 するので、その除去に注目することによって確認することができる。 ＧｌｙＣＡＭとＣＤ３４／Ｓｇｐ９０の硫酸化修飾部分に関連する特定のスル ファターゼ酵素は、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ他の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２９ ３巻、６８３〜６８９頁（１９９３年）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ他の論文、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１５７巻、２１８〜２２ ４頁（１９８８年）、およびＴｏｍａｔｓｕ他の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８１巻、６７７〜６８３頁（１９９１年 ）に開示されている。これらの各刊行物は、スルファターゼ酵素類、これら酵素 類のアミノ酸配列、これらスルファターゼ酵素類をコード化するＤＮＡ配列、お よびこれら酵素類を組換え法で産生させ次いで精製する方法を開示し説明するた め、本明細書に援用するものである。 本発明に用いるのに有用な好ましいスルファターゼ酵素としては、Ｎ−アセチ ルガラクトサミン−６−サルフェート／ガラクトース−６−サルフェートスルフ ァターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートスルファターゼがある 。本発明の発明者らは、硫酸基部分がセレクチンリガンドのガラクトース分子と Ｎ−アセチルグルコサミン分子の６位に存在していることを見出したので、本発 明に用いて有用なスルファターゼとしては、これらの硫酸基部分を除去できるも のが好ましい。使用と投与 （１）各種塩素酸塩、（２）スルファターゼ類、および（３）その組合せなど の化合物を配合して医薬製剤とし、これを必要とする 対象に投与して患者を治療することができる。これら製剤は、炎症を予防するた め予防的に投与するか、または炎症が始まった後で炎症を軽減するために投与す る。上記スルファターゼ類と、塩素酸ナトリウムもしくは塩素酸カリウムおよび セレン酸ナトリウムなどの硫酸化の代謝阻害剤とは、医薬として許容される担体 とともに投与することが好ましく、担体の種類は投与法によって異なり、例えば 経口投与では通常固体の担体を用い、そしてＩ．Ｖ．投与では液体の食塩水の担 体を用いる。製剤および／または投与手段は、塩素酸塩またはスルファターゼが 投与されているかどうかによっても変わる。スルファターゼは、一般に経口では 投与されずＩ．Ｖ．によって投与される酵素である。 所望の製剤は、各種の賦形剤を用いて製造することができ、賦形剤としては、 それぞれ医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マ グネシウム、ナトリウムサッカリンセルロース、炭酸マグネシウムなどがある。 経口用組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持効性製剤または散 剤の形態で摂取できる。ＤＭＳＯのような透過促進剤を含有する経皮製剤で塩素 酸塩またはセレン酸塩を直接投与することが特に有効である。他の局所製剤は、 皮膚の炎症を治療するのに投与することができる。 治療上有効な量は、かなりな比率の数のリガンドの硫酸化を阻害しまたは該リ ガンドから硫酸基部分を除いて炎症を予防または軽減できるのに充分な量である 。したがって、「治療する」という用語は、本明細書で用いる場合、炎症および ／または炎症に関連する症状を予防または軽減することを意味するものとする。 典型的には、本発明の組成物は、１％未満〜約９５％好ましくは約１０％〜約５ ０％の活性成分を含有している。好ましくは、約１００mg〜５００ mgを小児に投与し、約５００mg〜５ｇを成人に投与する。投与は、注射によるこ とが好ましく、局在領域に注射することがさらに好ましい。投与頻度は、患者の 反応性に基づいて与えられる治療によって決定される。他の有効な投与量は、用 量−反応曲線を確立するルーチン試験によって当該技術分野の当業者によって容 易に決定することができる。 スルファターゼ酵素の量を算出するため、当該技術分野の当業者であれば、与 えられた量のスルファターゼを放出するのに必要な酵素の量について容易に入手 できる情報を利用できよう。例えば、与えられた酵素が、１単位の該酵素が生理 的ｐＨ下で１マイクロモル／分のＳＯ₄をＬ−セレクチンリガンドから除くよう な活性を有している場合、治療目的のために、７０ｋｇのヒトに１〜１０単位を 静脈から投与する。硫酸化を阻害するのに必要な塩素酸塩その他の阻害剤の量も 、生体外の実験に基づいて算出することができる。例えば、与えられた量のＬ− セレクチンリガンドの硫酸化を阻害するのに必要な塩素酸塩の量を算出し、次い で治療すべき領域内のかようなリガンドの量を推定することによって、投与すべ き塩素酸塩の量を決定することができる。阻害剤の量は、勿論、使用される特定 の阻害剤によって変わる。 投与すべきスルファターゼまたは塩素酸塩（もしくはセレン酸塩）の投与量を 決定する場合、硫酸化を完全に阻害することや全ての硫酸基を取り除くことを望 んでいるのではないことに留意しなければならない。正常な治療過程が進行する には、少なくともいくらかの白血球または好中球が、創傷、感染または疾病状態 が起こっている領域の組織中に入っていかなければならない。投与されるスルフ ァターゼまたは塩素酸塩／セレン酸塩の量は、治療中の疾患のタイ プなどの各種の要因を考慮しながら、患者特有の必要に基づいて調節される。 スルファターゼ類および／または塩素酸塩類／セレン酸塩類は、広範囲の疾患 を治療するのに用いることができる。その疾患としては、リウマチ様関節炎、喘 息、成人型呼吸窮迫症候群、サルコイドーシス、過敏症性肺炎、多発性硬化症お よび皮膚部位へのリンパ腫の拡延などがある。本発明の組成物は、免疫系が身体 に敵対して、白血球を、組織の損傷、腫脹、炎症および／または痛みを起こす程 度まで組織中に蓄積する病状を治療するのに適用できなければならない。例えば 、リウマチ様関節炎の炎症は、大量の白血球が疾患の領域の関節に迅速に浸入し て周囲の組織を攻撃するときに起こる。 また、スルファターゼ類および／または塩素酸塩類／セレン酸塩の製剤は、心 臓発作からもたらされる組織損傷の望ましくない後遺症を予防するために投与す ることができる。心臓発作が起こり、次いで、例えば抗凝固薬または血栓溶解薬 （例えば、ｔｐＡ）を適用することによって患者が回復した場合、血餅が形成さ れた内皮被膜は、損傷を受けていることが多い。抗血栓症薬が血餅を除いた場合 、血餅の下側の損傷組織その他の酸素を与えられなかった内皮被膜中の損傷組織 が活性化される。白血球は、Ｌ−セレクチンを持っている。その受容体は、活性 化された内皮細胞の表面のリガンド分子に粘着する。そのリガンド分子は、活性 化によって内皮細胞の表面に誘発される。多数の白血球が迅速に捕捉されて冒さ れた領域を囲む組織中に入り、炎症、腫脹および患者の生存の可能性を低下させ る壊死を起こす。 心臓発作から起こる外傷を受けている患者を治療することに加えて、実際の身 体外傷がみられる患者は、身体の部分が重篤な外傷を 受けたのち通常起こる炎症と腫脹の量を軽減するため本発明の製剤で治療できる 。この治療は、外傷を受けた領域に、スルファターゼおよび／または塩素酸塩／ セレン酸塩を局所注射することによって実施することが最も好ましい。また、出 血性ショックがみられる患者は、治療して、回復血液流に伴う炎症を軽減するこ とができる。本発明の製剤を用いて治療することができる他の病状としては、各 種のタイプの関節炎、皮膚の各種慢性炎症状態、インスリン依存性糖尿病および 成人型呼吸窮迫症候群がある。本明細書の開示を読めば、当該技術分野の当業者 は、本発明の製剤の投与により治療および／または軽減できるかも知れない他の 病状および／または症状を認識するであろう。 他の投与方法も本発明に利用することができる。例えば、本発明のスルファタ ーゼおよび／または塩素酸塩／セレン酸塩は、坐薬として配合してもよく、場合 によってはエアゾル組成物および鼻腔内用組成物として配合してもよい。坐薬の 場合、賦形剤組成物としては、ポリアルキレングリコール類またはトリグリセリ ド類のような伝統的な結合剤や担体がある。このような坐薬は、活性成分を約０ ．５％〜約１０％（ｗ／ｗ）の範囲内、好ましくは約１％〜約２％（ｗ／ｗ）の 範囲内で含有する混合物から製造することができる。 鼻腔内製剤は、通常、鼻粘膜の刺激を起こさず毛様体の機能を大きく損なうこ ともない賦形剤を含有している。水、食塩水その他の公知の物質のような希釈剤 を本発明に用いることができる。また鼻腔内製剤は、限定されないが、例えばク ロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムのような保存剤を含有していてもよ い。鼻粘膜による対象のタンパク質の吸収を促進するため、界面活性剤を添加し てもよい。 各種の異なる呼吸器疾患が炎症により悪化する症状を呈するが、本発明の全て の面が、そのような症状の悪化を緩和しおよび／または予防するためにそのよう な疾患の治療に使用され得る。この治療は、本発明のスルファターゼおよび／ま たは塩素酸塩／セレン酸塩の局所肺投与によって実施することが好ましい。その ような化合物は、肺表面の通路に局所的に送達させることができる。エアゾル製 剤は、通常の投与量計量式吸入器（metered dose inhaler）（ＭＤＩ）を用いて 送達させることができる。スルファターゼまたは塩素酸塩／セレン酸塩のいずれ かまたはすべてを適切な噴射剤とともに配合し、その製剤をＭＤＩで送達させる ことによって、肺の炎症を非常に短期間に軽減することができる。 本発明のスルファターゼおよび／または塩素酸塩／セレン酸塩は、注入可能医 薬として投与することが好ましい。典型的に、注射用組成物は、液状の液剤また は懸濁剤として調製されるが、注射する前に液状賦形剤で溶液または懸濁剤にす るのに適した固体形態のものを用意してもよい。製剤は、乳化してもよく、また は活性成分をリボゾーム賦形剤で被包してもよい。 適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノ ールなど、およびそれらの組合せである。さらに、所望により、賦形剤は、湿潤 剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤のような補助物質を少量含有していてもよい。この ような剤形の実際の製造方法は、当該技術分野の当業者にとって公知であるかま たは明らかであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎ ｙ、米国ペンシルベニア州イーストン所在、第１７版、１９８５年を参照。投与 される組成物または製剤は、いずれにし ろ、治療されている対象箇所に所望の状態を得るのに充分な量の塩素酸塩／セレ ン酸塩および／またはスルファターゼを含有する。 上記に指摘したように、スルファターゼ酵素と硫酸基阻害剤の主な適応は、炎 症を予防または緩和することである。しかし、Ｌ−セレクチンは、リンパ腫の皮 膚部位への拡延に関与している（Ｍｉｃｈｉｅ，Ｓ．Ａ．他の論文、Ａｍｅｒｉ ｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１４３巻、１６８８〜１ ６９８頁（１９９３年）を参照）。スルファターゼと硫酸基阻害剤を使用すると 、リンパ腫または他の造血性新生物の皮膚部位への血行性拡延の予防を助長する 。各種の形態の癌が人体内で拡延するには、その癌性細胞はその元の腫瘍を離れ 、次いで別の部位に取り付き、その部位で癌性成長が続く。本明細書に記載され ているようにスルファターゼ酵素および／または硫酸基阻害剤を投与することに よって、他の部位への癌性細胞の再付着が妨害または阻害される。 本発明の各種スルファターゼ類と塩素酸塩類／セレン酸塩類は、それら自体で 、または互いに一緒に、または上記のような医薬として許容される賦形剤と組み 合わせて使用することができる。 実施例 以下の実施例は、Ｌ−セレクチンリガンドの、Ｌ−セレクチンとの相互作用お よび／または結合に対して、Ｌ−セレクチンリガンド上に存在する硫酸基が重要 であることを示すために実施された方法を、当該技術分野の当業者に完全に開示 し説明するのを目的として示した。これらの実施例は、本発明の発明者らが自分 たちの発明とみなしているものの範囲を限定するものではない。利用した数値（ 例えば量、温度など）の正確さを保証するために努力したが、いく つかの実験誤差やズレもあり得る。特に断らない限り、量部は重量部であり、分 子量は重量平均分子量であり、温度は℃であり、そして圧力は大気圧かまたはそ の近傍である。 特に断らない限り、本明細書で用いられる技術用語と科学用語は、全て、本発 明が属している技術分野の当業者が普通に理解しているのと同じ意味をもってい る。本明細書に記載されているのと類似のまたは等価の方法と材料が本発明の実 施または試験に使用できるが、ここでは好ましい方法と材料を記載する。本明細 書に挙げた刊行物は、全て本明細書に援用するものである。 実施例１ ＧｌｙＣＡＭ−１の硫酸化を阻害すると、ＧｌｙＣＡＭ−１のＬ−セレクチン との相互作用および／または結合がなくなる。リンパ節に、塩素酸塩の存在下ま たは非存在下で、（ａ）［³⁵−Ｓ］−サルフェート（硫酸塩）または（ｂ）〔³ −Ｈ〕フコースで臓器培養中に代謝で標識が付けられ、そしてデタージェントラ イセートがＬ−セレクチンキメラ（ＬＥＣ−ＩｇＧ）、ウサギ抗Ｓｇｐ５０ペプ チド抗体（抗ペプチド２）、ウサギ前免疫血清（preimmune serum）、ライマッ クス・フラブス（Limax flavus）凝集素（シアル酸特異性）、またはアリューリ ア・アウランティア凝集素（ＡＡＡ；フコース特異性）によって沈降したときに 、上記結論に到達した。［³−Ｈ］−フコースで標識を付けたＧｌｙＣＡＭ−１ の見掛けの分子量は、塩素酸塩が存在する場合僅かに大きかった。というのは、 恐らく、硫酸化が低下したことによって電気泳動の移動度が小さくなったためで あろう。 ＩＣＲマウス由来の腸間膜リンパ節と末梢リンパ節を集めて（１ 条件あたり８０ｍｇの湿潤重量）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有ＲＰＭＩ−１６４ ０の０．５ｍｌ中、１０ｍＭの塩素酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ社）の存在下 または非存在下（１／１０硫酸塩濃度）で、（ａ）２５０μＣｉの［³⁵−Ｓ］− 硫酸ナトリウム（ＩＣＮ）または（ｂ）２５０μＣｉの［５，６−³Ｈ］−Ｌ− フコース（ＩＣＮ）とともに、３７℃で４時間インキュベートした。組織は、１ ｍＭのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ社）、１％（ｖ／ｖ）のアプロチニン（Ｓｉｇｍａ 社）、１０μｇ／ｍｌのペプスタチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ社）および０．０２％のＮａＮ₃を含有するダルベッコのＰＢＳ（溶解緩衝液 （lysis buffer））中に２％のトリトンＸ−１００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ ａｎｎｈｅｉｍ社）を含有する液１．２ｍｌでさきに記載したようにして抽出し た¹¹。ライセート（lysate）を３分間沸騰させ、上澄み液をプロテインＡセファ ロース（Ｚｙｍｅｄ社）１００μｌで一夜、前洗浄を行った。その前洗浄済み上 澄み液の一部を、以下のビーズすなわちＩＥＣ−ＩｇＧ−プロテインＡセファロ ースビーズ（３０μｇＬＥＣ−ＩｇＧ／１０μｌビーズ）、ウサギ抗ペプチド２ −プロテインＡビーズ（１０μｌ血清／１０μｌビーズ）、ウサギ前免疫血清プ ロテインＡビーズ（１０μｌ血清／１０μｌビーズ）、ライマックス・フラブス 凝集素−セファロースビーズ（２０μｇタンパク質／１０μｌビーズ）、または アリューリア、アウランティア凝集素−セファロースビーズ（１０μｇタンパク 質／１０μｌビーズ）の１０μｌずつに添加し、ロッカー上で４℃で４時間イン キュベートした。これらビーズを前記溶解緩衝液で（６回）洗浄し、上記ビーズ の１／１４ずつを、シンチレーションカウンティングで直接カウンティングを行 うために採取し、残りのレムリ（Laemmli）試料緩衝液（β −メルカプトエタノールなし）で可溶化し、次いでＥＮＨＡＮＣＥ（Ｎｅｗ Ｅ ｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社）を利用するフルオログラフィーにより１０％ アクリルアミドゲル（非還元条件）上を泳動させた。分子量マーカー（ＢｉｏＲ ａｄ社）は、ホスホリラーゼＢ（９７．４Ｋ）、ＢＳＡ（６６．２Ｋ）、オボア ルブミン（４５Ｋ）、カルボニックアンヒドラーゼ（３１Ｋ）、ダイズトリプシ ンインヒビター（２１．５Ｋ）であった。４℃で一夜ロッキング（揺動）するこ とによって、ＬＥＣ−ＩｇＧと抗血清をプロテインＡ−セファロースビーズにコ ートした。ライマックス凝集素（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）とＡＡＡ（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）をＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（Ｓｉ ｇｍａｎ社）にカップリングさせることによってレクチンビーズを調製した。Ｍ ｉｌｌｅｒ，Ｒ．の論文、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８巻、５２７〜５ ３６頁（１９８７年）。 実施例２ ＧｌｙＣＡＭ−１の硫酸化を阻害すると、ＧｌｙＣＡＭ−１の、Ｌ−セレクチ ンとの相互作用および／または結合がなくなる。塩素酸塩の存在下（黒色バー） または非存在下（網線バー）で、（ａ）［³⁵−Ｓ］硫酸塩または（ｂ）［³−Ｈ ］−フコースで標識をつけた、実施例１の同じ沈降物の部分のシンチレーション カウンティングを行ったときに、上記結論に到達した。与えられたパネル（ａ） （記載せず）に示した百分率は、塩素酸塩の存在下、塩素酸塩の非存在下に比べ て得られたカウントの百分率を示す。抗ペプチド２、ライマックスおよびＡＡＡ に対する値は、硫酸化が全般的に低下していることを反映してほぼ同じであった 。独立した実験において、対 応する値は、６％（ＬＥＣ−ＴｇＧの場合）、３５．６％（抗ペプチドの場合） 、３５．３％（ライマックスの場合）であった。 実施例３ ＧｌｙＣＡＭ−１の硫酸化を阻害すると、ＧｌｙＣＡＭ−１の、Ｌ−セレクチ ンとの相互作用および／または結合がなくなる。塩素酸塩の存在下または非存在 下でリンパ節にＬ−［３−³Ｈ］−トレオニンで標識をつけたとき、上記結論に 到達した。調製培地（ａ）またはデタージェント抽出物（ｂ）を、ＬＥＣ−Ｉｇ Ｇ、ウサギ抗Ｓｇｐ５０抗ペプチド抗体類（抗ペプチド１、２、３）またはウサ ギ前免疫血清で沈降させた。 １０ｍＭの塩素酸ナトリウムの非存在下または存在下で、トレオニンなしで１ ／１０の硫酸塩濃度のＲＰＭＩ１６４０（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ含有）０．５ｍ ｌ中で、７５０μＣｉのＬ−［３−³Ｈ］トレオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に より、３７℃で４時間かけて、マウスリンパ節に標識をつけた。デタージェント ライセートを沸騰させ、前洗浄し、次いで実施例１に記載したようにして指定の 試薬で沈降させた。調製培地を平行して前洗浄して沈降させた。ビーズに結合し た物質を、フルオログラフィーを用い還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。 抗ペプチド抗体のレーンで約５０Ｋの成分が免疫グロブリンの重鎖によって圧縮 （compress）された。 実施例４ マウスリンパ節の代謝標識化 代謝標識化を行う（Ｉｍａｉ，Ｙ．、Ｌａｓｔｙ，Ｌ．Ａ．およびＲｏｓｅｎ ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｎａｔｕｒｅ、３６１巻、５５５ 〜５５７頁（１９９３年））ため、腋窩、上腕、頚部および腸間膜それぞれのリ ンパ節を５頭のＩＣＲマウスから切り取り、かみそりの刃でさいの目に切り、次 いでペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ ｍｌ）を補充した１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中でインキュベートした。上記組 織は、Ｄ−［６− ³ Ｈ］−ガラクトース、Ｄ−［６−³Ｈ］−グルコサミン、Ｄ− ［２−³Ｈ］−マンノース（０．５ｍＣｉ／ｍｌ、全て米国マサチューセッツ州 ボストン所在のＤｕ Ｐｏｎｔ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社か ら入手）、Ｌ−［５，６−³Ｈ］−フコース、またはＮａ₂ ³⁵ＳＯ₄（１ｍＣｉ／ ｍｌ、両者とも米国カリフォルニア州コスタメーサ所在のＩＣＮ社から入手）の 存在下で、４時間（３７℃）培養した。³⁵ＳＯ₄による標識化は、９０％の硫酸 塩なしＲＰＭＩ−１６４０と１０％の標準ＲＰＭＩ−１６４０の混合物中で行っ た。調製培地を培養物から収集し、１０，０００×ｇで５分間遠心分離にかける ことによって透明にした。ＧｌｙＣＡＭ−１の免疫沈降 全ステップを４℃で実施した。推論ＧｌｙＣＡＭ−１タンパク質コア由来のペ プチド：ＣＫＥＰＳＩＦＲＥＥＬＩＳＫＤ（ｐｅｐ２）に対するウサギポリクロ ーナル抗体で誘導体化したプロテインＡ−セファロース４Ｂ（米国カリフォルニ ア州サンフランシスコＺｙｍｅｄ社、２．５ｍｇ組換えプロテインＡ／ｍｌゲル ）を２０μｌ添加することによって、ＧｌｙＣＡＭ−１を調製培地から免疫沈降 させた（Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．、Ｄｏｗｂｅｎｋｏ， Ｄ．、Ｉｍａｉ，ｙ．、Ｈｅｎｚｅｌ，Ｗ．Ｊ．、Ｇｒｉｍｌｅｙ，Ｃ．、Ｆｅ ｎｎｉｅ，Ｃ．、Ｇｉｌｌｅｔ，Ｎ．、 Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｃｅｌｌ、６９巻 、９２７〜９３８頁（１９９２年））。得られたマトリックスをトリス緩衝食塩 水（ＴＢＳ：１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で５ 回洗浄し、次に遊離ｐｅｐ２（１ｍｇ／ｍｌ）を含有するＴＢＳの２００μｌを 添加することによって、結合リガンドを該マトリックスから溶出させた。調製物 の１／１０（２０μｌ）を、レムリ法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．の論文、Ｎａ ｔｕｒｅ、２２７巻、６８０〜６８５頁（１９７０年））に従って１０％ポリア クリルアミドゲル上でＳＤＳゲル電気泳動に付し、続いてＥｎｈａｎｃｅ（Ｎｅ ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社）を使用してフルオログラフィ解析した 。ＧｌｙＣＡＭ−１のゆるやかな酸加水分解 上記リガンド生成物を、０．２ＭのＨ₂ＳＯ₄で処理し（最終容積２５０μｌ） 、透明な鉱油（Ｓｉｇｍａ社）で液面を覆い、次いで１００℃で３０分間インキ ュベートした。薄層クロマトグラフィー 上記加水分解物を５０μｌの２ＮのＮＨ₄ＯＨで中和した後、その１μｌずつ ２個の試料を１００ｍｍ×５０ｍｍシリカゲルコートガラス板（６０ Ｆ２５４ 、ドイツダルムシュタット所在のＭｅｒｃｋ社）につけた。１ｍＭのＮａ³⁵ＳＯ₄ 溶液０．５μｌずつ二つ（各々５０００ｃｐｍ）を同じガラス板につけた。一 方の溶液は、加水分解物に重ね、第二の溶液は別のレーンにつけた。そのガラス 板を、ｎ−ＢｕＯＨ／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）／１Ｍホウ酸ナ トリウムｐＨ９、５０：２０：２５、で展開し、続いてＥ ｎｈａｎｃｅのスプレイ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社）でフル オログラフィーに付した。ゆるやかな酸加水分解物のゲル濾過による初期分画 上記中和された加水分解物を、Ｍピリジン酢酸ｐＨ５．４中２．５％ヘモグロ ビン（Ｓｉｇｍａ社）の５０μｌと混合し、ピリジン酢酸（０．１Ｍ、ｐＨ５． ４）中のＢｉｏｇｅｌ Ｐ４カラム（２００〜４００メッシュ、米国カリフォル ニア州リッチモンド所在のＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、１１ ２ｃｍ×１ｃｍ、ベッド容積＝８８ｍｌ）中に注入した。そのカラムを、同じピ リジン酢酸緩衝液で５ｍｌ／ｈの流速で２２℃で溶出させて、３０個の画分（０ ．８３〜０．８７ｍｌ）を収集した。各画分の試料４０μｌずつを、Ｕｌｔｉｍ ａ Ｇｏｌｄシンチレーションカクテル（米国イリノイ州ダウナーズグローブ所 在のＰａｃｋａｒｄ社）５ｍｌと混合し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ−８０００液体 シンチレーションカウンタで計数した。溶出容積は、２８．４ｍｌで起こったヘ モグロビンの最初の出現（空隙容量）に対して表す。ゲル瀘過分析に用いた炭水化物の標準 Ｐ４カラムは、以下のようにして得た炭水化物の標準で校正した。代謝により ［³Ｈ］−グルコサミンで標識化したＧｌｙＣＡＭ−１をシアリダーゼで処理す る（アルスロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）、米 国カリフォルニア州ラホーヤ所在のＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、０．３単位／ｍｌ 、ｐＨ５．５、３０分、３７℃）ことによって、［³Ｈ］−シアリル酸を得た。 Ｎ−アセチルグルコサミン−３−サルフェート（ＧｌｃＮＡｃ−３Ｓ、 ナトリウム塩）とガラクトース−６−サルフェート（Ｇａｌ−６Ｓ、ナトリウム 塩）は、Ｓｉｇｍａ社製であった。グルクロン酸モノサルフェート（ＧｌｕＵ− ＳＮ異性体の混合物）は、グルクロン酸を無水ＤＭＦ中２モル当量のＳＯ₃−ト リメチルアミンで不活性雰囲化下で（４時間、２５℃）処理して、調製した（Ｗ ｅｓｔｅｒｄｕｒｉｎ，Ｐ．、Ｗｉｌｌｅｍｓ，Ｈ．Ａ．およびｖａｎ Ｂｏｅ ｋｅｌ，Ｃ．Ａ．Ａ．の論文、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、３１巻、 ６９１５〜６９１８頁（１９９０年））。反応を飽和ＮａＨＣＯ₃で中和し、生 成物を、０．２Ｍピリジン酢酸（ｐＨ５．４）の直線勾配液で溶離するＤＥＡＥ −Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ａｌｄｒｉｃｈ社）のクロマトグラフィーで精製した。得 られたピリジウム塩を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社の５０Ｗ−Ｘ４樹脂（Ｎａ⁺型）を通 過させることによって、ナトリウム塩に変換した。ガラクトース−ジサルフェー トとガラクトース−トリサルフェート（異性体の混合物）は、ガラクトースを、 無水ＤＭＦ中５モル当量のＳＯ₃−トリメチルアミンで処理し（４０℃で６時間 ）、次に飽和ＮａＨＣＯ₃で中和することによって、調製した。生成物をアニオ ン交換クロマトグラフィーで精製し、得られたピリジニウム塩を上記のようにし て対応するナトリウム塩に変換した。３種の合成誘導体は、全て、負の高速原子 衝撃（ＦＡＢ）質量分析法で、特性を解析した。Ｐ４カラムから溶出した画分中 のＧｌｃＮＡｃ−３Ｓを、エルソン−モルガン反応で検出した（Ｒｅｉｓｓｉｇ ，Ｊ．Ｌ．、Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ，，Ｊ．Ｌ．およびＬｅｌｏｉｒ，Ｌ．Ｆ． の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２１７巻、９５９〜９６６頁（１９５５年 ））。生成したガラクトースーサルフェート類は、フェノール−硫酸検定法（Ｄ ｕｂｏｉｓ，Ｍ．、Ｇｉｌｌｅｓ，Ｋ．Ａ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ，Ｊ．Ｋ．、Ｒｅｂｅｒｓ，Ｐ．Ａ．およびＳｍｉｔｈ，Ｆ．の論文、Ａｎａｌ ．Ｃｈｅｍ．、２８巻、３５０〜３５６頁（１９５６年））で検出した。Ｇｌｃ Ｕ−Ｓは、カルバゾール反応で検出した（Ｂｉｔｔｅｒ，Ｔ．およびＭｕｉｒ， Ｈ．Ｍ．の論文、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４巻、３３０〜３３４頁（１９ ５６年））。ゆるやかな酸加水分解物のＰ４含有画分のアニオン交換クロマトグラフィー ４２ｍｌ以後にＰ４カラムから溶出する画分（（［³Ｈ］−ＧｌｃＮ）標識化 ＧｌｙＣＡＭ−１）の３５ｍｌ以後）をプールして凍結乾燥した。その残留物を 水２００μｌに溶解し、２ｍＭピリジン酢酸（ｐＨ５．０）で平衡化させたＤＥ ＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｓｉｇｍａ社、アセテート型、８０ｍｍ×５ ０ｍｍ）ベッド容積＝１．６ｍｌ）中に注入した。そのカラムを、２ｍＭピリジ ン酢酸８．５ｍｌと、続いてピリジン酢酸の２〜１０００ｍＭ直線勾配液（ｐＨ ５．０）８．５ｍｌとで溶離した。これら画分（３０個、約０．８５ｍｌずつ） を収集し、次いで各画分の３０μｌの試料を上記のようにしてカウントした。そ のカラムは、指定の標準物によって較正した。５０〜１５０ｍＭのピリジン酢酸 によってＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから溶出する画分（単一電荷の物 質）をプールして凍結乾燥した。単一電荷画分のゲル濾過 上記のようにして得られた単一電荷のフラグメントの生成物を、水２００μｌ に再度溶解し、Ｐ４カラムによるゲル濾過で分画した。画分を、以下のようにプ ールした。ピークＩ（５５〜６０ｍｌ） 、ピークＩＩ（４９〜５４ｍｌ）、ピークＩＩＩ（４３〜４８ｍｌ）、およピー クＩＶ（３６〜４２ｍｌ）である。プールした画分を凍結乾燥し、残留物を水２ ０μｌに再び溶解し、その後分析するまで−８０℃で貯蔵した。硫酸化炭水化物の全加水分解 脱硫酸化および脱アセチル化した単糖単位を得るため、ピークＩ、ＩＩおよび ＩＩＩの試料を６ＭのＨＣｌ中で（４時間、１００℃）加熱することによって、 硫酸化炭水化物の加水分解を行った。加水分解を行った後、試料は水を繰返し蒸 発させ、高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって単糖の 組成分析を行うため、水に再度溶解した。脱硫酸化 ピークＩＩとＩＩＩを、５０ｍＭのメタノール性ＨＣｌ／５％Ｈ₂Ｏ中でイン キュベートして、（同時に脱アセチル化を行うことなく）脱硫酸化を行った（２ ４時間、３６℃）。脱硫酸化を行った後、残留物を濃縮し、水に再溶解し、次い で２ｍＭピリジン酢酸（ｐＨ５．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ ｅカラム（８０ｍｍ×５ｍｍ、ベッド容積＝１．６ｍｌ）中に注入した。そのカ ラムを２ｍＭピリジン酢酸（ｐＨ５．０）で溶離して、非荷電物質を通過（flow -through）画分として回収した。その非結合（unbound）生成物を凍結乾燥し、 その後の分析に使うために水に再溶解した。β−ガラクトシダーゼによる消化 放射能標識オリゴ糖フラグメントを、最終容積５０μｌの２０ｍＭのＮａＨ₂ ＰＯ₄（酢酸によってｐＨ３．５に緩衝）中で、タチナタマメのエキソ−β−ガ ラクトシダーゼ（０．２５単位／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社）と、３７℃で１８時間反 応させた。得られた消化物をＨＰＡＥＣによって分析した。［³⁵ＳＯ₄］−標識付けのピークＩＩＩの部分加水分解 ³⁵ＳＯ₄標識付けピークＩＩＩ由来の物質を、最終容積１０μｌで（鉱油で液 面を覆った）０．１ＭのＨ₂ＳＯ₄と１００℃で１ｈ反応させた。２ＮのＮＨ₄Ｏ Ｈで中和した後、その加水分解物をＨＰＡＥＣで分析した。高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ） ピークＩ、ＩＩおよびＩＩＩ並びにこれらピークそれぞれの脱硫酸化生成物、 酵素消化生成物および加水分解生成物を、Ｃａｒｂｏｐａｃ ＰＡ１カラム（Ｄ ｉｏｎｅｘ社、米国カリフォルニア州サニーベール所在、２５０ｍｍ×４ｍｍ） を用いＨＰＡＥＣで分析した。各試料を水２５μｌに入れて注入した。溶離条件 （流量：１ｍｌ／ｍｉｎ）は、以下のとおりであった。すなわち、全加水分解物 と脱硫酸化ピークＩＩの分析には２０ｍＭのＮａＯＨ無勾配液を用い、脱硫酸化 ピークＩＩＩとそのβ−ガラクトシダーゼによる消化物に対しては１００ｍＭの ＮａＯＨ無勾配液を用い、硫酸化ピークＩＩに対しては１５０ｍＭのＮａＯＨを ４分間とそれに続いて１５０ｍＭのＮａＯＨ中０〜２５０ｍＭのＮａＯＡｃの直 線勾配液を２０分間用い（プログラム１）、硫酸化ピークＩ、ピークＩＩＩ、ピ ークＩＩＩのβ−ガラクトシダーゼによる消化物と部分加水分解物 に対しては１５０ｍＭのＮａＯＨ中５０ｍＭのＮａＯＡｃを５分間とそれに続い て１５０ｍＭのＮａＯＨ中５０〜８５０ｍＭのＮａＯＡｃの直線勾配液を３０分 間用いた（プログラム２）。標準物は、０．４ｍＭで用い、脈動電流検出法（pu lsed amperometric detection）で分析した。放射能標識生成物を、３０秒間の 画分を収集し、続いて上記のような液体シンチレーション分析法で検出した。ＨＰＬＣ分析に使用した炭水化物の標準 Ｇａｌ−６Ｓ、ＧｌｃＮＡｃ−３Ｓ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮ Ａｃ、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルラクトサミン、ＬａｃＮＡｃ ）およびＧａｌβ１−６ＧｌｃＮＡｃは、Ｓｉｇｍａ社製であった。Ｇａｌ−４ ＳとＧｌｃＮＡｃ−６Ｓは、Ｖ−Ｌａｂｓ社（米国ルイジアナ州カビントン所在 ）製であった。Ｇａｌ−３Ｓは、ウシスルファチド（Ｍａｔｒｅｙａ Ｉｎｃ． 社、米国ペンシルバニア州プレザントギャップ所在）を０．１ＭのＨ₂ＳＯ₄中で （３０分間、１００℃）加水分解することによって得た。Ｇａｌ−２Ｓは、Ｐｅ ａｔ他の方法（Ｐｅａｔ，Ｓ．、Ｂｏｗｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．およびＴｕｒｖｅｙ， Ｊ．Ｒ．の論文、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、７巻、２２５〜２３１頁（１ ９６８年））に基づいた方法を用い、１２，３，４，６−ラトラ−０−アセチル −α−Ｄ−がラクトロピラノース（Ｈｅｌｆｅｒｉｃｈ，Ｂ．およびＺｉｍｅｒ ，Ｊ．の論文、Ｂｅｒ．、２６０４〜２６１１頁（１９６２年））から合成した 。生成物の特性解析を¹Ｈ ＮＭＲ分光法とＦＡＢ質量分析法で行った。中性の 単糖の標準物（Ｆｕｃ、ＧａｌＮ、ＧｌｃＮ、Ｇａｌ，ＧｌｃおよびＭａｎの当 モル混合物）は、Ｄｉｏｎｅｘ社製であった。 上記実施例１〜３は、ＧｌｙＣＡＭ−１に硫酸基が存在していることがＧｌｙ ＣＡＭ−１のＬ−セレクチンとの激しい相互作用には不可欠であることを示して いる。実施例４は、特にＧｌｙＣＡＭ−１の硫酸基修飾部を同定している。Ｇｌ ｙＣＡＭ−１炭水化物の通常の分析は、入手可能なリガンドの量が限られていた ので今まで妨げられていたから、本発明の発明者らは、糖タンパク質オリゴ糖類 の配列決定に広く使用されている放射能トレーサー法を利用した（Ｖａｒｋｉ， Ａ．の論文、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、５巻、２２６〜２３５頁（１９９１年）；Ｃｕ ｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．、Ｍｅｒｋｌｅ，Ｒ．Ｋ．およびＳｔｕｌｔＳ，Ｎ．Ｌ ．の論文、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３２巻、１４１〜１８３頁（１９ ８９年）；Ｓｈｉｌａｔｉｆａｒｄ，Ａ．、Ｍｅｒｋｌｅ，Ｒ．Ｋ．、Ｈｅｌｌ ａｒｄ，Ｄ．Ｅ．、Ｗｅｌｌｅｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ，Ｗ．Ａ．お よびＣｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．の論文、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７巻、９４３〜 ９５２頁（１９９３年）；Ｍａｅｍｕｒａ，Ｋ．およびＦｕｋｕｄａ，Ｍ．の論 文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻、２４３７９〜２４３８６頁（１９９ ２年））。ＧｌｙＣＡＭ−１のオリゴ糖を、臓器培養で、³⁵ＳＯ₄とトリチウム 化炭水化物前駆物質のパネルで代謝標識化を行い、所定の単糖単位に標識を特異 的に導入させた。上記分析は、硫酸化オリゴ糖を、硫酸エステルを著しく開裂す ることなしに放出する加水分解条件を使用して行った。 すでに実証された、フコイジンと卵ゼリーコートフカン（フコース−４−サル フェートリッチの多糖）のＬ−セレクチンに対するリガンド活性（Ｓｔｏｏｌｍ ａｎ，Ｌ．Ｍ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． 、９６巻、７２２〜７２９ 頁（１９８３年）；Ｉｍａi，Ｙ．、Ｔｒｕｅ，Ｄ．Ｄ．、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ． Ｓ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１１巻 、１２２５〜１２３２頁（１９９０年））からみて、本発明の発明者らは、当初 、硫酸化フコースがＧｌｙＣＡＭ−１中に存在しているのかと考えてみた。以前 の研究によって、ゆるやかな酸加水分解（０．１５ＭのＨ₂ＳＯ₄、３０分間、１ ００℃）によってナマコのコンドロイチンサルフェートから硫酸化フコース（フ コース−３−サルフェートとフコース−３，４−ジサルフェート）が放出される ことが分かっている（Ｖｉｅｒａ，Ｒ．Ｐ．、Ｍｕｌｌｏｙ，Ｂ．およびＭｏｕ ｒａｏ，Ｐ．Ａ．Ｓ．の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻、１３５３ ０〜１３５３６頁（１９９１年））。しかし、ＧｌｙＣＡＭ−１をこれらの条件 で加水分解すると、中和フコースとしてすべての［³Ｈ］−Ｍａｎまたは［³Ｈ］ −Ｆｕｃで標識化されたカウントが放出された。このことは、このリガンド中の フコース残基が硫酸化しているのとは反対の結論を示している。［２−³Ｈ］− マンノース前駆物質は、マンノース単位およびフコース単位の両者として糖タン パク質に組み込まれていることが知られている（Ｖａｒｋｉ，Ａ．の論文、ＦＡ ＳＥＢ Ｊ．、５巻、２２６〜２３５頁（１９９１年））。全マンノースの標識 がＧｌｙＣＡＭ−１中にフコースとして排他的に組込まれていることは、Ｇｌｙ ＣＡＭ−１炭水化物中にマンノースが全く存在しないことを示している。この試 験結果は、さらに、ＧｌｙＣＡＭ−１のオリゴ糖連鎖が、このリガンドがＮ−グ リカナーゼの消化に対して完全な抵抗性を有していることによって先に示したよ うに、すべてＯ−結合であることを立証している（Ｉｍａｉ，Ｙ．、Ｓｉｎｇｅ ｒ，Ｍ．Ｓ．、Ｆｅｎｎｉｅ，Ｃ．、Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ ．およびＲｏｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１３巻、 １２１３〜１２２１頁（１９９１年））。 （³⁵ＳＯ₄）−標識ＧｌｙＣＡＭ−１をゆるやかに酸加水分解したところ、不 均一な範囲の大きさと電荷を有するフラグメントが得られた。本発明の発明者ら は、自分たちの分析を単一電荷を有するＰ４含有画分（P4-included fractions ）の分析に集中した。 上記単一電荷の加水分解生成物の構造同定を以下のようにして行った。³⁵ＳＯ₄ と³Ｈ−糖で標識化したフラグメントを、さらに加水分解、脱硫酸化および酵素 消化して、単糖成分の特性解析を行った。硫酸エステル結合の位置を、真正標準 を用いＨＰＡＥＣ分析によって特定した。実施例４の試験結果により、ＧｌｙＣ ＡＭ−１の成分として、−Ｏ₃ＳＯ−６−Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ−６−ＯＳＯ₃− 、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−６−ＯＳＯ₃−および−Ｏ₃ＳＯ−６−Ｇａｌβ １→４ＧｌｃＮＡｃが確認された。上記試験結果は、ＧｌｙＣＡＭ−１にガラク トース−３−サルフェートが存在する証拠を提供していないが、各種のＧａｌ− ３Ｓ含有炭水化物は、Ｌ−セレクチンに対してリガンド活性を有している（Ｇｒ ｅｅｎ，Ｐ．Ｊ．、Ｔａｍａｔａｎｉ，Ｔ．、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．、Ｍｉｙ ａｓａｋａ，Ｍ．、Ｈａｓｅｇａｗａ，Ａ．、Ｋｉｓｏ，Ｍ．、Ｙｕｅｎ，Ｃ． Ｔ．、Ｓｔｏｌｌ，Ｍ．Ｓ．およびＦｅｉｚｉ，Ｔ．の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８８巻、２４４〜２５１頁（１９ ９２年）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．、Ｔｏｄａ，Ｙ．、Ｔａｍａｔａｎｉ，Ｔ．、Ｗ ａｔａｎａｂｅ，Ｔ．、，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．、Ｎａｋａｏ，Ｔ．、Ｍｕｒａｓ ｅ，Ｋ．、Ｋｉｓｏ，Ｍ．、Ｈａｓｅｇａｗａ，Ａ．、Ｔａｄａｎｏ−Ａｒｉｔ ｏｍｉ，Ｋ．、Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｉ．およびＭｉｙ ａｓａｋａ，Ｍ．の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ ｕｎ．、１９０巻、４２６〜４３４頁（１９９３年））。ＧｌｃＮＡｃ−６Ｓは 、広い範囲の分類の複合糖質中に確認されており、その複合糖質としては、ケラ タン硫酸（サルフェート）のグリコサミノグリカン連鎖（Ｒｏｄｅｎ，Ｌ．の論 文、Ｉｎ Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉ ｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ、２６７〜３７２頁（１９８０年） （Ｗ．Ｊ．Ｌｅｎｎａｒｚ編集）ニューヨークＰｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ社発行 ）、Ｉ型ヒト免疫不全ウイルスのウイルス外膜糖タンパク質類（Ｓｈｉｌａｔｉ ｆａｒｄ，Ａ．、Ｍｅｒｋｌｅ，Ｒ．Ｋ．、Ｈｅｌｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．、Ｗｅｌ ｌｅｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ，Ｗ．Ａ．およびＣｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ ．Ｄ．の論文、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７巻９４３〜９５２頁（１９９３年））、 ニワトリ脂肪リポタンパク質、ウシ大血管の内皮細胞の糖タンパク質類（Ｒｏｕ ｘ，Ｌ．、Ｈｏｌｏｊｄａ，Ｓ．、Ｓｕｎｄｂｌａｄ，Ｇ．、Ｆｒｅｅｚｅ，Ｈ ．Ｈ．およびＶａｒｋｉ，Ａ．の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３巻、 ８８７９〜８８８９頁（１９８８年））、ウシとヒトのチログロブリン（Ｓｐｉ ｒｏ，Ｒ．Ｇ．およびＢｈｏｙｒｏｏ，Ｖ．Ｄ．の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．、２６３巻、１４３５１〜１４３５８頁（１９８８年））並びに根粒菌の根 粒形成因子（Ｒｏｃｈｅ，Ｄ．、Ｄｅｂｅｌｌｅ，Ｆ．、Ｍａｉｌｌｅｔ，Ｆ． 、Ｌｅｒｏｕｇｅ，Ｐ．、Ｆａｕｃｈｅｒ，Ｃ．、Ｔｒｕｃｈｅｔ，Ｇ．、Ｄｅ ｎａｒｉｅ，Ｊ．およびＰｒｏｍｅ，Ｊ．Ｃ．の論文、Ｃｅｌｌ、６７巻、１１ ３１〜１１４３頁（１９９１年）がある。Ｇａｌ−６Ｓは、以下の物質中に発見 されている。すなわち、ケラタン硫酸類（Ｒｏｄｅｎ ，Ｌ．の論文、Ｉｎ Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｐ ｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ、２６７〜３７２頁（Ｗ ．Ｊ．Ｌｅｎｎａｒｚ編集）ニューヨークＰｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ社発行（１ ９８０年））、ヒトの気管気管支ムチン類（Ｍａｗｈｉｎｎｅｙ，Ｔ．Ｐ．、Ａ ｄｅｌｓｔｅｉｎ，Ｅ．、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｄ．Ａ．、Ｍａｗｈｉｎｎｅｙ，Ａ． Ｍ．およびＢａｒｂｅｒｏ，Ｇ．Ｊ．の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６ ７巻、２９９４〜３００１頁（１９８６年））、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｓをともに含 有するラットの唾液ムチン類（Ｓｌｏｍｉａｎｙ，Ｂ．Ｌ．、Ｐｉｏｔｒｏｗｓ ｋｉ，Ｊ．、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．およびＳｌｏｍｉａｎｙ，Ａ．の論文、 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１５７巻、６１〜 ６７頁（１９８８年））、並びに組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，Ｇ．、Ｓｔｉｒｍ，Ｓ．、Ｇｅｙｅｒ，Ｇ．、Ｓｔｒｕｂｅ ，Ｋ．−Ｈ．、Ｂｅｒｇｗｅｒｆｆ，Ａ．Ａ．、Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ，Ｊ．Ｐ． およびＶｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ，Ｊ．Ｆ．Ｐ．の論文、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏ ｇｙ、２巻、４１１〜４１８頁（１９９２年））中に発見されている。ケラタン 硫酸とプラスミノーゲン活性化因子には、Ｇａｌ−６Ｓが、実施例４で確認され た構造体の場合と同様に、Ｎ−アセチルラクトサミン単位上に存在している。 シアル酸、硫酸基および恐らくフコースに対する機能の必要条件は、ＧｌｙＣ ＡＭ−１の認識決定基のいずれのモデルにも含まれていなければならない。可能 性の一つは、個々のＯ結合連鎖がシアル酸ベースまたは硫酸基ベースの決定基を 含んでいることである。これら個々の連鎖は、オリゴマーのＬ−セレクチンの別 々のレクチン ドメインによって認識されるかまたは単一のレクチンドメインに対する複合エピ トープ（combined epitope）を形成することもある（Ｎｏｒｇａｒｄ，Ｋ．Ｅ． 、Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．Ｌ．、Ｄｉａｚ，Ｓ．、Ｓｔｕｌｔｓ，Ｎ．Ｌ．、Ｕｓｈｉ ｙａｍａ，Ｓ．、ＭｃＥｖｅｒ，Ｒ．Ｐ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．および Ｖａｒｋｉ，Ａ．の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻、１２７６４〜 １２７７４頁（１９９３年））。シアル酸または硫酸基を除くと、リガンドとＬ −セレクチン間の相互作用の全体の親和力が大きく減少する。 好ましいリガンドは、例えば硫酸化ｓＬｅ^x様構造体と同じの、Ｌ−セレクチ ン認識部位を形成するＯ結合連鎖が硫酸化およびシアリル化されている。先に、 本発明の発明者らは、β−脱離によってＧｌｙＣＡＭ−１から放出される（³⁵Ｓ Ｏ₄）−標識されたＯ−結合連鎖は、すべてシアル酸特異的レクチン（ライマッ クス凝集素）に結合できることを観察した（Ｉｍａｉ，Ｙ．およびＲｏｓｅｎ， Ｓ．Ｄ．の論文、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．、１０巻、３４〜３９頁 （１９９３年））。したがって、硫酸化は、個々の連鎖のシアリル化なしでは起 こらない。 実施例５ 代謝標識ＧｌｙＣＡＭ−１の加水分解フラグメントの分析 ＧｌｙＣＡＭ−１を、上記実施例１に記載したようにして、リンパ節臓器培養 にて、³⁵ＳＯ₄とトリチウム化炭水化物前駆物質のパネルで代謝標識化を行った 。ゆるやかな加水分解条件を用いて、遊離の硫酸イオンを生成することなく硫酸 化オリゴ糖を放出させた。ゲル濾過とアニオン交換クロマトグラフィーを組み合 わせて得られた 低分子量で単一電荷のフラグメントを分析した。これらフラグメントの同定は、 各種の放射能標識糖前駆物質を用いて行い（Ｒ．Ｄ．Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｒ．Ｋ ．ＭｅｒｋｌｅおよびＮ．Ｌ．Ｓｔｕｌｔｓの論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃ ｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社 １９８９年）、３ ２巻に掲載、並びにＡ．Ｖａｒｋｉの論文、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、５巻、２２６〜 ２３５頁（１９９１年））、単一電荷の画分は、さらに化学的および酵素による 加水分解を行って、真正標準（基準物質）を用い高ｐＨアニオン交換クロマトグ ラフィー分析により構造の最終の特定を行った。ＧｌｙＣＡＭ−１の硫酸化成分 は、^-Ｏ₃ＳＯ−６−Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ−６−ＯＳＯ₃ ^-、Ｇａｌβ１→４Ｇｌ ｃＮＡｃ−６−ＯＳＯ₃ ^-および^-Ｏ₃ＳＯ−６−Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃと同 定された。 実施例６ ＧｌｙＣＡＭ−１のレクチン類との反応性 以前の研究によって、硫酸基（Ｙ．Ｉｍａｉ、Ｌ．Ａ．ＬａｓｋｙおよびＳ． Ｄ．Ｒｏｓｅｎの論文、Ｎａｔｕｒｅ、３６１巻５５５〜５５７頁（１９９３年 ））およびシアル酸と恐らくフコース（Ｙ．Ｉｍａｉ、Ｌ．Ａ．Ｌａｓｋｙおよ びＳ．Ｄ．Ｒｏｓｅｎの論文、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、４巻、３７３〜３８ １頁（１９９２年））は、ＧｌｙＣＡＭ−１のＬ−セレクチンとの激しい相互反 応にとって不可欠のものであることが立証されている。ＧｌｙＣＡＭ−１を加水 分解して得られた硫酸化構造体のシアル酸とフコースの置換部分について分析し た（上記実施例５参照）。この目的のため、明確な炭水化物特異性を有する一群 のレクチンを用いて、これ らレクチンのＧｌｙＣＡＭ−１に対する結合性を試験した。正常ＧｌｙＣＡＭ− １および低硫酸化（undersulfated）ＧｌｙＣＡＭ−１の両者を、酵素で脱シア リル化および／または脱フコシル化したかまたはしなかったものを試験した。 （³Ｈ−Ｇａｌ）標識ＧｌｙＣＡＭ−１を上記実施例１〜４に記載されている ようにして、マウスリンパ節の臓器培養で製造した。低硫酸化ＧｌｙＣＡＭは、 １０ｍＭの塩素酸ナトリウム（公知の硫酸化阻害剤）を含有する培地内でマウス リンパ節の臓器培養を行うことによって調製した。上記実施例１〜４に記載した ようにして、ＧｌｙＣＡＭ−１のコアタンパク質のペプチド配列に対する抗体（ ＣＡＭ０２ Ａｂ）によって免疫沈降させることによって、ＧｌｙＣＡＭ−１を 調製培地から単離した。ＧｌｙＣＡＭは、塩素酸塩の存在下または非存在下でほ ぼ同じ［³Ｈ］−ガラクトース活性を取り込んだが（０．２５ｍＣｉのインプッ トから２×１０⁶ｃｐｍの取込み）、［³⁵Ｓ］−硫酸基の取込みは、塩素酸塩の 存在下、対照の１０％まで抑制された（０．５ｍＣｉのインプットからの取込み ：０．１６×１０⁶対１．７５×１０⁶ｃｐｍ）。ＧｌｙＣＡＭ−１の脱シアリル 化は、すべての場合、１２０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．５中、アルスロバク ター・ウレアフアシエンスシアリダーゼ（１．７５単位／ｍｌ）で処理（１８時 間、３７℃）することによって行った。 この分析に使用したレクチン類は、以下のとおりであった。 ＷＧＡ：小麦胚芽凝集素（Ｈ．ＬｉｓおよびＮ．Ｓｈａｒｏｎ、Ａｎｎ Ｒｅ ｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５５巻、３５〜６７頁（１９８６年））。これは、シア ル酸（Ｓｉａ）と末端のＧｌｃＮＡｃ^*を認識する。溶離剤：ＧｌｃＮＡｃ。 ＡＡＡ：アリューリア・アウランティア凝集素（Ｈ．ＤｅｂｒａｙおよびＪ． Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ．．Ｃａｒｂｏ．Ｒｅｓ．、１８５巻、１５〜２０頁（１９ ８９年））。これは、αｌ−２、αｌ−３およびαｌ−６結合フコースを認識す る。溶離剤：フコース。 ＴＪＡ−１：トリコサンセス・ジャポニカ凝集素（Ｋ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、 Ｋ．Ｕｍｅｔｓｕ、Ｔ．ＳｕｚｕｋｉおよびＴ．Ｏｈｋｕｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ、３１巻、１１６４７〜１１６５０頁（１９９２年））。これは、Ｓ ｉａα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃまたはＳＯ₄−６−Ｇａｌβ１−４Ｇ ｌｃＮＡｃを認識する。溶離剤：ラクトース。 ＳＮＡ：サンブクス・ニグラ（Sambucus nigra）（アメリカニワトコの樹皮） 凝集素（Ｋ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，．Ｋ．Ｕｍｅｔｓｕ、Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉおよ びＴ．Ｏｈｋｕｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻１１６４７〜１１６５ ０頁（１９９２年）並びにＮ．Ｓｈｉｂｕｙａ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、 ２６２巻、１５６９〜１６０１頁（１９８７年））。これは、Ｓｉａα２−６Ｇ ｌｃＮＡｃ、Ｓｉａα２−６−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃおよびＳＯ₄−６− Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを認識する。溶離剤：ラクトース。 ＭＡＡ：マックキア・アムレンシス（Macckia amurensis）凝集素（Ｒ．Ｎ． Ｋｎｉｂｂｓ、Ｉ．Ｊ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｒ．Ｍ．Ｒａｔｃｌｉｆｆｅおよ びＮ．Ｓｈｉｂｕｙａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻、８３〜８８頁（ １９９１年））。これは、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを認識す る。溶離剤：ラクトース。 ＰＮＡ：ラッカセイ凝集素（Ｈ．ＬｉｓおよびＮ．Ｓｈａｒｏｎ 、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５５巻、３５〜６７頁（１９８６年）） 。これは、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃを認識する。溶離剤：ラクトース。 ＬＥＡ：リコペルシコン・エスクレンタム（Lycopersicon esculentum）凝集 素（トマトレクチン）（Ｒ．Ｄ．Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｒ．Ｋ．Ｍｅｒｋｌｅおよ びＮ．Ｌ．Ｓｔｕｌｔｓの論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、１９８９年発行）、３２巻に掲載）。 これは、ＧｌｃＮＡｃが順次つながっているという要件なしで（β１−４Ｇｌｃ ＮＡｃ）オリゴマーに結合する。溶離剤：Ｎ−アセチルグルコサミン。 上記の糖の略号^*は、次のとおりである。Ｆｕｃ：フコース；Ｇａｌ：ガラク トース；ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン；ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセ チルグルコサミン；Ｓｉａ：シアル酸（この糖のすべての天然に存在する変異体 を含む）。 追加の沈降剤として、ＧｌｙＣＡＭ−１のＣ末端ペプチドに対する抗体（ＣＡ Ｍ０５ Ａｂ）も使用した。ＣＡＭ０５ Ａｂの溶離剤は、０．１Ｍのグリシン −ＨＣｌ、０．２ＭのＮａＣｌ、０．２５％のトリトンＸ−１００、ｐＨ３０で あった。結合性は、全ｃｐｍインプットに対する％で表した。 ＧｌｙＣＡＭ−１生成物を、０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ₃を含有するリ ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の固定化レクチン（０．２ｍｌマトリックス ゲル ／ｍｌ、誘導体化：１〜２ｍｇレクチン／ｍｌゲル）とともに４℃にて２ｈ撹拝 し、次にマトリックスを遠心分離にかけ、０．２５％のトリトンＸ−１００を含 有するＰＢＳで４回洗浄し、次に０．２５％のトリトンＸ−１００を含有するＰ Ｂ Ｓ中 １００ｍＭの特定の溶離剤で溶離した。溶出液の活性を液体シンチレーシ ョンカウンティングで測定した。 レクチン沈降分析の試験結果を以下の表Ｉに示す。 レクチンの沈降に関する上記試験の結果は次のことを実証している。 （ａ）アルスロバクターシアリダーゼによる脱シアリル化によって、ＴＪＡ −１およびＳＮＡの両者に対する潜在結合部位（cryptic binding site）が暴露 された。脱シアリル化された低硫酸化物質がこれら２種のレクチンに結合できな かったので、上記部位は、硫酸化に依存していた。 （ｂ）ＧｌｙＣＡＭ−１の硫酸化が低下すると、潜在ＭＡＡ結合活性が暴露 され、その活性は、シアリル化に依存していた。 （ｃ）脱シアリル化によって潜在ＰＮＡ結合活性が暴露された。ＰＮＡに対 する結合性は、硫酸基の存在または非存在によって大きくは影響されなかった。 代謝標識ＧｌｙＣＡＭ−１の加水分解による分析結果は、レクチン沈降による 分析結果とともに、 Ｓｉａα２−３（ＳＯ₄−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡＣがＧｌｙＣＡＭ− １炭水化物連鎖の主キャッピング構造体内に存在していることに強力な裏付けを 与えた。ＰＮＡによる試験結果は、ＧｌｙＣＡＭ−１炭水化物がシアリル化Ｔ抗 原様構造体（すなわち、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）を含有し ていることを示唆した。 実施例７ エキソグリコシダーゼによるＧｌｙＣＡＭ−１の逐次消化 ［³Ｈ］−Ｇａｌによって標識化された正常ＧｌｙＣＡＭ−１または低硫酸化 ＧｌｙＣＡＭ−１を、上記のようにプロテインＡ−アガロースに接合したＣＡＭ ０２ Ａｂによる免疫沈降法によって、リンパ節の調整培地から単離した。単離 されたリガンドを、予め脱シアリル化するかまたはしないで下記の酵素で消化し た。 （１）５０ｍＭのカコジル酸ナトリウムＰＨ６．０中０．１単位／ｍｌのエ キソ−β１−４ガラクトシダーゼ（ディプロコッカス（Diplococcus）由来、Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、＃１０８８７１８）を用い、３７℃ で４８ｈ消化、または （２）５０ｍＭのカコジル酸ナトリウムＰＨ６．０中０．１ミリ単位／ｍｌ のエキソ−β１−４ ガラクトシダーゼ（ディプロコッカス由来、Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、＃１０８８７１８） ＋ α１−３／４フコシ ダーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｔｏｋｙｏ所在）（Ｋ．Ｍ ａｅｍｕｒａおよびＭ．Ｆｕｋｕｄａの論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６ ７巻、２４３７９〜２４３８６頁（１９９２年））を用い、３７℃で４８ｈ消化 。 得られた消化物をセファデックスＧ−２５ゲル濾過カラム（ＰＢＳ中２７０ｍ ｍ×８ｍｍ、０．２５％トリトンＸ−１００）に注入した。カラムをＰＢＳ、０ ．２５％トリトン−１００で溶離し、０．５ｍｌずつの画分を収集した。全画分 を［³Ｈ］−放射線についてカウントした。未消化物質は、空隙容量（４〜５ｍ ｌ）で溶出したが、放出された［³Ｈ］−Ｇａｌは、カラム中に含有され、空隙 容量の後２．５〜４ｍｌで溶出した。 ［³Ｈ］−Ｇａｌについて得られた結果は、以下の表ＩＩに示すとおりであっ た。 ［³Ｈ］−フコースで代謝標識化した正常ＧｌｙＣＡＭ−１または低硫酸化Ｇ ｌｙＣＡＭ−１を、脱シアリル化を行うかまたは行わずに、５０ｍＭカコジル酸 ナトリウム中０．１ミリ単位／ｍｌのα１ −３／４フコシダーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｔｏｋｙｏ ）を用いて消化した。放出された［³Ｈ］−Ｆｕｃを、ガラクトースについて先 に述べたようにして、ゲル濾過分析法によって測定した。［³Ｈ］−Ｆｕｃにつ いての試験結果は、下記表ＩＩＩに示すとおりであった。 ［³Ｈ］−Ｇａｌで標識化された低硫酸化ＧｌｙＣＡＭ−１または正常Ｇｌｙ ＣＡＭ−１を脱シアリル化し、それをα１−３／４フコシダーゼで処理するかま たは処理しなかったものの、ＡＡＡまたはＬＥＡ（トマトレクチン）に結合する 性能を測定した。ＡＡＡとＬＥＡの結合特異性と検定条件については、上記実施 例６を参照。 その分析試験の結果は下記表ＩＶに示すとおりであった。 表ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶに示す実験結果は、下記のことを実証している。 １．ＧｌｙＣＡＭ−１中の全ガラクトースの約３５％がシアル酸に対して 末端前（末端から２番目）の位置に位置し、ＧｌｃＮＡｃにβ１→４結合をして いた。この結果は、低硫酸化で脱シアリル化されかつ脱フコシル化された物質は 、β１−４エキソーガラクトシダーゼで処理したところ、その［³Ｈ］−Ｇａｌ カウントの３５％を放出したという事実（表ＩＩ）から得られた。リガンドが脱 シアリル化されていなければ、β１−４エキソーガラクトシダーゼのＧｌｙＣＡ Ｍ−１に対する活性が完全に欠除していることから判断して、このガラクトース はすべて正常にシアリル化されていた。このことは、分子の硫酸化が低いかどう かにもあてはまる。 ２．フコースは、ＧｌｃＮＡｃに対してα１→３結合している。この結果 は、以下のα１−３／４フコシダーゼの作用から得られた。すなわち、α１−３ ／４フコシダーゼは、（１）β１−４エキソーガラクトシダーゼによる、Ｇｌｙ ＣＡＭ−１からの［³Ｈ］− Ｇａｌカウントの放出を強めた（表ＩＩ）、（２）ＧｌｙＣＡＭ−１から［³Ｈ ］−Ｆｕｃカウントを直接放出した（表ＩＩＩ）、および（３）β１−４結合Ｇ ｌｃＮＡｃに結合することが知られているＬＥＡに対するＧｌｙＣＡＭ−１の結 合性を増大させた（表ＩＶ）。ＧｌｃＮＡｃの４位はＧａｌへの結合に関与して いるので（すなわちＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、フコースは、ＧｌｃＮＡｃ に対しα１−３結合で結合している筈である。表ＩＩのデータから、第一のＧｌ ｃＮＡｃの約７０％がフコースで置換されていると推定した。 ３．硫酸化されていると、β１−４エキソーガラクトシダーゼで処理した 場合、ＧｌｙＣＡＭ−１からの［³Ｈ］−Ｇａｌのカウントの放出が大きく阻害 された（表ＩＩ）。この結果は、β１−４結合ガラクトース残基が恐らく６位を 硫酸基で置換されているという別の証拠を提供した。脱フコシル化された硫酸化 ＧｌｙＣＡＭ−１と脱フコシル化された低硫酸化ＧｌｙＣＡＭ−１からの［³Ｈ ］−Ｇａｌカウントの放出に対するエキソ−β−ガラクトシダーゼの作用から、 末端のβ１−４ガラクトース残基の約６０％が硫酸基で置換されていると推定し た。ＧｌｙＣＡＭ−１炭水化物のキャッピング基の提案される構造 代謝で標識化されたＧｌｙＣＡＭ−１の加水分解生成物の分析、明確な炭水化 物特異性を有するレクチン類に対するＧｌｙＣＡＭ−１の結合性、およびＧｌｙ ＣＡＭ−１のオリゴ糖連鎖を分解するためのグリコシダーゼ類の使用について先 に提供されたデータは、ＧｌｙＣＡＭ−１の典型的な炭水化物連鎖が、以下式Ｉ Ｉで表されるシリアル化Ｔ抗原、すなわちＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌ ＮＡｃ−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒからなることを示し、このシリアル化Ｔ抗原は、Ｓ ｅｒ／Ｔｈｒ結合ＧａｌＮＡｃの６位に未知の数のＮ−アセチルラクトサミン単 位で延出し、そのＮ−アセチルラクトサミン単位は、６−硫酸化シアリルＬｅｗ ｉｓＸ構造体（すなわちα２−３結合のシアル酸と６位の硫酸化の両者によって 置換された末端ガラクトース）によって、非還元性末端でキャップされていた。 実施例８ 抗体ＭＥＣＡ−７９ ｍ Ａｂに対するＧｌｙＣＡＭとＣＤ３４の結合性を測 定する実験が行われた。Ｓｔｒｅｅｔｅｒ，Ｐ．Ｒ．、Ｒｏｕｓｅ，Ｂ．Ｔ．Ｎ ．およびＢｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．の論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０７ 巻、１８５３〜１８６２頁（１９８８年）；Ｍｉｃｈｉｅ，Ｓ．Ａ．、Ｓｔｒｅ ｅｔｅｒ，Ｐ．Ｒ．、Ｂｏｌｔ，Ｐ．Ａ．、Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｂ．Ｃ．およびＰ ｉｃｋｅｒ，Ｌ．Ｊ．の論文、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈ．、１４３巻、１６８８ 〜１６９８頁（１９９３年）。これらの実験の結果は、ＧｌｙＣＡＭとＣＤ３４ のＭＥＣＡ−７９ ｍ Ａｂに対する結合性は、これらリガンドの硫酸化に依存 していることを実証している。 上記実験は、糖分子の特定位置の硫酸化が、セレクチンリガンドのセレクチン 受容体に対する結合性にとって重要であることを示している。具体的に述べると 、上記試験結果は、硫酸基部分が、自然に存在するセレクチンリガンド内に存在 する糖分子の６位に存在していることを示している。具体的に述べれば、硫酸基 は、Ｎ−アセチルグルコサミンの６位とガラクトースの６位に存在している。し たがって、上記実験は、硫酸化を阻害することによって、許容し難 い高速度で起こると炎症に寄与する生化学的プロセスを遮断することができるこ とを示している。さらに、硫酸基部分を除去することによって、類似の方式で、 炎症に至ることが多い生化学的プロセスを阻害することができる。 本発明の各種の面を、最も実際的でかつ好ましい実施態様であるとみなされる ものについて本明細書に示し説明してきた。しかしながら、本発明の範囲内で、 変更が可能であり、かつ本明細書を読めば、当該技術分野の当業者には自明の変 形が思いうかぶことが認識されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/46 ＡＣＪ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＢＡ ＡＤＡ ＡＤＡ ＡＤＰ ＡＤＰ Ｃ１２Ｎ 9/14 ＡＣＤ 9/24 ＡＣＪ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヘマリッチ ステファン アメリカ合衆国 94103 カリフォルニア 州 サンフランシスコ フィフティーンス ストリート 1410 (72)発明者 イマイ ヤスユキ 日本東京都 文京区 本郷 ７−３−１ 東京大学生体異物免疫化学教室

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 医薬として許容される担体と、 スルファターゼ酵素とを含んでなり、 該酵素は、自然出現セレクチンリガンドの糖分子から硫酸基部分を外すもので あり、その硫酸基部分を外すのが糖分子の６位置からである ことを特徴とする組成物。 ２． 請求項１に記載の組成物であって、 該スルファターゼ酵素は、ガラクトース−６−サルフェートスルファターゼお よびＮ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートスルファターゼからなる群か ら選択される ことを特徴とするもの。 ３． 医薬として許容される担体と、 Ｌ−セレクチンリガンドの硫酸化の阻害剤とを含んでなり、 該阻害剤は、自然出現セレクチンリガンド内のガラクトースまたはＮ−アセチ ルグルコースまたはＮ−アセチルグルコサミンの６位置への硫酸基の付加を特異 的に阻害する ことを特徴とする組成物。 ４． 請求項３に記載の組成物であって、 該阻害剤は、塩素酸阻害剤であり、３′−ホスホアデノシン−５′−ホスホサ ルフェート（ＰＡＰＳ）の形成を遮断することにより硫酸化を阻害する ことを特徴とするもの。 ５． 必要とする患者に治療的に有効な分量のスルファターゼ酵素を医薬として 許容される担体に入れて投与することと、 該スルファターゼ酵素に、自然出現セレクチンリガンドの糖分子から硫酸基部 分を外させ、該スルファターゼ酵素は、ガラクトース−６−サルフェートスルフ ァターゼおよびＮ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートスルファターゼか らなる群から選択され、当該投与は人体の局所領域への注射によるものであるこ とと を含んでなる炎症の治療方法。 ６． 患者に治療的に有効な分量の硫酸化阻害剤を投与することと、 該阻害剤に、自然出現セレクチンリガンド内の糖分子の硫酸化を阻害させ、該 阻害剤は、セレン酸ナトリウムであり、それは３′−ホスホアデノシン−５′− ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ）の形成を遮断することにより硫酸化を阻害する ものであることと を含んでなる炎症の治療方法。 ７． 医薬として許容される担体と、 自然出現セレクチンリガンドの糖分子から硫酸基部分を外すスルファターゼ酵 素と、そして 自然出現セレクチンリガンドの硫酸化を阻害する阻害剤と を含んでなる組成物。 ８． 請求項７に記載の組成物であって、 該阻害剤は、セレン酸ナトリウムであり、３′−ホスホアデノシン−５′−ホ スホサルフェート（ＰＡＰＳ）の形成を遮断することにより硫酸化を阻害する ことを特徴とするもの。 ９． 請求項７に記載の組成物であって、 該スルファターゼ酵素は、ガラクトース−６−サルフェートスルファターゼお よびＮ−アセチルグルコサミン−６−サルフェートス ルファターゼからなる群から選択される ことを特徴とするもの。 １０． ガラクトース−６−サルフェートスルファターゼおよびＮ−アセチルグ ルコサミン−６−サルフェートスルファターゼからなる群から選択されるスルフ ァターゼ酵素を中に有する医薬的に許容される担体と、 自然出現セレクチンリガンドの硫酸化を阻害する塩素酸塩またはセレン酸塩な どの代謝による硫酸化阻害剤と を含んでなる組成物を、治療的に有効な分量でもって患者に投与することを含ん でなり、 該組成物は、患者身体の外傷を受けているまたは受けようとしている領域に局 所的に注射することにより患者に投与される ことを特徴とする炎症の治療方法。