KR20040039440A - 셀렉틴 매개 염증의 펩티드 및 ｏ-글리칸 억제제 - Google Patents

셀렉틴 매개 염증의 펩티드 및 ｏ-글리칸 억제제 Download PDF

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Abstract

PSGL-1의 티로신 술페이트, 특히 하나 이상의 잔기(46, 48, 51)는 시알화 및 푸코오스화 글리칸, 가장 바람직하게는 Thr-57과 함께 작용하여 P-셀렉틴과 고 친화성 결합을 매개한다. PSGL-1 O-글리칸은 디시알화 또는 중성 형태의 코어-2 사당 Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH로 구성된 것으로 판명되었다. 소수의 O-글리칸은 시알릴 루이스 엑스 항원을 함유하는 두 개의 주요종(하나의 종은 하기 화학식 (I)의 디시알화, 모노푸코오스화 글리칸이고, 다른 한 종은 하기 화학식 (II)의 폴리락토오사민 주쇄를 갖는 모노시알화, 트리푸코오스화 글리칸이다)으로서 생기는 α1,3 푸코오스화된 것이다:
(I)
(II)
상기 식에서,
R은 H, OH, 또 다른 당 또는 아글리콘 예컨대 아미노산이다.

Description

셀렉틴 매개 염증의 펩티드 및 Ｏ-글리칸 억제제{Peptide and O-glycan inhibitors of selectin mediated inflammation}
본 발명은 셀렉틴 매개 염증의 억제제에 관한 것이며, 특히 PSGL-1로부터 유도된 억제제, P-셀렉틴에 대한 리간드, 및 PSGL-1로부터 유도된 신규 과당에 관한 것이다.
미국 정부는 리차드 디. 커밍스 및 로저 피. 맥에버에 대한 미국 국립 위생 연구 연구비 번호 PO1 HL54804호 및 RO1 HL 43510호에 의해 본 발명의 권리를 갖는다.
셀렉틴은 소정맥 순환에서 발견되는 전단력하에서 혈소판 또는 내피 세포에 대한 백혈구의 부착을 개시하는 세 개의 Ca2+-의존성 세포막-결합 렉틴의 한 패밀리이다[라스키, (1992) Science 258, 964-969; 베빌라쿠아 일행, (1993) J. Clin. Invest. 91, 379-387; 맥에버 (1994) Curr. Opin. Immunol. 6, 75-84]. 백혈구에서 발현되는 L-셀렉틴은 내피 세포의 구성 리간드 또는 유도 리간드에 결합한다. 시토킨-활성 내피 세포에 의해 발현되는 E-셀렉틴, 트롬빈-활성 혈소판 및 내피 세포에 의해 발현되는 P-셀렉틴은 골수 세포 및 림프구의 서브세트의 리간드에 결합한다.
P-셀렉틴은 트롬빈 및 다른 아고니스트에 대한 반응으로 활성 혈소판 및 내피 세포의 표면에서 발현되는 칼슘-의존성 탄수화물-결합 단백질이다[맥에버 일행, (1995) J. Biol. Chem. 270, 11025-11028; 바르키, 에이. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 미국, 91, 7390-7397; 스프링거, 티.에이. (1995) Annu. Rev. Physiol. 57, 827-872]. 백혈구의 당결합체-기재 반대수용체와의 결합을 통하여, P-셀렉틴은 활성 혈소판 및 내피 세포에서 상기 세포의 롤링(rolling) 결합을 매개한다[로렌스 및 스프링거 (1991) Cell 65, 852-873; 무어 일행, (1995) J. Cell. Biol. 128, 661-671]. 시알산 및 푸코오스는 모두 백혈구의 P-셀렉틴 반대수용체의 성분이다[코랄 일행, (1990) Biochem. Biophys. Res. Comm. 172, 1349-1356; 무어 일행, (1992) J. Cell. Biol. 118, 445-456; 사코 일행, (1993) Cell 75, 1179-1186).
비록 셀렉틴이 작은 시알화, 푸코오스화 과당 예컨대 시알릴 루이스 엑스(sLex; NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc)와 약하게 상호작용하지만[폭살 일행, (1992) J. Cell Biol. 117, 895-902; 바르키, (1992) Curr. Opin. Cell Biol. 257, 257-266], 제한된 수의 당단백질[무어 일행, (1992) J. Cell Biol. 118, 445-456; 라스키 일행, (1992) Cell 69, 927-938; 레비노비츠 일행, (1993) J. Cell Biol. 121, 449-459; 왈체크 일행, (1993) J. Exp. Med. 178, 853-863; 바움휴에터 일행, (1993) Science 262, 436-438; 베르그 일행, (1993) Nature 366, 695-698] 또는 프로테오글리칸[노르가르드-슘니츠 일행, (1993) Science 261, 480-483]의 글리칸과 높은 친화도를 가지고 결합한다. 백혈구 표면의 결정적인 요소인 시알릴 루이스 엑스(sLex), NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcβ1-R을 함유하는 과당은 P-셀렉틴에 백혈구가 부착하는 것을 억제한다[폴리 일행, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 88, 6224-6228; 폭살 일행, (1992) J. Cell Biol. 117, 895-902] 그러나, 고수준의 sLex를 발현하는 비골수 세포가 골수 세포에 비하여 P-셀렉틴에 불충분하게 결합하기 때문에, 세포 표면의 sLex의 발현은 P-셀렉틴에 대하여 높은 친화도로 결합하기에 충분하지 않다[쥬 일행, (1991), J. Cell Biol. 115, 557-564]. 고 친화성 리간드는 염증이 있을 때 셀렉틴-매개 백혈구 부착의 생리학적 매개체로서 잠재적으로 중요하다. 따라서, 셀렉틴에 의한 상기 당결합체의 고 친화성 인식에 대한 구조적 기초를 이해하는 것은 많은 관심을 불러일으켰다.
고 친화성 셀렉틴 리간드의 서브세트는 뮤신과 유사한 당단백질로 구성된다[맥에버 일행, (1995)]. P-셀렉틴에 대한 시알로뮤신 리간드는 인간 호중구 및 인간 전골수 세포주 HL-60에 의해 발현된다[무어 일행, (1992); 무어 일행, (1994) J. Biol. Chem. 269, 23318-23327]. 백혈구는 P-셀렉틴에 대한 하나의 고 친화성 리간드, 즉 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)을 발현한다[무어 일행, (1995);무어 일행, (1992); 사코 일행, (1993); 노르가르드 일행, (1993) J. Biol. Chem. 268, 12764-127748; 무어 일행, (1994) J. Biol. Chem. 269, 23318-23327]. 리간드에 대한 P-셀렉틴의 결합은 Ca2+의존적이며 리간드를 시알리다제로 처리함으로써 억제된다.
PSGL은 SDS-PAGE에 의해 측정된 약 120,000의 분자량을 갖는 두 개의 이황화 결합된 서브유닛을 갖는 동종이합체이다(무어 일행, 1992). 각 서브유닛은 단지 3개의 N-글리칸을 갖지만, 많은 군집된 시알화 O-글리칸을 갖는다[무어 일행, (1992); 노르가르드 일행, (1993) J. Biol. Chem. 268, 12764-12774]. PSGL-1의 세포밖 도메인은 매우 확장되어 있으며, 이는 뮤신과 유사한 단백질의 특징이다. PSGL-1은 연속적인 10합체 반복(인간 전골수 세포 HL-60인 경우 15합체 반복이고 인간 백혈구인 경우 16합체 반복)을 포함하고, 많은 세린, 트레오닌 및 프롤린을 함유하는 세포밖 도메인을 갖는 타입1 세포막 단백질이다[사코 일행, (1993) Cell 75, 1179-1186; 무어 일행, (1995) J. Cell Biol. 128, 661-671; 벨드만 일행, (1995) J. Biol. Chem. 270, 16470-16475]. 18-잔기의 시그날 펩티드 다음에 19-41 잔기의 프로펩티드가 있으며, 이것은 백혈구에서 합성된 후 PSGL-1로부터 제거된다[사코 일행, (1993); 바치노 일행, (1995) J. Biol. Chem. 270, 21966-21974]. 공정을 거친 성숙된 단백질의 세포밖 도메인은 42 내지 318 잔기이며, 이어 69-잔기의 세포질 꼬리에 25-잔기의 투과세포막 도메인이 있다. 상기 단백질은 sLex항원뿐만 아니라 많은 변형되지 않은 시알 잔기를 갖는다. 리간드는 P-셀렉틴이 인식하는데 필요하지 않은 하나 이상의 PNGaseF-민감성 N-결합 글리칸을 함유한다. 이와 반대로, 상기 단백질은 폴리펩티드 주쇄가 O-시알로글리코프로테아제 효소에 의한 분해에 민감하도록 하는 군집된 시알화 O-결합 과당을 갖는다. 온전한 HL-60 세포를 상기 효소로 처리하는 것은 sLex의 전반적인 표면 발현에 영향을 미치지 않으면서 P-셀렉틴의 고 친화성 결합 위치를 제거하며[유시야마 일행, (1993), J. Biol. Chem. 268, 15229-15237], 고정된 P-셀렉틴에 세포가 부착되는 것을 방지한다[노르가르드 일행, (1993) J. Biol. Chem. 268, 12764-12774; 스테이닌거 일행, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992) 188, 760-766]. 상기 자료는 세포 표면 sLex의 단지 작은 부분을 갖는 시알로뮤신이 인간 골수 세포의 P-셀렉틴에 대한 기능적으로 중요한 고 친화성 결합 위치에 해당함을 시사한다.
사코 일행(1993)은 PSGL-1을 코딩하는 인간 HL-60 세포로부터 유도된 cDNA를 분리하였다. PSGL-1의 각 서브유닛에 대한 cDNA-유래 서열은 402개의 아미노산의 타입1 투과세포막 단백질을 예견한다. 세포밖 도메인은 잔기 1-18의 N-말단 시그날 펩티드 및 잔기 19-41의 추정상의 프로펩티드를 갖는다. 이 프로펩티드가 절단되면, 성숙된 단백질의 세포밖 도메인은 42-308 잔기이다. 상기 서열은 결국 25 잔기의 투과세포막 도메인 및 69 잔기의 세포질 꼬리를 갖는다. 세포밖 도메인은 O-당화의 잠재적인 위치인 세린 및 트레오닌이 풍부하다. 세포밖 도메인은 이합체 형성을 촉진할 수 있는 하나의 시스테인 및 46, 48 및 51 잔기에 3개의 잠재적인 티로신의 황화 위치뿐만 아니라 N-결합 과당의 부가를 위한 3개의 잠재적인 위치를갖는다.
비록 종래의 연구에 의하면 P-셀렉틴에 결합하기 위하여 PSGL-1의 시알화 및 푸코오스화가 필요하지만, PSGL-1의 번역 후 변형도 또한 중요할 수 있다. PSGL-1은 매우 O-당화되어 있으며, sLex에서 끝나는 몇몇 글리칸을 포함하여 시알화되고 푸코오스화된 O-결합 폴리-N-아세틸락토오사민을 함유한다(무어 일행, 1994, J. Biol. Chem. 269, 23318-23327). sLex또는 관련된 글리칸은 PSGL-1이 P-셀렉틴에 고 친화적으로 결합하기에 충분하지 않다. 예컨대, 시알산 또는 푸코오스가 없는 술페이트 화합물은 백혈구가 P-셀렉틴에 부착하는 것을 억제한다[노르가르드-슘니츠 일행, (1993) Science 261, 480-483; 넬손 일행, (1993) Blood 82, 3253-3258; 세코니 일행, (1994) J. Biol. Chem. 269, 15060-15066; 스키너 일행, (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 164, 1373-1379]. 상기 자료는 PSGL-1의 황화가 P-셀렉틴에 고 친화적으로 결합하는데 필요할 수 있음을 시사한다. 푸코오실트랜스퍼라아제를 갖는 COS 세포에서 발현되는 재조합 PSGL-1은 세포 부착 실험에서 P-셀렉틴과 상호 작용한다(사코 일행, 1993). 그러나, 재조합 PSGL-1의 과당과 원래의 당단백질 리간드의 과당의 유사한 정도는 공지되어있지 않다.
비록 셀렉틴과의 결합에 있어서 PSGL-1의 탄수화물이 중요하지만, 글리칸의 상세한 화학적 구조는 이용가능하지 않다. 원 리간드의 효소적 처리 및 다양한 세포 종류에서 발현된 재조합 PSGL-1의 연구를 통하여 분자의 당화에 관한 많은 정보가 얻어졌다. 이들 간접적인 방법이 리간드의 중요한 결정자에 관한 가치있는 정보를 제공할 수 있는 반면, 원래의 PSGL-1로부터 O-글리칸에 대한 상세한 구조적 정보는 리간드의 기능을 위하여 중요한 글리칸을 확인하고, PSGL-1이 P- 및 E-셀렉틴에 대한 리간드인 반면 다른 뮤신 예컨대 CD43은 그렇지 않은 것에 대한 더욱 명백한 이해를 제공하는데 있어서 필수적이다.
따라서, 본 발명은 일반적으로 당화되고 황화된 PSGL-1을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 P-셀렉틴 및 기타 셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합을 억제하는 방법 및 시약에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 P-셀렉틴에 대한 결합을 변형시키는데 유용한 신규 O-글리칸에 관한 것이다.
발명의 요약
PSGL-1의 N-말단에 있는 중요한 아미노산 잔기, 티로신 잔기의 황화의 중요성 및 N-말단 영역의 트레오닌과 커플링된 O-글리칸 탄수화물의 구조 및 역할을 확인한 연구를 통하여, P-셀렉틴에 결합하는 PSGL-1에 독특하게 존재하는 황화, 당화된 펩티드 및 O-글리칸 구조가 밝혀졌다.
실시예는 PSGL-1이 P-셀렉틴에 대한 고 친화성 결합에 필요한 주로 잔기 46, 48, 51에 있는 하나 이상의 티로신에서 황화됨을 나타낸다. 이들 연구는 인간 HL-60 세포에서 합성된 PSGL-1이 대사에 의해 [35S]술페이트로 표지될 수 있으며 PSGL-1을 세균의 아릴술파타제로 처리하여 티로신으로부터 술페이트을 방출시켜 P-셀렉틴에 대한 결합을 감소시킴을 나타낸다. 더욱이, P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합은 PSGL-1의 N-말단 근처에 있는 세 개의 추정적인 티로신의 황화 위치를 포함하는 합성 펩티드에 대한 항혈청에 의해 억제된다.
연구는 또한 두 개의 효소 즉, 푸코오실트랜스퍼라아제(FTIII) 및 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제를 발현하는 재조합 처리된 포유동물 세포에서 PSGL-1의 발현은 PSGL-1의 적합한 당화를 위하여 요구됨을 나타낸다. 비교 실험은 상기 효소를 발현하는 세포에서 발현된 PSGL-1의 당화가 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제를 발현하지 않는 COS 또는 CHO 세포에서 발현된 재조합 PSGL-1의 당화보다는 원래의 PSGL-1의 당화와 더 유사함을 나타낸다. HL-60 세포에 의해 합성된 PSGL-1의 Ser/Thr-결합 O-글리칸은3H-당 전구체로 대사에 의해 방사능으로 표지되었다. 대조 연구에서는, HL-60 세포에 의해서도 발현되는 뮤신과 유사한 당단백질인 CD43(루코시알린)의 O-글리칸을 분석하여 PSGL-1과 비교하였다. O-글리칸은 정제된 당단백질을 염기/붕소수소화물로 약하게 처리함으로써 Ser/Thr 잔기로부터 분리되었으며, 글리칸 구조는 기술을 조합하여 결정하였다. 기대와는 반대로, PSGL-1은 많이 푸코오스화되지 않으며; 대부분의 O-글리칸은 디시알화되거나 또는 중성 형태의 코어-2 사당 Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Gaβ1→3)GalNAcOH이다. 소수의 O-글리칸은 시알릴 루이스 엑스 항원을 함유하는 두 개의 주요종(하나의 종은 디시알화, 모노푸코오스화 글리칸
이고,
다른 한 종은 폴리락토오사민 주쇄를 갖는 모노시알화, 트리푸코오스화 글리칸
이며,
식중에서 R은 H, OH, 또 다른 당 또는 아글리콘 예컨대 아미노산이다)으로서 생기는 α1,3 푸코오스화된 것이다.
상기 결과는 PSGL-1이 PSGL-1과 셀렉틴 사이의 고 친화성 상호작용에 관여하는 독특한 푸코오스화 O-글리칸을 함유한다는 것을 나타낸다.
도 1a, 1b 및 1c는 PSGL-1이 아릴술파타아제에 민감한 티로신 술페이트를 함유한다는 것을 나타내는 효소로 절단된 PSGL-1에 대하여, NaH2PO4, pH 3.0 구배(파선)를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피에서의 보유 시간을 나타내는 그래프이다. 도 1a는 강염기로 가수분해된35S-PSGL-1을 나타내고; 도 1b는 강염기로 가수분해시키고 1000mU의 끓인 아릴술파타아제로 샴(sham)-처리한35S-PSGL-1을 나타내며; 도 1c는 강산으로 가수분해시키고 1000mU의 활성 효소로 처리한35S-PSGL-1을 나타낸다. 티로신, 티로신 술페이트 및 유리 술페이트의 보유 시간을 나타냈다. 유리 술페이트는 40.0분에 용출되었다. 황화 단당류들(Gal-6-술페이트, GlcNAc-6-술페이트, GalNAc-6-술페이트 및 GalNAc-4-술페이트)은 14 내지 15분의 비슷한 보유 시간에서 용출되었다.
도 2는 아릴술파타아제에 의해 온전한35S-PSGL-1로부터 분리된 [35S]술페이트 및 P-셀렉틴에 대한125I-PSGL-1의 Ca2+의존성 결합의 감소율을 나타내는 그래프이며, 티로신 술페이트가 P-셀렉틴의 결합에 중요함을 나타낸다.
도 3a 및 3b는 특정 PSGL-1에 대한 항-펩티드 혈청이 P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합을 방해함을 나타내는 그래프이다.125I-PSGL-1은 고정된 재조합 수용성 P-셀렉틴 또는 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 미세역가판에서 정상 토끼혈청(NRS) 또는 PSGL-1의 42-56 잔기에 대한 항혈청(항-42-56 아미노산)의 존재하에서 배양되었으며, 결합은 도 3a에 나타낸 바와 같이 혈청 농도에 대한 함수로 측정되었다. 혈소판-유도 P-셀렉틴은 20% NRS 또는 항-42-56 아미노산 혈청의 존재하에서 HL-60 세포와 함께 배양하였다. P-셀렉틴의 결합은 간접 면역형광 및 유동 세포측정법에 의해 측정되며, 도 3b는 P-셀렉틴에 대한 세포수를 나타낸다.
도 4a 내지 4e는 PSGL-1 분획 P-10-2b는 sLex결정자를 갖는 최소 크기의 글리칸을 함유함을 나타낸다.3H-GlcN-PSGL-1로부터 유도된 분획 P-10-2b는 엑소글리코시다아제로 처리되고 24시간 동안 하강 종이 크로마토그래피에 의해 분석하였다. β-제거된 글리칸을 먼저 뉴라미니다아제로 탈시알화시키고 중성 글리칸을 이온-교환 크로마토그래피에 의해 방출된 시알산으로부터 분리하였다. (A) 탈시알화 글리칸의 크로마토그래피; (B) β-갈락토오시다아제로 처리된 탈시알화 글리칸; (C) 스트렙토미세스(Streptomyces) α1,3/4-푸코오시다아제로 처리된 탈시알화 글리칸; (D) β-갈락토오시다아제, β-N-아세틸헥속사미니다아제 및 스트렙토미세스 α1,3/4-푸코오시다아제로 처리된 탈시알화 글리칸; (E)3H-Fuc-PSGL-1 분획 P-10-2b로부터 유도된 β-제거된 글리칸은 효소로 탈시알화시키고 동일한 실험에서 공크로마토그래피하였다. 진정한 표준의 이동을 표시하였다:
5, Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH;
4, Galβ1→4GlcNAβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH;
3*, GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH; 2, Galβ1→3GalNAcOH; 1, GlcNAc.
도 5a 및 5b는 PSGL-1 분획 P-10-2a가 시알화되고 트리푸코오스화된 폴리락토오사민-함유 O-글리칸으로 구성됨을 나타낸다.3H-GlcN-PSGL-1로부터 유도된 분획 P-10-2a는 엑소글리코시다아제로 처리되고 24시간 동안 하강 종이 크로마토그래피에 의해 분석하였다. β-제거된 글리칸을 먼저 뉴라미니다아제로 탈시알화시키고 방출된 시알산은 엔도-β-갈락토오시다아제, 또는 β-갈락토오시다아제 및 β-N-아세틸헥속사미니다아제의 조합으로 처리하기 전 및 처리 후에 중성 글리칸으로부터 분리하였다. (B) 탈시알화된 글리칸을 화학적으로 탈푸코오스화시키고 엔도-β-갈락토오시다아제 또는 β-갈락토오시다아제와 β-N-아세틸헥속사미니다아제의 조합으로 처리하기 전 및 후에 분석하였다. 진정한 표준의 이동을 표시하였다: 3, Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1; 3*, GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH; 2, Galβ1→4GlcNAc; 1, GlcNAc.
도 6은 P-10-3 글리칸이 중성 코어-2 사당을 함유함을 나타낸다.3H-GlcN-P-10-3을 뉴라미니다아제로 처리하고 방출된 시알산은 QAE-Sephadex 크로마토그래피에 의해 중성 글리칸으로부터 분리하였다. 탈시알화 글리칸은 β-갈락토오시다아제 단독으로, 또는 β-갈락토오시다아제와 β-N-아세틸헥속사미니다아제의 조합으로 처리하기 전 및 처리 후에 18시간 동안 하강 종이 크로마토그래피로 분석하였다. 진정한 표준의 이동을 표시하였다:
4, Galβ→4GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH;
e*, GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH; 2, Galβ1→4GlcNAc; 1, GlcNAc.
도 7은 PSGL-1에서 O-글리칸의 구조 및 상대적 비율을 나타낸다.
제약 및 진단용 펩티드
하기 실시예로부터 얻은 정보를 바탕으로, 재조합 기술 또는 펩티드 합성기에 이어 화학적 또는 효소적 황화 및 당화를 이용하여, 전술한 화학식 및 하기 치수 및 실시예에 대한 참고 자료에서 기술된 바와 같이 PSGL-1에 대한 P-셀렉틴 및 다른 셀렉틴의 결합을 억제하는데 유용한 펩티드를 합성할 수 있다. 펩티드는 바람직하게는 단백질의 아미노 말단에서 세 개의 티로신(서열 1의 46, 48 및 51 잔기) 중 최소한 하나를 포함하며, 그 중 하나 이상은 황화(-SO4)되어 있으며, 또 바람직하게는 O-결합 당화에 적합한 하나 이상의 트레오닌 또는 세린, 예컨대 서열 1의 아미노산 잔기 57의 트레오닌 잔기를 포함한다. 유용한 최소 펩티드의 예는 서열 1의 48 내지 57 잔기뿐만 아니라 P-셀렉틴에 대한 펩티드의 결합을 변경시키지 않는 보존적으로 치환된 펩티드에 해당한다. 실시예에서 증명한 바와 같이, 펩티드가 코어-2, 시알화, 푸코오스화 O-글리칸을 포함하는 것이 중요하다.
아미노산 서열 변형은 다음 세 개의 종류 중 하나 이상에 속한다: 치환, 삽입 또는 제거. 삽입은 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단의 융합뿐만 아니라 하나 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 삽입은 통상 아미노 말단 또는 카르복시 말단 융합의 삽입보다 더 적은 삽입, 예컨대 1 내지 4개의 잔기일 것이다. 면역융합 단백질 유도체, 예컨대 실시예에서 기재된 유도체는 시험관에서의 가교에 의해 또는 융합물을 코딩하는 DNA로 형질전환된 재조합 세포 배양에 의해 타겟 서열에 면역성을 주기에 충분히 큰 폴리펩티드를 융합함으로써 제조된다. 제거는 단백질 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되는 것을 특징으로한다. 통상, 단백질 분자 내의 임의의 한 위치에서 단지 약 2 내지 6개의 잔기가 제거된다. 이들 변형체는 일반적으로 단백질을 코딩하는 DNA의 뉴클레오티드에서 위치 특이적 돌연변이 생성에 의해 제조되며, 이로써 변형체를 코딩하는 DNA를 생산한 후, 재조합 세포 배양에서 상기 DNA를 발현시킨다. 공지된 서열을 갖는DNA의 미리 결정된 위치에서 치환 돌연변이를 만드는 기술은 공지되어 있으며, 예컨대 M13 프라이머 돌연변이 생성이다. 아미노산 치환은 통상 단일 잔기 치환이고; 삽입은 일반적으로 약 1 내지 10 아미노산 잔기일 것이며; 제거는 약 1 내지 30 잔기의 범위일 것이다. 제거 및 삽입은 바람직하게는 인접한 쌍으로 일어나며, 즉 두 개 잔기의 제거 또는 두 개 잔기의 삽입이다. 치환, 제거, 삽입 또는 이들의 조합으로 최종 구조물이 제조될 수 있다. 돌연변이는 해독(reading) 프레임을 벗어나서 상기 서열을 넣지 말아야 하며, 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 형성할 수 있는 상보적 영역을 만들지 말아야 할 것이다. 치환 변형체는 하나 이상의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입된 변형체이다. 상기 치환체는 일반적으로 하기 표 1 및 2에 따라 제조되며 보존적 치환으로 불리운다.
기능 또는 면역체의 실질적인 변화는 표 2의 예보다 덜 보존적인 치환체를 선택함으로써, 즉 (a) 치환 영역에서 폴리펩티드 주쇄의 구조, 예컨대 쉬트 또는 나선 구조, (b) 타겟 위치에서 분자의 전하 또는 소수성 또는 (c) 측쇄의 벌크(bulk)를 유지시키는 효과가 더욱 현저하게 다른 잔기를 선택함으로써 일어나다. 일반적으로 단백질 특성을 가장 크게 변화시킬 것으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔기, 예컨대 세린 또는 트레오닌이 소수성 잔기, 예컨대 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로 치환되거나 또는 그 반대; (b) 시스테인 또는 프롤린이 다른 잔기로 치환되거나 또는 그 반대; (c) 양전기 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대 리신, 아르기닌 또는 히스티딘이 음전기 잔기, 예컨대 글루탐산 또는 아르파르트산으로 치환되거나 또는 그 반대; 또는 (d) 벌크 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예컨대 이 경우 글리신으로 치환되거나 또는 그 반대; (e) 황화 및/또는 당화되는 위치의 수를 증가시킴으로써 생기는 치환이다.
치환 또는 제거 돌연변이생성은 N-당화(Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-당화(Ser 또는 Thr)를 위한 위치를 삽입하기 위하여 사용될 수 있다. 시스테인 또는 다른 변화되기 쉬운 잔기를 제거하는 것도 또한 바람직하다. 잠재적 단백질분해 위치, 예컨대 Arg의 제거 또는 치환은 예컨대 염기성 잔기중 하나를 제거하거나 또는 글루타민 또는 히스티딘 잔기로 치환함으로써 실시된다.
번역후 변형은 발현된 폴리펩티드에 대한 재조합 숙주 세포의 작용 결과이다. 글루타민 및 아스파라긴 잔기는 번역후 빈번히 탈아미드화되어 상응하는 글루탐산 및 아스파르트산이 된다. 다르게는, 상기 잔기가 약한 산성 조건하에서 탈아미드화된다. 기타 번역후 변형은 프롤린 및 리신의 수산화; 세린 또는 트레오닌 잔기에서 히드록시기의 인산화; 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄에서 o-아미노기의 메틸화[티.이. 크레이톤, 단백질: 구조 및 분자 특성(Proteins: Structure and Molecular Properties), W. H. Freeman & Co., 샌프란시스코, pp79-86 (1983)]; N-말단 아민의 아세틸화; 및 몇몇 경우에서 C-말단 카르복시의 아미드화를 포함한다.
펩티드 제조 방법
팹티드는 일반적으로 인용된 문헌의 실시예에서 기재된 바와 같이 공지된 기술에 따라 제조될 수 있으며, 이들 기술은 본 명세서에 구체적으로 기입되어 있다. 바람직한 펩티드는 모두 당화 및 황화된 것이기 때문에, 하기 기재한 바와 같이 펩티드를 적합한 포유류 숙주 세포에서 발현시키는 것이 바람직하다.
화학적 합성
바람직한 합성 방법은 메리필드[J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149-2154 (1963)]에 의해 처음 기재된 고상 합성 기술에 따라 펩티드를 제조하는 것이다. 다른 기술은 예컨대 엠. 보단츠키 일행의 Peptide Synthesis(2판, John Wiley & Sons, 1976)뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 문헌에서도 발견될 수 있다.
이들 합성에서 사용할 수 있는 적합한 보호기 및 이들의 약어는 상기 내용뿐만 아니라 제이.에프.더블유. 맥오미의 Protective Groups in Organic Chemistry(Plenum Press, 뉴욕, 1973)에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용된 일반적인 보호기는 t-부틸옥시카보닐(Boc), 플루오레닐메톡시카보닐(FMOC), 벤질(Bzl), 토실(Tos), o-브로모-페닐메톡시카보닐(BrCBZ 또는 BrZ), 페닐메톡시카보닐(CBZ 또는 Z), 2-클로로-페닐메톡시카보닐, (2-Cl-CBZ 또는 Cl-Z), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐(Mtr), 포르밀(CHO) 및 삼차부틸(t-Bu)이다. 트리플루오로아세트산(TFA), 염화메틸렌(CH2Cl2), N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA), N-메틸피롤리돈(NMP), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBT), 디메틸술폭시드(DMSO), 아세트산 무수물(Ac2O).
Nα-Boc 보호를 이용한 고상 펩티드 합성에 의해 펩티드를 합성하는 일반적인방법:
반복 시간
1.CH2Cl2중 25% TFA13분
2.CH2Cl2중 50% TFA116분
3.CH2Cl253분
4.NMP중 5% DIEA24분
5.NMP65분
6.커플링 단계157분
a. NMP중 미리 형성된36분
BOC-아미노산-HOBT 활성 에스테르
b. DMSO16분
c. DIEA5분
7.NMP중 10% Ac2O, 5% DIEA19분
8.CH2Cl253분
Nα-FMOC 보호를 이용한 고상 펩티드 합성을 위한 일반적인 합성 방법:
반복 시간
1.NMP중 20% 피페리딘13분
2.NMP중 20% 피페리딘215분
3.NMP69분
4.커플링171분
NMP중 미리 형성된
FMOC-아미노산-HOBT 활성 에스테르
5.NMP67분
Boc 또는 FMOC 방법을 사용하여 합성된 펩티드의 보호되지 않은 Nα-아미노기의 N-말단 아세틸화는 NMP중 10% Ac2O 및 5% DIEA로 처리하고 나서 펩티드 수지를 NMP 및/또는 CH2Cl2로 세척함으로써 실시된다.
발현 시스템
하기 실시예에서 증명된 바와 같이, P-셀렉틴에 결합하는 본 명세서에 기재된 황화되고 당화된 PSGL-1 펩티드는 티로신 잔기에 결합하는 하나 이상의 술페이트 및 적합한 당화 위치를 갖는 펩티드이다. 푸코오실트랜스퍼라아제를 발현하는 포유동물 세포(COS 세포)에서 발현된 재조합 PSGL-1과 정제된 원래의 PSGL-1을 비교한 연구는 당화가 실제로 상이함을 증명하였다. 따라서 더욱 자연스럽게 PSGL-1을 당화시키는 새로운 발현 시스템이 개발되었다. 이 발현 시스템은 두 개 이상의 글리코오실트랜스퍼라아제, 즉 푸코오실트랜스퍼라아제(FTIII) 및 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제를 발현하는 포유류 발현 시스템을 바탕으로 한다. 바람직한 실시형태는 세포주가 상기 두 효소를 코딩하는 cDNA로 형질감염된 잘 특성화된 발현주 예컨대 COS 또는 CHO 세포를 바탕으로 한다. cDNA는 각각 서열 2와 서열 3에 명시하였다. 서열 2는 쿠코우스카-라탈로 일행(Genes & Devel. 4, 1288-1303, 1990)에 의해 기재된 인간 α(1,3/1,4) 푸코오실트랜스퍼라아제 (FTIII)를 코딩한다. 서열 3은 비에르후이젠 및 후쿠다(Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 89, 9326-9330, 1992)에 의해 보고된 바와 같이 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제(EC 2.4.1.102)를 코딩한다. 종래 연구는 P-셀렉틴에 결합하기 위하여 PSGL-1의 변형을 위한 코어 2 6-N-아세틸글루코오실아미닐트랜스퍼라아제의 중요성을 인식하지 못하였다. 다르게는, 발현 시스템이 둘 중 하나 또는 모든 효소의 발현을 바탕으로 당연히 선택될 수 있으며, 두 번째 효소는 필요한 경우 형질감염에 의해 제공된다.
cDNA는 적합한 프로모터 및, 경우에 따라 엔핸서 및 선택 서열의 조절하에서 세포에 도입된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 전사를 조절하는 바람직한 프로모터는 다양한 소스, 예컨대 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤파타이티스-B 바이러스 및 가장 바람직하게는 시토메갈로바이러스와 같은 바이러스의 게놈으로부터, 또는 이종 포유동물의 프로모터, 예컨대 베타 액틴 프로모터로부터 얻을 수 있다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스의 복제 기점도 함유하는 SV40 제한 단편으로써 용이하게 얻어진다. 피어 일행,Nature, 273: 113(1978). 인간-시토메갈로바이러스의 즉각적인 초기 프로모터는 HindIII 제한 단편으로써 용이하게 얻어진다. 피.제이.그린어웨이 일행, Gene 18 355-360, (1982). 물론 숙주 세포 또는 관련 종의 프로모터도 또한 유용하다.
고등 진핵 세포에 의해 원하는 단백질을 코딩하는 DNA의 전사는 엔핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가된다. 엔핸서는 전사 개시 능력을 증가시키기 위하여 프로모터에 작용하는 일반적으로 약 10 내지 300bp인 DNA의 시스-활성 요소이다. 엔핸서는 전사 단위의 5'(엘.라이민스 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993) 및 3'(엠.엘.루스키 일행, Mol. Cell Bio. 3: 1108, 1983) 뿐만 아니라 코딩 서열 자체내(티.에프.오스본 일행, Mol. Cell Bio. 4, 1293, 1984)에서 발견되는 비교적 방향 및 위치 독립적인 요소이다. 많은 엔핸서 서열은 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타아제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 예로는 복제 기점(100-270bp)의 후반부에 있는 SV40 엔핸서, 시토메갈로바이러스의 초기 프로모터 엔핸서, 복제 기점의 후반부에 있는 폴리오마 엔핸서 및 아데노바이러스 엔핸서를 포함한다.
진핵 숙주세포[효모, 진균, 곤충, 식물, 동물 또는 핵화 세포(nucleated cell)]에서 사용되는 발현 벡터는 또한 mRNA 발현에 영향을 미치는 전사 종결에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 이들 영역은 원하는 단백질을 코딩하는 mRNA의 비번역 부위에서 폴리아데닐화된 단편으로써 전사된다. 3' 비번역 영역은 또한 전사 종결 위치를 포함한다.
발현 벡터는 선택 유전자 또는 선택 표지물질을 함유할 수 있다. 포유동물세포에 적합한 선택 표지물질의 예로는 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나아제 또는 네오마이신을 들 수 있다. 선택 표지물질이 성공적으로 포유동물 숙주 세포에 들어가면, 이들 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 선택 압력하에 놓일 때 생존하게 된다. 널리 사용되는 두 가지 선택 카테고리가 있다. 첫 번째 카테고리는 세포 대사 및 보조 배지없이는 생장할 수 없는 돌연변이 세포주를 사용하는 것을 바탕으로 한다. 두 가지 예는 DHFR-마이너스 CHO 세포, 마우스 LTK 세포이다. 이들 세포는 티미딘 또는 히포크산틴과 같은 영양분이 없이는 생장할 수 없다. 상기 세포는 완전한 뉴클레오티드 합성 경로에 필요한 특정 유전자가 결핍되어 있기 때문에, 이들 세포는 결핍된 뉴클레오티드가 보조 배지에 제공되지 않으면 생존할 수 없다. 보조 배지에 대한 대안은 온전한 DHFR 또는 TK 유전자를 각 유전자가 결핍된 세포에 도입하여 이들의 생장 요건을 바꾸는 것이다. DHFR 또는 TK 유전자로 형질전환되지 않은 세포는 비보조 배지에서 생존할 수 없을 것이다.
두 번째 카테고리는 모든 세포 종류에서 사용되고 돌연변이 세포주를 사용할 필요가 없는 선택 방법인 우세한 선택이다. 이들 방법은 통상 숙주 세포의 생장을 저지하는 약물을 사용한다. 신규 유전자를 갖는 이들 세포는 약제 내성을 갖는 단백질을 발현하고 선택에서 생존할 것이다. 상기 우세한 선택이 사용하는 약물의 예로는 네오마이신(피.서든 및 피.베르그, J. Molec, Appl. Genet. 1: 327, 1982), 미코페놀산(알.시.뮬리간 및 피.베르그, Science 209: 1422, 1980) 또는 히그로마이신(비.수그덴 일행, Mol. Cell. Biol, 5, 410-413, 1985)을 들 수 있다. 상기 세 개의 예는 각각 적합한 약물 G418 또는 네오마이신(제네티신), xgpt(미코페놀산) 또는 히그로마이신에 대한 내성을 주기 위하여 진핵성 조절하에서 세균 유전자를 사용한다.
"증폭"이란 용어는 세포의 염색체 DNA 내의 분리된 영역의 증가 또는 복제를 의미한다. 증폭은 선택 시약, 예컨대 DHFR을 불활성화시키는 메토트렉세이트(MTX)를 사용하여 실시된다. DHFR 유전자의 증폭 또는 연속적인 복제는 더 많은 양의 MTX에 의해 더 많은 양의 DHFR을 생산한다. 증폭 압력은 내생적인 DHFR이 있음에도 불구하고 훨씬 더 많은 양의 MTX를 배지에 첨가함으로써 가해진다. 원하는 단백질을 코딩하는 DNA 및 DHFR 또는 같이 들어가게 하는 증폭 유전자를 갖는 플라스미드와 함께 포유동물 숙주세포를 공형질감염시킴으로써 원하는 유전자를 증폭할 수 있다. 연구자는 상기 세포가 더 많은 DHFR을 요구한다는 것을 확신하며, 이 요건은 선택 유전자의 복제, 훨씬 더 높은 MTX 농도에서 생장할 수 있는 세포의 선택에 의해 충족된다. 원하는 이종 단백질을 코딩하는 유전자가 선택 유전자와 함께 들어가게 되면, 이 유전자의 복제는 원하는 단백질을 코딩하는 유전자의 복제를 낳게된다. 그 결과는 원하는 이종 단백질을 코딩하는 유전자의 증가된 복제, 즉 증폭된 유전자가 더 많은 원하는 이종 단백질을 발현하는 것이다.
고등 진핵세포에서 벡터를 발현하기 위한 바람직한 적합한 숙주세포는 SV40(COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVI세포주; 인간 태아 신장세포주(293, 에프.엘.그래함 일행, J. Gen Virol. 36: 59, 1977); 아기 햄스터 신장세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소세포-DHFR(CHO, 우를라우브 및 채신, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 77, 4216, 1980); 마우스 세르톨리 세포(TM4,제이.피. 매터, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); 원숭이 신장세포(CVI ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 종양세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫 간세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 허파세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포(hep G2, HB 8065); 마우스 유방암(MMT 060562, ATCC CCL 51); 및 TRI 세포(제이.피.매터 일행, Annals N.Y. Acad. Sci 383; 44-68, 1982)를 포함한다. 숙주 세포는 발현 벡터로 형질전환될 수 있으며 프로모터를 도입하고 형질전환체를 선택하거나 또는 유전자를 증폭하기에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도 및 pH는 발현을 위해 선택된 숙주 세포에서 사용된 조건이다.
P-셀렉틴에 대한 당단백질 리간드의 단백질 또는 탄수화물 성분으로부터 유도된 진단 및 치료제의 제조
상기 기재된 P-셀렉틴에 대한 당단백질 리간드는 진단 시약으로서 및, 잠재적으로는 수많은 염증 및 혈전 질환의 치료에서 다양한 적용분야를 갖는다.
진단 시약
리간드에 대한 항체는 P-셀렉틴 리간드의 결함으로 생긴 인간 질환의 탐지용으로 사용될 수 있다. 상기 질환은 백혈구가 활성 혈소판 또는 내피 세포에 결합할 수 없는 감염에 대하여 증가된 감수성을 갖는 환자에서 흔히 관찰되기 쉽다. 실험 세포, 일반적으로 백혈구는 의학적으로 승인된 표준 기술에 의해 채집되며 스크리닝된다. 검출 시스템은 ELISA 방법, 고정된 활성 세포에 방사표지된 항체를 결합시키기, 유동 세포측정법 (flow-cytometry), 면역과산화효소 또는 임뮤노골드(immunogold) 분석, 또는 당업자에게 공지된 기타 방법을 포함한다.
리간드의 특정 단백질 또는 탄수화물 성분에 대한 항체는 코어 단백질의 발현 또는 글리코오실트랜스퍼라아제 및/또는 단백질의 적합한 과당 사슬을 형성시키는 변형 효소에서의 결함을 식별하는데 사용될 수 있다. 항체는 또한 P-셀렉틴에 대한 리간드의 단백질 또는 탄수화물 성분을 발현하는 백혈구 이외에 세포 및 조직을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
리간드의 단백질 성분을 코딩하는 상보적 DNA 클론은 분리되고 서열을 확인할 수 있다. 이들 cDNA 프로브는 표준 방법 예컨대 세포로부터 분리된 RNA의 노던 블로팅 및 절제 조직의 인시튜 하이브리드법에 의해 백혈구 및 다른 조직에서 리간드의 RNA 전사체의 발현을 검사하기 위한 진단 시약으로서 사용될 수 있다.
유사한 방법이 P-셀렉틴 자체의 질적 또는 양적 질환을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 당단백질 리간드, 탄수화물, 또는 이들의 적합한 유도체를 표지하여 P-셀렉틴의 결함으로 인한 질환을 갖고 있는 환자로부터 얻은 활성 혈소판의 P-셀렉틴에 결합할 수 있는 능력을 검사한다.
리간드, 또는 이의 성분은 또한 P-셀렉틴과 리간드의 상호작용을 방해하는 화합물용 스크린에 결합하는 P-셀렉틴의 분석에 사용될 수 있다.
임상 적용
임상적으로, P-셀렉틴이 백혈구 부착, 염증, 종양 전이 및 응고와 관련된 몇몇 기능을 지니기 때문에, P-셀렉틴 및/또는 E-셀렉틴 및 L-셀렉틴을 포함하는 다른 셀렉틴의 결합을 방해하는 화합물, 예컨대 탄수화물은 상기 반응을 조절하는데사용될 수 있다. 이들 화합물은 PSGL-1 또는 이의 단편, PSGL-1 또는 이의 단편에 대한 항체를 포함한다. 예컨대, 당단백질 리간드, 또는 이의 화합물, 특히 탄수화물 단편은 활성 혈소판 또는 내피 세포의 표면에서 발현된 P-셀렉틴에 경쟁적으로 결합함으로써 백혈구 부착을 억제하는데 사용될 수 있다. 이와 유사하게, 리간드에 대한 항체는 백혈구 또는 다른 세포의 P-셀렉틴 리간드에 경쟁적으로 결합함으로써 P-셀렉틴에 의해 매개된 세포 부착을 방해하는데 사용될 수 있다. 상기 치료법은 백혈구-매개 염증의 효과적이지만 일시적인 억제가 필요한 급작스런 상황에서 유용하다. 게다가, 만성적인 질환의 치료도 시약의 지속적인 투여, 예컨대 피하 또는 구강 투여에 의해 달성될 수 있다.
염증 반응은 백혈구가 정상 조직을 손상시킬 수 있는 많은 독성 분자를 방출하기 때문에, 점검되지 않으면 숙주에 손상을 줄 수 있다. 이들 분자는 단백질 분해 효소 및 유리 라디칼을 포함한다. 백혈구가 조직 손상을 줄 수 있는 병리학적 상황의 예로는 허혈 및 재관류로부터의 손상, 세균성 패혈증 및 산재성 혈관내 응고, 성인 호흡기 디스트레스 신드롬, 종양 전이, 류마티스 관절염 및 동맥경화를 포함한다.
재관류 상해는 임상 심장학의 주요한 문제이다. 허혈 심근에서 백혈구 부착을 감소시키는 치료제는 혈전용해제의 치료 효능을 크게 향상시킬 수 있다. 조직 플라스미노젠 활성제 또는 스트렙토키나아제와 같은 시약으로 혈전용해를 치료하는 것은 비가역 심근세포사에 앞서서 심한 심근 허혈이 있는 많은 환자에서 관상 동맥 폐색을 덜어줄 수 있다. 그러나, 많은 상기 환자들은 혈류 회복에도 불구하고 여전히 심근 신경증을 겪는다. 이 "재관류 상해"는 아마도 부분적으로는 트롬빈 및 시토킨에 의한 혈소판 및 내피 세포의 활성이 백혈구에 부착하도록 하기 때문에 허혈 영역에서 백혈구가 혈관 내피세포에 부착되는 것과 연관이 있는 것으로 알려져 있다(롬슨 일행, Circulation 67: 1016-1023, 1983). 이들 부착성 백혈구는 내피세포를 통하여 이동하여 혈류 회복에 의해 구제되는 허혈성 심근을 파괴할 수 있다.
허혈 및 재관류가 발작; 장간막 및 말초 혈관 질병; 기관 이식; 및 순환계 쇼크(이 경우 많은 기관이 혈류 회복 후에 손상될 수 있다)를 포함하여 혈관 표면에 대한 백혈구의 부착에 의해 매개되는 기관 손상을 일으키는 수많은 다른 임상 질환이 있다.
세균 패혈증 및 산재성 혈관내 응고는 종종 위급 환자에서 동시에 존재한다. 이것은 트롬빈, 시토킨 및 다른 염증 매개체의 생성, 혈소판 및 내피 세포의 활성, 및 혈관 시스템을 통한 백혈구의 부착 및 혈소판 응집과 연관이 있다. 백혈구-의존성 기관 손상은 상기 상태의 중요한 특징이다.
성인 호흡기 디스트레스 신드롬은 패혈증 또는 이후의 외상이 있는 환자에서 발생하고 폐순환에서 백혈구의 광범위한 부착 및 응집과 연관이 있는 파괴적인 폐질환이다. 이것은 대량의 혈장이 폐로 혈관외유출되도록 하고 폐조직을 파괴시키며, 이것은 모두 대부분 백혈구 생성물에 의해 매개된다.
종종 치명적인 두 개의 관련된 폐질환은 동종 골수 이식을 받은 면역억제된 환자 및 인터루킨-2로 처리된 LAK 세포(림포킨-활성 림프구)의 처리로 생기는 일반적인 혈관 누출로 인한 합병증을 겪는 암환자에 있다. LAK 세포는 혈관벽에 부착하여 내피 세포에 대하여 독성인 생성물을 방출하는 것으로 알려져 있다. 비록 LAK 세포가 내피 세포에 부착하는 기작은 알려져 있지 않지만, 상기 세포는 아마도 내피 세포를 활성화시키는 분자를 방출할 것이며 호중구에서 작용하는 것과 유사한 기작으로 내피 세포에 결합할 것이다.
많은 악성 종양(암종, 림프종 및 육종을 포함)의 종양 세포는 맥관계를 통하여 멀리 떨어진 위치로 전이할 수 있다. 내피 세포에 대한 종양 세포의 부착 및 이들의 후속 이동 기작은 공지되어 있지 않지만, 적어도 몇몇 경우에 있어서 백혈구의 기작과 유사할 것이다. 구체적으로, 어떤 암종 세포는 E-셀렉틴(라이스 및 베빌락쿠아, Science 246: 1303-1306, 1991)과 P-셀렉틴(아루포 일행, Proc. Natl. Acad. Sci, 미국, 89: 2292-2296, 1992; 스톤 및 바그너, I. Clin. Invst. 92: 804-813, 1992)에 모두 결합하는 것으로 증명되었다. 혈소판과 전이 종양세포의 연관성이 잘 기재되어 있으며, 몇몇 암의 전파에 있어서 혈소판의 역할을 시사하고 있다. P-셀렉틴이 활성 혈소판에서 발현되기 때문에, 혈소판과 적어도 몇몇 악성 종양과의 연관에 P-셀렉틴이 관여하는 것으로 생각된다.
혈소판-백혈구 상호 작용은 동맥경화에서 중요한 것으로 생각된다. 혈소판은 동맥경화성 플라크내로 단핵구를 점증시키는 역할을 할 것이며; 단핵구의 축적은 죽종형성시 최초로 감지할 수 있는 징후이다. 완전히 성숙한 플라크의 파열은 혈소판 침착 및 혈전 형성의 활성화 및 증진뿐만 아니라, 호중구의 허혈 영역으로의 초기 점증을 유도한다. P-셀렉틴은 또한 죽종의 내피 세포 표면에서 부적합하게 발현되며, 이곳에서 단핵구의 초기 부착을 매개하여 죽종내로 이동하게 한다(존슨-티디 일행, Am. J. Path. 144: 952-961, 1994).
또 다른 가능한 적용분야는 류마티스 관절염 및 기타 자가면역 또는 염증 질환의 치료이다.
이들 임상 적용에서, 본 명세서에 기재된 펩티드 또는 분리된 O-글리칸, 또는 이의 단편은 활성 세포에서 발현된 P-셀렉틴에 경쟁적으로 결합함으로써 셀렉틴-의존성 상호작용을 방지하기 위하여 투여될 수 있다. 게다가, 단백질 및/또는 리간드의 탄수화물 성분, 또는 이의 단편에 대한 항체가 투여될 수 있다. 항체는 바람직하게는 인간에서 기원한 것이거나 또는 면역원성 반응을 야기하기 쉬운 부위를 제거하기 위하여 변형된 것이다.
본 발명에서 기재된 펩티드는 또한 무기 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 니트르산, 티오시안산, 황산 및 인산; 유기 산, 예컨대 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 젖산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산 및 푸마르산과의 반응에 의해 또는 무기 염기, 예컨대 수산화나트륨, 수산화암모니아 및 수산화칼륨; 및 유기 염기, 예컨대 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴 아민 및 치환된 에탄올아민과의 반응에 의해 형성된 의약적으로 수용가능한 산- 또는 염기-부가 염으로서 투여될 수 있다.
적합한 의약적 캐리어 내의 리간드 또는 항체의 탄수화물 성분(O-글리칸 구조 또는 이의 성분)은 즉각적인 경감이 필요할 때 혈관내로 투여되는 것이 바람직하다. 탄수화물은 또한 탄수화물 자체로서, 캐리어 분자에 접합되거나 또는 약물수송시스템에 의해 근육, 복강, 피하, 구강에 투여될 수 있다. 탄수화물은 생체내 반감기를 증가시키기 위하여 화학적으로 변형될 수 있다.
탄수화물은 자연적으로 또는 형질감염된 포유동물 세포의 실시예에서 기재된 바와 같이 유전 공학의 결과로서 탄수화물을 발현하는 세포로부터, 또는 바람직하게는 합성 방법에 의해 분리될 수 있다. 상기 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 게다가, 다수의 부수적인 글리코오실트랜스퍼라아제가 클로닝되었다(제이.씨. 폴슨 및 케이.제이. 콜리, J. Biol. Chem. 264: 17615-17618,1989). 따라서, 당업자는 합성 화학 및 효소 합성의 조합을 사용하여 의약품 또는 진단 시약을 제조할 수 있다.
생물학적 활성을 갖는 탄수화물은 P-셀렉틴에 백혈구가 결합하는 것을 억제하는 탄수화물이다. 환자에 대한 적합한 의약적 투여 장치는 당업자에게 공지되어 있다. 비경구성 투여인 경우, 탄수화물은 통상 용해되거나 또는 멸균수 또는 식염수에 현탁될 수 있다. 경구성 투여인 경우, 탄수화물은 정제, 액체 또는 캡슐형 불활성 캐리어에 혼입될 것이다. 적합한 캐리어는 전분 또는 당일 수 있으며 윤활제, 착향제, 결합체, 및 동일한 특성의 기타 물질을 포함할 수 있다. 탄수화물은 또한 용액 또는 크림의 국소 도포에 의해 상처 또는 염증부위에 국부적으로 투여될 수 있다.
다르게는, 탄수화물은 리포솜 또는 미세구(또는 미세입자) 안에, 위에 또는 이들의 일부로서 투여될 수 있다. 환자 투여용 리포솜 및 미세구의 제조 방법은 당업자에 공지되어 있다. 미국 특허 4,789,734호에서는 생물학적 물질을 리포솜에캡슐화하는 방법이 기재되어 있다. 본래, 상기 물질은 필요한 경우 계면활성제 및 투석되거나 초음파 처리된 물질과 함께 수용액, 적합한 인지질 및 첨가된 지질에 용해된다. 공지된 방법의 우수한 개관은 지. 그레고리아디스의 저서 "Drug Carriers in Biology and Medicine"의 14장 "리포솜"에 기재되어 있다(pp.287-341, Academic Press, 1979). 중합체 또는 단백질로 제조된 미세구는 당업자에게 공지되어 있으며, 위장관에서 직접 혈류로 들어 가도록 제조될 수 있다. 다르게는, 탄수화물은 혼입될 수 있으며 미세구, 또는 미세구의 혼성물은 몇일 내지 몇 달에 걸쳐 장기간 동안 천천히 방출되도록 주입될 수 있다. 예컨대 미국 특허 4,906,474호, 4,925,673호 및 3,625,214호를 참조한다.
탄수화물은 약 1㎍/kg체중 이상의 양으로 비경구적으로 투여될 때 활성이 있어야 한다. 대부분의 염증 질환의 치료에 있어서, 투여량은 0.1 내지 30㎎/kg체중일 것이다. 실시예에서 몇몇 특징적인 탄수화물의 투여량은 70㎎/kg일 수 있다.
항체 또는 탄수화물을 사용하는 치료 종류에 따른 반응을 평가하는 기준은 특정 조건을 따르고, 일반적으로 표준 의학 진료를 따를 것이다. 예컨대, 심근 경색의 확장을 방지하기 위한 유효 투여량에 대한 기준은 혈장에서 심근 괴사의 표지 효소를 관찰하거나, 심전도, 중요 신호 및 임상 반응을 모니터함으로써 당업자에 의해 결정될 것이다. 급성 호흡기 디스트레스 신드롬의 치료에 있어서는, 동맥내 산소, 폐침윤물의 용해에서의 개선 및 감소된 호흡곤란 및 빈삭호흡에 의해 측정된 임상적 개선을 조사할 것이다. 쇼크(저혈압) 환자의 치료에 있어서는, 유효 투여량은 혈압 회복 후의 임상 반응 및 중요 기관 예컨대 간 및 신장 기능의 구체적인측정을 바탕으로 할 것이다. 신경 기능은 발작 환자에서 모니터될 것이다. 이식된 기관의 기능, 예컨대 신장 이식 환자의 혈청 크레아티닌, 소변 흐름, 및 혈청 전해질을 모니터하기 위하여 특별한 검사가 사용된다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예를 참조함으로써 더욱 더 이해될 것이다:
실시예 1: PSGL-1에 결합된 과당의 구조 및 기능의 측정
인간 호중구로부터의 PSGL-1의 구조 및 기능에 대한 다양한 글리코오시다아제의 효과가 측정되었다. 상기 분자는 FTIII과 함께 COS 세포에서 발현된 재조합 PSGL-1과는 달리, 대개 엔도-α-N-아세틸갈락토오사미니다아제의 처리에 대하여 내성이 있으며, 이는 상기 분자가 세린 또는 트레오닌에 결합된 단순한 코어 1 Galβ1-3GalNAc 이당을 거의 가지지 않음을 시사한다. 인간 호중구 PSGL-1은 주로 O-결합 폴리-N-아세틸락토오사민에 sLex및 이의 비시알화 대응물 Lex를 드러낸다. 이들 자료는 인간 호중구의 PSGL-1은 P-셀렉틴이 FTIII과 함께 COS 세포에서 발현되는 재조합 PSGL-1에 비하여 우선적으로 인식하는 일련의 시알화, 푸코오스화 O-결합 폴리-N-아세틸락토오사민을 제공함을 시사한다. 부착된 과당의 구조 및 기능상의 특성을 더 규명하기 위하여 인간 호중구로부터 정제된, 방사성요오드화 PSGL-1에 대한 글리코오시다아제의 효과를 조사하였다. PSGL-1은 폴리-N-아세틸락토오사민을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이중 단지 몇몇은 엔도-β-갈락토오시다아제를 사용하여 제거될 수 있었다. Lex및 sLex구조의 대부분은 엔도-β-갈락토오시다아제 -민감성 사슬상에 있었다. 펩티드:N-글리코오시다아제 에프 (PNGaseF)의 처리는세 개의 가능한 N-결합 과당중 두 개 이상을 PSGL-1로부터 제거하였다. Lex및 sLex의 발현은 PNGaseF의 처리에 의해 감지할 수 있을 정도로 변화되지 않았으며, 이는 이들 구조가 주로 O-결합 폴리-N-아세틸락토오사민에 존재함을 나타낸다. 엔도-β-갈락토오시다아제-처리된 PSGL-1은 P-셀렉틴에 결합할 수 있는 능력을 지녔으며, 이는 P-셀렉틴에 의해 인식되는 몇몇 과당이 효소-내성 폴리-N-아세틸락토오사민에 존재하거나 또는 폴리-N-아세틸락토오사민이 결핍된 사슬에 존재함을 시사한다. PNGaseF 처리는 P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합 능력에 영향을 주지 않으며, 이는 P-셀렉틴 인식에 필요한 과당이 O-결합임을 증명하였다. 이들 자료는 인간 호중구로부터의 PSGL-1이 P-셀렉틴에 대한 고 친화성 결합을 향상시키는 복잡한 시알화 및 푸코오스화된 O-결합 폴리-N-아세틸락토오사민을 전시함을 증명하였다.
재료 및 방법
사용된 약어는 하기와 같다:
CHO, 중국 햄스터 난소;
Con A, 콘카나발린 에이;
HSA, 인간 혈청 알부민;
Lex, 루이스 엑스;
PBS, 인산-완충 식염수;
PAGE, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동;
PNGaseF, 펩티드:N-글리코오시다아제 에프;
PSGL-1, P-셀렉틴 당단백질 리간드;
sLex,시알릴 루이스 엑스;
tES, 절단된 용성 E-셀렉틴;
tPS, 절단된 용성 P-셀렉틴;
WGA, 밀 배종 아글루티닌.
재료: 트리톤 X-100, Brij-58, 및 아르트로박터 유레아파시엔스 (Arthrobacter ureafaciens)의 시알리다아제 (75U/㎎, EC 3.2.1.18)는 CalBioChem-Behring Corp.(미국 캘리포니아주 라졸라 소재)로부터 입수하였다. 상품명 Iodobeads, 상품명 3M Emphaze Biosupport Medium, 및 단백질 에이 세파로오스 CL4B는 Pierce Chemical Co.(미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 입수하였다. 에쉐리키아 프레운디이(Escherichia freundii)의 엔도-β-갈락토오시다아제 (5U/㎎, EC 3.2.1.103)는 V-Labs, Inc.(미국 로스앤젤레스 코빙톤 소재)로부터 입수하였다. 스트렙토미세스 종 142의 α1,3/4-L-푸코오시다아제(EC 3.2.1.51)는 PanVera Corp.(미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터, Jack Bean의 β-N-아세틸글루코오사미니다아제(EC 3.2.1.30, 53U/㎎)는 Sigma Chemical Co.(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수하였다. 재조합 펩티드: N-글리코오시다아제 에프 (EC 3.2.2.18, 25,000U/㎎, PNGaseF) 및 디플로코쿠스 뉴모니아에 (Diplococcus pneumoniae)의 엔도-α-N-아세틸갈락토오사미니다아제(EC 3.2.1.97, 상품명 O-글리카나아제)는 Genzyme Corp.(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)로부터 구입하였다.콘카나발린 에이 세파로오스(Con A, 10㎎/㎖수지)는 파마시아/LKB(스웨덴 웁살라 소재)로부터 입수하였다. 밀 배종 아글루티닌(WGA) 아가로오스(7.6㎎/㎖수지) 및 토마토 렉틴은 Vector Laboratories, Inc.(미국 버몬트 버링검 소재)로부터 입수하였다. 토마토 렉틴은 7.5㎎/㎖의 키토트리오스의 존재하에서 2㎎/㎖수지의 밀도로 브롬화시아노겐-활성 세파로오스와 커플링시켰다.
항체: 항-인간 P-셀렉틴 mAb(단일클론항체) S12 및 G1은 상기 맥에버 및 마틴(1984), 겡 일행(1990)에 의해 기재된 바와 같이 제조되어 특성이 규명되었다. 항-인간 E-셀렉틴 mAb CL2 및 CL37(뮬리간 일행, J. Clin. Invest. 88, 1396-1406, 1991)은 씨. 웨인 스미드(미국 텍사스주 휴스톤 소재의 Baylor College of Medicine)에 의해 제공되었다. LeuM1(CD15, IgM)은 Becton-Dickinson & Co.(미국 캘로포니아주 산호세 소재)에서 구입하였다. CSLEX-1 하이브리도마(HB 8580)는 ATCC로부터 구입하였고, IgM mAb는 샤틸 일행(J. BIol. Chem. 260, 11107-11114, 1985)에 의해 기재된 바와 같이 붕산 침전 및 pH 7.4의 PBS중 세파로오스 CL4B상에서 겔 여과에 의해 복수액으로부터 정제하였다. 염소 항-마우스 μ-사슬 특이성 IgG 및 MOPC104E(IgM)는 Cappel-Organon Technika(미국 노쓰캐롤리나주 듀르함 소재)로부터 구입하였다.
펩티드 항혈청 제조 및 면역침전: PSGL-1의 cDNA-유도 아미노산 서열의 잔기 42-56(QATEYEYLDYDFLPEC)(서열 1) 및 354-376(CISSLLPDGGEGPSATANGGLSK)(서열 1)에 해당하는 펩티드는 Applied Biosystems Model 431 펩티드 합성기에서 합성하였다. 펩티드 42-56은 부가된 시스테인을 통하여 말레이미드-활성 키홀 림펫트(keyholelimpet) 헤모시아닌(Pierce Chemical Co. 제조)과 커플링시켜 뉴질랜드 흰토끼(Montana State University Animal Resources Center 제공)에 주입하였다. 면역혈청을 채취하여125I-PSGL-1을 면역침전시키는데 사용하였다. 단백질 에이 비드(bead)(25㎕, 50% 현탁액)를 37℃에서 90분 동안 1㎕의 정상 또는 면역 토끼혈청의 1:4 희석액과 함께 미리 배양하였다. 그후, 비드를 0.1M NaCl, 20mM MOPS, pH7.5, 0.1% 트리톤 X-100(MBS/0.1%트리톤)으로 1회 세척하였다. 그리고 나서 정제된125I-PSGL-1 또는 방사성요오드화-WPG 용출액은 네가티브 콘트롤로서 작용하는 0.2㎎/㎖의 면역 펩티드 또는 PSGL-1 펩티드 354-376의 존재 또는 부재하에서 비드와 배양하였다. 37℃에서 90분 동안 배양한 후, 비드를 MBS/0.1%트리톤으로 5회 세척하고 SDS 샘플 완충액(라엠리, Nature 227, 680-685, 1970)과 함께 5분 동안 끓임으로써 용출시켰다. 면역침전물은 SDS-PAGE로 분석한 후, 자가방사기록법을 실시하였다.
가용성 형태의 E-셀렉틴을 안정하게 발현하는 CHO D-세포의 생산: CHO D-세포에서 가용성 재조합 E-셀렉틴을 높은 수준으로 생산하기 위하여 E-셀렉틴의 5' 및 3' 말단을 변형시키기 위하여, 인간 E-셀렉틴에 대한 완전한 길이의 cDNA를 함유하는 발현 플라스미드(ELAM-1:BBG 57, British BioTechnology Products, Ltd.)를 중합효소 연쇄반응에서 주형으로 사용하였다. 중합효소 연쇄반응에서 사용된 올리고뉴클레오티드 쌍(5' GTC CCT CTA GAC CAC CAT GAT TGC TTC ACA GTT T + 5' TCC CGG TCG ACT TAG GGA GCT TCA CAG GT)(각각 서열 4 및 5)은 E-셀렉틴 개시 코돈 앞에Xba I 위치 및 완벽한 코작(Kozak) 서열(Kozak, Nucleic Acids Res. 9, 5233-5252, 1981)을 도입하고, 또 6번째 콘센서스 리피트(consensus repeat)와 완전한 길이의 E-셀렉틴의 투과세포막 영역 사이에 위치하는 아미노산 550 이후에 도입된 종료 코돈 다음에 Sal I 위치를 도입하기 위하여 설계되었다. DNA 서열 분석을 통하여 중합효소 연쇄반응에 의해 생긴 변화뿐만 아니라 E-셀렉틴의 잔기 cDNA의 도입을 확인하였다. 그리고 나서, 절단된 E-셀렉틴(tES) 유전자는 유일한 Xba I 및 Sal I 제한 위치를 포함하도록 변형된 포유동물 발현 벡터 pDSRα2(유럽 특허출원 A20398753)에 Xba I-Sal I 단편으로써 도입되었다. tES 발현 벡터는 디히드로폴레이트 환원효소가 결핍된 CHO 세포주(DHFR-마이너스 CHO)에 형질감염시키고(우를라우브 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 77, 4216-4220, 1980), 형질전환체는 히포크산틴 및 티미딘이 결핍된 배지에서 선택하였다(부르드렐 일행, Protein Exp. Purif. 4, 130-140, 1993). RNase 보호 분석은 E-셀렉틴-특이적 mRNA를 높은 수준으로 발현하는 형질전환체를 스크리닝하는데 사용하였다(터너 일행, Blood 80, 374-381, 1992).
단백질 정제: PSGL-1은 무어 일행(1992)에 의해 기재된 바와 같이, 하기의 변형 방법으로 제조된 인간 호중구 세포막으로부터 정제하였다. 0.1M NaCl중 5% 트리톤 X-100, 20mM MOPS, pH7.5, 0.02% NaN3으로 추출한 호중구 세포막을 WGA-아가로오스에 가하고, 결합된 단백질은 0.5M N-아세틸글루코오사민으로 용출하였다(WGA 용출물). 0.1M NaCl, 20mM MOPS, pH7.5, 0.02% NaN3, 0.02% Brij-58, 2mM CaCl2,2mM MgCl2(평형화 완충액)로 광범위한 투석을 실시한 후, WGA 용출물은 절단된 P-셀렉틴(tPS)-Emphaze 칼럼(10㎎렉틴/㎖수지)에 가하였다. 칼럼은 평형화 완충액으로 광범위하게 세척하고 5mM EDTA로 용출하였다. 리간드-함유 분획을 모으고, 상품명 SMART Micro Sepatation System(파마시아/LKB)을 사용하여 0.1M NaCl, 20mM MOPS, pH7.5, 2mM EDTA, 0.02% NaN3, 0.02% Brij-58로 평형화시킨 Mono Q PC 1.6/5 칼럼에 가하였다. 칼럼은 50μ㎖/분에서 2-㎖ 선형 구배(0.1-1.0M NaCl)로 전개시켰다. 분획의 일부는 상품명 Iodobeads를 사용하여 제조자의 지시에 따라 Na125I로 요오드화시켰다. 분획의 순도는 SDS-PAGE 및 요오드화 분획의 자가방사기록에 의해 분석하였다.
9번째 콘센서스 리피트 이후로 절단된 가용성 재조합 형태의 P-셀렉틴(tPS)은 유시야마 일행(1993)에 의해 기재된 바와 같이 영구 형질감염된 293세포로 처리된 배지로부터 면역친화성에 의해 정제하였다. 침강 속도 및 평형 분석에 의해 측정된 바와 같이, tPS는 분자량 103,600Da의 비대칭 단량체였다. tPS에 대한 E280 1%는 12.3이었다.
절단된 재조합 가용성 E-셀렉틴(tES)은 tES를 안정하게 분비하는 CHO D-세포로 처리된 배지로부터 면역친화성에 의해 정제하였다. 상기 세포는 10% 소 태아 혈청, 10U/㎖ 페니실린 및 10㎎/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 Ham's F-12 영양분 혼합물과 동일양으로 하여 배양하였다. 콘플루언스(confluence) 상태에서, 상기 세포를 무-혈청 배지로 옮기고, 처리된 배지를 7일 마다 수확하였다.
처리된 배지는 연속적으로 연결된 두 개의 Sartorius 필터(10㎛ 및 0.2㎛)를 사용하여 정화 및 멸균-여과시켜, 50배 농축(Filtron Maximate, 10kDa MWCO)시켰다. 항-E-셀렉틴 mAb H18/7(베빌라쿠아 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 84, 9238-9242, 1987)은 6㎎/㎖수지의 밀도로 브롬화시아노겐-활성 세파로오스와 커플링시켰다. H18/7-세파로오스 칼럼은 1mM CaCl2및 1mM MgCl2를 함유하는 pH7.5의 PBS를 사용하여 4℃서 평형화시키고, 500㎖의 농축 배지를 10㎝/시간의 유속으로 칼럼(VT=200㎖)에 가하였다. 칼럼은 0.1M 글리신으로 pH2.7에서 용출하고, 분획은 pH7.5의 트리스-HCl을 첨가하여 급속 중화시켜 최종 농도를 0.1M로 하였다. 용출액은 pH7.5의 25mM 인산나트륨으로 투석시키고, 동일한 완충액으로 평형화시킨 Q-High Performance 음이온 교환칼럼(VT=200㎖, 파마시아 제조)에 가하였다. 칼럼은 NaCl(0.17-0.22M)의 선형 구배로 전개시켰다. 순도는 SDS-PAGE 및 N-말단 서열 분석법으로 평가하였다. 단백질 농도는 질 및 본 힙펠(Anal. Biochem. 182, 319-326, 1989)의 방법을 사용하여 계산된 E280 1%=12.5를 사용하여 측정하였다. tES의 수율은 약 500㎖의 농축된 처리 배지당 250㎎이었다.
가용성 tES의 침강 평형 분석: 온-라인 Rayleigh 간섭 광학기가 장착된 Beckman Optima XLA 분석 초원심분리기에서 4-홀 티탄 로터, 단칼럼 켈-f 센터피스, 및 사파이어 창을 사용하여 침강 평형 실험을 실시하였다. 자료는 텔레비젼-기재 카메라 및 온-라인 포착 및 분석 시스템을 사용하여 20℃에서 10,000, 15,000, 20,000 및 25,000rpm의 로터 속도에서 얻었다[티.엠. 라우에, 1981, 박사 학위논문, University of Connecticut, Storres, CT; 라우에 일행, 1992, Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science(에스. 하딩, 에이. 로웨 및 제이.씨. 호톤 편저) pp.90-125, Royal Society of Chemistry, 런던]. 샘플은 pH7.4의 PBS중 약 1.0, 0.5, 0.25 및 0.13㎎/㎖의 농도에서 가하였다. 평형에 대한 추정 시간 후에 때때로 자료를 수집하고, 연속적인 스캔(scan)을 감함으로써 평형을 검사하였다(디.에이.이판티스, 1964, Biochemistry, 3, 297-317). 광학창의 자료는 REEDIT 프로그램(데이비드 이판티스 제공)을 사용하여 선택하였다. 자료는 NONLIN 프로그램(디.에이.이판티스, 1964, Biochemistry, 3, 297-317)을 사용하여 tES의 단량체 분자량을 추정하기 위하여 분석하였다. tES의 상이한 로딩 농도, 방사 위치 및 각속도에서 얻은 세 개 채널 이상의 침강 평형 자료는 동시 비선형 최소자승법에 의해 적합하게 하였다. 분자량을 계산하기 위하여, tES의 부분 비부피는 tES의 탄수화물 조성에서 불확실성을 설명하는 0.688㎖/g(오차 ± 0.03㎖/g)으로 추정되었다(라우에 일행, 1992).
가용성 tES의 침강 속도 분석: 침강 속도 실험은 Rayleigh 간섭 광학기를 사용하여 Beckman Optima XLA 분석 초원심분리기에서 실시하였다. 실험은 4-홀 티탄 로터, 2-채널, 목탄 충전형, 에폰(epon) 센터피스 및 사파이어 창을 사용하여 20℃, 60,000rpm에서 실시하였다. 샘플은 pH7.4의 PBS중 0.5㎎/㎖의 농도로 로딩하였다. 침강계수는 더블유. 스태포드(1992, Anal. Biochem. 203, 295-301)에 의해 기재된 바와 같이 농도 그래프로부터 유도된 시간으로 측정하였다.
단백질 요오드화: mAb G1 및 CL2(200㎍)는 상품명 Iodobeads를 사용하여 400μCi의 무-캐리어 Na125I(ICN Biomedical, Inc., Costa Mesa, CA)로 요오드화시켰다. 유리125I는 0.1M NaCl, 20mM MOPS, pH7.5, 0.1% 트리톤 X-100으로 평형화시킨 Sephadex G-25 칼럼(PD-10, 파마시아)을 통한 겔 여과에 의해 제거하였다. 그리고 나서 표지된 항체는 TL-100 초원심분리기(미국 캘리포니아주 팔로알토 소재의 Beckman 제조)에서 90,000 x g 에서 30분 동안 원심분리시켰다. 표지된 단백질의 농도는 각 비표지 단백질을 기준으로 사용하여 Micro BCA 단백질 분석 키트(Pierce)로 측정하였다. 표지된 항체의 비활성의 범위는 0.5-1.0μCi/㎍단백질이었다.
PSGL-1(약 0.5㎍) 또는 WGA 용출액(약 100㎍)은 400μCi의 Na125I로 요오드화시키고 상기 기재한 바와 같이 염을 제거하였다. 방사표지된 PSGL-1은 상품명 Centicon-30 장치(파마시아/LKB)를 사용하여 약 200㎕로 농축시키고, 상품명 SMART Micro Sepatation System(파마시아/LKB)을 사용하여 0.15M NaCl, 20mM MOPS, pH7.5, 0.02% NaN3, 0.1% Brij-58로 평형화시킨 Superose 6 PC 3.2/30 칼럼상에서 겔 여과시켰다. 방사표지된 리간드의 비활성의 범위는 14-30μCi/㎍단백질이었다. 표지된 단백질은 일반적으로 트리클로로아세트산으로 침전될 수 있는 95%보다 높았다.
고정된 tPS 또는 tES에 대한125I-PSGL-1의 결합: NaN3이 0.02%인 HBSS(HBSS/Az)중 tPS 또는 tES(50㎕, 10㎍/㎖)를 미세역가판(상품명 Immulon I Removawell Strips, Dynatech Laboratories, Inc., 미국 버지니아주 챈틸리 소재)에서 4℃에서 하룻밤 배양하였다. HBSS/Az로 3회 세척한 후, 웰(well)을 22℃에서 2시간 동안 HBSS/Az/1%인간 혈청 알부민(HSA)으로 블록(block)시켰다. 그리고 나서 웰을 HBSS/Az로 1회 세척하고, HBSS/Az/0.1% HSA로 희석된125I-PSGL-1을 첨가하였다(50㎕, 5,000-10,000cpm/웰). 22℃에서 1시간 후, 웰은 12-채널 판세척기(상품명 Nunc-Immuno Wash 12, Nunc Inc., 미국 일리노이주 내퍼빌 소재)를 사용하여 HBSS/Az로 신속하게 5회 세척하였다. 그리고 나서 각 웰은 γ-계수기에서 카운트하였다. 모든 분석은 4반복으로 실시되었다. 몇몇 분석에서 고정된 tPS에 대한125I-PSGL-1의 결합은 액상 tPS 또는 tES의 농도를 증가시키면서 측정하였다.
고정된 항-탄수화물 항체에 대한125I-PSGL-1의 결합: HBSS/Az중 염소 항-마우스 μ-사슬 특이성 IgG(50㎕, 10㎍/㎖)를 상품명 Immulon I Removawell Strips에서 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 웰은 상술한 바와 같이 세척하고 블록시켰다. 그리고 나서, CSLEX-1, LeuM1 또는 MOPC104E를 첨가하였다(50㎕, 5㎍/㎖). 22℃에서 1시간 동안 배양한 후, 웰을 HBSS/Az로 3회 세척하고, HBSS/Az/0.1% HSA중125I-PSGL-1(50㎕, 5,000-10,000cpm/웰)을 첨가하였다. 1시간 후, 상술한 바와 같이 웰을 세척하고, 각 웰은 γ-계수기에서 카운트하였다. 모든 분석은 4반복으로 실시되었다.
125I-PSGL-1의 효소 분해: 시알리다아제(0.2U/㎖, 15시간), 엔도-β-갈락토오시다아제(2U/㎖, 15시간), 및 α1,3/4-L-푸코오시다아제(0.32mU/㎖, 15시간)를 사용한 분해는 0.1M NaCl, 50mM 아세트산 나트륨, pH5.5에서 실시하였다. PNGaseF(40U/㎖, 15시간)를 사용한 분해는 0.1M 인산 나트륨, pH8.6에서 실시하였다. PNGaseF가 SDS 전처리에 관계없이 비슷한 효과를 갖기 때문에 PSGL-1은 일반적으로 전처리하지 않는다. 시알리다아제(0.2U/㎖, 2시간)에 이어 엔도-α-N-아세틸갈락토오사미니다아제(0.1U/㎖, 15시간)를 사용한 연속적인 분해는 0.1M NaCl, 50mM 아세트산 나트륨, pH6.0에서 실시하였다. 모든 글리코오시다아제를 사용한 분해는 20μM 류펩틴, 30μM 앤티페인, 1mM 벤자미딘 및 0.02% NaN3의 존재하에서 37℃에서 실시하였다.
렉틴 친화성 크로마토그래피: 0.1M NaCl, 20mM 트리스, pH7.5, 2mM CaCl2, 0.1% Brij-58, 0.02% NaN3으로 평형화시킨 콘카나발린 에이(Con A) 세파로오스 칼럼(VT=1㎖)에125I-PSGL-1을 가하였다. 상기 칼럼은 5칼럼 부피의 평형화 완충액으로 세척하고 65℃로 미리 가열된 평형화 완충액중 0.5M α-메틸만노오시드로 용출시켰다. 토마토 렉틴 크로마토그래피는 칼럼(VT=1㎖)을 0.1M NaCl, 20mM MOPS,pH7.5, 0.1% Brij-58, 0.02% NaN3으로 평형화시키고, 평형화 완충액중 20㎎/㎖의 키토트리오스로 용출시키는 단계를 제외하고 유사하게 실시하였다. 렉틴 칼럼에 로딩한 카운트의 85% 이상이 얻어졌다.
위치 밀도 측정: 골수 세포와의 상호작용을 억제하는 P-셀렉틴(G1) 또는 E-셀렉틴(CL2)에 대한 mAb를 위치 밀도 측정에 사용하였다. 웰은 tPS 또는 tES(50㎕, 10㎍/㎖)로 코팅하고 상술한 바와 같이 블록시켰다. HBSS/Az/0.1% HSA중 포화 농도의125I-표지된 mAb(2㎍/㎖)를 웰에 첨가하고 22℃에서 1시간 동안 배양하였다. 웰을 5회 세척한 후, γ-계수기에서 카운트하였다. 비결합은 셀렉틴-코팅 웰에 결합된 cpm에서 HSA-코팅 웰에 결합된 cpm를 뺀 값으로 정의하였다. 위치 밀도는 포화시 항체의 1가 결합을 가정하고 계산하였다. 모든 분석은 4반복으로 실시하였다.
호중구 부착 분석: 인간 호중구는 짐머맨 일행(1985, J. Clin. Invest. 76, 2235-2246)에 의해 기재된 바와 같이 덱스트란 침강, 저장성 분해, 및 피콜-히파크 밀도 구배 원심분리에 의해 자발적인 공여자의 동의에 의해 헤파린이 처리된 혈액으로부터 분리하였다. 상품명 Immulon I Removawell 미세역가판에 고정된 tPS 또는 tES((50㎕, 10㎍/㎖)에 대한 호중구 부착의 정량은 젱 일행(1990)에 의해 기재된 바와 같이 실시하였다.
결과
PSGL-1 펩티드에 대한 항혈청은 인간 호중구로부터 P-셀렉틴 당단백질 리간드를 인식하였다. 인간 호중구 및 HL-60 세포에서 특성이 규명된 P-셀렉틴에 대한 시알로뮤신 리간드의 폴리펩티드 코어가 HL-60 cDNA 라이브러리로부터 발현 클로닝에 의해 확인된 P-셀렉틴에 대한 당단백질 리간드 PSGL-1과 면역학적으로 연관이 있는지를 결정하기 위하여, 토끼에서 제조된 PSGL-1의 cDNA-유도 아미노산 서열의 42-56 잔기에 해당하는 펩티드에 대한 항혈청을 검사하여, 상기 항혈청이 P-셀렉틴 친화성 크로마토그래피에 의해 분리된 당단백질 리간드를 인식할 수 있는지를 조사하였다. 본 연구에서 사용된125I-P-셀렉틴 당단백질 리간드의 방사화학적 순도는 상기 리간드가 비환원 조건하에서는 약 250,000, 환원 조건하에서는 약 120,000의 상대적 분자량임을 나타냈다. 따라서, 방사성요오드화 당단백질은 Mr120,000의 이황화 결합된 두 개의 서브유닛을 함유하였으며, 이는 단백질 블로팅 및 대사성 표지를 사용한 이전의 결과와 일치하였다. 상술한 바와 같이, 이합체 당단백질의 소부위는 사용된 조건하에서 내환원성이었다. 정상 토끼 혈청이 아닌, 면역 혈청은 정제된125I-P-셀렉틴 리간드를 침전시켰다. 항혈청에 의한 침전은 42-56 펩티드 서열에 대하여 특이적이었으며, 이는 PSGL-1의 아미노산 354-376에 해당하는 콘트롤 펩티드가 아닌 상기 펩티드를 포함함으로써 침전이 완전히 억제되었기 때문이다. 상기 항혈청의 특이성은 WGA 칼럼으로부터 용출된 방사표지된 호중구 세포막 단백질의 조혼합물로부터 리간드를 선택적으로 면역침전시킴으로써 더욱 증명되었다.
트립신 소화성 펩티드는 인간 호중구로부터 정제된 P-셀렉틴 당단백질로부터유도되었다. 이들 펩티드의 서열 His-Met-Tyr-Pro-Val-Arg 및 Pro-Gly-Lys-Thr-Pro-Glu-Pro는 PSGL-1의 cDNA-유도 서열(서열 1)에서 아미노산 340-345 및 380-386과 동일하였다. 면역침전 실험에서 얻은 이들 자료 및 결과는 양 그룹에서 연구된 P-셀렉틴 리간드의 폴리펩티드 주쇄를 확립시켰다.
정제된125I-PSGL-1은 P-셀렉틴에 특이적으로 결합하였다. 인간 호중구로부터 분리된125I-PSGL-1은 미세역가판에 고정된 tPS에 시간-의존적 양상으로 결합하였다. 결합은 웰에 코팅된 tPS의 양의 함수로 증가하였다. 결합은 Ca2+-의존적이었으며, 부착을 방해하지 않는 mAb S12에 의해서가 아니라, P-셀렉틴에 대한 백혈구의 부착을 억제하는 P-셀렉틴에 대한 mAb G1에 의해 억제되었다. 게다가, 방사표지된 당단백질의 84.6±2.4%(평균±표준편차, n=4)는 재조합 가용성 P-셀렉틴(tPS)에 다시 결합하였으며, EDTA를 함유하는 완충액으로 용출되었다. 이 결과는125I-PSGL-1의 기능이 요오드화에 의해 실질적으로 변화되지 않았음을 입증하였다.
PSGL-1은 치환된 폴리-N-아세틸락토오사민을 함유하였다. 인간 골수 세포의 PSGL-1은 β-제거에 의해 폴리펩티드 주쇄로부터 방출된 군집된 시알화 O-결합 과당을 함유한다(노르가르드 일행, 1993). 상기 O-결합 글리칸이 단순한 구조를 갖는지를 결정하기 위하여,125I-PSGL-1을 시알리다아제로 처리한 후, 세린 또는 트레오닌 잔기로부터 더 복잡한 O-결합 글리칸이 아닌 비-시알화 Galβ1-3GalNAc 코어1 이당류를 제거하는 엔도-α-N-아세틸갈락토오사미니다아제로 처리하였다(우메모토 일행, 1977, J. Biol. Chem. 252, 8609-8614). 시알리다아제의 처리는 PSGL-1의 전기영동 이동성을 보여주었으며, 이는 종래 결과를 확인하는 것이었다. 연이은 엔도-β-N-아세틸갈락토오사미니다아제의 첨가는 시알리다아제로 처리된 PSGL-1 보다 PSGL-1의 이동성을 단지 약간 더 증가시켰으며, 이는 매우 소수의 O-결합 과당이 상기 효소에 민감한 단순한 구조임을 시사한다.
PSGL-1이 시알화된 푸코오스화 사당 항원 sLex를 함유하기 때문에 푸코오스화된다(노르가르드 일행, 1993). 끝에서 두 번째의 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 제거하는 α1,3/4푸코오시다아제로 당단백질을 처리하는 것은, 비록 분자의 Lex에피토프의 일부인 푸코오스 잔기를 제거하였지만, 전기영동 이동성에는 영향을 미치지 않았다. 그리고 나서, 상기 리간드는 확장된 직쇄 폴리-N-아세틸락토오사민 사슬에서 갈락토오스와 N-아세틸글루코오사민 사이의 내부 β1-4 결합(Galβ1-4GlcNAc)을 가수분해시키는 엔도-β-갈락토오시다아제로 처리하였다(스쿠더 일행, 1983, Biochem. J. 213, 485-494; 스쿠더 일행, 1984, J. Biol. Chem. 259, 6586-6592). 상기 효소는 PSGL-1의 이동성을 가속화시키고 전기영동의 불균일성을 감소시켰으며, 이는 PSGL-1이 몇몇 폴리-N-아세틸락토오사민을 함유함을 시사한다.
PSGL-1에 폴리-N-아세틸락토오사민의 존재를 확인하기 위하여, 폴리-N-아세틸락토오사민에 잘 결합하는 고정된 토마토 렉틴을 함유하는 칼럼에 대한125I-PSGL-1의 결합 능력을 검사하였다. 상기 시스템에서 단일 폴리-N-아세틸락토오사민 사슬은 당단백질이 토마토 렉틴에 결합하도록 하기에 충분하다(머클 일행, 1987, J. Biol. Chem. 262, 8179-8189). PSGL-1의 95% 이상이 칼럼에 결합하였으며, 이는 주로 모든 분자가 하나 이상의 폴리-N-아세틸락토오사민을 함유한다는 것을 의미한다(표 3). PSGL-1을 엔도-β-갈락토오시다아제로 처리하는 것은 칼럼에 결합하는 물질의 양을 84%로 적당하게 감소시켰다. 이것은 전부는 아니지만 대부분의 폴리-N-아세틸락토오사민이 엔도-β-갈락토오시다아제에 의해 PSGL-1 분자의 일부로부터 제거될 수 있음을 시사한다. 폴리-N-아세틸락토오사민을 시알산 및/또는 푸코오스로 치환하는 것이 상기 효소의 효율을 억제하기 때문에, 엔도-β-갈락토오시다아제를 첨가하기 전에 PSGL-1을 시알리다아제 및 푸코오시다아제로 전처리하였다. 시알리다아제 및 푸코오시다아제로 처리하는 것은 칼럼에 대한 PSGL-1의 결합에 영향을 미치지 않았으며, 이는 시알산 또는 푸코오스 치환이 토마토 렉틴에 대한 폴리-N-아세틸락토오사민의 결합에 영향을 미치지 않는다는 사실과 일치한다. 그러나, 연이은 엔도-β-갈락토오시다아제의 첨가는 칼럼에 결합하는 당단백질을 69%로 감소시켰다. 토마토 렉틴이 엔도-β-갈락토오시다아제 처리에 의해 노출된 말단 GlcNAc 잔기에 약하게 결합하기 때문에(커밍스, 1994, Methods Enzymol. 230, 66-86), 상기 말단 잔기를 제거하기 위하여 β-N-아세틸글루코오사미니다아제를 첨가하였다. 단지 상기 물질의 53%가 토마토 렉틴에 결합하였다. 이들 자료는 PSGL-1이 폴리-N-아세틸락토오사민을 함유한다는 것을 확실히 증명하였다. 더욱이, 적어도 상기 사슬 중 몇몇은 시알산 및/또는 푸코오스 치환 때문에 엔도-β-갈락토오시다아제에 대하여 내성이 있었다. 시알리다아제, 푸코오시다아제,엔도-β-갈락토오시다아제 및 β-N-아세틸글루코오사미니다아제가 토마토 렉틴에 대한 모든 PSGL-1 분자의 결합을 제거하지 못하는 것은 O-결합 글리칸의 군집 특성, 내부 푸코오스 잔기의 존재, 및/또는 부가적인 치환체 예컨대 폴리-N-아세틸락토오사민에서 술페이트의 존재 때문에 효소 내성을 반영할 수 있다.
125I-PSGL-1은 지시된 글리코오시다아제로 처리하고 고정된 토마토 렉틴 칼럼에 가하였다(VT=1㎖, 2㎎렉틴/㎖수지). 세척 후, 칼럼을 20㎎/㎖의 키토트리오스로 용출시켰다. PSGL-1의 결합율은 키토트리오스로 용출된 방사능을 칼럼 관통액, 세척액 및 용출액의 총 방사능으로 나눈 값으로 정의하였다.
PSGL-1은 제한된 수의 이질적인 N-결합 과당을 함유하였다. PNGaseF 처리는 [125I]PSGL-1의 전기영동 이동성을 약간 증가시켰으며, 이는 모든 분자가 상기 효소에 민감한 제한된 수의 N-결합 글리칸을 함유한다는 종래 연구와 일치하였다. PSGL-1의 cDNA-유도 서열은 상기 분자가 N-결합 과당의 결합을 위한 단지 세 개의 잠재적 위치를 함유한다는 것을 나타낸다(사코 일행, 1993). N-결합 구조의 가능한 이질성을 탐구하기 위하여, 샴-처리 및 PNGaseF-처리된 [125I]PSGL-1을 콘카나발린 에이(Con A) 칼럼에 가하였으며, 콘카나발린 에이는 고 만노오스 N-결합 글리칸에 매우 잘 결합하고, 복잡한 2-안테나성(antennary) 및 하이브리드 N-결합 과당에 잘 결합하고, 또 복잡한 3-안테나성 및 4-안테나성 N-결합 사슬에는 매우 약하게 결합하는 식물 렉틴이다(오가타 일행, 1975, J. Biochem. 도쿄, 78, 687-696). 샴-처리된 리간드의 41.9±4.2%가 Con A에 결합한 반면, PNGaseF-처리된 물질의 단지 3.7±1.0%가 결합하였다(평균±표준편차, n=4). 칼럼에 로딩한 카운트의 85% 이상이 얻어졌다. 이 결과는 PNGaseF가 PSGL-1로부터 Con A에 의해 인식된 N-결합 글리칸을 제거하였음을 증명하였다.
Con A에 의해 결합되지 않은 PSGL-1 분획은 Con A에 의해 결합된 분획보다 약간 더 느리게 이동하였다. Con A-비결합 물질이 또한 N-결합 과당을 함유하는지를 확인하기 위하여, 결합된 분획 및 비결합된 분획을 모두 PNGaseF로 처리하였다. 상기 효소는 Con A-비결합 및 Con A-결합 분획의 육안상의 분자량을 각각 14.5kDa와 13.7kDa로 감소시켰다. 따라서, 모든 분획이 PNGaseF-민감성 N-결합 글리칸을 갖고 있었다. 이들 자료는 Con A-비결합 분획이 Con A가 인식하지 못한 3-안테나성 및/또는 4-안테나성 N-결합 글리칸을 함유함을 시사하였다. 골수 세포에서 기재될 수 있는 가장 큰 N-결합 글리칸(분자량 약 6,600)은 각 안테나 및 외부 및 코어 푸코오스에 폴리-N-아세틸락토오사민 서열을 갖는 디시알화 4-안테나 구조이다(스푼서 일행, 1984, J. Biol. Chem. 259, 4792-4801). 따라서, PNGaseF 처리 후에 관찰된 전기영동 이동성의 변화는 두 개 이상 및 경우에 따라 세 개의 복잡한 N-결합 글리칸이 제거된 것과 일치하였다. 심지어 PNGaseF 처리 후에도, Con A-비결합 물질은 Con A-결합 물질보다 약간 더 느리게 이동하였다. 이것은 Con A-비결합 분획이 PNGaseF에 대해 내성이 있는 하나의 N-결합 사슬을 가짐을 나타낼 수 있다. 다르게는, Con A-결합 및 Con A-비결합 분획 사이에 기타 구조적인 차이가 있을 수 있으며, 가장 그럴 듯한 것은 O-결합 당화에 있어서의 이질성이다.
시알리다아제 또는 엔도-β-갈락토오시다아제의 처리는 Con A-비결합 및 Con A-결합 분획의 전기영동 이동성에 비슷한 영향을 미쳤으며, 이는 아마도 이들 효소가 주로 풍부한 O-결합 과당에 영향을 주었기 때문이다. 엔도-β-갈락토오시다아제는 모든 N-결합 과당을 함유하는 PNGaseF 및 PSGL-1로 전처리된 PSGL-1의 전기영동 이동성을 비슷하게 증가시켰으며, 이는 적어도 몇몇 폴리-N-아세틸락토오사민이 O-결합 글리칸에 있음을 시사하였다.
PSGL-1은 O-결합 폴리-N-아세틸락토오사민에 Lex및 sLex를 발현하였다. PSGL-1이 폴리-N-아세틸락토오사민에 Lex및 sLex를 발현하는지를 알아보기 위하여, sLex(CSLEX-1) 또는 Lex(LeuM1)에 대한 고정된 단일클론 IgM 항체에 대한, 또는 고정된 무관한 IgM mAb(MOPC104E)에 대한125I-PSGL-1의 결합을 측정하기 위한 분석법이 개발되었다. PSGL-1은 MOPC104E가 아닌 CSLEX1에 결합하였으며, 이는 당단백질이 sLex를 발현한다는 종래의 면역블로팅 자료를 확인하는 것이었다.125I-PSGL-1 분자의 85% 이상이 CSLEX-1 친화성 칼럼에 결합하였으며, 이는 사실상 모든 분자가 sLex를 함유함을 나타낸다. PSGL-1은 또한 LeuM1에 결합하였으며, 비록 탈시알화가 당단백질의 정제 과정에서 상기 구조를 생성시켰을 수 있지만 PSGL-1이 Lex를 함유하였음을 나타낸다. 시알리다아제로 PSGL-1을 처리하는 것이 CSLEX-1에 대한 결합을 제거하고 LeuM1에 대한 결합을 증가시켰으며, 이는 이들 항체의 공지된 특이성과 일치하였다. 푸코오시다아제로 PSGL-1을 처리하는 것은 CSLEX-1에 대한 결합에 효과가 없었으며, 말단 시알산에 의해 상기 효소의 억제가 지속되었다(사노 일행, 1992, J. Biol. Chem. 267, 1522-1527; 케이. 마에무라 및 엠. 후쿠다, 1992, J. Biol. Chem. 267, 24379-24386). 이와는 반대로, 푸코오시다아제는 LeuM1에 대한 PSGL-1의 결합을 제거하였다.
상기 분석의 특이성을 확립한 후, PSGL-1을 엔도-β-갈락토오시다아제로 처리하는 것이 Lex또는 sLex의 발현에 영향을 미쳤는지를 측정하였다. 상기 효소는 고정된 LeuM1에 대한 PSGL-1의 결합을 제거하고 CSLEX-1에 대한 결합을 64±14%(평균±표준편차, n=4)로 감소시켰다. 상기 자료는 엔도-β-갈락토오시다아제에 의해절단된 폴리-N-아세틸락토오사민이 PSGL-1에 몇몇, 아마도 모든 Lex뿐만 아니라 일부의 sLex를 가져옴을 분명히 나타냈다. 남아있는 sLex구조는 상기 효소에 대해 내성이 있는 측쇄 또는 치환된 폴리-N-아세틸락토오사민에 또는 폴리-N-아세틸락토오사민이 결핍된 사슬에 있을 수 있다.
엔도-β-갈락토오시다아제의 효과와는 대조적으로, PNGaseF는 고정된 LeuM1 또는 CSLEX-1에 대한 PSGL-1의 결합에 영향을 미치지 않았으며, 이는 PNGaseF 민감성 N-결합 과당에 Lex또는 sLex구조가 거의 존재하지 않음을 나타낸다. 다른 자료와 관련하여, 상기 관찰은 O-결합 과당이 대부분, 아마도 모든 Lex또는 sLex구조를 가져옴을 나타낸다. 더욱이, 적어도 이들 몇몇 구조는 O-결합 폴리-N-아세틸락토오사민에 있었다.
P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합에 미치는 글리코오시다아제의 효과. 그리고 나서 고정된 tPS에 대한125I-PSGL-1의 결합에 미치는 글리코오시다아제의 효과를 측정하였다. 항-sLex항체에 대한 결합을 제거하고 항-Lex항체에 대한 결합을 향상시키는 시알리다아제의 처리는 tPS에 대한 PSGL-1의 결합을 완전히 억제하였다. 이와는 대조적으로, 항-sLex항체가 아닌 항-Lex항체에 대한 결합을 제거하는 푸코오시다아제의 처리는 PSGL-1과 tPS의 상호작용에 영향을 미치지 않았다. 이들 자료는 골수 세포 또는 PSGL-1에 대한 P-셀렉틴의 고-친화성 결합이 리간드에 시알산을 필요로 한다는 종래의 다른 분석 결과와 일치한다.
엔도-β-갈락토오시다아제로 PSGL-1을 처리하는 것은 단지 고정된 tPS에 대한 결합을 적당하게 감소시켰다. 네 개의 독립된 실험에서, 엔도-β-갈락토오시다아제는 결합을 25±11%(평균±표준편차, n=4)로 감소시켰다. 이들 자료는 P-셀렉틴 인식에 필요한 모두가 아닌 몇몇 시알화 사슬이 상기 효소에 민감한 폴리-N-아세틸락토오사민에 있음을 시사하였다. 인식에 필요한 나머지 글리칸은 엔도-β-갈락토오시다아제에 대해 내성이 있는 폴리-N-아세틸락토오사민 또는 폴리-N-아세틸락토오사민인 결핍된 과당에 있을 수 있다. 엔도-β-갈락토오시다아제는 tPS에 대한 결합을 억제하기 보다는 항-sLex항체에 대한 PSGL-1의 결합을 더욱 억제하였다. tPS와 상호작용하는 sLex의 수준은 정확하게 관련될 수 없으며, 이는 상기 분석에서 PSGL-1이 항체 또는 tPS에 결합하는데 얼마나 많은 sLex구조가 필요한지를 모르기 때문이다.
PNGaseF로 PSGL-1을 처리하는 것은 tPS에 대한 결합 능력에 영향을 주지 않으며, 이는 N-결합 과당이 P-셀렉틴 인식에 거의 역할을 하지 않는다는 결론을 지지하는 것이다.
인간 호중구의 PSGL-1의 구조 및 기능은 정제된 방사요오드화 당단백질을 이용한 분석을 사용하여 더욱 규명되었다. 그 결과는 상기 분자가 P-셀렉틴에 대한 고-친화성 결합 구조를 형성하는 일련의 시알화 및 푸코오스화 O-결합 폴리-N-아세틸락토오사민을 제공한다는 것을 시사하였다.
비록 PSGL-1의 대부분의 과당이 O-결합이지만, 이질적으로 판명된 몇몇 N-결합 글리칸이 있다. 모든 PSGL-1 분자는 PNGaseF-민감성 N-결합 과당을 함유하였지만, 고 만노오스 N-결합 글리칸과는 잘 결합하고 복잡한 2-안테나성 및 하이브리드 N-결합 사슬과는 덜 잘 결합하는 렉틴인 Con A에 당단백질 분자의 단지 42%가 결합하였다. SDS 겔에서 관찰된 육안상의 분자량 감소를 바탕으로, PNGaseF는 PSGL-1의 Con A-결합 및 Con A-비결합 분획으로부터 세 개의 가능한 N-결합 글리칸 중 두 개 이상을 제거하였다. PSGL-1의 Con A-비결합 분획에서 하나의 사슬은 PNGaseF에 대해 내성이 있으며, 이는 PNGaseF 처리 후 Con A-비결합 물질이 Con A-결합 물질보다 SDS 겔에서 여전히 약간 더 느리게 이동하기 때문이다. 다르게는, PNGaseF가 Con A-결합 및 Con A-비결합 분획으로부터 모든 N-결합 사슬을 제거했을 수 있으며, 이 경우 이동성 차이는 이질성 O-결합 당화를 반영할 수 있다. PNGaseF-민감성 N-결합 글리칸은 거의 또는 전혀 Lex및 sLex를 가져오지 않았으며, 측정가능한 정도로 P-셀렉틴과의 결합 상호작용에 기여하지 않았다. 상기 결과는 O-결합 글리칸이 P-셀렉틴이 인식하는 관련 구조를 나타낸다는 것을 강하게 시사한다. PSGL-1의 아군에서 단일 PNGaseF-내성 N-결합 글리칸이 P-셀렉틴 인식에 관여할 것 같지는 않다.
PSGL-1의 적어도 몇몇 O-결합 과당이 (α2-3)시알산 및 (α1-3)푸코오스를 가져오기 때문에, 이들은 비교적 큰 측쇄 구조를 가짐에 틀림없다. 상기 예상에 맞게, PSGL-1은 말단 시알산의 제거에 이어 엔도-α-N-아세틸갈락토오사미니다아제가 분해하는 Ser/Thr-결합 Galβ1-3GalNAc 코어 1 이당류를 거의 가져오지 않음이 밝혀졌다. 이들 자료는 겔 여과에 의해 평가될 때 PSGL-1로부터 β-제거에 의해 방출된3H-표지 O-결합 과당의 10% 미만이 작았다는 종래 관찰과 일치한다.
PSGL-1의 O-결합 글리칸은 폴리-N-아세틸락토오사민의 이질적인 기를 포함한다. SDS 겔에서의 이동성 및 토마토 렉틴에 대한 결합에 의해 측정된 바와 같이, 엔도-β-갈락토오시다아제는 Gal과 GlcNAc 사이의 내부 β1-4 결합에서 몇몇 폴리-N-아세틸락토오사민을 절단하였다. 상기 효소 처리는 또한 Lex및 sLex의 양을 감소시켰으며, 이는 이들의 몇몇 구조가 폴리-N-아세틸락토오사민에 있음을 나타낸다. 토마토 렉틴에 대한 결합에 의해 측정된 바와 같이, 엔도-β-갈락토오시다아제는 단지 시알리다아제 및 푸코오시다아제를 처리한 후 다른 폴리-N-아세틸락토오사민을 절단하였으며, 이는 상기 분자가 말단 또는 말단 근처에 엔도-β-갈락토오시다아제의 접근을 막은 시알산 및 푸코오스를 가지고 있음을 입증한 것이었다. 상기 세 개의 효소를 모두 처리한 후에도 PSGL-1 분자의 상당한 양이 여전히 토마토 렉틴에 결합되어 있기 때문에, 분지 또는 부가적인 내부 치환으로 인하여 엔도-β-갈락토오시다아제에 대한 내성이 남아있는 다른 O-결합 폴리-N-아세틸락토오사민 사슬이 있을 수 있다. 상기 구조는 엔도-β-갈락토오시다아제로 절단한 후 고정된 tPS에 대한 PSGL-1의 결합 능력에 적어도 부분적으로는 관여할 것이다.
종래 연구는 인간 골수 세포가 몇몇 O-결합 글리칸에 폴리-N-아세틸락토오사민을 발현한다는 것을 보였다. 이들 구조는 코어 2 O-결합 과당의 일부로서GalNAc의 C-6에 부착된 가지에서 거의 단독적으로 발생한다(후쿠다 일행, 1986, J. Biol. Chem. 261, 12796-12806; 하니슈 일행, 1989, J. Biol. Chem. 264, 872-883). 인간 골수 세포의 주요 시알로뮤신의 약 80개의 O-결합 글리칸 중에서, 단지 하나 또는 둘이 폴리-N-아세틸락토오사민을 함유하며, 이 중 약 절반은 말단 sLex를 갖는다. 이와는 대조적으로, 호중구의 PSGL-1은 코어 2 폴리-N-아세틸락토오사민을 더 높은 비율로 함유하는 것처럼 보인다. PSGL-1의 O-결합 글리칸을 구성하는 특정 단당류, 연결 구조 및 변형체를 결정하기 위해서는 직접 구조 분석이 필요할 것이다. 그러나, 현재의 자료는 이들 몇몇 글리칸이 류코시알린의 것과 다를 수 있음을 시사하며, 이는 인간 골수 세포가 두 개의 뚜렷한 시알로뮤신의 폴리펩티드 주쇄를 다르게 당화시킬 수 있음을 암시한다. 이 상이한 당화는 P-셀렉틴이 류코시알린이 아닌 PSGL-1과 고 친화성 결합을 하기 때문에 기능적으로 중요하다.
셀렉틴이 인식하기 위하여 대부분의 탄수화물 리간드는 시알화 및 푸코오스화될 필요가 있다. 이와 유사하게, PSGL-1은 P-셀렉틴과 상호작용하기 위하여 시알산 및 푸코오스를 필요로 한다. 비록 PSGL-1이 말단 sLex사당을 발현하지만, 인식하는데 있어서 이 구조 자체를 필요로 하는지는 분명하지 않다. 단순한 모델은 PSGL-1이 P-셀렉틴과 상호작용하는 결합성을 증가시키는 많은 말단 sLex를 제공하는 것이다. 그러나, 종래의 관찰은 고농도의 세포 표면 sLex가 P-셀렉틴과 최적으로상호작용하기에 충분하지 않음을 나타낸다. 각 과당 사슬의 부가적인 변형이 최적의 인식에 필수적인 것으로 보인다. 부근의 몇몇 과당의 특별한 특성이 또한 P-셀렉틴에 대한 고 친화성 결합을 향상시키는 군집된 당을 제공할 것이다.
사코 일행(1993)은 푸코오실트랜스퍼라아제가 결핍된 COS 세포가 아닌, α1-3/4 푸코오실트랜스퍼라아제(FTIII)와 함께 공형질감염된 COS 세포에서 발현될 때, P-셀렉틴에 결합하는 재조합 PSGL-1을 제조하였다. 재조합 분자의 상대적 분자량은 인간 골수세포 HL-60의 PSGL-1의 분자량과 유사하였으며, 저자는 재조합 PSGL-1의 구조 및 기능이 원래의 분자와 동일하다고 분명히 결론내렸다. 그러나, 이들 구조를 형성하는데 필요한 원래의 PSGL-1 및 글리코오실트랜스퍼라아제에 결합된 특별한 과당 구조는 공지되어 있지 않다. 더군다나, 재조합 PSGL-1을 생산하는 COS 세포에서 발현된 α1-3/4 푸코오실트랜스퍼라아제(FTIII)는 인간 골수 세포의 푸코오실트랜스퍼라아제와는 다르다(고엘즈 일행, 1990, Cell 63, 1349-1356; 사사키 일행, 1994, J. Biol. Chem. 269, 14730-14737). 따라서, 재조합 PSGL-1의 당화 및 그로 인한 기능이 인간 골수 세포의 원래의 당단백질과 동일한 지는 분명하지 않다. 게다가, 재조합 PSGL-1을 시알리다아제로 절단한 후, 엔도-α-N-갈락토오사미니다아제의 첨가는 당단백질의 이동성을 실질적으로 증가시켰으며, 이는 원래의 당단백질과는 대조적으로 FTIII과 함께 COS 세포에서 발현된 재조합 PSGL-1이 상기 효소에 민감한 단순한 O-결합 코어 1 Galβ1-3GalNAc 이당을 많이 함유한다는 것을 나타낸다.
사코 일행은 재조합 PSGL-1이 시알리다아제 및 엔도-β-N-갈락토오사미니다아제로 처리된 후 더 이상 P-셀렉틴에 결합하지 않음을 밝혔으며, O-결합 과당이 P-셀렉틴에 의한 인식에 중요하다고 결론내렸다. 제공된 자료를 바탕으로 볼 때, 상기 결론은 옳은 것처럼 보인다. 그러나, 사코 일행의 실험은 인식에 있어서 O-결합 글리칸의 역할을 뒷받침하는데 사용될 수 없다. 원래의 PSGL-1에 대한 결합을 제거하기 위하여 시알리다아제 처리를 연장할 필요가 있으며, 사코 일행에 의해 사용된 재조합 PSGL-1에 대한 시알리다아제 처리 조건은 P-셀렉틴의 결합을 감소시켰지만 제거하지는 못하였다. 단지 비-시알화 코어 1 Galβ1-3GalNAc 이당을 방출시키는 엔도-α-N-갈락토오사미니다아제를 첨가한 후의 P-셀렉틴의 결합 손실은 인식에 필요한 잔류 시알산을 제거하는 시알리다아제와 상기 효소의 이전에 관찰된 오염에 기인하는 것으로 보였다.
사코 일행은 또한 재조합 P-셀렉틴이 PNGaseF-처리된 모든 재조합 PSGL-1을 재침전시키지 않았기 때문에, N-결합 과당이 P-셀렉틴에 대한 결합에 기여한다고 제안하였다. 그러나, 이들 저자는 부가적인 침전 단계가 PSGL-1의 회수를 증가시켰는지를 검사하여 재침전 분석이 정량적인지 여부를 증명하지 않았다. 상기 동일한 집단은 또한 N-결합 당화의 억제제인 튜니카마이신으로 처리된 골수 세포 HL-60이 P-셀렉틴 발현 세포에 부착하지 않음을 관찰하였기 때문에, N-결합 당화가 P-셀렉틴 인식에 중요하다고 결론내렸다(라르센 일행, 1992, J. Biol. Chem. 267, 11104-11110). 그러나, 튜니카마이신은 소포체로부터 몇몇 단백질이 나가는 것을 억제하는 것과 같이 세포에 대하여 간접적인 효과를 발휘하는데, 이는 세포 부착에 대한 효과를 해석하는 것을 어렵게 한다. 본 출원의 연구는 인간 호중구의 PSGL-1의 N-결합 글리칸이 P-셀렉틴에 의한 인식에서 역할을 한다는 아무런 증거를 제공하지 않는다.
실시예 2: 푸코오실트랜스퍼라아제 III 및 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제를 코딩하는 cDNA로 형질감염된 CHO 세포에서 PSGL-1의 발현
인간 호중구로부터 정제된 원래의 PSGL-1의 많은 특성을 갖는 기능적 재조합 형태의 PSGL-1이 발현되었다. 본 연구는 PSGL-1이 P-셀렉틴에 결합하기 위하여 분지된 코어 2 구조를 함유하는 시알화 및 푸코오스화 O-결합 과당을 필요로 한다는 것을 증명하였다.
PSGL-1은 세포상에 N- 및 O-결합 과당이 매우 잘 규명되어 있어서 선택된 CHO 세포에서 발현되었다. 특히, 분비 및 표면 당단백질의 Ser/Thr-결합 과당은 Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr의 단순, 코어 1, 모노- 및 디시알화 유도체이다(사사키 일행, J. Biol. Chem. 262:12059-12076, 1987; 세구치 일행, Arch. Biochem. Biophys. 284:245-256, 1991). DHFR-마이너스 CHO 세포는 푸코오실트랜스퍼라아제 III(FTIII)을 코딩하는 cDNA(쿠코우스카-라탈로 일행, 1990), 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제를 코딩하는 cDNA(비에르후이젠 및 후쿠다, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 89:9326-933, 1992; 비에르후이젠 일행, J. Biol. Chem. 269:4473-4479, 1994), 또는 상기 두 개의 cDNA로 안정하게 형질감염되었다. 이들 cDNA는 pRc/RSV 또는 pCDNA3 발현 벡터(Invitrogen)에 연결시켰다. 인산칼슘 침전법으로 형질감염시킨 후, 안정하게 형질감염된 클론을 G418을 함유하는 배지에서 선택하였다. 하나 또는 모든 글리코오실트랜스퍼라아제를 발현하는 안정한 클론은세포 용해물에서 실시된 특정 글리코오실트랜스퍼라아제 분석을 사용하여 확인하였다. FTIII을 발현하는 세포는 또한 세포 표면에 시알릴 루이스 엑스 항원(NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcβ1-4-R)을 고 수준으로 발현하였으며, 이는 CSLEX1 단일클론 항체의 결합에 의해 측정하였다(후쿠시마 일행, Cancer Res. 44:5279-5285, 1984).
완전한 길이의 PSGL-1을 코딩하는 cDNA(무어 일행, J. Cell Biol. 128:661-671, 1995)는 pZeoSV 발현 벡터(Invitrogen)에 삽입하였다. 글리코오실트랜스퍼라아제를 발현하는 CHO 세포는 리포펙타민 시약(Gibco BRL Life Technologies)을 사용하여 PSGL-1 cDNA로 형질감염시켰다. 일시적인 발현 분석에서, 세포는 형질감염 48시간 후에 유동 세포측정법으로 분석하였다. 안정한 클론은 G418 및 Zeocin(Invitrogen)을 모두 함유하는 배지에서 선택하였다. 유동 세포측정법에 의한 세포-결합 항체의 분석은 무어 일행(1995)에 의해 기재된 바와 같이 실시하였다. 유동 세포측정법에 의한 세포-결합 혈소판-유도 P-셀렉틴의 분석은 무어 및 톰슨(Biochem. Biophys. Res. Commun. 186:173-181, 1992)에 의해 기재된 바와 같이 실시하였다.
일시적인 발현 연구에서, PSGL-1은 FTIII, 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제, 또는 상기 두 개의 글리코오실트랜스퍼라아제를 모두 발현하는 대부분의 형질감염된 세포에서 공발현되었다. 공발현은 유동 세포측정법으로 측정된 항-PSGL-1 단일클론 항체 PL1 또는 PL2(무어 일행, 1995)의 강한 결합에 의해 증명되었다. 이와는 대조적으로, 유동 세포측정법으로 P-셀렉틴이 단지 FTIII,코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제 및 PSGL-1을 발현하는 CHO 세포에 결합한다는 것이 밝혀졌다. P-셀렉틴은 PSGL-1이 부재시에는 하나 또는 두 개의 글리코오실트랜스퍼라아제를 모두 발현하는 CHO 세포에 결합하지 않았다. P-셀렉틴은 또한 PSGL-1이 존재시에도 FTIII 또는 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제를 발현하는 CHO 세포에 결합하지 않았다. 따라서, P-셀렉틴에 결합할 수 있는 기능적 형태의 PSGL-1은 FTIII 및 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제도 발현하는 CHO 세포에서만 발현되었다.
FTIII 및 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제를 안정하게 발현하는 CHO 세포 클론도 또한 선택되었다. 이들 세포는 유동 세포측정법으로 PL1 및 PL2의 결합에 의해 검출된 바와 같이 높은 수준으로 PSGL-1을 발현하였다. P-셀렉틴은 또한 이들 안정하게 선택된 세포에 잘 결합하였다. 따라서, CHO 세포에 대한 P-셀렉틴의 고 친화성 결합은 세포에 의한 FTIII, 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제 및 PSGL-1의 동시 발현을 필요로 한다. 일시적으로 또는 안정하게 PSGL-1을 발현하는 세포에 있어서, P-셀렉틴의 결합이 P-셀렉틴에 대한 비억제성 단일클론 항체 S12가 아닌, P-셀렉틴에 대한 억제성 단일클론 항체 G1에 의해 방해되기 때문에, P-셀렉틴의 결합은 특이적이었다(젱 일행, Nature, 343:757-760, 1990). 결합은 또한 Ca2+-의존적이었으며, 이는 셀렉틴이 탄수화물 리간드에 결합하는데 있어서 Ca2+가 필요하다는 것과 일치하였다. P-셀렉틴은 또한 세포의 PSGL-1에 특이적으로 결합하였으며, PL2가 아니라, PL1이 P-셀렉틴의 결합을 완전히 방해하였다. 더욱이, 대조 토끼 혈청이 아니라, 하기 항-42-56 혈청은 P-셀렉틴의 결합을 방해하였다.
상기 자료는 CHO 세포가 인간 백혈구의 원래의 PSGL-1과 마찬가지로 P-셀렉틴에 특이적이고 고친화적으로 결합하는 재조합 형태의 PSGL-1을 발현하도록 유전공학적으로 처리될 수 있음을 나타낸다. PL1 및 항-42-56 혈청에 의한 P-셀렉틴 결합 억제는 P-셀렉틴이 재조합 PSGL-1 및 인간 백혈구로부터 얻은 원래의 PSGL-1의 동일한 영역에 결합한다는 것을 나타낸다. CHO 세포에서 코어 2 효소가 필요한 것은 PSGL-1에서 P-셀렉틴 인식 위치의 중요한 성분이 Galβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-6)GalNAc-Ser/Thr 주쇄를 갖는 분지된 코어 2 O-결합 과당으로 구성되어 있음을 나타낸다. PSGL-1의 시알화 및 푸코오스화도 또한 P-셀렉틴에 대한 고 친화성 결합에 필요하며; 이들 변형은 중요한 코어 2 O-결합 글리칸에서 일어나야 한다.
실시예 3: PSGL-1에서 P-셀렉틴의 결합에 중요한 티로신 술페이트를 함유하는 영역의 결정.
PSGL-1은 308 잔기의 세포밖 영역을 갖는다. 처음의 18 잔기는 시그널 펩티드를 구성한다. 19-41 잔기는 합성 후 아마도 트랜스-골지 망상조직에서 절단될 추정적인 프로펩티드를 구성한다. 따라서, 성숙 단백질의 추정적인 N-말단은 42 잔기에서 시작한다. 티로신 술페이트를 위한 콘센서스 서열 내의 세 개의 티로신은 N-말단 근처의 46, 48 및 51 잔기이다. 42-56 잔기를 코딩하는 합성 잔기에 대한 토끼 다중클론 항체는 P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합을 완전히 억제하였으며,이는 P-셀렉틴에 대한 하나 이상의 중요한 인식 위치가 상기 영역에 존재한다는 것을 시사한다. 잔기 번호에 대한 모든 언급은 서열 1에 관한 것이다.
PSGL-1에 대한 두 개의 IgG 단일클론 항체 PL1 및 PL2는 이전에 무어 일행(J. Cell Biol. 128:661-671, 1995)에 의해 기재되었다. PL2가 아니라, PL1은 P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합을 완전히 억제하며, 정적 및 전단 조건하에서 P-셀렉틴에 대한 백혈구의 부착을 제거한다. PSGL-1에서 PL1 및 PL2에 대한 에피토프가 위치하는 영역을 맵핑(mapping)하기 위하여, PSGL-1의 세포밖 영역의 중첩 영역을 함유하는 일련의 융합 단백질을 세균에서 발현시켰다. 융합 단백질의 PSGL-1 서열은 다음과 같다: 단편 (1), 18-78 잔기; 단편 (2), 63-123 잔기; 단편 (3), 109-168 잔기; 단편 (4), 154-200 잔기; 단편 (5), 188-258 잔기; 단편 (6), 243-308 잔기. 각 단편을 코딩하는 DNA는 발현 벡터 pQE-40(Qiagen)에서 디히드로폴레이트 환원효소 및 6X His 태그를 코딩하는 DNA의 프레임에 융합시켰다. 각 단편은 세균에서 발현시키고, 6X His 태그가 결합된 니켈 친화성 칼럼에서 정제하였다. 각 융합 단백질의 항체와의 반응성은 환원 조건하에서 웨스턴 블로팅으로 평가하였다.
PL1은 단편 (1)에 강하게 결합하였으며, 다른 단편에는 결합하지 않았다. 이것은 PL1 에피토프가 18-78 잔기에 위치한다는 것을 나타낸다. 원래의 성숙 PSGL-1로부터 프로펩티드가 제거되는 것을 감안하면, 상기 에피토프는 42-78 잔기에 위치한다. PL1이 단편 (2)(63-123 잔기)에는 결합하지 않기 때문에, 에피토프는 42-70 잔기에 위치하기 쉽다. 따라서, PL1은 다중클론 항-42-56 혈청에 대한에피토프 근처에 있는 N-말단 에피토프에 결합한다. 이 결과는 P-셀렉틴 인식 위치의 중요한 성분이 PSGL-1의 N-말단에서 작은 영역 내에 존재한다는 것을 더욱 시사한다. 이와는 대조적으로, 비방해성 단일클론 항체 PL2는 단편 (5) 및 (6)에 결합하였으며(다른 단편에는 결합하지 않음), 이는 상기 PL2가 상기 양 단편에 존재하는 243-258 잔기 내의 에피토프를 인식한다는 것을 시사하였다.
이들 결과는 P-셀렉틴이 원래의 PSGL-1 및 재조합 PSGL-1의 특이한 영역에 결합한다는 것을 입증하였다. 이 영역은 성숙 분자의 N-말단 근처에 위치한다. P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 고 친화성 결합은 티로신 술페이트 및 시알화, 푸코오스화된 코어 2 측쇄 O-결합 과당을 필요로 한다. P-셀렉틴에 대한 결합 위치를 함유하는 PSGL-1의 단편, 또는 이의 유도체는 제조될 수 있다. 이들 단편은 42-58 잔기를 코딩할 만큼 짧을 수 있으며; 이 단편은 황화될 수 있는 세 개의 티로신뿐만 아니라 코어 2 O-결합 과당의 부착 위치가 될 수 있는 두 개의 트레오닌을 함유한다. 42 잔기로부터 확장된 더 긴 단편도 또한 P-셀렉틴에 고 친화적으로 결합할 것이다.
실험 절차
화학물질 및 시약
무-캐리어 [35S]술페이트(1100-1600Ci/밀리몰)는 듀퐁/NEN(독일 빌밍톤 소재)으로부터 구입하였다. 상품명 Emphaze 친화성 지지 수지는 Pierce Biochemicals(미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 구입하였다. 아에로박터아에로게네스(Aerobacter aerogenes) 아릴술파타아제, 아르트로박터 유레아파시엔스의 뉴라미니다아제 및 황화된 단당류는 Sigma Chemical Co.(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수하였다. 재조합 펩티드: N-글리코오시다아제 에프는 뵈링거 만하임(미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재)으로부터 구입하였다. 세포 배양을 위한 모든 시약은 GIBCO/BRL(미국 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재)로부터 입수하였다. 진정한 티로신 술페이트 표준물은 농축 H2SO4및 티로신을 사용하여 허트너(1984, Meth. Enzymol. 107, 200-224)에 의해 기재된 바와 같이 합성되었다. 기타 화학물질은 ACS 등급 또는 그 이상의 것이며 Fisher Scientific 으로부터 입수하였다.
방사표지된 PSGL-1의 분리
PSGL-1은 인간 호중구로부터 정제되어 무어 일행(1994)에 의해 기재된 바와 같이 Na125I로 방사표지하였다. HL-60 세포(1-2 x 06세포/㎖)는 10%의 투석된 소 태아 혈청을 함유하는 37℃, 술페이트-결핍 배지(S-MEM)에서 100μCi/㎖의 [35S]술페이트로 48시간 동안 표지하였다.35S-PSGL-1은 상품명 Emphaze와 5㎎/㎖의 밀도로 커플링된 재조합 가용성 P-셀렉틴(우시야마 일행, 1993, J. Biol. Chem. 268, 15229-15237)을 함유하는 칼럼에서 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다(무어 일행, 1994). EDTA로 용출된 농축 샘플은 Ca2+-함유 완충액으로 투석한 후 P-셀렉틴 칼럼에서 재크로마토그래피하였다. 정제된35S-PSGL-1은 환원성 또는 비환원성 SDS 샘플 완충액으로 처리하고, 7.5% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다(라엠리, 1970). 겔을 건조시키고 나서 -80℃에서 후지 RX X-선 필름에 노출시켰다.
티로신 술페이트의 검출
PSGL-1의 티로신 술페이트는35S-PSGL-1의 염기 가수분해에 의해 결정되었다. 자가방사기록법에 의해35S-PSGL-1을 확인한 후, 건조된 겔은 노출시킨 X-선 필름과 함께 정렬하고 비환원성 레인은 기재된 바와 같이 24시간 동안 110℃, 0.1M NaOH에서 강염기 가수분해시켰다(호르틴 일행, J. Biol. Chem. 261, 15827-15830, 1986). 가수분해물은 물로 세척한 Dowex 50(H+)칼럼에 통과시키고 동결건조시키고 나서 pH3.0의 NaH2PO4의 구배로 용출된 Varian AX-5 칼럼(4㎜ㅧ30㎝)을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피로 분석하였다.
PSGL-1의 효소 처리
모든 아릴술파타아제 처리는 37℃에서 하룻밤 동안 pH7.5의 약 500㎕의 0.01M 트리스-HCl에서 아에로박터 아에로게네스 아릴술파타아제(EC 3.1.6.1)를 사용하여 실시하였다(파울러 및 램믈러, 1964, Biochemistry 3, 230-237). 절단한 후, 효소 반응은 15분 동안 끓임으로써 종결시켰다. 샴 처리는 1000mU의 끊인 효소를 사용하여 실시하였다.35S-티로신 술페이트는 상술한 바와 같이 염기 가수분해에 의해35S-PSGL-1로부터 제조되었다. 염기 가수분해물은 50mU 또는 1000mU의활성 아릴술파타아제, 또는 1000mU의 끓인 아릴술파타아제로 처리하고 나서, 음이온 교환 크로마토그래피로 분석하였다.
아에로박터 아에로게네스 아릴술파타아제의 특이성은 황화된 단당류 GlcNAc-6-술페이트, Gal-6-술페이트, GalNAc-6-술페이트 및 GalNAc-4-술페이트에 대하여 측정되었다. 각각의 황화된 단당류(100nmol)는 1000mU의 끓이거나 또는 활성 효소로 따로 처리하였다. 하룻밤 배양한 후, 반응 혼합물을 15분 동안 끓이고, 동결건조시킨 후, 물에서 재현탁시키고 또 Dionex CarboPac PA-1 칼럼을 사용한 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피 및 PAD 검출에 의해 분석하였다(쉴라티파르드 및 커밍스, 1995, Glycobiology 5, 291-297).
온전한35S-PSGL-1 또는125I-PSGL-1은 상술한 바와 같이 아에로박터 아에로게네스 아릴술파타아제로 처리하였다. 아릴술파타아제에 의해35S-PSGL-1로부터 떨어져 나온 [35S]술페이트는 100㎕의 포화 Na2SO3을 캐리어로 사용한 BaSO4침전에 의해 정량하였다(쉴라티파르드 일행, 1993, J. Virol. 67, 943-945). 자료을 나타내는 그래프에서, 샴-처리된 샘플로부터 떨어져 나온 술페이트를 보정하여 샴-처리된 샘플을 0%로 설정하였다. 샴-처리된 샘플로부터 방출되는 방사능의 실제 비율은 1.3-5.0%의 범위였다.
대조 실험에서,125I-PSGL-1은 CSLEX-1 항체 칼럼에 가하기 전에 37℃에서 하룻밤 동안 pH5.0의 0.05M 아세트산 나트륨 중 1000mU의 아르트로박터 유레아파시엔스의 뉴라미니다아제로 처리하였다. CSLEX-1 크로마토그래피는 종래 기재된 바와 같이 실시하였다(무어 일행, 1994).
35S-PSGL-1은 쉴라티파르드 일행(1993)에 의해 기재된 바와 같이 펩티드:N-글리코오시다아제 에프로 처리하였다.35S-PSGL-1은 50㎕의 50mM 인산 나트륨, pH7.5, 50mM 2-메르캅토에탄올, 0.5% SDS에서 5분 동안 끊임으로써 변성시켰다. 그리고 나서, SDS는 1.5% NP-40을 사용하여 0.2%의 최종 농도로 희석하였다. 10U의 효소를 변성된35S-PSGL-1에 첨가하고 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
P-셀렉틴에 대한 아릴술파타아제로 처리된 PSGL-1의 재결합
아릴술파타아제로 처리된 PSGL-1을 Ca2+-함유 완충액 중 P-셀렉틴 친화성 칼럼에 가하고, 결합된 방사능을 EDTA로 용출시켰다. EDTA를 사용하여 칼럼으로부터 용출된125I-PSGL-1의 비율을 보정하여 샴-처리된 샘플을 100%로 설정하였다(실제 재결합율은 87-99% 범위임).
면역침전 및 P-셀렉틴 결합 분석
35S-PSGL-1의 면역침전은 무어 일행(1994)에 의해 기재된 바와 같이, PSGL-1의 42-56 잔기(QATEYEYLDYDFLPE)에 해당하는 펩티드(사코 일행, 1993)에 대한 토끼 항혈청(항-42-56)(무어 일행, 1995; 무어 일행, 1994) 또는 정상 토끼 혈청(NRS)을 사용하여 실시하였다. 면역침전물은 비환원 조건하에서 SDS-PAGE로 분석하고 나서, 자가방사기록법을 실시하였다. 고상 P-셀렉틴 결합 분석은 무어 일행(1994)에 의해 기재된 바와 같이 실시하였다. 간단히 말하면, 고정된 재조합 가용성 P-셀렉틴(50㎕, 10㎍/㎖) 또는 인간 혈청 알부민(HSA)(50㎕, 1% HSA)을 함유하는 미세역가판에서 NRS 또는 PSGL-1의 42-56 잔기에 대한 항혈청(항-42-56)의 존재하에서125I-PSGL-1을 배양하였다. HL-60 세포에 대한 혈소판-유도 P-셀렉틴의 결합은 20% NRS 또는 20% 항-42-56 혈청의 존재하에서 기재된 바와 같이 유동 세포측정법으로 측정하였다.
결과 및 토론
PSGL-1이 전사 후에 황화되는지를 확인하기 위하여, 인간 전골수성 류케미아 HL-60 세포를 물질대사에 의해 [35S]술페이트로 표지하고, 또 PSGL-1은 P-셀렉틴 칼럼에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 상기 세포의 용출액으로부터 정제하였다. [35S]술페이트로 표지된 단백질은 환원 조건하에서는 120,000, 비환원 조건하에서는 240,000의 상대적 분자량으로 SDS 겔에서 이동하는 것으로 탐지되었다.
상기 이동성은 PSGL-1의 이황화-연결 동종이합체 구조와 일치하였다(무어 일행, 1992). 또한, [35S]술페이트로 표지된 단백질은 PSGL-1의 세포밖 영역인 42-56 잔기를 코딩하는 합성 펩티드에 대한 특정 토끼 항혈청으로 면역침전시켰다. 상층액 분석을 통하여 항-42-56은 모든35S-PSGL-1을 침전시킨 반면, 정상 토끼혈청(NRS)은35S-PSGL-1을 전혀 침전시키지 못하였음을 확인하였다. 이들 결과는 PSGL-1이 전사 후에 황화된다는 것을 입증하였다.
술페이트는 티로신 술페이트(허트너 일행, 1988, Mod. Cell Biol. 6, 97-140) 또는 황화 탄수화물(피에트 일행, 1991, Cell 65, 1103-1110; 크젤렌 및 린달, 1991, Ann. Rev. Biochem. 60, 443-475)로서 진핵 당단백질에 혼입될 수 있다. 기초 연구에서, 다른 당단백질에서는 황화 탄수화물 구조를 감지하는 기술을 사용했을 때, 황화 탄수화물은 PSGL-1에서 감지되지 않았다[쉴라티파르드 일행, (1995, 1993)]. PSGL-1의 cDNA 서열은 네 개의 세포질밖 티로신 잔기를 예측하며, 이 중 세 개는 티로신 황화에 대한 예측된 콘센서스 서열 내의 46, 48 및 51 위치에 군집되어 있다(허트너 및 바에우에를, 1988). PSGL-1이 티로신 술페이트를 갖는지를 확인하기 위하여, 240kDa의35S-PSGL-1을 함유하는 겔 조각을 강염기로 가수분해시키고 음이온 교환 크로마토그래피로 분석하였다. 황화된 당 표준물이 아닌 티로신 술페이트로 공용출된 단일 방사능 피이크가 얻어졌다(도 1a).
그리고 나서, P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합에 있어서 티로신 술페이트의 중요성을 검사하였다. 비록 단백질 내의 티로신 술페이트의 기능이 명확하지 않지만, 몇몇 단백질은 최적 활성을 위하여 상기 변형을 필요로 한다(피트만 일행, 1992, Biochemistry 31, 3315-3325; 동 일행, 1994, Biochemistry 33, 13946-13953). 티로신 술페이트의 중요성을 평가하기 위한 일반적인 방법은 화학 억제제로 새로 합성된 단백질의 황화를 억제하거나 또는 위치-지향성 돌연변이생성에 의해 티로신을 페닐알라닌으로 치환하는 것이다. 술페이트를 온전한 PSGL-1의 티로신으로부터 효소적으로 제거하는 다른 방법도 검사하였다. 아에로박터 아에로게네스의 아릴술파타아제가35S-티로신 술페이트로부터 술페이트를 제거하는 능력도 또한 측정되었다. 50mU 만큼 적은 양의 상기 아릴술파타아제는 PSGL-1로부터 유도된35S-티로신 술페이트로부터 [35S]술페이트를 정량적으로 제거하였다(도 1b, 1c). 1000mU의 상기 효소가 Gal-6-술페이트, GlcNAc-6-술페이트, GalNAc-4-술페이트 및 GalNAc-6-술페이트로부터 술페이트를 제거하지 않았기 때문에, 상기 제거는 특이적이었다.
아릴술파타아제가 온전한35S-PSGL-1로부터 술페이트를 제거하는 능력을 검사하였다. 상기 효소에 의해 떨어져 나온 [35S]술페이트는 불용성 BaSO4침전에 의해 정량하였다. PSGL-1에서 50% 이하의 [35S]술페이트는 500mU의 아릴술파타아제에 의해 제거되었으며; 효소의 양을 증가시키는 것이 더 많은 방사능을 방출시키지는 않았다(도 2).
PSGL-1에서 티로신 술페이트의 기능상의 중요성은125I-PSGL-1을 아릴술파타아제로 처리하고 P-셀렉틴 칼럼에 대한 상기 처리된 리간드의 재결합을 측정함으로써 평가되었다. P-셀렉틴에 대한 아릴술파타아제로 처리된125I-PSGL-1의 결합은 투여량-의존적으로 감소되었으며; 감소된 결합과35S-PSGL-1로부터 제거된 술페이트는 서로 역의 관계였다(도 2). 1000mU의 아릴술파타아제로 처리된 PSGL-1이 sLex의 단일클론 항체 CSLEX-1을 함유하는 친화성 칼럼에 정량적으로 결합하였기 때문에, 아릴술파타아제 처리 후 P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 감소된 결합은 엑소글리코오시다아제를 오염시키는 방출된 시알산 및/또는 푸코오스에 기인하지 않았다.
아릴술파타아제는35S-PSGL-1로부터 약 50%의 [35S]술페이트를 제거하고, P-셀렉틴에 대한125I-PSGL-1의 재결합을 동일한 정도로 감소시켰다. 아릴술파타아제로 처리한 후 P-셀렉틴에 재결합하는35S-PSGL-1의 분획이 중요한 티로신 술페이트 잔기를 가질 가능성이 있는 반면, P-셀렉틴에 재결합하지 않는 분획은 티로신 술페이트를 상실하였다.35S-PSGL-1을 1000mU의 아릴술파타아제로 처리한 후 P-셀렉틴 칼럼에 가하였다. 결합 분획 및 비결합 분획은 SDS-PAGE로 분석하였다.35S-PSGL-1에 해당하는 밴드는 결합 분획에서 관찰된 반면, 비결합 분획에서는 아무런 밴드가 관찰되지 않았다. 비결합 분획의 방사능은 유리 술페이트를 나타냈다. 결합 분획에서35S-PSGL-1의 밴드가 가수분해될 때, 방사능은 티로신 술페이트에서 얻어졌다. 대조 실험에서,125I-PSGL-1을 1000mU의 아릴술파타아제로 처리한 후 P-셀렉틴 칼럼에 가하였다. SDS-PAGE 분석을 통하여 온전한125I-PSGL-1이 비결합 및 결합 분획에서 모두 회수되었음을 확인하였다. 따라서, 아릴술파타아제는 더 이상 P-셀렉틴에 결합하지 않은 PSGL-1의 서브세트로부터 술페이트를 정량적으로 제거하였지만, 반면 상기 효소는 PSGL-1을 분해하지 않았다.
PSGL-1의 서브세트에 결합된 P-셀렉틴에 남아있는 티로신 술페이트는 아릴술파타아제의 접근 불가능성 때문에 또는 상기 효소의 작용을 방해하는 PSGL-1의 몇몇 다른 특징 때문에 아릴술파타아제에 대하여 내성일 수 있다.35S-PSGL-1이 펩티드:N-글리코오시다아제 에프 및 아르트로박터 유레아파시엔스의 뉴라미니다아제에 의해 부분적으로 글리코오스가 제거될 때, 이후의 아릴술파타아제 처리는 70% 이하의 [35S]술페이트를 제거하였다. 뉴라미니다아제도 또한 P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합을 제거하기 때문에, [35S]술페이트의 증가된 제거가 P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합을 더욱 감소시키는 지의 여부는 측정될 수 없었다. 상기 결과는 PSGL-1의 광범위한 당화가 아릴술파타아제에 대한 몇몇 티로신 술페이트 위치의 접근 불가능성을 설명할 수 있음을 시사한다.
PSGL-1의 기능에 대한 티로신 술페이트의 중요성을 더 증명하기 위하여, PSGL-1의 세포밖 영역인 42-56 잔기를 코딩하는 펩티드에 대한 항혈청을 사용하였다. 상술한 바와 같이, 상기 영역은 46, 48 및 51 잔기에서 세 개의 잠재적인 티로신 황화 위치를 함유한다. 상기 항혈청은 고정된 P-셀렉틴에 대한125I-PSGL-1의 결합을 억제하고(도 3a), 또한 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같이 HL-60 세포에 대한 P-셀렉틴의 결합을 제거하였다(도 3b). 따라서, 42-56 펩티드에 대한 항혈청은 원래의 PSGL-1에 결합하며 또 P-셀렉틴에 의한 인식을 효과적으로 방해한다.
상기 결과는 PSGL-1이 P-셀렉틴과의 고 친화성 결합에 필요한 티로신 술페이트를 함유한다는 것을 입증하였다. PSGL-1이 O-결합 과당에 sLex결정자를 함유하고 또 시알산 및 푸코오스 모두 P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합에 필요하다는 것이 종래에 밝혀졌다. 티로신 술페이트는 P-셀렉틴에 직접 결합하는 글리칸의 적합한 표현을 향상시키기 때문에 중요할 수 있다. 다르게는, 티로신 술페이트가 P-셀렉틴과 직접 상호작용할 수 있다. 술파타이드 및 황화 과당이 P-셀렉틴에 결합하는 것으로 공지되어 있기 때문에, 후자의 가능성이 더 높은 것으로 보인다. 술페이트는 또한 L-셀렉틴에 대한 GlyCAM-1의 결합에 있어서 중요한 결정자이지만, GlyCAM-1은 단당류 보다는 Gal-6-술페이트 및 GlcNAc-6-술페이트에 술페이트를 함유한다.
상기 결과는 PSGL-1이 P-셀렉틴에 대한 중요한 인식 위치의 성분으로서 탄수화물 및 티로신 술페이트를 모두 제공하는 모델을 제안한다. 상기 위치는 세 개의 잠재적인 티로신 술페이트 잔기 근처에 있는 PSGL-1의 N-말단, 세포막 말단의 영역에 존재한다고 가정된다. 상기 가정과 일치하여, PSGL-1에서 세포막 말단의 에피토프를 인식하는 단일클론 항체 PL1은 정적 및 전단 조건하에서 백혈구에 대한 액상 P-셀렉틴의 결합을 방해하고 또 P-셀렉틴에 대한 호중구의 부착을 제거하였다. 이와는 대조적으로, PSGL-1에서 세포막 근처의 에피토프를 인식하는 단일클론 항체PL2는 P-셀렉틴에 대한 결합을 억제하지 않는다. P-셀렉틴이 뮤신형 당단백질에서 국소 위치를 인식한다는 개념은 셀렉틴이 전 폴리펩티드에 걸쳐 부착된 다중, 군집 O-결합 글리칸을 인식한다는 모델로부터 뚜렷하다(라스키 일행, 1992, Cell 69, 927-938; 바움휴터 일행, 1993, Science 262, 436-438).
실시예 4: PSGL에서 O-글리칸 구조의 결정
3H-당 전구체를 사용하여 대사적으로 방사표지된 HL-60 세포에 의해 합성된 PSGL-1의 O-글리칸 구조를 결정하였다. 동일한 세포에서 발현된 두 개의 시알로뮤신이 상이하게 O-당화되는지를 확인하기 위하여 PSGL-1의 당화와 CD43의 당화를 비교하였다. HL-60 및 호중구 PSGL-1 모두의 P- 및 E-셀렉틴에 대한 결합에 있어서 중요한 것으로 공지된 전사 후 변형을 비교할 수 있기 때문에, HL-60 세포주를 본 연구에 사용하였다.
본 연구는 PSGL-1의 대부분의 O-글리칸이 디시알화되거나 또는 중성 형태의 코어-2 사당이라는 것을 증명하였다. 단지 몇몇 O-글리칸이 푸코오스화되며 이들은 sLex항원에 대한 구조적 결정자를 함유한다. 이들 결과는 PSGL-1이 CD43과는 다르게 당화되며 P- 및 E-셀렉틴과의 고 친화성 상호작용에 중요할 수 있는 독특한 O-글리칸을 함유한다는 것을 증명하였다.
사용된 약어는 다음과 같다:
sLex,시알릴 루이스 엑스;
NDV, 뉴캐슬병 바이러스;
CHO, 중국 햄스터 난소;
GlcN, 글루코오사민;
GalN, 갈락토오사민;
GalNOH, 갈락토오사미니톨;
GalNAcOH, N-아세틸갈락토오사미니톨;
FT, 푸코오실트랜스퍼라아제;
C2GnT, 코어 2 β1,6 N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제;
HPAEC, 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피;
I. 실험 절차
재료
단백질 에이-세파로오스, QAE-Sephadex, 아르트로박터 유레아파시엔스의 뉴라미니다아제, 잭빈(jack bean) β-갈락토오시다아제, 잭빈 β-N-아세틸헥속사미니다아제 및 Galβ1→3GalNAc는 Sigma로부터 입수하였다. 프로나아제 및 TPCK-처리된 트립신은 Worthington Biochemicals로부터 구입하였다. 에쉐리키아 프레운디이의 엔도-β-갈락토오시다아제는 V-labs로부터 입수하였다. 스트렙토미세스 종 142의 α1,3/4-푸코오시다아제는 Takara로부터 구입하였다. 뉴캐슬병 바이러스의 뉴라미니다아제는 Oxford Glycosystems로부터 입수하였다. D-[6-3H]글루코오사민 염산(20-45Ci/밀리몰), D-[2-3H]만노오스(20-30Ci/밀리몰) 및 L-[6-3H]푸코오스(70-90Ci/밀리몰)은 듀퐁/NEN으로부터 구입하고, NaB[3H]4(40-60Ci/밀리몰)은 ARC로부터 구입하였다. 토끼 항-마우스 IgG1은 Zymed로부터 구입하였다. 상품명 Emphaze 친화성 지지 수지는 Pierce Biochemicals로부터 입수하였다. Bio-Gel P-4 및 P-10 수지 및 분자량 표지물질은 BioRad로부터 입수하였다. 모든 세포 배양 시약은 GIBCO/BRL로부터 입수하였다. 다른 화학물질은 ACS 등급이거나 또는 그 이상이며 Fisher Scientific으로부터 입수하였다.
물질대사에 의해 방사표지된 PSGL-1의 분리
HL-60 세포의3H-GlcN,3H-Man 및3H-Fuc 물질대사에 의한 방사표지는 기재된 바와 같이 실시되었다(무어 일행, 1992, J. Cell. Biol. 118, 445-456; 윌킨스 일행, 1995, J. Biol. Chem. 270, 22677-22680).3H-PSGL-1은 상품명 Emphaze와 5㎎/㎖(1.0㎖의 베드 부피)의 밀도로 커플링된, 고정된 재조합 가용성 P-셀렉틴(우시야마 일행, 1993, J. Biol. Chem. 268, 15229-15237)의 칼럼에 대한 친화성 크로마토그래피를 사용하여 세포 추출물로부터 정제하였다(무어 일행, 1994, J. Biol. Chem. 269, 23318-23327). EDTA로 용출된 농축 샘플은 Ca2+-함유 완충액으로 투석한 후 P-셀렉틴 칼럼에서 재크로마토그래피하였다. 정제된3H-PSGL-1은 환원성 또는 비환원성 SDS 샘플 완충액으로 처리하고(라엠리, 영국, 1970, Nature 227, 680-685), 7.5% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다. 겔을 건조시키고 나서 -80℃에서 후지 RX X-선 필름에 노출시켜 자가방사기록하였다. 비환원성 레인으로부터 얻은 겔 조각에서 약 250kDa의3H-PSGL-1을 분석하였다.
CD43의 면역침전
CD43은 CD43-특이성 mAb, H5H5(IgG1)을 사용하여3H-당으로 표지된 HC-60 세포로부터 면역침전시켰다. H5H5 하이브리도마 세포주는 티. 아우구스트 박사에 의해 생산되었으며 Developmental hybridoma Bank(The Johns Hopkins University School of Medicine)로부터 입수하였다. CD43은 먼저 37℃에서 1시간 동안 100㎍의 토끼 항-마우스 IgG1 항체를 50㎕의 단백질 에이-세파로오스 비드에 미리 로딩함으로써 면역침전시켰다. 세척한 후, 37℃에서 1시간 동안 500㎕의 비희석된 H5H5 배양 배지를 첨가함으로써 CD43 특이성 항체를 비드에 흡수시켰다. 세척 후, 미리 로딩된 비드를3H-당으로 표지된 HC-60 세포 추출물에 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 비드는 Hanks 균형염 용액으로 5회 세척하고 나서, 비환원성 SDS 샘플 완충액에서 5분 동안 끓이고, 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다. 자가방사기록후 확인된 겔 조각에서 120kDa의 정제된 CD43을 잘라내고 분석하였다.
3 H-PSGL-1 및 3 H-CD43으로부터 방사표지된 O-글리칸의β-제거 및 Bio-Gel 및 QAE-Sephadex에서 글리칸의 크로마토그래피
방사표지된 PSGL-1 및 CD43을 함유하는 겔 조각은 기재된 바와 같이 순한 염기/붕소수소화물로 직접 처리하였다(이예르 일행, 1971, Arch. Biochem. Biophys.142, 101-105; 커밍스 일행, 1983, J. Biol. Chem. 258, 15261-15273). 떨어져 나온 방사표지 글리칸은 Dowex 50(H+형) 칼럼에서 크로마토그래피에 의해 염을 제거하고, 글리칸을 추가 분석하였다. 크로마토그래피는 pH5.5의 0.1M 피리딜/아세테이트 완충액중 1ㅧ90㎝ 칼럼의 Bio-Gel P-4(중간 메쉬) 및 1x48㎝ 칼럼의 Bio-Gel P-10(중간 메쉬)에서 실시하고, 1㎖의 분획을 채집하였다. 글리칸의 음이온 특성 및 시알화는 20, 70, 140, 200 및 250mM NaCl을 함유하는 2mM 트리스-염기로 단계 용출시키면서, QAE-Sephadex 칼럼에서 크로마토그래피에 의해 부분적으로 평가하였다.
방사표지된 O-글리칸 표준물의 제조
단순한 코어-1 O-글리칸 Galβ1→3GalNAc는 Galβ1→3GalNAcOH[3H]를 형성하도록 NaB[3H]4의 존재하에서 환원에 의해 방사표지하였다(리 일행, 1978, J. Biol. Chem. 253, 7762-777).3H-GlcN이 표지된 표준 글리칸은 상기 과정을 거친 후3H-GlcN으로 표지된 HL-60 세포의 총 당단백질로부터 제조되었다(칼슨 일행, 1986, J. Biol. Chem. 261, 12787-12795). 상기 표준물은 디시알화 코어-2 육당 NeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6(NeuAcα2→3Galβ1→3)GalNAcOH, 중성 코어-2 사당 Galβ1→4GlcNAcβ1→6(3Galβ1→3)GalNAcOH, 및 삼당 GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH를 포함한다. 상기 표준물을 제조하기 위하여,3H-GlcN으로 표지된 세포 추출물을 0.01M NaHCO3, pH7.5에서 투석시키고, 100㎍/㎖의 TPCK-처리된 트립신으로 37℃에서 하룻밤 동안 처리하였다. 건조된 트립신 분해물은 β-제거를 위하여 순한 염기/붕소수소화물로 처리하고, 떨어져 나온 O-글리칸은 Bio-Gel P-4 칼럼에서 크기에 따라 분획하였다. 방사능 피이크에 해당하는 모아진 분획은 QAE-Sephadex 칼럼 크로마토그래피에 의해 전하 분포에 대하여 분석하였다. 그리고 나서, 각 글리칸 구조는 하기 기재된 바와 같이 하강 종이 크로마토그래피에 의해 아르트로박터 뉴라미니다아제, β-갈락토오시다아제 및 β-N-아세틸헥속사미니다아제에 대한 민감성에 의해 확인하였다.
코어-2 푸코오스화 오당 표준물 Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH는 인간 FTIV 유전자로 안정하게 형질감염된 COS7 세포로부터 50㎍의 추출물의 존재하에서3H-GlcN-사당 Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH와 표지되지 않은 GDP-Fuc(100μM)를 함께 배양함으로써 제조되었다. 상기 α1,3FT는 α1,3 결합의 Fuc를 말단 N-아세틸락토오사민 서열을 함유하는 수용체의 GlcNAc 잔기에 부가한다(고엘즈 일행, 1990, Cell 63, 1349-1356; 로웨 일행, 1991, J. Biol. Chem. 266, 21777-21783; 쿠마르 일행, 1991, J. Biol. Chem. 266, 21777-21783). 반응 생성물은 예상한 바와 같이 오당처럼 이동하였으며, 스트렙토미세스 α1,3/4-푸코오시다아제의 처리에 의해 상응하는 사당으로 전환되었다.
Man:Fuc 비율을 정하고 표준 고 만노오스형 N-글리칸을 제공하기 위하여, 방사표지된 글리칸을 [3H]Man으로 표지된 HL-60 세포 추출물로부터 제조하였다. 글리코펩티드를 제조하기 위하여, 상기 세포 추출물을 커밍스 일행(1983, J. Biol. Chem. 258, 15261-15273)에 의해 기재된 바와 같이, TCA로 침전시키고 프로나아제로 처리하였다. 상기 글리코펩티드로부터, 고 만노오스형 N-글리칸 표준물(Man9GlcNAc1, Man8GlcNAc1, Man7GlcNAc1, Man6GlcNAc1, Man5GlcNAc1)은 엔도-β-N-아세틸글루코오사미니다아제 에이치로 처리된 후 제조되었다[알.디. 커밍스, 1993, Glycobiology: A Practical Approach(엠. 후쿠다 및 에이. 코바타 편저), pp.243-289, IRL Press at Oxford University Press, 영국 옥스포드].
[ 3 H]GlcN으로 표지된 글리칸에서 방사표지된 단당류의 상대적인 몰비
HL-60 세포에서 제조된 [3H]GlcN-표지된 디시알화 육당 NeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6(NeuAcα2→3Galβ1→3)GalNAcOH에서, NeuAc, GlcNAc 및 GalNAcOH 잔기가 방사표지된다(에이. 바르키, 1994, Meth. Enzymol. 230, 16-32). 평형 방사표지시 상기 잔기의 상대적인 몰비는 1에 가까워야 한다. GlcNAc 및 GalNAc 잔기에 대한 상대적인 몰비를 측정하기 위하여, 상기3H-GlcN-육당을 탈시알화시켜3H-GlcN-사당을 제조하고; 상기 사당을 강산에서 가수분해시키고 방출된 방사능은 하기 기재된 바와 같이 HPAEC에 의해 확인하였다. 모든 방사능은3H-GlcN:3H-GalNOH=1.0:0.8의 비율로3H-GlcN 및3H-GalNOH에서 얻어졌다. 상기 비율은 분리된 글리칸의 상대적인 몰비를 계산하는데 있어서 보정 인자로서 사용되었으며, 즉 가수분해 후 샘플의3H-GalN(OH)에서 회수된 방사능을 0.8로 나누었다. 상대적인 몰비는3H-GlcN 전구체로 물질대사에 의해 방사표지된 HL-60 세포에 관한 다른 연구와 일치한다(케이. 마에무라 및 엠. 후쿠다, 1992, J. Biol. Chem. 267, 24379-24386). NeuAc 및 GlcNAc 잔기에 대한 상대적인 몰비를 측정하기 위하여,3H-GlcN-육당을 뉴라미니다아제로 탈시알화시키고 NeuAc에서 방출된 방사능을 측정하였다. GlcN 및 NeuAc에서 회수된 방사능은 각각 1.0:1.4였다. NeuAc의 방사능이 탈시알화된 육당의 두 잔기로부터 유도되었기 때문에, 이는 상대적인 몰비 GlcN:NeuAc=1.0:0.7인 최종값을 제공한다.
단당류 조성물의 결정
PSGL-1 및 CD43에서 GlcN:GalN 및 Man:Fuc의 비율은 정제된 PSGL-1 및 CD43을 함유하는 절제된 겔 조각을 강산으로 가수분해시킨 후에 측정하였다. 상기 겔 조각은 2시간 동안 121℃에서 250㎕의 2N 트리플루오로아세트산(TFA)으로 처리하였다. 가수분해물 내의 떨어져 나온 방사표지된 단당류는 Dionex 시스템에서 CarboPac PA-1 칼럼(4ㅧ250㎜)에서 pH 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC) 및 30분 동안 16mM NaOH로 용출시켜 확인하였다. 분획(0.3분)을 모으고 섬광 계수기로 방사능을 측정하였다. 방사표지된 단당류는 표준 단당류의 보유시간과 비교함으로써 확인하였다. 글리칸에서 GlcN:GalN에 대한 상대적인 몰비는 GlcN 피이크에서의 방사능을 GalN 피이크에서의 방사능으로 나누고3H-GlcN:3H-GalN의 비활성 차이를 보정하여 계산하였다.3H-Man-글리칸에서 Man:Fuc 비율은 또한 [2-3H]Man으로 세포를 평형 방사표지한 후 통상적으로 관찰되는 Man:Fuc의 비율 1.0:1.0을 사용하여, 상술한 바와 같이 산 가수분해 후에 측정하였다.
기타 절차
β-N-아세틸헥속사미니다아제, β-갈락토오시다아제, 아르트로박터 뉴라미니다아제, 스트렙토미세스 α1,3/4-푸코오시다아제 및 에쉐리키아 프레운디이의 엔도-β-갈락토오시다아제를 이용한 글리칸의 효소 처리는 커밍스 일행(1989, Methods in Cell Biol. 32, 142-180); 스리바트산 일행(1992, J. Biol. Chem. 267, 20196-20203)에 의해 기재된 바와 같이 실시하였다. NDV-뉴라미니다아제의 처리는 37℃에서 24시간 동안 20mU의 효소와 함께 20㎕의 10mM 인산염, pH7.0에서 실시한 후, 20mU의 효소를 더 첨가하고 24시간 동안 더 배양함으로써 실시하였다. O-글리칸은 알.디. 커밍스(1993, Glycobiology)에 의해 기재된 바와 같이, 피리딘/에틸아세테이트/물/아세트산(5:5:1:3) 용매계를 사용하여 정해진 시간 동안 와트만 여과지에서 하강 종이 크로마토그래피에 의해 분석 및 정제하였다. 글리칸은 스푼서 일행(1984, J. Biol. Chem. 259, 4792-4801)에 의해 기재된 바와 같이, 100℃에서 1시간 동안 0.1N TFA로 처리하여 화학적으로 탈푸코오스화시켰다.
II. 결과
PSGL-1 및 CD43의 정제
PSGL-1 및 CD43은3H-GlcN에 의해 대사적으로 표지된 HL-60 세포로부터 정제하였다.3H-GlcN로 표지된 HL-60 세포 추출물의 PSGL-1은 고정된 P-셀렉틴에 대한 친화성 크로마토그래피를 실시한 후, 결합된 EDTA-용출 분획을 재크로마토그래피하여 정제하였다. 2회 정제된 물질에서 사실 모든 방사표지물(90-99%)이 P-셀렉틴에 결합하였다. 상기 2-단계 과정은 첫 단계 후에 남아있는 비환원 조건하에서 약 120kDa의 오염성 당단백질을 제거하는데 필요하였다. 정제된 PSGL-1은 비환원 조건하에서는 약 250kDa 및 환원 조건하에서는 약 120kDa의 이합체로서 행동하였다. 정제된 PSGL-1은 7.5%의 폴리아크릴아미드에서 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE로 용해시키고 나서 자가방사기록법으로 분석하였다.
CD433H-GlcN-표지 HL-60 세포 추출물은 CD43-특이성 mAb와 2차 토끼 항-마우스 IgG1 항체 또는 2차 항체 단독으로 면역침전시켰다. 상기 면역침전물은 10%의 아크릴아미드 겔에서 비환원 조건하에서 전기영동하고 나서 자가방사기록법으로 분석하였다. CD43에 대한 120kDa의 단일 밴드는 환원 및 비환원 조건하에서 모두 관찰되었다.
PSGL-1 및 CD43에서 방사표지된 당의 조성
PSGL-1 및 CD43 당화의 초기 평가에서, 정제된 당단백질의 GlcN:GalN의 비율을 측정하였다.3H-GlcN은 동물 세포에 의해 방사표지된 GlcNAc, GalNAc 및 시알산으로 물질대사되었다.3H-GlcN-당단백질을 함유하는 겔 조각은 강산(시알산을 파괴시킴)으로 처리하고 방사표지된 GlcN 및 GalN은 Dionex HPAEC로 확인하였다. GlcN:GalN 비율은 PSGL-1인 경우 약 2:1이고 CD43인 경우 약 1:1이다. CD43인 경우 약 1:1의 GlcN:GalN 비율은 CD43의 대부분의 글리칸이 단순한 코어-2 모티프(motif) Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH를 갖는다는 출판된 증거와 일치한다. 상기 결과는 PSGL-1의 글리칸이 CD43의 글리칸보다 GalNAc에 비해 더 많은 양의 GlcNAc를 함유한다는 것을 증명하였다.
PSGL-1에서 sLex결정자의 존재는 PSGL-1이 심하게 푸코오스화되었음을 예상하게 한다. [2-3H]Man으로 대사적으로 방사표지된 HL-60 세포로부터 분리된 PSGL-1 및 CD43에 존재하는 Fuc의 양을 분석하였다. 상기 표지된 전구체는 세포의 물질대사에 의해 2-3H-Fuc으로 전환되며, 평형 표지 후 Man 및 Fuc의 상대적인 비활성은 동일하다.3H-Man-PSGL-1 및3H-Man-CD43은 SDS-PAGE 및 자가방사기록에 의해 분리하였다. 상응하는 밴드를 강산으로 가수분해시키고 떨어져 나온 단당류는 Dionex 시스템에서 HPAEC로 분리하였다. Man:Fuc 비율은 PSGL-1인 경우 3:5, CD43인 경우 3:2로 측정되었다. 대조로서, Man:Fuc 비율도 또한 HL-60 세포로부터 정제되지 않은 총 당단백질에 대하여 측정하였으며 3:1로 밝혀졌다. PSGL-1, CD43 및 총 HL-60 당단백질에서3H-Man 및3H-Fuc의 상대적인 양은3H-Man-PSGL-1,3H-Man-CD43 및3H-Man-표지 HL-60 세포의 총 당단백질을 산으로 가수분해시킨 후에 측정하였다.산 가수분해물은 16mM NaOH로 용출시킨 Carbo-Pac PA-1 칼럼을 사용하여 HPAEC로 분석하였다. 각 흐릿한 피이크의 총 방사능을 측정하였다. PSGL-1은 CD43보다 더 많은 Fuc 잔기를 함유하고, HL-60 세포의 평균 당단백질보다 더 많은 Fuc 잔기를 함유한다.
상기 정보를 사용하여, PSGL-1의 Fuc 잔기 수를 추정할 수 있다. PSGL-1의 cDNA 서열은 PSGL-1이 세 개의 잠재적인 N-당화 위치를 갖는다는 것을 예측한다. PSGL-1은 단지 복잡한 형태의 N-글리칸을 함유하며, 이 중 각각은 세 개의 Man 잔기를 가져야 한다. 따라서, PSGL-1의 세 개의 복잡한 형태의 N-글리칸은 몰당 9개의 Man 잔기를 나타내며, 이에 따라 PSGL-1의 몰당 15개의 Fuc 잔기가 있다. 이와는 대조적으로, CD43은 단지 하나의 N-결합 글리칸을 함유하고 PSGL-1에 비하여 훨씬 더 적은 Fuc를 갖는다. 일괄하면,3H-Man-당단백질의 조성 분석은 PSGL-1이 CD43보다 다르게 당화된다는 것을 증명하였다.
PSGL-1 및 CD43으로부터 O-글리칸의β-제거 및 Bio-Gel P-4 및 P-10에서의 크로마토그래피
PSGL-1 및 CD43의 O-글리칸은 정제된 당단백질을 함유하는 겔 조각을 순한 염기-붕소수소화물로 처리하여 β-제거시킴으로써 직접 떨어뜨리고, Bio-Gel P-4 칼럼에서 분획시켰다. PSGL-1 및 CD43에서 떨어져 나온3H-GlcN-글리칸은 각각 47%, 41% 및 11%의 총 방사능을 나타내는 세 개의 분획으로 회수하였다. CD43과 비교하여, PSGL-1은 비교적 큰 글리칸을 높은 비율로 함유하였다.
PSGL-1 및 CD43으로부터 얻은 P-4-I 샘플은 Bio-Gel P-10 칼럼에 대한 크로마토그래피에 의해 추가 정제하였다. PSGL-1로부터 P-4-I 분획의 방사능은 P-10-I 및 P-10-2로 지칭된 Bio-Gel P-10에서 두 개의 주요한 피이크로 분리되었다. 상기 글리칸의 집단은 디시알화 코어-2 육당 표준물 NeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6(NeuAcα2→3Galβ1→3)GalNAcOH보다 크기가 더 크다. PSGL-1의 P-4-II 분획 내의 주요 물질은 디시알화 코어-2 육당 표준물보다 약간 더 작은 위치(P-10-3으로 칭함)의 Bio-Gel P-10에서 용출되었다. 이와는 대조적으로, CD43의 P-4-I 및 P-4-II 모든 분획에서 대부분의 물질은 디시알화 코어-2 육당 표준물과 마찬가지로 Bio-Gel P-10에서 동일하게 용출되었다.
CD43으로부터 P-4-I에서 회수된 글리칸은 엑소글리코오시다아제 처리 및 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 상기 글리칸은 기대했던 디시알화 코어-2 육당인 것으로 나타났다. CD43으로부터 P-4-I 샘플의 작은 분획은 Bio-Gel P-10에서 더 큰 크기의 글리칸으로 회수되었으며, 이는 CD43으로부터 O-글리칸의 작은 분획이 코어-2 모티프에서 확장된 폴리락토오사민 구조를 갖는다는 종래 연구와 일치하였다. CD43의 글리칸 구조는 기재되어 있기 때문에, 추가로 분석하지 않았다.
PSGL-1로부터 P-10-1, P-10-2 및 P-10-3 글리칸의 조성 분석
β-제거에 의해 Ser/Thr 잔기로부터 방출된 O-글리칸은 환원 말단에 이후의 강산 가수분해에 의해3H-GalNOH로 회수될 수 있는3H-GalNAcOH를 함유해야 한다.PSGL-1의 혼합물에서 어떤 글리칸이 O-글리칸을 제공하는지를 확인하기 위하여, Bio-Gel P-10으로부터 각 글리칸의 GalNOH, GalN 및 GlcN 함량은3H-GlcN-PSGL-1 P-10-1, P-10-2 및 P-10-3 분획을 강산으로 가수분해한 후, Dionex 시스템의 HPAEC로 측정하였다. 산 가수분해물은 16mM NaOH로 용출시킨 Carbo-Pac PA-1 칼럼을 사용하여 HPAEC로 분석하였다. 각 피이크의 총 방사능을 측정하였다. PSGL-1 P-10-2 및 P-10-3 분획에서 총 GalN(OH)의 95% 이상이 GalNOH로 회수되었으며, 이는 β-제거가 유효했으며 PSGL-1의 O-글리칸이 상기 분획에 나타났음을 증명하는 것이었다. P-10-1의 글리칸은 GalNOH가 결핍되었으며, β-제거에 의해 방출된 O-글리칸을 나타내지 않았다. 대신, P-10-1 분획은 펩티드에 여전히 부착된 N-글리칸을 함유하였다. 이는3H-Man-PSGL-1로부터 상기 글리칸에서 회수된3H-Man의 존재에 의해 확인되었다. P-10-1 샘플에서 회수된 소량의 GalN은 N-글리칸에 존재하는 GalNAc 잔기로부터 생겼거나, 또는 펩티드에 여전히 결합되어 β-제거 과정에서 방출되지 않은 소량의 잔기성 O-글리칸으로부터 생길 수 있었을 것이다.
PSGL-1로부터 P-10-1, P-10-2 및 P-10-3 글리칸의 시알화
P-10-2 및 P-10-3의 O-글리칸 및 P-10-1의 N-글리칸의 시알화 양상은 뉴라미니다아제 처리 전 및 후에 QAE-Sephadex에서 음이온-교환 칼럼 크로마토그래피로 결정하였다. 상기 시스템에서, -1 전하(1개의 시알산)를 갖는 글리칸은 20mM NaCl로 용출시키고, -2 전하(2개의 시알산)를 갖는 글리칸은 70mM NaCl로 용출시키고, 또 -3 전하(3개의 시알산)를 갖는 글리칸은 140mM NaCl로 용출시켰다[24, 25].3H-GlcN-PSGL-1의 P-10-1, P-10-2 및 P-10-3 분획을 QAE-Sephadex 칼럼에 가하고, 상기 칼럼은 NDV 뉴라미니다아제로 처리하기 전 또는 후에 지시된 농도(mM)의 NaCl로 용출시켰다. P-10-1 분획의 글리칸은 이질적으로 하전되었으며, 이는 상기 분획의 글리코펩티드에서 N-글리칸의 생성과 일치하였다. NDV 뉴라미니다아제로 처리한 후, 20mM NaCl로 용출된 방사능은 20시간 동안 하강 종이 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 진정한 NeuAc는 25㎝ 이동하였다. P-10-2 글리칸은 모노- 및 디시알화 종이며, P-10-3 글리칸은 중성 및 모노시알화 종의 혼합물이었다.
글리칸의 음이온 특성이 시알산에 기인한 것인지를 결정하고 시알산의 결합을 정의하기 위하여,3H-GlcN으로 표지된 O-글리칸의 일부를 NDV 뉴라미니다아제로 처리하였다. 상기 효소는 α2,3-결합 시알산 잔기에 대하여 고 특이성을 나타내며, 다른 결합의 시알산은 효율적으로 절단하지 못할 것이다[폴슨 일행, 1982, J. Biol. Chem. 257, 12734-12738]. NDV 뉴라미니다아제 처리 후, P-10-1의 글리칸은 덜 하전되었으며, 이는 시알산의 손실과 일치하였다. 그러나, 잔기에 하전된 글리칸의 존재는 글리코펩티드의 N-글리칸에 대해 기대되는 프로필(profile)을 나타낸다. 이와는 대조적으로, P-10-2 및 P-10-3의 글리칸은 NDV 뉴라미니다아제 처리 후 중성이 되었으며, 이는 이들 글리칸의 모든 시알산이 α2,3-결합임을 증명하였다. NDV 뉴라미니다아제 처리 후 20mM NaCl로 용출되는 물질의 피이크는 하강 종이 크로마토그래피에서 표준 NeuAc와 공용출에 의해 밝혀진 바와 같이, 유리3H-NeuAc로서 정량적으로 회수되었다.3H-GlcN으로 표지된 HL-60 세포의 PSGL-1에서의시알산은 Neu5Ac임이 이전에 확립되었다. 상기 결과는 P-10-2의 O-글리칸이 모노- 및 디시알화 종이고, P-10-3의 O-글리칸은 중성 및 시알화 종이며, 시알산은 글리칸에 대하여 α2,3-결합임을 증명하였다. 더욱이, 상기 결과는 NDV 뉴라미니다아제 처리 후에 중성 종이 생기기 때문에 PSGL-1의 O-글리칸이 황화되지 않음을 입증하였다.
PSGL-1로부터 P-10-2 글리칸의 하강 종이 크로마토그래피
P-10-2의 글리칸은 제조용 하강 종이 크로마토그래피를 사용하여 추가 정제되어 두 개의 주요한 종이 회수되었다. 하나의 피이크는 기점으로부터 천천히 이동하는 더 큰 크기의 글리칸을 함유하였다(P-10-2a로 칭함). 더 빠르게 이동하는 물질의 작은 피이크도 또한 관찰되었으며(약 24㎝), 이는 P-4-II 피이크로부터 유도된 몇몇 잔기성 글리칸을 나타냈다. QAE-Sephadex에서 음이온-교환 크로마토그래피를 실시할 때, P-10-2a 물질은 모노시알화 종으로서 용출된 반면, P-10-2b 물질은 디시알화 종으로서 용출되었다.
P-10-2b 글리칸의 엑소글리코오시다아제 처리
P-10-2b에서 더 작은 크기의 디시알화 글리칸은 NDV 뉴라미니다아제로 처리하여 탈시알화시키고, 떨어져 나온 시알산은 QAE-Sephadex에서 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 탈시알화 글리칸은 순차적인 엑소글리코오시다아제 처리 전 및 후에 하강 종이 크로마토그래피로 분석하였다(도 4a-e). 뉴라미니다아제로 처리한 후, 탈시알화 P-10-2b 글리칸은 두 개의 종으로 분획하였다. 소수의 피이크(약 10%)는 푸코오스화 오당 표준물Galβ1→4(Fucβ1→3)GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH와 함께 이동하였으며, P-10-2b1로 지칭하였다. 물질의 주요한 피이크(약 90%)는 표준 코어-2 사당 Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH와 함께 이동하였으며, P-10-2b2로 지칭하였다.
탈시알화 P-10-2b 글리칸은 β-N-아세틸헥속사미니다아제로 처리하였다. 상기 처리는 샘플 내의 종의 이동을 변화시키지 않았으며, 이는 상기 글리칸이 말단 GlcNAc 잔기가 결핍되었음을 나타낸다. 그러나, 탈시알화 P-10-2b 혼합물이 β-갈락토오시다아제로 처리될 때, P-10-2b1글리칸은 영향을 받지 않은 반면, P-10-2b2글리칸은 분해되어 표준 삼당 GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH와 함께 이동하였다(도 4b). Galβ1→3GalNAcOH 구조는 상기 효소가 β1,3-결합한 말단 갈락토오스 잔기를 효율적으로 절단하지 못하기 때문에 잭빈 β-갈락토오시다아제에 대하여 내성이 있다(리 일행, 1975, J. Biol. Chem. 250, 6786-6791). 이는 상기 분석에서 사용된 잭빈 β-갈락토오시다아제의 농도에서 표준 이당 Galβ1→3GalNAcOH이 절단되지 않은 대조 실험으로 확인되었다. P-10-2b2글리칸이 디시알화 종으로부터 유도되기 때문에, 상기 결과는 P-10-2b2글리칸이 코어-2 육당 NeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6(NeuAcα2→Galβ1→3)GalNAcOH로부터 유도됨을 증명하였다.
디시알화3H-GlcN-P-10-2b 글리칸이 스트렙토미세스 α1,3/4-푸코오시다아제로 처리될 때, P-10-2b1글리칸은 상실되며, 회수된 모든 글리칸은 코어-2 사당 표준 Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH와 함께 이동하였다(도 4c). 탈시알화 P-10-2b 글리칸을 스트렙토미세스 α1,3/4-푸코오시다아제, β-N-아세틸헥속사미니다아제 및 β-갈락토오시다아제로 함께 처리하면, P-10-2b1및 P-10-2b2글리칸을 모두 완전히 분해시켜3H-GlcNAc 및3H-이당 Galβ1→3GalNAcOH를 유리시켰다(도 4d). 이들 결과는 P-10-2b1글리칸이 푸코오스화 오당 구조 Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH를 갖는다는 것을 증명하였다. 원래의 P-10-2b 글리칸이 디시알화 종이기 때문에, P-10-2b1글리칸은 sLex항원 NeuAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→R을 함유하고 칠당 구조 NeuAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→6(NeuAcα2→3Galβ1→3)GalNAcOH를 갖는다(도 7),
이들 글리칸에서 푸코오스의 존재를 더 확인하고 다른 글리칸에서 Fuc의 확인을 용이하게 하기 위하여, HL-60 세포를 물질대사에 의해 [3H-Fuc]로 방사표지하였다.3H-Fuc로 표지된 O-글리칸은 상술한 동일한 절차를 거쳐3H-GlcN-글리칸에 대하여 기재된 바와 같이 β-제거에 의해 회수하였다. 탈시알화 P-10-2b 분획에서 회수된3H-Fuc는 탈시알화3H-GlcN-P-10-2b1글리칸과 함께 이동하였다(도 4e). 일괄하면, 상기 결과는 PSGL-1의 P-10-2b1글리칸이 푸코오스화되며 sLex구조를 함유한다는 것을 입증하였다.
P-10-2a 글리칸의 엔도- 및 엑소글리코오시다아제 처리
비교적 큰 크기 때문에, P-10-2a 글리칸이 폴리락토오사민 [3Galβ1→4GlcNAcβ1-]n을 함유할 가능성이 있었다. 상기 가능성을 평가하기 위하여, P-10-2a 글리칸을 탈시알화시키고 시알산을 QAE-Sephadex 크로마토그래피로 제거하였다. 그 결과 얻어진 중성 글리칸은 타입2 폴리락토오사민에서 내부 β1→4 갈락토오스 잔기를 절단하는 엔도-β-갈락토오시다아제로 처리하였다[코바타 및 타카사키, 1993, Glycobiology: A Practical Approach(엠. 후쿠다 및 에이. 코바타 편저), pp.165-185, IRL Press at Oxford University Press, 영국 옥스포드]. 상기 글리칸은 상기 처리에 대하여 내성이 있었다(도 5a). 탈시알화 P-10-2a 글리칸도 또한 β-갈락토오시다아제 및 β-N-아세틸헥속사미니다아제의 조합 처리에 대하여 내성이 있었다(도 5a). 이 때, P-10-2a 글리칸이 모든 내부 GlcNAc 잔기가 푸코오스화된 폴리락토오사민 주쇄를 함유할 가능성이 있었다. 상기 폴리푸코오스화 폴리락토오사민 구조는 엔도-β-갈락토오시다아제에 대하여 내성이 있었다(후쿠다 일행, 1984, J. Biol. Chem. 259, 10925-10935). 완전한 탈푸코오스화는 엔도-β-갈락토오시다아제가 사슬을 절단하기 전에 필요하였다.
탈시알화 P-10-2a 글리칸은 화학적으로 탈푸코오스화시킨 후 엔도-β-갈락토오시다아제로 처리하였다. 푸코오스를 제거한 후, 상기 효소는 P-10-2a 글리칸을정량적으로 절단하여 삼당 Galβ1→4GlcNAcβ1→3Gal, 잔기성 코어-2 삼당 GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH 및 이당 GlcNAcβ1→3Gal로 확인된 세 개의 주요 화합물을 거의 동일한 몰비율로 방출시켰다(도 5b). 엔도-β-갈락토오시다아제의 특이한 작용에 의한 상기 생성물의 생성은
의 주쇄 구조를 갖는 글리칸에 대하여 예측되며, 식 중에서 화살표는 글리칸을 함유하는 탈푸코오스화 폴리락토오사민의 엔도-β-갈락토오시다아제에 대한 특정 절단 위치를 나타낸다(코바타 및 타카사키, 1993, Glycobiology). 폴리락토오사민의 사슬 길이는 다른 단편에 대하여 이당 GlcNAcβ1→3Gal에서 회수된 방사능으로부터 추론될 수 있다. 엔도-β-갈락토오시다아제 처리 후, 삼당 GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH의 회수는 폴리락토오사민이 GlcNAc로부터 β1-6 결합에 의해 GalNAcOH 잔기로 확장됨을 증명하였다. Galβ1→4GlcNAcβ1→3Gal의 회수는 Gal 잔기가 폴리락토오사민의 비환원성 말단에 존재함을 입증하였다. 예상한 바와 같이, 탈시알화 및 탈푸코오스화 P-10-2a 글리칸을 β-갈락토오시다아제 및 β-N-아세틸헥속사미니다아제의 조합으로 처리하면, 완전히 절단되어3H-GlcNAc 및3H-이당 Galβ1→3GalNAcOH로 유리되었다(도 4d).
푸코오스가 제거되기 전에, 엔도-β-갈락토오시다아제에 대한 탈시알화 P-10-2a의 내성은 글리칸 내의 각 GlcNAc 잔기가 구조 Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH에서 α1,3-결합된 푸코오스 잔기를 함유할 가능성과 일치하였다. 불완전하게 푸코오스화된 폴리락토오사민을 함유하는 O-글리칸은 엔도-β-갈락토오시다아제에 대하여 민감하다.
P-10-2a 글리칸에 대하여 예측된 푸코오스화 양상을 확인하기 위하여,3H-Fuc-P-10-2a 글리칸이3H-Fuc-PSGL-1로부터 제조되었다. 뉴라미니다아제로 처리한 후, 탈시알화3H-Fuc-글리칸은 탈시알화3H-GlcN-P-10-2a 글리칸과 함께 이동하였다. 탈시알화3H-Fuc-P-10-2a 글리칸이 스트렙토미세스 α1,3/4-푸코오시다아제로 처리될 때, 방사능 Fuc의 약 1/3이 떨어져 나왔다. 상기 결과는 가정된 글리칸 구조 및 단지 폴리푸코오스화 글리칸 내의 끝에서 두 번째 GlcNAc 잔기로부터 Fuc를 제거할 수 있는 스트렙토미세스 α1,3/4 푸코오시다아제의 특이성을 바탕으로 예측되었다(마에무라 및 후쿠다, 1992, J. Biol. Chem. 267, 24379-24386; 사노 일행, 1992, J. Biol. Chem. 267, 1522-1527). 일괄하면, 상기 자료는 P-10-2a 글리칸이 세 개의 Fuc 잔기를 함유하며, 이 중 하나는 말단 락토오사민 단위에 있음을 증명하였다.
P-10-2a 글리칸은 모노시알화되며, 두 개의 가능한 하기 구조(a 또는 b)중 하나를 가질 수 있다:
(a)
(b)
상기 가능성을 구별하기 위하여,3H-GlcN-P-10-2a 시알화 글리칸을 뉴라미니다아제의 존재 또는 부재하에서 β-갈락토오시다아제, β-N-아세틸헥속사미니다아제 및 스트렙토미세스 α1,3/4-푸코오시다아제의 혼합물로 처리하였다. 구조 (a)는 완전한 절단을 위하여 다른 효소와 함께 뉴라미니다아제를 필요로 하는 반면, 구조 (b)는 뉴라미니다아제 없이 엑소글리코오시다아제에 의해 분해될 것으로 예측되었다. 뉴라미니다아제만으로 처리된3H-GlcN-P-10-2a는 방사표지된 NeuAc를 방출하였다. 글리칸이 뉴라미니다아제 없이 β-갈락토오시다아제, β-N-아세틸헥속사미니다아제 및 스트렙토미세스 α1,3/4 푸코오시다아제의 혼합물로 처리될 때, 방사능이 방출되지 않았다. 다른 엑소글리코오시다아제와 함께 뉴라미니다아제를 포함하는 것은 글리칸을 완전히 분해하여3H-NeuAc,3H-GlcNAc 및3H-이당 Galβ1→3GalNAcOH를 유리시켰다. 일괄하면, 상기 결과는 P-10-2a 글리칸에서 단일 시알산 잔기가 구조 (a)에 나타낸 바와 같이, 폴리락토오사민 사슬의 말단 위치에 존재하며, 이들 글리칸은 sLex구조를 갖는다는 것을 증명하였다(도 7).
P-10-3 글리칸의 엔도- 및 엑소글리코오시다아제 처리
P-10-3 글리칸은 주로 중성 또는 모노시알화 종이었다. 우세한 종(약 80의 방사능)은 비시알화되었다. P-10-3 분획은 뉴라미니다아제로 처리하고, 떨어져 나온 시알산은 QAE-Sephadex에서 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 탈시알화 종의 약 90%는 표준 코어-2 사당 Galβ1→4GlcNAcβ1→6(Galβ1→3)GalNAcOH와 함께 이동하였으며, 나머지는 코어-1 이당 Galβ1→3GalNAcOH와 함께 이동하였다(도 6). 탈시알화 P-10-3 글리칸을 β-갈락토오시다아제로 처리하는 것은 주요 피이크의 이동성을 예상된 삼당 표준물의 피이크로 이동시켰다(도 6). β-갈락토오시다아제 및 β-N-아세틸헥속사미니다아제의 조합으로 처리하는 것은 유리3H-GlcNAc 및3H-Galβ1→3GalNAcOH를 생성시켰다(도 6). P-10-3 글리칸에서 방사표지물의 약 20%는 뉴라미니다아제 처리에 의해 중성 종으로 전환되는 모노시알화 종이 우세한 것으로 밝혀졌다. 상기 결과는 P-10-3 글리칸이 주로 중성 코어-2 사당이며 몇몇은 모노시알화 코어-2 오당임을 증명하였다(도 7). 게다가, 중성 글리칸의 몇몇은 코어-2 이당 구조를 가졌다(도 7).
HL-60 세포의 PSGL-1에서 O-글리칸의 상대적인 비율
PSGL-1에서 O-글리칸의 상대적인 비율은 각 O-글리칸에서 회수된 방사능의 양 및3H-GlcN:3H-GalNOH:3H-NeuAc의 상대적인 몰비 1.0:0.8:0.7로부터 계산할 수 있다(도 7). PSGL-1에서 대부분의 O-글리칸은 코어-2 구조를 함유하였다. P-10-2b1및 P-10-2b2에서 회수된 소수의 글리칸은 sLex결정자를 함유하였다.
III. 결론
본 연구는 인간 HL-60 세포의 PSGL-1이 코어-2 모티프와 함께 O-글리칸을 함유함을 증명하였다. 대부분의 글리칸은 푸코오스화되어 있지 않으며, 중성 및 시알화 종의 혼합물이었다. 소수의 O-글리칸(약 14%)은 푸코오스화되어 있으며, 말단 sLex구조를 함유하였다. 두 종류의 푸코오스화 O-글리칸이 존재하였으며; 한 종류는 폴리락토오사민이 결핍된 디시알화 칠당이고, 다른 한 종류는 폴리락토오사민을 함유하는 독특한 모노시알화, 트리-푸코오스화 글리칸이었다. HL-60 세포의 PSGL-1에서 코어-2 O-글리칸의 존재는 인간 호중구의 PSGL-1의 당화에 관한 연구 결과와 일치하였다. 인간 호중구 및 HL-60 세포의 탈시알화 PSGL-1은 단지 탈시알화 코어-1 글리칸을 절단하는 엔도-α-N-아세틸갈락토오사미니다아제(O-글리카나아제)의 처리에 대하여 내성이 있었다. HL-60에서 유도된 PSGL-1에서 O-글리칸의 sLex결정자 및 폴리락토오사민을 직접 증명하는 것은 상기 구조가 호중구에서 유도된 PSGL-1의 O-글리칸에 존재한다는 간접적인 증거를 보강하였다.
중요한 차이가 HL-60 세포의 PSGL-1 및 CD43의 O-글리칸에서 관찰되었다. 비록 상기 두 단백질이 주로 코어-2 O-글리칸을 가지고 있지만, PSGL-1은 중성 코어-2 사당을 많이 가지는 반면, CD43은 대부분 디시알화 코어-2 육당을 가지고 있었다. 코어-2 구조는 O-글리칸에서 폴리락토오사민 합성에 대한 전구체이지만, 단지 PSGL-1은 상당한 양의 폴리락토오사민을 가지고 있었다. 이는 코어-2 구조가 필요하지만 폴리락토오사민 첨가에 있어서는 충분하지 않음을 나타낸다. 또한, CD43은 PSGL-1에서 발견된 두 종의 푸코오스화 O-글리칸이 결핍되었다. 비록 모노푸코오스화 O-글리칸이 CD43에서 확인되었지만, 상기 종은 CD43에서 단지 0.5%의 O-글리칸을 나타낸다. PSGL-1에서 확인된 트리푸코오스화 모노시알화 O-글리칸은 CD43에서는 발견되지 않았다.
상술한 바와 같이, P-셀렉틴은 다양한 황화 글리칸에 약하게 결합할 수 있으며, 이들 글리칸은 인간 골수 세포에 대한 P-셀렉틴의 결합을 억제시켰다. 그러나, PSGL-1의 O-글리칸은 황화되지 않았다. 대신, PSGL-1은 E-셀렉틴이 아닌 P-셀렉틴과의 상호작용에 필요한 티로신 술페이트를 함유하였다. 티로신 황화를 위한 세 개의 콘센서스 위치는 46, 48 및 51 잔기에서 PSGL-1의 아미노산 말단에 생겼다. PSGL-1에 대한 mAb인 PL1은 P-셀렉틴에 대한 결합을 방해하며, 티로신 황화 위치와 중첩되는 49-62 잔기에 걸쳐있는 에피토프를 인식하였다. 티로신 황화 위치 근처에 44 및 57 잔기에서 잠재적인 O-당화 위치를 나타내는 두 개의 Thr 잔기가 있었다. PSGL-1이 FTIII 또는 FTVII와 함께 COS 세포에서 공발현될 때, 상기 잔기에서의 돌연변이는 P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합을 감소시켰다. 이들 결과는 티로신 술페이트 잔기와 연결된 단지 하나 또는 두 개의 O-글리칸이 P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 고 친화성 결합을 향상시키기에 충분할 수 있음을 시사한다. 그러나, 본자의 다른 영역에 있는 O-글리칸도 또한 P-셀렉틴 및 E-셀렉틴과의 상호작용에 기여할 수 있다.
원래 뮤신형 당단백질은 셀렉틴에 의해 인식되도록 많은 O-글리칸이 군집될 수 있는 편리한 스캐폴드로 작용하는 것으로 제안되었다. 그러나, 상기 자료는 다른 연구와 함께 뮤신형 당단백질이 상이하게 당화된다는 것을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 셀렉틴 매개 염증의 억제제, 특히 PSGL-1로부터 유도된 억제제, P-셀렉틴에 대한 리간드, 및 PSGL-1로부터 유도된 신규 과당에 관한
PSGL-1의 티로신 술페이트, 특히 하나 이상의 잔기(46, 48, 51)는 시알화 및 푸코오스화 글리칸, 가장 바람직하게는 Thr-57과 함께 작용하여 P-셀렉틴과 고 친화성 결합을 매개한다.
서열
(1) 일반 정보:
(i) 출원인: 보오드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 오클라호마
(ii) 발명의 명칭: 셀렉틴 매개 염증의 펩티드 및 O-글리칸 억제제
(iii) 서열의 개수: 5
(iv) 연락처 주소:
(A) 수신인: 파트레아 엘. 파브스트
(B) 거리: 웨스트 피치트리 스트리트 1201 원 아틀랜틱 센터 2800
(C) 도시: 아틀랜타
(D) 주: 조오지아
(E) 국가: 미합중국
(F) 우편번호: 30306-3450
(v) 컴퓨터 판독가능 형태:
(A) 매체 형태: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.25
(vi) 현 출원 자료:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(viii) 변호사/대리인 정보:
(A) 성명: 파브스트, 파트레아 엘.
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(C) 참조/소송 번호: OMRF110CIP7
(ix) 통신 정보:
(A) 전화: (404) 873-8794
(B) 팩스: (404) 873-8795
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 402 아미노산
(B) 종류: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 펩티드
(xi) 서열 기술:
서열 1
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 2042 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: cDNA
(xi) 서열 기술:
서열 2
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 2102 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: cDNA
(xi) 서열 기술:
서열 3
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 34 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: DNA
(xi) 서열 기술:
서열 4
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: DNA
(xi) 서열 기술:
서열 5

Claims (27)

  1. 디시알화, 모노푸코오스화 글리칸
    (식중, R은 H, OH, 또 다른 당 또는 아미노산과 같은 아글리콘임) 및
    폴리락토오사민 주쇄를 갖는 모노시알화, 트리푸코오스화 글리칸
    (식중, R은 H, OH, 또 다른 당 또는 아미노산과 같은 아글리콘임)로 구성된 군으로부터 선택된 O-글리칸.
  2. 제 1항에 있어서, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하기 위하여 의약적으로 수용가능한 캐리어를 추가로 포함하는 O-글리칸.
  3. 디시알화, 모노푸코오스화 글리칸 및 폴리락토오사민 주쇄를 갖는 모노시알화, 트리푸코오스화 글리칸으로 구성된 군으로부터 선택된 O-글리칸의 염증을 억제하기 위하여 이를 필요로 하는 개인에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, P-셀렉틴 결합에 의해 매개된 염증을 억제하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, O-글리칸이 디시알화, 모노푸코오스화 글리칸
    (식중, R이 H, OH, 또 다른 당 또는 아미노산과 같은 아글리콘임) 및
    폴리락토오사민 주쇄를 갖는 모노시알화, 트리푸코오스화 글리칸
    (식중, R은 H, OH, 또 다른 당 또는 아미노산과 같은 아글리콘임)로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    글리칸이
    및
    로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  6. 자연 그대로의 세포가 모두 발현하지는 않는 푸코오실트랜스퍼라아제 및 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제를 발현하는 진핵 세포를 포함하는 발현계.
  7. 제 6항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인 계.
  8. 제 6항에 있어서, 효소가 인간 글리코오실트랜스퍼라아제인 계.
  9. 제 6항에 있어서, 두 글리코오실트랜스퍼라아제가 모두 재조합 DNA 또는 RNA 분자로부터 발현되는 계.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 세포가 PSGL-1을 코딩하는 재조합 DNA 분자 또는 이의 단편으로 형질감염된 계.
  11. 제 10항에 있어서, 푸코오실트랜스퍼라아제가 α1/3-1-4 푸코오실트랜스퍼라아제(FTIII)인 계.
  12. 푸코오실트랜스퍼라아제 및 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제를 발현하는 진핵 세포에서 발현된 P-셀렉틴에 결합하는 재조합 PSGL-1 또는 이의 단편.
  13. 제 12항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인 PSGL-1.
  14. 제 12항에 있어서, 글리코오실트랜스퍼라아제가 인간 트랜스퍼라아제인 PSGL-1.
  15. 제 12항에 있어서, 푸코오실트랜스퍼라아제가 α1/3-1-4 푸코오실트랜스퍼라아제(FTIII)인 PSGL-1.
  16. 하나 이상의 티로신 잔기가 황화(-SO4)되고, 하나 이상의 O-결합 당화 위치가 존재하는, 서열 1의 티로신 잔기 46, 48 및 51을 포함하는 P-셀렉틴에 결합하는 황화, 당화된 펩티드.
  17. 제 16항에 있어서, 세 개의 티로신 잔기 모두가 황화된 펩티드.
  18. 제 16항에 있어서, O-결합 당화에 적합한 트레오닌 또는 세린을 포함하는 펩티드.
  19. 제 18항에 있어서, 트레오닌이 서열 1의 트레오닌 잔기 44, 57, 69 및 70에 해당하는 펩티드.
  20. 제 16항에 있어서, 서열 1의 티로신 잔기 46에서 다음의 N- 또는 O-결합 당화 위치까지의 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
  21. 제 16항에 있어서, 서열 1의 42 내지 57, 42 내지 67, 42 내지 69, 42 내지 70, 42 내지 73, 42 내지 77, 42 내지 80, 42 내지 81, 42 내지 82, 42 내지 90, 42 내지 91, 42 내지 100, 42 내지 103, 42 내지 104에 해당하는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되고, 펩티드 내에 P-셀렉틴에 대한 펩티드의 결합을 감소시킬 수있는 황화 티로신 또는 탄수화물 부착을 변화시키지 않는 보존적 치환을 갖는 펩티드.
  22. 제 16항에 있어서, 의약적으로 수용가능한 캐리어를 추가로 포함하는 펩티드.
  23. 제 16항에 있어서, 탐지가능한 표지물질을 추가로 포함하는 펩티드.
  24. α1-3 푸코오실트랜스퍼라아제, α1-4 푸코오실트랜스퍼라아제 또는 α1/3-1-4 푸코오실트랜스퍼라아제(FTIII) 및 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제를 발현하는 진핵 세포에서 발현된 P-셀렉틴에 결합하는 재조합 PSGL-1 또는 이의 단편 및 하나 이상의 티로신 잔기가 황화(-SO4)되고, 하나 이상의 O-결합 당화 위치가 존재하는 서열 1의 티로신 잔기 46, 48 및 51을 포함하는 P-셀렉틴에 결합하는 황화, 당화 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되고, PSGL-1 또는 이의 단편의 염증을 억제하기 위하여 이를 필요로 하는 개인에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, P-셀렉틴 결합에 의해 매개된 염증을 억제하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 황화, 당화된 펩티드가 α1-3 푸코오실트랜스퍼라아제, α1-4 푸코오실트랜스퍼라아제 또는 α1/3-1-4 푸코오실트랜스퍼라아제(FTIII) 및 코어 2 β1-6-N-아세틸글루코오사미닐트랜스퍼라아제를 발현하는 진핵 세포에서 발현되는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포이고 글리코오실트랜스퍼라아제가 인간 글리코오실트랜스퍼라아제인 방법.
  27. 제 24항에 있어서, 펩티드가 서열 1의 42 내지 57, 42 내지 67, 42 내지 69, 42 내지 70, 42 내지 73, 42 내지 77, 42 내지 80, 42 내지 81, 42 내지 82, 42 내지 90, 42 내지 91, 42 내지 100, 42 내지 103, 42 내지 104에 해당하는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 펩티드가 P-셀렉틴에 대한 펩티드의 결합을 감소시킬 수 있는 황화 티로신 또는 탄수화물 부착을 변화시키지 않는 보존적 치환을 펩티드 내에 갖는 방법.
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