ES2380147T3 - Diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas y otras usando una enzima generadora de formilglicina(FGE) - Google Patents

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Abstract

Método para determinar el nivel de expresión de enzima generadora de Cα-formilglicina (FGE) en un sujeto, comprendiendo el método medir in vitro en una muestra obtenida de un sujeto la actividad de generación de C- formilglicina de un péptido o polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: aminoácidos 34-374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78.

Description

Diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas y otras usando una enzima generadora de formilglicina (FGE)
Esta invención se refiere, entre otras cosas, a métodos y composiciones para el diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas (MSD) así como a otras deficiencias de sulfatasa. Más específicamente, la invención usa moléculas que modulan modificaciones postraduccionales en sulfatasas. Tales modificaciones son esenciales para una función sulfatasa apropiada.
Las sulfatasas son miembros de una familia de genes altamente conservada, que comparten una amplia homología de secuencia (Franco, B., et al., Cell, 1995, 81:15-25; Parenti, G., et al., Curr. Opin. Gen. Dev., 1997, 7:386-391), un alto grado de similitud estructural (Bond, C.S., et al., Structure, 1997, 5:277-289; Lukatela, G., et al., Biochemistry, 1998, 37:3654-64), y una modificación postraduccional única que es esencial para la escisión del éster de sulfato (Schmidt, B., et al., Cell, 1995, 82: 271-278; Selmer, T., et al., Eur. J. Biochem., 1996, 238:341-345). La modificación postraduccional implica la oxidación de un residuo conservado de cisteína (en eucariotas) o serina (en determinadas procariotas), en Cp, proporcionando L-Ca-formilglicina (también conocida como FGly; ácido 2-amino-3oxopropanoico) en el que un grupo aldehído sustituye al grupo tiometilo de la cadena lateral. El aldehído es una parte esencial del sitio catalítico de la sulfatasa y probablemente actúa como hidrato de aldehído. Uno de los grupos hidroxilo geminales acepta el sulfato durante la escisión del éster de sulfato conduciendo a la formación de un producto intermedio de enzima covalentemente sulfatada. El otro hidroxilo se requiere para la eliminación posterior del sulfato y regeneración del grupo aldehído. Esta modificación se produce en el retículo endoplasmático durante, o poco después de, la importación del polipéptido de sulfatasa naciente y se dirige por una secuencia lineal corta que rodea al residuo de cisteína (o serina) que va a modificarse. Esta secuencia altamente conservada es el hexapéptido L/V-C(S)-X-P-S-R (SEQ ID NO: 32), presente en la región N-terminal de todas las sulfatasas eucariotas y lo más frecuentemente lleva un grupo hidroxilo o tiol en el residuo X (Dierks, T., et al., Proc. NatL Acad Sci. U. S. A., 1997, 94:11963-11968).
Hasta la fecha se han identificado trece genes de sulfatasa en seres humanos. Codifican para enzimas con diferente especificidad de sustrato y ubicación subcelular tales como lisosomas, aparato de golgi y RE. Cuatro de esos genes, ARSC, ARSD, ARSE y ARSF, que codifican para arilsulfatasa C, D, E y F, respectivamente, se encuentran ubicados dentro de la misma región cromosómica (Xp22.3). Comparten una similitud de secuencia significativa y una organización genómica casi idéntica, lo que indica que surgen de eventos de duplicación que se produjeron recientemente durante la evolución (Franco B, et al., Cell, 1995, 81:15-25; Meroni G, et al., Hum Mol Genet, 1996, 5:423-31).
La importancia de las sulfatasas en el metabolismo de seres humanos se ve destacada por la identificación de al menos ocho enfermedades monogénicas humanas provocadas por la deficiencia de actividades sulfatasa individuales. La mayoría de estos estados son trastornos de almacenamiento lisosomal en los que las consecuencias fenotípicas se derivan del tipo y la distribución tisular del material almacenado. Entre ellos hay cinco tipos diferentes de mucopolisacaridosis (tipos II, IIIA, IIID, IVA y VI de MPS) debido a deficiencias de sulfatasas que actúan sobre el catabolismo de glicosaminoglicanos (Neufeld y Muenzer, 2001, The mucopolysaccharidoses, en The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, D. Valle, B. Childs, K.W. Kinzler y B. Vogelstein, eds. Nueva York: Mc Graw-Hill, págs. 3421-3452), y leucodistrofia metacromática (MLD), que se caracteriza por el almacenamiento de sulfolípidos en los sistemas nerviosos central y periférico conduciendo a deterioro neurológico grave y progresivo. Dos enfermedades humanas adicionales están provocadas por deficiencias de sulfatasas no lisosomales. Incluyen ictiosis ligada al cromosoma X, un trastorno cutáneo debido a deficiencia de sulfatasa esteroidea (STS/ARSC), y condrodisplasia punctata, un trastorno que afecta a los huesos y cartílagos debido a deficiencia de arilsulfatasa E (ARSE). Las sulfatasas también están implicadas en síndromes de malformación humanos inducidos por fármacos, tales como embriopatía por warfarina, provocada por la inhibición de la actividad ARSE debido a la exposición in utero a warfarina durante el embarazo.
En un trastorno monogénico humano intrigante, la deficiencia múltiple de sulfatasas (MSD), todas las actividades sulfatasa son defectuosas simultáneamente. Por consiguiente, el fenotipo de esta enfermedad multisistémica grave combina las características observadas en deficiencias de sulfatasas individuales. Las células de pacientes con MSD son deficientes en cuanto a actividades sulfatasa incluso tras la transfección con ADNc que codifican para sulfatasas humanas, lo que sugiere la presencia de un mecanismo común requerido para la actividad de todas las sulfatasas (Rommerskirch y von Figura, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, 89:2561-2565). Se encontró que la modificación postraduccional de sulfatasas era defectuosa en un paciente con MSD, lo que sugiere que este trastorno está provocado por una mutación en un gen, o genes, implicado en la maquinaria de conversión de cisteína en formilglicina (Schmidt, B., et al., Cell, 1995, 82:271-278). A pesar del intenso interés biológico y médico, los esfuerzos dirigidos a la identificación de este/estos gen(es) se han visto dificultados por la poca frecuencia de pacientes con MSD y la consiguiente falta de casos familiares adecuados para realizar un mapeo genético.
Esta invención proporciona métodos y composiciones para el diagnóstico y el tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas (MIM 272200), y el tratamiento de otras deficiencias de sulfatasa. Más específicamente, se ha identificado un gen que codifica para la enzima generadora de formilglicina (FGE), una enzima responsable de la modificación postraduccional única que se produce en sulfatasas que es esencial para la función sulfatasa (formación de L-Ca formilglicina; también conocida como FGly y/o ácido 2-amino-3-oxopropanoico). Se ha descubierto, inesperadamente, que mutaciones en el gen de FGE conducen al desarrollo de deficiencia múltiple de sulfatasas (MSD) en sujetos. También se ha descubierto, inesperadamente, que la FGE potencia la actividad de sulfatasas, incluyendo, pero sin limitarse a, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, Nacetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3. HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6. A la vista de estos descubrimientos, las moléculas de la presente invención pueden usarse en el diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas así como otras deficiencias de sulfatasa.
La invención proporciona un método para determinar el nivel de expresión de enzima generadora de Ca-formilglicina (FGE) en un sujeto, comprendiendo el método medir in vitro en una muestra obtenida de un sujeto la actividad de generación de Ca-formilglicina de un péptido o polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en aminoácidos 34-374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2,5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78.
Proporciona además un método para identificar un agente útil en la modulación de la actividad de generación de Ca formilglicina, que comprende:
(a)
poner en contacto una molécula que tiene actividad de generación de Ca-formilglicina con un agente candidato,
(b)
medir la actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula, y
(c)
comparar la actividad medida de generación de Ca-formilglicina de la molécula con un control para determinar si el agente candidato modula la actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula;
en el que la molécula es una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 1, o es un producto de expresión de la misma.
También proporciona un método para determinar una deficiencia de sulfatasa en un sujeto caracterizada por una expresión aberrante de una molécula de ácido nucleico o un producto de expresión de la misma, que comprende:
monitorizar una muestra de un paciente para detectar un parámetro seleccionado del grupo que consiste en
(i)
una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 1,
(ii)
un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico,
(iii) un péptido derivado del polipéptido, y
(iv)
un anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido o péptido, como determinación de una deficiencia de sulfatasa en el sujeto. La muestra puede ser, por ejemplo, un líquido biológico o un tejido. La etapa de monitorizar puede incluir poner en contacto la muestra con un agente detectable seleccionado del grupo
que consiste en:
(a)
una molécula de ácido nucleico que se hibrida selectivamente en condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico de (i),
(b)
un anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido de (ii), o el péptido de (iii), y
(c)
un polipéptido o péptido que se une al anticuerpo de (iv).
El anticuerpo, el polipéptido, el péptido o el ácido nucleico pueden marcarse con un marcador radioactivo o una enzima.
El método puede incluir someter a ensayo la muestra para detectar el péptido
La invención proporciona además un kit, que comprende un envase que contiene un agente y un control; en el que el agente es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une selectivamente a un péptido o polipéptido tal como se describió anteriormente, o es un ácido nucleico que se une selectivamente a un ácido nucleico que codifica para dicho péptido o polipéptido; y en el que el control es para compararlo con un valor medido de unión de dicho agente a dicho péptido, polipéptido o ácido nucleico.
El control puede ser un valor predeterminado para compararlo con dicho valor medido.
Puede comprender un epítopo del péptido o polipéptido.
La invención también incluye el uso de una molécula de ácido nucleico, péptido o polipéptido que aumenta la actividad de generación de Ca-formilglicina en la preparación de un medicamento para tratar una deficiencia de sulfatasa en un sujeto; en el que:
(i)
la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:
(a)
el complemento de una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con una molécula que consiste en una secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 1;
(b)
una molécula de ácido nucleico que se diferencia de una molécula de ácido nucleico de (a) debido a la degeneración del código genético; y
(c)
un ácido nucleico que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 3, 4, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 y 80-87; y
(ii)
el péptido o el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en:
(a)
un péptido o un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico tal como se describió anteriormente; y
(b)
un péptido o un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: aminoácidos 34374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56; 58, 60, 62, 64, 66, 68,70, 72, 74, 76 y 78.
El medicamento descrito con respecto al uso mencionado anteriormente puede comprender además un agente seleccionado del grupo que consiste en: una molécula de ácido nucleico que codifica para iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5, o HSulf-6; un producto de expresión de la molécula de ácido nucleico; y un fragmento del producto de expresión de la molécula de ácido nucleico.
El agente que aumenta la actividad de generación de Ca-formilglicina puede producirse por una célula que expresa dicha molécula de ácido nucleico. La célula puede expresar una molécula de ácido nucleico de FGE exógena o endógena.
La invención incluye además una molécula de ácido nucleico, péptido o polipéptido que modula la actividad de generación de Ca-formilglicina; para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa en un sujeto; siendo la molécula de ácido nucleico, péptido o polipéptido tal como se describió anteriormente.
Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico, péptido, o polipéptido, junto con un portador farmacéuticamente aceptable también está dentro del alcance de la presente invención.
La invención también incluye un método para identificar un agente candidato útil en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa, que comprende:
determinar la expresión de un conjunto de moléculas de ácido nucleico in vitro en una célula o tejido en condiciones que, en ausencia de un agente candidato, permiten una primera cantidad de expresión del conjunto de moléculas de ácido nucleico; en el que el conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende al menos una molécula de ácido nucleico que es una molécula de ácido nucleico tal como se describió anteriormente;
poner en contacto la célula o tejido con el agente candidato in vitro, y
detectar una cantidad de prueba de expresión del conjunto de moléculas de ácido nucleico;
en el que un aumento en la cantidad de prueba de expresión en presencia del agente candidato con respecto a la primera cantidad de expresión indica que el agente candidato es útil en el tratamiento de la deficiencia de sulfatasa.
Incluye además una matriz de moléculas de ácido nucleico en fase sólida que consiste en un conjunto de moléculas de ácido nucleico, productos de expresión de las mismas, o fragmentos de los mismos, cuando se fija a un sustrato sólido; codificando cada molécula de ácido nucleico para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos 34-374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6.
La matriz de moléculas de ácido nucleico en fase sólida puede comprender al menos una molécula de ácido nucleico de control.
El conjunto de moléculas de ácido nucleico puede comprender al menos una o al menos dos moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: aminoácidos 34-374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6.
También se incluye dentro del alcance de la presente invención un alelo variante aislado de un gen de FGE humana que codifica para un polipéptido de FGE variante, comprendiendo el polipéptido:
una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una variación en la SEQ ID NO: 2, en el que la al menos una variación comprende: Met1Arg; Met1Val; Ser155Pro; Cys218Tyr; Ala279Val; Arg327Stop; Cys336Arg; Arg345Cys; Arg349Trp; Arg349Gln; Ser359Stop; o una combinación de las mismas.
La invención incluye un polipéptido de FGE humana variante aislado que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos una variación en la SEQ ID NO: 2, en el que la al menos una variación comprende: Met1Arg; Met1Val; Ser155Pro; Cys218Tyr; Ala279Val; Arg327Stop; Cys336Arg; Arg345Cys; Arg349Trp; Arg349Gln; Ser359Stop; o una combinación de las mismas.
Un anticuerpo que tiene tal polipéptido de FGE humana variante como inmunógeno también está dentro del alcance de la presente invención.
El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo marcado de manera detectable.
Si está marcado de manera detectable, el marcador detectable puede comprender, por ejemplo, un elemento radioactivo, un compuesto químico que fluoresce, o una enzima.
La invención incluye además un método de producción de una sulfatasa activada, comprendiendo el método:
(a)
poner en contacto la sulfatasa con una enzima generadora de Ca-formilglicina (FGE) in vitro; en el que la enzima generadora de Ca-formilglicina es un polipéptido o péptido tal como se describe en la reivindicación 1; o
(b)
proporcionar una célula que coexpresa una sulfatasa y una enzima generadora de Ca-formilglicina (FGE) de modo que se produce una sulfatasa activada dentro de la célula; en el que la célula comprende ARN o ADN heterólogo que da como resultado una expresión aumentada de la sulfatasa activada, con respecto a lo que se produciría en ausencia del ARN o ADN heterólogo; y en el que la enzima generadora de Ca-formilglicina es un polipéptido o péptido tal como se describió anteriormente.
La sulfatasa puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, Nacetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6.
La deficiencia de sulfatasa a la que se hace referencia con respecto a los métodos o usos descritos anteriormente puede seleccionarse del grupo que consiste en: deficiencia múltiple de sulfatasas, mucopolisacaridosis II, mucopolisacaridosis IIIA, mucopolisacaridosis IVA, mucopolisacaridosis VI, mucopolisacaridosis VIII, leucodistrofia metacromática, condrodisplasia punctata I recesiva ligada al cromosoma X y ictiosis ligada al cromosoma X.
Breve descripción de las secuencias
SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de FGE humana.
SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de FGE humana (SEQ ID NO: 1).
SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de FGE humana que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 2 (es decir, nucleótidos 20-1141 de SEQ ID NO: 1).
SEQ ID NO: 4 es la secuencia de nucleótidos con n.º de registro de GenBank AK075459.
SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de SEQ ID NO: 4, un producto de proteína sin nombre que tiene el n.º de registro de GenBank BAC11634.
SEQ ID NO: 6 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de iduronato 2-sulfatasa humana (n.º de registro de GenBank M58342).
SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de iduronato 2sulfatasa humana (SEQ ID NO: 6).
SEQ ID NO: 8 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de sulfamidasa humana (n.º de registro de GenBank U30894).
SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de sulfamidasa humana (SEQ ID NO: 8).
SEQ ID NO: 10 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa humana (n.º de registro de GenBank U06088).
SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de Nacetilgalactosamina 6-sulfatasa humana (SEQ ID NO: 10).
SEQ ID NO: 12 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de N-acetilglucosamina 6-sulfatasa humana (n.º de registro de GenBank Z12173).
SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de Nacetilglucosamina 6-sulfatasa humana (SEQ ID NO: 12).
SEQ ID NO: 14 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa A humana (n.º de registro de GenBank X52151).
SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de arilsulfatasa A humana (SEQ ID NO: 14).
SEQ ID NO: 16 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa B humana (n.º de registro de GenBank J05225).
SEQ ID NO: 17 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de arilsulfatasa B humana (SEQ ID NO: 16).
SEQ ID NO: 18 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa C humana (n.º de registro de GenBank J04964).
SEQ ID NO: 19 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de arilsulfatasa C humana (SEQ ID NO: 18).
SEQ ID NO: 20 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa D humana (n.º de registro de GenBank X83572).
SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de arilsulfatasa D humana (SEQ ID NO: 20).
SEQ ID NO: 22 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa E humana (n.º de registro de GenBank X83573).
SEQ ID NO: 23 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de arilsulfatasa E humana (SEQ ID NO: 22).
SEQ ID NO: 24 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa F humana (n.º de registro de GenBank X97868).
SEQ ID NO: 25 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de arilsulfatasa F humana (SEQ ID NO: 24).
SEQ ID NO: 26 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de arilsulfatasa G humana (n.º de registro de GenBank BC012375).
SEQ ID NO: 27 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de la arilsulfatasa G humana (SEQ ID NO: 26).
SEQ ID NO: 28 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HSulf-1 (n.º de registro de GenBank AY101175). SEQ ID NO: 29 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de HSulf-1 (SEQ ID NO: 28).
SEQ ID NO: 30 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HSulf-2 (n.º de registro de GenBank AY101176).
SEQ ID NO: 31 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de HSulf-2 (SEQ ID NO: 30). SEQ ID NO: 32 es el hexapéptido altamente conservado L/V-FGly-X-P-S-R presente en sulfatasas. SEQ ID NO: 33 es un sustrato de formación de FGly sintético; su secuencia primaria se deriva de arilsulfatasa A
humana. SEQ ID NO: 34 es el oligopéptido reorganizado al azar PVSLPTRSCAALLTGR. SEQ ID NO: 35 es el oligopéptido Ser69 PVSLSTPSRAALLTGR. SEQ ID NO: 36 es un cebador específico para FGE humana 1199nc. SEQ ID NO: 37 es un cebador directo específico para FGE humana 1c. SEQ ID NO: 38 es un cebador inverso específico para FGE humana 1182c. SEQ ID NO: 39 es un cebador específico para 5’-FGE humana que contiene un sitio de EcoRI. SEQ ID NO: 40 es un cebador específico para HA. SEQ ID NO: 41 es un cebador específico para c-myc. SEQ ID NO: 42 es un cebador específico para RGS-His6. SEQ ID NO: 43 es un oligopéptido tríptico SQNTPDSSASNLGFR de una preparación de FGE humana. SEQ ID NO: 44 es un oligopéptido tríptico MVPIPAGVFTMGTDDPQIK de una preparación de FGE humana. SEQ ID NO: 45 es la secuencia de nucleótidos del parálogo de FGE2 humana (GenBank GI: 24308053). SEQ ID NO: 46 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del parálogo de FGE2 humana
(SEQ ID NO: 45). SEQ ID NO: 47 es la secuencia de nucleótidos del parálogo de FGE de ratón (GenBank GI: 26344956). SEQ ID NO: 48 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del parálogo de FGE de ratón
(SEQ ID NO: 47). SEQ ID NO: 49 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de ratón (GenBank GI: 22122361). SEQ ID NO: 50 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de ratón
(SEQ ID NO: 49). SEQ ID NO: 51 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de mosca de la fruta (GenBank GI: 20130397). SEQ ID NO: 52 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de mosca
de la fruta (SEQ ID NO: 51). SEQ ID NO: 53 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de mosquito (GenBank GI: 21289310). SEQ ID NO: 54 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de
mosquito (SEQ ID NO: 53).
SEQ ID NO: 55 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de S. coelicolor estrechamente relacionado
(GenBank GI: 21225812). SEQ ID NO: 56 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de S. coelicolor (SEQ ID NO: 55).
SEQ ID NO: 57 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de C. efficiens estrechamente relacionado
(GenBank GI: 25028125). SEQ ID NO: 58 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de C. efficiens (SEQ ID NO: 57).
SEQ ID NO: 59 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de N. aromaticivorans (GenBank GI: 23108562).
SEQ ID NO: 60 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de N. aromaticivorans (SEQ ID NO: 59). SEQ ID NO: 61 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de M. loti (GenBank GI: 13474559). SEQ ID NO: 62 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de M. loti
(SEQ ID NO: 61). SEQ ID NO: 63 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de B. fungorum (GenBank GI: 22988809). SEQ ID NO: 64 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de B.
fungorum (SEQ ID NO: 63). SEQ ID NO: 65 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de S. meliloti (GenBank GI: 16264068). SEQ ID NO: 66 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de S.
meliloti (SEQ ID NO: 65). SEQ ID NO: 67 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de Microscilla sp. (GenBank GI: 14518334). SEQ ID NO: 68 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de
Microscilla sp. (SEQ ID NO: 67). SEQ ID NO: 69 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de P. putida KT2440 (GenBank GI: 26990068). SEQ ID NO: 70 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de P.
putida KT2440 (SEQ ID NO: 69). SEQ ID NO: 71 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de R. metallidurans (GenBank GI: 22975289). SEQ ID NO: 72 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de R.
metallidurans (SEQ ID NO: 71). SEQ ID NO: 73 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de P. marinus (GenBank GI: 23132010). SEQ ID NO: 74 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de P.
marinus (SEQ ID NO: 73).
SEQ ID NO: 75 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de C. crescentus CB15 (GenBank GI: 16125425). SEQ ID NO: 76 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de C.
crescentus CB 15 (SEQ ID NO: 75).
SEQ ID NO: 77 es la secuencia de nucleótidos del ortólogo de FGE de M. tuberculosis Ht37Rv (GenBank GI: 15607852). SEQ ID NO: 78 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción del ortólogo de FGE de M.
tuberculosis Ht37Rv (SEQ ID NO: 77). SEQ ID NO: 79 es el heptapéptido altamente conservado presente en el subdominio 3 de parálogos y ortólogos de FGE.
SEQ ID NO: 80 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene n.º de registro de
GenBank: CA379852. SEQ ID NO: 81 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene n.º de registro de GenBank: AI721440.
SEQ ID NO: 82 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene n.º de registro de
GenBank: BJ505402. SEQ ID NO: 83 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene n.º de registro de GenBank: BJ054666.
SEQ ID NO: 84 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene n.º de registro de
GenBank: AL892419. SEQ ID NO: 85 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene n.º de registro de GenBank: CA064079.
SEQ ID NO: 86 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene n.º de registro de
GenBank: BF189614. SEQ ID NO: 87 es la secuencia de nucleótidos del fragmento EST ortólogo de FGE que tiene n.º de registro de GenBank: AV609121.
SEQ ID NO: 88 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HSulf-3.
SEQ ID NO: 89 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de HSulf-3 (SEQ ID NO: 88). SEQ ID NO: 90 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HSulf-4. SEQ ID NO: 91 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de HSulf-4 (SEQ ID
NO: 90). SEQ ID NO: 92 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HSulf-5. SEQ ID NO: 93 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de HSulf-5 (SEQ ID
NO: 92). SEQ ID NO: 94 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HSulf-6. SEQ ID NO: 95 es la secuencia de aminoácidos predicha del producto de traducción de ADNc de HSulf-6 (SEQ ID
NO: 94).
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: un esquema de espectro de masas MALDI-TOF de P23 tras la incubación en ausencia (A) o presencia (B) de un extracto soluble de microsomas de testículos bovinos.
Figura 2: un árbol filogenético derivado de una alineación de FGE humana y 21 proteínas de la semilla DUF323 en PFAM.
Figura 3: organización del locus del gen de FGE humana y murina. Los exones se muestran a escala como cuadros y cuadros claros (locus murino). Los números encima de las líneas de intrón indican el tamaño de los intrones en kilobases.
Figura 4: diagrama que muestra un mapa de plásmido pXMG.1.3 de expresión de FGE.
Figura 5: gráfico de barras que representa actividad N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa en células 36F transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE.
Figura 6: gráfico de barras que representa actividad específica N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa en células 36F transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE.
Figura 7: gráfico de barras que representa producción de N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa en células 36F transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE.
Figura 8: gráfico que representa actividad iduronato 2-sulfatasa en células 30C6 transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE.
Figura 9: representa un kit que incluye características de la presente invención.
Los inventores han descubierto el gen que codifica para enzima generadora de formilglicina (FGE), una enzima responsable de la modificación postraduccional única que se produce en sulfatasas que es esencial para la función sulfatasa: la formación de L-Ca-formilglicina (también conocida como FGly y/o ácido 2-amino-3-oxopropanoico). Se ha descubierto, de manera inesperada, que mutaciones en el gen de FGE conducen al desarrollo de deficiencia múltiple de sulfatasas (MSD) en sujetos. También se ha descubierto, de manera inesperada, que la FGE potencia la actividad de sulfatasas, incluyendo, pero sin limitarse a, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6, y sulfatasas descritas en las solicitudes provisionales estadounidenses con números de publicación 20030073118, 20030147875, 20030148920, 20030162279 y 20030166283. A la vista de estos descubrimientos, las moléculas descritas en el presente documento pueden usarse en el diagnóstico y/o tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas, así como el tratamiento de otras deficiencias de sulfatasa.
Se proporcionan métodos para usar moléculas en el diagnóstico de deficiencia múltiple de sulfatasas.
Adicionalmente, también se proporcionan métodos para usar esas moléculas in vivo o in vitro con el fin de modular la formación de FGly en sulfatasas, métodos para tratar estados asociados con tal modificación, y composiciones útiles en la preparación de preparaciones terapéuticas para el tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas así como otras deficiencias de sulfatasa.
También se proporcionan polipéptidos que modulan la formación de FGly en sulfatasas, ácidos nucleicos aislados que codifican para esos polipéptidos, modificaciones y variantes funcionales de los anteriores, fragmentos útiles de los anteriores, así como productos terapéuticos y productos de diagnóstico, métodos de investigación, composiciones y herramientas referentes a los mismos.
“Actividad de generación de Ca-formilglicina” se refiere a la capacidad de una molécula para formar, o potenciar la formación de, FGly en un sustrato. El sustrato puede ser una sulfatasa tal como se describe en otra parte en el presente documento, o un oligopéptido sintético (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 33, y los ejemplos). El sustrato contiene preferiblemente el hexapéptido conservado de SEQ ID NO: 32 [L/V-C(S)-X-P-S-R]. Métodos para someter a ensayo la formación de FGly son tal como se describe en la técnica (véase, por ejemplo, Dierks, T., et al., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 1997, 94:11963-11968), y en otra parte en el presente documento (véase, por ejemplo, los ejemplos). Una “molécula”, tal como se usa en el presente documento, abarca tanto “ácidos nucleicos” como “polipéptidos”. Las moléculas de FGE pueden formar, o potenciar/aumentar la formación de, FGly tanto in vivo como in vitro.
La “potenciación (o “aumento”)” de la actividad de generación de Ca-formilglicina, tal como se usa en el presente documento, se refiere normalmente a una expresión aumentada de FGE y/o su polipéptido codificado. La expresión aumentada se refiere a aumentar (es decir, hasta un grado detectable) la replicación, transcripción y/o traducción de cualquiera de los ácidos nucleicos (ácidos nucleicos de FGE tal como se describe en otra parte en el presente documento), dado que la regulación por incremento de cualquiera de estos procesos da como resultado un aumento de la concentración/cantidad del polipéptido codificado por el gen (ácido nucleico). La potenciación (o aumento) de la actividad de generación de Ca-formilglicina también se refiere a prevenir o inhibir la degradación de FGE (por ejemplo, mediante aumento de la ubiquitinización), regulación por disminución, etc., dando como resultado, por ejemplo, una t1/2 (semivida) de molécula de FGE estable o aumentada en comparación con un control. La regulación por disminución o expresión reducida se refiere a la expresión reducida de un gen y/o su polipéptido codificado. La regulación por incremento o regulación por disminución de la expresión génica puede determinarse directamente detectando un aumento o disminución, respectivamente, en el nivel de ARNm para el gen (por ejemplo, FGE), o el nivel de expresión de proteína del polipéptido codificado por el gen, usando cualquier medio adecuado conocido en la técnica, tal como hibridación de ácido nucleico o métodos de detección con anticuerpos, respectivamente, y en comparación con controles. La regulación por incremento o regulación por disminución de la expresión del gen de FGE también puede determinarse indirectamente detectando un cambio en la actividad de generación de Ca formilglicina.
“Expresión”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a expresión de ácido nucleico y/o polipéptido, así como a actividad de la molécula de polipéptido (por ejemplo, actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula).
Un método implica la clonación de un ADNc que codifica para FGE. FGE es una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y codifica para un polipéptido con actividad de generación de Ca-formilglicina. La secuencia del ADNc de FGE humana se presenta como SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos predicha de este producto de proteína codificado por ADNc se presenta como SEQ ID NO: 2.
Tal como se usa en el presente documento, un sujeto es un mamífero o un mamífero no humano. En todas las realizaciones se prefieren FGE humana y sujetos humanos.
Se dan a conocer un polipéptido de FGE aislado, el ADNc que codifica para este polipéptido, modificaciones y variantes funcionales de los anteriores, fragmentos útiles de los anteriores, así como productos de diagnóstico y productos terapéuticos referentes a los mismos.
Tal como se usa en el presente documento con respecto a ácidos nucleicos, el término “aislado” significa: (i) amplificado in vitro mediante, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) producido de manera recombinante mediante clonación; (iii) purificado, tal como mediante escisión y separación en gel; o (iv) sintetizado mediante, por ejemplo, síntesis química. Un ácido nucleico aislado es uno que se manipula fácilmente mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica. Por tanto, una secuencia de nucleótidos contenida en un vector en el que se conocen sitios de restricción en 5’ y 3’ o para la que se han dado a conocer secuencias de cebadores para reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se considera aislada pero una secuencia de ácido nucleico que existe en su estado nativo en su huésped natural no. Un ácido nucleico aislado puede estar sustancialmente purificado, pero no necesita estarlo. Por ejemplo, un ácido nucleico que está aislado dentro de un vector de clonación o expresión no es puro porque puede comprender sólo un diminuto porcentaje del material en la célula en la que reside. Sin embargo, un ácido nucleico de este tipo está aislado tal como se usa el término en el presente documento porque se manipula fácilmente mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento con respecto a polipéptidos, el término “aislado” significa separado de su entorno nativo en una forma suficientemente pura de modo que puede manipularse o usarse para uno cualquiera de los propósitos descritos en el presente documento. Por tanto, aislado significa suficientemente puro para usarse (i) para preparar y/o aislar anticuerpos, (ii) como reactivo en un ensayo, (iii) para secuenciar, (iv) como producto terapéutico, etc.
Moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para un polipéptido de FGE que tiene actividad de generación de Ca-formilglicina incluyen: (a) moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con una molécula que consiste en un ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y que codifican para un polipéptido de FGE que tiene actividad de generación de Ca-formilglicina, (b) deleciones, adiciones y sustituciones de (a) que codifican para un polipéptido de FGE respectivo que tiene actividad de generación de Ca-formilglicina, (c) moléculas de ácido nucleico que se diferencian de las moléculas de ácido nucleico de (a) o (b) en secuencia de codón debido a la degeneración del código genético, y (d) complementos de (a), (b) o (c). “Complementos”, tal como se usa en el presente documento, incluye “cadenas complementarias de longitud completa o cadenas complementarias al 100% de (a), (b) o (c)”.
Se dan a conocer homólogos y alelos de los ácidos nucleicos de FGE que también tienen actividad de generación de Ca-formilglicina. Los homólogos, tal como se describen en el presente documento, incluyen las moléculas identificadas en otra parte en el presente documento (véanse por ejemplo, SEQ ID NO: 4, 5, 45-78, y 80-87) es decir ortólogos y parálogos. Pueden identificarse homólogos adicionales siguiendo las enseñanzas en el presente documento así como mediante técnicas convencionales. Dado que los homólogos de FGE descritos en el presente documento comparten todos actividad de generación de Ca-formilglicina, pueden usarse de manera intercambiable con la molécula de FGE humana en todos los aspectos descritos en el presente documento.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican para polipéptidos de FGE pueden hibridarse con el complemento de una molécula de ácido nucleico que consiste en la región codificante de SEQ ID NO: 1, en condiciones rigurosas. En una realización importante, la expresión “condiciones rigurosas”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a parámetros con los que está familiarizada la técnica. Con ácidos nucleicos, se dice que las condiciones de hibridación son rigurosas normalmente en condiciones de baja fuerza iónica y una temperatura justo por debajo de la temperatura de fusión (Tf) del complejo de híbrido de ADN (normalmente, aproximadamente 3ºC por debajo de la Tf del híbrido). Una rigurosidad superior proporciona una correlación más específica entre la secuencia sonda y la diana. Las condiciones rigurosas usadas en la hibridación de ácidos nucleicos se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse en referencias que compilan tales métodos, por ejemplo Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Un ejemplo de “condiciones rigurosas” es la hibridación a 65ºC en 6 x SSC. Otro ejemplo de condiciones rigurosas es la hibridación a 65ºC en tampón de hibridación que consiste en 3,5 x SSC, Ficoll al 0,02%, polivinilpirrolidona al 0,02%, albúmina sérica bovina al 0,02%, H2PO4 [pH 7] 2,5 mM, SDS al 0,5%, EDTA 2 mM. (SSC es cloruro de sodio 0,15 M/citrato de sodio 0,15 M, pH 7; SDS es dodecilsulfato de sodio; y EDTA es ácido etilendiaminatetracético). Tras la hibridación, se lava la membrana sobre la que se transfiere el ADN a 2 x SSC a temperatura ambiente y después a 0,1 x SSC/0,1 x SDS a temperaturas de hasta 68ºC. En un ejemplo adicional, una alternativa al uso de una disolución de hibridación acuosa es el uso de una disolución de hibridación en formamida. Por tanto, pueden lograrse condiciones de hibridación rigurosas usando, por ejemplo, una disolución de formamida al 50% y 42ºC. Hay otras condiciones, reactivos, etcétera, que pueden usarse, y darán como resultado un grado similar de rigurosidad. El experto en la técnica estará familiarizado con tales condiciones, y por tanto no se proporcionan en el presente documento. Sin embargo, se entenderá que el experto en la técnica podrá manipular las condiciones de una manera que permitan la clara identificación de homólogos y alelos de ácidos nucleicos de FGE descritos en el presente documento. El experto en la técnica también está familiarizado con la metodología para examinar células y bibliotecas para detectar la expresión de tales moléculas que entonces se aíslan de manera rutinaria, seguido por aislamiento de la molécula de ácido nucleico pertinente y secuenciación.
En general, los homólogos y alelos compartirán normalmente al menos el 40% de identidad de nucleótidos y/o al menos el 50% de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, en algunos casos compartirán al menos el 50% de identidad de nucleótidos y/o al menos el 65% de identidad de aminoácidos y en todavía otros casos compartirán al menos el 60% de identidad de nucleótidos y/o al menos el 75% de identidad de aminoácidos. En casos adicionales, los homólogos y alelos compartirán normalmente al menos el 90%, el 95%, o incluso el 99% de identidad de nucleótidos y/o al menos el 95%, el 98%, o incluso el 99% de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente. La homología puede calcularse usando diversas herramientas de software disponibles para el público desarrolladas por NCBI (Bethesda, Maryland). Herramientas a modo de ejemplo incluyen el algoritmo heurístico de Altschul SF, et al., (J Mol Biol, 1990, 215: 403-410), también conocido como BLAST. Pueden obtenerse alineaciones por emparejamiento y de ClustalW (configuración de matriz BLOSUM30) así como análisis hidropático de Kyte-Doolittle usando herramientas públicas (EMBL, Heidelberg, Alemania) y comerciales (por ejemplo, el software de análisis de secuencias MacVector de Oxford Molecular Group/enetics Computer Group, Madison, WI). También se abarcan los complementos de Watson-Crick de los ácidos nucleicos anteriores.
En la selección para detectar genes relacionados con FGE, tales como homólogos y alelos de FGE, puede realizarse una transferencia de tipo Southern usando las condiciones anteriores, junto con una sonda radioactiva. Tras lavar la membrana a la que se transfiere finalmente el ADN, puede colocarse la membrana contra una película de rayos X o una placa de sistema de detección y cuantificación de la radioactividad para detectar la señal radioactiva.
Dadas las enseñanzas en el presente documento de un clon de ADNc de FGE humana de longitud completa, pueden aislarse otras secuencias de mamífero tales como el clon de ADNc de ratón correspondiente al gen de FGE humana a partir de una biblioteca de ADNc, usando técnicas de hibridación de colonias convencionales.
�?cidos nucleicos degenerados incluyen codones alternativos a los presentes en los materiales nativos. Por ejemplo, se codifican residuos de serina por los codones TCA, AGT, TCC, TCG, TCT y AGC. Por tanto, resultará evidente para un experto en la técnica que puede emplearse cualquiera de los tripletes de nucleótidos que codifican para serina para dirigir el aparato de síntesis de proteínas, in vitro o in vivo, para incorporar un residuo de serina en un polipéptido de FGE que está alargándose. De manera similar, tripletes de secuencias de nucleótidos que codifican para otros residuos de aminoácido incluyen, pero no se limitan a: CCA, CCC, CCG y CCT (codones de prolina); CGA, CGC, CGG, CGT, AGA y AGG (codones de arginina); ACA, ACC, ACG y ACT (codones de treonina); AAC y AAT (codones de asparagina); y ATA, ATC y ATT (codones de isoleucina). Otros residuos de aminoácido pueden codificarse de manera similar por múltiples secuencias de nucleótidos. Por tanto, pueden usarse ácidos nucleicos degenerados que se diferencian de los ácidos nucleicos aislados biológicamente en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético.
Se proporcionan fragmentos únicos aislados de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o complementos de los mismos. Un fragmento único es uno que es una “firma” para el ácido nucleico más grande. Por ejemplo, el fragmento único es lo bastante largo para garantizar que su secuencia precisa no se encuentra en moléculas dentro del genoma humano fuera de los ácidos nucleicos de FGE definidos anteriormente (y alelos humanos). Los expertos en la técnica pueden aplicar procedimientos simplemente de rutina para determinar si un fragmento es único dentro del genoma humano. Sin embargo, los fragmentos únicos excluyen fragmentos compuestos completamente por las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, y/u otras secuencias previamente publicadas en la fecha de presentación de esta solicitud.
Un fragmento que está completamente compuesto por la secuencia descrita en los depósitos de GenBank anteriores es una que no incluye ninguno de los nucleótidos únicos para las secuencias descritas en el presente documento. Por tanto, un fragmento único debe contener una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia exacta de esos depósitos de GenBank o fragmentos de la misma. La diferencia puede ser una adición, deleción o sustitución con respecto a la secuencia de GenBank o puede ser una secuencia completamente separada de la secuencia de GenBank.
Pueden usarse fragmentos únicos como sondas en ensayos de transferencia de tipo Southern y Northern para identificar tales ácidos nucleicos, o pueden usarse en ensayos de amplificación tales como los que emplean PCR.
Tal como saben los expertos en la técnica, se prefieren sondas grandes tales como 200, 250, 300 o más nucleótidos para determinados usos tales como transferencias de tipo Southern y Northern, mientras que se preferirán fragmentos más pequeños para usos tales como PCR. También pueden usarse fragmentos únicos para producir proteínas de fusión para generar anticuerpos o determinar la unión de los fragmentos de polipéptido, tal como se demuestra en los ejemplos, o para generar componentes de inmunoensayo. Asimismo, pueden emplearse fragmentos únicos para producir fragmentos no fusionados de los polipéptidos de FGE, útiles, por ejemplo, en la preparación de anticuerpos, inmunoensayos o aplicaciones terapéuticas. Pueden usarse adicionalmente fragmentos únicos como moléculas antisentido para inhibir la expresión de ácidos nucleicos y polipéptidos de FGE respectivamente.
Tal como reconocerán los expertos en la técnica, el tamaño del fragmento único dependerá de su conservación en el código genético. Por tanto, algunas regiones de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 y complementos requerirán que segmentos más largos sean únicos mientras que otras sólo requerirán segmentos cortos, normalmente de entre 12 y 32 nucleótidos de longitud (por ejemplo de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 y 32 bases) o más, hasta la longitud completa de la secuencia dada a conocer. Tal como se mencionó anteriormente, esta descripción pretende abarcar todos y cada uno de los fragmentos de cada secuencia, comenzando en el primer nucleótido, el segundo nucleótido, etcétera, hasta 8 nucleótidos del final, y terminando en cualquier lugar desde el nucleótido número 8, 9, 10, etcétera, para cada secuencia, hasta el último nucleótido, (siempre que la secuencia sea única tal como se describió anteriormente). Prácticamente cualquier segmento de la región de SEQ ID NO: 1 comenzando en el nucleótido 1 y terminando en el nucleótido 1180, o SEQ ID NO: 3 comenzando en el nucleótido 1 y terminando en el nucleótido 1122, o complementos de los mismos, que tenga 20 o más nucleótidos de longitud será único. Los expertos en la técnica están versados en los métodos para seleccionar tales secuencias, normalmente basándose en la capacidad del fragmento único para distinguir selectivamente la secuencia de interés de otras secuencias en el genoma humano del fragmento. Normalmente, para aquéllas en bases de datos conocidas es todo lo que se necesita, aunque pueden realizarse hibridación confirmatoria in vitro y análisis de secuenciación.
Tal como se mencionó anteriormente, pueden usarse oligonucleótidos antisentido que se unen selectivamente a una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de FGE para disminuir la actividad FGE.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “oligonucleótido antisentido” o “antisentido” describe un oligonucleótido que es un oligorribonucleótido, oligodesoxirribonucleótido, oligorribonucleótido modificado, u oligodesoxirribonucleótido modificado que se hibrida en condiciones fisiológicas con ADN que comprende un gen particular o con un transcrito de ARNm de ese gene y, de ese modo, inhibe la transcripción de ese gen y/o la traducción de ese ARNm. Las moléculas antisentido están diseñadas para interferir con la transcripción o traducción de un gen diana tras la hibridación con ese gen diana o transcrito. Los expertos en la técnica reconocerán que la longitud exacta del oligonucleótido antisentido y su grado de complementariedad con su diana dependerán de la diana específica seleccionada, incluyendo la secuencia de la diana y las bases particulares que comprende esa secuencia. Se prefiere que el oligonucleótido antisentido se construya y disponga para unirse selectivamente con la diana en condiciones fisiológicas, es decir, para hibridarse sustancialmente más a la secuencia diana que a cualquier otra secuencia en la célula diana en condiciones fisiológicas. Basándose en SEQ ID NO: 1 o en secuencias genómicas y/o de ADNc alélicas u homólogas, un experto en la técnica puede elegir fácilmente y sintetizar cualquiera de varias moléculas antisentido apropiadas. Con el fin de ser suficientemente selectivos y potentes para la inhibición, tales oligonucleótidos antisentido deben comprender al menos 10 y, más preferiblemente, al menos 15 bases consecutivas que son complementarias a la diana, aunque en determinados casos se han usado satisfactoriamente oligonucleótidos modificados de tan sólo 7 bases de longitud como oligonucleótidos antisentido (Wagner et al., Nat. Med, 1995, 1(11):1116-1118; Nat. Biotech., 1996, 14:840-844). Lo más preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido comprenden una secuencia complementaria de 20-30 bases. Aunque pueden elegirse oligonucleótidos que son antisentido para cualquier región del gen o transcritos de ARNm, en realizaciones preferidas los oligonucleótidos antisentido corresponden a sitios N-terminales o en sentido 5’ tales como sitios de iniciación de la traducción, de iniciación de la transcripción o de promotor. Además, oligonucleótidos antisentido pueden dirigirse a regiones no traducidas en 3’. También se ha usado el direccionamiento a sitios de corte y empalme de ARNm en la técnica pero puede preferirse menos si se produce corte y empalme de ARNm alternativo. Además, el antisentido se dirige, preferiblemente, a sitios en los que no se espera una estructura secundaria de ARNm (véase, por ejemplo, Sainio et al., Cell Mol. Neurobiol. 14(5):439-457, 1994) y a la que no se espera que se unan proteínas. Finalmente, aunque SEQ ID NO: 1 da a conocer una secuencia de ADNc, un experto habitual en la técnica puede derivar fácilmente el ADN genómico correspondiente para esta secuencia. Por tanto, pueden proporcionarse oligonucleótidos antisentido que son complementarios al ADN genómico correspondiente a SEQ ID NO: 1. De manera similar, se permiten oligonucleótidos antisentido para los ADN genómicos y ADNc de FGE homólogos o alélicos sin excesiva experimentación.
En un conjunto de realizaciones, los oligonucleótidos antisentido pueden estar compuestos por desoxirribonucleótidos “naturales”, ribonucleótidos, o cualquier combinación de los mismos. Es decir, el extremo 5’ de un nucleótido nativo y el extremo 3’ de otro nucleótido nativo pueden estar unidos covalentemente, como en sistemas naturales, mediante un enlace internucleósido de fosfodiéster. Estos oligonucleótidos pueden prepararse mediante métodos reconocidos en la técnica que pueden llevarse a cabo de manera manual o mediante un sintetizador automatizado. También pueden producirse de manera recombinante mediante vectores.
Sin embargo, en realizaciones preferidas los oligonucleótidos antisentido también pueden incluir oligonucleótidos “modificados”. Es decir, los oligonucleótidos pueden modificarse de varias maneras que no impiden que se hibriden a su diana pero que potencian su estabilidad o direccionamiento o que de otro modo potencian su eficacia terapéutica.
La expresión “oligonucleótido modificado” tal como se usa en el presente documento describe un oligonucleótido en el que (1) al menos dos de sus nucleótidos están unidos covalentemente mediante un enlace internucleósido sintético (es decir, un enlace distinto de un enlace de fosfodiéster entre el extremo 5’ de un nucleótido y el extremo 3’ de otro nucleótido) y/o (2) se ha unido covalentemente al oligonucleótido un grupo químico que no está normalmente asociado con ácidos nucleicos. Enlaces internucleósido sintéticos preferidos son fosforotioatos, alquilfosfonatos, fosforoditioatos, ésteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, ésteres carboxilmetílicos y péptidos.
La expresión “oligonucleótido modificado” también abarca oligonucleótidos con una base y/o azúcar modificado covalentemente. Por ejemplo, oligonucleótidos modificados incluyen oligonucleótidos que tienen azúcares de estructura principal que están covalentemente unidos a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posición 3’ y distintos de un grupo fosfato en la posición 5’. Por tanto, oligonucleótidos modificados pueden incluir un grupo ribosa 2’-O-alquilado. Además, oligonucleótidos modificados pueden incluir azúcares tales como arabinosa en vez de ribosa. Por tanto, se contemplan preparaciones farmacéuticas que contienen moléculas antisentido modificadas que son complementarias a, y pueden hibridarse en condiciones fisiológicas con, ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de FGE, junto con portadores farmacéuticamente aceptables. Pueden administrarse oligonucleótidos antisentido como parte de una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica de este tipo puede incluir el oligonucleótidos antisentido en combinación con cualquier portador convencional fisiológica y/o farmacéuticamente aceptable que se conoce en la técnica. Las composiciones deben ser estériles y contener una cantidad terapéuticamente eficaz de los oligonucleótidos antisentido en una unidad de peso o volumen adecuada para su administración a un paciente. La expresión “farmacéuticamente aceptable” significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los principios activos. La expresión “fisiológicamente aceptable” se refiere a un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, cultivo celular, tejido u organismo. Las características del portador dependerán de la vía de administración. Portadores fisiológica y farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizadores, solubilizadores y otros materiales que se conocen bien en la técnica.
También se proporcionan métodos para aumentar la actividad de generación de Ca-formilglicina en una célula. En realizaciones importantes, esto se logra mediante el uso de vectores (“vectores de expresión” y/o “vectores de direccionamiento”).
“Vectores”, tal como se usa en el presente documento, puede ser cualquiera de varios ácidos nucleicos en los que puede insertarse una secuencia deseada mediante restricción y ligación para su transporte entre diferentes entornos genéticos o para su expresión en una célula huésped. Los vectores están compuestos normalmente por ADN aunque también están disponibles vectores de ARN. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos y genomas de virus. Un vector de clonación es uno que puede replicarse en una célula huésped, y que se caracteriza además por uno o más sitios de restricción de endonucleasas en los que puede cortarse el vector de una manera determinable y en los que puede ligarse una secuencia de ADN deseada de tal manera que el nuevo vector recombinante conserva su capacidad para replicarse en la célula huésped. En el caso de plásmidos, puede producirse la replicación de la secuencia deseada muchas veces ya que el plásmido aumenta el número de copias dentro de la bacteria huésped o sólo una única vez por huésped antes de que el huésped se reproduzca mediante mitosis. En el caso de fago, la replicación puede producirse de manera activa durante una fase lítica o de manera pasiva durante una fase lisogénica. Un “vector de expresión” es uno en el que puede insertarse una secuencia de ADN deseada (por ejemplo, el ADNc de FGE de SEQ ID NO: 3) mediante restricción y ligación de tal manera que está operativamente unido a secuencias reguladoras y puede expresarse como un transcrito de ARN. Los vectores pueden contener además una o más secuencias marcadoras adecuadas para su uso en la identificación de células que se han transformado o transfectado o no con el vector. Los marcadores incluyen, por ejemplo, genes que codifican para proteínas que aumentan o disminuyen o bien su resistencia o bien su sensibilidad a antibióticos u otros compuestos, genes que codifican para enzimas cuyas actividades pueden detectarse mediante ensayos convencionales conocidos en la técnica (por ejemplo, 1-galactosidasa o fosfatasa alcalina), y genes que afectan visiblemente al fenotipo de células, huéspedes, colonias o placas transformadas o transfectadas (por ejemplo, proteína verde fluorescente).
Un “vector de direccionamiento” es uno que contiene normalmente constructos/secuencias de direccionamiento que se usan, por ejemplo, para insertar una secuencia reguladora dentro de un gen endógeno (por ejemplo, dentro de las secuencias de un exón y/o intrón), dentro de las secuencias promotoras del gen endógeno, o en sentido 5’ de las secuencias promotoras del gen endógeno. En otro ejemplo, un vector de direccionamiento puede contener el gen de interés (por ejemplo, codificado por el ADNc de SEQ ID NO: 1) y otras secuencias necesarias para el direccionamiento del gen a una ubicación preferida en el genoma (por ejemplo, una ubicación transcripcionalmente activa, por ejemplo en el sentido 3’ de un promotor endógeno de un gen no relacionado). La construcción de vectores y constructos de direccionamiento se describe en detalle en las patentes estadounidenses 5.641.670 y
6.270.989.
Puede usarse prácticamente cualquier célula, procariota o eucariota, que puede transformarse con ADN o ARN heterólogo y que puede hacerse crecer o mantenerse en cultivo. Ejemplos incluyen células bacterianas tales como Escherichia coli, células de insecto y células de mamífero tales como ser humano, ratón, hámster, cerdo, cabra, primate, etc. Pueden ser cepas de células primarias o secundarias (que muestran un número finito de duplicaciones de población media en cultivo y no están inmortalizadas) y líneas celulares inmortalizadas (que muestran un periodo de vida aparentemente ilimitado en cultivo). Las células primarias y secundarias incluyen, por ejemplo, fibroblastos, queratinocitos, células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales de mama, células epiteliales intestinales), células endoteliales, células de la glía, células neurales, elementos formados de la sangre (por ejemplo, linfocitos, células de médula ósea), células del músculo y precursores de esos tipos de células somáticas incluyendo células madre embrionarias. Cuando las células deben usarse en terapia génica, se obtienen preferiblemente células primarias del individuo a quien se le administran las células manipuladas. Sin embargo, pueden obtenerse células primarias de un donante (distinto del receptor) de la misma especie. Ejemplos de líneas de células humanas inmortalizadas que pueden usarse con los constructos de ADN y métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, células HT-1080 (ATCC CCL 121), células HeLa y derivados de células HeLa (ATCC CCL 2, 2.1 y 2.2), células de cáncer de mama MCF-7 (ATCC BTH 22), células de leucemia K-562 (ATCC CCL 243), células de carcinoma KB (ATCC CCL 17), células de carcinoma de ovario 2780AD (Van der Blick, A. M. et al., Cancer Res, 48:5927-5932 (1988), células Raji (ATCC CCL 86), células de adenocarcinoma de colon WiDr (ATCC CCL 218), células de adenocarcinoma de colon SW620 (ATCC CCL 227), células Jurkat (ATCC TIB 152), células Namalwa (ATCC CRL1432), células HL-60 (ATCC CCL 240), células Daudi (ATCC CCL 213), células RPMI 8226 (ATCC CCL 155), células U-937 (ATCC CRL 1593), células de melanoma de Bowes (ATCC CRL 9607), células 2R4 de la sublínea WI-38VA13 (ATCC CLL 75.1) y células MOLT-4 (ATCC CRL 1582), células CHO, y células COS, así como células de heterohibridoma producidas mediante fusión de células humanas y células de otra especie. También pueden usarse cepas de fibroblastos humanos secundarios, tales como WI-38 (ATCC CCL 75) y MRC-5 (ATCC CCL 171). Se describe una evaluación adicional de los tipos de células que pueden usarse en las patentes estadounidenses 5.641.670 y 6.270.989. También pueden usarse sistemas de transcripción libres de células en lugar de células.
Las células se mantienen en condiciones, tal como se conoce en la técnica, que dan como resultado la expresión de la proteína FGE o fragmentos funcionales de la misma. Las proteínas expresadas usando los métodos descritos pueden purificarse a partir de lisados celulares o sobrenadantes celulares. Pueden prepararse proteínas preparadas según este método como una formulación farmacéuticamente útil y administrarse a un ser humano o animal no humano mediante vías farmacéuticas convencionales tal como se conoce en la técnica (por ejemplo, oral, intravenosa, intramuscular, intranasal, intratraqueal o subcutánea). Tal como se describe en otra parte en el presente documento, las células recombinantes pueden ser células inmortalizadas, primarias o secundarias, preferiblemente humanas. El uso de células de otra especie puede ser deseable en casos en los que las células no humanas son ventajosas para fines de producción de proteína en los que la FGE no humana producida es terapéuticamente útil.
Tal como se usa en el presente documento, se dice que una secuencia codificante y secuencias reguladoras están “operativamente” unidas cuando están unidas covalentemente de tal manera que se coloca la expresión o transcripción de la secuencia codificante bajo la influencia o el control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias codificantes se traduzcan en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están operativamente unidas si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras en 5’ da como resultado la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de cambio de marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes, o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente para traducirse en una proteína. Por tanto, una región promotora estará operativamente unida a una secuencia codificante si la región promotora puede realizar a la transcripción de esa secuencia de ADN de tal manera que el transcrito resultante puede traducirse en la proteína o polipéptido deseado.
La naturaleza precisa de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar entre tipos de especie o célula, pero en general incluirán, como necesario, secuencias no transcritas en 5’ y no traducidas en 5’ que participan en la iniciación de la transcripción y la traducción respectivamente, tal como una caja TATA, secuencia de ocupación, secuencia CAAT, y similares. Especialmente, tales secuencias reguladoras no transcritas en 5’ incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen operativamente unido. Las secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en sentido 5’ según se desee. Los vectores pueden incluir opcionalmente secuencias señal o líder en 5’. La elección y el diseño de un vector apropiado están dentro de la capacidad y discreción de un experto habitual en la técnica.
Vectores de expresión que contienen todos los elementos necesarios para la expresión están comercialmente disponibles y los conocen los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Se diseñan mediante ingeniería genética células mediante la introducción en las células de ADN (ARN) heterólogo que codifica para polipéptido de FGE o fragmento o variante del mismo. Ese ADN (ARN) heterólogo se coloca bajo el control operativo de elementos transcripcionales para permitir la expresión del ADN heterólogo en la célula huésped.
Sistemas preferidos para la expresión de ARNm en células de mamífero son aquéllos tales como pRc/CMV (disponible de Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene un marcador seleccionable tal como un gen que confiere resistencia a G418 (lo que facilita la selección de líneas celulares transfectadas de manera estable) y las secuencias de potenciador-promotor del citomegalovirus (CMV) humano. Adicionalmente, es adecuado para la expresión en líneas celulares de primate o canino el vector pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contiene un origen de replicación de virus de Epstein Barr (EBV), que facilita el mantenimiento del plásmido como elemento extracromosómico de múltiples copias. Otro vector de expresión es el plásmido pEF-BOS que contiene el promotor de factor de elongación 1a de polipéptido, que estimula la transcripción eficaz in vitro. El plásmido se describe por Mishizuma y Nagata (Nuc. Acids Res. 18:5322, 1990), y su uso en experimentos de transfección se da a conocer, por ejemplo, por Demoulin (Mol. Cell. Biol. 16:4710-4716, 1996). Todavía otro vector de expresión preferido es un adenovirus, descrito por Stratford-Perricaudet, que es defectuoso para proteínas E1 y E3 (J. Clin. Invest. 90:626630, 1992). El uso del adenovirus como recombinante Adeno.P1A se da a conocer por Warnier et al., en la inyección intradérmica en ratones para su inmunización frente a P1A (Int. J. Cancer, 67:303-310, 1996).
Pueden proporcionarse kits de expresión, que permiten al experto en la técnica preparar un vector o vectores de expresión deseados. Tales kits de expresión incluyen al menos partes separadas de cada una de las secuencias codificantes anteriormente comentadas. Pueden añadirse otros componentes, según se desee, siempre que se incluyan las secuencias anteriormente mencionadas, que se requieren.
También se reconocerá que pueden usarse vectores de expresión que contienen la secuencia de ADNc de FGE descrita anteriormente para transfectar líneas celulares y células huésped, ya sean procariotas (por ejemplo, Escherichia coli), o eucariotas (por ejemplo, células CHO, células COS, sistemas de expresión en levadura y expresión de baculovirus recombinante en células de insecto). Son especialmente útiles células de mamífero tales como ser humano, ratón, hámster, cerdo, cabra, primate, etc. Pueden ser de una amplia variedad de tipos de tejido, e incluyen células primarias y líneas celulares inmortalizadas tal como se describe en otra parte en el presente documento. Ejemplos específicos incluyen células HT-1080, células CHO, células dendríticas, células U293, leucocitos de sangre periférica, células madre de médula ósea, células madre embrionarias y células de insecto. La construcción de “deficientes” en gen de FGE en células y en animales es útil para proporcionar materiales para estudiar determinados aspectos de la actividad FGE.
Pueden proporcionarse polipéptidos aislados (incluyendo proteínas completas y proteínas parciales), codificados por los ácidos nucleicos de FGE anteriores, e incluyen el polipéptido de SEQ ID NO: 2 y fragmentos únicos del mismo. Tales polipéptidos son útiles, por ejemplo, solos o como parte de proteínas de fusión para generar anticuerpos, como componentes de un inmunoensayo, etc. Pueden aislarse polipéptidos a partir de muestras biológicas incluyendo homogeneizados tisulares o celulares, y también pueden expresarse de manera recombinante en una variedad de sistemas de expresión procariotas y eucariotas construyendo un vector de expresión apropiado para el sistema de expresión, introduciendo el vector de expresión en el sistema de expresión, y aislando la proteína expresada de manera recombinante. También pueden sintetizarse químicamente polipéptidos cortos, incluyendo péptidos antigénicos (tal como se presentan por moléculas del MHC sobre la superficie de una célula para su reconocimiento inmunitario) usando métodos bien establecidos de síntesis de péptido.
Un fragmento único de un polipéptido de FGE, en general, tiene los rasgos y las características de fragmentos únicos tal como se comentó anteriormente en relación con ácidos nucleicos. Tal como reconocerán los expertos en la técnica, el tamaño del fragmento único dependerá de factores tales como si el fragmento constituye una parte de un dominio de proteína conservado. Por tanto, algunas regiones de SEQ ID NO: 2 requerirán segmentos más largos para ser únicas mientras que otras sólo requerirán segmentos cortos, normalmente de entre 5 y 12 aminoácidos (por ejemplo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 aminoácidos de longitud o más, incluyendo cada número entero hasta la longitud completa, 287 aminoácidos de longitud).
Fragmentos únicos de un polipéptido son preferiblemente aquellos fragmentos que conservan una capacidad funcional diferenciada del polipéptido. Las capacidades funcionales que pueden conservarse en un fragmento único de un polipéptido incluyen interacción con anticuerpos, interacción con otros polipéptidos o fragmentos de los mismos, interacción con otras moléculas, etc. Una actividad importante es la capacidad para actuar como una firma para identificar el polipéptido. Los expertos en la técnica conocerán bien métodos para seleccionar secuencias de aminoácidos únicas, normalmente basándose en la capacidad del fragmento único para distinguir selectivamente la secuencia de interés de otras que no son miembros de la familia. Una comparación de la secuencia del fragmento con las de bases de datos conocidas es normalmente todo lo que se necesita.
Las variantes de los polipéptidos de FGE descritos anteriormente son útiles. Tal como se usa en el presente documento, una “variante” de un polipéptido de FGE es un polipéptido que contiene una o más modificaciones de la secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido de FGE. Las modificaciones que crean una variante de polipéptido de FGE se realizan normalmente en el ácido nucleico que codifica para el polipéptido de FGE, y pueden incluir deleciones, mutaciones puntuales, truncaciones, sustituciones de aminoácidos y adición de aminoácidos o restos distintos de aminoácido para: 1) reducir o eliminar una actividad de un polipéptido de FGE; 2) potenciar una propiedad de un polipéptido de FGE, tal como estabilidad de la proteína en un sistema de expresión o la estabilidad de la unión proteína-ligando; 3) proporcionar una propiedad o actividad novedosa a un polipéptido de FGE, tal como adición de un epítopo antigénico o adición de un resto detectable; o 4) proporcionar una unión equivalente o mejor a un receptor de polipéptido de FGE u otra molécula. Alternativamente, pueden realizarse modificaciones directamente en el polipéptido, tal como mediante escisión, adición de una molécula ligadora, adición de un resto detectable, tal como biotina, adición de un ácido graso, y similares. Las modificaciones también abarcan proteínas de fusión que comprenden la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos de FGE. Un experto en la técnica estará familiarizado con métodos para predecir el efecto sobre la conformación de la proteína de un cambio en la secuencia de la proteína, y por tanto puede “diseñar” un de polipéptido de FGE variante según métodos conocidos. Un ejemplo de un método de este tipo se describe por Dahiyat y Mayo en Science 278:82-87, 1997, mediante lo cual pueden diseñarse proteínas de novo. El método puede aplicarse a una proteína conocida para variar sólo una parte de la secuencia del polipéptido. Aplicando los métodos computacionales de Dahiyat y Mayo, pueden proponerse variantes específicas del polipéptido de FGE y someterse a prueba para determinar si la variante conserva una conformación deseada.
Las variantes pueden incluir polipéptidos de FGE que se modifican específicamente para alterar una característica del polipéptido no relacionada con su actividad fisiológica. Por ejemplo, pueden sustituirse o eliminarse residuos de cisteína para prevenir enlaces disulfuro no deseados. De manera similar, pueden cambiarse determinados aminoácidos para potenciar la expresión de un polipéptido de FGE eliminando la proteolisis mediante proteasas en un sistema de expresión (por ejemplo, residuos de aminoácido dibásico en sistemas de expresión de levadura en los que está presente actividad proteasa KEX2).
Las mutaciones de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de FGE conservan preferiblemente el marco de lectura de aminoácidos de la secuencia codificante, y preferiblemente no crean regiones en el ácido nucleico que es probable que se hibriden para formar estructuras secundarias, tales como horquillas o bucles, que pueden ser perjudiciales para la expresión del polipéptido variante.
Pueden realizarse mutaciones seleccionando una sustitución de aminoácidos, o mediante mutagénesis al azar de un sitio seleccionado en un ácido nucleico que codifica para el polipéptido. Entonces se expresan polipéptidos variantes y se someten a prueba para detectar una o más actividades para determinar qué mutación proporciona un polipéptido variante con las propiedades deseadas. Pueden realizarse mutaciones adicionales en variantes (o en polipéptidos de FGE no variantes) que son silenciosas en cuanto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que proporcionan codones preferidos para la traducción en un huésped particular, o alteran la estructura del ARNm para, por ejemplo, potenciar la estabilidad y/o expresión. Los codones preferidos para la traducción de un ácido nucleico en, por ejemplo, Escherichia coli, células de mamífero, etc. los conocen bien los expertos en la técnica. Pueden realizarse todavía otras mutaciones en las secuencias no codificantes de un clon de ADNc o gen de FGE para potenciar la expresión del polipéptido.
El experto en la técnica constatará que pueden realizarse sustituciones de aminoácidos conservativas en polipéptidos de FGE para proporcionar variantes funcionalmente equivalentes de los polipéptidos anteriores, es decir, las variantes conservan las capacidades funcionales de los polipéptidos de FGE. Tal como se usa en el presente documento, una “sustitución de aminoácidos conservativa” se refiere a una sustitución de aminoácidos que no altera significativamente la estructura terciaria y/o actividad del polipéptido. Pueden prepararse variantes según métodos para alterar la secuencia del polipéptido conocidos para un experto habitual en la técnica, e incluyen los que se encuentran en referencias que compilan tales métodos, por ejemplo Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
J. Sambrook, et al., eds., segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Variantes funcionalmente equivalentes a modo de ejemplo de los polipéptidos de FGE incluyen sustituciones de aminoácidos conservativas de SEQ ID NO: 2. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen sustituciones realizadas entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; y (g) E, D.
Por tanto, se contemplan variantes funcionalmente equivalentes de polipéptidos de FGE, es decir, variantes de polipéptidos de FGE que conservan la función de los polipéptidos de FGE naturales. Se realizan normalmente sustituciones de aminoácidos conservativas en la secuencia de aminoácidos de polipéptidos de FGE para producir variantes funcionalmente equivalentes de polipéptidos de FGE mediante alteración de un ácido nucleico que codifica para polipéptidos de FGE (SEQ ID NO: 1, 3). Tales sustituciones pueden realizarse mediante una variedad de métodos conocidos por un experto habitual en la técnica. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos mediante mutación dirigida por PCR, mutagénesis dirigida al sitio según el método de Kunkel (Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985), o mediante síntesis química de un gen que codifica para un polipéptido de FGE. La actividad de fragmentos funcionalmente equivalentes de polipéptidos de FGE puede someterse a prueba clonando el gen que codifica para el polipéptido de FGE alterado en un vector de expresión bacteriano o de mamífero, introduciendo el vector en una célula huésped apropiada, expresando el polipéptido de
FGE alterado, y sometiendo a prueba para detectar una capacidad funcional de los polipéptidos de FGE tal como se da a conocer en el presente documento (por ejemplo, actividad de generación de Ca-formilglicina, etc.).
La información proporcionada en el presente documento tiene varios usos, algunos de los cuales se describen en otra parte en el presente documento. En primer lugar, permite el aislamiento de polipéptidos de FGE. Puede utilizarse una variedad de metodologías bien conocidas por el experto en la técnica para obtener moléculas de FGE aisladas. El polipéptido puede purificarse a partir de células que producen de manera natural el polipéptido mediante medios cromatográficos o reconocimiento inmunológico. Alternativamente, puede introducirse un vector de expresión en células para provocar la producción del polipéptido. En otro método, pueden microinyectarse transcritos de ARNm o introducirse de otro modo en células para provocar la producción del polipéptido codificado. También puede usarse la traducción de ARNm de FGE en extractos libres de células tales como el sistema de lisado de reticulocitos para producir polipéptidos de FGE. Los expertos en la técnica también pueden seguir fácilmente métodos conocidos para aislar polipéptidos de FGE. Incluyen, pero no se limitan a, inmunocromatografía, HPLC, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de inmunoafinidad.
En determinadas realizaciones, pueden proporcionarse polipéptidos “negativos dominantes”, derivados de polipéptidos de FGE. Un polipéptido negativo dominante es una variante inactiva de una proteína, que, interaccionando con la maquinaria celular, desplaza a una proteína activa de su interacción con la maquinaria celular
o compite con la proteína activa, reduciendo así el efecto de la proteína activa. Por ejemplo, un receptor negativo dominante que se une a un ligando pero que no transmite una señal en respuesta a la unión del ligando puede reducir el efecto biológico de la expresión del ligando. Asimismo, una cinasa catalíticamente inactiva negativa dominante que interacciona normalmente con proteínas diana pero que no fosforila a las proteínas diana puede reducir la fosforilación de las proteínas diana en respuesta a una señal celular. De manera similar, un factor de transcripción negativo dominante que se une a un sitio de promotor en la región de control de un gen pero que no aumenta la transcripción del gen puede reducir el efecto de un factor de transcripción normal ocupando sitios de unión a promotor sin aumentar la transcripción.
El resultado final de la expresión de un polipéptido negativo dominante en una célula es una reducción de la función de proteínas activas. Un experto habitual en la técnica puede evaluar la posibilidad de una variante negativa dominante de una proteína, y usar técnicas de mutagénesis convencionales para crear uno o más polipéptidos variantes negativos dominantes. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.580.723 y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. El experto en la técnica puede someter entonces a prueba la población de polipéptidos sometidos a mutagénesis para detectar una disminución de una actividad seleccionada y/o para detectar la conservación de una actividad de este tipo. Otros métodos similares para crear y someter a prueba variantes negativas dominantes de una proteína resultarán evidentes para un experto en la técnica.
El aislamiento del ADNc de FGE también hace posible que el experto en la técnica diagnostique un trastorno caracterizado por una expresión aberrante de FGE. Estos métodos suponen determinar la expresión del gen de FGE, y/o polipéptidos de FGE derivados del mismo. En la primera situación, tales determinaciones pueden llevarse a cabo mediante cualquier ensayo de determinación de ácido nucleico convencional, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa, o sometiendo a ensayo con sondas de hibridación marcadas tal como se muestra a modo de ejemplo a continuación. En la última situación, tal determinación puede llevarse a cabo mediante cualquier ensayo inmunológico convencional usando, por ejemplo, anticuerpos que se unen a la proteína FGE secretada. Un trastorno preferido que puede diagnosticarse es deficiencia múltiple de sulfatasas.
Son útiles agentes de unión a péptido aislados que pueden ser, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (“polipéptidos de unión”), que tienen la capacidad de unirse selectivamente a polipéptidos de FGE. Anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, preparados según metodología convencional. En determinadas realizaciones, se excluyen agentes de unión (por ejemplo, anticuerpos) que se unen a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 4.
De manera significativa, tal como se conoce en la técnica, sólo una pequeña parte de una molécula de anticuerpo, el parátopo, participa en la unión del anticuerpo a su epítopo (véase, en general, Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., Nueva York; Roitt, L (1991) Essential Immunology, 7ª ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc’ y Fc, por ejemplo, son efectores de la cascada del complemento pero no participan en la unión a antígeno. Un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región pFc’, o que se ha producido sin la región pFc’, denominado fragmento F(ab’)2, conserva ambos sitios de unión a antígeno de un anticuerpo intacto. De manera similar, un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región Fc, o que se ha producido sin la región Fc, denominado fragmento Fab, conserva uno de los sitios de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Avanzando adicionalmente, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unida covalentemente y una parte de la cadena pesada de anticuerpo denominada Fd. Los fragmentos Fd son los determinantes principales de la especificidad de anticuerpo (un fragmento Fd individual puede estar asociado con hasta diez cadenas ligeras diferentes si alterar la especificidad de anticuerpo) y los fragmentos Fd conservan capacidad de unión a epítopo en aislamiento.
Dentro de la parte de unión a antígeno de un anticuerpo, tal como se conoce bien en la técnica, hay regiones determinantes de complementariedad (CDR), que interaccionan directamente con el epítopo del antígeno, y regiones de entramado (FR), que mantienen la estructura terciaria del parátopo (véase, en general, Clark, 1986; Roitt, 1991). Tanto en el fragmento Fd de cadena pesada como en la cadena ligera de inmunoglobulinas IgG, hay cuatro regiones de entramado (de FR1 a FR4) separadas respectivamente por tres regiones determinantes de complementariedad (de CDR1 a CDR3). Las CDR, y en particular las regiones CDR3, y más particularmente la CDR3 de cadena pesada, son ampliamente responsables de la especificidad del anticuerpo.
Ahora está bien establecido en la técnica que las regiones distintas de CDR de un anticuerpo de mamífero pueden sustituirse por regiones similares de anticuerpos coespecíficos o heteroespecíficos mientras que conservan la especificidad epitópica del anticuerpo original. Esto se manifiesta de la manera más clara en el desarrollo y el uso de anticuerpos “humanizados” en los que se unen covalentemente CDR no humanas a regiones FR y/o Fc/pFc’ humanas para producir un anticuerpo funcional. Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses 4.816.567, 5.225.539, 5.585.089, 5.693.762 y 5.859.205. Por tanto, por ejemplo, la publicación internacional PCT n.º WO 92/04381 enseña la producción y el uso de anticuerpos frente a VSR murinos humanizados en los que al menos una parte de las regiones FR murinas se ha sustituido por regiones FR de origen humano. Tales anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos intactos con capacidad de unión a antígeno, se denominan con frecuencia anticuerpos “quiméricos”.
Por tanto, tal como resultará evidente a un experto habitual en la técnica, puede proporcionarse lo siguiente: fragmentos F(ab’)2, Fab, Fv y Fd; anticuerpos quiméricos en los que las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han sustituido por secuencias humanas o no humanas homólogas; anticuerpos de fragmento F(ab’)2 quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han sustituido por secuencias humanas o no humanas homólogas; anticuerpos de fragmento Fab quimérico en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han sustituido por secuencias humanas o no humanas homólogas; y anticuerpos de fragmento Fd quimérico en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 se han sustituido por secuencias humanas o no humanas homólogas. También pueden proporcionarse los denominados anticuerpos monocatenarios.
Por tanto, pueden proporcionarse polipéptidos de numerosos tamaños y tipos que se unen específicamente a polipéptidos de FGE, y complejos tanto de polipéptidos de FGE como de sus parejas de unión. Estos polipéptidos también pueden derivarse de fuentes distintas de tecnología de anticuerpos. Por ejemplo, tales agentes de unión a polipéptido pueden proporcionarse mediante bibliotecas de péptidos degenerados que pueden prepararse fácilmente en disolución, en forma inmovilizada, como bibliotecas de presentación de péptidos en flagelos bacterianos o como bibliotecas de presentación en fagos. También pueden sintetizarse bibliotecas combinatorias de péptidos que contienen uno o más aminoácidos. Pueden sintetizarse adicionalmente bibliotecas de péptidos y restos sintéticos distintos de péptidos.
La presentación en fagos puede ser particularmente eficaz en la identificación de péptidos de unión útiles. En resumen, se prepara una biblioteca de fagos (usando por ejemplo fago m13, fd, o lambda), que presentan insertos de desde 4 hasta aproximadamente 80 residuos de aminoácido usando procedimientos convencionales. Los insertos pueden representar, por ejemplo, una matriz completamente degenerada o sesgada. Entonces pueden seleccionarse insertos que llevan fago que se unen al polipéptido de FGE o un complejo de FGE y una pareja de unión. Este proceso puede repetirse a lo largo de varios ciclos de reselección de fago que se une al polipéptido de FGE o complejo. Ciclos repetidos conducen a un enriquecimiento de fago que lleva secuencias particulares. Puede realizarse un análisis de secuencia de ADN para identificar las secuencias de los polipéptidos expresados. Puede determinarse la parte lineal mínima de la secuencia que se une al polipéptido de FGE o complejo. Puede repetirse el procedimiento usando una biblioteca sesgada que contiene insertos que contienen una parte o la totalidad de la parte lineal mínima más uno o más residuos degenerados adicionales en sentido 5’ o en sentido 3’ de la misma. También pueden usarse métodos de selección de dos híbridos de levadura para identificar polipéptidos que se unen a los polipéptidos de FGE. Por tanto, los polipéptidos de FGE, o un fragmento de los mismos, o complejos de FGE y una pareja de unión, pueden usarse para examinar bibliotecas de péptidos, incluyendo bibliotecas de presentación en fagos, para identificar y seleccionar parejas de unión a péptidos de los polipéptidos de FGE. Tales moléculas pueden usarse, tal como se describe, para ensayos de selección, para protocolos de purificación, para interferir directamente con el funcionamiento de FGE y para otros fines que resultarán evidentes para los expertos habituales en la técnica.
También puede usarse un polipéptido de FGE, o un fragmento del mismo, para aislar sus parejas de unión nativas. El aislamiento de parejas de unión puede realizarse según métodos bien conocidos. Por ejemplo, pueden unirse polipéptidos de FGE aislados a un sustrato, y después puede aplicarse una disolución que se sospecha que contiene una pareja de unión a FGE al sustrato. Si la pareja de unión para polipéptidos de FGE está presente en la disolución, entonces se unirá al polipéptido de FGE unido al sustrato. Entonces puede aislarse la pareja de unión. Otras proteínas que son parejas de unión para FGE pueden aislarse mediante métodos similares sin experimentación excesiva. Una pareja de unión preferida es una sulfatasa.
Pueden proporcionarse métodos para medir el nivel de expresión de FGE en un sujeto. Esto puede realizarse obteniendo en primer lugar una muestra de prueba del sujeto. La muestra de prueba puede ser tejido o líquido biológico. Los tejidos incluyen cerebro, corazón, suero, mama, colon, vejiga, útero, próstata, estómago, testículos, ovario, páncreas, glándula pituitaria, glándula suprarrenal, glándula tiroidea, glándula salivar, glándula mamaria, riñón, hígado, intestino, bazo, timo, vasos sanguíneos, médula ósea, tráquea y pulmón. En determinadas realizaciones, las muestras de prueba se originan de tejidos del corazón y vasos sanguíneos, y los líquidos biológicos incluyen sangre, saliva y orina. Pueden usarse técnica tanto invasivas como no invasivas para obtener tales muestras y están bien documentadas en la técnica. A nivel molecular pueden usarse tanto PCR como transferencia de tipo Northern para determinar el nivel de ARNm de FGE usando productos descritos en el presente documento, y protocolos bien conocidos en la técnica que se encuentran en referencias que compilan tales métodos. A nivel de proteína, puede determinarse la expresión de FGE usando sueros anti-FGE o bien policlonales o bien monoclonales en combinación con ensayos inmunológicos convencionales. Los métodos preferidos compararán el nivel medido de expresión de FGE de la muestra de prueba con un control. Un control puede incluir una cantidad conocida de una sonda de ácido nucleico, un epítopo de FGE (tal como un producto de expresión de FGE), o una muestra de prueba similar de un sujeto con un nivel de control o “normal” de expresión de FGE.
Preferiblemente se producen polipéptidos de FGE de manera recombinante, aunque tales polipéptidos pueden aislarse de extractos biológicos. Polipéptidos de FGE producidos de manera recombinante incluyen proteínas quiméricas que comprenden una fusión de una proteína FGE con otro polipéptido, por ejemplo, un polipéptido que puede proporcionar o potenciar la unión proteína-proteína, unión de ácido nucleico específica de secuencia (tal como GAL4), potenciar la estabilidad del polipéptido de FGE en condiciones de ensayo, o proporcionar un resto detectable, tal como proteína verde fluorescente. Un polipéptido fusionado a un fragmento o polipéptido de FGE también puede proporcionar medios para detectar fácilmente la proteína de fusión, por ejemplo, mediante reconocimiento inmunológico o mediante marcado fluorescente.
La información proporcionada en el presente documento también es útil en la generación de animales transgénicos no humanos. Tal como se usa en el presente documento, “animales transgénicos no humanos” incluyen animales no humanos que tienen una o más moléculas de ácido nucleico exógenas incorporadas en células de línea germinal y/o células somáticas. Por tanto, los animales transgénicos incluyen animales “deficientes” que tienen una alteración de genes homocigóticos o heterocigóticos mediante recombinación homóloga, animales que tienen vectores de expresión incorporados de manera episomal o cromosómica, etc. Pueden prepararse animales deficientes mediante recombinación homóloga usando células madre embrionarias tal como se conoce bien en la técnica. La recombinación puede facilitarse usando, por ejemplo, el sistema cre/lox u otros sistemas de recombinasa conocidos por un experto habitual en la técnica. En determinadas realizaciones, el propio sistema de recombinasa se expresa de manera condicionada, por ejemplo, en determinados tejidos o tipos de célula, en determinados estadios de desarrollo embrionario o posembrionario, se induce mediante la adición de un compuesto que aumenta o disminuye la expresión, y similares. En general, los vectores de expresión condicionados usados en tales sistemas usan una variedad de promotores que confieren el patrón de expresión génica deseado (por ejemplo, temporal o espacial). También pueden unirse operativamente promotores condicionados a moléculas de ácido nucleico de FGE para aumentar la expresión de FGE de una manera regulada o condicionada. También pueden unirse operativamente reguladores negativos que actúan en trans de la actividad o expresión de FGE a un promotor condicionado tal como se describió anteriormente. Tales reguladores que actúan en trans incluyen moléculas de ácidos nucleicos de FGE antisentido, moléculas de ácido nucleico que codifican para moléculas de FGE negativas dominantes, moléculas de ribozima específicas para ácidos nucleicos de FGE, y similares. Los animales transgénicos no humanos son útiles en experimentos dirigidos a someter a prueba los efectos bioquímicos o fisiológicos de productos de diagnóstico o productos terapéuticos para detectar estados caracterizados por una expresión de FGE aumentada o disminuida. Otros usos resultarán evidentes para un experto habitual en la técnica.
También se contempla la terapia génica. El procedimiento para realizar terapia génica ex vivo se explica en la patente estadounidense 5.399.346 y en documentos presentados en la historia de presentación de esa patente, todos los cuales son documentos disponibles para el público. En general, implica la introducción in vitro de una copia funcional de un gen en una(s) célula(s) de un sujeto que contiene(n) una copia defectuosa del gen, y devolver la(s) célula(s) modificada(s) mediante ingeniería genética al sujeto. La copia funcional del gen está bajo el control operativo de elementos reguladores que permiten la expresión del gen en la(s) célula(s) modificada(s) mediante ingeniería genética. Los expertos habituales en la técnica conocen bien numerosas técnicas de transfección y transducción así como vectores de expresión apropiados, algunos de los cuales se describen en la solicitud PCT WO95/00654. También se contempla la terapia génica in vivo usando vectores tales como adenovirus, retrovirus, herpesvirus, y liposomas seleccionados como diana.
Pueden proporcionarse métodos eficaces de identificación de agentes o compuestos de partida para agentes activos a nivel de una función celular dependiente de FGE o fragmento de FGE. En particular, tales funciones incluyen interacción con otros polipéptidos o fragmentos. Generalmente, los métodos de selección suponen someter a ensayo para detectar compuestos que interfieren con la actividad FGE (tal como actividad de generación de Ca formilglicina), aunque también pueden someterse a ensayo compuestos que potencian la actividad FGE de generación de Ca-formilglicina usando los métodos de selección. Tales métodos pueden adaptarse para la selección automatizada de alto rendimiento de compuestos. Indicaciones diana incluyen procesos celulares modulados por FGE tales como actividad de generación de Ca-formilglicina.
Se proporciona una amplia variedad de ensayos para agentes candidatos (farmacológicos), incluyendo, ensayos de unión proteína-liando in vitro marcados, ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética, inmunoensayos, ensayos basados en células tales como selecciones de dos o tres híbridos, ensayos de expresión, etc. Los ácidos nucleicos transfectados pueden codificar, por ejemplo, para bibliotecas de péptidos combinatorias o bibliotecas de ADNc. En la técnica se conocen reactivos convenientes para tales ensayos, por ejemplo, proteínas de fusión de GAL4. Un ensayo basado en células a modo de ejemplo implica transferir a una célula un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de FGE fusionado a un dominio de unión a ADN de GAL4 y un ácido nucleico que codifica para un gen indicador operativamente unido a una región reguladora de expresión génica, tal como uno o más sitios de unión a GAL4. La activación de transcripción de gen indicador se produce cuando el polipéptido de fusión de FGE e indicador se une de tal manera que permite la transcripción del gen indicador. Entonces se detectan agentes que modulan una función celular mediada por polipéptido de FGE mediante un cambio en la expresión del gen indicador. En la técnica se conocen métodos para determinar cambios en la expresión de un gen indicador.
Los fragmentos de FGE usados en los métodos, cuando no se producen mediante un ácido nucleico transfectado, se añaden a una mezcla de ensayo como un polipéptido aislado. Preferiblemente se producen polipéptidos de FGE de manera recombinante, aunque tales polipéptidos pueden aislarse de extractos biológicos. Los polipéptidos de FGE producidos de manera recombinante incluyen proteínas quiméricas que comprende una fusión de una proteína FGE con otro polipéptido, por ejemplo, un polipéptido que puede proporcionar o potenciar la unión proteína-proteína, unión a ácido nucleico específica de secuencia (tal como GAL4), potenciar la estabilidad del polipéptido de FGE en condiciones de ensayo, o proporcionar un resto detectable, tal como proteína verde fluorescente o epítopo Flag.
La mezcla de ensayo comprende una diana de unión a FGE intracelular natural que puede interaccionar con FGE. Aunque pueden usarse dianas de unión a FGE naturales, con frecuencia se prefiere usar partes (por ejemplo, péptidos (véase por ejemplo, el péptido de SEQ ID NO: 33) o fragmentos de ácido nucleico) o análogos (es decir, agentes que imitan las propiedades de unión a FGE de la diana de unión natural para fines del ensayo) de la diana de unión a FGE siempre que la parte o el análogo proporcione avidez y afinidad de unión al fragmento de FGE medible en el ensayo.
La mezcla de ensayo también comprende un agente candidato. Normalmente, se aplica una pluralidad de mezclas de ensayo en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferente a las diversas concentraciones. Normalmente, una de esas concentraciones sirve como control negativo, es decir, a una concentración nula de agente o a una concentración de agente por debajo de los límites de detección del ensayo. Agentes candidatos abarcan numerosas clases químicas, aunque normalmente son compuestos orgánicos. Preferiblemente, los agentes candidatos son compuestos orgánicos pequeños, es decir, aquéllos que tienen un peso molecular de más de 50 pero menos de aproximadamente 2500, preferiblemente menos de aproximadamente 1000 y, más preferiblemente, menos de aproximadamente 500. Agentes candidatos comprenden grupos químicos funcionales necesarios para interacciones estructurales con polipéptidos y/o ácidos nucleicos, y normalmente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos químicos funcionales y más preferiblemente al menos tres de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos pueden comprender una estructura heterocíclica o de carbono cíclica y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales identificados anteriormente. Los agentes candidatos también pueden ser biomoléculas tales como péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroles, isoprenoides, purinas, pirimidinas, derivados o análogos estructurales de los anteriores, o combinaciones de los mismos y similares. Cuando el agente es un ácido nucleico, el agente es normalmente una molécula de ADN o ARN, aunque también se contemplan ácidos nucleicos modificados tal como se define en el presente documento.
Los agentes candidatos se obtienen de una amplia variedad de fuentes incluyendo bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis al azar y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos aleatorizados, bibliotecas combinatorias orgánicas sintéticas, bibliotecas de presentación en fagos de péptidos al azar y similares. Alternativamente, están disponibles o pueden producirse fácilmente bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Adicionalmente, pueden modificarse compuestos y bibliotecas naturales y producidas sintéticamente mediante medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Además, pueden someterse agentes conocidos (farmacológicos) a modificaciones químicas dirigidas o al azar tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc. para producir análogos estructurales de los agentes.
También puede incluirse una variedad de otros reactivos en la mezcla. Incluyen reactivos tales como sales, tampones, proteínas neutras (por ejemplo, albúmina), detergentes, etc. que pueden usarse para facilitar la unión óptima proteína-proteína y/o proteína-ácido nucleico. Un reactivo de este tipo también puede reducir las interacciones no específicas o de fondo de los componentes de reacción. También pueden usarse otros reactivos que mejoran la eficacia del ensayo tales como proteasa, inhibidores, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos y similares.
La mezcla de los materiales de ensayo anteriores se incuba en condiciones mediante las cuales, salvo por la presencia del agente candidato, el polipéptido de FGE se une específicamente a una diana de unión celular, una parte de la misma o análogo de la misma. El orden de adición de componentes, la temperatura de incubación, tiempo de incubación, y otros parámetros del ensayo pueden determinarse fácilmente. Tal experimentación implica simplemente la optimización de los parámetros del ensayo, no la composición fundamental del ensayo. Las temperaturas de incubación son normalmente de entre 4ºC y 40ºC. Los tiempos de incubación se minimizan preferiblemente para facilitar una selección rápida de alto rendimiento, y son normalmente de entre 0,1 y 10 horas.
Tras la incubación, se detecta la presencia o ausencia de unión específica entre el polipéptido de FGE y una o más dianas de unión mediante cualquier método conveniente disponible para el usuario. Para ensayos de tipo de unión libre de células, con frecuencia se usa una etapa de separación para separar componentes unidos de no unidos. La etapa de separación puede lograrse de una variedad de maneras. Convenientemente, al menos uno de los componentes se inmoviliza sobre un sustrato sólido, del que pueden separarse fácilmente los componentes no unidos. El sustrato sólido puede prepararse de una amplia variedad de materiales y en una amplia variedad de formas, por ejemplo, placa de microtitulación, microperla, tira reactiva, partícula de resina, etc. El sustrato se elige preferiblemente para relaciones señal-ruido máximas, principalmente para minimizar la unión de fondo, así como para la facilidad de separación y coste.
La separación puede realizarse, por ejemplo, retirando una perla o tira reactiva de un depósito, vaciando o diluyendo un depósito tal como un pocillo de placa de microtitulación aclarando una perla, partícula, columna cromatográfica o filtro con una disolución de lavado o disolvente. La etapa de separación incluye preferiblemente múltiples aclarados
o lavados. Por ejemplo, cuando el sustrato sólido es una placa de microtitulación, los pocillos pueden lavarse varias veces con una disolución de lavado, que incluye normalmente los componentes de la mezcla de incubación que no participan en uniones específicas tales como sales, tampón, detergente, proteína no específica, etc. Cuando el sustrato sólido es una perla magnética, las perlas pueden lavarse una o más veces con una disolución de lavado y aislarse usando un imán.
Puede realizarse la detección de cualquier manera conveniente para ensayos basados en células tales como selecciones de dos o tres híbridos. El transcrito resultante de un ensayo de transcripción de gen indicador de polipéptido de FGE que interacciona con una molécula diana codifica normalmente para un producto directa o indirectamente detectable, por ejemplo, actividad 1-galactosidasa, actividad luciferasa y similares. Para ensayos de unión libres de células, uno de los componentes comprende habitualmente, o está acoplado a, un marcador detectable. Puede usarse una amplia variedad de marcadores, tales como los que proporcionan detección directa (por ejemplo, radioactividad, luminiscencia, densidad óptica o electrónica, etc.), o detección indirecta (por ejemplo, etiqueta de epítopo tal como el epítopo FLAG, etiqueta enzimática tal como peroxidasa del rábano, etc.). El marcador puede unirse a una pareja de unión a FGE, o incorporarse en la estructura de la pareja de unión.
Puede usarse una variedad de métodos para detectar el marcador, dependiendo de la naturaleza del marcador y otros componentes del ensayo. Por ejemplo, el marcador puede detectarse mientras está unido al sustrato sólido o posteriormente a la separación del sustrato sólido. Pueden detectarse directamente marcadores mediante densidad óptica o electrónica, emisiones radioactivas, transferencias de energía no radiada, etc. o detectarse indirectamente con conjugados de anticuerpo, conjugados de estreptavidina-biotina, etc. En la técnica se conocen bien métodos para detectar los marcadores.
Pueden proporcionarse agentes de unión específicos para FGE, métodos de identificación y preparación de tales agentes, y su uso en diagnóstico, terapia y desarrollo farmacéutico. Por ejemplo los agentes farmacológicos específicos para FGE son útiles en una variedad de aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, especialmente cuando la enfermedad o el pronóstico de la enfermedad está asociado con características de unión a FGE alteradas tales como en deficiencia múltiple de sulfatasas. Agentes de unión específicos para FGE novedosos incluyen anticuerpos específicos para FGE, receptores de superficie celular, y otros agentes de unión naturales intracelulares y extracelulares identificados con ensayos tales como selecciones de dos híbridos, y agentes de unión no naturales intracelulares y extracelulares identificados en exploraciones de bibliotecas químicas y similares.
En general, la especificidad de la unión de FGE a una molécula específica se determina mediante constantes de equilibrio de unión. Las dianas que pueden unirse selectivamente a un polipéptido de FGE tienen preferiblemente constantes de equilibrio de unión de al menos aproximadamente 107 M-1, más preferiblemente al menos aproximadamente 108 M-1, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 109 M-1. Puede usarse una amplia variedad de ensayos basados en células y libres de células para demostrar la unión específica para FGE. Ensayos basados en células incluyen selecciones de uno, dos y tres híbridos, ensayos en los que se inhibe o se incrementa la transcripción mediada por FGE, etc. Ensayos libres de células incluyen ensayos de unión FGE-proteína, inmunoensayos, etc. Otros ensayos útiles para seleccionar agentes que se unen a polipéptidos de FGE incluyen transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (FRET), y análisis de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA).
Puede proporcionarse un método para identificar un agente útil en la modulación de la actividad de generación de Ca-formilglicina. El método implica (a) poner en contacto una molécula que tiene actividad de generación de Ca formilglicina con un agente candidato, (b) medir la actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula, y (c) comparar la actividad de generación de Ca-formilglicina medida de la molécula con un control para determinar si el agente candidato modula la actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula, en el que la molécula es una molécula de ácido nucleico de FGE tal como se describe en el presente documento, o un producto de expresión de la misma. “Poner en contacto” se refiere a poner en contacto tanto directo como indirecto una molécula que tiene actividad de generación de Ca-formilglicina con el agente candidato. Poner en contacto “indirecto” significa que el agente candidato ejerce su efecto sobre la actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula mediante un tercer agente (por ejemplo, una molécula mensajera, un receptor, etc.). En determinadas realizaciones, el control es la actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula medida en ausencia del agente candidato. Los métodos de ensayo y agentes candidatos son tal como se describieron anteriormente en las realizaciones anteriores con respecto a FGE.
Puede proporcionarse un método de diagnóstico de un trastorno caracterizado por una expresión aberrante de una molécula de ácido nucleico, un producto de expresión de la misma, o un fragmento de un producto de expresión de la misma. El método implica poner en contacto una muestra biológica aislada de un sujeto con un agente que se une específicamente a la molécula de ácido nucleico, un producto de expresión de la misma, o un fragmento de un producto de expresión de la misma, y determinar la interacción entre el agente y la molécula de ácido nucleico o el producto de expresión como una determinación del trastorno, en el que la molécula de ácido nucleico es una molécula de FGE tal como se describe en el presente documento. El trastorno es deficiencia múltiple de sulfatasas. Las mutaciones en el gen de FGE que provocan la expresión aberrante de moléculas de FGE da como resultado los siguientes cambios de aminoácido en SEQ ID NO: 2: Met1Arg; Met1Val; Leu20Phe; Ser155Pro; Ala177Pro; Cys218Tyr; Arg224Trp; Asn259De; Pro266Leu; Ala279Val; Arg327Stop; Cys336Arg; Arg345Cys; Ala348Pro; Arg349Gln; Arg349Trp; Arg349Trp; Ser359Stop; o una combinación de los mismos.
En el caso en el que la molécula es una molécula de ácido nucleico, tales determinaciones pueden llevarse a cabo mediante cualquier ensayo de determinación de ácido nucleico convencional, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa, o sometiendo a ensayo con sondas de hibridación marcadas tal como se muestra a modo de ejemplo en el presente documento. En el caso en el que la molécula es un producto de expresión de la molécula de ácido nucleico, o un fragmento de un producto de expresión de la molécula de ácido nucleico, tal determinación puede llevarse a cabo mediante cualquier ensayo inmunológico convencional usando, por ejemplo, anticuerpos que se unen a cualquiera de los productos de expresión de polipéptido.
“Expresión aberrante” se refiere a expresión disminuida (subexpresión) o expresión aumentada (sobreexpresión) de moléculas de FGE (ácidos nucleicos y/o polipéptidos) en comparación con un control (es decir, expresión de la misma molécula en un sujeto sano o “normal”). Un “sujeto sano”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un sujeto que, según patrones médicos convencionales, no tiene ni está en riesgo de desarrollar una deficiencia múltiple de sulfatasas. Los sujetos sanos tampoco muestran de otro modo síntomas de enfermedad. En otras palabras, tales sujetos, si se examinan por un profesional médico, se caracterizarán como sanos y libres de síntomas de una deficiencia múltiple de sulfatasas. Incluyen características de leucodistrofia metacromática y de una mucopolisacaridosis, tales como cantidades aumentadas de mucopolisacáridos ácidos en diversos tejidos, “gargolismo” leve, rápido deterioro neurológico, presencia excesiva de mucopolisacárido y sulfatida en la orina, proteína de líquido cefalorraquídeo aumentada y degeneración metacromática de mielina en nervios periféricos.
Pueden usarse kits novedosos para medir los niveles de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento, o productos de expresión de los mismos.
En una realización, un kit comprende un envase que contiene un agente que se une selectivamente a cualquiera de los ácidos nucleicos aislados de FGE anteriores, o productos de expresión de los mismos, y un control para comparar con un valor medido de unión de dicho agente a cualquiera de los ácidos nucleicos aislados de FGE anteriores o productos de expresión de los mismos. En algunas realizaciones, el control es un valor predeterminado para comparar con el valor medido. En determinadas realizaciones, el control comprende un epítopo del producto de expresión de cualquiera de los ácidos nucleicos aislados de FGE anteriores. En una realización, el kit comprende además un segundo agente que se une selectivamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6, o un péptido de los mismos, y un control para comparar con un valor medido de unión de dicho segundo agente a dicho polipéptido o péptido del mismo.
En el caso de detección de ácido nucleico, pueden incluirse pares de cebadores para amplificar una molécula de ácido nucleico. Los kits preferidos incluirán controles tales como cantidades conocidas de sondas de ácido nucleico, epítopos (tales como iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6, productos de expresión) o anticuerpos anti-epítopo, así como instrucciones u otro material impreso. En determinadas realizaciones el material impreso puede caracterizar el riesgo de desarrollar un estado de deficiencia de sulfatasa basándose en el desenlace del ensayo. Los reactivos pueden envasarse en recipientes y/o recubrirse sobre pocillos en cantidades predeterminadas, y los kits pueden incluir materiales convencionales tales como reactivos inmunológicos marcados (tales como anticuerpos anti-IgG marcados) y similares. Un kit es una placa de microtitulación de poliestireno envasada recubierta con proteína FGE y un recipiente que contiene anticuerpos anti-IgG humana marcados. Se pone en contacto un pocillo de la placa con, por ejemplo, un líquido biológico, se lava y después se pone en contacto con el anticuerpo anti-IgG. Entonces se detecta el marcador. En la figura 25 se ilustra un kit generalmente designado con el número 11. El kit 11 comprende los siguientes elementos principales: un envase 15, un agente 17 tal como se describe en el presente documento, un agente 19 de control e instrucciones 21. El envase 15 es una estructura de tipo caja para contener un vial (o varios viales) que contiene el agente 17, un vial (o varios viales) que contiene un agente 19 de control, e instrucciones 21. Los expertos en la técnica pueden modificar fácilmente el envase 15 para adaptarse a necesidades individuales.
Pueden proporcionarse métodos para tratar deficiencia múltiple de sulfatasas en un sujeto. Un método implica administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento un agente que modula la actividad de generación de Ca formilglicina, en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de generación de Ca-formilglicina en el sujeto. En algunas realizaciones, el método comprende además coadministrar un agente seleccionado del grupo que consiste en una molécula de ácido nucleico que codifica para iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6, un producto de expresión de la molécula de ácido nucleico, y/o un fragmento del producto de expresión de la molécula de ácido nucleico.
“Agentes que modulan la expresión” de un ácido nucleico o un polipéptido, tal como se usa en el presente documento, se conocen en la técnica, y se refieren a ácidos nucleicos sentido y antisentido, ácidos nucleicos negativos dominantes, anticuerpos frente a los polipéptidos, y similares. Cualquier agente que modula la expresión de una molécula (y tal como se describe en el presente documento, modula su actividad) es útil. En determinadas realizaciones, el agente que modula la actividad de generación de Ca-formilglicina es una molécula de ácido nucleico aislada (por ejemplo, un ácido nucleico de SEQ ID NO: 3). En realizaciones importantes, el agente que modula la actividad de generación de Ca-formilglicina es un péptido (por ejemplo, un péptido de SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, el agente que modula la actividad de generación de Ca-formilglicina es un ácido nucleico sentido.
Puede proporcionarse un método para aumentar la actividad de generación de Ca-formilglicina en un sujeto. El método implica administrar una molécula de ácido nucleico de FGE aislada descrita en el presente documento, y/o un producto de expresión de la misma, a un sujeto, en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de generación de Ca-formilglicina en el sujeto.
Puede proporcionarse un método para aumentar la actividad de generación de Ca-formilglicina en una célula. El método implica poner en contacto la célula con una molécula de ácido nucleico aislada (por ejemplo, un ácido nucleico de SEQ ID NO: 1), o un producto de expresión de la misma (por ejemplo, un péptido de SEQ ID NO: 2), en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de generación de Ca-formilglicina en la célula. En realizaciones importantes, el método implica activar el gen de FGE endógeno para aumentar la actividad de generación de Ca formilglicina en la célula.
En cualquiera de las realizaciones anteriores el ácido nucleico puede estar operativamente acoplado a una secuencia de expresión génica que dirige la expresión de la molécula de ácido nucleico dentro de una célula eucariota tal como una célula HT-1080. La “secuencia de expresión génica” es cualquier secuencia de nucleótidos reguladora, tal como una secuencia promotora o combinación promotor-potenciador, lo que facilita la transcripción y traducción eficaces del ácido nucleico al que está operativamente unida. La secuencia de expresión génica puede ser, por ejemplo, un promotor de mamífero o de virus, tal como un promotor constitutivo o inducible. Promotores de mamífero constitutivos incluyen, pero no se limitan a, los promotores para los siguientes genes: hipoxantina fosforibosil transferasa (HFTR), adenosina desaminasa, piruvato cinasa, promotor de a-actina y otros promotores constitutivos. Promotores de virus a modo de ejemplo que funcionan constitutivamente en células eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores del virus del simio, virus del papiloma, adenovirus, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus del sarcoma de Rous, citomegalovirus, las repeticiones terminales largas (LTR) de virus de leucemia de Moloney y otros retrovirus, y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Otros promotores constitutivos los conocen los expertos habituales en la técnica. Los promotores útiles como secuencias de expresión génica también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles se activan en presencia de un agente de inducción. Por ejemplo, el promotor de metalotioneína se activa para aumentar la transcripción y traducción en presencia de determinados iones metálicos. Otros promotores inducibles los conocen los expertos habituales en la técnica.
En general, la secuencia de expresión génica incluirá, según sea necesario, secuencias no transcritas en 5’ y no traducidas en 5’ que participan en la iniciación de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como una caja TATA, secuencia de ocupación, secuencia CAAT y similares. Especialmente, tales secuencias no transcritas en 5’ incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional de ácido nucleico operativamente unido. Las secuencias de expresión génica incluyen opcionalmente secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en sentido 5’ según se desee.
Preferiblemente, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de FGE descritas en el presente documento está unida a una secuencia de expresión génica que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula de un linaje celular específico, por ejemplo, una neurona. Una secuencia que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula tal como una neurona, es una que es selectivamente activa en un tipo celular de este tipo, provocando así la expresión de la molécula de ácido nucleico en esas células. El promotor de sinapsina 1, por ejemplo, puede usarse para expresar cualquiera de las moléculas de ácido nucleico anteriores de la invención en una neurona; y el promotor del gen del factor de von Willebrand, por ejemplo, puede usarse para expresar una molécula de ácido nucleico en una célula endotelial vascular. Los expertos habituales en la técnica podrán identificar fácilmente promotores alternativos que pueden expresar una molécula de ácido nucleico en cualquiera de las células preferidas.
Se dice que la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de expresión génica están “operativamente unidas” cuando están unidas covalentemente de tal manera que se coloca la transcripción y/o traducción de la secuencia codificante de ácido nucleico (por ejemplo, en el caso de FGE, SEQ ID NO: 3) bajo la influencia o el control de la secuencia de expresión génica. Si se desea que la secuencia de ácido nucleico se traduzca en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están operativamente unidas si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión génica en 5’ da como resultado la transcripción de la secuencia de ácido nucleico y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de cambio de marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia de ácido nucleico, y/o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente para traducirse en una proteína. Por tanto, una secuencia de expresión génica estará operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico si la secuencia de expresión génica puede realizar la transcripción de esa secuencia de ácido nucleico de tal manera que el transcrito resultante pueda traducirse en la proteína o polipéptido deseado.
Las moléculas descritas en el presente documento pueden suministrarse a los tipos de célula preferidos solas o en asociación con un vector (véase también la explicación anterior sobre vectores). En su sentido más amplio (y de manera coherente con la descripción de vectores de expresión y de direccionamiento en otra parte en el presente documento), un “vector” es cualquier vehículo que puede facilitar: (1) el suministro de una molécula a una célula diana y/o (2) la captación de la molécula por una célula diana. Preferiblemente, los vectores de suministro transportan la molécula al interior de la célula diana con degradación reducida con respecto al grado de degradación que resultaría en ausencia del vector. Opcionalmente, puede fijarse un “ligando de direccionamiento” al vector para suministrar selectivamente el vector a una célula que expresa sobre su superficie el receptor relacionado para el ligando de direccionamiento. De esta manera, el vector (que contiene un ácido nucleico o una proteína) puede suministrarse selectivamente a una neurona. Metodologías para el direccionamiento incluyen conjugados, tales como los descritos en la patente estadounidense 5.391.723 concedida a Priest. Otro ejemplo de un vehículo de direccionamiento bien conocido es un liposoma. Hay liposomas comercialmente disponibles de Gibco BRL. Están publicados numerosos métodos para preparar liposomas de direccionamiento.
En general, vectores útiles incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos, virus, otros vehículos derivados de cepas virales o bacterianas que se han manipulado mediante la inserción o incorporación de las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento, y fragmentos de ácido nucleico adicionales (por ejemplo, potenciadores, promotores) que pueden fijarse a las secuencias de ácido nucleico. Vectores virales son un tipo preferido de vector e incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: adenovirus; virus adenoasociado; retrovirus, tales como virus de leucemia murina de Moloney; virus del sarcoma murino de Harvey; virus de tumor de mama murino; virus del sarcoma de Rouse; virus de tipo SV40; virus del polioma; virus de Epstein-Barr; virus del papiloma; virus del herpes; virus vaccinia; virus de la polio; y virus de ARN tales como un retrovirus. Pueden emplearse fácilmente otros vectores no mencionados pero conocidos en la técnica.
Un virus particularmente preferido para determinadas aplicaciones es el virus adenoasociado, un virus de ADN bicatenario. El virus adenoasociado puede infectar una amplia gama de tipos de células y especies y puede diseñarse mediante ingeniería para ser deficiente para la replicación. Además tiene ventajas, tales como estabilidad al calor y disolventes lipídicos, altas frecuencias de transducción en células de diversos linajes, incluyendo células hematopoyéticas, y falta de inhibición de superinfección permitiendo por tanto múltiples series de transducciones. Se notifica que el virus adenoasociado puede integrarse en el ADN celular humano de una manera específica del sitio, minimizando así la posibilidad de mutagénesis por inserción y variabilidad de la expresión del gen insertado. Además, se ha realizado un seguimiento de infecciones por virus adenoasociado de tipo natural en cultivo tisular durante más de 100 pasos en ausencia de presión selectiva, lo que supone que la integración genómica del virus adenoasociado es un acontecimiento relativamente estable. El virus adenoasociado también puede funcionar de una manera extracromosómica.
En general, otros vectores virales preferidos se basan en virus eucariotas no citopáticos en los que se han sustituido genes no esenciales por el gen de interés. Virus no citopáticos incluyen retrovirus, cuyo ciclo de vida implica la transcripción inversa de ARN viral genómico para dar ADN con la posterior integración proviral en el ADN celular huésped. Se han aprobado adenovirus y retrovirus para ensayos de terapia génica en seres humanos. En general, los retrovirus son deficientes para la replicación (es decir, pueden dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero son incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Tales vectores de expresión retrovirales genéticamente alterados tienen utilidad general para la transducción de alta eficacia de genes in vivo. Se proporcionan protocolos convencionales para producir retrovirus deficientes para la replicación (incluyendo las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una línea celular de empaquetamiento con plásmido, producción de retrovirus recombinantes mediante la línea celular de empaquetamiento, recogida de partículas virales a partir de medios de cultivo tisular, e infección de las células diana con partículas virales) en Kriegler, M., “Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual”, W.H. Freeman C.O., Nueva York (1990) y Murry, E.J. Ed. “Methods in Molecular Biology”, vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, Nueva Jersey (1991).
Otro vector retroviral preferido es el vector derivado de virus de leucemia murina de Moloney, tal como se describe Nabel, E.G., et al., Science, 1990, 249:1285-1288. Se notifica que estos vectores fueron eficaces para el suministro de genes a las tres capas de la pared arterial, incluyendo la media. Otros vectores preferidos se dan a conocer en Flugelman, et al., Circulation, 1992, 85:1110-1117. Vectores adicionales que son útiles para suministrar moléculas se describen en la patente estadounidense n.º 5.674.722 de Mulligan, et al.
Además de los vectores anteriores, pueden usarse otros métodos de suministro para suministrar una molécula descrita en el presente documento a una célula tal como una neurona, célula hepática, fibroblasto y/o endotelial vascular, y facilitar la captación por la misma.
Un método de suministro de este tipo preferido es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen sistemas basados en lípidos incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido es un liposoma. Los liposomas son vasos de membrana artificiales que son útiles como vector de suministro in vivo o in vitro. Se ha mostrado que vasos unilamelares grandes (LUV), cuyo tamaño oscila entre 0,2 y 4,0 Om pueden encapsular macromoléculas grandes. Pueden encapsularse ARN, ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y suministrarse a células en una forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 1981, 6:77). Con el fin de que un liposoma sea un vector de transferencia génica eficaz, debe estar presente una o más de las siguientes características: (1) encapsulación del gen de interés con alta eficacia con retención de actividad biológica; (2) unión preferible y sustancial a una célula diana en comparación con células no diana; (3) suministro del contenido acuoso de la vesícula al citoplasma de la célula diana con alta eficacia; y (4) expresión precisa y eficaz de la información genética.
Pueden dirigirse liposomas a un tejido particular, tal como el miocardio o la pared de células vasculares, acoplando el liposoma a un ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido o proteína. Ligandos que pueden ser útiles para dirigir un liposoma a la pared vascular incluyen, pero no se limitan a, la proteína vírica de la cubierta del virus hemaglutinante de Japón. Adicionalmente, el vector puede acoplarse a un péptido de direccionamiento nuclear, que dirigirá el ácido nucleico al núcleo de la célula huésped.
Hay liposomas comercialmente disponibles de Gibco BRL, por ejemplo, como LIPOFECTIN™ y LIPOFECTACE™, que están formados por lípidos catiónicos tales como cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) y bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB). Métodos para preparar liposomas se conocen bien en la técnica y se han descrito en muchas publicaciones. También se han revisado liposomas por Gregoriadis, G. En Trends in Biotechnology. V. 3, págs. 235-241 (1985). También se describen liposomas novedosos para el suministro intracelular de macromoléculas, incluyendo ácidos nucleicos, en la solicitud internacional PCT n.º PCT/US96/07572 (publicación n.º WO 96/40060, titulada “Intracellular Delivery of Macromolecules”).
En una realización particular, el vehículo preferido es un implante o micropartícula biocompatible que es adecuado para su implantación en el receptor mamífero. Implantes bioerosionables a modo de ejemplo que son útiles según este método se describen en la solicitud internacional PCT n.º PCT/LUS/03307 (publicación n.º WO 95/24929, titulada “Polymeric Gene Delivery System”, que reivindica prioridad de la solicitud de patente estadounidense con n.º de serie 213.668, presentada el 15 de marzo de 1994). El documento PCT/US/0307 describe una matriz polimérica biocompatible, preferiblemente biodegradable para contener un gen exógeno bajo el control de un promotor apropiado. La matriz polimérica se usa para lograr un pliegue sostenido del gen exógeno en el paciente. Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden encapsularse o dispersarse dentro de la matriz polimérica biocompatible, preferiblemente biodegradable dada a conocer en el documento PCT/US/03307. La matriz polimérica está preferiblemente en forma de una micropartícula tal como una microesfera (en la que un ácido nucleico se dispersa por la totalidad de una matriz polimérica sólida) o una microcápsula (en la que un ácido nucleico está almacenado en el núcleo de una carcasa polimérica). Otras formas de matriz polimérica para contener los ácidos nucleicos incluyen películas, recubrimientos, geles, implantes y endoprótesis. El tamaño y la composición del dispositivo de matriz polimérica se seleccionan para dar como resultado una cinética de liberación favorable en el tejido en el que se implanta el dispositivo de matriz. El tamaño del dispositivo de matriz polimérica se selecciona además según el método de suministro que va a usarse, normalmente inyección en un tejido o administración de una suspensión mediante aerosol en las zonas nasal y/o pulmonar. La composición de matriz polimérica puede seleccionarse para que tenga tanto tasas de degradación favorables como también para estar formada por un material que es bioadhesivo, para aumentar adicionalmente la eficacia de transferencia cuando se administra el dispositivo a una superficie vascular. La composición de matriz también puede seleccionarse para no degradarse, sino más bien liberar mediante difusión a lo largo de un periodo de tiempo extendido.
Pueden usarse matrices poliméricas tanto biodegradables como no biodegradables para suministrar los ácidos nucleicos al sujeto. Se prefieren matrices biodegradables. Tales polímeros pueden ser polímeros naturales o sintéticos. Se prefieren polímeros sintéticos. El polímero se selecciona basándose en el periodo de tiempo a lo largo del cual se desea la liberación, generalmente en el orden de algunas horas a un año o más. Normalmente, la liberación a lo largo de un periodo que oscila entre algunas horas y de tres a doce meses es lo más deseable. El polímero está opcionalmente en forma de un hidrogel que puede absorber hasta aproximadamente el 90% de su peso en agua y más, opcionalmente está reticulado con iones de múltiples valencias u otros polímeros.
En general, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden suministrarse usando el implante bioerosionable mediante difusión, o más preferiblemente, mediante degradación de la matriz polimérica. Polímeros sintéticos a modo de ejemplo que pueden usarse para formar el sistema de suministro biodegradable incluyen: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicoles, poli(óxidos de alquileno), poli(tereftalatos de alquileno), poli(alcoholes vinílicos), poliviniléteres, poli(ésteres vinílicos), poli(haluros de vinilo), polivinilpirrolidona, poliglicolidos, polisiloxanos, poliuretanos y copolímeros de los mismos, alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitrocelulosas, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hipromelosa, hidroxibutilmetilcelulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato-butirato de celulosa, acetato-ftalato de celulosa, carboxiletilcelulosa, triacetato de celulosa, sal sódica de sulfato de celulosa, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli (metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli(acrilato de octadecilo), polietileno, polipropileno, polietilenglicol, poli(óxido de etileno), poli(tereftalato de etileno), poli(alcoholes vinílicos), poli(acetato de vinilo), poli(cloruro de vinilo), poliestireno y polivinilpirrolidona.
Ejemplos de polímeros no biodegradables incluyen etileno-acetato de vinilo, poli(ácido (met)acrílico), poliamidas, copolímeros y mezclas de los mismos.
Ejemplos de polímeros biodegradables incluyen polímeros sintéticos tales como polímeros de ácido láctico y ácido glicólico, polianhídridos, poli(orto)ésteres, poliuretanos, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), y poli(lactida-cocaprolactona), y polímeros naturales tales como alginato y otros polisacáridos incluyendo dextrano y celulosa, colágeno, derivados químicos de los mismos (sustituciones, adiciones de grupos químicos, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones y otras modificaciones realizadas de manera rutinaria por los expertos en la técnica), albúmina y otras proteínas hidrófilas, zeína y otras prolaminas y proteínas hidrófobas, copolímeros y mezclas de los mismos. En general, estos materiales se degradan o bien mediante hidrólisis enzimática o bien mediante exposición a agua in vivo, mediante erosión superficial o en masa.
Polímeros bioadhesivos de interés particular incluyen hidrogeles bioerosionables descritos por H.S. Sawhney, C.P. Pathak y J.A. Hubell en Macromolecules, 1993, 26, 581-587, cuyas enseñanzas se incorporan en el presente documento, poli(ácidos hialurónicos), caseína, gelatina, glutina, polianhídridos, poli(ácido acrílico), alginato, quitosano, poli(metacrilatos de metilo), poli(metacrilatos de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo) poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo) y poli(acrilato de octadecilo). Por tanto, puede proporcionarse lo siguiente: una composición de las moléculas descritas anteriormente para su uso como medicamento, métodos para preparar el medicamento y métodos para la liberación sostenida del medicamento in vivo.
También pueden usarse agentes de compactación en combinación con un vector. Un “agente de compactación”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un agente, tal como una histona, que neutraliza las cargas negativas en el ácido nucleico y por tanto permite la compactación del ácido nucleico en un gránulo fino. La compactación del ácido nucleico facilita la captación del ácido nucleico por la célula diana. Los agentes de compactación pueden usarse solos, es decir, para suministrar un ácido nucleico aislado tal como se describe en el presente documento en una forma que se capta más eficazmente por la célula o, más preferiblemente, en combinación con uno o más de los vectores descritos anteriormente.
Otras composiciones a modo de ejemplo que pueden usarse para facilitar la captación por una célula diana de los ácidos nucleicos incluyen fosfato de calcio y otros mediadores químicos de transporte intracelular, composiciones de microinyección y electroporación.
Pueden proporcionarse métodos para aumentar la actividad sulfatasa en una célula. Tales métodos implican poner en contacto una célula que expresa una sulfatasa con una molécula de ácido nucleico aislada tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico aislada tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, una molécula de ácido nucleico de FGE que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, 3, 4, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 y 80-87), o un producto de expresión de la misma (por ejemplo, un polipéptido tal como se reivindica en las reivindicaciones 11-15, 19, 20, o un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78), en una cantidad eficaz para aumentar la actividad sulfatasa en la célula. “Aumentar” la actividad sulfatasa, tal como se usa en el presente documento, se refiere a aumentar la afinidad por, y/o conversión de, el sustrato específico para la sulfatasa, normalmente el resultado de un aumento en la formación de FGly en la molécula de sulfatasa. En una realización, la célula expresa una sulfatasa a niveles superiores a los de células de tipo natural. Por “aumentar la actividad sulfatasa en una célula” también se refiere a aumentar la actividad de una sulfatasa que se secreta por la célula. La célula puede expresar una sulfatasa endógena y/o exógena. Dicho poner en contacto la molécula de FGE también se refiere a activar el gen de FGE endógeno de las células. En realizaciones importantes, se activa la sulfatasa endógena. En determinadas realizaciones, la sulfatasa es iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1. HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y/o HSulf-6. En determinadas realizaciones la célula es una de mamífero.
Puede proporcionarse una composición farmacéutica. La composición puede comprender una sulfatasa que se produce por una célula, en una cantidad farmacéuticamente eficaz para tratar una deficiencia de sulfatasa, y un portador farmacéuticamente aceptable. En el presente documento dicha célula se ha puesto en contacto con un agente que comprende una molécula de ácido nucleico aislada tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, tal como se reivindica en las reivindicaciones 1-8, o un ácido nucleico tal como se reivindica en las reivindicaciones 1-8, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, 3, 4, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 y 80-87), o un producto de expresión de la misma (por ejemplo, un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78). En realizaciones importantes, la sulfatasa se expresa a niveles superiores que en células normales/control.
También puede proporcionarse una célula que produce sulfatasa; en la que se aumenta la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida por la célula. La célula comprende: (i) una sulfatasa con una actividad aumentada en comparación con un control, y (ii) una enzima generadora de formilglicina con una actividad aumentada en comparación con un control, en la que la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida por la célula se aumenta en al menos el 5% con respecto a la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida por la célula en ausencia de la enzima generadora de formilglicina. Se conoce en la técnica que la sobreexpresión de sulfatasas puede disminuir la actividad de sulfatasas endógenas (Anson et al., Biochem. J., 1993, 294:657-662). Además, sólo una fracción de las sulfatasas recombinantes es activa. Se ha descubierto, inesperadamente, que la expresión/actividad aumentada de FGE en una célula con expresión/actividad aumentada de una sulfatasa da como resultado la producción de una sulfatasa que es más activa. Dado que la presencia de FGly en una molécula de sulfatasa está asociada con actividad sulfatasa, puede cuantificarse la “sulfatasa activa” determinando la presencia de FGly en el producto celular de sulfatasa usando espectrometría de masas MALDI-TOF, tal como se describe en otra parte en el presente documento. Entonces puede determinarse fácilmente la razón con respecto a sulfatasa total.
Pueden proporcionarse métodos para el diagnóstico y la terapia de deficiencias de sulfatasa. Tales trastornos incluyen, pero no se limitan a, deficiencia múltiple de sulfatasas, mucopolisacaridosis II (MPS II; síndrome de Hunter), mucopolisacaridosis IIIA (MPS IIIA; síndrome de Sanfilippo A), mucopolisacaridosis VIII (MPS VIII), mucopolisacaridosis IVA (MPS IVA; síndrome de Morquio A), mucopolisacaridosis VI (MPS VI; síndrome de Maroteaux-Lamy), leucodistrofia metacromática (MLD), condrodisplasia punctata I recesiva ligada al cromosoma X e ictiosis ligada al cromosoma X (deficiencia de sulfatasa esteroidea).
Los métodos son útiles en el tratamiento tanto agudo como profiláctico de cualquiera de los estados anteriores. Tal como se usa en el presente documento, un tratamiento agudo se refiere al tratamiento de sujetos que tienen un estado particular. El tratamiento profiláctico se refiere al tratamiento de sujetos con riesgo de tener el estado, pero que actualmente no tienen o experimentan los síntomas del estado.
En su sentido más amplio, los términos “tratamiento” o “tratar” se refieren a tratamientos tanto agudos como profilácticos. Si el sujeto que necesita tratamiento está experimentando un estado (o tiene o está teniendo un estado particular), entonces tratar el estado se refiere a mejorar, reducir o eliminar el estado o uno o más síntomas que surgen del estado. En algunas realizaciones preferidas, tratar el estado se refiere a mejorar, reducir o eliminar un síntoma específico o un subconjunto específico de síntomas asociados con el estado. Si el sujeto que necesita tratamiento es uno que está en riesgo de desarrollar un estado, entonces tratar al sujeto se refiere a reducir el riesgo del sujeto de desarrollar el estado.
El modo de administración y la dosificación de un agente terapéutico variarán con el estadio particular del estado que está tratándose, la edad y la condición física del sujeto que está tratándose, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), la vía específica de administración, y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional sanitario.
Tal como se describe en el presente documento, pueden administrarse agentes terapéuticos en cantidades eficaces para tratar cualquiera de las deficiencias de sulfatasa anteriores. En general, una cantidad eficaz es cualquier cantidad que puede provocar un cambio beneficioso en un tejido deseado de un sujeto. Preferiblemente, una cantidad eficaz es la cantidad suficiente para provocar un cambio fenotípico favorable en un estado particular tal como una reducción, alivio o eliminación de un síntoma o de un estado en su totalidad.
En general, una cantidad eficaz es la cantidad de una preparación farmacéutica que sola, o junto con dosis adicionales, produce la respuesta deseada. Esto puede suponer sólo ralentizar la progresión del estado temporalmente, aunque más preferiblemente, implica detener la progresión del estado permanentemente o retrasar la aparición de, o prevenir que se produzca, el estado. Esto puede monitorizarse mediante métodos rutinarios. Generalmente, las dosis de compuestos activos serán de desde aproximadamente 0,01 mg/kg al día hasta 1000 mg/kg al día. Se espera que dosis que oscilan entre 50 Og y 500 mg/kg serán adecuadas, preferiblemente por vía oral y en una o varias administraciones al día.
Tales cantidades dependerán, por supuesto, del estado particular que está tratándose, la gravedad del estado, los parámetros del paciente individual incluyendo edad, condición física, tamaño y peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional sanitario. Dosis inferiores resultarán de determinadas formas de administración, tales como administración intravenosa. En el caso de que una respuesta en un sujeto sea insuficiente a las dosis iniciales aplicadas, pueden emplearse dosis superiores (o dosis eficazmente superiores mediante una vía de administración diferente, más localizada) hasta el grado que lo permita la tolerancia del paciente. Se contemplan múltiples dosis al día para lograr niveles sistemáticos apropiados de compuestos. Se prefiere generalmente que se use una dosis máxima, es decir, la dosis segura más alta según criterio médico sensato. Sin embargo, los expertos habituales en la técnica entenderán que un paciente puede insistir en una dosis inferior o dosis tolerable por motivos médicos, motivos psicológicos o por prácticamente cualquier otro motivo.
Los agentes descritos en el presente documento pueden combinarse, opcionalmente, con un portador farmacéuticamente aceptable para formar una preparación farmacéutica. La expresión “portador farmacéuticamente aceptable” tal como se usa en el presente documento significa una o más cargas, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidas o líquidas compatibles, que son adecuadas para su administración en un ser humano. El término “portador” representa un componente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el principio activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también pueden estar entremezclados con las moléculas descritas en el presente documento, y entre sí, de una manera tal que no hay interacción que afectaría sustancialmente a la eficacia farmacéutica deseada. En algunos aspectos, las preparaciones farmacéuticas comprenden un agente tal como se describe en el presente documento en una cantidad eficaz para tratar un trastorno.
Las preparaciones farmacéuticas pueden contener agentes de tamponamiento adecuados, incluyendo: ácido acético en una sal; ácido cítrico en una sal; ácido bórico en una sal; o ácido fosfórico en una sal. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener, opcionalmente, conservantes adecuados, tales como: cloruro de benzalconio; clorobutanol; parabenos o timerosal.
Hay una variedad de vías de administración disponibles. El modo particular seleccionado dependerá, por supuesto, del fármaco particular seleccionado, la gravedad del estado que está tratándose y la dosificación requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos descritos en el presente documento, de manera general, pueden ponerse en práctica usando cualquier modo de administración que es médicamente aceptable, lo que significa cualquier modo que produce niveles eficaces de los compuestos activos sin provocar efectos adversos clínicamente inaceptables. Tales modos de administración incluyen vías oral, rectal, tópica, nasal, intradérmica, transdérmica o parenteral. El término “parenteral” incluye subcutáneo, intravenoso, intraomental, intramuscular o infusión. Las vías intravenosa o intramuscular no son particularmente adecuadas para profilaxis y terapia a largo plazo. Como ejemplo, pueden formularse composiciones farmacéuticas para el tratamiento agudo de sujetos que tienen una cefalea de tipo migraña de una variedad de formas diferentes y para una variedad de modos de administración incluyendo comprimidos, cápsulas, polvos, supositorios, inyecciones y pulverizaciones nasales.
Las preparaciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de poner el principio activo en asociación con un portador que constituye uno o más componentes auxiliares. En general, las composiciones se preparan poniendo de manera uniforme e íntima el compuesto activo en asociación con un portador líquido, un portador sólido finamente dividido o ambos, y después, si es necesario, conformando el producto.
Pueden presentarse composiciones adecuadas para su administración oral como unidades diferenciadas, tales como cápsulas, comprimidos, pastillas para chupar, conteniendo cada una cantidad predeterminada del compuesto activo. Otras composiciones incluyen suspensiones en líquidos acuosos o líquidos no acuosos tales como un jarabe, elixir o una emulsión.
Las composiciones adecuadas para su administración parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa estéril de un agente descrito en el presente documento, que es preferiblemente isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación acuosa puede formularse según métodos conocidos usando agentes de dispersión y humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una suspensión o disolución inyectable estéril en un disolvente o diluyente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, disolución de Ringer y disolución de cloruro de sodio isotónica. Además, se emplean convencionalmente aceites estériles fijos como medio disolvente o de suspensión. Con este fin puede emplearse cualquier aceite fijo suave incluyendo mono o di-glicéridos sintéticos. Además, pueden usarse ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de productos inyectables. Pueden encontrarse formulaciones adecuadas para administraciones oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc. en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.
Puede proporcionarse un método para aumentar la actividad de generación de Ca-formilglicina en una célula. El método implica poner en contacto la célula con una molécula de ácido nucleico aislada (por ejemplo, un ácido nucleico de SEQ ID NO: 1), o un producto de expresión de la misma (por ejemplo, un péptido de SEQ ID NO: 2), en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de generación de Ca-formilglicina en la célula. En realizaciones importantes, el método implica activar el gen de FGE endógeno para aumentar la actividad de generación de Ca formilglicina en la célula. En algunas realizaciones, la puesta en contacto se realiza en condiciones que permiten la entrada de una molécula en la célula.
La expresión “permitir la entrada” de una molécula en una a célula tiene los siguientes significados dependiendo de la naturaleza de la molécula. Para un ácido nucleico aislado pretende describir la entrada del ácido nucleico a través de la membrana celular y en el núcleo de la célula, tras lo cual el “transgén de ácido nucleico” puede usar la maquinaria de la célula para producir polipéptidos funcionales codificados por el ácido nucleico. Por “transgén de ácido nucleico” se pretende describir todos los ácidos nucleicos descritos en el presente documento con o sin los vectores asociados. Para un polipéptido, se pretende describir la entrada del polipéptido a través de la membrana celular y al interior del citoplasma celular, y si es necesario, el uso de la maquinaria citoplasmática de la célula para modificar funcionalmente el polipéptido (por ejemplo, para dar una forma activa).
Pueden emplearse diversas técnicas para introducir ácidos nucleicos en células, dependiendo de si los ácidos nucleicos se introducen in vitro o in vivo en un huésped. Tales técnicas incluyen transfección de precipitados de ácido nucleico-CaPO4, transfección de ácidos nucleicos asociados con DEAE, transfección con un retrovirus que incluye el ácido nucleico de interés, transfección mediada por liposoma y similares. Para determinados usos, se prefiere dirigir el ácido nucleico a células particulares. En tales casos, un vehículo usado para suministrar un ácido nucleico al interior de una célula (por ejemplo, un retrovirus, u otro virus; un liposoma) puede tener una molécula de direccionamiento unida al mismo. Por ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana superficial en la célula diana o un ligando para un receptor en la célula diana puede unirse al, o incorporarse dentro del, vehículo de suministro de ácido nucleico. Por ejemplo, cuando se emplean liposomas para suministrar los ácidos nucleicos, pueden incorporarse proteínas que se unen a una proteína de membrana superficial asociada con la endocitosis en la formulación de liposoma para dirigir y/o para facilitar la captación. Tales proteínas incluyen proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas tróficos para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización en la ciclación, proteínas que seleccionan como diana una ubicación intracelular y potencian la semivida intracelular, y similares. También se han usado satisfactoriamente sistemas de suministro poliméricos para suministrar ácidos nucleicos al interior de células, tal como conocen los expertos en la técnica. Tales sistemas permiten incluso la administración oral de ácidos nucleicos.
Otros sistemas de suministro pueden incluir sistemas de suministro de liberación en el tiempo, liberación retrasada o liberación sostenida. Tales sistemas pueden evitar administraciones repetidas de un agente tal como se describe en el presente documento, aumentando la conveniencia para el sujeto y el médico. Hay muchos tipos de sistemas de suministro de liberación disponibles y los conocen los expertos habituales en la técnica. Incluyen sistemas basados en polímero tales como poli(lactida-glicolida), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, poli(ácido hidroxibutírico) y polianhídridos. Se describen microcápsulas de los polímeros anteriores que contienen fármacos, por ejemplo, en la patente estadounidense 5.075.109. Los sistemas de suministro también incluyen sistemas no poliméricos que son: lípidos incluyendo esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono di y tri-glicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; recubrimientos de cera; comprimidos sometidos a compresión usando aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fundidos; y similares. Ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas de erosión en los que un agente tal como se describe en el presente documento está contenido en una forma dentro de una matriz tal como se describe en las patentes estadounidenses n.os 4.452.775,
4.675.189 y 5.736.152, y (b) sistemas de difusión en los que un componente activo penetra a una tasa controlada desde un polímero tal como se describe en las patentes estadounidenses n.os 3.854.480, 5.133.974 y 5.407.686. Además, pueden usarse sistemas de suministro de hardware basados en bombas, algunos de los cuales están adaptados para su implantación.
El uso de un implante de liberación sostenida a largo plazo puede ser deseable. La liberación a largo plazo, tal como se usa en el presente documento, significa que el implante se construye y dispone para suministrar niveles terapéuticos del principio activo durante al menos 30 días, y preferiblemente 60 días. Los expertos habituales en la técnica conocen bien implantes de liberación sostenida a largo plazo e incluyen algunos de los sistemas de liberación descritos anteriormente. Ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, implantes de liberación sostenida a largo plazo descritos en la patente estadounidense n.º 4.748.024, y la patente canadiense n.º 1330939.
Puede realizarse la administración, y en algunas realizaciones la coadministración de agentes distintos de las moléculas de FGE descritas en el presente documento que cuando se administran en cantidades eficaces pueden actuar de manera cooperativa, aditiva o sinérgica con una molécula tal como se describe en el presente documento para: (i) modular la actividad de generación de Ca-formilglicina, y (ii) tratar cualquiera de los estados en los que participa la actividad de generación de Ca-formilglicina de una molécula de la invención (por ejemplo, una deficiencia de sulfatasa incluyendo MSD). Agentes distintos de las moléculas de FGE incluyen iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 o HSulf-6, (ácidos nucleicos y polipéptidos, y/o fragmentos de los mismos), y/o combinaciones de los mismos.
“Coadministrar”, tal como se usa en el presente documento se refiere a administrar simultáneamente dos o más compuestos tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un ácido nucleico y/o polipéptido de FGE, y un agente que se sabe que es beneficioso en el tratamiento de, por ejemplo, una deficiencia de sulfatasa (por ejemplo, iduronato 2-sulfatasa en el tratamiento de MPSII)), como mezcla en una única composición, o secuencialmente, lo bastante próximos en el tiempo para que los compuestos puedan ejercer un efecto aditivo o incluso sinérgico.
Pueden proporcionarse matrices de moléculas de ácido nucleico en fase sólida. La matriz puede consistir esencialmente en un conjunto de moléculas de ácido nucleico, productos de expresión de las mismas, o fragmentos (o bien del ácido nucleico o bien de la molécula de polipéptido) de los mismos, seleccionándose cada molécula de ácido nucleico del grupo que consiste en FGE, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuif-5 y HSulf-6, fijado a un sustrato sólido. En algunas realizaciones, la matriz en fase sólida comprende además al menos una molécula de ácido nucleico de control. En determinadas realizaciones, el conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o incluso al menos cinco moléculas de ácido nucleico, seleccionándose cada una del grupo que consiste en FGE, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, Nacetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6. En realizaciones preferidas, el conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende un número máximo de 100 moléculas de ácido nucleico diferentes. En realizaciones importantes, el conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende un número máximo de 10 moléculas de ácido nucleico diferentes.
Puede usarse una técnica de hibridación convencional de tecnología de micromatrices para evaluar patrones de expresión de ácido nucleico e identificar la expresión de ácido nucleico. La tecnología de micromatriz, que también se conoce por otros nombres incluyendo: tecnología de chip de ADN, tecnología de chip génico y tecnología de red de ácido nucleico en fase sólida, la conocen bien los expertos habituales en la técnica y se basa en, pero no se limita a, obtener una matriz de sondas de ácido nucleico identificadas (por ejemplo, moléculas descritas en otra parte en el presente documento tales como de FGE, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa P, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5, y/o HSulf-6) sobre un sustrato fijo, marcar moléculas diana con moléculas indicadoras (por ejemplo, etiquetas radioactivas, quimioluminiscentes o fluorescentes tales como fluoresceína, Cye3-dLTTP o Cye5-dUTP), hibridar ácidos nucleicos diana con las sondas, y evaluar la hibridación diana-sonda. En general, una sonda con una secuencia de ácido nucleico que corresponde perfectamente con la secuencia diana dará como resultado la detección de una señal de molécula indicadora más fuerte que sondas con correspondencias menos perfectas. Se presentan muchos componentes y técnicas usadas en la tecnología de micromatriz de ácido nucleico en The Chipping Forecast, Nature Genetics, Vol. 21, enero de 1999.
Los sustratos de micromatriz pueden incluir, pero no se limitan a, vidrio, sílice, aluminosilicatos, borosilicatos, óxidos metálicos tales como alúmina y óxido de níquel, diversas arcillas, nitrocelulosa o nailon. En todas las realizaciones se prefiere un sustrato de vidrio. Pueden seleccionarse sondas del grupo de ácidos nucleicos incluyendo, pero sin limitarse a: ADN, ADN genómico, ADNc, y oligonucleótidos; y pueden ser naturales o sintéticas. Las sondas de oligonucleótidos son preferiblemente oligonucleótidos de 20 a 25 meros y las sondas de ADN/ADNc tienen preferiblemente de 500 a 5000 bases de longitud, aunque pueden usarse otras longitudes. Un experto habitual en la técnica puede determinar una longitud de sonda apropiada siguiendo procedimientos conocidos en la técnica. En una realización, sondas preferidas son conjuntos de dos o más de las moléculas de ácido nucleico expuestas como SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 10 y/o 12. Pueden purificarse sondas para eliminar contaminantes usando métodos convencionales conocidos por los expertos habituales en la técnica tales como filtración en gel o precipitación.
En una realización, puede recubrirse el sustrato de micromatriz con un compuesto para potenciar la síntesis de la sonda sobre el sustrato. Tales compuestos incluyen, pero no se limitan a, oligoetilenglicoles. En otra realización, pueden usarse grupos o agentes de acoplamiento sobre el sustrato para unir covalentemente el primer nucleótido u olignucleótido al sustrato. Estos agentes o grupos pueden incluir, pero no se limitan a: grupos amino, hidroxilo, bromo y carboxilo. Estos grupos reactivos se fijan preferiblemente al sustrato mediante un radical hidrocarbilo tal como un radical divalente alquileno o fenileno, ocupándose una posición de valencia por la unión a la cadena y fijándose la restante a los grupos reactivos. Estos grupos hidrocarbilo pueden contener hasta aproximadamente diez átomos de carbono, preferiblemente hasta aproximadamente seis átomos de carbono. Habitualmente se prefieren radicales alquileno que contienen de dos a cuatro átomos de carbono en la cadena principal. Estos y otros detalles del procedimiento se dan a conocer, por ejemplo, en la patente estadounidense 4.458.066.
En una realización, se sintetizan directamente sondas sobre el sustrato en un patrón de rejilla predeterminado usando métodos tales como síntesis química dirigida por luz, desprotección fotoquímica o suministro de precursores de nucleótidos al sustrato y posterior producción de sonda.
En otra realización, el sustrato puede recubrirse con un compuesto para potenciar la unión de la sonda al sustrato. Tales compuestos incluyen, pero no se limitan a: polilisina, aminosilanos, silanos amino-reactivos (Chipping Forecast, 1999) o cromo (Gwynne y Page, 2000). En esta realización, se aplican sondas previamente sintetizadas al sustrato en un patrón de rejilla y volumen preciso, predeterminado, usando un robot controlado por ordenador para aplicar una sonda al sustrato de una manera de impresión por contacto o de una manera sin contacto tal como suministro por chorro de tinta o piezoeléctrico. Pueden unirse covalentemente sondas al sustrato con métodos que incluyen, pero no se limitan a, irradiación UV. En otra realización se unen sondas al sustrato con calor.
Las dianas son ácidos nucleicos seleccionados del grupo que incluye, pero no se limita a: ADN, ADN genómico, ADNc, ARN, ARNm y pueden ser naturales o sintéticas. En todas las realizaciones, se prefieren moléculas de ácido nucleico de sujetos que se sospecha que desarrollan o tienen una deficiencia de sulfatasa. En determinadas realizaciones, puede unirse una o más moléculas de ácido nucleico de control al sustrato. Preferiblemente, moléculas de ácido nucleico de control permiten la determinación de factores incluyendo, pero sin limitarse a: calidad de ácido nucleico y características de unión; calidad y eficacia de reactivo; éxito de hibridación; y umbrales y éxito deanálisis. �?cidos nucleicos de control pueden incluir, pero no se limitan a, productos de expresión de genes tales como genes de mantenimiento o fragmentos de los mismos.
Para seleccionar un conjunto de marcadores de enfermedad de deficiencia de sulfatasa, preferiblemente se analizan los datos de expresión generados, por ejemplo, por análisis de micromatriz de expresión génica, para determinar qué genes en diferentes categorías de pacientes (siendo cada categoría de pacientes un trastorno de deficiencia de sulfatasa diferente) se expresan de manera significativamente diferenciada. La significación de la expresión génica puede determinarse usando software informático Permax, aunque puede usarse cualquier paquete estadístico convencional que puede distinguir diferencias significativas en la expresión. Permax realiza pruebas de la t de 2 muestras con permutación en grandes matrices de datos. Para vectores dimensionales altos de observaciones, el software Permax calcula datos estadísticos de la t para cada atributo, y evalúa la significación usando la distribución de permutación de los atributos globales máximo y mínimo. El uso principal es para determinar los atributos (genes) que son más diferentes entre dos grupos (por ejemplo, sujeto sano de control y un sujeto con una deficiencia de sulfatasa particular), medir “lo más diferente” usando el valor de los datos estadísticos de la t, y sus niveles de significación.
También puede determinarse una enfermedad de expresión de deficiencia de sulfatasa relacionada con moléculas de ácido nucleico usando métodos de medición de proteínas para determinar la expresión de SEQ ID NO: 2, por ejemplo, determinando la expresión de polipéptidos codificados por SEQ ID NO: 1 y/o 3. Métodos preferidos para medir específica y cuantitativamente proteínas incluyen, pero no se limitan a: métodos basados en espectroscopia de masas tales como desorción/ionización por láser potenciada en superficie (SELDI; por ejemplo, sistema ProteinChip de Ciphergen), métodos no basados en espectroscopia de masas, y métodos basados en inmunohistoquímica tales como electroforesis en gel en dos dimensiones.
La metodología SELDI puede usarse, mediante procedimientos conocidos por los expertos habituales en la técnica, para vaporizar cantidades microscópicas de proteína y para crear una “huella” de proteínas individuales, permitiendo así la medición simultánea de la abundancia de muchas proteínas en una única muestra. Preferiblemente pueden usarse ensayos basados en SELDI para caracterizar deficiencia múltiple de sulfatasas así como estadios de tales estados. Tales ensayos incluyen preferiblemente, pero no se limitan a, los siguientes ejemplos. Pueden medirse selectivamente productos génicos descubiertos mediante micromatrices de ARN mediante captura específica (mediada por anticuerpos) en el disco de proteína de SELDI (por ejemplo, SELDI selectiva). Pueden resolverse productos génicos descubiertos mediante selección de proteínas (por ejemplo, con geles en 2-D), mediante “SELDI de proteína total” optimizada para visualizar los marcadores particulares de interés de entre SEQ ID NO: 1, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 y/o 28. Pueden usarse modelos predictivos de una deficiencia de sulfatasa específica de medición de SELDI de múltiples marcadores de SEQ ID NO: 1, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 y/o 28, para las estrategias de SELDI.
El uso de cualquiera de los métodos de micromatriz anteriores para determinar la expresión de ácidos nucleicos relacionados con una enfermedad de deficiencia de sulfatasa puede realizarse con métodos rutinarios conocidos por los expertos habituales en la técnica y la expresión determinada mediante métodos de medición de proteínas puede correlacionarse con niveles predeterminados de un marcador usado como método de pronóstico para seleccionar estrategias de tratamiento para pacientes con enfermedad de deficiencia de sulfatasa.
Puede proporcionarse una célula productora de sulfatasa, en la que se aumenta la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida (es decir, la actividad específica) de la célula. La célula comprende: (i) una sulfatasa con una expresión aumentada, y (ii) una enzima generadora de formilglicina con una expresión aumentada, en la que la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida por la célula se aumenta en al menos el 5% con respecto a la razón de sulfatasa activa con respecto a la sulfatasa total producida por la célula en ausencia de la enzima generadora de formilglicina.
Una “sulfatasa con expresión aumentada”, tal como se usa en el presente documento, se refiere normalmente a expresión aumentada de una sulfatasa y/o su polipéptido codificado en comparación con un control. La expresión aumentada se refiere a aumentar (es decir, hasta un grado detectable) la replicación, transcripción y/o traducción de cualquiera de los ácidos nucleicos de sulfatasa (ácidos nucleicos de sulfatasa tal como se describe en otra parte en el presente documento), ya que la regulación por incremento de cualquiera de esos procesos da como resultado un aumento de la concentración/cantidad del polipéptido codificado por el gen (ácido nucleico). Esto puede lograrse usando varios métodos conocidos en la técnica, también descritos en otra parte en el presente documento, tal como transfección de una célula con el ADNc de sulfatasa, y/o ADN genómico que abarca el locus de sulfatasa, activación del gen de sulfatasa endógeno colocando, por ejemplo, un elemento promotor fuerte en sentido 5’ del locus genómico del gen de sulfatasa endógeno usando recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la tecnología de activación génica descrita en detalle en las patentes estadounidenses n.os 5.733.761, 6.270.989 y 6.565.844), etc. Un control típico será una célula idéntica transfectada con un(os) plásmido(s) vector(es). Potenciar (o aumentar) la actividad sulfatasa también se refiere a prevenir o inhibir la degradación de sulfatasa (por ejemplo, mediante ubiquitinización aumentada), regulación por disminución, etc., dando como resultado, por ejemplo, t1/2 (semivida) de molécula de sulfatasa aumentada o estable en comparación con un control. Regulación por disminución o expresión disminuida se refiere a expresión disminuida de un gen y/o su polipéptido codificado. La regulación por incremento o regulación por disminución de la expresión génica puede determinarse directamente detectando un aumento o disminución, respectivamente, en el nivel de ARNm para el gen (por ejemplo, una sulfatasa), o el nivel de expresión de proteína del polipéptido codificado por el gen, usando cualquier medio adecuado conocido en la técnica, tal como hibridación de ácido nucleico o métodos de detección de anticuerpos, respectivamente, y en comparación con controles. La regulación por incremento o regulación por disminución de expresión de genes de sulfatasa también puede determinarse indirectamente detectando un cambio en la actividad sulfatasa.
De manera similar, una “enzima generadora de formilglicina con una expresión aumentada”, tal como se usa en el presente documento, se refiere normalmente a expresión aumentada de un ácido nucleico de FGE y/o su polipéptido codificado en comparación con un control. Expresión aumentada se refiere a aumentar (es decir, hasta un grado detectable) la replicación, transcripción y/o traducción de cualquiera de los ácidos nucleicos de FGE (tal como se describe en otra parte en el presente documento), ya que la regulación por incremento de cualquiera de esos procesos da como resultado un aumento de la concentración/cantidad del polipéptido codificado por el gen (ácido nucleico). Esto puede lograrse usando los métodos descritos anteriormente (para las sulfatasas), y en otra parte en el presente documento.
En determinadas realizaciones, la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida por la célula se aumenta en al menos el 10%, el 15%, el 20%, el 50%, el 100%, el 200%, el 500%, el 1000%, con respecto a la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida por la célula en ausencia de la enzima generadora de formilglicina.
Puede proporcionarse un método mejorado para tratar una deficiencia de sulfatasa en un sujeto. El método implica administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento una sulfatasa en una cantidad eficaz para tratar la deficiencia de sulfatasa en el sujeto, en el que la sulfatasa se pone en contacto con una enzima generadora de formilglicina en una cantidad eficaz para aumentar la actividad específica de la sulfatasa. Tal como se describe en otra parte en el presente documento, “actividad específica” se refiere a la razón de sulfatasa activa con respecto a sulfatasa total producida. “Poner en contacto”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a modificar postraduccionalmente mediante FGE la sulfatasa tal como se describe en otra parte en el presente documento. Resultará evidente para un experto habitual en la técnica que una FGE puede entrar en contacto con una sulfatasa y modificarla si los ácidos nucleicos que codifican para FGE y una sulfatasa se coexpresan en una célula, o incluso si un polipéptido de FGE aislado entra en contacto con un polipéptido de sulfatasa aislado in vivo o in vitro. Aunque puede coadministrarse un polipéptido de FGE aislado con un polipéptido de sulfatasa aislado a un sujeto para tratar una deficiencia de sulfatasa en el sujeto, se prefiere que el contacto entre FGE y la sulfatasa tenga lugar in vitro antes de la administración de la sulfatasa al sujeto. Este método de tratamiento mejorado es beneficioso para un sujeto ya que se necesita administrar cantidades inferiores de la sulfatasa, y/o con menos frecuencia, ya que la sulfatasa tiene una actividad específica superior.
La invención se entenderá más completamente mediante referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, se pretende que estos ejemplos ilustren meramente las realizaciones de la invención y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1:
La deficiencia múltiple de sulfatasas está producida por mutaciones en el gen que codifica para la enzima generadora de Ca-formilglicina (FGE) humana
Procedimientos experimentales
Materiales y métodos
Ensayo in vitro para FGE
Para monitorizar la actividad FGE, se usó el péptido P23 de 23-meros N-acetilado y C-amidado (MTDFYVPVSLCTPSRAALLTGRS) (SEQ ID NO: 33) como sustrato. Se monitorizó la conversión del residuo de cisteína en la posición 11 en FGly mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Se preparó una disolución madre 6 !M de P23 en acetonitrilo al 30% y ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA). En condiciones normales, se incubaron 6 pmol de P23 a 37ºC con hasta 10 !l de enzima en un volumen final de 30 !l de Tris/HCl 50 mM, pH 9,0, que contenía NaCl 67 mM, CaCl2 15 !M, DTT 2 mM, y albúmina sérica bovina 0,33 mg/ml. Para detener la reacción enzimática, se añadieron 1,5 !l de TFA al 10%. Entonces P23 se unió a ZipTip C18 (Millipore), se lavó con TFA al 0,1% y se eluyó en 3 !l de acetonitrilo al 50%, TFA al 0,1%. Se mezclaron 0,5 !l del eluato con 0,5 !l de disolución de matriz (ácido a-ciano-4-hidroxi-cinámico 5 mg/ml (Bruker Daltonics, Billerica, MA) en acetonitrilo al 50%, TFA al 0,1%) en una diana de acero inoxidable. Se realizó la espectrometría de masas MALDI-TOF con un espectrómetro Reflex III (Bruker Daltonics) usando reflectrón y energía láser justo antes del umbral de desorción/ionización. Todos los espectros fueron promedios de 200-300 disparos de varios puntos en la diana. Se calibró el eje de masas usando péptidos de masas moleculares que oscilaban entre 1000 y 3000 Da como patrones externos. MH+ monoisotrópico de P23 es 2526,28 y del producto que contiene FGly, 2508,29. Se calculó la actividad (pmol de producto / h) partiendo de la base de la altura pico del producto divido por la suma de las alturas de pico de P23 y el producto.
Purificación de FGE a partir de testículos bovinos
Se obtuvieron testículos bovinos del matadero local y se almacenaron durante hasta 20 h en hielo. Se liberó el parénquima del tejido conjuntivo y se homogeneizó en una licuadora Waring Blendor y mediante tres rondas de licuado a motor. Se realizó la preparación de microsomas rugosos (RM) mediante fraccionamiento celular del homogenizado obtenido tal como se describe (Meyer et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:14550-14557) con las siguientes modificaciones. Se realizaron tres etapas de centrifugación diferencial, de 20 minutos cada una a 4ºC, a 500 g (rotor JA10), 3000 g (JA10) y 10000 g (JA20). A partir del último sobrenadante, se sedimentaron las membranas de RM (125000 g, rotor Ti45, 45 min., 4ºC), se homogeneizaron mediante licuado a motor y se estratificaron en un colchón de sacarosa (Hepes 50 mM, pH 7,6, KAc 50 mM, MgAc2 6 mM, EDTA 1 mM, sacarosa 1,3 M, 1-mercaptoetanol 5 mM). Se recuperaron los RM del sedimento tras la centrifugación durante 210 minutos a 45000 rpm en un rotor Ti45 a 4ºC. Habitualmente, se obtuvieron 100000-150000 equivalentes de RM, tal como definen Walter y Blobel (Methods Enzymol.,1983, 96:84-93), de 1 kg de tejido testicular. Se obtuvo el reticuloplasma, es decir el contenido luminar del RM, mediante la extracción diferencial a concentraciones bajas de desoxi Big Chap, tal como se describe (Fey et al., J. Biol. Chem., 2001, 276:47021-47028). Para la purificación de FGE, se dializaron 95 ml de reticuloplasma durante 20 h a 4 ºC frente a Tris/HCl 20 mM, pH 8,0, DTT 2,5 mM, y se aclararon mediante centrifugación a 125000 g durante 1 h. Se cargaron alícuotas de 32 ml del reticuloplasma aclarado en una columna MonoQ HR10/10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a temperatura ambiente, se lavaron y se eluyeron a 2 ml/min. con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,75 M en 80 ml del tampón Tris. Se reunieron las fracciones que contenían actividad FGE, que eluyeron a NaCl 50-165 mM, de tres rondas (42 ml) y se mezclaron con 2 ml de concanavalina A-Sepharose (Amersham Biosciences) que se habían lavado con tampón Hepes 50 mM, pH 7,4, que contenía KCl 0,5 M, MgCl2 1 mM, MnCl2 1 mM, CaCl2 1 mM, y DTT 2,5 mM. Tras la incubación durante 16 h a 4 ºC, se recogió la Concanavalina A-Sepharose en una columna y se lavó con 6 ml del mismo tampón Hepes. Se eluyó el material unido incubando la columna durante 1 h a temperatura ambiente con 6 ml de a-metilmanósido 0,5 M en Hepes 50 mM, pH 7,4, DTT 2,5 mM. Se repitió la elución con 4 ml del mismo eluyente. Se ajustaron los eluatos combinados (10 ml) de concanavalina A-Sepharose a pH 8,0 con Tris/HCl 0,5 M, pH 9,0, y se mezclaron con 2 ml de Affigel 10 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que se había derivatizado con 10 mg del péptido reorganizado al azar (PVSLPTRSCAALLTGR) (SEQ ID NO: 34) y se lavaron con tampón A (Hepes 50 mM, pH 8,0, que contenía acetato de potasio 0,15 M, sacarosa 0,125 M, MgCl2 1 mM y DTT 2,5 mM). Tras la incubación durante 3 h a 4 ºC se recogió la matriz de afinidad en una columna. Se recogieron la fracción no retenida y una de lavado con 4 ml de tampón A, se combinaron y se mezclaron con 2 ml de Affigel 10 que se había sustituido con 10 mg del péptido Ser69 (PVSLSTPSRAALLTGR) (SEQ ID NO: 35) y se lavaron con tampón A. Tras la incubación durante la noche a 4ºC, se recogió la matriz de afinidad en una columna, se lavó 3 veces con 6 ml de tampón B (el tampón A que contenía NaCl 2 M y una mezcla de los 20 aminoácidos proteinogénicos, cada uno a 50 mg/ml). Se eluyó el material unido de la matriz de afinidad incubando el Affigel dos veces durante 90 min. cada una con 6 ml de tampón B que contenía el péptido Ser69 25 mM. Se sustituyó una alícuota del eluato con albúmina sérica bobina 1 mg/ml, se dializó frente al tampón A y se analizó para determinar su actividad. Se concentró la parte restante de la actividad (11,8 ml) en un concentrador Vivaspin 500 (Vivascience AG, Hannover, Alemania), y se solubilizó a 95ºC en tampón de muestra Laemmli SDS. Se monitorizaron la composición del polipéptido del material de partida y las preparaciones obtenidas tras las etapas cromatográficas mediante SDS-PAGE (15% de acrilamida, 0,16% de bisacrilamida) y tinción con SYPRO Ruby (Bio-Rad Laboratories).
Identificación de FGE mediante espectrometría de masas
Para el análisis de huella de masa peptídica, se digirieron los polipéptidos purificados colocados en gel con tripsina (Shevchenko et al., Anal. Chem., 1996, 68:850-855), se desalaron en C18 ZipTip y se analizaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF usando ácido dihidrobenzoico como matriz y dos péptidos autolíticos obtenidos a partir de tripsina (m/z 842,51 y 2211,10) como patrones internos. Para el análisis de espectrometría de masas en tándem se analizaron péptidos seleccionados mediante espectrometría de masas por descomposición metaestable - MALDI-TOF. Se aislaron sus iones doblemente cargados correspondientes y se fragmentaron mediante espectrometría de masas con trampa iónica con nano-ESI fuera de línea (EsquireLC, Bruker Daltonics). Se usaron los datos de la espectrometría de masas mediante el algoritmo de búsqueda Mascot para la identificación de proteínas en la base de datos de proteínas NCBInr y la base de datos de nucleótidos NCBI EST.
Bioinformática
Se describieron péptidos señal y sitios de escisión con el método de von Heijne (von Heijne, Nucleic Acids Res., 1986, 14:4683-90) implementado en EMBOSS (Rice et al., Trends in Genetics, 2000, 16:276-277). Se predijeron los sitios de N-glicosilación usando el algoritmo de Brunak (Gupta y Brunak, Pac. Symp. Biocomput., 2002, 310-22). Se detectaron los dominios funcionales mediante la búsqueda de modelos ocultos de Markov en PFAM (versión 7.8) (Sonnhammer et al., Nucleic Acids Res., 1998, 26:320-322). Para buscar homólogos de FGE, se consultaron las bases de datos del National Center for Biotechnology Information (Wheeler et al., Nucleic Acids Res., 2002, 20:1316) con BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402). Se calcularon las similitudes de secuencia usando herramientas convencionales de EMBOSS. Se determinó la sintenia y la organización genómica de los loci usando fuentes de genoma humano y de ratón de NCBI y el Human Mouse Homology Map (mapa de homologías entre ser humano y ratón) también de NCBI, (Bethesda, MD).
Clonación de ADNc de FGE humana
Se sometió a transcripción inversa el ARN total, preparado a partir de fibroblastos humanos usando el kit RNEASY™ Mini (Qiagen, Inc., Valencia, CA) usando el kit OMNISCRIPT RT™ (Qiagen, Inc., Valencia, CA) y o bien un cebador de oligo(dT) o bien el cebador específico de FGE, 1199nc (CCAATGTAGGTCAGACACG) (SEQ ID NO: 36). Se amplificó el ADNc de primera hebra mediante PCR usando el cebador directo 1c (ACATGGCCCGCGGGAC) (SEQ ID NO: 37) y, como cebador inverso, o bien 1199nc o bien 1182nc (CGACTGCTCCTTGGACTGG) (SEQ ID NO: 38). Se clonaron los productos de la PCR directamente en el vector pCR4-TOPO™ (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Mediante secuenciación múltiple de los productos clonados de la PCR, que se habían obtenido de diversos individuos y de reacciones de RT y PCR independientes, se determinó la secuencia codificante del ADNc de FGE (SEQ ID NO: 1 y 3).
Detección de mutaciones, secuenciación genómica, mutagénesis dirigida al sitio y análisis de transferencia de tipo Northern
Los protocolos convencionales utilizados en este estudio fueron esencialmente tal como se describen en Lübke et al. (Nat. Gen., 2001, 28: 73-76) y Hansske et al. (J. Clin. Invest., 2002, 109:725-733). Las transferencias de tipo Northern se hibridaron con una sonda de ADNc que cubre toda la región codificante y una sonda de ADNc de 1actina como control para carga de ARN.
Líneas celulares y cultivo celular
Se obtuvieron fibroblastos de pacientes con MSD 1-6 de E. Christenson (Rigshospitalet Copenhage), M. Beck (Universitätskinderklinik Mainz), A. Kohlschütter (Universitätskrankenhaus Eppendorf, Hamburgo), E. Zammarchi (Meyer Hospital, Universidad de Florencia), K. Harzer (Institut für Hirnforschung, Universität Tübingen), y A. Fensom (Guy’s Hospital, Londres), respectivamente. Se mantuvieron las células CHO, BHK21, HT-1080 y fibroblastos de piel humana a 37ºC en 5% de CO2 en medio Eagle modificado por Dulbecco que contenía un 10% de suero bovino fetal.
Transfección, inmunofluorescencia indirecta, análisis de inmunotransferencia de tipo Western y detección de actividad FEG
Se dotó el ADNc de FGE con un sitio de EcoRI en 5’ y o bien una secuencia de marcador de HA, c-Myc o bien RGSHis6 en 3’, seguido por un codón de terminación y un sitio de HindIII, mediante PCR de adición usando Pfu polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA) y los cebadores siguientes: GGAATTCGGGACAACATGGCTGCG (EcoRI) (SEQ ID NO: 39), CCCAAGCTTATGCGTAGTCAGGCACATCATACGGATAGTCCATGGTGGGCAGGC (HA)(SEQ ID NO: 40), CCCAAGCTTACAGGTCTTCTTCAGAAATCAGCTTTTGTTCGTCCATGGTGGGCAG GC (c-Myc) (SEQ ID NO: 41), CCCAAGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGCGATC CTCTGTCCATGGTGGGCAGGC (RGS-His6) (SEQ ID NO: 42). Se clonaron los productos resultantes de PCR como fragmentos de EcoRI/HindIII en pMPSVEH (Artelt et al., Gene, 1988, 68:213-219). Se transfectaron de manera transitoria los plásmidos obtenidos en células HT-1080, BHK21 y CHO, se hicieron crecer sobre portaobjetos, usando EFFECTENE™ (Qiagen) como reactivo de transfección. 48 tras la transfección, se analizaron las células mediante inmunofluorescencia indirecta tal como se describió anteriormente (Lübke et al., Nat. Gen., 2001, 28:73-76; Hansske et al., J. Clin. Invest., 2002, 109:725-733), usando anticuerpos monoclonales IgG1 frente a HA (Berkeley Antibody Company, Richmond, CA), c-Myc (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) o RGS-His (Qiagen) como anticuerpos primarios. Se detectó la proteína marcadora de retículo endoplasmático, proteína disulfuro isomerasa (PDI) con un anticuerpo monoclonal de diferente subtipo (IgG2A, Stressgen Biotech., Victoria BC, Canadá). Se detectaron los anticuerpos primarios con anticuerpos secundarios de cabra específicos de isotipo acoplados a CY2 o CY3, respectivamente (Molecular Probes, Inc., Eugene, O). Se obtuvieron imágenes de inmunofluorescencia en un microscopio de barrido láser Leica TCS Sp2 AOBS. Para el análisis de inmunotransferencia tipo Western se usaron los mismos anticuerpos monoclonales y una IgG anti-ratón conjugada con HRP como anticuerpo secundario. Para la determinación de la actividad FEG, se lavaron células sometidas a tripsinización con solución salina tamponada con fosfato que contenía una mezcla de inhibidores de proteinasa (clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo 208 !M, aprotinina 0,16 !M, leupeptina 4,2 !M, bestatina 7,2 !M, pepstatina A 3 !M, E-64 2.8 !M E-64), se solubilizaron en Tris 10 mM, pH 8,0, que contenía DTT 2,5 mM, los inhibidores de proteinasa y Triton X-100 al 1%, y se aclararon por centrifugación a 125.000 g durante 1 h. Se sometió el sobrenadante a cromatografía en una columna MonoQ PC 1,6/5 usando las condiciones descritas anteriormente. Se reunieron las fracciones que eluyeron en NaCl 50-200 mM, se liofilizaron y se reconstituyeron en una décima parte del volumen reunido original antes de la determinación de la actividad FEG con el péptido P23.
Transducción retroviral
Se clonaron los ADNc de interés en el vector pLPCX y pLNCX2 basado en el virus de la leucemia murina de Moloney (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Se realizó la transfección de células FNX-Eco ecotrópicas (ATCC, Manassas, VA) y la transducción de células RETROPACK™ PT67 anfotróficas (BD Biosciences Clontech) y fibroblastos humanos tal como se describe (Lübke et al., Nat. Gen., 2001, 28:73-76; Thiel et al., Biochem. J., 2002, 376, 195-201). Para algunos experimentos se seleccionaron las células PT63 transducidas en pLPCX con puromicina antes de la determinación de las actividades sulfatasa.
Ensayos de sulfatasa
Se determinó la actividad de ASA, STS y GalNAc6S tal como se describe en Rommerskirch y von Figura, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, 89:2561-2565; Glössl y Kresse, Clin. Chim. Acta, 1978, 88:111-119.
Resultados
Un ensayo basado en péptidos rápido para determinar la actividad FEG
Se ha desarrollado un ensayo para determinar la actividad FEG en extractos de microsomas usando fragmentos de [35S] ASA sintentizados in vitro como sustrato. Se añadieron los fragmentos a la mezcla de ensayo como complejos de cadena naciente asociados a ribosoma. La cuantificación del producto incluyó digestión tríptica, separación de los péptidos mediante RP-HPLC e identificación y cuantificación de péptido tríptico que contenía FGly marcada con [35S] mediante una combinación de derivatización química a hidrazonas, separación mediante RP-HPLC y recuento mediante centelleo líquido (Fey et al., J. Biol. Chem., 2001, 276: 47021-47028). Para monitorizar la actividad enzimática durante la purificación, fue necesario modificar este procedimiento engorroso. Un péptido sintético de 16meros que correspondía a los residuos 65-80 de ASA y que contenía el motivo de secuencia requerido para la formación de FGly inhibió la actividad FEG en el ensayo in vitro. Esto sugirió que péptidos tales como ASA65-80 pueden servir como sustratos para FGE. Se sintetizó el péptido de 23-meros P23 (SEQ ID NO: 33), que corresponde a los residuos 60-80 de ASA con un residuo de metionina N-acetilada y uno de serina C-amidada adicionales para proteger los extremos N y C terminales, respectivamente. Las formas que contienen FGly y la cisteína de P23 pudieron identificarse y cuantificarse mediante espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser asistida por matriz con analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Se verificó la presencia del residuo de FGly en la posición 11 de P23 mediante espectrometría de masas por descomposición metaestable - MALDI-TOF (véase Peng et al., J. Mass Spec., 2003, 38:80-86). La incubación de P23 con extractos de microsomas de páncreas bovino
o testículos bovinos convirtió hasta el 95% del péptido en un derivado que contenía FGly (figura 1). En condiciones normales, la reacción fue proporcional a la cantidad de enzima y el tiempo de incubación siempre que se hubiera consumido menos del 50% del sustrato y el periodo de incubación no superara las 24 h. La km para P23 fue de 13 nM. Los efectos del glutatión reducido y oxidado, Ca2+ y pH fueron comparables a los observados en el ensayo usando complejos de cadena naciente asociados a ribosoma como sustrato (Fey et al., J. Biol. Chem., 2001, 276:47021-47028).
Purificación de FGE
Para la purificación de FGE, la fracción soluble (reticuloplasma) de microsomas de testículos bovinos sirvió como material de partida. La actividad específica de FGE fue 10-20 veces superior a la que tiene en reticuloplasma de microsomas de páncreas bovino (Fey et al., J. Biol. Chem., 2001, 276:47021-47028). Se logró la purificación de FGE mediante una combinación de cuatro etapas cromatográficas. Las dos primeras etapas fueron cromatografía en un intercambiador aniónico MonoQ y concavalina A-Sepharose. A pH 8, se unió la actividad FEG a MonoQ y se eluyó en NaCl 50-165 mM con una recuperación del 60-90%. Cuando se mezcló esta fracción con concanavalina A-Sepharose, se unió FGE. Pudo eluirse el 30-40% de la actividad de partida con a-metilmanósido 0,5 M. Las dos etapas de purificación finales fueron cromatografía en matrices de afinidad derivatizadas con péptidos de 16-meros. La primera matriz de afinidad fue Affigel 10 sustituida con una variante del péptido ASA65-80, en el que los residuos Cys69, Pro71 y Arg73, críticos para la formación de FGly, estaban reorganizados al azar (péptido reorganizado al azar PVSLPTRSCAALLTGR -SEQ ID NO: 34). Este péptido no inhibió la actividad FEG cuando se añadió a una concentración 10 mM al ensayo in vitro y, cuando se inmovilizó en Affigel 10, no conservó la actividad FEG. La cromatografía en la matriz de afinidad de péptido reorganizado eliminó las proteínas de unión al péptido incluyendo las chaperonas en el retículo endoplasmático. La segunda matriz de afinidad fue Affigel 10 sustituida con una variante del péptido ASA65-80, en el que se sustituyó la Cys69 por una serina (péptido Ser69 PVSLSTPSRAALLTGR-SEQ ID NO: 35). La matriz de afinidad del péptido Ser69 unió de manera eficaz FGE. La actividad FEG pudo eluirse o bien con KSCN 2 M o bien con péptido Ser69 25 mM con una recuperación del 2040%. Antes de la determinación de la actividad, tuvo que eliminarse el KSCN o el péptido Ser69 mediante diálisis. La substitución de Cys69 por serina fue crucial para la elución de FGE activa. Affigel 10 sustituido con el péptido ASA65-80 de tipo natural unió FGE de manera eficaz. Sin embargo, casi no pudo recuperarse ninguna actividad en eluatos con sales caotrópicas (KSCN, MgCl2), péptidos (ASA65-80 o péptido Ser69) o tampones con pH bajo o alto. En la figura 2, se muestra el patrón de polipéptido del material de partida y las fracciones activas obtenidas tras las cuatro etapas cromatográficas de una purificación típica. En la fracción final, se recuperó el 5% de la actividad FEG de partida y el 0,0006% de la proteína de partida (purificación de 8333 veces).
Los polipéptidos purificados de 39,5 y 41,5 kDa se codifican por un único gen
Se sometieron a análisis de huella peptídica los polipéptidos de 39,5 y 41,5 kDa en la preparación de FGE purificada. Los espectros de masas de los péptidos trípticos de los dos polipéptidos obtenidos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF fueron en su mayor parte solapantes, lo que sugiere que las dos proteínas se originan a partir del mismo gen. Entre los péptidos trípticos de ambos polipéptidos se encontraron dos péptidos abundantes MH+ 1580,73, SQNTPDSSASNLGFR (SEQ ID NO: 43) y MH+ 2049,91, MVPIPAGVFTMGTDDPQIK -SEQ ID NO: 44 más dos oxidaciones de metionina), lo que correspondía a la proteína codificada por un ADNc con n.º de registro de GenBank AK075459 (SEQ ID NO: 4). Se confirmó la secuencia de aminoácidos de los dos péptidos mediante espectros de descomposición metaestable - MALDI-TOF y mediante análisis de EM/EM usando espectrometría de masas con trampa iónica con ionización por nano-electropulverización (ESI) fuera de línea. Una secuencia de EST ortóloga bovina del ADNc humano que cubre la parte C-terminal de la FGE y que corresponde a las secuencias de ambos péptidos proporcionó la información de secuencia adicional para la FGE bovina.
Conservación evolutiva y estructura de dominio de FGE
El gen para la FGE humana está codificado por el ADNc de (SEQ ID NO: 1 y/o 3) y está ubicado en el cromosoma 3p26. Abarca ~105 kb y la secuencia codificante se distribuye a lo largo de 9 exones. Se encontraron tres ortólogos del gen de FGE humana en ratón (identidad del 87%), Drosophila melanogaster (identidad del 48%) y Anopheles gambiae (identidad del 47%). Se encontraron secuencias EST ortólogas para 8 especies adicionales incluyendo vaca, cerdo, Xenopus laevis, Silurana tropicalis, pez cebra, salmón y otras especies de peces (para más detalles véase el ejemplo 2). La estructura exón-intrón entre el gen humano y el de ratón está conservada y el gen de ratón en el cromosoma 6E2 está ubicado dentro de una región sintética con respecto a la del cromosoma 3p26 humano. Los genomas de S. cerevisiae y C. elegans carecen de homólogos de FGE. En procariotas se encontraron 12 homólogos de FGE humana. Se predijo que el ADNc para la FGE humana codificaba para una proteína de 374 residuos (figura 3 y SEQ ID NO: 2). La proteína contiene una secuencia señal escindible de 33 residuos, lo que indica translocación de FGE al interior del retículo endoplasmático, y contiene un único sitio de N-glicosilación en Asn141. La unión de FGE a concanavalina A sugiere que se utiliza este sitio de N-glicosilación. Los residuos 87-367 de FGE se enumeran en la base de datos de motivos de proteínas PFAM como un dominio de función desconocida (PFAM: DUF323). El análisis de comparación de secuencias de FGE humana y sus ortólogos eucariotas identificados en bases de datos indica que este dominio está compuesto por tres subdominios distintos.
El subdominio N-terminal (residuos 91-154 en FGE humana) tiene una identidad de secuencia del 46% y una similitud del 79% dentro de los cuatro ortólogos de FGE eucariotas conocidos. En la FGE humana, este dominio porta el sitio de N-glicosilación en Asn 141, que está conservado en los otros ortólogos. La parte media de FGE (residuos 179-308 en FGE humana) está representada por un subdominio rico en triptófano (12 triptófanos por 129 residuos). La identidad de los ortólogos eucariotas dentro de este subdominio es del 57%, la similitud es del 82%. El
subdominio C-terminal (residuos 327-366 en FGE humana) es la secuencia más altamente conservada dentro de la familia de FGE. La identidad de secuencia del subdominio C-terminal humano con los ortólogos eucariotas (3 secuencias de longitud completa y 8 EST) es del 85%, la similitud del 97%. Dentro de los 40 residuos del subdominio 3, cuatro residuos de cisteína están completamente conservados. Tres de las cisteínas también están 5 conservadas en los ortólogos de FGE procariotas. Los 12 miembros procariotas de la familia de FGE (para más detalles véase el ejemplo 2) comparten la estructura de subdominios con los FGE eucariotas. Los límites entre los tres subdominios son más evidentes en la familia procariota de FGE debido a secuencias no conservadas de longitudes variables que separan los subdominios entre sí. El genoma humano y de ratón codifican para dos homólogos estrechamente relacionados de FGE (SEQ ID NO: 43 y 44, n.º de registro de GenBank NM_015411, en
10 el hombre, y SEQ ID NO: 45 y 46, n.º de registro de GenBank AK076022, en ratón). Los dos parálogos son idénticos en un 86%. Sus genes están ubicados en regiones sinténicas del cromosoma (7q11 en ser humano, 5G1 en ratón). Ambos parálogos comparten con los ortólogos de FGE la estructura de subdominios y son idénticos en un 35% y similares en un 47% con respecto a la FGE humana. En el tercer subdominio, que es idéntico en un 100% en ambos homólogos, falta la secuencia undecamérica que contiene cisteína del subdominio 3.
15 Expresión, ubicación subcelular y formas moleculares
Puede detectarse un único transcrito de 2,1 kb mediante análisis de transferencia de tipo Northern del ARN total de fibroblastos de piel y ARN-poli A+ de corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y 20 páncreas. En relación con el ARN de 1-actina, la abundancia varía en un orden de magnitud y es la más alta en páncreas y riñón y la más baja en cerebro. Se sometieron a ensayo diversas líneas de células eucariotas que expresan de manera estable o transitoria el ADNc de FGE humana o derivados de FGE prolongados en el extremo C-terminal por un marcador de HA, Myc o His6 para determinar la actividad FEG y la ubicación subcelular de FGE. La expresión transitoria de FGE marcada y no marcada aumentó la actividad FEG 1,6 – 3,9 veces. La expresión 25 estable de FGE en células PT67 aumentó la actividad FGE en aproximadamente 100 veces. La detección de la forma de FGE marcada mediante inmunofluorescencia indirecta en células BHK 21, CHO y HT1080 mostró una coubicación de las formas de FGE marcadas de manera diversa con la proteína disulfuro isomerasa, una proteína luminal del retículo endoplasmático. El análisis de inmunotransferencia tipo Western de los extractos de células BHK21 transfectadas de manera transitoria con ADNc que codifica para las formas marcadas de FGE mostró una
30 única banda inmunorreactiva con un tamaño aparente de entre 42 y 44 kDa.
El gen de FGE porta mutaciones en MSD
La MSD está producida por una deficiencia para generar residuos de FGly en sulfatasas (Schmidt, B., et al., Cell,
35 1995, 82: 271-278). El gen de FGE, por tanto, es un gen candidato para la MSD. Se amplificó y se secuenció el ADNc que codifica para FGE de siete pacientes con MSD y se encontraron diez mutaciones diferentes que se confirmaron mediante secuenciación del ADN genómico (tabla 1).
Tabla 1: Mutaciones en pacientes con MSD
Mutación
Efecto sobre la proteína Observaciones Paciente
1076C>A
S359X Truncamiento de los 16 residuos del extremo C-terminal 1*
IVS3+5-8 del
Deleción de residuos 149-173 Deleción en marco del exón 3 1, 2
979C>T
R327X Pérdida del subdominio 3 2
1045C>T
R349W Substitución de un residuo conservado en el subdominio 3 3, 7
1046G>A
R349Q Substitución de un residuo conservado en el subdominio 3 4
1006T>C
C336R Substitución de un residuo conservado en el subdominio 3 4
836C>T
A279V Substitución de un residuo conservado en el subdominio 2 5
243delC
cambio de marco y truncamiento Pérdida de los tres subdominios 5
661delG
cambio de marco y truncamiento Pérdida del tercero del C-terminal de FGE que incluye el subdominio 3 6**
IVS6-1G>A
Deleción de residuos 281-318 Deleción en marco del exón 7 5
40 *El paciente 1 es el paciente con MSD Mo. en Schmidt, B., et al., Cell, 1995, 82:271-278 y Rommerskirch y von Figura, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 1992, 89:2561-2565. **El paciente 6 es el paciente con MSD notificado por Burk et al., J. Pediatr., 1984, 104:574-578.
Los otros pacientes representan casos no publicados.
45 El primer paciente era heterocigoto para una sustitución 1076C>A que convierte el codón para serina 359 en un codón de terminación (S359X) y una mutación que produce la deleción de los 25 residuos 149-173 que están codificados por el exón 3 y separan los dominios primero y segundo de la proteína. La secuenciación genómica
reveló una deleción de nucleótidos +5-8 del tercer intrón (IVS3+5-8 del) destruyéndose de ese modo el sitio donador de corte y empalme del intrón 3. El segundo paciente era heterocigoto para la mutación que produce la pérdida del exón 3 (IVS3+5-8 del) y una sustitución 979C>T que convierte el codón para arginina 327 en un codón de terminación (R327X). La FGE truncada codificada por el alelo 979C>T carece de la mayor parte del subdominio 3. El 5 tercer paciente era homocigoto para una sustitución 1045C>T que sustituye la arginina conservada 349 en el subdominio 3 por triptófano (R349W). El cuarto paciente era heterocigoto para dos mutaciones de aminoácido que reemplazan residuos conservados en el dominio de FGE: una sustitución 1046>T que reemplaza la arginina 349 por glutamina (R349Q) y una sustitución 1006T>C que reemplaza la cisteína 336 por arginina (C336R). El quinto paciente era heterocigoto para una sustitución 836 C>T que reemplaza la alanina conservada 279 por valina 10 (A279V). La segunda mutación es una deleción de único nucleótido (243delC) que cambia la secuencia tras la prolina 81 y que produce una detención de la traducción tras el residuo 139. El sexto paciente era heterocigoto para la deleción de un único nucleótido (661delG) que cambia la secuencia de aminoácidos tras el residuo 220 y que introduce un codón de terminación tras el residuo 266. La segunda mutación es una mutación del sitio aceptor de corte y empalme del intrón 6 (IVS6-1G>A) que produce una deleción en marco del exón 7 que codifica para los
15 residuos 281-318. En el séptimo paciente se encontró la misma sustitución 1045C>T que en el tercer paciente. Además se detectaron dos polimorfismos en la región codificante de 18 alelos de FGE de los pacientes control y con MSD. El 22% portaba una sustitución 188G>A, que reemplaza la serina 63 por asparagina (S63N) y el 28% una sustitución silenciosa 1116C>T.
20 Transducción de fibroblastos con MSD con ADNc de FGE de tipo natural y mutante
Con el fin de confirmar la deficiencia de FGE como la causa de la inactividad de las sulfatasas sintetizadas en la MSD, se expresó el ADNc de FGE en fibroblastos con MSD utilizando transferencia de genes retrovirales. Como control, se transdujo el vector retroviral sin inserto de ADNc. Para monitorizar la complementación del defecto 25 metabólico con la actividad de ASA, se midió la esteroide sulfatasa (STS) y la N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa (GalNAc6S) en los fibroblastos transducidos antes o tras la selección. La transducción de la FGE de tipo natural restableció parcialmente la actividad catalítica de las tres sulfatasas en dos líneas de células con MSD (tabla 2) y para la STS en una tercera línea de células con MSD. Debe observarse que para ASA y GalNAc6S, el restablecimiento fue sólo parcial tras la selección de los fibroblastos que alcanzaban del 20 al 50% de la actividad 30 normal. Para la STS, se encontró que la actividad se restablecía a la de los fibroblastos control tras la selección. La selección aumentó la actividad de ASA y STS en del 50 al 80%, lo que es compatible con la observación anterior de que llegan a translucirse del 15 al 50% de los fibroblastos (Lübke et al., Nat. Gen., 2001, 28:73-76). Las actividades sulfatasa en los fibroblastos con MSD transducidos con el vector retroviral solo (tabla 2) fueron comparables a las de los fibroblastos con MSD no transducidos (no mostradas). La transducción de ADNc de FGE que porta la mutación
35 IVS3+5-8del no restableció las actividades sulfatasa (tabla 2).
Tabla 2: Complementación de fibroblastos con MSD por transducción de ADNc de FGE de tipo natural o mutante
Fibroblastos
Inserto de FGE Sulfatasa ASA1 STS1 GalNAc6S1
MSD 3º
- 1,9 � 0,2 < 3 56,7 � 32
FGE+
7,9 13,5 n. d.
FGE++
12,2 � 0,2 75,2 283 � 42
FGE-IVS3+5-8del+
1,8 < 3 n. d.
FGE-IVS3+5-8del++
2,1 < 3 98,5
MSD 4º
- 1,1 � 0,3 <3 n. d.
FGE+
4,7 17,0 n. d.
Fibroblastos control
58 � 11 66 � 31 828 � 426
1Los valores proporcionan la razón entre ASA (mU/mg de proteína celular), STS (!U/mg de proteína celular), GalNAc6S (!U/mg de proteína celular) y la de 1-hexosaminidasa (U/mg de proteína celular). Para los fibroblastos control se proporciona la media y la variación de 6-11 40 líneas celulares. Cuando está indicado, se proporciona el intervalo de dos cultivos transducidos en paralelo para fibroblastos con MSD. º El número de fibroblastos con MSD se refiere al del paciente en la tabla 1.
+ Determinación de la actividad antes de la selección. ++ Determinación de la actividad tras la selección. n.d.: no determinado
45 Discusión
FGE es una glicoproteína altamente conservada del retículo endoplasmático.
La purificación de FGE de testículos bovinos dio dos polipéptidos de 39,5 y 41,5 kDa que se originan a partir del mismo gen. La expresión de tres versiones de FGE marcadas de manera diferente en tres líneas de células eucariotas diferentes como una única forma sugiere que una de las dos formas observadas en la preparación de FGE purificada de testículos bovinos puede haberse generado por proteólisis limitada durante la purificación. La substitución de Cys69 en el péptido ASA65-80 por serina fue crítica para la purificación de FGE mediante cromatografía de afinidad. La FGE tiene una secuencia señal escindible que media la translocación a través de la membrana del retículo endoplasmático. La mayor parte de la proteína madura (275 residuos de 340) define un dominio único, que es probable que esté compuesto por tres subdominios (véase el ejemplo 2), para ninguno de los tres subdominios existen homólogos en proteínas con función conocida. El reconocimiento del motivo de modificación FGly lineal en polipéptidos de sulfatasa recién sintetizados (Dierks et al., EMBO J., 1999, 18:20842091) podría ser la función de un subdominio de FGE. El dominio catalítico podría catalizar la formación de FGly de varias formas. Se ha propuesto que extrae electrones del grupo tiol de la cisteína y los transfiere a un aceptor. El tioaldehído resultante se hidrolizaría espontáneamente a FGly y H2S (Schmidt, B., et al., Cell, 1995, 82:271-278). Alternativamente FGE podría actuar como una oxigenasa de función mixta (monooxigenasa) que introduce un átomo de O2 en la cisteína y el otro en H2O con la ayuda de un donador de electrones tal como FADH2. El derivado de hidrato de tioaldehído resultante de cisteína reaccionaría espontáneamente con FGly y H2S. Experimentos preliminares con una preparación de FGE parcialmente purificada mostraron una dependencia crítica de la formación de FGly del oxígeno molecular. Esto sugeriría que FGE actúa como una oxigenasa de función mixta. La alta conservación particular del subdominio 3 y la presencia de tres residuos de cisteína completamente conservados en el mismo hacen que este subdominio sea un candidato probable para el sitio catalítico. Será interesante comprobar si los elementos estructurales que median el reconocimiento del motivo FGly y la unión de un aceptor de electrones o un donador de electrones se correlacionan con la estructura de dominio de FGE.
FGE recombinante se ubica en el retículo endoplasmático, lo que es compatible con el sitio propuesto de su acción. Los residuos de FGly se generan en sulfatasas recién sintetizadas durante o poco después de su translocación al retículo endoplasmático (Dierks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94:11963-11968; Dierks et al., FEBS Lett., 1998, 423:61-65). La propia FGE no contiene una señal de retención en el RE del tipo KDEL. Su retención en el retículo endoplasmático puede estar mediada por tanto por la interacción con otras proteínas del RE. Los componentes de la maquinaria de translocación/N-glicosilación son candidatos atractivos para tales parejas de interacción.
Las mutaciones en FGE producen MSD
Se ha demostrado que las mutaciones en el gen que codifica para FGE producen MSD. La FGE también puede interaccionar con otros componentes, y los defectos en genes que codifican para estos últimos podrían producir MSD de igual forma. En siete pacientes con MSD se encontraron de hecho diez mutaciones diferentes en el gen de FGE. Todas las mutaciones tienen efectos graves en la proteína FGE sustituyendo residuos altamente conservados en el subdominio 3 (tres mutaciones) o en el subdominio 2 (una mutación) o truncamientos en el extremo C-terminal de diversas longitudes (cuatro mutaciones) o grandes deleciones en macro (dos mutaciones) Para dos líneas celulares con MSD y una de las mutaciones en MSD se demostró que la transducción del ADNc de FEG de tipo natural, pero no del mutante, restablece parcialmente las actividades sulfatasas. Esto identifica claramente el gen de FGE como el sitio de mutación y la naturaleza de la mutación que produce la enfermedad. MSD es tanto clínica como bioquímicamente heterogénea. Se ha diferenciado una forma neonatal poco frecuente que se presenta al nacer y que desarrolla una forma común de hidrocefalia que se asemeja inicialmente a una leucodistrofia metacromática infantil y que posteriormente desarrolla características similares a las de la ictiosis y la mucopolisacaridosis, y una forma leve menos frecuente en la que prevalecen las características clínicas de una mucopolisacaridosis. Desde el punto de vista bioquímico, es característico que pueda detectarse una actividad de sulfatasas residual, que para la mayoría de los casos en fibroblastos de piel en cultivo es inferior al 10% de los controles (Burch et al., Clin. Genet., 1986, 30: 409-15; Basner et al., Pediatr. Res., 1979, 13:1316-1318). Sin embargo, en algunas líneas celulares con MSD, la actividad de sulfatasas seleccionadas puede alcanzar el intervalo normal (Yutaka et al., Clin. Genet., 1981, 20:296-303). Además, se ha notificado que la actividad residual se somete a variaciones dependiendo de las condiciones del cultivo celular y de factores desconocidos. Desde el punto de vista bioquímico, la MSD se ha clasificado en dos grupos. En el grupo I, la actividad residual de sulfatasas es inferior al 15% incluyendo la de ASB. En el grupo II, la actividad residual de sulfatasas es superior y particularmente la de ASB puede alcanzar valores de hasta el 50-100% del control. Todos los pacientes notificados en el presente documento se encuentran dentro del grupo I, excepto el paciente 5, que pertenece al grupo II (actividad de ASB en el intervalo control) del fenotipo bioquímico. Basándose en criterios clínicos, los pacientes 1 y 6 son casos de neonatos, mientras que los pacientes 2-4 y 7 tienen la forma de MSD común y el paciente 5 la forma similar a mucopolisacaridosis.
La heterogeneidad fenotípica sugiere que las diferentes mutaciones en pacientes con MSD están asociadas con diferentes actividades residuales de FGE. Los datos preliminares en células PT67 que expresan de manera estable FGE IVS3+5-8del indican que la deleción en marco del exón 3 anula la actividad FEG completamente. La caracterización de las mutaciones en MSD, de las propiedades bioquímicas de FGE mutante y del contenido residual de FGly en sulfatasas usando un método de espectrometría de masas altamente sensible desarrollado recientemente (Peng et al., J. Mass Spec., 2003, 38:80-86) proporcionará una mejor comprensión de la correlación genotipo-fenotipo en MSD.
Ejemplo 2:
El gen de FGE humana define una nueva familia de genes que modifican sulfatasas que está conservada de procariotas a eucariotas
Bioinformática
Se describieron los péptidos señal y los sitios de escisión con el método de von Heijne (Nucleic Acids Res., 1986, 14:4683) implementado en EMBOSS (Rice et al., Trends in Genetics, 2000, 16:276-277), y el método de Nielsen et al. (Protein Engineering, 1997, 10:1-6). Se predijeron los sitios de N-glicosilación usando el algoritmo de Brunak (Gupta y Brunak, Pac. Symp. Biocomput., 2002, 310-22).
Se detectaron los dominios funcionales buscando mediante la búsqueda de modelos ocultos de Harkov en PFAM (versión 7.8) (Sonnhammer et al., Nucleic Acids Res., 1998, 26:320-322). Se obtuvieron secuencias de la semilla DUF323 en PFAM de TrEMBL (Bairoch, A. y Apweiler, R., Nucleic Acids Res., 2000, 28:45-48). Se realizaron alineaciones múltiples y construcciones de árbol filogenético con Clustal W (Thompson, J., et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680). Para la computación de árbol filogenético, se excluyeron las posiciones de hueco y se corrigieron para substituciones múltiples. Se realizó remuestreo en árbol (tree bootstrapping) para obtener resultados significativos. Se visualizaron los árboles usando Njplot (Perriere, G. y Gouy, M., Biochimie, 1996, 78:364-369). Las alineaciones se representaron gráficamente usando el comando prettyplot de EMBOSS.
Para buscar homólogos de FGE, se consultaron las bases de datos NR, NT y EST del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Wheeler et al., Nucleic Acids Res., 2002, 20:13-16), con BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402). Para las secuencias proteicas, se realizó la búsqueda usando Psi-Blast de convergencia iterativo frente a la versión actual de la base de datos NR que usa un punto de corte de valor probable de 10-40 , y parámetros por defecto. Se alcanzó la convergencia tras 5 iteraciones. Para las secuencias de nucleótidos, se realizó la búsqueda con Psi-TBlastn: usando NR y la secuencia proteica de FGE humana como entrada, se construyó una matriz de puntuación para hFGE con Psi-Blast de convergencia iterativo. Se usó esta matriz como entrada para Blastall para consultar las bases de datos de nucleótidos NT y EST. Para ambas etapas, se usó un punto de corte de valor probable de 10-20 .
Se realizó la predicción de la estructura secundaria de las proteínas usando Psipred (Jones, D., J Mol Biol., 1999, 292:1950-202; McGuffin, L., et al., Bioinfonnatics, 2000, 16:404-405).
Se calcularon puntuaciones de similitud de los subdominios a partir de las alineaciones usando el algoritmo cons. de EMBOSS con parámetros por defecto. Se generaron las meta-alineaciones mediante la alineación de secuencias consenso de subgrupos de la familia de FGE. Se determinaron la sintenia y la organización de loci genómicos usando recursos de genoma de ser humano y ratón de NCBI en NCBI (Bethesda, MD) y sintenia de ser humanoratón-rata de Softberry (Mount Kisco, NY). Se descargaron secuencias genómicas bacterianas del servidor FTP de NCBI. Se usó la anotación genómica microbiana de NCBI para obtener una visión general de los loci genómicos de los genes bacterianos de FGE.
Resultados y discusión
Características y motivos básicos de la FGE humana y proteínas relacionadas
El gen de FGE humana (SEQ ID NO: 1, 3) codifica para la proteína FGE (SEQ ID NO: 2) que se predice que tiene 374 residuos. Una señal de escisión entre los residuos 22-33 (Heijne-Score de 15,29) y un índice hidropático (Kyte,
J. y Doolittle, R., J Mol Biol., 1982, 157:105-132) de los residuos 17-29 de entre 1,7 y 3,3 indican que los 33 residuos del extremo N-terminal se escinden tras la translocación al RE. Sin embargo con el algoritmo de Nielsen et al. (Protein Engineering, 1997, 10:1-6), se predice la escisión de la secuencia señal tras el residuo 34. La proteína tiene un único sitio posible de N-glicosilación en Asn 141.
Una búsqueda con la secuencia de proteína FGE en la base de datos de motivos de proteínas PFAM (Sonnhammer et al., Nucleic Acids Res., 1998, 26:320-322) reveló que los residuos 87-367 de la FGE humana pueden clasificarse como el dominio de proteína DUF323 (“dominio de función desconocida”, PF03781) con un valor probable altamente significativo de 7:9,10-114. La semilla en PFAM que define DUF323 consiste en 25 secuencias de proteínas, de las que la mayoría son proteínas hipotéticas derivadas de datos de secuenciación. Para analizar la relación entre la FGE humana y DUF323, se realizó una alineación múltiple de FGE con las secuencias de la semilla DUF323. Basándose en esto, se construyó y remuestreó un árbol filogenético. Cuatro de las secuencias hipotéticas (TrEMBL-ID Q9CK12, Q9I761, 094632 y Q9Y405) tuvieron una divergencia tan fuerte de los otros miembros de la semilla que evitaron el remuestreo satisfactorio y tuvieron que eliminarse del conjunto. La figura 2 muestra el árbol de remuestreo que presenta la relación entre la FGE humana y las 21 proteínas de semilla DUF323 restantes. El árbol puede usarse para subdividir los miembros de semilla en dos categorías: homólogos estrechamente relacionados
con la FGE humana y los genes restantes, menos relacionados.
Las 7 proteínas superiores tienen una distancia filogenético de entre 0,41 y 0,73 con respecto a la FGE humana. Sólo contienen un único dominio, DUF323. La homología dentro de este grupo se extiende por toda la secuencia de 5 aminoácidos, consistiendo la mayor parte en el dominio DUF323. El dominio DUF323 está fuertemente conservado dentro de este grupo de homólogos, mientras que las otras 15 proteínas de la semilla están menos relacionadas con la FGE humana (distancia filogenético de entre 1,14 y 1,93). Su dominio DUF323 diverge considerablemente del dominio DUF323 altamente conservado del primer grupo (véase la sección “Subdominios de FGE y mutaciones en el gen de FGE”). La mayoría de estas 15 proteínas son hipotéticas, habiéndose investigado adicionalmente seis de 10 ellas. Una de ellas, una serina/treonina cinasa (TrEMBL:O84147) de C. trachomatis contiene otros dominios además de DUF323: un dominio de unión a ATP y un dominio cinasa. Las secuencias de R. sphaeroides (TrEMBL: Q9ALV8) y Pseudomonas sp. (TrEMBL: 052577) codifican para la proteína NirV, un gen cotranscrito con la nitrito reductasa que contiene cobre nirK (Jain, R. y Shapleigh, J., Microbiology, 2001, 147:2505-2515). CarC (TrEMBL: Q9XB56) es una oxigenasa implicada en la síntesis de un antibiótico 1-lactámico de E. carotovora (McGowan, S., et al., Mol 15 Microbiol., 1996, 22:415-426; Khaleeli N, T. C., y Busby RW, Biochemistry, 2000, 39:8666-8673). XylR (TrEMBL: 031397) y BH0900 (TrEMBL: Q9KEF2) son proteínas potenciadoras de unión implicadas en la regulación de la utilización de pentosas (Rodionov, D., et al., FEMS Microbiol Lett., 2001, 205:305-314) en Bacillaceae y Clostridiaceae. La comparación de FGE y DUF323 condujo al establecimiento de un umbral de homología que diferencia la familia de FGE de homólogos que contienen DUF323 distantes con diferentes funciones. Estos últimos
20 incluyen una serina/treonina cinasa y XylR, un potenciador de la transcripción así como FGE, una enzima generadora de FGly y CarC, una oxigenasa. Tal como se comenta en otra parte en el presente documento, la FGE también podría ejercer su función de modificación de cisteína como una oxigenasa, lo que sugiere que la FGE y miembros distintos de FGE de la semilla DUF323 pueden compartir una función oxigenasa.
25 Homólogos de FGE
La presencia de homólogos estrechamente relacionados de la FGE humana en la semilla DUF323 dirigió la búsqueda de homólogos de FGE humana en la base de datos NR de NCBI (Wheeler et al., Nucleic Acids Res., 2002, 20:13-16). El umbral de la búsqueda se eligió de tal forma que se obtuvieron los 6 homólogos presentes en la
30 semilla DUF323 y otros homólogos estrechamente relacionados sin encontrar los otros miembros de semilla. Esta búsqueda condujo a la identificación de tres ortólogos de FGE en eucariotas, 12 ortólogos en procariotas y dos parálogos en el hombre y el ratón (tabla 3).
Tabla 3: La familia de genes de FGE en eucariotas y procariotas
SEQ ID NO: NA, AA [GI]
ESPECIE LONGITUD [AA] SUBGRUPO
1/3, 2
Homo sapiens 374 E1
49, 50 [22122361]
Mus musculus 372f E1
51, 52 [20130397]
Drosophila melanogaster 336 E1
53, 54 [21289310]
Anopheles gambiae 290 E1
47, 48 [26344956]
Mus musculus 308 E2
45, 46 [24308053]
Homo sapiens 301 E2
55, 56 [21225812]
Streptomyces coelicolor A3(2) 314 P1
57, 58 [25028125]
Corynebacterium efficiens YS-314 334 P1
59, 60 [23108562]
Novosphingobium aromaticivorans 338 P2
61, 62 [13474559]
Mesorhizobium loti 372 P2
63, 64 [22988809]
Burkholderia fungorum 416 P2
65, 66 [16264068]
Sinorhizobium meliloti 303 P2
67, 68 [14518334]
Microscilla sp. 354 P2
69, 70 [26990068]
Pseudomonas putida KT2440 291 P2
71, 72 [22975289]
Ralstonia metallidurans 259 P2
73, 74 [23132010]
Prochlorococcus marinus 291 P2
75, 76 [16125425]
Caulobacter crescentus CB15 338 P2
77, 78 [15607852]
Mycobacterium tuberculosis Ht37Rv 299 P2
GI - Identificador de proteínas de GenBank
NA - ácido nucleico AA - aminoácidos,
E1 - ortólogos eucariotas E2 - parálogos eucariotas
P1 - ortólogos procariotas estrechamente relacionados P2 – otros ortólogos procariotas
5 f - secuencia de proteínas mal predicha en GenBank
Obsérvese que en GenBank se predice que la secuencia GI 22122361 de ratón codifica para una proteína de 284
aa, aunque la secuencia NM 145937 de ADNc codifica para una proteína de 372 residuos. Esta mala predicción se
basa en la omisión del primer exón del gen murino de FGE. Todas las secuencias encontradas en la base de datos 10 NR son de procariotas o eucariotas superiores. No se detectaron homólogos de FGE en Archaebacteriae o plantas.
Las búsquedas con umbrales incluso inferiores en los genomas completamente secuenciados de C. elegans y S.
cerevisiae y las bases de datos relacionadas ORF no revelaron ningún homólogo. Una búsqueda en las secuencias
eucariotas de las bases de datos de nucleótidos NT y EST condujo a la identificación de 8 EST de ortólogo de FGE
adicionales, mostrando los fragmentos de secuencia de ADNc en el extremo 3’ terminal un alto grado de 15 conservación a nivel de proteína que no se enumeran en la base de datos NR. Estas secuencias no abarcan la parte
codificante completa de los ARNm y proceden todos ellos a eucariotas superiores (tabla 4).
Tabla 4: Fragmentos EST ortólogos de FGE en eucariotas
SEQ ID NO: NA [GB]
ESPECIE
80 [CA379852]
Oncorhynchus mykiss
81 [AI721440]
Danio rerio
82 [BJ505402]
Oryzias latipes
83 [BJ054666]
Xenopus laevis
84 [AL892419]
Silurana tropicalis
85 [CA064079]
Salmo salar
86 [BF189614]
Sus scrofa
87 [AV609121]
Bos taurus
GB - n.º de registro de GenBank; NA - ácido nucleico
20 La alineación múltiple y la construcción de un árbol filogenético (usando ClustalW) de las secuencias codificantes a partir de la base de datos NR permitió la definición de cuatro subgrupos de homólogos: ortólogos eucariotas (FGE de ser humano, ratón, mosquito y mosca de la fruta, parálogos eucariotas (parálogo de FGE de ser humano y ratón), ortólogos procariotas estrechamente relacionados con FGE (Streptomyces y Corynebacterium y otros ortólogos
25 procariotas (Caulobacter, Pseudomonas, Mycobacterium, Prochlorococcus, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Novosphingobium, Ralstonia, Burkholderia, y Microscilla). Los ortólogos eucariotas muestran una identidad global con la FGE humana del 87% (ratón), 48% (mosca de la fruta) y 47% (Anopheles). Aunque los ortólogos de FGE se encuentran en procariotas y eucariotas superiores, no aparecen en genomas completamente secuenciados de eucariotas inferiores situados filogenéticamente entre S. cerevisiae y D. melanogaster. Además, los homólogos de FGE están ausentes en los genomas completamente secuenciados de E. coli y el pez globo.
Tal como se comenta en otra parte en el presente documento, los parálogos de FGE encontrados en ser human y 5 ratón pueden tener una actividad de generación de FGly y contribuir a las actividades residuales de las sulfatasas encontradas en pacientes con MSD.
Subdominios de FGE
10 Los miembros de la familia de genes de FGE tienen tres partes/dominios altamente conservados (tal como se describe en otra parte en el presente documento). Además de las dos secuencias no conservadas que separan a la primera, tienen extensiones no conservadas en los extremos N y C terminales. Se considera que las tres partes representan subdominios del dominio DUF323 porque están separadas por partes no conservadas de longitud variable. La longitud de la parte que separa los subdominios 1 y 2 varías entre 22 y 29 residuos y la que separa los
15 subdominios 2 y 3 entre 7 y 38 aminoácidos. Las partes no conservadas de los extremos N y C terminales muestran una variación incluso más fuerte en la longitud (extremo N-terminal: 0-90 AA, extremo C-terminal: 0-28 AA). La secuencia para el gen de FGE de Ralstonia metallidurans está probablemente incompleta, puesto que carece del primer subdominio.
20 Para verificar la plausibilidad de definir subdominios de DUF323, se realizó la predicción de una estructura secundaria de la proteína FGE humana usando Psipred. Se predice que la señal de RE hidrófoba (residuos 1-33) contiene estructuras en hélice lo que confirma la predicción de señal del algoritmo de von-Heijne. La región no conservada N-terminal (aa 34-89) y la región de separación entre los subdominios 2 y 3 (aa 308-327) contienen secciones helicoidales. La región que separa los subdominios 1 y 2 contiene una hélice. La hélice a en los aa 65/66
25 tiene una baja confianza de predicción y es probablemente un artefacto de predicción. Los límites de subdominio están situados dentro de las hélices y no interrumpen las hélices a o las láminas 1. El primer subdominio está constituido por varias láminas 1 y una hélice a, el segundo subdominio contiene dos láminas 1 y cuatro hélices a. El tercer subdominio tiene una región de hélice a flanqueada por una lámina al comienzo y al final del subdominio. En resumen, la estructura secundaria está de acuerdo con la estructura de subdominios propuesta ya que los límites de
30 subdominio están situados dentro de hélices y los subdominios contienen los elementos estructurales hélices a y láminas 1.
Debe observarse que ninguno de los subdominios existe como un módulo aislado en las secuencias enumeradas en las bases de datos. Dentro de cada uno de los cuatro subgrupos de la familia de FGE, los subdominios están
35 altamente conservados, mostrando el tercer subdominio la mayor homología (tabla 5). Este subdominio también muestra la homología más fuerte en todos los subgrupos.
Tabla 5: Homología (% de similitud) de los subdominios de la familia de FGE
Subfamilia Miembros
1 Subdominio 2 3
E1
4 79 82 100
E2
2 90 94 100
P1
2 70 79 95
P2
10 59 79 80
E1 - ortólogos eucariotas; E2 - parálogos eucariotas 40 P1 - ortólogos procariotas estrechamente relacionados; P2 - otros ortólogos procariotas
El primer subdominio de la familia de FGE muestra la homología más débil en todos los subgrupos. En los ortólogos eucariotas porta el sitio de N-glicosilación: en el residuo Asn 141 en ser humano, en Asn 139 en el ratón y en Asn 120 en la mosca de la fruta. En Anopheles, no se encontró asparagina en el residuo 130 homólogo a Asn 120 de D.
45 melanogaster. Sin embargo, un cambio de dos nucleótidos crearía un sitio de N-glicosilación en Asn 130 en Anopheles. Por tanto, es necesario volver a secuenciar la secuencia que abarca el residuo 130. El segundo subdominio es rico en triptófanos con 12 Trp en 129 residuos de la FGE humana. Diez de estos triptófanos están conservados en la familia de FGE.
50 Alta conservación del subdominio 3: el subdominio 3 entre ortólogos eucariotas es similar en un 100% e idéntico en un 90%. La importancia del tercer subdominio para la función de la proteína está subrayada por la observación de que este subdominio no es un punto clave para las mutaciones que dan lugar a la enfermedad en pacientes con MSD. Siete de las nueve mutaciones identificadas en seis pacientes con MSD descritos en el ejemplo 1 están ubicadas en secuencias que codifican para los 40 residuos del subdominio 3. Los residuos contienen cuatro
55 cisteínas, tres de las cuales están conservadas entre los ortólogos procariotas y eucariotas. Los dos parálogos eucariotas muestran la menor homología con los otros miembros de la familia de FGE, por ejemplo carecen de dos de las tres cisteínas conservadas del subdominio 3. Las características conservadas entre las secuencias del subdominio 3 de ortólogos y parálogos son el motivo RVXXGG(A)S inicial (SEQ ID NO: 79), un heptámero que contiene tres argininas (residuos 19-25 de la secuencia consenso del subdominio) y el motivo GFR terminal. Una comparación con el dominio DUF323 de las 15 secuencias semillas que no son homólogos estrechos de FGE muestra marcadas diferencias de secuencia: las 15 secuencias de semillas tienen un subdominio primero y segundo menos conservado, aunque la estructura de subdominios global también es visible. El subdominio 3, que está fuertemente conservado en la familia de FGE, es más corto y tiene una homología significativamente más débil en el subdominio 3 de eucariotas (similitud de aproximadamente el 20%) en comparación con los miembros de la familia de FGE de procariotas (similitud de aproximadamente el 60%). Por tanto, todos carecen de los residuos conservados de cisteína del subdominio 3. Las únicas características conservadas son el motivo RVXXGG(A)S inicial (SEQ ID NO: 79) y el motivo GFR terminal.
Organización genómica del gen de FGE humana y murina
El gen de FGE humana está ubicado en el cromosoma 3p26. Abarca 105 kb y 9 exones para la secuencia traducida. El gen de FGE murina tiene una longitud de 80 Kb y está ubicado en el cromosoma 6E2. Los 9 exones del gen de FGE murina tienen casi el mismo tamaño que los exones humanos (figura 3). Las principales diferencias entre el gen de ser humano y el de ratón son la menor conservación de UTR en 3’ en el exón 9 y la longitud de exón 9, que es 461 pb más largo que en el gen murino. El segmento 6E2 del cromosoma 6 de ratón es altamente sinténico al segmento 3p26 del cromosoma humano. Hacia el telómero, tanto los loci de FGE humana como murina están flanqueados por los genes que codifican para LMCD1, KIAA0212, ITPR1, AXCAM, y IL5RA. En la dirección centromérica, ambos loci de FGE están flanqueados por los loci de CAV3 y OXTR.
Organización genómica de los genes de FGE de procariotas
En procariotas, las sulfatasas se clasifican o bien como sulfatasas de tipo cisteína o bien de tipo serina dependiendo del residuo que se convierte en FGly en su centro activo (Miech, C., et al., J Biol Chem., 1998, 273:4835-4837; Dierks, T., et al., J Biol Chem., 1998, 273:25560-25564). En Klebsiella pneumoniae, E. coli y Yersinia pestis, las sulfatasas de tipo serina forman parte de un operón con AtsB, que codifica para una proteína citosólica que contiene motivos de agrupamiento (cluster) de hierro-azufre y son críticos para la generación de FGly a partir de residuos de serina (Marquordt, C., et al., J Biol Chem., 2003, 278:2212-2218; Szameit, C., et al., J Biol Chem., 1999, 274:1537515381).
Por tanto, fue de interés examinar si los genes de FGE procariotas estaban ubicados en la proximidad de sulfatasas de tipo cisteína que son los sustratos de FGE. Entre los genes de FGE procariotas mostrados en la tabla 3, siete tienen genomas completamente secuenciados, lo que permite un análisis de las proximidades de los loci de FGE. De hecho, en cuatro de los 7 genomas (C. efficiens: PID 25028125, P. putida: PID 26990068, C. crescentus: PID 16125425 y M. tuberculosis: PID 15607852) se encontró una sulfatasa de tipo cisteína en proximidad directa con FGE compatible con una cotranscripción de FGE y la sulfatasa. En dos de ellos (C. efficiens y P. putida), FGE y la sulfatasa han sido ORF solapantes, lo que indica fuertemente su coexpresión. Además, la proximidad genómica de los genes de FGE y sulfatasa en cuatro procariotas proporciona una evidencia adicional para suponer que las FEG bacterianas son ortólogos funcionales.
Los tres microorganismos restantes sí tienen sulfatasas de tipo cisteína (S. coelicolor: PID 24413927, M. loti: PID 13476324, S. meliloti: PID 16262963, 16263377, 15964702), sin embargo, los genes próximos a FGE en estos microorganismos ni contienen una secuencia distintiva de sulfatasa canónica (Dierks, T., et al., J Biol Chem., 1998, 273:25560-25564) ni un dominio que indique su función. En estos microorganismos, la expresión de FGE y sulfatasas de tipo cisteína, por tanto, probablemente va a regularse en trans.
Conclusiones
La identificación de FGE humana cuya deficiencia produce la enfermedad de almacenamiento lisosomal transmitida de manera autonómica-recesiva, deficiencia múltiple de sulfatasas, permite la definición de una nueva familia de genes que comprende ortólogos de FGE de procariotas y eucariotas así como un parálogo de FGE en ratón y ser humano. La FGE no se encuentra en genomas completamente secuenciados de E. coli, S. cerevisiae, C. elegans y Fugu rubripes. Además, hay un vacío filogenético entre procariotas y eucariotas superiores, careciéndose de FGE en algunas especies situadas filogenéticamente entre procariotas y D. melanogaster. Sin embargo, algunos de estos eucariotas inferiores, por ejemplo C. elegans, tienen genes de sulfatasa de tipo cisteína. Esto indica la existencia de un segundo sistema de generación de FGly que actúan sobre las sulfatasas de tipo cisteína. Esta suposición está apoyada por la observación de que E. coli, que carece de FGE, puede generar FGly en sulfatasas de tipo cisteína (Dierks, T., et al., J Biol Chem., 1998, 273:25560-25564).
Ejemplo 3:
La expresión de FGE produce aumentos significativos en la actividad sulfatasa en líneas celulares que sobreexpresan una sulfatasa
Se desea examinar los efectos de FGE sobre células que expresan/sobreexpresan una sulfatasa. Para este fin, se transfectaron células HT-1080 que expresan las sulfatasas humanas iduronato 2-sulfatasa (I2S) o Nacetilgalactosamina 6-sulfatasa (GALNS) por duplicado con o bien un constructo de expresión de FGE, pXMG.1.3
5 (tabla 7 y figura 4) o un plásmido control, pXMG.1.2 (FGE en orientación antisentido no puede producir FGE funcional, tabla 7). Se recogieron muestras de los medios 24, 48, y 72 horas tras un cambio de medio tras electroporación de 24 horas. Se sometieron a prueba las muestras de medio para determinar la actividad sulfatasa respectiva mediante ensayo de actividad y el nivel de proteína sulfatasa total estimado mediante ELISA específico para o bien iduronato 2-sulfatasa o N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa.
10 Tabla 6. Líneas celulares transfectadas que expresan sulfatasas usadas como sustratos para transfección
Cepa celular
Plásmido Sulfatasa expresada
36F
XFM4A.1 N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa
30C6
pXI2S6 Iduronato 2-sulfatasa
Tabla 7. Plásmidos de FGE y control usados para transfectar células HT-1080 que expresan iduronato 2-sulfatasa y N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa
Plásmido
Configuración de elementos de secuencia de ADN principales*
pXMG.1.3 (expresión de FGE)
> Potenciador/promotor de CMV de 1,6 kb > ADNc de FGE de 1,1 kb > secuencia no traducida de hGH3’ < amp < casete de DHFR < casete de Cdneo (neomicina fosfotransferasa)
pXMG.1.2 (control, orientación inversa de FGE)
> Potenciador/promotor de CMV de 1,6 kb < ADNc de FGE de 1,1 kb < secuencia no traducida de hGH3’ < amp < casete de DHFR < casete de Cdneo (neomicina fosfotransferasa)
15 * > indica orientación de 5’ a 3’
Procedimientos experimentales
Materiales y métodos
20 Transfección de células HT-1080 que producen iduronato 2-sulfatasa y N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa
Se recogieron células HT-1080 hasta obtener 9-12 x 106 células para cada electroporación. Se transfectaron dos plásmidos por duplicado: uno para someterse a prueba (FGE) y un control; en este caso, el plásmido control
25 contenía el ADNc de FGE clonado en orientación inversa con respecto al promotor de CMV. Se centrifugaron las células a aproximadamente 1000 RPM durante 5 minutos. Se suspendieron las células en 1X PBS a 16x106 células/ml. Se añadieron al fondo de la cubeta de electroporación 100 !g de ADN de plásmido, se añadieron 750 !l de suspensión celular (12x106 células) a la disolución de ADN en la cubeta. Se mezclaron suavemente las células y el ADN con una pipeta de transferencia de plástico, teniendo cuidado de no crear burbujas. Se sometieron las
30 células a electroporación a 450 V, 250 !F (BioRad Gene Pulser). Se registró la constante de tiempo.
Se permitió que las células sometidas a electroporación se asentaran sin alteraciones durante 10-30 minutos. Entonces se añadieron 1,25 ml de DMEM/suero bovino al 10% a cada cubeta, se mezclaron y se transfirieron todas las células a un matraz T75 nuevo que contenía 20 ml de DMEM/10. Tras 24 horas, se volvió a alimentar el matraz
35 con 20 ml de DMEM/10 para eliminar las células muertas. 48-72 horas tras la transfección, se recogieron muestras de los medios y se recogieron las células de los matraces T75 por duplicado.
Preparación del medio
40 1 l de DMEM/10 (contiene: 23 ml de L-glutamina 2 mM,115 ml de suero bovino).
Se transfectaron las células en medios sin metotrexato (MTX). 24 horas después, se volvió a alimentar a las células con medios que contenían las cantidades apropiadas de MTX (36F = MTX 10 !M, 30C6 = MTX 0,1 M). Se recogió el medio y se recogieron las células 24, 48, y 72 horas tras volver a alimentar.
45 Ensayos de actividad
Iduronato 2-sulfatasa (I2S). Se equilibraron columnas de desalación NAP5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) con tampón de diálisis (acetato de sodio 5 mM, Tris 5 mM, pH 7,0). Se aplicó una muestra que 50 contenía I2S a la columna y se permitió que entrara en el lecho. Se eluyó la muestra en 1 ml de tampón de diálisis. Se diluyeron adicionalmente las muestras desaladas hasta aproximadamente I2S 100 ng/ml tampón de reacción (acetato de sodio 5 mM, BSA 0,5 mg/l, Triton X-100 al 0,1 %, pH 4,5). Se añadieron 10 !L de cada muestra de I2S a
la fila superior de una placa fluorimétrica de 96 pocillos (Perkin Elmer, Norwalk, CT) y se preincubó durante 15 minutos a 37ºC. Se preparó el sustrato disolviendo sulfato de 4-metil-umbeliferilo (Fluka, Buchs, Suiza) en tampón de sustrato (acetato de sodio 5 mM, BSA 0,5 mg/l, pH 4,5) a una concentración final de 1,5 mg/ml. Se añadieron 100 !l de sustrato a cada pocillo que contenía muestra de I2S y se incubó la placa durante 1 hora a 37ºC en la oscuridad. Tras la incubación, se añadieron 190 !l de tampón de parada (glicina 332,5 mM, carbonato de sodio 207,5 mM, pH 10,7) a cada pocillo que contenía la muestra. Se preparó 4-metilumbeliferona como disolución madre (4-MUF, Sigma, St. Louis, MO) como patrón de producto en agua de calidad como reactivo hasta una concentración final de 1 !M. Se añadieron 150 !L de la disolución madre de 4-MUF 1 !M y 150 !l de tampón de parada a un pocillo de fila superior en la placa. Se añadieron 150 !L de tampón de parada a cada pocillo restante en la placa de 96 pocillos. Se realizaron diluciones en serie dos veces desde la fila superior de cada columna hasta la última fila de la placa. Se leyó la placa en un analizador de microplacas universal Fusion (Packard, Meriden, CT) con una longitud de onda de filtro de excitación de 330 nm y una longitud de onda de filtro de emisión de 440 nm. Se generó una curva patrón de !moles de disolución madre de 4-MUF frente a fluorescencia, y se extrapoló la fluorescencia de las muestras desconocidas a partir de esta curva. Los resultados se notifican como unidades/ml en las que una unidad de actividad era igual a 1 !mol de 4-MUF producido por minuto a 37ºC.
N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa (GALNS). El ensayo de actividad GALNS hace uso del sustrato fluorescente 4metilumbeliferil-1-D-galactopiranósido-6-sulfato (Toronto Research Chemicals Inc., n.º de catálogo M33448). El ensayo comprendió dos etapas. En la primera etapa, se incubaron 75 !l del sustrato 1,3 mM preparado en tampón de reacción (acetato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,1 M, pH 4,3) durante 4 horas a 37ºC con 10 !l de muestra de proteína/medios o sus diluciones correspondientes. Se detuvo la reacción mediante la adición de 5 !l de fosfato de sodio monobásico 2 M para inhibir la actividad GALNS. Tras la adición de aproximadamente 500 U de 1galactosidasa de Aspergillus oryzae (Sigma, n.º de catálogo G5160), se incubó la mezcla de reacción a 37ºC durante una hora adicional para liberar el resto fluorescente del sustrato. Se detuvo la segunda reacción mediante la adición de 910 !l de disolución de parada (glicina al 1%, carbonato de sodio al 1%, pH 10,7). Se midió la fluorescencia de la mezcla resultante mediante el uso de una longitud de onda de medición de 359 nm y una longitud de onda de referencia de 445 nm con 4-metilumbeliferona (sal sódica de Sigma, n.º de catálogo M1508) que sirve como patrón de referencia. Una unidad de la actividad corresponde a nmoles de 4-metilumbeliferona liberados por hora.
Inmunoensayos (ELISA)
Iduronato 2-sulfatasa (I2S). Se recubrió una placa de fondo plano de 96 pocillos con un anticuerpo anti-I2S monoclonal de ratón diluido hasta 10 !g/ml en bicarbonato de sodio 50 nM pH 9,6 durante 1 hora a 37ºC. Se desarrolló el anticuerpo anti-I2S monoclonal de ratón por contrato por Maine Biotechnology Services, Inc. (Portland, ME) hasta dar lugar a un polipéptido de I2S humano, de longitud completa, producido de manera recombinante, purificado usando tecnología de producción de hibridomas convencional. Se lavó la placa 3 veces con 1X PBS que contenía Tween-20 al 0,1% y se bloqueó durante 1 hora con BSA al 2% en tampón de lavado a 37ºC. Se usó tampón de lavado con BSA al 2% para diluir las muestras y los patrones. Se diluyó el patrón de I2S y se usó desde 100 ng/ml hasta 1,56 ng/ml. Tras la eliminación del tampón de bloqueo, se aplicaron las muestras y los patrones a la placa y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Se diluyó el anticuerpo de detección, anticuerpo anti-I2S de ratón conjugado con peroxidasa de rábano, hasta 0,15 !g/ml en tampón de lavado con BSA al 2%. Se lavó la placa 3 veces, se añadió el anticuerpo de detección a la placa y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Para revelar la placa, se preparó el sustrato TMB (Bio-Rad, Hercules, CA). Se lavó la placa 3 veces, se añadieron 100 !l de sustrato a cada pocillo y se incubó durante 15 minutos a 37ºC. Se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 2 N (100 !l/pocillo) y se leyó la placa en un lector de placas de microtitulación a 450 nm, usando 655 nm como la longitud de onda de referencia.
N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa (GALNS). Dos anticuerpos anti-GALNS monoclonales de ratón proporcionaron la base del ELISA de GALNS. Los anticuerpos anti-GALNS monoclonales de ratón también se desarrollaron por contrato por Maine Biotechnology Services, Inc. (Portland, ME) hasta dar lugar a un polipéptido de GALNS humano, de longitud completa, producido de manera recombinante, purificado usando tecnología de producción de hibridomas convencional. Se usó el primer anticuerpo para la captura de GALNS para recubrir una placa F96 MaxiSorp Nunc-Immuno (Nalge Nunc, n.º de catálogo 442404) en un tampón de recubrimiento (bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9,6). Tras la incubación durante una hora a 37ºC y el lavado con un tampón de lavado, se bloqueó la placa con un tampón de bloqueo (PBS, Tween-20 al 0,05%, BSA al 2%) durante una hora a 37ºC. Entonces se cargaron en la placa las muestras experimentales y de control junto con los patrones de GALNS y se incubaron adicionalmente durante una hora a 37ºC. Tras el lavado con un tampón de lavado, se aplicó el segundo anticuerpo de detección conjugado con HRP en tampón de bloqueo seguido por incubación de 30 minutos a 37ºC. Tras lavar la placa de nuevo, se añadió el reactivo de sustrato de TMB de Bio-Rad y se incubó durante 15 minutos. Entonces se añadió ácido sulfúrico 2 N para detener la reacción y se obtuvieron los resultados espectrofotométricamente usando un lector de placas de Molecular Device a una longitud de onda de 450 nm.
Discusión
Efecto de FGE sobre la actividad sulfatasa
GALNS. Se observó un aumento de aproximadamente 50 veces en la actividad GALNS total con respecto a los niveles control (figura 5). Se observó este nivel de actividad aumentada con los tres puntos de tiempo de toma de muestras de medio. Además, la actividad GALNS se acumuló linealmente a lo largo del tiempo con un aumento de cuatro veces entre las 24 y las 48 horas y un aumento de dos veces entre los puntos de tiempo de 48 horas y 72 horas.
I2S. Aunque de menor magnitud absoluta, se observó un efecto similar para la actividad I2S total, observándose un aumento de aproximadamente 5 veces en la actividad I2S total con respecto a los niveles control. Este nivel de actividad aumentada se mantuvo durante la duración del experimento. La actividad I2S se acumuló en el medio linealmente a lo largo del tiempo, de manera similar a los resultados observados con GALNS (2,3 veces entre las 24 y las 48 horas, y 1,8 veces entre las 48 y las 72 horas).
Efecto de FGE sobre la actividad sulfatasa específica
GALNS. La expresión de FGE en células 36F potenció la actividad específica aparente de GALNS (razón de actividad enzimática con respecto a enzima total estimada mediante ELISA) en 40-60 veces con respecto a los niveles control (figura 6). El aumento en la actividad específica se mantuvo durante los tres puntos de tiempo en el estudio y pareció aumentar durante los tres días de acumulación tras la transfección.
I2S. Se observó un efecto similar con I2S, observándose un aumento de 6-7 veces en la actividad específica (3-5 U/mg) con respecto a los valores control (0,5-0,7 U/mg).
Los valores del ELISA tanto para GALNS (figura 7) como para I2S no resultaron significativamente afectados por la transfección de FGE. Esto indica que la expresión de FGE no afecta a las rutas de traducción y secreción implicadas en la producción de sulfatasa.
En resumen, todos estos resultados para ambas sulfatasas indican que la expresión de FGE aumenta espectacularmente la actividad específica de sulfatasa en líneas celulares que sobreexpresan GALNS e I2S.
Coexpresión de FGE (SUMF1) y otros genes de sulfatasa
Para someter a prueba el efecto de FGE (SUMF1) sobre actividades sulfatasa adicionales en células normales se sobreexpresó ADNc de ARSA (SEQ ID NO: 14), ARSC (SEQ ID NO: 18) y ARSE (SEQ ID NO: 22) en diversas líneas celulares con y sin cotransfección del ADNc de FGE (SUMF1) y se midieron las actividades sulfatasa. La sobreexpresión de ADNc de sulfatasa en células Cos-7 dio como resultado un aumento moderado de la actividad sulfatasa, mientras que se observó un sorprendente aumento sinérgico (de 20 a 50 veces) cuando se coexpresaron tanto un gen de sulfatasa como un gen de FGE (SUMF1). Se observó un efecto similar, aunque inferior, en tres líneas celulares adicionales, HepG2, LE293 y U2OS. La sobreexpresión simultánea de múltiples ADNc de sulfatasa dio como resultado un aumento inferior de cada actividad sulfatasa específica en comparación con la sobreexpresión de una única sulfatasa, lo que indica la presencia de competición de las diferentes sulfatasas por la maquinaria de modificación.
Para someter a prueba la conservación funcional del gen de FGE (SUMF1) durante la evolución se sobreexpresión ADNc de ARSA, ARSC y ARSE en diversas líneas celulares con y sin cotransfección del ADNc de MSD y se midieron las actividades sulfatasa. Tanto los genes de FGE (SUMF1) murinos como los de Drosophila eran activos en las tres sulfatasas humanas, siendo la FGE (SUMF1) de Drosophila menos eficaz. Estos datos demuestran un alto grado de conservación funcional de FGE (SUMF1) durante la evolución, lo que implica una importancia biológica significativa para la función y supervivencia celulares. Se observó un efecto similar y constante, aunque mucho más débil, usando el gen de FGE2 (SUMF2), lo que sugiere que la proteína codificada por este gen también tiene una actividad modificante de sulfatasa. Estos datos demuestran que la cantidad de la proteína FGE (SUMF1) codificada es un factor limitante para las actividades sulfatasa, un hallazgo con importantes implicaciones para la producción a gran escala de sulfatasas activas que van a utilizarse en la terapia de sustitución de enzimas.
Ejemplo 4:
Identificación del gen mutado en MSD por medio de complementación funcional usando transferencia de cromosomas mediada por microcélulas.
En un experimento separado usando transferencia de cromosomas mediada por microcélulas por medio de complementación funcional se confirmó que el gen mutado en MSD es FGE. Los hallazgos proporcionan un punto de vista adicional en un mecanismo biológico novedoso que afecta a una familia de proteínas entera en organismos relacionados de manera distante. Además de identificar la base molecular de una enfermedad genética poco frecuente, los datos confirman además un efecto de potenciación poderoso del producto génico de FGE sobre la actividad de sulfatasas. Este último hallazgo tiene implicaciones clínicas directas para la terapia de al menos ocho enfermedades humanas producidas por deficiencias de sulfatasa.
5 El gen para MSD mapea en el cromosoma 3p26
Para identificar la ubicación cromosómica del gen mutado en MSD, se intentó rescatar las enzimas deficientes en sulfatasa mediante complementación funcional a través de transferencia de cromosomas mediada por microcélulas. Se usó un panel de líneas celulares híbridas humanas/de ratón, que contenían cromosomas humanos normales 10 individuales marcados con el marcador seleccionable dominante HyTK, como fuente de cromosomas humanos donadores y se fusionaron a una línea celular inmortalizada de un paciente con MSD. Se transfirieron los 22 autosomas humanos uno por uno a la línea celular del paciente y se seleccionaron los híbridos en higromicina. Aproximadamente se recogieron 25 colonias supervivientes en cada uno de los 22 experimentos de transferencia. Se hicieron crecer éstas por separado y se recogieron para las pruebas enzimáticas posteriores. Se sometieron a 15 prueba las actividades arilsulfatasa A (ARSA) (SEQ ID NO: 15), arilsulfatasa B (ARSB) (SEQ ID NO: 17), y arilsulfatasa C (ARSC) (SEQ ID NO: 19) para cada uno de los aproximadamente 440 clones (20 x 22). Este análisis indicó claramente que las actividades sulfatasa de varios clones que se derivaban de la transferencia del cromosoma 3 eran significativamente superiores en comparación con las de los otros clones. Se observó una variabilidad sorprendente cuando se analizaron las actividades de cada clon individual a partir de la transferencia del 20 cromosoma. Para verificar si cada clon tenía un cromosoma 3 humano intacto procedente de la línea celular donadora, se usó un panel de 23 marcadores genéticos polimórficos del cromosoma 3, distribuidos de manera uniforme a lo largo de la longitud del cromosoma y seleccionados previamente partiendo de la base de tener diferentes alelos entre las líneas celulares donadoras y del paciente. Esto permitió examinar la presencia del cromosoma donador e identificar la posible pérdida de regiones específicas debido a la rotura cromosómica 25 imprevista. Cada clon que tenía alta actividad enzimática conservaba el cromosoma 3 completo procedente de la línea celular donadora, mientras que los clones con bajas actividades parecían haber perdido el cromosoma completo partiendo de la base de la ausencia de alelos del cromosoma 3 procedentes de la línea celular donadora. Estos últimos clones conservaban probablemente una región pequeña del cromosoma donador que contenía el gen marcador seleccionable que les permitía sobrevivir en medio que contenía higromicina. Estos datos indican que un
30 cromosoma 3 humano normal podía complementar el defecto observado en la línea celular del paciente con MSD.
Para determinar la región cromosómica específica que contenía el gen responsable para la actividad de complementación, se usaron híbridos del cromosoma 3 marcados con Neo que se encontró que habían perdido varias partes del cromosoma. Además, se realizó transferencia de cromosomas mediada por microcélulas irradiadas 35 de cromosomas 3 humanos marcados con HyTK. Se sometieron a prueba ciento quince híbridos irradiados de cromosoma 3 para determinar las actividades sulfatasa y se obtuvo el genotipo usando un panel de 31 marcadores microsatétiles polimórficos que abarcaban el cromosoma completo. Todos los clones que presentaban altas actividades enzimáticas parecían tener el cromosoma 3p26 conservado. Un análisis de resolución superior usando marcadores adicionales de esta región mapeó la posible ubicación para el gen de complementación entre los
40 marcadores D3S3630 y D3S2397.
Identificación del gen mutado en MSD
Se investigaron los genes de la región genómica 3p26 para determinar mutaciones en pacientes con MSD. Se
45 amplificó por PCR cada exón incluyendo las uniones de corte y empalme y se analizó mediante secuenciación directa. Se realizó el análisis de mutación en doce individuos afectados no relacionados; cinco pacientes con MSD descritos anteriormente y siete casos no publicados. Se identificaron varias mutaciones de la cohorte de MSD en el marcador de secuencia expresada (EST) AK075459 (SEQ ID NO: 4,5), que correspondía a un gen de función desconocida, lo que sugiere fuertemente que éste era el gen implicado en MSD. Se encontró que cada mutación
50 estaba ausente en 100 individuos control, excluyendo así la presencia de un polimorfismo de secuencia. Se realizó un análisis de mutación de confirmación adicional en ARN de pacientes sometidos a transcripción inversa, particularmente en aquellos casos en los que el análisis del ADN genómico reveló la presencia de una mutación en o cerca de un sitio de corte y empalme, que afecta posiblemente al corte y empalme. También se identificaron mutaciones de cambio de marco, terminadora, de corte y empalme y de aminoácido, lo que sugiere que la
55 enfermedad está producida por un mecanismo de pérdida de función, tal como se prevé para un trastorno recesivo. Esto también concuerda con la observación de que casi todas las mutaciones de aminoácido afectan a aminoácidos que están altamente conservados a lo largo de la evolución (véase a continuación).
Tabla 8: Mutaciones en MSD adicionales identificadas
Caso
referencia fenotipo exón cambio de nucleótido cambio de aminoácido
1. BA426
Conary et al, 1988 moderado 3 463T>C S 155P
3
463T>C S155P
2. BA428
Burch et al, 1986 neonatal grave 5 661delG cambio de marco
3.
BA431 Zenger et al, 1989 moderado 1 2T>G MIR 2 276delC cambio de marco
4.
BA799 Burk et al, 1981 leve-moderado 3 463T>C S155P 3 463T>C S155P
5.
BA806 no publicado neonatal grave 9 1045T>C R349W
6.
BA807 Schmidt et al, 1995 desconocido 3 c519+4delGTAA salto de ex 3 9 1076C>A S359X
7.
BA809 Couchot et al, 1974 leve-moderado 1 1A>G M1V 9 1042G>C A348P
8.
BA810 no publicado grave 8 1006T>C C336R 9 1046G>A R349Q
9.
BA811 no publicado neonatal grave 3 c519+4delGTAA salto de ex 3 8 979C>T R327X
10.
BA815 no publicado moderado 5 c.603-6delC salto de ex 6 6 836C>T A279V
11.
BA919 no publicado leve-moderado 9 1033C> T R345C 9 1033C>T R345C
12.
BA920 no publicado moderado 5 653G>A C218Y 9 1033C>T R345C
Se identificaron mutaciones en cada paciente con MSD sometido a prueba, excluyendo así la heterogeneidad de locus. No se observó correlación obvia entre los tipos de mutaciones identificados y la gravedad del fenotipo notificado en los pacientes, lo que sugiere que la variabilidad clínica no está producida por heterogeneidad alélica. 5 En tres casos, se encontró que diferentes pacientes (casos 1 y 4, casos 6 y 9, y casos 11 y 12 en la tabla 6) portaban la misma mutación. Dos de estos pacientes (casos 11 y 12) proceden de la misma ciudad en Sicilia, lo que sugiere la presencia de un efecto fundador que de hecho se confirmó mediante análisis de haplotipos. Sorprendentemente, se encontró que la mayoría de los pacientes se componía de heterocigotos que portaban diferentes mutaciones alélicas, mientras que sólo algunos eran homocigotos. Aunque compatible con la ausencia de
10 consaguineidad notificada por los progenitores, este fue un hallazgo algo inesperado para un trastorno recesivo muy poco frecuente tal como MSD.
El gen y la proteína FGE
15 Se reunió la secuencia de ADNc consenso del ADNc de la FGE humana (también usada de manera intercambiable en el presente documento como SUMF1) (SEQ ID NO: 1) a partir de varios clones de marcador de secuencia expresada (EST) y parcialmente a partir de la secuencia genómica correspondiente. El gen contiene nueve exones y abarca aproximadamente 105 kb (véase el ejemplo 1). La comparación de secuencias también identificó la presencia de un gen de FGE parálogo ubicado en el cromosoma 7 humano que se designó FGE2 (también usado de
20 manera intercambiable en el presente documento como SUMF2) (SEQ ID NO: 45, 46).
Complementación funcional de deficiencias de sulfatasa
Se infectaron fibroblastos de dos pacientes (casos 1 y 12 en la tabla 8) con MSD en los que se identificaron
25 mutaciones del gen de FGE (SUMF1) (líneas celulares BA426 y BA920) con virus VHS que contenían el tipo natural y dos formas mutada del ADNc de FGE (SUMF1) (R327X y Lex3). Se sometieron a prueba las actividades ARSA, ARSB y ARSC 72 horas tras la infección. La expresión del ADNc de FGE de tipo natural (SUMF1) dio como resultado la complementación funcional de las tres actividades, mientras que el ADNc de FGE (SUMF1) mutante no (tabla 9). Estos datos proporcionan una evidencia concluyente para la identidad de FGE (SUMF1) como el gen en
30 MSD y demuestran la relevancia funcional de las mutaciones encontradas en los pacientes. Las mutaciones asociadas con la enfermedad dan como resultado deficiencia de sulfatasa, demostrando por tanto que FGE (SUMF1) es un factor esencial para la actividad sulfatasa.
Tabla 9: Complementación funcional de deficiencias de sulfatasa Línea celular receptora con MSD Constructo ARSA(1) ARSB(1) ARSC(1)
BA426 amplicón de VHS 24,0 22,5 0,15 SUMF1-Lex3 42,0 23,8 0,29 SUMF1-R327X 33,6 24,2 0,16 SUMF1 119,5 (4,9 x) 37,8 (1,7 x) 0,62 (4,1 x)
BA920 amplicón de VHS 16,6 11,3 0,15 SUMF1-Lex3 17,2 14,4 0,07 SUMF1-R327X 36,0 13,5 0,13 SUMF1 66,5 (4,0 x) 21,6 (1,9 x) 0,42 (2,8 x)
Intervalo de control 123,7 – 394,6 50,6 – 60,7 1,80 – 1,58
(1)Todas las actividades enzimáticas se expresan como nmoles de 4-metilumbeliferona liberados por mg de proteína-1. 3 h. Se infectaron las líneas celulares BA426 y BA920 de MSD con el amplicón de VHS solo, y con constructos que portaban o bien el ADNc de SUMF1 mutante o bien de tipo natural. El aumento de las actividades arilsulfatasas individuales en fibroblastos infectados con el gen de SUMF1 de tipo natural,
5 en comparación con el de las células infectadas con el vector solo, se indica entre paréntesis. Se indican las actividades medidas en los fibroblastos control no infectados.
Base molecular de MSD
10 Basándose en la hipótesis de que el gen de la enfermedad debe poder complementar la deficiencia enzimática en una línea celular del paciente, se realizó transferencia de cromosomas mediada por microcélulas a una línea celular inmortalizada de un paciente con MSD. Esta técnica se ha usado satisfactoriamente para la identificación de genes cuya función predicha podía evaluarse en líneas celulares (por ejemplo midiendo la actividad enzimática o detectando características morfológicas). Para abordar el problema de la variabilidad estocástica de la actividad
15 enzimática se midieron las actividades de tres sulfatasas diferentes (ARSA, ARSB y ARSC) en el ensayo de complementación. Los resultados de la transferencia de cromosomas indicaron claramente el mapeo del gen de complementación en el cromosoma 3. Se logró un mapeo subregional generando un panel de híbridos de radiación para el cromosoma 3. Se caracterizaron clones híbridos individuales tanto a nivel genómico, tipificando 31 marcadores microsatélites que presentaban diferentes alelos entre las líneas celulares donadoras y receptoras,
20 como a nivel funcional sometiendo a prueba las actividades sulfatasa. El análisis de 130 de tales híbridos dio como resultado el mapeo de la región de complementación en el cromosoma 3p26.
Una vez definida la región genómica crítica, también se identificó el gen de FGE (SUMF1) mediante análisis de mutación en ADN de los pacientes. Se encontraron mutaciones en todos los pacientes sometidos a prueba, lo que 25 demuestra que un único gen está implicado en la MSD. Las mutaciones encontradas eran de diferentes tipos, dando como resultado la mayoría (por ejemplo sitio de corte y empalme, sitio de inicio, terminadora, de cambio de marco) posiblemente una función perdida de la proteína codificada, tal como se espera para una enfermedad recesiva. La mayoría de las mutaciones de aminoácido afectan a codones correspondientes a aminoácidos que están altamente conservados durante la evolución, lo que sugiere que estas mutaciones también producen una pérdida de función.
30 No pudieron establecerse correlaciones entre el tipo de mutación y la gravedad del fenotipo, lo que indica que este último se debe a factores no relacionados. De manera inesperada para una enfermedad genética poco frecuente, se encontró que muchos pacientes se componían de heterocigotos, que portaban dos mutaciones diferentes. Sin embargo, se identificó un efecto fundador para una mutación que se originó en una pequeña ciudad de Sicilia.
35 Función del gen de FGE (SUMF1)
Se demostró de manera definitiva la identidad del gen de FGE (SUMF1) como el “factor de complementación” rescatando la deficiencia enzimática de cuatro sulfatasas diferentes con la expresión del ADNc de FGE (SUMF1) exógeno, insertado en un vector viral, en dos líneas celulares de pacientes diferentes. En cada caso se observó un 40 restablecimiento constante, aunque parcial, de todas las actividades sometidas a prueba, en comparación con las líneas celulares de pacientes control transfectadas con vectores vacíos. Como promedio, el aumento de las actividades enzimáticas osciló entre 1,7 y 4,9 veces y alcanzó aproximadamente la mitad de los niveles observados en las líneas celulares normales. La actividad enzimática se correlaciona con el número de partículas virales usadas en cada experimento y con la eficacia de la infección tal como se somete a prueba mediante un análisis con proteína
45 marcadora (GFP). En los mismos experimentos, se usaron vectores que contenían ADNc de FGE (SUMF1) que portaban dos de las mutaciones encontradas en los pacientes, R327X y Lex3, y no se observó aumento significativo de la actividad enzimática, demostrando así la relevancia funcional de estas mutaciones.
Tal como se menciona en otra parte en el presente documento, Schmidt et al. descubrieron en primer lugar que las sulfatasas experimentan una modificación tras la traducción de una cisteína altamente conservada, que se encuentra en el sitio activo de la mayoría de las sulfatasas, a Ca-formilglicina. También demostraron que esta modificación era defectuosa en MSD (Schmidt, B., et al., Cell, 1995, 82:271-278). Los datos funcionales y de mutación proporcionan una fuerte evidencia de que FGE (SUMF1) es responsable de esta modificación.
El gen de FGE (SUMF1) muestra un grado extremadamente alto de conservación de secuencia en todas las especies relacionadas de manera distante analizadas, desde las bacterias hasta el hombre. Se proporciona evidencia de que el homólogo de Drosophila del gen de FGE humana (SUMF1) puede activar sulfatasas humanas sobreexpresadas, demostrando que el alto nivel de similitud de secuencia observado de los genes de FGE (SUMF1) de especies relacionadas de manera distante se correlaciona con una conservación funcional sorprendente. Una excepción notable son las levaduras, que parecen carecer del gen de FGE (SUMF1) así como de cualquier gen que codifique para sulfatasas, lo que indica que este microorganismo no requiere la función sulfatasa y sugiere la presencia de una influencia recíproca en la evolución de los genes de FGE (SUMF1) y sulfatasas.
Resulta interesante que hay dos genes homólogos, FGE (SUMF1) y FGE2 (SUMF2), en los genomas de todos los vertebrados analizados, incluyendo los seres humanos. Como resulta evidente a partir del árbol filogenético, el gen de FGE2 (SUMF2) parece haber evolucionado independientemente del gen de FGE (SUMF1). En los ensayos, el gen de FGE2 (SUMF2) también puede activar sulfatasas, sin embargo lo hace de una manera mucho menos eficaz en comparación con el gen de FGE (SUMF1). Esto puede explicar la actividad sulfatasa residual encontrada en pacientes con MSD y sugiere que una deficiencia de sulfatasa completa sería letal. En este momento no se puede descartar la posibilidad de que el gen de FGE2 (SUMF2) tenga una función adicional, todavía desconocida.
Efecto sobre la terapia de enfermedades debidas a deficiencias de sulfatasas
Se observó un fuerte aumento, de hasta 50 veces, de las actividades sulfatasa en células que sobreexpresan ADNc de FGE (SUMF1) junto con o bien ADNc de ARSA, ARSC, o bien ARSE, en comparación con células que sobreexpresan sulfatasas individuales solas. En todas las líneas celulares se encontró un efecto sinérgico significativo, lo que indica que FGE (SUMF1) es un factor limitante para la actividad sulfatasa. Sin embargo, se observó variabilidad entre diferentes sulfatasas, posiblemente debido a la diferente afinidad de la proteína codificada por FGE (SUMF1) con las diversas sulfatasas. También se observó variabilidad entre diferentes líneas celulares que pueden tener diferentes niveles de enzima generadora de formilglicina endógena. Compatible con estas observaciones, se encontró que la expresión del gen de MSD varía entre diferentes tejidos, con niveles significativamente altos en riñón e hígado. Esto puede tener implicaciones importantes, ya que los tejidos con bajos niveles de expresión del gen de FGE (SUMF1) pueden ser menos capaces de modificar de manera eficaz las proteínas sulfatasas suministradas de manera exógena (véase más adelante). Estos datos juntos sugieren que la función del gen de FGE (SUMF1) ha evolucionado para lograr un sistema de regulación doble, controlándose cada sulfatasa tanto mediante un mecanismo individual, responsable de los niveles de ARNm de cada gen de sulfatasa estructural, como mediante un mecanismo común compartido por todas las sulfatasas. Además, FGE2 (SUMF2) proporciona redundancia parcial para la modificación de sulfatasas.
Estos datos tiene profundas implicaciones para la producción en masa de sulfatasas activas que van a utilizarse en la terapia de sustitución de enzimas. Se han notificado estudios de sustitución de enzimas en modelos animales de deficiencias de sulfatasas, tales como un modelo fenilo de mucopolisacaridosis VI, y se ha demostrado que son eficaces para prevenir y curar diversos síntomas. En la actualidad se están realizando ensayos terapéuticos en seres humanos para dos trastornos congénitos debidos a deficiencias de sulfatasas, MPSII (síndrome de Hunter) y MPSVI (síndrome de Maroteaux-Lamy) y pronto se ampliará a un número mayor de pacientes.
Ejemplo 5:
Terapia de sustitución de enzimas con GALNS activada por FGE para MPS IVA de la enfermedad de Morquio
La causa principal de la patología esquelética en pacientes con Morquio es la acumulación de queratán sulfato (KS) en condrocitos del disco epifisario (placa de crecimiento) debido a la deficiencia de la sulfatasa lisosomal, GALNS. El objetivo primario de estudios de investigación in vivo fue determinar si GALNS activada por FGE administrada por vía intravenosa (i.v.) podía penetrar en los condrocitos de la placa de crecimiento, así como en otros tipos celulares apropiados en ratones normales. Pese a la falta general de anomalías del esqueleto, también se usó un modelo de ratón deficiente en GALNS (Morquio Knock-In-MKI, S. Tomatsu, Universidad de St. Louis, MO) para demostrar la actividad bioquímica in vivo de GALNS activada por FGE administrada repetidamente. La falta de patología esquelética en los modelos de ratón refleja el hecho de que el KS esquelético o bien está enormemente reducido o bien está ausente en roedores (Venn G, & Mason RM., Biochem J., 1985, 228:443-450). Sin embargo, estos ratones sí demostraron acumulación detectable de GAG y otras anomalías celulares en diversos órganos y tejidos. Por tanto, el objetivo global de los estudios fue demostrar que GALNS activada por FGE penetra en la placa de crecimiento (estudio de biodistribución) y demuestran la actividad enzimática de GALNS funcional dirigida hacia la eliminación de GAG acumulados en los tejidos afectados (estudio farmacodinámico).
Los resultados de estos estudios demuestran que GALNS activada por FGE inyectada por vía i.v. se internalizó por los condrocitos de la placa de crecimiento, aunque a niveles relativamente bajos en comparación con otros tejidos. Además, la inyección de GALNS activada por FGE durante el transcurso de 16 semanas en ratones MKI produjo el aclaramiento eficaz de los GAG acumulados y redujo la tinción con biomarcador lisosomal en todos los tejidos blandos examinados. En resumen, los experimentos demuestran satisfactoriamente el suministro de GALNS a los condrocitos de la placa de crecimiento y demuestran la actividad bioquímica en lo que se refiere al aclaramiento de GAG en múltiples tejidos.
Estudio de biodistribución
Se administró a ratones ICR (normales) de cuatro semanas de edad una única inyección i.v. de 5 mg/kg de GALNS activada por FGE. Se recogieron el hígado, fémur (hueso), corazón, riñón y bazo dos horas tras la inyección y se prepararon para el examen histológico. Se usó un anticuerpo monoclonal anti-GALNS humano para detectar la presencia de GALNS inyectada en los diversos tejidos. Se detectó GALNS en todos los tejidos examinados en comparación con los controles con vehículo. Además, GALNS se observó fácilmente en todos los tejidos examinados usando un sistema indicador con peroxidasa de rábano, con la excepción del hueso. La demostración de la captación de GALNS en la placa de crecimiento requirió el uso de un sistema indicador de isotiocianato de fluoresceína (FTTC) más sensible e indica que aunque GALNS penetra en la placa de crecimiento, está menos fácilmente disponible para los condrocitos de la placa de crecimiento que para las células de los tejidos blandos. Pese al requisito de un método de detección de fluorescencia más sensible, se observó el suministro de GALNS a los condrocitos de la placa de crecimiento ósea en todos los cortes de placa de crecimiento observados en comparación con los controles con vehículo.
Estudio farmacodinámico en ratones MKI
Se administraron a ratones MKI o de tipo natural de cuatro semanas de edad inyecciones i.v. administradas semanalmente (n = 8 por grupo) hasta las 20 semanas de edad. Cada inyección semanal consistió en o bien 2 mg/kg de GALNS activada por FGE o bien control con vehículo (sin inyección para los ratones de tipo natural). Se sacrificaron todos los animales para realizar el examen histológico a las 20 semanas de edad y se tiñeron usando los siguientes métodos: hematoxilina y eosina para determinar la morfología celular, azul alciano para la detección de GAG.
Se demostró el aclaramiento de los GAG acumulados mediante tinción con azul alciano reducida o ausente en todos los tejidos blandos examinados (hígado, corazón, riñón y bazo). Esto se observó sólo en los ratones a los que se inyectó GALNS. Aunque la placa de crecimiento en los ratones MKI funcionaba normalmente tal como se demuestra por una morfología esquelética normal, hubo más anomalías celulares sutiles observadas (incluyendo vacuolización de condrocitos sin efecto patológico aparente). Los condrocitos vacuolizados de las zonas hipertróficas y proliferativas en las placas de crecimiento no resultaron afectados por el suministro de GALNS. Esto contrastó con los condrocitos en la zona de calcificación de la placa de crecimiento en los que se observó una reducción de la vacuolización en los ratones a los que se inyectó GALNS. La vacuolización de los condrocitos y la acumulación de GAG supuestamente distintos de KS en la placa de crecimiento en los ratones MKI fueron, en general, sorprendentes e inesperadas debido a la falta conocida de KS en la placa de crecimiento en ratones. Estas observaciones particulares reflejan probablemente el hecho de que, en ratones knock-in, están presentes altos niveles de GALNS mutante (en contraposición a los ratones knock-out en los que no hay GALNS mutante residual, ni vacuolización de condrocitos de la placa de crecimiento ni acumulación de GAG - Tomatsu S. et al., Human Molecular Genetics, 2003, 12:3349-3358). El fenómeno de vacuolización en la placa de crecimiento puede ser indicativo de un efecto secundario de un subconjunto de células que expresan GALNS mutante. No obstante, la inyección de enzima durante el transcurso de 16 semanas demostró una fuerte evidencia del suministro de GALNS activada por FGE a múltiples tejidos y de la actividad enzimática in vivo.
Descripción detallada de los dibujos
Figura 1: Espectros de masas MALDI-TOF de P23 tras la incubación en ausencia (A) o presencia (B) de un extracto soluble de microsomas de testículos bovinos. Se incubaron 6 pmol de P23 en condiciones normales durante 10 min. a 37ºC en ausencia o presencia de 1 !l de extracto microsomal. Se prepararon las muestras para espectrometría de masas MALDI-TOF tal como se describe en Procedimientos experimentales. Se indican las masas monoisotrópicas MH+ de P23 (2526,28) y su derivado de FGly (2508,29).
Figura 2: �?rbol filogenético derivado de una alineación de FGE humana y 21 proteínas de la semilla DUF323 en PFAM. Los números de las ramas indican distancia filogenética. Las proteínas se designan mediante su número ID de TrEMBL y el nombre de la especie. hFGE - FGE humana. Parte superior derecha: escala de las distancias filogenéticas. Un asterisco indica que el gen se ha investigado adicionalmente. Los siete genes superiores forman parte de la familia de genes de FGE.
Figura 3: Organización del locus del gen de FGE humana y murina. Los exones se muestran a escala como cuadros oscuros (locus humano) y cuadros claros (locus murino). La barra en la esquina inferior derecha muestra la escala.
Las líneas entre los exones muestran los intrones (que no están a escala). Los números encima de las líneas de intrón indican el tamaño de los intrones en kilobases.
Figura 4: Diagrama que muestra un mapa de plásmido pXMG.1.3 de expresión de FGE
Figura 5: Gráfico de barras que representa actividad N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa en células 36F transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE. Se transfectaron las células con bien un plásmido control, pXMG.1.2, con el ADNc de FGE en la orientación inversa, o bien un plásmido de expresión de FGE, pXMG.1.3 en medios sin metrotrexato (MTX). Se volvió a alimentar a las células 24 horas más tarde con medios que contenían MTX 1,0 !M. Se recogió el medio y se recogieron las células 24, 48, y 72 horas tras volver a alimentar. Se determinó la actividad N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa mediante el ensayo de actividad. Cada valor mostrado es el promedio de dos transfecciones separadas indicándose las desviaciones estándar mediante barras de error.
Figura 6: Gráfico de barras que representa actividad específica N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa en células 36F transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE. Se transfectaron las células con bien un plásmido control, pXMG.1.2, con el ADNc de FGE en la orientación inversa, o bien un plásmido de expresión de FGE, pXMG.1.3 en medios sin metrotrexato (MTX). Se volvió a alimentar a las células 24 horas más tarde con medios que contenían MTX 1,0 !M. Se recogió el medio y se recogieron las células 24, 48, y 72 horas tras volver a alimentar. Se determinó la actividad específica N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa mediante el ensayo de actividad y ELISA y se representa como la razón de actividad N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa por mg de Nacetilgalactosamina 6-sulfatasa reactiva en ELISA. Cada valor mostrado es el promedio de dos transfecciones separadas.
Figura 7: Gráfico de barras que representa producción de N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa en células 36F transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE. Se transfectaron las células con bien un plásmido control, pXMG.1.2, con el ADNc de FGE en la orientación inversa, o bien un plásmido de expresión de FGE, pXMG.1.3 en medios sin metrotrexato (MTX). Se volvió a alimentar a las células 24 horas más tarde con medios que contenían MTX 1,0 !M. Se recogió el medio y se recogieron las células 24, 48, y 72 horas tras volver a alimentar. Se determinó la proteína total N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa mediante ELISA. Cada valor mostrado es el promedio de dos transfecciones separadas indicándose las desviaciones estándar mediante barras de error.
Figura 8: Gráfico que representa actividad iduronato 2-sulfatasa en células 30C6 transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de FGE. Se transfectaron las células con bien un plásmido control, pXMG.1.2, con el ADNc de FGE en la orientación inversa, o bien un plásmido de expresión de FGE, pXMG.1.3 en medios sin metrotrexato (MTX). Se volvió a alimentar a las células 24 horas más tarde con medios que contenían MTX 1,0 !M. Se recogió el medio y se recogieron las células 24, 48, y 72 horas tras volver a alimentar. Se determinó la actividad iduronato 2-actividad mediante el ensayo de actividad. Cada valor mostrado es el promedio de dos transfecciones separadas.
Figura 9: Representa un kit que incluye características de la presente invención.
Todas las referencias dadas a conocer en el presente documento se incorporan como referencia en su totalidad. Lo que se reivindica se presenta a continuación y va seguido por una lista de secuencias.
Lista de secuencias
<110> Transkaryotic Therapies, Inc. von Figura, Kart Schmidt, Bernhard Dierks, Thomas Heartlein, Michael W. Cosma, Maria P. Ballabio, Andrea
<120> DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE DEFICIENCIA MÚLTIPLE DE SULFATASAS Y OTRAS DEFICIENCIAS DE SULFATASAS
<130> 0403WO
<150> US 60/447.747
<151>
<160> 95
<170> PatentIn versión 3.2
<210> 1
<211> 1180 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (20)..(1141) 15 <223> ADNc de FGE
<400> 1
<210> 2 5 <211> 374
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 1122 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210>
4 15 <211> 2130
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210>
5 5 <211> 374
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 2297 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 550 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
<210> 8
<211> 2657 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9 5 <211> 502
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10
<211> 1014 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 10
15 <210> 11
<211> 522
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210> 16
<211> 2228 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 533
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 18
5
<211> 2401
<212> ADN
10
<213> Homo sapiens
91
<400> 18
<210> 19
<211> 583
<212> PRT
<213> Homo sapiens 10 <400> 19
<210> 20
<211> 1945 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 20
10 <210> 21
<211> 593
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
<210> 22
<211> 1858 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 22
5 10
<210> 23 <211> 589 <212> PRT <213> Homo sapiens
103
<400> 23
<210> 24
<211> 1996
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
<210> 26
<211> 1578
<212> ADN 10 <213> Homo sapiens
<400> 26 5 <210> 27
<211> 525
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)..(1)
<223> Leu o Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa puede ser un aminoácido que se produce de manera natural
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Cys o Ser
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3)..(3)
<223> Cualquier aminoácido
<400> 32
<210> 33
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia derivada de arilsulfatasa A humana
<220>
<221> PÉPTIDO
<222> (1)..(23)
<223> Sustrato de formación de FGly sintético; secuencia primaria de arilsulfatasa A humana
<400> 33
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Una variante del péptido ASA65-80, en la que los residuos Cys69, Pro71 y Arg73, críticos para la formación
de FGly, estaban reorganizados al azar 25
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> Oligopéptido reorganizado al azar
<400> 34 35
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Una variante del péptido ASA65-80, en la que la Cys69 se sustituyó por una serina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> Oligopéptido de Ser69
<400> 35 <210> 36
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR específico de FGE humana
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> Cebador 1199nc de PCR específico de FGE humana
<400> 36 ccaatgtagg tcagacacg 19
<210> 37
<211> 16
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR específico de FGE humana
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Cebador 1c directo específico de FGE humana
<400> 37 acatggcccg cgggac 16
<210> 38
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR específico de FGE humana
<220> <221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> Cebador 1182c inverso específico de FGE humana
<400> 38 cgactgctcc ttggactgg 19
<210> 39
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR específico de FGE humana
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> Cebador 5’ de PCR específico de FGE humana que contiene EcoRI
<400> 39 ggaattcggg acaacatggc tgcg 24
<210> 40
<211> 54
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador específico de HA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(54)
<223> Cebador específico de HA
<400> 40 cccaagctta tgcgtagtca ggcacatcat acggatagtc catggtgggc aggc 54
<210> 41
<211> 57
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> Cebador específico de c-myc
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223> Cebador específico de c-myc
<400> 41 cccaagctta caggtcttct tcagaaatca gcttttgttc gtccatggtg ggcaggc 57
<210> 42
<211> 54
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador específico de RGS-His6
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(54)
<223> Cebador específico de RGS-His6
<400> 42 cccaagctta gtgatggtga tggtgatgcg atcctctgtc catggtgggc aggc 54
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Oligopéptido tríptico de una preparación de FGE humana
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> Oligopéptido tríptico de una preparación de FGE humana
<400> 43 <210> 44
<211> 19 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Oligopéptido tríptico de una preparación de FGE humana
<220> 15 <221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Oligopéptido tríptico de una preparación de FGE humana
<400> 44
25 <210> 45
<211> 906
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 45
<211> 301
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 47
15 <210> 48
<211> 308
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 48
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 49 5 <210> 50
<211> 284
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 50
<212> ADN
<213> Drosophila melanogaster
<400> 51
15 <210> 52
<211> 336
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 52
<210> 53
<211> 870 5 <212> ADN
<213> Anopheles gambiae
<400> 53
15 <210> 54
<211> 290
<212> PRT
<213> Anopheles gambiae
<400> 54
<212> ADN
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 55 <212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<212> ADN
<213> Corynebacterium efficiens
<400> 57
15 <210> 58
<211> 334
<212> PRT
<213> Corynebacterium efficiens
<400> 58
<210> 59
<211> 1017
<212> ADN
<213> Novosphingobium aromaticivorans
<400> 59
<210> 60
<211> 338
<212> PRT
<213> Novosphingobium aromaticivorans 15 <400> 60
<212> ADN
<213> Mesorhizobium loti
<400> 61 5 <210> 62
<211> 372
<212> PRT
<213> Mesorhizobium loti
<400> 62
<212> ADN
<213> Burkholderia fungorum
<400> 63 <212> PRT
<213> Burkholderia fungorum
<400> 64
<212> ADN
<213> Sinorhizobium meliloti
<400> 65 <212> PRT
<213> Sinorhizobium meliloti
<210> 67
<211> 1065 5 <212> ADN
<213> Microscilla sp.
<400> 67
<212> PRT
<213> Microscilla sp.
<400> 68
<210> 69
<211> 876
<212> ADN
<213> Pseudomonas putida KT2440
<400> 69
<210> 70
<211> 291
<212> PRT 15 <213> Pseudomonas putida KT2440
<400> 70
<212> ADN
<213> Ralstonia metallidurans
<400> 71
15 <210> 72
<211> 259
<212> PRT
<213> Ralstonia metallidurans
<400> 72
<212> ADN
<213> Prochlorococcus marinus
<400> 73 5 <210> 74
<211> 291
<212> PRT
<213> Prochlorococcus marinus
<400> 74
<212> ADN
<213> Caulobacter crescentus CB15
<400> 75 <212> PRT
<213> Caulobacter crescentus CB15
<400> 76
<210> 77
<211> 900 5 <212> ADN
<213> Mycobacterium tuberculosis H37Rv
<400> 77
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis H37Rv
<400> 78
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dominio conservado en procariotas y procariotas
<220>
<221> DOMINIO
<222> (1)..(7)
<223> dominio conservado
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Gly o Ala
<400> 79
<210> 80
<211> 630
<212> ADN
<213> Oncorhynchus mykiss
<400> 80 <210> 81
<211> 655
<212> ADN
<213> Danio rerio
<220>
<221> misc_feature
<222> (590)..(590)
<223> n es a, c, g o t
<220>
<221> misc_feature
<222> (626)..(626)
<223> n es a, c, g o t
<400> 81
<210> 82
<211> 773
5
<212> ADN
<213> Oryzias latipes
10
<220> <221> misc_feature
<222> (690)..(690)
15
<223> n es a, c, g o t
<220>
20
<221> misc_feature <222> (755)..(755)
<223> n es a, c, g o t
25
<400> 82
30
<210> 83 <211> 566
<212> ADN
35
<213> Xenopus laevis
<220>
40
<221> misc_feature <222> (6)..(6)
<223> n es a, c, g o t
<220>
5
<221> misc_feature
<222> (47)..(47)
10
<223> n es a, c, g, o t <220>
<221> misc_feature
15
<222> (81)..(81)
<223> n es a, c, g o t
20
<400> 83
<212> ADN
<213> Silurana tropicalis
<400> 84 <212> ADN
<213> Salmo salar
<400> 85
15 <210> 86
<211> 415
<212> ADN
<213> Sus scrofa
<400> 86
5 <210> 87
<211> 595
<212> ADN
<213> Bos taurus
<400> 87
<210> 88
20
<211> 1611 <212> ADN
<213> Homo sapiens
25
<220>
<221> CDS
30
<222> (1)..(1608) <223> hSULF3
<400> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
<210> 90
5
<211> 1722
<212> ADN
10
<213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
15
<222> (1)..(1719)
<223> hSULF4
20
<400> 90
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
<210> 92
5
<211> 1710
<212> ADN
10
<213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
15
<222> (1)..(1707)
<223> hSULF5
20
<400> 92
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
<210> 94
<211> 2067 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2064) 15 <223> hSULF6
<400> 94
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 95

Claims (33)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Método para determinar el nivel de expresión de enzima generadora de Ca-formilglicina (FGE) en un sujeto, comprendiendo el método medir in vitro en una muestra obtenida de un sujeto la actividad de generación de Ca formilglicina de un péptido o polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: aminoácidos 34-374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78.
  2. 2.
    Método para identificar un agente útil en la modulación de la actividad de generación de Ca-formilglicina, que comprende:
    (a)
    poner en contacto una molécula que tiene actividad de generación de Ca-formilglicina o una molécula de ácido nucleico que codifica para una molécula con dicha actividad con un agente candidato,
    (b)
    medir la actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula, y
    (c)
    comparar la actividad de generación de Ca-formilglicina medida de la molécula con un control para determinar si el agente candidato modula la actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula;
    en el que la molécula es una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 1, o es un producto de expresión de la misma.
  3. 3. Método para determinar una deficiencia de sulfatasa en un sujeto caracterizada por una expresión aberrante de una molécula de ácido nucleico o un producto de expresión de la misma, que comprende:
    monitorizar una muestra de un paciente para detectar un parámetro seleccionado del grupo que consiste en:
    (i)
    una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 1,
    (ii)
    un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico,
    (iii) un péptido derivado del polipéptido, y
    (iv) un anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido o péptido, como determinación de una deficiencia de sulfatasa en el sujeto.
  4. 4.
    Método según la reivindicación 3, en el que la muestra es un líquido biológico o un tejido.
  5. 5.
    Método según la reivindicación 3, en el que la etapa de monitorizar comprende poner en contacto la muestra con un agente detectable seleccionado del grupo que consiste en
    (a)
    una molécula de ácido nucleico que se hibrida selectivamente en condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico de (i),
    (b)
    un anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido de (ii), o el péptido de (iii), y
    (c)
    un polipéptido o péptido que se une al anticuerpo de (iv).
  6. 6.
    Método según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo, el polipéptido, el péptido o el ácido nucleico se marca con un marcador radioactivo o una enzima.
  7. 7.
    Método según la reivindicación 3, que comprende someter a ensayo la muestra para detectar el péptido.
  8. 8.
    Kit, que comprende un envase que contiene un agente y un control; en el que el agente es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une selectivamente a un péptido o polipéptido según la reivindicación 1, o es un ácido nucleico que se une selectivamente a un ácido nucleico que codifica para dicho péptido o polipéptido; y en el que el control es para comparar un valor medido de unión de dicho agente a dicho péptido, polipéptido o ácido nucleico.
  9. 9.
    Kit según la reivindicación 8; en el que el control es un valor predeterminado para compararlo con el valor medido.
  10. 10.
    Kit según la reivindicación 8; en el que el control comprende un epítopo del péptido o polipéptido.
  11. 11.
    Uso de una molécula de ácido nucleico, péptido o polipéptido que modula la actividad de generación de Ca formilglicina en la preparación de un medicamento para tratar una deficiencia de sulfatasa en un sujeto; en el que:
    (i)
    la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:
    (a)
    una molécula de ácido nucleico de hibridación que se hibrida en condiciones rigurosas con una molécula que consiste en una secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 1, o un complemento de dicha molécula de hibridación que codifica para un polipéptido que tiene actividad FGE;
    (b)
    una molécula de ácido nucleico que se diferencia de una molécula de ácido nucleico de (a) debido a la degeneración del código genético; y
    (c)
    un ácido nucleico que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 3, 4, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 y 80-87; y
    (ii)
    el péptido o el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en:
    (a)
    un péptido o un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico tal como se describió anteriormente; y
    (b)
    un péptido o un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: aminoácidos 34374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46,48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68,70, 72, 74, 76 y 78.
  12. 12.
    Uso según la reivindicación 11; en el que el medicamento comprende además un agente seleccionado del grupo que consiste en: una molécula de ácido nucleico que codifica para iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, Nacetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 o HSulf-6; un producto de expresión de la molécula de ácido nucleico; y un fragmento del producto de expresión de la molécula de ácido nucleico.
  13. 13.
    Uso según la reivindicación 11; en el que el agente que modula la actividad de generación de Ca-formilglicina se produce mediante una célula que expresa dicha molécula de ácido nucleico.
  14. 14.
    Uso según la reivindicación 13; en el que la célula expresa una molécula de ácido nucleico de FGE exógena.
  15. 15.
    Uso según la reivindicación 13, en el que la célula expresa una molécula de ácido nucleico de FGE endógena.
  16. 16.
    Molécula de ácido nucleico, péptido o polipéptido que modula la actividad de generación de Ca-formilglicina; para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa en un sujeto; siendo la molécula de ácido nucleico, péptido o polipéptido según la reivindicación 11.
  17. 17.
    Composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico, péptido, o polipéptido según la reivindicación 11, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  18. 18.
    Método para identificar un agente candidato útil en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa, que comprende:
    determinar la expresión de un conjunto de moléculas de ácido nucleico in vitro en una célula o tejido en condiciones que, en ausencia de un agente candidato, permiten una primera cantidad de expresión del conjunto de moléculas de ácido nucleico; en el que el conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende al menos una molécula de ácido nucleico que es una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11;
    poner en contacto la célula o tejido con el agente candidato in vitro, y
    detectar una cantidad de prueba de expresión del conjunto de moléculas de ácido nucleico;
    en el que un aumento en la cantidad de prueba de expresión en presencia del agente candidato con respecto a la primera cantidad de expresión indica que el agente candidato es útil en el tratamiento de la deficiencia de sulfatasa.
  19. 19.
    Matriz de moléculas de ácido nucleico en fase sólida que consiste en un conjunto de moléculas de ácido nucleico, productos de expresión de las mismas, o fragmentos de los mismos, cuando se fija a un sustrato sólido; codificando cada molécula de ácido nucleico para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos 34-374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6.
  20. 20.
    Matriz de moléculas de ácido nucleico en fase sólida según la reivindicación 19, que comprende además al menos una molécula de ácido nucleico de control.
  21. 21.
    Matriz de moléculas de ácido nucleico en fase sólida según la reivindicación 19; en la que el conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: aminoácidos 34-374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6.
  22. 22.
    Matriz de moléculas de ácido nucleico en fase sólida según la reivindicación 19; en la que el conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende al menos dos moléculas de ácido nucleico, codificando cada molécula de ácido nucleico para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: aminoácidos 34-374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6.
  23. 23.
    Alelo variante aislado de un gen de FGE humana que codifica para un polipéptido de FGE variante, comprendiendo el polipéptido: una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una variación en la SEQ ID NO: 2, en el que la al menos una variación comprende: Met1Arg; Met1Val; Ser155Pro; Cys218Tyr; Ala279Val; Arg327Stop; Cys336Arg; Arg345Cys; Arg349Trp; Arg349Gln; Ser359Stop; o una combinación de las mismas.
  24. 24.
    Polipéptido de FGE humana variante aislado que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos una variación en la SEQ ID NO: 2, en el que la al menos una variación comprende: Met1Arg; Met1Val; Ser155Pro; Cys218Tyr; Ala279Val; Arg327Stop; Cys336Arg; Arg345Cys; Arg349Trp; Arg349Gln; Ser359Stop; o a combinación de las mismas.
  25. 25.
    Anticuerpo que tiene el polipéptido de FGE humana variante según la reivindicación 23 como inmunógeno.
  26. 26.
    Anticuerpo según la reivindicación 25, que es un anticuerpo policlonal.
  27. 27.
    Anticuerpo según la reivindicación 25, que es un anticuerpo monoclonal.
  28. 28.
    Anticuerpo según la reivindicación 25, que es un anticuerpo quimérico.
  29. 29.
    Anticuerpo según la reivindicación 25, marcado de manera detectable.
  30. 30.
    Anticuerpo según la reivindicación 29, en el que dicho marcador detectable comprende un elemento radioactivo, un compuesto químico que fluoresce o una enzima.
  31. 31.
    Método de producción de una sulfatasa activada, comprendiendo el método:
    (a)
    poner en contacto la sulfatasa con una enzima generadora de Ca-formilglicina (FGE) in vitro; en el que la enzima generadora de Ca-formilglicina es un polipéptido o péptido según la reivindicación 1; o
    (b)
    proporcionar una célula que coexpresa una sulfatasa y una enzima generadora de Ca-formilglicina (FGE) de modo que se produce sulfatasa activada dentro de la célula; en el que la célula comprende ARN o ADN heterólogo que da como resultado una expresión aumentada de la sulfatasa activada, con respecto a lo que se produciría en ausencia del ARN o ADN heterólogo; y en el que la enzima generadora de Ca-formilglicina es un polipéptido o péptido según la reivindicación 1.
  32. 32.
    Método según la reivindicación 31, en el que la sulfatasa se selecciona del grupo que consiste en iduronato 2sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6.
  33. 33.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 ó 18, o uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16; en el que la deficiencia de sulfatasa a la que se hace referencia con respecto a dicho método o uso se selecciona del grupo que consiste en: deficiencia múltiple de sulfatasas, mucopolisacaridosis II, mucopolisacaridosis IIIA, mucopolisacaridosis IVA, mucopolisacaridosis VI, mucopolisacaridosis VIII, leucodistrofia metacromática, condrodisplasia punctata I recesiva ligada al cromosoma X e ictiosis ligada al cromosoma X.
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