JP2002530425A - 炎症を処置する際のコア２ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼインヒビターの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、炎症を処置するための化合物および方法を提供する。本発明の化合物は、好中球のような炎症細胞の内皮細胞および他の骨髄性細胞へのコア２オリゴサッカリド媒介性結合を調節する。重要なことには、本発明の方法は、リンパ球輸送に影響することを伴わずに、炎症をブロックする。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コア２オリゴサッカリドの合成に関与するコア２ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの活性を阻害する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、炎症の処置の分野に関する。リンパ球輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎ
ｇ）に有意に影響することなく、炎症応答を調節するための化合物および方法が
提供される。

【０００２】 （背景） 哺乳動物はしばしば、炎症応答を誘導することにより、細胞損傷、感染、また
は組織における急な変化に対して応答する。代表的には、炎症応答は、損傷の部
位で炎症細胞（例えば、好中球、好酸球および好塩基球のような骨髄性細胞）を
誘引し、かつ引き止める分子を産生する内皮細胞によって開始される。次いで、
炎症細胞は、内皮障壁を通して周囲組織内に輸送される。生じる炎症細胞（特に
、好中球）の蓄積は、毒性酸素粒子の生成、および局所的な組織分解および炎症
に寄与する好中性顆粒（これは、酸性加水分解酵素および分解性酵素（例えば、
プロテアーゼ、エラスターゼ、およびコラーゲナーゼ）を含む）の放出が後に続
く。好中球はまた、炎症を増幅する化学誘引物質および補体活性化因子を放出し
得る。

【０００３】 炎症応答は、傷害性因子を破壊、希釈、および隔離すること、ならびに罹患し
た組織の修復を刺激することにより治癒プロセスにおいて役割を果たし得るが、
炎症応答はまた有害であり得、そして実際に生命を脅かし得る。５つの症状が、
しばしば、炎症応答を特徴付ける：疼痛、発赤、発熱、腫脹、および機能の喪失
。例えば、炎症は、血管からの血漿の漏出を生じる。この漏出は有益な効果を有
し得るが、これは、疼痛を引き起こし、そして制御されない場合には、機能の喪
失および死亡（例えば、成人呼吸促進症候群）へと導き得る。アナフィラキシー
ショック、関節炎、および痛風は、制御されない炎症または不適切な炎症によっ
て特徴付けられる状態のうちの１つである。

【０００４】 炎症応答は、炎症応答が非特異的であるという点で、Ｔリンパ球およびＢリン
パ球によって媒介される免疫応答とは異なる。抗体およびＭＨＣに媒介される免
疫応答は、特定の病原体または他の因子に特異的であるが、炎症応答は、特定の
因子の同定に関与しない。しかし、炎症応答および特異的免疫応答の両方は、血
管から組織損傷または感染の部位への、個々の細胞型の管外遊出に関与する。さ
らに、リンパ球の管外遊出を媒介するレセプターのいくつかはまた、炎症細胞の
管外遊出に関与する。特に、正常な環境下でのリンパ節へのリンパ球輸送は、サ
イトカイン誘導に応答して血管内皮の細胞により発現されるセレクチンによって
媒介される。セレクチンはまた、炎症の間の、血管内皮への好中球の補充に関与
する（Ｋａｎｓａｓ（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８８：３２５９−８７；ＭｃＥｖ
ｅｒおよびＣｕｍｍｉｎｇｓ（１９９７）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０
０：４８５−９１に概説される）。３つの型のセレクチンが、白血球と血管内皮
との間の相互作用に関与する。Ｅ−セレクチン（内皮−白血球接着分子−１（Ｅ
ＬＡＭ−１）とも呼ばれる）およびＰ−セレクチンは、活性化内皮において発現
される。Ｐ−セレクチンはまた、活性化血小板に存在するが、Ｌ−セレクチンは
、リンパ球において見出される。セレクチンの欠損は、種々の程度のリンパ球輸
送欠陥、炎症部位への好中球補充の低減、および白血球代謝回転の減少を生じる
（Ａｒｂｏｎｅｓら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：２４７−２６０；Ｊｏ
ｈｎｓｏｎら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８６：１１０６−１４；Ｌａｂｏｗら（
１９９５）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７０９−７２０；Ｍａｙａｄａｓら（１９
９３）、Ｃｅｌｌ ７４：５４１−５５４）。

【０００５】 セレクチンに対する白血球の結合は、細胞の表面に提示されるオリゴサッカリ
ドリガンドによって少なくとも部分的に媒介される。オリゴサッカリドリガンド
は、一般的に、糖タンパク質および糖脂質に付着される。生理的に関連するセレ
クチンリガンドを保有するオリゴサッカリドの型は、現在、ほとんど不確定であ
り、種々の可能性が、Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカン、糖脂質、ならびにプロテオ
グリカンの間で存在する（Ｖａｒｋｉ（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ
．９９：１５８−１６２に概説される）。

【０００６】 Ｐ−セレクチンに対する主要なリガンドは、「Ｐ−セレクチン糖タンパク質リ
ガンド−１」（ＰＳＧＬ−１；Ｌｉら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７１：３２５５−３２６４；Ｎｏｒｇａｒｄら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６８：１２７６４−１２７７４）として公知のタンパク質であると報告
されている。ＰＳＧＬ−１は、２つの１２０ｋＤａサブユニットのジスルフィド
結合したダイマーである、膜ムチンである。ＰＳＧＬ−１の各サブユニットは、
約７０個の細胞外セリンおよびスレオニン残基（これは、Ｏ−グリコシル化につ
いての潜在的部位およびＮ−グリコシル化についての３つの潜在的部位である）
を含む（Ｎｏｒｇａｒｄら、前出）。ＰＳＧＬ−１の部位特異的変異誘発は、セ
レクチンに対するＰＳＧＬ−１の接着における、チロシンおよびスレオニン残基
の役割を支持し、従って、Ｏ結合型グリカンが関与することを示唆する（Ｌｉら
（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３２５５−３２６４）。

【０００７】 セリン／スレオニン（Ｏ）結合型オリゴサッカリドは、細胞表面および分泌タ
ンパク質において主要な種々の構造である。例えば、二次リンパ系器官の高内皮
性小静脈（ＨＥＶ）における硫酸化シアリル化（ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）Ｏ結合
型オリゴサッカリドは、Ｌ−セレクチンに対するリガンドである。これらのリガ
ンドはまた、以下を含む種々のセレクチン対抗レセプターに存在する：ＣＤ３４
（Ｂａｕｍｈｕｅｔｅｒら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：４３６−４３
８）、ＧｌｙＣＡＭ−１（Ｌａｓｋｙら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：
４３６−４３８）、ＭＡｄＣＡＭ−１（Ｂｅｒｇら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ
３６６：６９５−６９８）、Ｓｇｐ２００（ＲｏｓｅｎおよびＢｅｒｔｏｚｚｉ
（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：６６３−６７３）
、およびポドカリキシン（ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ）様タンパク質（Ｓａｓｓｅ
ｔｔｉら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１９６５−１９７５）。Ｏ
−グリコシル化が必須であると思われない、他の報告されたセレクチン対抗レセ
プターとしては、以下が挙げられる：Ｅ−セレクチンリガンド−１（ＥＳＬ−１
）（Ｓｔｅｅｇｍａｉｅｒら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６１５−６２
０）、ＣＤ２４（Ａｉｇｎｅｒら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１
５５７−１５６５）、ならびにヘパリンプロテオグリカン（Ｎｏｒｇａｒｄ−Ｓ
ｕｍｎｉｃｈｔら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：４８０−４８３）。さ
らに、糖脂質は、インビトロで機能するセレクチンリガンドを含む（Ａｌｏｎら
（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５３５６−５３６６）；Ｌａｒｋｉ
ｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３６６１−８）；Ｓｔｒ
ｏｕｄら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：７５８−６９）。

【０００８】 大半の組織でのＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性の広範な発現は、なぜ哺乳動物Ｏ−
グリカンの大部分がコア２サブタイプのものであるかを説明し得る（図１）（Ｂ
ｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ（１９９５）「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏ−ｇ
ｌｙｃａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−
α−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ ｌｉｎｋａｇｅ ｔｙｐｅ」、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ、Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌら編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２１０
〜２５９頁；ＳｃｈａｃｈｔｅｒおよびＢｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ（１９８９）Ｓ
ｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．４３：１−２６）。コア２オリゴサッカリ
ドはムチンの共通の成分であり、ムチンは、質量の大部分がＯ結合型オリゴサッ
カリドに起因する糖タンパク質である。ムチンは、細胞表面に防御的機能を提供
し、そして細胞−細胞相互作用を調節することにより、気道上皮、胃腸管、およ
び免疫系に必須であると考えられる（Ｈｏｕｎｓｅｌｌら（１９９６）、Ｇｌｙ
ｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１３：１９−２６；ＳｔｒｏｕｓおよびＤｅｋｋ
ｅｒ（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７
：５７−９２に概説される）。

【０００９】 コア２ Ｏ−グリカンは二分岐であり、そしてＮ−アセチルグルコサミン（Ｇ
ｌｃＮＡｃ）およびガラクトース（Ｇａｌ）モノサッカリドをβ１−３およびβ
１−４結合で付加し、それによりポリラクトサミンと呼ばれるラクトサミン二糖
類反復物を生成するグリコシルトランスフェラーゼにより多様化され得る。これ
らはさらに、末端位置で連結されたシアル酸（Ｓｉａ）およびＬ−フコース（Ｆ
ｕｃ）で改変され得る。コア２ Ｏ−グリカン生合成に対するこのような改変は
、白血球接着分子のセレクチンファミリーについてのオリゴサッカリドリガンド
を提供し得る（図１）（Ｌａｓｋｙ（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．６４：１１３−１３９；Ｌｏｗｅ（１９９７）Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５
１：１４１８−１４２６；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．５７：８２７−７２に概説される）。炎症におけるリンパ球ホー
ミングおよび好中球補充の両方は、α１−３フコシルトランスフェラーゼＶＩＩ
（ＦｕｃＴ−ＶＩＩ）酵素を必要とし（Ｍａｌｙら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６
：６４３−６５３）、従ってフコシル化オリゴサッカリドがセレクチン接着に関
与することを示唆する。ＦｕｃＴ−ＶＩＩ酵素は、Ｎ結合型グリカンおよびＯ結
合型グリカン、ならびに糖脂質において作用し得る。

【００１０】 哺乳動物Ｏ結合型オリゴサッカリド（Ｏ−グリカン）の合成においてＯ−グリ
カンの構造的多様性を制御する、重要な分枝酵素は、コア２ β１−６Ｎ−アセ
チルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ）である（Ｂｉ
ｅｒｈｕｉｚｅｎおよびＦｕｋｕｄａ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３２６−９３３０）；Ｗｉｌｌｉａｍｓおよび
Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１１２４７
−１１２５２）。Ｋｕｍａｒらは、コア２ β１−６Ｎ−アセチルグルコサミニ
ル−トランスフェラーゼをコードする遺伝子を、ＰＳＧＬ−１およびフコシルト
ランスフェラーゼもまた発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内
にトランスフェクトすることがＰ−セレクチンに対する高い親和性の結合を生じ
ることを報告した（Ｂｌｏｏｄ（１９９６）８８：３８７２−３８７９）。

【００１１】 コア２ Ｏ−グリカン合成はまた、報告されるところによれば、リンパ系細胞
生理機能および免疫応答の調節に関与する（ＴｓｕｂｏｉおよびＦｕｋｕｄａ（
１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６：６３６４−６３７３）。末梢Ｔ細胞および末梢
Ｂ細胞の抗原媒介性活性化は、コア２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ活性のアップレギュレ
ーションおよびＣＤ４３上の分枝Ｏ−グリカンによって特徴付けられる（Ｂａｕ
ｍら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：８７７−８８７；Ｐｉｌｌｅｒ
ら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５１４６−１５１５０）。
コア２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔはまた、以下において関連付けられた：ヴィスコット
−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）（Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：６２８０−６２９０；Ｐｉｌｌｅｒら（１９９１）、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１５０１−１５１０）ＡＩＤＳ（Ｆｏｘら（１９８
３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：７６２−７）、および白血病（Ｂｒｏｃｋｈ
ａｕｓｅｎら（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：１２５７−１２６３；
Ｓａｉｔｏｈら（１９９１）Ｂｌｏｏｄ ７７：１４９１−９）。

【００１２】 従って、白血球管外遊出、リンパ球輸送、および他のプロセスが、コア２ Ｇ
ｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを必要とするオリゴサッカリド構造に明らかに関
連する。これは、慢性炎症および他の所望されない炎症に対して有効であるが、
病原体および他の因子に対して有効な防御を開始する身体の能力を損なわない処
置を開発する能力を妨害してきた。理想的には、このような処置は、初期で炎症
応答に干渉するが、リンパ球媒介性免疫応答に対して副作用を有さない。本発明
は、この必要性および他の必要性を満たす。

【００１３】 （発明の要旨） 本発明は、哺乳動物において炎症応答を調節するための方法および化合物を提
供する。この調節は、コア２オリゴサッカリド（ｃｏｒｅ ２ ｏｌｉｇｏｓａ
ｃｃｈａｒｉｄｅ）に対するレセプター（例えば、Ｐ−セレクチン）へのコア２
オリゴサッカリドの結合をブロックする化合物を、哺乳動物に投与することによ
って達成される。コア２オリゴサッカリドは、炎症細胞（例えば、好中球）上に
存在し得る。いくつかの実施形態では、この化合物の投与は、内皮細胞または他
の骨髄性細胞、炎症細胞へのコア２オリゴサッカリド結合を阻害する。コア２オ
リゴサッカリド媒介性結合を標的化することにより、この方法は炎症に対して有
効であるが、リンパ球輸送を有意に変化させない。

【００１４】 いくつかの実施形態では、本発明の方法および化合物は、コア２オリゴサッカ
リドの合成を低減するか、または妨げる。例えば、コア２ ＧｌｃＮＡｃトラン
スフェラーゼの活性を阻害し、従って、コア２オリゴサッカリドの形成を妨げる
化合物が投与され得る。例えば、この化合物は、最小コア２オリゴサッカリドの
酵素的合成を阻害し得る（例えば、β１，６−結合型ＧｌｃＮＡｃのＧａｌβ１
，３−ＧｌｃＮＡｃアクセプターへの付着を妨げ得る）。他の化合物は、最小コ
ア２オリゴサッカリド（これは、さもなくば、コア２オリゴサッカリドに付加さ
れる（例えば、ＳＬｅ^x））への１つ以上のさらなるサッカリド残基の付着を阻
害し得る。

【００１５】 あるいは、この化合物は、コア２オリゴサッカリドに結合し得、従って、内皮
細胞またはコア２オリゴサッカリドについてのレセプター（例えば、Ｐ−セレク
チン）を提示する他の骨髄性細胞へのコア２オリゴサッカリドの結合と競合し、
そしてこれを阻害する。

【００１６】 また本発明により、内皮細胞または第２の骨髄性細胞への骨髄性細胞の結合を
調節する方法が提供される。この方法は、骨髄性細胞を骨髄性細胞の表面上のコ
ア２オリゴサッカリドの合成を調節する化合物と接触させる工程を包含する。あ
るいは、この化合物の接近性は、コア２オリゴサッカリドに結合し得、従って、
コア２オリゴサッカリドが対応するレセプターに結合する能力を低減させる。目
的の骨髄性細胞としては、例えば、好中球、好酸球、単球、および顆粒球が挙げ
られる。

【００１７】 本発明はまた、哺乳動物において炎症応答を阻害する際に使用するための化合
物を同定する方法を提供する。これらの方法は、以下を包含する：ａ）コア２
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、潜在的な炎症モジュレーター、ＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＮＡｃ糖ドナー、アクセプターサッカリド、およびコア２ ＧｌｃＮＡｃトラ
ンスフェラーゼ活性に必要とされるさらなる試薬を含むアッセイ混合物を提供す
る工程；ｂ）コア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが活性である条件下で、
このアッセイ混合物をインキュベートする工程；およびｃ）アクセプターサッカ
リドに転移されたＧｌｃＮＡｃの量が、潜在的な炎症モジュレーターを欠くアッ
セイと比較して増加しているかまたは減少しているかを決定する工程。アクセプ
ターサッカリドへのＧｌｃＮＡｃ転移における減少を生じる潜在的な炎症モジュ
レーターが、炎症応答を阻害するために適切である。

【００１８】 哺乳動物において炎症応答を阻害するために有用である化合物を同定するため
に、さらに試験され得るリード化合物を同定するためのさらなる方法もまた、提
供される。これらの方法は、以下を包含する：ａ）コア２ ＧｌｃＮＡｃトラン
スフェラーゼ、コア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼについてのアクセプタ
ーサッカリド、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをコードするポリヌクレオチドを含
む細胞を提供する工程；ｂ）この細胞を潜在的な炎症モジュレーターと接触させ
る工程、およびコア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが正常に発現される条
件下で、この細胞をインキュベートする工程；ならびにｃ）コア２オリゴサッカ
リドのレベルが、潜在的な炎症モジュレーターの非存在下におけるコア２オリゴ
サッカリドのレベルと比較して、増加しているかまたは減少しているかを決定す
る工程。産生されるコア２オリゴサッカリドの量において減少を引き起こす潜在
的な炎症モジュレーターは、この化合物が、哺乳動物における炎症応答を阻害す
るか否かを決定するために、さらに試験するのに適切である。このアッセイにお
いて使用される細胞は、いくつかの実施形態では、コア２ ＧｌｃＮＡｃトラン
スフェラーゼに加えて１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ、ならびに対応
する反応物（例えば、ヌクレオチド糖）（これは、最小コア２オリゴサッカリド
のＧｌｃＮＡｃに対してさらなるサッカリド残基を付加して、改変されたコア２
オリゴサッカリドを形成し得る）を含み得る。これらの実施形態では、コア２オ
リゴサッカリドのレベルは、改変されたコア２オリゴサッカリドの存在または非
存在を検出することにより決定される。

【００１９】 哺乳動物において炎症を潜在的に阻害するが、リンパ球媒介性免疫応答を阻害
しないリード化合物はまた、潜在的な炎症モジュレーター化合物のライブラリー
をコア２オリゴサッカリドと接触させること、およびコア２オリゴサッカリドに
結合する潜在的な炎症モジュレーター化合物を同定することによって同定され得
る。コア２オリゴサッカリドに結合する化合物は、炎症モジュレーターとしてさ
らに試験するのに適切なリード化合物である。

【００２０】 （詳細な説明） （定義） 以下の略語を、本明細書中で使用する： Ａｒａ＝アラビノシル； Ｆｒｕ＝フルクトシル； Ｆｕｃ＝フコシル； Ｇａｌ＝ガラクトシル； ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミニル； Ｇｌｃ＝グルコシル； ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミニル； Ｍａｎ＝マンノシル；および ＮｅｕＡｃ＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル（ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａ
ｍｉｎｙｌ））。

【００２１】 オリゴサッカリドは、還元末端のサッカリドが実際に還元糖であろうとなかろ
うと、還元末端および非還元末端を有するとみなされる。容認された命名法に従
い、本明細書中ではオリゴサッカリドを、左に非還元末端および右に還元末端を
有して示す。本明細書中に記載されるすべてのオリゴサッカリドは、非還元サッ
カリドについての名称または略語（例えば、Ｇａｌ）、次いで、グリコシド結合
の配置（αまたはβ）、環の結合、結合に関与する還元サッカリドの環の位置、
次いで、還元サッカリドの名称または略語（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）で記載され
る。２つの糖の間の連結は、例えば、２，３、２→３、または（２，３）として
表され得る。各サッカリドは、ピラノースである。

【００２２】 「コア２オリゴサッカリド」は、Ｏ結合型の分枝サッカリド部分であり、この
生合成は、コア２ ＧｌｃＮＡｃβ１，６−トランスフェラーゼの活性を必要と
する。一般的に、コア２オリゴサッカリドは、ガラクトース（β１，３結合型ま
たはβ１，４結合型）およびＧｌｃＮＡｃ残基（ＧａｌＮＡｃにβ１，６結合し
た）が付着したＧａｌＮＡｃ残基を最低でも含む（図１）。コア２ ＧｌｃＮＡ
ｃトランスフェラーゼは、ＧｌｃＮＡｃ残基の付着を触媒して、この「最小コア
２オリゴサッカリド」を形成する酵素である。コア２オリゴサッカリドはまた、
図１に示されるように、ガラクトースおよびＧｌｃＮＡｃ残基のいずれかまたは
その両方に付着した、さらなる炭水化物残基を有し得る。ＧｌｃＮＡｃ分枝は、
ポリラクトサミン、シアリルルイス^x（ＳＬｅ^x）および他のサッカリド構造の付
加のための足場として作用し得；このような「改変されたコア２オリゴサッカリ
ド」もまた、本明細書中で使用される場合、用語コア２オリゴサッカリドの意味
に入るとみなされる。最初のＧａｌＮＡｃ残基は、一般に、ポリペプチド、糖脂
質、または他のヒドロキシル化分子の、例えば、セリンまたはスレオニン残基上
に存在するヒドロキシル基に対してＯ結合されている。

【００２３】 本願に必要とされる命名法および一般実験室手順の多くは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
、１９８９に見出され得る。本明細書中以降、この手引書を「Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら」として言及する。

【００２４】 用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態にあるデオキシリボヌ
クレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーをいい、そして他に限定されない
限り、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で核酸にハイブリダイズする、
天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む。他に示されない限り、特定の核酸
配列は、その相補的配列を含む。

【００２５】 「阻害性核酸」は、阻害性核酸治療（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ ｔｈｅｒａｐｙ）における用途のために使用または設計された、任
意の核酸または改変された核酸である。「阻害性核酸治療」は、遺伝子発現を阻
害する（例えば、ＤＮＡ転写の阻害、ＲＮＡのプロセシング、輸送、もしくは翻
訳の阻害、またはタンパク質合成の阻害）ための阻害性核酸の使用をいう。阻害
性核酸治療は、本明細書中に記載されるような、核酸または改変された核酸を使
用する疾患の処置のための種々のアプローチを含む。種々の阻害性核酸治療（ア
ンチセンス核酸を含む）は、以下により詳細に考察される。

【００２６】 用語「作動可能に連結された」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター
、シグナル配列、または転写因子結合部位の整列）と第２の核酸配列との間の機
能的な連結であって、ここで、発現制御配列が、第２の配列に対応する核酸の転
写および／または翻訳に影響する、連結をいう。

【００２７】 用語「組換え」は、細胞を参照して使用される場合には、この細胞が異種核酸
を複製するか、または異種核酸によりコードされるペプチドもしくはタンパク質
を発現することを示す。組換え細胞は、その細胞のネイティブな（非組換え）形
態において見出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、この細胞のネイ
ティブな形態において見出される遺伝子を含み得、ここでこの遺伝子は、人工的
手段により改変され、そして細胞内に再導入されている。この用語はまた、細胞
から核酸を取り除くことなく改変された、細胞に対して内因性の核酸を含む細胞
を包含する；このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異、および関
連の技術により得られた改変が挙げられる。

【００２８】 「異種配列」または「異種核酸」は、本明細書中で使用される場合、特定の宿
主細胞に対して外来の供給源に由来する配列もしくは核酸、または同一の宿主細
胞由来の場合には、その本来の形態から改変されている配列もしくは核酸である
。

【００２９】 「部分配列」は、それぞれ、核酸またはアミノ酸（例えば、ポリペプチド）の
より長い配列の中の一部分を含む核酸またはアミノ酸の配列をいう。

【００３０】 「組換え発現カセット」または単純に「発現カセット」は、そのような配列と
適合性である宿主において構造遺伝子の発現に影響し得る核酸エレメントを含む
、組換え的にかまたは合成的に生成された核酸構築物である。発現カセットは、
少なくともプロモーターを、そして必要に応じて転写終結シグナルを含む。代表
的には、組換え発現カセットは、転写される核酸（例えば、所望されるポリペプ
チドをコードする核酸）およびプロモーターを含む。発現をもたらす際に必要ま
たは有益なさらなる因子もまた、本明細書中に記載されるように、使用され得る
。例えば、発現カセットはまた、宿主細胞からの発現されたタンパク質の分泌を
指向するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。転写終結シグ
ナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響する他の核酸配列もまた、発現カ
セットに含まれ得る。

【００３１】 用語「単離された」は、目的の酵素または他の物質のネイティブな状態におい
て見出されるような、その目的の酵素または他の物質に通常付随している成分を
、実質的または本質的に含まない物質をいうように意味される。従って、本発明
の酵素、核酸、または他の物質は、単離される場合、それらのインサイチュ環境
で通常会合している物質を含まない。代表的に、単離されたタンパク質または核
酸は、標準的な方法により測定される場合に（例えば、銀染色ゲルにおけるバン
ド強度を決定すること、または純度を決定するための他の方法によって）、少な
くとも約８０％純粋、通常少なくとも約９０％、そして好ましくは少なくとも約
９５％純粋である。タンパク質および核酸の純度または均質性は、当該分野にお
いて周知の多くの方法（例えば、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル
電気泳動、次いで、染色による視覚化）によって示され得る。特定の目的のため
には、高分解能が必要とされ、そしてＨＰＬＣまたは精製のための類似の手段が
利用される。

【００３２】 用語「同一」または「同一性」パーセントは、２つ以上の核酸配列またはポリ
ペプチド配列の文脈において、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用してか
もしくは目視検査によって測定したとき、最大一致となるよう比較および整列さ
れる場合に、同一であるか、または同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチド
の指定されたパーセンテージを有する、２つ以上の配列または部分配列をいう。

【００３３】 句「実質的に同一」は、２つの核酸またはポリペプチドの文脈において、以下
の配列比較アルゴリズムの１つを使用してかもしくは目視検査によって測定した
とき、最大一致となるよう比較および整列される場合に、少なくとも７０％、好
ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残
基の同一性を有する、２つ以上の配列または部分配列をいう。好ましくは、実質
的な同一性は、少なくとも約５０残基長である配列の領域にわたって、より好ま
しくは、少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、そして最も好ましく
は、この配列は、少なくとも約１５０残基にわたり実質的に同一である。最も好
ましい実施形態では、配列は、コード領域の長さ全体にわたって実質的に同一で
ある。

【００３４】 配列比較のために、代表的に、１つの配列は、参照配列（これに対して、試験
配列を比較する）として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験
配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要ならば、部分配列座標を指
定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。次いで、配列比
較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に
対する試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。

【００３５】 比較のための配列の最適な整列は、例えば、以下によって実行され得る：Ｓｍ
ｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１
９８１）の局所的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントア
ルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法についての検
索、これらのアルゴリズムのコンピューター化インプリメンテーション（ＧＡＰ
、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏ
ｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｅｉｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ
，ＷＩ））、または目視検査（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、を参照の
こと）。

【００３６】 配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なア
ルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｈｕ
ｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載され
る。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅ
ｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利
用可能である。このアルゴリズムは、最初に、問合せ配列において長さＷの短い
ワード（これは、データベースの配列中の同じ長さのワードと整列された場合に
、いくつかの正に評価された閾値スコアＴと一致するか、または満たすかのいず
れかである）を同定することによって、高スコア付配列対（ＨＳＰ）を同定する
ことを含む。Ｔは、近接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒ
ｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）として言及される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら
、前出）。これらの開始近接ワードヒット（ｉｎｉｔｉａｌ ｎｅｉｇｈｂｏｒ
ｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｈｉｔ）は、それらを含む、より長いＨＳＰを見出すため
の検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、このワードヒットは、
累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長され
る。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（１対の一致
残基についての報酬（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に０より大きい）およびパラメ
ーターＮ（不一致残基についてのペナルティ（ｐｅｎａｌｔｙ）スコア；常に０
より小さい）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコア付けマト
リクスを使用して、累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの伸長
を、以下の場合に停止する：その最大達成値からＸ量だけ、累積アラインメント
スコアが低下した場合；１つ以上の負にスコア付けされた残基アラインメントの
蓄積に起因して、累積スコアが０以下になった場合；または、いずれかの配列の
末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは
、このアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（
ヌクレオチド配列に対する）は、デフォルトとして、以下を使用する：１１のワ
ード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較。ア
ミノ酸について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、以下を使用す
る：３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア
付けマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）
。

【００３７】 配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはま
た、２つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎおよ
びＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０
：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムに
よって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、こ
れは、２つのヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸配列間の一致が偶然に生
じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較
において最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして
最も好ましくは約０．００１未満である場合に、参照配列に対して類似とみなさ
れる。

【００３８】 ２つの核酸配列または２つのポリペプチドが実質的に同一であることのさらな
る指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプ
チドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性
であるということである。従って、ポリペプチドは、代表的に、例えば、２つの
ペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合には、第２のポリペプチドに対し
て実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は
、以下に記載されるように、２つの分子が、ストリンジェントな条件下で互いに
対してハイブリダイズするということである。

【００３９】 「実質的に結合する」は、核酸の文脈において、プローブ核酸と標的核酸との
間の相補的ハイブリダイゼーションをいい、そして標的ポリヌクレオチド配列の
所望される検出を達成するために、ハイブリダイゼーション培地のストリンジェ
ンシーを低減させることによって適応され得る少数の不一致を含む。

【００４０】 句「〜に特異的にハイブリダイズする」は、その配列が、複雑な混合物の（例
えば、細胞全体の）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合に、ストリンジェント
な条件下での、特定のヌクレオチド配列に対してのみの分子の結合、二重鎖形成
（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）またはハイブリダイゼーションをいう。用語「ストリン
ジェントな条件」は、プローブがその標的部分配列にハイブリダイズするが、他
の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列
依存的であり、そして異なる環境において異なる。より長い配列は、より高い温
度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定
されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約
５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に対して相補的なプローブの
５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（標的配列は、一般的に、
過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％は平衡状態で占められる）（
規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下での）温度である。代表的に
、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約０．１Ｍ Ｎａ
イオン未満、代表的に約０．０１〜０．１Ｍ Ｎａイオン濃度（または、他の塩
）であり、そして温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に
ついては少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば、５０より大きいヌ
クレオチド）については少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェン
トな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加で達成され得る。

【００４１】 句「特異的に結合する」は、タンパク質、サッカリド、および他の生物製剤（
ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の異種集団の存在下における標的分子の存在の決定的であ
る結合反応をいう。従って、指定されたアッセイ条件のもとで、指定されたレセ
プターまたは他の化合物は、優先的に目的のコア２オリゴサッカリドまたは他の
分子に結合し、そしてサンプル中に存在する他の分子に対して有意な量で結合し
ない。このような条件下でのタンパク質に対する特異的結合は、特定のリガンド
に対するその特異性について選択されたレセプターを必要とする。種々のアッセ
イ様式が、特定のリガンドと特異的に反応するレセプターを選択するために使用
され得る。例えば、コア２オリゴサッカリドまたは他の分子と特異的に免疫反応
性であるモノクローナル抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ
が慣用的に使用される。特異的免疫反応性を決定するために使用され得るイムノ
アッセイの様式および条件に関する説明については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎ
ｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。

【００４２】 特定のポリヌクレオチド配列の「保存的に改変されたバリエーション」は、同
一または本質的に同一なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドか、または
ポリヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列
をいう。遺伝暗号の縮重が理由で、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定の
ポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、
ＡＧＡ、およびＡＧＧはすべて、アミノ酸アルギニンをコードする。従って、コ
ドンによってアルギニンが指定されるすべての位置で、このコドンは、コードさ
れるポリペプチドを変更させることなく、記載される対応するコドンのうちのい
ずれかに変更され得る。このような核酸のバリエーションは、「サイレントな置
換」または「サイレントなバリエーション」であり、「保存的に改変されたバリ
エーション」のうちの１種である。ポリペプチドをコードする、本明細書中に記
載のすべてのポリヌクレオチド配列はまた、他に記述される場合を除き、すべて
の可能なサイレントなバリエーションを記載する。従って、サイレントな置換は
、アミノ酸をコードするすべての核酸配列に関して暗示される特徴である。核酸
中の各コドン（ＡＵＧ（これは、通常、メチオニンについての唯一のコドンであ
る）を除く）が、標準的技術によって、機能的に同一の分子を産生するために改
変され得ることを、当業者は認識する。いくつかの実施形態では、酵素をコード
するヌクレオチド配列は、好ましくは、酵素を産生するために使用される特定の
宿主細胞（例えば、酵母、哺乳動物、植物、真菌など）における発現のために最
適化される。

【００４３】 同様に、アミノ酸配列中の１または数個のアミノ酸における「保存的アミノ酸
置換」は、非常に類似した特性を有する異なるアミノ酸で置換される。そしてこ
れはまた、特定のアミノ酸配列またはアミノ酸をコードする特定の核酸配列に対
して非常に類似であるとして、容易に同定される。このような任意の特定の配列
の保存的に置換されたバリエーションは、本発明の特徴である。コードされる配
列中の単一のアミノ酸または低いパーセンテージのアミノ酸（代表的には、５％
未満、より代表的には、１％未満）を変更、付加、または欠失する個々の置換、
欠失、または付加は、「保存的に改変されたバリエーション」であり、ここで変
更は、化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる。機能的に類似し
たアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野において周知である。例えば
、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。

【００４４】 用語「シアル酸」は９個の炭素のカルボキシル化した糖のファミリーの任意の
メンバーをいう。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル
−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド（ａｃｅｔａｍｉｎｄｏ）−３，
５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース（ｇａｌａｃｔ
ｏｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓ）−１−オン酸（ｏｎｉｃ ａｃｉｄ））（しば
しば、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと省略される）である。この
ファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ
またはＮｅｕＧｃ）であり、ここでＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル
化される。第３のシアル酸ファミリーのメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−
ノヌロソン酸（ｎｏｎｕｌｏｓｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＫＤＮ）（Ｎａｄａｎｏ
ら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋ
ａｎａｍｏｒｉら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−
２１８１９）である。９−置換シアル酸（例えば、９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−
Ｎｅｕ５Ａｃ様９−Ｏ−ラクチル（ｌａｃｔｙｌ）−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ
−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび
９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ）もまた、含まれる。シアル酸ファミ
リーの概説については、例えば、Ｖａｒｋｉ（１９９２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ ２：２５−４０；Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅ
ｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照のこと。シア
リル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、国際公開ＷＯ９２／１
６６４０（１９９２年１０月１日公開）に開示される。

【００４５】 用語「トランスジェニック」は、細胞内に導入された特定の遺伝的改変を含む
細胞またはその細胞の祖先をいう。このような改変としては、１つ以上の点変異
、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせが挙げられ得る。動物を参照していう
場合、用語「トランスジェニック」は、動物がトランスジェニックである細胞を
含むこと、およびそのような動物の子孫を意味する。トランスジェニック細胞お
よび非トランスジェニック細胞の両方から構成される動物は、本明細書中で「キ
メラ」動物として言及される。

【００４６】 （好ましい実施形態の説明） 本発明は、第１の骨髄性細胞の内皮細胞または第２の骨髄性細胞に対する結合
を調節するために適切な方法および化合物を提供する。このような方法および化
合物を用いて、哺乳動物における炎症応答を予防または低減し得る。炎症を調節
するために以前から利用可能な方法とは異なり、本発明の方法および化合物は、
炎症に特異的であり、そしてＢリンパ球媒介性免疫応答およびＴリンパ球媒介性
免疫応答を妨害しない。第１の骨髄性細胞の内皮細胞または第２の骨髄性細胞に
対する結合を調節するために有用である化合物を同定するためのスクリーニング
方法もまた提供される。このような化合物は、炎症を低減または処置する能力に
ついてさらに試験するためのリード化合物としての使用に適切である。コア２
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの機能的遺伝子を欠くトランスジェニック動物
もまた本発明によって提供される。

【００４７】 本発明の化合物および方法は、治療用途および薬物発見用途だけでなく、異な
る細胞型およびそれらの相互作用の炎症プロセスに対する効果の研究にも有用で
ある。

【００４８】 本発明は、炎症細胞の血管内皮に対する結合および血管から組織への炎症細胞
の管外遊出が、コア２オリゴサッカリドによって媒介されるとの発見に部分的に
基づく。驚くべきことに、血液から感染部位または組織損傷へののリンパ球輸送
は、たとえリンパ球および細胞の管外遊出が類似のレセプターを伴ったとしても
、コア２オリゴサッカリドの非存在によって影響されない。従って、本発明の方
法は、コア２オリゴサッカリドのレセプターに対する炎症細胞のコア２オリゴサ
ッカリド媒介結合を調節し得る化合物の治療有効量を哺乳動物に投与する工程を
含む。この化合物は、コア２オリゴサッカリドの合成を低減し得るかまたはコア
２オリゴサッカリドの分解を増強し得、従って、潜在的な炎症部位に対する炎症
細胞の輸送の低減をもたらす。従って、コア２オリゴサッカリドの量および／ま
たは結合能力の低減は、潜在的な炎症部位に対する炎症細胞の輸送の低減を引き
起こす。しかし、リンパ球輸送は、コア２オリゴサッカリドの喪失またはブロッ
クにより影響されない。

【００４９】 本発明の方法および組成物は、種々の細胞型（特に、好中球のような炎症性細
胞）に存在し、そしてそれらの細胞型上での結合のために利用可能なコア２オリ
ゴサッカリドの量を変更する。コア２オリゴサッカリドは、例えば、糖タンパク
質または糖脂質のような任意のいくつかの糖結合体に存在し得る。糖タンパク質
に結合した場合、コア２オリゴサッカリドは一般に、スレオニン残基またはセリ
ン残基に対するＯ結合を通してこのタンパク質に連結される。コア２グリカンは
、構造Ｇａｌβ１→３（ＧｌｃＮＡｃβ１→６）ＧａｌＮＡｃ−（図１）を有し
、糖タンパク質のＯ残基に直接付着され得るか、または糖タンパク質もしくは糖
脂質に付着される糖残基に付着され得る。糖脂質会合コア２オリゴサッカリドの
１例は、Ｇａｌβ１→３（ＧｌｃＮＡｃβ１→６）ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌ
α１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→脂質（例えば、セラミド）である。別の例
は、α１→３結合によってコア２構造が別の糖残基に連結される糖脂質である。

【００５０】 いくつかの実施形態では、本発明の方法は、コア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフ
ェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．１０２）の活性における変化を引き起こす。コア２
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼは、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグル
コサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ）とも呼ばれる。この
酵素は、活性化された糖ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから、構造Ｇａｌβ１→３Ｇａｌ
ＮＡｃ−を含むアクセプターサッカリドへのＧｌｃＮＡｃの転移を触媒する。従
って、例えば、本発明は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの活性を阻害するブロック剤
に関する。本発明のブロック剤は、この酵素もしくはこの酵素についての基質に
直接作用し得るか、またはこの酵素をコードする遺伝子の発現を阻害し得る。あ
るいは、例えば、この構造を、例えば、第２の骨髄性細胞の内皮細胞上のリガン
ドにより結合され得ないオリゴサッカリドへと変換することによって、コア２オ
リゴサッカリドを破壊する薬剤を投与し得る。コア２オリゴサッカリドに結合し
、従ってこのリガンドによる結合を防止するブロック剤（例えば、抗体）はまた
、本発明の方法に従って投与され得る。

【００５１】 炎症調節剤を調製するための方法ならびに適切な候補を同定するための種々の
スクリーニングアッセイもまた開示される。これらの化合物についての治療用途
および他の用途もまた提供される。

【００５２】 （Ｉ．コア２オリゴサッカリド媒介性の炎症細胞結合および管外遊出を調節す
るための方法） 本発明は、炎症に関与する細胞の内皮細胞およびまた他の内皮細胞細胞に対す
る結合を調節する方法を提供する。この結合は、好中球のような炎症性細胞の表
面上に提示されるコア２オリゴサッカリドによって媒介される。内皮細胞、およ
び好中球が結合する他の細胞は、コア２オリゴサッカリドについてのレセプター
を提示する。少なくともいくつかの場合には、このレセプターは、Ｐセレクチン
またはＥセレクチンのようなセレクチンである。この細胞間結合を調節すること
により、炎症応答が予防または処置され得る。

【００５３】 （Ａ．コア２オリゴサッカリドの合成に関与するグリコシルトランスフェラー
ゼのインヒビター） １つの実施形態では、本発明の方法は、コア２オリゴサッカリドの合成に関与
するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの酵素活性を阻害することによ
り炎症を低減または予防する工程を含む。これらの部分の合成を触媒する一般的
な酵素群である、グリコシルトランスフェラーゼは、糖ヌクレオチド（ドナー基
質）からアクセプター基質への単糖の転移を触媒する。アクセプター基質は、ト
ランスフェラーゼの特異性に依存して、別のグリコシル残基、ポリペプチドまた
は脂質であり得る。例えば、Ｂｅｙｅｒら（１９８１）Ａｄｖ．ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍ．５２：２４を参照のこと。グリコシルトランスフェラーゼは、転移される糖
残基の型に基づくファミリーに分類される。例えば、シアル酸を転移する酵素は
、シアリルトランスフェラーゼと呼ばれ、フコースを転移する酵素は「フコシル
トランスフェラーゼ」と呼ばれ、そしてシアル酸を転移する酵素は「シアリルト
ランスフェラーゼ」と呼ばれる。シアリルトランスフェラーゼは、オリゴサッカ
リド多様化の間にシアル酸残基を付加するグリコシルトランスフェラーゼ酵素の
ファミリーである（概説については、例えば、Ｈａｒｄｕｉｎ−Ｌｅｐｅｒｓら
（１９９５）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：７４１−７５８を参照のこと）。
シアリル化は、ゴルジ装置で生じ、そして一般にさらなるオリゴサッカリド鎖伸
長を終結させる。各ファミリーには代表的に、動物細胞の糖タンパク質および糖
脂質に見出される多様な炭水化物構造を合成するために必要とされる１０〜１５
の異なる酵素が存在する。各酵素は、利用するドナーおよびアクセプター基質に
基づいて規定された構造を作製し、そして転移反応の間に形成されるアノマー結
合を作製する。

【００５４】 好ましくは、インヒビターは、目的の特定のグリコシルトランスフェラーゼに
特異的であり、そしてこのグリコシルトランスフェラーゼは、炎症応答に関与し
ない他のオリゴサッカリドの合成に必要とされるグリコシルトランスフェラーゼ
である。好ましい実施形態では、この酵素が、コア２オリゴサッカリドの合成に
ほぼ独占的に関与し、そして他のオリゴサッカリドの合成に関与しないように、
標的グリコシルトランスフェラーゼは、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ
である。

【００５５】 阻害されるべき標的酵素（例えば、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ）が同定されると
、多くのアプローチを用いてその活性をブロックし得る。酵素活性を阻害する薬
剤の例としては、免疫グロブリン、自殺基質、アルキル化剤、および種々の基質
アナログが挙げられる。概説については、Ｆｅｒｓｈｔ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ（第２版 １９８５）を参照のこと
。グリコシルトランスフェラーゼ活性を阻害することにより炎症を調節する方法
は、そのグリコシルトランスフェラーゼについての基質のアナログである化合物
を哺乳動物に投与する工程を含み得る。

【００５６】 いくつかの実施形態では、インヒビターは、糖ヌクレオチドまたはドナー基質
のアナログ（例えば、ＧｌｃＮＡｃまたはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのアナログ）で
ある。上記で考察するように、グリコシルトランスフェラーゼのドナー基質は、
糖ヌクレオチド（通常、ジホスホヌクレオシド）である。例えば、ウリジンジホ
スホ糖（ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｓｕｇａｒ）は、グルコース、ガラクトース、Ｎ−
アセチルグルコサミン、キシロースおよびグルクロン酸のグリコシドの形成につ
いてのドナー基質である。グアノシンジホスホ糖は、マンノースおよびフコース
のグリコシドの合成についてのドナー基質である。

【００５７】 この知識を用いて、当業者は、多数の糖ヌクレオチドを容易に合成し得、次い
でこの糖ヌクレオチドは、特異的酵素の最大阻害能力を同定するために試験され
得る。本明細書中で用いられる場合、用語「糖ヌクレオチド」とは、上記で考察
した糖ヌクレオチドおよび合成され得るかまたは天然の供給源から単離され得る
種々のそのアナログの両方をいう。この構造についてのバリエーションの数は、
制限がない。例えば、糖とリン酸エステルとの間のエステル結合およびピロリン
酸の無水結合の両方が、酵素切断の潜在的な標的である。より安定なＣ−Ｐ結合
でのＯ−Ｐ結合またはＣ−Ｏ結合の置換が、酵素分解に対してより耐性である、
ヌクレオチド一リン酸またはヌクレオチド二リン酸の糖アナログを提供する。こ
のような化合物は、特定のグリコシルトランスフェラーゼの基質アナログとして
作用することによって糖タンパク質合成または糖脂質合成を選択的に阻害する可
能性を有する。例えば、Ｖａｇｈｅｆｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１３
８３−１３９１（１９８７）およびＶａｇｈｅｆｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．
３０：１３９１−１３９９（１９８７）を参照のこと。グリコシルトランスフェ
ラーゼインヒビターは、例えば、米国特許第５，４６１，１４３号にも記載され
る。

【００５８】 別のアプローチは、糖残基とヌクレオシド部分との間の一リン酸架橋または二
リン酸架橋を置換することである。例えば、二リン酸架橋は、等配電子の−ＯＣ
ＯＮＨＳＯ₂Ｏ−残基で置換され得る。Ｓａｍａｒａｓａら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈ
ｅｍ．２８：４０−４６（１９８５）を参照のこと。

【００５９】 グリコシル化を阻害し得る糖ヌクレオチドのアナログは、抗生物質および抗ウ
イルス剤として用いられている。このような化合物の例としては、ＵＤＰ−２ｄ
ＧｌｃまたはＧＤＰ−２ｄＧｌｃのいずれかに転移され、そしてその形態でウイ
ルスエンベロープにおける糖タンパク質のグリコシル化を阻害する２−デオキシ
−Ｄ−グルコースが挙げられる。本明細書中に参考として援用される、ＤｅＣｌ
ｅｒｃｑ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０５：１（１９８２）。ツニカマイシンおよ
びストレプトビルジン（ｓｔｒｅｐｔｏｖｉｒｕｄｉｎ）のような抗生物質もま
た、グリコシル化を阻害する能力に起因して有効である。例えば、ツニカマイシ
ンは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼについてのドナー基質で
あるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのアナログである。炭素鎖での二リン酸架橋の置換は
、ツニカマイシンが細胞膜を通過するが、依然としてこの酵素の活性部位に容易
に結合するのを可能にする。これらおよび関連の化合物の構造は、本明細書中に
記載されるように、本発明に従って類似の阻害効果を有する化合物を設計および
合成する際の指示を当業者に提供する。

【００６０】 ヌクレオチドは、グリコシル残基がアクセプター基質へと転移される反応の副
産物である。ヌクレオチドは、グリコシルトランスフェラーゼを競合的に阻害す
ることが見出されている。従って、種々のヌクレオチドおよびそれらのアナログ
は、これらの酵素のインヒビターとしての可能性を有する。例えば、ＵＤＰおよ
びＵＭＰを用いて、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ活性を阻害し得る。

【００６１】 ドナー基質アナログに加えて、アクセプター基質のアナログもまた、インヒビ
ターとして用いられ得る。さらに、当業者は、用いられ得る種々の可能な構造を
認識する。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃーＴのアクセプター基質特異性によって、Ｃ２
ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの特異的阻害が達成され得る。理想的には、阻害性化合物は、
他の酵素の存在下でさえ、所定の酵素についての特異的アクセプター基質として
作用し得るべきである。さらに、この化合物は、効率的なアクセプター基質であ
るべきである。従って、このインヒビターのＫ_iは、少なくとも約１０^-5Ｍ、よ
り好ましくは少なくとも約１０^-7Ｍであるべきである。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ
の阻害についての適切なアナログとしては、ガラクトース残基が６−デオキシガ
ラクトースによって置換されたＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ−の誘導体が挙げら
れる。デオキシガラクトース含有化合物は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃーＴに結合する
がアクセプターとして機能しない。

【００６２】 グリコシルトランスフェラーゼはまた、このグリコシルトランスフェラーゼに
ついてのアクセプター基質を、このアクセプターオリゴサッカリドを目的のグリ
コシルトランスフェラーゼについてのアクセプターとして機能しない異なる構造
へと転換させる競合するグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼと
接触させることにより阻害され得る。例えば、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ含有
オリゴサッカリドを、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔによってアクセプター基質として
利用されないオリゴサッカリド構造Ｇａｌβ１→３（Ｓｉａα２→６−）Ｇａｌ
ＮＡｃを形成するα２，６シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６ ＧａｌＮＡｃ
ＩＩ）と接触させることにより、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ活性を阻害し得る。
他のシアリルトランスフェラーゼもまた、この目的のために適切である；これら
としては、例えば、ＳＴ３ＧａｌＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ、ＩＩＩおよびＩＶ
、ならびにＧａｌＮＡｃ残基をアクセプター残基として利用し得る他のものが挙
げられる。光反応性ニトロフェニル基質誘導体は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの有
効なインヒビターの別の例である（Ｔｏｋｉら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８：４１７−４２３）。

【００６３】 阻害効果を示す天然に存在する分子もまた、本発明において使用するために単
離され得る。糖タンパク質または糖脂質の生合成は、調節が多くの因子に依存す
る複雑な代謝経路である。天然に存在する阻害性化合物は精製され得、そして活
性をさらに阻害するために用いられ得る。

【００６４】 本発明の好ましいグリコシルトランスフェラーゼインヒビターは、細胞膜を横
切り、そしてゴルジ装置に侵入する能力を有する。従って、ブロック剤は好まし
くは、膜を通しての拡散を可能にするのに充分に疎水性である。一般に、ブロッ
ク剤は、細胞の代謝に対して他の副作用を有さず、その結果、特定の反応が阻害
されながらも他のグリコシル化反応が進行する。ブロック剤は好ましくは、比較
的低分子であり、それにより、免疫原性を回避し、そして細胞膜を通した通過を
可能にする。理想的には、ブロック剤は、約１００〜２０００ダルトンの間の分
子量を有するが、所望の適用に依存して５０００以上までの分子量を有し得る。
最も好ましい実施態様では、インヒビターは、約２００〜６００ダルトンの間の
分子量を有する。

【００６５】 本発明のインヒビターは好ましくは、標的酵素についての強力な親和性を有し
、その結果、グリコシルトランスフェラーゼ活性の少なくとも約７０％阻害、よ
り好ましくは約７５％〜８５％、そして最も好ましくは９０％〜９５％以上が達
成されする。この酵素のこのインヒビターについての親和性は好ましくは、酵素
−インヒビター複合体の解離定数、すなわち、Ｋ_iが、約１０^-5Ｍ未満、代表的
には約１０^-6Ｍと１０^-8Ｍとの間であるに充分に強力である。

【００６６】 グリコシルトランスフェラーゼ活性を阻害するなお別の戦術は、目的の特定の
酵素に対して惹起した免疫グロブリン分子を使用することである。例えば、Ｗｈ
ｉｔｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９：２７４０−２７４７（１９９０）を参照の
こと。従って、種々の免疫グロブリン分子の産生および操作のために当業者に利
用可能な多数の技術は、細胞間接着を阻害するために適用され得る。免疫グロブ
リンは、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）₂を含む抗体に加えて種々の形
態でならびに単鎖で存在し得る。

【００６７】 この酵素に結合する抗体は、種々の手段によって生成され得る。非ヒト（例え
ば、マウス、ウサギ、ウマなどの）モノクローナル抗体の生成は周知であり、そ
して例えば、動物にグリコシルトランスフェラーゼまたはキャリアに結合体化し
たそのフラグメントを免疫することにより達成され得る。免疫した動物から得ら
れる抗体産生細胞は、不死化およびスクリーニングされるか、またはこの酵素と
その基質との相互作用を阻害する抗体の生成について最初にスクリーニングされ
、次いで不死化される。モノクローナル抗体生成の一般的手順の考察については
、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照のこと。

【００６８】 酵素阻害は一般に、酵素によって触媒される反応速度を低減させるような基質
とその酵素との間の相互作用を含む。インヒビターは、多数の基準によって分類
され得る。例えば、インヒビターは、可逆性または不可逆性であり得る。不可逆
性インヒビターは、いくらかあったとしてもその標的酵素から非常にゆっくりと
解離する。なぜなら、不可逆性インヒビターは、その酵素に対して共有結合また
は非共有結合のいずれかで非常に強固に結合するようになるからである。対照的
に、可逆的阻害は、解離し得る酵素−インヒビター複合体を含む。

【００６９】 インヒビターはまた、競合的、非競合的または不競合的インヒビターであるか
否かに従って分類され得る。単一の基質を含む反応速度的に単純な系についての
競合的阻害では、酵素は、基質またはインヒビターのいずれかに結合し得るが両
方には結合し得ない。代表的には、競合インヒビターは、基質または産物に似て
おり、そして酵素の活性部位に結合し、従って、基質が活性部位に結合するのを
ブロックする。競合インヒビターは、その酵素についての基質の親和性を有効に
低減することによって触媒速度を減少させる。代表的には、酵素は、平衡要件に
起因してそれ自体の産物によって競合的に阻害され得る。この酵素は触媒である
ので、反応を正方向または逆方向に加速することが原則的に可能である。

【００７０】 非競合的インヒビターは、酵素がそのインヒビターに結合するのと同時に基質
に結合するのを可能にする。非競合的インヒビターは、遊離の酵素の比を減らす
のではなく、酵素の代謝回転数を減少させることによって作用する。別の可能な
カテゴリーの阻害は、混合型または不競合的阻害である。ここでは、インヒビタ
ーが、結合部位に影響を与え、そしてまたこの酵素の代謝回転数を変更する。１
より多くの基質を含む反応速度的に複雑な系の酵素阻害は、グリコシルトランス
フェラーゼについての場合と同様、Ｓｅｇｅｌ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃ
ｓに記載される（Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．１９７５）。

【００７１】 Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ活性およびその阻害または増強は代表的に、酵素活性
を決定するための標準的方法に従ってアッセイされる。酵素アッセイの一般的考
察については、Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏ，「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎ
ｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ，第１８２巻，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（
Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら，１９９０）を参照のこと。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ活性
についてのアッセイは代表的に、生理学的ｐＨに調整された緩衝化溶液、二価カ
チオンの供給源、ドナー基質（通常、標識されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、アク
セプター基質（例えば、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ）、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−
Ｔ、およびその阻害活性が試験されるべきサンプルまたはサンプルの画分を含む
。２３℃または３７℃にて所定の時間後、反応を停止させ、そしてシアリル化産
物を単離し、そして標準的方法に従って（例えば、シンチレーションカウンター
において）測定する。

【００７２】 （Ｂ．グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子発現の阻害） グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子発現の阻害は、阻害性核酸の使用によっ
て達成され得る。阻害性核酸は、相補的核酸配列に特異的に結合し得る単鎖核酸
であり得る。適切な標的配列に結合することにより、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−
ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡの二重鎖または三重鎖が形成される。これらの核酸
はしばしば、「アンチセンス」と呼ばれる。なぜなら、これらは通常、遺伝子の
センス鎖すなわちコード鎖に相補的であるからである。とはいえ、近年、「セン
ス」核酸の使用についてのアプローチもまた開発された。本明細書中で使用され
る場合、用語「阻害性核酸」とは、「センス」および「アンチセンス」の両方の
核酸をいう。

【００７３】 １つの実施形態では、阻害性核酸は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔをコードする標
的核酸に特異的に結合し得る。このような阻害性核酸の投与は、コア２オリゴサ
ッカリドの生合成を低減または排除することにより、Ｂリンパ球媒介性免疫応答
を阻害し得る。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔをコードするヌクレオチド配列は、ヒト
ｃＤＮＡ（ＢｉｅｒｈｕｉｚｅｎおよびＦｕｋｕｄａ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３２６−９３３０；ＧｅｎＢａ
ｎｋ登録番号ｍ９７３４７）を含むいくつかの種について公知である。ヒト遺伝
子は、Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら（１９９５）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．５：４１７−
４２５；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ４１４１５に記載される。これらのヌクレオ
チド配列から、適切な阻害性核酸を誘導し得る。

【００７４】 標的核酸に結合させることにより、阻害性核酸は、標的核酸の機能を阻害し得
る。例えば、これは、ｍＲＮＡへのＤＮＡの転写、プロセシングもしくはポリ（
Ａ）付加、ＤＮＡの複製、翻訳のブロック、または細胞阻害機構の促進（例えば
、ＲＮＡ分解の促進）の結果であり得る。それゆえ、阻害性核酸方法は、異なる
機構によって作動する特定の遺伝子の発現を変更する多数の異なるアプローチを
含む。これらの異なる型の阻害性核酸技術は、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．およびＴｏｕ
ｌｍｅ，Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１０
４９：９９−１２５に記載される。

【００７５】 阻害性核酸治療アプローチは、ＤＮＡ配列を標的とするアプローチ、ＲＮＡ配
列（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）を標的とするアプローチ、タンパク質
を標的とするアプローチ（センス鎖アプローチ）、および標的核酸の切断または
化学修飾を引き起こすアプローチへと分類され得る。

【００７６】 ＤＮＡを標的とするアプローチは、いくつかのカテゴリーに分けられる。核酸
は、二重鎖ＤＮＡの主溝に結合して三重らせん、すなわち「三重鎖」構造を形成
するように設計され得る。あるいは、阻害性核酸は、複製または転写の間の二重
鎖ＤＮＡの開口から生じる一本鎖ＤＮＡの領域に結合するように設計される。Ｈ
ｅｌｅｎｅおよびＴｏｕｌｍｅ、前出を参照のこと。

【００７７】 より通常には、阻害性核酸は、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体に結合するよう
に設計される。阻害性核酸は、プレｍＲＮＡの成熟を妨害するために用いられる
。阻害性核酸は、ＲＮＡのプロセシング、スプライシングまたは翻訳を妨害する
ように設計され得る。阻害性核酸はしばしば、ｍＲＮＡに対して標的化される。
このアプローチでは、阻害性核酸は、コードされるタンパク質の翻訳を特異的に
ブロックするように設計される。このアプローチを用いて、阻害性核酸は、重要
なタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳の阻害によって特定の細胞機能を選択
的に抑制するように用いられ得る。例えば、標的ｍＲＮＡ領域に相補的な阻害性
アンチセンス核酸は、タンパク質発現を阻害する。例えば、Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ
Ｅ．Ｌ．ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５：１０２８−１０３２およびＨａｒｅｌ−Ｂｅｌｌａｎら（１９８８）Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，１６８：２３０９−２３１８を参照のこと。Ｈｅｌｅｎｅおよび
Ｔｏｕｌｍｅに記載されるように、ｍＲＮＡを標的化する阻害性核酸は、コード
されるタンパク質の翻訳を阻害するようにいくつかの異なる機構によって作動す
ることが示されている。

【００７８】 細胞に導入される阻害性核酸はまた、ｍＲＮＡ翻訳に関与する酵素または結合
タンパク質を捕獲または競合する遺伝子またはｍＲＮＡの「センス」鎖を含み得
る。ＨｅｌｅｎｅおよびＴｏｕｌｍｅを参照のこと。

【００７９】 最後に、阻害性核酸を用いて、標的の遺伝子またはｍＲＮＡの化学的不活化ま
たは切断を誘導し得る。化学的不活化は、細胞内での阻害性核酸と標的核酸との
間の架橋の誘導により生じ得る。あるいは、不可逆的光化学反応が、阻害性核酸
に付着した光反応性基によって標的核酸において誘導され得る。適切に誘導体化
された阻害性核酸によって誘導される標的核酸の他の化学修飾もまた用いられ得
る。

【００８０】 標的核酸の切断、それゆえ、不活化は、切断反応を誘導するように活性化され
得る阻害性核酸に置換基を付着させることによってもたらされ得る。置換基は、
化学的切断、光反応性切断、または酵素的切断のいずれかをもたらす置換基であ
り得る。例えば、ｍＲＮＡ：アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッドを、
ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを消化するヌクレアーゼと接触させ得る。あるい
は、切断は、リボザイムまたは触媒性ＲＮＡの使用によって誘導され得る。この
アプローチでは、阻害性核酸は、天然に存在するＲＮＡ（リボザイム）または触
媒活性を有する合成核酸のいずれかを含む。

【００８１】 他の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、トランス
活性化因子が遺伝子発現を誘導する能力をブロックする薬剤の投与によって阻害
される。例えば、腫瘍壊死因子α、インターロイキン−１、グルココルチコイド
（例えば、デキサメタゾン）、レチノイン酸およびいくつかの肝臓転写因子（例
えば、ＨＮＦ−１、ＤＢＰおよびＬＡＰ）のトランス活性化活性を妨害する薬剤
を投与し得る。

【００８２】 これらの細胞表面上の標的化分子結合レセプターとの結合体化による免疫系の
特定の細胞への阻害性核酸の標的化は、上記の形態の阻害性核酸治療の全てにつ
いて用いられ得る。

【００８３】 （Ｃ．コア２オリゴサッカリド媒介結合をブロックする化合物） 本発明はまた、コア２オリゴサッカリドとそのオリゴサッカリドについてのリ
ガンドとの間の相互作用をブロックする化合物が投与される、炎症を調節する方
法を提供する。例えば、コア２オリゴサッカリドに特異的に結合する抗体または
レクチンを投与し得る。炎症細胞と関連しない（例えば、遊離多糖として存在す
る）レセプターは、炎症細胞関連コア２オリゴサッカリドとそれらの細胞レセプ
ターとの間の相互作用をブロックするために用いられ得る。他の化合物（例えば
、本明細書中に記載される方法を用いて道程される低分子）もまた投与され得る
。

【００８４】 （ＩＩ．スクリーニング方法） コア２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ活性を阻害または増強する能力について種々の化合
物および化合物の混合物をスクリーニングすることによって治療的に有効な調節
剤である化合物をさらに試験するために適切であるリード化合物を、またはコア
２オリゴサッカリドに結合しかつリガンドがそのレセプターに結合するのを防止
するリード化合物を同定し得る。試験は、最小コア２オリゴサッカリド、または
さらなる糖残基が付加された改変されたコア２オリゴサッカリドのいずれかを用
いて行われ得る。例えば、リード化合物がＳＬｅ^x含有コア２オリゴサッカリド
に結合する能力を試験し得る。

【００８５】 所望の活性を有する天然に存在する化合物を発見するためのスクリーニングア
ッセイの使用は周知であり、そして何年もの間広範に用いられている。例えば、
抗生物質活性を有する多くの化合物は、このアプローチを用いて元々同定された
。このような化合物の例としては、モノラクタム（ｍｏｎｏｌａｃｔａｍ）およ
びアミノグリコシド抗生物質が挙げられる。種々の酵素活性を阻害する化合物（
例えば、コレステロール合成に関与する酵素であるヒドロキシメチルグルタミル
補酵素Ａレダクターゼのインヒビターである、メビノリン、ロバスタチンおよび
メバコア（ｍｅｖａｃｏｒ））はまた、この技術によって見出されている。グリ
コシルトランスフェラーゼ活性を阻害する抗生物質（例えば、ツニカマイシンお
よびストレプトビルジン）もまた、この様式で同定された。

【００８６】 従って、本発明の別の重要な局面は、グリコシルトランスフェラーゼ調節活性
についてサンプルをスクリーニングするための方法に関する。本明細書中で使用
される場合、「サンプル」は、グリコシルトランスフェラーゼアッセイにおいて
試験するために適切な任意の混合物であり得る。代表的なサンプルは、合成によ
って生成される化合物の混合物あるいは天然に存在する混合物（例えば、細胞培
養ブロス）を含む。適切な細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、微生物細胞
または植物細胞のような任意の培養細胞が挙げられる。微生物細胞培養は、細菌
、原生動物、酵母、真菌などのような任意の微視的な生物からなる。

【００８７】 代表的なスクリーニングアッセイでは、サンプル（例えば、真菌ブロス）は、
標準的なグリコシルトランスフェラーゼアッセイに添加される。コントロールア
ッセイと比較して活性の阻害または増強が見出された場合、この混合物は通常分
画されて、活性の阻害または増強を提供するサンプル成分が同定される。このサ
ンプルは、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
、電気泳動、限外濾過、ＨＰＬＣなどのような標準的方法を用いて分画される。
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９８２）を
参照のこと。次いで、各単離された画分は、活性の阻害または増強について試験
される。所望の場合、次いでこの画分は、さらに細分画され、そして試験される
。この細分画（ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎ）および試験手順は、所望により何回で
も繰り返され得る。

【００８８】 種々の標準的精製方法を合わせることにより、インビボでの治療試験に適切な
実質的に純粋な化合物が入手され得る。本明細書中に定義されるような実質的に
純粋な調節剤は、標準的な電気泳動条件下で主に単一バンドとして、またはクロ
マトグラフィーカラムでモニタリングした場合に主に単一ピークとして移動する
、阻害増強化合物または活性増強化合物である。より詳細には、実質的に純粋な
調節剤の組成物は、１０％未満の種々雑多な化合物を含む。

【００８９】 Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ活性またはコア２オリゴサッカリド結合に対する効果
をアッセイして、免疫応答の適切なモジュレーターを同定することに加えて、炎
症に対する効果を直接試験し得る。炎症についての標準的なアッセイは、チオグ
リコレートの注射による腹膜炎の誘導である。

【００９０】 好ましい実施形態では、アッセイは、アッセイ工程を自動化し、そして任意の
便利な供給源からの化合物をアッセイ（代表的には並行して行われる）に（例え
ば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレートでのマイクロタイター
形式）提供することにより、大きな化学ライブラリーをスクリーニングするよう
に設計される。

【００９１】 示したように、本発明は、高処理能力形式での、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性
についてのインビトロアッセイを提供する。記載したアッセイ形式の各々につい
て、モジュラーを含まない「モジュレーターなし」のコントロール反応物は、コ
ア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性のバックグラウンドレベルを提供する。本発明の高処
理能力アッセイでは、１日において７０００までの異なるモジュレーターをスク
リーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェル
を用いて潜在的な選択されたモジュレーターに対して別のアッセイを行い得るか
、または濃度もしくはインキュベーション時間の効果が観察されるべき場合には
、５〜１０毎のウェルが単一のモジュレーターを試験し得る。従って、単一の標
準的マイクロタイタープレートが、約１００（９６）モジュレーターをアッセイ
し得る。１５３６ウェルプレートを用いるならば、単一プレートは、約１００〜
約１５００の異なる化合物を容易にアッセイし得る。１日あたり多くの異なるプ
レートをアッセイすることが可能である；約６，０００〜２０，０００まで、そ
してさらに約１００，０００から１，０００，０００の異なる化合物までのアッ
セイスクリーニングが、本発明の一体型システムを用いて可能である。

【００９２】 いくつかのアッセイでは、陽性コントロールを有して、アッセイの成分が適切
に作用することを確実にすることが望ましい。例えば、コア２ＧｌｎＮＡｃＴ活
性の公知のモジュレーターは、アッセイの１つのサンプルと共にインキュベート
され得、そしてシグナルにおいて得られる増加または減少が本明細書中の方法に
従って決定され得る。

【００９３】 本質的に任意の化合物は、本発明の方法において使用するための、Ｃ２ Ｇｌ
ｎＮＡｃ−Ｔ活性の潜在的なモジュレーターとして試験され得る。最も好ましい
のは一般に、水溶液または有機（特に、ＤＭＳＯベースの）溶液に溶解され得る
化合物が用いられることである。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ａｌ
ｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ａ
ｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などを含む、化学化
合物の多くの供給業者が存在することが認識される。

【００９４】 １つの好ましい実施形態では、Ｃ２ ＧｌｃＮＡＣＴ活性またはコア２オリゴ
サッカリドへの結合のモジュレーターは、潜在的な多数の治療化合物（潜在的な
モジュレーター化合物）を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニング
することにより同定される。このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」
は、本明細書中に記載のように、１以上のアッセイにおいてスクリーニングされ
て、所望の特徴的活性を提示するライブラリーメンバー（特定の化学種またはサ
ブクラス）が同定され得る。このようにして同定された化合物は、従来の「リー
ド化合物（ｌｅａｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」として供され得るか、またはそれら
自体が潜在的な治療剤もしくは実際の治療剤として用いられ得る。

【００９５】 コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬のような多数の化学的「構築ブロ
ック」を組み合わせることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかによ
って作製された多様な化学化合物の収集物である。例えば、ポリペプチドライブ
ラリーのような直鎖状コンビナトリアル化学ライブラリーは、化学的構築ブロッ
ク（アミノ酸）のセットを全ての可能な方法で所定の化合物長（すなわち、ポリ
ペプチド化合物におけるアミノ酸の数）について組み合わせることにより、形成
される。数百万の化学化合物は、化学的構築ブロックのこのようなコンビナトリ
アル混合によって合成され得る。

【００９６】 コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に
周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、以下が挙
げられるがこれらに限定されない：ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第
５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ
．３７：４８７−４９３（１９９３）およびＨｏｕｇｈｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ
３５４：８４−８８（１９９１）を参照のこと）。化学的多様性ライブラリー
を作製するための他の化学反応もまた用いられ得る。このような化学としては、
以下が挙げられるがこれらに限定されない：ペプトイド（ＰＣＴ公開第ＷＯ９１
／１９７３５）、コードペプチド（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２０２４２）、ランダ
ムバイオオリゴマー（ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン
（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよび
ジペプチドのようなダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓら，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９−６９１３（
１９９３））、ビニローグ性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら，Ｊ．Ａｍｅｒ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、β−Ｄ−グルコース骨
格（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）を有する非ペプチダルペプチド模倣物（ｎｏｎｐ
ｅｐｔｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら，
Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））
、類似の有機合成の低分子化合物ライブラリー（Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈ
ｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３（１９９３））、および／またはペプ
チジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５
８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ、ＢｅｒｇｅｒおよびＳ
ａｍｂｒｏｏｋ、全て前出を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば
、米国特許第５，５３９，０８３号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば
、Ｖａｕｇｈｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）３
０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）
、炭水化物ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１
５２０−１５２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号を参照の
こと）、低分子有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ
Ｃ＆ＥＮ，１月１８日，３３頁（１９９３）；イソプレノイド（米国特許第５，
５６９，５８８号）；チアゾリジノン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）および
メタチアザノン（ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅ）（米国特許第５，５４９，９
７４号）；ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９
，１３４号）；モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号）；ベンゾ
ジアゼピン（５，２８８，５１４）などを参照のこと）。

【００９７】 コンビナトリアルライブラリーの調製のためのデバイスは市販されている（例
えば、３５７ＭＰＳ，３９０ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ，
Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ
，ＭＡ、４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ
ｉｔｙ，ＣＡ、６０５０ Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍ
Ａを参照のこと）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が市販さ
れている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．、Ａｓｉ
ｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ、ＣｈｅｍＳｔａｒ、Ｌｔｄ．Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ、３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ，Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤなどを参照のこと）。

【００９８】 （ＩＩＩ．本発明の治療用途および診断用途） 本発明の組成物および方法を治療的に用いて、炎症のような種々の状態に関連
したグリコシルトランスフェラーゼ活性（例えば、Ｃ２ ＧｌｎＮＡｃ−Ｔ）を
選択的に阻害または増強し得る。本発明をまた用いて、例えば、急性炎症疾患お
よび慢性炎症疾患のような有害な炎症応答を阻害し得る。急性炎症疾患の代表的
な例としては、虫垂炎、扁桃炎、遅延型過敏症反応、敗血症に起因する炎症、皮
膚の炎症および虚血再灌流障害が挙げられる。慢性炎症疾患の代表的な例は、慢
性間接リウマチである。

【００９９】 治療適用では、本発明のグリコシルトランスフェラーゼインヒビターは、不適
切なまたは望ましくない免疫応答に既に罹患している個体に投与される。グリコ
シルトランスフェラーゼインヒビターまたはコア２グリカンに結合してコア２グ
リカンをブロックする薬剤を含む組成物は、望ましくない免疫応答を抑制し、そ
して症状および／または合併症を治療するかまたは少なくとも部分的に休止させ
るに充分な量で患者に投与される。これを達成するために適切な量は、「治療有
効用量」として定義される。この用途のために有効な量は、例えば、インヒビタ
ー組成物、投与様式、処置されるべき疾患の段階および重篤度、患者の体重およ
び全身的健康状態、ならびに処方医の判断に依存する。

【０１００】 あるいは、１以上のグリコシルトランスフェラーゼインヒビターの発現を阻害
する、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、アンチセンス核酸、またはグリコシルトラ
ンスフェラーゼの発現もしくは活性をブロックするペプチドをコードする核酸）
を患者に導入して、阻害を達成し得る。米国特許第５，５８０，８５９号は、核
酸がコードする遺伝子の発現を得るための細胞への裸の核酸の注射の使用を記載
する。

【０１０１】 本発明はまた、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性の減少と関連した状態を処置する方
法を提供する。例えば、いくつかの型の癌が、ＳＴ３ ＧＡｌ Ｉまたは他のシ
アリルトランスフェラーゼによるシアル酸残基の付加に起因して短縮される一連
のＯグリカンである、Ｔ抗原の存在によって特徴付けている。新生オリゴサッカ
リドに対するシアル酸の付加は、正常に存在するオリゴサッカリド構造の合成を
妨害する。本発明は、患者におけるＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性の活性を増加させ
ることによって、これらの異常に終結したＴ抗原の頻度を減少させる方法を提供
する。増加したＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性は、シアリルトランスフェラーゼにつ
いてのアクセプター基質を改変し得、従って、シアリルトランスフェラーゼが作
用できない際には、推定のアクセプターをオリゴサッカリドへと変換させる。

【０１０２】 治療有効量の本発明のグリコシルトランスフェラーゼインヒビターまたはエン
ハンサー化合物は、（治療投与または予防投与である）最初の投与については、
７０ｋｇの患者について一般に約１．０ｍｇ〜約１０ｇ、通常約１０ｍｇ〜約５
ｇ、そして好ましくは約２ｍｇと約１ｇとの間のグリコシルトランスフェラーゼ
インヒビターの範囲である。これらの用量には、免疫系の活性を測定することに
より、患者の応答および状態に依存して、数週間から数ヶ月にわたる反復投与が
続き得る。

【０１０３】 本発明の組成物が深刻な疾患状態、すなわち、生命を脅かすかまたは生命を脅
かす可能性のある状況で用いられ得ることを覚えておかねばならない。このよう
な場合、外来物質の最小化およびインヒビターの相対的非毒性性質を考慮すると
、治療医がかなり過剰なこれらの組成物を投与することが可能であり、そして望
ましく感じられ得る。

【０１０４】 予防的用途については、投与は、危険群に与えられるべきである。治療的投与
は、免疫障害の場合、疾患の最初の徴候で、または検出で、または診断のすぐ後
に始められ得る。これにはしばしば、少なくとも症状が実質的に軽減されるまで
、およびその後一定の期間にわたって反復投与が続き得る。

【０１０５】 治療的または予防的処置のための薬学的組成物は、非経口、局所、経口または
局所投与が意図される。代表的には、薬学的組成物が、非経口的に（例えば、静
脈内に、皮下に、皮内にまたは筋肉内に）投与される。本発明の組成物はまた、
経口投与に適切である。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは水
生キャリア）中に溶解または懸濁したグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤の溶
液を含む経口投与のための組成物を提供する。種々の水性キャリア（例えば、水
、緩衝化水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など）が用
いられ得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得るか
、または滅菌濾過され得る。得られる水溶液は、投与前に滅菌溶液と合わされて
凍結乾燥調製物として使用されるために包装され得るかまたは凍結乾燥され得る
。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされるような薬学的に受容可
能な補助物質（例えば、ｐＨ調節および緩衝化剤、張度調節剤、湿潤剤など）（
例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩
化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートな
ど）を含み得る。

【０１０６】 薬学的処方物における本発明のグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤の濃度は
、広範に、すなわち、約０．１重量％未満、通常少なくとも約２重量％以下から
２０重量％〜５０重量％以上という高さまで変動し得、そして選択される特定の
投与形態に合わせて主に溶液の用量、粘度などによって選択される。

【０１０７】 本発明のグリコシルトランスフェラーゼインヒビターはまた、特定の組織（例
えば、リンパ組織）に対して結合体を標的化するために役立つリポソームを介し
て投与され得るかまたは感染された細胞に対して選択的に標的化され得、ならび
にペプチド組成の半減期を増加させ得る。リポソームとしては、エマルジョン、
発泡体、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、層状層などが挙げられる
。これらの調製物では、送達されるべきペプチドは、リポソームの一部として、
単独でまたは例えば、リンパ系細胞において優勢なレセプターに結合する分子（
例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）と共に、または他の治療
的もしくは免疫原性組成物と共に取り込まれる。従って、所望のペプチドまたは
本発明の結合体が充填されたリポソームは、リンパ系細胞の部位へと指向され得
、次いで、ここでリポソームは、選択されたグリコシルトランスフェラーゼイン
ヒビター組成物を送達する。本発明における使用のためのリポソームは、標準的
な小胞形成脂質から形成され、これは一般に、中性のリン脂質および負に荷電し
たリン脂質ならびにステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択
は一般に、例えば、リポソームのサイズ、血流中でのリポソームの酸不安定性お
よび安定性を考慮することにより導かれる。リポソームを調製するために、例え
ば、Ｓｚｏｋａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６
７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号
および同第４，８３７，０２８号に記載されるような、種々の方法が利用可能で
ある。

【０１０８】 種々の標的化剤を用いるリポソームの標的化は、当該分野で周知である（例え
ば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号を参照の
こと）。免疫細胞に対して標的化するために、リポソームに取り込まれるべきリ
ガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な、抗体または
そのフラグメントを含み得る。ペプチドまたは結合体を含むリポソーム懸濁物は
、とりわけ、投与形態、送達されるべき結合体、および処置されるべき疾患の段
階に従って変動する用量で、静脈内、局所、局部などに投与され得る。

【０１０９】 固体組成物については、従来の非毒性固体キャリア（例えば、薬学的グレード
のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリ
ンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシ
ウムなどを含む）が用いられ得る。経口投与については、薬学的に受容可能な非
毒性組成物は、以前に列挙されたキャリアのような通常用いられる賦形剤のいず
れか、および一般に１０〜９５％の、そしてより好ましくは２５％〜７５％の活
性成分、すなわち、本発明の１以上の結合体を取り込むことにより形成される。

【０１１０】 エアロゾル投与については、インヒビターを、好ましくは、界面活性剤および
噴霧剤とともに適切な形態で供給する。グリコシルトランスフェラーゼインヒビ
ターの代表的パーセンテージは、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１％
〜１０％である。この界面活性剤は、当然ながら、無毒でなければならず、そし
て好ましくは噴霧剤に可溶性である。このような薬剤の代表は、脂肪族多価アル
コールまたはその環状無水物を有するカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パ
ルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック（ｏｌｅ
ｓｔｅｒｉｃ）酸およびオレイン酸のような、６〜２２個の炭素原子を含む、脂
肪酸のエステルまたは部分的エステルである。混合されたグリセリドまたは天然
のグリセリドのような混合されたエステルが使用されてもよい。この界面活性剤
は、組成物の重量の０．１％〜２０％、好ましくは０．２５〜５％を構成し得る
。組成物の残りは通常は噴霧剤である。このキャリアはまた、所望の場合、例え
ば、鼻腔内送達のための、レシチンのように含まれ得る。

【０１１１】 本発明はまた、患者由来のサンプル中のコア２グリカンのレベルを検出するこ
とによる炎症をモニタリングする方法を提供する。これは、所望の炭水化物構造
の検出のための標準的方法に従って実施され得る。例えば、コア２グリカンか、
またはコア２グリカンのアクセプター基質に結合する検出部分は、コア２グリカ
ンがこのサンプル中に存在するか否かを検出するために用いられる。

【０１１２】 代表的な実施形態において、この検出部分は、検出可能標識で標識される。こ
の検出可能標識は、一次標識（ここでこの標識は、直接検出されるエレメント、
または直接検出可能なエレメントを生成するエレメントを含む）または二次標識
（ここで、検出される標識は、免疫学的標識化において一般的であるとおり、一
次標識に結合する）であり得る。標識への導入、標識化手順、および標識の検出
は、ＰｏｌａｋおよびＶａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ（１９９７）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔ
ｒｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹおよびＨａｕｇｌａｎｄ（１９９６）Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅ
ｕｇｅｎｅ，ＯＲにより公表されたハンドブックおよびカタログの組み合わせ）
において見出される。一次標識および二次標識は、未検出のエレメントおよび検
出されたエレメントを含み得る。本発明における有用な一次標識および二次標識
は、蛍光色素のようなスペクトル標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）およびＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^TM、のようなフルオレセイン
および誘導体、ローダミンおよび誘導体（例えば、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、テトラ
ロージミン（ｔｅｔｒａｒｈｏｄｉｍｉｎｅ）イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ
）など）、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙ
ｅｓ^TM、など）、放射性標識（例えば、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³³Ｐな
ど）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼな
ど）、コロイド金もしくは有色ガラスのようなスペクトル比色標識、またはプラ
スチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズ
を含み得る。この標識は、当該分野で周知の方法による検出アッセイの成分（例
えば、検出試薬）に直接または間接的に結合し得る。上記に示すように、広範な
種々の標識が用いられ得るが、標識の選択は、必要な感度、化合物との結合体化
の容易さ、安定性要件、利用可能な装置および廃棄可能な設備に依存する。

【０１１３】 好ましい標識としては、以下を用いる標識が挙げられる：１）例えば、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ，およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲ
Ｌから入手可能なキットと、上記の崩壊産物として光子を生じる基質を用いる化
学発光（西洋ワサビペルオキシダーゼまたはルシフェラーゼを用いる）；２）着
色産物（着色沈殿を生じる基質と、西洋ワサビペルオキシダーゼおよび／または
アルカリホスファターゼの両方を用いる［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍから入
手可能なキット］）；３）例えば、アルカリホスファターゼおよび基質Ａｔｔｏ
Ｐｈｏｓ［Ａｍｅｒｓｈａｍ］、または蛍光産物を産生する他の基質を用いる、
半蛍光（ｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、４）蛍光（例えば、Ｃｙ−５［
Ａｍｅｒｓｈａｍ］を用いる）、フルオレセイン、および他の蛍光タグ］；５）
放射能。標識化および検出のための他の方法は、当業者に容易に明白である。

【０１１４】 本発明の試薬を検出するために結合体化され得る好ましい酵素としては、例え
ば、ルシフェラーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。ルシフェ
ラーゼの化学発光基質は、ルシフェリンである。アルカリホスファターゼ基質の
実施形態としては、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）（分光光度計
で検出される）；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニト
ロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）および変色しない（ｆａｓｔ）レ
ッド／ナフトール（ｎａｐｔｈｏｌ）ＡＳ−ＴＲホスフェート（視覚的に検出さ
れる）ならびに４−メトキシ−４−（３−ホスホノフェニル）スピロ［１，２−
ジオキセタン−３，２’−アダマンタン］（照度計で検出される）が挙げられる
。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質の実施形態としては、２，２’アジノ−ビス
（３−エチルベンズチアゾリン−６スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリ
チル酸（５ＡＳ）、ｏ−ジアニシジン、およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ
）（分光光度計で検出される）；ならびに３，３，５，５’−テトラメチルベン
ジジン（ＴＭＢ）、３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３−アミノ−９−
エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、および４−クロロ−１−ナフトール（４Ｃ１Ｎ
）（視覚的に検出される）が挙げられる。他の適切な基質が当業者に公知である
。

【０１１５】 一般に、特定の標識をモニターする検出器が、標識を検出するために用いられ
る。代表的な検出器としては、分光光度計、光電管およびフォトダイオード、顕
微鏡、シンチレーションカウンター、カメラ、フィルムなど、ならびにそれらの
組み合わせが挙げられる。適切な検出器の例は、当業者に公知の種々の商業的供
給源から広範に入手可能である。通常、結合した標識部分を含む基質の光学的画
像が引き続くコンピューター分析のためにデジタル化される。

【０１１６】 本発明の方法における使用に適切な市販の検出部分としては、α２，３シアリ
ルガラクトシドのために、ＳＮＡ−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）レクチン（ＦＬ−１３０１、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂ
ｕｒｌｉｎｇａｍｅ ＣＡ）およびビオチン化ＳＮＡレクチン（Ｂ−１３０５、
Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が挙げられる。α２，６シアリルガ
ラクトシドの検出のためには、ＭＡＬ ＩＩ−ＦＩＴＣレクチンおよびビオチン
化ＭＡＩＬ ＩＩレクチン（Ｂ−１２６５，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）が適切な検出部分の例である。

【０１１７】 有効な抗炎症処置は、患者から得られたサンプル（例えば、好中球）中のコア
２グリカンの存在の低減により示される。あるいは、特定のグリコシルトランス
フェラーゼ活性のレベルを検出するための方法が用いられ得る。Ｃ２ ＧｌｃＮ
Ａｃ−Ｔのようなグリコシルトランスフェラーゼを検出するための標準的アッセ
イは、本明細書において記載されている。また、有効な抗炎症処置は、特定のグ
リコシルトランスフェラーゼの活性の実質的な低減により示される。本明細書に
おいて用いる場合、適切なコア２グリカンレベルまたはグリコシルトランスフェ
ラーゼ活性の「実質的な低減（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）
」は、未処置のコントロールと比べた、試験サンプル中の少なくとも約３０％の
低減をいう。好ましくは、この低減は、少なくとも約５０％、より好ましくは少
なくとも約７５％であり、そして最も好ましくはコア２グリカンまたはＣ２ Ｇ
ｌｃＮＡｃ−Ｔレベルは、未処置のコントロールに比べて、処置された哺乳動物
由来のサンプル中で少なくとも約９０％低減する。

【０１１８】 （ＩＶ．Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔを欠くトランスジェニック動物） 本発明はまた、動物の野生型細胞で見出される少なくとも１つのＣ２ Ｇｌｃ
ＮＡｃ−Ｔ遺伝子を欠く細胞を含む、キメラおよびトランスジェニックの非ヒト
動物、ならびにこのような動物を産生する方法を提供する。これらの動物は、コ
ア２オリゴサッカライドが炎症および他の効果に影響する機構の研究を含む、い
くつかの目的のために有用である。このような「ノックアウト」動物はまた、野
生型動物において生成される場合、特定の適用に望ましくないシアル酸残基を保
有する、糖タンパク質および糖脂質を生成するために有用である。

【０１１９】 「キメラ動物」は、機能的Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ遺伝子を欠くいくつかの細
胞および不活性化された遺伝子を有さない他の細胞を含む。これに対し、「トラ
ンスジェニック動物」は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ遺伝子を不活性にする特定の
改変を全てが組み込まれた細胞から構成される。トランスジェニック動物は、そ
の子孫に不活性化されたＣ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ遺伝子を伝達し得るが、キメラ
動物が変異を伝達する能力は、不活性化された遺伝子が動物の生殖細胞に存在す
るか否かに依存する。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ遺伝子を不活性化する改変は、例
えば、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含み得る。改変は、遺
伝子自体の転写、得られたｍＲＮＡの翻訳および／または安定性に干渉し得るか
、または遺伝子が、不活性なＣ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔポリペプチドをコードする
ようにさせ得る。

【０１２０】 本願に係る方法は、ほとんどの脊椎動物種のトランスジェニック動物およびキ
メラ動物を産生するために有用である。このような動物種としては、非ヒト動物
（マウスおよびラット、ウサギのようなげっ歯類、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）および
ヤギ（ｇｏａｔ）のようなヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ブタ（ｐｉｇ）のようなブタ
（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ならびにウシ（ｃａｔｔｌｅ）およびバッファローのよう
なウシ（ｂｏｖｉｎｅ）を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。トラン
スジェニック動物を得る方法は、例えば、Ｐｕｈｌｅｒ，Ａ編、Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌ．１９９
３；Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ編、Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８巻）、１９９
３：およびＰｉｎｋｅｒｔ、ＣＡ編、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９４に記載されている。

【０１２１】 ゲノム中に不活性化されたＣ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ遺伝子を有するトランスジ
ェニック動物またはキメラ動物を得る方法の１つは、受精した卵母細胞を不活性
化改変を含むように改変されたＣ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔコードポリヌクレオチド
を含むベクターと接触させることである。いくつかの動物（例えば、マウス）に
おいては、インビボで受精を行い、そして受精した卵子を外科的に取り出す。他
の動物、特にウシでは、生きた動物または屠場の動物から卵細胞を取り出してこ
の卵子をインビトロで受精させることが好ましい。ＤｅＢｏｅｒら、ＷＯ９１／
０８２１６を参照のこと。インビトロ受精は、改変が実質的に同調的な細胞に導
入されることを可能にする。次いで、受精した卵母細胞を、約１６〜１５０の細
胞を含む、移植前胚が得られるまでインビトロで培養する。胚の１６〜３２細胞
期は、桑実胚と記載されている。３２より多い細胞を含む移植前胚は、胚盤胞と
呼ばれる。これらの胚は、胞胚腔の発達を、代表的には６４細胞期で示す。所望
の場合、胚細胞中の所望の不活性化Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ遺伝子の存在は、当
業者に公知の方法により検出され得る。移植前段階まで受精卵母細胞を培養する
方法は、以下により記載されている：Ｇｏｒｄｏｎら（１９８４）Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：４１４；Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｎ．Ｙ．（１９８６）（マウス胚）；Ｈａｍｍｅ
ｒら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０（ウサギおよびブタの胚）；
Ｇａｎｄｏｌｆｉら（１９８７）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８１：２３〜２
８；Ｒｅｘｒｏａｄら（１９８８）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６６：９４７〜９５
３（ヒツジ胚）およびＥｙｅｓｔｏｎｅら（１９８９）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅ
ｒｔ．８５：７１５〜７２０；Ｃａｍｏｕｓら（１９８４）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．
Ｆｅｒｔ．７２：７７９〜７８５；ならびにＨｅｙｍａｎら（１９８７）Ｔｈｅ
ｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２７：５９６８（ウシ胚）。時に移植前胚は、移植待
ちの期間、凍結保存される。移植前胚は、導入遺伝子が組み込まれる発生の段階
に依存して、トランスジェニック動物またはキメラ動物を誕生させる適切な雌に
移入される。キメラ哺乳動物は、真の生殖系列トランスジェニック動物を形成す
るように交配され得る。

【０１２２】 あるいは、改変されたＣ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ遺伝子は、胚幹細胞（ＥＳ）に
導入され得る。これらの細胞は、インビトロで培養された移植前胚から得られる
。例えば、Ｈｏｏｐｅｒ，ＭＬ，Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：
Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｐｌａｎｎｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ
Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ（Ｍｏｄｅｒｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖ．１
），Ｉｎｔ’ｌ．Ｐｕｂ．Ｄｉｓｔｒｉｂ．，Ｉｎｃ．，１９９３；Ｂｒａｄｌ
ｅｙら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９，２５５〜２５８を参照のこと。形質
転換されたＥＳ細胞を、非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わせる。このＥＳ細胞
は、胚をコロニー形成させ、そしていくつかの胚において、得られたキメラ動物
の生殖系列を形成する。Ｊａｅｎｉｓｃｈ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０
：１４６８〜１４７４を参照のこと。あるいは、生物体を再構築し得るＥＳ細胞
または体細胞（「体細胞性再集団化細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｒｅｐｏｐｕｌａｔ
ｉｎｇ ｃｅｌｌ）」）は、除核された受精卵母細胞への移植のための核の供給
源として用いられ得て、トランスジェニック哺乳動物を生じる。例えば、Ｗｉｌ
ｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０〜８１３を参照のこと。

【０１２３】 レシピエント細胞への改変されたＣ２ ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ遺伝子の導入は、当
業者に公知の方法により達成され得る。例えば、改変された遺伝子は、相同組換
えにより野生型シアリルトランスフェラーゼ遺伝子座に標的化され得る。あるい
は、リイコンビナーゼ系を用いて、目的の遺伝子座の全てまたは一部を欠失し得
る。リコンビナーゼ系の例としては、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘ
系（例えば、Ｇｕら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３〜１０６；Ｔ
ｅｒｒｙら（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．６：３４９〜３５６を
参照のこと）およびＦＬＰ／ＦＲＴ部位特異的組み込み系（例えば、Ｄｙｍｅｃ
ｋｉ（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：６
１９１〜６１９６を参照のこと）が挙げられる。これらの系において、特定のリ
コンビナーゼにより認識される部位は、代表的に欠失されるべき遺伝子の部分に
隣接する位置で、ゲノムに導入される。次いで、この細胞へのリコンビナーゼの
導入は、ゲノムからその組換え部位に隣接されるポリヌクレオチド配列を除去す
る組換えを触媒する。所望の場合、特定の細胞型のみが目的のシアリルトランス
フェラーゼ遺伝子を欠失する動物が得られ得る。例えば、Ｔｓｉｅｎら（１９９
６）Ｃｅｌｌ ８７：１３１７〜２６；Ｂｒｏｃａｒｄら（１９９６）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１０８８７〜１０８９０；Ｗ
ａｎｇら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３
：３９３２〜６；Ｍｅｙｅｒｓら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１３
６〜４１）を参照のこと。

【０１２４】 （実施例） 以下の実施例は、例示のために提供されるが本発明を限定するものではない。

【０１２５】 （実施例１） 哺乳動物のセリン／スレオニンに連結したオリゴサッカリド（Ｏ−グリカン）
は、通常ゴルジ装置酵素コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトラン
スフェラーゼ（Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ）を用いて合成される。コア２ Ｏ−グリ
カンは、ムチン産生およびセレクチンリガンド生合成に必須であると仮定されて
いる。本実施例は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴを欠くマウスが好中球増加およびセレ
クチンリガンドの部分的欠損を有する制限された表現型を示すことを示す。コア
２オリゴサッカリドの減少は、Ｅセレクチン、ＬセレクチンおよびＰセレクチン
を有する基層（ｓｕｂｓｔｒａｔａ）上での好中球ローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ
）、ならびに炎症部位での好中球補充を減少させる。しかし、リンパ節高内皮性
小静脈上のＬセレクチンリガンドの存在の低減は、リンパ球ホーミングに作用し
ない。これらの研究は、コア２オリゴサッカリド生合成がセレクチンの生理学的
役割を区別することを示し、そして骨髄性ホメオスターシスおよび炎症における
Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴの機能を示す。

【０１２６】 （実験手順） （Ａ．Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴの遺伝子標的化および変異マウスの産生） マウスＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴゲノムＤＮＡの単離およびＣｒｅ ｌｏｘＰ組換
えシグナルを保有する標的化ベクターの構築を、以下の記載と同様に成し遂げた
（Ｐｒｉａｔｅｌら（１９９７）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ７：４５〜５６）
。Ｒ１ ＥＳ細胞（Ｎａｇｙら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８４２４〜８４２８）に、１０μｇの直鎖化標的構築物
をエレクトロポレーションし、そして得られたクローンを、ゲノムプローブを用
いるサザンブロッティングによりスクリーニングした。標的ＥＳ細胞に５μｇの
Ｃｒｅ発現プラスミドをエレクトロポレーションし、そしてＣ２ ＧｌｃＮＡｃ
Ｔ^Δ対立遺伝子およびＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^F対立遺伝子を保有するサブクロー
ンを単離した。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^ΔおよびＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Fのキメラ
マウスを、標準的技術（Ｍｅｔｚｌｅｒら（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３：２
０５６〜２０６５）を用いて産生し、そしてヘテロ接合性の子孫およびホモ接合
性の子孫の生成のためのＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドに交雑させた。サザン
ブロットおよびＰＣＲにより、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ対立遺伝子構造を分析した
。欠失領域に隣接するＰＣＲプライマー（Ｗ５’：５’−ＧＧＧ ＴＴＡ ＣＧ
Ｇ ＡＴＧ ＡＧＣ ＴＣＴ ＧＴＧ ＴＣおよびＷ３’：５’−ＣＣＣ ＴＧ
Ｇ ＡＡＧ ＣＡＧ ＧＡＣ ＡＡＴ ＴＣＴ Ｇ−３’）を用いて、野生型Ｃ
２ ＧｌｃＮＡｃＴ対立遺伝子を検出した。これは３０４ｂｐのフラグメントを
生じる。一方、変異対立遺伝子は、２００ｂｐのフラグメントを生じるＷ５’お
よびｌｏｘＰプライマー（Ｍ３’：５’−ＣＴＣ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＴＣ Ｃ
ＣＣ ＧＧＧ ＴＡＣ−３’）を用いて検出した。

【０１２７】 （Ｂ．Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ酵素アッセイおよびオリゴサッカリド分析） 総容量５０μｌ中に、５０ｍＭ Ｍｅｓ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＮＡｃ中０．５μＣｉのＵＤＰ−［³Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、０．１Ｍ Ｇｌｃ
ＮＡｃ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭアクセプター、および正常組織、ヘテロ接
合性のヌル組織またはホモ接合性のヌル組織由来の２５μｌの細胞溶解物、を含
有する酵素アッセイ混合物を３７℃で１時間インキュベートし、続いてＣ１８
Ｓｅｐ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）処理した（ＢｉｅｒｈｕｉｚｅｎおよびＦｕｋ
ｕｄａ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：
９３２６〜９３３０；Ｙｏｕｓｅｆｉら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６６：１７７２〜１７８２）。オリゴサッカリド分析のために、野生型動物ま
たはＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴヌル動物由来の脾細胞を、［³Ｈ］グルコサミン（１
０μＣｉ／ｍｌ）で、２４時間、代謝的に標識し、そして以下に記載の手順に従
って処理した（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６９：４４７３〜４４７９；ＭａｅｍｕｒａおよびＦｕｋｕｄａ（１９９２）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４３７９〜２４３８６）。以前に報告（Ｍ
ａｅｍｕｒａおよびＦｕｋｕｄａ（１９９２）、前出）のとおり、Ｂｉｏ−Ｇｅ
ｌ Ｐ−４ゲル濾過により、Ｏ結合型オリゴサッカリドを、最初に分析した。次
いで、シアリル化Ｏ−グリカンを脱シアリル化し、そしてアミノ結合カラムおよ
び標準的技術（Ｐｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１５
０１〜１５１０）を用いるＨＰＬＣにより分析した。

【０１２８】 （Ｃ．フローサイトメトリー） 脾細胞の単一細胞懸濁液を調製し、そして塩化アンモニウム溶解により赤血球
を除去した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＣＳ）中で抗体（以下）の存在下
で、細胞を４℃で２０分間インキュベートした。ＥセレクチンまたはＰセレクチ
ン結合のため、細胞を０．５μｇ／ｍｌのＦｃ Ｂｌｏｃｋ（抗ＣＤ３２／１６
、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で処理し、次いで５ｍｍ ＥＤＴＡの添加を伴って、
または添加なしにＧｒ−１およびＥセレクチン−ＩｇＭキメラまたはＰセレクチ
ン−ＩｇＭキメラ（Ｍａｌｙら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６：６４３〜６５３）
のいずれかとともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、そし
て適切な場合、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ結合体化二次抗体（Ｓｉｇｍａ）とインキュ
ベートした。用いた抗体は、ＣＤ１１ａ（Ｍ１７／４）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７
０）、ＣＤ１８（Ｃ７１／１６）、ＣＤ２２（Ｃｙ３４．１）、ＣＤ２４（Ｍ１
／６９）、ＣＤ４３（Ｓ７および１Ｂ１１）、ＣＤ４５（３０−Ｆ１１）、ＣＤ
４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、およびＧ
ｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）であった。抗ＰＳＧＬ−１
抗体である４ＲＡ１０は、Ｄ．Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ博士の寄贈によるものである
。ＣＥＬＬＱＵＥＳＴ^TMソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を
用いるＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリーで、データを分析した。

【０１２９】 （Ｄ．血液学） メトキシフルランで麻酔したマウスの尾静脈から、ＥＤＴＡ被覆ポリプロピレ
ンミクロチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に血液を収集した。
赤血球、白血球および血小板の細胞数および形態学の分析を、手動で、そして正
常マウス血液で較正したＣＥＬＬ−ＤＹＮ ３５００（ＵＣＳＤ Ｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｉｌｌｃｒｅｓｔ）を用いて、行った。

【０１３０】 （Ｅ．骨髄前駆細胞アッセイ） 野生型またはＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴヌルマウスの大腿骨から、ＰＢＳ中の２％
ＦＢＳを用いて骨髄を流出（ｆｌｕｓｈ）させ、そして２５ｇの注射針を通して
穏やかに吸引することにより単一細胞懸濁液を調製した。１．５×１０⁴有核細
胞を、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｍ３４３４（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）において三連で３５ｍｍシャーレ中にプレートした。３７
℃、５％ＣＯ₂で１０〜１２日間、シャーレをインキュベートし、そして光学顕
微鏡を用いてコロニーを数え上げた。

【０１３１】 （Ｆ．白血球ローリング） 可溶性のマウスＥセレクチン−ＩｇＧキメラ分子、マウスＰセレクチン−Ｉｇ
Ｇキメラ分子およびマウスＬセレクチン−ＩｇＧキメラ分子を、ポリスチレンシ
ャーレ上で被覆し、そして並行プレートフローチャンバ（ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｅｒｙｌａｎｄ）中でアセンブルした。野生型マウス、
Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Δ/ΔマウスまたはＦｕｃＴ−ＶＩＩ^-/-マウス由来の好中
球を、ローリング培地である、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２を補充した、
カルシウムおよびマグネシウムを有さない、ＨＢＳＳ中の０．２％ＢＳＡ（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ
）中で１×１０⁶／ｍｌの濃度で調製した。シリンジポンプ（ＫＤ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いる５ｄｙｎ／ｃｍ²での３
０秒間の、フローチャンバへの好中球の注入の直前に、カルシウム濃度を２ｍＭ
に調節した。この注入を３分間停止して、基質に対して好中球を静的接着させ、
次いで０．１９ｄｙｎ／ｃｍ²で再スタートした。セルフローを妨げることなく
、２分ごとに壁剪断力（ｗａｌｌ ｓｈｅａｒ ｆｏｒｃｅ）を二倍にした。好
中球のフィールドを１０×対物（レンズ）を用いて観察し、状態をＶＣＲテープ
に記録した。パブリックドメインＮＩＨ画像プログラムのＳｃｉｏｎバージョン
（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）を用いて
６１００／６６Ｐｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（登録商標）上で画像分析を実
施した。それぞれの特定の剪断力で、２分後の静的条件下で接着を維持する細胞
の画分を、この細胞を手動で数え上げること、そしてこの数をフロー開始の直前
に観察される接着細胞の数で割ることにより決定した（すなわち、１００％は、
静止接着後、最低の剪断フロー速度の開始の前に、観察されたフィールドで見ら
れた細胞を示す）。

【０１３２】 （Ｇ．腹膜の炎症） １ｍｌの３％チオグリコレート（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）（Ｓｉｇｍ
ａ）を用いてマウスに腹腔内注射した。示した時間で、マウスを屠殺し、腹腔を
１０ｍｌの氷冷ＰＢＳ（１％ＢＳＡおよび０．５ｍＭ ＥＤＴＡ含有）で洗浄し
た。赤血球を低張性溶解で取り除き、そして血球計算器を用いて白血球を手動で
計算した。サイトスピン（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ）をＬｅｕｋｏｓｔａｔ（Ｓｉｇｍ
ａ）で染色し、そして好中球を計数した。腹腔滲出液をまた、Ｇｒ−１およびＦ
４／８０（Ｃａｌｔａｇ）で染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し
た。

【０１３３】 （Ｈ．リンパ球輸送） 二次リンパ系器官の細胞性を決定するために、野生型およびＣ２ ＧｌｃＮＡ
ｃＴホモ接合性ヌルマウスから、組織を切り出した。腸間膜リンパ節、末梢（腋
窩および上腕）リンパ節およびパイアー斑からのリンパ球の単一細胞懸濁液を血
球計算器を用いて手動で数え上げた。腋窩リンパ節および上腕リンパ節の凍結切
片を５μｍに切断し、風乾し、そしてアセトン中で固定し、その後ヘマトキシリ
ンおよびエオシンで染色した。別の実験において、以前に記載のように（Ｍａｌ
ｙら（１９９６）前出；Ｓｍｉｔｈら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７１：８２５０〜８２５９）、Ｌ−セレクチンＩｇＭを、末梢リンパ節の凍結切
片に適用した。連続切片を末梢結節アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）抗体ＭＥ
ＣＡ ７９で染色した。リンパ球ホーミングアッセイを、以前に記載（Ｍａｌｙ
ら（１９９６）前出）の様に実行した。簡略にいえば、２．５×１０⁷ＣＭＦＤ
Ａ（ＭＯｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｐｒｏｂｅｓ）で標識した野生型腸間膜白血球
を野生型マウスまたはＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Δ/Δマウスの尾静脈に注射した。
１時間後、この動物を屠殺し、そして造血器官を取り出した。フローサイトメト
リーにより、１００，０００のＣＭＦＤＡ陽性白血球の分析を実行した。

【０１３４】 （Ｉ．統計分析） Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ（登録商標）ソフトウェアを用い、独立サンプルについて
スチューデントｔ検定により、データを分析した。

【０１３５】 （結果） （Ａ．Ｃ２ ＧｌｕＮＡｃＴ遺伝子の標的化変異誘発および欠失） Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴは、ゴルジ装置局在化ＩＩ型膜貫通グリコシルトランス
フェラーゼであり、そして試験された哺乳動物の間で保存されている（Ｂｉｅｒ
ｈｕｉｚｅｎおよびＦｕｋｕｄａ（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．８９：
９３２６〜９３３０；Ｓｅｋｉｎｅら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７２：２７２４６〜２７２５２）。単一のＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴタンパク質コー
ドエキソンを含むマウスゲノムクローンを、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換えにより、エ
キソン欠失を制御するように設計した遺伝子標的ベクターの構築において用いた
（図２Ａ）。胚性幹細胞（ＥＳ）中の標的ベクターの相同組換えにより、インビ
ボにおいて全身性Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Δまたは条件的Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^F
の変異体の引き続く産生のための選択マーカーおよび３ ｌｏｘＰ部位を組み込
んだ（図２Ｂおよび図２Ｃ）。これらの対立遺伝子を、マウス生殖系列に伝達し
、そしてＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Δまたは条件的Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Fのいずれ
かの対立遺伝子についてホモ接合性の子孫を生成した。このような子孫は、同腹
仔の２５％の間に存在し、明白な身体的異常または行動的異常がなく、正常に発
育して、完全に繁殖性であった。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Δ対立遺伝子についてホ
モ接合性のマウスをさらに分析した。

【０１３６】 （Ｂ．Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性およびコア２Ｏ−グリカン量） Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ酵素活性は、コア１オリゴサッカリドの基質アナログを
用いることにより特異的に検出される（Ｙｏｕｓｅｆｉら（１９９１）Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７７２〜１７８２）。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Δ対立
遺伝子についてホモ接合性のマウスにおいて、高いＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴレベル
を通常発現する組織は、有意な活性を欠いていた。この組織には、脾臓、骨髄お
よび腎臓が挙げられる（図３Ａ）。コア２ Ｏ−グリカンの欠損を生じたＣ２
ＧｌｃＮＡｃＴの喪失があるか否かを検出するため、代謝的に標識した脾細胞に
おいて、オリゴサッカリド構築物を分析した。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Δ対立遺伝
子についてホモ接合性の脾細胞から単離したＯ結合型オリゴサッカリドは、Ｇａ
ｌβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃを欠き、この
ことは、コア２ Ｏ−グリカンの欠損を示す（図３Ｂ、上部パネル、ピーク３）
。脱シアリル化およびさらなるクロマトグラフィー分析は、コア２ Ｏ−グリカ
ンの喪失をさらに示した（図３Ｂ、下部パネル、ピーク３）。Ｃ２ ＧｌｃＮＡ
ｃＴ欠失脾臓細胞における、大部分のコア１オリゴサッカリドはシアリル化され
、これは、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性の非存在において予期される構造と一致し
ている。

【０１３７】 予め、オリゴサッカリド依存性であるとみなされたモノクローナル抗体をまた
、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損細胞を特徴付けるために適用した。Ｂリンパ球は、
ＣＤ２２およびＢ細胞エピトープＢ２２０を特異的に発現し、この後者の方は、
ＣＤ４５の糖形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）である（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９８９
）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１１７９〜８４）。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性
を欠く脾細胞は、Ｂ２２０エピトープを欠くが、細胞表面でのＣＤ２２およびＣ
Ｄ４５のタンパク質レベルは、変更されなかった（図３Ｃ、左パネル）。このＣ
Ｄ４３糖タンパク質は、モノクローナル抗体Ｓ７および１Ｂ１１により別々に認
識される２つの異なる糖形態として、白血球上で高度に発現される。骨髄性細胞
上で発現される高分子量のＣＤ４３糖形態は、コア２ Ｏ結合型オリゴサッカリ
ドで改変され、そして１Ｂ１１抗体により認識される（Ｊｏｎｅｓら（１９９４
）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３４２６〜３４３９）。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ ^Δ 対立遺伝子についてホモ接合性のマウスにおいて、骨髄性細胞は、Ｓ７結合に
ついて陽性のままであったが、１Ｂ１１抗体結合は、明らかに存在しなかった（
図３Ｃ、右パネル）。これらのデータは、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Δ対立遺伝子の
ホモ接合性が、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性およびコア２ Ｏ−グリカンの欠損を
生じることを示す。

【０１３８】 （Ｃ．Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損が中度の好中球増加症を生じる） 組織学的試験において、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損マウスの細胞形態または器
官形態における変更は検出されなかった。腎臓、肺、腸管および関連した上皮は
、顕著でなく、そして腸杯状細胞におけるムチンレベルは、コントロールから識
別不能であった（データ示さず）。血清生化学の分析は、正常な腎機能を示した
（データ示さず）。血液学的試験は、血液の白血球増加症を明らかにした。総白
血球数は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴヌルマウスにおいて２．４倍に上昇した。この
増加は、好中球の４．３倍の増加をほぼ完全に説明した（図４Ａ）。骨髄前駆細
胞数は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴヌルマウスにおいて正常であり、このことは、白
血球が、好中球産生の増加の結果ではないことを意味する（図４Ｂ）。他の研究
では、循環する血小板のレベルおよび形態はまた、変化せず、そして出血時間に
おける差異は明確でない（データ示さず）。これらの観察は、セレクチンまたは
セレクチンリガンドにおけるマウス欠損から得られる特定の結果の暗示である。

【０１３９】 （Ｄ．セレクチンリガンド形成および白血球ローリングにおけるＣ２ Ｇｌｃ
ＮＡｃＴ関与） セレクチンリガンド生合成におけるＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴの役割を検出するた
め、セレクチン−Ｉｇキメラを用いて、細胞表面上のＥセレクチン、Ｌセレクチ
ンおよびＰセレクチンのリガンドのレベルを試験した。Ｅセレクチンキメラおよ
びＰセレクチンキメラは、顆粒球および単球を含む、血液中の骨髄性細胞上の炭
水化物リガンドに特異的に結合する（Ｍａｌｙら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６：
６４３〜６５３）。フローサイトメトリーを用いて、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴヌル
マウス由来の末梢血白血球が、ＥセレクチンリガンドおよびＰセレクチンリガン
ドの両方において欠損されることを見出した。Ｐセレクチンキメラは、有意に結
合せず、一方、低レベルのＥセレクチンＩｇ結合は残った（図５Ａ）。これらの
結果は、セレクチンリガンドを保有するタンパク質の発現の低減に起因しなかっ
た。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損白血球上のＰＳＧＬ−１、Ｌ−セレクチンおよび
ＣＤ２４の細胞表面レベルは、内皮への白血球の固い接着に関与する種々の接着
分子のレベルのようには、影響を受けなかった（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂおよび
ＣＤ１８；図５Ｂ）。

【０１４０】 並行プレートフローチャンバシステムを、機能的セレクチン結合へのコア２オ
リゴサッカリドの寄与を測定するために用いた。固定したＥセレクチン−Ｉｇ、
Ｌセレクチン−ＩｇまたはＰセレクチン−Ｉｇのキメラは、このシステムにおけ
る好中球ローリングのための接着基質として働く。ＦｕｃＴ−ＶＩＩヌル白血球
の結合を、直接比較でモニターした。なぜなら、それらはほとんどの剪断力では
セレクチンに明白には結合しないからである（Ｍａｌｙら、前出）。コア２オリ
ゴサッカリドにおける白血球欠損は、用いた全ての剪断力でＥセレクチンおよび
Ｐセレクチンにおいて低減したが有意なローリング活性を示した。一方、Ｆｕｃ
Ｔ−ＶＩＩヌル白血球は、固定されたセレクチン−Ｉｇキメラと明白には相互作
用しなかった（図６）。最高の剪断力では、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴヌル白血球の
５０％が、Ｐセレクチン基質に結合したまま残り、そして約２０％が、Ｅ−セレ
クチン基質と結合したまま残った。対照的に、Ｌセレクチン上での白血球ローリ
ングは、コア２オリゴサッカリド生合成に特に依存するようである。なぜならＣ
２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損白血球は、１０ダイン／ｃｍ²未満の剪断力の場合を除
けば結合し得ない。

【０１４１】 （Ｅ．コア２オリゴサッカリドは、炎症部位に好中球を補充する） コア２オリゴサッカリドは、セレクチンリガンド生合成に寄与するので、Ｃ２
ＧｌｃＮＡｃＴヌルマウスは、炎症部位へのリンパ球輸送および好中球の補充
において異常性を示すようである。炎症性刺激後の最初の４時間の間、炎症部位
への好中球補充は、ほとんどセレクチン機能に依存する（Ｍａｙａｄａｓら（１
９９３）Ｃｅｌｌ ７４：５４１〜５５４）。チオグリコレート注射により誘導
された腹膜炎は、急性炎症のモデルにおけるセレクチン機能を評価するために用
いられ得る。これにはインビボにおける好中球補充の定量を含む。コア２オリゴ
サッカリドの非存在下で、炎症を起こした腹膜への好中球補充における重篤な欠
陥は、４時間で回復できるコントロールの好中球メンバーの２０％のみで見られ
た（表１）。好中球メンバーのこの減少の程度は、セレクチンリガンド形成にお
いてより欠損しているＦｕｃＴ−ＶＩＩ欠損マウスにおいて類似する（Ｍａｌｙ
ら、前出）。これらのデータは、コア２オリゴサッカリドが、急性炎症の間のセ
レクチン媒介性好中球補充において本質的機能を提供することを示す。

【０１４２】

【表１】

【０１４３】 データは、チオグリコレート処理したマウスの腹膜洗浄液から回収した好中球数
（×１０⁴）の平均±ＳＥＭである。各群におけるマウスの数は、括弧内に示す
。単独ｔ検定は^*ｐ＜０．００１の有意性を示した。

【０１４４】 （Ｆ．Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴにより生成されたＬセレクチンリガンドは、リン
パ球ホーミングに不要である） ＬセレクチンおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩは、リンパ節へのリンパ球ホーミングに
重要である（Ａｒｂｏｎｅｓら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：２４７〜２
６０；Ｍａｌｙら、前出）。ＨＥＶへのＬセレクチン対抗−レセプターは、シア
リルムチンであり得るので、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴは、その産生に関与したよう
である。しかし、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損マウス由来の二次リンパ系器官は、
正常組織サイズ、およびリンパ球量またはサブセット比のいずれにおいても変化
のない小胞解剖を示した（図６Ａ）。にもかかわらず、リンパ節ＨＥＶへのＬ−
セレクチン結合は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴの非存在下で低減した（図６Ｂ）。Ｌ
セレクチンリガンド形成におけるこの欠損は、より高い濃度のＬセレクチン−Ｉ
ｇキメラを用いた場合は明白でなく（データ示さず）、そしてＣ２ ＧｌｃＮＡ
ｃＴ欠損リンパ節へのリンパ節ホーミングと有意なコンセンサスを有さず、そし
て脾臓は統計的に未変化であった（図６Ｃおよびデータ示さず）。これらの結果
は、ＨＥＶ Ｌセレクチン生合成におけるＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性が、二次リ
ンパ系器官へのリンパ節ホーミングに不要であることを示す。

【０１４５】 （考察） Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴグリコシルトランスフェラーゼは、白血球中のコア２Ｏ
−グリカンの生合成に必須である。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴの喪失は、炎症性応答
において欠損を生じるセレクチンリガンド欠損の特有のモデルを提供するが、リ
ンパ球ホーミングはインタクトなままである。生理学的セレクチンリガンドの構
造的基礎を決定することは、引き続き関連する。なぜなら、この研究は、セレク
チンリガンド生合成および機能が種々の解剖的区画の中で差示的に調節されるこ
とを示すからである。いくつかのグリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシ
ダーゼは、有意な程度の細胞型特異性を通して機能することが見出された（Ｍａ
ｌｙら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６：６４３〜６５３；Ｃｈｕｉら（１９９７）
Ｃｅｌｌ ９０：１５７〜１６７；Ｈｅｎｎｅｔら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４５０４〜４５０９）、そしてＣ２
ＧｌｃＮＡｃＴは、骨髄性細胞のセレクチン媒介性応答に関与する役割に専念
させられるようである。

【０１４６】 （Ａ．セレクチンリガンドの生合成におけるコア２オリゴサッカリド） Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴは、Ｅセレクチン、Ｌセレクチン、およびＰセレクチン
のリガンド形成において差示的に作動する。フローサイトメトリーにより観察さ
れたコア２Ｏ−グリカン欠損白血球へのＥセレクチン−ＩｇおよびＰセレクチン
−Ｉｇの結合の欠損は、ＥセレクチンおよびＰセレクチンの両方の基質上で有意
に残余する結合を示した好中球ローリングアッセイからのデータにより調節され
た。さらに、少量のＬセレクチン結合が、ＦｕｃＴ−ＶＩＩヌル白血球に比べて
残ったが、適用された最低の剪断力でのみであった。全ての３つのセレクチンが
ＰＳＧＬ−１に結合し得、そしてＰＳＧＬ−１は、ローリングアッセイにおける
主なセレクチン対抗レセプターとして作用し得る。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損白
血球による残りのＥセレクチンおよびＰセレクチンの結合は、生理学的セレクチ
ンリガンド形成におけるＮ−グリカンについて潜在的な役割を示す。ＣＤ２４糖
タンパク質は、骨髄性細胞表面上で広範にＮ−グリコシル化される。ここでは、
ＣＤ２４糖タンパク質は、Ｐセレクチンへの単球および好中球の結合を媒介する
ことが報告されている（Ａｉｇｎｅｒら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
７：１５５７〜１５６５）。さらに、Ｅセレクチン対抗レセプターであるＥＳＬ
−１は、Ｎ結合型オリゴサッカリドのみを含み、そして白血球微絨毛上で見出さ
れている。ここでＥＳＬ−１は、最初の細胞接着事象を調節し得る（Ｓｔｅｅｇ
ｍａｉｅｒら（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１０：６８７〜９４）。白
血球Ｌセレクチンリガンド産生は、コア２オリゴサッカリド形成に大きく依存す
るようである。このコア２オリゴサッカリド形成は、炎症および管外遊出の部位
での好中球同士の結合に関与する二次的相互作用に特に関連し得る（Ｗａｌｃｈ
ｅｃｋら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１０８１〜７）。本
発明者らの研究は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴが、白血球上のＥセレクチンリガンド
、ＬセレクチンリガンドおよびＰセレクチンリガンドの大きい割合を提供するが
、ＦｕｃＴ−ＶＩＩほど重要でないことを示す。従って、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ
により生成されないＦｕｃＴ−ＶＩＩの他のオリゴサッカリド基質はまた、セレ
クチンリガンド生合成に関与する。

【０１４７】 （Ｂ．白血球中のＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴの生理学的および細胞型特異性） Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴヌル好中球の剪断フロー研究におけるＥセレクチン結合
事象およびＰセレクチン結合事象とともに、腹膜炎症の間の好中球補充において
観察された減少は、驚く程に重篤であった。減少の程度は、好中球補充における
８０％の減少を有したＦｕｃＴ−ＶＩＩの非存在下で観察された減少の程度と類
似している。炎症した腹膜への好中球補充の全てがセレクチンまたはＦｕｃＴ−
ＶＩＩを必要とするわけではない。急性炎症の最初の４時間に補充された約２０
％の好中球は、細胞内接着分子−１の機能により説明され得る（ＩＣＡＭ−１；
Ｋｕｎｋｅｌら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：５７〜６５）。これ
らの知見は、急性炎症へのセレクチンおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩの関与がＣ２ Ｇ
ｌｃＮＡｃＴおよびコア２オリゴサッカリドに依存することを意味する。

【０１４８】 Ｃ２ＧｌｃＮＡｃＴ欠損マウスにおける変化した白血球ホメオスタシスは、Ｐ
セレクチンおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩ欠損の研究と比較して中程度の重篤度である
。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴの非存在下における主な血行動態効果は、好中球レベル
の増加であった。Ｐセレクチンの非存在は、末梢好中球のわずかな増加を生じる
が、総白血球には変化を生じない（Ｍａｙａｄａｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７
４：５４１〜５５４）。一方、ＥセレクチンまたはＬセレクチンのいずれかを欠
損するマウスは、正常な末梢血液学的プロフィールを示す（Ａｒｂｏｎｅｓら（
１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：２４７〜２６０；Ｌａｂｏｗら（１９９５）
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７０９〜７２０）。ＰセレクチンおよびＥセレクチンの
両方を欠失している（Ｆｒｅｎｅｔｔｅら、１９９６）場合、またはＦｕｃＴ−
ＶＩＩの非存在下（Ｍａｌｙら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６：６４３〜６５３）
では、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損マウスにおいて測定した以上の、白血球の顕著
な増加が観察される。骨髄前駆細胞の頻度は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損マウス
において変化しておらず、このことは、好中球の半減期の延長が、Ｐセレクチン
欠損で報告されたＪｏｈｎｓｏｎら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８６：１１０６〜
１４）ような好中球増加症を説明し得ることを示唆する（。Ｐセレクチンの非存
在下で報告された結果に比べて、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損マウスは、正常な出
血時間を示した（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８７：１
２３８〜１２４２；データ示さず）。

【０１４９】 Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ機能の選択的特性は、リンパ節の形態およびリンパ球ホ
ーミングの研究からさらに証明された。リンパ節ＨＥＶに対するＬセレクチン結
合で観察された部分的欠損は、重要でないようである。なぜなら、リンパ球量お
よびホーミングは影響されなかったからである。おそらく、生理学的Ｌセレクチ
ンリガンドは、通常、過剰量で発現される。そしてＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損マ
ウスにおいて残っている量は、正常なリンパ球ホーミングを促進するのに十分で
ある。Ｌセレクチンリガンドを輸送するようにＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴにより改変
されたＨＥＶ糖タンパク質は、リンパ球ホーミングに関与しないこともまたあり
得る。Ｌセレクチンリガンドは、別のオリゴサッカリドクラス（Ｎ−グリカン、
Ｏ−グリカン、糖脂質など）に存在し得るので、これらのクラスにおいて根底を
なす構造は、インビボにおけるそれらの提示およびＬセレクチン結合における機
能の有効性に影響し得る。リンパ球ホーミングに関連するＬセレクチン対抗レセ
プターは、ＣＤ３４のようなシアリル化ムチンを含む。それらの正体は、未確認
であり、そしてＣＤ３４欠損マウスは、正常なリンパ球ホーミングを示す（Ｃｈ
ｅｎｇら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８７：４７９〜９０；Ｓｕｚｕｋｉら（１９
９６）Ｂｌｏｏｄ ８７：３５５０〜６２）。他のオリゴサッカリドクラスが含
まれる可能性は、Ｏ−シアログリコプロテアーゼ−耐性Ｌセレクチンリガンドが
リンパ節ＨＥＶ上に存在するという観察と一致している（Ｃｌａｒｋら（１９９
８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４０：７２１〜３１）。生理学的Ｌセレクチン
リガンドの構造的特徴は完全に確立されていないとはいえ、リンパ球ホーミング
に関与するオリゴサッカリドは、ＦｕｃＴ−ＶＩＩの機能に依存するが、Ｃ２
ＧｌｃＮＡｃＴを必要とせず、従ってコア２オリゴサッカリドから構成されない
かもしれない。

【０１５０】 （Ｃ．オリゴサッカリド多様化および機能におけるＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ） Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴグリコシルトランスフェラーゼは、腎臓、骨髄および末
梢白血球中のコア２Ｏ−グリカンの生成に必須である。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴは
また、糖脂質基質上で作用し得るので（Ｐｉｌｌｅｒら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１３３８５〜９０）、顕在性の表現型が、一部は、ゴル
ジ装置中のＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴの基質である特定の糖脂質の欠損に対して起因
し得る可能性がある。本発明者らはまた、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴアイソザイムを
コードする別個の遺伝子産物が特定の画分（例えば、リンパ節ＨＥＶ）中で発現
される可能性を除外し得ず、そしてこれは機能的Ｌセレクチンリガンド形成を説
明し得る。いくつかの研究は、コア２Ｏ−グリカンおよびコア４Ｏ−グリカンの
両方を合成し得るムチン産生組織中のこのようなアイソザイムの存在を示唆した
（Ｋｕｈｎｓら（１９９３）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１０：３８１〜９４；Ｒ
ｏｐｐら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３８６３〜７１）。
コア４Ｏ−グリカンは、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損を部分的に補償し得るが、Ｃ
４ ＧｌｃＮＡｃＴ活性は、骨髄性細胞型において通常には見出されない（Ｂｉ
ｅｒｈｕｉｚｅｎおよびＦｕｋｕｄａ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３２６〜９３３０；Ｓｃｈａｃｈｔｅｒおよび
Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ（１９８９）Ｓｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．４
３：１〜２６）、そしてコア４活性は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損マウス由来の
組織において誘導されなかった（データ示さず）。

【０１５１】 炎症の間の好中球補充におけるＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴの機能は、セレクチンリ
ガンドの生合成における役割と一致する。Ｅセレクチンリガンド、Ｌセレクチン
リガンド、およびＰセレクチンリガンド産生は、部分的にのみＣ２ ＧｌｃＮＡ
ｃＴ依存性である。なおこの部分的依存性は、強力かつ制限された生理学的活性
を含む。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性の阻害は、急性炎症反応および再潅流障害を
緩和するための選択的手段を提供し得る（ＬｏｗｅおよびＷａｒｄ（１９９７）
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：８２２〜８２６）。本発明者らの結果は、
コア２Ｏ−グリカンが、重複する活性を有するさらなるグリコシルトランスフェ
ラーゼの存在を反映し得る予期せぬ限定的生物学的機能を提供することを意味す
る。グリコシルトランスフェラーゼにより発揮される特有の調節的役割は、コア
および糖タンパク質成分によるオリゴサッカリドのレベルおよびそれらの構造的
提示に影響を与え得る異なる発現パターンと通して生じ得る。どちらの可能性も
、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴグリコシルトランスフェラーゼが骨髄ホメオスタシスお
よび炎症を選択的に調節する方法を説明し得る。

【０１５２】 本明細書において記載される実施例および実施形態は、例示目的のためのみで
あり、そしてそれらに照らした種々の改変または変化が、当業者に示唆され、そ
して本願の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが
理解される。本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全て
の目的のため参考として本明細書において援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、哺乳動物Ｏ−グリカン生合成（詳細には、コア１ Ｏ−グリカンおよ
びコア２ Ｏ−グリカンの産生）の図を示す。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ酵素は、
ゴルジ装置において二分岐Ｏ−グリカンを産生する際に機能する。コア２分枝は
、ラクトサミン二糖類反復物およびセレクチンリガンドシアリルルイスＸの引き
続く産生のための足場を提供する。

【図２】 図２Ａ〜２Ｃは、胚幹細胞およびマウスにおいてＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ遺伝子
を欠失させるために使用されるストラテジーを示す。図２Ａでは、野生型Ｃ２
ＧｌｃＮＡｃＴゲノム遺伝子座をｐｆｌｏｘベクターと共に使用して、標的化ベ
クターを構築した。ここでは、単一のエキソンオープンリーディングフレームが
、ｌｏｘＰ部位に隣接される（Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^F[tkneo]）。示される制限
酵素部位は、ＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＢｇｌＩＩ（Ｂｇ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）、
ＮｏｔＩ（Ｎ）、およびＸｂａＩ（Ｘ）である。Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ標的化Ｅ
Ｓ細胞における一過性のＣｒｅ発現は、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Δ（全身的ヌル）
またはＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^F（条件的ヌル）変異を伴って単離されるサブクロ
ーンを生じた（図２Ｂ）。図２Ｃは、ｌｏｘＰプローブで探索されたＥＳ細胞Ｄ
ＮＡのＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ消化物のサザンブロット分析を示す。これは、予
期された構造を確証した。野生型ＲＩ ＥＳ細胞ＤＮＡは、ｌｏｘＰプローブと
のハイブリダイゼーションを示さなかった。３つのｌｏｘＰ部位が、標的化され
た親クローンに存在する（１５６）。１つのｌｏｘＰ部位は、２つのＣ２ Ｇｌ
ｃＮＡｃＴ^Δサブクローン（１５６．２４および１５６．２９）の各々に存在し
、そして２つのｌｏｘＰ部位はＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Fサブクローン（１５６．
３４）に存在する。右パネルでは、ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、そしてゲノムプ
ローブで探索された、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Δキメラ由来の子孫のヘテロ接合体
交配由来のテイル（ｔａｉｌ）ＤＮＡが、６．５ｋｂの野生型対立遺伝子および
３．７ｋｂの変異対立遺伝子を示す。

【図３】 図３Ａ〜３Ｃは、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性およびオリゴサッカリド産生を実
証する。図３Ａでは、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を通常発現する組織を、野生型
マウス、ヘテロ接合体ヌルマウス、およびホモ接合体ヌルマウスにおける酵素活
性についてアッセイした。結果は、３つの同様の実験のうちの１つを表す。図３
Ｂは、野生型マウスおよびＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Δ/Δマウスの脾細胞において
実施されたオリゴサッカリド分析を示す。［³Ｈ］−グルコサミン標識化Ｏ−グ
リカンを単離し、そしてＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−４ゲル濾過に供した（上部パネル
）。シアリル化オリゴサッカリドを含む画分（ピーク１および２）を混合し、脱
シアリル化し、そしてＨＰＬＣに供した（下部パネル）。ピーク１、２、３、４
、および５は、Ｇａｌβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌ
ＮＡｃＯＨおよびＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃＯＨのジシアリル化形態（ピーク
１）、ならびにＧａｌβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌ
ＮＡｃＯＨおよびＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃＯＨののモノシアリル化形態（ピ
ーク２）、Ｇａｌβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡ
ｃＯＨ（ピーク３）、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃＯＨ（ピーク４）、ならびに
ＧａｌＮＡｃＯＨ（ピーク５）の溶出位置を示す。図３Ｃに示される実験では、
脾細胞を、ＣＤ２２およびＢ細胞特異的形態のＣＤ４５を認識するｍＡｂ（Ｂ２
２０）またはＣＤ２２およびすべてのＣＤ４５アイソフォームを認識するｍＡｂ
（３０−Ｆ１１）で二重染色した。細胞をまた、ＣＤ４３の１１５ｋＤの糖形態
（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）を認識するｍＡｂ（Ｓ７）およびＣＤ４３の１３０ｋＤ
の糖形態を認識するｍＡｂ（１Ｂ１１）で二重染色し、そしてフローサイトメト
リー分析に供した。骨髄性細胞を、前方および側方散乱によりゲート制御した。

【図４】 図４Ａおよび４Ｂは、Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴ欠損マウスにおける末梢血液学を
示す。血液を、６〜８週齢のマウスの尾静脈から収集した。自動化された総白血
球計数および自動化および手動の示差的計数を、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ ３５００お
よびライト−ギームザ染色スミアを使用して実施した。各遺伝子型の２０匹のマ
ウスからの計数を、全血１ｍｌあたりの細胞±ＳＥＭとして表す。図４Ｃは、骨
髄におけるコロニー形成単位を示す。これは、増殖因子の存在下にあるメチルセ
ルロースにおける有核骨髄性細胞のインビトロ分化によって分析された。コロニ
ー形成単位の数（ＧＭ−顆粒球／マクロファージ；ＧＥＭＭ−顆粒球／赤芽球／
マクロファージ／単球；Ｅ−赤芽球；Ｂ−Ｂ細胞）を、１０日目に計数した。デ
ータは、各遺伝子型の６匹のマウス由来の平均±ＳＥＭである。

【図５】 図５Ａ〜図５Ｂは、白血球セレクチンリガンド発現を示す。図５Ａ：精製され
た末梢血白血球を、Ｇｒ−１とＰ−セレクチン−ＩｇＭキメラまたはＥ−セレク
チン−ＩｇＭキメラのいずれかとを用いて、４℃にて３０分間染色した。ヤギ抗
ヒト二次を使用して、ＩｇＭキメラを検出し、そしてＦＡＣＳ分析に供される場
合に、Ｇｒ−１陽性集団において生細胞をゲート制御した。ＥＤＴＡの存在下で
染色された細胞は、コントロールとして機能する。データは、４つの個々の実験
の代表である。図５Ｂ：末梢血白血球を、Ｇｒ−１と白血球接着分子（ＣＤ１１
ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８）またはセレクチン対抗レセプター（ＣＤ２４、ＣＤ
６２Ｌ、ＰＳＧＬ−１）に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
とを用いて染色した。パネルは、３つの同様の実験のうちの１つであるｌ。ここ
で、収集されたデータは、Ｇｒ−１陽性細胞においてゲート制御された２５００
の事象を表す。図５Ｃは実験からの結果を示し、この実験では、野生型マウス、
Ｃ２ ＧｌｃＮＡｃＴヌルマウスおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩヌルマウス由来の末梢
血好中球を、固定されたＥ−セレクチン ＩｇＧキメラ、Ｐ−セレクチン Ｉｇ
Ｇキメラ、またはＬ−セレクチン ＩｇＧキメラでコーティングされたフローチ
ャンバー内に注入した。細胞の静的接着を、フローを３分間停止した後に記録し
、そして比剪断力の適用後に、ローリング計数をビデオで記録した。独立した測
定の数を括弧内に示す。データは、平均±ＳＥＭを表す。部位密度は、以下の通
りであった：Ｅ−セレクチン−ＩｇＧ、１平方マイクロメートルあたり６３分子
；Ｌ−セレクチン−ＩｇＧ、１平方マイクロメートルあたり２，８４０分子；Ｐ
−セレクチン−ＩｇＧ、１平方マイクロメートルあたり１，４６９分子。

【図６】 図６Ａ〜６Ｃは、リンパ節形態、Ｌ−セレクチン結合およびリンパ球ホーミン
グの分析の結果を示す。図６Ａ：腸間膜および末梢（上腕および腋窩）のリンパ
節、ならびにパイアー斑凝集体を、野生型マウスまたはＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴヌ
ルマウスから単離した。各器官から回収されたリンパ球を、血球計を使用して手
動で定量した。各遺伝子型の７匹の動物を分析した。そして結果を、平均±ＳＥ
Ｍとして表す。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された末梢リンパ節の凍結
切片を、２５×倍率で撮影した。図６Ｂ：Ｌ−セレクチンの免疫組織化学のため
に、野生型（左パネル）またはＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴ^Δ/Δ（右パネル）のマウ
ス由来の末梢リンパ節の凍結切片を、ＬセレクチンＩｇＭ免疫組織化学的プロー
ブまたはＭＥＣＡ ７９抗体を用いて染色した。図６Ｃ：リンパ球ホーミング研
究において、野生型リンパ球を、野生型マウスまたはＣ２ ＧｌｃＮＡｃＴヌル
マウスの尾静脈に注射した。各遺伝子型の４匹のマウス由来の腸間膜および末梢
（上腕および腋窩）のリンパ節、ならびにパイアー斑におけるＣＭＦＤＡ陽性リ
ンパ球を、フローサイトメトリーにより分析した（１００，０００事象）。デー
タを、平均±ＳＥＭとして表す。パイアー斑組織に対するホーミングにおけるわ
ずかな減少は、統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．３８）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/04 Ａ６１Ｐ 11/04 29/00 29/00 31/04 31/04 43/00 １１１ 43/00 １１１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エリース， レスリー ジィ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92037， ラ ホヤ， カミニト イースト ブラ フ ナンバー188 3295 Ｆターム(参考） 4C084 AA13 AA17 NA14 ZA362 ZA592 ZA662 ZA892 ZB112 ZB352 4C086 AA01 AA02 EA16 NA14 ZA36 ZA45 ZA59 ZA66 ZA89 ZB11 ZB15

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物における炎症応答を調節する方法であって、該方法
   は、コア２オリゴサッカリドの該コア２オリゴサッカリドに対するレセプターへ
   の結合を阻害する化合物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記方法が、リンパ球輸送を有意に変化させない、請求項１
   に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記化合物が、前記コア２オリゴサッカリドの酵素的合成を
   阻害する、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記化合物が、最小コア２オリゴサッカリドの酵素的合成を
   阻害する、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記化合物が、１つ以上のサッカリド残基の前記最小コア２
   オリゴサッカリドへの付着を阻害し、該残基は、該化合物の非存在下では該最小
   コア２オリゴサッカリドへの付着される、請求項３に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記化合物が、前記哺乳動物におけるコア２ ＧｌｃＮＡｃ
   トランスフェラーゼ活性の量を阻害する、請求項３に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記化合物が、前記コア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラー
   ゼをコードする遺伝子の発現を阻害する、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記化合物が、前記コア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラー
   ゼの酵素的活性を阻害する、請求項６に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記レセプターがＰ−セレクチンである、請求項１に記載の
   方法。
10. 【請求項１０】 第１の骨髄性細胞の内皮細胞への結合または第１の骨髄性
    細胞の第２の骨髄性細胞への結合を調節する方法であって、該方法は、コア２オ
    リゴサッカリドに結合するかまたはコア２オリゴサッカリドの合成を調節する化
    合物と、該第１の骨髄性細胞とを接触させる工程を包含する、方法。
11. 【請求項１１】 前記第１の骨髄性細胞が哺乳動物中に存在する、請求項１
    ０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記第１の骨髄性細胞が、好中球、好酸球、単球、および
    顆粒球からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記第１の骨髄性細胞の前記内皮細胞への結合または前記
    第１の骨髄性細胞の前記第２の骨髄性細胞への結合が阻害される、請求項１０に
    記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記化合物が、前記骨髄性細胞の表面上のコア２オリゴサ
    ッカリドの合成を阻害する、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記コア２オリゴサッカリドが、最小コア２オリゴサッカ
    リドである、請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記コア２オリゴサッカリドが、改変されたコア２オリゴ
    サッカリドである、請求項１４に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記化合物が、コア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ
    活性を阻害する、請求項１４に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記化合物が、前記コア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラ
    ーゼをコードする遺伝子の発現を阻害する、請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、
    請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記コア２ Ｇ
    ｌｃＮＡｃトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズして、ｍ
    ＲＮＡ：アンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリッドを形成する、請求項１
    ９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記骨髄性細胞の前記内皮細胞への結合または前記骨髄性
    細胞の前記第２の骨髄性細胞への結合が増強される、請求項１０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記化合物が、コア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ
    をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記化合物が、コア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ
    ポリペプチドまたはその活性なフラグメントを含む、請求項２１に記載の方法。
24. 【請求項２４】 哺乳動物における炎症応答を阻害する際の使用のための化
    合物を同定する方法であって、該方法は、以下： ａ）コア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、潜在的な炎症モジュレーター
    、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ糖ドナー、アクセプターサッカリド、およびコア２ Ｇ
    ｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ活性に必要とされるさらなる試薬、を含むアッセ
    イ混合物を提供する工程； ｂ）該コア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが活性である条件下で、該ア
    ッセイ混合物をインキュベートする工程；および ｃ）該アクセプターサッカリドに転移されたＧｌｃＮＡｃの量が、該潜在的な
    炎症モジュレーターを欠くアッセイと比較して、増加しているかまたは減少して
    いるかを決定する工程； を包含し、ここで、該アクセプターサッカリドへのＧｌｃＮＡｃ転移における減
    少を生じる潜在的な炎症モジュレーターが、炎症応答を阻害するために適切であ
    る、方法。
25. 【請求項２５】 前記アクセプターサッカリドが、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮ
    Ａｃ−の構造を含む、請求項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 哺乳動物における炎症応答を阻害するための化合物を同定
    する方法であって、該方法は、以下： コア２ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、該コア２ ＧｌｃＮＡｃトランス
    フェラーゼについてのアクセプターサッカリド、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを
    コードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供する工程； 該細胞を潜在的な炎症モジュレーターと接触させる工程、および該コア２ Ｇ
    ｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが正常に発現される条件下で、該細胞をインキュ
    ベートする工程；ならびに 該コア２オリゴサッカリドのレベルが、該潜在的な炎症モジュレーターの非存
    在下における該コア２オリゴサッカリドのレベルと比較して、増加しているかま
    たは減少しているかを決定する工程； を包含し、ここで、産生されるコア２オリゴサッカリドの量において減少を引き
    起こす潜在的な炎症モジュレーターが、哺乳動物における炎症応答を阻害するた
    めに有用である、方法。
27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の方法であって、ここで： 前記細胞は、１つ以上のさらなるグリコシルトランスフェラーゼ、および最小
    コア２オリゴサッカリドのＧｌｃＮＡｃに対してさらなるサッカリド残基を付加
    して、改変されたコア２オリゴサッカリドを形成し得る、対応する反応物をさら
    に含み； そして、コア２オリゴサッカリドのレベルは、該改変されたコア２オリゴサッ
    カリドの存在または非存在を検出することにより決定される、 方法。
28. 【請求項２８】 請求項２７に記載の方法であって、ここで前記改変された
    コア２オリゴサッカリドの存在または非存在は、前記潜在的な炎症モジュレータ
    ーの存在が、該改変されたコア２オリゴサッカリドについてのレセプターに結合
    する前記細胞の能力における低減を生じるか否かを決定することにより検出され
    る、方法。
29. 【請求項２９】 前記改変されたコア２オリゴサッカリドが、ポリラクトサ
    ミン部分を含み、そして前記レセプターがガレクチン−１である、請求項２８に
    記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記改変されたコア２オリゴサッカリドが、ＳＬｅ^x部分
    を含む、請求項２８に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記レセプターがＰセレクチンである、請求項３０に記載
    の方法。
32. 【請求項３２】 哺乳動物において炎症を阻害するが、リンパ球媒介性免疫
    応答を阻害しないリード化合物を同定する方法であって、該方法は、潜在的な炎
    症モジュレーター化合物のライブラリーをコア２オリゴサッカリドと接触させる
    工程、および該コア２オリゴサッカリドに結合する潜在的な炎症モジュレーター
    化合物を同定する工程、を包含し、ここで該コア２オリゴサッカリドに結合する
    化合物が、炎症モジュレーターとしてさらに試験するのに適切なリード化合物で
    ある、方法。
33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の方法であって、該方法がさらに、前記
    リード化合物が、コア２オリゴサッカリドと対応するレセプターとの結合を阻害
    するか否かを決定することによって、該リード化合物を試験する工程を包含する
    、方法。
34. 【請求項３４】 前記レセプターがＰ−セレクチンである、請求項３３に記
    載の方法。
35. 【請求項３５】 請求項３２に記載の方法であって、該方法がさらに、前記
    リード化合物を試験動物に投与する工程、および該試験動物による刺激物に対す
    る炎症応答が、該化合物の投与によって低減または予防されるか否かを決定する
    工程によって該リード化合物を試験する工程をさらに包含する、方法。