JP5331293B2

JP5331293B2 - 多様性を表現するオリゴ糖またはその誘導体

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Publication number: JP5331293B2
Application number: JP2006127109A
Authority: JP
Inventors: 純子天野; 大介菅原
Original assignee: Noguchi Inst
Current assignee: Noguchi Inst
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2026-04-28
Also published as: JP2007297521A

Description

本発明は、生体の機能発現の多様性を制御する新規な糖鎖構造を含むオリゴ糖またはその誘導体に関するものである。また、新規な糖鎖構造を含むオリゴ糖またはその誘導体に関し、更には、新規な糖鎖構造を含む単離精製もしくは合成されたオリゴ糖またはその誘導体に関するものである。

「糖鎖」または「オリゴ糖」とは、単独でまたはタンパク質（ペプチドを含む）や脂質等に結合して存在し、構造多様性を持つ分子である。そして、天然に存在する混合物中のある糖鎖の構造や、特定の機能を有することがわかっている組成物中に含まれる糖鎖の構造が判明すれば、その糖鎖またはその糖鎖の誘導体を常法に従って合成することによって、特定の機能を有する糖またはその糖を含有する組成物等を工業的に得ることが可能になる。

また、ある特定の機能を有すると思われる糖鎖の構造が判明すれば、その糖は、周辺物質の開発または周辺物質の構造同定の標準物質として産業上重要なものとなる。

しかしながら、糖鎖は、分子量および組成が同一の構造異性体が存在するので、単離同定が困難で容易には詳細な構造情報が得られない。また、糖鎖の生合成は、糖転移酵素、糖分解酵素、糖供与体合成酵素、糖供与体輸送タンパク質等、様々なタンパク質が関与するので、それらの遺伝子発現を解析するだけでは構造が判明しない。

そこで、構造が既知である標準糖鎖を天然から調製し、または化学的あるいは酵素学的に合成して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や質量分析等で解析したデータを集積して、未知糖鎖を解明する手がかりとすることが行われている。しかし、ポリラクトサミンが伸長した比較的単純な構造は、天然からの単離や合成が容易であるため入手しやすいが、分岐構造をもつ糖鎖や、様々なフコース修飾を有する糖鎖については、単離されたり、合成されたり、構造が同定されたりした種類が未だ不十分であるのが現状である。

一方、例えば、ヒト母乳には様々なオリゴ糖が含まれていることが知られている。このオリゴ糖は遊離のまま存在し、上皮細胞の糖タンパク質糖鎖を合成する系と同一の系で合成されるので、構造類似性が極めて高い。従って、ヒト母乳中のオリゴ糖は上皮細胞が発現し得る極めて多様な糖鎖のライブラリーといえる。

そこで、ヒトミルクオリゴ糖の解析は古くから行われており、ユニークな構造が報告されてきたが、数百種以上あるといわれる構造多様性のためにまだその全貌は明らかにはなっていない。現在、比較的含有量が大きく構造が複雑でない３−６糖の同定は、ＨＰＬＣでの一斉分析が行われている。また、多量に得られたものはＮＭＲ解析も適用されている。しかしながら、上皮上糖鎖の多様性を担うと思われる、より分子量が大きく複雑な構造は、ごく一部が判明している他は質量測定による分子量情報のみが得られているにすぎなかった。

例えば、非特許文献２にあるように、１０糖（デカオース）にフコースが２個結合したと思われる分子量のオリゴ糖等が質量測定で観測されているが、ミルクオリゴ糖は分岐構造の有無や、フコース・シアル酸の結合が異なる等異性体が多岐にわたることが特徴であるので、質量測定による分子量情報だけでは構造同定は不可能であった。

また、ＮＭＲにより同定されたデカオース以上のミルクオリゴ糖は、非特許文献１にある下記の構造（１）、および、非特許文献３にある下記の構造（２）だけであった。

Chai. et al., Arch. Biochem.Biophys., 434, 116-127 (2005) Dreisewerd, K.et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 139-150 (2006) Chai. et al.,Anal. Chem., 78, 1581-1592 (2006)

例えば、ヒト母乳中のオリゴ糖は脂質に次いで含量が多く、未成熟な新生児の栄養源および生体防御に重要な役割を果たしている。ヒトミルクオリゴ糖は、外界と接してバリアーやアンテナとなっている上皮細胞表面の複合糖質糖鎖と類似の構造を持ち、遊離型で多量に存在することによって、細胞間相互作用の調節や病原性微生物の上皮への接着を阻害している。

また、実際にすでに分離同定されたヒトミルクオリゴ糖の中には、血液型抗原、分化抗原、癌関連抗原、接着分子リガンド等と同じ構造が含まれていることが報告されている。すなわち、ヒトミルクオリゴ糖は上皮細胞が発現しうる極めて多様な糖鎖のライブラリーである。

特定の疾患に関連する糖鎖としては、具体的には、ＡＢＯ式血液型抗原やＬｅｗｉｓ式血液型抗原がある。これら糖鎖抗原はフコースを含み様々な生物活性や疾患に関与している。これらの糖鎖は血球表面だけでなく上皮組織や分泌液中の糖鎖、糖脂質、糖タンパク質等にも発現し、炎症性疾患、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、ウイルス性疾患、癌性疾患、感染性疾患、心臓疾患、高コレステロール血症等と重要な関係にある。

例えば、コレラ菌、サルモネラ菌、ヘリコバクターピロリ菌、カンピロバクター菌、インフルエンザウイルス、ノーウォークウイルス、リノウイルス、エコウイルス等の感染症で、血液型との相関が報告されている。ここに挙げた例を含め、多くの病原性微生物と、フコースおよび／またはシアル酸を含む糖鎖や血液型抗原糖鎖との直接の相互作用が確認されている。

大腸癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、肝癌、膵癌等の癌でも、フコースおよび／またはシアル酸を含む抗原や血液型抗原の発現変化が認められている。その発現変化は前癌状態から起こり、病気の進行や治療と密接に関連し、病態と高い相関がある。

また、心臓疾患のリスクも血液型と相関する。血中コレステロールやＬＤＬ値、血圧が血液型と相関することや、血液凝固因子の活性が血液型抗原によって影響することが要因であるとされる。

さらに、特定疾患が自己免疫疾患に起因しており、且つ血液型と相関があるとされている疾患の例として、小児脂肪症、インスリン非依存型糖尿病、グレーブス病、硬直性脊椎症等が挙げられる。

そのほかにも、発生や分化の特定の段階でフコースおよび／またはシアル酸を含む様々な抗原が発現することが明らかになっており、細胞の機能発現に重要である。

しかしながら、背景技術に記載した通り、かかる糖鎖の構造は殆ど判明していなかった。

すなわち、本発明の課題は、オリゴ糖の構造を解析して、知られていない構造を有するオリゴ糖またはその誘導体を提供することであり、特にグライコミクスおよびグライコプロテオミクスに有用な多様性を表現する標準糖鎖を提供することである。すなわち、未知糖鎖を解明する手がかりとなる構造解析用として用いられる標準糖鎖としてのオリゴ糖またはその誘導体を提供することである。また、新規な糖鎖構造を含む単離精製もしくは合成されたオリゴ糖またはその誘導体に関するものである。

更には、その構造が判明した糖鎖を用いた構造解析方法、炎症性疾患、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、ウイルス性疾患、癌性疾患、感染性疾患、心臓疾患等の診断方法または治療方法、上皮細胞の識別方法等を提供することである。

オリゴ糖またはその誘導体を含有する種々の機能を有する、各種構造解析法の標準物質、炎症性疾患、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、ウイルス性疾患、癌性疾患、感染性疾患、心臓疾患等診断用もしくは治療用医薬、飲料、食品、化粧料等の原料等の組成物を提供することである。

本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、分岐を有し、様々な疾患マーカーとなりうるフコース結合を発現している多様なオリゴ糖の構造を見出して、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
（１）Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）を４個以上有し、
（２）ガラクトースで分岐する構造を１個以上有し、
（３）フコースを２個以上有する
構造を含むオリゴ糖またはその誘導体を提供するものである。以下、上記（１）、（２）および（３）を満たす基本構造を有するものを「オリゴ糖−１」と略記する。

また、本発明は、
（１）Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）を４個以上有し、
（２）ラクトース（Ｇａｌ−Ｇｌｃ）を１個以上有する
構造を含むオリゴ糖またはその誘導体（ただし、下記の構造（１）および（２）で示されるものを除く）を提供するものである。以下、上記（１）および（２）を満たす基本構造を有するものを「オリゴ糖−２」と略記する。

また、本発明は、下記の構造（３）で示される構造を含む上記のオリゴ糖またはその誘導体（ただし、上記の構造（１）および（２）で示されるものを除く）を提供するものである。以下、かかる基本構造を有するものを「オリゴ糖−３」と略記する。

［構造（３）中、Ｒ１〜Ｒ８は、互いに同一でも異なっていてもよい、水素またはフコースを示し、ｍ／ｎ（ｍ、ｎは１〜６の整数）なる標記は、それぞれ独立してｍまたはｎの位置に結合していることを示す。］

また、本発明は、
（１）Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）を５個以上有し、
（２）ラクトースを１個以上有する
構造を含むオリゴ糖またはその誘導体を提供するものである。以下、上記（１）および（２）を満たす基本構造を有するものを「オリゴ糖−４」と略記する。

また、本発明は、下記の構造（４）で示される構造を含むオリゴ糖またはその誘導体を提供するものである。以下、かかる基本構造を有するものを「オリゴ糖−５」と略記する。

［構造（４）中、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一でも異なっていてもよい、水素またはフコースを示し、ｍ／ｎ（ｍ、ｎは１〜６の整数）なる標記は、それぞれ独立してｍまたはｎの位置に結合していることを示す。］

また、本発明は、上記の構造を含むオリゴ糖またはその誘導体であって、単離精製されたオリゴ糖またはその誘導体を提供するものである。

また、本発明は、上記の構造を含むオリゴ糖またはその誘導体であって、合成されたオリゴ糖またはその誘導体を提供するものである。

また、本発明は、糖鎖の構造解析の標準糖鎖として用いられる上記の構造を含むオリゴ糖またはその誘導体を提供するものである。

また、本発明は、上記の構造を含むオリゴ糖またはその誘導体を標準糖鎖として用いることを特徴とする糖鎖の構造解析方法を提供するものである。

また、本発明は、上記の構造を含むオリゴ糖またはその誘導体を用いることを特徴とする疾患診断薬もしくは治療薬をスクリーニングする方法、上皮細胞の識別方法を提供するものである。

また、本発明は、上記の構造を含むオリゴ糖またはその誘導体を含有することを特徴とする構造解析の標準物質、治療用もしくは診断用医薬品、食品、飲料または化粧料を提供するものである。

本発明によれば、糖タンパク質糖鎖構造と類似の多様性を有し、様々な疾患マーカーとなり得るフコース結合やシアル酸結合を発現している多様なオリゴ糖またはその誘導体を提供でき、グライコミクスおよびグライコプロテオミクスに有用な標準糖鎖が提供されることによって、糖タンパク質の機能解明や病態の解明に有用な情報を得ることができる。

本発明によって、様々な細胞から糖鎖を切り出して調製して得たオリゴ糖と同様の構造をもつミルク中の多種類のオリゴ糖を分離し構造決定し、また他の新規糖鎖解析法の標準糖鎖として供与することが可能である。本発明によって、ポストゲノムの重要課題である機能グライコミクスおよびグライコプロテオミクス推進に有用な基盤を提供することができる。

また、その構造が判明した糖鎖を用いた構造解析方法、炎症性疾患、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、ウイルス性疾患、癌性疾患、感染性疾患、心臓疾患等の診断方法もしくは治療方法、上皮細胞の識別方法等を提供することができる。

また、オリゴ糖またはその誘導体を含有する種々の機能を有する、各種構造解析法の標準物質、炎症性疾患、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、ウイルス性疾患、癌性疾患、感染性疾患、心臓疾患等の治療用医薬；食品、飲料または化粧料原料等の組成物を提供することができる。

「オリゴ糖またはその誘導体」とは、本発明をもとに天然から分離精製して同定したオリゴ糖構造に、さらに糖が結合してもよいし、そのオリゴ糖にアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質が結合してもよいし、ポリマー等に１種類または多種類のオリゴ糖が結合していてもよいし、オリゴ糖に化学的または酵素学的にアルキル基、カルボニル基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、アミド基等が導入されていてもよい。

＜同定方法＞
本発明は、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５の基本構造を含むオリゴ糖又はその誘導体であり、また、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５の基本構造を含む単離精製もしくは合成されたオリゴ糖またはその誘導体であるが、以下にその同定法を具体的に詳述する。

すなわち、オリゴ糖を標識あるいはそのままｎｅｇａｔｉｖｅ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ測定を行う。以下、ピレン標識されたオリゴ糖について述べるが、この標識法に限られるものではない。なお、ピレン標識は実施例記載の方法で行う。

構造の同定は、例えば、以下の構造（５）に示したような母核が１０糖であるオリゴ糖は、Ａ（環が切断されて生じた非還元末端側のフラグメント）、Ｄ、Ｙ（グリコシド結合が切断されて生じた還元末端側のフラグメント）タイプのプロダクトイオンを検出することによって行った。

すなわち、Ｒ１およびＲ４にフコースが存在するかどうかは、囲んだ部分のＤイオンあるいはＡ１イオンのｍ／ｚがわかればよい。また、Ｒ７がＨの場合は、Ａ２イオンが生じ、そのｍ／ｚによってその先の分岐側鎖にいくつのフコースが存在するかが判明する。Ｙイオンは、主に３分岐側鎖が切断した残りの母核８糖にフコースがいくつ有しているかを示す。表１にそれぞれのイオンにフコースが結合した場合のｍ／ｚを示す。

以上のイオンからフコースの側鎖上の分布を解析した。

次に、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３にフコースが結合した場合は、Ｆｕｃ−Ｇａｌの２糖が遊離するので、Ｃイオン（ｍ／ｚ３２５）、あるいはプレカーサーイオンやプロダクトイオンから３２５少ないＺイオンが検出される。

また、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６にフコースが結合し、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）構造を有する時は、ｍ／ｚ３６４が検出され、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）構造を有する時は、ｍ／ｚ３４８が検出される。

本発明の別の態様は、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５、またはそれらの誘導体であって、新規な「単離精製されたオリゴ糖またはその誘導体」である。本発明によって、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５の構造が判明したので、単離精製は常法に従って、ヒトの母乳等から例えば実施例に示した方法によって単離精製できる。

オリゴ糖誘導体も新規物質である。更に、本発明により構造が分かれば、その物質およびその物質の誘導体は常法に従って合成できる。従って、本発明の別の態様は、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５、またはそれらの誘導体であって、新規な「合成されたオリゴ糖またはその誘導体」である。本発明に係る新規な「オリゴ糖誘導体」、「単離精製されたオリゴ糖またはその誘導体」「合成されたオリゴ糖またはその誘導体」は、特にヒト母乳に含まれるオリゴ糖に構造が類似しているので、ヒト母乳またはヒト母乳中の特定成分が持つと考えられている前記特定の機能や効果を奏するものであり、極めて有用である。

以上のようにして、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５の構造が判明したので、その糖鎖またはその糖鎖の誘導体を常法に従って合成することによって、特定の機能を有する糖またはその糖を含有する組成物等を工業的に得ることができる。オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５は、消化管上皮において病原性微生物が付着するのを阻止する感染防御分子としての機能、ビフィズス菌の増殖分子としての機能、また、腸管免疫細胞の機能発現の調節分子としての機能等を有することが分かっているヒト母乳から得られたものであるので、種々の感染防御機能を有することが期待される。

更には、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５を用いた構造解析方法は、液体クロマトグラフィー、質量分析法、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、糖鎖チップ、レクチンアレイ、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴法等である。

オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５の基本構造を含有するマススペクトル用の標準物質は、未知試料のマススペクトルと比較することによって、同一構造をもつ、あるいは同一部分構造をもつことで構造を推定することができる。

また、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５を有効成分として、常法に従って炎症性疾患、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、ウイルス性疾患、癌性疾患、感染性疾患、心臓疾患等を診断したり、予防したり、治療したりする目的の薬剤を得ることができる。

また、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５を含む構造を抗原として抗体を調製したり、特異的に結合する分子を調製したりすることによって、それらの抗体や分子を利用して診断、治療や上皮細胞の識別ができる。

また、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５を含む構造を固定した分子を用いることによって、上皮細胞の識別やオリゴ糖に特異的に結合する分子の調製ができる。

また、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５を含むオリゴ糖またはその誘導体を有効成分として、常法に従って配合させることによって、種々の食品；飲料；化粧液、乳液、クリーム等の化粧料を得ることができる。

オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５は、本発明により構造が判明したので、その工業的大量合成は常法に従って可能である。また、種々の用途物に対しては、かかるオリゴ糖またはその誘導体を配合すればよいだけであるので、常法に従って製造すれば上記本発明の用途物・組成物が得られる。

オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５の上記した方法、用途および組成物としての使用は本発明の範囲であり、常法に従って配合すればよいだけであるので、その限りにおいては、かかる使用は本明細書の記載で明確である。また、ヒト母乳を配合することは知られていたとしても、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−５のみを単離または合成して、それを有効成分として、または主成分として配合した本発明の各種製品は新規なものである。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
＜ミルクオリゴ糖の調製方法＞
脂肪およびタンパク質を除くために、メタノール−クロロホルム抽出を行った。ヒト母乳２５０ｍＬに対し、２倍容量のメタノールをおよび３倍容量のクロロホルムを加え、十分な撹拌を行った後、遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分間）を行った。

糖鎖を含む水相を回収し、粗オリゴ糖画分を得た。粗オリゴ糖画分をゲル濾過クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５、アマシャムバイオサイエンス社、５．０×６６．７ｃｍ）を行ない、溶出には高純水を用いた。フェノール−硫酸法によりヘキソースを検出し、ラクトースより大きいオリゴ糖を集めた。中性オリゴ糖と酸性オリゴ糖を分離するため、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ、東ソー社、１．６×９．７ｃｍ）を行ない、中性オリゴ糖は高純水で、酸性オリゴ糖は、１００、２００、３００、４００、５００ｍＭの酢酸ピリジン（ｐＨ５）により溶出した。

中性オリゴ糖画分をゲル濾過クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５、アマシャムバイオサイエンス社、５．０×６６．７ｃｍ）により分離する。デカオースより大きい糖鎖が含まれる画分を１−ピレンブタン酸ヒドラジドで標識し、Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ（ＡＡＬ）−アガロースカラム（Ｊ−オイルミルズ社：直径４．６ｍｍ×長さ３ｃｍ、ベッド容量２ｍＬ）を用いてフコース結合糖鎖を分画した。

５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し、さらにフコース（０．５ｍＭ）を加えた５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。さらに、逆相カラムとして、ＩｎｅｒｔｓｉｌＷＰ−３００Ｃ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍｌｏｎｇ、ジーエルサイエンス社）を２本連結して用いた高速液体クロマトグラフィー（２５％アセトニトリル、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃）によって、種々のオリゴ糖を分離精製した。このようにして下記のＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤＤ１を得た。

なお、上記「ピレン標識」は以下のように行った。すなわち、試料をねじふた付きガラス反応管に加え乾固させ、５００ｎｍｏＬの１−ピレンブタン酸ヒドラジド（以下、「ＰＢＨ」と略記する）をメタノール２０μＬに溶解して反応管に加え、更に、メタノールで希釈した酢酸（酢酸とメタノールの比は体積比で１：８）２μＬを加えてふたを完全に閉めた。よく撹拌後、８０℃で２０分間加熱し、１ＭのＮａＯＨ水溶液加えて中和した。１．７ＭのＮａＢＨ_４溶液３０μＬを加えて４０℃で３０分間反応させ、更に１．７ＭのＮａＢＨ_４溶液１０μＬを加えて４０℃で３０分間反応させた。次いで、過剰の試薬を除去するために以下の操作を行った。純水４００μＬおよびクロロホルム４００μＬを加えてよく振った後静置した。下層のクロロホルムを捨て、新しいクロロホルム４００μＬを加えてもう一度抽出した。上層を取り乾固させた。Ｓｅｐ−ｐａｋＣ_１８カートリッジをメタノール続いて純水で洗浄し、乾固した反応物を純水に溶解してカートリッジに通した。純水でカートリッジを洗浄し、次に、アセトニトリル−純水（体積比６：４）で溶出することによって、ＰＢＨで標識、還元された、上記のピレン標識オリゴ糖を得た。

＜テトラフコシルデカオース異性体の同定＞
互いに分子量および組成式が同一で構造異性体の関係にあるピレン標識テトラフコシルデカオースＤ１およびＤ２をＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳで測定した。

［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ２６７１を選択してＭＳ／ＭＳ測定を行った。結果を図１に示す。図１の（ａ）はＤ１から得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ／ＭＳスペクトルであり、図１の（ｂ）はＤ２から得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ／ＭＳスペクトルである。Ｄ１よりｍ／ｚ２１６１、２０１５、１２４３、６７２を検出し、Ｄ２よりｍ／ｚ２１６１、２０１５、１３９０、６７２を検出した。

まず、プリカーサーイオンからラクトサミン側鎖が遊離したＹイオンに着目すると、側鎖にフコースがいくつ結合したものがあるかが判明する。Ｄ１およびＤ２には、ｍ／ｚ２１６１（２６７１−FucHexHexNAc）およびｍ／ｚ２０１５（２６７１−Fuc2HexHexNAc）が検出されたので、フコースが１個結合した側鎖およびフコースが２個結合した側鎖をもつことが分かった。

Ｄ１のＡイオンｍ／ｚ１２４３はフコースが２個結合しているので、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５のいずれかにフコースを有する。Ｄ２のＡイオンｍ／ｚ１３９０はＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５のいずれかにフコースが３個結合していることを示す。また、Ｄ１およびＤ２ともにＤイオンとしてｍ／ｚ６７２が検出されているので、Ｒ１またはＲ４にフコースが１個存在する。またＡイオンが生じたのでＲ７にフコースを有しない。従って、Ｄ１はＲ２またはＲ５にフコースが存在し、Ｄ２はＲ２およびＲ５にフコースが存在する。以上のことから、Ｄ１にはＲ１またはＲ４、Ｒ２またはＲ５、Ｒ３およびＲ６に、Ｄ２にはＲ１またはＲ４、Ｒ３またはＲ６、Ｒ２およびＲ５にフコースが結合していることが分かった。

この物質はオリゴ糖−１、オリゴ糖−２およびオリゴ糖−３の構造を含むオリゴ糖に該当しているものである。従って、オリゴ糖−１、オリゴ糖−２およびオリゴ糖−３の構造を含むオリゴ糖は、母乳または母乳中の特定成分の有する機能・効果を有しているものである。

実施例２
＜トリフコシルデカオース異性体の同定＞
実施例１において、ヒト母乳から得た、最後の分離精製過程の逆相カラム高速液体クロマトグラフィーによって、ピレン標識トリフコシルデカオースＤ３およびＤ４を得た。互いに分子量および組成式が同一で構造異性体の関係にあるＤ３およびＤ４をＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳで測定した。

［Ｍ−Ｈ］⁻イオンであるｍ／ｚ２５２６を選択してＭＳ／ＭＳ測定を行った。結果を図２に示す。図２の（ａ）はＤ３から得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ／ＭＳスペクトルであり、図２の（ｂ）はＤ４から得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ／ＭＳスペクトルである。Ｄ３よりｍ／ｚ２２０１、２０１５、１２４３、６７２、Ｄ４よりｍ／ｚ２２０１、２０１５、１８６９、１２４３、６５６、５２６を検出した。

まず、Fucα1-2Galが遊離した断片、ｍ／ｚ２２０１が得られたので、これらの異性体にはＲ１、Ｒ２またはＲ３にフコースが結合していることがわかる。更に、Ｄ３のｍ／ｚ２０１５、Ｄ４のｍ／ｚ１８６９を選択したＭＳ^３測定で、３２５減少したイオンが得られたことからも、フコースが１個結合した側鎖には、Fucα1-2Galが存在することを裏付けられた。

Ｄ３は、Ｙイオンとしてｍ／ｚ２０１５しか生じないことや、フコースが２個結合したＡイオンｍ／ｚ１２４３、およびフコースを１個有するＤイオンｍ／ｚ６７２が生じたので、全ての側鎖にフコースが１個ずつ結合していることが分かった。Ｄ４では、フコースを有しないＤイオンｍ／ｚ５２６が検出されたので、Ｒ１およびＲ４にはフコースが存在しないことが明らかである。また、Ｄ４には、ｍ／ｚ６５６が検出され、フコースが２個結合した側鎖が存在する。これらのこと、およびＡイオンとしてｍ／ｚ１２４３が検出されたので、Ｄ４はＲ２、Ｒ３、およびＲ５にフコースが結合していることが明らかになった。

実施例３
＜ジフコシルドデカオースの同定＞
実施例１において、ヒト母乳から得た、最後の分離精製過程の逆相カラム高速液体クロマトグラフィーによって下記のジフコシルドデカオースＤＤ１を得て、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳにより測定した。

［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ２７４５をプリカーサーイオンとして選択してＭＳ／ＭＳ測定を実施した。結果を図３に示す。ｍ／ｚ２３８０、２２３４、１８６９、１４６２、１４０３、１０３７、８７５を検出した。Ｙイオンはプリカーサーイオンからラクトサミン側鎖が遊離したことにより生じる。まず、このＹイオンに着目することにより、側鎖に結合したフコース残基数が判明する。ｍ／ｚ２３８０（２７４５−Hex1HexNAc1）およびｍ／ｚ２２３４（２７４５−Fuc1Hex1HexNAc1）が検出されたことから、フコースが０および１結合した側鎖が存在することが示された。

ｍ／ｚ８７５は、Fuc1Hex2HexNAc2の存在を示し、ラクトサミンが２回繰り返された側鎖にフコース１個結合していることを示す。Ｄイオンとして、ｍ／ｚ１０３７が検出されたことは、以下に示した化合物にＲ１、Ｒ４、Ｒ５のいずれか１ヶ所にフコース残基が結合していることを示す。フコース１個のみ結合したＡイオンｍ／ｚ１４６２が検出されたこと、およびもう一つのＤイオンとして、ｍ／ｚ１４０３が検出されたことは、上述したように、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５のいずれか１ヶ所にフコース残基が結合していることに合わせ、Ｒ２およびＲ６およびＲ７にはフコース残基が結合していないことを示す。

更に、Ａイオンｍ／ｚ１４６２を選択してＭＳ^３測定を行うと、Fuc-Galが遊離したｍ／ｚ１１３７が検出され、Ｒ１にフコースが存在することが示された。従って、もう一つのフコース残基は、Ｒ３またはＲ８に結合していることが分かった。

以上の測定結果から、ジフコシルドデカオースＤＤ１は、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ８のうちいずれか１ヶ所にフコース残基が結合している下記の構造であることが明らかになった。

この物質はオリゴ糖−１、オリゴ糖−２、オリゴ糖−３およびオリゴ糖−４の構造を含むオリゴ糖に該当しているものである。従って、オリゴ糖−１ないしオリゴ糖−４、およびそれに類似するオリゴ糖−５の構造を含むオリゴ糖は、母乳または母乳中の特定成分の有する機能・効果を有しているものである。

本発明の特定の構造を有するオリゴ糖は、特にグライコミクスおよびグライコプロテオミクスに有用な多様性を表現する標準糖鎖、すなわち、未知糖鎖を解明する手がかりとなる構造解析用の標準糖鎖として極めて有用であるため、糖タンパク質の機能解明や病態の解明の分野に広く利用されるものである。また、本発明の特定の構造を有する単離されたもしくは合成されたオリゴ糖は、オリゴ糖を配合してなることが知られている種々の用途に広く用いられるものである。

実施例１において得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ／ＭＳスペクトルであり、（ａ）はＤ１から得られたスペクトルを示し、（ｂ）はＤ２から得られたスペクトルを示す。実施例２において得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ／ＭＳスペクトルであり、（ａ）はＤ３から得られたスペクトルを示し、（ｂ）はＤ４から得られたスペクトルを示す。実施例３において得られたＤＤ１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。

Claims

下記の構造（３）で示されるオリゴ糖またはそれがピレン標識されたオリゴ糖（ただし、下記の構造（１）および（２）で示されるものを除く）。

［構造（３）中、Ｒ１〜Ｒ８は、互いに同一でも異なっていてもよい、水素またはフコースを示し、ｍ／ｎ（ｍ、ｎは１〜６の整数）なる標記は、それぞれ独立してｍまたはｎの位置に結合していることを示す。］
糖鎖の構造解析の標準糖鎖として用いられる請求項１に記載のオリゴ糖。
請求項１に記載のオリゴ糖を標準糖鎖として用いることを特徴とする糖鎖の構造解析方法。
請求項１に記載のオリゴ糖を含有することを特徴とする構造解析の標準物質。
請求項１に記載のオリゴ糖を含有することを特徴とする食品、飲料または化粧料。