DE69630307T2

DE69630307T2 - O-glycaninhibitoren von selectinvermittelten entzüngen

Info

Publication number: DE69630307T2
Application number: DE69630307T
Authority: DE
Inventors: P. Rodger MCEVER; D. Richard CUMMINGS; L. Kevin MOORE
Original assignee: University of Oklahoma
Current assignee: University of Oklahoma
Priority date: 1995-08-03
Filing date: 1996-08-02
Publication date: 2004-07-15
Anticipated expiration: 2016-08-03
Also published as: ES2208759T3; WO1997006176A2; ATE251636T1; CA2228512A1; AU723262B2; KR20040039440A; MXPA98000968A; EP0850243A2; JPH11510543A; DK0850243T3; EP0850243B1; WO1997006176A3; AU6766996A; KR100523506B1; DE69630307D1

Description

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Inhibitoren von Selectin-vermittelter Entzündung und richtet sich speziell auf Inhibitoren, die von PSGL-1, dem Liganden für P-Selectin, deriviert sind und richtet sich auf neuartige, von PSGL-1 derivierte Oligosaccharide.
Die Selectine sind eine Familie von drei Ca²⁺-abhängigen Membran-gebundenen Lectinen, die das Anhaften von Leukozyten an Thrombozyten oder Endothelzellen unter Scherkräften auslösen, wie sie im Venenkreislauf angetroffen werden (Laskey, (1992) Science 258, 964–969; Bevilacqua, et al., (1993) J. Clin. Invest. 91, 379–387; McEver (1994) Curr. Opin. Immunol. 6, 75–84). L-Selectin, das auf Leukozyten exprimiert wird, bindet an konstitutiven oder induzierbaren Liganden auf Endothelzellen. E-Selectin, das durch Cytokin-aktivierte Endothelzellen exprimiert wird, und P-Selectin, das durch Thrombin-aktivierte Thrombozyten und Endothelzellen exprimiert wird, bindet an Liganden auf Knochenmarkzellen und Untergruppen von Lymphozyten.
P-Selectin ist ein Calcium-abhängiges Kohlenhydrat-bindendes Protein, das auf Oberflächen von aktivierten Thrombozyten und Endothel in Reaktion auf Thrombin und andere Agonisten exprimiert wird (McEver, et al. (1995) J. Biol. Chem., 270, 11025–11028; Varki, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, 7390–7397; Springer, T. A. (1995) Annu. Rev. Physiol. 57, 827–872). Durch sein Binden an Glykokonjugat-basierenden Gegenrezeptoren auf Leukozyten vermittelt P-Selectin ein rollendes Anhaften dieser Zellen an aktivierten Thrombozyten und Endothel (Lawrence und Springer (1991) Cell 65, 852–873; Moore, et al. (1995) J. Cell. Biol. 128, 661–671). Sowohl die Sialinsäure als auch Fucose sind Komponenten der P-Selectin-Gegenrezeptoren auf Leukozyten (Corral, et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Comm. 172, 1349–1356; Moore, et al. (1992) J. Cell. Biol. 118, 445–456; Sako, et al. (1993) Cell 75, 1179–1186).
Obgleich die Selectine mit kleinen sialylierten, fucosylierten Oligosacchariden in schwacher Wechselwirkung stehen, wie beispielsweise Sialyl-Lewis-x (sLe^x; NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc) (Foxall, et al., (1992) J. Cell Biol. 117, 895–902; Varki, (1992) Curr. Opin. Cell Biol. 257, 257–266), binden sie mit höherer Affinität an Glykanen, was sich auf einer begrenzten Zahl von Glykoproteinen zeigt (Moore, et al., (1992) J. Cell Biol. 118, 445–456; Lasky, et al., (1992) Cell 69, 927–938; Levinovitz, et al. (1993) J. Cell Biol. 121, 449–459; Walchek, et al., (1993) J. Exp. Med. 178, 853–863; Baumhueter, et al., (1993) Science 262, 436–438; Berg, et al., (1993) Nature 366, 695–698) oder Proteoglykanen (Norgard-Sumnicht, et al., (1993) Science 261, 480–483). Oligosaccharide, die Sialyl-Lewis-x (sLe^x), NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcα1-R, enthalten, eine Determinante, die auf den Oberflächen von Leukozyten vorhanden ist, hemmen das Anhaften von Leukozyten an P-Selectin (Polley, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6224–6228; Foxall, et al. (1992) J. Cell Biol. 117, 895–902). Allerdings ist die Expression von sLe^x an Zelloberflächen für das Binden mit hoher Affinität von Zellen an P-Selectin nicht ausreichend, da andere Zellen als Knochenmarkzellen, die hohe Mengen an sLe^x exprimieren, schwach an P-Selectin im Vergleich zu Knochenmarkzellen binden (Zhou, et al. (1991) J. Cell Biol. 115, 557–564). Die Liganden mit hoher Affinität sind potentiell als physiologische Vermittler von Selectin-vermittelten Leukozytenanhaftung bei einer Entzündung von Bedeutung. Daher hat das Verständnis der strukturellen Grundlage für die Hochaftinitätserkennung dieser Glykokonjugate durch die Selectine ein zunehmendes Interesse auf sich gezogen.
Eine Untergruppe der Hochaftinitäts-Selectin-Liganden aus Mucin-ähnlichen Glykoproteinen (McEver, et al. (1995)). Einer der Sialomucin-Liganden für P-Selectin wird durch Human-neutrophile und Human-promyelozytäre HL-60-Zelllinie exprimiert (Moore, et al., (1992); Moore, et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 23318–23327). Leukozyten exprimieren einen singulären Hochaffinitäts-Liganden für P-Selectin, bezeichnet als P-Selectin-Glykoprotein-Ligand-1 (PSGL-1) (Moore, et al., (1995); Moore, et al., (1992); Sako, et al., (1993); Norgaard, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 12764–127748; Moore, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 23318–23327). Das Binden von P-Selectin an den Liganden ist Ca²⁺-abhängig und wird durch Behandlung des Liganden mit Sialidase aufgehoben.
PSGL ist ein Homodimer mit zwei Disulfid-verknüpften Untereinheiten mit relativen Molmassen von näherungsweise 120.000 entsprechend einer Bestimmung mit Hilfe von SDS-PAGE (Moore, et al., 1992). Jede Untereinheit verfügt über nicht mehr als 3 N-Glykane, hat jedoch zahlreiche geclusterte, sialylierte O-Glykane (Moore, et al. (1992); Norgard, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 12764–12774). Die extrazelluläre Domäne von PSGL-1 ist stark verlängert, was ein charakteristisches Merkmal für Mucin-ähnliche Proteine ist. PSGL-1 ist ein Membranprotein vom Typ 1 mit einer extrazellulären Domäne, die zahlreiche Serine, Threonine und Proline enthält und einschließlich eine Reihe von decameren, kurz wiederholten Sequenzen (15 in Human-promyelozytären HL-60-Zellen und 16 in Human-Leukozyten) (Sako, et al. (1993) Cell 75, 1179–1186; Moore, et al. (1995) J. Cell Biol. 128, 661–671; Veldman, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 16470–16475). Hinter einem 18-Rest-Signalpeptid gibt es einen Propeptid-überspannenden Rest 19–41, der von PSGL-1 nach seiner Synthese in Leukozyten entfernt wird (Sako, et al. (1993); Vachino, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 21966–21974). Die extrazelluläre Domäne des bearbeiteten reifen Proteins erstreckt sich von den Resten 42 bis 318 und wird gefolgt von einer 25-Rest-Transmembrandomäne an einem 69-Rest-zytoplasmatischen Schwanz. Sie trägt zahlreiche unmodifizierte Sialylsäurereste sowie das sLe^x-Antigen. Der Ligand enthält mindestens ein PNGase-F-sensitives, N-verknüpftes Glykan, welches das P-Selectin für die Erkennung nicht benötigt. Im Gegensatz dazu verfügt es über geclusterte, sialylierte, O-verknüpfte Oligosaccharide, die das Polypeptid-Grundgerüst empfänglich machen für eine Aufspaltung durch das Enzym O-Sialoglykoprotease. Die Behandlung von intakten HL-60-Zellen mit diesem Enzym eliminiert die Hochaffinitäts-Bindungsstellen von P-Selectin (Ushiyama, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268, 15229–15237) und verhindert die Zellanhaftung an immobilisiertem P-Selectin (Norgard, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268, 12764–12774; Steininger, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992) 188, 760–766), ohne die Gesamt-Oberflächenexpression von sLe^x zu beeinträchtigen. Diese Daten legen nahe, dass dieses Sialomucin, das lediglich einen kleinen Abschnitt der Zelloberflächen-sLe^x trägt, mit den funktionell bedeutenden Hochaffinitäts-Bindungsstellen für P-Selectin auf Human-Knochenmarkzellen übereinstimmt.
Sako et al. (1993) haben eine von Human-HL-60-Zellen derivierte cDNA isoliert, die PSGL-1 codiert. Die cDNA-derivierte Sequenz für jede Untereinheit von PSGL-1 prognostiziert ein Typ 1-Transmembranprotein von 402 Aminosäuren. Die extrazelluläre Domäne verfügt über ein N-terminales Signalpeptid von den Resten 1 bis 18 und über ein vermutliches Propeptid von den Resten 19 bis 41. Nimmt man eine Spaltung des Propeptids an, so beginnt die extrazelluläre Domäne des reifen Proteins bei Rest 42 und erstreckt sich bis zum Rest 308. Die Sequenz schließt mit einer 25-Rest-Transmembrandomäne und einem 69-Restzytoplasmatischen Schwanz ab. Die extrazelluläre Domäne ist reich an Serinen und Threoninen, die potentielle Orte für O-Glykosylierung sind. Die extrazelluläre Domäne enthält 3 potentielle Orte für die Anlagerung von N-verknüpften Oligosacchariden sowie ein einzelnes Cystein, welches die Dimerisierung fördern könnte, und 3 potentielle Tyrosin-Sulfatierungsstellen an den Resten 46, 48 und 51.
Obgleich frühere Untersuchungen gezeigt haben, dass die Sialylierung und Fucosylierung von PSGL-1 zum Binden an P-Selectin erforderlich sind können andere Posttranslationsmodifikationen von PSGL-1 ebenfalls von Bedeutung sein. PSGL-1 ist stark O-glykosyliert und enthält sialyliertes und fucosyliertes O-verknüpftes Poly-N-Acetyllactosamin einschließlich einiger Glykane, die in sLe^x terminieren (Moore, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 23318–23327). sLe^x oder verwandte Glykane sind für das Hochaffinitätsbinden von PSGL-1 an P-Selectin nicht ausreichend. Beispielsweise können sulfatierte Verbindungen, denen entweder Sialinsäure oder Fucose fehlt, das Anhaften von Leukozyten am P-Selectin hemmen (Norgaard-Sumnicht, et al. (1993) Science 261, 480–483; Nelson, et al. (1993) Blood 82, 3253–3258; Cecconi, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 15060–15066; Skinner, et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 164, 1373–1379). Diese Daten legen nahe, dass die Sulfatierung von PSGL-1 für sein Hochaffinitätsbinden an P-Selectin erforderlich sein kann. Rekombinantes PSGL-1, das in COS-Zellen mit Fucosyltransferase exprimiert wird, steht in Versuchen der Zellanhaftung mit P-Selectin in Wechselwirkung (Sako, et al., 1993). Allerdings ist der Umfang unbekannt, in dem die Oligosaccharide auf rekombinanten PSGL-1 denen des nativen Glykoprotein-Liganden ähneln.
Obgleich Kohlenhydrate auf PSGL-1 für das Binden an Selectinen entscheidend sind, sind keine detaillierten chemischen Strukturen der Glykane verfügbar. Der größte Teil der Informationen über die Glykosylierung des Moleküls ist durch enzymatische Behandlungen des nativen Liganden und durch Untersuchungen an rekombinanten Formen von PSGL-1 erhalten worden, die in verschiedenen Zelltypen exprimiert sind. Obgleich diese indirekten Methoden wertvolle Information über entscheidende Determinanten auf dem Liganden liefern können, ist eine detaillierte strukturelle Information über O-Glykane von nativem PSGL-1 für die Identifizierung von Glykanen entscheidend, die für die Liganden-Funktion bedeutend sind, und um ein besseres Verständnis darüber zu liefern, warum PSGL-1 ein Ligand für P- und E-Selectin ist, während andere Mucine, wie beispielsweise CD43, dieses nicht sind.
Mit der vorliegenden Patentanmeldung wird ein Verfahren zum Erzeugen von PSGL-1 offenbart, das normalerweise glykosyliert und sulfatiert ist.
Mit der vorliegenden Patentanmeldung wird ebenfalls ein Verfahren sowie Reagenzien zum Hemmen des Bindens von PSGL-1 an P-Selectin und an anderen Selectinen offenbart.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neuartige O-Glykane bereitzustellen, die zum Modifizieren des Bindens an P-Selectin verwendbar sind.
Die WIPO International Publication Nr. WO 94/11498 offenbart einen Glykoprotein-Liganden für P-Selectin sowie Verfahren zu dessen Verwendung.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird mit den Ansprüchen 1, 6, 10 sowie 20 bis 53 und in den davon abhängigen Ansprüchen beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A, 1B und 1C sind graphische Darstellungen der Retentionszeit für Anionen-Austauschchromatographie unter Verwendung von NaH₂PO₄, pH 3,0, wobei der Gradient (gestrichelte Linie) enzymatisch abgebautes PSGL-1 zeigt, dass PSGL-1 Tyrosinsulfat enthält, das gegenüber Arylsulfatase anfällig ist. Mit starker Base hydrolysiertes ³⁵S-PSGL-1 ist in 1A gezeigt; mit starker Base hydrolysiertes und mit 1.000 mU von gekochter Arylsulfatase scheinbehandeltes ³⁵S-PSGL-1 in 1B gezeigt; und mit starker Base hydrolysiertes und mit 1.000 mU aktivem Enzym behandeltes ³⁵S-PSGL-1 ist in 1C gezeigt. Die Retentionszeiten von Tyrosin, Tyrosinsulfat und freiem Sulfat werden angegeben. Freies Sulfat eluiert bei 40,0 min. Sulfatierte Monosaccharide (Gal-6-Sulfat, GlcNAc-6-Sulfat, GalNAc-6-Sulfat und GalNAc-4-Sulfat) eluieren mit ähnlichen Retentionszeiten zwischen 14 und 15 min.
2 ist eine graphische Darstellung der Arylsulfatase-Freisetzung von [³⁵S]Sulfat von intaktem ³⁵S-PSGL-1 und der prozentualen Abnahme im Ca²⁺-abhängigen Binden von ¹²⁵I-PSGL-1 an P-Selectin, womit gezeigt wird, dass Tyrosinsulfat für das Binden an P-Selectin wichtig ist.
3A und 3B sind graphische Darstellungen, die zeigen, dass ein spezifisches Antipeptid-Serum auf PSGL-1 das Binden von PSGL-1 an P-Selectin blockiert. Es wurde ¹²⁵I-PSGL-1 in Gegenwart von "Normalem Kaninchenserum" (NRS) oder dem gegen den Resten 42 bis 56 von PSGL-1 gerichteten Antiserum (anti-42-56-Aminosäuren) in Mikrotiterplatten, die immobilisiertes, rekombinantes, lösliches P-Selectin oder Human-Serumalbumin (HSA) enthielten, inkubiert und das Binden als eine Funktion der Serumkonzentration gemessen, wie in 3A gezeigt wird. Es wurde von Thrombozyten deriviertes P-Selectin mit HL-60-Zellen in Gegenwart von 20% NRS oder anti-42-56-Aminosäureserum inkubiert. Das Binden von P-Selectin wurde mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszens und Durchflusszytometrie assayiert und die Zellenzahl gegen das P-Selectin-Binden aufgetragen, wie in 3B gezeigt wird.
4A–E zeigen, dass die PSGL-1-Fraktion P-10-2b ein auf Minimum bemessenes Glykan enthält, welches die sLe^x-Determinante führt. Die von ³H-GlcN-PSGL-1 derivierte Fraktion P-10-2b wurde mit Exoglykosidasen behandelt und mit Hilfe der absteigenden Durchlaufchromatographie für 24 h analysiert. Die β-eliminierten Glykane wurden zuerst mit Neuraminidase desialyliert und die neutralen Glykane aus der freigesetzten Sialinsäure mit Hilfe der Ionen-Austauschchromatographie abgetrennt. (A) Chromatographie von desialylierten Glykanen; (B) desialylierte Glykane, die mit β-Galactosidase behandelt wurden; (C) desialylierte Glykane, die mit Streptomyces-α1,3/4-Fucosidase behandelt wurden; (D) desialylierte Glykane, die mit einer Kombination von β-Galactosidase, β-N-Acetylhexosaminidase und Streptomyces-α1,3/4-Fucosidase behandelt wurden; (E) β-eliminierte Glykane, deriviert von ³H-Fuc-PSGL-1-Fraktion P-10-2b, die enzymatisch desialyliert und in dem gleichen Versuch chromatographiert wurden. Die Migration von authentischen Standards wird angezeigt: 5,
Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH; 4, Galβ1→4 GlcNAβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH; 3*, GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH; 2, Galβ1→3 GalNAcOH; 1, GlcNAc.
Die 5A und B zeigen, dass die PSGL-1-Fraktion P-10-2a aus einem sialylierten, Polylactosamin-enthaltenden O-Glykan besteht, die trifucosyliert ist. Die von ³H-GlcN-PSGL-1 derivierte Fraktion P-10-2a wurde mit Exoglykosidase behandelt und mit Hilfe der absteigenden Durchlaufchromatographie für 24 h analysiert. Die β-eliminierten Glykane wurden zuerst mit Neuraminidase desialyliert und die freigesetzte Sialinsäure von den neutralen Glykanen vor und nach den Behandlungen entweder mit Endo-β-Galactosidase oder einer Kombination von β-Galactosidase und β-N-Acetylhexosaminidase abgetrennt. (B) Desialylierte Glykane wurden chemisch defucosyliert und vor und nach den Behandlungen entweder mit Endo-β-Galactosidase oder einer Kombination von β-Galactosidase plus β-N-Acetylhexosaminidase analysiert. Die Migration von authentischen Standards wird angegeben:
3, Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1; 3*, GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH; 2, Galβ1→4GlcNAc; 1, GlcNAc.
6 zeigt, dass P-10-3-Glykane das neutrale Kern-2-Tetrasaccharid enthalten. ³H-GlcN-P-10-3 wurde mit Neuraminidase behandelt und die freigesetzte Sialinsäure von neutralen Glykanen mit Hilfe der QAE-Sephadex-Chromatographie abgetrennt. Die desialylierten Glykane wurden mit Hilfe der absteigenden Durchlaufchromatographie für 18 h vor und nach der Behandlung entweder mit β-Galactosidase allein oder mit β-Galactosidase plus β-N-Acetylhexosaminidase analysiert. Die Migration von authentischen Standards wird angegeben:
4, Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH; e*, GicNAcβ1→6(Galβ1→3) GalNAcOH; 2, Galβ1→4GlcNAc; 1, GlcNAc.
7 sind Strukturen und relative Prozentanteile der O-Glykane in PSGL-1.
Sulfatierte, glykosylierte Peptide und die O-Glykanstrukturen, die eindeutig PSGL-1 präsentieren und an P-Selectin binden, sind unter Anwendung von Untersuchungen entwickelt worden, die die entscheidenden Aminosäure-Reste in dem N-Terminalbereich von PSGL-1, die Bedeutung der Sulfatierung der Tyrosin-Reste und die Struktur und die Rolle der O-Glykan-Kohlenhydratstrukturen gekoppelt an Threonin in dem N-terminalen Bereich identifiziert haben.
Die Beispiele zeigen, dass PSGL-1 hauptsächlich auf einem oder mehreren des Tyrosins an den Resten 46, 48 und 51 sulfatiert ist, die für ein Hochaffinitätsbinden an P-Selectin erforderlich sind. Die Untersuchungen zeigen, dass in Human-HL-60-Zellen synthetisiertes PSGL-1 metabolisch mit [³⁵S]Sulfat markiert werden kann, das hauptsächlich in Tyrosinsulfat eingebaut ist, und dass die Behandlung von PSGL-1 mit einer bakteriellen Arylsulfatase Sulfat aus Tyrosin freisetzt, woraus eine konkordante Abnahme des Bindens an P-Selectin resultiert. Darüber hinaus wird das Binden von PSGL-1 an P-Selectin durch Antiserum blockiert, das gegen synthetisches Peptid gerichtet ist, welches die 3 vermutlichen Tyrosinsulfatierungsstellen in der Nähe des N-Endes von PSGL-1 umfasst.
Die Untersuchungen zeigen außerdem, dass die Expression von PSGL-1 in einer rekombinant-bearbeiteten Mammalia-Zelle, die 2 Enzyme exprimiert, für eine geeignete Glykosylierung von PSGL-1 erforderlich ist: eine Fucosyltransferase(FTIII) und eine Kern-2-β1-6-N-Acetylglucosaminyltransferase. Vergleichstests haben nachgewiesen, dass die Glykosylierung von PSGL-1, das in Zellen exprimiert ist, die diese Enzyme exprimieren, der Glykosylierung von nativem PSGL-1 ähnlicher ist als die Glykosylierung von rekombinantem PSGL-1, das in COS- oder CHO-Zellen exprimiert ist, die nicht die Kern-2-β1-6-N-Acetylglucosaminyltransferase exprimieren. Die Strukturen der Ser/Thr-verknüpften O-Glykane von PSGL-1, das durch HL-60-Zellen synthetisiert ist, wurden sodann metabolisch mit ³H-Zucker-Präkursoren radiomarkiert. In Kontrolluntersuchungen wurden die O-Glykane auf CD43 (Leukosialin) einem Mucin-ähnlichen Glykoprotein, das ebenfalls durch HL-60-Zellen exprimiert wird, analysiert und mit denen des PSGL-1 verglichen. Es wurden O-Glykane von Ser/Thr-Resten durch sanfte Base/Borhydrid-Behandlung von gereinigten Glykoproteinen freigesetzt und Glykanstrukturen mit Hilfe einer Kombination von Methoden ermittelt. Im Gegensatz zu den Erwartungen wurde das PSGL-1 nicht stark fucosyliert; eine Mehrzahl der O-Glykane wurden disialyliert oder neutrale Formen des Kern-2-Tetrasaccharids Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Baβ1→3)GalNAcOH. Es ist beispielsweise eine Minderheit der O-Glykane α1,3-fucosyliert, die als die 2 Hauptvertreter auftreten, die das Sialyl-Lewis-x-Antigen enthalten – ein Vertreter ist disi- alyliertes, monofucosyliertes Glykan:
während das andere ein monosialyliertes, trifucosyliertes Glykan ist, das über ein Polylactosamin-Grundgerüst verfügt:
worin R N, OH, ein anderer Zucker oder ein Aglykon ist, wie beispielsweise eine Aminosäure.
Diese Ergebnisse zeigen, dass PSGL-1 eindeutig fucosylierte O-Glykane enthält, die in Hochaffinitäts-Wechselwirkungen zwischen PSGL-1 und Selectinen beteiligt sind.
Pharmazeutische und diagnostische Peptide
Auf der Grundlage der in den vorstehend beschriebenen Beispielen erhaltenen Information kann man unter Anwendung rekombinanter Methoden oder Peptid-Synthetisiermittel, gefolgt von einer chemischen oder enzymatischen Sulfatierung und Glykosylierung, Peptide synthetisch darstellen, die zum Hemmen des Bindens von P-Selectin und anderen Selectinen an PSGL-1 verwendbar sind, wie mit Hilfe der vorstehenden allgemeinen Formel und unter Bezugnahme auf die Figuren und auf die nachfolgenden Beispiele beschrieben ist. In die Peptide sind vorzugsweise mindestens eines der 3 Tyrosine am Amino-Ende des Proteins einbezogen (Reste 46, 48 und 51 der Sequenzliste ID-Nr. 1), wovon mindestens eines sulfatiert ist (-SO₄), und vorzugsweise mindestens ein Threonin oder Serin einbezogen ist, das für die O-verknüpfte Glykosylierung geeignet ist, z. B. der Threonin-Rest am Aminosäure-Rest 57 der Sequenzliste ID-Nr. 1. Ein Beispiel für ein als Minimum verwendbares Peptid entspricht den Resten 48 bis 57 der Sequenz ID-Nr. 1 sowie Peptiden, die über konservative Substitutionen verfügen, welche das Binden des Peptids am P-Selectin nicht verändern. Wie in den Beispielen demonstriert wird, kommt es darauf an, dass in das Peptid ein Kern-2-sialyliertes, fucosyliertes O-Glykan einbezogen ist, wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird.
Aminosäuresequenz-Modifikationen fallen in eine oder mehrere der drei Klassen: substitutionelle, insertionelle oder deletionale Varianten. Insertionen schließen Terminalfusionen von Amino und/oder Carboxyl ein sowie Intrasequenzinsertionen von einzelnen oder mehrfachen Aminosäure-Resten. Bei den Insertionen wird es sich in der Regel um kleinere Insertionen handeln als solche der Amino- oder Carboxyl-Terminalfusionen beispielsweise in der Größenordnung von ein bis vier Resten. Immunogene Fusionsprotein-Derivate, wie sie in den Beispielen beschrieben werden, werden durch Verschmelzen eines ausreichend großen Polypeptids erzeugt um der Targetsequenz Immunogenität durch Vernetzen in vitro oder durch rekombinante Zellkultur zu vermitteln, die mit DNA transformiert ist, die die Verschmelzung codiert. Deletionen sind durch die Entfernung von einem oder mehreren Aminosäure-Resten von der Proteinsequenz gekennzeichnet. Im typischen Fall werden nicht mehr als etwa 2 bis 6 Reste an irgendeiner Stelle im Inneren des Proteinmoleküls deletiert. Diese Varianten werden in der Regel mit Hilfe der ortspezifischen Mutagenese von Nucleotiden in der DNA dargestellt, die das Protein codiert, wodurch eine DNA erzeugt wird, die die Variante codiert, und wonach die DNA in einer rekombinanten Zellkultur exprimiert wird. Methoden zum Erzeugen von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA, die eine bekannte Sequenz hat, sind gut bekannt, z. B. die M13-Primer-Mutagenese. Aminosäure-Substitutionen sind im typischen Fall einzelne Reste; Insertionen werden gewöhnlich in der Größenordnung von 1 bis 10 Aminosäure-Resten liegen und Deletionen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten. Deletionen oder Insertionen werden vorzugsweise in benachbarten Paaren ausgeführt, d. h. eine Deletion von 2 Resten oder Insertion von 2 Resten. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder eine beliebige Kombination davon lassen sich kombinieren, um zu einem fertigen Konstrukt zu gelangen. Die Mutationen dürfen die Sequenz nicht außerhalb des Leserasters bringen und werden vorzugsweise keine komplementären Regionen schaffen, die sekundäre mRNA-Struktur erzeugen könnten. Substitutionelle Varianten sind solche, bei denen mindestens ein Rest entfernt worden ist und ein anderer Rest an dessen Stelle inseriert wurde. Derartige Substitutionen werden in der Regel entsprechend den folgenden Tabellen 1 und 2 vorgenommen und als konservative Substitutionen bezeichnet.
Tabelle 1: Aminosäure-Abkürzungen

Tabelle 2: Aminosäure-Substitutionen

ursprünglicher Rest	exemplarische Substitutionen
Ala	ser
Arg	lys
Asn	gln; his
Asp	glu
Cys	ser
Gln	asn
Glu	asp
Gly	pro
His	asn; gln
Ile	leu; val
Leu	ile; val
Lys	arg; gln; glu
Met	Leu; ile
Phe	met; leu; tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
Val	ile; leu

Wesentliche Änderungen in der Funktion oder der immunologischen Identität werden erzeugt, indem Substitutionen gewählt werden, die weniger konservativ sind als die in Tabelle 2, d. h. das Auswählen von Resten, die hinsichtlich ihres Einflusses stärker signifikant differieren, um (a) die Struktur des Polypeptidgerüsts in dem Bereich der Substitution zu bewahren, beispielsweise als eine flächige oder helikale Konformation; um (b) die Ladung oder den hydrophoben Charakter des Moleküls an einer Targetstelle zu bewahren; oder (c) die Masse der Seitenkette aufrecht zu erhalten. Die Substitutionen, von denen in der Regel zu erwarten ist, dass sie die größten Änderungen in den Proteineigenschaften hervorrufen, werden solche sein, bei denen (a) ein hydrophiler Rest, z. B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest substituiert wird, z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (b) ein Cystein oder Prolin für (oder durch) irgendeinen anderen Rest substituiert wird; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z. B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, substituiert wird für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z. B. Glutamyl oder Aspartyl; oder (d) ein Rest mit einer volumigen Seitenkette, z. B. Phenylalanin, substituiert wird für (oder durch) einen solchen, der keine Seitenkette hat, z. B. Glycin in diesem Fall; (e) durch Erhöhen der Zahl der Stellen für die Sulfatierung und/oder Glykosylierung.
Die substitutionelle oder deletionale Mutagenese kann eingesetzt werden, um Stellen für die N-Glykosylierung (Asn-X-Thr/Ser) oder O-Glykosylierung (Ser oder Thr) zu inserieren. Deletionen von Cystein oder anderen labilen Resten können ebenfalls angestrebt werden. Deletionen oder Substitutionen von potentiellen Proteolyse-Stellen, z. B. Arg, werden beispielsweise dadurch erreicht, dass einer der basischen Reste deletiert werden oder einer durch Glutaminyl- oder Histidyl-Reste substituiert wird.
Bestimmte posttranslationale Derivatisierungen sind das Ergebnis der Wirkung von rekombinanten Wirtszellen auf dem exprimierten Polypeptid. Häufig werden Glutaminyl- und Asparaginyl-Reste posttranslational desamidiert zu den entsprechenden Glutamyl- oder Asparaginyl-Resten. Alternativ werden diese Reste unter milden sauren Bedingungen desamidiert. Andere posttranslationale Modifikationen schließen ein: Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxyl-Gruppen von Seryl- oder Threonyl-Resten, Methylierung der o-Amino-Gruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 [1983]), Acetylierung des N-terminalen Amins und in einigen Fällen Amidierung des C-terminalen Carboxyls.
Methoden zur Herstellung von Peptiden
Die Peptide können in der Regel mit Hilfe der folgenden bekannten Methoden hergestellt werden, wie beispielsweise in den genannten Veröffentlichungen beschrieben wurde, deren Lehren hierin speziell einbezogen sind. Da die bevorzugten Peptide sowohl glykosyliert als auch sulfatiert sind, werden die Peptide in geeigneten Mammalia-Wirtszellen entsprechend der nachfolgenden Beschreibung vorzugsweise exprimiert.
Chemische Synthese
In einer bevorzugten synthetischen Methode werden die Peptide nach der Festphase-Synthesemethode hergestellt, die zuerst von Merrifield in J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149–2154 (1963) beschrieben wurde. Andere Methoden finden sich beispielsweise bei M. Bodanszky, et al., Peptide Synthesis, zweite Ausgabe, (John Wiley & Sons, 1976) sowie in anderen Literaturarbeiten, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind.
Geeignete Schutzgruppen, die in derartigen Synthesen verwendbar sind, sowie deren Abkürzungen finden sich in der vorgenannten Literatur sowie bei J. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, (Plenum Press, New York, 1973). Die hierin am häufigsten verwendeten Schutzgruppen sind: tert-Butyloxycarbonyl (Boc), Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC), Benzyl (Bzl), Tosyl (Tos), o-Bromphenylmethoxycarbonyl (BrCBZ oder BrZ), Phenylmethoxycarbonyl (CBZ oder Z), 2-Chlorphenylmethoxycarbonyl, (2-Cl-CBZ oder Cl-Z), 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl (Mtr), Formyl (CHO) und tert-Butyl (t-Bu), Trifluoressigsäure (TFA), Dichlormethan (CH₂Cl₂), N,N-Diisopropylethylamin (DIEA), N-Methylpyrrolidon (NMP), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), Dimethylsulfoxid (DMSO), Essigsäureanhydrid (Ac₂O).
Allgemeine Syntheseprozeduren für die Synthese von Peptiden mit Hilfe der Peptidsynthese in Festphase unter Anwendung des N^α-Boc-Schutzes.
Allgemeine Syntheseprozeduren für die Peptidsynthese in Festphase unter Anwendung des N^α-FMOC-Schutzes.
Die N-terminale Acetylierung an der deprotektierten N^α-Aminogruppe von Peptiden, die unter Anwendung entweder der Boc- oder FMOC-Strategien synthetisch dargestellt werden, wird erreicht mit 10% Ac₂O und 5% DIEA in NMP, gefolgt von einer Wäsche des Peptidharzes mit NMP und/oder CH₂Cl₂.
Expressionssysteme
Wie in den nachfolgenden Beispielen demonstriert wird, handelt es sich bei den sulfatierten, glykosylierten PSGL-1-Peptiden, die hierin beschrieben werden und an P-Selectin binden, um solche, die über mindestens eine Sulfatbindung an einem Tyrosin-Rest und eine entsprechende Glykosylierung verfügen. Vergleichsuntersuchungen von rekombinanten PSGL-1, die in Mammalia-Zellen exprimiert sind (COS-Zellen) und die eine Fucosyltransferase mit gereinigtem nativen PSGL-1 exprimieren, haben gezeigt, dass die Glykosylierung weitgehend anders ist. Es ist daher ein neues Expressionssystem entwickelt worden, das zu einer natürlicheren Glykosylierung von PSGL-1 führt. Das Expressionssystem beruht auf einem Mammalia-Expressionssystem, das mindestens 2 Glykosyltransferasen exprimiert: Fucosyltransferase III (FTIII) und Kern-2-β1-6-N-Acetylglucosaminyltransferase. In einer bevorzugten Vorgehensweise basiert die Zelllinie auf einer gut charakterisierten Expressionslinie, wie beispielsweise COS- oder CHO-Zellen, die mit der cDNA transfiziert sind, die die zwei Enzyme codiert. Diese cDNA sind nachfolgend als Sequenzlisten ID-Nr. 2 bzw. 3 gezeigt. Die Sequenzliste ID-Nr. 2 codiert eine Human-α(1,3/1,4)Fucosyltransferase (FTIII), die von Kukowska-Latallo, et al. in Genes & Devel. 4, 1288–1303 (1990) beschrieben wurde. Die Sequenzliste ID-Nr. 3 codiert Kern-2-β 1-6-N-Acetylglucosaminyltransferase (EC 2.4.1.102), wie von Bierhuizen und Fukuda, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9326–9330 (1992) berichtet wurde. Frühere Untersuchungen haben versagt, die Bedeutung der Kern-2-6-N-Acetylglucosaminyltransferase oder zur Modifikation von PSGL-1 hinsichtlich ihres Beitrages zum Binden an P-Selectin zu erkennen. Alternativ kann das Expressionssystem auf der Grundlage der Expression entweder eines oder beide Enzyme in natürlicher Weise gewählt werden, wobei das zweite Enzym nach Erfordernis durch Transfektion bereitgestellt wird.
Die cDNA werden in die Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren und wahlweise Verstärker und Selektionssequenzen eingeführt.
Bevorzugte Promotoren, die die Transkription von Vektoren in Mammalia-Wirtszellen kontrollieren, können aus zahlreichen Quellen erhalten werden, wie beispielsweise die Genome von Viren, z. B.: Simian-Virus 40 (SV40), Adenovirus, Retroviren, Hepatitis-B-Virus und am meisten bevorzugt Zytomegalivirus, oder von heterologen Mammalia-Promotoren, z. B. beta-Aktin-Promotor. Die ersten und letzten Promotoren des SV40-Virus werden mühelos als ein SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Ursprung der Replikation enthält. Siehe hierzu Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978). Der unmittelbare erste Promotor des Human-Zytomegalivirus wird mühelos als ein HindIII-Restriktionsfragment erhalten. Siehe hierzu Greenaway, P. J. et al., Gene 18 355–360 (1982). Selbstverständlich sind auch Promotoren von der Wirtszelle oder verwandte Spezies verwendbar.
Die Transkription einer DNA, die ein gewünschtes Protein durch höhere Eukaryoten codiert, wird durch Inserieren einer Verstärkersequenz in den Vektor erhöht. Die Verstärker (("Enhancer")) sind cis-wirkende Elemente der DNA mit in der Regel etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor zur Erhöhung seines Vermögens zur Einleitung der Transkription einwirken. Verstärker, die relativ orientierungs- und positionsunabhängig sind, sind im Bezug auf 5' (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993) und 3' (Lusky, M. L., et al., Mol. Cell Cio. 3: 1108 (1983)) zu der Transkriptionseinheit im Inneren eines Introns (Banerji, J. L. et al., Cell 33: 729 (1983)) sowie im Inneren der codierenden Sequenz selbst (Osborne, T. F., et al., Mol. Cell Bio. 4 1293 (1984)) gefunden worden. Es sind hier zahlreiche Verstärkersequenzen von Mammalia-Genen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Im typischen Fall wird man jedoch einen Verstärker von einem eukaryotischen Zellvirus verwenden. Beispiele schließen den SV40-Verstärker an der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270) ein, den frühen Promotor-Verstärker des Zytomegalivirus, Polyoma-Verstärker an der späten Seite des Replikationsursprunges und die Adenovirus-Verstärker.
In eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilz, Insekt, Pflanze, Tier, Mensch oder kernhaltige Zellen) verwendete Expressionsvektoren können auch Sequenzen enthalten, die für die Terminierung der Transkription erforderlich sind, die die mRNA-Expression beeinträchtigen können. Diese Bereiche werden als polyadenylierte Segmente in dem nichttranslatierten Abschnitt der mRNA transkribiert, die das gewünschte Protein codiert. Die 3'-nichttranslatierten Regionen schließen auch Terminationsstellen der Transkription ein.
Expressionsvektoren können auch ein Selektionsgen oder selektierbare Marker enthalten. Beispiele für geeignete selektierbare Marker für Mammalia-Zellen sind Dihydrofolatreduktase (DHFR), Thymidinkinase oder Neomycin. Wenn die selektierbaren Marker erfolgreich in eine Mammalia-Wirtszelle transferiert sind, überlebt die transformierte Mammalia-Wirtszelle, wenn sie unter einen selektiven Druck gesetzt wird. Es gibt zwei weitverbreitete unterschiedlilche Kategorien von selektiven Regimen. Die erste Kategorie beruht auf einen Zellstoff-Stoffwechsel und der Verwendung einer mutanten Zelllinie, der die Fähigkeit fehlt, unabhängig von einem angereicherten Medium zu wachsen. Zwei Beispiele dafür sind: DHFR-minus-CHO-Zellen und Maus-LTK-Zellen. Diesen Zellen fehlt die Fähigkeit ohne den Zusatz solcher Nährmittel wie Thymidin oder Hypoxanthin zu wachsen. Da diesen Zellen bestimmte Gene fehlen, die für einen vollständigen Nucleotid-Syntheseweg benötigt werden, können sie so lange nicht überleben, wie die fehlenden Nucleotide in einem angereicherten Nährmedium bereitgestellt werden. Eine Alternative für die Nährstoffanreicherung des Mediums ist die Einführung eines intakten DHFR- oder TK-Gens in Zellen, denen die entsprechenden Gene fehlen, wodurch deren Wachstumsanforderungen verändert werden. Einzelne Zellen, die nicht mit dem DHFR- oder TK-Gen transformiert sind, werden nicht in der Lage sein, in nicht mit Nährstoff angereicherten Medien zu überleben.
Bei der zweiten Kategorie handelt es sich um eine dominante Selektion, die auf ein Selektionsschema beruht, das in jedem beliebigen Zelltyp verwendet wird und nicht die Verwendung einer mutanten Zelllinie erfordert. Bei diesen Schemen wird im typischen Fall ein Medikament verwendet, um das Wachstum einer Wirtszelle aufzuhalten. Solche Zellen, die über ein neues Gen verfügen, würden ein Protein exprimieren, das Medikamentenresistenz überträgt, und sie würden die Selektion überleben. Beispiele einer solchen dominanten Selektion verwenden die Medikamente Neomycin (Southern, P. und Berg, P., J. Molec, Appl. Genet. 1: 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan, R. C. und Berg, P. Science 209: 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol, 5 410–413 (1985)). Bei den drei vorstehend gegebenen Beispielen werden bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle eingesetzt, um dem entsprechenden Medikament G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin Resistenz zu vermitteln.
"Amplifikation" bezieht sich auf die Erhöhung oder Replikation einer isolierten Region innerhalb einer chromosomalen DNA einer Zelle. Amplifikation wird unter Verwendung eines Selektionsmittels erzielt, z. B. Methotrexat (MTX), das die DHFR inaktiviert. Amplifikation oder die Erzeugung von successiven Kopien des DHFR-Gens führen angesichts größerer MTX-Mengen zu einer Erzeugung größerer Mengen von DHFR. Der Amplifikationsdruck wird unabhängig von dem Vorhandensein einer endogenen DHFR aufgebracht, indem immer größere Mengen MTX den Nährstoffmedien zugesetzt werden. Die Amplifikation eines gewünschten Gens kann dadurch erzielt werden, dass eine Mammalia-Wirtszelle mit einem Plasmid cotransfiziert wird das über eine DNA verfügt, die ein gewünschtes Protein codiert, sowie über das DHFR- oder Amplifikationsgen, welches die Cointegration zulässt. Man stellt sicher, dass die Zelle mehr DHFR benötigt, wobei diese Anforderung durch Replikation des Selektionsgens erfüllt wird, indem lediglich auf Zellen selektiert wird, die in Gegenwart noch größerer MTX-Konzentrationen wachsen können. So lange das Gen, das ein gewünschtes heterologes Protein codiert, mit dem Selektionsgen cointegriert wurde, führt die Replikation dieses Gens zur Replikation des Gens, das das gewünschte Protein codiert. Das Ergebnis besteht darin, dass vermehrte Kopien des Gens, d. h. ein amplifiziertes Gen, welches das gewünschte heterologe Protein codiert, mehr von dem gewünschten heterologen Protein exprimiert.
Bevorzugte geeignete Wirtszellen zum Exprimieren der Vektoren in höheren Eukaryoten schließen ein: Affennieren-CVI-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); Human-embryonale Nieren-Linie (293, Graham, F. L. et al. J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); Baby-Hamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Ovarialzellen-DHFR des chinesischen Hamsters (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4216, (1980)); Maus-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, J. P., Biol. Reprod. 23: 243–251 (1980)); Affennierenzellen (CVI ATCC CCL 70); Nierenzellen des afrikanischen Grünaffen (VERO-76, ATCC CRL-1587); Cervix-Karzinomzellen des Menschen (HELA, ATCC CCL 2); Nierenzellen des Hundes (MDCK, ATCC CCL 34); Leberzellen der Büffetratte (BRL 3A, ATCC CRL 1442); Lungenzellen des Menschen (W138, ATCC CCL 75); Leberzellen des Menschen (hep G2, HB 8065); Brusttumor der Maus (MMT 060562, ATCC CCL51); und TRI-Zellen (Mather, J. P. et al., Annals N. Y. Acad. Sci 383; 44–68 (1982)). Die Wirtszellen können mit den Expressionsvektoren transformiert und in konventionellen Nährstoffmedien aufgezogen werden, die nach Erfordernis für das Auslösen von Promotoren, das Auswählen von Transformanten oder amplifizierenden Genen modifiziert wurde. Die Aufzuchtbedingungen, wie beispielsweise Temperatur und pH-Wert, sind solche, wie sie früher im Zusammenhang mit der für die Expression ausgewählten Wirtszelle verwendet wurden.
Herstellung von diagnostischen und therapeutischen Mitteln die hergeleitet sind von den Protein- oder Kohlehydratkomponenten des Glykoprotein-Liganden für P-Selectin
Der vorstehend beschriebene Glykoprotein-Ligand für P-Selectin verfügt über eine Vielzahl von Anwendungen als Diagnostikreagens und potentiell bei der Behandlung zahlreicher Entzündungskrankheiten und thrombotischer Erkrankungen.
Diagnostikreagentien
Antikörper zu dem Liganden können für Nachweis von Erkrankungen des Menschen verwendet werden, indem P-Selectin-Liganden defekt sein könnten. Derartige Erkrankungen sind am ehesten bei Patienten mit erhöhter Empfindlichkeit für Infektionen anzutreffen, in denen Leukozyten nicht in der Lage sind, an aktivierten Thrombozyten oder Endothel zu binden. Es werden zu testende Zellen, bei denen es sich normalerweise um Leukozyten handelt, mit Hilfe von medizinisch anerkannten Methoden gesammelt und einem Screening unterworfen. Detektionssysteme schließen ELISA-Prozeduren ein, das Binden von radiomarkiertem Antikörper an immobilisierten aktivierten Zellen, Durchflusszytometrie, Immunperoxidase- oder Immunogold-Analyse oder andere der Fachwelt bekannten Methoden.
Antikörper, die speziell auf Protein- oder Kohlehydrat-Komponenten des Liganden gerichtet sind, lassen sich verwenden, um Defekte in der Expression des Kernproteins oder in Glykosyltransferasen und/oder modifizierenden Enzymen zu unterscheiden, die die entsprechenden Oligosaccharidketten auf dem Protein aufbauen. Die Antikörper können auch zum Screening von anderen Zellen und Geweben als den Leukozyten zur Expression der Protein- oder Kohlehydratkomponenten des Liganden für P-Selectin verwendet werden.
Es können komplementäre DNA-Klone, die die Proteinkomponente des Liganden codieren, isoliert und sequenziert werden. Diese cDNA-Sonden können als Diagnostikreagentien zur Untersuchung der Expression von RNA-Transkripten für den Liganden in Leukozyten und anderen Geweben mit Hilfe von Standardprozeduren verwendet werden, wie beispielsweise das Northern-Blotting von RNA, die aus Zellen isoliert ist, und in situ-Hybridisierung von Gewebeschnitten.
Ein ähnliches Vorgehen kann angewendet werden, um Störungen von P-Selectin selbst qualitativ oder quantitativ zu bestimmen. Der Glykoprotein-Ligand, Kohlehydrate oder geeignete Derivate davon werden markiert und auf deren Fähigkeit getestet, sich an P-Selectin auf aktivierten Thrombozyten von Patienten mit Erkrankungen zu binden, in denen P-Selectin defekt sein könnte.
Der Ligand oder Komponenten davon können auch in Assays von sich bindendem P-Selectin verwendet werden, um ein Screening auf Verbindungen durchzuführen, die die Wechselwirkungen von P-Selectin mit dem Liganden blockieren.
Klinische Anwendungen
Da P-Selectin über mehrere Funktionen im Zusammenhang mit Leukozytenanhaftung, Entzündung, Tumormetastasen und Blutgerinnung verfügt, können Verbindungen, die in das Binden von P-Selectin und/oder den anderen Selectinen eingreifen, einschließlich E-Selectin und L-Selectin, wie beispielsweise Kohlehydrate, klinisch verwendet werden, um diese Reaktionen zu modellieren. Diese Verbindungen schließen PSGL-1 oder Fragmente davon, Antikörper auf PSGL-1 oder Fragmente davon ein. Beispielsweise kann der Glykoprotein-Ligand oder Komponenten davon und speziell die Kohlehydrat-Teile verwendet werden, um die Leukozytenanhaftung durch kompetitives Binden an P-Selectin zu hemmen, das auf der Oberfläche von aktivierten Thrombozyten oder Endothelzellen exprimiert ist. In ähnlicher Weise können Antikörper zu dem Liganden verwendet werden, um die durch P-Selectin vermittelte Zellenanhaftung durch kompetitives Binden an den P-Selectin-Liganden auf Leukozyten oder anderen Zellen zu blockieren. Diese Therapien sind in akuten Situationen dort anwendbar, wo eine wirksame und jedoch vorübergehende Hemmung der Leukozyten-vermittelten Entzündung angestrebt wird. Darüber hinaus kann eine Behandlung chronischer Erkrankungen durch länger anhaltende Verabreichung von Mitteln wie beispielsweise durch subkutane oder orale Verabreichung praktiziert werden.
Sofern sie nicht bekämpft wird, kann eine entzündliche Reaktion für den Wirt eine Schädigung hervorrufen, da Leukozyten zahlreiche toxische Moleküle freisetzen, die normale Gewebe beschädigen können. Diese Moleküle schließen proteolytische Enzyme und Freie Radikale ein. Beispiele für pathologische Situationen, in denen Leukozyten eine Gewebeschädigung hervorrufen können, Verletzung durch Ischämie und Reperfusion ein, bakterielle Sepsis und Ausstreuung einer intravaskulären Blutgerinnung, Schocklunge, Tumormetastase, rheumatoide Arthritis und Atherosklerose ein.
Ein Hauptproblem in der klinischen Kardiologie ist eine Reperfusionsschädigung. Therapeutische Mittel, die die Leukozytenanhaftung im ischämischen Myocardium verringern, können die therapeutische Wirksamkeit von thrombolytischen Mitteln erheblich steigern. Die thrombolytische Therapie mit Mitteln, wie beispielsweise Gewebeplasminogen-Aktivator oder Streptokinase, können bei vielen Patienten mit schwerer Myocardischämie vor einem irreversiblen Myocard-Zelltod die Blockierung der Herzkranzarterie beheben. Trotz der Wiederherstellung des Blutflusses leiden jedoch viele dieser Patienten noch an Myocardneurose. Von dieser "Reperfusionsschädigung" ist bekannt, dass sie der Anhaftung von Leukozyten an vaskulärem Endothel in der ischämischen Zone im Zusammenhang steht, wahrscheinlich zum Teil aufgrund einer Aktivierung von Thrombozyten und Endothel durch Thrombin und Zytokine, die sie für Leukozyten adhäsiv machen (Romson et al., Circulation 67: 1016–1023, 1983). Diese anhaftenden Leukozyten können durch das Endothel wandern und ischämisches Myocardium genau dann zerstören, wenn es durch Wiederherstellung des Blutflusses behoben wurde.
Es gibt eine Reihe anderer häufiger klinischer Störungen, bei denen Ischämie und Reperfusion zu einer Organschädigung führen, die durch Anhaftung von Leukozyten an Gefäßoberflächen vermittelt wird, einschließlich Schlaganfälle; mesenteriale und periphere Gefäßerkrankung; Organtransplantation; sowie Kreislaufschock (in diesem Fall könnten viele Organe nach der Wiederherstellung des Blutdurchflusses geschädigt werden).
Bakterielle Sepsis und disseminierte intravasale Koagulation treten oftmals bei kritisch kranken Patienten gleichzeitig auf. Dieses ist begleitet von der Erzeugung von Thrombin und Zytokinen und anderen Entzündungsauslösern, die Aktivierung von Thrombozyten und Endothel und die Anhaftung von Leukozyten und die Zusammenballung von Thrombozyten im gesamten Gefäßsystem. Die Leukozyten-abhängige Organschädigung ist ein wichtiges Merkmal für diese Beschwerden.
Das Atemnotsyndrom der Erwachsenen ist eine zerstörerische Lungenkrankheit, die bei Patienten mit Sepsis oder nach einem Trauma auftritt und die begleitet ist von einer verbreiteten Anhaftung und Zusammenballung von Leukozyten in dem pulmonalem Kreislauf. Dieses führt zu einer Extravasation großer Mengen von Plasma in die Lungen und zur Zerstörung von Lungengewebe, die beide zum großen Teil durch Leukozytenprodukte ausgelöst werden.
Zwei miteinander verwandte Lungenerkrankungen, die oftmals tödlich sind, treten bei immunosupprimierten Patienten auf, bei denen eine allogene Knochenmarktransplantation vorgenommen wurde, und bei Krebspatienten, die an Komplikationen leiden, die sich aus einem allgemeinen Gefäßaustritt ergeben und aus einer Behandlung mit Interleukin-2-behandelten LAK-Zellen (Lymphokinaktivierte Lymphozyten) resultieren. Von den LAK-Zellen ist bekannt, dass sie an Gefäßwandungen haften und Produkte freisetzen, die für das Endothel vermutlich toxisch sind. Obwohl der Mechanismus, nachdem LAK-Zellen an Endothel haften, nicht bekannt ist, könnten derartige Zellen möglicherweise Moleküle freisetzen, die das Endothel aktivieren und dann an Endothel über Mechanismen binden, die ähnlich denen sind, die in Neutrophilen wirken.
Durch das Gefäßsystem können Tumorzellen von vielen bösartigen Geschwulsten (einschließlich Karzinoms, Lymphoma und Sarkoma) bis in entfernte Stellen metastasieren. Die Mechansimen der Anhaftung von Tumorzellen an Endothel und ihre anschließende Migration sind nicht voll aufgeklärt, können jedoch mindestens in einigen Fällen ähnliche denen der Leukozyten verlaufen. Speziell ist von bestimmten Karzinomzellen nachgewiesen worden, dass sie sowohl an E-Selectin binden, wie von Rice und Bevilacqua berichtet wurde (Science 246: 1303–1306 (1991)) als auch an P-Selectin, wie von Aruffo, et al. berichtet wurde (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2292–2296 (1992)), Stone and Wagner, I. Clin. Invst. 92: 804–813 (1992). Der Zusammenhang von Thrombozyten mit metastasierenden Tumorzellen ist gut beschrieben worden und legt nahe, dass Thrombozyten bei der Ausbreitung einiger Krebserkrankungen eine Rolle spielen. Da P-Selectin auf aktivierten Thrombozyten exprimiert wird, wird angenommen, dass es in Verbindung mit Thrombozyten mindestens bei einigen malignen Tumoren beteiligt ist.
Von den Wechselwirkungen Thrombozyt/Leukozyt wird angenommen, dass sie in der Atherosklerose von Bedeutung sind. Thrombozyten könnten eine Rolle bei der Rekrutierung von Monozyten in atherosklerotische Plaques spielen; wobei die Häufung von Monozyten bekanntermaßen eines der ersten nachweisbaren Ereignisse im Verlaufe der Atherogenese ist. Das Aufreißen von vollständig entwickeltem Plaque kann nicht nur zur Thrombozytenablagerung und Aktivierung führen und zur Förderung der Bildung eines Thrombus, sondern auch zu einer frühen Rekrutierung von Neutrophilen zu einem Ischämiebereich. P-Selectin ist auch unzureichend auf der Oberfläche Endothelzellen exprimiert, die Atheromas überlagern, wo es die erste Anhaftung von Monozyten vermitteln kann, die anschließend in das Atheroma einwandern (Johnson-Tidey, et al., Am. J. Path. 144: 952–961, 1994).
Ein anderes Gebiet einer möglichen Anwendung ist die Behandlung von rheumatoider Arthritis und anderer Autoimmun- oder Entzündungserkrankungen.
In diesen klinischen Anwendungen lassen sich die Peptide oder das isolierte O-Glykan oder Fragment davon, wie sie hierin beschrieben wurden, verabreichen, um Selectin-abhängige Wechselwirkungen durch kompetitives Binden an P-Selectin zu blockieren, das auf aktivierten Zellen exprimiert ist. Darüber hinaus lassen sich Antikörper zu dem Protein und/oder den Kohlehydrat-Komponenten des Liganden oder von Fragmenten davon verabreichen. Die Antikörper stammen vorzugsweise aus einer menschlichen Quelle oder sind so modifiziert, dass sie solche Abschnitte deletieren, die aller Wahrscheinlichkeit nach eine Immunantwort-auslösende Reaktion hervorrufen.
Die hierin beschriebenen Peptide können auch als ein pharmazeutisch zulässiges Säure- oder Base-Additionssalz verabreicht werden, das durch Reaktion mit anorganischen Säuren erzeugt wird, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure; sowie organischen Säuren, wie beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Propansäure, Glykolsäure, Milchsäure, Pyruvinsäure, Oxalsäure, Malonsäure, Succinsäure, Maleinsäure und Fumarsäure; oder durch Reaktion mit einer anorganischen Base, wie beispielsweise Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid; sowie organischen Basen, wie beispielsweise Mono-, Di-, Trialklyl- und Arylamine und substituierte Ethanolamine.
Kohlenhydrat-Komponenten (die O-Glykan-Strukturen oder Komponenten davon) des Liganden oder der Antikörper werden in einem geeigneten pharmazeutischen Träger vorzugsweise intravenös verabreicht, wo eine sofortige Freisetzung erforderlich ist. Das Kohlenhydrat/Die Kohlenhydrate können auch intramuskulär, intraperitoneal, subkutan, oral, als das Kohlenhydrat, mit einem Trägermolekül konjugiert oder in einer Vorrichtung zur Arzneimittelzuführung verabreicht werden. Um seine in vivo-Halbwertszeit zu erhöhen, kann das Kohlenhydrat chemisch modifiziert werden.
Das Kohlenhydrat kann von Zellen, die das Kohlenhydrat exprimieren, entweder auf natürlichem Wege oder als Ergebnis einer gentechnischen Bearbeitung entsprechend der Beschreibung in den Beispielen für transfizierte Mammalia-Zellen oder vorzugsweise mit Hilfe synthetischer Maßnahmen isoliert werden. Diese Methoden sind der Fachwelt bekannt. Außerdem ist eine große Zahl von zusätzlichen Glykosyltransferasen geklont worden (J. C. Paulson und K. J. Colley, J. Biol. Chem. 264: 17615–17618, 1989). Dementsprechend können Wissenschaftler, die mit dem Gebiet vertraut sind, eine Kombination von Synthesechemie und enzymatischer Synthese anwenden, um Pharmazeutika oder Diagnostikreagentien zu erzeugen.
Kohlenhydrate, die biologisch aktiv sind, sind solche, die das Binden von Leukozyten an P-Selectin hemmen. Geeignete pharmazeutische Vehikel zur Verabreichung an einen Patienten sind der Fachwelt bekannt. Bei der parenteralen Verabreichung wird das Kohlenhydrat in der Regel in sterilem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst oder suspendiert. Bei enteraler Verabreichung wird das Kohlenhydrat in einen inerten Träger in einer Tablette, Flüssigkeit oder in Kapselform eingebaut. Geeignete Träger können Stärken oder Zucker sein und schließen Gleitmittel ein, Geschmackstoffe, Bindemittel und andere Materialien der gleichen Beschaffenheit. Das Kohlenhydrat kann auch lokal auf einer Wunde oder einer entzündeten Stelle durch topische Aufbringung einer Lösung oder einer Creme verabreicht werden.
Alternativ kann das Kohlenhydrat in, auf oder als Bestandteil von Liposomen oder Mikrokügelchen (oder Mikropartikeln) verabreicht werden. Methoden für die Herstellung von Liposomen und Mikrokügelchen zur Verabreichung an einen Patienten sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. In der US-P-4 789 734 werden Methoden zum Verkapseln biologischer Materialien in Liposomen beschrieben. Im Wesentlichen wird das Material in einer wässrigen Lösung aufgelöst, die geeigneten Phospholipide und Lipide zusammen mit den Tensiden nach Erfordernis zugesetzt und das Material nach Erfordernis dialysiert oder beschallt. Eine gute Übersicht über bekannte Methoden ist die von G. Gregoriadis, Kapitel 14, "Liposomen" in Drug Carriers in Biology and Medicine, S. 287–341 (Academic Press, 1979). Aus Polymeren oder Proteinen erzeugte Mikrokügelchen sind der Fachwelt gut bekannt und können zur Passage durch den gastrointestinalen Trakt direkt in den Blutstrom zugeschnitten werden. Alternativ kann das Kohlenhydrat eingebaut und die Mikrokügelchen oder der Verbund von Mikrokügelchen für eine langsame Freisetzung über eine Zeitdauer implantiert werden, wobei die Zeitdauer von Tagen bis zu Monaten reicht. Siehe hierzu beispielsweise die US-P-4 906 474, 4 925 673 und 3 625 214.
Die Kohlenhydrate sollten bei parenteraler Verabreichung in Mengen oberhalb von etwa 1 μg/kg Körpergewicht aktiv sein. Bei Behandlung der meisten Entzündungserkrankungen liegt die Dosis im Bereich zwischen 0,1 bis 30 mg/kg Körpergewicht. Eine Dosierung von 70 mg/kg kann bei einigen Kohlenhydraten erforderlich sein, die in den "Beispielen" charakterisiert sind.
Die Kriterien zur Bewertung der Reaktion auf therapeutische Modalitäten unter Einsatz von Antikörpern oder Kohlenhydrat werden durch den speziellen Krankheitszustand bestimmt und folgen generell der Standardpraxis der Medizin. Beispielsweise werden die Kriterien für die wirksame Dosierung zur Verhütung der Ausdehnung eines Herzinfarktes vom Fachmann festgelegt, indem er einen Blick auf Markenenzyme von Myokardnekrose in dem Plasma wirft, in dem das Elektrokardiogramm, Vitalitätsanzeichen und klinische Werte kontrolliert werden. Bei Behandlung eines akuten Atemnotsyndroms würde man Verbesserungen des arteriellen Sauerstoffes, die Auflösung von pulmonalen Infiltraten und klinische Verbesserung untersuchen, die anhand einer verlangsamten und beschleunigten Atmung gemessen werden. Bei der Behandlung von Patienten im Schock (geringer Blutdruck) würde die wirksame Dosierung auf klinischen Werten und speziellen Messungen der Funktion vitaler Organe beruhen, wie beispielsweise der Leber und der Niere nach der Wiederherstellung des Blutdruckes. Bei Patienten mit Schlaganfall würde die neurologische Funktion beobachtet werden. Spezielle Tests werden zur Beobachtung des Funktionierens von transplantierten Organen angewendet, beispielsweise Serum-Kreatinin, Urinfluss und Serum-Elektrolyten in Patienten, die eine Nierentransplantation erhalten haben.
Die vorliegende Erfindung und Beispiele werden unter Bezugnahme der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele besser verstanden.
Beispiel 1: Bestimmung der Struktur und Funktion der an PSGL-1 ansitzenden Oligosaccharide
Es wurden die Einflüsse der verschiedenen Glykosidasen auf die Struktur und Funktion von PSGL-1 von Human-Neutrophilen bestimmt. Dieses Molekül ist anders als das in COS-Zellen mit FTIII exprimierte, rekombinante PSGL-1 im Großen und Ganzen gegenüber einer Behandlung mit Endo-α-N-Acetylgalactosaminidase resistent, was nahelegt, dass es über wenige einfache Kern-1-Galβ1-3GalNAc-Disaccharide verfügt, die mit Serin oder Threonin verknüpft sind. Human-Neutrophil-PSGL-1 zeigt sLe^x und dessen nicht sialylierten Gegenspieler, Le^x, hauptsächlich auf O-verknüpftem Poly-N-Acetyllactosamin. Diese Daten lassen vermuten, dass PSGL-1 auf Human-Neutrophilen ein Gebiet von sialyliertem, fucosyliertem, O-verknüpftem Poly-N-Acetyllactosamin präsentiert, das bevorzugt P-Selectin im Vergleich zu rekombinantem PSGL-1 erkennt, das in COS-Zellen mit FTIII exprimiert ist.
Es wurden die Einflüsse von Glykosidasen auf gereinigtem, radioiodiertem PSGL-1 von Human-Neutrophilen untersucht, um die Struktur und Funktion der ansitzenden Oligosaccharide weiter zu charakterisieren. Von PSGL-1 wurde festgestellt, dass es über Poly-N-Acetyllactosamin vertilgt, von denen lediglich ein Teil mit Endo-β-Galactosidase entfernt werden kann. Die Mehrheit der Le^x- und sLe^x-Strukturen waren Endo-β-Galactosidase-empfindliche Ketten. Peptid: N-Glykosidase-F (PNGase-F)-Behandlung entfernte mindestens zwei der drei möglichen N-verknüpften Oligosaccharide von PSGL-1. Die Expression von der Le^x und sLe^x war durch den PNGase-F-Abbau nicht nachweisbar verändert, was zeigt, dass diese Strukturen hauptsächlich auf O-verknüpftem Poly-N-Acetyllactosamin sind. Endo-β-Galactosidase-behandeltes PSGL-1 bewahrte seine Fähigkeit zum Binden an P-Selectin, was vermuten lässt, dass einige der Oligosaccharide, die durch P-Selectin erkannt werden, sich entweder auf Enzym-resistentem Poly-N-Acetyllactosamin befinden oder auf Ketten, denen Poly-N-Acetyllactosamin fehlt. Die PNGase-F-Behandlung beeinträchtigte nicht die Fähigkeit von PSGL-1 zum Binden an P-Selectin, was demonstriert, dass die Oligosaccharide, die für die P-Selectin-Erkennung benötigt werden, O-verknüpft sind. Diese Daten zeigen, dass PSGL-1 von Human-Neutrophilen ein komplexes, sialyliertes und fucosyliertes, O-verknüpftes Poly-N-Acetyllactosamin zeigt, das ein Hochaffinitäts-Binden an P-Selectin unterstützt.
Materialien und Methoden
Es wurden die folgenden Abkürzungen verwendet: CHO, Ovarien des Chinesischen Hamsters; Con A, Concanavalin A; HSA, Humanserumalbumin; Le^x, Lewis-x; PBS, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung; PAGE, Polyacrylamid-Gelelektrophorese; PNGase-F, Peptid: N-Glykosidase-F; PSGL-1, P-Selectin-Glykoprotein-Ligand-1; sLe^x, Sialyl-Lewis-x; tES, abgestumpftes lösliches E-Selectin; tPS, abgestumpftes lösliches P-Selectin; WGA, Weizenkeim-Agglutinin.
Materialien: Triton X-100, Brij-58 und Sialidase von Arthrobacter ureafaciens (75 U/mg, EC 3.2.1.18) wurden von der CalBioChem-Behring Corp. (La Jolla, CA) erhalten. Iodobeads^®, 3 M Emphaze^® Biosupport Medium und Protein A-Sepharose-CL4B kam von Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). Endo-β-Galactosidase von Escherichia freundii (5 U/mg, EC 3.2.1.103) wurde von V-Labs, Inc. (Covington, LA) erhalten. Streptomyces sp. 142 α1,3/4-L-Fucosidase (EC 3.2.1.51) wurde von der PanVera Corp. (Madison, WI) und β-N-Acetylglucosaminidase von Jack Bean (EC 3.2.1.30, 53 U/mg) von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. Rekombinantes Peptid: N-Glykosidase-F (EC 3.2.2.18, 25.000 U/mg, PNGase-F) und Endo-α-N-Acetylgalactosaminidase von Diplococcus pneumoniae (EC 3.2.1.97, O-Glykanase^®) wurden von der Genzyme Corp. (Cambridge, MA) erhalten, Concanavalin A-Sepharose (Con A, 10 mg/ml-Harz), wurde von der Pharmacia/LKB (Uppsala, Schweden) erhalten. Weizenkern-Agglutinin (WGA)-Agarose (7,6 mg/ml-Harz) und Tomatenlektin wurden von Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, VT) erhalten. Tomatenlektin wurde an Bromcyan-aktivierte Sepharose bis zu einer Dichte von 2 mg/ml Harz in Gegenwart von 7,5 mg/ml Chitotriose gekoppelt.
Antikörper: Das Antihuman-P-Selectin mAbs S12 und G1 wurden hergestellt und charakterisiert, wie bereits von McEver und Martin (1984), Geng, et al., (1990) beschrieben wurde. Das Antihuman-E-Selectin mAbs CL2 und CL37 (Mulligan, et al., J. Clin. Invest. 88, 1396–1406 (1991)) wurden von C. Wayne Smith (Baylor College of Medicine, Houston, TX) bereitgestellt. LeuM1 (CD15, IgM) wurde von Becton-Dickinson & Company (San Jose, CA) erworben. Die CSLEX-1-Hybridoma (HB 8580) wurden von der American Type Culture Collection erworben und das IgM mAb wurden von Ascites-Fluid durch Borsäureausfällung und Gelfiltration auf Sepharose CL4B in PBS, pH 7,4 entsprechend der Beschreibung von Shattil, et al., J. Biol. Chem. 260, 11107–11114 (1985) gereinigt. Ziege-Antimaus-μ-Ketten-spezifisches IgG und MOPC104E (IgM) wurden von Cappel-Organon Technika (Durham, NC) erworben.
Peptid-Antiseren-Erzeugung und Immunpräzipitation
Peptide, die den Resten 42 bis 56 (QATEYEYLDYDFLPEC) (Seq. ID-Nr. 1) und 354 bis 376 (CISSLLPDGGEGPSATANGGLSK) (Seq. ID-Nr. 1) der cDNA-derivierten Aminosäuresequenz von PSGL-1 entsprechen, wurden auf einer Peptidsynthetisiervorrichtung von Applied Biosystems, Model 431, synthetisiert. Das Peptid 42 bis 56 wurde an Maleinimid-aktiviertes Schlüsselloch-Archäogastropoda-Hämocyanin (Pierce Chemical Co.) über das hinzugefügte Cystein gebunden und Neuseeländischen Weißen Kaninchen injiziert (Montana State University Animal Resources Center). Die Immunseren wurden gesammelt und zur Immunpräzipitation von ¹²⁵I-PSGL-1 verwendet. Die Protein A-Perlen (25 μl, 50%ige Suspension) wurden mit 1 μl einer 1 : 4-Verdünnung entweder von normalem oder immunem Kaninchenserum für 90 min bei 37°C vorinkubiert. Die Perlen wurden einmalig mit 0,1 M NaCl, 20 mM MOPS, pH 7,5, 0,1 % Triton X-100 (MBS/0,1 % Triton) gewaschen. Sodann wurde gereinigtes ¹²⁵I-PSGL-1 oder radioiodiertes WGA-Eluat mit den Perlen in Gegenwart oder bei Abwesenheit von 0,2 mg/ml entweder des immunisierenden Peptids oder des PSGL-1-Peptids 354–376 inkubiert, das als eine Negativkontrolle diente. Nach einer Inkubationszeit von 90 min bei 37°C wurden die Perlen 5 Mal mit MBS/0,1 % Triton gewaschen und durch Sieden für 5 min mit SDS-Probepuffer eluiert (Laemmli, Nature 227, 680–685 (1970)). Die Immunpräzipitate wurden mit Hilfe der SDS-PAGE analysiert, gefolgt von einer Autoradiographie.
Erzeugung von CHO-D^–-Zellen, die stabil eine lösliche Form von E-Selectin exprimieren. Ein Expressionsplasmid (ELAM-1: BBG 57, erhalten von British Bio Technology Products, Ltd.), das die cDNA für Human-E-Selectin in voller Länge enthielt, wurde als Matrize in der Polymerase-Kettenreaktion zum Modifizieren der 5'- und 3'-Enden von E-Selectin für eine Erzeugung großer Mengen an rekombinantem löslichen E-Selectin in CHO-D^–-Zellen verwendet. Das Oligonucleotid-Paar (5' GTC CCT CTA GAC CAC CAT GAT TGC TTC ACA GTT T + 5' TCC CGG TCG ACT TAG GGA GCT TCA CAG GT) (Sequenzliste ID-Nr. 4 bzw. 5), das in der Polymerase-Kettenreaktion verwendet wurde, war so konzipiert, dass eine Xba I-Stelle und eine perfekte Kozak-Sequenz (Kozak, Nucleic Acids Res. 9, 5233–5252 (1981)) eingeführt wurden, die dem E-Selectin-Startcodon vorangeht, und um eine Sal I-Stelle einzuführen, nachdem das Stopcodon hinter der Aminosäure 550 eingeführt wurde, die sich zwischen der 6. Konsensuswiederholung und der Transmembrandomäne des E-Selectins der vollen Länge befindet. Die DNA-Sequenzanalyse bestätigte die durch die Polymerase-Kettenreaktion erzeugten Änderungen sowie die Integrität des übrigen Teils der E-Selectin-cDNA. Das abgestumpfte E-Selectin (tES)-Gen wurde sodann als ein Xba I-Sal I-Fragment in den Mammalia-Expressionsvektor pDSRα2 (Europäische Patentanmeldung A20398753) eingeführt, der unter Einbeziehung einzelner Xba I und Sal I Restriktionsstellen modifiziert wurde. Der tES-Expressionsvektor wurde in eine CHO-Zelllinie transfiziert, die hinsichtlich der Dihydrofolatreduktase defizient war (DHFR-minus CHO) (Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216–4220 (1980)), und es wurden Transfektanten in einem Medium gewählt, dem Hypoxanthin und Thymidin fehlte (Bourdrel, et al., Protein Exp. Purif. 4, 130–140 (1993)). Für ein Screening auf Transfektanten die hohe Mengen an E-Selectin-spezifischer mRNA hatten (Turner, et al., Blood 80, 374–381 (1992)) wurde ein Rnase-Schutzassay verwendet.
Protein-Reinigung. PSGL-1 wurde von Human-Neutrophilmembranen gereinigt, die entsprechend der Beschreibung von Moore et al., (1992) mit den folgenden Modifikationen hergestellt wurden. Es wurden Neutrophilmembranen, die mit 5% Triton X-100 in 0,1 M NaCl, 20 mM MOPS, pH 7,5, 0,02% NaN₃ extrahiert wurden, auf WGA-Agarose aufgetragen und gebundene Proteine mit 0,5 M N-Acetylglucosamin (WGA-Eluat) eluiert. Nach einer ausgedehnten Dialyse gegen 0,1 M NaCl, 20 mM MOPS, pH 7,5, 0,02% NaN₃, 0,02% Brij-58, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ (Gleichgewichtspuffer) wurde das WGA-Eluat auf eine abgestumpfte P-Selectin (tPS)-Emphaze-Säule (10 mg Lectin/ml Harz) geladen. Die Säule wurde ausgiebig mit Gleichgewichtspuffer gewaschen und mit 5 mM EDTA eluiert. Die Liganden-enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und auf eine Mono Q PC 1,6/5-Säule geladen, die mit 0,1 M NaCl, 20 mM MOPS, pH 7,5, 2 mM EDTA, 0,02% NaN₃, 0,02% Brij-58 equilibriert wurde, indem ein SMART^® Micro Separation System (Pharmacia/LKB) verwendet wurde. Die Säule wurde mit einem 2 ml linearen Gradienten (0,1–1,0 M NaCl) bei 50 μl/min entwickelt wurde. Es wurden Aliquots der Fraktionen mit Na¹²⁵I unter Verwendung von Iodobeads^® entsprechend den Anweisungen des Herstellers iodiert. Die Reinheit der Fraktionen wurde mit Hilfe der SDS-PAGE und der Autoradiographie der iodierten Fraktionen gemessen.
Eine rekombinante lösliche Form von P-Selectin (tPS), das nach der 9. Konsensus-Wiederholung abgestumpft wurde, wurde aus dem konditionierten Medium von permanent transfizierten 293 Zellen entsprechend der Beschreibung von Ushiyama, et al., (1993) einer Immunoaffinitätsreinigung unterzogen. Wie mit Hilfe der Sedimentationsgeschwindigkeit und einer Gleichgewichtsanalyse ermittelt wurde, ist tPS ein asymmetrisches Monomer mit einer relativen Molekülmasse von 103.600 Da. Der Wert E₂₈₀ ^1% für tPS beträgt 12,3.
Es wurde rekombinantes, lösliches und abgestumpftes E-Selectin (tES) aus konditioniertem Medium von CHO D^–-Zellen, die stabil tES absonderten, einer Immunoaffinitätsreinigung unterzogen. Die Zellen wurden in gleichen Teilen aus Dulbecco's modifizierten Eagle's Medium (DMEM) und Ham's F-12-Nährmischung, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 10 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin aufgezogen. Bei Konfluenz wurden die Zellen in serumfreies Medium gegeben und alle 7 Tage konditioniertes Medium geerntet. Das konditionierte Medium wurde geklärt, steril filtriert, indem 2 Sartorius-Filter verwendet wurden (10 μm und 0,2 μm), die in Reihe geschaltet waren, und wurden sodann 50-fach eingeengt (Filtron Maximate, 10 kDa MW_CO). Das Anti-E-Selectin mAb N18/7 (Bevilacqua, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9238–9242 (1987)) wurde bis zu einer Dichte von 6 mg/ml Harz an Bromcyan-aktivierter Sepharose gekoppelt. Die H18/7-Sepharose-Säule wurde bei 4°C mit PBS, pH 7,5, mit einem Gehalt von 1 mM CaCl₂ und 1 mM MgCl₂ equilibriert und 500 ml konzentriertes Medium auf die Säule bei einer Durchflussrate von 10 cm/h (V_T = 200ml) geladen. Die Säule wurde mit 0,1 M Glycin, pH 2,7, eluiert und die Fraktionen durch Zusatz von Tris-HCl, pH 7,5 auf eine Endkonzentration von 0,1 M rasch neutralisiert. Das Eluat wurde gegen 25 mM Natriumphosphat, pH 7,5, dialysiert und auf eine Anionen-Austauschsäule Q-High Performance (V_T = 200 ml, Pharma cia) geladen, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von NaCl (0,17 bis 0,22 M) entwickelt. Die Reinheit wurde mit Hilfe der SDS-PAGE und mit Hilfe der N-terminalen Sequenzanalyse bestimmt. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines Wertes von E₂₈₀ ^1% = 12,5 ermittelt, der unter Anwendung der Methode von Gill und von Hippel, Anal. Biochem. 182, 319–326 (1989) berechnet wurde. Die Ausbeute betrug 250 mg tES pro näherungsweise 500 ml konzentriertes und konditioniertes Medium.
Sedimentations-Gleichgewichtsanalyse von löslichem tES. Die Sedimentations-Gleichgewichtsversuche wurden unter Verwendung eines 4-Loch-Titanrotors, von Kurzsäulen-kel-f-Mittelstücken und Sapphir-Fenstern in einer Beckman Optima XLA-analytischen Ultrazentrifuge ausgeführt, die mit einer On-Line-Rayleigh-Interferenzoptik ausgestattet war. Die Daten wurden bei Drehgeschwindigkeiten von 10.000; 15.000; 20.000 oder 25.000 U/min bei 20°C unter Verwendung einer Fernsehkamera und eines On-Line-Erfassungs- und Analysesystems aufgenommen (Laue, T. M. (1981) Ph. D. Dissertation, University of Connecticut, Storres, CT; Laue, et al., (1992) in Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science (Harding, S., Rowe, A., und Horton, J. C., Herausg.) S. 90–125, Royal Society of Chemistry, London). Es wurden Proben bei Konzentrationen von näherungsweise 1,0, 0,5, 0,25 und 0,13 mg/ml in PBS, pH 7,4, geladen. Die Daten wurden in Intervallen nach der geschätzten Zeit bis zur Gleichgewichtseinstellung aufgenommen und auf Gleichgewicht getestet, indem aufeinanderfolgende Scans subtrahiert wurden (Yphantis, D. A. (1964) Biochemistry 3, 297–317). Die Daten innerhalb des optischen Fensters wurden unter Anwendung des Programms REEDIT (bereitgestellt von David Yphantis) ausgewählt. Die Daten wurden analysiert, um die relative Molekülmasse des Monomers von tES unter Anwendung des NONLIN-Programms (Yphantis, D. A. (1964) Biochemistry 3, 297–317) zu ermitteln. Es wurden drei oder mehrere Kanäle der Sedimentations-Gleichgewichtsdaten, die bei unterschiedlicher Beladungskonzentration von tES, Radialpositionen und Winkelgeschwindigkeiten erhalten wurden, mit Hilfe der simultanen, nicht linearen Analyse der kleinsten Fehlerquadrate angepasst. Die Berechnungen der relativen Molekülmasse des partiellen spezifischen Volumens von tES wurden mit 0,688 ml/g mit einer Genauigkeit von ± 0,03 ml/g ermittelt, um die Unsicherheit der Kohlenhydratzusammensetzung von tES zu berücksichtigen (Laue, et al. (1992)).
Sedimentations-Geschwindigkeitsanalyse von löslichem tES. Die Sedimentations-Geschwindigkeitsversuche wurden in einer analytischen Ultrazentrifuge, Beckman Optima XLA, unter Verwendung einer Rayleigh-Interferenzoptik ausgeführt. Die Versuche wurden bei 60.000 U/min und 20°C unter Verwendung eines 4-Loch-Titanrotors, 2-Kanal-Kohle-gefüllte Epon-Mittelstücke und Sapphirfenster ausgeführt. Die Probe wurde bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml in PBS, pH 7,4, geladen. Die Sedimentationskoeffizienten wurden anhand der Ableitung nach der Zeit des Konzentrationsprofils entsprechend der Beschreibung von Stafford, W. (1992) Anal. Biochem. 203, 295–301 bestimmt.
Protein-Iodierungen. Es wurde mAbs G1 und CL2 (200 μg) mit 400 μCi-trägerfreiem Na¹²⁵I (ICN Biomedical, Inc., Costa Mesa, CA) unter Verwendung von Iodobeads^® iodiert. Das freie ¹²⁵I wurde mit Hilfe der Gelfiltration durch eine Sephadex G-25-Säule (PD-10, Pharmacia) entfernt, die in 0,1 M NaCl, 20 mM MOPS, pH 7,5, 0,1% Triton X-100 äquilibriert wurde. Die markierten Antikörper wurden sodann für 30 min bei 90.000 g in einer TL-100-Ultrazentrifuge (Beckman, Palo Alto, CA) zentrifugiert. Die Konzentration der markierten Proteine wurde mit einem Mikro BCA-Proteinassaykit (Pierce) unter Verwendung der entsprechenden nichtmarkierten Proteine als Standards bestimmt. Die spezifische Aktivität der markierten Antikörper lag im Bereich von 0,5 bis 1,0 μCi/μg Protein.
Es wurde PSGL-1 (näherungsweise 0,5 μg) oder WGA-Eluat (näherungsweise 100 μg) mit 400 μCi Na¹²⁵I iodiert und entsprechend der vorstehenden Beschreibung einer Entsalzung unterzogen. Das radiomarkierte PSGL-1 wurde bis auf näherungsweise 200 μl unter Anwendung einer Centicon-30^®-Vorrichtung (Pharmacia/LKB) eingeengt und eine Gelfiltration auf einer Superose 6 PC 3,2/30-Säule ausgeführt, die mit 0,15 M NaCl, 20 mM MOPS, pH 7,5, 0,02% NaN₃, 0,1 % Brij-58 unter Anwendung eines SMART Micro Separation System (Pharmacia/LKB) äquilibriert wurde. Die spezifische Aktivität des radiomarkierten Liganden lag im Bereich von 14 bis 30 μCi/μg Protein. Die markierten Proteine waren routinemäßig mit mehr als 95% Trichloressigsäure ausfällbar.
Binden von ¹²⁵I-PSGL-1 an immobilisiertem tPS oder tES. Es wurden tPS oder tES (50 μl, 10 μg/ml) in HBSS, 0,02% NaN₃ (HBSS/Az) über Nacht bei 4°C in Mikrotiterplatten (Immulon I Removawell^® Strips, Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) inkubiert. Nach 3 Wäschen mit HBSS/Az wurden die Mulden mit HBSS/Az/1 % Humanserumalbumin (HSA) für 2 Stunden bei 22°C blockiert. Die Mulden wurden sodann 1 malig mit HBSS/Az gewaschen und ¹²⁵I-PSGL-1 verdünnt in HBSS/Az/0,1% HSA zugesetzt (50 μl, 5.000 bis 10.000 cpm ((Zählimpulse pro Minute))/Mulde). Nach 1 Stunde bei 22°C wurden die Mulden rasch 5 Mal mit HBSS/Az unter Anwendung einer 12-Kanal-Plattenwaschvorrichtung (Nunc-Immuno Wash 12, Nunc Inc., Naperville, IL) gewaschen. Die einzelnen Mulden wurden sodann in einem γ-Zähler gezählt. Sämtliche Assays wurden 4-fach ausgeführt. In bestimmten Assays wurde das Binden von ¹²⁵I-PSGL-1 an immobilisierten tPS in Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen von Flüssigphase-tPS oder -tES gemessen.
Binden von ¹²⁵I-PSGL-1 an immobilisierten Anti-Kohlenhydrat-Antikörpern. Es wurde Ziegen-Antimaus μ-Ketten-spezifisches IgG (50 μl, 10 μg/ml) in HBSS/Az über Nacht bei 4°C in Immulon I Removawell^®-Streifen inkubiert. Die Mulden wurden gewaschen und blockiert, wie vorstehend beschrieben wurde. Danach wurde entweder CSLEX-1, LeuM1 oder MOPC104E zugesetzt (5O μl, 5 μg/ml). Nach Inkubation für 1 Stunde bei 22°C wurden die Mulden 3 Mal mit HBSS/Az gewaschen und ¹²⁵I-PSGL-1 in HBSS/Az/0,1% HSA (50 μl, 5.000 bis 10.000 cpm/Mulde) zugesetzt. Nach 1 Stunde wurden die Mulden entsprechend der vorstehenden Beschreibung gewaschen und einzelne Mulden in einem γ-Zähler gezählt. Sämtliche Assays wurden 4-fach ausgeführt.
Enzymatischer Aufschluss von ¹²⁵I-PSGL-1. Die Aufschlüsse mit Sialidase (0,2 U/ml, 1.5h), Endo-β-Galactosidase (2 U/ml, 15 h) und α1,3/4-L-Fucosidase (0,32 mU/ml, 15 h) wurden in 0,1 M NaCl, 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, ausgeführt. Die Aufschlüsse mit PNGase-F (40 U/ml, 15 h) erfolgten in 0,1 M Natriumphosphat, pH 8,6. PSGL-1 wurde in der Regel nicht mit SDS vorbehandelt, da PNGase-F ähnliche Auswirkungen mit oder ohne SDS-Vorbehandlung hatte. Sequenzielle Aufschlüsse mit Sialidase (0,2 U/ml, 2 h), gefolgt von einer Endo-α-N-Acetylgalactosaminidase (0,1 U/ml, 15 h) wurden in 0,1 M NaCl, 50 mM Natriumacetat, pH 6,0, ausgeführt. Sämtliche Glycosidase-Aufschlüsse wurden bei 37°C in Gegenwart von 20 μM Leupeptin, 30 μM Antipain, 1 mM Benzamidin und 0,02% NaN₃ ausgeführt.
Lectin-Affinitätschromatographie. Es wurde ¹²⁵I-PSGL-1 auf eine Concanavalin A (Con A)-Sepharose-Säule (V_T = 1 ml) gegeben, die in 0,1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl₂, 0,1 % Brij-58, 0,02% NaN₃ equilibriert wurde. Die Säule wurde mit 5 Säulenvolumina Gleichgewichts-Puffer gewaschen und mit 0,5 M α- Methylmannosid in Gleichgewichts-Puffer, vorgewärmt bis 65°C, eluiert. Die Tomatenlectinchromatographie wurde in ähnlicher Weise ausgeführt mit der Ausnahme, dass die Säule (V_T = 1 ml) mit 0,1 M NaCl, 20 mM MOPS, pH 7,5, 0,1 Brij-58, 0,02% NaN₃ äquilibriert war und in Gleichgewichts-Puffer stufenweise mit 20 mg/ml Chitotriose eluiert wurde. Es wurden mehr als 85% der auf die Lectinsäulen geladenen Zählungen gewonnen.
Stellendichte-Bestimmungen. Für die Stellendichte-Messungen wurde mAbs an P-Selectin (G1) oder E-Selectin (CL2), die Wechselwirkungen mit Knochenmarkzellen hemmen verwendet. Die Mulden wurden mit tPS oder tES (50 μl, 10 μg/ml) beschichtet und blockiert, wie vorstehend beschrieben wurde. Die Sättigungskonzentrationen von ¹²⁵I-markiertem mAb (2 μg/ml) in HBSS/Az/0,1% HSA wurden in die Mulden gegeben und für 1 h bei 22°C inkubiert. Die Mulden wurden 5 Mal gewaschen und anschließend in einem γ-Zähler gezählt. Das spezifische Binden wurde als "cpm" gebunden an Selectin-beschichteten Mulden, minus "cpm" gebunden an HSA-beschichteten Mulden festgelegt. Die Stellendichten wurden unter der Annahme eines einwertigen Bindens von Antikörper bei Sättigung berechnet. Sämtliche Assays wurden 4-fach ausgeführt.
Assay der Neutrophil-Adhäsion. Es wurden aus heparinisiertem Blut von freiwilligen Spendern Human-Neutrophile durch Dextransedimentation, hypotonische Lyse und Ficoll-Hypaque-Dichtegradientzentrifugation entsprechend der Beschreibung von Zimmerman, et al. (1985) J. Clin. Invest. 76, 2235–2246 isoliert. Die quantitative Bestimmung der Neutrophil-Adhäsion an tPS oder tES (50 μl, 10 μg/ml), immobilisiert auf Immulon I Removawell^®-Mikrotiterplatten, wurde entsprechend der Beschreibung von Geng, et al., (1990) ausgeführt.
Ergebnisse
Ein Antiserium auf ein PSGL-1-Peptid erkennt den P-Selectin-Glykoprotein-Liganden von Human-Neutrophilen. Um zu bestimmen, ob der Polypeptid-Kern des Sialomucin-Liganden für P-Selectin, der in Human-Neutrophilen und HL-60-Zellen charakteristisch ist, immunologisch mit PSGL-1 verwandt ist, wurde ein Glykoprotein-Ligand für P-Selectin, identifiziert durch Expressionsklonen aus einer HL-60-cDNA-Bank, Antiserum, hergestellt in Kaninchen gegen ein Peptid entsprechend den Resten 42 bis 56 der cDNA-derivierten Aminosäuresequenz und PSGL-1, getestet, um festzustellen, ob dieses Antiserum den Glykoprotein-Liganden erkennen konnte, den wir mit Hilfe der P-Selectin-Affinitätschromatographie isoliert hatten. Die radiochemische Reinheit des ¹²⁵I-P-Selectin-Glykoprotein-Liganden, der in der vorliegenden Untersuchung verwendet wurde, zeigte, dass es eine relative Molekülmasse von näherungsweise 250.000 unter nicht reduzierenden Bedingungen und näherungsweise 120.000 unter reduzierenden Bedingungen hatte. Damit stand das radioiodierte Glykoprotein, das zwei Disulfid-verknüpfte Untereinheiten von M_r 120.000 hatte, in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen unter Anwendung des Proteinblottings oder metabolischen Markierens. Wie bereits ausgeführt, war ein kleiner Teil des dimeren Glykoproteins gegenüber Reduktion unter den zur Anwendung gelangenden Bedingungen resistent. Das Immunserum, jedoch nicht Normales Kaninchenserum, fällte den gereinigten ¹²⁵I-P-Selectin-Liganden aus. Die Präzipitation durch das Antiserum war spezifisch für die 42-56-Peptidsequenz, da es vollständig durch Einschluss dieses Peptid gehemmt war, nicht jedoch durch ein Kontrollpeptid entsprechend den Aminosäuren 354–376 von PSGL-1. Die Spezifität des Antiserums wurde außerdem durch seine selektive Immunpräzipitation des Liganden aus einer rohen Mischung von radiomarkierten Neutrophil-Membranproteinen demonstriert, die aus einer WGA-Säule eluiert wurden.
Es wurden zwei tryptische Peptide aus dem P-Selectin Glykoprotein-Liganden abgeleitet, die aus Human-Neutrophilen gereinigt wurden. Die Sequenzen dieser Peptide, His-Met-Tyr-Pro-Val-Arg und Pro-Gly-Lys-Thr-Pro-Glu-Pro sind identisch mit den Aminosäuren 340–345 und 380–386 in der cDNA-derivierten Sequenz von PSGL-1 (Seq. ID-Nr. 1). Diese Daten und die Ergebnisse von den Versuchen der Immunpräzipitation liefern die Identität des Polypeptidgerüsts der P-Selectin-Liganden, die von beiden Gruppen untersucht wurden.
Gereinigtes ¹²⁵I-PSGL-1 bindet spezifisch an P-Selectin. ¹²⁵1-PSGL-1, das aus Human-Neutrophilen isoliert wurde, zeigte eine Bindung in zeitabhängiger Weise an tPS, die auf Mikrotiter-Mulden immobilisiert waren. Das Binden nahm in Abhängigkeit von der Menge des auf die Mulden beschichteten tPS zu. Das Binden war Ca⁺²-abhängig und wurde durch G1 aufgehoben, ein mAb an P-Selectin, welches die Leukozytenanhaftung an P-Selectin hemmt, nicht jedoch durch S12, ein mAb welches die Anhaftung nicht blockiert. Darüber hinaus zeigten 84,6±2,4% (Mittelwert ± SD, n = 4) des radiomarkierten Glykoproteins eine Neubindung an einer Säule von rekombinantem, löslichen P-Selectin (tPS) und wurde mit einem EDTA-enthaltenden Puffer eluiert. Dieses Ergebnis demonstriert, dass die Funktion von ¹²⁵I-PSGL-1 durch Iodierung nicht wesentlich verändert wurde.
PSGL-1 enthält substituiertes Poly-N-Acetyllactosamin. PSGL-1 von Human-Knochenmarkzellen enthält geclusterte, sialylierte, O-verknüpfte Oligosaccharide, die von dem Polypeptidgerüst durch β-Elimination freigesetzt werden (Norgard, et al. 1993). Um zu bestimmen, ob diese O-verknüpften Glykane einfache Strukturen haben, wurde ¹²⁵I-PSGL-1 mit Sialidase behandelt und anschließend mit Endo-α-N-Acetylgalactosaminidase, einem Enzym, das nicht sialylierte Galβ1-3GalNAc-Kern-1-Disaccharide freisetzt, jedoch nicht mehr komplexe O-verknüpfte Glykane aus Serin- oder Threonin-Resten (Umemoto, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252, 8609–8614). Die Behandlung mit Sialidase verringerte die elektrophoretische Beweglichkeit von PSGL-1, was die früheren Ergebnisse bestätigt. Der anschließende Zusatz von Endo-β-N-Acetylgalactosaminidase erhöhte die Beweglichkeit von PSGL-1 lediglich geringfügig mehr als Sialidase-behandeltes PSGL-1, was vermuten lässt, dass sehr wenige der O-verknüpften Oligosaccharide einfache Strukturen waren, die gegenüber diesem Enzym empfindlich waren.
PSGL-1 ist fucosyliert, da es das sialylierte, fucosylierte Tetrasaccharid-Antigen, sLe^x (Norgard, et al., (1993)) enthält. Die Behandlung des Glykoproteins mit α1,3/4-Fucosidase, die an einem vorletzten GlcNAc anhaftende Fucose entfernt, hatte keinen Einfluss auf die elektrophoretische Beweglichkeit, obgleich es Fucose-Reste entfernte, die Teil der Le^x-Epitope auf dem Molekül waren. Der Ligand wurde sodann mit Endo-β-Galactosidase behandelt, die innere α1-4-Verknüpfungen zwischen Galactose und N-Acetylglucosamin (Galβ1-4GlcNAc) in verlängerten und verzweigten Poly-N-Acetyllactosamin-Ketten hydrolysiert (Scudder, et al., (1983) Biochem. J. 213, 485–494; Scudder, et al., (1984) J. Biol. Chem. 259, 6586–6592). Dieses Enzym beschleunigt geringfügig die Beweglichkeit und verringert die elektrophoretische Heterogenität von PSGL-1, was nahe legt, dass PSGL-1 etwas Poly-N-Acetyllactosamin enthielt.
Um das Vorhandensein von Poly-N-Acetyllactosamin auf PSGL-1 zu bestätigen, wurde die Fähigkeit von ¹²⁵I-PSGL-1 zum Binden an einer Säule, die immobilisiertes Tomatenlectin enthielt, das begierig an Poly-N-Acetyllactosamin bindet, getestet. Es ist eine einzige Poly-N-Acetyllactosamin-Kette ausreichend, um das Binden von Glykoprotein an Tomatenlectin in diesem System zu bestätigen (Merkte, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 8179–8189). Es waren mehr als 95% des PSGL-1 an der Säule gebunden, was zeigt, dass im Wesentlichen jedes Molekül mindestens ein Poly-N-Acetyllactosamin enthielt (Tabelle 3). Die Behandlung von PSGL-1 mit Endo-β-Galactosidase verringerte sich mäßig auf 84% der Materialmenge, die an der Säule bindet. Dieses lässt vermuten, dass das Meiste, wenn nicht alles, Poly-N-Acetyllactosamin von einem Teil der PSGL-1-Moleküle durch Endo-β-Galactosidase entfernt werden konnte. Da Substitutionen von Poly-N-Acetyllactosamin mit Sialinsäure und/oder Fucose die Wirksamkeit dieses Enzyms hemmen, wurde PSGL-1 mit Sialidase und Fucosidase vor dem Zusatz von Endo-β-Galactosidase vorbehandelt. Die Behandlung mit Sialidase und Fucosidase hat keinen Einfluss auf das Binden von PSGL-1 an der Säule, was in Übereinstimmung mit der Tatsache steht, dass Substitutionen mit Sialinsäure oder Fucose das Binden von Poly-N-Acetyllactosamin an Tomatenlectin nicht beeinflussen. Allerdings verringerte der nachfolgende Zusatz von Endo-β-Galactosidase den an der Säule gebundenen Glykoprotein-Teil auf 69%. Da Tomatenlectin schwach an terminalen GlcNAc-Resten bindet, die einer Endo-β-Galactosidase-Behandlung ausgesetzt sind (Cummings, (1994) Methods Enzymol. 230, 66–86), wurde β-N-Acetylglucosaminidase zur Entfernung dieser terminalen Reste zugesetzt. Lediglich 53% dieses Materials waren an Tomatenlectin gebunden. Diese Daten zeigen eindeutig, dass PSGL-1 Poly-N-Acetyllactosamin enthielt. Darüber hinaus waren mindestens einige dieser Ketten von Substitutionen mit Sialinsäure und/oder Fucose gegenüber Endo-β-Galactosidase beständig. Das Unvermögen von Sialidase, Fucosidase, Endo-β-Galactosidase und β-N-Acetylglucosaminidase, das Binden aller PSGL-1-Moleküle an Tomatenlectin zu eliminieren, kann aufgrund der geclusterten Beschaffenheit von O-verknüpften Glykanen, der Gegenwart von inneren Fucose-Resten und/oder der Gegenwart von zusätzlichen Substitutionen, wie beispielsweise Sulfat an Poly-N-Acetyllactosamin die Enzymbeständigkeit wiederspiegeln.

Tabelle 3: Einflüsse von Glykosidasen auf das Binden von ¹²⁵I-PSGL-1 an einer Tomatenlectin-Affinitätssäule

Enzymbehandlung	prozentuale Bindung
scheinbar	> 95
Endo-β-Galactosidase	84
Sialidase + Fucosidase	> 95
Sialidase + Fucosidase + Endo-β-Galactosidase	69
Sialidase + Fucosidase + Endo-β-Galactosidase + β-N-Acetylglucosaminidase	53
Peptid: N-Glykosidase-F	> 95

¹²⁵I-PSGL-1 wurde mit den angegebenen Glykosidasen behandelt und auf eine Säule von immobilisiertem Tomatenlectin (V_T = 1 ml, 2 mg Lectin/ml Harz) gegeben. Nach dem Waschen wurde die Säule mit 20 mg/ml Chitotriose eluiert. Der prozentuale Anteil von gebundenem PSGL-1 wurde als die Radioaktivität festgelegt, die mit Hilfe der Chitotriose eluiert wurde, dividiert durch die Summe von Radioaktivität und Säulendurchfluss, Wäsche und Eluat.
PSGL-1 enthält eine begrenzte Zahl von heterogen N-verknüpften Oligosacchariden. Die PNGase-F-Behandlung erhöhte geringfügig die elektrophoretische Beweglichkeit von [¹²⁵I]-PSGL-1, was in Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen steht und zeigt, dass sämtliche Moleküle eine begrenzte Zahl von N-verknüpften Glykanen enthalten, die gegenüber diesem Enzym ansprechbar sind. Die cDNA-derivierte Sequenz von PSGL-1 zeigt, dass das Molekül lediglich drei potentielle Stellen für die Anhaftung von N-verknüpften Oligosacchariden enthält (Sako, et al., (1993)). Um die mögliche Heterogenität der N-verknüpften Strukturen zu untersuchen, wurden scheinbehandelte und PNGase-F-behandeltes [¹²⁵I]-PSGL-1 auf eine Säule von Concanavalin A (Con A) gegeben, einem Pflanzenlectin, das sich lebhaft an Mannose-reichen N-verknüpften Glykanen bindet, weniger lebhaft an komplexem, biantennalen und hybriden N-verknüpften Oligosacchariden und sehr schwach an komplexen triantennalen und tetraantennalen N-verknüpften Ketten (Ogata, et al., (1975) J. Biochem. (Tokyo) 78, 687–696). 41,9 ± 4,2% des scheinbehandelten Liganden waren an Con A gebunden, während lediglich 3,7 ± 1,0% des PNGase-F-behandelten Materials gebunden war (Mittelwert ± SD, n = 4). Es wurden mehr als 85% der Zählungen, die auf die Säule geladen wurden, gewonnen. Dieses Ergebnis demonstriert, dass PNGase-F N-verknüpfte Glykane, die von Con A erkannt wurden, von PSGL-1 entfernt.
Die nicht durch Con A gebundene Fraktion von PSGL-1 migriert geringfügig langsamer als die von Con A gebundene Fraktion. Um zu bestätigen, dass das Con A-ungebundene Material auch N-verknüpfte Oligosaccharide enthält, wurden sowohl die gebundene als auch die nicht gebundene Fraktion mit PNGase-F behandelt. Das Enzym verringerte die scheinbaren relativen Molekülmassen der Con A-ungebundenen und Con A-gebundenen Fraktionen um 14,5 kDa bzw. 13,7 kDa. Somit verfügten beide Fraktionen über PNGase-F-empfindliche, N-verknüpfte Glykane. Diese Daten lassen vermuten, dass die Con A-ungebundene Fraktion triantennale und/oder tetraantennale N-verknüpfte Glykane enthielt, die Con A nicht erkannten. Das größte N-verknüpfte Glykan, das auf Knochenmarkzellen zu beschreiben ist (Molmasse näherungsweise 6.600) ist eine disialylierte tetraantennale Struktur mit Poly-N-Acetyllactosamin-Sequenzen auf jeder Antenne und sowohl externer als auch Kern-Fucose (Spooncer, et al. (1984) J. Biol. Chem. 259, 4792–4801).
Damit steht die beobachtete Veränderung der elektrophoretischen Beweglichkeit nach PNGase-F-Behandlung in Übereinstimmung mit der Entfernung von mindestens zwei möglicherweise drei komplexen N-verknüpften Glykanen. Selbst nach PNGase-F-Behandlung migriert das Con A-ungebundene Material geringfügig langsamer als das Con A-gebundene Material. Dieses kann ein Hinweis darauf sein, dass die Con A-ungebundene Fraktion eine einzelne N-verknüpfte Kette zurück hielt, die gegenüber PNGase-F beständig war. Andererseits kann es andere strukturelle Unterschiede zwischen den Con A-gebundenen und Con A-ungebundenen Fraktionen geben, von denen mit größter Wahrscheinlichkeit die Heterogenität in einer O-verknüpften Glykosylierung ist.
Die Behandlung mit Sialidase oder Endo-β-Galactosidase hatte ähnliche Einflüsse auf die elektrophoretischen Beweglichkeiten der Con A-ungebundenen und Con A-gebundenen Fraktionen wahrscheinlich aufgrund dessen, dass diese Enzyme hauptsächlich die überschüssigen O-verknüpften Oligosaccharide beeinflusste. Endo-β-Galactosidase erzeugte ähnliche Zunahmen in den elektrophoretischen Beweglichkeiten von PSGL-1, das mit PNGase-F und PSGL-1 vorbehandelt wurde, die alle ihre N-verknüpften Oligosaccharide enthielten, was nahe legt, dass mindestens etwas von dem Poly-N-Acetyllactosamin auf den O-verknüpften Glykanen war.
PSGL-1 exprimiert Le^x und sLe^x auf O-verknüpftem Poly-N-Acetyllactosamin. Um zu ermitteln, ob PSGL-1 Le^x oder sLe^x auf Poly-N-Acetyllactosamin exprimiert, wurde ein Assay entwickelt, um das Binden von ¹²⁵I-PSGL-1 an einen immobilisierten monoklonalen IgM-Antikörper auf sLe^x (CSLEX-1) oder Le^x (LeuM1) zu messen oder auf einem immobilisierten, irrelevanten IgM mAb (MOPC104E). PSGL-1, das an CSLEX-1 gebunden ist nicht jedoch an MOPC104E, bestätigt die früheren Daten des Immun-Blottings, dass das Glykoprotein sLe^x exprimiert. Mehr als 85% der ¹²⁵I-PSGL-1-Moleküle, die an einer CSLEX-1-Affinitätssäule gebunden sind, zeigen, dass nahezu alle Moleküle sLe^x enthielten. Ebenfalls an LeuM1 gebundenes PSGL-1 zeigt, dass es Le^x enthielt, obgleich es möglich ist, die Desialylierung diese Struktur während der Reinigung des Glykoproteins erzeugt. Die Behandlung von PSGL-1 mit Sialidase eliminierte das Binden an CSLEX-1 und erhöhte das Binden an LeuM1, was in Übereinstimmung mit den bekannten Spezifitäten dieser Antikörper steht. Die Behandlung von PSGL-1 mit Fucosidase hatte keinen Einfluss auf das Binden an CSLEX-1 bei der Bewahrung der Hemmung des Enzyms durch terminate Sialinsäure (Sann, et al., (1992) J. Biol. Chem. 267, 1522–1527; Maemura, K. und Fukuda, M. (1992) J. Biol. Chem. 267, 24379–24386). Im Gegensatz dazu eliminierte die Fucosidase das Binden von PSGL-1 an LeuM1.
Nach der Ermittlung der Spezifizität des Assays wurde festgestellt, ob die Behandlung von PSGL-1 mit Endo-β-Galactosidase die Expression von Le^x oder sLe^x beeinflusste. Dieses Enzym hob das Binden von PSGL-1 an immobilisiertem LeuM1 auf und verringerte das Binden an CSLEX-1 um 64 ± 14% (Mittelwert ± SD, n = 4). Diese Daten zeigen eindeutig, dass Poly-N-Acetyllactosamin, das durch Endo-β-Galactosidase gespalten wird, etwas und möglicherweise das gesamte Le^x sowie einen Teil des sLe^x auf PSGL-1 trug. Die verbleibenden sLe^x-Strukturen können sich auf verzweigtem oder substituiertem Poly-N-Acetyllactosamin befinden, das gegenüber dem Enzym resistent war, oder auf Ketten, denen das Poly-N-Acetyllactosamin fehlte.
Im Gegensatz zu den Einflüssen von Endo-β-Galactosidase beeinflusste PNGase-F nicht das Binden von PSGL-1 an immobilisiertem LeuM1 oder CSLEX-1, was darauf hinweist, dass wenige, sofern überhaupt, Le^x- oder sLe^x-Strukturen auf PNGase-F-empfindlichen N-gekoppelten Oligosacchariden vorhanden waren. In Verbindung mit anderen Daten zeigt diese Beobachtung, dass O-verknüpfte Oligosaccharide die meisten, wenn nicht alle, Le^x- und sLe^x-Strukturen trägt. Darüber hinaus befanden sich mindestens einige dieser Strukturen auf O-verknüpftem Poly-N-Acetyllactosamin.
Einflüsse von Glykosidasen auf das Binden von PSGL-1 an P-Selectin. Es wurden die Einflüsse der Glykosidasen auf das Binden von ¹²⁵I-PSGL-1 an immobilisierten tPS bestimmt. Die Behandlung mit Sialidase, die das Binden an den Anti-sLe^x-Antikörper eliminierte, jedoch das Binden an den Anti-Le^x-Antikörper erhöhte, verhinderte vollständig das Binden von PSGL-1 an tPS. Im Gegensatz dazu hatte die Behandlung mit Fucosidase, die das Binden an dem Anti-Le^x-Antikörper eliminierte, nicht jedoch an dem Anti-sLe^x-Antikörper, keinen Einfluss auf die Wechselwirkung von PSGL-1 mit tPS. Diese Daten stehen in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen aus anderen Assays, dass das Hochaffinitätsbinden von P-Selectin an Knochenmarkzellen oder PSGL-1 Sialinsäure an dem Liganden erforderlich macht.
Die Behandlung von PSGL-1 mit Endo-β-Galactosidase führte lediglich zu einer mäßigen Verringerung des Bindens an immobilisiertem tPS. In vier unabhängigen Versuchen reduzierte Endo-β-Galactosidase das Binden um 25 ± 11 % (Mittelwert ± SD, n = 4). Diese Daten lassen vermuten, dass einige, wenn nicht alle, der sialylierten Ketten, die für die Erkennung von P-Selectin erforderlich sind, sich auf Poly-N-Acetyllactosamin befanden, das gegenüber dem Enzym ansprechbar ist. Die verbleibenden Glykane, die für die Erkennung erforderlich sind, könnten sich am Poly-N-Acetyllactosamin befinden, das gegenüber Endo-β-Galactosidase resistent ist, oder an Oligosacchariden, denen Poly-N-Acetyllactosamin fehlt. Endo-β-Galactosidase hemmte das Binden von PSGL-1 an dem Anti-sLe^x-Antikörper stärker als es das Binden an tPS hemmte. Die Mengen an sLe^x mit der Wechselwirkung mit tPS ließen nicht genau in Korrelation bringen, da nicht bekannt ist, wie viele sLe^x-Strukturen für PSGL-1 benötigt werden, um entweder an dem Antikörper oder an der tPS in diesen Assays zu binden.
Die Behandlung von PSGL-1 mit PNGase-F beeinflusste nicht dessen Fähigkeit zum Binden an tPS, was die Schlussfolgerung stützt, dass N-verknüpftes Oligosaccharid eine nur geringe Rolle in der P-Selectin-Erkennung spielt, wenn überhaupt eine.
Die Struktur und Funktion von PSGL-1 von Human-Neutrophilen wurde weiter unter Verwendung von Assays mit gereinigten, radioiodierten Glykoprotein charakterisiert. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass dieses Molekül ein Gebiet von sialylierten und fucosylierten, O-verknüpften Poly-N-Acetyllactosamin bietet, welches mit Hochaffinität bindende Strukturen für P-Selectin erzeugt.
Obgleich die große Mehrzahl der Oligosaccharide an PSGL-1 O-verknüpft ist, gibt es einige wenige N-verknüpfte Glykane, von denen ermittelt wurde, dass sie heterogen sind. Es enthielten alle PSGL-1-Moleküle PNGase-F-empfindliche N-verknüpfte Oligosaccharide, jedoch lediglich 42% der Glykoprotein-Moleküle waren an Con A gebunden, einem Lectin, das gut an Mannose-reichen Nverknüpften Glykanen bindet und weniger gut an komplexen biantennalen und hybriden N-verknüpften Ketten. Auf der Grundlage der Verringerungen in der scheinbaren relativen Molekülmasse, die in SDS-Gelen festgestellt wurde, entfernte PNGase-F mindestens 2 der 3 möglichen N-verknüpften Glykane sowohl von den Con A-gebundenen als auch von den Con A-ungebundenen Fraktionen von PSGL-1. Eine der Ketten an der Con A-ungebundenen Fraktion von PSGL-1 kann gegenüber PNGase-F resistent sein, da das Con A-ungebundene Material nach Behandlung mit PNGase-F noch etwas langsamer in SDS-Gelen migriert als das Con A-gebundene Material. Alternativ kann PNGase-F sämtliche Nverknüpften Ketten sowohl von den Con A-gebundenen als auch Con Aungebundenen Fraktionen entfernt haben, in welchem Fall der Unterschied in der Beweglichkeit die heterogene O-verknüpfte Glykosylierung wiederspiegeln kann. Die PNGase-F-empfindlichen N-verknüpften Glykane führten wenig oder kein Le^x und sLe^x und lieferten keinen messbaren Beitrag z der Wechselwirkung des Bindens mit P-Selectin. Diese Ergebnisse lassen stark vermuten, dass die O-verknüpften Glykane die relevanten Strukturen zeigen, die das P-Selectin erkennen. Es ist äußerst unwahrscheinlich, dass ein einziges PNGase-F-resistentes N-verknüpftes Glykan an einer Subpopulation von PSGL-1 für die P-Selectin-Erkennung verantwortlich ist.
Da mindestens einige der O-verknüpften Oligosaccharide an PSGL-1 (α2-3) Sialinsäure und (α1-3) Fucose tragen, müssen sie über relativ große, verzweigte Strukturen verfügen. In Übereinstimmung mit dieser Vorhersage wurde festgestellt, dass PSGL-1 wenige Ser/Thr-verknüpften Galβ1-3GalNAc-Kern-1-Disaccharide trägt, die nach der Entfernung von terminalen Sialinsäuren Endo-α-N-Acetylgalactosaminidase spalten. Diese Daten stehen in Überein stimmung mit früheren Beobachtungen, dass weniger als 10% der ³H-markierten, O-verknüpften Oligosaccharide, die durch β-Eliminierung von PSGL-1 freigesetzt werden, zur Bestimmung mit Hilfe der Gelfiltration zu klein waren.
In die O-verknüpften Glykane an PSGL-1 ist eine heterogene Gruppe von Poly-N-Acetyllactosamin einbezogen. Gemessen anhand der Beweglichkeit auf SDS-Gelen und durch Binden an Tomatenlectin spaltet Endo-β-Galactosidase etwas von dem Poly-N-Acetyllactosamin an der inneren β1-4-Verknüpfung zwischen dem Gal und GlcNAc. Die Behandung mit diesem Enzym verringert auch die Mengen an Le^x und sLe^x, was darauf hinweist, dass einige dieser Strukturen sich am Poly-N-Acetyllactosamin befinden. Gemessen anhand des Bindens an Tomatenlectin spaltet Endo-β-Galactosidase anderes Poly-N-Acetyllactosamin lediglich nach Behandlung mit Sialidase und Fucosidase, was demonstriert, dass sie Sialinsäure- und Fucose-Reste an oder in der Nähe ihrer Endglieder hatten, die den Zugriff zur Endo-β-Galactosidase verhinderten. Da ein signifikanter Teil der PSGL-1-Moleküle nach Behandlung mit allen 3 Enzymen noch an Tomatenlectin gebunden ist, kann es andere O-verknüpfte Poly-N-Acetyllactosamin-Ketten geben, die gegenüber Endo-β-Galactosidase resistent geblieben sind, was auf Verzweigung oder zusätzliche innere Substitutionen zurückzuführen ist. Diese Strukturen könnten zumindestens teilweise für die Fähigkeit von PSGL-1 zum Binden an immobilisiertem tPS nach Abbau mit Endo-β-Galactosidase verantwortlich sein.
Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Human-Knochenmarkzellen Poly-N-Acetyllactosamin auf einigen O-verknüpften Glykanen exprimieren. Diese Strukturen treten zumeist ausschließlich an der Verzweigung auf, die an dem C-6 von GalNAc als Teil eines Kern-2-O-verknüpften Oligosaccharids angebracht sind (Fukuda, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261, 12796–12806; Hanisch, et al., (1989) J. Biol. Chem. 264, 872–883). Von den näherungsweise 80 O-verknüpften Glykanen an den größeren Sialomucin von Human-Knochenmarkzellen, Leukosialin (CD43), enthalten lediglich eines oder zwei Poly-N-Acetyllactosamin, wobei näherungsweise die Hälfte von ihnen über einen terminalen sLe^x-Rest verfügt. Im Gegensatz dazu scheint PSGL-1 von Neutrophilen einen höheren Prozentanteil an Kern-2-Poly-N-Acetyllactosamin zu enthalten. Um die speziellen Monosaccharide, Verknüpfungen und Modifikationen zu bestimmen, die die O-verknüpften Glykane von PSGL-1 ausmachen, wird eine direkte Strukturanalyse erforderlich sein. Allerdings lassen die vorliegenden Daten vermuten, dass einige dieser Glykane von denen in Leukosialin differieren, was wiederum besagt, dass Human-Knochenmarkzellen die Polypeptid-Grundgerüste von 2 unterschiedlichen Sialomucinen unterschiedlich glykosylieren können. Diese unterschiedliche Glykosylierung ist von funktioneller Bedeutung, da P-Selectin mit hoher Affinität an PSGL-1 bindet, nicht jedoch an Leukosialin.
Die Selectine erfordern eine Sialylierung und Fucosylierung der meisten Kohlenhydrat-Liganden zur Erkennung. In ähnlicher Weise erfordert PSGL-1 Sialinsäure und Fucose zur Wechselwirkung mit P-Selectin. Obgleich PSGL-1 das terminate sLe^x-Tetrasaccharid exprimiert, ist es nicht eindeutig, ob es diese Struktur von sich aus zur Erkennung benötigt. Ein einfaches Modell besteht darin, dass PSGL-1 zahlreiche terminale sLe^x-Reste bietet, die die Aktivität erhöhen, mit der es mit P-Selectin in Wechselwirkung steht. Allerdings zeigen frühere Beobachtungen, dass hohe Konzentrationen an Zelloberflächen-sLe^x nicht ausreichend sind, um optimale Wechselwirkung mit P-Selectin zu vermitteln. Es ist wahrscheinlicher, dass zusätzliche Modifikationen an jeder Oligosaccharid-Kette für eine optimale Erkennung entscheidend sind. Spezielle Merkmale verschiedener Oligosaccharide hinsichtlich der Nähe können auch als ein geclustertes Saccharid-Fleck vorliegen, der das Hochaffinitätsbinden an P-Selectin fördert.
Sako et al. (1993) erzeugten eine rekombinante Form von PSGL-1, die an P-Selectin bindet, wenn sie in COS-Zellen exprimiert ist, die mit einer α1-3/4-Fucosyltransferase (FTIII) cotransfiziert sind, nicht jedoch in COS-Zellen, denen es an Fucosyltransferase fehlt. Die relative Molekülmasse des rekombinanten Moleküls war ähnlich derjenigen von PSGL-1 in Human-Knochenmarkzellen HL-60, und die Autoren schlussfolgerten offensichtlich, dass die Struktur und Funktion von rekombinantem PSGL-1 denen des nativen Moleküls äquivalent waren. Allerdings sind die speziellen Oligosaccharid-Strukturen, die an dem PSGL-1 hängen, und die zum Aufbau dieser Strukturen erforderlichen Glykosyltransferasen unbekannt. Darüber hinaus unterscheidet sich die α1-3/4-Fucosyltransferase (FTIII), die in den COS-Zellen exprimiert ist, um rekombinantes PSGL-1 zu erzeugen, von dem Fucosyltransferasen in Human-Knochenmarkzellen (Goelz, et al. (1990) Cell 63, 1349–1356; Sasaki, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 14730–14737). Damit ist es nicht sicher, dass die Glykosylierung damit die Funktion des rekombinanten PSGL-1 identisch mit dem des nativen Glykoproteins in Human-Knochenmarkzellen ist. Tatsächlich bewirkt nach einem Sialidaseabbau von rekombinantem PSGL-1 der Zusatz von Endo-β-N-Galactosaminidase eine wesentliche Erhöhung der Beweglichkeit des Glykoproteins, was darauf hinweist, dass rekombinantes PSGL-1, das in COS-Zellen mit FTIII exprimiert ist, im Gegensatz zu dem nativen Glykoprotein zahlreiche einfache O-verknüpfte Kern-1-Gal-β1-3GalNAc-Disaccharide enthält, die gegenüber diesem Enzym empfindlich sind.
Sako et al. haben festgestellt, dass rekombinantes PSGL-1 nicht länger an P-Selectin nach Behandlung mit Sialidase und Endo-β-N-Galactosaminidase bindet und haben daraus geschlussfolgert, dass O-verknüpfte Oligosaccharide für die Erkennung durch P-Selectin entscheidend sind. Auf der Grundlage der hier gebotenen Daten scheint diese Schlussfolgerung korrekt zu sein. Allerdings kann der Versuch von Sako et al. nicht verwendet werden, um eine Rolle für die O-verknüpften Glykane in der Erkennung zu unterstützen. Ein längerer Abbau mit Sialidase ist zur Eliminierung des Bindens an nativem PSGL-1 erforderlich, und die Bedingungen für den Sialidase-Abbau von rekombinantem PSGL-1, wie er von Sako et al. benutzt wurde, verringern das Binden von P-Selectin, eliminieren es aber nicht. Der Verlust des P-Selectin-Bindens nach Zusatz von Endo-α-N-Galactosaminidase der lediglich nicht sialylierte Kern-1-Galβ1-3GalNAc-Disaccharide freisetzt, war eher auf die früher beobachtete Kontamination dieses Enzyms mit Sialidase zurückzuführen, mit der die verbleibenden Sialinsäuren entfernt werden, die für die Erkennung erforderlich sind.
Sako et al. haben auch vorgeschlagen, dass die N-verknüpften Oligosaccharide zum Binden an P-Selectin deshalb beitragen, weil rekombinantes P-Selectin nicht alles PNGase-F-behandeltes rekombinantes PSGL-1 nicht erneut ausfällt. Allerdings haben diese Autoren nicht nachgewiesen, ob das Repräzipitations-Assay quantitativ war, indem überprüft wurde, ob zusätzliche Präzipitations-Schritte die Gewinnung von PSGL-1 erhöhten. Die gleiche Gruppe schlussfolgerte auch, dass N-verknüpfte Glykosylierung für die P-Selectin-Erkennung von Bedeutung war, da sie festgestellt haben, dass mit Tunicamycin behandelte Knochenmark-HL-60-Zellen, ein Inhibitor der N-verknüpften Glykosylierung, nicht an P-Selectin-exprimierenden Zellen haftete (Larsen, et al., (1992) J. Biol. Chem. 267, 11104–11110). Allerdings übt Tunicamycin indirekte Einflüsse auf Zellen aus, wie beispielsweise das Hemmen des Austritts einiger Proteine aus dem endoplasmatischen Retikulum, was die Interpretation ihrer Einflüsse auf die Zellanhaftung schwierig macht. Die Untersuchungen in der vorliegenden Patentanmeldung geben keine Bestätigung dafür, dass die N-verknüpften Glykane von PSGL-1 von Human-Neutrophilen eine Rolle bei der Erkennung durch P-Selectin spielen.
Beispiel 2: Expression von PSGL-1 in CHO-Zellen, die mit cDNA transfiziert wurden, die Fucosyltransferase III codiert, sowie einer Kern-2-β1-6-N-Acetylglucosaminyltransferase
Es wurde eine funktionelle, rekombinante Form von PSGL-1 exprimiert, die über viele der Eigenschaften der aus Human-Neutrophilen gereinigten nativen PSGL-1 verfügt. Die Untersuchung demonstriert, dass PSGL-1, um an P-Selectin zu binden, sialylierte und fucosylierte O-verknüpfte Oligosaccharide benötigt, die eine verzweigte Kern-2-Struktur enthalten.
PSGL-1 wurde in Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) exprimiert, die deshalb ausgewählt wurden, weil die N- und O-verknüpften Oligosaccharid-Strukturen auf diesen Zellen sehr gut charakterisiert sind. Insbesondere sind die Ser/Thr-verknüpften Oligosaccharide auf sezernierten und Oberflächen-Glykoproteinen einfache Kern-1-, mono- und disialylierte Derivate von Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr (Sasaki et al., J. Biol. Chem. 262: 12059–12076, 1987; Seguchi et al., Arch. Biochem. Biophys. 284: 245–256, 1991). DHFR-minus-CHO-Zellen wurden stabil mit der cDNA, die Fucosyltransferase III (FTIII) codiert, transfiziert (Kukowska-Latallo, et al., 1990), mit der cDNA, die die Kern-2-β1-6-N-Acetylglucosaminyltransferase codiert (Bierhuizen und Fukuda, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9326–9333, 1992; Bierhuizen et al., J. Biol. Chem. 269: 4473–4479, 1994) oder mit beiden cDNAs. Die cDNAs wurden in die pRc/RSV- oder pCDNA3-Expressionsvektoren ligiert (Invitrogen). Nach der Transfektion mit Hilfe der Calciumphosphat-Präzipitationsmethode wurden stabile transfizierte Klone in Medium ausgewählt, das G418 enthielt. Es wurden Klone identifiziert, die eine der Beiden oder beide Glykosyltransferasen exprimieren, indem spezielle Glykosyltransferase-Assays angewendet wurden, die auf Zell-Lysaten ausgeführt wurden. Zellen, die FTIII exprimieren, exprimieren auch große Mengen des Sialyl-Lewis-x-Antigens (NeuAcα2-3Ga1β1-4[Fucal-3]GlcNAcα1-4-R) auf ihren Oberflächen, was mit Hilfe des Bindens des CSLEX1-monoklonalen Antikörpers gemessen wird (Fukushima et al., Cancer Res. 44: 5279–5285, 1984).
Es wurde eine cDNA, die eine Form von PSGL-1 in voller Länge codiert (Moore et al., J. Cell Biol. 128: 661–671, 1995) in den pZeoSV-Expressionsvektor insertiert (Invitrogen). CHO-Zellen, die die Glykosyltransferasen exprimieren, wurden transfiziert mit der PSGL-1-cDNA, indem das Lipofektamin-Reagens verwendet wurde (Gibco BRL Life Technologies). In einer Analyse der vorübergehenden Expression wurden Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie 48 h nach der Transfektion analysiert. Es wurden stabile Klone in Medium ausgewählt, das sowohl G418 als auch Zeocin (Invitrogen) enthielt. Die Analyse von Zell-gebundenen Antikörpern mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde entsprechend der Beschreibung von Moore et al., (1995) ausgeführt. Die Analyse von Zell-gebundenem, von Thrombozyten-derivierten P-Selectin mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde entsprechend der Beschreibung von Moore und Thompson ausgeführt, Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 173–181 (1992).
Bei den Untersuchungen der vorübergehenden Expression war PSGL-1 auf der Mehrzahl von transfizierten Zellen coexprimiert, die FTIII exprimieren, die Kern-2-β1-6-N-Acetylglucosaminyltransferase oder beiden Glykosyltransferasen. Die Coexpression wurde durch starkes Binden von anti-PSGL-1-monoklonalen Antikörpern PL1 oder PL2 dokumentiert (Moore, et al. 1995), was mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen wurde. Im Gegensatz dazu zeigte die durchflusszytometrische Analyse, dass P-Selectin lediglich auf CHO-Zellen gebunden war, die FTIII, die Kern-2-β1-6-N-Acetylglucosaminyltransferase und PSGL-1 exprimieren. P-Selectin zeigte keine Bindung an CHO-Zellen, die entweder eine der Beiden oder beide Glykosyltransferasen in Abwesenheit von PSGL-1 exprimieren. P-Selectin versagte auch beim Binden an CHO-Zellen, die entweder FTIII oder die Kern-2-β1-6-N-Acetylglucosaminyltransferase selbst bei Gegenwart von PSGL-1 exprimieren. Damit war eine funktionelle Form von PSGL-1, das zum Binden an P-Selectin in der Lage war, lediglich auf CHO-Zellen exprimiert, die ebenfalls FTIII und die Kern-2-β1-6-N-Acetylglucosaminyltransferase exprimieren.
Es wurden auch CHO-Zell-Klone gewählt, die stabil FTIII und die Kern-2-β1-6-N-Acetylglucosaminyltransferase exprimieren. Diese Zellen exprimierten große Mengen an PSGL-1, was durch Binden von PL1 und PL2 mit Hilfe der Durchflusszytometrie detektiert wurde. P-Selectin zeigte auch eine gute Bindung an diesen stabil ausgewählten Zellen. Damit erforderte ein Hochaffinitätsbinden von P-Selectin an CHO-Zellen die gleichzeitige Expression von FTIII, der Kern-2-β 1-6-N-Acetylglucosaminyltransferase und PSGL-1 durch die Zellen. Bei Zellen, die PSGL-1 entweder vorübergehend oder stabil exprimieren, war das Binden von P-Selectin spezifisch da es durch einen inhibitorischen monoklonalen Antikörper an P-Selectin, G1, blockiert war, nicht jedoch durch einen nichtinhibitorischen, monoklonalen Antikörper an P-Selectin, S12 (Geng et al., Nature 343: 757–760, 1990). Das Binden war außerdem Ca⁺²-abhängig, was in Übereinstimmung mit der Forderung für Ca²⁺ für Selectine zum Binden von Kohlenhydrat-Liganden stand. P-Selectin zeigte auch ein spezifisches Binden an PSGL-1 auf den Zellen: PL1, nicht jedoch PL2, vollständig blockiertes Binden von P-Selectin. Darüber hinaus blockierte das Anti-42-56-Serum, wie nachfolgend diskutiert wird, nicht jedoch das Kontroll-Kaninchenserum das Binden von P-Selectin.
Diese Daten zeigen, dass CHO-Zellen genetisch bearbeitet werden können, um eine rekombinante Form von PSGL-1 zu exprimieren, die spezifisch und mit hoher Affinität an P-Selectin bindet, wie das bei nativem PSGL-1 von Human-Leukozyten der Fall ist. Die Hemmung des Bindens von P-Selectin durch PL1 und durch das Anti-42-56-Serum zeigt, dass P-Selectin an der gleichen Region an rekombinantem PSGL-1 und an nativem PSGL-1 von Human-Leukozyten bindet. Die Notwendigkeit für das Kern-2-Enzym in den CHO-Zellen zeigt, dass eine kritische Komponente der P-Selectin-Erkennungsstelle an PSGL-1 aus verzweigtem, Kern-2-0-verknüpftem Oligosaccharid/Oligosacchariden mit einem Galβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-6)GalNAc-Ser/Thr-Gerüst besteht. Die Sialylierung und Fucosylierung von PSGL-1 ist auch für das Hochaffinitätsbinden an P-Selectin erforderlich; diese Modifikationen müssen an den entscheidenden Kern-2-O-verknüpften Glykanen auftreten.
Beispiel 3: Bestimmung eines sulfatierten Tyrosins, das eine Region in PSGL-1 enthält, die für das P-Selectin-Binden entscheidend ist
PSGL-1 verfügt über eine extrazelluläre Domäne von 308 Resten. Die ersten 18 Reste bauen ein Signalpeptid auf. Die Reste 19 bis 41 bauen ein vermutliches Propeptid auf, von dem vorhergesagt wird, dass es nach der Synthese gespalten wird, wahrscheinlich in dem Trans-Golgi-Netzwerk. Daher beginnt der vermutliche N-Terminus des reifen Proteins bei Rest 42. Die drei Tyrosine im Inneren der Konsensussequenz für die Tyrosinsulfatierung sind die Reste 46, 48 und 51 in der Nähe des N-Terminus. Das polyklonale Kaninchen-Antiserum wird zu einem synthetischen Rest, der die Reste 42–56 codiert, blockiert vollständig das Binden von PSGL-1 an P-Selectin, was nahe legt, dass mindestens ein Teil der entscheidenden Erkennungsstelle für P-Selectin in dieser Region liegt. Alle Angaben auf die Restnummern beziehen sich auf die Sequenzliste ID-Nr. 1.
Für zwei IgG-monoklonale Antikörper zu PSGL-1, bezeichnet als PL1 und PL2, sind früher bereits in Moore et al., (J Cell Biol. 128: 661–671 (1995)) beschrieben worden. PL1 blockiert das Binden von PSGL-1 an P-Selectin vollständig, nicht jedoch PL2, und hebt die Haftung von Leukozyten an P-Selectin sowohl unter statischen als auch unter Bedingungen der Scherung auf. Um die Regionen auf PSGL-1 zu kartieren, wo sich die Epitope für PL1 und PL2 befinden, wurden in Bakterien eine Reihe von Fusionsproteinen exprimiert, die überlappende Regionen von extrazellulärer Domäne von PSGL-1 enthalten. Die PSGL-1-Sequenzen in den Fusionsproteinen waren folgende: Fragment 1, Reste 18–78; Fragment 2, Reste 63–123; Fragment 3, Reste 109–168; Fragment 4, Reste 154–200; Fragment 5, Reste 188–258; Fragment 6, Reste 243–308. Die DNA, die jedes Fragment codiert, wurde in den Rahmen zu der DNA eingeschmolzen, die die Dihydrofolatreduktase und ein 6X His-Tag in dem Expressionsvektor pQE-40 (Qiagen) codiert. Jedes Fragment wurde in Bakterien exprimiert und auf einer Nickel-Affinitätssäule gereinigt, das an dem 6X His-Tag gebunden war. Das Reaktionsvermögen jedes Fusionsproteins mit den Antikörpern wurde mit Hilfe des Western-Blottings unter reduzierenden Bedingungen bewertet.
PL1 war stark an Fragment 1 gebunden, jedoch an keinem der anderen Fragmente. Dieses zeigt, dass das PL1-Epitop im Inneren der Reste 18–78 angeordnet ist. Unter der Annahme der proteolytischen Entfernung des Propeptids von nativem reifen PSGL-1, befindet sich das Epitop im Inneren der Reste 42–78. Da PL1 nicht an Fragment 2 (Reste 63–123) bindet, befindet sich das Epitop wahrscheinlich im Inneren der Reste 42–70. Damit bindet PL1 an einem N-terminalen Epitop, der sich in der Nähe der Epitope für das polyklonale Anti-42-56-Serum befindet. Dieses Ergebnis lässt weiter vermuten, dass eine entscheidende Komponente der P-Selectin-Erkennungsstelle im Inneren einer kleinen Region an dem N-Terminus von PSGL-1 ruht. Im Gegensatz dazu war der nicht-blockierende monoklonale Antikörper PL2 an Fragmenten 5 und 6 gebunden (nicht jedoch an den anderen Fragmenten), was vermuten lässt, dass er ein Epitop innerhalb der Reste 243–258 erkennt, die in beiden Fragmenten vorhanden sind.
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass P-Selectin an einer spezifischen Region sowohl an nativer als auch rekombinanter PSGL-1 bindet. Diese Region sitzt nahe dem N-Terminus des reifen Moleküls. Das Hochaffinitätsbinden von PSGL-1 an P-Selectin erfordert sowohl Tyrosinsulfatierung als auch sialylierte, fucosylierte, Kern-2-verzweigte, O-verknüpfte Oligosaccharide. Es können Fragmente von von PSGL-1 oder Derivaten davon aufgebaut werden, die die Bindungsstelle für P-Selectin enthalten. Derartige Fragmente können so kurz wie die codierenden Reste 42–58 sein, wobei dieses Fragment die drei Tyrosine enthält, die in der Lage sind sulfatiert zu werden, sowie die zwei Threonine, die Anbringungsstellen für Kern-2-, O-verknüpfte Oligosaccharide sein können. Längere Fragmente, die sich vom Rest 42 erstrecken, sollten ebenfalls mit hoher Affinität an P-Selectin binden.
Experimentelle Prozeduren
Chemikalien und Reagenzien. Es wurde "Carrier Free [³⁵S]Sulfat (1100–1600 Ci/mMol) von Dupont/NEN (Wilmington, DE) erworben. Es wurde Emphaze^®-Affinitäts-Trägerharz von Pierce Biochemicals (Rockford, IL) erworben. Die Aerobacter aerogenes-Arylsulfatase, Arthrobacter ureafaciens-Neuraminidase und sulfatierte Monosaccharide wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. Rekombinante Peptid:N-Glykosidase F wurde von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) erworben. Sämtliche Zellkultur-Reagentien wurden von GIBCO/BRL (Grand Island, NY) erhalten. Authentischer Tyrosinsulfat-Standard wurde entsprechend der Beschreibung von Huttner (1984) (Meth. Enzymol. 107, 200–224) unter Verwendung von konzentrierter H₂SO₄ und Tyrosin synthetisch dargestellt. Andere Chemikalien waren von ACS-Reinheit oder besser und wurden von "Fisher Scientific" erhalten.
Isolation von radiomarkiertem PSGL-1. PSGL-1 wurde von Human-Neutrophilen gereinigt und mit Na¹²⁵I entsprechend der Beschreibung von Moore, et al., (1994) radiomarkiert. Die HL-60-Zellen (1–2 x 10⁶ Zellen/ml) wurden für 48 h mit 100 μG/ml [³⁵S]Sulfat bei 37°C in Sulfat-armen Medium (S-MEM) markiert, das 10% dialysiertes fetales Rinderserum enthielt. Das ³⁵S-PSGL-1 wurde unter Anwendung der Affinitätschromatographie in einer Säule gereinigt, die rekombinantes, lösliches P-Selectin enthielt (Ushiyama, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268, 15229–15237), gekoppelt an Emphaze^® bei einer Dichte von 5 mg/ml (Moore, et al. (1994)). Die angereicherte, EDTA-eluierte Probe wurde erneut an der P-Selectin-Säule nach Dialyse in einen Ca²⁺-enthaltenden Puffer chromatographiert. Das gereinigte ³⁵S-PSGL-1 wurde mit reduzierendem oder nicht reduzierendem SDS-Probepuffer behandelt und in einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel (Laemmli (1970)) einer Elektrophorese unterworfen. Die Gele wurden getrocknet und sodann bei –80°C mit einem Fuji RX-Röntgenfilm belichtet.
Detektion von Tyrosinsulfat. Die Tyrosin-Sulfatierung von PSGL-1 wurde mit Hilfe der Basenhydrolyse von ³⁵S-PSGL-1 bestimmt. Nach der Identifikation von ³⁵S-PSGL-1 mit Hilfe der Autoradiographie wurde das getrocknete Gel mit dem exponierten Röntgenfilm ausgelegt und das Band von der nicht reduzierenden Spur einer starken Basehydrolyse in 1,0 M NaOH bei 110°C für 24 h unterworfen, wie von Hortin, et al. (J. Biol. Chem. 261, 15827–15830 (1986)) beschrieben wurde. Das Hydrolysat wurde über eine Dowex 50 (H⁺)-Säule geschickt, mit Wasser gewaschen, lyophilisiert und mit Hilfe der Anionen-Austauschchromatographie unter Verwendung einer Varian AX-5-Säule (4 mm x 30 cm) analysiert, die mit einem Gradienten von NaH₂PO₄, pH 3,0, eluiert wurde.
Enzymatische Behandlung von PSGL-1. Alle Arylsulfatase-Digestionen wurden mit Aerobacter aerogenes-Arylsulfatase (EC 3.1.6.1) (Fowler und Rammler (1964) Biochemistry 3, 230–237) in näherungsweise 500 μl 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5, über Nacht bei 37°C ausgeführt. Nach der Digestion wurden die Enzymreaktionen durch Sieden für 15 min abgebrochen. Es wurden Schein-Digestionen mit 1.000 mU gekochtem Enzym ausgeführt. Das ³⁵S-Tyrosinsulfat aus ³⁵S-PSGL-1 wurde mit Hilfe der Basenhydrolyse entsprechend der vorstehenden Beschreibung hergestellt. Das Basenhydrolysat wurde mit 50 mU oder 1.000 mU aktiver Arylsulfatase oder mit 1.000 mU gekochter Arylsulfatase behandelt und anschließend mit Hilfe der Anionen-Austauschchromatographie analysiert.
Die Spezifizität der A. aerogenes-Arylsulfatase wurde für die sulfatierten Monosaccharide GlcNAc-6-Sulfat, Gal-6-Sulfat, GalNAc-6-Sulfat und GalNAc-4-Sulfat bestimmt. Jedes der sulfatierten Monosaccharide (100 nMol) wurde separat mit 1.000 mU gekochtem oder aktivem Enzym behandelt. Nach einer Inkubation über Nacht wurden die Reaktionsmischungen für 15 min gekocht, lyophilisiert, erneut in Wasser suspendiert und mit Hilfe der Anionen-Austauschchromatographie bei hohem pH mit einer Dionex CarboPac PA-1-Säule und PAD-Detektion analysiert, wie von Shilatifard und Cummings beschrieben wurde ((1995) Glycobiology 5, 291–297).
Es wurde intaktes ³⁵S-PSGL-1 oder ¹²⁵I-PSGL-1 mit A. aerogenes-Arylsulfatase entsprechend der vorstehenden Beschreibung behandelt. Das von ³⁵S-PSGL-1 durch Arylsulfatase freigesetzte [³⁵S]Sulfat wurde mit Hilfe der Arylsulfatase quantitativ durch BaSO₄-Ausfällung bestimmt, wobei 100 μ lgesättigte Na₂SO₄ als ein Träger verwendet wurde (Shilatifard, et al., (1993) J. Virol. 67, 943–945). In der graphischen Darstellung der Daten wurde das von der scheinbehandelten Probe freigesetzte Sulfat eingestellt, indem die scheinbehandelte Probe mit 0% angesetzt wurde. Der tatsächliche prozentuale Anteil der von den scheinbehandelten Proben freigesetzten Radioaktivität lag im Bereich von 1,3 bis 5,0%.
In einem Kontrollversuch wurde ¹²⁵I-PSGL-1 mit 1.000 mU Arthrobacter ureafaciens-Neuraminidase in 0,05 M Natriumacetat, pH 5,0, über Nacht bei 37°C vor der Aufbringung auf eine CSLEX-1-Antikörper-Säule behandelt. Die Chromatographie auf CSLEX-1 wurde entsprechend der früheren Beschreibung von Moore, et al., (1994) ausgeführt.
³⁵S-PSGL-1 mit Peptid:N-Glykosidase F entsprechend der Beschreibung von Shilatifard, et al., (1993) behandelt. ³⁵S-PSGL-1 wurde durch Sieden für 5 min in 50 μl 50 mMol Natriumphosphat, pH 7,5, 50 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5% SDS denaturiert. Das SDS wurde sodann auf eine Endkonzentration von 0,2% mit 1,5% NP-40 verdünnt. Es wurden 10 U Enzym zu dem denaturierten ³⁵S-PSGL-1 zugesetzt und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Erneutes Binden von Arylsulfatase-behandeltem PSGL-1 an P-Selectin
Es wurde mit Arylsulfatase behandeltes PSGL-1 auf eine P-Selectin-Affinitätssäule in Ca²⁺-enthaltenden Puffer gegeben und die gebundene Radioaktivität mit EDTA eluiert. Der Prozentanteil von ¹²⁵I-PSGL-1, der aus der Säule mit EDTA eluiert wurde, wurde korrigiert, indem die scheinbehandelte Probe gleich 100% gesetzt wurde (tatsächliches erneutes Binden im Bereich von 87 bis 99%).
Immunpräzipitation und P-Selectin-Bindungsassays
Die Immunpräzipitation von ³⁵S-PSGL-1 wurde entsprechend der Beschreibung von Moore, et al., (1994) unter Verwendung eines Kaninchen-Antiserums (Moore, et al., (1995), Moore, et al., (1994)) auf ein Peptid entsprechend den Resten 42–56 (QATEYEYLDYDFLPE) von PSGL-1 (Sako, et al., (1993)) (Anti-42-56) oder Normal-Kaninchenserum (NRS) ausgeführt. Die Immunpräzipitate wurden mit Hilfe von SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen analysiert, gefolgt von einer Autoradiographie. Die Festphase-Bindungsassays von P-Selectin wurden entsprechend der Beschreibung von Moore, et al., (1994) ausgeführt. Kurz zusammengefasst, wurde ¹²⁵I-PSGL-1 in Gegenwart von NRS oder dem Antiserum inkubiert, das gegen die Reste 42–56 von PSGL-1 (Anti-42–56) gerichtet ist, und zwar in Mikrotiterplatten, die immobilisiertes, rekombinantes, lösliches P-Selectin (50 μl, 10 μg/ml) oder Humanserumalbumin (HSA) (50 μl, 1 HSA) enthielten. Das Binden von Thrombozyten-deriviertem P-Selectin an HL-60-Zellen wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie, wie schon beschrieben, in Gegenwart von 20% NRS oder 20% Anti-42-56-Serum gemessen.
Ergebnisse und Diskussion
Um zu bestimmen, ob PSGL-1 posttranslational sulfatiert ist, wurden Human-promyelozytische HL-60-Leukämiezellen metabolisch mit [³⁵S]Sulfat markiert und PSGL-1 von Lysaten dieser Zellen mit Hilfe der Affinitätschromatographie auf einer P-Selectin-Säule gereinigt. Es wurde ein [³⁵S]Sulfat-markiertes Protein detektiert, dass in SDS-Gelen mit einer relativen Molekülmasse von 120.000 unter reduzierenden Bedingungen und mit einer relativen Molekülmasse von 240.000 unter nicht reduzierenden Bedingungen migrierte.
Diese Beweglichkeiten stehen in Übereinstimmung mit der Disulfid-verknüpften homodimeren Struktur von PSGL-1 (Moore, et al., 1992). Darüber hinaus wurde das [³⁵S]Sulfat-markierte Protein einer Immunpräzipitation mit einem speziellen Kaninchen-Antiserum unterzogen, das gegen ein synthetisches Peptid erzeugt wurde, das die Reste 42–56 der extrazellulären Domäne von PSGL-1 codiert. Die Analyse der Überstände zeigte, dass Anti-42-56 das gesamte ³⁵S-PSGL-1 ausfällte, während normales Kaninchenserum (NRS) nichts von dem ³⁵S-PSGL-1 ausfällte. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass PSGL-1 posttranslational sulfatiert ist.
Das Sulfat kann in eukaryotische Glykoproteine als Tyrosinsulfat eingebaut werden (Huttner, et al. (1988) Mod. Cell Biol. 6, 97–140) oder als sulfatierte Kohlenhydrate (Fiete, et al., (1991) Cell 65, 1103–1110; Kjellen und Lindahl; (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 443–475). In ersten Untersuchungen wurden sulfatierte Kohlenhydrate auf PSGL-1 unter Anwendung von Methoden nicht detektiert, mit denen derartige Strukturen auf anderen Glykoproteinen detektiert wurden (Shilatifard, et al. (1995, 1993)). Die cDNA-Sequenz von PSGL-1 prognostiziert 4 extrazytoplasmatische Tyrosin-Reste, drei von denen sind an den Stellen 46, 48 und 51 innerhalb einer vorhergesagten Konsensussequenz für die Tyrosinsulfatierung geclustert (Huttner und Baeuerle (1988)). Um zu ermitteln, ob PSGL-1 ein Tyrosinsulfat hat, wurde ein Gel-Plättchen, das 240 kDa ³⁵S-PSGL-1 enthielt, mit einer starken Base hydrolysiert und mit Hilfe der Anionen-Austauschchromatographie analysiert. Es wurde ein einzelner radioaktiver Peak erhalten, der mit Tyrosinsulfat coeluiert wurde, nicht jedoch mit sulfatierten Zucker-Standards (1A).
Sodann wurde Tyrosinsulfat im Bezug auf seine Bedeutung für das Binden von PSGL-1 an P-Selectin getestet. Obgleich die Funktionen von Tyrosinsulfat innerhalb der Proteine nicht klar sind, erfordern einige Proteine diese Modifikation für eine optimale Aktivität (Pittman, et al. (1992) Biochemistry 31, 3315–3325; Dong, et al., (1994) Biochemistry 33, 13946–13953). Das übliche Herangehen zur Bewertung der Bedeutung von Tyrosinsulfat besteht darin, dass die Sulfatierung von neusynthetisch dargestellten Proteinen mit chemischen Inhibitoren vermieden wird oder das Tyrosin durch Phenylalanin mit Hilfe der ortsgerichteten Mutagenese ersetzt wird. Ein alternatives Vorgehen, bei dem Sulfat enzymatisch vom Tyrosin an intaktem PSGL-1 entfernt wurde, wurde getestet. Ebenfalls wurde die Fähigkeit einer Arylsulfatase von Aerobacter aerogenes zur Freisetzung von Sulfat aus ³⁵S-Tyrosinsulfat bestimmt. Nur bis zu 50 mU dieser Arylsulfatase setzen quantitativ [³⁵S]Sulfat von ³⁵S-Tyrosinsulfat frei, das von PSGL-1 abgeleitet war (1B, 1C). Diese Aufspaltung war spezifisch, da 1.000 mU des Enzyms nicht irgendein Sulfat von Gal-6-Sulfat, GlcNAc-6-Sulfat, GalNAc-4-Sulfat und GalNAc-6-Sulfat freisetzen.
Es wurde die Fähigkeit der Arylsulfatase zum Freisetzen von Sulfat aus intaktem ³⁵S-PSGL-1 untersucht. Es wurde durch das Enzym freigesetztes [³⁵S]Sulfat quantitativ durch Ausfällung als unlösliches BaSO₄ bestimmt. Es wurden bis zu 50% des [³⁵S]Sulfats auf PSGL-1 durch 500 mU Arylsulfatase freigesetzt; durch zunehmende Mengen an Enzym wurde keine weitere Radioaktivität freigesetzt (2).
Es wurde die funktionelle Bedeutung des Tyrosinsulfats auf PSGL-1 bewertet, indem ¹²⁵I-PSGL-1 mit Arylsulfatase behandelt und das erneute Binden des behandelten Liganden an einer P-Selectin-Säule gemessen wurde. Das Binden von mit Arylsulfatase-behandeltem ¹²⁵I-PSGL-1 an P-Selectin wurde in dosisabhängiger Weise reduziert, wobei das abnehmende Binden umgekehrt proportional zur Menge des Sulfats war, die von ³⁵S-PSGL-1 freigesetzt wurde (2). Das reduzierte Binden von PSGL-1 an P-Selectin nach der Behandlung mit Arylsulfatase war keine Folge eines allgemeinen Freisetzens von Sialinsäure und/oder Fucose durch kontaminierende Exoglykosidasen, da PSGL-1, das mit 1.000 mU Arylsulfatase behandelt wurde, quantitativ an jede beliebige Affinitäts säule gebunden wurde, die CSLEX-1, einen monoklonalen Antikörper von sLe^x, enthielt.
Arylsufatase setzte näherungsweise 50% des [³⁵S]Sulfats von ³⁵S-PSGL-1 frei und verringerte das erneute Binden von ¹²⁵I-PSGL-1 an P-Selectin in dem gleichen Umfang. Es wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass die Fraktion von ³⁵S-PSGL-1, die erneut an P-Selectin nach der Behandlung mit Arylsulfatase gebunden wurde, entscheidende Tyrosinsulfat-Reste zurückhielt, während die Fraktion, die nicht an P-Selectin erneut gebunden wurde, Tyrosinsulfat verloren hatte. Es wurde ³⁵S-PSGL-1 mit 1.000 mU Arylsulfatase behandelt und sodann auf eine P-Selectin-Säule gegeben. Die gebundenen und ungebundenen Fraktionen wurden mit Hilfe der SDS-PAGE analysiert. Es wurde in den beiden Fraktionen eine Bande beobachtet, die dem ³⁵S-PSGL-1 entsprach, während in den ungebundenen Fraktionen keine Bande festgestellt wurde. Die Radioaktivität in den ungebundenen Fraktionen repräsentiert das freie Sulfat. Wenn die Bande von ³⁵S-PSGL-1 in den gebundenen Fraktionen hydrolysiert wurde, wurde die Radioaktivität in Tyrosinsulfat wiederhergestellt. In dem Kontrollversuch wurde ¹²⁵I-PSGL-1 mit 1.000 mU Arylsulfatase behandelt und anschließend auf die P-Selectin-Säule gegeben. Die SDS-PAGE-Analyse ergab, dass sowohl in den ungebundenen als auch in den gebundenen Fraktionen ¹²⁵I-PSGL-1 gewonnen wurde. Damit entfernte die Arylsulfatase Sulfat quantitativ von einer Teilmenge von PSGL-1, die P-Selectin nicht länger gebunden hat , wobei PSGL-1 ansonsten nicht von dem Enzym abgebaut wurde.
Das in der P-Selectin gebundenen Teilmenge von PSGL-1 zurückbleibende Tyrosinsulfat kann gegenüber Arylsulfatase resistent sein, was auf seine Unzugänglichkeit oder auf ein gewisses anderes Merkmal von PSGL-1 zurückzuführen ist, das die Enzymwirkung blockiert. Wenn ³⁵S-PSGL-1 teilweise durch Behandlung mit Peptid:N-Glykosidase F und Arthrobacter ureafaciens-Neuraminidase deglykosyliert wird, setzt die nachfolgende Behandlung mit Arylsulfatase bis zu 70% der Radioaktivität als [³⁵S]Sulfat frei. Da Neuraminidase auch das Binden von PSGL-1 an P-Selectin eliminiert, konnte nicht ermittelt werden, ob die vermehrte Entfernung von [³⁵S]Sulfat das Binden von PSGL-1 an P-Selectin weiter herabsetzt. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die extensive Glykosylierung von PSGL-1 für die Unzugänglichkeit einiger Tyrosinsulfat-Stellen für Arylsulfatase verantwortlich gemacht werden kann.
Um die Bedeutung der Tyrosinsulfatierung für die Funktion von PSGL-1 weiter zu demonstrieren, wurde das Antiserum für das Peptid, das die Reste 42–56 der extrazellulären Domäne von PSGL-1 codiert, verwendet. Wie vorstehend ausgeführt wurde, enthält diese Region die drei potentiellen Stellen der Tyrosinsulfatierung an den Resten 46, 48 und 51. Das Antiserum hemmte das Binden von ¹²⁵I-PSGL-1 an immobilisiertem P-Selectin (3A) und hob auch das Binden von P-Selectin an HL-60-Zellen auf, was mit Hilfe der Durchflusszytometrie (3B) gemessen wurde. Somit bindet das Antiserum zu dem 42-56-Peptid an nativem PSGL-1 und blockiert wirksam dessen Erkennung durch P-Selectin.
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass PSGL-1 Tyrosinsulfat enthält, das für das Hochaffinitätsbinden an P-Selectin erforderlich ist. Es ist bereits gezeigt worden, dass PSGL-1 die sLe^x-Determinante an O-verknüpften Oligosacchariden enthält und dass sowohl Sialinsäure als auch Fucose für das Binden von PSGL-1 an P-Selectin erforderlich sind. Tyrosinsulfat kann deshalb von Bedeutung sein, weil es eine entsprechende Präsentation der Glykane fördert, die direkt an P-Selectin binden. Alternativ kann das Tyrosinsulfat direkt mit P-Selectin Wechselwirken. Diese letztere Möglichkeit scheint wahrscheinlicher zu sein, da von Sulfatid und sulfatierten Oligosacchariden bekannt ist, dass sie an P-Selectin binden. Sulfat ist auch eine entscheidende Determinante für das Binden von GlyCAM-1 an L-Selectin, wobei GlyCAM-1 Sulfat eher in Gal-6-Sulfat und GlcNAc-6 enthält als an Monosacchariden.
Die Ergebnisse legen ein Modell nahe, bei dem PSGL-1 sowohl Kohlenhydrat als auch Tyrosinsulfat als Komponenten für eine entscheidende Erkennungsstelle für P-Selectin präsentiert. Hypothetisch wird davon ausgegangen, dass sich diese Stelle an der N-terminalen, Membran-abgelegenen Region von PSGL-1 in der Nähe der drei potentiellen sulfatierten Tyrosin-Reste befindet. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese blockiert PL1, bei dem es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt, der ein Membran-abgelegenes Epitop an PSGL-1 erkennt, das Binden von Fluidphase-P-Selectin an Leukozyten und hebt die Anhaftung von Neutrophilen an P-Selectin sowohl unter statischen als auch unter Bedingungen des Scherens auf. Im Gegensatz dazu hemmt PL2, bei dem es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt, der ein Membran-proximales Epitop an PSGL-1 erkennt, nicht das Binden an P-Selectin. Das Konzept, dass P-Selectin eine lokalisierte Stellen an einem Mucin-ähnlichen Glykoprotein erkennt, unterscheidet sich von einem Modell, bei dem ein Selectin mehrfache, geclusterte, O-verknüpfte Glykane erkennt, die entlang des gesamten Polypeptids angebracht sind (Lasky, et al., (1992) Cell 69, 927–938; Baumheuter, et al., (1993) Science 262, 436–438).
Beispiel 4: Bestimmung von O-Glykan-Strukturen an PSGL
Es wurden die Strukturen der O-Glykane an PSGL-1 bestimmt, die mit Hilfe von HL-60-Zellen synthetisch dargestellt wurden, die metabolisch mit ³H- Zuckerpräkursoren radiomarkiert waren. Die Glykosylierung von PSGL-1 wurde mit der von CD43 verglichen, um festzustellen, ob zwei durch die gleichen Zellen exprimierte Sialomucine unterschiedlich O-glykosyliert sind. In diesen Untersuchungen wurde die HL-60-Zell-Linie verwendet, da die posttranslationalen Modifikationen, von denen bekannt ist, dass sie für das Binden an P- und E-Selectin sowohl an HL-60 als auch an Neutrophilen PSGL-1, vergleichbar sind.
Die Untersuchungen demonstrieren, dass die Mehrzahl von O-Glykanen von PSGL-1 disialylierte oder neutrale Formen des Kern-2-Tetrasaccharids sind. Es sind lediglich einige wenige der O-Glykane fucosyliert und diese enthalten die strukturelle Determinante für das sLe^x-Antigen. Die Ergebnisse demonstrieren, dass PSGL-1 von CD43 unterschiedlich glykosyliert ist und dass PSGL-1 einmalige O-Glykane enthält, die möglicherweise für die Hochaffinitäts-Wechselwirkungen mit P- und E-Selectin entscheidend sind.
Die verwendeten Abkürzungen sind: sLe^x, Sialyl-Lewis-x; NDV, Newcastle-Disease-Virus; CHO, Chinesischer Hamsterovarien; GlcN, Glucosamin; GalN, Galactosamin; GalNOH, Galactosaminitol; GalNAcOH, N-Acetylgalactosaminitol; FT, Fucosyltransferase; C2GnT, Kern-2-β1,6-N-Acetylglucosaminyltransferase; HPAEC, Anionen-Austauschchromatographie bei hohem pH-Wert.
I Experimentelle Prozeduren
Materialien – Protein A-Sepharose, QAE-Sephadex, Arthrobacter ureafaciens-Neuraminidase, Riesenbohnen-β-Galactosidase, Riesenbohnen-β-N-Acetylhexosaminidase und Galβ1→3GalNAc, die von Sigma erhalten wurden. Pronase und TPCK-behandeltes Trypsin wurden von Worthington Biochemicals erworben. Escherichia freundii-endo-β-Galactosidase wurde von V-Labs erhalten. Streptomyces Spezies, 142 α1,3/4-Fucosidase wurden von Takara erworben. Newcastle-Disease-Virus-Neuraminidase wurde von Oxford (Glykosystems erhalten. D-[6-³H]Glucosamin-Hydrochlorid (20–45 Ci/mMol), D-[2-³H]Mannose (20–30 Ci/mMol und L-[6-³H]Fucose (70–90 Ci/mMol wurden von Dupont/NEN erworben und NaB[³H]₄ (40–60 Ci/mMol) wurden von ARC erworben. Kaninchen-Antimaus-IgGl wurde von Zymed erworben. Emphaze ^TM-Affinitäts-Trägerharz wurde von Pierce Biochemicals erhalten. Bio-Gel P-4- und P-10-Harze und Molmassen-Marker wurden von BioRad erhalten. Alle Zellkultur-Reagentien wurden von GIBCO/BRL erhalten. Weitere Chemikalien waren von ACS-Reinheit oder besser und wurden von Fisher Scientific erhalten.
Isolation von metabolisch radiomarkiertem PSGL-1 – ³H-GlcN, ³H-Man und 3N-Fuc Radiomarkieren von NL-60-Zellen wurde weitgehend entsprechend der Beschreibung von Moore, et al. (1992) J. Cell. Biol. 118, 445– 456; Wilkins, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 22677–22680 ausgeführt. ³H-PSGL-1 wurde von Zellextrakten unter Anwendung der Affinitätschromatographie auf einer Säule von immobilisiertem, rekombinantem, löslichen P-Selectin gereinigt (Ushiyama, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 15229–15237), gekoppelt an Emphaze^TM bei einer Dichte von 5 mg/ml (1,0 ml Bett-Volumen) (Moore, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 23318–23327). Die angereicherten und mit EDTA eluierten Proben wurden erneut auf der P-Selectin-Säule nach Dialyse in einen Ca²⁺-enthaltenden Puffer chromatographiert. Es wurde gereinigtes ³H-PSGL-1 mit reduzierendem oder nicht reduzierendem SDS-Probepuffer (Laemmli, UK, (1970) Nature 227, 680–685) behandelt und in einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden getrocknet und anschließend durch Belichtung mit einem Fuji RX-Röntgenfilm bei 80°C autoradiographiert. Das näherungsweise 250 kDa ³N-PSGL-1 wurde in Gelscheiben aus nicht reduzierenden Bahnen analysiert.
Immunpräzipitation von CD43 – CD43 wurde von ³H-Zucker-markierten HC-60-Zellen unter Verwendung einer CD43-spezifischen mAb, H5H5 (IgGl) einer Immunpräzipitation unterzogen. Die H5H5-Hybridom-Zell-Linie wurde von Dr. T. August erzeugt und von der "Developmental Hybridoma Bank" (The Johns Hopkins University School of Medicine) erhalten. CD43 wurde einer Immunpräzipitation unterzogen, indem zuerst 50 μl Protein-A-Sepharose-Perlen mit 100 μg eines Kaninchen-Antimaus-IgGl-Antikörpers bei 37°C für 1 h vorbelastet wurden. Nach dem Waschen wurde der CD43-spezifische Antikörper auf den Perlen absorbiert, indem 500 μl unverdünnte H5H5-Kulturmedien bei 37°C für 1 h zugegeben wurden. Nach dem Waschen wurden die vorbelasteten Perlen zu dem ³H-Zucker-markierten HC-60-Zellextrakt gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Perlen wurden 5 Mal mit ausgewogener Salzlösung nach Hanks gewaschen, 5 min in nicht reduzierendem SDS-Probepuffer gekocht und in einem 10%igen SDS-Polyacrylamid-Gel analysiert. Das gereinigte CD43 von 120 kDa in Gelscheiben, das nach Autoradiographie identifiziert wurde, wurde excidiert und analysiert.
β-Elimination von radiomarkierten O-Glykanen aus ³H-PSGL-1 und ³H-CD43 und Chromatographie von Glykanen auf Bio-Gel und QAE-Sephadex – Die Gelscheiben, die radiomarkiertes PSGL-1 und CD43 enthielten, wurden direkt mit schwacher Base/Borhydrid entsprechend der Beschreibung von Iyer, et al. ((1971) Arch. Biochem. Biophys. 142, 101–105; Cummings, et al. (1983) J. Biol. Chem. 258, 15261–15273) behandelt. Die freigesetzten radiomarkierten Glykane wurden mit Hilfe der Chromatographie auf einer Säule von Dowex 50 (H⁺-Form) entsalzen und die Glykane weiter analysiert. Die Chromatographie wurde auf Bio-Gel P-4 (mittlere Maschenweite) in einer 1 × 90cm-Säule und auf Bio-Gel P-10 (mittlere Maschenweite) in einer 1 x 48cm-Säule in 0,1 M Pyridyl/Acetat-Puffer, pH 5,5, ausgeführt und 1 ml-Fraktionen aufgenommen. Der anionische Charakter und die Sialylierung von Glykanen wurden zum Teil mit Hilfe der Chromatographie auf einer Säule von QAE-Sephadex mit schrittweiser Eluierung in 2 mMol Tris-Base-enthaltendem 20, 70, 140, 200 und 250 mM-NaCl bewertet.
Herstellung von radiomarkierten O-Glykan-Standards. Die einfache Kern-1-O-Glykan-Galβ1→3GalNAc wurde durch Reduktion in Gegenwart von NaB[³H]₄ unter Bildung von Galβ1→3GalNAcOH[³H] radiomarkiert (Li, et al. (1978) J. Biol. Chem. 253, 7762–777). Es wurde eine Reihe von ³H-GlcN-markierten Standardglykanen aus ³H-GlcN-markierten HL-60-Zell-Gesamtglykoproteinen entsprechend der früher beschriebenen Prozeduren hergestellt (Carlsson, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 12787–12795). Die Standards enthielten das disialylierte Kern-2-Hexasaccharid
NeuAcα2α3Galβ1→4GlcNAcβ1 β6(NeuAcα2→3Galβ1β3)GalNAcOH, das neutrale Kern-2-Tetrasaccharid
Galβ1→4GlcNAcβ1→6(3Galβ1→3)GalNAcOH und das Trisaccharid GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH. Um diese Standards herzustellen, wurden die ³N-GlcN-markierten Zellextrakte gegen 0,01 Mol NaHCO₃, pH 7,5, dialysiert und mit 100 μg/ml TPCK-behandeltem Trypsin über Nacht bei 37°C behandelt. Der getrocknete tryptische Aufschluss wurde mit schwacher Base/Borhydrid behandelt, um die β-Eliminierung zu bewirken, und die freigesetzten O-Glykane wurden auf einer Säule von Bio-Gel P-4 einer Größenfraktionierung unterzogen. Die gepoolten Fraktionen, die den Radioaktivitätspeaks entsprachen, wurden auf Ladungsverteilung mit Hilfe der QAE-Sephadex-Säulenchromatographie analysiert. Die Struktur jedes Glykans wurde sodann über die Empfindlichkeit gegenüber Arthrobacter-Neuraminidase, β-Galactosidase und β-N-Acetylhexosaminidase bestätigt, was mit Hilfe der absteigenden Durchlaufchromatographie entsprechend der nachfolgenden Beschreibung ermittelt wurde.
Der Kern-2-fucosylierte Pentasaccharid-Standard Galβ1→4(Fucal→3)GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH wurde hergestellt, indem das ³H-GlcN-Tetrasaccharid Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH mit nichtmarkiertem GDP-Fuc (100 μM) in Gegenwart von 50 μg Extrakt von COS7-Zellen, die stabil mit Human-FTIV-Gen transfiziert waren, inkubiert wurde. Dieses α1,3FT fügt Fuc in eine α1,3-Verknüpfung an GlcNAc-Reste in Acceptoren an, die terminale N-Acetyllactosamin-Sequenzen enthalten (Goelz, et al. (1990) Cell 63, 1349–1356; Lowe, et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 21777–21783; Kumar, et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 21777–21783). Das Produkt der Reaktion migrierte als ein Pentasaccharid, was zu erwarten war, und wurde in das entsprechende Tetrasaccharid durch Behandlung mit der Streptomyces- α1,3/4-Fucosidase umgewandelt.
Um das Verhältnis Man : Fuc zu bestimmen und Standard-N-Glykane vom Mannose-reichen Typ bereitzustellen, wurden radiomarkierte Glykoproteine aus [³H]Man-markierten HL-60-Zellextrakten hergestellt. Für die Herstellung von Glykopeptiden wurden die Zellextrakte mit TCA ausgefällt und mit Pronase entsprechend der Beschreibung von Cummings, et al. ((1983) J. Biol. Chem. 258, 15261–15273) behandelt. Von diesen Glykopeptiden wurden N-Glykan-Standards vom Mannose-reichen Typ (Man₉GlcNAc₁, Man₈GlcNAc₁, Man₇GlcNAc₁, Man₆GlcNAc₁, Man₅GlcNAc₁) nach der Behandlung mit Endo-β-N-Acetylglucosaminidase N (Cummings, R. D. (1993) Glykobiology: A Practical Approach (M. Fukuda und A. Kobata, Herausg.) S. 243–289, IRL Press at Oxford University Press, Oxford) hergestellt.
Relative Molverhältnisse von radiomarkierten Monosacchariden in [³H]GlcN-markierten Glykanen – In dem [³H]GlcN-markierten disialylierten Hexasaccharid wurde NeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6(NeuAcα2→3Galβ1→3)GalNAcOH, hergestellt aus HL-60-Zellen, wurden die NeuAc-, GlcNAc- und GalNAcOH-Reste radiomarkiert (Varki, A. (1994) Meth. Enzymol. 230, 16–32). Während des Gleichgewichts-radiomarkieren sollten die relativen Molanteile dieser Reste nahe 1 betragen. Um das relative Molverhältnis für GlcNAc- und GalNAc-Reste zu bestimmen wurde dieses ³N-GlcN-Hexasaccharid desialyliert, um ein ³H-GlcN-Tetrasaccharid zu erzeugen, wobei dieses Tetrasaccharid in starker Säure hydrolysiert wurde und die freigesetzte Radioaktivität entsprechend der nachfolgenden Beschreibung mit Hilfe von HPAEC identifiziert wurde. Sämtliche Radioaktivität wurde in ³H-GlcN und ³H-GalNOH im Verhältnis von ³H-GlcN:³H-GalNOH von 1,0 : 0,8 gewonnen. Dieses Verhältnis wurde als Korrekturfaktor für die Berechnung der relativen Molverhältnisse von isolierten Glykanen verwendet, d. h. die in 3H-GalN OH) in einer Probe nach der Hydrolyse gewonnene Radioaktivität wurde durch 0,8 dividiert. Das relative Molverhältnis steht in Übereinstimmung mit anderen Untersuchungen an HL-60-Zellen, die metabolisch radiomarkiert wurden mit dem ³H-GlcN-Präkursor (Maemura, K. und Fukuda, M. (1992) J. Biol. Chem. 267, 24379–24386). Um das relative Molverhältnis für NeuAc- und GlcNAc-Reste zu bestimmen, wurde das ³H-GlcN-Hexasaccharid mit Neuraminidase disialyliert und die freigesetzte Radioaktivität in NeuAc bestimmt. Die in GlcN und NeuAc gewonnene Radioaktivität stand jeweils im Verhältnis von 1,0 : 1,4. Da NeuAc-Radioaktivität von 2 Resten des disialylierten Hexasaccharids abgeleitet wurde, lieferte dieser Endwert für das relative Molverhältnis für GlcN : NeuAc 1,0 : 0,7.
Bestimmung der Monosaccharid-Zusammensetzung – Die Verhältnisse von GlcN : GalN und Man : Fuc in PSGL-1 und CD43 wurden nach einer Hydrolyse in starker Säure von exzisierten Gelscheiben ermittelt, die gereinigtes PSGL-1 und CD43 enthielten. Die Gelscheiben wurden in 250 μl 2 N Trifluoressigsäure (TFA) für 2 h bei 121 °C behandelt. Die freigesetzten, radiomarkierten Monosaccharide in dem Hydrolysat wurden mit Hilfe einer pH-Anionen-Austauschchromatographie (HPAEC) auf einer CarboPac PA-1-Säule (4 x 250 mm) in einem Dionex-System identifiziert und mit 16 mM NaOH für 30 min eluiert. Die Fraktionen (0,3 min) wurden aufgenommen und die Radioaktivität durch Szentillationszählung bestimmt. Die radiomarkierten Monosaccharide wurden anhand ihrer Retentionszeiten im Vergleich mit denen von Standard-Monosacchariden identifiziert. Das relative Molverhältnis für GlcN : GalN in Glykanen wurde berechnet, indem die Radioaktivität in dem GlcN-Peak durch die Radioaktivität in dem GalN-Peak dividiert wurde und auf Unterschiede der spezifischen Aktivität von ³H-GlcN gegenüber ³N-GalN korrigiert wurde. Das Man : Fuc-Verhältnis in ³H-Man-Glykanen wurde ebenfalls nach Säurehydrolyse entsprechend der vorstehenden Beschreibung unter Anwendung eines Verhältnisses von Man : Fuc von 1,0 : 1,0 bestimmt, das im typischen Fall nach Gleichgewichts-Radiomarkierung von Zellen mit [2-³H]Man beobachtet wird.
Sonstige Prozeduren – Die enzymatischen Behandlungen von Glykanen mit β-N-Acetylhexosaminidase, β-Galactosidase, Arthrobacter Neuraminidase, Streptomyces-α1,3/4-Fucosidase und E. freundii-Endo-β-Galactosidase wurden entsprechend der Beschreibung von Cummings, et al. ((1989) Methods in Cell Biol. 32, 142–180; Srivatsan, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 20196–20203) ausgeführt. Der Aufschluss mit NDV-Neuraminidase wurde in 20 μl 10 mM Phosphat, pH 7,0 mit 20 mU Enzym für 24 h bei 37°C ausgeführt, gefolgt von einer Zugabe von 20 mU eines anderen Enzyms und einer weiteren Inkubation für 24 h. Die O-Glykane wurden analysiert und mit Hilfe der absteigenden Durchlaufchromatographie auf Whatman-Filterpapier für die angegebenen Zeiten unter Verwendung des Lösemittelsystems Pyridin/Ethylacetat/Wasser/Essigsäure (5 : 5 : 1 : 3) gereinigt, wie von Cummings, R. D. ((1993) Glycobiology) beschrieben wurde. Die Glykane wurden chemisch defucosyliert durch Behandlung mit 0,1 N TFA bei 100°C für 1 h entsprechend der Beschreibung von Spooncer, et al. ((1984) J. Biol. Chem. 259, 4792–4801).
II. Ergebnisse
Reinigung von PSGL-1 und CD43 – PSGL-1 und CD43 wurden aus HL-60-Zellen, die metabolisch mit ³H-GlcN markiert waren, gereinigt. PSGL-1 aus 3H-GIcN-markierten wurde mit Hilfe der Affinitätschromato graphie auf immobilisiertem P-Selectin gereinigt, gefolgt von einer erneuten Chromatographie der gebundenen, mit EDTA eluierten Fraktion. Nahezu alle (90-99%) der radiomarkierten Anteile in dem 2X-gereinigten Material haben P-Selectin gebunden. Diese zweistufige Prozedur war erforderlich, um ein Kontaminieren des Glykoproteins von näherungsweise 120 kDa unter nicht reduzierenden Bedingungen zu entfernen, das nach dem ersten Schritt zurückgeblieben war. Das gereinigte PSGL-1 verhielt sich wie ein Dimer von näherungsweise 250 kDa unter nicht reduzierenden Bedingungen und näherungsweise 120 kDa unter reduzierenden Bedingungen. Das gereinigte PSGL-1 wurde durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen in 2,5% Polyacrylamid aufgelöst und anschließend mit Hilfe der Autoradiographie analysiert.
Es wurden CD43 3N-GlcN-markierte HL-60-Zellextrakte einer Immunpräzipitation mit einem CD43-spezifischen mAb plus einem sekundären Kaninchen-Antimaus-IgGl-Antikörper oder einem sekundären Antikörper allein einer Immunpräzipitation unterzogen. Die Immunpräzipitate wurden unter nicht reduzierenden Bedingungen in einem 10%igen Acrylamid-Gel einer Elektrophorese unterzogen und anschließend mit Hilfe der Autoradiographie analysiert. Eine einzelne Bande von 120 kDa für CD43 wurde sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht reduzierenden Bedingungen festgestellt.
Zusammensetzung von radiomarkierten Zuckern in PSGL-1 und CD43 – In der ersten Bewertung der Glykosylierung von PSGL-1 und CD43 wurde das Verhältnis von GlcN : GalN in den gereinigten Glykoproteinen bestimmt. ³N-GlcN wurde durch Metabolisierung mit Tierzellen in radiomarkiertes GlcNAc, GalNAc und Sialinsäure eingeführt. Es wurden Gelscheiben, die ³H-GlcN-Glykoproteine enthielten, mit starker Säure behandelt (was zu einer Zerstörung der Sialinsäuren führte) und das radiomarkierte GlcN und GalN mit Hilfe von Dionex-HPAEC identifiziert. Das Verhältnis von GlcN : GalN wurde mit näherungsweise 2 : 1 für PSGL-1 und näherungsweise 1 : 1 für CD43 ermittelt. Das GlcN : GalN-Verhältnis von näherungsweise 1 : 1 für CD43 stand in Übereinstimmung mit der veröffentlichten Bestätigung, dass eine Mehrzahl der Glykane in CD43 über das einfach Kern-2-motif-Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH verfügte. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die Glykane von PSGL-1 höhere Mengen an GlcNAc relativ zu GalNAc enthalten als die Glykane von CD43.
Das Vorhandensein der sLe^x-Determinante auf PSGL-1 hat zu Vermutungen geführt, dass PSGL-1 stark fucosyliert sein könnte. Es wurde die Menge an Fuc ermittelt, die auf PSGL-1 und CD43 vorhanden war, die von mit [2 ³H]Man metabolisch radiomarkierten HL-60-Zellen isoliert wurden. Dieser markierte Präkursor wird durch Zellen zu 2-³H-Fuc metabolisiert, wobei die relative spezifische Aktivität von Man und Fuc nach der Gleichgewichtsmarkierung gleich ist.
Es wurde ³H-Man-PSGL-1 und -CD43 mit Hilfe der SDS-PAGE und Autoradiographie isoliert. Die entsprechenden Bänder wurden einer starken Säurehydrolyse unterworfen und die freigesetzten Monosaccharide mit Hilfe der HPAEC auf einem Dionex-System abgetrennt. Das Man : Fuc-Verhältnis wurde mit 3 : 5 für PSGL-1 und mit 3 : 2 für CD43 ermittelt. Als eine Kontrolle wurde auch das Man : Fuc-Verhältnis für die gesamten ungereinigten Glykoproteine aus HL-60-Zellen bestimmt und ein Wert von 3 : 1 ermittelt. Die relativen Mengen von ³H-Man und ³H-Fuc in PSGL-1, CD43 und die Gesamt-HL-60-Glykoproteine wurden nach einer Säurehydrolyse von ³H-Man-PSGL-1, ³H-Man-CD43 und Gesamt ³H-Man-markierten-HL-60-Zell-Glykoproteinen bestimmt. Die Säurehydrolysate wurden mit Hilfe der HPAEC unter Verwendung einer Carbo-Pac-PA-1-Säule analysiert, die mit 16 mM NaOH eluiert wurde. Die Gesamtradioaktivität in dem jeweiligen abgestuften Peak wurde ermittelt. PSGL-1 enthält mehr Fuc-Reste als CD43 und mehr Fuc-Reste als durchschnittlich Glykoproteine in HL-60-Zellen.
Unter Verwendung dieser Information ist es möglich, die Zahl der Fuc-Reste auf PSGL-1 zu bestimmen. Die cDNA-Sequenz von PSGL-1 prognostiziert, dass PSGL-1 über drei potentielle N-Glykosylierungsstellen verfügt. PSGL-1 enthält lediglich N-Glykane vom komplexen Typ, von denen jedes drei Man-Reste haben sollte. Damit repräsentieren drei N-Glykane vom Komplex-Typ auf PSGL-1 9 Man-Reste pro Mol, so dass dementsprechend näherungsweise 15 Fuc-Reste pro Mol PSGL-1 vorhanden sind. Im Gegensatz dazu enthält CD43 lediglich ein einziges N-verknüpftes Glykan und verfügt im Vergleich zu PSGL-1 über sehr viel weniger Fuc. Zusammengefasst demonstrieren die Analysen der Zusammensetzungen von ³H-Man-Glykoproteinen, dass PSGL-1 anders glykosyliert ist als CD43.
β-Eliminierung von O-Glykanen von PSGL-1 und CD43 und Chromatographie auf Bio-Gel P-4 und P-10 – Die O-Glykane von PSGL-1 und CD43 wurden direkt freigesetzt, indem Gelplättchen, die gereinigte Glykoproteine enthielten, mit schwacher Base/Borhydrid behandelt wurden, um die β-Eliminierung zu bewirken, und wurden auf einer Säule von Bio-Gel P-4 fraktioniert. Die freigesetzten 3H-GlcN-Glykane wurden sowohl von PSGL-1 als auch CD43 in drei Fraktionen gewonnen, die 47%, 41 % bzw. 11 % der Gesamtradioaktivität repräsentierten. Im Vergleich zu CD43 enthält PSGL-1 einen hohen Anteil an relativ großen Glykanen.
Die P-4-I-Proben sowohl von PSGL-1 als auch CD43 wurden mit Hilfe der Chromatographie auf einer Säule von Bio-Gel P-10 weiter gereinigt. Die Radioaktivität in der P-4-I-Fraktion von PSGL-1 teilte sich in zwei größere Peaks auf Bio-Gel P-10 auf und wurde bezeichnet mit P-10-1 und P-10-2. Diese Population von Glykanen ist hinsichtlich der Größe größer als der disialylierte Kern-2-Hexasaccharid-Standard
NeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAca1→6(NeuAca2→3Galβ1→3)GalNAcOH.
Der Hauptanteil in der P-4-II-Fraktion von PSGL-1, wurde auf Bio-Gel P-10 in einer etwas kleineren Position (bezeichnet als P-10-3) als der disialylierte Kern-2-Hexasaccharid-Standard eluiert. Im Gegensatz dazu wurde der größte Teil des Materials sowohl in den P-4-I- als auch den P-4-II-Fraktionen von CD43 identisch auf Bio-Gel P-10 als der disialylierte Kern-2-Hexasaccharid-Standard eluiert.
Die in P-4-I von CD43 gewonnenen Glykane wurden unter Anwendung von Exoglykosidase-Behandlungen und Anionen-Austauschchromatographie analysiert. Von den Glykanen zeigte sich, dass sie das erwartete disialylierte Kern-2-Hexasaccharid sind. Eine kleinere Fraktion der P-4-I-Probe von CD43 wurde in Glykanen mit größerer Größe auf Bio-Gel P-10 gewonnen, was mit früheren Untersuchungen in Übereinstimmung stand, die zeigen, dass eine kleinere Fraktion von O-Glykanen aus CD43 über eine verlängerte Polylactosamin-Struktur auf dem Kern-2-motif verfügt. Da die Strukturen von Glykanen in CD43 beschrieben worden sind, wurden sie nicht weiter analysiert.
Analysen der Zusammensetzungen von P-10-1-, P-10-2- und P-10-3-Glykanen aus PSGL-1 – O-Glykane, die durch β-Eliminierung von Ser/Thr-Resten freigesetzt werden, sollten an dem reduzierenden Ende ³H-GalNAcOH enthalten, das nach einer starken Säurehydrolyse als ³H-GalNOH gewonnen werden kann. Um zu identifizieren, welche Glykane in der Mischung von PSGL-1 die O-Glykane repräsentieren, wurde der Gehalt von GalNOH, GalN und GlcN jedes Glykans von Bio-Gel P-10 mit Hilfe der HPAEC auf einem Dionex-System gefolgt von einer starken Säurehydrolyse der Fraktionen ³H-GlcN-PSGL-1 P-10-1, P-10-2 und P-10-3 bestimmt. Die Säurehydrolysate wurden mit Hilfe der HPAEC unter Verwendung einer Carbo-Pac PA-1-Säule analysiert, die mit 16 mM NaOH eluiert wurden. Die Gesamt-Radioaktivität in jedem Peak wurde ermittelt. Es wurden mehr als 95% des gesamten GalN(OH) in PSGL-1-, P-10-2- und P-10-3-Fraktionen als GalNOH gewonnen, was zeigt, dass die β-Eliminierung wirksam war und dass die O-Glykane von PSGL-1 in diesen Fraktionen repräsentiert werden. Den Glykanen in P-10-1 fehlt GalNOH und sie repräsentieren keine O-Glykane, die durch β-Eliminierung freigesetzt werden. Anstelle dessen enthält die P-10-1-Fraktion N-Glykane, die noch an dem Peptid anhaften. Es wurde durch das Vorhandensein von ³H-Man bestätigt, dass in diesen Glykanen von ³H-Man-PSGL-1 gewonnen wurde. Die kleine Menge von GalN, die in P-10-1-Proben gewonnen wurde, könnte von GalNAc-Resten kommen, die in N-Glykanen vorhanden sind, oder könnten aus einer geringen Menge von restlichen O-Glykanen resultieren, die noch mit dem Peptid verknüpft sind und während der Prozeduren der β-Eliminierung nicht freigesetzt wurden.
Sialylierung von P-10-1-, P-10-2- und P-10-3-Glykanen von PSGL-1 – Die Sialylierungsmuster der O-Glykane in P-10-2 und P-10-3 und der N-Glykane in P-10-1 wurden mit Hilfe der Anionen-Austauschsäulenchromatographie auf QAE-Sephadex vor und nach Behandlung mit Neuraminidase bestimmt. In diesem System eluieren Glykane mit 1 negativen Ladung (1 Sialinsäure) mit 20 mM NaCl, solche mit 2 negativen Ladungen (2 Sialinsäuren) eluieren mit 70 mM NaCl und solche mit 3 negativen Ladungen (3 Sialinsäuren) eluieren mit 140 mM NaCl [24,25]. Die Fraktionen von ³H-GlcN-PSGL-1 P-10-1, P-10-2 und P-10-3 wurden auf die Säulen von QAE-Sephadex gegeben und die Säulen mit den angegebenen Konzentrationen von NaCl (mM) entweder vor oder nach der Behandlung mit Newcastle-Disease-Virus (NDV)-Neuraminidase eluiert. Die Glykane in der P-10-1-Fraktion waren heterogen geladen, was in Übereinstimmung mit dem Vorhandensein von N-Glykanen in den Glykopeptiden in dieser Fraktion steht. Nach der Behandlung mit NDV-Neuraminidase wurde die Radioaktivität, eluiert mit 20 mM NaCl, mit Hilfe der absteigenden Durchlaufchromatographie für 20 h analysiert. Authentisches NeuAc migrierte 25 cm. Die P-10-2-Glykane waren mono- und disialylierte Vertreter und die P-10-3-Glykane eine Mischung von neutralen und monosialylierten Vertretern.
Um festzustellen, ob der anionische Charakter der Glykane auf Sialinsäure zurückzuführen ist, und um die Verknüpfung der Sialinsäure festzulegen, wurden Teile der ³H-GlcN-markierten O-Glykane mit Neuraminidase vom Newcastle-Disease-Virus (NDV) behandelt. Dieses Enzym zeigt eine hohe Spezifizität für α2,3-verknüpfte Sialinsäure-Reste und wird nicht Sialinsäure in anderen Verknüpfungen effizient spalten (Paulson, et al. (1982) J. Biol. Chem. 257, 12734–12738). Nach der NDV-Neuraminidase-Behandlung waren die Glykane in P-10-1 geringer geladen, was mit einem Verlust an Sialinsäure in Übereinstimmung steht. Allerdings ist das Vorhandensein restlicher geladener Glykane kennzeichnend für das für N-Glykane in Glykopeptiden zu erwartende Profil. Im Gegensatz dazu wurden die Glykane in P-10-2 und P-10-3 nach der NDV-Neuraminidase-Behandlung neutral, was demonstriert, dass alle Sialinsäuren in diesen Glykanen α2,3-verknüpft sind. Der Peak des Material, das mit 20 mM NaCl nach NDV-Neuraminidase-Behandlung eluiert, wurde quantitativ als freie ³H-NeuAc gewonnen, was durch dessen Coeluierung mit Standard-NeuAc auf der absteigenden Durchlaufchromatographie gezeigt wird. Es wurde früher davon ausgegangen, dass die Sialinsäure auf PSGL-1 von ³N-GlcN-markierten HL-60-Zellen Neu5Ac ist. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die O-Glykane in P-10- 2 mono- und disialylierte Vertreter sind und dass die O-Glykane in P-10-3 eine Kombination neutraler und sialylierter Vertreter sind, wobei die Sialinsäure in α2,3-Verknüpfung zu Glykanen steht. Außerdem demonstrieren diese Ergebnisse, dass die O-Glykane von PSGL-1 nicht sulfatiert sind, da neutrale Spezies aus der Behandlung mit NDV-Neuraminidase folgen.
Absteigende Durchlaufchromatographie von P-10-2-Glykanen von PSGL-1 Die Glykane in P-10-2 wurden weiter unter Verwendung der präparativen absteigenden Durchlaufchromatographie gereinigt und zwei größere Vertreter gewonnen. Der eine Peak enthielt Glykane mit größerer Größe, die langsam von dem Ursprung (bezeichnet als P-10-2a) migrierten. Ein kleiner Peak eines schneller migrierenden Materials (näherungsweise 24 cm) wurde ebenfalls festgestellt, der einige Restglykane repräsentiert, die sich von dem P-4-11-Peak ableiten. Bei der Anionen-Austauschchromatographie auf QAE-Sephadex eluierte das P-10-2a-Material als monosialylierte Vertreter, während das P-10-2b-Material als disialylierte Vertreter eluierte.
Exoglykosidase-Behandlungen von P-10-2b-Glykanen – Die disialylierten Glykane in P-10-2b mit geringerer Größe wurden durch Behandlung mit NDV-Neuraminidase desialyliert und freigesetzte Sialinsäure durch Chromatographie auf QAE-Sephadex entfernt. Die desialylierten Glykane wurden mit Hilfe absteigenden Durchlaufchromatographie vor und nach sequenziellen Exoglykosidase-Behandlungen (4A–E) analysiert. Nach der Behandlung mit Neuraminidase wurden die desialylierten P-10-2b-Glykane als zwei Vertreter fraktioniert (4A). Ein kleinerer Peak (näherungsweise 10%) comigrierte mit dem fucosylierten Pentasaccharid-Standard
Galβ1→4(Fucβ1→3)GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH
und wurde bezeichnet als P-10-2b. Ein größerer Peak (näherungsweise 90%) von Material comigrierte mit dem Standard-Kern-2-Tetrasaccharid Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH und wurde bezeichnet als P-10-2b₂.
Die desialylierten P-10-2b-Glykane wurden mit β-N-Acetylhexosaminidase behandelt. Diese Behandlung veränderte die Migration beider Vertreter in der Probe, was darauf hinweist, dass den Glykanen terminate GlcNAc-Reste fehlen. Wenn allerdings die desialylierte P-10-2b-Mischung mit β-Galactosidase behandelt wurde, blieben die P-10-2b₁-Glykane unbeeinflusst, während P-10-2b₂-Glykane abgebaut wurden und mit dem Standard-Trisaccharid
GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH (4B)
comigrierten. Die Galβ1→3GalNAcOH-Struktur ist gegenüber Riesenbohnen-β-Galactosidase resistent, da das Enzym terminale Galactosyl-Reste in der β1,3-Verknüpfung im Wesentlichen nicht spaltet (Li, et al. (1975) J. Biol. Chem. 250, 6786–6791). Dieses wurde in Kontrolluntersuchungen bestätigt, worin keine Spaltung des Standard-Disaccharids Galβ1→3GalNAcOH mit den Konzentrationen von Riesenbohnen-β-Galactosidase auftrat, wie sie in diesen Analysen zur Anwendung gelangten. Da die P-10-2b₂-Glykane von disialylierten Vertretern abgeleitet sind, demonstrieren diese Ergebnisse, dass die P-10-2b₂-Glykane von dem Kern-2-Hexasaccharid
NeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6(NeuAcα2→3Galβ1→3)GalNAcOH
abgeleitet sind.
Wenn die disialylierten ³N-GlcN-P-10-2b-Glykane mit der Streptomyces-α1,3/4-Fucosidase behandelt werden, waren die P-10-2b₁-Glykane verloren und alle gewonnenen Glykane comigrierten mit dem Kern-2-Tetrasaccharid-Standard Galβ1→4GlcNAca1→6(Galβ1→3)GalNAcOH (4C). Die kombinierte Behandlung der desialylierten P-10-2b-Glykane mit Streptomyces-α1,3/4-Fucosidase, -β-N-Acetylhexosaminidase und -β-Galactosidase führte zu einem vollständigen Abbau sowohl der P-10-2b₁- als auch der P-10-2b₂-Glykane zu freiem ³H-GlcNAc und dem ³H-Disaccharid Galβ1→3GalNAcOH (4D). Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die P-10-2b₁-Glykane über die fucosylierte Pentasaccharid-Struktur verfügen:
Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH.
Da die ursprünglichen P-10-2b-Glykane disialylierte Vertreter sind, enthalten P-10-2b₁-Glykane das sLe^x-Antigen
NeuAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→R
und verfügen über die Heptasaccharid-Struktur
NeuAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcα1→6
(NeuAcα2→3Galβ1→3)GalNAcOH (7).
Um weiter das Vorhandensein von Fucose in diesen Glykanen zu bestätigen und die Identifikation von Fuc in anderen Glykanen zu erleichtern, wurden HL-60-Zellen metabolisch mit [³N-Fuc] radiomarkiert. Die ³N-Fucmarkierten O-Glykane wurden durch β-Eliminierung entsprechend der Beschreibung für die ³N-GlcN-Glykane gewonnen, indem die gleichen Prozeduren befolgt wurden, wie sie vorstehend beschrieben wurden. Das in der desialylierten P-10-2b-Fraktion gewonnene ³H-Fuc comigrierte mit den desialylierten ³H-GlcN-P-10-2b₁-Glykanen (4E). Zusammengefasst demonstrieren diese Ergebnisse, dass P-10-2b₁-Glykane von PSGL-1 fucosyliert sind und die sLe^x-Struktur enthalten.
Endo- und Exoglykosidase-Behandlungen von P-10-2a-Glykanen – Aufgrund ihrer relativen großen Größe wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass die P-10-2a-Glykane Polylactosamin [3Galβ1→4GlcNAcβ1-]_n enthalten. Um diese Möglichkeit einzuschätzen, wurden die P-10-2a-Glykane desialyliert und die Sialinsäure durch QAE-Sephadex-Chromatographie entfernt. Die resultierenden neutralen Glykane wurden mit Endo-β-Galactosidase behandelt, einem Enzym, das innere β1→4-Galactosyl-Reste innerhalb des Typs 2 des Polylactosamins abspaltet (Kobata und Takasaki (1993) Glycobiology: A Practical Approach (M. Fukuda und A. Kobata, Heraus.), S. 165–185, IRL Press at Oxford University Press, Oxford). Die Glykane waren gegenüber dieser Behandlung resistent (5A). Die desialylierten P-10-2a-Glykane waren ebenfalls gegenüber einer kombinierten Behandlung mit β-Galactosidase und β-N-Acetylhexosaminidase resistent (5A). Sodann wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass die P-10-2a-Glykane ein Polylactosamin-Gerüst enthalten könnten, in welchem alle inneren GlcNAc-Reste fucosyliert sind. Derartige polyfucosylierte Polylactosamin-Strukturen sind gegenüber Endo-β-Galactosidase resistent (Fukuda, et al. (1984) J. Biol. Chem. 259, 10925–10935). Es ist eine vollständige Defucosylierung erforderlich, bevor Endo-β-Galactosidase die Ketten abbauen kann.
Die desialylierten P-10-2a-Glykane wurden chemisch defucosyliert und anschließend mit Endo-β-Galactosidase behandelt. Nach Defucosylierung baute das Enzym die P-10-2a-Glykane quantitativ ab, um drei größere Verbindungen in näherungsweise einem äquimolaren Verhältnis freizusetzen, die identifiziert wurden als das Trisaccharid Galβ1→4GlcNAcβ1→3Gal, als das restliche Kern-2-Trisaccharid GlcNAcβ1→6(Gal1→3)GalNAcOH und als das Disaccharid GlcNAcβ1→3Gal (5B). Die Erzeugung solcher Produkte aus der spezifischen Wirkung von Endo-β-Galactosidase wird für ein Glykan mit der folgenden Gerüststruktur vorhergesagt:
worin die Pfeile die speziellen Stellen der Spaltung für Endo-β-Galactosidase eines defucosylierten, Polylactosamin-enthaltenden Glykans anzeigen (Kobata und Takasaki (1993) Glycobiology). Die Länge der Polylactosamin-Kette kann von der Radioaktivität abgeleitet werden, die in dem Disaccharid GlcNAcβ1→3Gal relativ zu anderen Fragmenten gewonnen wird. Die Gewinnung des Trisaccharids GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH, gefolgt von einer Endo-β-Galactosidase-Behandlung demonstriert, dass das Polylactosamin von der GlcNac in der β1-6-Verknüpfung bis zu dem GalNAcOH-Rest verlängert ist. Die Gewinnung von Galβ1→4GlcNAcβ1→3Gal demonstriert, dass Gal-Reste in dem nicht reduzierenden Terminus des Polylactosamins vorhanden sind. Wie zu erwarten war, führte die Behandlung der desialylierten und defucosylierten P-10-2a-Glykane mit einer Kombination von β-Galactosidase und β-N-Acetylhexosaminidase zu einem vollständigen Aufschluss zu freier ³H-GlcNAc und dem ³H-Disaccharid Galβ1→3GalNAcOH (4B).
Die Resistenz der desialylierten P-10-2a-Glykane gegenüber Endo-β-Galactosidase vor der Defucosylierung steht in Übereinstimmung mit der Möglichkeit, dass jeder GlcNAc-Rest in dem Glykan einen α1,3-verknüpften Fucosyl-Rest in der Struktur enthält:
Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→3Galβ1→ 4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH. O-Glykane, die unvollständig fucosylierte Polylactosamine enthalten, sind gegenüber Endo-β-Galactosidase empfindlich.
Um das für die P-10-2a-Glykane vorhergesagte Muster der Fucosylierung zu bestätigen, wurden die ³H-Fuc-P-10-2a-Glykane aus ³H-Fuc-PSGL-1 hergestellt. Nach der Behandlung mit Neuraminidase comigrierten die desialylie rten ³H-Fuc-Glykane mit den desialylierten ³H-GlcN-P-10-2a-Glykanen. Wenn die desialylierten ³H-Fuc-P-10-2a-Glykane mit der Streptomyces-α1,3/4-Fucosidase behandelt wurden, wurde näherungsweise ein Drittel des radioaktiven Fuc freigesetzt. Dieses Ergebnis wird auf der Grundlage der postulierten Glykan-Struktur und der Spezifität der Streptomyces-α1,3/4-Fucosidase vorhergesagt, die lediglich Fuc von den vorletzten GlcNAc-Resten in einem polyfucosylierten Glykan entfernen kann (Maemura und Fukuda (1992) J. Biol. Chem. 267, 24379–24386, Sano, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 1522–1527). Zusammengefasst demonstrieren diese Daten, dass die P-10-2a-Glykane drei Fuc-Reste enthalten, von denen einer sich in der terminalen Lactosaminyleinheit befindet.
Die P-10-2a-Glykane sind monosialyliert und könnten eine der zwei möglichen Strukturen haben (a oder b), wie sie nachfolgend dargestellt sind:
Zur Unterscheidung zwischen diesen Möglichkeiten wurden die ³H-GlcN-P-10-2a-sialylierten Glykane mit einer Mischung von β-Galactosidase, β-N-Acetylhexosaminidase und Streptomyces-α1,3/4-Fucosidase mit oder ohne Neuraminidase behandelt. Es wurde vorhergesagt, dass Struktur (a) zusätzlich zu den anderen Enzymen eine Neuraminidase für den vollständigen Aufschluss erfordern würde, während Struktur (b) durch die Exoglykosidasen in Abwesenheit von Neuraminidase abgebaut werden würde. Die Behandlung des ³H-GlcN-P-10-2a mit Neuraminidase allein, setzte radiomarkiertes NeuAc frei. Wenn die Glykane mit einer Mischung von β-Galactosidase, β-N-Acetylhexosaminidase und Streptomyces-α1,3/4-Fucosidase in Abwesenheit von Neuraminidase behandelt wurden, wurde keine Radioaktivität freigesetzt. Die Einbeziehung von Neuraminidase mit anderen Exoglykosidasen führte zum vollständigen Aufschluss der Glykane zu freien ³H-NeuAc, freien ³H-GlcNAc und dem ³H-Disaccharid Galβ1→3GalNAcOH. Zusammengefasst demonstrieren diese Ergebnisse, dass der einzelne Sialinsäure-Rest auf den P-10-2a-Glykanen in einer terminalen Position auf der Polylactosamin-Kette vorhanden ist, wie sie in Struktur (a) gezeigt ist, und dass diese Glykane die sLe^x-Struktur (7) haben.
Endo- und Exoglykosidase-Behandlungen von P-10-3-Glykanen – Die P-10-3-Glykane sind hauptsächlich neutrale oder monosialylierte Vertreter. Die vorherrschenden Vertreter (näherungsweise 80% der Radioaktivität) waren nicht sialyliert. Die P-10-3-Fraktion wurde mit Neuraminidase behandelt und die freigesetzte Sialinsäure durch Chromatographie auf dem QAE-Sephadex entfernt. Näherungsweise 90% der desialylierten Vertreter comigrierten mit dem Standard-Kern-2-Tetrasaccharid Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH, während der Rest mit dem Kern-1-Disaccharid Galβ1→3GalNAcOH (6) comigrierte. Die Behandlung der desialylierten P-10-3-Glykane mit β-Galactosidase bewirkte eine Verschiebung der Migration des größeren Peaks zu dem des erwarteten Trisaccharid-Standards (6). Die Behandlung mit einer Kombination von β-Galactosidase und β-N-Acetylhexosaminidase erzeugte freie ³H-GlcNAc und ³H-Galβ1→3GalNAcOH (6). Näherungsweise 20% des radiomarkierten Anteils in den P-10-3-Glykanen erwiesen sich überwiegend als monosialylierte Vertreter, die durch Behandlung mit Neuraminidase zu neutralen Vertretern überführt wurden. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die P-10-3-Glykane hauptsächlich neutrale Kern-2-Tetrasaccharide sind und einige monosialylierte Kern-2-Pentasaccharide (7). Zusätzlich verfügen einige der neutralen Glykane über die Kern-2-Disaccharid-Struktur (7).
Relativer Prozentanteil vo O-Glykanen in PSGL-1 von HL-60-Zellen – Die relativen Prozentanteile von O-Glykanen in PSGL-1 lassen sich aus der Menge der in jedem O-Glykan gewonnenen Radioaktivität und aus dem relativen Molverhältnis für ³H-GlcN: ³H-GalNOH: ³H-NeuAc mit 1,0 : 0,8 : 0,7 (7) berechnen. Die Mehrheit der O-Glykane in PSGL-1 enthält die Kern-2-Struktur. Eine Minderheit der Glykane, die in P-10-2b₁ und P-10-2a gewonnen wurden, enthält die sLe^x-Determinante.
III. Schlussfolgerungen
Die vorliegende Untersuchung demonstriert, dass PSGL-1 von Human-HL-60-Zellen O-Glykane mit einem Kern-2-motif enthält. Eine Mehrheit der Glykane sind nicht fucosyliert und sind Mischungen von neutralen und sialylierten Vertretern. Eine Minderheit der O-Glykane (näherungsweise 14%) sind fucosyliert und enthalten die terminale sLe^x-Struktur. Es sind zwei Typen von fucosylierten O-Glykanen vorhanden; der eine Typ ist ein disialyliertes Heptasaccharid, dem Polylactosamin fehlt, und der andere ist ein eindeutig monosialyliertes, trifucosyliertes Glykan, das Polylactosamin enthält. Das Vorhandensein von Kern-2-O-Glykanen auf PSGL-1 von HL-60-Zellen steht in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Untersuchungen über die Glykosylierung von PSGL-1 von Human-Neutrophilen. Desialyliertes PSGL-1 sowohl von Human-Neutrophilen als auch von HL-60-Zellen ist gegenüber einer Behandlung mit Endo-β-N-Acetylgalactosaminidase (O-Glykanase) resistent, die lediglich desialylierte Kern- 1-Glykane spaltet. Der unmittelbare Nachweis von sLe^x-Determinanten und Polylactosamin auf O-Glykanen von HL-60-deriviertem PSGL-1 verstärkt den indirekten Beweis dafür, dass diese Strukturen auf O-Glykanen von neutrophil deriviertem PSGL-1 vorhanden sind.
Es wurden signifikante Unterschiede in den O-Glykanen auf PSGL-1 und CD43 von HL-60-Zellen festgestellt. Obgleich beide Proteine primär Kern-2-O-Glykane aufweisen, hat PSGL-1 zahlreiche neutrale Kern-2-Tetrasaccharide, während CD43 überwiegend disialylierte Kern-2-Hexasaccharide hat. Die Kern-2-Struktur ist ein Präkursor für die Polylactosaminsynthese in O-Glykanen, wobei jedoch lediglich PSGL-1 signifikante Mengen von Polylactosamin hat. Dieses zeigt, dass die Kern-2-Struktur erforderlich, nicht jedoch ausreichend für die Polylactosamin-Addition ist. Ferner fehlen dem CD43 die zwei Vertreter von fucosylierten O-Glykanen, die sich in PSGL-1 finden. Obgleich ein monofucosyliertes O-Glykan in CD43 identifiziert wurde, repräsentiert dieser Vertreter lediglich 0,5% der O-Glykane in CD43. Das trifucosylierte, monosialylierte O-Glykan, das auf PSGL-1 identifiziert wurde, wurde nicht auf CD43 gefunden.
Wie vorstehend diskutiert wurde, kann P-Selectin schwach an einer Vielzahl von sulfatierten Glykanen binden, wobei diese Glykane das Binden von P-Selectin an Human-Knochenmarkzellen hemmen. Allerdings sind die O-Glykane von PSGL-1 nicht sulfatiert. Anstelle dessen enthält PSGL-1 Tyrosinsulfat, das für Wechselwirkungen mit P-Selectin nicht jedoch mit E-Selectin benötigt wird. Drei Konsensusstellen für Tyrosinsulfatierung treten am Amino-Terminus von PSGL-1 an den Resten 46, 48 und 51 auf. PL1, ein mAb zu PSGL-1, blockiert das Binden an P-Selectin und erkennt ein Epitop, das die Reste 49–62 überspannt, die die Stellen der Tyrosinsulfatierung überlappen. In der Nähe der Stellen der Tyrosinsulfatierung befinden sich zwei Thr-Reste, die potentielle Stellen der O-Glykosylierung an den Resten 44 und 57 repräsentieren. Mutationen in diesen Resten verringern das Binden von PSGL-1 an P-Selectin, wenn PSGL-1 in COS-Zellen entweder mit FTIII oder FTVII coexprimiert ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass lediglich eines oder zwei O-Glykane in Verbindung mit Tyrosinsulfat-Resten ausreichend sein können, um das Hochaffinitätsbinden von PSGL-1 an P-Selectin zu fördern. Allerdings können O-Glykane in anderen Regionen des Moleküls ebenfalls zu Wechselwirkungen mit P- und E-Selectin beitragen.
Es wurde ursprünglich angenommen, dass Mucin-ähnliche Glykoproteine als bequeme Protein-Gerüste wirken, auf denen viele O-Glykane für die Erkennung durch Selectine geclustert sein können. Diese Daten zeigen in Verbindung mit anderen Untersuchungen jedoch, dass Mucin-ähnliche Glykoproteine unterschiedlich glykosyliert sind.
Sequenzliste

Claims

Gereinigtes O-Glykan, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Gereinigtes O-Glykan nach Anspruch 1, worin R2 OH ist.
Gereinigtes O-Glykan nach Anspruch 1, worin R2 ein Aglykon ist.
Gereinigtes O-Glykan nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin R1 ein Aglykon ist.
Zusammensetzung, aufweisend das O-Glykan nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einem pharmazeutisch zulässigen Träger zur Verabreichung an einen Patienten, der dieses bedarf.
Verfahren zum Hemmen des Bindens von PSGL-1 an P-Selectin in vitro, umfassend das Verabreichen einer ausreichenden Menge eines O-Glykans, um das Binden zu Hemmen, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem R2 OH ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem R2 ein Aglykon ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin R1 ein Aglykon ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Therapie, worin die Zusammensetzung ein O-Glykan und einen pharmazeutisch zulässigen Träger aufweist, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 H ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin R2 OH ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin R2 ein Aglykon ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, worin R1 ein Aglykon ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin die Therapie das Hemmen des Bindens von PSGL-1 an P-Selectin umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin die Therapie das Modulieren von Leukozytenadhäsion umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin die Therapie das Modulieren einer Entzündung umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin die Therapie das Modulieren von Tumormetastase umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin die Therapie das Reduzieren oder Modulieren von Koagulation, Schlag oder Gefäßerkrankung umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin die Zusammensetzung eine wirksame Menge des O-Glykans aufweist.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen des Bindens von PSGL-1 an p-Selectin, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 H ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zum Modulieren von Leukozytenadhäsion, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zum Modulieren von Tumormetastase, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 H ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen von Leukozytenadhäsion, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zum Blocken von Zelladhäsion, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 H ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen von Entzündung, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierfen Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 H ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen von Leukozyten-vermittelter Entzündung, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 H ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung der Leukozytenadhäsion im ischämischen Myocardium, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 H ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung von Reperfusionsverletzung, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 H ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung von Organverletzung, die durch Adhäsion von Leukozyten an einer Gefäßoberfläche ermittelt wird, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 H ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments für die Verringerung oder Modulierung von Schlag, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 H ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung von Gefäßerkrankung, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 H ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung von mesenterialer oder peripheraler Gefäßerkrankung, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung der Adhäsion von Leukozyten in einem Gefäßsystem, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 H ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung der Aggregation von Thrombozyten in einem Gefäßsystem, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung von Organschaden, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 H ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung der von Leukozyten-abhängigem Organschaden, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung von bakterieller Sepsis, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 H ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung von disseminierter intravasaler Koagulation, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 H ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung von Atemnotsyndrom des Erwachsenen, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 H ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung der Adhäsion oder Aggregation von Leukozyten im Lungenkreislauf, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung von generalisierten Gefäßdurchlässigkeit, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 H ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung von Metastase von Tumorzellen von einer Malignität, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung von Atherosklerose, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von rheumatoider Arthritis, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 H ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Autoimmunerkrankung, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Entzündungserkrankung, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst nach Anspruch 1.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verhütung der Ausdehnung eines Myokardinfarktes, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 H ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines akuten Atemnotsyndroms, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 H ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Schock, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 H ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von niedrigem Blutdruck, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 H ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 H ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer thrombotischen Erkrankung, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 H ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation von Koagulation, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung eines O-Glykans zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung oder Modulierung von Kreislaufschock, worin das O-Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem disialylierten, monofucosylierten Glykan:
und einem monosialylierten, trifucosylierten Glykan mit einem Polylactosamin-Gerüst:
worin R1 N ist, ein Zucker oder ein Aglykon, und worin R2 N ist, OH, ein Zucker oder ein Aglykon.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 53, worin R2 OH ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 53, worin R2 ein Aglykon ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 55, worin R1 ein Aglykon ist.