ES2555056T3 - Diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas y otras usando una enzima generadora de formilglicina (FGE) - Google Patents

Diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas y otras usando una enzima generadora de formilglicina (FGE) Download PDF

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Abstract

Un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa, o el uso de un polipéptido para preparar un medicamento para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa; en el que dicho polipéptido tiene actividad de generación de Cα-formilglicina (actividad de FGE) y: a) tiene una secuencia seleccionada de SEC ID Nº 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, o aminoácidos 34-374 de SEC ID Nº. 2; o b) tiene al menos el 50 % de identidad de secuencia con SEC ID Nº 2; o c) tiene una o más mutaciones de aminoácido conservativas con respecto a un polipéptido como se describe 10 en a) anteriormente o con respecto a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, o aminoácidos 34-374 de SEC ID Nº. 2; o d) es un fragmento de un polipéptido como se describe en cualquiera de a) a c) anteriormente; o e) es una proteína de fusión de cualquiera de a) a d) anteriormente.

Description

Diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas y otras usando una enzima generadora de formilglicina (FGE)
DESCRIPCIÓN
5
Campo de la invención
La presente invención se refiere a usos médicos para el tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas (MSD) y otras deficiencias de sulfatasas, además de a métodos de diagnóstico o pronóstico de tales deficiencias. 10
Antecedentes de la invención
Las sulfatasas son miembros de una familia de genes altamente conservada, que comparten una amplia homología de secuencia (Franco, B., et al., Cell, 1995, 81:15-25; Parenti, G., et al., Curr. Opin. Gen. Dev., 1997, 7:386-391), un 15 alto grado de similitud estructural (Bond, C.S., et al., Structure, 1997, 5:277-289; Lukatela, G., et al., Biochemistry, 1998, 37:3654-64) y una modificación postraduccional única que es esencial para la escisión del éster de sulfato (Schmidt, B., et al., Cell, 1995, 82: 271-278; Selmer, T., et al., Eur. J. Biochem., 1996, 238:341-345). La modificación postraduccional implica la oxidación de un residuo conservado de cisteína (en eucariotas) o serina (en determinados procariotas), en Cβ, proporcionando L-Cα-formilglicina (también conocida como FGly; ácido 2-amino-3- 20 oxopropanoico) en el que un grupo aldehído sustituye al grupo tiometilo de la cadena lateral. El aldehído es una parte esencial del sitio catalítico de la sulfatasa y probablemente actúa como hidrato de aldehído. Uno de los grupos hidroxilo geminales acepta el sulfato durante la escisión del éster de sulfato conduciendo a la formación de un producto intermedio de enzima covalentemente sulfatada. El otro hidroxilo se requiere para la eliminación posterior del sulfato y regeneración del grupo aldehído. Esta modificación se produce en el retículo endoplásmico durante, o 25 poco después de, la importación del polipéptido de sulfatasa naciente y se dirige por una secuencia lineal corta que rodea al residuo de cisteína (o serina) que va a modificarse. Esta secuencia altamente conservada es el hexapéptido L/V-C(S)-X-P-S-R (SEC ID Nº: 32), presente en la región del extremo N de todas las sulfatasas eucariotas y lo más frecuentemente lleva un grupo hidroxilo o tiol en el residuo X (Dierks, T., et al., Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A., 1997, 94:11963-11968). 30
El documento WO 01/60991 trata proteínas cinasas humanas (PKIN) y polinucleótidos que identifican y codifican PKIN. También trata vectores de expresión adecuados, células huésped, anticuerpos, agonistas y antagonistas, además de métodos de diagnóstico, tratamiento o prevención de trastornos asociados a expresión aberrante de PKIN. 35
Fey et al. (J. Biol. Chem., 276, No 50, 47021-47028 [2001]) trata la caracterización de la formación postraduccional de formilglicina por componentes luminales del retículo endoplásmico.
Dierks et al. (PNAS, 94, 11963-11968 [1997]) trata la conversión de cisteína en formilglicina y la modificación de 40 proteínas en sulfatasas eucariotas.
Dierks et al. (EMBO Journal, 18, No 8, 2084-2091 [1999)]) trata los determinantes de secuencia que dirigen la conversión de cisteína en formilglicina en sulfatasas eucariotas.
45
Hasta la fecha se han identificado trece genes de sulfatasa en seres humanos. Codifican enzimas con diferente especificidad de sustrato y localización subcelular tales como lisosomas, aparato de Golgi y RE. Cuatro de esos genes, ARSC, ARSD, ARSE y ARSF, que codifican arilsulfatasa C, D, E y F, respectivamente, están localizados dentro de la misma región cromosómica (Xp22.3). Comparten una similitud de secuencia significativa y una organización genómica casi idéntica, que indica que surgen de eventos de duplicación que se produjeron 50 recientemente durante la evolución (Franco B, et al., Cell, 1995, 81:15-25; Meroni G, et al., Hum Mol Genet, 1996, 5:423-31).
La importancia de las sulfatasas en el metabolismo humano se enfatiza por la identificación de al menos ocho enfermedades monogénicas humanas provocadas por la deficiencia de actividades de sulfatasa individuales. La 55 mayoría de estas afecciones son trastornos de almacenamiento lisosómico en los que las consecuencias fenotípicas se derivan del tipo y la distribución tisular del material almacenado. Entre ellos hay cinco tipos diferentes de mucopolisacaridosis (tipos IIIA, IIID, IVA y VI de MPS) debido a deficiencias de sulfatasas que actúan sobre el catabolismo de glicosaminoglicanos (Neufeld y Muenzer, 2001, The mucopolysaccharidoses, en The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, D. Valle, B. Childs, K.W. Kinzler y B. 60 Vogelstein, eds. Nueva York: Me Graw-Hill, págs. 3421-3452) y leucodistrofia metacromática (MLD), que se caracteriza por el almacenamiento de sulfolípidos en los sistemas nerviosos central y periférico conduciendo a deterioro neurológico grave y progresivo. Dos enfermedades humanas adicionales están provocadas por deficiencias de sulfatasas no liposómicas. Incluyen ictiosis ligada al cromosoma X, un trastorno cutáneo debido a deficiencia de sulfatasa esteroidea (STS/ARSC), y condrodisplasia punctata, un trastorno que afecta al hueso y cartílago debido a 65 deficiencia de arilsulfatasa E (ARSE). Las sulfatasas también participan en síndromes de malformación humanos
inducidos por fármacos, tales como embriopatía por warfarina, provocada por la inhibición de la actividad ARSE debido a la exposición in utero a warfarina durante el embarazo.
En un trastorno monogénico humano intrigante, la deficiencia múltiple de sulfatasas (MSD), todas las actividades de sulfatasa son defectuosas simultáneamente. Por consiguiente, el fenotipo de esta enfermedad multisistémica grave 5 combina las características observadas en deficiencias de sulfatasas individuales. Las células de pacientes con MSD son deficientes en actividades de sulfatasa incluso tras la transfección con ADNc que codifican sulfatasas humanas, sugiriendo la presencia de un mecanismo común requerido para la actividad de todas las sulfatasas (Rommerskirch y von Figura, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, 89:2561-2565). Se encontró que la modificación postraduccional de sulfatasas era defectuosa en un paciente con MSD, sugiriendo que este trastorno está provocado por una mutación 10 en un gen, o genes, que participan en la maquinaria de conversión de cisteína en formilglicina (Schmidt, B., et al., Cell, 1995, 82:271-278). A pesar del intenso interés biológico y médico, los esfuerzos dirigidos a la identificación de este/estos gen(es) se han visto dificultados por la rareza de pacientes con MSD y la consiguiente falta de casos familiares adecuados para realizar un mapeo genético.
15
Resumen de la invención
La presente invención proporciona usos médicos para el tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas (MIM 272200) y otras deficiencias de sulfatasas como se expone en las reivindicaciones 1 a 12 y 15, además de métodos de diagnóstico o pronóstico como se exponen en las reivindicaciones 13 y 14. 20
Los presentes inventores han identificado un gen que codifica la enzima generadora de formilglicina (FGE), una enzima responsable de la modificación postraduccional única que se produce en sulfatasas que es esencial para la función sulfatasa (formación de L-Cα-formilglicina; también conocida como FGly y/o ácido 2-amino-3-oxopropanoico). Se ha descubierto, inesperadamente, que mutaciones en el gen de FGE conducen al desarrollo de deficiencia 25 múltiple de sulfatasas (MSD) en sujetos. También se ha descubierto, inesperadamente, que la FGE potencia la actividad de sulfatasas, incluyendo, pero sin limitarse a, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6. En vista de estos descubrimientos, las moléculas de la presente invención pueden usarse en el diagnóstico y tratamiento de 30 deficiencia múltiple de sulfatasas, así como otras deficiencias de sulfatasa.
Breve descripción de las secuencias
SEC ID Nº: 1 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de FGE humana. 35
SEC ID Nº: 2 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de FGE humana (SEC ID Nº: 1).
SEC ID Nº: 3 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de FGE humana que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 2 40 (es decir, nucleótidos 20-1141 de SEC ID Nº: 1).
SEC ID Nº: 4 es la secuencia de nucleótidos con Nº de acceso de GenBank AK075459.
SEC ID Nº: 5 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de SEC ID Nº: 4, un producto de 45 proteína sin nombre que tiene el Nº de acceso de GenBank BAC11634.
SEC ID Nº: 6 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de iduronato 2-sulfatasa humana (Nº de acceso de GenBank M58342).
50
SEC ID Nº: 7 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de iduronato 2- sulfatasa humana (SEC ID Nº: 6).
SEC ID Nº: 8 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de sulfamidasa humana (Nº de acceso de GenBank U30894).
55
SEC ID Nº: 9 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de sulfamidasa humana (SEC ID Nº: 8).
SEC ID Nº: 10 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa humana (Nº de acceso de GenBank U06088). 60
SEC ID Nº: 11 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de N- acetilgalactosamina 6-sulfatasa humana (SEC ID Nº: 10).
SEC ID Nº: 12 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de N-acetilglucosamina 6-sulfatasa humana (Nº de acceso 65 de GenBank Z12173).
SEC ID Nº: 13 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de N- acetilglucosamina 6-sulfatasa humana (SEC ID Nº: 12).
SEC ID Nº: 14 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa A humana (Nº de acceso de GenBank 5 X52151).
SEC ID Nº: 15 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de arilsulfatasa A humana (SEC ID Nº: 14).
10
SEC ID Nº: 16 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa B humana (Nº de acceso de GenBank J05225).
SEC ID Nº: 17 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de arilsulfatasa B humana (SEC ID Nº: 16). 15
SEC ID Nº: 18 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa C humana (Nº de acceso de GenBank J04964).
SEC ID Nº: 19 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de arilsulfatasa C 20 humana (SEC ID Nº: 18).
SEC ID Nº: 20 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa D humana (Nº de acceso de GenBank X83572).
25
SEC ID Nº: 21 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de arilsulfatasa D humana (SEC ID Nº: 20).
SEC ID Nº: 22 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa E humana (Nº de acceso de GenBank X83573). 30
SEC ID Nº: 23 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de arilsulfatasa E humana (SEC ID Nº: 22).
SEC ID Nº: 24 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa F humana (Nº de acceso de GenBank 35 X97868).
SEC ID Nº: 25 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de arilsulfatasa F humana (SEC ID Nº: 24).
40
SEC ID Nº: 26 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa G humana (Nº de acceso de GenBank BC012375).
SEC ID Nº: 27 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de la arilsulfatasa G humana (SEO ID NO: 26). 45
SEC ID Nº: 28 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HSulf-1 (Nº de acceso de GenBank AY101175).
SEC ID Nº: 29 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de HSulf-1 (SEC ID Nº: 28). 50
SEC ID Nº: 30 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HSulf-2 (Nº de acceso de GenBank AY101176).
SEC ID Nº: 31 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de HSulf-2 (SEC ID Nº: 30). 55
SEC ID Nº: 32 es el hexapéptido altamente conservado L/V-FGIy-X-P-S-R presente en sulfatasas.
SEC ID Nº: 33 es un sustrato de formación de FGIy sintético; su secuencia primaria se deriva de arilsulfatasa A humana. 60
SEC ID Nº: 34 es el oligopéptido reorganizado al azar PVSLPTRSCAALLTGR.
SEC ID Nº: 35 es el oligopéptido Ser69 PVSLSTPSRAALLTGR.
65
SEC ID Nº: 36 es un cebador específico para FGE humana 1199nc.
SEC ID Nº: 37 es un cebador directo específico para FGE humana 1c.
SEC ID Nº: 38 es un cebador inverso específico para FGE humana 1182c.
5
SEC ID Nº: 39 es un cebador específico para 5'-FGE humana que contiene un sitio de EcoRI.
SEC ID Nº: 40 es un cebador específico para HA.
SEC ID Nº: 41 es un cebador específico para c-myc. 10
SEC ID Nº: 42 es un cebador específico para RGS-His6.
SEC ID Nº: 43 es un oligopéptido tríptico SQNTPDSSASNLGFR de una preparación de FGE humana.
15
SEC ID Nº: 44 es un oligopéptido tríptico MVPIPAGVFTMGTDDPQIK de una preparación de FGE humana.
SEC ID Nº: 45 es la secuencia de nucleótidos del parálogo de FGE2 humana (GenBank Gl: 24308053).
SEC ID Nº: 46 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del parálogo de FGE2 humana 20 (SEC ID Nº: 45).
SEC ID Nº: 47 es la secuencia de nucleótidos del parálogo de FGE de ratón (GenBank Gl: 26344956).
SEC ID Nº: 48 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del parálogo de FGE de ratón 25 (SEC ID Nº: 47).
SEC ID Nº: 49 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de ratón (GenBank Gl: 22122361).
SEC ID Nº: 50 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de ratón 30 (SEC ID Nº: 49).
SEC ID Nº: 51 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de mosca de la fruta (GenBank Gl: 20130397).
SEC ID Nº: 52 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de mosca 35 de la fruta (SEC ID Nº: 51).
SEC ID Nº: 53 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de mosquito (GenBank Gl: 21289310).
SEC ID Nº: 54 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de mosquito 40 (SEC ID Nº: 53).
SEC ID Nº: 55 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de S. coelicolor estrechamente relacionado (GenBank Gl: 21225812).
45
SEC ID Nº: 56 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de S. coelicolor (SEC ID Nº: 55).
SEC ID Nº: 57 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de C. efficiens estrechamente relacionado (GenBank Gl: 25028125). 50
SEC ID Nº: 58 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de C. efficiens (SEC ID Nº: 57).
SEC ID Nº: 59 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de N. aromaticivorans (GenBank Gl: 23108562). 55
SEC ID Nº: 60 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de N. aromaticivorans (SEC ID Nº: 59).
SEC ID Nº: 61 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de M. loti (GenBank Gl: 13474559). 60
SEC ID Nº: 62 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de M. loti (SEC ID Nº: 61).
SEC ID Nº: 63 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de B. fungorum (GenBank Gl: 22988809). 65
SEC ID Nº: 64 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de B. fungorum (SEC ID Nº: 63).
SEC ID Nº: 65 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de S. meliloti (GenBank Gl: 16264068).
5
SEC ID Nº: 66 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de S. meliloti (SEC ID Nº: 65).
SEC ID Nº: 67 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de Microscilla sp. (GenBank Gl: 14518334).
10
SEC ID Nº: 68 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de Microscilla sp. (SEC ID Nº: 67).
SEC ID Nº: 69 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de P. putida KT2440 (GenBank Gl: 26990068).
15
SEC ID Nº: 70 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de P. putida KT2440 (SEC ID Nº: 69).
SEC ID Nº: 71 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de R. metallidurans (GenBank Gl: 22975289).
20
SEC ID Nº: 72 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de R. metallidurans (SEC ID Nº: 71).
SEC ID Nº: 73 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de P. marinus (GenBank Gl: 23132010).
25
SEC ID Nº: 74 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de P. marinus (SEC ID Nº: 73).
SEC ID Nº: 75 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de C. crescentus CB15 (GenBank Gl: 16125425).
30
SEC ID Nº: 76 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de C. crescentus CB 15 (SEC ID Nº: 75).
SEC ID Nº: 77 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de M. tuberculosis Ht37Rv (GenBank Gl: 15607852). 35
SEC ID Nº: 78 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de M. tuberculosis Ht37Rv (SEC ID Nº: 77).
SEC ID Nº: 79 es el heptapéptido altamente conservado presente en el subdominio 3 de parálogos y ortólogos de 40 FGE.
SEC ID Nº: 80 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene Nº de acceso de GenBank: CA379852.
45
SEC ID Nº: 81 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene Nº de acceso de GenBank: AI721440.
SEC ID Nº: 82 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene Nº de acceso de GenBank: BJ505402. 50
SEC ID Nº: 83 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene Nº de acceso de GenBank: BJ054666.
SEC ID Nº: 84 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene Nº de acceso de 55 GenBank: AL892419.
SEC ID Nº: 85 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene Nº de acceso de GenBank: CA064079.
60
SEC ID Nº: 86 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene Nº de acceso de GenBank: BF189614.
SEC ID Nº: 87 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene Nº de acceso de GenBank: AV609121. 65
SEC ID Nº: 88 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HSulf-3.
SEC ID Nº: 89 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de HSulf-3 (SEC ID Nº: 88).
SEC ID Nº: 90 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HSulf-4. 5
SEC ID Nº: 91 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de HSulf-4 (SEC ID Nº: 90).
SEC ID Nº: 92 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HSulf-5. 10
SEC ID Nº: 93 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de HSulf-5 (SEC ID Nº: 92).
SEC ID Nº: 94 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HSulf-6. 15
SEC ID Nº: 95 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de HSulf-6 (SEC ID Nº: 94).
Breve descripción de los dibujos 20
Fig. 1: Un esquema de espectro de masas MALDI-TOF de P23 tras la incubación en ausencia (A) o presencia (B) de un extracto soluble de microsomas de testículos bovinos.
Fig. 2: Un árbol filogenético derivado de un alineamiento de FGE humana y 21 proteínas de la semilla DUF323 25 en PFAM.
Fig. 3: Organización del locus del gen de FGE humana y murina. Los exones se muestran a escala como recuadros y recuadros claros (locus murino). Los números encima de las líneas de intrón indican el tamaño de los intrones en kilobases. 30
Fig. 4: Diagrama que muestra un mapa de plásmido pXMG.1.3 de expresión de FGE.
Fig. 5: Gráfico de barras que representa actividad N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa en células 36F transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE. 35
Fig. 6: Gráfico de barras que representa actividad específica N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa en células 36F transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE.
Fig. 7: Gráfico de barras que representa la producción de N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa en células 36F 40 transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE.
Fig. 8: Gráfico que representa actividad iduronato 2-sulfatasa en células 3006 transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE.
45
Fig. 9: Representa un kit que incluye características de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
La invención se explica en las reivindicaciones 1 a 15. Se ha descubierto el gen que codifica enzima generadora de 50 formilglicina (FGE), una enzima responsable de la modificación postraduccional única que se produce en sulfatasas que es esencial para la función de sulfatasa: la formación de L-Cα-formilglicina (también conocida como FGly y/o ácido 2-amino-3-oxopropanoico). Se ha descubierto, inesperadamente, que mutaciones en el gen de FGE conducen al desarrollo de deficiencia múltiple de sulfatasas (MSD) en sujetos. También se ha descubierto, inesperadamente, que la FGE potencia la actividad de sulfatasas, incluyendo, pero sin limitarse a, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, 55 N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6, y sulfatasas descritas en las solicitudes provisionales de EE.UU. con números de publicación 20030073118, 20030147875, 20030148920, 20030162279 y 20030166283.
60
“Actividad de generación de Cα-formilglicina” se refiere a la capacidad de una molécula para formar, o potenciar, la formación de FGly en un sustrato. El sustrato puede ser una sulfatasa como se describe en otra parte en el presente documento, o un oligopéptido sintético (véase, por ejemplo, SEC ID Nº: 33, y los ejemplos). El sustrato contiene preferiblemente el hexapéptido conservado de SEC ID Nº: 32 [L/V-C(S)-X-P-S-R]. Métodos de ensayo de la formación de FGly son como se describen en la técnica (véase, por ejemplo, Dierks, T., et al., Proc. Natl. Acad Sci. 65 U.S.A., 1997, 94:11963-11968), y en otra parte en el presente documento (véanse, por ejemplo, los ejemplos). Una
“molécula”, como se usa en el presente documento, engloba tanto “ácidos nucleicos” como “polipéptidos”. Las moléculas de FGE son capaces de formar, o potenciar/aumentar, la formación de FGly tanto in vivo como in vitro.
La “potenciación (o “aumento”)” de la actividad de generación de Cα-formilglicina, como se usa en el presente documento, se refiere normalmente a una expresión aumentada de FGE y/o su polipéptido codificado. La expresión 5 aumentada se refiere a aumentar (es decir, hasta un grado detectable) la replicación, transcripción y/o traducción de cualquiera de los ácidos nucleicos (ácidos nucleicos de FGE como se describen en otra parte en el presente documento), ya que la regulación por incremento de cualquiera de estos procesos produce un aumento de la concentración/cantidad del polipéptido codificado por el gen (ácido nucleico). La potenciación (o aumento) de la actividad de generación de Cα-formilglicina también se refiere a prevenir o inhibir la degradación de FGE (por 10 ejemplo, mediante el aumento de la ubiquitinización), regulación por disminución, etc., produciendo, por ejemplo, una t½ (semivida) de molécula de FGE estable o aumentada en comparación con un control. La regulación por disminución o expresión reducida se refiere a la expresión reducida de un gen y/o su polipéptido codificado. La regulación por incremento o regulación por disminución de la expresión génica puede determinarse directamente detectando un aumento o disminución, respectivamente, en el nivel de ARNm para el gen (por ejemplo, FGE), o el 15 nivel de expresión de proteína del polipéptido codificado por el gen, usando cualquier medio adecuado conocido en la técnica, tal como hibridación de ácido nucleico o métodos de detección con anticuerpos, respectivamente, y en comparación con controles. La regulación por incremento o regulación por disminución de la expresión del gen de FGE también puede determinarse indirectamente detectando un cambio en la actividad de generación de Cα-formilglicina. 20
“Expresión”, como se usa en el presente documento, se refiere a expresión de ácido nucleico y/o polipéptido, así como a actividad de la molécula de polipéptido (por ejemplo, actividad de generación de Cα-formilglicina de la molécula).
25
Como se usa en el presente documento, un sujeto es un mamífero o un mamífero no humano. En todas las realizaciones se prefieren FGE humana y sujetos humanos.
Como se usa en el presente documento con respecto a ácidos nucleicos, el término “aislado” significa: (i) amplificado in vitro mediante, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) producido de manera recombinante 30 mediante clonación; (iii) purificado, como mediante escisión y separación en gel; o (iv) sintetizado mediante, por ejemplo, síntesis química. Un ácido nucleico aislado es uno que se manipula fácilmente mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica. Por tanto, una secuencia de nucleótidos contenida en un vector en el que se conocen sitios de restricción en 5' y 3' o para la que se han divulgado secuencias de cebadores para reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se considera aislada, pero una secuencia de ácido nucleico que existe en su 35 estado nativo en su huésped natural no. Un ácido nucleico aislado puede estar sustancialmente purificado, pero no necesita estarlo. Por ejemplo, un ácido nucleico que está aislado dentro de un vector de clonación o expresión no es puro porque puede comprender solo un diminuto porcentaje del material en la célula en la que reside. Sin embargo, un ácido nucleico de este tipo está aislado, como se usa el término en el presente documento, porque se manipula fácilmente mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. 40
Como se usa en el presente documento con respecto a polipéptidos, el término “aislado” significa separado de su entorno nativo en una forma suficientemente pura de modo que puede manipularse o usarse para uno cualquiera de los fines de la invención descrita en el presente documento. Por tanto, aislado significa suficientemente puro para usarse (i) para preparar y/o aislar anticuerpos, (ii) como reactivo en un ensayo, (iii) para secuenciar, (iv) como 45 producto terapéutico, etc.
Según la invención, moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de FGE que tiene actividad de generación de Cα-formilglicina incluyen: (a) moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con una molécula que consiste en un ácido nucleico de SEC ID Nº: 1 y que codifican un polipéptido de FGE que 50 tiene actividad de generación de Cα-formilglicina, (b) deleciones, adiciones y sustituciones de (a) que codifican un polipéptido de FGE respectivo que tiene actividad de generación de Cα-formilglicina, (c) moléculas de ácido nucleico que se diferencian de las moléculas de ácido nucleico de (a) o (b) en secuencia de codón debido a la degeneración del código genético, y (d) complementos de (a), (b) o (c). “Complementos”, como se usa en el presente documento, incluye “cadenas complementarias de longitud completa o cadenas complementarias al 100 % de (a), (b) o (c)”. 55
Pueden proporcionarse homólogos y alelos de los ácidos nucleicos de FGE descritos en el presente documento que también tienen actividad de generación de Cα-formilglicina. Los homólogos, como se describen en el presente documento, incluyen las moléculas identificadas en otra parte en el presente documento (véanse, por ejemplo, SEC ID Nº: 4, 5, 45-78 y 80-87), es decir, ortólogos y parálogos. Pueden identificarse homólogos adicionales siguiendo 60 las enseñanzas de la presente invención, así como mediante técnicas convencionales. Como los homólogos de FGE descritos en el presente documento comparten todos actividad de generación de Cα-formilglicina, pueden usarse de manera intercambiable con la molécula de FGE humana en todos los aspectos de la invención.
En general, los homólogos y alelos compartirán normalmente al menos el 40 % de identidad de nucleótidos y/o al 65 menos el 50 % de identidad de aminoácidos con SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2, respectivamente, en algunos casos
compartirán al menos el 50 % de identidad de nucleótidos y/o al menos el 65 % de identidad de aminoácidos y en todavía otros casos compartirán al menos el 60 % de identidad de nucleótidos y/o al menos el 75 % de identidad de aminoácidos. En casos adicionales, los homólogos y alelos compartirán normalmente al menos el 90 %, el 95 %, o incluso el 99 % de identidad de nucleótidos y/o al menos el 95 %, el 98 %, o incluso el 99 % de identidad de aminoácidos con SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2, respectivamente. La homología puede calcularse usando diversas 5 herramientas de software disponibles para el público desarrolladas por NCBI (Bethesda, Maryland). Herramientas a modo de ejemplo incluyen el algoritmo heurístico de Altschul SF, et al., (J Mol Biol, 1990, 215: 403-410), también conocido como BLAST. Pueden obtenerse alineamientos por emparejamiento y de ClustalW (configuración de matriz BLOSUM30), así como análisis hidropático de Kyte-Doolittle usando herramientas públicas (EMBL, Heidelberg, Alemania) y comerciales (por ejemplo, el software de análisis de secuencias MacVector de Oxford Molecular 10 Group/enetics Computer Group, Madison, Wl). También pueden usarse los complementos de Watson-Crick de los ácidos nucleicos anteriores.
En el cribado de genes relacionados con FGE, tales como homólogos y alelos de FGE, puede realizarse una transferencia Southern usando las condiciones anteriores, junto con una sonda radiactiva. Después de lavar la 15 membrana a la que se transfiere finalmente el ADN, puede colocarse la membrana contra una película de rayos X o una placa de sistema de detección y cuantificación de la radiactividad para detectar la señal radiactiva.
Dadas las enseñanzas en el presente documento de un clon de ADNc de FGE humana de longitud completa, pueden aislarse otras secuencias de mamífero tales como el clon de ADNc de ratón correspondiente al gen de FGE 20 humana a partir de una biblioteca de ADNc, usando técnicas de hibridación de colonias convencionales.
Pueden proporcionarse ácidos nucleicos degenerados que incluyen codones alternativos a los presentes en los materiales nativos. Por ejemplo, se codifican residuos de serina por los codones TCA, AGT, TCC, TCG, TCT y AGC. Por tanto, será evidente para un experto en la materia que puede emplearse cualquiera de los tripletes de 25 nucleótidos que codifican serina para dirigir el aparato de síntesis de proteínas, in vitro o in vivo, para incorporar un residuo de serina en un polipéptido de FGE que está alargándose. Similarmente, tripletes de secuencias de nucleótidos que codifican otros residuos de aminoácido incluyen, pero no se limitan a: CCA, CCC, CCG y CCT (codones de prolina); CGA, CGC, CGG, CGT, AGA y AGG (codones de arginina); ACA, ACC, ACG y ACT (codones de treonina); AAC y AAT (codones de asparagina); y ATA, ATC y ATT (codones de isoleucina). Otros residuos de 30 aminoácido pueden codificarse similarmente por múltiples secuencias de nucleótidos. Por tanto, pueden usarse ácidos nucleicos que se diferencian de los ácidos nucleicos biológicamente aislados en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético.
Pueden aislarse fragmentos únicos de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3 o complementos de los mismos. Un fragmento 35 único es uno que es una “firma” para el ácido nucleico más grande. Por ejemplo, el fragmento único es lo bastante largo para garantizar que su secuencia precisa no se encuentra en moléculas dentro del genoma humano fuera de los ácidos nucleicos de FGE definidos anteriormente (y alelos humanos). Los expertos en la materia pueden aplicar procedimientos simplemente de rutina para determinar si un fragmento es único dentro del genoma humano. Sin embargo, los fragmentos únicos excluyen fragmentos compuestos completamente de las secuencias de nucleótidos 40 seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID Nº: 4, y/u otras secuencias previamente publicadas a partir de la fecha de presentación de la presente solicitud.
Un fragmento que está completamente compuesto de la secuencia descrita en los depósitos de GenBank anteriores es una que no incluye ninguno de los nucleótidos únicos para las secuencias de la invención. Por tanto, un 45 fragmento único según la invención debe contener una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia exacta de esos en los depósitos de GenBank o fragmentos de la misma. La diferencia puede ser una adición, deleción o sustitución con respecto a la secuencia de GenBank o puede ser una secuencia completamente separada de la secuencia de GenBank.
50
Pueden usarse fragmentos únicos como sondas en ensayos de transferencia Southern y Northern para identificar tales ácidos nucleicos, o pueden usarse en ensayos de amplificación tales como los que emplean PCR. Como saben los expertos en la materia, se prefieren sondas grandes tales como 200, 250, 300 o más nucleótidos para determinados usos tales como transferencias Southern y Northern, mientras que se preferirán fragmentos más pequeños para usos tales como PCR. También pueden usarse fragmentos únicos para producir proteínas de fusión 55 para generar anticuerpos o determinar la unión de los fragmentos de polipéptido, como se demuestra en los ejemplos, o para generar componentes de inmunoensayo. Asimismo, pueden emplearse fragmentos únicos para producir fragmentos no fusionados de los polipéptidos de FGE, útiles, por ejemplo, en la preparación de anticuerpos, inmunoensayos o aplicaciones terapéuticas. Pueden usarse adicionalmente fragmentos únicos como moléculas antisentido para inhibir la expresión de ácidos nucleicos y polipéptidos de FGE respectivamente. 60
Como se reconocerá por aquellos expertos en la materia, el tamaño del fragmento único dependerá de su conservación en el código genético. Por tanto, algunas regiones de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3 y complementos requerirán que segmentos más largos sean únicos, mientras que otras solo requerirán segmentos cortos, normalmente de entre 12 y 32 nucleótidos de longitud (por ejemplo de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 65 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 y 32 bases) o más, hasta la longitud completa de la secuencia divulgada. Como se ha
mencionado anteriormente, la presente divulgación pretende englobar todos y cada uno de los fragmentos de cada secuencia, comenzando en el imprimación nucleótido, el segundo nucleótido, etcétera, hasta 8 nucleótidos del final, y terminando en cualquier lugar desde el nucleótido número 8, 9, 10, etcétera, para cada secuencia, hasta el último nucleótido (siempre que la secuencia sea única como se ha descrito anteriormente). Prácticamente cualquier segmento de la región de SEC ID Nº: 1 comenzando en el nucleótido 1 y terminando en el nucleótido 1180, o SEC 5 ID Nº: 3 comenzando en el nucleótido 1 y terminando en el nucleótido 1122, o complementos de los mismos, que tenga 20 o más nucleótidos de longitud será único. Los expertos en la materia están bien versados en los métodos para seleccionar tales secuencias, normalmente basándose en la capacidad del fragmento único para distinguir selectivamente la secuencia de interés de otras secuencias en el genoma humano del fragmento. Normalmente, para aquellas en bases de datos conocidas es todo lo que se necesita, aunque pueden realizarse hibridación 10 confirmatoria in vitro y análisis de secuenciación.
“Vectores”, como se usa en el presente documento, puede ser cualquiera de varios ácidos nucleicos en los que puede insertarse una secuencia deseada mediante restricción y ligación para su transporte entre diferentes entornos genéticos o para su expresión en una célula huésped. Los vectores están compuestos normalmente de ADN, 15 aunque también están disponibles vectores de ARN. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos y genomas de virus. Un vector de clonación es uno que es capaz de replicarse en una célula huésped, y que se caracteriza además por uno o más sitios de restricción de endonucleasas en los que puede cortarse el vector de una manera determinable y en los que puede ligarse una secuencia de ADN deseada de tal manera que el nuevo vector recombinante conserva su capacidad para replicarse en la célula huésped. En el caso de plásmidos, puede 20 producirse la replicación de la secuencia deseada muchas veces ya que el plásmido aumenta el número de copias dentro de la bacteria huésped o solo una única vez por huésped antes de que el huésped se reproduzca por mitosis. En el caso de fago, la replicación puede producirse de manera activa durante una fase lítica o de manera pasiva durante una fase lisogénica. Un “vector de expresión” es uno en el que puede insertarse una secuencia de ADN deseada (por ejemplo, el ADNc de FGE de SEC ID Nº: 3) mediante restricción y ligación de tal manera que está 25 operativamente unido a secuencias reguladoras y puede expresarse como un transcrito de ARN. Los vectores pueden contener además una o más secuencias marcadoras adecuadas para su uso en la identificación de células que se han transformado o transfectado o no con el vector. Los marcadores incluyen, por ejemplo, genes que codifican proteínas que aumentan o disminuyen o tanto la resistencia como la sensibilidad a antibióticos u otros compuestos, genes que codifican enzimas cuyas actividades son detectables por ensayos convencionales conocidos 30 en la técnica (por ejemplo, β-galactosidasa β-galactosidasa o fosfatasa alcalina), y genes que afectan visiblemente el fenotipo de células, huéspedes, colonias o placas transformadas o transfectadas (por ejemplo, proteína verde fluorescente).
Un “vector de direccionamiento” es uno que normalmente contiene construcciones/secuencias de direccionamiento 35 que se usan, por ejemplo, para insertar una secuencia reguladora dentro de un gen endógeno (por ejemplo, dentro de las secuencias de un exón y/o intrón), dentro de las secuencias promotoras del gen endógeno, o en la dirección 5' de las secuencias promotoras del gen endógeno. En otro ejemplo, un vector de direccionamiento puede contener el gen de interés (por ejemplo, codificado por el ADNc de SEC ID Nº: 1) y otras secuencias necesarias para el direccionamiento del gen a una localización preferida en el genoma (por ejemplo, una localización 40 transcripcionalmente activa, por ejemplo, en la dirección 3' de un promotor endógeno de un gen no relacionado). La construcción de vectores y construcciones de direccionamiento se describe en detalle en las patentes de EE.UU. 5.641.670 y 6.270.989.
Pueden transformarse células procariotas o eucariotas con ADN o ARN heterólogo y que puede hacerse crecer o 45 mantenerse en cultivo. Ejemplos incluyen células bacterianas tales como Escherichia coli, células de insecto y células de mamífero tales como ser humano, ratón, hámster, cerdo, cabra, primate, etc. Pueden ser cepas de células primarias o secundarias (que muestran un número finito de duplicaciones de población media en cultivo y no están inmortalizadas) y líneas celulares inmortalizadas (que muestran un periodo de vida aparentemente ilimitado en cultivo). Las células primarias y secundarias incluyen, por ejemplo, fibroblastos, queratinocitos, células epiteliales 50 (por ejemplo, células epiteliales de mama, células epiteliales intestinales), células endoteliales, células de la glía, células neurales, elementos formados de la sangre (por ejemplo, linfocitos, células de la médula ósea), células de músculo y precursores de esos tipos de células somáticas incluyendo células madre embrionarias. Cuando las células van a usarse en terapia génica, se obtienen preferiblemente células primarias del individuo al que se administran las células manipuladas. Sin embargo, pueden obtenerse células primarias de un donante (distinto del 55 receptor) de la misma especie. Ejemplos de líneas de células humanas inmortalizadas que pueden usarse con las construcciones de ADN y métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, células HT-1080 (ATCC CCL 121), células HeLa y derivados de células HeLa (ATCC CCL 2, 2.1 y 2.2), células de cáncer de mama MCF-7 (ATCC BTH 22), células de leucemia K-562 (ATCC CCL 243), células de carcinoma KB (ATCC CCL 17), células de carcinoma de ovario 2780AD (Van der Blick, A. M. at al., Cancer Res, 48:5927-5932 (1988), células Raji (ATCC CCL 60 86), células de adenocarcinoma de colon WiDr (ATCC CCL 218), células de adenocarcinoma de colon SW620 (ATCC CCL 227), células Jurkat (ATCC TIB 152), células Namalwa (ATCC CRL1432), células HL-60 (ATCC CCL 240), células Daudi (ATCC CCL 213), células RPMI 8226 (ATCC CCL 155), células U-937 (ATCC CRL 1593), células de melanoma de Bowes (ATCC CRL 9607), células 2R4 de la sublínea WI-38VA13 (ATCC CLL 75.1) y células MOLT-4 (ATCC CRL 1582), células CHO y células COS, así como células de heterohibridoma producidas 65 por la fusión de células humanas y células de otra especie. También pueden usarse cepas de fibroblastos humanos
secundarios, tales como WI-38 (ATCC CCL 75) y MRC-5 (ATCC CCL 171). Se proporciona discusión adicional de los tipos de células que pueden usarse en las patentes de EE.UU. 5.641.670 y 6.270.989. También pueden usarse sistemas de transcripción libres de células en lugar de células.
Las células se mantienen en condiciones, como se conocen en la técnica, que producen la expresión de la proteína 5 FGE o fragmentos funcionales de la misma. Las proteínas expresadas usando los métodos descritos pueden purificarse a partir de lisados celulares o sobrenadantes celulares. Pueden prepararse proteínas preparadas según este método como una formulación farmacéuticamente útil y administrarse a un ser humano o animal no humano por vías farmacéuticas convencionales como se conoce en la técnica (por ejemplo, oral, intravenosa, intramuscular, intranasal, intratraqueal o subcutánea). Como se describe en otra parte en el presente documento, las células 10 recombinantes pueden ser células inmortalizadas, primarias o secundarias, preferiblemente humanas. El uso de células de otra especie puede ser deseable en casos en los que las células no humanas sean ventajosas para fines de producción de proteína en los que la FGE no humana producida es terapéuticamente útil.
Como se usa en el presente documento, se dice que una secuencia codificante y secuencias reguladoras están 15 “operativamente” unidas cuando están covalentemente enlazadas de tal manera que se coloca la expresión o transcripción de la secuencia codificante bajo la influencia o el control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias codificantes se traduzcan en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están operativamente unidas si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras en 5' produce la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) produce la 20 introducción de una mutación del marco de lectura, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes, o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente para traducirse en una proteína. Por tanto, una región promotora estaría operativamente enlazada a una secuencia codificante si la región promotora fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN de tal manera que el transcrito resultante pudiera traducirse en la proteína o polipéptido deseado. 25
La naturaleza precisa de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar entre tipos de especies o células, pero en general incluirán, según sea necesario, secuencias no transcritas en 5' y no traducidas en 5' que participan en la iniciación de la transcripción y la traducción respectivamente, tal como una caja TATA, secuencia de ocupación, secuencia CAAT, y similares. Especialmente, tales secuencias reguladoras no transcritas 30 en 5' incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen operativamente unido. Las secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en la dirección 5' según se desee. Los vectores de la invención pueden incluir opcionalmente secuencias señal o líder en 5'. La elección y el diseño de un vector apropiado están dentro de la capacidad y discreción de un experto habitual en la materia. 35
Vectores de expresión que contienen todos los elementos necesarios para la expresión están comercialmente disponibles y son conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Se diseñan mediante ingeniería genética células mediante la introducción en las células de ADN (ARN) heterólogo que codifica polipéptido de FGE o 40 fragmento o VARIANTEe del mismo. Ese ADN (ARN) heterólogo se coloca bajo el control operativo de elementos transcripcionales para permitir la expresión del ADN heterólogo en la célula huésped.
Sistemas preferidos para la expresión de ARNm en células de mamífero son aquellos tales como pRc/CMV (disponible de Invitrogen, Carlsbad, CA) que contienen un marcador de selección tal como un gen que confiere 45 resistencia a G418 (que facilita la selección de líneas celulares establemente transfectadas) y las secuencias de potenciador-promotor del citomegalovirus (CMV) humano. Adicionalmente, es adecuado para la expresión en líneas celulares de primate o canino el vector pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contiene un origen de replicación de virus de Epstein Barr (EBV), que facilita el mantenimiento del plásmido como elemento extracromosómico de múltiples copias. Otro vector de expresión es el plásmido pEF-BOS que contiene el promotor de factor de elongación 50 1α de polipéptido, que estimula eficazmente la transcripción in vitro. El plásmido se describe por Mishizuma y Nagata (Nuc. Acids Res. 18:5322, 1990), y su uso en experimentos de transfección se divulga, por ejemplo, por Demoulin (Mol. Cell. Biol. 16:4710-4716, 1996). Todavía otro vector de expresión preferido es un adenovirus, descrito por Stratford-Perricaudet, que es defectuoso para proteínas E1 y E3 (J. Clin. Invest. 90:626-630, 1992). El uso del adenovirus como recombinante Adeno.P1 A se divulga por Warnier et al., en la inyección intradérmica en ratones 55 para inmunización frente a P1A (Int. J. Cancer, 67:303-310, 1996).
Los kits de expresión permiten al experto en la materia preparar un vector o vectores de expresión deseados. Tales kits de expresión incluyen al menos porciones separadas de cada una de las secuencias codificantes anteriormente tratadas. Pueden añadirse otros componentes, según se desee, siempre que incluyan las secuencias previamente 60 mencionadas, que se requieren.
Pueden usarse vectores de expresión que contienen la secuencia de ADNc de FGE descrita anteriormente para transfectar líneas celulares y células huésped, ya sean procariotas (por ejemplo, Escherichia coli) o eucariotas (por ejemplo, células CHO, células COS, sistemas de expresión en levadura y expresión de baculovirus recombinante en 65 células de insecto). Son especialmente útiles células de mamífero tales como ser humano, ratón, hámster, cerdo,
cabra, primate, etc. Pueden ser de una amplia variedad de tipos de tejido, e incluir células primarias y líneas celulares inmortalizadas como se describe en otra parte en el presente documento. Ejemplos específicos incluyen células HT-1080, células CHO, células dendríticas, células U293, leucocitos de sangre periférica, células madre de médula ósea, células madre embrionarias y células de insecto.
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Pueden proporcionarse polipéptidos aislados (incluyendo proteínas completas y proteínas parciales), codificados por los ácidos nucleicos de FGE anteriores, e incluir el polipéptido de SEC ID Nº: 2 y fragmentos únicos del mismo. Tales polipéptidos son útiles, por ejemplo, solos o como parte de proteínas de fusión para generar anticuerpos, como componentes de un inmunoensayo, etc. Pueden aislarse polipéptidos a partir de muestras biológicas que incluyen homogeneizados tisulares o celulares, y también pueden expresarse de manera recombinante en una variedad de 10 sistemas de expresión procariotas y eucariotas construyendo un vector de expresión apropiado para el sistema de expresión, introduciendo el vector de expresión en el sistema de expresión y aislando la proteína expresada de manera recombinante. También pueden sintetizarse químicamente polipéptidos cortos, incluyendo péptidos antigénicos (tal como se presentan por moléculas del MHC sobre la superficie de una célula para su reconocimiento inmunitario) usando métodos bien establecidos de síntesis de péptido. 15
Un fragmento único de un polipéptido de FGE, en general, tiene los rasgos y las características de fragmentos únicos tal como se trató anteriormente en relación con ácidos nucleicos. Como se reconocerá por aquellos expertos en la materia, el tamaño del fragmento único dependerá de factores tales como si el fragmento constituyera una parte de un dominio de proteína conservado. Por tanto, algunas regiones de SEC ID Nº: 2 requerirán segmentos 20 más largos para ser únicas, mientras que otras solo requerirán segmentos cortos, normalmente de entre 5 y 12 aminoácidos (por ejemplo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 aminoácidos de longitud o más, incluyendo cada número entero hasta la longitud completa, 287 aminoácidos de longitud).
Fragmentos únicos de un polipéptido son preferiblemente aquellos fragmentos que retienen una capacidad funcional 25 distinta del polipéptido. Las capacidades funcionales que pueden ser retenidas en un fragmento único de un polipéptido incluyen interacción con anticuerpos, interacción con otros polipéptidos o fragmentos de los mismos, interacción con otras moléculas, etc. Una actividad importante es la capacidad para actuar como una firma para identificar el polipéptido. Aquellos expertos en la materia están bien versados en métodos de selección de secuencias de aminoácidos únicas, normalmente basándose en la capacidad del fragmento único para distinguir 30 selectivamente la secuencia de interés de otras que miembros no de la familia. Una comparación de la secuencia del fragmento con las de bases de datos conocidas es normalmente todo lo que se necesita.
Pueden proporcionarse VARIANTEes de los polipéptidos de FGE descritos anteriormente. Como se usa en el presente documento, una “VARIANTEe” de un polipéptido de FGE es un polipéptido que contiene una o más 35 modificaciones a la secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido de FGE. Las modificaciones que crean una VARIANTEe de polipéptido de FGE se hacen normalmente al ácido nucleico que codifica el polipéptido de FGE, y pueden incluir deleciones, mutaciones puntuales, truncaciones, sustituciones de aminoácidos y adición de aminoácidos o restos distintos de aminoácido para: 1) reducir o eliminar una actividad de un polipéptido de FGE; 2) potenciar una propiedad de un polipéptido de FGE, tal como estabilidad de la proteína en un sistema de expresión o 40 la estabilidad de la unión proteína-ligando; 3) proporcionar una actividad o propiedad novedosa a un polipéptido de FGE, tal como adición de un epítope antigénico o adición de un resto detectable; o 4) proporcionar una unión equivalente o mejor a un receptor de polipéptido de FGE u otra molécula. Alternativamente, pueden hacerse modificaciones directamente al polipéptido, tal como por escisión, adición de una molécula conectora, adición de un resto detectable, tal como biotina, adición de un ácido graso, y similares. Las modificaciones también engloban 45 proteínas de fusión que comprenden la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos de FGE. Un experto en la materia estará familiarizado con métodos de predicción del efecto sobre la conformación de la proteína de un cambio en la secuencia de la proteína y, por tanto, puede “diseñar” un polipéptido de FGE de VARIANTEe según métodos conocidos. Un ejemplo de un método tal se describe por Dahiyat y Mayo en Science 278:82-87, 1997, mediante el cual pueden diseñarse proteínas de novo. El método puede aplicarse a una proteína conocida para variar solo una 50 porción de la secuencia del polipéptido. Aplicando los métodos computacionales de Dahiyat y Mayo, pueden proponerse VARIANTEes específicas del polipéptido de FGE y probarse para determinar si la VARIANTEe retiene una conformación deseada.
Las VARIANTEes pueden incluir polipéptidos de FGE que se modifican, específicamente para alterar una 55 característica del polipéptido no relacionada con su actividad fisiológica. Por ejemplo, pueden sustituirse o delecionarse residuos de cisteína para prevenir enlaces disulfuro no deseados. Similarmente, pueden cambiarse determinados aminoácidos para potenciar la expresión de un polipéptido de FGE eliminando la proteolisis mediante proteasas en un sistema de expresión (por ejemplo, residuos de aminoácido dibásico en sistemas de expresión de levadura en los que está presente actividad de proteasa KEX2). 60
Las mutaciones de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de FGE conservan preferiblemente el marco de lectura de aminoácidos de la secuencia codificante, y preferiblemente no crean regiones en el ácido nucleico que es probable que se hibriden para formar estructuras secundarias, tales como horquillas o bucles, que pueden ser perjudiciales para la expresión del polipéptido VARIANTEe. 65
Pueden hacerse mutaciones seleccionando una sustitución de aminoácidos, o mediante mutagénesis al azar de un sitio seleccionado en un ácido nucleico que codifica el polipéptido. Entonces se expresan polipéptidos VARIANTEes y se prueban para una o más actividades para determinar qué mutación proporciona un polipéptido VARIANTEe con las propiedades deseadas. Pueden hacerse mutaciones adicionales a VARIANTEes (o en polipéptidos de FGE no VARIANTEes) que son silenciosas en cuanto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que proporcionan 5 codones preferidos para la traducción en un huésped particular, o alteran la estructura del ARNm para, por ejemplo, potenciar la estabilidad y/o expresión. Los codones preferidos para la traducción de un ácido nucleico en, por ejemplo, Escherichia coli, células de mamífero, etc., son bien conocidos para aquellos expertos en la materia. Pueden hacerse todavía otras mutaciones a las secuencias no codificantes de un gen de FGE o clon de ADNc para potenciar la expresión del polipéptido. 10
El experto en la materia sabrá que pueden hacerse sustituciones de aminoácidos conservativas en polipéptidos de FGE para proporcionar VARIANTEes funcionalmente equivalentes de los polipéptidos anteriores, es decir, las VARIANTEes retienen las capacidades funcionales de los polipéptidos de FGE. Como se usa en el presente documento, una “sustitución de aminoácidos conservativa” se refiere a una sustitución de aminoácidos que no altera 15 significativamente la estructura terciaria y/o actividad del polipéptido. Pueden prepararse VARIANTEes según métodos de alteración de la secuencia del polipéptido conocidos para un experto habitual en la materia, e incluyen los que se encuentran en referencias que compilan tales métodos, por ejemplo Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 20 Nueva York. VARIANTEes funcionalmente equivalentes a modo de ejemplo de los polipéptidos de FGE incluyen sustituciones de aminoácidos conservativas de SEC ID Nº: 2. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen sustituciones hechas entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; y (g) E, D.
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Por tanto, se contemplan por la invención VARIANTEes funcionalmente equivalentes de polipéptidos de FGE, es decir, VARIANTEes de polipéptidos de FGE que retienen la función de los polipéptidos de FGE naturales. Se hacen normalmente sustituciones de aminoácidos conservativas en la secuencia de aminoácidos de polipéptidos de FGE para producir VARIANTEes funcionalmente equivalentes de polipéptidos de FGE mediante alteración de un ácido nucleico que codifica polipéptidos de FGE (SEC ID Nº: 1, 3). Tales sustituciones pueden hacerse mediante una 30 variedad de métodos conocidos por un experto habitual en la materia. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos mediante mutación dirigida por PCR, mutagénesis dirigida al sitio según el método de Kunkel (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985), o mediante síntesis química de un gen que codifica un polipéptido de FGE. La actividad de fragmentos funcionalmente equivalentes de polipéptidos de FGE puede probarse clonando el gen que codifica el polipéptido de FGE alterado en un vector de expresión bacteriano o de mamífero, 35 introduciendo el vector en una célula huésped apropiada, expresando el polipéptido de FGE alterado, y probando para una capacidad funcional de los polipéptidos de FGE como se divulga en el presente documento (por ejemplo, actividad de generación de Cα-formilglicina, etc.).
Puede utilizarse una variedad de metodologías bien conocidas por el experto en la materia para obtener moléculas 40 de FGE aisladas. El polipéptido puede purificarse a partir de células que producen de manera natural el polipéptido mediante medios cromatográficos o reconocimiento inmunológico. Alternativamente, puede introducirse un vector de expresión en células para provocar la producción del polipéptido. En otro método, pueden microinyectarse transcritos de ARNm o introducirse de otro modo en células para provocar la producción del polipéptido codificado. También puede usarse la traducción de ARNm de FGE en extractos libres de células tales como el sistema de lisado de 45 reticulocitos para producir polipéptidos de FGE. Aquellos expertos en la materia también pueden seguir fácilmente métodos conocidos de aislamiento de polipéptidos de FGE. Éstos incluyen, pero no se limitan a, inmunocromatografía, HPLC, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de inmunoafinidad.
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El aislamiento del ADNc de FGE también hace posible que el experto en la materia diagnostique un trastorno caracterizado por una expresión aberrante de FGE. Estos métodos implican determinar la expresión del gen de FGE, y/o polipéptidos de FGE derivados del mismo. En la imprimacióna situación, tales determinaciones pueden llevarse a cabo mediante cualquier ensayo de determinación de ácido nucleico convencional, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa, o ensayando con sondas de hibridación marcadas como se ejemplifica a continuación. En la última 55 situación, tal determinación puede llevarse a cabo mediante cualquier ensayo inmunológico convencional usando, por ejemplo, anticuerpos que se unen a la proteína FGE secretada. Un trastorno preferido que puede diagnosticarse según la invención es deficiencia múltiple de sulfatasas.
Pueden proporcionarse agentes de unión a péptido aislados que pueden ser, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos 60 de anticuerpos (“polipéptidos de unión”), que tienen la capacidad de unirse selectivamente a polipéptidos de FGE. Los anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, preparados según metodología convencional.
Significativamente, como es muy conocido en la técnica, solo una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el parátope, participa en la unión del anticuerpo a su epítope (véanse, en general, Clark, W.R. (1986) The 65 Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., Nueva York; Roitt, L (1991) Essential
Immunology, 7a ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc’ y Fc, por ejemplo, son efectores de la cascada del complemento, pero no participan en la unión a antígeno. Un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región pFc’, o que se ha producido sin la región pFc’, denominado un fragmento F(ab’)2, retiene ambos sitios de unión a antígeno de un anticuerpo intacto. Similarmente, un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región Fc, o que se ha producido sin la región Fc, denominado un fragmento Fab, retiene uno de 5 los sitios de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Avanzando adicionalmente, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unida covalentemente y una porción de la cadena pesada de anticuerpo denominada Fd. Los fragmentos Fd son los determinantes principales de la especificidad del anticuerpo (un fragmento Fd individual puede estar asociado con hasta diez cadenas ligeras diferentes si alterar la especificidad de anticuerpo) y los fragmentos Fd retienen la capacidad de unión a epítope en aislamiento. 10
Dentro de la porción de unión a antígeno de un anticuerpo, como es muy conocido en la técnica, hay regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que interaccionan directamente con el epítope del antígeno, y regiones estructurales (FR), que mantienen la estructura terciaria del parátope (véanse, en general, Clark, 1986; Roitt, 1991). En tanto el fragmento Fd de cadena pesada como la cadena ligera de inmunoglobulinas IgG, hay cuatro 15 regiones estructurales (de FR1 a FR4) separadas respectivamente por tres regiones determinantes de la complementariedad (de CDR1 a CDR3). Las CDR, y en particular las regiones CDR3, y más particularmente la CDR3 de cadena pesada, son ampliamente responsables de la especificidad del anticuerpo.
Ahora está bien establecido en la técnica que las regiones distintas de CDR de un anticuerpo de mamífero pueden 20 sustituirse por regiones similares de anticuerpos coespecíficos o heteroespecíficos mientras que retengan la especificidad epitópica del anticuerpo original. Esto se manifiesta de la manera más clara en el desarrollo y el uso de anticuerpos “humanizados” en los que se unen covalentemente CDR no humanas a regiones FR y/o Fc/pFc’ humanas para producir un anticuerpo funcional. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 4.816.567, 5.225.539, 5.585.089, 5.693.762 y 5.859.205. Por tanto, por ejemplo, la publicación internacional PCT número WO 92/04381 25 enseña la producción y el uso de anticuerpos frente al VSR murinos humanizados en los que al menos una porción de las regiones FR murinas se ha sustituido por regiones FR de origen humano. Tales anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos intactos con capacidad de unión a antígeno, se denominan frecuentemente anticuerpos “quiméricos”.
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Por tanto, como será evidente para un experto habitual en la materia, puede proporcionarse lo siguiente: fragmentos F(ab’)2, Fab, Fv y Fd; anticuerpos quiméricos en los que las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han sustituido por secuencias humanas o no humanas homólogas; anticuerpos de fragmento F(ab’)2 quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han sustituido por secuencias humanas o no humanas homólogas; anticuerpos de fragmento Fab quimérico en los que las regiones FR 35 y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han sustituido por secuencias humanas o no humanas homólogas; y anticuerpos de fragmento Fd quimérico en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 se han sustituido por secuencias humanas o no humanas homólogas. También pueden proporcionarse los denominados anticuerpos monocatenarios.
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Por tanto, pueden proporcionarse polipéptidos de numerosos tamaños y tipos que se unen específicamente a polipéptidos de FGE, y complejos tanto de polipéptidos de FGE como de sus componentes de unión. Estos polipéptidos también pueden derivarse de fuentes distintas de tecnología de anticuerpos. Por ejemplo, tales agentes de unión a polipéptido pueden proporcionarse mediante bibliotecas de péptidos degenerados que pueden prepararse fácilmente en disolución, en forma inmovilizada, como bibliotecas de presentación de péptidos en 45 flagelos bacterianos o como bibliotecas de presentación en fagos. También pueden sintetizarse bibliotecas combinatorias de péptidos que contienen uno o más aminoácidos. Pueden sintetizarse adicionalmente bibliotecas de péptidos y restos sintéticos distintos de péptidos.
La presentación en fagos puede ser particularmente eficaz en la identificación de péptidos de unión útiles en la 50 invención. Brevemente, se prepara una biblioteca de fagos (usando, por ejemplo, fago m13, fd o lambda), que presenta insertos de 4 a aproximadamente 80 residuos de aminoácido usando procedimientos convencionales. Los insertos pueden representar, por ejemplo, una matriz completamente degenerada o sesgada. Entonces pueden seleccionarse insertos que llevan fago que se unen al polipéptido de FGE o un complejo de FGE y un componente de unión. Este proceso puede repetirse a lo largo de varios ciclos de re-selección de fago que se unen al polipéptido 55 de FGE o complejo. Ciclos repetidos conducen a un enriquecimiento de fago que lleva secuencias particulares. Puede realizarse un análisis de secuencia de ADN para identificar las secuencias de los polipéptidos expresados. Puede determinarse la porción lineal mínima de la secuencia que se une al polipéptido de FGE o complejo. Puede repetirse el procedimiento usando una biblioteca sesgada que contiene insertos que contienen una parte o la totalidad de la porción lineal mínima más uno o más residuos degenerados adicionales en la dirección 5' o en la 60 dirección 3' de la misma. También pueden usarse métodos de selección de dos híbridos de levadura para identificar polipéptidos que se unen a los polipéptidos de FGE. Por tanto, los polipéptidos de FGE de la invención, o un fragmento de los mismos, o complejos de FGE y un componente de unión, pueden usarse para cribar bibliotecas de péptidos, incluyendo bibliotecas de presentación en fagos, para identificar y seleccionar componentes de unión a péptidos de los polipéptidos de FGE de la invención. Tales moléculas pueden usarse, como se ha descrito, para 65 ensayos de cribado, para protocolos de purificación, para interferir directamente con el funcionamiento de FGE y
para otros fines que serán evidentes para aquellos expertos habituales en la materia.
También puede usarse un polipéptido de FGE, o un fragmento del mismo, para aislar sus componentes de unión nativos. El aislamiento de componentes de unión puede realizarse según métodos bien conocidos. Por ejemplo, pueden unirse polipéptidos de FGE aislados a un sustrato, y después puede aplicarse una disolución que se 5 sospecha que contiene un componente de unión a FGE al sustrato. Si la pareja de unión para polipéptidos de FGE está presente en la disolución, entonces se unirá al polipéptido de FGE unido al sustrato. Entonces puede aislarse el componente de unión. Otras proteínas que son componentes de unión para FGE pueden aislarse mediante métodos similares sin experimentación excesiva. Un componente de unión preferido es una sulfatasa.
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Preferiblemente se producen polipéptidos de FGE de manera recombinante, aunque tales polipéptidos pueden aislarse de extractos biológicos. Polipéptidos de FGE producidos de manera recombinante incluyen proteínas quiméricas que comprenden una fusión de una proteína FGE con otro polipéptido, por ejemplo, un polipéptido capaz de proporcionar o potenciar la unión proteína-proteína, unión de ácido nucleico específica de secuencia (tal como GAL4), potenciar la estabilidad del polipéptido de FGE en condiciones de ensayo, o proporcionar un resto 15 detectable, tal como proteína verde fluorescente. Un polipéptido fusionado a un polipéptido o fragmento de FGE también puede proporcionar medios para detectar fácilmente la proteína de fusión, por ejemplo, mediante reconocimiento inmunológico o por marcado fluorescente.
La invención puede usarse en terapia génica. El procedimiento para realizar terapia génica ex vivo se explica 20 brevemente en la patente de EE.UU. 5.399.346 y en documentos presentados en la historia de presentación de esa patente, todos los cuales son documentos disponibles para el público. En general, implica la introducción in vitro de una copia funcional de un gen en una célula(s) de un sujeto que contiene una copia defectuosa del gen, y devolver la(s) célula(s) modificada(s) mediante ingeniería genética al sujeto. La copia funcional del gen está bajo el control operativo de elementos reguladores que permiten la expresión del gen en la(s) célula(s) modificada(s) mediante 25 ingeniería genética. Aquellos expertos habituales en la técnica conocen bien numerosas técnicas de transfección y transducción, así como vectores de expresión apropiados, algunos de los cuales se describen en la solicitud PCT W095/00654. También se contempla terapia génica in vivo usando vectores tales como adenovirus, retrovirus, virus del herpes y liposomas seleccionados como diana.
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Agentes de unión específicos para FGE, métodos de identificación y preparación de tales agentes, y su uso en diagnóstico, terapia y desarrollo farmacéutico. Por ejemplo, los agentes farmacológicos específicos para FGE son útiles en una variedad de aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, especialmente cuando la enfermedad o el pronóstico de la enfermedad está asociado con características de unión a FGE alteradas tales como en deficiencia múltiple de sulfatasas. Agentes de unión específicos para FGE novedosos incluyen anticuerpos específicos para 35 FGE, receptores de superficie celular, y otros agentes de unión naturales intracelulares y extracelulares identificados con ensayos tales como cribados de dos híbridos, y agentes de unión no naturales intracelulares y extracelulares identificados en cribados de bibliotecas químicas y similares.
En general, la especificidad de la unión de FGE a una molécula específica se determina mediante constantes de 40 equilibrio de unión. Las dianas que son capaces de unirse selectivamente a un polipéptido de FGE tienen preferiblemente constantes de equilibrio de unión de al menos aproximadamente 107 M-1, más preferiblemente al menos aproximadamente 108 M-1, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 109 M-1. Puede usarse una amplia variedad de ensayos basados en células y libres de células para demostrar la unión específica para FGE. Los ensayos basados en células incluyen uno, dos y tres cribados híbridos, ensayos en los que se inhibe o se 45 incrementa la transcripción mediada por FGE, etc. Ensayos libres de células incluyen ensayos de unión a proteína FGE, inmunoensayos, etc. Otros ensayos útiles para cribar agentes que se unen a polipéptidos de FGE incluyen transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (FRET), y análisis de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA).
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Puede proporcionarse un método de diagnóstico de un trastorno caracterizado por una expresión aberrante de una molécula de ácido nucleico, un producto de expresión de la misma, o un fragmento de un producto de expresión de la misma. El método implica poner en contacto una muestra biológica aislada de un sujeto con un agente que se une específicamente a la molécula de ácido nucleico, un producto de expresión de la misma, o un fragmento de un producto de expresión de la misma, y determinar la interacción entre el agente y la molécula de ácido nucleico o el 55 producto de expresión como una determinación del trastorno, en el que la molécula de ácido nucleico es una molécula de FGE. El trastorno es deficiencia múltiple de sulfatasas. Las mutaciones en el gen de FGE que provocan la expresión aberrante de moléculas de FGE produce los siguientes cambios de aminoácido en SEC ID Nº: 2: Met1Arg; Met1Val; Leu20Phe; Ser155Pro; Ala177Pro; Cys218Tyr; Arg224Trp; Asn259Ile; Pro266Leu; Ala279Val; Arg327Stop; Cys336Arg; Arg345Cys; Ala348Pro; Arg349Gln; Arg349Trp; Arg349Trp; Ser359Stop; o una 60 combinación de los mismos.
En el caso en el que la molécula sea una molécula de ácido nucleico, tales determinaciones pueden llevarse a cabo mediante cualquier ensayo de determinación de ácido nucleico estándar, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa, o ensayando con sondas de hibridación marcadas como se ejemplifica en el presente documento. En el 65 caso en el que la molécula sea un producto de expresión de la molécula de ácido nucleico, o un fragmento de un
producto de expresión de la molécula de ácido nucleico, tal determinación puede llevarse a cabo mediante cualquier ensayo inmunológico estándar usando, por ejemplo, anticuerpos que se unen a cualquiera de los productos de expresión de polipéptido.
“Expresión aberrante” se refiere a expresión disminuida (subexpresión) o expresión aumentada (sobreexpresión) de 5 moléculas de FGE (ácidos nucleicos y/o polipéptidos) en comparación con un control (es decir, expresión de la misma molécula en un sujeto sano o “normal”). Un “sujeto sano”, como se usa en el presente documento, se refiere a un sujeto que, según patrones médicos estándar, no tiene ni está en riesgo de desarrollar una deficiencia múltiple de sulfatasas. Los sujetos sanos tampoco muestran de otro modo síntomas de enfermedad. En otras palabras, tales sujetos, si se examinan por un profesional médico, se caracterizarían como sanos y libres de síntomas de una 10 deficiencia múltiple de sulfatasas. Éstos incluyen características de leucodistrofia metacromática y de una mucopolisacaridosis, tales como cantidades aumentadas de mucopolisacáridos ácidos en diversos tejidos, “gargolismo” leve, rápido deterioro neurológico, presencia excesiva de mucopolisacárido y sulfatida en la orina, proteína de líquido cefalorraquídeo aumentada y degeneración metacromática de mielina en nervios periféricos.
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Pueden usarse kits novedosos para medir los niveles de los ácidos nucleicos, o productos de expresión de los mismos.
En una realización, un kit comprende un envase que contiene un agente que se une selectivamente a cualquiera de los ácidos nucleicos aislados de FGE anteriores, o productos de expresión de los mismos, y un control para 20 comparar con un valor medido de unión de dicho agente a cualquiera de los ácidos nucleicos aislados de FGE anteriores o productos de expresión de los mismos. En algunas realizaciones, el control es un valor predeterminado para comparar con el valor medido. En determinadas realizaciones, el control comprende un epítope del producto de expresión de cualquiera de los ácidos nucleicos aislados de FGE anteriores. En una realización, el kit comprende además un segundo agente que se une selectivamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en 25 iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6, o un péptido de los mismos, y un control para comparar con un valor medido de unión de dicho segundo agente a dicho polipéptido o péptido del mismo.
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En el caso de detección de ácido nucleico, pueden incluirse pares de cebadores para amplificar una molécula de ácido nucleico de la invención. Los kits preferidos incluirían controles tales como cantidades conocidas de sondas de ácido nucleico, epítopes (tales como iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6, productos de expresión) o 35 anticuerpos anti-epítope, así como instrucciones u otro material impreso. En determinadas realizaciones, el material impreso puede caracterizar el riesgo de desarrollar una afección de deficiencia de sulfatasa basándose en el resultado del ensayo. Los reactivos pueden envasarse en recipientes y/o recubrirse sobre pocillos en cantidades predeterminadas, y los kits pueden incluir materiales estándar tales como reactivos inmunológicos marcados (tales como anticuerpos anti-lgG marcados) y similares. Un kit es una placa de microtitulación de poliestireno envasada 40 recubierta con proteína FGE y un recipiente que contiene anticuerpos anti-lgG humana marcados. Se pone en contacto un pocillo de la placa con, por ejemplo, un líquido biológico, se lava y después se pone en contacto con el anticuerpo anti-lgG. Entonces se detecta el marcador. En la Figura 25 se ilustra un kit que es ejemplo de las características de la presente invención, generalmente designado con el número 11. El kit 11 comprende los siguientes elementos principales: un envase 15, un agente 17 como se describe en el presente documento, un 45 agente 19 de control e instrucciones 21. El envase 15 es una estructura de tipo caja para contener un vial (o varios viales) que contiene un agente 17 de la invención, un vial (o varios viales) que contiene un agente de control 19, e instrucciones 21. Los expertos en la materia pueden modificar fácilmente el envase 15 para adaptarlo a necesidades individuales.
50
Un método para tratar deficiencia múltiple de sulfatasas en un sujeto implica administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento un agente que modula la actividad de generación de Cα-formilglicina, en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de generación de Cα-formilglicina en el sujeto. En algunas realizaciones, el método comprende además co-administrar un agente seleccionado del grupo que consiste en una molécula de ácido nucleico que codifica iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, 55 arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6, un producto de expresión de la molécula de ácido nucleico, y/o un fragmento del producto de expresión de la molécula de ácido nucleico.
“Agentes que modulan la expresión” de un ácido nucleico o un polipéptido, como se usa en el presente documento, 60 se conocen en la técnica, y se refieren a ácidos nucleicos sentido y antisentido, ácidos nucleicos negativos dominantes, anticuerpos para los polipéptidos, y similares. Es útil cualquier agente que module la expresión de una molécula (y como se describe en el presente documento, module su actividad). En determinadas realizaciones, el agente que modula la actividad de generación de Cα-formilglicina es una molécula de ácido nucleico aislada (por ejemplo, un ácido nucleico de SEC ID Nº: 3). En realizaciones importantes, el agente que modula la actividad de 65 generación de Cα-formilglicina es un péptido descrito en el presente documento (por ejemplo, un péptido de SEC ID
Nº: 2). En algunas realizaciones, el agente que modula la actividad de generación de Cα-formilglicina es un ácido nucleico sentido.
Se proporciona un método para aumentar la actividad de generación de Cα-formilglicina en un sujeto. El método implica administrar una molécula de ácido nucleico de FGE aislada de la invención, y/o un producto de expresión de la misma, a un sujeto, en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de generación de Cα-formilglicina en el 5 sujeto.
Se proporciona un método de aumento de la actividad de generación de Cα-formilglicina en una célula. El método implica poner en contacto la célula con una molécula de ácido nucleico aislada descrita en el presente documento (por ejemplo, un ácido nucleico de SEC ID Nº: 1), o un producto de expresión de la misma (por ejemplo, un péptido 10 de SEC ID Nº: 2), en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de generación de Cα-formilglicina en la célula. En realizaciones importantes, el método implica activar el gen de FGE endógeno para aumentar la actividad de generación de Cα-formilglicina en la célula.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el ácido nucleico puede estar operativamente acoplado a una 15 secuencia de expresión génica que dirige la expresión de la molécula de ácido nucleico dentro de una célula eucariota, como una célula HT-1080. La “secuencia de expresión génica” es cualquier secuencia de nucleótidos reguladora, tal como una secuencia promotora o combinación de promotor-potenciador, que facilita la transcripción y traducción eficaces del ácido nucleico al que está operativamente unida. La secuencia de expresión génica puede ser, por ejemplo, un promotor de mamífero o viral, tal como un promotor constitutivo o inducible. Promotores de 20 mamífero constitutivos incluyen, pero no se limitan a, los promotores para los siguientes genes: hipoxantina fosforibosil transferasa (HFTR), adenosina desaminasa, piruvato cinasa, promotor de α-actina y otros promotores constitutivos. Promotores virales a modo de ejemplo que funcionan constitutivamente en células eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores del virus simio, virus del papiloma, adenovirus, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus del sarcoma de Rous, citomegalovirus, las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de leucemia de 25 Moloney y otros retrovirus, y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Otros promotores constitutivos son conocidos por aquellos expertos habituales en la técnica. Los promotores útiles como secuencias de expresión génica de la invención también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles se activan en presencia de un agente de inducción. Por ejemplo, el promotor de metalotioneína se activa para aumentar la transcripción y traducción en presencia de determinados iones metálicos. Otros promotores inducibles son conocidos 30 por aquellos expertos habituales en la técnica.
En general, la secuencia de expresión génica debe incluir, según sea necesario, secuencias no transcritas en 5' y no traducidas en 5’ que participan en la iniciación de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como una caja TATA, secuencia de ocupación, secuencia CAAT y similares. Especialmente, tales secuencias no transcritas en 5' 35 incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico operativamente unido. Las secuencias de expresión génica incluyen opcionalmente secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en la dirección 5', según se desee.
Preferiblemente, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de FGE descritas en el presente documento está 40 enlazada a una secuencia de expresión génica que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula de un linaje celular específico, por ejemplo, una neurona. Una secuencia que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula tal como una neurona es una que es selectivamente activa en un tipo de célula tal, provocando así la expresión de la molécula de ácido nucleico en esas células. El promotor de sinapsina 1, por ejemplo, puede usarse para expresar cualquiera de las moléculas de ácido nucleico anteriores de la invención en 45 una neurona; y el promotor del gen del factor de von Willebrand, por ejemplo, puede usarse para expresar una molécula de ácido nucleico en una célula endotelial vascular. Aquellos expertos habituales en la técnica serán capaces de identificar fácilmente promotores alternativos que son capaces de expresar una molécula de ácido nucleico en cualquiera de las células preferidas.
50
Se dice que la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de expresión génica están “operativamente enlazadas” cuando están unidas covalentemente de tal manera que se coloca la transcripción y/o traducción de la secuencia codificante de ácido nucleico (por ejemplo, en el caso de FGE, SEC ID Nº: 3) bajo la influencia o el control de la secuencia de expresión génica. Si se desea que la secuencia de ácido nucleico se traduzca en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están operativamente enlazadas si la inducción de un promotor en la 55 secuencia de expresión génica en 5' produce la transcripción de la secuencia de ácido nucleico y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) produce la introducción de una mutación del marco de lectura, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia de ácido nucleico, y/o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente para traducirse en una proteína. Por tanto, una secuencia de expresión génica estaría operativamente enlazada a una secuencia de ácido nucleico si la secuencia 60 de expresión génica fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ácido nucleico de tal manera que el transcrito resultante pudiera traducirse en la proteína o polipéptido deseado.
Las moléculas descritas en el presente documento pueden administrarse a los tipos de célula preferidos solas o en asociación con un vector (véase también la discusión anterior sobre vectores). En su sentido más amplio (y de 65 manera coherente con la descripción de vectores de expresión y de direccionamiento en otra parte en el presente
documento), un “vector” es cualquier vehículo capaz de facilitar: (1) la administración de una molécula a una célula diana y/o (2) la captación de la molécula por una célula diana. Preferiblemente, los vectores de administración transportan la molécula al interior de la célula diana con degradación reducida con respecto al grado de degradación que se produciría en ausencia del vector. Opcionalmente, puede unirse un “ligando de direccionamiento” al vector para administrar selectivamente el vector a una célula que expresa sobre su superficie el receptor relacionado para 5 el ligando de direccionamiento. De esta manera, el vector (que contiene un ácido nucleico o una proteína) puede administrarse selectivamente a una neurona. Metodologías para el direccionamiento incluyen conjugados, tales como los descritos en la patente de EE.UU. 5.391.723 concedida a Priest. Otro ejemplo de un vehículo de direccionamiento bien conocido es un liposoma. Los liposomas están comercialmente disponibles de Gibco BRL. Están publicados numerosos métodos para preparar liposomas de direccionamiento. 10
En general, los vectores útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos, virus, otros vehículos derivados de cepas virales o bacterianas que se han manipulado mediante la inserción o incorporación de las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento, y fragmentos de ácido nucleico adicionales (por ejemplo, potenciadores, promotores) que pueden unirse a las secuencias de ácido nucleico descritas en el 15 presente documento. Vectores virales son un tipo preferido de vector e incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: adenovirus; virus adeno-asociado; retrovirus, tales como virus de la leucemia murina de Moloney; virus del sarcoma murino de Harvey; virus de tumor de mama murino; virus del sarcoma de Rous; virus de tipo SV40; virus del polioma; virus de Epstein-Barr; virus del papiloma; virus del herpes; virus de la variolovacuna; virus de la polio; y virus de ARN tales como un retrovirus. Pueden emplearse fácilmente otros 20 vectores no mencionados, pero conocidos en la técnica.
Un virus particularmente preferido para determinadas aplicaciones es el virus adeno-asociado, un virus de ADN bicatenario. El virus adeno-asociado es capaz de infectar una amplia gama de tipos de células y especies y puede diseñarse mediante ingeniería para ser deficiente para la replicación. Además tiene ventajas, tales como estabilidad 25 al calor y a disolventes de lípidos, altas frecuencias de transducción en células de diversos linajes, incluyendo células hematopoyéticas, y falta de inhibición de superinfección, permitiendo así múltiples series de transducciones. Se notifica que el virus adeno-asociado puede integrarse en el ADN celular humano de una manera específica del sitio, minimizando así la posibilidad de mutagénesis por inserción y la variabilidad de la expresión del gen insertado. Además, se ha realizado un seguimiento de infecciones por virus adeno-asociado no mutante en cultivo tisular 30 durante más de 100 pasos en ausencia de presión selectiva, que implica que la integración genómica del virus adeno-asociado es un acontecimiento relativamente estable. El virus adeno-asociado también puede funcionar de una manera extracromosómica.
En general, otros vectores virales preferidos se basan en virus eucariotas no citopáticos en los que se han sustituido 35 genes no esenciales por el gen de interés. Virus no citopáticos incluyen retrovirus, cuyo ciclo de vida implica la transcripción inversa de ARN viral genómico en ADN con la posterior integración proviral en el ADN celular huésped. Se han aprobado adenovirus y retrovirus para ensayos de terapia génica humana. En general, los retrovirus son deficientes para la replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Tales vectores de expresión retrovirales genéticamente alterados tienen utilidad 40 general para la transducción de alta eficacia de genes in vivo. Se proporcionan protocolos estándar para producir retrovirus deficientes para la replicación (incluyendo las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una línea celular de empaquetamiento con plásmido, producción de retrovirus recombinantes mediante la línea celular de empaquetamiento, recogida de partículas virales de medios de cultivo tisular, e infección de las células diana con partículas virales) en Kriegler, M., “Gene Transfer and Expression, A 45 Laboratory Manual”, W.H. Freeman C.O., Nueva York (1990) y Murry, E.J. Ed. “Methods in Molecular Biology”, vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, Nueva Jersey (1991).
Otro vector retroviral preferido es el vector derivado del virus de la leucemia murina de Moloney, como se describe Nabel, E.G., et al., Science, 1990, 249:1285-1288. Se notifica que estos vectores fueron eficaces para la 50 administración de genes a las tres capas de la pared arterial, incluyendo la media. Otros vectores preferidos se divulgan en Flugelman, et al., Circulation, 1992, 85:1110-1117. Vectores adicionales que son útiles para administrar moléculas de la invención descritas en el presente documento se describen en la patente de EE.UU. Nº 5.674.722 de Mulligan, et al.
55
Además de los vectores anteriores, pueden usarse otros métodos de administración para suministrar una molécula descrita en el presente documento a una célula tal como una neurona, hígado, fibroblasto y/o una célula endotelial vascular, y facilitar la captación por la misma.
Un método de administración tal preferido de la invención es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de 60 dispersión coloidal incluyen sistemas basados en lípidos incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido es un liposoma. Los liposomas son vasos de membrana artificiales que son útiles como vector de administración in vivo o in vitro. Se ha mostrado que vasos unilaminares grandes (LUV), cuyo tamaño oscila de 0,2 - 4,0 µm, pueden encapsular macromoléculas grandes. Pueden encapsularse ARN, ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y administrarse a las células en una forma biológicamente 65 activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 1981, 6:77). Con el fin de que un liposoma sea un vector de transferencia
génica eficaz, debe estar presente una o más de las siguientes características: (1) encapsulación del gen de interés con alta eficacia con retención de actividad biológica; (2) unión preferible y sustancial a una célula diana en comparación con células no diana; (3) administración del contenido acuoso de la vesícula al citoplasma de la célula diana con alta eficacia; y (4) expresión precisa y eficaz de la información genética.
5
Pueden dirigirse liposomas a un tejido particular, tal como el miocardio o la pared de células vasculares, acoplando el liposoma a un ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido o proteína. Ligandos que pueden ser útiles para dirigir un liposoma a la pared vascular incluyen, pero no se limitan a, la proteína viral de la cubierta del virus hemaglutinante de Japón. Adicionalmente, el vector puede acoplarse a un péptido de direccionamiento nuclear, que dirigirá el ácido nucleico al núcleo de la célula huésped. 10
Los liposomas están comercialmente disponibles de Gibco BRL, por ejemplo, como LIPOFECTIN™ y LIPOFECTACE™, que están formados por lípidos catiónicos tales como cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) y bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB). Métodos de preparación de liposomas se conocen bien en la técnica y se han descrito en muchas publicaciones. También se han revisado liposomas por 15 Gregoriadis, G. en Trends in Biotechnology. V. 3, págs. 235-241 (1985). También se describen liposomas novedosos para la administración intracelular de macromoléculas, incluyendo ácidos nucleicos, en la solicitud internacional PCT nº PCT/US96/07572 (publicación Nº WO 96/40060, titulada “Intracellular Delivery of Macromolecules”).
En una realización particular, el vehículo preferido es una micropartícula biocompatible o implante que es adecuado 20 para su implantación en el receptor mamífero. Implantes bioerosionables a modo de ejemplo que son útiles según este método se describen en la solicitud internacional PCT nº PCT/US/03307 (publicación Nº WO 95/24929, titulada “Polymeric Gene Delivery System”, que reivindica prioridad a la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 213.668, presentada el 15 de marzo de 1994). El documento PCT/US/0307 describe una matriz polimérica biocompatible, preferiblemente biodegradable, para contener un gen exógeno bajo el control de un promotor apropiado. La matriz 25 polimérica se usa para lograr la liberación sostenida del gen exógeno en el paciente. Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden encapsularse o dispersarse dentro de la matriz polimérica biocompatible, preferiblemente biodegradable, divulgada en el documento PCT/US/03307. La matriz polimérica está preferiblemente en forma de una micropartícula, tal como una microesfera (en la que un ácido nucleico se dispersa por la totalidad de una matriz polimérica sólida) o una microcápsula (en la que un ácido nucleico está almacenado en el núcleo de una 30 carcasa polimérica). Otras formas de la matriz polimérica para contener los ácidos nucleicos de la invención incluyen películas, recubrimientos, geles, implantes y prótesis endovasculares. El tamaño y la composición del dispositivo de matriz polimérica se seleccionan para producir una cinética de liberación favorable en el tejido en el que se implanta el dispositivo de matriz. El tamaño del dispositivo de matriz polimérica se selecciona además según el método de administración que va a usarse, normalmente inyección en un tejido o administración de una suspensión mediante 35 aerosol en las áreas nasal y/o pulmonar. La composición de matriz polimérica puede seleccionarse para que tenga tanto tasas de degradación favorables como también para estar formada de un material que es bioadhesivo, para aumentar adicionalmente la eficacia de transferencia cuando el dispositivo se administra a una superficie vascular. La composición de matriz también puede seleccionarse para no degradarse, sino más bien para liberarse mediante difusión a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. 40
Pueden usarse matrices poliméricas tanto biodegradables como no biodegradables para administrar los ácidos de la invención al sujeto. Se prefieren matrices biodegradables. Tales polímeros pueden ser polímeros naturales o sintéticos. Se prefieren polímeros sintéticos. El polímero se selecciona basándose en el periodo de tiempo a lo largo del cual se desea la liberación, generalmente en el orden de algunas horas a un año o más. Normalmente, la 45 liberación a lo largo de un periodo que oscila entre algunas horas y de tres a doce meses es lo más deseable. El polímero está opcionalmente en forma de un hidrogel que puede absorber hasta aproximadamente el 90 % de su peso en agua y más, opcionalmente está reticulado con iones multivalentes u otros polímeros.
En general, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden administrarse usando el implante 50 bioerosionable mediante difusión, o más preferiblemente, mediante degradación de la matriz polimérica. Polímeros sintéticos a modo de ejemplo que pueden usarse para formar el sistema de administración biodegradable incluyen: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicoles, poli(óxidos de alquileno), poli(tereftalatos de alquileno), poli(alcoholes vinílicos), poliviniléteres, poli(ésteres vinílicos), poli(haluros de vinilo), polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polisiloxanos, poliuretanos y copolímeros de los mismos, alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosas, éteres 55 de celulosa, ésteres de celulosa, nitrocelulosas, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hipromelosa, hidroxibutilmetilcelulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato-butirato de celulosa, acetato-ftalato de celulosa, carboxiletilcelulosa, triacetato de celulosa, sal sódica de sulfato de celulosa, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de 60 fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli(acrilato de octadecilo), polietileno, polipropileno, polietilenglicol, poli(óxido de etileno), poli(tereftalato de etileno), poli(alcoholes vinílicos), poli(acetato de vinilo), poli(cloruro de vinilo), poliestireno y polivinilpirrolidona.
Ejemplos de polímeros no biodegradables incluyen etileno-acetato de vinilo, poli(ácido (met)acrílico), poliamidas, 65 copolímeros y mezclas de los mismos.
Ejemplos de polímeros biodegradables incluyen polímeros sintéticos tales como polímeros de ácido láctico y ácido glicólico, polianhídridos, poli(orto)ésteres, poliuretanos, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico) y poli(lactida-co- caprolactona), y polímeros naturales tales como alginato y otros polisacáridos incluyendo dextrano y celulosa, colágeno, derivados químicos de los mismos (sustituciones, adiciones de grupos químicos, por ejemplo, alquilo, 5 alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones y otras modificaciones realizadas rutinariamente por aquellos expertos en la materia), albúmina y otras proteínas hidrófilas, zeína y otras prolaminas y proteínas hidrófobas, copolímeros y mezclas de los mismos. En general, estos materiales se degradan o bien mediante hidrólisis enzimática o bien mediante exposición a agua in vivo, mediante erosión superficial o en masa.
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Polímeros bioadhesivos de interés particular incluyen hidrogeles bioerosionables descritos por H.S. Sawhney, C.P. Pathak y J.A. Hubell en Macromolecules, 1993, 26, 581-587, poli(ácidos hialurónicos), caseína, gelatina, glutina, polianhídridos, poli(ácido acrílico), alginato, quitosano, poli(metacrilatos de metilo), poli(metacrilatos de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo) poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato 15 de isobutilo) y poli(acrilato de octadecilo). Por tanto, puede proporcionarse una composición de las moléculas anteriormente descritas de la invención para su uso como medicamento, métodos de preparación del medicamento y métodos para la liberación sostenida del medicamento in vivo.
También pueden usarse agentes de compactación en combinación con un vector descrito en el presente documento. 20 Un “agente de compactación”, como se usa en el presente documento, se refiere a un agente, tal como una histona, que neutraliza las cargas negativas en el ácido nucleico y así permite la compactación del ácido nucleico en un gránulo fino. La compactación del ácido nucleico facilita la captación del ácido nucleico por la célula diana. Los agentes de compactación pueden usarse solos, es decir, para administrar un ácido nucleico aislado descrito en el presente documento en una forma que se capta más eficazmente por la célula o, más preferiblemente, en 25 combinación con uno o más de los vectores descritos anteriormente.
Otras composiciones a modo de ejemplo que pueden usarse para facilitar la captación por una célula diana de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento incluyen fosfato de calcio y otros mediadores químicos de transporte intracelular, composiciones de microinyección y electroporación. 30
Pueden proporcionarse métodos de aumento de la actividad de sulfatasa en una célula. Tales métodos implican poner en contacto una célula que expresa una sulfatasa con una molécula de ácido nucleico aislada descrita en el presente documento (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de FGE que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 3, 4, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 y 80-35 87), o un producto de expresión de la misma (por ejemplo, un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78), en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de sulfatasa en la célula. “Aumentar” la actividad de sulfatasa, como se usa en el presente documento, se refiere a aumentar la afinidad por, y/o conversión de, el sustrato específico para la sulfatasa, normalmente el resultado de un aumento en la formación de FGIy en la molécula de sulfatasa. En una 40 realización, la célula expresa una sulfatasa a niveles superiores a los de células no mutantes. Por “aumentar la actividad de sulfatasa en una célula” también se refiere a aumentar la actividad de una sulfatasa que se secreta por la célula. La célula puede expresar una sulfatasa endógena y/o exógena. Dicho poner en contacto la molécula de FGE también se refiere a activar el gen de FGE endógeno de las células. En realizaciones importantes, se activa la sulfatasa endógena. En determinadas realizaciones, la sulfatasa es iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-45 acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y/o HSulf-6. En determinadas realizaciones la célula es una célula de mamífero.
Puede proporcionarse una composición farmacéutica. La composición puede comprender una sulfatasa que se 50 produce por una célula, en una cantidad farmacéuticamente eficaz para tratar una deficiencia de sulfatasa, y un vehículo, en el que dicha célula se ha puesto en contacto con un agente que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una FGE (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 1, 3, 4, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 y 80-87), o un producto de expresión de la misma (por ejemplo, un péptido seleccionado del grupo que 55 consiste en la SEC ID Nº: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78). En realizaciones importantes, la sulfatasa se expresa a niveles superiores que en células normales/control.
También puede proporcionarse una célula que produce sulfatasa; en la que se aumenta la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida por la célula. La célula comprende: (i) una sulfatasa con una actividad 60 aumentada en comparación con un control, y (ii) una enzima generadora de formilglicina con una actividad aumentada en comparación con un control, en la que la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida por la célula se aumenta en al menos el 5 % con respecto a la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida por la célula en ausencia de la enzima generadora de formilglicina. Se conoce en la técnica que la sobreexpresión de sulfatasas puede disminuir la actividad de sulfatasas endógenas (Anson et al., Biochem. J., 65 1993, 294:657-662). Además, solo una fracción de las sulfatasas recombinantes es activa. Los presentes inventores
han descubierto, inesperadamente, que la expresión/actividad aumentada de FGE en una célula con expresión/actividad aumentada de una sulfatasa produce la producción de una sulfatasa que es más activa. Como la presencia de FGIy en una molécula de sulfatasa está asociada con actividad de sulfatasa, puede cuantificarse la “sulfatasa activa” determinando la presencia de FGIy en el producto celular de sulfatasa usando espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en otra parte en el presente documento. Entonces puede determinarse 5 fácilmente la razón con sulfatasa total.
Pueden proporcionarse métodos para el diagnóstico y la terapia de deficiencias de sulfatasa. Tales trastornos incluyen, pero no se limitan a, deficiencia múltiple de sulfatasas, mucopolisacaridosis II (MPS II; síndrome de Hunter), mucopolisacaridosis IIIA (MPS IIIA; síndrome de Sanfilippo A), mucopolisacaridosis VIII (MPS VIII), 10 mucopolisacaridosis IVA (MPS IVA; síndrome de Morquio A), mucopolisacaridosis VI (MPS VI; síndrome de Maroteaux-Lamy), leucodistrofia metacromática (MLD), condrodisplasia punctata 1 recesiva ligada al cromosoma X e ictiosis ligada al cromosoma X (deficiencia de sulfatasa esteroidea).
Los métodos descritos en el presente documento son útiles en el tratamiento tanto agudo como profiláctico de 15 cualquiera de las afecciones anteriores. Como se usa en el presente documento, un tratamiento agudo se refiere al tratamiento de sujetos que tienen una afección particular. Tratamiento profiláctico se refiere al tratamiento de sujetos en riesgo de tener la afección, pero que actualmente no tienen o experimentan los síntomas de la afección.
En su sentido más amplio, los términos “tratamiento” o “tratar” se refieren a tratamientos tanto agudos como 20 profilácticos. Si el sujeto en necesidad de tratamiento está experimentando una afección (o tiene o está teniendo una afección particular), entonces tratar la afección se refiere a mejorar, reducir o eliminar la afección o uno o más síntomas que surgen de la afección. En algunas realizaciones preferidas, tratar la afección se refiere a mejorar, reducir o eliminar un síntoma específico o un subconjunto específico de síntomas asociados a la afección. Si el sujeto en necesidad de tratamiento es uno que está en riesgo de tener una afección, entonces tratar al sujeto se 25 refiere a reducir el riesgo de que el sujeto tenga la afección.
El modo de administración y la dosificación de un agente terapéutico descrito en el presente documento variarán con el estadio particular de la afección que está tratándose, la edad y la condición física del sujeto que está tratándose, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), la vía específica de administración, y 30 factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional sanitario.
Como se describe en el presente documento, se administran agentes en cantidades eficaces para tratar cualquiera de las deficiencias de sulfatasa anteriores. En general, una cantidad eficaz es cualquier cantidad que puede provocar un cambio beneficioso en un tejido deseado de un sujeto. Preferiblemente, una cantidad eficaz es la 35 cantidad suficiente para provocar un cambio fenotípico favorable en una afección particular tal como una reducción, alivio o eliminación de un síntoma o de una afección en su totalidad.
En general, una cantidad eficaz es la cantidad de una preparación farmacéutica que sola, o junto con dosis adicionales, produce la respuesta deseada. Esto puede implicar solo ralentizar la progresión de la afección 40 temporalmente, aunque más preferiblemente, implica detener la progresión de la afección permanentemente o retrasar la aparición de, o prevenir que se produzca, la afección. Esto puede monitorizarse mediante métodos rutinarios. Generalmente, las dosis de compuestos activos serían de aproximadamente 0,01 mg/kg por día a 1000 mg/kg por día. Se espera que dosis que oscilan de 50 µg-500 mg/kg sean adecuadas, preferiblemente por vía oral y en una o varias administraciones por día. 45
Tales cantidades dependerán, por supuesto, de la afección particular que está tratándose, la gravedad de la afección, los parámetros del paciente individual incluyendo edad, condición física, tamaño y peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional sanitario. Dosis inferiores resultarán de determinadas formas 50 de administración, tales como administración intravenosa. En el caso de que una respuesta en un sujeto sea insuficiente a las dosis iniciales aplicadas, pueden emplearse dosis superiores (o dosis eficazmente superiores mediante una vía de administración diferente, más localizada) hasta el grado que lo permita la tolerancia del paciente. Se contemplan múltiples dosis por día para lograr niveles sistémicos apropiados de compuestos. Se prefiere generalmente que se use una dosis máxima, es decir, la dosis segura más alta según el criterio médico 55 sensato. Sin embargo, aquellos expertos habituales en la materia entenderán que un paciente puede insistir en una dosis inferior o dosis tolerable por motivos médicos, motivos psicológicos o por prácticamente cualquier otro motivo.
Los agentes descritos en el presente documento pueden combinarse, opcionalmente, con un vehículo farmacéuticamente aceptable para formar una preparación farmacéutica. La expresión “vehículo farmacéuticamente 60 aceptable”, como se usa en el presente documento, significa una o más cargas, diluyentes o sustancias de encapsulación sólidas o líquidas compatibles, que son adecuadas para su administración en un ser humano. El término “vehículo” indica un componente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el principio activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también pueden estar entremezclados con las moléculas de la presente invención, y entre sí, de una manera tal que no haya interacción 65 que afectara sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada. En algunos aspectos, las preparaciones
farmacéuticas comprenden un agente descrito en el presente documento en una cantidad eficaz para tratar un trastorno.
Las preparaciones farmacéuticas pueden contener agentes de tamponamiento adecuados, incluyendo: ácido acético en una sal; ácido cítrico en una sal; ácido bórico en una sal; o ácido fosfórico en una sal. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener, opcionalmente, conservantes adecuados, tales como: cloruro de 5 benzalconio; clorobutanol; parabenos o timerosal.
Están disponibles una variedad de vías de administración. El modo particular seleccionado dependerá, por supuesto, del fármaco particular seleccionado, la gravedad de la afección que está tratándose y la dosificación requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos descritos en el presente documento, de manera general, pueden ponerse en 10 práctica usando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, que significa cualquier modo que produzca niveles eficaces de los compuestos activos sin provocar efectos adversos clínicamente inaceptables. Tales modos de administración incluyen vías oral, rectal, tópica, nasal, intradérmica, transdérmica o parenteral. El término “parenteral” incluye subcutáneo, intravenoso, intraomental, intramuscular o infusión. Las vías intravenosa o intramuscular no son particularmente adecuadas para terapia y profilaxis a largo plazo. Como un ejemplo, pueden 15 formularse composiciones farmacéuticas para el tratamiento agudo de sujetos que tienen una cefalea de tipo migraña de una variedad de formas diferentes y para una variedad de modos de administración incluyendo comprimidos, cápsulas, polvos, supositorios, inyecciones y esprays nasales.
Las preparaciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden 20 prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de poner el principio activo en asociación con un vehículo que constituye uno o más componentes auxiliares. En general, las composiciones se preparan poniendo de manera uniforme e íntima el compuesto activo en asociación con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y luego, si es necesario, moldear el producto. 25
Pueden presentarse composiciones adecuadas para administración oral como unidades diferenciadas, tales como cápsulas, comprimidos, pastillas para chupar, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del compuesto activo. Otras composiciones incluyen suspensiones en líquidos acuosos o líquidos no acuosos tales como un jarabe, elixir o una emulsión. 30
Composiciones adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa estéril de un agente de la invención, que es preferiblemente isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación acuosa puede formularse según métodos conocidos usando agentes de dispersión y humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución o suspensión inyectable 35 estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, disolución de Ringer y disolución isotónica de cloruro sódico. Además, se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles como medio disolvente o de suspensión. Para este fin puede emplearse cualquier aceite no volátil suave incluyendo mono o di-glicéridos sintéticos. Además, pueden usarse ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de 40 inyectables. Pueden encontrarse formulaciones adecuadas para administraciones oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc., en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.
Puede proporcionarse un método para aumentar la actividad de generación de Cα-formilglicina en una célula. El método implica poner en contacto la célula con una molécula de ácido nucleico aislada (por ejemplo, un ácido 45 nucleico de SEC ID Nº: 1), o un producto de expresión de la misma (por ejemplo, un péptido de SEC ID Nº: 2), en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de generación de Cα-formilglicina en la célula. En realizaciones importantes, el método implica activar el gen de FGE endógeno para aumentar la actividad de generación de Cα-formilglicina en la célula. En algunas realizaciones, la puesta en contacto se realiza en condiciones que permiten la entrada de una molécula descrita en el presente documento en la célula. 50
La expresión “permitir la entrada” de una molécula en una célula tiene los siguientes significados dependiendo de la naturaleza de la molécula. Para un ácido nucleico aislado pretende describir la entrada del ácido nucleico a través de la membrana celular y en el núcleo de la célula, tras lo cual el “transgén de ácido nucleico” puede utilizar la maquinaria de la célula para producir polipéptidos funcionales codificados por el ácido nucleico. Por “transgén de 55 ácido nucleico” se pretende describir todos los ácidos nucleicos descritos en el presente documento con o sin los vectores asociados. Para un polipéptido, se pretende describir la entrada del polipéptido a través de la membrana celular y al interior del citoplasma celular, y si es necesario, la utilización de la maquinaria citoplasmática de la célula para modificar funcionalmente el polipéptido (por ejemplo, para dar una forma activa).
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Pueden emplearse diversas técnicas para introducir los ácidos nucleicos descritos en el presente documento en células, dependiendo de si los ácidos nucleicos se introducen in vitro o in vivo en un huésped. Tales técnicas incluyen transfección de precipitados de ácido nucleico-CaPO4, transfección de ácidos nucleicos asociados con DEAE, transfección con un retrovirus que incluye el ácido nucleico de interés, transfección mediada por liposoma y similares. Para determinados usos, se prefiere dirigir el ácido nucleico a células particulares. En tales casos, un 65 vehículo usado para administrar un ácido nucleico descrito en el presente documento al interior de una célula (por
ejemplo, un retrovirus, u otro virus; un liposoma) puede tener una molécula de direccionamiento unida al mismo. Por ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana superficial en la célula diana o un ligando para un receptor en la célula diana puede unirse al, o incorporarse dentro del, vehículo de administración de ácido nucleico. Por ejemplo, cuando se emplean liposomas para suministrar los ácidos nucleicos descritos en el presente documento, pueden incorporarse proteínas que se unen a una proteína de membrana 5 superficial asociada con la endocitosis en la formulación de liposoma para dirigir y/o para facilitar la captación. Tales proteínas incluyen proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas tróficos para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización en la ciclación, proteínas que seleccionan como diana una localización intracelular y potencian la semivida intracelular, y similares. También se han usado satisfactoriamente sistemas de administración poliméricos para administrar ácidos nucleicos al interior de células, 10 como conocen aquellos expertos en la materia. Tales sistemas permiten incluso la administración oral de ácidos nucleicos.
Otros sistemas de administración pueden incluir sistemas de administración de liberación en el tiempo, liberación retrasada o liberación sostenida. Tales sistemas pueden evitar administraciones repetidas de un agente de la 15 presente invención, aumentando la conveniencia para el sujeto y el médico. Están disponibles muchos tipos de sistemas de administración de liberación y son conocidos por aquellos expertos habituales en la técnica. Incluyen sistemas basados en polímero tales como poli(lactida-glicolida), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, poli(ácido hidroxibutírico) y polianhídridos. Se describen microcápsulas de los polímeros anteriores que contienen fármacos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.075.109. Los sistemas de administración también 20 incluyen sistemas no poliméricos que son: lípidos incluyendo esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono-, di- y tri-glicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; recubrimientos de cera; comprimidos usando aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fundidos; y similares. Ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas de erosión en los que un agente descrito en el presente documento está contenido en una forma dentro 25 de una matriz tal como aquellas descritas en las patentes de EE.UU. Nº 4.452.775, 4.675.189 y 5.736.152, y (b) sistemas de difusión en los que un componente activo penetra a una tasa controlada desde un polímero tal como se describe en las patentes de EE.UU. Nº 3.854.480, 5.133.974 y 5.407.686. Además, pueden usarse sistemas de administración de hardware basados en bombas, algunos de los cuales están adaptados para implantación.
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Puede ser deseable el uso de un implante de liberación sostenida a largo plazo. La liberación a largo plazo, como se usa en el presente documento, significa que el implante se construye y dispone para administrar niveles terapéuticos del principio activo durante al menos 30 días, y preferiblemente 60 días. Aquellos expertos habituales en la técnica conocen bien implantes de liberación sostenida a largo plazo e incluyen algunos de los sistemas de liberación descritos anteriormente. Ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, implantes de liberación sostenida a 35 largo plazo descritos en la patente de EE.UU. Nº 4.748.024, y la patente canadiense Nº 1330939.
Administración, y en algunas realizaciones, la coadministración de agentes distintos de las moléculas de FGE descritas en el presente documento que cuando se administran en cantidades eficaces pueden actuar de manera cooperativa, aditiva o sinérgica con una molécula de FGE descrita en el presente documento para: (i) modular la 40 actividad de generación de Cα-formilglicina, y (ii) tratar cualquiera de las afecciones en las que participa la actividad de generación de Cα-formilglicina de una molécula de la invención (por ejemplo, una deficiencia de sulfatasa incluyendo MSD). Agentes distintos de las moléculas de FGE descritas en el presente documento incluyen iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-45 3, HSulf-4, HSulf-5 o HSulf-6, (ácidos nucleicos y polipéptidos, y/o fragmentos de los mismos), y/o combinaciones de los mismos.
“Co-administrar”, como se usa en el presente documento, se refiere a administrar simultáneamente dos o más compuestos de la invención (por ejemplo, un ácido nucleico y/o polipéptido de FGE, y un agente que se sabe que es 50 beneficioso en el tratamiento de, por ejemplo, una deficiencia de sulfatasa (por ejemplo, iduronato 2-sulfatasa en el tratamiento de MPSII), como mezcla en una única composición, o secuencialmente, lo bastante próximos en el tiempo para que los compuestos puedan ejercer un efecto aditivo o incluso sinérgico.
Pueden proporcionarse matrices de moléculas de ácido nucleico en fase sólida. La matriz consiste esencialmente en 55 un conjunto de moléculas de ácido nucleico, productos de expresión de las mismas, o fragmentos (o bien del ácido nucleico o bien de la molécula de polipéptido) de los mismos, seleccionándose cada molécula de ácido nucleico del grupo que consiste en FGE, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuif-5 y HSulf-6, fijado a un sustrato sólido. En 60 algunas realizaciones, la matriz en fase sólida comprende además al menos una molécula de ácido nucleico de control. En determinadas realizaciones, el conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o incluso al menos cinco moléculas de ácido nucleico, seleccionándose cada una del grupo que consiste en FGE, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, 65 arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6. En realizaciones preferidas, el
conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende un número máximo de 100 moléculas de ácido nucleico diferentes. En realizaciones importantes, el conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende un número máximo de 10 moléculas de ácido nucleico diferentes.
Se utilizan técnicas de hibridación estándar de tecnología de micromatrices para evaluar patrones de expresión de 5 ácido nucleico e identificar la expresión de ácido nucleico. La tecnología de micromatrices, que también se conoce por otros nombres incluyendo: tecnología de chip de ADN, tecnología de chip génico y tecnología de matriz de ácido nucleico en fase sólida, es muy conocida por aquellos expertos habituales en la técnica y se basa en, pero no se limita a, obtener una matriz de sondas de ácido nucleico identificadas (por ejemplo, moléculas descritas en otra parte en el presente documento tales como de FGE, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6- 10 sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa P, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y/o HSulf-6) sobre un sustrato fijo, marcar moléculas diana con moléculas indicadoras (por ejemplo, mascas radiactivas, quimioluminiscentes o fluorescentes tales como fluoresceína, Cye3-dUTP o Cye5-dUTP), hibridar ácidos nucleicos diana con las sondas, y evaluar la hibridación diana-sonda. En general, una sonda con una secuencia de ácido 15 nucleico que se corresponde perfectamente con la secuencia diana producirá la detección de una señal de molécula indicadora más fuerte que sondas con correspondencias menos perfectas. Se presentan muchos componentes y técnicas utilizadas en la tecnología de micromatrices de ácido nucleico en The Chipping Forecast, Nature Genetics, Vol. 21, enero de 1999.
20
Los sustratos de micromatriz pueden incluir, pero no se limitan a, vidrio, sílice, aluminosilicatos, borosilicatos, óxidos metálicos tales como alúmina y óxido de níquel, diversas arcillas, nitrocelulosa o nailon. En todas las realizaciones se prefiere un sustrato de vidrio. Se seleccionan sondas del grupo de ácidos nucleicos incluyendo, pero sin limitarse a: ADN, ADN genómico, ADNc y oligonucleótidos; y pueden ser naturales o sintéticas. Las sondas de oligonucleótidos son preferiblemente oligonucleótidos 20 a 25 meros y las sondas de ADN/ADNc tienen 25 preferiblemente 500 a 5000 bases de longitud, aunque pueden usarse otras longitudes. Un experto habitual en la materia puede determinar una longitud de sonda apropiada siguiendo procedimientos conocidos en la técnica. En una realización, sondas preferidas son conjuntos de dos o más de las moléculas de ácido nucleico expuestas como SEC ID Nº: 1, 3, 4, 6, 8, 10 y/o 12. Pueden purificarse sondas para eliminar contaminantes usando métodos estándar conocidos por aquellos expertos habituales en la técnica tales como filtración en gel o precipitación. 30
En una realización, puede recubrirse el sustrato de micromatriz con un compuesto para potenciar la síntesis de la sonda sobre el sustrato. Tales compuestos incluyen, pero no se limitan a, oligoetilenglicoles. En otra realización, pueden usarse grupos o agentes de acoplamiento sobre el sustrato para enlazar covalentemente el imprimación nucleótido u oligonucleótido al sustrato. Estos agentes o grupos pueden incluir, pero no se limitan a: grupos amino, 35 hidroxi, bromo y carboxi. Estos grupos reactivos se unen preferiblemente al sustrato mediante un radical hidrocarbilo tal como un radical divalente alquileno o fenileno, ocupándose una posición de valencia por la unión a la cadena y uniéndose la restante a los grupos reactivos. Estos grupos hidrocarbilo pueden contener hasta aproximadamente diez átomos de carbono, preferiblemente hasta aproximadamente seis átomos de carbono. Normalmente se prefieren radicales alquileno que contienen dos a cuatro átomos de carbono en la cadena principal. Estos y otros 40 detalles del proceso se divulgan, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 4.458.066.
En una realización, se sintetizan directamente sondas sobre el sustrato en un patrón de rejilla predeterminado usando métodos tales como síntesis química dirigida por luz, desprotección fotoquímica o administración de precursores de nucleótidos al sustrato y posterior producción de sonda. 45
En otra realización, el sustrato puede recubrirse con un compuesto para potenciar la unión de la sonda al sustrato. Tales compuestos incluyen, pero no se limitan a: polilisina, aminosilanos, silanos amino-reactivos (Chipping Forecast, 1999) o cromo (Gwynne y Page, 2000). En esta realización, se aplican sondas previamente sintetizadas al sustrato en un patrón de rejilla y volumen preciso, predeterminado, utilizando un robot controlado por ordenador para 50 aplicar la sonda al sustrato de una manera de impresión por contacto o de una manera sin contacto tal como suministro por chorro de tinta o piezoeléctrico. Pueden enlazarse covalentemente sondas al sustrato con métodos que incluyen, pero no se limitan a, irradiación UV. En otra realización se enlazan sondas al sustrato con calor.
Las dianas son ácidos nucleicos seleccionados del grupo que incluye, pero no se limita a: ADN, ADN genómico, 55 ADNc, ARN, ARNm y pueden ser naturales o sintéticas. En todas las realizaciones, se prefieren moléculas de ácido nucleico de sujetos que se sospecha que desarrollan o tienen una deficiencia de sulfatasa. En determinadas realizaciones, una o más moléculas de ácido nucleico de control se unen al sustrato. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico de control permiten la determinación de factores incluyendo, pero sin limitarse a: calidad de ácido nucleico y características de unión; calidad y eficacia de reactivo; éxito de hibridación; y umbrales y éxito de análisis. 60 Ácidos nucleicos de control pueden incluir, pero no se limitan a, productos de expresión de genes tales como genes de mantenimiento o fragmentos de los mismos.
Para seleccionar un conjunto de marcadores de enfermedad de deficiencia de sulfatasa, preferiblemente se analizan los datos de expresión generados, por ejemplo, por análisis de micromatrices de expresión génica, para determinar 65 qué genes en diferentes categorías de pacientes (siendo cada categoría de pacientes un trastorno de deficiencia de
sulfatasa diferente) se expresan de manera significativamente diferenciada. La significación de la expresión génica puede determinarse usando el software informático Permax, aunque puede usarse cualquier paquete estadístico convencional que pueda distinguir diferencias significativas en la expresión. Permax realiza pruebas de la t de 2 muestras con permutación en grandes matrices de datos. Para vectores dimensionales altos de observaciones, el software Permax calcula datos estadísticos de la t para cada atributo, y evalúa la significación usando la distribución 5 de permutación de los atributos globales máximo y mínimo. El uso principal es para determinar los atributos (genes) que son los más diferentes entre dos grupos (por ejemplo, sujeto sano de control y un sujeto con una deficiencia de sulfatasa particular), medir “lo más diferente” usando el valor de los datos estadísticos de la t, y sus niveles de significación.
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También puede determinarse la expresión de moléculas de ácido nucleico relacionadas con una enfermedad de deficiencia de sulfatasa usando métodos de medición de proteínas para determinar la expresión de SEC ID Nº: 2, por ejemplo, determinando la expresión de polipéptidos codificados por SEC ID Nº: 1 y/o 3. Métodos preferidos para medir específica y cuantitativamente proteínas incluyen, pero no se limitan a: métodos basados en espectroscopía de masas tales como desorción/ionización por láser potenciada en superficie (SELDI; por ejemplo, sistema 15 ProteinChip de Ciphergen), métodos no basados en espectroscopia de masas, y métodos basados en inmunohistoquímica tales como electroforesis en gel en dos dimensiones.
La metodología SELDI puede usarse, mediante procedimientos conocidos para aquellos expertos habituales en la técnica, para vaporizar cantidades microscópicas de proteína y para crear una “huella” de proteínas individuales, 20 permitiendo así la medición simultánea de la abundancia de muchas proteínas en una única muestra. Preferiblemente pueden utilizarse ensayos basados en SELDI para caracterizar deficiencia múltiple de sulfatasas, así como estadios de tales afecciones. Tales ensayos incluyen preferiblemente, pero no se limitan a, los siguientes ejemplos. Pueden medirse selectivamente productos génicos descubiertos mediante micromatrices de ARN mediante captura específica (mediada por anticuerpos) en el disco de proteína de SELDI (por ejemplo, SELDI 25 selectiva). Pueden resolverse productos génicos descubiertos mediante cribado de proteínas (por ejemplo, con geles en 2-D), mediante “SELDI de proteína total” optimizada para visualizar aquellos marcadores particulares de interés de entre SEC ID Nº: 1, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 y/o 28. Pueden utilizarse modelos predictivos de una deficiencia de sulfatasa específica de medición de SELDI de múltiples marcadores de entre SEC ID Nº: 1, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 y/o 28, para las estrategias de SELDI. 30
El uso de cualquiera de los métodos de micromatriz anteriores para determinar la expresión de ácidos nucleicos relacionados con una enfermedad de deficiencia de sulfatasa puede hacerse con métodos rutinarios conocidos por aquellos expertos habituales en la técnica y la expresión determinada mediante métodos de medición de proteínas puede correlacionarse con niveles predeterminados de un marcador usado como método de pronóstico para 35 seleccionar estrategias de tratamiento para pacientes con enfermedad de deficiencia de sulfatasa.
Puede proporcionarse una célula productora de sulfatasa, en la que se aumenta la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida (es decir, la actividad específica) por la célula. La célula comprende: (i) una sulfatasa con una expresión aumentada, y (ii) una enzima generadora de formilglicina con una expresión aumentada, 40 en la que la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida por la célula se aumenta en al menos el 5 % con respecto a la razón de sulfatasa activa con respecto a la sulfatasa total producida por la célula en ausencia de la enzima generadora de formilglicina.
Una “sulfatasa con expresión aumentada”, como se usa en el presente documento, se refiere normalmente a 45 expresión aumentada de una sulfatasa y/o su polipéptido codificado en comparación con un control. La expresión aumentada se refiere a aumentar (es decir, hasta un grado detectable) la replicación, transcripción y/o traducción de cualquiera de los ácidos nucleicos de sulfatasa (ácidos nucleicos de sulfatasa como se describen en otra parte en el presente documento), ya que la regulación por incremento de cualquiera de esos procesos produce un aumento de la concentración/cantidad del polipéptido codificado por el gen (ácido nucleico). Esto puede lograrse usando varios 50 métodos conocidos en la técnica, también descritos en otra parte en el presente documento, tal como transfección de una célula con el ADNc de sulfatasa, y/o ADN genómico que engloba el locus de sulfatasa, activación del gen de sulfatasa endógeno colocando, por ejemplo, un elemento promotor fuerte en la dirección 5' del locus genómico del gen de sulfatasa endógeno usando recombinación homologa (véase, por ejemplo, la tecnología de activación génica descrita en detalle en las patentes de EE.UU. Nº 5.733.761, 6.270.989 y 6.565.844), etc. Un control típico sería una 55 célula idéntica transfectada con un(os) plásmido(s) de vector. Potenciar (o aumentar) la actividad de sulfatasa también se refiere a prevenir o inhibir la degradación de sulfatasa (por ejemplo, mediante ubiquitinización aumentada), regulación por disminución, etc., dando como resultado, por ejemplo, t½ (semivida) de molécula de sulfatasa aumentada o estable en comparación con un control. Regulación por disminución o expresión disminuida se refiere a expresión disminuida de un gen y/o su polipéptido codificado. La regulación por incremento o regulación 60 por disminución de la expresión génica puede determinarse directamente detectando un aumento o disminución, respectivamente, en el nivel de ARNm para el gen (por ejemplo, una sulfatasa), o el nivel de expresión de proteína del polipéptido codificado por el gen, usando cualquier medio adecuado conocido en la técnica, tal como hibridación de ácido nucleico o métodos de detección de anticuerpos, respectivamente, y en comparación con controles. La regulación por incremento o regulación por disminución de la expresión de genes de sulfatasa también puede 65 determinarse indirectamente detectando un cambio en la actividad de sulfatasa.
Similarmente, una “enzima generadora de formilglicina con una expresión aumentada”, como se usa en el presente documento, se refiere normalmente a expresión aumentada de un ácido nucleico de FGE de la invención y/o su polipéptido codificado en comparación con un control. Expresión aumentada se refiere a aumentar (es decir, hasta un grado detectable) la replicación, transcripción y/o traducción de cualquiera de los ácidos nucleicos de FGE (como 5 se describe en otra parte en el presente documento), ya que la regulación por incremento de cualquiera de esos procesos produce un aumento de la concentración/cantidad del polipéptido codificado por el gen (ácido nucleico). Esto puede lograrse usando los métodos descritos anteriormente (para las sulfatasas), y en otra parte en el presente documento.
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En determinadas realizaciones, la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida por la célula se aumenta en al menos el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 50 %, el 100 %, el 200 %, el 500 %, el 1000 %, con respecto a la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida por la célula en ausencia de la enzima generadora de formilglicina.
15
Puede proporcionarse un método mejorado para tratar una deficiencia de sulfatasa en un sujeto. El método implica administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una sulfatasa en una cantidad eficaz para tratar la deficiencia de sulfatasa en el sujeto, en el que la sulfatasa se pone en contacto con una enzima generadora de formilglicina en una cantidad eficaz para aumentar la actividad específica de la sulfatasa. Como se describe en otra parte en el presente documento, “actividad específica” se refiere a la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total 20 producida. “Poner en contacto”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a modificar postraduccionalmente mediante FGE la sulfatasa como se describe en otra parte en el presente documento. Será evidente para un experto habitual en la materia que una FGE puede entrar en contacto con una sulfatasa y modificarla si los ácidos nucleicos que codifican FGE y una sulfatasa se co-expresan en una célula, o incluso si un polipéptido de FGE aislado entra en contacto con un polipéptido de sulfatasa aislado in vivo o in vitro. Aunque puede 25 co-administrarse un polipéptido de FGE aislado con un polipéptido de sulfatasa aislado a un sujeto para tratar una deficiencia de sulfatasa en el sujeto, se prefiere que el contacto entre FGE y la sulfatasa tenga lugar in vitro antes de la administración de la sulfatasa al sujeto. Este método de tratamiento mejorado es beneficioso para un sujeto, ya que necesitan administrar cantidades menores de la sulfatasa, y/o con menos frecuencia, ya que la sulfatasa tiene una actividad específica superior. 30
La invención se entenderá más completamente mediante referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplos
35
Ejemplo 1:
La deficiencia múltiple de sulfatasas está producida por mutaciones en el gen que codifica la enzima generadora de Cα-formilglicina (FGE) humana
40
Procedimientos experimentales
Materiales y métodos
Ensayo in vitro para FGE 45
Para monitorizar la actividad FGE, se usó el péptido P23 23-mero N-acetilado y C-amidado (MTDFYVPVSLCTPSRAALLTGRS) (SEC ID Nº: 33) como sustrato. Se monitorizó la conversión del residuo de cisteína en la posición 11 en FGIy mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Se preparó una disolución madre 6 µM de P23 en acetonitrilo al 30 % y ácido trifluoroacético al 0,1 % (TFA). En condiciones normales, se incubaron 6 50 pmoles de P23 a 37 ºC con hasta 10 µl de enzima en un volumen final de 30 µl de Tris/HCI 50 mM, pH 9,0, que contenía NaCI 67 mM, CaCI2 15 µM, DTT 2 mM, y albúmina sérica bovina 0,33 mg/ml. Para detener la reacción enzimática, se añadieron 1,5 µl de TFA al 10 %. Entonces P23 se unió a ZipTip C18 (Millipore), se lavó con TFA al 0,1 % y se eluyó en 3 µl de acetonitrilo al 50 %, TFA al 0,1 %. Se mezclaron 0,5 µl del eluato con 0,5 µl de disolución de matriz (ácido a-ciano-4-hidroxi-cinámico 5 mg/ml (Bruker Daltonics, Billerica, MA) en acetonitrilo al 50 %, TFA al 55 0,1 %) en una diana de acero inoxidable. Se realizó la espectrometría de masas MALDI-TOF con un Reflex III (Bruker Daltonics) usando reflectrón y energía láser justo antes del umbral de desorción/ionización. Todos los espectros fueron promedios de 200-300 disparos de varios puntos en la diana. Se calibró el eje de masas usando péptidos de masas moleculares que oscilaban entre 1000 y 3000 Da como patrones externos. MH+ monoisotrópico de P23 es 2526,28 y del producto que contiene FGIy, 2508,29. Se calculó la actividad (pmol de producto / h) 60 partiendo de la base de la altura pico del producto divido por la suma de las alturas de pico de P23 y el producto.
Purificación de FGE a partir de testículos bovinos
Se obtuvieron testículos bovinos del matadero local y se almacenaron durante hasta 20 h en hielo. Se liberó el 65 parénquima del tejido conjuntivo y se homogeneizó en una Waring Blendor y mediante tres rondas de licuado a
motor. Se realizó la preparación de microsomas rugosos (RM) mediante fraccionamiento celular del homogenizado obtenido como se describe (Meyer et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:14550-14557) con las siguientes modificaciones. Se realizaron tres etapas de centrifugación diferencial, de 20 minutos cada una a 4 ºC, a 500 g (rotor JA10), 3000 g (JA10) y 10000 g (JA20). A partir del último sobrenadante, se sedimentaron las membranas de RM (125000 g, rotor TÍ45, 45 min, 4 ºC), se homogeneizaron mediante licuado a motor y se estratificaron en un colchón de sacarosa 5 (Hepes 50 mM, pH 7,6, KAc 50 mM, MgAc2 6 mM, EDTA 1 mM, sacarosa 1,3 M, β-mercaptoetanol 5 mM). Se recuperaron los RM del sedimento después de centrifugar durante 210 minutos a 45000 rpm en un rotor TÍ45 a 4 ºC. Normalmente, se obtuvieron 100000-150000 equivalentes de RM, como definen Walter y Blobel (Methods Enzymol.,1983, 96:84-93), de 1 kg de tejido testicular. Se obtuvo el reticuloplasma, es decir el contenido luminar del RM, mediante la extracción diferencial a concentraciones bajas de desoxi Big Chap, como se describe (Fey et al., J. 10 Biol. Chem., 2001, 276:47021-47028). Para la purificación de FGE, se dializaron 95 ml de reticuloplasma durante 20 h a 4 ºC frente a Tris/HCI 20 mM, pH 8,0, DTT 2,5 mM, y se aclararon mediante centrifugación a 125000 g durante 1 h. Se cargaron alícuotas de 32 ml del reticuloplasma aclarado en una columna MonoQ HR10/10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a temperatura ambiente, se lavaron y se eluyeron a 2 ml/min con un gradiente lineal de NaCI de 0 a 0,75 M en 80 ml del tampón Tris. Se reunieron las fracciones que contenían actividad de FGE, que 15 eluyeron a NaCI 50-165 mM, de tres rondas (42 ml) y se mezclaron con 2 ml de concanavalina A-Sepharose (Amersham Biosciences) que se había lavado con tampón Hepes 50 mM, pH 7,4, que contenía KCI 0,5 M, MgCI2 1 mM, MnCI2 1 mM, CaCI2 1 mM y DTT 2,5 mM. Después de la incubación durante 16 h a 4 ºC, se recogió la concanavalina A-Sepharose en una columna y se lavó con 6 ml del mismo tampón Hepes. Se eluyó el material unido incubando la columna durante 1 h a temperatura ambiente con 6 ml de a-metilmanósido 0,5 M en Hepes 50 mM, pH 20 7,4, DTT 2,5 mM. Se repitió la elución con 4 ml del mismo eluyente. Se ajustaron los eluatos combinados (10 ml) de concanavalina A-Sepharose a pH 8,0 con Tris/HCI 0,5 M, pH 9,0, y se mezclaron con 2 ml de Affigel 10 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que se había derivatizado con 10 mg del péptido reorganizado al azar (PVSLPTRSCAALLTGR) (SEC ID Nº: 34) y se lavaron con tampón A (Hepes 50 mM, pH 8,0, que contenía acetato de potasio 0,15 M, sacarosa 0,125 M, MgCI2 1 mM y DTT 2,5 mM). Después de la incubación durante 3 h a 4 ºC se 25 recogió la matriz de afinidad en una columna. Se recogieron la fracción no retenida y una de lavado con 4 ml de tampón A, se combinaron y se mezclaron con 2 ml de Affigel 10 que se había sustituido con 10 mg del péptido Ser69 (PVSLSTPSRAALLTGR) (SEC ID Nº: 35) y se lavaron con tampón A. Después de la incubación durante la noche a 4 ºC, se recogió la matriz de afinidad en una columna, se lavó 3 veces con 6 ml de tampón B (el tampón A que contenía NaCI 2 M y una mezcla de los 20 aminoácidos proteinogénicos, cada uno a 50 mg/ml). Se eluyó el material 30 unido de la matriz de afinidad incubando el Affigel dos veces durante 90 min cada una con 6 ml de tampón B que contenía el péptido Ser69 25 mM. Se sustituyó una alícuota del eluato con albúmina sérica bobina 1 mg/ml, se dializó frente al tampón A y se analizó para su actividad. Se concentró la parte restante de la actividad (11,8 ml) en un concentrador Vivaspin 500 (Vivascience AG, Hannover, Alemania), y se solubilizó a 95 ºC en tampón de muestra Laemmli SDS. Se monitorizaron la composición del polipéptido del material de partida y las preparaciones obtenidas 35 después de las etapas cromatográficas mediante SDS-PAGE (15 % de acrilamida, 0,16 % de bisacrilamida) y tinción con SYPRO Ruby (Bio-Rad Laboratories).
Identificación de FGE mediante espectrometría de masas
40
Para el análisis de huella de masa peptídica, los polipéptidos purificados se digirieron en gel con tripsina (Shevchenko et al., Anal. Chem., 1996, 68:850-855), se desalaron en C18 ZipTip y se analizaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF usando ácido dihidrobenzoico como matriz y dos péptidos autolíticos de tripsina (m/z 842,51 y 2211,10) como patrones internos. Para el análisis de espectrometría de masas en tándem se analizaron péptidos seleccionados mediante espectrometría de masas por descomposición metaestable - MALDI-45 TOF. Se aislaron sus iones doblemente cargados correspondientes y se fragmentaron mediante espectrometría de masas con trampa iónica con nano-ESI fuera de línea (EsquireLC, Bruker Daltonics). Se usaron los datos de la espectrometría de masas mediante el algoritmo de búsqueda Mascot para la identificación de proteínas en la base de datos de proteínas NCBInr y la base de datos de nucleótidos NCBI EST.
50
Bioinformática
Se describieron péptidos señal y sitios de escisión con el método de von Heijne (von Heijne, Nucleic Acids Res., 1986, 14:4683-90) implementado en EMBOSS (Rice et al., Trends in Genetics, 2000, 16:276-277). Se predijeron los sitios de N-glicosilación usando el algoritmo de Brunak (Gupta y Brunak, Pac. Symp. Biocomput., 2002, 310-22). Se 55 detectaron los dominios funcionales mediante la búsqueda de modelos ocultos de Markov en PFAM (versión 7.8) (Sonnhammer et al., Nucleic Acids Res., 1998, 26:320-322). Para buscar homólogos de FGE, se consultaron las bases de datos del National Center for Biotechnology Information (Wheeler et al., Nucleic Acids Res., 2002, 20:13- 16) con BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402). Se calcularon las similitudes de secuencia usando herramientas estándar de EMBOSS. Se determinó la sintenia y la organización genómica de los loci usando 60 fuentes de genoma humano y de ratón de NCBI y el mapa de homologías entre ser humano y ratón, también de NCBI, (Bethesda, MD).
Clonación de ADNc de FGE humana
65
Se sometió a transcripción inversa el ARN total, preparado a partir de fibroblastos humanos usando el kit RNEASY™
Mini (Qiagen, Inc., Valencia, CA) usando el kit OMNISCRIPT RT™ (Qiagen, Inc., Valencia, CA) y o bien un cebador de oligo(dT) o bien el cebador específico de FGE, 1199nc (CCAATGTAGGTCAGACACG) (SEC ID Nº: 36). Se amplificó el ADNc de imprimacióna hebra mediante PCR usando el cebador directo 1c (ACATGGCCCGCGGGAC) (SEC ID Nº: 37) y, como cebador inverso, o bien 1199nc o bien 1182nc (CGACTGCTCCTTGGACTGG) (SEC ID Nº: 38). Se clonaron los productos de la PCR directamente en el vector pCR4-TOPO™ (Invitrogen Corporation, 5 Carlsbad, CA). Mediante secuenciación múltiple de los productos clonados de la PCR, que se habían obtenido de diversos individuos y de reacciones de RT y PCR independientes, se determinó la secuencia codificante del ADNc de FGE (SEC ID Nº: 1 y 3).
Detección de mutaciones, secuenciación genómica, mutagénesis dirigida al sitio y análisis de transferencia 10 Northern
Los protocolos convencionales utilizados en este estudio fueron esencialmente como se describen en Lübke et al. (Nat. Gen., 2001, 28: 73-76) y Hansske et al. (J. Clin. Invest., 2002, 109:725-733). Las transferencias Northern se hibridaron con una sonda de ADNc que cubre toda la región codificante y una sonda de ADNc de -actina como 15 control para carga de ARN.
Líneas celulares y cultivo celular
Se obtuvieron fibroblastos de pacientes con MSD 1-6 de E. Christenson (Rigshospitalet Copenhage), M. Beck 20 (Universitätskinderklinik Mainz), A. Kohlschütter (Universitätskrankenhaus Eppendorf, Hamburgo), E. Zammarchi (Meyer Hospital, Universidad de Florencia), K. Harzer (Institut für Hirnforschung, Universität Tübingen) y A. Fensom (Guy’s Hospital, Londres), respectivamente. Se mantuvieron los fibroblastos de piel humana, BHK21, HT-1080 y las células CHO a 37 ºC en 5 % de CO2 en medio Eagle modificado por Dulbecco que contenía 10 % de suero bovino fetal. 25
Transfección, inmunofluorescencia indirecta, análisis de transferencia Western y detección de actividad FEG
Se dotó el ADNc de FGE con un sitio de EcoRI en 5’ y o bien una secuencia de marcador de HA, c-Myc o bien RGS-His6 en 3’, seguido por un codón de terminación y un sitio de Hindlll, mediante PCR de adición usando 30 Pfu polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA) y los cebadores siguientes: GGAATTCGGGACAACATGGCTGCG (EcoRI) (SEC ID Nº: 39), CCCAAGCTTATGCGTAGTCAGGCACATCATACGGATAGTCCATGGTGGGCAGGC (HA) (SEC ID Nº: 40), CCCAAGCTTACAGGTCTTCTTCAGAAATCAGCTTTTGTTCGTCCATGGTGGGCAG GC (c-Myc) (SEC ID Nº: 41), CCCAAGCTT AGT GAT GGT GAT GGT GAT GCGAT C CTCTGTCCATGGTGGGCAGGC (RGS-His6) (SEC ID Nº: 42). Se clonaron los productos resultantes de PCR 35 como fragmentos de EcoRI/HindIII en pMPSVEH (Artelt et al., Gene, 1988, 68:213-219). Se transfectaron de manera transitoria los plásmidos obtenidos en células HT-1080, BHK21 y CHO, se hicieron crecer sobre portaobjetos, usando EFFECTENE™ (Qiagen) como reactivo de transfección. 48 después de la transfección, se analizaron las células mediante inmunofluorescencia indirecta como se ha descrito previamente (Lübke et al., Nat. Gen., 2001, 28:73-76; Hansske et al., J. Clin. Invest., 2002, 109:725-733), usando anticuerpos 40 monoclonales lgG1 contra HA (Berkeley Antibody Company, Richmond, CA), c-Myc (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) o RGS-His (Qiagen) como anticuerpos primarios. Se detectó la proteína marcadora de retículo endoplásmico, proteína disulfuro isomerasa (PDI) con un anticuerpo monoclonal de diferente subtipo (lgG2A, Stressgen Biotech., Victoria BC, Canadá). Se detectaron los anticuerpos primarios con anticuerpos secundarios de cabra específicos de isotipo acoplados a CY2 o CY3, respectivamente (Molecular Probes, Inc., 45 Eugene, O). Se obtuvieron imágenes de inmunofluorescencia en un microscopio de barrido láser Leica TCS Sp2 AOBS. Para el análisis de transferencia Western se usaron los mismos anticuerpos monoclonales y una IgG anti-ratón conjugada con HRP como anticuerpo secundario. Para la determinación de la actividad de FEG, se lavaron células sometidas a tripsinización con solución salina tamponada con fosfato que contenía una mezcla de inhibidores de proteinasa (clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo 208 µM, 50 aprotinina 0,16 µM, leupeptina 4,2 µM, bestatina 7,2 µM, pepstatina A 3 µM, E-64 22,8 µM), se solubilizaron en Tris 10 mM, pH 8,0, que contenía DTT 2,5 mM, los inhibidores de proteinasa y Triton X-100 al 1 %, y se aclararon por centrifugación a 125.000 g durante 1 h. Se sometió el sobrenadante a cromatografía en una columna MonoQ PC 1.6/5 usando las condiciones descritas anteriormente. Se reunieron las fracciones que eluyeron en NaCI 50-200 mM, se liofilizaron y se reconstituyeron en un décimo del volumen reunido original 55 antes de la determinación de la actividad de FEG con el péptido P23.
Transducción retroviral
Se clonaron los ADNc de interés en el vector pLPCX y pLNCX2 basado en el virus de la leucemia murina de 60 Moloney (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Se realizó la transfección de células FNX-Eco ecotrópicas (ATCC, Manassas, VA) y la transducción de células RETROPACK™ PT67 anfotróficas (BD Biosciences Clontech) y fibroblastos humanos como se describe (Lübke et al., Nat. Gen., 2001, 28:73-76; Thiel et al., Biochem. J., 2002, 376, 195-201). Para algunos experimentos se seleccionaron las células PT67 transducidas en pLPCX con puromicina antes de la determinación de las actividades de sulfatasa. 65
Ensayos de sulfatasa
Se determinó la actividad de ASA, STS y GalNAc6S como se describe en Rommerskirch y von Figura, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, 89:2561-2565; Glossi y Kresse, Clin. Chim. Acta, 1978, 88:111-119.
5
Resultados
Un ensayo basado en péptidos rápido para actividad FEG
Los presentes inventores han desarrollado un ensayo para determinar la actividad FEG en extractos de microsomas 10 usando fragmentos de [35S] ASA sintetizados in vitro como sustrato. Se añadieron los fragmentos a la mezcla de ensayo como complejos de cadena naciente asociados a ribosoma. La cuantificación del producto incluyó digestión tríptica, separación de los péptidos mediante RP-HPLC e identificación y cuantificación de péptido tríptico que contenía FGIy marcada con [35S] mediante una combinación de derivatización química a hidrazonas, separación mediante RP-HPLC y recuento mediante centelleo líquido (Fey et al., J. Biol. Chem., 2001, 276: 47021-47028). Para 15 monitorizar la actividad enzimática durante la purificación, fue necesario modificar este procedimiento engorroso. Un péptido sintético 16-mero correspondiente a los residuos 65-80 de ASA y que contenía el motivo de secuencia requerido para la formación de FGIy inhibió la actividad de FEG en el ensayo in vitro. Esto sugirió que péptidos tales como ASA65-80 pueden servir como sustratos para FGE. Los presentes inventores sintetizaron el péptido 23-mero P23 (SEC ID Nº: 33), que se corresponde con los residuos 60-80 de ASA con un residuo de metionina N-acetilada y 20 uno de serina C-amidada adicionales para proteger los extremos N y C, respectivamente. La cisteína y las formas que contienen FGIy de P23 pudieron identificarse y cuantificarse mediante espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser asistida por matriz con analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Se verificó la presencia del residuo de FGIy en la posición 11 de P23 mediante espectrometría de masas por descomposición metaestable - MALDI-TOF (véase Peng et al., J. Mass Spec., 2003, 38:80-86). La incubación de P23 con extractos 25 de microsomas de páncreas bovino o testículos bovinos convirtió hasta el 95 % del péptido en un derivado que contenía FGIy (Figura 1). En condiciones normales, la reacción fue proporcional a la cantidad de enzima y el tiempo de incubación siempre que se hubiera consumido menos del 50 % del sustrato y el periodo de incubación no superara las 24 h. La km para P23 fue de 13 nM. Los efectos del glutatión reducido y oxidado, Ca2+ y pH fueron comparables a los observados en el ensayo usando complejos de cadena naciente asociados a ribosoma como 30 sustrato (Fey et al., J. Biol. Chem., 2001, 276:47021-47028).
Purificación de FGE
Para la purificación de FGE, la fracción soluble (reticuloplasma) de microsomas de testículos bovinos sirvió como 35 material de partida. La actividad específica de FGE fue 10-20 veces superior a la que tiene en reticuloplasma de microsomas de páncreas bovino (Fey et al., J. Biol. Chem., 2001, 276:47021-47028). Se logró la purificación de FGE mediante una combinación de cuatro etapas cromatográficas. Las dos imprimaciónas etapas fueron cromatografía en un intercambiador aniónico MonoQ y concavalina A-Sepharose. A pH 8, se unió la actividad FEG a MonoQ y se eluyó en NaCI 50-165 mM con una recuperación del 60-90 %. Cuando esta fracción se mezcló con concanavalina A- 40 Sepharose, se unió FGE. Pudo eluirse el 30-40 % de la actividad de partida con a-metilmanósido 0,5 M. Las dos etapas de purificación finales fueron cromatografía en matrices de afinidad derivatizadas con péptidos 16-meros. La imprimacióna matriz de afinidad fue Affigel 10 sustituida con una VARIANTEe del péptido ASA65-80, en el que los residuos Cys69, Pro71 y Arg73, críticos para la formación de FGIy, estaban reorganizados al azar (péptido reorganizado al azar PVSLPTRSCAALLTGR -SEC ID Nº: 34). Este péptido no inhibió la actividad FEG cuando se 45 añadió a una concentración 10 mM al ensayo in vitro y, cuando se inmovilizó en Affigel 10, no retuvo la actividad FEG. La cromatografía en la matriz de afinidad de péptido reorganizado eliminó las proteínas de unión al péptido incluyendo las chaperonas del retículo endoplásmico. La segunda matriz de afinidad fue Affigel 10 sustituida con una VARIANTEe del péptido ASA65-80, en el que se sustituyó la Cys69 por una serina (péptido Ser69 PVSLSTPSRAALLTGR-SEC ID Nº: 35). La matriz de afinidad del péptido Sen69 unió de manera eficaz FGE. La 50 actividad de FEG pudo eluirse o bien con KSCN 2 M o bien con péptido Ser69 25 mM con una recuperación del 20- 40 %. Antes de la determinación de la actividad, tuvo que eliminarse el KSCN o el péptido Ser69 mediante diálisis. La substitución de Cys69 por serina fue crucial para la elución de FGE activa. Affigel 10 sustituido con el péptido ASA65-80 no mutante unió FGE de manera eficaz. Sin embargo, casi no pudo recuperarse ninguna actividad en eluatos con sales caotrópicas (KSCN, MgCl2), péptidos (ASA65-80 o péptido Ser69) o tampones con pH bajo o alto. 55 En la Fig. 2 se muestra el patrón de polipéptido del material de partida y de las fracciones activas obtenidas después de las cuatro etapas cromatográficas de una purificación típica. En la fracción final se recuperó el 5 % de la actividad FEG de partida y el 0,0006 % de la proteína de partida (purificación de 8333 veces).
Los polipéptidos purificados de 39,5 y 41,5 kDa están codificados por un único gen 60
Se sometieron a análisis de huella peptídica los polipéptidos de 39,5 y 41,5 kDa en la preparación de FGE purificada. Los espectros de masas de los péptidos trípticos de los dos polipéptidos obtenidos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF fueron en su mayor parte solapantes, sugiriendo que las dos proteínas se originan a partir del mismo gen. Entre los péptidos trípticos de ambos polipéptidos se encontraron dos péptidos 65 abundantes MH+ 1580,73, SQNTPDSSASNLGFR (SEC ID Nº: 43) y MH+ 2049,91, MVPIPAGVFTMGTDDPQIK -
SEC ID Nº: 44 más dos oxidaciones de metionina), que correspondían con la proteína codificada por un ADNc con Nº de acceso de GenBank AK075459 (SEC ID Nº: 4). Se confirmó la secuencia de aminoácidos de los dos péptidos mediante espectros de descomposición metaestable - MALDI-TOF y mediante análisis de EM/EM usando espectrometría de masas con trampa iónica con ionización por nano-electropulverización (ESI) fuera de línea. Una secuencia de EST del ortólogo bovino del ADNc humano que cubre la parte del extremo C de la FGE y que se 5 corresponde con las secuencias de ambos péptidos proporcionó la información de secuencia adicional para la FGE bovina.
Conservación evolutiva y estructura de dominio de FGE
10
El gen para la FGE humana está codificado por el ADNc de (SEC ID Nº: 1 y/o 3) y está localizado en el cromosoma 3p26. Abarca ∼105 kb y la secuencia codificante se distribuye a lo largo de 9 exones. Se encontraron tres ortólogos del gen de FGE humana en ratón (identidad del 87 %), Drosophila melanogaster (identidad del 48 %) y Anopheles gambiae (identidad del 47 %). Se encontraron secuencias EST ortólogas para 8 especies adicionales incluyendo vaca, cerdo, Xenopus laevis, Silurana tropicalis, pez cebra, salmón y otras especies de peces (para más detalles 15 véase el Ejemplo 2). La estructura exón-intrón entre el gen humano y el de ratón está conservada y el gen de ratón en el cromosoma 6E2 está localizado dentro de una región sintética con respecto a la del cromosoma 3p26 humano. Los genomas de S. cerevisiae y C. elegans carecen de homólogos de FGE. En procariotas se encontraron 12 homólogos de FGE humana. Se predijo que el ADNc para la FGE humana codificaba para una proteína de 374 residuos (Fig. 3 y SEC ID Nº: 2). La proteína contiene una secuencia señal escindible de 33 residuos, que indica 20 translocación de FGE al interior del retículo endoplásmico, y contiene un único sitio de N-glicosilación en Asn141. La unión de FGE a concanavalina A sugiere que se utiliza este sitio de N-glicosilación. Los residuos 87-367 de FGE se enumeran en la base de datos de motivos de proteínas PFAM como un dominio de función desconocida (PFAM: DUF323). El análisis de comparación de secuencias de FGE humana y sus ortólogos eucariotas identificados en bases de datos indica que este dominio está compuesto por tres subdominios distintos. 25
El subdominio del extremo N (residuos 91-154 en FGE humana) tiene una identidad de secuencia del 46 % y una similitud del 79 % dentro de los cuatro ortólogos de FGE eucariotas conocidos. En la FGE humana, este dominio porta el sitio de N-glicosilación en Asn 141, que está conservado en los otros ortólogos. La parte media de FGE (residuos 179-308 en FGE humana) está representada por un subdominio rico en triptófano (12 triptófanos por 129 30 residuos). La identidad de los ortólogos eucariotas dentro de este subdominio es del 57 %, la similitud es del 82 %. El subdominio del extremo C (residuos 327-366 en FGE humana) es la secuencia más altamente conservada dentro de la familia de FGE. La identidad de secuencia del subdominio del extremo C humano con los ortólogos eucariotas (3 secuencias de longitud completa y 8 EST) es del 85 %, la similitud del 97 %. Dentro de los 40 residuos del subdominio 3, cuatro residuos de cisteína están completamente conservados. Tres de las cisteínas también están 35 conservadas en los ortólogos de FGE procariotas. Los 12 miembros procariotas de la familia de FGE (para más detalles véase el Ejemplo 2) comparten la estructura de subdominios con los FGE eucariotas. Los límites entre los tres subdominios son más evidentes en la familia procariota de FGE debido a secuencias no conservadas de longitudes variables que separan los subdominios entre sí. El genoma humano y de ratón codifican dos homólogos estrechamente relacionados de FGE (SEC ID Nº: 43 y 44, Nº de acceso de GenBank NM_015411, en el hombre, y 40 SEC ID Nº: 45 y 46, Nº de acceso de GenBank AK076022, en ratón). Los dos parálogos son idénticos en un 86 %. Sus genes están localizados en regiones sinténicas del cromosoma (7q11 en ser humano, 5G1 en ratón). Ambos parálogos comparten con los ortólogos de FGE la estructura de subdominios y son idénticos en un 35 % y similares en un 47 % con respecto a la FGE humana. En el tercer subdominio, que es idéntico en un 100 % en ambos homólogos, falta la secuencia undecamérica que contiene cisteína del subdominio 3. 45
Expresión, localización subcelular y formas moleculares
Es detectarse un único transcrito de 2,1 kb mediante análisis de transferencia Northern del ARN total de fibroblastos de piel y ARN-poli A+ de corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas. En 50 relación con el ARN de -actina, la abundancia varía en un orden de magnitud y es la más alta en páncreas y riñón y la más baja en cerebro. Se ensayaron diversas líneas de células eucariotas que expresan de manera estable o transitoria el ADNc de FGE humana o derivados de FGE prolongados en el extremo C por un marcador de HA, Myc o His6 para actividad de FEG y la localización subcelular de FGE. La expresión transitoria de FGE marcada y no marcada aumentó la actividad FEG 1,6 - 3,9 veces. La expresión estable de FGE en células PT67 aumentó la 55 actividad FGE en aproximadamente 100 veces. La detección de la forma de FGE marcada mediante inmunofluorescencia indirecta en células BHK 21, CHO y HT1080 mostró una co-ubicación de las formas de FGE marcadas de manera diversa con la proteína disulfuro isomerasa, una proteína luminal del retículo endoplásmico. El análisis de transferencia Western de los extractos de células BHK 21 transfectadas de manera transitoria con ADNc que codifica las formas marcadas de FGE mostró una única banda inmunorreactiva con un tamaño aparente de 60 entre 42 y 44 kDa.
El gen de FGE porta mutaciones en MSD
La MSD se produce por una deficiencia para generar residuos de FGIy en sulfatasas (Schmidt, B., et al., Cell, 1995, 65 82: 271-278). El gen de FGE es, por tanto, un gen candidato para la MSD. Los presentes inventores amplificaron y
secuenciaron el ADNc que codifica FGE de siete pacientes con MSD y encontraron diez mutaciones diferentes que se confirmaron mediante secuenciación del ADN genómico (Tabla 1).
Tabla 1: Mutaciones en pacientes con MSD
5
Mutación
Efecto en proteína Observaciones Paciente
1076C>A
S359X El truncamiento de la C-terminal de 16 residuos 1*
IVS3+5-8 del
La deleción de residuos 149-173 En marco deleción del exón 3 1,2
979C>T
R327X Pérdida de subdominio 3 2
1045C>T
R349W La sustitución de un residuo conservado en subdominio 3 3,7
1046G>A
R349Q La sustitución de un residuo conservado en subdominio 3 4
1006T>C
C336R La sustitución de un residuo conservado en subdominio 3 4
836C>T
A279V La sustitución de un residuo conservado en subdominio 3 5
243delC
desplazamiento del marco y el truncamiento La pérdida de los tres subdominios 5
661delG
desplazamiento del marco y el truncamiento Pérdida de la tercera C-terminal de FGE incluyendo subdominio 3 6**
IVS6-1G>A
La deleción de residuos 281-318 En marco deleción del exón 7 5
* Paciente 1 es el paciente MSD Mo. en Schmidt, B., et al, Cell, 1 995, 82:. 271-278 y Rommerskirch y von Figura, Proc. Natl. Acad. Sci, EE.UU., 1992, 89:. 2561-2565. ** Paciente 6 es el paciente MSD reportado por Burk et al, J. Pediatr, 1984, 104:.. 574-578.
10
15
20
25
30
Los otros pacientes representan casos no publicados.
El imprimación paciente era heterocigoto para una sustitución 1076C>A que convierte el codón para serina 359 en un codón de terminación (S359X) y una mutación que produce la deleción de los 25 residuos 149-173 que están 35 codificados por el exón 3 y separan los dominios imprimacióno y segundo de la proteína. La secuenciación genómica reveló una deleción de nucleótidos +5-8 del tercer intrón (IVS3+5-8 del), destruyéndose así el sitio donador de corte y empalme del intrón 3. El segundo paciente era heterocigoto para la mutación que produce la pérdida del exón 3 (IVS3+5-8 del) y una sustitución 979C>T que convierte el codón para arginina 327 en un codón de terminación (R327X). La FGE truncada codificada por el alelo 979C>T carece de la mayor parte del subdominio 3. El tercer 40 paciente era homocigoto para una sustitución 10450T que sustituye la arginina conservada 349 en el subdominio 3 por triptófano (R349W). El cuarto paciente era heterocigoto para dos mutaciones de aminoácido que reemplazan residuos conservados en el dominio de FGE: una sustitución 1046>T que reemplaza la arginina 349 por glutamina (R349Q) y una sustitución 1006T>C que reemplaza la cisteína 336 por arginina (C336R). El quinto paciente era heterocigoto para una sustitución 836 C>T que reemplaza la alanina conservada 279 por valina (A279V). La 45 segunda mutación es una deleción de único nucleótido (243delC) que cambia la secuencia después de la prolina 81 y que produce una detención de la traducción después del residuo 139. El sexto paciente era heterocigoto para la deleción de un único nucleótido (661delG) que cambia la secuencia de aminoácidos tras el residuo 220 y que introduce un codón de terminación tras el residuo 266. La segunda mutación es una mutación del sitio aceptor de corte y empalme del intrón 6 (IVS6-1G>A) que produce una deleción en marco del exón 7 que codifica los residuos 50 281-318. En el séptimo paciente se encontró la misma sustitución 1045C>T que en el tercer paciente. Además se detectaron dos polimorfismos en la región codificante de 18 alelos de FGE de los controles y pacientes con MSD. El 22 % portaba una sustitución 188G>A, que reemplaza la serina 63 por asparagina (S63N) y el 28 % una sustitución silenciosa 1116C>T.
55
Transducción de fibroblastos con MSD con ADNc de FGE no mutante y mutante
Con el fin de confirmar la deficiencia de FGE como la causa de la inactividad de las sulfatasas sintetizadas en la MSD, se expresó el ADNc de FGE en fibroblastos con MSD utilizando transferencia de genes retrovirales. Como control, los presentes inventores transdujeron el vector retroviral sin inserto de ADNc. Para monitorizar la 60 complementación del defecto metabólico con la actividad de ASA, se midieron la esteroide sulfatasa (STS) y la N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa (GalNAc6S) en los fibroblastos transducidos antes o después de la selección. La transducción de la FGE no mutante restauró parcialmente la actividad catalítica de las tres sulfatasas en dos líneas de células con MSD (Tabla 2) y para la STS en una tercera línea de células con MSD. Debe observarse que para ASA y GalNAc6S la restauración fue solo parcial después de la selección de los fibroblastos que alcanzaban del 20 65 al 50 % de la actividad normal. Para la STS, se encontró que la actividad se restauraba a la de los fibroblastos de
control después de la selección. La selección aumentó la actividad de ASA y STS del 50 al 80 %, que es compatible con la observación anterior de que llegan a translucirse del 15 al 50 % de los fibroblastos (Lübke et al., Nat. Gen., 2001, 28:73-76). Las actividades de sulfatasa en los fibroblastos con MSD transducidos con el vector retroviral solo (Tabla 2) fueron comparables a las de los fibroblastos con MSD no transducidos (no mostradas). La transducción de ADNc de FGE que porta la mutación IVS3+5-8del no restauró las actividades de sulfatasa (Tabla 2). 5
Tabla 2: Complementación de fibroblastos con MSD por transducción de ADNc de FGE no mutante o mutante
Sulfatasa
Inserción FGE
Fibroblastos
imagen1
10
15
20
Fibroblastos
25
1Los valores dan la razón entre ASA (proteína celular mU / mg), STS (/ mg de proteína celular mU), Ga1NAc6S (mU / mg celular proteína) y la de β-hexosaminidasa (proteína de la célula U / mg). Para el control de fibroblastos la media y la variación de 6 a 11 líneas celulares se da. Donde se indica el rango de dos culturas transducidas en paralelo se da para fibroblastos MSD. ° El número de fibroblastos MSD se refiere a la del paciente en la Tabla 1. + Determinación de la actividad antes de la selección. ++ Determinación de la actividad después de la selección. N.D .: no determinado
30
35
Discusión
FGE es una glicoproteína altamente conservada del retículo endoplásmico.
40
La purificación de FGE de testículos bovinos dio dos polipéptidos de 39,5 y 41,5 kDa que se originan a partir del mismo gen. La expresión de tres versiones de FGE marcadas de manera diferente en tres líneas de células eucariotas diferentes como una única forma sugiere que una de las dos formas observadas en la preparación de FGE purificada de testículos bovinos puede haberse generado por proteólisis limitada durante la purificación. La substitución de Cys69 en el péptido ASA65-80 por serina fue crítica para la purificación de FGE mediante 45 cromatografía de afinidad. La FGE tiene una secuencia señal escindible que media en la translocación a través de la membrana del retículo endoplásmico. La mayor parte de la proteína madura (275 residuos de 340) define un dominio único, que es probable que esté compuesto por tres subdominios (véase el Ejemplo 2), para ninguno de los tres subdominios existen homólogos en proteínas con función conocida. El reconocimiento del motivo de modificación FGIy lineal en polipéptidos de sulfatasa recién sintetizados (Dierks et al., EMBO J., 1999, 18:2084- 2091) podría ser 50 la función de un subdominio de FGE. El dominio catalítico podría catalizar la formación de FGIy de varias formas. Se ha propuesto que FGE extrae electrones del grupo tiol de la cisteína y los transfiere a un aceptor. El tioaldehído resultante se hidrolizaría espontáneamente a FGIy y H2S (Schmidt, B., et al., Cell, 1995, 82:271-278). Alternativamente, FGE podría actuar como una oxigenasa de función mixta (monooxigenasa) que introduce un átomo de O2 en la cisteína y el otro en H2O con la ayuda de un donante de electrones tal como FADH2. El derivado 55 de hidrato de tioaldehído resultante de cisteína reaccionaría espontáneamente con FGIy y H2S. Experimentos preliminares con una preparación de FGE parcialmente purificada mostraron una dependencia crítica de la formación de FGIy del oxígeno molecular. Esto sugeriría que FGE actúa como una oxigenasa de función mixta. La alta conservación particular del subdominio 3 y la presencia de tres residuos de cisteína completamente conservados en el mismo hacen que este subdominio sea un candidato probable para el sitio catalítico. Será interesante ver si los 60 elementos estructurales que median en el reconocimiento del motivo FGIy y la unión de un aceptor de electrones o un donante de electrones se correlacionan con la estructura de dominio de FGE.
FGE recombinante se localiza en el retículo endoplásmico, que es compatible con el sitio propuesto de su acción. Los residuos de FGIy se generan en sulfatasas recién sintetizadas durante o poco después de su translocación al 65 retículo endoplásmico (Dierks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94:11963-11968; Dierks et al., FEBS Lett.,
1998, 423:61-65). La propia FGE no contiene una señal de retención en el RE del tipo KDEL. Su retención en el retículo endoplásmico puede estar mediada, por tanto, por la interacción con otras proteínas del RE. Los componentes de la maquinaria de translocación/N-glicosilación son candidatos atractivos para tales parejas de interacción.
5
Las mutaciones en FGE producen MSD
Los presentes inventores han mostrado que las mutaciones en el gen que codifica FGE producen MSD. La FGE también puede interaccionar con otros componentes, y los defectos en genes que codifican estos últimos podrían producir MSD de igual forma. En siete pacientes con MSD los presentes inventores encontraron de hecho diez 10 mutaciones diferentes en el gen de FGE. Todas las mutaciones tienen efectos graves en la proteína FGE sustituyendo residuos altamente conservados en el subdominio 3 (tres mutaciones) o en el subdominio 2 (una mutación) o truncamientos en el extremo C de diversas longitudes (cuatro mutaciones) o grandes deleciones en marco (dos mutaciones). Para dos líneas celulares con MSD y una de las mutaciones en MSD se demostró que la transducción del ADNc de FEG no mutante, pero no del mutante, restaura parcialmente las actividades de 15 sulfatasas. Esto identifica claramente el gen de FGE como el sitio de mutación y la naturaleza de la mutación que produce la enfermedad. MSD es tanto clínica como bioquímicamente heterogénea. Se ha diferenciado una forma neonatal poco frecuente que se presenta al nacer y que desarrolla un hidrocéfalo, una forma común que se asemeja inicialmente a una leucodistrofia metacromática infantil y que posteriormente desarrolla características similares a las de la ictiosis y la mucopolisacaridosis, y una forma leve menos frecuente en la que prevalecen las características 20 clínicas de una mucopolisacaridosis. Bioquímicamente, es característico que pueda detectarse una actividad de sulfatasas residual, que para la mayoría de los casos en fibroblastos de piel en cultivo es inferior al 10 % de los controles (Burch et al., Clin. Genet., 1986, 30: 409-15; Basner et al., Pediatr. Res., 1979, 13:1316-1318). Sin embargo, en algunas líneas celulares con MSD, la actividad de sulfatasas seleccionadas puede alcanzar el intervalo normal (Yutaka et al., Clin. Genet., 1981, 20:296-303). Además, se ha informado que la actividad residual se somete 25 a variaciones dependiendo de las condiciones del cultivo celular y de factores desconocidos. Bioquímicamente, la MSD se ha clasificado en dos grupos. En el grupo I, la actividad residual de sulfatasas es inferior al 15 % incluyendo la de ASB. En el grupo II, la actividad residual de sulfatasas es superior y particularmente la de ASB puede alcanzar valores de hasta el 50-100 % del control. Todos los pacientes informados en el presente documento se clasifican en el grupo I, excepto el paciente 5, que se clasifica en el grupo II (actividad de ASB en el intervalo control) del fenotipo 30 bioquímico. Basándose en criterios clínicos, los pacientes 1 y 6 son casos de neonatos, mientras que los pacientes 2-4 y 7 tienen la forma de MSD común y el paciente 5 la forma similar a mucopolisacaridosis.
La heterogeneidad fenotípica sugiere que las diferentes mutaciones en pacientes con MSD están asociadas con diferentes actividades residuales de FGE. Los datos preliminares en células PT67 que expresan de manera estable 35 FGE IVS3+5-8del indican que la deleción en marco del exón 3 anula la actividad FEG completamente. La caracterización de las mutaciones en MSD, de las propiedades bioquímicas de FGE mutante y del contenido residual de FGIy en sulfatasas usando un método de espectrometría de masas altamente sensible desarrollado recientemente (Peng et al., J. Mass Spec., 2003, 38:80-86) proporcionará un mejor entendimiento de la correlación genotipo-fenotipo en MSD. 40
Ejemplo 2:
El gen de FGE humana define una nueva familia de genes que modifican sulfatasas que está conservada de procariotas a eucariotas 45
Bioinformática
Se describieron los péptidos señal y los sitios de escisión con el método de von Heijne (Nucleic Acids Res., 1986, 14:4683) implementado en EMBOSS (Rice et al., Trends in Genetics, 2000, 16:276-277), y el método de Nielsen et 50 al. (Protein Engineering, 1997, 10:1-6). Se predijeron los sitios de N-glicosilación usando el algoritmo de Brunak (Gupta y Brunak, Pac. Symp. Biocomput., 2002, 310-22).
Se detectaron los dominios funcionales buscando modelos ocultos de Markov en PFAM (versión 7.8) (Sonnhammer et al., Nucleic Acids Res., 1998, 26:320-322). Se obtuvieron secuencias de la semilla DUF323 en PFAM de TrEMBL 55 (Bairoch, A. y Apweiler, R., Nucleic Acids Res., 2000, 28:45-48). Se realizaron alineamientos múltiples y construcciones de árbol filogenético con Clustal W (Thompson, J., et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680). Para la computación de árbol filogenético, se excluyeron las posiciones de hueco y se corrigieron para substituciones múltiples. Se realizó remuestreo en árbol para obtener resultados significativos. Se visualizaron los árboles usando Njplot (Perriere, G. y Gouy, M., Biochimie, 1996, 78:364-369). Los alineamientos se representaron 60 gráficamente usando el comando prettyplot de EMBOSS.
Para buscar homólogos de FGE, se consultaron las bases de datos NR, NT y EST del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Wheeler et al., Nucleic Acids Res., 2002, 20:13-16) con BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402). Para las secuencias proteicas, se realizó la búsqueda usando Psi-Blast de 65 convergencia iterativo frente a la versión actual de la base de datos NR que usa un punto de corte de valor probable
de 10-40, y parámetros por defecto. Se alcanzó la convergencia después de 5 iteraciones. Para las secuencias de nucleótidos, se realizó la búsqueda con Psi-TBIastn: usando NR y la secuencia de proteínas de FGE humana como entrada, se construyó una matriz de puntuación para hFGE con Psi-Blast de convergencia iterativo. Se usó esta matriz como entrada para Blastall para consultar las bases de datos de nucleótidos NT y EST. Para ambas etapas, se usó un punto de corte de valor probable de 10-20. 5
Se realizó la predicción de la estructura secundaria de las proteínas usando Psipred (Jones, D., J Mol Biol., 1999, 292:1950-202; McGuffin, L., et al., Bioinformatics, 2000, 16:404-405).
Se calcularon puntuaciones de similitud de los subdominios a partir de los alineamientos usando el algoritmo cons. 10 de EMBOSS con parámetros por defecto. Se generaron los meta-alineamientos alineando secuencias consenso de subgrupos de la familia de FGE. Se determinaron la sintenia y la organización de loci genómicos usando recursos de genoma de ser humano y ratón de NCBI en NCBI (Bethesda, MD) y sintenia de ser humano-ratón-rata de Softberry (Mount Kisco, NY). Se descargaron secuencias genómicas bacterianas del servidor FTP de NCBI. Se usó la anotación genómica microbiana de NCBI para obtener una visión general de los loci genómicos de los genes 15 bacterianos de FGE.
Resultados y discusión
Características y motivos básicos de la FGE humana y proteínas relacionadas 20
El gen de FGE humana (SEC ID Nº: 1, 3) codifica la proteína FGE (SEC ID Nº: 2) que se predice que tiene 374 residuos. Una señal de escisión entre los residuos 22-33 (Heijne-Score de 15,29) y un índice hidropático (Kyte, J. y Doolittle, R., J Mol Biol., 1982, 157:105-132) de los residuos 17-29 de entre 1,7 y 3,3 indican que los 33 residuos del extremo N se escinden después de la translocación al RE. Sin embargo con el algoritmo de Nielsen et al. (Protein 25 Engineering, 1997, 10:1-6), se predice la escisión de la secuencia señal después del residuo 34. La proteína tiene un único sitio posible de N-glicosilación en Asn 141.
Una búsqueda con la secuencia de proteína FGE en la base de datos de motivos de proteínas PFAM (Sonnhammer et al., Nucleic Acids Res., 1998, 26:320-322) reveló que los residuos 87-367 de la FGE humana pueden clasificarse 30 como el dominio de proteína DUF323 (“dominio de función desconocida”, PF03781) con un valor probable altamente significativo de 7:9*10-114. La semilla en PFAM que define DUF323 consiste en 25 secuencias de proteínas, de las que la mayoría son proteínas hipotéticas derivadas de datos de secuenciación. Para analizar la relación entre la FGE humana y DUF323, se realizó un alineamiento múltiple de FGE con las secuencias de la semilla DUF323. Basándose en esto, se construyó y remuestreo un árbol filogenético. Cuatro de las secuencias hipotéticas (TrEMBL- 35 ID Q9CK12, Q9I761, 094632 y Q9Y405) tuvieron una divergencia tan fuerte de los otros miembros de la semilla que evitaron el remuestreo satisfactorio y tuvieron que eliminarse del conjunto. La Figura 2 muestra el árbol de remuestreo que presenta la relación entre la FGE humana y las 21 proteínas de semilla DUF323 restantes. El árbol puede usarse para subdividir los miembros de semilla en dos categorías: homólogos estrechamente relacionados con FGE humana y los genes restantes menos relacionados. 40
Las 7 proteínas superiores tienen una distancia filogenético entre 0,41 y 0,73 con respecto a la FGE humana. Solo contienen un único dominio, DUF323. La homología dentro de este grupo se extiende por toda la secuencia de aminoácidos, consistiendo la mayor parte en el dominio DUF323. El dominio DUF323 está fuertemente conservado dentro de este grupo de homólogos, mientras que las otras 15 proteínas de la semilla están menos relacionadas con 45 la FGE humana (distancia filogenética entre 1,14 y 1,93). Su dominio DUF323 diverge considerablemente del dominio DUF323 altamente conservado del imprimación grupo (véase la sección “Subdominios de FGE y mutaciones en el gen de FGE”). La mayoría de estas 15 proteínas son hipotéticas, habiéndose investigado adicionalmente seis de ellas. Una de ellas, una serina/treonina cinasa (TrEMBL:084147) de C. trachomatis contiene otros dominios, además de DUF323: un dominio de unión a ATP y un dominio cinasa. Las secuencias de R. 50 sphaeroides (TrEMBL: Q9ALV8) y Pseudomonas sp. (TrEMBL: 052577) codifican la proteína NirV, un gen cotranscrito con la nitrito reductasa que contiene cobre nirK (Jain, R. y Shapleigh, J., Microbiology, 2001, 147:2505-2515). CarC (TrEMBL: Q9XB56) es una oxigenasa implicada en la síntesis de un antibiótico β-lactámico de E. carotovora (McGowan, S., et al., Mol Microbiol., 1996, 22:415-426; Khaleeli N, T. C. y Busby RW, Biochemistry, 2000, 39:8666-8673). XylR (TrEMBL: 031397) y BH0900 (TrEMBL: Q9KEF2) son proteínas potenciadoras de unión 55 implicadas en la regulación de la utilización de pentosas (Rodionov, D., et al., FEMS Microbiol Lett., 2001, 205:305-314) en Bacillaceae y Clostridiaceae. La comparación de FGE y DUF323 condujo al establecimiento de un umbral de homología que diferencia la familia de FGE de homólogos que contienen DUF323 distantes con diferentes funciones. Estos últimos incluyen una serina/treonina cinasa y XylR, un potenciador de la transcripción, así como FGE, una enzima generadora de FGIy y CarC, una oxigenasa. Como se trata en otra parte en el presente documento, la FGE 60 también podría ejercer su función de modificación de cisteína como una oxigenasa, sugiriendo que la FGE y miembros distintos de FGE de la semilla DUF323 pueden compartir una función oxigenasa.
Homólogos de FGE
65
La presencia de homólogos estrechamente relacionados de la FGE humana en la semilla DUF323 dirigió a los
presentes inventores a la búsqueda de homólogos de FGE humana en la base de datos NR de NCBI (Wheeler et al., Nucleic Acids Res., 2002, 20:13-16). El umbral de la búsqueda se eligió de tal forma que se obtuvieron los 6 homólogos presentes en la semilla DUF323 y otros homólogos estrechamente relacionados sin encontrar los otros miembros de semilla. Esta búsqueda condujo a la identificación de tres ortólogos de FGE en eucariotas, 12 ortólogos en procariotas y dos parálogos en el hombre y el ratón (Tabla 3). 5
Tabla 3: La familia de genes de FGE en eucariotas y procariotas
Subgrupo
Longitud [AA]
Especies
imagen2
10
15
20
25
30
35
Identificador proteína GI GenBank NA- AA ácido nucleico - aminoácidos, E1 - E2 - ortólogos eucariotas paralogs eucariotas P1 - estrechamente relacionado procariota P2 ortólogos - otros ortólogos procariotas secuencia de la proteína f- mispredicted en GenBank
40
45
Obsérvese que en GenBank se predice que la secuencia Gl 22122361 de ratón codifica una proteína de 284 aa, aunque la secuencia NM 145937 de ADNc codifica una proteína de 372 residuos. Esta mala predicción se basa en la omisión del imprimación exón del gen murino de FGE. Todas las secuencias encontradas en la base de datos NR son de procariotas o eucariotas superiores. No se detectaron homólogos de FGE en Archaebacteriae o plantas. Las 50 búsquedas con umbrales incluso inferiores en los genomas completamente secuenciados de C. elegans y S. cerevisiae y las bases de datos relacionadas ORF no revelaron ningún homólogo. Una búsqueda en las secuencias eucariotas de las bases de datos de nucleótidos NT y EST condujo a la identificación de 8 EST de ortólogo de FGE adicionales, mostrando los fragmentos de secuencia de ADNc en el extremo 3’ un alto grado de conservación al nivel de proteína que no se enumeran en la base de datos NR. Estas secuencias no engloban la parte codificante 55 completa de los ARNm y todos son de eucariotas superiores (Tabla 4).
60
65
Tabla 4: Fragmentos EST ortólogos de FGE en eucariotas
imagen3
Especies
5
10
15
imagen4
20
GB- GenBank adhesión n; Ácido nucleico NA-
25
El alineamiento múltiple y la construcción de un árbol filogenético (usando ClustalW) de las secuencias codificantes a partir de la base de datos NR permitió la definición de cuatro subgrupos de homólogos: ortólogos eucariotas (FGE de ser humano, ratón, mosquito y mosca de la fruta, parálogos eucariotas (parálogo de FGE de ser humano y ratón), ortólogos procariotas estrechamente relacionados con FGE (Streptomyces y Corynebacterium y otros ortólogos procariotas (Caulobacter, Pseudomonas, Mycobacterium, Prochlorococcus, Mesorhizobium, Sinorhizobium, 30 Novosphingobium, Ralstonia, Burkholderia, y Microscilla). Los ortólogos eucariotas muestran una identidad global con la FGE humana del 87 % (ratón), 48 % (mosca de la fruta) y 47 % (Anopheles). Aunque los ortólogos de FGE se encuentran en procariotas y eucariotas superiores, no aparecen en los genomas completamente secuenciados de eucariotas inferiores situados filogenéticamente entre S. cerevisiae y D. melanogaster. Además, los homólogos de FGE están ausentes en los genomas completamente secuenciados de E. coli y el pez globo. 35
Como se trata en otra parte en el presente documento, los parálogos de FGE encontrados en ser humano y ratón pueden tener una actividad de generación de FGIy menor y contribuir a las actividades residuales de las sulfatasas encontradas en pacientes con MSD.
40
Subdominios de FGE
Los miembros de la familia de genes de FGE tienen tres partes/dominios altamente conservados (como se describe en otra parte en el presente documento). Además de las dos secuencias no conservadas que separan a la imprimacióna, tienen extensiones no conservadas en los extremos N y C. Se considera que las tres partes 45 representan subdominios del dominio DUF323 debido a que están separadas por partes no conservadas de longitud variable. La longitud de la parte que separa los subdominios 1 y 2 varías entre 22 y 29 residuos y la que separa los subdominios 2 y 3 entre 7 y 38 aminoácidos. Las partes no conservadas de los extremos N y C muestran una variación incluso más fuerte en la longitud (extremo N: 0-90 AA, extremo C: 0-28 AA). La secuencia para el gen de FGE de Ralstonia metallidurans está probablemente incompleta, ya que carece del imprimación subdominio. 50
Para verificar la plausibilidad de definir subdominios de DUF323, presentes inventores realizaron la predicción de una estructura secundaria de la proteína FGE humana usando Psipred. Se predice que la señal de RE hidrófoba (residuos 1-33) contiene estructuras en hélice, que confirma la predicción de señal del algoritmo de von-Heijne. La región no conservada del extremo N (aa 34-89) y la región de separación entre los subdominios 2 y 3 (aa 308-327) 55 contienen secciones helicoidales. La región que separa los subdominios 1 y 2 contiene una hélice. La hélice α en los aa 65/66 tiene una baja confianza de predicción y es probablemente un artefacto de predicción. Los límites de subdominio están situados dentro de las hélices y no interrumpen las hélices α o las hebras β. El imprimación subdominio está constituido por varias hebras β y una hélice α, el segundo subdominio contiene dos hebras β y cuatro hélices α. El tercer subdominio tiene una región de hélice α flanqueada por una hoja al principio y al final del 60 subdominio. En resumen, la estructura secundaria está de acuerdo con la estructura de subdominios propuesta ya que los límites de subdominio están situados dentro de hélices y los subdominios contienen los elementos estructurales hélices α y hebras β.
Debe observarse que ninguno de los subdominios existe como un módulo aislado en las secuencias enumeradas en 65 las bases de datos. Dentro de cada uno de los cuatro subgrupos de la familia de FGE, los subdominios están
altamente conservados, mostrando el tercer subdominio la mayor homología (Tabla 5). Este subdominio también muestra la homología más fuerte en todos los subgrupos.
imagen5
5
Tabla 5: Homología (% de similitud) de los subdominios de la familia de FGE
Subdominio
Miembros
Subfamilia
10
15
E1 - ortólogos eucariotas; E2 - paralogs eucariotas
P1 - ortólogos procariotas estrechamente relacionados; P2 - otros ortólogos procariotas
El imprimación subdominio de la familia de FGE muestra la homología más débil en todos los subgrupos. En los 20 ortólogos eucariotas lleva el sitio de N-glicosilación: en el residuo Asn 141 en ser humano, en Asn 139 en el ratón y Asn 120 en la mosca de la fruta. En Anopheles, no se encontró asparagina en el residuo 130 homólogo a Asn 120 de D. melanogaster. Sin embargo, un cambio de dos nucleótidos crearía un sitio de N-glicosilación Asn 130 en Anopheles. Por tanto, es necesario volver a secuenciar la secuencia que engloba el residuo 130. El segundo subdominio es rico en triptófanos con 12 Trp en 129 residuos de la FGE humana. Diez de estos triptófanos están 25 conservados en la familia de FGE.
Alta conservación del subdominio 3: el subdominio 3 entre ortólogos eucariotas es similar en un 100 % e idéntico en un 90 %. La importancia del tercer subdominio para la función de la proteína está subrayada por la observación de que este subdominio no es un punto clave para las mutaciones causantes de la enfermedad en pacientes con MSD. 30 Siete de las nueve mutaciones identificadas en seis pacientes con MSD descritos en el Ejemplo 1 están localizadas en secuencias que codifican los 40 residuos del subdominio 3. Los residuos contienen cuatro cisteínas, tres de las cuales están conservadas entre los ortólogos procariotas y eucariotas. Los dos parálogos eucariotas muestran la menor homología con los otros miembros de la familia de FGE, por ejemplo, carecen de dos de las tres cisteínas conservadas del subdominio 3. Las características conservadas entre las secuencias del subdominio 3 de ortólogos 35 y parálogos son el motivo RVXXGG(A)S inicial (SEC ID Nº: 79), un heptámero que contiene tres argininas (residuos 19-25 de la secuencia consenso del subdominio) y el motivo GFR terminal. Una comparación con el dominio DUF323 de las 15 secuencias semillas que no son homólogos estrechos de FGE muestra marcadas diferencias de secuencia: las 15 secuencias de semillas tienen un subdominio imprimacióno y segundo menos conservado, aunque la estructura de subdominios global también es visible. El subdominio 3, que está fuertemente conservado en la 40 familia de FGE, es más corto y tiene una homología significativamente más débil en el subdominio 3 de eucariotas (similitud de aproximadamente el 20 %) en comparación con los miembros de la familia de FGE de procariotas (similitud de aproximadamente el 60 %). Por tanto, todos carecen de los residuos conservados de cisteína del subdominio 3. Las únicas características conservadas son el motivo RVXXGG(A)S inicial (SEC ID Nº: 79) y el motivo GFR terminal. 45
Organización genómica del gen de FGE humana y murina
El gen de FGE humana está localizado en el cromosoma 3p26. Abarca 105 kb y 9 exones para la secuencia traducida. El gen de FGE murina tiene una longitud de 80 Kb y está localizado en el cromosoma 6E2. Los 9 exones 50 del gen de FGE murina tienen casi el mismo tamaño que los exones humanos (Figura 3). Las principales diferencias entre el gen humano y de ratón son la menor conservación de UTR en 3’ en el exón 9 y la longitud de exón 9, que es 461 pb más largo que en el gen murino. El segmento 6E2 del cromosoma 6 de ratón es altamente sinténico al segmento 3p26 del cromosoma humano. Hacia el telómero, tanto los loci de FGE humana como murina están flanqueados por los genes que codifican LMCD1, KIAA0212, ITPR1, AXCAM y IL5RA. En la dirección centromérica, 55 ambos loci de FGE están flanqueados por los loci de CAV3 y OXTR.
Organización genómica de los genes de FGE de procariotas
En procariotas, las sulfatasas se clasifican o bien como sulfatasas de tipo cisteína o bien de tipo serina dependiendo 60 del residuo que se convierte en FGIy en su centro activo (Miech, C., et al., J Biol Chem., 1998, 273:4835-4837; Dierks, T., et al., J Biol Chem., 1998, 273:25560-25564). En Klebsiella pneumoniae, E. coli y Yersinia pestis, las sulfatasas de tipo serina forman parte de un operón con AtsB, que codifica una proteína citosólica que contiene motivos de agrupamiento de hierro-azufre y son críticos para la generación de FGIy a partir de residuos de serina (Marquordt, C., et al., J Biol Chem., 2003, 278:2212-2218; Szameit, C., et al., J Biol Chem., 1999, 274:15375- 65 15381).
Por tanto, fue de interés examinar si los genes de FGE procariotas estaban localizados en la proximidad de sulfatasas de tipo cisteína que son los sustratos de FGE. Entre los genes de FGE procariotas mostrados en la Tabla 3, siete tienen genomas completamente secuenciados, que permite un análisis de las proximidades de los loci de FGE. De hecho, en cuatro de los 7 genomas (C. efficiens: PID 25028125, P. putida: PID 26990068, C. crescentus: 5 PID 16125425 y M. tuberculosis: PID 15607852) se encontró una sulfatasa de tipo cisteína en proximidad directa con FGE compatible con una cotranscripción de FGE y la sulfatasa. En dos de ellos (C. efficiens y P. putida), FGE y la sulfatasa tienen incluso ORF solapantes, que indica fuertemente su coexpresión. Además, la proximidad genómica de los genes de FGE y sulfatasa en cuatro procariotas proporciona una evidencia adicional para suponer que las FEG bacterianas son ortólogos funcionales. 10
Los tres microorganismos restantes sí contienen sulfatasas de tipo cisteína (S. coelicolor. PID 24413927, M. loti: PID 13476324, S. meliloti: PID 16262963, 16263377, 15964702), sin embargo, los genes próximos a FGE en estos microorganismos ni contienen una secuencia distintiva de sulfatasa canónica (Dierks, T., et al., J Biol Chem., 1998, 273:25560-25564) ni un dominio que indique su función. En estos organismos, la expresión de FGE y sulfatasas de 15 tipo cisteína, por tanto, probablemente va a regularse en trans.
Conclusiones
La identificación de FGE humana cuya deficiencia produce la enfermedad de almacenamiento lisosómico transmitida 20 de manera autonómica-recesiva, deficiencia múltiple de sulfatasas, permite la definición de una nueva familia de genes que comprende ortólogos de FGE de procariotas y eucariotas, así como un parálogo de FGE en ratón y ser humano. La FGE no se encuentra en genomas completamente secuenciados de E. coli, S. cerevisiae, C. elegans y Fugu rubripes. Además, hay un vacío filogenético entre procariotas y eucariotas superiores, careciéndose de FGE en algunas especies situadas filogenéticamente entre procariotas y D. melanogaster. Sin embargo, algunos de estos 25 eucariotas inferiores, por ejemplo C. elegans, tienen genes de sulfatasa de tipo cisteína. Esto indica la existencia de un segundo sistema de generación de FGIy que actúa sobre las sulfatasas de tipo cisteína. Esta suposición está apoyada por la observación de que E. coli, que carece de FGE, puede generar FGIy en sulfatasas de tipo cisteína (Dierks, T., et al., J Biol Chem., 1998, 273:25560-25564).
30
Ejemplo 3:
La expresión de FGE produce aumentos significativos en la actividad de sulfatasa en líneas celulares que expresan en exceso una sulfatasa
35
Los presentes inventores quisieron examinar los efectos de FGE sobre células que expresan/expresan en exceso una sulfatasa. Para este fin, se transfectaron células HT-1080 que expresan las sulfatasas humanas iduronato 2-sulfatasa (I2S) o N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa (GALNS) por duplicado con o bien una construcción de expresión de FGE, pXMG.1.3 (Tabla 7 y Figura 4) o bien un plásmido de control, pXMG.1.2 (FGE en orientación antisentido no puede producir FGE funcional, Tabla 7). Se recogieron muestras de los medios 24, 48 y 72 horas tras un cambio de 40 medio tras electroporación de 24 horas. Se probaron las muestras de medio para actividad de sulfatasa respectiva mediante ensayo de actividad y el nivel de proteína sulfatasa total estimado mediante ELISA específico para o bien iduronato 2-sulfatasa o bien N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa.
Tabla 6. Líneas celulares transfectadas que expresan sulfatasas usadas como sustratos para transfección 45
imagen6
Sulfatasa Expresada
Plásmido
Cepa celular
N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa
50
Iduronato 2-sulfatasa
Tabla 7. Plásmidos de FGE y de control usados para transfectar células HT-1080 que expresan iduronato 2-sulfatasa y N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa 55
imagen7
Configuración de los elementos de la secuencia de ADN Major *
Plásmido
> 1,6 kb CMV potenciador / promotor> 1,1 kb cADN FGE> secuencia no traducida hGH3 '<amp <DHFR casete <casete Cdneo (neomicina fosfotransferasa)
pXMG.1.3 (expresión FGE)
60
kb CMV potenciador / promotor de <1,1 kb cADN FGE <hGH3 'no traducida secuencia <amp <DHFR casete <casete Cdneo (neomicina fosfotransferasa)
pXMG.1.2 (control, FGE orientación inversa)
65
Denota orientación 5’ a 3’
Procedimientos experimentales
Materiales v métodos 5
Transfección de células HT-1080 que producen iduronato 2-sulfatasa y N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa
Se recogieron células HT-1080 para obtener 9-12 x 106 células para cada electroporación. Se transfectaron dos plásmidos por duplicado: uno para probarse (FGE) y un control; en este caso, el plásmido de control contenía el 10 ADNc de FGE clonado en la orientación inversa con respecto al promotor de CMV. Se centrifugaron las células a aproximadamente 1000 RPM durante 5 minutos. Se suspendieron las células en 1X PBS a 16x106 células/ml. Se añadieron al fondo de la cubeta de electroporación 100 µg de ADN de plásmido, se añadieron 750 µl de suspensión celular (12x106 células) a la disolución de ADN en la cubeta. Se mezclaron suavemente las células y el ADN con una pipeta de transferencia de plástico, teniendo cuidado de no crear burbujas. Se sometieron las células a 15 electroporación a 450 V, 250 µF (BioRad Gene Pulser). Se registró la constante de tiempo.
Se permitió que las células sometidas a electroporación se asentaran sin alteraciones durante 10-30 minutos. Entonces se añadieron 1,25 ml de DMEM/suero bovino al 10 % a cada cubeta, se mezclaron y se transfirieron todas las células a un matraz T75 nuevo que contenía 20 ml de DMEM/10. Después de 24 horas, se volvió a alimentar el 20 matraz con 20 ml de DMEM/10 para eliminar las células muertas. 48-72 horas después de la transfección, se recogieron muestras de los medios y se recogieron las células de los matraces T75 por duplicado.
Preparación del medio
25
1 I de DMEM/10 (contiene: 23 ml de L-glutamina 2 mM, 115 ml de suero bovino).
Se transfectaron las células en medios sin metotrexato (MTX). 24 horas después, las células volvieron a alimentarse con medios que contenían las cantidades apropiadas de MTX (36F = MTX 1,0 µM, 30C6 = MTX 0,1 M). Se recogió el medio y se recogieron las células 24, 48 y 72 horas después de volver a alimentar. Ensayos de actividad 30
Iduronato 2-sulfatasa (I2S). Se equilibraron columnas de desalación NAP5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) con tampón de diálisis (acetato sódico 5 mM, Tris 5 mM, pH 7,0). Se aplicó una muestra que contenía I2S a la columna y se permitió que entrara en el lecho. Se eluyó la muestra en 1 ml en tampón de diálisis. Se diluyeron adicionalmente las muestras desaladas hasta aproximadamente I2S 100 ng/ml tampón de reacción 35 (acetato sódico 5 mM, BSA 0,5 mg/l, Triton X-100 al 0,1 %, pH 4,5). Se añadieron 10 µl de cada muestra de I2S a la fila superior de una placa fluorimétrica de 96 pocillos (Perkin Elmer, Norwalk, CT) y se preincubó durante 15 minutos a 37 ºC. Se preparó el sustrato disolviendo sulfato de 4-metil-umbeliferilo (Fluka, Buchs, Suiza) en tampón de sustrato (acetato sódico 5 mM, BSA 0,5 mg/l, pH 4,5) a una concentración final de 1,5 mg/ml. Se añadieron 100 µl de sustrato a cada pocillo que contenía muestra de I2S y se incubó la placa durante 1 hora a 37 ºC en la oscuridad. 40 Después de la incubación, se añadieron 190 µl de tampón de parada (glicina 332,5 mM, carbonato sódico 207,5 mM, pH 10,7) a cada pocillo que contenía la muestra. Se preparó 4-metilumbeliferona como disolución madre (4-MUF, Sigma, St. Louis, MO) como patrón de producto en agua de calidad como reactivo hasta una concentración final de 1 µM. Se añadieron 150 de la disolución madre de 4-MUF 1 µM y 150 µl de tampón de parada a un pocillo de fila superior en la placa. Se añadieron 150 de tampón de parada a cada pocillo restante en la placa de 96 pocillos. Se 45 realizaron diluciones sucesivas dobles desde la fila superior de cada columna hasta la última fila de la placa. Se leyó la placa en un analizador de microplacas universal Fusion (Packard, Meriden, CT) con una longitud de onda de filtro de excitación de 330 nm y una longitud de onda de filtro de emisión de 440 nm. Se generó una curva patrón de µmoles de disolución madre de 4-MUF frente a fluorescencia, y se extrapoló la fluorescencia de las muestras desconocidas a partir de esta curva. Los resultados se informan como unidades/ml en las que una unidad de 50 actividad era igual a 1 µmol de 4-MUF producido por minuto a 37 ºC.
N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa (GALNS). El ensayo de actividad de GALNS hace uso del sustrato fluorescente 4- metilumbeliferil-β-D-galactopiranósido-6-sulfato (Toronto Research Chemicals Inc., nº de catálogo M33448). El ensayo comprendió dos etapas. En la imprimacióna etapa, se incubaron 75 µL del sustrato 1,3 mM preparado en 55 tampón de reacción (acetato sódico 0,1 M, cloruro sódico 0,1 M, pH 4,3) durante 4 horas a 37 ºC con 10 µl de medio/muestra de proteína o sus diluciones correspondientes. Se detuvo la reacción mediante la adición de 5 µl de fosfato de sodio monobásico 2 M para inhibir la actividad de GALNS. Tras la adición de aproximadamente 500 U de β-galactosidasa de Aspergillus oryzae (Sigma, nº de catálogo G5160), se incubó la mezcla de reacción a 37 ºC durante una hora adicional para liberar el resto fluorescente del sustrato. Se detuvo la segunda reacción mediante la 60 adición de 910 µl de disolución de parada (glicina al 1 %, carbonato de sodio al 1 %, pH 10,7). Se midió la fluorescencia de la mezcla resultante usando una longitud de onda de medición de 359 nm y una longitud de onda de referencia de 445 nm con 4-metilumbeliferona (sal sódica de Sigma, nº de catálogo M1508) que sirve como patrón de referencia. Una unidad de la actividad se corresponde con nmoles de 4-metilumbeliferona liberados por hora. 65
Inmunoensayos (ELISA)
Iduronato 2-sulfatasa (I2S). Se recubrió una placa de fondo plano de 96 pocillos con un anticuerpo anti-l2S monoclonal de ratón diluido a 10 ng/ml en bicarbonato sódico 50 nM a pH 9,6 durante 1 hora a 37 ºC. Se desarrolló el anticuerpo anti-l2S monoclonal de ratón por contrato por Maine Biotechnology Services, Inc. (Portland, ME) hasta 5 dar lugar a un polipéptido de I2S humano, de longitud completa, producido de manera recombinante, purificado usando tecnología de producción de hibridomas estándar. Se lavó la placa 3 veces con 1X PBS que contenía Tween-20 al 0,1 % y se bloqueó durante 1 hora con BSA al 2 % en tampón de lavado a 37 ºC. Se usó tampón de lavado con BSA al 2 % para diluir las muestras y los patrones. Se diluyó el patrón de I2S y se usó desde 100 ng/ml hasta 1,56 ng/ml. Después de la eliminación del tampón de bloqueo, se aplicaron las muestras y los patrones a la 10 placa y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Se diluyó el anticuerpo de detección, anticuerpo anti-l2S de ratón conjugado con peroxidasa de rábano, a 0,15 µg/ml en tampón de lavado con BSA al 2 %. Se lavó la placa 3 veces, se añadió el anticuerpo de detección a la placa y se incubó durante 30 minutos a 37 ºC. Para revelar la placa, se preparó el sustrato TMB (Bio-Rad, Hercules, CA). Se lavó la placa 3 veces, se añadieron 100 µl de sustrato a cada pocillo y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 2 N (100 µl/pocillo) y se 15 leyó la placa en un lector de placas de microtitulación a 450 nm, usando 655 nm como la longitud de onda de referencia.
N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa (GALNS). Dos anticuerpos anti-GALNS monoclonales de ratón proporcionaron la base del ELISA de GALNS. Los anticuerpos anti-GALNS monoclonales de ratón también se desarrollaron por 20 contrato por Maine Biotechnology Services, Inc. (Portland, ME) hasta dar lugar a un polipéptido de GALNS humano, de longitud completa, producido de manera recombinante, purificado usando tecnología de producción de hibridomas estándar. Se usó el imprimación anticuerpo para la captura de GALNS para recubrir una placa F96 MaxiSorp Nunc-lmmuno (Nalge Nunc, nº de catálogo 442404) en un tampón de recubrimiento (bicarbonato sódico 50 mM, pH 9,6). Después de la incubación durante una hora a 37 ºC y el lavado con un tampón de lavado, se bloqueó 25 la placa con tampón de bloqueo (PBS, Tween-20 al 0,05 %, BSA al 2 %) durante una hora a 37 ºC. Entonces se cargaron en la placa las muestras experimentales y de control junto con los patrones de GALNS y se incubaron adicionalmente durante una hora a 37 ºC. Después de lavar con un tampón de lavado, se aplicó el segundo anticuerpo de detección conjugado con HRP en tampón de bloqueo seguido por incubación de 30 minutos a 37 ºC. Después de lavar la placa de nuevo, se añadió el reactivo de sustrato de TMB de Bio-Rad y se incubó durante 15 30 minutos. Entonces se añadió ácido sulfúrico 2 N para detener la reacción y los resultados se puntuaron espectrofotométricamente usando un lector de placas de Molecular Device a una longitud de onda de 450 nm.
Discusión
35
Efecto de FGE sobre la actividad de sulfatasa
GALNS. Se observó un aumento de aproximadamente 50 veces en la actividad de GALNS total con respecto a los niveles control (Figura 5). Se observó este nivel de actividad aumentada con los tres puntos de tiempo de muestreo de medio. Además, la actividad de GALNS se acumuló linealmente a lo largo del tiempo con un aumento de cuatro 40 veces entre las 24 y las 48 horas y un aumento de dos veces entre los momentos de tiempo de 48 horas y 72 horas.
I2S. Aunque de menor magnitud absoluta, se observó un efecto similar para la actividad de I2S total, observándose un aumento de aproximadamente 5 veces en la actividad de I2S total con respecto a los niveles control. Este nivel de actividad aumentada se mantuvo durante la duración del experimento. La actividad de I2S se acumuló en el 45 medio linealmente a lo largo del tiempo, similarmente a los resultados observados con GALNS (2,3 veces entre las 24 y las 48 horas, y 1,8 veces entre las 48 y las 72 horas).
Efecto de FGE sobre la actividad de sulfatasa específica
50
GALNS. La expresión de FGE en células 36F potenció la actividad específica aparente de GALNS (razón de actividad enzimática con respecto a enzima total estimada mediante ELISA) en 40-60 veces con respecto a los niveles control (Figura 6). El aumento en la actividad específica se mantuvo durante los tres momentos de tiempo en el estudio y pareció aumentar durante los tres días de acumulación tras la transfección.
55
I2S. Se observó un efecto similar con I2S, observándose un aumento de 6-7 veces en la actividad específica (3-5 U/mg) con respecto a los valores de control (0,5-0,7 U/mg).
Los valores del ELISA tanto para GALNS (Figura 7) como para I2S no resultaron significativamente afectados por la transfección de FGE. Esto indica que la expresión de FGE no altera las rutas de traducción y secreción que 60 participan en la producción de sulfatasa.
En resumen, todos estos resultados para ambas sulfatasas indican que la expresión de FGE aumenta espectacularmente la actividad específica de sulfatasa en líneas celulares que expresan en exceso GALNS e I2S.
65
Para probar el efecto de FGE (SUMF1) sobre actividades de sulfatasa adicionales en células normales, los presentes inventores expresaron en exceso ADNc de ARSA (SEC ID Nº: 14), ARSC (SEC ID Nº: 18) y ARSE (SEC ID Nº: 22) en diversas líneas celulares con y sin co-transfección del ADNc de FGE (SUMF1) y midieron las actividades de sulfatasa. La expresión en exceso de ADNc de sulfatasa en células Cos-7 produjo un aumento 5 moderado de la actividad de sulfatasa, mientras que se observó un sorprendente aumento sinérgico (20 a 50 veces) cuando se co-expresaron tanto un gen de sulfatasa como un gen de FGE (SUMF1). Se observó un efecto similar, aunque inferior, en tres líneas celulares adicionales, HepG2, LE293 y U20S. La expresión en exceso simultánea de múltiples ADNc de sulfatasa produjo un aumento inferior de cada actividad de sulfatasa específica en comparación con la expresión en exceso de una única sulfatasa, que indica la presencia de competición de las diferentes 10 sulfatasas por la maquinaria de modificación.
Para probar la conservación funcional del gen de FGE (SUMF1) durante la evolución, los presentes inventores expresaron en exceso ADNc de ARSA, ARSC y ARSE en diversas líneas celulares con y sin cotransfección del ADNc de MSD y midieron las actividades de sulfatasa. Tanto los genes de FGE (SUMF1) murinos como los de 15 Drosophila eran activos en las tres sulfatasas humanas, siendo la FGE (SUMF1) de Drosophila menos eficaz. Estos datos demuestran un alto grado de conservación funcional de FGE (SUMF1) durante la evolución, que implica una importancia biológica significativa para la función y supervivencia celulares. Se observó un efecto similar y constante, aunque mucho más débil, usando el gen de FGE2 (SUMF2), sugiriendo que la proteína codificada por este gen también tiene una actividad modificante de sulfatasa. Estos datos demuestran que la cantidad de la proteína FGE 20 (SUMF1) codificada es un factor limitante para las actividades de sulfatasa, un hallazgo con importantes implicaciones para la producción a gran escala de sulfatasas activas que van a utilizarse en la terapia de sustitución de enzimas.
Ejemplo 4: 25
Identificación del gen mutado en MSD por medio de complementación funcional usando transferencia de cromosomas mediada por microcélulas.
En un experimento separado usando transferencia de cromosomas mediada por microcélulas por medio de 30 complementación funcional, los presentes inventores confirmaron que el gen mutado en MSD es FGE. Los hallazgos de los inventores proporcionan un punto de vista adicional en un mecanismo biológico novedoso que afecta a una familia de proteínas entera en organismos relacionados de manera distante. Además de identificar la base molecular de una enfermedad genética poco frecuente, los datos de los presentes inventores confirman además un efecto de potenciación poderoso del producto génico de FGE sobre la actividad de sulfatasas. Este último hallazgo tiene 35 implicaciones clínicas directas para la terapia de al menos ocho enfermedades humanas producidas por deficiencias de sulfatasa.
El gen para MSD mapea en el cromosoma 3p26
40
Para identificar la localización cromosómica del gen mutado en MSD, los presentes inventores intentaron rescatar las enzimas deficientes en sulfatasa mediante complementación funcional a través de transferencia de cromosomas mediada por microcélulas. Se usó un panel de líneas celulares híbridas humanas/de ratón, que contenían cromosomas humanos normales individuales marcados con el marcador de selección dominante HyTK, como fuente de cromosomas humanos donadores y se fusionaron a una línea celular inmortalizada de un paciente con MSD. Se 45 transfirieron los 22 autosomas humanos uno por uno a la línea celular del paciente y se seleccionaron los híbridos en higromicina. Se recogieron aproximadamente 25 colonias supervivientes en cada uno de los 22 experimentos de transferencia. Se hicieron crecer éstas por separado y se recogieron para las pruebas enzimáticas posteriores. Se probaron las actividades de arilsulfatasa A (ARSA) (SEC ID Nº: 15), arilsulfatasa B (ARSB) (SEC ID Nº: 17) y arilsulfatasa C (ARSC) (SEC ID Nº: 19) para cada uno de los aproximadamente 440 clones (20 x 22). Este análisis 50 indicó claramente que las actividades de sulfatasa de varios clones que se derivaban de la transferencia del cromosoma 3 eran significativamente superiores en comparación con las de los otros clones. Se observó una variabilidad sorprendente cuando se analizaron las actividades de cada clon individual a partir de la transferencia del cromosoma. Para verificar si cada clon tenía un cromosoma 3 humano intacto procedente de la línea celular donante, los presentes inventores usaron un panel de 23 marcadores genéticos polimórficos del cromosoma 3, 55 distribuidos de manera uniforme a lo largo de la longitud del cromosoma y seleccionados previamente basándose en que tienen diferentes alelos entre las líneas celulares de donante y del paciente. Esto permitió examinar la presencia del cromosoma donante e identificar la posible pérdida de regiones específicas debido a la rotura cromosómica imprevista. Cada clon que tenía alta actividad enzimática retuvo el cromosoma 3 completo de la línea celular donante, mientras que los clones con bajas actividades parecían haber perdido el cromosoma completo basándose 60 en la ausencia de alelos del cromosoma 3 de la línea celular donante. Estos últimos clones probablemente retuvieron una región pequeña del cromosoma donante que contenía el gen marcador de selección que les permitía sobrevivir en medio que contenía higromicina. Estos datos indican que un cromosoma 3 humano normal era capaz de complementar el defecto observado en la línea celular del paciente con MSD.
65
Para determinar la región cromosómica específica que contenía el gen responsable de la actividad de
complementación, los presentes inventores usaron híbridos del cromosoma 3 marcados con Neo que se encontró que habían perdido varias porciones del cromosoma. Además, los presentes inventores realizaron transferencia de cromosomas mediada por microcélulas irradiadas de cromosomas 3 humanos marcados con HyTK. Se probaron ciento quince híbridos irradiados de cromosoma 3 para actividades de sulfatasa y se genotiparon usando un panel de 31 marcadores microsatélites polimórficos que abarcaban el cromosoma completo. Todos los clones que 5 presentaban altas actividades enzimáticas parecían haber retenido el cromosoma 3p26. Un análisis de resolución superior usando marcadores adicionales de esta región mapeó la posible localización para el gen de complementación entre los marcadores D3S3630 y D3S2397.
Identificación del gen mutado en MSD 10
Los presentes inventores investigaron los genes de la región genómica 3p26 para mutaciones en pacientes con MSD. Se amplificó por PCR cada exón incluyendo las uniones de corte y empalme y se analizó mediante secuenciación directa. Se realizó el análisis de mutación en doce individuos afectados no relacionados; cinco pacientes con MSD descritos previamente y siete casos no publicados. Se identificaron varias mutaciones de la 15 cohorte de MSD de los presentes inventores en el marcador de secuencia expresada (EST) AK075459 (SEC ID Nº: 4, 5), correspondientes a un gen de función desconocida, sugiriendo fuertemente que éste era el gen implicado en MSD. Se encontró que cada mutación estaba ausente en 100 individuos de control, excluyendo así la presencia de un polimorfismo de secuencia. Se realizó un análisis de mutación de confirmación adicional en ARN de pacientes sometidos a transcripción inversa, particularmente en aquellos casos en los que el análisis del ADN genómico reveló 20 la presencia de una mutación en o cerca de un sitio de corte y empalme, que afecta posiblemente el corte y empalme. También se identificaron mutaciones del marco de lectura, terminadora, de corte y empalme y de aminoácido, sugiriendo que la enfermedad se produce por un mecanismo de pérdida de función, como se prevé para un trastorno recesivo. Esto también concuerda con la observación de que casi todas las mutaciones de aminoácido afectan a aminoácidos que están altamente conservados a lo largo de la evolución (véase a continuación). 25
imagen8
Tabla 8: Mutaciones en MSD adicionales identificadas
Cambio aminoácido
Cambio nucleotido
fenotipo
Referencia
Caso
30
moderado
desplazamiento
Neonato severo
35
moderado
desplazamiento
Leve a moderado
40
No publicado
Neonato severo
desconocido
Leve a moderado
45
severo
No publicado
Neonato severo
No publicado
50
moderado
No publicado
Leve a moderado
No publicado
55
No publicado
moderado
60
Se identificaron mutaciones en cada paciente con MSD probado, excluyendo así la heterogeneidad de locus. No se observó correlación obvia entre los tipos de mutaciones identificados y la gravedad del fenotipo informado en los pacientes, sugiriendo que la variabilidad clínica no está producida por heterogeneidad alélica. En tres casos, se encontró que diferentes pacientes (caso 1 y 4, caso 6 y 9, y caso 11 y 12 en la Tabla 6) portaban la misma mutación. Dos de estos pacientes (caso 11 y 12) proceden de la misma ciudad en Sicilia, sugiriendo la presencia de un efecto 65 fundador que de hecho se confirmó mediante análisis de haplotipos. Sorprendentemente, se encontró que la
mayoría de los pacientes se componía de heterocigotos que portaban diferentes mutaciones alélicas, mientras que solo algunos eran homocigotos. Aunque de acuerdo con la ausencia de consanguineidad informada por los progenitores, este fue un hallazgo algo inesperado para un trastorno recesivo muy poco frecuente tal como MSD.
El gen y la proteína FGE
5
Se reunió la secuencia de ADNc consenso del ADNc de la FGE humana (también usada de manera intercambiable en el presente documento como SUMF1) (SEC ID Nº: 1) a partir de varios clones de marcador de secuencia expresada (EST) y parcialmente a partir de la secuencia genómica correspondiente. El gen contiene nueve exones y abarca aproximadamente 105 kb (véase el Ejemplo 1). La comparación de secuencias también identificó la presencia de un gen de FGE parálogo localizado en el cromosoma 7 humano que los presentes inventores 10 designaron FGE2 (también usado de manera intercambiable en el presente documento como SUMF2) (SEC ID Nº: 45, 46).
Complementación funcional de deficiencias de sulfatasa
15
Se infectaron fibroblastos de dos pacientes (caso 1 y 12 en la Tabla 8) con MSD en los que los presentes inventores identificaron mutaciones del gen de FGE (SUMF1) (líneas celulares BA426 y BA920) con virus VHS que contenían las formas no mutada y dos formas mutada del ADNc de FGE (SUMF1) (R327X y Δex3). Se probaron las actividades ARSA, ARSB y ARSC 72 h después de la infección. La expresión del ADNc de FGE no mutante (SUMF1) produjo la complementación funcional de las tres actividades, mientras que el ADNc de FGE (SUMF1) 20 mutante no (Tabla 9). Estos datos proporcionan una evidencia concluyente para la identidad de FGE (SUMF1) como el gen en MSD y demuestran la relevancia funcional de las mutaciones encontradas en los pacientes. Las mutaciones asociadas con la enfermedad producen deficiencia de sulfatasa, demostrando así que FGE (SUMF1) es un factor esencial para la actividad de sulfatasa.
25
Tabla 9: Complementación funcional de deficiencias de sulfatasa
Recipiente Línea celular MSD Contrucción
imagen9
30
35
Rango control
40
(1) Todas las actividades enzimáticas se expresan como nmoles de 4 metilumbeliferona liberada 'de proteínas mg -1' 3 hrs. MSD líneas celulares BA426 y BA920 se infectaron con el amplicón HSV solo, y con construcciones que llevan ya sea mutante o de tipo salvaje SUMF1 ADNc. El aumento de las actividades de arilsulfatasa individuales en los fibroblastos infectados con el gen SUMF1 de tipo salvaje, en comparación con los de las células infectadas con el vector solo, se indica entre paréntesis. Actividades medidos en los fibroblastos control no infectadas se indican.
45
Base molecular de MSD
Basándose en la hipótesis de que el gen de la enfermedad debe ser capaz de complementar la deficiencia 50 enzimática en una línea celular del paciente, los presentes inventores realizaron transferencia de cromosomas mediada por microcélulas a una línea celular inmortalizada de un paciente con MSD. Esta técnica se ha usado satisfactoriamente para la identificación de genes cuya función predicha podía evaluarse en líneas celulares (por ejemplo, midiendo la actividad enzimática o detectando características morfológicas). Para abordar el problema de la variabilidad estocástica de la actividad enzimática, los presentes inventores midieron las actividades de tres 55 sulfatasas diferentes (ARSA, ARSB y ARSC) en el ensayo de complementación. Los resultados de la transferencia de cromosomas indicaron claramente el mapeo del gen de complementación en el cromosoma 3. Se logró un mapeo subregional generando un panel de híbridos de radiación para el cromosoma 3. Se caracterizaron clones híbridos individuales tanto a nivel genómico, tipificando 31 marcadores microsatélites que presentaban diferentes alelos entre las líneas celulares donantes y receptoras, como a nivel funcional probando las actividades de sulfatasa. El análisis 60 de 130 de tales híbridos produjo el mapeo de la región de complementación en el cromosoma 3p26.
Una vez definida la región genómica crítica, también se identificó el gen de FGE (SUMF1) mediante análisis de mutación en ADN de los pacientes. Se encontraron mutaciones en todos los pacientes probados, que demuestra que un único gen está implicado en la MSD. Las mutaciones encontradas eran de diferentes tipos, produciendo la 65 mayoría (por ejemplo, sitio de corte y empalme, sitio de inicio, terminadora, de cambio de marco) posiblemente una
función perdida de la proteína codificada, como era de esperar para una enfermedad recesiva. La mayoría de las mutaciones de aminoácido afectan a codones correspondientes a aminoácidos que están altamente conservados durante la evolución, sugiriendo que estas mutaciones también producen una pérdida de función. No pudieron establecerse correlaciones entre el tipo de mutación y la gravedad del fenotipo, que indica que este último se debe a factores no relacionados. Inesperadamente para una enfermedad genética poco frecuente, se encontró que muchos 5 pacientes se componían de heterocigotos, que portaban dos mutaciones diferentes. Sin embargo, se identificó un efecto fundador para una mutación que se originó en una pequeña ciudad de Sicilia.
Función del gen de FGE (SUMF1)
10
Se demostró de manera definitiva la identidad del gen de FGE (SUMF1) como el “factor de complementación” rescatando la deficiencia enzimática de cuatro sulfatasas diferentes con la expresión del ADNc de FGE (SUMF1) exógeno, insertado en un vector viral, en dos líneas celulares de pacientes diferentes. En cada caso se observó una restauración constante, aunque parcial, de todas las actividades probadas, en comparación con las líneas celulares de pacientes de control transfectadas con vectores vacíos. En promedio, el aumento de las actividades enzimáticas 15 osciló entre 1,7 y 4,9 veces y alcanzó aproximadamente la mitad de los niveles observados en las líneas celulares normales. La actividad enzimática se correlaciona con el número de partículas virales usadas en cada experimento y con la eficacia de la infección como se prueba mediante un análisis con proteína marcadora (GFP). En los mismos experimentos, se usaron vectores que contenían ADNc de FGE (SUMF1) que portaban dos de las mutaciones encontradas en los pacientes, R327X y Δex3, y no se observó aumento significativo de la actividad enzimática, 20 demostrando así la relevancia funcional de estas mutaciones.
Como se menciona en otra parte en el presente documento, Schmidt et al. descubrieron en imprimación lugar que las sulfatasas experimentan una modificación postraduccional de una cisteína altamente conservada, que se encuentra en el sitio activo de la mayoría de las sulfatasas, a Cα-formilglicina. También demostraron que esta 25 modificación era defectuosa en MSD (Schmidt, B., et al., Cell, 1995, 82:271-278). Los datos funcionales y de mutación de los presentes inventores proporcionan una fuerte evidencia de que FGE (SUMF1) es responsable de esta modificación.
El gen de FGE (SUMF1) muestra un grado extremadamente alto de conservación de secuencia en todas las 30 especies relacionadas de manera distante analizadas, desde las bacterias hasta el hombre. Los presentes inventores proporcionan evidencia de que el homólogo de Drosophila del gen de FGE humana (SUMF1) es capaz de activar sulfatasas humanas expresadas en exceso, demostrando que el alto nivel de similitud de secuencia observado de los genes de FGE (SUMF1) de especies relacionadas de manera distante se correlaciona con una conservación funcional sorprendente. Una excepción notable son las levaduras, que parecen carecer del gen de 35 FGE (SUMF1), así como de cualquier gen que codifique sulfatasas, que indica que este organismo no requiere la función sulfatasa y sugiere la presencia de una influencia recíproca en la evolución de los genes de FGE (SUMF1) y sulfatasas.
De forma interesante, hay dos genes homólogos, FGE (SUMF1) y FGE2 (SUMF2), en los genomas de todos los 40 vertebrados analizados, incluyendo los seres humanos. Como es evidente a partir del árbol filogenético, el gen de FGE2 (SUMF2) parece haber evolucionado independientemente del gen de FGE (SUMF1). En los ensayos de los presentes inventores, el gen de FGE2 (SUMF2) también es capaz de activar sulfatasas, sin embargo lo hace de una manera mucho menos eficaz en comparación con el gen de FGE (SUMF1). Esto puede explicar la actividad de sulfatasa residual encontrada en pacientes con MSD y sugiere que una deficiencia de sulfatasa completa sería letal. 45 En este momento los presentes inventores no pueden descartar la posibilidad de que el gen de FGE2 (SUMF2) tenga una función adicional, todavía desconocida.
Impacto sobre la terapia de enfermedades debidas a deficiencias de sulfatasas
50
Se observó un fuerte aumento, de hasta 50 veces, de las actividades de sulfatasa en células que expresan en exceso ADNc de FGE (SUMF1) junto con o bien ADNc de ARSA, ARSC, o bien ARSE, en comparación con células que expresan en exceso sulfatasas individuales solas. En todas las líneas celulares se encontró un efecto sinérgico significativo, que indica que FGE (SUMF1) es un factor limitante para la actividad de sulfatasa. Sin embargo, se observó variabilidad entre diferentes sulfatasas, posiblemente debido a la diferente afinidad de la proteína codificada 55 por FGE (SUMF1) con las diversas sulfatasas. También se observó variabilidad entre diferentes líneas celulares que pueden tener diferentes niveles de enzima generadora de formilglicina endógena. De acuerdo con estos observaciones, los presentes inventores encontraron que la expresión del gen de MSD varía entre diferentes tejidos, con niveles significativamente altos en riñón e hígado. Esto puede tener implicaciones importantes, ya que los tejidos con bajos niveles de expresión del gen de FGE (SUMF1) pueden ser menos capaces de modificar de manera eficaz 60 las proteínas sulfatasas administradas de manera exógena (véase más adelante). Estos datos juntos sugieren que la función del gen de FGE (SUMF1) ha evolucionado para lograr un sistema de regulación doble, controlándose cada sulfatasa tanto mediante un mecanismo individual, responsable de los niveles de ARNm de cada gen de sulfatasa estructural, como mediante un mecanismo común compartido por todas las sulfatasas. Además, FGE2 (SUMF2) proporciona redundancia parcial para la modificación de sulfatasas. 65
Estos datos tiene profundas implicaciones para la producción en masa de sulfatasas activas que van a utilizarse en la terapia de sustitución de enzimas. Se han informado estudios de sustitución de enzimas en modelos animales de deficiencias de sulfatasas, tales como un modelo fenilo de mucopolisacaridosis VI, y se ha demostrado que son eficaces para prevenir y curar diversos síntomas. En la actualidad se están realizando ensayos terapéuticos en seres humanos para dos trastornos congénitos debidos a deficiencias de sulfatasas, MPSII (síndrome de Hunter) y MPSVI 5 (síndrome de Maroteaux-Lamy) y pronto se ampliará a un número mayor de pacientes.
Ejemplo 5:
Terapia de sustitución de enzimas con GALNS activada por FGE para MPS IVA de la enfermedad de Morquio La 10 causa principal de la patología esquelética en pacientes con Morquio es la acumulación de queratán sulfato (KS) en condrocitos del disco epifisiario (placa de crecimiento) debido a la deficiencia de la sulfatasa lisosómica, GALNS. El objetivo primario de estudios de investigación in vivo fue determinar si GALNS activada por FGE administrada por vía intravenosa (i.v.) era capaz de penetrar en los condrocitos de la placa de crecimiento, así como en otros tipos celulares apropiados en ratones normales. Pese a la falta general de anomalías esqueléticas, también se usó un 15 modelo de ratón deficiente en GALNS (Morquio Knock-ln-MKI, S. Tomatsu, Universidad de St. Louis, MO) para demostrar la actividad bioquímica in vivo de GALNS activada por FGE administrada repetidamente. La falta de patología esquelética en los modelos de ratón refleja el hecho de que el KS esquelético o bien está enormemente reducido o bien está ausente en roedores (Venn G, & Mason RM., Biochem J., 1985, 228:443-450). Sin embargo, estos ratones sí demostraron acumulación detectable de GAG y otras anomalías celulares en diversos órganos y 20 tejidos. Por tanto, el objetivo global de los estudios fue demostrar que GALNS activada por FGE penetra en la placa de crecimiento (estudio de biodistribución) y muestran la actividad enzimática de GALNS funcional dirigida hacia la eliminación de GAG acumulados en los tejidos afectados (estudio farmacodinámico).
Los resultados de estos estudios demostraron que GALNS activada por FGE inyectada por vía i.v. se internalizó por 25 los condrocitos de la placa de crecimiento, aunque a niveles relativamente bajos en comparación con otros tejidos. Además, la inyección de GALNS activada por FGE durante el transcurso de 16 semanas en ratones MKI produjo el aclaramiento eficaz de los GAG acumulados y redujo la tinción con biomarcador lisosómico en todos los tejidos blandos examinados. En resumen, los experimentos demostraron satisfactoriamente la administración de GALNS a los condrocitos de la placa de crecimiento y demostraron la actividad bioquímica en lo que se refiere al aclaramiento 30 de GAG en múltiples tejidos.
Estudio de biodistribución
Se administró a ratones ICR (normales) de cuatro semanas de edad una única inyección i.v. de 5 mg/kg de GALNS 35 activada por FGE. Se recogieron el hígado, fémur (hueso), corazón, riñón y bazo dos horas tras la inyección y se prepararon para el examen histológico. Se usó un anticuerpo monoclonal anti-GALNS humano para detectar la presencia de GALNS inyectada en los diversos tejidos. Se detectó GALNS en todos los tejidos examinados en comparación con los controles con vehículo. Además, GALNS se observó fácilmente en todos los tejidos examinados usando un sistema indicador con peroxidasa de rábano, con la excepción del hueso. La demostración 40 de la captación de GALNS en la placa de crecimiento requirió el uso de un sistema indicador de isotiocianato de fluoresceína (FTTC) más sensible e indica que aunque GALNS penetra en la placa de crecimiento, está menos fácilmente disponible para los condrocitos de la placa de crecimiento que para las células de los tejidos blandos. Pese al requisito de un método de detección de fluorescencia más sensible, se observó la administración de GALNS a los condrocitos de la placa de crecimiento ósea en todas las secciones de placa de crecimiento examinadas en 45 comparación con los controles con vehículo.
Estudio farmacodinámico en ratones MKI
Se administraron a ratones MKI o no mutantes de cuatro semanas de edad inyecciones i.v. administradas 50 semanalmente (n = 8 por grupo) hasta las 20 semanas de edad. Cada inyección semanal consistió en o bien 2 mg/kg de GALNS activada por FGE o bien control de vehículo (sin inyección para los ratones no mutantes). Se sacrificaron todos los ratones para el examen histológico a las 20 semanas de edad y se tiñeron usando los siguientes métodos: hematoxilina y eosina para morfología celular, azul alciano para la detección de GAG.
55
Se demostró el aclaramiento de los GAG acumulados mediante tinción con azul alciano reducida o ausente en todos los tejidos blandos examinados (hígado, corazón, riñón y bazo). Esto se observó solo en los ratones inyectados con GALNS. Aunque la placa de crecimiento en los ratones MKI funcionaba normalmente como se demuestra por una morfología esquelética normal, hubo más anomalías celulares sutiles observadas (incluyendo vacuolización de condrocitos sin efecto patológico aparente). Los condrocitos vacuolizados de las zonas hipertróficas y proliferativas 60 de la placa de crecimiento no resultaron afectados por la administración de GALNS. Esto contrastó con los condrocitos en la zona de calcificación de la placa de crecimiento en los que se observó una reducción de la vacuolización en los ratones inyectados con GALNS. La vacuolización de los condrocitos y la acumulación de GAG supuestamente distintos de KS en la placa de crecimiento en los ratones MKI fueron, en general, sorprendentes e inesperadas debido a la falta conocida de KS en la placa de crecimiento de ratones. Estas observaciones 65 particulares reflejan probablemente el hecho de que, en ratones inactivados, están presentes altos niveles de
GALNS mutante (a diferencia de los ratones silenciados en los que no hay GALNS mutante residual, ni vacuolización de condrocitos de la placa de crecimiento ni acumulación de GAG - Tomatsu S. et al., Human Molecular Genetics, 2003, 12:3349-3358). El fenómeno de vacuolización en la placa de crecimiento puede ser indicativo de un efecto secundario de un subconjunto de células que expresan GALNS mutante. No obstante, la inyección de enzima durante el transcurso de 16 semanas demostró una fuerte evidencia de la administración de GALNS activada por 5 FGE a múltiples tejidos y de la actividad enzimática in vivo.
Descripción detallada de los dibujos
Fig. 1: Espectros de masas MALDI-TOF de P23 después de la incubación en ausencia (A) o presencia 10 (B) de un extracto soluble de microsomas de testículos bovinos. Se incubaron 6 pmoles de P23 en condiciones normales durante 10 min a 37 ºC en ausencia o presencia de 1 µl de extracto microsómico. Se prepararon las muestras para espectrometría de masas MALDI-TOF como se describe en Procedimientos experimentales. Se indican las masas monoisotrópicas MH+ de P23 (2526,28) y su derivado de FGIy (2508,29).
Fig. 2: Árbol filogenético derivado de un alineamiento de FGE humana y 21 proteínas de la semilla 15 DUF323 en PFAM. Los números en las ramas indican distancia filogenética. Las proteínas se designan mediante su número ID de TrEMBL y el nombre de la especie. hFGE - FGE humana. Parte superior derecha: escala de las distancias filogenéticas. Un asterisco indica que el gen se ha investigado adicionalmente. Los siete genes superiores forman parte de la familia de genes de FGE.
Fig. 3: Organización del locus del gen de FGE humana y murina. Los exones se muestran a escala como 20 recuadros oscuros (locus humano) y recuadros claros (locus murino). La barra en la esquina inferior derecha muestra la escala. Las líneas entre los exones muestran los intrones (que no están a escala). Los números encima de las líneas de intrón indican el tamaño de los intrones en kilobases.
Fig. 4: Diagrama que muestra un mapa de plásmido pXMG.1.3 de expresión de FGE
Fig. 5: Gráfico de barras que representa la actividad N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa en células 36F 25 transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE. Se transfectaron las células con bien un plásmido control, pXMG.1.2, con el ADNc de FGE en la orientación inversa, o bien un plásmido de expresión de FGE, pXMG.1.3 en medios sin metrotrexato (MTX). Se volvió a alimentar a las células 24 horas más tarde con medios que contenían MTX 1,0 µM. Se recogió el medio y se recogieron las células 24, 48 y 72 horas después de volver a alimentar. Se determinó la actividad N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa mediante el 30 ensayo de actividad. Cada valor mostrado es el promedio de dos transfecciones separadas indicándose las desviaciones estándar mediante barras de error.
Fig. 6: Gráfico de barras que representa la actividad específica N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa en células 36F transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE. Se transfectaron las células con o bien un plásmido de control, pXMG.1.2, con el ADNc de FGE en la orientación inversa, o bien un 35 plásmido de expresión de FGE, pXMG.1.3 en medios sin metrotrexato (MTX). Se volvió a alimentar a las células 24 horas más tarde con medios que contenían MTX 1,0 µM. Se recogió el medio y se recogieron las células 24, 48 y 72 horas después de volver a alimentar. Se determinó la actividad específica N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa mediante el ensayo de actividad y ELISA y se representa como la razón de actividad N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa por mg de N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa reactiva en ELISA. 40 Cada valor mostrado es el promedio de dos transfecciones separadas.
Fig. 7: Gráfico de barras que representa producción de N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa en células 36F transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE. Se transfectaron las células con o bien un plásmido control, pXMG.1.2, con el ADNc de FGE en la orientación inversa, o bien un plásmido de expresión de FGE, pXMG.1.3 en medios sin metrotrexato (MTX). Se volvió a alimentar a las células 24 horas 45 más tarde con medios que contenían MTX 1,0 µM. Se recogió el medio y se recogieron las células 24, 48 y 72 horas después de volver a alimentar. Se determinó la proteína total N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa mediante ELISA. Cada valor mostrado es el promedio de dos transfecciones separadas indicándose las desviaciones estándar mediante barras de error.
Fig. 8: Gráfico que representa actividad iduronato 2-sulfatasa en células 3006 transfectadas de manera 50 transitoria con plásmido de expresión de FGE. Se transfectaron las células con o bien un plásmido control, pXMG.1.2, con el ADNc de FGE en la orientación inversa, o bien un plásmido de expresión de FGE, pXMG.1.3 en medios sin metrotrexato (MTX). Se volvió a alimentar a las células 24 horas más tarde con medios que contenían MTX 1,0 µM. Se recogió el medio y se recogieron las células 24, 48 y 72 horas tras volver a alimentar. Se determinó la actividad iduronato 2-actividad mediante el ensayo de actividad. Cada valor 55 mostrado es el promedio de dos transfecciones separadas.
Fig. 9: Representa un kit que incluye características de la presente invención.
Todas las referencias dadas a conocer en el presente documento se incorporan como referencia en su totalidad. Lo que se reivindica se presenta a continuación y va seguido por una lista de secuencias. 60
65

Claims (15)

  1. 1. Un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa, o el uso de un polipéptido para preparar un medicamento para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa; en el que dicho polipéptido tiene actividad de generación de Cα-formilglicina (actividad de FGE) y: 5
    a) tiene una secuencia seleccionada de SEC ID Nº 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, o aminoácidos 34-374 de SEC ID Nº. 2; o
    b) tiene al menos el 50 % de identidad de secuencia con SEC ID Nº 2; o
    c) tiene una o más mutaciones de aminoácido conservativas con respecto a un polipéptido como se describe 10 en a) anteriormente o con respecto a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, o aminoácidos 34-374 de SEC ID Nº. 2; o
    d) es un fragmento de un polipéptido como se describe en cualquiera de a) a c) anteriormente; o
    e) es una proteína de fusión de cualquiera de a) a d) anteriormente.
    15
  2. 2. Un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según la reivindicación 1, o el uso del polipéptido para preparar un medicamento para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según la reivindicación 1; en el que el grado de identidad de secuencia en la parte b) de la reivindicación 1 es de al menos el 75 %.
    20
  3. 3. Un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según la reivindicación 1, o el uso del polipéptido para preparar un medicamento para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según la reivindicación 1; en el que el grado de identidad de secuencia en la parte b) de la reivindicación 1 es de al menos el 95 %.
    25
  4. 4. Un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o el uso del polipéptido para preparar un medicamento para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; en el que el polipéptido tiene actividad de generación de Cα-formilglicina y tiene un subdominio 3 que comprende al menos uno de los siguientes:
    30
    (i) un motivo GFR
    (ii) un motivo RVXXGG(A)S
    (iii) un heptámero que contiene tres argininas
    (iv) tres residuos de cisteína.
    35
  5. 5. Un ácido nucleico o vector que codifica un polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa, o el uso de un ácido nucleico o vector que codifica el polipéptido para preparar un medicamento para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa.
  6. 6. Un vector que codifica un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según la 40 reivindicación 5, o el uso de un vector que codifica el polipéptido para preparar un medicamento para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según la reivindicación 5; en el que dicho vector es un vector viral.
  7. 7. Un vector viral que codifica un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según la reivindicación 6, o el uso de un vector viral que codifica el polipéptido para preparar un medicamento para su uso en 45 el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa; en el que el vector viral es un adenovirus, un virus adeno-asociado o un retrovirus.
  8. 8. Un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el uso de un polipéptido para preparar un medicamento para su uso en el tratamiento de 50 una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o un ácido nucleico o vector que codifica un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o el uso de un ácido nucleico o vector que codifica dicho polipéptido para preparar un medicamento que es para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7; en el que el tratamiento es el tratamiento de un ser humano. 55
  9. 9. Un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 8, o el uso de un polipéptido para preparar un medicamento para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 8, o un ácido nucleico o vector que codifica un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las 60 reivindicaciones 5 a 8, o el uso de un ácido nucleico o vector que codifica dicho polipéptido para preparar un medicamento que es para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8;
    en el que dicho deficiencia de sulfatasa está seleccionada del grupo que consiste en: deficiencia múltiple de sulfatasas, mucopolisacaridosis II (MPS II; síndrome de Hunter), mucopolisacaridosis IIIA (MPS IIIA; síndrome de 65 Sanfilippo A), mucopolisacaridosis VIII (MPS VIII), mucopolisacaridosis IVA (MPS IVA; síndrome de Morquio A),
    mucopolisacaridosis VI (MPS VI; síndrome de Maroteaux-Lamy), leucodistrofia metacromática (MLD), condrodisplasia punctata 1 recesiva ligada al cromosoma X o ictiosis ligada al cromosoma X (deficiencia de sulfatasa esteroidea).
  10. 10. Un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 4, 8 o 9, o el uso de un polipéptido para preparar un medicamento para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 8 o 9, o un ácido nucleico o vector que codifica un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, o el uso de un ácido nucleico o vector que codifica dicho polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9; en el que el polipéptido es 10 una FGE eucariota, de mamífero o humana.
  11. 11. Un agente que se une selectivamente a un polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en un método de diagnóstico o pronóstico de una deficiencia de sulfatasa que se realiza en el cuerpo humano o animal; en el que el agente es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un receptor de la 15 superficie celular.
  12. 12. El agente como se describe en la reivindicación 11 para el uso descrito en ella, en el que la deficiencia de sulfatasa está seleccionada del grupo que consiste en: deficiencia múltiple de sulfatasas, mucopolisacaridosis II (MPS II; síndrome de Hunter), mucopolisacaridosis IIIA (MPS IIIA; síndrome de Sanfilippo A), mucopolisacaridosis 20 VIII (MPS VIII), mucopolisacaridosis IVA (MPS IVA; síndrome de Morquio A), mucopolisacaridosis VI (MPS VI; síndrome de Maroteaux-Lamy), leucodistrofia metacromática (MLD), condrodisplasia punctata 1 recesiva ligada al cromosoma X o ictiosis ligada al cromosoma X (deficiencia de sulfatasa esteroidea); y en el que el agente es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o un receptor de la superficie celular.
    25
  13. 13. Un método de diagnóstico o pronóstico de una deficiencia de sulfatasa que comprende poner en contacto una muestra biológica obtenida de un sujeto con un agente que se une selectivamente a un polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; en el que el agente es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un receptor de la superficie celular.
    30
  14. 14. Un método de diagnóstico o pronóstico según la reivindicación 13; en el que la deficiencia de sulfatasa está seleccionada del grupo que consiste en: deficiencia múltiple de sulfatasas, mucopolisacaridosis II (MPS II; síndrome de Hunter), mucopolisacaridosis IIIA (MPS IIIA; síndrome de Sanfilippo A), mucopolisacaridosis VIII (MPS VIII), mucopolisacaridosis IVA (MPS IVA; síndrome de Morquio A), mucopolisacaridosis VI (MPS VI; síndrome de Maroteaux-Lamy), leucodistrofia metacromática (MLD), condrodisplasia punctata 1 recesiva ligada al cromosoma X o 35 ictiosis ligada al cromosoma X (deficiencia de sulfatasa esteroidea).
  15. 15. Un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 8 o 9, o el uso de un polipéptido para preparar un medicamento para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 8 o 9, o un ácido nucleico o vector 40 que codifica un polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, o el uso de un ácido nucleico o vector que codifica dicho polipéptido para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9; en el que dicho polipéptido, ácido nucleico, vector o agente se proporciona en una composición farmacéutica junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 45
    50
    55
    60
    65
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