ES2208759T3 - O-glicanos inhibidores de la inflamacion mediada por selectina. - Google Patents
O-glicanos inhibidores de la inflamacion mediada por selectina.Info
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Abstract
EL SULFATO DE TIROSINA EN PSGL - 1, PARTICULARMENTE AL MENOS UNO DE LOS RESIDUOS (46, 48) Y (51), FUNCIONA EN CONJUNCION CON GLICANOS SIALILADOS Y FUCOSILADOS, MAS PREFERIBLEMENTE THR - 57, PARA MEDIAR UNION DE ALTA AFINIDAD A P - SELECTINA. SE HA DETERMINATO QUE LOS O - GLICANOS DE PSGL - 1 CONSISTEN EN FORMAS DISIALILADAS O NEUTRALES DEL NUCLEO 2 TETRASACARIDO GAL BE 1 > 4G1CNAC BE 1 -> 6(GAL BE 1 -> 3)GALNACOH. UNA MINORIA DE LOS O - GLICANOS ESTAN AL 1,3 FUCOSILADOS QUE OCURREN COMO DOS ESPECIES PRINCIPALES QUE CONTIENEN EL ANTIGENO SIALIL LEWIS X : UNA ESPECIE ES UN GLICANO SIIALILADO, MONOFUCOSILADO DE FORMULA (I), Y EL OTRO ES UN GLICANO MONOSIALILADO, TRIFUCOSILADO QUE TIENE UNA ESQUELETO DE FORMULA (II), DONDE R = H, OH, OTRO AZUCAR O UNA AGLICONA COMO UN AMINOACIDO.
Description
O-glicanos inhibidores de la
inflamación mediada por selectina.
Esta invención se refiere a los inhibidores de la
inflamación mediada por selectina y, en particular, se refiere a los
inhibidores derivados de PSGL-1, el ligando de
P-selectina y a nuevos oligosacáridos derivados de
PSGL-1.
Las selectinas son una familia de tres lectinas
unidas a la membrana dependientes de Ca^{2+} que inician la
adhesión de los leucocitos a las plaquetas o a las células
endoteliales bajo fuerzas de arrastre que aparecen en la circulación
venosa (Laskey, (1992) Science 258, 964-969;
Bevilacqua y col., (1993) J. Clin. Invest. 91,
379-387; McEver (1994) Curr. Opin. Immunol.
6, 75-84). L-selectina, que se
expresa sobre los leucocitos, se une a ligandos constitutivos o
inducibles sobre células endoteliales. E-selectina,
que se expresa en células endoteliales activadas por citocinas,
y
P-selectina, que se expresa en plaquetas y células endoteliales activadas con trombina, se unen a ligandos sobre células mieloides y a subgrupos de linfocitos.
P-selectina, que se expresa en plaquetas y células endoteliales activadas con trombina, se unen a ligandos sobre células mieloides y a subgrupos de linfocitos.
P-selectina es una proteína
dependiente de calcio que se une a glúcidos, que se expresa en las
superficies de plaquetas activadas y endotelio en respuesta a la
trombina y a otros agonistas (McEver y col., (1995) J. Biol.
Chem., 270,11025-11028; Varkl, A. (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 91, 7390-7937;
Springer, T.A. (1995) Annu. Rev. Physiol. 57,
827-872). A través de su unión a ligandos
glicoconjugados sobre los linfocitos, P-selectina
media la fase de rodamiento de la adhesión de estas células sobre
las plaquetas activadas y el endotelio (Lawrence y Springer (1991)
Cell 65, 852-873; Moore y col. (1995) J.
Cell. Biol. 128, 661-671). El ácido siálico y la
fucosa son componentes de los ligandos de
P-selectina sobre los leucocitos (Corral y col.
(1990) Biochem. Biophys. Res. Comm. 172,
1349-1356; Moore y col. (1992) J. Cell. Biol.
118, 445-456, Sako y col. (1993) Cell 75,
1179-1186).
Aunque las selectinas interaccionan débilmente
con oligosacáridos pequeños sializados, fucosilados tales como el
grupo sialil Lewis x (sLe^{x}
NeuAc\alpha2-3Gal\beta1-4[Fuc\alpha1-3]GlcNAc)(Foxall
y col. (1992) J. Cell Biol. 117, 895-902;
Varki (1992) Curr. Opin. Cell Biol. 257,
257-266), se unen con alta afinidad a los glicanos
que tienen un número reducido de glicoproteínas (Moore y col.,
(1992) J. Cell Biol. 118, 445-456; Lasky y
col., (1992) Cell 69, 927-938; Levinovitz y
col., (1993) J. Cell Biol. 121, 449-459;
Walcheck y col., (1993) J. Exp. Med. 178,
853-863; Baumhueter y col., (1993) Science
262, 436-438; Berg y col., (1993) Nature 366,
695-698) o proteoglicanos
(Norgard-Sumnicht y col. (1993) Science 261,
480-483). Los oligosacáridos que contienen el grupo
sialil Lewis x (sLe^{x}),
NeuAc\alpha2-3Gal\beta1-4[Fuc\alpha1-3]GlcNAc\beta1-R,
un determinante presente en las superficies leucocitarias, inhiben
la adhesión de los leucocitos a P-selectina (Polley
y col., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
6224-6228; Foxall y col., (1992) J. Cell
Biol. 117, 895-902). Sin embargo, la expresión
de sLe^{x} sobre las superficies no es suficiente para la alta
afinidad de unión de las células hacia P-selectina,
ya que las células no mieloides que expresan elevados niveles de
sLe^{x} se unen débilmente a P-selectina en
comparación con las células mieloides (Zhou y col., (1991) J.
Cell Biol. 115, 557-564). Los ligandos de alta
afinidad son potencialmente importantes como mediadores fisiológicos
de la adhesión leucocitaria mediada por selectina durante la
inflamación. Así, existe un interés creciente hacia la comprensión
de las bases estructurales para el reconocimiento de alta afinidad
de estos glicoconjugados por parte de las selectinas.
Un subgrupo de ligandos de alta afinidad por las
selectinas está formado por glicoproteínas de tipo mucílago (McEver
y col. (1995)). En los neutrófilos humanos y en la línea celular
promielocítica HL-60 se expresa una sialomucina
ligando para P-selectina (Moore y col., (1992);
(Moore y col., (1994) J. Biol. Chem. 269,
23318-23327). Los leucocitos expresan un único
ligando de alta afinidad por P-selectina denominado
glicoproteína ligando de P-selectina 1
(PSGL-1) (Moore y col., (1995); Moore y col.,
(1992); Sako y col., (1993); Norgaard y col. (1993) J. Biol.
Chem. 268, 12764-12774; Moore y col., (1994)
J. Biol. Chem. 269, 23318-23327). La unión de
P-selectina a los ligandos depende de Ca^{2+} y se
suprime mediante el tratamiento del ligando con sialidasa.
PSGL es un homodímero con dos subunidades unidas
mediante puentes disulfuro con pesos moleculares relativos de
aproximadamente 120.000 valorados por SDS-PAGE
(Moore y col., 1992). Cada subunidad no tiene más de tres
N-glicanos, pero tiene muchos
O-glicanos sializados agrupados (Moore y col.
(1992), Norgard y col. (1993) J. Biol. Chem. 268,
12764-12774). El dominio extracelular de
PSGL-1 se extiende ampliamente, característica
propia de las proteínas de tipo mucílago. PSGL-1 es
una proteína de membrana de tipo 1 con un dominio extracelular que
contiene muchas serinas, treoninas y prolinas, que incluyen una
serie de repeticiones decaméricas (15 en las células promielocíticas
humanas HL-60 y 16 en los leucocitos humanos) (Sako
y col. (1993) Cell 75, 1179-1186; Moore y col
(1995) J. Cell Biol. 128, 661-671; Veldman y
col. (1995) J. Biol. Chem. 270, 21966-21974).
A continuación de un péptido señal de 18 residuos, hay un péptido
precursor que se extiende entre los residuos 19-41
que se elimina de PSGL-1 tras su síntesis en los
leucocitos (Sako y col. (1993); Vachino y col. (1995) J. Biol.
Chem. 270, 21966-21974). El dominio
extracelular de la proteína procesada madura se extiende del residuo
42 al 318 y sigue con un dominio transmembrana de 25 residuos hasta
una cola citoplasmática de 69 residuos. Lleva muchos residuos de
siálico sin modificar así como el antígeno sLe^{x}. El ligando
contiene al menos un glicano N-ligado sensible a
PNGasaF que P-selectina no requiere para el
reconocimiento. Por el contrario, tiene oligosacáridos sializados
O-ligados agrupados que dan el esqueleto
polipeptídico sensible a la escisión con la enzima
O-sialoglicoproteasa. El tratamiento de células
HL-60 intactas con esta enzima elimina los sitios de
unión de alta afinidad a P-selectina (Ushiyama y
col. (1993) J. Biol. Chem. 268, 15229-15237)
y evita la adhesión celular a P-selectina
inmovilizada (Norgard y col. (1993) J. Biol. Chem. 268,
12764-12774; Steininger y col. Biochem. Biophys.
Res. Commun. (1992) 188, 760-766) sin afectar a
la expresión general en la superficie de sLe^{x}, correspondiendo
con sitios funcionalmente importantes de unión de alta afinidad a
P-selectina en células humanas mieloides.
Sako y col. (1993) aislaron el ADNc derivado de
células humanas HL-60 que codifica para
PSGL-1. La secuencia que deriva del ADNc para cada
subunidad de PSGL-1 predice una proteína
transmembrana de tipo 1 de 402 aminoácidos. El dominio extracelular
tiene un péptido señal N-terminal de los residuos 1
a 18 y un péptido precursor putativo de los residuos 19 a 48.
Asumiendo la escisión del péptido precursor, el dominio extracelular
de la proteína madura comienza en el residuo 42 y se extiende hasta
el residuo 308. La secuencia concluye con un dominio transmembrana
de 25 residuos y con una cola citoplasmática de 69 residuos. EL
dominio extracelular es rico en serinas y treoninas que son sitios
potenciales de O-glicosilación. El dominio
extracelular contiene tres sitios potenciales para la adición de
oligosacáridos N-ligados así como una única cisteína
que puede promover la dimerización y tres sitios potenciales de
sulfatación de tirosina en los residuos 46, 48 y 51.
Aunque estudios previos han demostrado que se
requiere la sialización y la fucosilación de PSGL-1
para su unión a P-selectina, también pueden ser
importantes otras modificaciones post-traducionales
de PSGL-1. PSGL-1 está altamente
O-glicosilado y contiene
poli-N-acetil-lactosamina
sializada y fucosilada O-ligada, incluyendo algunos
glicanos que acaban en sLe^{x} (Moore y col. (1994) J. Biol. Chem.
269, 23318-23327). sLe^{x} o glicanos relacionados
no son suficientes para la unión de alta afinidad de
PSGL-1 a P-selectina. Por ejemplo,
compuestos sulfatados que carecen de ácido siálico o de fucosa
pueden inhibir la adhesión de los leucocitos a
P-selectina (Norgaard-Sumnicht y
col. (1993) Science 261, 480-483; Nelson y
col. (1993) Blood 82, 3253-3258; Cecconi y
col. (1994) J. Biol. Chem. 269, 15060-15066;
Skinner y col. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 164,
1373-1379). Estos datos sugieren que la sulfatación
de PSGL-1 puede requerirse para su unión de alta
afinidad a P-selectina. PSGL-1
recombinante expresada en células COS con una fucosiltransferasa
interacciona con P-selectina en experimentos de
adhesión celular (Sako y col., 1993). No obstante, se desconoce el
grado de parecido de los oligosacáridos de PSGL-1
recombinante con los de la glicoproteína nativa.
Aunque los glúcidos sobre PSGL-1
son críticos para la unión a selectinas, no están disponibles las
estructuras químicas detalladas de los glicanos. Mucha de la
información acerca de la glicosilación de la molécula se ha obtenido
mediante tratamientos enzimáticos del ligando nativo y mediante
estudios de las formas recombinantes de PSGL-1
expresadas en varios tipos celulares. Mientras que estos
procedimientos indirectos pueden proporcionar información valiosa
acerca de los determinantes críticos en el ligando, la información
estructural detallada de los O-glicanos de
PSGL-1 nativo es esencial para identificar los
glicanos que son importantes para la función de ligando y para
proporcionar una comprensión más clara de por qué
PSGL-1 es un ligando para las P- y
E-selectinas, mientras que otras mucinas tales como
CD43 no lo son.
Esta solicitud describe un procedimiento para
fabricar PSGL-1 que está glicosilado y sulfatado de
forma normal.
Esta solicitud describe además un procedimiento y
los reactivos para inhibir la unión de PSGL-1 a
P-selectina y a otras selectinas.
Es objeto de la presente invención proporcionar
nuevos O-glicanos que son útiles para modificar la
unión a
P-selectina.
P-selectina.
La publicación internacional OMPI nº WO94/11498
describe una glicoproteína ligando de P-selectina y
procedimientos para el uso de ésta.
La invención se describe en las reivindicaciones
1, 6, 10 y 20-53 y en las reivindicaciones que
dependen de ellas.
Las Figuras 1A, 1B y 1C son gráficos del tiempo
de retención para una cromatografía de intercambio aniónico usando
un gradiente de NaH_{2}PO_{4}, pH 3,0 (línea discontinua) para
PSGL-1 digerido enzimáticamente que demuestra que
PSGL-1 contiene tirosina sulfato que es sensible a
la arilsulfatasa. ^{35}S-PSGL-1
hidrolizado con una base fuerte se muestra en la Figura 1A;
^{35}S-PSGL-1 hidrolizado con una
base fuerte y con el tratamiento control con 1000 mU de
arilsulfatasa hervida se muestra en la Figura 1B; y
^{35}S-PSGL-1 hidrolizado con una
base fuerte y tratado con 1000 U de enzima activa se muestra en la
Figura 1C.
Se indican los tiempos de retención de la
tirosina, tirosina sulfato y sulfato libre. El sulfato libre eluyó
en el min 40,0. Los monosacáridos sulfatados
(Gal-6-sulfato;
GlcNAc-6-sulfato,
GalNAc-6-sulfato y
GalNAc-4-sulfato) eluyeron con
tiempos de retención similares entre 14 y 15 min.
La Figura 2 es un gráfico de la liberación de
sulfato[^{35}S] por la arilsulfatasa a partir de
^{35}S-PSGL-1 intacto y el
porcentaje de reducción de la unión dependiente de Ca^{2+} de
^{125}I-PSGL-1 a
P-selectina, mostrando que la tirosina sulfato es
importante para la unión a P-selectina.
Las Figuras 3A y 3B son gráficos que muestran que
un suero específico anti-péptido para
PSGL-1 bloquea la unión de PSGL-1 a
P-selectina.
^{125}I-PSGL-1 se incubó en la
presencia de suero normal de conejo (NRS) o del antisuero dirigido
contra los residuos 42-56 de PSGL-1
(anti-aminoácidos 42-56) en placas
de microvaloración que contenían P-selectina soluble
recombinante inmovilizada o albúmina de suero humano (HSA) y la
unión se midió en función de la concentración de suero como se
muestra en la Figura 3A. P-selectina derivada de
plaquetas se incubó con células HL-60 en presencia
de 20% de NRS o de suero anti-aminoácidos
42-56. La unión de P-selectina se
ensayó mediante inmunofluorescencia indirecta y citometría de flujo
y el número de células se representó frente a la unión a
P-selectina como se muestra en la Figura 3B.
Las Figuras 4A-E muestran que la
fracción de PSGL-1
P-10-2b contiene un glicano de
tamaño mínimo que lleva el determinante sLe^{x}. La fracción
P-10-2b deriva de
^{3}H-GlcN-PSGL-1
se trató con exoglicosidasas y se analizó mediante cromatografía de
descenso en papel durante 24 h. Los glicanos
\beta-eliminados primero se desializaron con
neuroaminidasa y los glicanos neutros se separaron del ácido siálico
liberado mediante cromatografía de intercambio iónico. (A)
Cromatografía de los glicanos desializados; (B) glicanos
desializados tratados con \beta-galactosidasa; (C)
glicanos desializados tratados con
\alpha-1,3/4-fucosidasa de
Streptomyces; (D) glicanos desializados tratados con una
combinación de \beta-galactosidasa,
\beta-N-acetilhexosaminidasa y
\alpha-1,3/4-fucosidasa de
Streptomyces. (E) glicanos \beta-eliminados
derivados de la fracción P-10-2b de
^{3}H-GlcN-PSGL-1
se desializaron enzimáticamente y se
co-cromatografiaron en el mismo experimento. La
migración de los patrones reales se indica:5.
Gal\beta1\rightarrow4(Fuc\alpha13)GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH;
4, Gal\beta1\rightarrow4
GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta13)GalNAcOH;
3*,
GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal(\beta13)GalNAcOH;
2, Gal\beta1\rightarrow3 GalNAcOH; 1, GlcNAc.
Las Figuras 5A y B muestran que la fracción de
PSGL-1 P-10-2a está
formada por un O-glicano sializado que contiene
polilactosamina que está trifucosilado. La fracción
P-10-2a que deriva de
^{3}H-GlcN-PSGL-1
se trató con exoglicosidasa y se analizó mediante cromatografía de
descenso en papel durante 24 h. Los glicanos
\beta-eliminados primero se desializaron con
neuroaminidasa y el ácido siálico se separó de los glicanos neutros
antes y después de los tratamientos con
endo-\beta-galactosidasa o con una
combinación de \beta-galactosidasa y
\beta-N-acetilhexosaminidasa. (B)
Los glicanos desializados se defucosilaron químicamente y se
analizaron antes y después de los tratamientos con
endo-\beta-galactosidasa o con una
combinación de \beta-galactosidasa más
\beta-N-acetil-hexosaminidasa.
La migración de los patrones reales se indica:
3,
Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow3Gal\beta1;
3*,
GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH;
2, Gal\beta1\rightarrowGlcNAc; 1, GlcNAc.
La Figura 6 muestra que los glicanos
P-10-3 contienen el tetrasacárido
neutro de núcleo 2.
^{3}H-GlcN-PSGL-1
se extrajo con neuroaminidasa y el ácido siálico liberado se separó
de los glicanos neutros mediante cromatografía en
QAE-Sephadex. Los glicanos desializados se
analizaron mediante cromatografía de descenso en papel durante 18 h
antes y después del tratamiento con
\beta-galactosidasa sola o con
\beta-galactosidasa más
\beta-N-acetilhexosaminidasa. La
migración de los patrones reales se indica:
4,
Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH,
e*,
GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)
GalNAcOH; 2, Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc; 1,
GlcNAc.
La Figura 7 son estructuras y porcentajes
relativos de los O-glicanos en
PSGL-1.
Los péptidos sulfatados, glicosilados y las
estructuras de O-glicanos presentes únicamente en
PSGL-1 que se une a P-selectina se
han desarrollado usando estudios que identifican los residuos
aminoacídicos críticos en la región N-terminal de
PSGL-1, la importancia de la sulfatación de los
residuos de tirosina, y la estructura y el papel que desempeña las
estructuras de glúcidos O-glicanos acopladas a
treonina en la región N-terminal.
Los ejemplos demuestran que
PSGL-1 se sulfata, inicialmente, en una o más de las
tirosinas en los residuos 46, 48 y 51 que se requieren para la unión
de alta afinidad a P-selectina. Los estudios
demuestran que el PSGL-1 sintetizado en células
humanas HL-60 puede marcarse metabólicamente con
azufre [^{35}S] que se incorpora inicialmente en el sulfato de la
tirosina y que el tratamiento de PSGL-1 con una
arilsulfatasa bacteriana libera el sulfato de la tirosina, lo que
produce una disminución acorde en la unión a
P-selectina. Además, la unión de
PSGL-1 a P-selectina se bloquea con
antisuero dirigido contra un péptido sintético rodeado de tres
sitios putativos de sulfatación en tirosina cerca del dominio
N-terminal de PSGL-1.
Los estudios demuestran también que en la
expresión de PSGL-1 en un sistema de expresión
recombinante de células de mamíferos se requieren dos enzimas para
la correcta glicosilación de PSGL-1: una
fucosiltransferasa (FTIII) y
\beta1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa
de núcleo 2. Los ensayos comparativos demuestran que la
glicosilación de PSGL-1 expresado en células que
expresan estas enzimas es más parecida a la glicosilación de
PSGL-1 nativo que la glicosilación de
PSGL-1 recombinante expresado en células COS o CHO
que no expresan
\beta1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa
de núcleo 2. Las estructuras de los O-glicanos
unidos a Ser/Thr de PSGL-1 sintetizados en células
HL-60 se marcaron entonces metabólicamente con
radiactividad con precursores de azúcares marcados con ^{3}H. En
estudios control, los O-glicanos de
CD-43 (leucosialina), una glicoproteína de tipo
mucina que se expresa también en las células HL-60,
se analizaron y se compararon con los de PSGL-1. Los
O-glicanos se liberaron de los residuos de Ser/Thr
con un tratamiento de base suave/borhídrico de las glicoproteínas
purificadas y las estructuras de los glicanos se determinaron
mediante una combinación de técnicas. En contra de lo esperado,
PSGL-1 no está muy fucosilado; una mayoría de
O-glicanos son formas disializadas o neutras de
tetrasacáridos de núcleo 2
Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH.
Por ejemplo, una minoría de los O-glicanos están
fucosilados en \alpha1,3 lo que aparecen como dos especies
principales que contienen el antígeno sialil Lewis x. Una especie es
un glicano disializado, monofucosilado:
y la otra es un glicano monosializado,
trifucosilado que tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R=H, OH, otro azúcar o una aglicona tal
como un
aminoácido.
Estos resultados demuestran que
PSGL-1 contiene O-glicanos
fucosilados únicos que están implicados en las interacciones de
alta afinidad entre PSGL-1 y selectinas.
Basándose en la información obtenida de los
ejemplos descritos anteriormente, uno puede sintetizar usando
técnicas recombinantes o sintetizadores de péptidos seguido de
sulfatación química y enzimática y glicosilación, péptidos que son
útiles para inhibir la unión de P-selectina y otras
selectinas a PSGL-1, como se describe mediante la
fórmula general precedente y consultando a las figuras y a los
ejemplos que se describen más adelante. Los péptidos preferiblemente
incluyen como mínimo una de las tres tirosinas en la región amino
terminal de la proteína (residuos 46, 48 y 21 del Listado de
Secuencia ID nº 1), al menos uno de los cuales está sulfatado
(-SO_{4}) y preferiblemente incluye al menos una treonina o serina
que es adecuada para O-glicosilación, por ejemplo,
el residuo de treonina en el residuo aminoacídico 57 del Listado de
Secuencia ID nº 1. Un ejemplo de un péptido mínimo útil corresponde
con los residuos 48 a 57 de la Secuencia ID nº 2, así como péptidos
que tienen sustituciones conservativas que no alteran la unión del
péptido a P-selectina. Como se demuestra mediante
los ejemplos, es importante que el péptido incluya un
O-glicano de núcleo-2, sializado,
fucosilado, como se demuestra en los siguientes ejemplos.
Las modificaciones de la secuencia de aminoácidos
se agrupan en una o más de tres clases: variantes de sustitución, de
inserción o de deleción. Las inserciones incluyen fusiones amino o
carboxi terminales así como inserciones en el interior de la
secuencia de uno o múltiples residuos aminoacídicos. Las inserciones
normalmente serán inserciones menores que las de las fusiones amino
o carboxi terminales, por ejemplo, del orden de uno a cuatro
residuos. Los derivados de proteínas inmunogénicas de fusión, tales
como los descritos en los ejemplos, se hacen mediante la fusión de
un polipéptido suficientemente largo para conferir inmunogenicidad a
la secuencia diana mediante recombinación in vitro o mediante
cultivo celular recombinante transformado con ADN que codifica para
la fusión. Las deleciones se caracterizan por la eliminación de uno
o más residuos aminoacídicos de la secuencia de la proteína.
Típicamente, no se delecionan más de aproximadamente 2 a 6 residuos
en un sitio cualquiera dentro de la molécula proteica. Estas
variantes normalmente se preparan mediante mutagénesis específica de
sitio de nucleótidos en el ADN que codifica la proteína,
produciéndose así el ADN que codifica para la variante y, después de
esto, expresándose el ADN en el cultivo celular recombinante. Las
técnicas para hacer las mutaciones de sustitución en los sitios
predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida se
conocen bien, por ejemplo, la mutagénesis con el cebador M13. Las
sustituciones aminoacídicas son típicamente residuos únicos; las
inserciones normalmente serán del orden de aproximadamente 1 a 10
residuos aminoacídicos; y las deleciones estarán en el intervalo
aproximado de 1 a 30 residuos. Las deleciones o inserciones
preferiblemente se hacen en pares adyacentes, es decir, una deleción
de 2 residuos o una inserción de 2 residuos. Las sustituciones,
deleciones, inserciones o cualquier combinación de éstas pueden
combinarse para llegar al constructo final. Las mutaciones no deben
situarse en la secuencia fuera del marco de lectura y
preferiblemente no crearán regiones complementarias que podrían
producir estructuras de ARNm secundarias. Las variantes de
sustitución son aquellas en las que al menos se ha eliminado un
residuo y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Tales
sustituciones, generalmente, se hacen de acuerdo con las tablas
siguientes 1 y 2 y se denominarán en lo sucesivo sustituciones
conservativas.
| Abreviaturas de aminoácidos | ||
| Aminoácido | Abreviatura | |
| Alanina | Ala | A |
| Aloisoleucina | Alle | |
| Arginina | Arg | R |
| Asparagina | Asn | N |
| Ácido aspártico | Asp | D |
| Cisteína | Cys | C |
| Ácido glutámico | Glu | E |
| Glutamina | Gln | K |
| Glicina | Gly | G |
| Histidina | His | H |
| Isoleucina | Ile | I |
| Leucina | Leu | L |
| Lisina | Lys | K |
| Fenilalanina | Phe | F |
| Prolina | Pro | P |
| Ácido piroglutámico | pGlu | |
| Serina | Ser | S |
| Treonina | Thr | T |
| Tirosina | Tyr | Y |
| Triptófano | Trp | |
| Valina | Val |
| Sustituciones de aminoácidos | |
| Residuo original | Sustituciones ilustrativas |
| Ala | ser |
| Arg | lys |
| Asn | gln; his |
| Asp | glu |
| Cys | ser |
| Gln | asn |
| Glu | asp |
| Gly | pro |
| His | asn; gln |
| Ile | leu; val |
| Leu | ile; val |
| Lys | arg; gln; glu |
| Met | leu; ile |
| Phe | met; leu; tyr |
| Ser | thr |
| Thr | ser |
| Trp | tyr |
| Tyr | trp; phe |
| Val | ile; leu |
Se hacen cambios sustanciales en la función o en
la identidad inmunológica seleccionando sustituciones que son menos
conservativas que las de la Tabla 2, es decir, seleccionando
residuos que difieren más significativamente en su efecto sobre el
mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el
área de sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o
en hélice (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el
sitio diana o (c) la voluminosidad de la cadena lateral. Las
sustituciones que, en general, se espera que produzcan los mayores
cambios en las propiedades de la proteína serán aquellas en las que
(a) un residuo hidrófilo, por ejemplo, seril o treonil, se sustituye
por un residuo hidrófobo, por ejemplo, leucil, isoleucil,
fenialanil, valil o alanil; (b) una cisteína o una prolina se
sustituye por cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una
cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisil, arginil o
histidil, se sustituye por un residuo electronegativo, por ejemplo,
glutamil o aspartil; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral
voluminosa, por ejemplo, la fenilalanina, se sustituye por uno que
no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina, en este caso, (e)
mediante el incremento de sitios para la sulfatación y/o
glicosilación.
La mutagénesis por sustitución o por deleción
puede emplearse para insertar sitios para
N-glicosilación
(Asn-X-Thr/Ser) u
O-glicosilación (Ser o Thr). Las deleciones de
cisteína o de otros residuos lábiles pueden ser deseables también.
Las deleciones o sustituciones de sitios de proteolisis potencial,
por ejemplo, Arg, se llevan a cabo, por ejemplo, delecionando uno de
los residuos básicos y sustituyendo uno por residuos glutaminil o
histidil.
Determinados derivados
post-traduccionales son el resultado de la acción de
células hospedadoras recombinantes en el polipéptido expresado. Los
residuos glutaminil y asparaginil a menudo se desamidan
post-traduccionalmente a los residuos
correspondientes glutamil y aspartil. Alternativamente, estos
residuos se desamidan bajo condiciones suavemente acídicas. Otras
modificaciones post-traduccionales incluyen la
hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos
hidroxilo de residuos seril o treonil, la metilación de grupos
o-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e
histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular
Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pág.
79-86 [1983]) acetilación del amino
N-terminal y, en algunas ocasiones, amidación del
carboxilo
C-terminal.
C-terminal.
Los péptidos generalmente pueden prepararse
siguiendo técnicas conocidas, como se describe, por ejemplo, en las
publicaciones citadas, cuyas enseñanzas se incorporan
específicamente en la presenta invención. Debido a que los péptidos
preferidos están glicosilados y sulfatados, es preferible expresar
los péptidos en células hospedadoras de mamíferos adecuadas como se
describe más adelante.
En uno de los procedimientos sintéticos
preferidos, los péptidos se preparan siguiendo técnicas sintéticas
en fase sólida descritas inicialmente por Merrifield en J. Amer.
Chem. Soc., 85, 2149-2154 (1963). Pueden
encontrarse otras técnicas, por ejemplo, en M. Bodanszky y col.,
Peptide Synthesis, segunda edición, (John Wiley & Sons,
1976), así como en otros trabajos de referencia conocidos por los
expertos en la técnica.
En el texto que sigue se hallarán grupos
protectores apropiados útiles en tales síntesis y sus abreviaturas,
así como en J. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic
Chemistry, (Plenum Press, New York, 1973). Los grupos
protectores comunes usados en la presente invención son
t-butiloxicarbonilo (Boc), fluorenilmetoxicarbonilo
(CBZ o Z),
2-cloro-fenil-metoxicarbonilo,
(2-Cl-CBZ o Cl-Z),
4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo
(Mtr), formilo (CHO) y butilo terciario (t-Bu).
Ácido trifluoroacético (TFA),cloruro de metileno
(CH_{2}Cl_{2}), N,N-diisopropiletilamina (DIEA),
N-metilpirrolidona (NMP),
1-hidroxibenzotriazol (HOBT), Dimetilsulfóxido
(DMSO), anhídrido acético (Ac_{2}O).
Procedimientos sintéticos generales para la
síntesis de los péptidos mediante síntesis de péptidos en fase
sólida que usan protección N^{\alpha}-Boc.
| Repeticiones | Tiempo | ||
| 1. | 25% de TFA en CH_{2}Cl_{2} | 1 | 3 min |
| 2. | 50% de TFA en CH_{2}Cl_{2} | 1 | 16 min |
| 3. | CH_{2}Cl_{2} | 5 | 3 min |
| 4. | 5% de DIEA en NMP | 2 | 4 min |
| 5. | NMP | 6 | 5 min |
| 6. | Etapa de acoplamiento | 1 | 57 min |
| a. Éster activo preformado BOC-Aminoácido-HOBT en NMP | 36 min | ||
| b. DMSO | 16 min | ||
| c. DIEA | 5 min | ||
| 7. | 10% de Ac_{2}O, 5% de DIEA en | 1 | 9 min |
| 8. | NMP | 5 | 3 min |
| CH_{2}Cl_{2} |
Procedimientos sintéticos generales para la
síntesis de péptidos en fase sólida que usan protección
N^{\alpha}-FMOC.
| Repeticiones | Tiempo | ||
| 1. | 20% de piperidina en NMP | 1 | 3 min |
| 2. | 20% de piperidina en NMP | 1 | 15 min |
| 3. | NMP | 6 | 9 min |
| 4. | Acoplamiento | 1 | 71 min |
| Éster activo preformado FMOC-Aminoácido-HOBT en NMP | |||
| 5. | NMP | 6 | 7 min |
La acetilación N-terminal del
grupo N^{\alpha}-amino desprotegido de los
péptidos sintetizados usando estrategias Boc o FMOC se lleva a cabo
con 10% de Ac_{2}O y 5% de DIEA en NMP, siguiendo un lavado de la
resina del péptido con NMP y/o CH_{2}Cl_{2}.
Como se demuestra mediante los siguientes
ejemplos, los péptidos PSGL-1 sulfatados,
glicosilados descritos en la presente invención que se unen a
P-selectina son aquellos que tienen al menos un
sulfato unido a un residuo de tirosina y una glicosilación
apropiada. Estudios comparativos de PSGL-1
recombinante expresado en células de mamífero (células COS) que
expresan una fucosiltransferasa con PSGL-1 nativo
purificado demuestran que la glicosilación fue sustancialmente
diferente. Se ha desarrollado, por lo tanto, un nuevo sistema de
expresión que produce una glicosilación más natural de
PSGL-1. El sistema de expresión está basado en un
sistema de expresión de mamíferos que expresa al menos dos
glicosiltransferasas: fucosiltransferasas III (FTIII) y
\beta1-6-N-acetilglucosaminaniltransferasa
de núcleo-2. En un enfoque preferido, la línea
celular se basa en una línea de expresión tal como células COS o CHO
que se transfectan con el ADNc que codifica para dos enzimas.
Los ADNc se muestran más adelante como Listado de
Secuencia ID nº 2 y 3, respectivamente. El Listado de la Secuencia
ID nº 2 codifica para una
\alpha(1,3/1,4)fucosiltransferasa (FTIII) humana
descrita por Kukosawa-Latallo y col., Genes &
Devel. 4, 1288-1303 (1990). El Listado de la
Secuencia ID nº 3 codifica para la
\beta1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa
de núcleo-2 (EC 2.4.1.102), como informaron
Bierhuizan y Fukuda, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
9326-9330 (1992). Estudios previos han fracasado en
reconocer la importancia de la
\beta1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa
de núcleo-2 para la modificación de
PSGL-1 para conferir la unión a
P-selectina. Alternativamente, el sistema de
expresión puede seleccionarse sobre la base de la expresión de una o
ambas enzimas de forma natural, proporcionando la segunda enzima
mediante transfección si fuera necesario.
Los ADNc se introducen en las células bajo el
control de promotores apropiados y, opcionalmente, intensificadores
y secuencias de selección.
Los promotores preferidos que controlan la
transcripción de vectores en células hospedadoras de mamíferos
pueden obtenerse de varias fuentes, por ejemplo, de los genomas de
los virus tales como: Virus de Simio 40 (SV40), adenovirus,
retrovirus, virus de la hepatitis B y, lo más preferible,
citomegalovirus, o de promotores de mamíferos heterólogos, por
ejemplo, el promotor de beta actina. Los promotores tempranos y
tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un
fragmento de restricción de SV40 que además contiene el origen de
replicación viral de SV40, Fiers y col., Nature, 273: 113
(1978). El promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano se
obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de Hind
III. Greenaway, P.J. y col., Gene 18:
355-360 (1982). Por supuesto, son también útiles los
promotores de la célula hospedadora o de especies relacionadas.
La transcripción del ADN que codifica para la
proteína deseada por los eucariotas superiores se incrementa
mediante la inserción de una secuencia intensificadora en el vector.
Los intensificadores son elementos de ADN que actúan en cis,
normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un
promotor para aumentar su capacidad de iniciación de la
transcripción. Los intensificadores son relativamente independientes
de orientación y posición habiéndose hallado en posición 5'
(Laimins, L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993) y
3' (Lusky, M.L. y col., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)) a la
unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji, J.L. y col.,
Cell 33:729 (1983)) así como dentro de la propia secuencia
codificante (Osborne, T.F. y col., Mol. Cell Bio. 4 1293
(1984)). Se conocen bien muchas secuencias intensificadoras de genes
mamíferos (globina, elastasa, albúmina,
\alpha-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin
embargo, se usará un intensificador de un virus de células
eucariotas. Los ejemplos incluyen el intensificador de SV40 en el
lado tardío del origen de replicación (pb 100-270),
el intensificador del promotor temprano del citomegalovirus, el
intensificador del polioma en el lado tardío del origen de
replicación e intensificadores de adenovirus.
Los vectores de expresión que se unan en células
hospedadoras eucariotas (células de levaduras, hongos, insectos,
plantas, animales, humanos o nucleadas) pueden contener además
secuencias necesarias para la terminación de la transcripción que
puede afectar a la expresión del ARNm. Estas regiones se transcriben
como segmentos poliadenilados en la porción no traducible del ARNm
que codifica para la proteína deseada. Las regiones 3' no
traducibles incluyen también sitios de terminación de la
transcripción.
Los vectores de expresión pueden contener un gen
de selección o un marcador de selección. Ejemplos de marcadores de
selección adecuados para células de mamífero son la dihidrofolato
reductasa (DHFR), la timidín quinasa o la neomicina. Cuando los
marcadores de selección se transfieren exitosamente en una célula
hospedadora de mamífero, la célula hospedadora de mamífero
transformada sobrevive cuando se sitúa bajo presión selectiva. Hay
dos categorías distintas que se usan ampliamente de regímenes de
selección. La primera categoría se basa en el metabolismo celular y
el uso de una línea celular mutante que carece de la capacidad para
crecer sin un medio suplementado. Dos ejemplos son: las células CHO
menos-DHFR y las células murinas LTK. Estas células
carecen de la capacidad de crecer sin la adición al medio de
nutrientes tales como la timidina o la hipoxantina. Debido a que
estas células carecen de ciertos genes necesarios para una ruta de
síntesis de nucleótidos completa, no pueden sobrevivir a menos que
se les proporcione los nucleótidos de los que carecen en un medio
suplementado. Una alternativa a suplementar el medio es introducir
un gen intacto de DHFR o TK en las células que carecen de los genes
respectivos, alterando así sus requerimientos de crecimiento. Las
células individuales que no se transformaron con el gen DHFR o TK no
serán capaces de sobrevivir en un medio no suplementado.
La segunda categoría es la selección dominante
que se refiere a un diseño de selección que se usa en cualquier tipo
celular y no requiere el uso de una línea celular mutante. Estos
diseños usan, típicamente, un fármaco para impedir el crecimiento de
una célula hospedadora. Ejemplos de dicha selección dominante usan
los fármacos neomicina, Southern P. y Berg, P. J. Molec. Appl.
Genet. 1: 327 (1982), ácido micofenólico, Mulligang, R.C. y
Berg, P. Science 209: 1422 (1980) o higromicina, Sugden, B. y col.
Mol. Cell. Biol. 5: 410 - 413 (1985). Los tres ejemplos dados
anteriormente emplean genes bacterianos bajo el control eucariotas
para conferir resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina
(geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina,
respectivamente.
Se denominará en lo sucesivo "amplificación"
al incremento o replicación de una región aislada dentro del ADN
cromosómico de la célula. La amplificación se consigue usando un
agente de selección, por ejemplo, metotrexato (MTX) que inactiva la
DHFR. La amplificación o la fabricación de copias sucesivas del gen
de DHFR produce grandes cantidades de DHFR produciéndose en la
presencia de gran cantidad de MTX. La presión de amplificación se
aplica, a pesar de la presencia de DHFR endógena, añadiendo incluso
gran cantidad de MTX al medio. La amplificación de un gen deseado
puede conseguirse mediante co-transfección a una
célula hospedadora de mamífero con un plásmido que tenga la
secuencia de ADN que codifique una proteína deseada y el DHFR o la
amplificación del gen que permite la cointegración. Se asegura que
la célula requiere más DHFR, a cuyo requerimiento se llega mediante
la replicación del gen de selección, mediante la selección
únicamente de las células que pueden crecer en presencia de una
concentración de MTX incluso mayor. Mientras que el gen que codifica
para una proteína heteróloga deseada se haya cointegrado con el gen
de selección, la replicación de este gen dará lugar a la replicación
del gen que codifica para la proteína deseada. El resultado es que
se incrementan las copias del gen, es decir, un gen amplificado, que
codifica para la proteína heteróloga deseada expresa más proteína
heteróloga deseada.
Las células hospedadoras preferidas adecuadas
para la expresión de los vectores en eucariotas superiores incluyen:
la línea de riñón de mono CVI transformada con SV40
(COS-7, ATCC CRL 1651); línea embrionaria de riñón
humano (293, Graham, F. L. y col. J. Gen. Virol. 36: 59
(1977)); células de riñón de bebé de hámster (BHK, ATCC CCL 10);
células de ovario de hámster chino-DHFR (CHO, Urlaub
y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216,
(1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, J.P., Biol.
Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de
mono (CVI ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano
(VERO-76, ATCC CRL-1587); células de
carcinoma de cérvix humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón
caninas (MCDK, ATCC CCL 34); células de riñón de rata búfalo (BRL
3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75);
células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón
(MMT 060562, ATCC CCL51); y, células TRI (Mather, J.P. y col.,
Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)).
Las células hospedadoras pueden transformarse con vectores de
expresión y cultivarse en medios con nutrientes convencionales
modificados apropiadamente para inducir promotores, seleccionar
transformantes o amplificar genes. Las condiciones del cultivo tales
como temperatura y pH, son las previamente usadas con la célula
hospedadora seleccionadas para la expresión.
La glicoproteína ligando de
P-selectina descrita anteriormente tiene diversas
aplicaciones como reactivos de diagnóstico y, potencialmente, en el
tratamiento de numerosas alteraciones inflamatorias y
trombóticas.
Los anticuerpos contra el ligando pueden usarse
para la detección de alteraciones humanas en las que los ligandos de
P-selectina podrían estar defectuosos. Lo más
probable es que tales alteraciones se observasen en pacientes con
una susceptibilidad a las infecciones incrementada en los que los
leucocitos no serían capaces de unirse a las plaquetas o al
endotelio activados. Las células a ensayar, normalmente leucocitos,
se recogen mediante técnicas estándar aprobadas médicamente y se
analizan. Los sistemas de detección incluyen procedimientos de
ELISA, unión de anticuerpos marcados radiactivamente a células
activadas inmovilizadas, citometría de flujo, análisis por
inmunoperosidasa o "inmunogold" u otros procedimientos
conocidos por los expertos en la técnica.
Los anticuerpos dirigidos específicamente contra
los componentes proteicos o de glúcidos del ligando pueden usarse
para distinguir defectos en la expresión del núcleo proteico o en
las glicosiltransferasas y/o enzimas modificadoras que construyen
las cadenas de oligosacáridos adecuadas sobre la proteína. Los
anticuerpos pueden usarse además para identificar en células y
tejidos distintos a leucocitos la expresión de componentes proteicos
o de glúcidos del ligando de la P-selectina.
Los clones de ADN complementario que codifican
para el componente proteico del ligando pueden aislarse y
secuenciarse. Estas sondas de ADNc pueden usarse como reactivos de
diagnóstico para examinar la expresión de los tránscritos de ARN del
ligando en los leucocitos y en otros tejidos mediante procedimientos
estándar tales como Northern Blotting del ARN aislado de células e
hibridación in situ de secciones histológicas.
Un enfoque similar puede usarse para determinar
alteraciones cualitativas y cuantitativas de la propia
P-selectina. La glicoproteína ligando, los glúcidos
o derivados apropiados de éstos, se marcan y se prueba su capacidad
para unirse a P-selectina sobre plaquetas activadas
de pacientes con alteraciones en las que P-selectina
podría estar defectuosa.
Los ligandos, o componentes de éstos, pueden
usarse también en ensayos de unión a P-selectina
para identificar compuestos que bloquean las interacciones entre
P-selectina y el ligando.
Debido a que la P-selectina tiene
varias funciones relacionadas con la adherencia leucocitaria,
inflamación, metástasis tumoral y coagulación, clínicamente, los
compuestos que interfieren con la unión de
P-selectina y/o las otras selectinas, que incluyen a
E-selectina y L-selectina, tales
como los glúcidos, pueden usarse para modular estas respuestas.
Estos compuestos incluyen a PSGL-1 o a sus
fragmentos, anticuerpos contra PSGL-1 o sus
fragmentos. Por ejemplo, la glicoproteína ligando, o sus
componentes, de forma particular los restos glucídicos, pueden
usarse para inhibir la adhesión leucocitaria mediante unión
competitiva a P-selectina expresada sobre la
superficie de plaquetas o células endoteliales, ambas activadas. De
manera similar, los anticuerpos contra el ligando pueden usarse para
bloquear la adhesión mediada por P-selectina
mediante unión competitiva al ligando de P-selectina
sobre los leucocitos u otras células. Estas terapias son útiles en
situaciones agudas donde se desea la inhibición efectiva, pero
transitoria, de la inflamación mediada por leucocitos. Además, el
tratamiento de alteraciones crónicas puede lograrse mediante la
administración sostenida de los agentes, por ejemplo, mediante
administración subcutánea u oral.
Una respuesta inflamatoria puede producir daño en
el paciente si no se detecta, debido a que los leucocitos liberan
muchas moléculas tóxicas que pueden dañar a los tejidos normales.
Estas moléculas incluyen enzimas proteolíticas y radicales libres.
Ejemplos de situaciones patológicas en las que los leucocitos pueden
producir tisular incluyen el daño por isquemia y reperfusión, sepsis
bacteriana y coagulación intravascular diseminada, síndrome de dolor
respiratorio del adulto, metástasis tumoral, artritis reumatoide y
aterosclerosis.
El daño de la reperfusión es el problema
principal en la cardiología clínica. Los agentes terapéuticos que
reducen la adherencia leucocitaria en el miocardio isquémico pueden
aumentar significativamente la eficacia terapéutica de los agentes
trombóticos. La terapia trombolítica con agentes tales como el
activador de plasminógeno tisular o la estreptoquinasa pueden
remediar la obstrucción arterial coronaria en muchos pacientes con
isquemia miocárdica severa previa a la irreversible muerte celular
del miocardio. Sin embargo, muchos de estos pacientes sufren aún
neurosis miocárdica a pesar del restablecimiento del flujo
sanguíneo. Este "daño por reperfusión" se sabe que está
asociado con la adherencia de los leucocitos al endotelio vascular
en la zona isquémica, presumiblemente debido en parte a la
activación de las plaquetas y el endotelio por trombina y citocinas
que los hacen adhesivos para los leucocitos (Romson y col.,
Circulation 67:1016-1023, 1983). Estos
leucocitos adherentes pueden migrar a través del endotelio y
destruir el miocardio isquémico a la vez que está siendo salvado por
el restablecimiento del flujo sanguíneo.
Hay varias alteraciones clínicas comunes
diferentes en las que la isquemia y la reperfusión producen daño en
los órganos mediado por la adherencia de los leucocitos a las
superficies celulares, que incluyen infartos; enfermedad vascular
mesentérica y periférica; transplante de órganos; y shock
circulatorio (en este caso pueden dañarse muchos órganos tras el
restablecimiento del flujo sanguíneo).
La sepsis bacteriana y la coagulación
intravascular diseminada existen a menudo concurrentemente en
pacientes críticamente enfermos. Están asociadas con la generación
de trombina, citocinas y otros mediadores inflamatorios, activación
de plaquetas y endotelio, y adherencia de leucocitos y agregación de
plaquetas en todo el sistema vascular. EL daño a los órganos
dependiente de leucocitos es un rasgo característico de estas
situaciones.
El síndrome de dolor respiratorio del adulto es
una alteración pulmonar devastadora que ocurre en pacientes con
sepsis o tras un trauma, que se asocia con la adherencia y
agregación de leucocitos diseminada en la circulación pulmonar. Esto
conduce a la extravasación de gran cantidad de plasma en los
pulmones y a la destrucción del tejido pulmonar, ambos mediados en
gran parte por los productos leucocitarios.
Dos alteraciones pulmonares relacionadas que a
menudo son fatales en pacientes inmunosuprimidos para transplante de
médula ósea alogénico y en pacientes con cáncer que sufren
complicaciones que surgen de pérdida vascular generalizada que se
produce por el tratamiento con células LAK (linfocitos activados con
linfocina) tratadas con interleucina-2. Se sabe que
las células LAK se adhieren a las paredes vasculares y liberan
productos que son presumiblemente tóxicos para el endotelio. Aunque
se desconoce el mecanismo a través del cual se adhieren las células
LAK al endotelio, estas células podrían liberar potencialmente
moléculas que activan el endotelio y luego unirse al endotelio
mediante mecanismos similares a los que operan en neutrófilos.
Las células tumorales de muchas malignidades (que
incluyen carcinomas, linfomas y sarcomas) pueden metastatizar a
sitios distantes a través de la vasculatura. No se conoce bien el
mecanismo de adhesión de las células tumorales al endotelio y su
migración posterior, pero puede ser similar a la de los leucocitos,
al menos en algunos casos. Específicamente, determinadas células de
carcinoma han demostrado que se unen a E-selectina,
como informaron Rice y Bevilacqua, Science 246:
1303-1306 (1991) y P-selectina, como
informaron Aruffo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
2292-2296 (1992). Stone y Wagner, J. Clin.
Invest. 92:804-813 (1992). Se ha descrito la
asociación de las plaquetas con las células tumorales que
metastatizan, sugiriendo un papel para las plaquetas en la expansión
de algunos cánceres. Debido a que P-selectina se
expresa sobre plaquetas activadas, se cree que está implicada en la
asociación de las plaquetas con, al menos, algunos tumores
malignos.
Se cree que las interacciones entre plaquetas y
leucocitos son importantes en la aterosclerosis. Las plaquetas
podrían desempeñar un papel en el reclutamiento de los monocitos a
las placas ateroscleróticas; se sabe que la acumulación de monocitos
es uno de los sucesos más tempranos que se detecta durante la
aterogénesis. La ruptura de una placa desarrollada por completo
puede no sólo lleve al depósito y activación de las plaquetas y a
promover la formación del trombo, sino que además reclute
tempranamente a los neutrófilos al área de isquemia.
P-selectina se expresa también inapropiadamente en
la superficie de las células endoteliales que revisten los ateromas,
donde pueden mediar el anclaje inicial a los monocitos que luego
migran dentro del ateroma (Johnson-Tidey, y col.
Am. J. Path. 144: 952-961, 1994).
Otra área de aplicación potencial es en el
tratamiento de la artritis reumatoide y otras alteraciones
autoinmunes o inflamatorias.
En estas aplicaciones clínicas, los péptidos o el
O-glicano aislado, o fragmentos de éstos, descritos
en la presente invención, pueden administrarse para bloquear las
interacciones dependientes de selectina mediante la unión
competitiva de P-selectina expresada sobre células
activadas. Además, pueden administrarse los anticuerpos contra los
componentes proteicos o de glúcidos del ligando, o fragmentos de
éstos. Los anticuerpos son preferiblemente de origen humano o
modificados para delecionar aquellas partes que con más probabilidad
pueden causar una reacción inmunogénica.
Los péptidos que se describen en la presente
invención pueden administrarse también como ácidos o bases de sales
farmacéuticamente aceptables formadas mediante la reacción con
ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico,
ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico y
ácido fosfórico, y ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido
acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido
pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido
maleico y ácido fumárico, o mediante reacción con bases inorgánicas
tales como hidróxido sódico, hidróxido amónico, hidróxido potásico,
y bases orgánicas tales como mono-, di-, trialquil y aril aminas y
etanolaminas sustituidas.
Los componentes de glúcidos (las estructuras
O-glicano o sus componentes) del ligando o de los
anticuerpos en un vehículo farmacéutico apropiado, se administran
preferiblemente por vía intravenosa donde se requiere liberación
inmediata. El/los glúcido/s pueden administrarse también por vía
intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, oral, como glúcidos o
conjugados con una molécula vehículo o en sistemas de liberación de
fármacos. El glúcido puede modificarse químicamente para aumentar su
vida media in vivo.
El glúcido puede aislarse de células que expresan
el glúcido, ya sea de forma natural o como resultado de ingeniería
genética como se describe en los ejemplos de células de mamífero
transfectadas, o preferiblemente, con medios sintéticos.
Los expertos en la técnica conocen estos
procedimientos. Además, se han clonado un gran número de
glicosiltransferasas (J.C. Paulson y K.J. Colley, J. Biol. Chem.
264: 17615-17618, 1989). De acuerdo con esto, los
trabajadores expertos en la técnica, pueden usar una combinación de
síntesis química y enzimática para fabricar reactivos farmacéuticos
o de diagnóstico.
Los glúcidos que son biológicamente activos son
aquéllos que inhiben la unión de los leucocitos a
P-selectina. Los vehículos farmacéuticamente
adecuados para la administración a un paciente son conocidos por los
expertos en la técnica. Para la administración parenteral, los
glúcidos se disolverán normalmente o se resuspenderán en agua
estéril o solución salina. Para la administración entérica, los
glúcidos se incorporarán a un vehículo inerte en forma de
comprimidos, líquido o cápsula. Los vehículos adecuados pueden ser
almidones o azúcares que incluyen lubricantes, saborizantes,
aglutinantes y otros materiales de la misma naturaleza. Los glúcidos
pueden administrarse también localmente en una herida o en el lugar
de la inflamación mediante aplicación tópica de una solución o una
crema.
Alternativamente, el glúcido puede administrarse
en, o como parte de, liposomas o microesferas (o micropartículas).
Los procedimientos para preparar liposomas y microesferas para la
administración a un paciente son conocidos por los expertos en la
técnica. La Patente de EEUU nº 4.489.734 describe procedimientos
para encapsular materiales biológicos en liposomas. Esencialmente,
el material se disuelve en una solución acuosa, se añaden los
fosfolípidos y lípidos apropiados, junto con detergentes si se
requieren y, si fuera necesario, el material se dializa o sonica.
Una buena revisión de procedimientos es la de G. Gregoriadis,
Capítulo 14. "Liposomes", Drug Carriers in Biology and
Medicine pág. 287-341 (Academic Press, 1979).
Los expertos en la técnica conocen bien las microesferas formadas
por polímeros o proteínas y pueden diseñarse para pasar a través del
tracto gastrointestinal directamente al torrente sanguíneo.
Alternativamente, los glúcidos pueden incorporarse y las
microesferas o compuestos de microesferas se implantan para
liberación lenta durante un periodo de tiempo que oscila de días a
meses. Véanse, por ejemplo, las patentes de EEUU nº 4.906.474,
4.925.673 y 3.625.214.
Los glúcidos deberían ser activos cuando se
administran por vía parenteral en cantidades superiores a
aproximadamente 1 \mug/kg de peso corporal. Para el tratamiento de
la mayoría de las alteraciones inflamatorias, el intervalo de dosis
estará entre 0,1 y 30 mg/kg de peso corporal. Una dosis de 70 mg/kg
puede requerirse para algunos de los glúcidos caracterizados en los
ejemplos.
El criterio para evaluar una respuesta a las
modalidades terapéuticas que emplean anticuerpos o glúcidos se dicta
mediante la condición específica y seguirá, en general, prácticas
médicas estándar. Por ejemplo, el criterio para la dosis efectiva
para evitar la extensión del infarto de miocardio se determinaría
por un experto en la técnica buscando enzimas marcadoras de la
necrosis del miocardio en el plasma, mediante seguimiento del
electrocardiograma, constantes vitales y respuesta clínica. Para el
tratamiento del síndrome de dolor agudo respiratorio, se examinarían
las mejorías en el oxígeno arterial, resolución de los infiltrados
pulmonares y mejora clínica como se mide a través de la disnea y
taquipnea reducidas. Para el tratamiento de pacientes en
shock (baja presión sanguínea), la dosis efectiva se basaría
en la respuesta clínica a medidas específicas de la función de
órganos vitales tales como el hígado y el riñón tras el
restablecimiento de la presión sanguínea. Se realizaría un
seguimiento de la función neurológica en los pacientes con infarto.
Se usan pruebas específicas para hacer el seguimiento del
funcionamiento de los órganos transplantados; por ejemplo, la
creatinina sérica, el flujo de orina y los electrolitos séricos en
pacientes que sufren transplante renal.
La presente invención y los ejemplos se
entenderán mejor en referencia a los siguientes ejemplos no
limitantes.
Se determinaron los efectos de diversas
glicosidasas sobre la estructura y función de PSGL-1
de neutrófilos humanos. Esta molécula, a diferencia del
PSGL-1 recombinante expresado en células COS con
FTIII, es muy resistente al tratamiento con
endo-\alpha-acetilgalactosaminidasa,
lo que sugiere que tiene pocos disacáridos de
núcleo-1 simple Gal\beta1-3GalNac
unidos a serina o treonina. PSGL-1 de neutrófilos
humanos tiene sLe^{x} y el equivalente no sializado, Le^{x},
principalmente en
poli-N-acetil-lactosamina
O-ligada. Estos datos sugieren que
PSGL-1 en neutrófilos humanos presenta una matriz de
poli-N-acetil-lactosamina
O-ligada, sializada y fucosilada que
P-selectina reconoce preferentemente en comparación
con PSGL-1 recombinante expresado en células COS con
FTIII.
Los efectos de las glicosidasas sobre
PSGL-1 purificado, marcado con yodo radiactivo, de
neutrófilos humanos se examinaron para caracterizar mejor la
estructura y la función de los oligosacáridos unidos. Se halló que
PSGL-1 tiene
poli-N-acetil-lactosamina,
pudiéndose eliminarse sólo algo de ella con
endo-\beta-galactosidasa. La
mayoría de las estructuras Le^{x} y sLe^{x} estaban en cadenas
sensibles a
endo-\beta-galactosidasa. El
tratamiento de con
péptido-N-glicosidasa F (PNGasaF)
eliminó al menos dos de los tres oligosacáridos
N-ligados posibles de PSGL-1. La
expresión de Le^{x} y sLe^{x} no se alteró de forma detectable
mediante digestión con PNGasaF, indicando que estas estructuras
eran, principalmente,
poli-N-acetil-lactosamina
O-ligada. El PSGL-1 tratado con
endo-\beta-galactosidasa mantuvo
la capacidad de unirse a P-selectina, lo que sugiere
que alguna parte del oligosacárido reconocido por
P-selectina estaba sobre la
poli-N-acetil-lactosamina
resistente a la enzima o sobre las cadenas que carecían de
poli-N-acetil-lactosamina.
El tratamiento con PNGasaF no afectó a la capacidad de
PSGL-1 de unión a P-selectina,
demostrando que los oligosacáridos requeridos para el reconocimiento
de P-selectina están O-ligados.
Estos datos demuestran que PSGL-1 de neutrófilos
humanos exhibe
poli-N-acetil-lactosamina
O-ligada compleja, sializada y fucosilada que
promueve la unión de alta afinidad a
P-selectina.
Las abreviaturas usadas son: CHO, ovario de
hámster chino; Con A, Concanavalina A; HSA, albúmina de suero
humano; Le^{x}, Lewis x; PBS, tampón salino fosfato; PAGE,
electroforesis en gel de poliacrilamida; PNGasaF,
péptido-N-glicosidasa F;
PSGL-1, glicoproteína ligando de
P-selectina 1; sLe^{x}, sialil Lewis x; tES,
E-selectina truncada soluble; tPS,
P-selectina truncada soluble; WGA, aglutinina de
germen de trigo.
El Triton X-100,
Brij-58 y la sialidasa de Arthrobacter
ureafaciens (/5 U/mg, EC 3.2.1.18) se obtuvieron de
CalbioChem-Behring Corp. (La Jolla, CA). Las
Iodobeads®, el medio de biosoporte 3M Emphaze® y la Sefarosa con
Proteína A CL4B fueron de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). La
Endo-\beta-galactosidasa de
Escherichia freundii (5 U/mg, EC 3.2.1.103) se obtuvo de
V-Labs, Inc. (Covington, LA). La 142
\alpha1,3/4-L-fucosidasa de
Streptomyces sp. (EC 3.2.1.30, 53 U/mg) fue de Sigma Chemical
Co. (St. Louis, MO). El
péptido-N-glicosicasaF recombinante
(EC 3.2.2.18, 25.000 U/mg, PNGasaF) y la
endo.\alpha-N-acetilgalactosaminidasa
de Diplococcus pneumoniae (EC 3.2.1.97,
O-glicanasa®) se obtuvieron de Genzyme Corp.
(Cambridge, MA). La Sefarosa con Concanavalina A (Con A, 10 mg/ml de
resina) fue de Pharmacia/LKB (Uppsala, Sweden). La agarosa con
aglutinina de germen de trigo (WGA) (7,6 mg/ml de resina) y la
lectina de tomate se obtuvieron de Vector Laboratories, Inc.
(Burlingame, VT). La lectina de tomare se acopló a Sefarosa activada
con bromuro de cianógeno a una densidad 2 mg/ml de resina en
presencia de 7,5 mg/ml de quitotriosa.
Los anticuerpos monoclonales
anti-P-selectina humana S12 y G1 se
prepararon y caracterizaron como describieron previamente McEver y
Martin (1984), Geng y col., (19901). Los anticuerpos monoclonales
anti-E-selectina humana CL2 y CL37
(Mullingan y col., J. Clin. Invest. 88,
1396-1406 (1991)) se obtuvieron de C. Wayne Smith
(Baylor College of Medicine, Houston, TX). LeuM1 (CD15, IgM) se
obtuvo de Becton Dickinson & Co. (San Jose, CA). El hibridoma
CSLEX-1 (HB 8580) se obtuvo de la Colección de
Cultivos Americana y el anticuerpo monoclonal IgM se purificó a
partir de líquido ascítico mediante precipitación con ácido bórico y
filtración en gel de Sefarosa CL4B en PBS, pH 7,4 como describieron
Shatti y col., J. Biol. Chem. 260,
11107-11114 (1985). La IgG específica de cabra
contra la cadena \mu de ratón y MOPC104E (IgM) se obtuvieron de
Cappel-Organon Technika (Durham, NC).
Los péptidos correspondientes a los residuos
42-56
(QATEY-EYLDYDFLPEC)(Secuencia ID nº 1) y
354-376 (CISSLLPDGGEGPSATAGGLSK) (Secuencia
ID nº 1) de la secuencia de aminoácidos derivada del ADNc de
\hbox{PSGl-1} se sintetizaron en un
sintetizador de péptidos Applied Biosystems Model 431. El péptido
42-58 se acopló a la hemocianina de lapa
californiana (KLH) activada con maleimida (Pierce Chemical Co.)
mediante la adición de cisteína y se inyectó en conejos blancos de
Nueva Zelanda (Montana State University Resources Center). El suero
inmunizado se recogió y se usó para inmunoprecipitar
^{125}I-PSGL-1. Las bolitas de
proteína A (25 \mul, suspensión al 50%) se preincubaron con 1
\mul de una dilución 1:4 de suero de conejo normal o inmunizado
durante 90 minutos a 37ºC. Las bolitas se lavaron una vez con NaCl
0,1 M, MOPS 20 mM, pH 7,5, Triton x-100 0,1% (MBS/
Triton 0,1%). El eluído de
\hbox{ ^{125} I-PSGL-1}
purificado o WGA marcado con yodo radiactivo se incubó entonces con
las bolitas en presencia o ausencia de 0,2 mg/ml del péptido de
inmunización o del péptido PSGL-1
354-376 que sirvió como control negativo. Después de
90 minutos de incubación a 37ºC las bolitas se lavaron cinco veces
con MBS/Triton 0,1% y el eluído se hirvió durante 5 min con tampón
de muestra SDS (Laemmli, Nature 227, 680-685
(1970)). Los inmunoprecipitados se analizaron mediante
SDS-PAGE, seguido de autorradiografía.
Se usó un plásmido de expresión
(ELAM-1:BBG 57, obtenido de British BioTechnology
Products, Ltd.) que contiene el ADNc completo de la
E-selectina humana como molde en la reacción en
cadena de la polimerasa para modificar los extremos 5' y 3' de
E-selectina para producir gran cantidad de
E-selectina recombinante soluble en las células CHO
D^{+}. El par de oligonucleótidos (5' GTC CCT CTA GAC CAC CAT GAT
TGC TTC ACA GTT T + 5' TCC CGG TCG ACT TAG GGA GCT TCA CAG GT)
(Listado de Secuencia ID nº 4 y 5 respectivamente) usados en la
reacción en cadena de la polimerasa se diseñaron para introducir un
sitio Xba I y una secuencia Kozak perfecta (Kozak, Nucleic
Acids Res. 9, 5233-5252 (1981)) que precedía al
codón de iniciación de la P-selectina y para
introducir un sitio Sal I tras el codón de parada
introducido después del aminoácido 550 localizado entre la sexta
repetición de consenso y el dominio transmembrana de la secuencia
completa de E-selectina. El análisis de la secuencia
de ADN verificó los cambios generados por la reacción en cadena de
la polimerasa así como la integridad del resto del ADNc de
E-selectina. El gen de E-selectina
truncado (tES) se introdujo entonces como un fragmento Xba I- Sal
I en el vector de expresión de mamíferos pDSR\alpha2
(solicitud de patente europea A20398753) que se modificó para
incluir sitios de restricción únicos para Xba I y Sal
I. El vector de expresión tES se transfectó en la línea celular
CHO deficiente en dihidrofolato reductasa
(DHFR-menos CHO) (Urlaub y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)) y los
transfectantes se seleccionaron en un medio que carecía de
hipoxantina y timidina (Bourdrel y col., Protein. Exp. Purif.
4, 130-140 (1993)). Se usó un ensayo de protección
frente a RNAsa para identificar los transfectantes que tenían
niveles elevados de ARNm específico de E-selectina
(Turner y col., Blood 80, 374-381
(1992)).
PSGL-1 se purificó de membranas
de neutrófilos humanos preparadas como se describe en Moore y col.,
(1992), con las modificaciones siguientes. Las membranas de
neutrófilos se extrajeron con Triton X-100 5% en
NaCl 0,1 M, MOPS 20 mM, pH 7,5, NaN_{3}0,02% se aplicaron a
agarosa WGA y las proteínas unidas se eluyeron con
N-acetilglucosamina 0,5 M (eluído WGA). Después de
diálisis extensiva frente a NaCl 0,1M, MOPS 20 mM, pH 7,5, NaN_{3}
0,02%, Brij-58 0,02%, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2}
2mM (tampón de equilibrado), el eluído WGA se cargó en una columna
Emphaze de P-selectina truncada (tPS) (10 mg
lectina/ml de resina). La columna se lavó extensivamente con tampón
de equilibrado y se eluyó con EDTA 5 mM. Las fracciones que
contenían el ligando se mezclaron y se cargaron en una columna Mono
Q PC 1,6/5 equilibrada con NaCl 0,1M, MOPS 20 mM, pH 7,5, NaN_{3}
0,02%, Brij-58 0,02% usando un Sistema de
Microseparación SMART® (Pharmacia/LKB). La columna se desarrolló con
un gradiente lineal (NaCl 0,1-1,0 M) a 50
\mul/min. Las alícuotas de las fracciones se marcaron con yodo con
Na^{125}I usando Iodobeads® según las instrucciones del
fabricante. La pureza de las fracciones se evaluó mediante
SDS-PAGE y autorradiografía de las fracciones
marcadas con yodo.
\newpage
Una forma soluble de P-selectina
truncada (tPS) después de la novena repetición de consenso se
purificó mediante inmunoafinidad a partir del medio acondicionado de
células 293 transfectadas permanentemente como se describe en
Ushiyama y col., (1993). tPS es un monómero asimétrico con un peso
molecular de 103.600 Da, determinado mediante velocidad de
sedimentación y análisis de equilibrio. El E_{280}^{1%} para tPS
es 12,3.
La E-selectina truncada (tES)
recombinante soluble se purificó mediante inmunoafinidad a partir
del medio acondicionado de células CHO D^{+} que secretaban de
forma estable tES. Las células se cultivaron a partes iguales en
medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y en la mezcla de
nutrientes Ham's F-12, suplementados con 10% de
suero bovino feral, 10 u/ml de penicilina y 10 mg/ml de
estreptomicina. Cuando llegaron a la confluencia, las células se
cambiaron a medio libre de suero y el medio acondicionado se recogió
cada 7 días. El medio condicionado se clarificó, se esterilizó por
filtración, usando dos filtros Sartorius (10 \mum y 0,2 \mum)
conectados en serie y luego se concentró 50 veces (Filtron Maximate,
10 KDa MW_{co}). El anticuerpo monoclonal
anti-E-selectina H18/7 (Bevilacqua y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
9238-9242 (1987) se acopló a Sefarosa activada con
bromuro de cianógeno a una densidad de 6 mg/ml de resina. La columna
de Sefarosa-H18/7 se equilibró a 4ºC con PBS, pH 7,5
que contenía CaCl_{2} 1 mM y MgCl_{2} 1 mM y se cargaron en la
columna 500 ml de medio concentrado (V_{T}= 200 ml) a una tasa de
flujo de 10 cm/h. La columna se eluyó con glicina 0,1 M, pH 2,7 y
las fracciones se neutralizaron rápidamente mediante la adición de
Tris-HCl, pH 7,5 hasta una concentración final de
0,1 M. El eluído se dializó frente a 25 fosfato de sodio 25 mM, pH
7,5 y se cargó en una columna de intercambio aniónico
Q-High Performance (V_{T} = 200 ml, Pharmacia)
equilibrada en el mismo tampón. La columna se desarrolló con un
gradiente lineal de NaCl (0,17 - 0,22 M). La pureza se evaluó
mediante SDS-PAGE y mediante el análisis de la
secuencia terminal. La concentración de proteína se determinó usando
un E_{280}^{1%} = 12,5 que se calculó usando el método de Gill y
von Hippel, Anal. Biochem. 182, 319-326
(1989). El rendimiento fue 250 mg de tES por aproximadamente 500 ml
de medio acondicionado concentrado.
Los experimentos de equilibrio de sedimentación
se llevaron a cabo usando un rotor de titanio de cuatro agujeros,
piezas centrales kel-f de columna corta y pareces de
zafiro en una ultracentrífuga analítica Beckman Optima XLA equipada
con interferencia óptica de Rayleigh conectado. Los datos se
adquirieron a velocidades del rotor de 10.000, 15.000, 20.000 y
25.000 rpm a 20ºC usando una cámara de televisión y un sistema de
adquisición y análisis conectado (Laue, T. M. (1981) tesis doctoral,
Universidad de Connecticut, Storres, CT; Laue y col., (1992) en
Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer
Science (Harding, S., Rowe, A. y Horton, J. C., eds.) pág.
90-125, Royal Society of Chemistry, Londres).
Las muestras se cargaron en concentraciones aproximadas de 1,0, 0,5,
0,25 y o,13 mg/ml en PBS, pH 7,4. Los datos se recogieron a
intervalos tras el tiempo estimado para el equilibrio y se probó su
equilibrio mediante la sustracción de escaneos sucesivos (Yphantis,
D.A., (1964) Biochemistry 3, 297-317). Los
datos dentro de la región óptica se seleccionaron usando el programa
REEDIT (proporcionado por David Yphantis). Los datos se analizaron
para estimar el peso molecular del monómero de tES usando el
programa NONUM (Yphantis, D.A. (1964) Biochemistry 3,
297-317). Los datos de equilibrio de sedimentación
de tres o más canales obtenidos a diferentes concentraciones de
carga de tES, posiciones radiales y velocidades angulares se
adaptaron mediante análisis simultáneo no lineal de mínimos
cuadrados. Para los cálculos del peso molecular, el volumen
específico parcial de tES se estimó en 0,688 ml/g con una
inexactitud de \pm 0,03 ml/g para contar con la incertidumbre de
la composición glucídica de tES (Laue y col. (1992)).
Los experimentos de velocidad de sedimentación se
llevaron a cabo en la ultracentrífuga analítica Beckman Optima XLA
usando las interferencia ópticas de Rayleigh. Los experimentos se
realizaron a 60.000 rpm y a 20ºC, usando un rotor de titanio de
cuatro agujeros, piezas centrales epon rellenas de carbón, de
dos canales y paredes de zafiro. La muestra se cargó a una
concentración de 0,5 mg/ml en PBS, pH 7,4. Los coeficientes de
sedimentación se determinaron mediante el tiempo derivado del perfil
de concentración como se describe en Stafford, W. (1992) Anal.
Biochem. 203, 295-301.
Los anticuerpos monoclonales G1 y CL2 (200
\mug) se marcaron con yodo con 400 \muCi Na^{125}I libre de
vehículo (ICN Biomedical, Inc., Costa Mesa, CA) usando Iodobeads®.
El ^{125}I libre se eliminó mediante filtración en gel a través de
una columna de Sefadex G-25
(PD-10,Pharmacia) que se equilibró en NaCl 0,1 M,
MOPS 20 mM, pH 7,5, Triton X-100 0,1%. Los
anticuerpos marcados se centrifugaron durante 30 min a 90.000 x g en
una ultracentrífuga TL-100 (Beckman, Palo Alto, CA).
La concentración de proteínas marcadas se determinó mediante un kit
de ensayo Micro BCA (Pierce) usando las proteínas respectivas sin
marcar como patrones. La actividad específica de los anticuerpos
marcados osciló entre 0,5-1,0 \muCi/\mug de
proteína.
PSGL-1 (0,5 \mug
aproximadamente) o el eluído WGA (100 \mug aproximadamente) se
marcaron con yodo con 400 \muCi de Na^{125}I y se eliminó la sal
como se describió anteriormente. PSGL-1 marcado
radiactivamente se concentró hasta aproximadamente 200 \mul usando
un dispositivo Centicon 30® (Pharmacia/LKB) y se filtró en gel en
una columna Superose 6 PC 3.2/30 equilibrada con NaCl 0,15 M, MOPS
20 mM, pH 7,5, NaN_{3} 0,02%, Brij-58 0,1% usando
un sistema de microseparación SMART® (Pharmacia/LKB). La actividad
específica del ligando marcado radiactivamente osciló entre
14-30 \muCi/\mug de proteína. Las proteínas
marcadas fueron rutinariamente mayores que 95% de precipitado con
ácido tricloroacético.
TPS o tES (50 \mul, 10 \mug/ml) en HBSS,
NaN_{3} (HBSS/Az) se incubaron toda la noche a 4ºC en placas de
microvaloración (Tiras Immulon I Removawell®, Dinatech Laboratories,
Inc., Chantilly, VA). Después de tres lavados con HBSS/Az los
pocillos se bloquearon con HBSS/Az/ albúmina de suero humano (HSA)
1% durante 2 h a 22ºC. Los pocillos se lavaron luego una vez con
HBSS/Az y se añadió ^{125}I-PSGL-1
diluido en HBSS/Az/HSA 0,1% (50 \mul, 5.000-10.000
cpm/pocillo). Después de 1 h a 22ºC los pocillos se lavaron
rápidamente cinco veces con HBSS/Az usando un lavador de placas de
12 canales (Nunc-Immuno Wash 12, Nunc Inc.,
Naperville, IL). Se midieron las cuentas de los pocillos por
separado en un contador \gamma. Todos los ensayos se realizaron
por cuadruplicado. En determinados ensayos la unión de
^{125}I-PSGL-1 a tPS inmovilizada
se midió en presencia de concentraciones crecientes de tPS o tES en
fase fluida.
La IgG específica de cabra contra la cadena \mu
de ratón (50 \mul, 10 \mug/ml) se incubó en HBSS/Az toda la
noche a 4ºC en tiras Immulon I Removawell®. Los pocillos se lavaron
y se bloquearon como se describió anteriormente. Después, se añadió
CSLEX-1, Leu M1 o MOPC104E (50 \mul, 5\mug/ml).
Tras la incubación durante 1 h a 22ºC, los pocillos se lavaron tres
veces con HBSS/Az y se añadió
^{125}I-PSGL-1 diluido en
HBSS/Az/HSA 0,1% (50 \mul, 5.000-10.000
cpm/pocillo). Tras 1h, los pocillos se lavaron como se describió
anteriormente y se midieron las cuentas de los pocillos por separado
en un contador \gamma. Todos los ensayos se realizaron por
cuadruplicado.
Las digestiones con sialidasa (0,2 U/ml, 15 h),
endo-\beta-galactosidasa (2 U/ml,
15 h) y \alpha1,3/4-L-fucosidasa
(0,32 mU/ml, 15 h) se realizaron en NaCl 0,1 M, acetato sódico 50
mM, pH 5,5. Las digestiones con PNGasaF (40 U/ml, 15 h) se hicieron
en fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,6. Generalmente,
PSGL-1 no sufrió pretratamiento con SDS porque la
PNGasaF tiene efectos similares con o sin pretratamiento con SDS.
Las digestiones secuenciales con sialidasa (0,2 U/ml, 2 h) seguidas
por
endo-\alpha-N-acetilgalactosaminidasa
(0,1 U/ml, 15 h) se realizaron en NaCl 0,1 M, acetato de sodio 50
mM, pH 6,0. Todas las digestiones con glicosidasa se realizaron a
37ºC en presencia de leupeptina 20 \muM, antipapaína 30 \muM,
benzamidina 1 mM y NaN_{3} 0,02%.
^{125}I-PSGL-1
se aplicó a una columna de Sefarosa con Concanavalina A (Con A)
(V_{T} = 1 ml) equilibrada en NaCl 0,1 M, Tris 20 mM, pH 7,5,
CaCl_{2} 2 mM, Brij-58 0,1%, NaN_{3} 0,02%. La
columna se lavó con cinco volúmenes de tampón de equilibrado y se
eluyó con \alpha-metilmanósido 0,5 M en tampón de
equilibrado precalentado a 65ºC. La cromatografía de lectina de
tomate se realizó de manera similar excepto en que la columna
(V_{T} = 1 ml) se equilibró con NaCl 0,1 M, MOPS 20 mM, pH 7,5,
Brij-58 0,1%, NaN_{3} 0,02% y se eluyó por etapas
con 20 mg/ml de quitotriosa en tampón de equilibrado. Se recogieron
más del 85% de las cuentas cargadas en las columnas de lectina.
Los anticuerpos monoclonales contra
P-selectina (G1) o E-selectina (CL2)
que inhiben las interacciones con las células mieloides se usaron
para medidas de densidad de sitio. Los pocillos se recubrieron con
tPS o tES (50 \mul, 10 \mug/ml) y se bloquearon como se
describió anteriormente. Se añadieron concentraciones saturantes de
anticuerpo monoclonal marcado con ^{125}I (2 \mug/ml) en
HBSS/Az/HSA 0,1% a los pocillos y se incubaron durante 1 h a 22ºC.
Los pocillos se lavaron 5 veces y a continuación se midieron las
cuentas en un contador \gamma. La unión específica se definió en
cpm unidas a los pocillos cubiertos de selectina menos las cpm
unidas a los pocillos cubiertos con HSA. Las densidades de sitio se
calcularon asumiendo enlaces monovalentes del anticuerpo en
saturación. Todos los ensayos se realizaron por cuadruplicado.
Se aislaron neutrófilos humanos de sangre
heparinizada de donantes voluntarios mediante sedimentación con
dextrano, lisis hipotónica y centrifugación en gradiente de densidad
en Ficoll-Hypaque como se describe en Zimmerman y
col. (1995) J. Clin. Invest. 76, 2235-2246.
La cuantificación de la adhesión de neutrófilos a tPS o tES (50
\mul, 10 \mug/ml) inmovilizadas en placas de microvaloración
Immulon I Removawell®, se realizó como se describe en Geng y col.,
(1990).
Para determinar si el núcleo del polipéptido de
la sialomucina ligando de P-selectina caracterizado
en neutrófilos humanos y en células HL-60 estaba
relacionado inmunológicamente con PSGL-1, una
glicoproteína ligando de P-selectina identificada
mediante clonaje de expresión de una biblioteca de ADNc de
HL-60, se probó el antisuero preparado en conejos
contra el péptido que corresponde a los residuos
42-56 de la secuencia de aminoácidos que deriva del
ADNc de PSGL-1 para ver si este antisuero podía
reconocer la glicoproteína ligando que aislamos mediante
cromatografía de afinidad a P-selectina. La pureza
radioquímica de la glicoproteína ligando de
^{125}I-P selectina usada en este estudio mostró
que exhibía un peso molecular relativo de aproximadamente 250.000
bajo condiciones no reductoras y aproximadamente 120.000 bajo
condiciones reductoras. Por lo que, la glicoproteína marcada
radiactivamente con yodo contenía dos subunidades unidas por puentes
disulfuro de M_{r} 120.000 consistente con los resultados previos
usando transferencia de proteína o marcaje metabólico. Como se
mencionó previamente, una pequeña porción de la glicoproteína
dimérica era resistente a la reducción bajo las condiciones usadas.
El suero inmunizado, pero no el suero normal de conejo, precipitó al
ligando purificado de
^{125}I-P-selectina. La
precipitación con el antisuero fue específica para la secuencia
peptídica 42-56, debido a que se inhibió
completamente con la inclusión de este péptido, pero no con la
inclusión de un péptido control que corresponde a los aminoácidos
354-376 de PSGL-1. La especificidad
del antisuero se demostró además mediante inmunoprecipitación
selectiva del ligando a partir de una mezcla de proteínas membranas
de neutrófilos marcadas radiactivamente que se eluyeron de la
columna WGA.
Dos péptidos trípticos derivaron de la
glicoproteína ligando de P-selectina purificada de
neutrófilos humanos. Las secuencias de estos péptidos,
His-Met-Tyr-Pro-Val-Arg
y
Pro-Gly-Lys-Thr-Pro-Glu-Pro,
son idénticas a los aminoácidos 340-345 y
380-386 de la secuencia derivada del ADNc de
PSGL-1 (Secuencia ID nº 1). Estos datos y los
resultados de los experimentos de inmunoprecipitación establecen la
identidad de los esqueletos polipeptídicos de los ligandos de
P-selectina estudiados en ambos grupos.
^{125}I-PSGL-1
aislado de neutrófilos humanos se unió de forma dependiente del
tiempo a tPS inmovilizada en placas de microvaloración. La unión
aumentó en función de la cantidad de la tPS que cubría los pocillos.
La unión fue dependiente de Ca^{2+} y se suprimió con G1, un
anticuerpo monoclonal contra P-selectina que inhibe
la adhesión de los leucocitos a P-selectina, pero no
con S12, un anticuerpo monoclonal que no bloquea la adhesión.
Además, 84,6 \pm 2,4% (media \pm DS, n = 4) de la glicoproteína
marcada radiactivamente se re-unió a una columna de
P-selectina recombinante soluble (tPS) y se eluyó
con tampón que contenía EDTA. Este resultado demuestra que la
función de ^{125}I-PSGL-1 no se
alteró sustancialmente por el marcaje con yodo.
PSGL-1 de células mieloides
humanas contiene oligosacáridos O-ligados agrupados
y sializados que se liberan del esqueleto polipeptídico mediante
eliminación \beta (Norgard y col. (1993). Para determinar si estos
glicanos O-ligados tenían estructuras simples,
^{125}I-PSGL-1se trató con
sialidasa, posteriormente con
endo-\alpha-N-acetilgalactosaminidasa,
una enzima que libera el disacáridos de núcleo-1
Gal\beta1-3GalNAc no sializados, pero no glicanos
O-ligados más complejos, de residuos de serina y
treonina (Umemoto y col. (1977) J. Biol. Chem. 252,
8609-8614). El tratamiento con sialidasa redujo la
movilidad electroforética de PSGL-1, confirmando
resultados previos. La adición posterior de
endo-\beta-N-acetilgalactosaminidasa
aumentó la movilidad de PSGL-1 sólo ligeramente más
que la de PSGL-1 tratada con sialidasa, lo que
sugiere que muy pocos de los oligosacáridos
O-ligados eran estructuras simples que fueran
susceptibles a esta enzima.
PSGL-1 está fucosilado, ya que
contiene el antígeno tetrasacárido, sializado, fucosilado sLe^{x}
(Norgard y col. (1993)). El tratamiento de la glicoproteína con
\alpha1, 3/4 fucosidasa que elimina la fucosa anclada al penúltimo
GlcNAc, no tuvo efecto sobre la movilidad electroforética, sin
embargo, sí que eliminó los residuos de fucosa que formaban parte de
los epítopos del Le^{x} sobre la molécula. El ligando se trató
entonces con
endo-\beta-galactosidasa, que
hidroliza las uniones internas \beta 1-4 entre
galactosa y N-acetilglucosamina
(Gal\beta1-4GlcNAc) en las cadenas extendidas sin
ramificar de
poli-N-acetil-lactosamina
(Scudder y col., (1983) Biochem. J. 213,
485-494; Scudder y col., (1984) J. Biol.
Chem. 259, 6586-6592). Esta enzima aceleró
ligeramente la movilidad y redujo la heterogeneidad electroforética
de
\hbox{PSGL-1,} sugiriendo que
PSGL-1 contenía algo de
poli-N-acetil-lactosamina.
Para confirmar la presencia de
poli-N-acetil-lactosamina,
se ensayó la capacidad de
^{125}I-PSGL-1 para unirse a una
columna que contenía lectina de tomate inmovilizada, que se une
ávidamente a
poli-N-acetil-lactosamina.
Una única cadena de
poli-N-acetil-lactosamina
es suficiente para que se produzca la unión de una glicoproteína a
la lectina de tomate en este sistema (Merkle y col. (1987) J. Biol.
Chem. 262, 8179-8189). Más del 95% de
PSGL-1 se unió a la columna, indicando que,
esencialmente, cada molécula contenía al menos una
poli-N-acetil-lactosamina
(Tabla 3). El tratamiento de PSGL-1 con
endo-\beta-galactosidasa redujo
modestamente a 84% la cantidad de material que se unió a la columna.
Esto sugiere que la mayoría, si no todas, de las
poli-N-acetil-lactosamina
podrían eliminarse de una fracción de las moléculas de
PSGL-1 mediante
endo-\beta-galactosidasa. Debido a
que las sustituciones de
poli-N-acetil-lactosamina
con ácido siálico y/o fucosa inhiben la eficiencia de esta enzima,
se hizo un pretratamiento a PSGL-1 con sialidasa y
fucosidasa antes de la adición de
endo-\beta-galactosidasa. El
tratamiento con sialidasa y fucosidasa no tuvo efecto sobre la unión
de PSGL-1 a la columna, de acuerdo con el hecho de
que las sustituciones con ácido siálico o fucosa no afectan a la
unión de
poli-N-acetil-lactosamina
a la lectina de tomate. Sin embargo, la adición posterior de
endo-\beta-galactosidasa redujo al
69% la fracción de la glicoproteína que se unía a la columna. Debido
a que la lectina del tomate se une débilmente a residuos GlcNAc
terminales que están expuestos al tratamiento con
endo-\beta-galactosidasa
(Cummings, (1994) Methods Enzymol. 230,
66-86), se añadió
\beta-N-acetilglucosaminidasa para
eliminar estos residuos terminales. Solo el 53% de este material se
unió a la lectina de tomate. Estos datos demuestran claramente que
PSGL-1 contenía
poli-N-acetil-lactosamina.
Además, alguna de estas cadenas al menos era resistente a la
endo-\beta-galactosidasa debido a
sustituciones con ácido siálico y/o fucosa. La incapacidad de la
sialidasa, fucosidasa,
endo-\beta-galactosidasa y
\beta-N-acetilglucosaminidasa para
eliminar la unión de todas las moléculas de PSGL-1 a
la lectina de tomate puede reflejar la resistencia a la enzima
debida al agrupamiento natural de glicanos
O-ligados, la presencia de residuos internos de
fucosa y/o la presencia de sustituciones adicionales tales como
sulfato en la
poli-N-acetil-lactosamina.
| Efectos de las glicosidasas sobre la unión de ^{125}I-PSGL-1 a una columna de afinidad a lectina de tomate. | |
| Tratamiento enzimático | Porcentaje de unión |
| Control | > 95 |
| Endo-\beta-galactosidasa | 84 |
| Sialidasa + fucosidasa | >95 |
| Sialidasa + fucosidasa + Endo-\beta-galactosidasa | 69 |
| Sialidasa + fucosidasa + Endo-\beta-galactosidasa + \beta-N-acetilglucosaminidasa | 53 |
| Péptido-N-glicosidasa F | >95 |
| ^{125}I-PSGL-1 se trató con la/s glicosidasa/s indicada/s y se aplicó a una columna de lectina de tomate | |
| inmovilizada (V_{t} = 1 ml. 2 mg lectina/ml de resina). Tras los lavarse, la columna se eluyó con 20 mg/ml | |
| de quitotriosa. El porcentaje de PSGL-1 unido se definió como la radiactividad eluída mediante quito- | |
| triosa dividida por la suma de la radiactividad en el flujo de la columna, del lavado y del eluído. |
El tratamiento con PNGasaF aumentó ligeramente la
movilidad electroforética de [^{125}I] PSGL-1,
consistentemente con previos estudios que indican que todas las
moléculas contenían un número limitado de glicanos
N-ligados sensibles a esta enzima. La secuencia
derivada del ADNc de PSGL-1 indica que la molécula
contiene sólo tres sitios potenciales para el anclaje de
oligosacáridos N-ligados (Sako y col., (1993)).
Para explorar la posible heterogeneidad de las estructuras
N-ligados, [^{125}I]PSGL-1
con tratamiento control y con PNGasaF se aplicó a una columna de
Concanavalina A (Con A), una lectina vegetal que se une ávidamente a
glicanos con mucha manosa N-ligados, menos
ávidamente a complejos biantenarios y oligosacáridos híbridos
N-ligados, y muy débilmente al complejo triantenario
y tetrantenario de cadenas N-ligados (Ogata y col.
(1975) J. Biochem. (Tokyo) 78, 687-696). 41,9
\pm 4,2% del ligando con tratamiento control se unió a Con A,
mientras que solamente 3,7 \pm 1,0% del material tratado con
PNGasaF se unió (media \pm DS, n = 4). Más del 85% de las cuentas
cargadas en la columna se recogieron. Este resultado demuestra que
PNGasaF eliminó los glicanos N-ligados que
reconocios por Con A de PSGL-1.
La fracción de PSGL-1 que no se
unía a Con A migró más despacio que la fracción unida a Con A. Para
confirmar que el material que no se unía a Con A también contenía
oligosacáridos N-ligados, ambas fracciones, unida y
sin unir, se trataron con PNGasaF. La enzima redujo los pesos
moleculares aparentes de las fracciones sin unir y unida a 14,5 kDa
y 13,7 kDa, respectivamente. Así, ambas fracciones tenían glicanos
N-ligados sensibles a PNGasaF. Estos datos
sugirieron que la fracción que no se unía a Con A contenían glicanos
triantenarios y/o tetraantenarios N-ligados que la
Con A no reconoció. El glicano N-ligado más largo
descrito en células mieloides (peso molecular aproximada 6.600) es
una estructura tetraantenaria disializada con secuencias de
poli-N-acetil-lactosamina
sobre cada antena, externas y con núcleo de fucosa (Spooner y col.
(1984) J. Biol. Chem. 259, 4792-4801). Por lo
tanto, el cambio observado en la movilidad eletroforética después
del tratamiento con PNGasaF es consistente con la eliminación de al
menos dos y posiblemente tres glicanos complejos
N-ligados. Incluso después del tratamiento con
PNGasaF, el material que no se unía a Con A migró ligeramente más
despacio que el material unido a Con A. Esto puede indicar que la
fracción que no se unió a Con A retuvo una única cadena unida en N
que fue resistente a la PNGasaF. Alternativamente, puede haber otras
diferencias estructurales entre las fracciones unidas a Con A y las
que no se unieron a Con A, de las cuales, la más probable es la
heterogeneidad de la O-glicosilación.
El tratamiento con sialidasa o con
endo-\beta-galactosidasa tuvo
efectos similares en las movilidades electroforéticas de las
fracciones que no se unieron a Con A y de las unidas a Con A,
probablemente debido a que estas enzimas afectan principalmente a
los oligosacáridos abundantes O-ligados. La
endo-\beta-galactosidasa produjo
aumentos similares en las movilidades electroforéticas de
PSGL-1 con pretratamiento con PNGasaF y
PSGL-1 que contenía todos sus oligosacáridos
N-ligados, lo que sugiere que al menos parte de la
poli-N-acetil-lactosamina
estaba sobre glicanos O-ligados.
\newpage
Para determinar si PSGL-1 expresa
Le^{x} o sLe^{x} sobre
poli-N-acetil-lactosamina
se desarrolló un ensayo para medir la unión de
^{125}I-PSGL-1 a un anticuerpo
monoclonal IgM inmovilizado contra sLe^{x}
(CSLEX-1) o Le^{x} (LeuM1), o a un anticuerpo
monoclonal IgM inmovilizado irrelevante (MOPC104E). PSGL.1 unido a
CSLEX1 pero no a MOPC104E, que confirmó los datos previos de
inmunotransferencia que la glicoproteína expresada sLe^{x}. Más
del 85% de las moléculas de
^{125}I-PSGL-1 se unieron a una
columna de afinidad de CSLEX-1 lo que indicó que
casi todas las moléculas contenían sLe^{x}. PSGL-1
también se unió a LeuM1, indicando que contenía Le^{x}, aunque es
posible que la desialización generase esta estructura durante la
purificación de la glicoproteína. El tratamiento de
PSGL-1 con sialidasa eliminó la unión a
CSLEX-1 e incrementó la unión a LeuM1, de acuerdo
con las especificidades conocidas de estos anticuerpos. El
tratamiento de PSGL-1 con fucosidasa no tuvo efecto
sobre la unión a CSLEX-1, de acuerdo con la
inhibición de esta enzima por ácido siálico terminal (Sano y col.
(1992) J. Biol. Chem. 267, 1522-1527; Maemura K. y
Fukuda M. (1992) J. Biol. Chem. 267,
24379-24386). Por el contrario, la fucosidasa que
eliminó la unión de PSGL-1 a LeuM1.
Tras el establecimiento de la especificidad del
ensayo, se determinó si el tratamiento de PSGL-1 con
endo-\beta-galactosidasa afectó a
la expresión de estructuras Le^{x} o sLe^{x}. Esta enzima
suprimió la unión de PSGL-1 a LeuM1 inmovilizado y
redujo la unión a CSLEX-1 64 \pm 14% (media \pm
DS). Estos datos indican claramente que la
endo-\beta-galactosidasa escindió
la
poli-N-acetil-lactosamina
llevándose parte, y quizás todo, de Le^{x} así como una fracción
de sLe^{x} sobre PSGL-1. Las estructuras que
quedan de sLe^{x} pueden estar sobre
poli-N-acetil-lactosamina
ramificada o sustituida que sea resistente a la enzima o sobre
cadenas que carezcan que
poli-N-acetil-lactosamina.
En contraste con los efectos de la
endo-\beta-galactosidasa, PNGasaF
no afectó a la unión de PSGL-1 a LeuM1 o
CSLEX-1 inmovilizado, indicando que pocas, silas
hubiera, estructuras Le^{x} o sLe^{x} estaban presentes en
oligosacáridos N-ligados sensibles a PNGasaF. En
conjunto con los otros datos, esta observación indicó que los
oligosacáridos O-ligados llevaban la mayoría de, y
quizás todas, las estructuras Le^{x} y sLe^{x}. Además, al menos
alguna de estas estructuras eran
poli-N-acetil-lactosamina
O-ligada.
Se determinaron entonces los efectos de las
glicosidasas sobre la unión de
^{125}I-PSGL-1 a tPS inmovilizada.
El tratamiento con sialidasa, que eliminó la unión al anticuerpo
anti-sLe^{x} pero intensificó la unión al
anticuerpo anti-Le^{x}, evitó completamente la
unión de PSGL-1 a tPS. Por el contrario, el
tratamiento con fucosidasa, que eliminó la unión al anticuerpo
anti-Le^{x} pero no al anticuerpo
anti-sLe^{x}, no tuvo efectos sobre la interacción
de PSGL-1 con tPS. Estos datos están de acuerdo con
resultados previos de otros ensayos en los que la unión de alta
afinidad de P-selectina a células mieloides o a
PSGL-1 requería ácido siálico sobre el ligando.
El tratamiento de PSGL-1 con
endo-\beta-galactosidasa produjo
sólo una modesta reducción en la unión a tPS inmovilizada. En cuatro
experimentos independientes, la
endo-\beta-galactosidasa redujo la
unión 25 \pm 11% (media \pm DS, n=4). Estos datos sugieren que
parte, pero no todas las cadenas sializadas que se requieren para el
reconocimiento de P-selectina estaban sobre
poli-N-acetil-lactosamina
que eran sensibles a la enzima. Los glicanos restantes que se
requieren para el reconocimiento podrían estar sobre
poli-N-acetil-lactosamina
que fueran resistentes a
endo-\beta-galactosidasa o sobre
oligosacáridos que carecen de
poli-N-acetil-lactosamina.
La endo-\beta-galactosidasa
inhibió la unión de PSGL-1 al anticuerpo
anti-sLe^{x} más de lo que inhibió la unión a tPS.
Los niveles de sLe^{x} podrían no estar exactamente
correlacionados con la interacción con tPS, ya que no se sabe
cuántas estructuras de sLe^{x} se requerían para la unión de
PSGL-1 al anticuerpo o a tPS en estos ensayos.
El tratamiento de PSGL-1 con
PNGasaF no afectó a su capacidad para unirse a tPS, apoyando la
conclusión de que los oligosacáridos N-ligados
desempeñan, si acaso, un pequeño papel en el reconocimiento de
P-selectina.
La estructura y la función de
PSGL-1 de neutrófilos humanos se caracterizó además
usando ensayos con la glicoproteína purificada, marcada
radiactivamente con yodo. Los resultados sugieren que esta molécula
presenta una matriz de
poli-N-acetil-lactosamina
O-ligada, sializada y fucosilada, que crea
estructuras de unión de alta afinidad por la
P-selectina.
Aunque la gran mayoría de los oligosacáridos de
PSGL-1 están O-ligados, hay unos
pocos glicanos N-ligados que se determinó que eran
heterogéneos. Todas las moléculas de PSGL-1
contenían oligosacáridos N-ligados sensibles a
PNGasaF, pero sólo el 42% de las moléculas de glicoproteína se unían
a Con A, una lectina que se une bien a glicanos
N-ligados con mucha manosa y menos bien a complejos
biantenarios y a cadenas N-ligadas híbridas.
Basándose en las reducciones del peso molecular aparente observadas
en geles SDS, la PNGasaF eliminó al menos dos de los tres glicanos
N-ligados posibles de ambas fracciones, la que se
unió y la que no a Con A, de PSGL-1. Una cadena
sobre la fracción que no se unió a Con A puede ser resistente al
tratamiento con PNGasaF, ya que el material que no se unió a Con A
migró aún más despacio en geles SDS que el material unido a Con A
tras el tratamiento con PNGasaF. Alternativamente, la PNGasaF puede
haber eliminado todas las cadenas N-ligadas de ambas
fracciones, la que se unía y la que no a Con A, en cuyo caso la
diferencia de movilidad puede reflejar la heterogénea glicosilación
O-ligada. Los glicanos N-ligados
sensibles a PNGasaF llevaban poco o nada de Le^{x} y sLe^{x} y
no contribuyeron de forma apreciable a la interacción con
P-selectina. Estos resultados sugieren claramente
que los glicanos O-ligados exhiben las estructuras
relevantes que reconoce P-selectina.
Debido a que al menos parte de los oligosacáridos
O-ligados sobre PSGL-1 llevan
(\alpha2-3)ácido siálico y
(\alpha1-3)fucosa, deben tener estructuras
relativamente grandes y ramificadas. De acuerdo con esta predicción,
se halló que PSGL-1 llevaba pocos disacáridos de
núcleo-1 Gal\beta1-3GalNAc
ligados a Ser/Thr que la
endo-\alpha-N-acetilgalactosaminidasa
escinde tras la eliminación de los ácidos siálicos terminales.
Estos datos son coherentes con las observaciones previas de que se
liberaban por \beta-eliminación menos del 10% de
oligosacáridos N-ligados marcados con ^{3}H de
PSGL-1 eran pequeños, como se valoró mediante
filtración en gel.
Los glicanos O-ligados en
PSGL-1 incluyen un grupo heterogéneo de
poli-N-acetil-lactosamina.
Medido mediante movilidad en geles de SDS y por unión a lectina de
tomate, la
endo-\beta-galactosidasa escindió
parte de la
poli-N-acetil-lactosamina
en el enlace interno \beta1-4 entre la Gal y
GlcNAc. El tratamiento con esta enzima redujo además la cantidad de
Le^{x} y de sLe^{x}, indicando que parte de estas estructuras
estaban sobre la
poli-N-acetil-lactosamina.
Medido mediante la unión a lectina de tomate, la
endo-\beta-galactosidasa escindió
otras
poli-N-acetil-lactosamina
sólo después del tratamiento con sialidasa y fucosidasa, demostrando
que tenían restos de ácido siálico y de fucosa en o cerca de su
región terminal que prevenía el acceso de
endo-\beta-galactosidasa. Debido a
que una fracción de las moléculas de PSGL-1 se unían
aún a la lectina de tomate después del tratamiento con las tres
enzimas, puede haber otras cadenas de
poli-N-acetil-lactosamina
que se permanezcan resistentes a la
endo-\beta-galactosidasa debido a
la ramificación o a sustituciones internas adicionales. Tales
estructuras podrían ser responsables, al menos en parte, de la
capacidad de PSGL-1 para unirse a tPS inmovilizado
después de la digestión con
endo-\beta-galactosidasa.
Estudios previos han demostrado que las células
humanas mieloides expresan
poli-N-acetil-lactosamina
en algunos de los glicanos O-ligados. Estas
estructuras aparecen casi exclusivamente en la ramificación anclada
al C-6 de GalNAc como parte del oligosacárido de
núcleo-2 O-ligado (Fukuda y col.
(1986) J. Biol. Chem. 261, 12796-12806;
Hanisch y col., (1989) J. Biol. Chem. 264,
872-883). De los aproximadamente 80 glicanos
O-ligados sobre la principal sialomucina de células
mieloides humanas, la leucosialina (CD43), solamente uno o dos
contienen
poli-N-acetil-lactosamina
y, aproximadamente, la mitad de éstos tienen un resto terminal
sLe^{x}. Por el contrario, PSGL-1 de neutrófilos
parece que contiene un elevado porcentaje de
núcleo-2,
poli-N-acetil-lactosamina.
Se requerirá el análisis estructural directo para determinar los
monosacáridos específicos, las uniones y las modificaciones que
constituyen los glicanos O-ligados de
PSGL-1. Sin embargo, los datos actuales sugieren que
parte de estos glicanos pueden diferir de los de la leucosialina, lo
que implica que las células mieloides humanas pueden glicosilar
diferencialmente los esqueletos polipeptídicos de dos sialomucinas
distintas. Esta glicosilación diferencial es importante
funcionalmente, ya que P-selectina se une con alta
afinidad a PSGL-1, pero no a leucosialina.
Las selectinas requieren la sialización y
fucosilación de la mayoría de los glúcidos ligandos para
reconocerlos. De manera similar, PSGL-1 requiere
ácido siálico y fucosa para interaccionar con
P-selectina. Aunque PSGL-1 expresa
el tetrasacárido terminal sLe^{x}, no está claro si requiere esta
estructura per se para el reconocimiento. Un modelo simple es
que PSGL-1 presenta muchos restos terminales
sLe^{x} que aumentan la avidez con la que interacciona con
P-selectina. Sin embargo, observaciones previas
indican que elevadas concentraciones de sLe^{x} en la superficie
celular no son suficientes para conferir interacciones óptimas con
P-selectina. Es más probable que modificaciones
adicionales en cada cadena de oligosacáridos sean esenciales para el
reconocimiento óptimo. Las características específicas de varios
aminoácidos próximos pueden estar presentes en un parche de
sacáridos agrupados que promueva la unión de alta afinidad de
P-selectina.
Sako y col (1993) generaron una forma
recombinante de PSGL-1 que se unía a
P-selectina cuando se expresaba en células COS
co-transfectadas con una
\alpha-1-3/4 fucosiltransferasa
(FTIII), pero no en células COS que carecían de la
fucosiltransferasa. El peso molecular relativo de la molécula
recombinante fue similar al de PSGL-1 en células
mieloides humanas HL-60 y los autores concluyeron
que aparentemente la estructura y la función de
PSGL-1 recombinante era equivalente a la hallada en
la molécula nativa. Sin embargo, se desconocen las estructuras
específicas de oligosacáridos ancladas a PSGL-1
nativo y la glicosiltransferasas que se requerían para construir
estas estructuras. Además, la
\alpha-1-3/4 fucosiltransferasa
(FTIII) expresada en las células COS para generar
PSGL-1 recombinante difiere de la fucosiltransferasa
de las células mieloides humanas (Goelz y col. (1990) Cell
63, 1349-1356; Sasaki y col. (1994) J. Biol.
Chem. 269, 14730-14737). Por tanto, no está
claro que la glicosilación y, de hecho, la función, de
PSGL-1 recombinante sea idéntica a la de la
glicoproteína nativa en células mieloides humanas. De hecho, tras la
digestión de PSGL-1 recombinante con sialidasa, la
adición de
endo-\beta-galactosaminidasa
produjo un aumento sustancial en la movilidad de la glicoproteína,
lo que indica que PSGL-1 recombinante expresada en
células COS con FTIII, en contraste con la glicoproteína nativa,
contiene muchos disacáridos simples de núcleo 1
Gal\beta1-3GalNAc O-ligados que
son susceptibles a esta enzima.
Sako y col. hallaron que PSGL-1
no se volvía a unir a P-selectina después del
tratamiento con sialidasa y
\beta-N-galactosaminidasa y
concluyeron que los oligosacáridos O-ligados eran
importantes para el reconocimiento por P-selectina.
La digestión prolongada con sialidasa se requiere para suprimir la
unión a PSGL-1 nativo, y las condiciones para la
digestión con sialidasa de PSGL-1 recombinantes
usadas por Sako y col. redujeron, pero no eliminaron, la unión a
P-selectina. La pérdida de la unión de
P-selectina tras la adición de
endo-\alpha-N-galactosaminidasa,
que libera sólo el disacárido de núcleo-1
Gal\beta1-3GalNAc no sializado, se debía
probablemente más a la contaminación previamente observada de esta
enzima con sialidasa, que eliminaría los ácidos siálicos que
quedaban que se requieren para el reconocimiento.
Sako y col. sugirieron además que los
oligosacáridos N-ligados contribuían a la unión de
P-selectina, debido a que
P-selectina recombinante no precipitó todo el
precipitado de PSGL-1 recombinante tratado con
PNGasaF. Sin embargo, estos autores no demostraron si el ensayo de
re-precipitación era cuantitativo probando si cada
etapa de precipitación adicional aumentaba la recuperación de
PSGL-1. El mismo grupo concluyó también que la
glicosilación N-ligada era importante para el
reconocimiento por P-selectina porque observaron que
las células mieloides HL-60 tratadas con
tunicamicina, un inhibidor de la glicosilación
N-ligada, no se adherían a células que expresan
P-selectina (Larsen y col. (1992) J. Biol.
Chem. 267, 11104-11110). Sin embargo, la
tunicamicina ejerce efectos indirectos sobre las células, tales como
inhibir la salida de algunas proteínas del retículo endoplasmático,
lo que dificulta interpretar sus efectos sobre la adhesión celular.
Los estudios en esta solicitud no proporcionan evidencias de que los
glicanos N-ligados de PSGL-1 de
neutrófilos humanos desempeñen un papel en el reconocimiento por
P-selectina.
Se ha expresado una forma funcional de
PSGL-1 recombinante que tiene muchas de las
propiedades de PSGL-1 nativo purificado de
neutrófilos humanos. El estudio demuestra que
PSGL-1, a fin de unirse a
P-selectina, requiere oligosacáridos
O-ligados sializados y fucosilados que contengan la
estructura ramificada de núcleo 2.
PSGL-1 se expresó en células de
ovario de hámster chino (CHO), que se seleccionaron debido a que las
estructuras de oligosacáridos N- y O-ligados sobre
estas células están muy bien caracterizadas. En particular, los
oligosacáridos ligados a Ser/Thr sobre proteínas de secreción y de
superficie son derivados simples, de núcleo 1, mono y desializados,
de
Gal\beta1-3GalNAc\alpha1-Ser/Thr
(Sasaki y col., J. Biol. Chem.
262:12059-12076, 1987; Seguchi y col., Arch.
Biochem. Biophys. 284:245-256, 1991), células
CHO DHFR-menos se transfectaron de forma estable con
ADNc que codifica para fucosiltransferasa III (FTIII)
(Kukowska-Latallo y col., 1990) con el ADNc que
codifica para el núcleo 2
\beta1-6.N-acetilglucosaminiltransferasa
(Bierhuizen y Fukuda, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:9326-933), 1992; Bierhuizen y col., J. Biol.
Chem. 269: 4473-4479, 1994) o con ambos ADNc.
Los ADNc se ligaron en los vectores de expresión pRc/RSV o pCDNA3
(Invitrogen). Tras la transfección con el procedimiento de
precipitación con fosfato de calcio, los clones transfectados de
forma estable se seleccionaron en medio que contenía G418. Los
clones que expresaron una o ambas glicosiltransferasas se
identificaron usado ensayos específicos de glicosiltransferasa
realizados sobre los lisados celulares. Las células que expresaron
FTIII también expresaron elevados niveles del antígeno de Lewis x
(NeuAc\alpha2-3Gal\beta1-4[Fuca1-3]GlcNAc\beta1-4-R)
en sus superficies, medidos con el anticuerpo monoclonal CSLEX1
(Fukushima y col. Cancer Res. 44:5279-5285,
1984).
El ADNc que codifica para la forma completa de
PSGL-1 (Moore y col. J. Cell Biol.
128:661-671, 1995) se insertó en el vector de
expresión pZeoSV (Invitrogen). Las células CHO que expresaban las
glicosiltransferasas se transfectaron con el ADNc de
PSGL-1 usando el reactivo Lipofectamina (Gibco BRL
Life Technologies). En análisis de expresión transitoria, se
analizaron las células mediante citometría de flujo 48h después de
la transfección. Los clones estables se seleccionaron en medio que
contenía G418 y Zeocina (Invitrogen). El análisis de los anticuerpos
unidos a las células mediante citometría de flujo se realizó como se
describe en Moore y col. (1995). El análisis de las células unidas a
P-selectina derivada de plaquetas mediante
citometría de flujo se realizó como se describe en Moore y Thompson,
Biochem. Biophys. Res. Common.186:173-181
(1992).
En estudios de expresión transitoria,
PSGL-1 se co-expresó en la mayoría
de las células transfectadas que expresaban FTIII,
\beta1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa
de núcleo 2, o ambas glicosiltransferasas. La
co-expresión se documentó mediante la fuerte unión
de los anticuerpos monoclonales
anti-PSGL-1 PL1 o PL2 (Moore y col.
1995) medida mediante citometría de flujo. Por el contrario, el
análisis citométrico indicó que la P-selectina se
unió solamente a células CHO que expresaban FTIII,
\beta1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa
de núcleo 2 y PSGL-1. P-selectina
no se unió a células CHO que expresaban una o ambas
glicosiltransferasas, en ausencia de PSGL-1.
P-selectina tampoco se unió a células CHO que
expresaban o FTIII, o
\beta1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa
de núcleo 2, incluso en presencia de PSGL-1. Por
tanto, solamente se expresó una forma funcional de
PSGL-1 capar de unirse a P-selectina
en células CHO que además expresaban FTIII y
\beta1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa
de núcleo 2.
Se seleccionaron también los clones de células
CHO que expresaron de forma estable FTIII y
\beta1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa
de núcleo 2. Estas células expresaron elevados niveles de
PSGL-1 detectados por la unión de PL1 y PL2 mediante
citometría de flujo. P-selectina también se unió
bien a estas células seleccionadas de forma estable. Así, la alta
afinidad de unión de P-selectina a células CHO
requirió la expresión simultánea en las células de FTIII.
\beta1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa
de núcleo 2 y PSGL-1. Para las células que
expresan PSGL-1 de forma transitoria o estable, la
unión de P-selectina fue específica, ya que se
bloqueó con un anticuerpo monoclonal inhibitorio para
P-selectina, G1, pero no con una anticuerpo
monoclonal no inhibitorio para P-selectina, S12
(Geng y col., Nature 343:757-760, 1990). La
unión fue además dependiente de Ca^{2+}, de acuerdo con los
requerimientos de Ca^{2+} de las selectinas para unirse a glúcidos
ligandos. P-selectina además se unió específicamente
a PSGL-1 sobre las células: PL1, pero no PL2,
bloqueó completamente la unión de P-selectina.
Además, el suero anti-42-56,
descrito anteriormente, pero no el suero control de conejo, bloqueó
la unión de P-selectina.
Estos datos indican que las células CHO pueden
diseñarse genéticamente para expresar una forma recombinante de
PSGL-1 que se una específicamente y con alta
afinidad a P-selectina como lo hace
PSGL-1 nativo de leucocitos humanos. La inhibición
de la unión de P-selectina por PL1 y por el suero
anti-42-56 indica que
P-selectina se une a la misma región en
PSGL-1 recombinante y en PSGL-1
nativo de leucocitos humanos. El requerimiento de la enzima de
núcleo 2 en las células CHO indica que un componente crítico del
sitio de reconocimiento en PSGL-1 está formado por
oligosacárido/s de núcleo 2 O-ligado/s con un
esqueleto
Gal\beta1-3(Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-6)GalNAc-Ser/Thr.
También se requiere la sialización y fucosilación de
PSGL-1 para la unión de alta afinidad a
P-selectina; estas modificaciones deben ocurrir en
los glicanos críticos de núcleo 2 O-ligados.
PSGL-1 tiene un domino
extracelular de 308 residuos. Los 18 residuos iniciales constituyen
un péptido señal. Los residuos 19-41 constituyen un
pro-péptido putativo que se predice que se escinde a
continuación de la síntesis, probablemente en
trans-Golgi. Por lo tanto, la región
N-terminal putativa de la proteína madura comienza
en el residuo 42. Las tres tirosinas dentro de la secuencia consenso
para la sulfatación de tirosina están en los residuos 46, 48 y 51,
cerca de la región N-terminal. Un antisuero
policlonal de conejo contra un residuo sintético que codifica para
los residuos 42-56 bloquea completamente la unión de
PSGL-1 a P-selectina, lo que sugiere
que, al menos en parte, el sitio de reconocimiento crítico para
P-selectina se halla en esta región. Todas las
referencias al número de residuo se refieren al Listado de Secuencia
ID nº 1.
Se han descrito previamente dos anticuerpos
monoclonales IgG contra PSGL-1, denominados PL1 y
PL2 en Moore y col. J. Cell Biol. 128:661-671
(1995)). PL1, pero no PL2, bloquea completamente la unión de
PSGL-1 a P-selectina, y suprime la
adhesión de los leucocitos a P-selectina bajo
condiciones estáticas y de arrastre. Para mapear las regiones de
PSGL-1 donde se localizan los epítopos para PL1 y
PL2, se expresaron en bacterias una serie de proteínas de fusión que
contienen regiones solapantes del dominio extracelular de
PSGL-1. Las secuencias de PSGL-1 en
las proteínas de fusión eran como se detalla a continuación:
Fragmento 1, residuos 18-78; Fragmento 2, residuos
63-123; Fragmento 3, residuos
109-168; Fragmento 4, residuos
154-200; Fragmento 5, residuos
188-258; y Fragmento 6, residuos
243-308. El ADN que codificaba para cada fragmento
se fusionó en el marco del ADN que codificaba para la dihidrofolato
reductasa y un marcador 6X His, en el vector de expresión
pQE-40 (Qiagen). Cada fragmento se expresó en
bacterias y se purificó en columnas de afinidad de níquel que unían
el marcador 6X His. La reactividad de cada proteína de fusión con
los anticuerpos se evaluó mediante Western Blotting bajo condiciones
reductoras.
PL1 se une fuertemente al Fragmento 1, pero no se
une a ninguno de los otros fragmentos. Esto indica que el epítopo de
PL1 está localizado dentro de los residuos 18-78.
Asumiendo que se elimina el pro-péptido de
PSGL-1 maduro nativo, el epítopo se localiza dentro
de los residuos 42-78. Ya que PL1 no se une al
Fragmento 2 (residuos 63-123), el epítopo se
localiza probablemente dentro de los residuos 42-70.
Por tanto, PL1 se une a un epítopo N-terminal que
está cerca de los epítopos para el suero policlonal
anti-42-56. Este resultado sugiere,
además, que un componente crítico para el reconocimiento de
P-selectina reside dentro de una pequeña región en
la región N-terminal de PSGL-1. Por
el contrario, el anticuerpo monoclonal no bloqueante PL2 se unió a
los Fragmentos 5 y 6 (pero no a otros fragmentos), lo que sugiere
que reconoce un epítopo dentro de los residuos
243-258, que está presente en ambos fragmentos.
Estos resultados demuestran que
P-selectina se une a una región específica en
PSGL-1 nativo y recombinante. Esta región reside
cerca de la región N-terminal de la molécula madura.
La unión de alta afinidad de PSGL-1 a
P-selectina requiere la sulfatación de tirosina y
oligosacáridos de núcleo 2 ramificados O-ligados
sializados y fucosilados. Los Fragmentos de PSGL-1,
o derivados de éstos, pueden construirse para que contengan el sitio
de unión para P-selectina. Tales fragmentos pueden
ser tan cortos como para que codifiquen para los residuos
42-58; este fragmento contiene las tres tirosinas
que son capaces de ser sulfatadas así como dos treoninas que pueden
ser los sitios de anclaje para oligosacáridos de núcleo 2
O-ligados. Fragmentos que se extiendan más allá del
residuo 42 deberían también unirse con alta afinidad a
P-selectina.
El [^{35}S]sulfato libre de vehículo
(100-1600 Ci/mmol) se obtuvo de Dupont/NEN
(Wilmington, DE). El soporte de resina de afinidad Emphaze® se
obtuvo de Pierce Biochemicals (Rockord, IL). La arilsulfatasa de
Aerobacter aerogenes, la neuraminidasa de Arthrobacter
ureafaciens y los monosacáridos sulfatados se obtuvieron de
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). La
péptido-N-glicosidasa F recombinante
se obtuvo de Boehringer Manheim (Indianapolis, IN). Todos los
reactivos de cultivo celular se obtuvieron de GIBCO/BRL (Grand
Island, NY). El patrón de tirosina sulfato real se sintetizó como se
describe (Huttner, (1984) Meth. Enzymol. 107,
200-224) usando H_{2}SO_{4} concentrado y
tirosina. Otros compuestos químicos de grado ACS o mejor, se
obtuvieron de Fisher Scientific.
PSGL-1 se purificó de neutrófilos
humanos y se marcó radiactivamente con Na^{125}I como se describe
en Moore y col., (1994). Las células HL-60
(1-2 x 10^{6} cél/ml) se marcaron durante 48 h con
100 \muCi/ml de [^{35}S]sulfato a 37ºC en medio
deficiente en sulfato (S-MEM) que contenía 10% de
suero bovino fetal dializado.
^{35}S-PSGL-1 se purificó usando
cromatografía de afinidad en una columna que contenía
P-selectina soluble recombinante (Ushiyama y col.
(1993) J. Biol. Chem. 268, 15229-15237)
acoplada a Emphaze® a una densidad de 5 mg/ml (Moore y col. (1994)).
La muestra enriquecida eluída con EDTA se volvió a cromatografiar en
la columna de P-selectina después de la diálisis en
tampón que contenía Ca^{2+}.
^{35}S-PSGL-1 purificado se trató
con tampón de muestra SDS reductor o no reductor y se sometió a
electroforesis en un gel de poliacrilamida 7,5% (Laemmli (1970)).
Los geles se secaron y se expusieron a una película de
rayos-x Fuji RX a -80ºC.
La sulfatación de tirosina de
PSGL-1 se determinó mediante hidrólisis básica de
^{35}S-PSGL-1. Tras la
identificación de ^{35}S-PSGL-1
por autorradiografía, el gel secado se alineó con la película de
rayos X expuesta y la banda del pocillo en condiciones no reductoras
se sometió a una fuerte hidrólisis básica en NaOH 1,0 M a 110ºC,
durante 24 h, como se describe (Hortin y col. J. Biol. Chem.
261, 15827-15830 (1986). El lisado de la hidrólisis
se pasó sobre una columna Dowex 50 (H+) lavada con agua, se
liofilizó y se analizó mediante cromatografía de intercambio
aniónico usando una columna Varian AX-5 (4 mm x 30
cm) que se eluyó con un gradiente de NaH_{2}PO_{4}, pH 3,0.
Todas las digestiones con arilsulfatasa se
realizaron con la arilsulfatasa de Aerobacter aerogenes (EC
3.1.6.1) (Fowler y Rammler (1964) Biochemistry 3,
230-237) en aproximadamente 500 \mul de
Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5, durante toda la noche a
37ºC. Tras la digestión, las reacciones enzimáticas se finalizaron
mediante hervido durante 15 min. Las digestiones control se
realizaron con 1000 mU de la enzima hervida. La
^{35}S-tirosina sulfato de
^{35}S-PSGL-1 se preparó mediante
hidrólisis básica como se describió anteriormente. Los lisados de la
hidrólisis básica se trataron con 50 mU o 1000 mU de arilsulfatasa
activa o con 1000 mU de arilsulfatasa hervida y luego se analizaron
mediante cromatografía de intercambio aniónico.
La especificidad de la arilsulfatasa de A.
aerogenes se determinó por los monosacáridos sulfatados
GlcNAc-6-sulfato,
Gal-6-sulfato,
GalNAc-6-sulfato y
GalNAc-4-sulfato. Cada uno de los
monosacáridos sulfatados (100 nmol) se trató por separado con 1000
mU de enzima activa o hervida. Después de incubarse toda la noche
las mezclas de reacción se hirvieron durante 15 min, se liofilizaron
y se resuspendieron en agua y analizaron mediante cromatografía de
intercambio aniónico a pH alto con una columna Dionex CarboPac
PA-1 y detección PAD como se describe (Shilatifard y
Cummings (1995) Glycobiology 5, 291-297.
^{35}S-PSGL-1 o
^{125}I-PSGL-1 intactos se
trataron con la arilsulfatasa de A. aerogenes como se
describió anteriormente. El [^{35}S]sulfato liberado de
^{35}S-PSGL-1 por la arilsulfatasa
se cuantificó por precipitación con BaSO_{4}, con 100 \mul de
Na_{2}SO_{3} saturado como vehículo (Shilatifard y col., (1993)
J. Virol. 67, 943-945). En la representación
gráfica de los datos, el sulfato liberado de la muestra con el
tratamiento control se ajustó haciendo la que la muestra con el
tratamiento control igual a 0%. El porcentaje real de radiactividad
liberada de las muestras con el tratamiento control osciló entre
1,3-5,0%.
En un experimento control,
^{125}I-PSGL-1 se trató con 1000
mU de la neuraminidasa de Arthrobacter ureafaciens en acetato
sódico 0,05 M, pH 5,0 toda la noche a 37ºC antes de aplicarse a una
columna de anticuerpo CLEX-1. La cromatografía en
CSLEX-1 se realizó como se describió previamente
(Moore y col. (1994).
^{35}S-PSGL-1
se trató con péptido-N-glicosidasa F
como se describe en Shifatifarl y col.
(1993).^{35}S-PSGL-1 se
desnaturalizó mediante hervido durante 5 minutos en 50 \mul de
fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, 2-mercaptoetanol 50
mM, SDS 0,5%. El SDS se diluyó luego a una concentración final 0,2%
con NP-40 1,5%, se añadieron 10 U de enzima al
^{35}S-PSGL-1 desnaturalizado y se
incubó toda la noche a 37ºC.
PSGL-1 tratado con arilsulfatasa
se aplicó a una columna de afinidad de P-selectina
en tampón que contenía Ca^{2+} y la radiactividad unida se eluyó
con EDTA. El porcentaje de
^{125}I-PSGL-1 eluído de la
columna con EDTA se corrigió igualando a 100% la muestra con el
tratamiento control (la re-unión real osciló entre
87-99%).
La inmunoprecipitación de
^{35}S-PSGL-1 se realizó como se
describe en Moore y col. (1994), usando un antisuero de conejo
(Moore y col., (1995), Moore y col., (1994)) contra un péptido que
corresponde a los residuos 42-56
(QATEYEYLDYD-FLPE) de PSGL-1 (Sako y
col., (1993)) (anti-42-56) o suero
normal de conejo (NRS). Los inmunoprecipitados se analizaron
mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras,
seguido de autorradiografía. El ensayo de unión a
P-selectina en fase sólida se realizó como se
describe en Moore y col., 1994). Brevemente, se incubó
^{125}I-PSGL-1 en presencia de NRS
o de antisuero dirigido contra los residuos 42-56 de
PSGL-1 (anti-42-56)
en placas de microvaloración que contenían
P-selectina recombinante soluble inmovilizada (50
\mul, 10 \mug/ml) o albúmina de suero humano (HSA) (50 \mul,
HSA 1%). La unión de P-selectina derivada de
plaquetas a células HL-60 se midió mediante
citometría de flujo como se describió, en presencia de NRS 20% o
suero anti-42-56 20%.
\newpage
Para determinar si PSGL-1 se
sulfata post-traduccionalmente, las células de
leucemia promielocítica humana HL-60 se marcaron
metabólicamente con [^{35}S]sulfato y se purificó
PSGL-1 de lisados de estas células por cromatografía
de afinidad en una columna de P-selectina. Se
detectó una proteína marcada con [^{35}S]sulfato que migró
en geles de SDS con un peso molecular relativo de 120.000 bajo
condiciones reductoras y de 240.000 bajo condiciones no
reductoras.
Estas movilidades son consistentes con la
estructura homodimérica unida por puentes disulfuro de
PSGL-1 (Moore y col., 1992). Además, la proteína
marcada con [^{35}S]sulfato se inmunoprecipitó con un
antisuero específico de conejo generado contra un péptido sintético
que codifica para los residuos 42-56 del dominio
extracelular de PSGL-1. El análisis de los
sobrenadantes mostró que anti-42-56
precipitó todo el ^{35}S-PSGL-1,
mientras que el suero normal de conejo (NRS) no precipitó nada de
^{35}S-PSGL-1. Estos resultados
demuestran que PSGL-1 se sulfata
post-traduccionalmente.
El sulfato puede incorporarse en glicoproteínas
eucarióticas como tirosina sulfato (Huttner y col. (1988) Mod. Cell
Biol. 6, 97-140) o como glúcidos sulfatados (Fiete y
col. 1991) Cell 65, 1103-1110; Kjellen y
Lindahl; (1991) Ann. Rev. Biochem. 60,
443-475). En estudios preliminares, no se detectaron
glúcidos sulfatados sobre PSGL-1, usando técnicas
que detectaban dichas estructuras sobre otras glicoproteínas
(Shilatifard y col. (1995, 1998)). La secuencia de
PSGL-1 predice cuatro residuos de tirosina
extracitoplasmáticos, tres de los cuales están agrupados en las
posiciones 46, 48 y 51 dentro de la secuencia consenso predicha para
la sulfatación de tirosina (Huttner y Baeuerle (1988)). Para
determinar si PGL-1 tiene tirosina sulfato, la
porción de gel que contenía el
^{35}S-PSGL-1 de 240 kDa se
hidrolizó con una base fuerte y se analizó mediante cromatografía de
intercambio aniónico. Se recogió un único pico radiactivo que
co-eluyó con tirosina sulfato pero no con los
patrones de azúcares sulfatados (Figura 1A).
La tirosina sulfato se ensayó entonces para
conocer su importancia en la unión de PSGL-1 a
P-selectina. Aunque las funciones de la tirosina
sulfato dentro de las proteínas no están claras, algunas proteínas
requieren esta modificación para una actividad óptima (Pittman y
col. (1992) Biochemistry 31, 3315-3325; Dong
y col. (1994) Biochemistry 33, 13946-13953).
El enfoque normal para evaluar la importancia de la tirosina sulfato
es prevenir la sulfatación de proteínas nuevamente sintetizadas con
inhibidores químicos o sustituir la tirosina con fenilalanina
mediante mutagénesis dirigida de sitio. Se probó un enfoque
alternativa en la que el sulfato se elimina enzimáticamente de la
tirosina sobre PSGL-1 intacto. Se determinó también
la capacidad de una arilsulfatasa de Aerobacter aerogenes
para liberar el sulfato de ^{35}S-tirosina. Con
tan solo 50 mU de esta arilsulfatasa liberó cuantitativamente
^{35}S-sulfato de
^{35}S-tirosina sulfato derivada de
PSGL-1 (Figuras 1B, 1C). Esta escisión fue
específica ya que, 1000 mU de la enzima no liberaron ningún sulfato
de Gal-6-sulfato,
GlcNAc-6-sulfato,
GalNAc-4-sulfato y
GalNAc-6-sulfato.
Se examinó la capacidad de la arilsulfatasa para
liberar sulfato de ^{35}S-PSGL-1.
El [^{35}S]sulfato liberado por la enzima se cuantificó
mediante precipitación como BaSO_{4} insoluble. Hasta el 50% del
[^{35}S]sulfato en PSGL-1 se liberó con 500
mU de arilsulfatasa; cantidades crecientes de la enzima no liberaron
más radiactividad (Figura 2).
La importancia funcional de la tirosina sulfato
en PSGL-1 se evaluó mediante el tratamiento de
^{125}I-PSGL-1 con arilsulfatasa y
se midió la re-unión del ligando tratado a una
columna de P-selectina. La unión de
^{125}I-PSGL-1 tratado con
arilsulfatasa a P-selectina se redujo de manera
dependiente de la dosis; la reducción de la unión fue inversamente
proporcional a la cantidad de sulfato liberado de
^{35}S-PSGL-1 (Figura 2). La unión
reducida de PSGL-1 a P-selectina
tras el tratamiento con arilsulfatasa no se debió a una liberación
general del ácido siálico y/o fucosa procedentes de exoglicosidasas
contaminantes, ya que PSGL-1 tratado con 1000 mU de
arilsulfatasa se unió cuantitativamente a cualquier columna de
afinidad que contenía CSLEX-1, un anticuerpo
monoclonal contra sLe^{x}.
La arilsulfatasa liberó aproximadamente 50% de
[^{35}S]sulfato de PSGL-1 y redujo la
re-unión de
^{125}I-PSGL-1 a
P-selectina en el mismo grado. Se consideró la
posibilidad de que la fracción de
^{35}S-PSGL-1 que se volvía a unir
a P-selectina después del tratamiento con
arilsulfatasa retuviese residuos de tirosina sulfato críticos,
mientras que la fracción que no se volvía a unir a
P-selectina había perdido las tirosina sulfato.
^{35}S-PSGL-1 se trató con 1000 mU
de arilsulfatasa y se aplicó a continuación a una columna de
P-selectina. Las fracciones unida y sin unir se
analizaron mediante SDS-PAGE. Se observó una banda
que correspondía a ^{35}S-PSGL-1
en las fracciones unidas, mientras que no ésta no se vio en las
fracciones no unidas. La radiactividad de las fracciones no unidas
representó el sulfato libre. Cuando se hidrolizó la banda de
^{35}S-PSGL-1 en las fracciones
unidas, se recogió la radiactividad en la tirosina sulfato. En el
experimento control,
^{125}I-PSGL-1 se trató con 1000
mU de arilsulfatasa y se aplicó posteriormente a la columna de
P-selectina. El análisis por
SDS-PAGE reveló que se había recogido el
^{125}I-PSGL-1 intacto en ambas
fracciones, unida y sin unir. Por tanto, la arilsulfatasa eliminó el
sulfato cuantitativamente de un subgrupo de PSGL-1,
que no se volvió a unir a la columna de P-selectina,
pero, de ninguna manera, la enzima degradó
PSGL-1.
La tirosina sulfato que queda en el subgrupo de
PSGL-1 unido a P-selectina puede ser
resistente a arilsulfatasa debido a su inaccesibilidad o a alguna
otra característica de PSGL-1 que bloquea la acción
de la enzima. Cuando
\hbox{ ^{35} S-PSGL-1} se
desglicosiló parcialmente mediante tratamiento con
péptido-N-glicosidasa F y
neuraminidasa de Arthrobacter ureafaciens, el tratamiento
posterior con arilsulfatasa liberó hasta el 70% de la radiactividad
como [^{35}S]sulfato. Como la neuraminidasa elimina también
la unión de PSGL-1 a P-selectina, no
podría determinarse si el aumento de la eliminación de
[^{35}S]sulfato redujo más la unión de
PSGL-1 a P-selectina. Estos
resultados sugieren que la glicosilación extensiva de
PSGL-1 puede ser causada por la inaccesibilidad a la
arilsulfatasa de algunos sitios tirosina sulfato.
Para demostrar mejor la importancia de la
sulfatación de tirosina para la función de PSGL-1,
se usó el antisuero del péptido que codifica para los residuos
42-56 del dominio extracelular de
PSGL-1. Como se mencionó anteriormente, esta región
contiene los tres sitios potenciales de glicosilación en los
residuos 46, 48 y 51. El antisuero inhibió la unión de
^{125}I-PSGL-1 a
P-selectina inmovilizada (Figura 3A) y además
suprimió la unión de P-selectina a células
HL-60, medida por citometría de flujo (Figura 3B).
Por lo tanto, el antisuero contra los péptidos 42-56
se une a PSGL-1 nativo y bloquea de forma efectiva
su reconocimiento por P-selectina.
Estos resultados demuestran que
PSGL-1 contiene una tirosina sulfato que se requiere
para la unión de alta afinidad a P-selectina. Se ha
mostrado previamente que PSGL-1 contiene el
determinante sLe^{x} en oligosacáridos O-ligados y
ambos, ácido siálico y fucosa, se requieren para la unión de
PSGL-1 a P-selectina. La tirosina
sulfato puede ser importante porque promueve la presentación
apropiada de los glicanos que se unen directamente a
P-selectina. Alternativamente, la tirosina sulfato
puede interaccionar directamente con P-selectina.
Esta última posibilidad parece más probable, ya que se sabe que los
oligosacáridos sulfátidos y sulfatados se unen a
P-selectina. El sulfato también es un determinante
crítico para la unión de GlyCAM-1 a
L-selectina, pero GlyCAM-1 contiene
sulfato en Gal-6-sulfato y
GlcNAc-6 más que sobre los monosacáridos.
Los resultados sugieren un modelo en el que
PSGL-1 presenta glúcidos y tirosina sulfato como
componentes de un sitio de reconocimiento crítico para
P-selectina. Se hipotetiza que este sitio se
localiza en la región N-terminal, distal de
membrana, de PSGL-1, cerca de los tres residuos
potencialmente sulfatados de tirosina. De acuerdo con esta
hipótesis, PL1, un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo
distal de membrana sobre PSGL-1, bloquea la unión de
P-selectina en fase fluida a los leucocitos y
suprime la adhesión de neutrófilos a P-selectina
bajo condiciones estáticas y de arrastre. Por el contrario, PL2, un
anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo de membrana proximal
sobre PSGL-1, no inhibe la unión a
P-selectina. El concepto de que
P-selectina reconoce un sitio localizado sobre una
glicoproteína de tipo mucina es distinto de un modelo en el que una
selectina reconoce múltiples glicanos, agrupados,
O-ligados, anclados a lo largo de todo el
polipéptido (Lasky y col., (1992) Cell 69,
927-938; Baumheuter y col. (1993) Science
262, 436-438).
Se determinaron las estructuras de los
O-glicanos sobre PSGL-1 sintetizadas
por las células HL-60 marcadas radiactivamente de
forma metabólica con precursores de azúcares ^{3}H. La
glicosilación de PSGL-1 se comparó con la de CD43
para determinar si las dos sialomucinas expresadas por las mismas
células estaban O-glicosiladas de forma diferente.
La línea celular HL-60 se usó en estos estudios
debido a que las modificaciones post-traducionales
que se sabe que son importantes para la unión de P- y
E-selectina son comparables en
PSGL-1 de HL-60 y de
neutrófilos.
Los estudios demuestran que la mayoría de
O-glicanos de PSGL-1 están
desializados o son formas neutras del tetrasacárido de
núcleo-2. Sólo unos pocos O-glicanos
se fucosilan y estos contienen los determinantes estructurales para
el antígeno sLe^{x}. Estos resultados demuestran que
PSGL-1 está glicosilado de forma diferente a CD43 y
que PSGL-1 contiene O-glicanos
únicos que probablemente son críticos para interacciones de alta
afinidad con P- y E-selectina.
Las abreviaturas usadas son: sLe^{x}, sialil
Lewis x; NDV, virus de la enfermedad de Newcastle; CHO, ovario de
hámster chino; GlcN, glucosamina; GalN, galactosamina; GalNOH,
galactosaminitol; GalNAcOH,
N-acetilgalactosaminitol; FT, fucosiltransferasa;
C2GnT, \beta1,6 N-acetilglucosaminiltransferasa de
núcleo 2; HPAEC, cromatografía de intercambio aniónico a pH
alto.
Materiales- Proteína A-Sefarosa,
QAE-Sephadex, neuraminidasa de Arthrobacter
ureafaciens, \beta-acetilhexosaminidasa de
Canavalia ensiformis ("jack bean") y
Gal\beta1\rightarrow3GalNAc se obtuvieron de Sigma. La pronasa y
la tripsina tratada con TPCK se obtuvieron de Worthington
Biochemicals. La
endo-\beta-galactosidasa de
Escherichia freundii se obtuvo de V-labs. La
\alpha1,3/4-fucosidasa de Streptomyces sp.
142 se obtuvo de Takara. La neuraminidasa del virus de la enfermedad
de Newcastle se obtuvo de Oxford Glycosystems. El hidrocloruro de
D-[6-^{3}H]glucosamina
(20-45 Ci/mmol), la
D-[2-^{3}H]manosa (20-30
Ci/mmol) y la L-[6-^{3}H]fucosa
(70-90 Ci/mmol) se obtuvieron de Dupont/NEN y el
NaB[^{3}H]_{4} (40-60 Ci/mmol) se
obtuvo de ARC. El suero de conejo anti-ratón IgG1 se
obtuvo de Zymed. El soporte de resina de afinidad Emphaze^{TM} se
obtuvo de Pierce Biochemicals. Las resinas Bio-Gel
P-4 y P-10 y los marcadores de peso
molecular se obtuvieron de Bio-Rad. Todos los
reactivos de cultivos se obtuvieron de GIBCO/BRL. Otros compuestos
químicos fueron de grado ACS o mejor y se obtuvieron de Fisher
Scientific.
El marcaje metabólico con radiactividad de
^{3}H-GlcN, ^{3}H-Man y
^{3}H-Fuc de células HL-60 se
realizó esencialmente como describieron Moore y col. (1992) J.
Cell. Biol. 118, 445-456; Wilkins y col. (1995)
J. Biol. Chem. 270, 22677.22680.
^{3}H-PSGL-1 se purificó a partir
de extractos celulares usando cromatografía de afinidad en una
columna de P-selectina inmovilizada, soluble y
recombinante (Ushiyama y col. (1993) J. Biol. Chem. 268,
15229-12237) acoplada a Emphaze^{TM} a una
densidad de 5mg/ml (volumen del lecho 1,0 ml) (Moore y col. (1994)
J. Biol. Chem. 269, 23318-23327). Las
muestras enriquecidas eluídas con EDTA se volvieron a cromatografiar
en la columna de P-selectina después de la diálisis
en un tampón que contenía Ca^{2+}.
^{3}H-PSGL-1 purificado se trató
con tampón de muestra SDS reductor o no reductor (Laemmli, G.B.
(1970) Nature 227. 680-685) ý se sometió a
electroforesis en un gel de poliacrilamida al 7,5%. Los geles se
secaron y luego se autorradiografiaron mediante exposición a una
película de rayos x Fuji RX a -80ºC. Se analizó
^{3}H-PSGL-1 de aproximadamente
250 kDa en las porciones de gel de los carriles no reductores.
CD43 se inmunoprecipitó de células
HC-60 marcadas con ^{3}H-azúcares
usando un anticuerpo monoclonal específico de CD43, H5H5 (IgG1). La
línea celular de hibridoma H5H5 la produjo el Dr. T. August y se
obtuvo del Banco de desarrollo de hibridomas (The Johns Hopkins
University School of Medicine). CD43 se inmunoprecipitó cargando
inicialmente 50 \mul de bolitas de Proteína
A-Sefarosa con 100 \mug de anticuerpo de conejo
anti-IgG1 de ratón a 37ºC durante 1 h. Después del
lavado, se adsorbió a las bolitas un anticuerpo específico de CD43
mediante la adición de 500 \mul de medio de cultivo H5H5 sin
diluir a 37ºC durante 1 h. Después del lavado, las bolitas
pre-cargadas se añadieron al extracto celular de
HC-60 marcadas con ^{3}H-azúcares
y se incubaron a 4ºC toda la noche. Las bolitas se lavaron 5 veces
con solución equilibrada de Hanks, se hirvieron durante 5 min en
tampón de muestra SDS no reductor y se analizaron en un gel de
SDS-poliacrilamida 10%. El CD43 purificado en las
porciones de gel se identificado mediante autorradiografía se
escindió y se analizó.
Las porciones de gel que contenían
PSGL-1 y CD43 marcadas radiactivamente se trataron
directamente con una base suave/borhídrico como se describe [Lyer y
col. (1971) Arch. Biochem. Biophys. 142,
101-105; Cummings y col. (1983) J. Biol.
Biochem. 258, 15261-15273]. Se eliminaron las
sales de los glicanos liberados marcados radiactivamente mediante
cromatografía en una columna Dowex 50 (tipo H^{+}) y se analizaron
mejor los glicanos. La cromatografía se realizó en
Bio-Gel P-4 (malla media) en una
columna de 1 x 90 cm y en Bio-Gel P10 (malla media)
en una columna de 1 x 48 cm en tampón piridil/acetato 0,1 M, pH 5,5
y se recogieron fracciones de 1 ml. El carácter aniónico y la
sialización de los glicanos se evaluó parcialmente por cromatografía
en columna de QAE-Sefadex, con elución en etapas en
Tris-base 2 mM que contenía NaCl 20, 70, 140, 200 y
250 mM.
El O-glicano de
núcleo-1 simple Gal\beta1\rightarrow3GalNAc se
marcó radiactivamente mediante reducción en presencia de
NaB[^{3}H]_{4} para formar
Gal\beta1\rightarrow3GalNAcOH[^{3}H] [Li y col. (1978)
J. Biol. Chem. 253, 7762-777]. Se preparó un
grupo de glicanos patrones marcados con ^{3}H-GlcN
a partir de las glicoproteínas totales de células
HL-60 marcadas con ^{3}H-GlcN
siguiendo los procedimientos descritos anteriormente [Carlsson y
col. (1986) J. Biol. Chem. 261, 12787-12795].
Los patrones incluyeron el hexasacárido de núcleo-2
desializado
NeuAc\alpha2\rightarrow3Gal\beta1\rightarrow4GlcNac\beta1\rightarrow6(NeuAc\alpha2\rightarrow3Gal\beta1\rightarrow3)GalNacOH,
el tetrasacárido neutro de núcleo-2
Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow6(3Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH
y el trisacárido
GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH.
Para preparar estos patrones, los extractos celulares marcados con
^{3}H-GlcN se dializaron frente a NaHCO_{3} 0,01
M, pH 7,5 y se trataron con tripsina tratada con TPCK 100 \mug/ml
toda la noche a 37ºC. El digerido tríptico seco se trató con una
base suave/borhídrico para producir
\beta-eliminación y los O-glicanos
liberados se fraccionaron por tamaño en una columna de
Bio-Gel P-4. Las fracciones
mezcladas que correspondían a los picos de radiactividad se
analizaron por distribución de carga mediante una cromatografía en
columna de QAE-Sefadex. La estructura de cada
glicano se confirmó entonces mediante sensibilidad a la
neuraminidasa de Arthrobacter,
\beta-galactosidasa y
\beta-acetilhexosaminidasa, determinada por
cromatografía de descenso en papel como se describió
anteriormente.
El pentasacárido de núcleo-2
fucosilado patrón
Gal\beta1\rightarrow4(Fuc\alpha1\rightarrow3)GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH
se preparó incubando el
^{3}H-GlcN-tetrasacárido
Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH
con GDP-Fuc (100 \muM) sin marcar en presencia de
50 \mug de extracto de células COS7 transfectadas de forma estable
con el gen humano FTIV. Este \alpha1,3FT añade Fuc en una unión
\alpha1,3 a residuos de GlcNAc en aceptores que contienen
secuencias terminales de
N-acetil-lactosamina [Goelz y col.
(1990) Cell 63, 1349-1358; Lowe y col. (1991)
J. Biol. Chem. 266, 21777-21783; Kumar y col.
(1991) J. Biol. Chem. 266,21777-21783]. El
producto de la reacción migró como un pentasacárido, como se
esperaba, y se convirtió en el tetrasacárido correspondiente
mediante tratamiento con \alpha1,3/4-fucosidasa de
Streptomyces.
Para definir el cociente Man:Fuc y proporcionar
patrones N-glicanos con mucha manosa, se prepararon
glicoproteínas marcadas radiactivamente a partir de extractos
celulares de HL-60 marcadas con [^{3}H]Man.
Para la preparación de glicopéptidos, se precipitaron los extractos
celulares con TCA y se trataron con Pronasa como se describe en
Cummings y col. (1983) J. Biol. Chem. 258,
15261-15273. A partir de estos glicopéptidos, se
prepararon los patrones de N-glicanos con mucha
manosa (Man_{9}GlcNAc_{1}, Man_{8}GlcNAc_{1},
Man_{7}GlcNAc_{1}, Man_{8}GlcNAc_{1},
Man_{5}GlcNAc_{1}) siguiendo el tratamiento con
endo-\beta-N-acetilglucosaminidasa
H [Cummings, R.D., (1993) Glycobiology: A Practical Approach
(M. Fukuda y A. Kobata eds.) pág. 243-286, IRL Press
en Oxford University Press, Oxford].
En el hexasacárido disializado
NeuAc\alpha2\rightarrow3Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow6(NeuAc\alpha2\rightarrow3Gal\beta1\rightarrow3)GalN
AcOH marcado con [^{3}H]GlcN, preparado a partir de células
HL-60, los residuos NeuAc, GlcNAc y GalNAcOH se
marcaron radiactivamente [Varki, A. (1994) Meth. Enzymol.
230, 16-32]. Durante el equilibrio del marcaje
radiactivo los cocientes molares relativos para estos residuos
deberían estar próximos a la unidad. Para determinar el cociente
molar relativo de GlcNAc y de los residuos de GlcNAc, este
^{3}H-GlcN-hexasacárido se
desializó para generar un
^{3}H-GlcN-tetrasacárido; este
tetrasacárido se hidrolizó en un ácido fuerte y la radiactividad
liberada se identificó mediante HPAEC como se describió
anteriormente. Se recuperó toda la radiactividad en
^{3}H-GlcN y ^{3}H-GalNOH en el
cociente ^{3}H-GlcN:^{3}H-GalNOH
1,0:0,8. Este cociente se usó como factor de corrección para
calcular los cocientes molares relativos de los glicanos aislados,
es decir, la radiactividad recuperada en
^{3}H-GalN(OH) en una muestra tras la
hidrólisis se dividía por 0,8. El cociente molar relativo coincide
con otros estudios sobre HL-60 marcadas
radiactivamente de forma metabólica con el precursor
^{3}H-GlcN [Maemura, K. y Fukuda, M. (1992) J.
Biol. Chem. 267, 24379-24386]. Para determinar
el cociente molar relativo para los residuos NeuAc y GlcNAc, el
^{3}H-GlcN-hexasacárido se
desializó con neuraminidasa y se detectó la radiactividad liberada
en NeuAc. La radiactividad recuperada en GlcN y NeuAc tenía un
cociente de 1,0:1,4 respectivamente. Debido a que la radiactividad
de NeuAc derivaba de dos residuos del hexasacárido disializado, éste
dio un valor final de cociente molar relativo para GlcN:NeuAc de
1,0:0,7.
Los cocientes de GlcN:GalN y Man:Fuc en
PSGL-1 y CD43 se determinaron tras hidrólisis en
ácido fuerte de las porciones de gel escindidas que contenían
PSGL-1 y CD43 purificados. Las porciones del gel se
trataron con 250 \mul de ácido trifluoroacético 2N (TFA) a 121ºC
durante 2h. Los monosacáridos liberados marcados radiactivamente en
el lisado de la hidrólisis se identificaron mediante cromatografía
de intercambio aniónico por pH (HPAEC) en una columna CarboPac
PA-1 (4 x 250 mm) en un sistema Dionex y elución con
NaOH 16 mM durante 30 min. Se recogieron las fracciones (0,3 min) y
se determinó la radiactividad mediante recuento de centelleo. Los
monosacáridos marcados radiactivamente se identificaron por sus
tiempos de retención comparándose con los de los monosacáridos
patrón. El cociente molar relativo para GlcN:GalN en los glicanos se
calculó dividiendo la radiactividad del pico GlcN por la
radiactividad del pico GalN y corrigiendo las diferencias de
actividad específica de ^{3}H-GlcN frente a
^{3}H-GalN. El cociente Man:Fuc en
^{3}H-Man-glicanos se determinó
también tras hidrólisis ácida como se describió anteriormente,
usando un cociente Man:Fuc 1,0:1,0 que se observa típicamente tras
el equilibrio de marcaje radiactivo de células con
[2-^{3}H]Man.
Los tratamientos enzimáticos de glicanos con
\beta-N-acetilhexosaminidasa,
\beta-galactosidasa, neuraminidasa de
Arthrobacter, \alpha1,3/4-fucosidasa de
Streptomyces y
endo-\beta-galactosidasa de
Escherichia freundii se realizaron como se describe en
Cummings y col. (1989) Methods in Cell Biol. 32,
142-180; Srivatsan y col. (1992) J. Biol.
Chem. 267, 20196-20203. La digestión con la
neuraminidasa de NDV se realizó en 20 \mul de fosfato 10 mM, pH
7,0 con 20 mU de enzima durante 24 h a 37ºC, seguida de la adición
de otras 20 mU de enzima y una incubación más de 24 h. Los
O-glicanos se analizaron y se purificaron mediante
cromatografía de descenso en papel de filtro Whatman durante los
tiempos mencionados usando el sistema disolvente ácido
piridina/acetato de etilo/agua/ácido acético (5:5:1:3), como se
describe en Cummings, R.D. (1993) Glycobiology: Los glicanos
se defucosilaron químicamente mediante tratamiento con TFA 0,1 N a
100ºC durante 1h como se describe en Spooner y col. (1984) J.
Biol. Chem. 259, 4792-4801.
PSGL-1 y CD43 se purificaron a
partir de células HL-60 marcadas metabólicamente con
^{3}H-GlcN. PSGL-1 se purificó de
a partir de extractos celulares de HL-60 marcados
con ^{3}H-GlcN mediante cromatografía de afinidad
sobre P-selectina inmovilizada, seguida de
re-cromatografía de la fracción unida eluída con
EDTA. Casi todo (90-99%) el material marcado
radiactivamente purificado 2 veces se unió a
P-selectina. Este procedimiento en dos etapas fue
necesario para eliminar una glicoproteína contaminante de
aproximadamente 250 KDa en condiciones no reductoras y de
aproximadamente 120 KDa en condiciones reductoras. El
PSGL-1 purificado se resolvió mediante
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras
en poliacrilamida 7,5% y luego se analizó mediante
autorradiografía.
CD-43 de extractos celulares
HL-60 marcados con ^{3}H-GlcN se
inmunoprecipitó con una anticuerpo monoclonal específico frente a
CD43 más una anticuerpo secundario de conejo
anti-IgG1 de ratón o con un anticuerpo secundario
solo. Los inmunoprecipitados se sometieron a electroforesis bajo
condiciones no reductoras en un gel de acrilamida 10% y luego se
analizó mediante autorradiagrafía. Se observó una banda única de 120
KDa para CD43 en condiciones reductoras y no reductoras.
En la evaluación inicial de la glicosilación de
PSGL-1 y CD43 se determinó el cociente de GlcN:GalN
en las glicoproteínas purificadas. ^{3}H-GlcN se
metaboliza en las células animales en GlcNAc marcada
radiactivamente. GalNAc y ácidos siálicos. Las porciones de gel que
contenían las
^{3}H-GlcN-glicoproteínas se
trataron con un ácido fuerte (lo que produjo la destrucción de los
ácidos siálicos) y Glc y GalN marcadas radiactivamente, se
identificaron mediante HPAEC en Dionex. El cociente GlcN:GalN se
determinó que era aproximadamente 2:1 para PSGL-1 y
aproximadamente 1:1 para CD43. El cociente GlcN:GalN de
aproximadamente 1:1 para CD43 coincide con las evidencias publicadas
de que la mayoría de los glicanos en CD43 tienen el motivo de
núcleo-2 simple
Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH.
Estos resultados demuestran que los glicanos de
PSGL-1 contienen gran cantidad de GlcNAc en relación
con la GalNAc de los glicanos de CD43.
La presencia del determinante sLe^{x} en
PSGL-1 ha llevado a especular que
PSGL-1 podría estar muy fucosilado. Se evaluó la
cantidad de Fuc en PSGL-1 y CD43 aislado de células
HL-60 marcadas radiactivamente de forma metabólica
con [2-^{3}H]Man. Las células metabolizan
este precursor marcado a
2-^{3}H-Fuc y la actividad
específica relativa de Man y Fuc tras el equilibrio del marcaje es
equivalente.^{3}H-Man-PSGL-1
y -CD43 se aislaron mediante SDS-PAGE y se
autorradiografiaron. Las correspondientes bandas se sometieron a
hidrólisis con ácido fuerte y los monosacáridos liberados se
separaron mediante HPAEC en un sistema Dionex. El cociente Man:Fuc
se determinó que fue 3:5 para PSGL-1 y 3:2 para
CD43. El cociente Man:Fuc se determinó además para las
glicoproteínas totales sin purificar de las células
HL-60 como control, y se halló que fue 3:1. Las
cantidades relativas de ^{3}H-Man y
^{3}H-Fuc en PSGL-1, CD43 y las
glicoproteínas totales de HL-60 se determinaron tras
la hidrólisis ácida de
^{3}H-Man-PSGL-1,
^{3}H-Man-CD43 y glicoproteínas
totales de HL-60 marcadas con
^{3}H-Man. Los lisados de la hidrólisis ácida se
analizaron mediante HPAEC usando una columna
Carbo-Pac PA-1 eluída con NaOH 16
mM. Se determinó la radiactividad total en cada pico sombreado.
PSGL-1 contiene más residuos de Fuc que CD43 y más
residuos de Fuc que la media de las glicoproteínas de las células
HL-60.
Usando esta información es posible estimar el
número de residuos de Fuc en PSGL-1. La secuencia de
ADNc de PSGL-1 predice que tiene tres sitios de
N-glicosilación potencial. PSGL-1
contiene solamente N-glicanos complejos, cada uno de
los cuales, debería tener 3 residuos de Man. Por tanto, 3
N-glicanos complejos en PSGL-1
representan 9 residuos de Man por mol, y de forma correspondiente,
hay aproximadamente 15 residuos de Fuc por mol de
PSGL-1. Por el contrario, CD43 contiene solamente un
glicano N-ligado simple y tiene mucha menos Fuc en
comparación con PSGL-1. Teniendo en cuenta todo
esto, el análisis de la composición de
^{3}H-Man-glicoproteínas demuestra
que PSGL-1 está glicosilado de forma diferente que
CD43.
Los O-glicanos de
PSGL-1 y CD43 se liberaron directamente mediante
tratamiento de las porciones de gel que contenían las glicoproteínas
purificadas con base suave/borhídrico para producir
\beta-eliminación y se fraccionaron en una columna
de Bio-Gel P-4. Los
^{3}H-GlcN-glicanos liberados de
PSGL-1 y CD43 se recogieron en tres fracciones que
representaban 47%, 41% y 11% del total de la radiactividad,
respectivamente. Comparado con CD43, PSGL-1 contiene
una gran proporción de glicanos relativamente grandes.
Las muestras de
P-4-I de PSGL-1 y
CD43 se purificaron además mediante cromatografía en una columna
Bio-Gel P-10. La radiactividad en la
fracción P-4-I de
PSGL-1 se separó en dos picos principales en
Bio-Gel P-10 designados
P-10-1 y
P-10-2. Esta población de glicanos
es de mayor tamaño que el hexasacárido de núcleo-2
disializado patrón
NeuAc\alpha2\rightarrow3Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow6(NeuAc\alpha2\rightarrow3Gal\beta1\rightarrow3)GalN
AcOH. El material principal en la fracción
P-4-II de PSGL-1
eluyó en Bio-Gel P-10 en una
posición ligeramente menor (designado
P-10-3) que el hexasacárido
disializado de núcleo-2 patrón. Por el contrario, la
mayoría del material en las fracciones
P-4-I y
P-4-II de CD43 eluyó en
Bio-Gel P-10 de forma idéntica al
hexasacárido disializado de núcleo-2 patrón.
Los glicanos de CD43 recogidos en
P-4-I se analizaron usando
tratamientos con exoglicosidasa y cromatografía de intercambio
aniónico. Los glicanos mostraron ser el hexasacárido disializado de
núcleo-2 que se esperaba. Una pequeña fracción de la
muestra P-4-I de CD43 se recogió en
glicanos de gran tamaño en Bio-Gel
P-10 de acuerdo con estudios previos que mostraron
que una pequeña fracción de los O-glicanos de CD43
tienen una estructura extendida de polilactosamina en el motivo de
núcleo-2. Ya que estas estructuras se han descrito,
no se analizarán más.
Los O-glicanos liberados de
residuos de Ser/Thr mediante \beta-eliminación
deberían contener ^{3}H-GalNAcOH en la región
terminal reductora, que se recupera como
^{3}H-GalNOH tras la hidrólisis con un ácido
fuerte. Para identificar qué glicanos en la mezcla de
PSGL-1 representan a los
O-glicanos, el contenido en GalNOH, GalN y GlcN de
cada glicano se determinó mediante Bio-Gel
P-10 por HPAEC en un sistema Dionex seguido de
hidrólisis con ácido fuerte de las fracciones del
^{3}H-GlcN-PSGL-1
P-10-1,
P-10-2 y
P-10-3. Los lisados de la hidrólisis
se analizaron mediante HPAEC usando una columna
Carbo-Pac PA-1 eluída con NaOH 16
mM. Se determinó la radiactividad total en cada pico. Más del 95% de
GalN(OH) total en las fracciones de PSGL-1
P-10-2 y
P-10-3 se recogió como GalNOH, lo
que demostraba que la \beta-eliminación fue
eficiente y que los O-glicanos de
PSGL-1 están representados en estas fracciones. Los
glicanos en P-10-1 carecía de GalNOH
y no representan O-glicanos liberados mediante
\beta-eliminación. En su lugar, la fracción
P-10-1 contiene
N-glicanos anclados aún al péptido. Esto se confirmó
por la presencia de ^{3}H-Man en estos glicanos
recogida de
^{3}H-Man-PSGL-1.
La pequeña cantidad de GalN recogida en las muestras
P-10-1 podría surgir de los residuos
GalNAc presentes en N-glicanos o podría ser producto
de una pequeña cantidad residual de O-glicanos aún
unidos al péptido y no liberados durante los procedimientos de
\beta-eliminación.
Los patrones de sialización de los
O-glicanos en P-10-2
y P-10-3 y de los
N-glicanos en P-10-1
se determinaron mediante cromatografía de intercambio aniónicoen
QAE-Sefadex, antes y después del tratamiento con
neuraminidasa. En este sistema, los glicanos con 1 carga negativa (1
ácido siálico) eluyen con NaCl 10 mM, aquellos con 2 cargas
negativas (2 ácidos siálicos) eluyen con NaCl 70 mM, y aquellos con
3 cargas negativas (3 ácidos siálicos) eluyen con NaCl 140 mM [24,
25]. Las fracciones de
^{3}H-GlcN-PSGL-1
P-10-1,
P-10-2 y
P-10-3 se aplicaron a las columnas
de QAE-Sefadex y las columnas se eluyeron con las
concentraciones indicadas de NaCl (mM) antes o después del
tratamiento con la neuraminidasa del virus de la enfermedad de
Newcastle (NVD). Los glicanos en la fracción
P-10-1 se cargaron de forma
heterogénea, de acuerdo con lo que sucedió en los
N-glicanos en los glicopéptidos de esta fracción.
Después del tratamiento con NDV neuraminidasa, la radiactividad
eluyó con NaCl 20 mM se analizó mediante cromatografía de descenso
en papel durante 20 h. El NeuAc auténtico migró 25 cm. Los glicanos
P-10-2 eran especies mono- y
disializadas y los glicanos P-10-3
eran una mezcla de especies neutras y monosializadas.
Para determinar si el carácter aniónico de los
glicanos se debía al ácido siálico y para definir el enlace del
ácido siálico, partes de los O-glicanos marcados con
^{3}H-GlcN se trataron con neuraminidasa del virus
de la enfermedad de Newcastle (NDV). Esta enzima exhibe una alta
especificidad por los residuos de ácido siálico unidos en
\alpha2,3 y no escindirá eficientemente el ácido siálico en otros
enlaces [Paulson y col. (1982) J. Biol. Chem. 257,
12734-12738]. Tras el tratamiento con
NDV-neuraminidasa, los glicanos en
P-10-1 estaban menos cargados, de
acuerdo con una pérdida de ácido siálico. Sin embargo, la presencia
de glicanos cargados de manera residual es indicativa del perfil
esperado para los N-glicanos en glicopéptidos. Por
el contrario, los glicanos en P-10-2
y P-10-3 se convirtieron en neutros
tras el tratamiento con NDV-neuraminidasa,
demostrando que todos los ácidos siálicos de estos glicanos estaban
unidos en \alpha2,3. El pico del material que eluye con NaCl 20 mM
tras el tratamiento con NDV-neuraminidasa se recogió
de forma cuantitativa como ^{3}H-NeuAc libre,
como se muestra por su co-elución con el patrón
NeuAc en la cromatografía de descenso en papel. Se había establecido
previamente que el ácido siálico en PSGL-1 de
células HL-60 marcadas con
^{3}H-GlcN es Neu5Ac. Estos resultados demuestran
que los O-glicanos en
P-10-2 son especies mono- y
disializadas y que los O-glicanos en
P-10-3 son una combinación de
especies neutras y sializadas, con el ácido siálico unido en
\alpha2,3 a los glicanos. Además, estos resultados demuestran que
los O-glicanos de PSGL-1 no están
sulfatados, debido a las especies neutras que se producen tras el
tratamiento con NDV-neuraminidasa.
Los glicanos en
P-10-2 se purificaron más usando una
cromatografía preparativa de descenso en papel y se recogieron dos
especies principales. Un pico contenía glicanos de gran tamaño que
migraron lentamente desde el origen (designado
P-10-2a). Se observó también un
pequeño pico de material de migración más rápida (24 cm
aproximadamente), que representó algunos glicanos residuales
derivados del pico P-4-II. Sobre la
cromatografía de intercambio aniónico en
QAE-Sefadex, el material
P-10-2a eluyó como especies
monosializadas, mientras que el material
P-10-2b eluyó como especies
disializadas.
Los glicanos disializados, de pequeño tamaño, en
P-10-2b se desializaron mediante
tratamiento con NDV-neuraminidasa y el ácido siálico
liberado se eliminó mediante cromatografía en
QAE-Sefadex. Los glicanos desializados se analizaron
mediante cromatografía de descenso en papel antes y después de los
tratamientos secuenciales con exoglicosidasa (Figuras
4A-E). Tras el tratamiento con neuraminidasa, los
glicanos desializados P-10-2b se
fraccionaron en dos especies (Figura 4A). Un pico menor (10%
aproximadamente) co-migró con el pentasacárido
fucosilado patrón
Gal\beta1\rightarrow4(Fuc\beta1\rightarrow3)GlcNAc\beta1\rightarrow6
(Gal\beta1\rightarrow3) GalNAcOH y se designó
P-10-2b_{1}. Un pico principal
(90% aproximadamente) de material co-migró con el
tetrasacárido de núcleo-2 patrón
Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH
y se designó P-10-2b_{2}.
Los glicanos desializados
P-10-2b se trataron con
\beta-N-acetilhexosaminidasa. Este
tratamiento no alteró la migración de ninguna de las especies de la
muestra, indicando que los glicanos carecen de residuos GlcNAc
terminales. Sin embargo, cuando la mezcla
P-10-2b se trató con
\beta-galactosidasa, no se afectaron los glicanos
P-10-2b_{1}, mientras que los
glicanos P-10-2b_{2} se degradaron
y co-migraron con el trisacárido patrón
GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH
(Figura 4B). La estructura Gal\beta1\rightarrow3GalNAcOH es
resistente a la \beta-galactosidasa de
Canavalia ensiformis, ya que esta enzima no escinde
eficientemente los residuos galactosil terminales con unión
\beta1,3 [Li y col. (1975) J. Biol. Chem. 250,
6786-6791]. Esto se confirmó en estudios control, en
los que no se producía escisión del disacárido patrón
Gal\beta1\rightarrow3GalNAcOH con las concentraciones de la
\beta-galactosidasa de Canavalia ensiformis
usada en estos análisis. Debido a que los glicanos
P-10-2_{b} derivan de especies
disializadas, estos resultados demuestran que los glicanos
P-10-2b_{2} derivan del
hexasacárido de núcleo-2
NeuAc\alpha2\rightarrow3Gal\beta1\rightarrow4GlcNac\beta1\rightarrow6(NeuAc\alpha2\rightarrow3Gal\beta1\rightarrow3)GalN
acOH.
Cuando los glicanos disializados
^{3}H-GlcN-P-10-2b
se trataron con la \alpha1,3/4-fucosidasa de
Streptomyces, los glicanos
P-10-2b_{1} se perdieron y todos
los glicanos recogidos co-migraron con el
tetrasacárido de núcleo-2 patrón
Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH
(Figura 4C). El tratamiento combinado de los glicanos desializados
P-10-2b con la
\alpha1,3/4-fucosidasa de Streptomyces,
\beta-N-acetilhexosaminidasa y
\beta-galactosidasa produjo una degradación
completa de los glicanos
P-10-2b_{1} y
P-10-2b_{2} a
^{3}H-GlcNAc libre y
^{3}H-disacárido Gal\beta1\rightarrow3GalNAcOH
(Figura 4D). Estos resultados demuestran que los glicanos
P-10-2b_{1} tienen la estructura
de pentasacárido fucosilada
Gal\beta1\rightarrow4(Fuc\alpha1\rightarrow3)GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH.
Debido a que los glicanos P-10-2b
originales son especies disializadas, los glicanos
P-10-2b_{1} contienen el antígeno
sLe^{x}
NeuAc\alpha2\rightarrow3Gal\beta1\rightarrow4[Fuc\alpha1\rightarrow3]GlcNAc\beta1\rightarrowR
y tienen la estructura de heptasacárido
NeuAc\alpha2\rightarrow3Gal\beta1\rightarrow4[Fuc\alpha1\rightarrow3]GlcNAc\beta1\rightarrow6(NeuAc\alpha2\rightarrow3Ga
l\beta1\rightarrow3)GalNAcOH (Figura 7).
Para confirmar más aún la presencia de fucosa en
estos glicanos y facilitar la identificación de Fuc en otros
glicanos, las células HL-60 se marcaron
radiactivamente de forma metabólica con
[^{3}H-Fuc]. Los O-glicanos
marcados con ^{3}H-Fuc se recogieron mediante
\beta-eliminación como se describió para los
^{3}H-glicanos, después de los mismos
procedimientos descritos anteriormente. El
^{3}H-Fuc recogido en la fracción desializada de
P-10-2b co-migró con
los glicanos desializados
^{3}H-GlcN-P-10-2b_{1}
(Figura 4E). En conjunto, estos resultados demuestran que los
glicanos P-10-2b_{1} de
PSGL-1 están fucosilados y contienen la estructura
sLe^{x}.
Debido a su gran tamaño relativo, se consideró la
posibilidad de que los glicanos
P-10-2a contengan polilactosamina
[3Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1-]_{n}. Para evaluar esta
posibilidad, los glicanos P-10-2a se
desializaron y el ácido siálico se eliminó mediante cromatografía en
QAE-Sefadex. Los glicanos neutros resultantes se
trataron con
endo-\beta-galactosidasa, una
enzima que escinde los residuos galactosil \beta1\rightarrow4
internos dentro de una polilactosamina de tipo 2 [Kobata y Takasaki
(1993) Glycobiology: A Practical Approach (M. Fukuca y A.
Kobata, eds),pág. 165-185, IRL Press en Oxford
University Press, Oxford]. Los glicanos fueron resistentes a este
tratamiento (Figura 5A). Se consideró entonces la posibilidad de que
los glicanos P-10-2a podrían
contener un esqueleto de polilactosamina en el que todos los
residuos internos de GlcNAc están fucosilados. Tales estructuras de
polilactosamina polifucosiladas son resistentes a la
endo-\beta-galactosidasa [Fukuda
y col. (1984) J. Biol. Chem. 259,
10925-10935]. Es necesaria la defucosilación
completa antes de que la
endo-\beta-galactosidasa pueda
digerir las cadenas.
Los glicanos desializados
P-10-2a se defucosilaron
químicamente y se trataron luego con
endo-\beta-galactosidasa. Tras la
defucosilación, la enzima digirió cuantitativamente los glicanos
P-10-2a para liberar los tres
compuestos principales en un cociente aproximado equimolar
identificado como el trisacárido
Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow3Gal, el
trisacárido de núcleo-2 residual
GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH
y el disacárido GlcNAc\beta1\rightarrow3Gal (Figura 5B). Se
predice la generación de tales productos a partir de la acción
específica de
endo-\beta-galactosidasa para un
glicano con esqueleto de estructura:
donde las flechas indican los sitios específicos
de escisión para
endo-\beta-galactosidasa de un
glicano que contiene polilactosamina defucosilada [Kobata y Takasaki
(1993) Glycobiology]. La longitud de la cadena de
polilactosamina puede deducirse de la radiactividad recuperada en el
disacárido GlcNAc\beta1\rightarrow3Gal en relación con los demás
fragmentos. La recuperación del trisacárido
GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH
tras el tratamiento con
endo-\beta-galactosidasa demuestra
que la polilactosamina se extiende desde la GlcNAc con unión
\beta1-6 al residuo GalNAcOH. La recuperación del
Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow3Gal demuestra
que los residuos de Gal están presentes en la región terminal no
reductora de la polilactosamina. Como se esperaba, el tratamiento de
los glicanos P-10-2a desializados y
defucosilados con una combinación de
\beta-galactosidasa y
\beta-N-acetilhexosaminidasa
produjo una digestión completa a ^{3}H-GlcNAc
libre y ^{3}H-disacárido
Gal\beta1\rightarrow3GalNAcOH (Figura
4B).
La resistencia de los glicanos
P-10-2a desializados a
endo-\beta-galactosidasa previa a
la defucosilación está de acuerdo con la posibilidad de que cada
residuo GlcNAc dentro del glicano contiene un residuo fucosil con
unión \alpha1,3 en la estructura
Gal\beta1\rightarrow4(Fuc\alpha1\rightarrow3)GlcNAc\beta1\rightarrow3Gal\beta1\rightarrow4(Fuc\alpha1\rightarrow3)GlcNAc
\beta1\rightarrow3Gal\beta1\rightarrow4(Fuc\alpha1\rightarrow3)GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH.
Los O-glicanos que contienen polilactosaminas
fucosiladas de forma incompleta son sensibles a
endo-\beta-galactosidasa.
Para confirmar el patrón de glicosilación
predicho por los glicanos P-10-2a,
los glicanos
^{3}H-Fuc-P-10-2a
se preparó a partir de
^{3}H-Fuc-PSGL-1.
Tras el tratamiento con neuraminidasa, los
^{3}H-Fuc-glicanos desializados
co-migraron con los glicanos desializados
^{3}H-Fuc-P-10-2a.
Cuando los glicanos desializados
^{3}H-Fuc-P-10-2a
se trataron con la \alpha1,3/4-fucosidasa de
Streptomyces, se liberó aproximadamente un tercio de la Fuc
radiactiva. Este resultado se predice basándose en la estructura de
glicano postulada y a la especificidad de la
\alpha1,3/4-fucosidasa de Streptomyces, que
puede eliminar Fuc sólo de los penúltimos residuos GlcNAc dentro de
un glicano polifucosilado [Maemura y Fukuda (1992) J. Biol.
Chem. 267, 24379-24386; Sano y col. (1992) J.
Biol. Chem. 267, 1522-1527]. En conjunto, estos
datos demuestran que los glicanos
P-10-2a contienen tres residuos de
Fuc, uno de los cuales está en la unidad lactosaminil terminal.
Los glicanos
P-10-2a están monosializados y
podrían tener una o dos estructuras posibles (a o b) se muestran a
continuación:
Para distinguir entre estas posibilidades, los
glicanos desializados
^{3}H-GlcN-P-10-2a
se trataron con una mezcla de \beta-galactosidasa,
\beta-N-acetilhexosaminidasa y
\alpha1,3/4-fucosidasa de Streptomyces con
o sin neuraminidasa. Se predijo que la estructura (a) requeriría
neuraminidasa además de las otras enzimas para la digestión
completa, mientras que la estructura (b) se degradaría por las
exoglicosidasas en ausencia de neuraminidasa. El tratamiento de
^{3}H-GlcN-P-10-2a
sólo con neuraminidasa, liberó NeuAc marcado radiactivamente. Cuando
los glicanos se trataron con una mezcla de
\beta-galactosidasa,
\beta-N-acetilhexosaminidasa y
\alpha1,3/4-fucosidasa de Streptomyces, en
ausencia de neuraminidasa, no se liberó radiactividad. La inclusión
de neuraminidasa con otras exoglicosidasas produjo la degradación
completa de los glicanos a ^{3}H-NeuAc libre,
^{3}H-GlcNAc libre y el
^{3}H-disacárido
Gal\beta1\rightarrow3GalNAcOH. En conjunto, estos resultados
demuestran que el único residuo de ácido siálico en los glicanos
P-10-2a está presente en una
posición terminal en la cadena de polilactosamina, mostrada en la
estructura (a) y que estos glicanos tienen la estructura sLe^{x}
(Figura 7).
Los glicanos
P-10-3 eran principalmente especies
neutras o monosializadas. Las especies predominantes (80% de la
radiactividad, aproximadamente) eran no-sializadas.
La fracción P-10-3 se trató con
neuraminidasa y el ácido siálico liberado se eliminó mediante
cromatografía en QAE-Sefadex. Aproximadamente 90% de
las especies desializadas co-migraron con el
tetrasacárido de núcleo-2 patrón
Gal\beta1\rightarrow4GlcNAc\beta1\rightarrow6(Gal\beta1\rightarrow3)GalNAcOH
y el resto co-migró con el disacárido de
núcleo-1 Gal\beta1\rightarrow3GalNAcOH (Figura
6). El tratamiento de los glicanos desializados
P-10-3 con
\beta-galactosidasa produjo un cambio en la
migración del pico principal frente a la esperada del trisacárido
patrón (Figura 6). El tratamiento con una combinación de
\beta-galactosidasa y
\beta-N-acetilhexosaminidasa
generó ^{3}H-GlcNAc libre y
^{3}H-Gal\beta1\rightarrowGalNAcOH (Figura 6).
Aproximadamente, 20% de los glicanos
P-10-3 marcados radiactivamente se
hallaron en especies predominantemente monosializadas que se
convertían en especies neutras mediante tratamiento con
neuraminidasa. Estos resultados demuestran que los glicanos
P-10-3 son principalmente
tetrasacáridos neutros de núcleo-2 y algunos
pentasacáridos sializados de núcleo-2 (Figura 7).
Además, algunos de los glicanos neutros tienen la estructura de
disacárido de núcleo-2 (Figura 7).
Los porcentajes relativos de
O-glicanos en PSGL-1 pueden
calcularse a partir de la cantidad de radiactividad recogida en
cada O-glicano y a partir del cociente molar
relativo para
^{3}H-GlcN:^{3}H-GalNAcOH:^{3}H-NeuAc
de 1,0:0,8:0,7 (Figura 7). La mayoría de O-glicanos
en PSGL-1 contienen la estructura de
núcleo-2. Una minoría de glicanos, recogidos en
P-10-2b_{1} y
P-10-2a, contienen el determinante
sLe^{x}.
Este estudio demuestra que PSGL-1
de células humanas HL-60 contiene
O-glicanos con un motivo de
núcleo-2. La mayoría de los glicanos no están
fucosilados y son mezclas de especies neutras y sializadas. La
minoría de los O-glicanos (14%, aproximadamente)
están fucosilados y contienen la estructura terminal sLe^{x}.
Están presentes dos tipos de O-glicanos fucosilados:
un tipo es un heptasacárido disializado que carece de
polilactosamina y el otro es un glicano único monosializado,
tri-fucosilado que contiene polilactosamina. La
presencia de O-glicanos de núcleo-2
en PSGL-1 de células HL-60 está de
acuerdo con resultados de estudios sobre la glicosilación de
PSGL-1 de neutrófilos humanos.
PSGL-1 desializado de neutrófilos humanos y de
células HL-60 es resistente al tratamiento con
endo-\alpha-N-acetilgalactosaminidasa
(O-glicanasa), que escinde solamente los glicanos de
núcleo-1 desializados. La demostración directa de
determinantes sLe^{x} y la polilactosamina en
O-glicanos de PSGL-1 derivado de
células HL-60 refuerza la evidencia indirecta de que
estas estructuras están presentes en O-glicanos de
PSGL-1 derivado de neutrófilos.
Se observaron diferencias significativas entre
los O-glicanos en PSGL-1 y CD43 de
células HL-60. Aunque ambas proteínas tienen
principalmente glicanos de núcleo-2,
PSGL-1 tiene muchos tetrasacáridos neutros de
núcleo-2, mientras que CD43 tiene sobre todo
hexasacáridos disializados de núcleo-2. La
estructura de núcleo-2 es un precursor para la
síntesis de polilactosamina en O-glicanos, pero
solamente PSGL-1 tiene cantidades significativas de
polilactosamina. Esto indica que la estructura de
núcleo-2 es necesaria pero no suficiente para la
adición de polilactosamina. Además, CD43 carece de las dos especies
de O-glicanos fucosilados halladas en
PSGL-1. Aunque se identificó un
O-glicano monofucosilado en CD43, estas especies
representan sólo el 0,5% de los O-glicanos en CD43.
El O-glicano monosializado, trifucosilado
identificado en PSGL-1 no se halló en CD43.
Como se discutió anteriormente,
P-selectina puede unirse débilmente a una variedad
de glicanos sulfatados y estos glicanos inhiben la unión de
P-selectina a células mieloides humanas. Sin
embargo, los O-glicanos de PSGL-1 no
están sulfatados. En su lugar, PSGL-1 contiene
tirosina sulfato que se requiere para las interacciones con
P-selectina, pero no con
E-selectina. En la región amino terminal de
PSGL-1 aparecen tres sitios de consenso para la
sulfatación de tirosina en los residuos 46, 48 y 51. PL1, un
anticuerpo monoclonal contra PSGL-1, bloquea la
unión a P-selectina y reconoce un epítopo que se
extiende entre los residuos 49-62 que solapa con los
sitios de sulfatación de tirosina. Cerca de los sitios de
sulfatación de tirosina hay dos residuos Thr que representan sitios
de O-glicosilación potencial en los residuos 44 y
57. Las mutaciones en estos residuos reducen la unión de
PSGL-1 a P-selectina cuando
PSGL-1 se co-expresa en células COS
con FTIII o con FTVII. Estos resultados sugieren que solamente uno
de los dos O-glicanos en conjunción con los residuos
de tirosina sulfato pueden ser suficientes para promover la unió de
alta afinidad de PSGL-1 a
P-selectina. Sin embargo, O-glicanos
de otras regiones de la molécula pueden contribuir también a las
interacciones con P- y E-selectina.
Se sugirió originalmente que las glicoproteínas
de tipo mucina actúan como andamiajes sobre los cuales pueden
agruparse muchos O-glicanos para el reconocimiento
de las selectinas. Sin embargo, estos datos, en conjunción con otros
estudios, indican que las glicoproteínas de tipo mucina se
glicosilan de forma diferente.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Comisión de Reactivos de la Universidad de Oklahoma
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Péptido y O-glicanos inhibidores de la inflamación mediada por selectina
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Patrea L- Pabst
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2800 One Atlantic Center, 1201 West Peachtree Street
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Atlanta
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Georgia
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 30306-3450
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMATO DE LECTURA INFORMÁTICO:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Versión # 1.25
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE CUMPLIMENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- PROCURADOR/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Pabst, Patrea L.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE LISTADO: 31.284
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE MINUTA: OMRF110CIP7
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (404)873-8794
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (404)873-8795
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 402 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2042 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2102 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCCCTCTAG ACCACCATGA TTGCTTCACA GTTT
\hfill34
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCCGGTCGA CTTAGGGAGC TTCACAGGT
\hfill29
Claims (56)
1. Un O-glicano purificado
seleccionado del grupo formado por un glicano disializado,
monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar, o una aglicona, y
en el que R2 es H, OH, un azúcar, o una
aglicona.
2. Un O-glicano purificado según
la reivindicación 1, en el que R2 es OH.
3. Un O-glicano purificado según
la reivindicación 1, en el que R2 es una aglicona.
4. Un O-glicano purificado según
una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que R1 es una aglicona.
5. Una composición que comprende el
O-glicano de una cualquiera de las reivindicaciones
1-4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para
la administración a un paciente que los necesite.
6. Un procedimiento para inhibir la unión de
PSGL-1 a P-selectina in
vitro que comprende la administración de una cantidad efectiva
de un O-glicano suficiente para inhibir dicha unión,
en el que el O-glicano se selecciona de un grupo
formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tienen un esqueleto de
polilactosamina.
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en
el que R2 es OH.
8. Un procedimiento según la reivindicación 6, en
el que R2 es una aglicona.
9. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6-8, en el que R1 es una
aglicona.
10. Una composición farmacéutica para uso en
terapia, en la que la composición comprende un
O-glicano y un vehículo farmacéuticamente aceptable,
en el que el O-glicano se selecciona del grupo
formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
11. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 10, en la que R2 es OH.
12. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 10, en la que R2 es una aglicona.
13. Una composición farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en la que
R1 es una aglicona.
14. Una composición farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en la que
la terapia comprende la inhibición de la unión de
PSGL-1 a P-selectina.
15. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 10-13, en la que la terapia
comprende la modulación de la adherencia leucocitaria.
16. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 10-13, en la que la terapia
comprende la modulación de la inflamación.
17. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 10-13, en la que la terapia
comprende la modulación de la metástasis tumoral.
18. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 10-13, en la que la terapia
comprende la reducción o modulación de la coagulación, infarto o
enfermedad vascular.
19. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 10-13, en la que la composición
comprende una cantidad efectiva del O-glicano.
20. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para inhibir la unión de
PSGL-1 a P-selectina, en el que el
O-glicano se selecciona de un grupo formado por un
glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
21. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para modular la adherencia leucocitaria, en el
que el O-glicano se selecciona de un grupo formado
por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
22. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para modular la metástasis tumoral, en el que
el O-glicano se selecciona de un grupo formado por
un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
23. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para inhibir la adhesión leucocitaria, en el
que el O-glicano se selecciona de un grupo formado
por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
24. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para bloquear la adhesión celular, en el que
el O-glicano se selecciona de un grupo formado por
un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
25. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para inhibir la inflamación, en el que el
O-glicano se selecciona de un grupo formado por un
glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
26. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para inhibir la inflamación mediada por
leucocitos, en el que el O-glicano se selecciona de
un grupo formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
27. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir la adherencia leucocitaria en el
miocardio isquémico, en el que el O-glicano se
selecciona de un grupo formado por un glicano disializado,
monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
28. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular el daño de reperfusión,
en el que el O-glicano se selecciona de un grupo
formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
29. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para modular el daño a los órganos mediado por
la adherencia de los leucocitos a las superficies vasculares, en el
que el O-glicano se selecciona de un grupo formado
por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
30. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular el infarto, en el que
el O-glicano se selecciona de un grupo formado por
un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
31. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular la enfermedad vascular,
en el que el O-glicano se selecciona de un grupo
formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
32. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular la enfermedad vascular
mesentérica o periférica, en el que el O-glicano se
selecciona de un grupo formado por un glicano disializado,
monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
33. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular la adherencia de los
leucocitos en un sistema vascular, en el que el
O-glicano se selecciona de un grupo formado por un
glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
34. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular la agregación de las
plaquetas en un sistema vascular, en el que el
O-glicano se selecciona de un grupo formado por un
glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
35. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para fabricar una medicina para reducir o
modular el daño a los órganos, en el que el
O-glicano se selecciona de un grupo formado por un
glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
36. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular el daño a los órganos
dependiente de leucocitos, en el que el O-glicano se
selecciona de un grupo formado por un glicano disializado,
monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
37. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular la sepsis bacteriana,
en el que el O-glicano se selecciona de un grupo
formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
38. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modularla coagulación
diseminada intravascular, en el que el O-glicano se
selecciona de un grupo formado por un glicano disializado,
monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
39. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular el síndrome de dolor
respiratorio agudo del adulto, en el que el
O-glicano se selecciona de un grupo formado por un
glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
40. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular la adherencia o
agregación de leucocitos en la circulación pulmonar, en el que el
O-glicano se selecciona de un grupo formado por un
glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
41. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular la pérdida vascular
generalizada, en el que el O-glicano se selecciona
de un grupo formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
42. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular la metástasis de
células tumorales de una malignidad, en el que el
O-glicano se selecciona de un grupo formado por un
glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
43. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular la aterosclerosis, en
el que el O-glicano se selecciona de un grupo
formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
44. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para el tratamiento de la artritis reumatoide,
en el que el O-glicano se selecciona de un grupo
formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
45. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para el tratamiento de una alteración
autoinmune, en el que el O-glicano se selecciona de
un grupo formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
46. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para el tratamiento de una alteración
inflamatoria, en el que el O-glicano se selecciona
de un grupo formado por un glicano disializado, monofucosilado y un
glicano monosializado, trifucosilado que tiene un esqueleto de
polilactosamina según la reivindicación 1.
47. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para prevenir la extensión del infarto de
miocardio, en el que el O-glicano se selecciona de
un grupo formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
48. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para el tratamiento del síndrome de dolor
respiratorio agudo del adulto, en el que el
O-glicano se selecciona de un grupo formado por un
glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
49. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para el tratamiento del shock, en el
que el O-glicano se selecciona de un grupo formado
por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
50. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para el tratamiento de la presión sanguínea
baja, en el que el O-glicano se selecciona de un
grupo formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
51. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para el tratamiento de una alteración
trombótica, en el que el O-glicano se selecciona de
un grupo formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
52. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para modular la coagulación, en el que el
O-glicano se selecciona de un grupo formado por un
glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
53. Uso de un O-glicano para
fabricar una medicina para reducir o modular el shock
circulatorio, en el que el O-glicano se selecciona
de un grupo formado por un glicano disializado, monofucosilado:
y un glicano monosializado, trifucosilado que
tiene un esqueleto de
polilactosamina:
en el que R1 es H, un azúcar o una aglicona, y en
el que R2 es H, OH, un azúcar o una
aglicona.
54. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 20-53, en el que R2 es OH.
55. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 20-53, en el que R2 es una
aglicona.
56. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 20-55, en el que R1 es una
aglicona.
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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