ES2908470T3 - Conjugados de anticuerpo anti-CD22-maitansina y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Conjugados de anticuerpo anti-CD22-maitansina y métodos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un conjugado que incluye al menos un resto de aminoácido modificado con una cadena lateral de la fórmula (I): **(Ver fórmula)** en donde W2 es un anticuerpo anti-CD22.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de anticuerpo anti-CD22-maitansina y métodos de uso de los mismos
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio conforme a la sección 119(e) del título 35 del USC de la solicitud provisional de EE. UU. N.° 62/252.985, presentada el 9 de noviembre de 2015.
Introducción
El campo de los conjugados terapéuticos de proteína-molécula pequeña ha avanzado enormemente, proporcionando varios fármacos clínicamente beneficiosos con la promesa de proporcionar más en los próximos años. Los terapéuticos de conjugados de proteína pueden proporcionar varias ventajas, debido a, por ejemplo, la especificidad, la multiplicidad de funciones y la inactividad relativamente baja, dando como resultado menos efectos secundarios. La modificación química de proteínas puede ampliar estas ventajas haciéndolas más potentes, estables o multimodales.
Se usan comúnmente varias transformaciones químicas habituales para crear y manipular modificaciones postraduccionales en proteínas. Hay varios métodos donde se es capaz de modificar selectivamente las cadenas laterales de ciertos aminoácidos. Por ejemplo, las cadenas laterales de ácido carboxílico (aspartato y glutamato) pueden ser elegidas por activación inicial con un reactivo de carbodiimida soluble en agua y posterior reacción con una amina. Similarmente, la lisina puede ser elegida mediante el uso de ésteres o isotiocianatos activados, y se puede elegir tioles de cisteína con maleimidas y a-halo-carbonilos.
Un obstáculo significativo para la creación de un terapéutico o reactivo de proteína químicamente alterado es la producción de la proteína en una forma homogénea biológicamente activa. La conjugación de un fármaco o marca detectable con un polipéptido puede ser difícil de controlar, lo que da como resultado una mezcla heterogénea de conjugados que se diferencian en el número de moléculas de fármaco unidas y en la posición de la conjugación química. En algunos casos, puede ser conveniente controlar el sitio de conjugación y/o el fármaco o marca detectable conjugado con el polipéptido usando las herramientas de química orgánica sintética para dirigir la formación precisa y selectiva de enlaces químicos en un polipéptido.
El documento de patente WO2014/078566A1 desvela compuestos y conjugados de hidrazinil-indol. El documento de patente US2015/157736A1 desvela compuestos de hidrazinil-pirrolo y métodos de producción de un conjugado. Sumario
La presente divulgación proporciona estructuras de conjugado de anticuerpo anti-CD22-maitansina. La divulgación también engloba métodos de producción de dichos conjugados, así como métodos de uso de los mismos.
La presente invención proporciona un conjugado que incluye al menos un resto de aminoácido modificado con una cadena lateral de la fórmula (I):
Figure imgf000002_0001
en donde W2 es un anticuerpo anti-CD22.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD22 se une al epítope dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1-670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8A-8C.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD22 comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1 (FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina;
Z30 es un aminoácido básico o un aminoácido alifático;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, con la condición de que cuando la secuencia esté en el extremo N del conjugado, X1 está presente; y
X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido.
En ciertas realizaciones, la secuencia es L(FGly')TPSR.
En ciertas realizaciones, Z30 se selecciona de R, K, H, A, G, L, V, I y P; X1 se selecciona de L, M, S y V; y X2 y X3 se seleccionan cada uno independientemente de S, T, A, V, G y C.
En ciertas realizaciones, el resto de aminoácido modificado está situado en un extremo C de una región constante de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD22.
En ciertas realizaciones, la región constante de la cadena pesada comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1(FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina;
Z30 es un aminoácido básico o un aminoácido alifático;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, con la condición de que cuando la secuencia esté en el extremo N del conjugado, X1 está presente; y
X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido, y
en donde la secuencia es carboxiterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos SLSLSPG.
En ciertas realizaciones, la región constante de la cadena pesada comprende la secuencia SPGSL(FGly')TPSRGS. En ciertas realizaciones, Z30 se selecciona de R, K, H, A, G, L, V, I y P; X1 se selecciona de L, M, S y V; y X2 y X3 se seleccionan cada uno independientemente de S, T, A, V, G y C.
En ciertas realizaciones, el resto de aminoácido modificado está situado en una región constante de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD22.
En ciertas realizaciones, la región constante de la cadena ligera comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1(FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina;
Z30 es un aminoácido básico o un aminoácido alifático;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, con la condición de que cuando la secuencia esté en el extremo N del conjugado, X1 está presente; y
X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido, y
en donde la secuencia carboxiterminal con respecto a la secuencia KVDNAL, y/o es aminoterminal con respecto a la secuencia QSGNSQ.
En ciertas realizaciones, la región constante de la cadena ligera comprende la secuencia KVDNAL(FGly')TPSRQSGNSQ.
En ciertas realizaciones, Z30 se selecciona de R, K, H, A, G, L, V, I y P; X1 se selecciona de L, M, S y V; y X2 y X3 se seleccionan cada uno independientemente de S, T, A, V, G y C.
En ciertas realizaciones, el resto de aminoácido modificado está situado en una región CH1 de cadena pesada del anticuerpo anti-CD22.
En ciertas realizaciones, la región CH1 de cadena pesada comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1(FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina;
Z30 es un aminoácido básico o un aminoácido alifático;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, con la condición de que cuando la secuencia esté en el extremo N del conjugado, X1 está presente; y
X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido, y
en donde la secuencia es carboxiterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos SWNSGA y/o es aminoterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos GVHTFP.
En ciertas realizaciones, la región CH1 de cadena pesada comprende la secuencia SWNSGAL(FGly')TPSRGVHTFP. En ciertas realizaciones, Z30 se selecciona de R, K, H, A, G, L, V, I y P; X1 se selecciona de L, M, S y V; y X2 y X3 se seleccionan cada uno independientemente de S, T, A, V, G y C.
En ciertas realizaciones, el resto de aminoácido modificado está situado en una región CH2 de cadena pesada del anticuerpo anti-CD22.
En ciertas realizaciones, el resto de aminoácido modificado está situado en una región CH3 de cadena pesada del anticuerpo anti-CD22.
En ciertas realizaciones, el resto de aminoácido modificado está situado en un extremo C de una región CH3 de cadena pesada del anticuerpo anti-CD22. En ciertas de tales realizaciones, la región CH3 de cadena pesada comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1(FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina;
Z30 es un aminoácido básico o un aminoácido alifático;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, con la condición de que cuando la secuencia esté en el extremo N del conjugado, X1 está presente; y
X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido, y
en donde la secuencia es carboxiterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos SLSLSPG.
En ciertas realizaciones, la región CH3 de cadena pesada comprende la secuencia SPGSL(FGly')TPSRGS.
En ciertas realizaciones, Z30 se selecciona de R, K, H, A, G, L, V, I y P; X1 se selecciona de L, M, S y V; y X2 y X3 se seleccionan cada uno independientemente de S, T, A, V, G y C.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que incluye un conjugado como se describe en el presente documento, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona un conjugado o composición farmacéutica de cualquiera de las realizaciones anteriores, para su uso en un método de tratamiento de cáncer en un sujeto. El método puede incluir administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica o conjugado como se describe en el presente documento, donde la administraciones eficaz para tratar cáncer en el sujeto.
También se desvela un método de administración de un fármaco a un sitio diana en un sujeto. El método incluye administrar al sujeto una composición farmacéutica que incluye un conjugado como se describe en el presente documento, donde la administraciones eficaz para liberar una cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco del conjugado en el sitio diana en el sujeto.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1, panel A, muestra una secuencia de reconocimiento de la enzima generadora de formilglicina (FGE) insertada en la localización deseada a lo largo del esqueleto del anticuerpo usando técnicas habituales de biología molecular. Tras la expresión, la FGE, que es endógena a células eucariotas, cataliza la conversión de la Cys dentro de la secuencia consenso dando un resto de formilglicina (FGly). La FIG. 1, panel B, muestra los anticuerpos que llevan restos aldehído (2 por anticuerpo) que reaccionan con un conector hidrazino-/'so-Pictet-Spengler (HIPS) y carga para generar un ADC conjugado específicamente en el sitio. La FIG. 1, panel C, muestra química de HIPS, que avanza a través de un ion hidrazonio intermedio seguido por alquilación intramolecular con un indol nucleófilo para generar un enlace C-C estable.
La FIG. 2 muestra un trazado de columna de interacción hidrófoba (HIC) de un anticuerpo anti-CD22 marcado con aldehído conjugado en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP, según realizaciones de la presente divulgación.
La FIG. 3 muestra un trazado de HIC de un anticuerpo anti-CD22 marcado con aldehído conjugado en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP, según realizaciones de la presente divulgación.
La FIG. 4 muestra un trazado de cromatografía de fase inversa (PLRP) de un anticuerpo anti-CD22 marcado con aldehído conjugado en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP, según realizaciones de la presente divulgación.
La FIG. 5 muestra un gráfico del análisis analítico de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de un anticuerpo anti-CD22 marcado con aldehído conjugado en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP, según realizaciones de la presente divulgación.
La FIG. 6A muestra un gráfico que indica la potencia /n v'/tro contra células WSU-DLCL2 (% de viabilidad frente al log de la concentración de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) (nM)) para ADC anti-CD22 conjugados en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP, según realizaciones de la presente divulgación. La FIG. 6B muestra un gráfico de potencia /n v/tro contra células Ramos (% de viabilidad frente al log de la concentración de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) (nM)) para ADC anti-CD22 conjugados en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP, según realizaciones de la presente divulgación.
La FIG. 7 muestra un gráfico que indica la eficacia /n v/vo contra un modelo de xenoinjerto WSU-DLCL2 (volumen tumoral medio (mm3) frente a días) para ADC anti-CD22 conjugados en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP, según realizaciones de la presente divulgación.
La FIG. 8A-8C proporciona secuencias de aminoácidos de las isoformas de CD22 (arriba a abajo: SEQ ID NO://­ //).
La FIG. 9A representa un mapa del sitio que muestra los posibles sitios de modificación para generación de un polipéptido Ig marcado con aldehído. La secuencia superior es la secuencia de aminoácidos de la región conservada de un polipéptido IgG1 de cadena ligera (SEQ ID NO://) y muestra posibles sitios de modificación en una cadena ligera de Ig; la secuencia inferior es la secuencia de aminoácidos de la región conservada de un polipéptido Ig de cadena pesada (SEQ ID NO://; N.° de acceso de GenBank AAG00909) y muestra posibles sitios de modificación en una cadena pesada de Ig. La numeración de cadenas pesadas y ligeras se basa en las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa.
La FIG. 9B representa un alineamiento de regiones constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina para IgG 1 (SEQ ID NO://), IgG2 (SEQ ID NO://), IgG3 (SEQ ID NO://), IgG4 (SEQ ID NO://) e IgA (SEQ ID NO://), que muestra sitios de modificación en los que las marcas de aldehído se pueden proporcionar en una cadena pesada de la inmunoglobulina. La numeración de cadenas pesadas y ligeras se basa en las cadenas pesadas y ligeras completas.
La FIG. 9C representa un alineamiento de regiones constantes de la cadena ligera de inmunoglobulina (SEQ ID NO://), que muestra sitios de modificación en los que se pueden proporcionar las marcas de aldehído en una cadena ligera de la inmunoglobulina.
La FIG. 10 muestra ilustraciones de formatos de ELISA para la detección de diversos analitos, según realizaciones de la presente divulgación.
FIG. 11 - un ADC anti-CD22 según la presente divulgación fue altamente monomérico, tuvo una DAR promedio de 1,8, e incluyó una única especie de cadena ligera y pesada. El ADC anti-CD22 se analizó por (FIG. 11, panel A) cromatografía de exclusión por tamaño para evaluar el porcentaje de monómero (99,2 %) y por interacción hidrófoba (HIC; FIG. 11, panel B) y cromatografía de fase inversa (PLRP) (FIG. 11, panel C) para evaluar la relación entre el fármaco y el anticuerpo (DAR), que fue 1,8.
FIG. 12 - un ADC anti-CD22 según la presente divulgación se unió a la proteína CD22 humana igual de bien que el anticuerpo anti-CD22 no mutante. Se usó un ELISA competitivo para comparar la unión del ADC anti-CD22 con el anticuerpo anti-CD22 no mutante (WT). Los datos se presentan como la media ± D.E. (n = 4).
FIG. 13 - un ADC anti-CD22 según la presente divulgación medió en la internalización de CD22 similarmente al anticuerpo anti-CD22 no mutante. Se usaron las estirpes celulares de NHL, Ramos, Granta-519 y WSU-DLCL2 para comparar la internalización de CD22 de la superficie celular ya que medió uniéndose a cualquiera de anti-CD22 WT o CAT-02-106.
FIG. 14 - un ADC anti-CD22 según la presente divulgación fue igual de potente contra células tumorales de NHL parentales y que expresan MDR1 in vitro. Se usaron células Ramos y WSU-DLCL2 parentales (WT) (FIG. 14, panel A y panel C) y variantes de esas estirpes que se manipularon para expresar MDR1 (MDR1+, FIG. 14, panel B y panel D) como dianas para estudios de citotoxicidad in vitro de la actividad de ADC anti-CD22. Se usaron maitansina libre y un ADC aCD22 preparado con el anticuerpo CAT-02, pero conjugado con la maitansina usando un conector escindible por valina-citrulina como controles. En un experimento de control adicional, se añadió el inhibidor de MDR1, ciclosporina, a células WT o MDR1+ WSU-DLCL2 (FIG. 14, panel E y panel F). Los datos se presentan como la media ± D.E. (n = 2).
FIG. 15 - un ADC anti-CD22 según la presente divulgación no medió en la citotoxicidad inespecífica. La estirpe celular de tumor gástrico, NCI-N87, se incubó in vitro durante 5 días en presencia de concentraciones crecientes del ADC anti-CD22. Entonces, se evaluó la viabilidad celular usando un método basado en MTS. Los datos se presentan como la media ± D.E. (n =2).
FIG. 16 - El ADC relacionado con ADC anti-CD22, anti-HER2 conjugado con una carga activa de conector de HIPS-4AP-maitansina, no indujo la destrucción por vecindad. Se realizaron estudios de citotoxicidad in vitro usando células NCI-N87 HER2+, células Ramos HER2-, o un cocultivo de ambas células como diana. Se usaron maitansina libre (2 nM) y anti-HER2 conjugado con MMAE por un conector escindible de valina-citrulina (vc) (carga activa 2 nM), como controles positivos para la destrucción por vecindad. El ADC anti-HER2 se administró en una carga activa 2 nM. Los datos se presentan como la media ± D.E. (n =2).
FIG. 17 - un ADC anti-CD22 según la presente divulgación fue eficaz in vivo contra los modelos de xenoinjerto de WSU-DLCL2 y Ramos derivados de NHL. Ratones CB17 ICR SCID hembra (8/grupo) que tenían xenoinjertos WSU-DLCL2 se trataron con vehículo solo o con el ADC anti-CD22 ya fuera en (FIG. 17, panel A) una dosis única de 10 mg/kg o (FIG. 17, panel B) en dosis múltiples de 10 mg/kg administrado cada cuatro días para un total de cuatro dosis (q4d x 4). El tratamiento se inició cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 118 o 262 mm3 para los estudios de dosis única o dosis múltiples, respectivamente. (FIG. 17, panel C) Ratones CB17 ICR SCID hembra (12/grupo) que tenían xenoinjertos de Ramos se trataron con vehículo solo, o con 5 o 10 mg/kg de CAT-02-106 q4d x 4. La administración se inició cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 246 mm3. Los datos se presentan como la media ± S.E.M.
FIG. 18 - Células Ramos y WSU-DLCL2 expresaron diferentes niveles de CD22 de la superficie celular. Se incubaron células Ramos y WSU-DLCL2 con un anticuerpo anti-CD22 marcado con fluoresceína y luego se analizaron por citometría de flujo. Se muestra en el gráfico la intensidad media de la fluorescencia del canal FL1 (que detecta fluoresceína) para cada tipo de célula.
FIG. 19 - Los pesos corporales de los ratones no fueron afectados por el tratamiento con un ADC anti-CD22 según la presente divulgación. Se muestran pesos corporales medios de ratones en los estudios de eficacia de xenoinjertos. (FIG. 19, panel A) Estudio de dosis única de WSU-DLCL2; (FIG. 19, panel B) estudio de dosis múltiples de WSU-DLCL2; (FIG. 19, panel C) estudio de Ramos. Las barras de error indican D.E.
FIG. 20 - un ADC anti-CD22 según la presente divulgación puede ser administrado en ratas hasta 60 mg/kg con efectos mínimos. Las ratas Sprague-Dawley (5/grupo) recibieron una dosis de 6, 20, 40 o 60 mg/kg de CAT-02-106 seguido por un periodo de observación de 12 días. (FIG. 20, panel A) Se monitorizó el peso corporal en los momentos indicados. (FIG. 20, panel B) Se evaluaron la alanina aminotransferasa (ALT) y (FIG. 20, panel C) el números de plaquetas 5 y 12 días después de las dosis. Los datos se presentan como la media ± D.E.
FIG. 21 - un ADC anti-CD22 según la presente divulgación se unió específicamente a linfocitos B de macaco cangrejero. Se seleccionaron linfocitos de sangre periférica de macacos cangrejeros según sus perfiles de dispersión frontal y lateral (arriba izquierda). Las células se incubaron con o estreptavidina (SA) conjugada con fluoresceína-isotiocianato (FITC) solo (arriba derecha), o con ADC anti-CD22 biotinilado seguido por SA FITC. La coincubación con anticuerpos que reconocían linfocitos T (CD3, izquierda abajo) o linfocitos B (CD20, derecha abajo) demostró especificidad de la unión de CAT-02-106 con una población de linfocitos B.
FIG. 22 - un ADC anti-CD22 según la presente divulgación mostró reactividad específica de linfocitos B en tejidos humanos y de macaco cangrejero. El ADC anti-CD22 se unió a regiones del bazo ricas en linfocitos B (arriba). Los tejidos de corazón dieron negativo para la tinción (centro). Las secciones de pulmón dieron negativo, con la excepción de los leucocitos dispersados (abajo).
FIG. 23 - macacos cangrejeros no presentaron efectos adversos observados con una dosis repetida de 60 mg/kg de un ADC anti-CD22 según la presente divulgación. Los macacos cangrejeros (2/sexo/grupo) se administraron con 10, 30 o 60 mg/kg del ADC anti-CD22 una vez cada tres semanas para un total de dos dosis, seguido por un periodo de observación de 21 días. Se monitorizaron (FIG. 23, panel A) Aspartato transaminasa (AST), (FIG. 23, panel B) alanina aminotransferasa (ALT), (FIG. 23, panel C) plaquetas y (FIG. 23, panel D) monocitos en los momentos indicados. Los datos se presentan como la media ± D.E.
FIG. 24 (panel A y panel B) - El tratamiento con un ADC anti-CD22 según la presente divulgación redujo las poblaciones de linfocitos B periféricos en macacos cangrejeros. Las células mononucleares de sangre periférica de macacos cangrejeros enrolados en el estudio de toxicidad se monitorizaron por citometría de flujo para detectar la relación de linfocitos B (CD20+), linfocitos T (CD3+) y linfocitos NK (CD20-/CD3-) observada en animales antes de la dosis y en los días 7, 14, 28, y 35. Los datos se presentan como la media ± D.E.
FIG. 25 - un ADC anti-CD22 según la presente divulgación presentó estabilidad in vivo muy alta como se muestra por un estudio farmacocinético en ratas. Las ratas Sprague-Dawley (3/grupo) se administraron con una dosis única en embolada i.v. de 3 mg/kg de ADC anti-CD22. Se recogieron muestras de plasma en los tiempos designados y se analizaron (como se muestra en la FIG. 10) para concentraciones de anticuerpo total, conjugado total y ADC total.
La FIG. 26 muestra la Tabla 3: Resumen de la media (± DE) de parámetros farmacocinéticos y toxicocinéticos (TC) de valores totales de ADC en animales administrados con un ADC anti-CD22 según las realizaciones de la presente divulgación.
Definiciones
Los siguientes términos tienen los siguientes significados, a menos que se indique lo contrario. Cualquier término sin definir tiene su significado reconocido en la técnica.
"Alquilo" se refiere a grupos hidrocarbilo alifáticos saturados monovalentes que tienen desde 1 hasta 10 átomos de carbono y tal como 1 a 6 átomos de carbono, o 1 a 5, o 1 a 4, o 1 a 3 átomos de carbono. Este término incluye, a modo de ejemplo, grupos hidrocarbilo lineales y ramificados tales como metilo (CH3-), etilo (CH3CH2-), n-propilo (CH3CH2CH2-), isopropilo ((CH3)2CH-), n-butilo (CH3CH2CH2CH2-), isobutilo ((CH3)2CHCH2-), sec-butilo ((CH3)(CH3CH2)CH-), t-butilo ((CHs^C-), n-pentilo (CH3CH2CH2CH2CH2-) y neopentilo ((CHa)aCCH2-).
El término "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo como se define en el presente documento en donde uno o más átomos de carbono en la cadena de alquilo (excepto el átomo de carbono C1) se han sustituido opcionalmente con un heteroátomo, tal como -O-, -N-, -S-, -S(O)n- (donde n es 0 a 2), -NR- (donde R es hidrógeno o alquilo) y que tiene desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-arilo, -SO2-heteroarilo y -NRaRb, en donde R' y R" pueden ser iguales o diferentes y se eligen de hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo y heterocíclico.
"Alquileno" se refiere a grupos hidrocarbilo alifáticos divalentes que tienen preferentemente desde 1 hasta 6 y más preferentemente 1 a 3 átomos de carbono que son o de cadena lineal o ramificada, y que están interrumpidos opcionalmente con uno o más grupos seleccionados de -O-, -NR10-, -NR10C(O)-, -C(O)NR10- y similares. Este término incluye, a modo de ejemplo, metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2-), n-propileno (-CH2CH2CH2-), iso-propileno (-CH2CH(CHs)-), (-C(CHs)2CH2CH2-), (-C(CHs)2CH2C(O)-), (-C(CHs)2CH2C(O)NH-), (-CH(CHs)CH2-) y similares.
"Alquileno sustituido" se refiere a un grupo alquileno que tiene desde 1 hasta 3 hidrógenos sustituidos con sustituyentes como se describe para carbonos en la definición de "sustituido" a continuación.
El término "alcano" se refiere a grupo alquilo y grupo alquileno, como se define en el presente documento.
El término "alquilaminoalquilo", "alquilaminoalquenilo" y "alquilaminoalquinilo" se refiere a grupos R'NHR"- donde R' es un grupo alquilo como se define en el presente documento y R" es grupo alquileno, alquenileno o alquinileno como se define en el presente documento.
El término "alcarilo" o "aralquilo" se refiere a los grupos -alquilen-arilo y -alquilen sustituido-arilo donde alquileno, alquileno sustituido y arilo se definen en el presente documento.
"Alcoxi" se refiere al grupo -O-alquilo, en donde alquilo es como se define en el presente documento. Alcoxi incluye, a modo de ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, t-butoxi, sec-butoxi, n-pentoxi y similares. El término "alcoxi" también se refiere a los grupos alquenil-O-, cicloalquil-O-, cicloalquenil-O- y alquinil-O-, donde alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo y alquinilo son como se definen en el presente documento.
El término "alcoxi sustituido" se refiere a los grupos alquil sustituido-O-, alquenil sustituido-O-, cicloalquil sustituido-O-, cicloalquenil sustituido-O- y alquinil sustituido -O-, donde alquilo sustituido, alquenilo sustituido, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo sustituido y alquinilo sustituido son como se definen en el presente documento.
El término "alcoxiamino" se refiere al grupo -NH-alcoxi, en donde alcoxi se define en el presente documento.
El término "haloalcoxi" se refiere a los grupos alquil-O- en donde uno o más átomos de hidrógeno en el grupo alquilo se han sustituido con un grupo halo e incluyen, a modo de ejemplos, grupos tales como trifluorometoxi, y similares.
El término "haloalquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido como se ha descrito anteriormente, en donde uno o más átomos de hidrógeno en el grupo alquilo se han sustituido con un grupo halo. Los ejemplos de dichos grupos incluyen, sin limitación, grupos fluoroalquilo, tales como trifluorometilo, difluorometilo, trifluoroetilo y similares.
El término "alquilalcoxi" se refiere a los grupos -alquilen-O-alquilo, alquilen-O-alquilo sustituido, alquilen sustituido-O-alquilo y alquilen sustituido-O-alquilo sustituido en donde alquilo, alquilo sustituido, alquileno y alquileno sustituido son como se definen en el presente documento.
El término "alquiltioalcoxi" se refiere al grupo -alquilen-S-alquilo, alquilen-S-alquilo sustituido, alquilen sustituido-S-alquilo y alquilen sustituido-S-alquilo sustituido, en donde alquilo, alquilo sustituido, alquileno y alquileno sustituido son como se definen en el presente documento.
"Alquenilo" se refiere a grupos hidrocarbilo de cadena lineal o ramificados que tienen desde 2 hasta 6 átomos de carbono y preferentemente 2 a 4 átomos de carbono y que tienen al menos 1 y preferentemente desde 1 hasta 2 sitios de insaturación de doble enlace. Este término incluye, a modo de ejemplo, bi-vinilo, alilo y but-3-en-1-ilo. Dentro de este término están incluidos los isómeros en cis y trans o mezclas de estos isómeros.
El término "alquenilo sustituido" se refiere a un grupo alquenilo como se define en el presente documento que tiene desde 1 hasta 5 sustituyentes, o desde 1 hasta 3 sustituyentes, seleccionados de alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-alquilo sustituido, -SO2-arilo y -SO2-heteroarilo.
"Alquinilo" se refiere a grupos hidrocarbilo monovalentes lineales o ramificados que tienen desde 2 hasta 6 átomos de carbono y preferentemente 2 a 3 átomos de carbono y que tiene al menos 1 y preferentemente desde 1 hasta 2 sitios de insaturación de triple enlace. Los ejemplos de dichos grupos alquinilo incluyen acetilenilo (-C=CH) y propargilo (-CH2CECH).
El término "alquinilo sustituido" se refiere a un grupo alquinilo como se define en el presente documento que tiene desde 1 hasta 5 sustituyentes, o desde 1 hasta 3 sustituyentes, seleccionados de alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-alquilo sustituido, -SO2-arilo y -SO2-heteroarilo.
"Alquiniloxi" se refiere al grupo —O-alquinilo, en donde alquinilo es como se define en el presente documento. Alquiniloxi incluye, a modo de ejemplo, etiniloxi, propiniloxi y similares.
"Acilo" se refiere a los grupos H-C(O)-, alquil-C(O)-, alquil sustituido-C(O)-, alquenil-C(O)-, alquenil sustituido-C(O)-, alquinil-C(O)-, alquinil sustituido-C(O)-, cicloalquil-C(O)-, cicloalquil sustituido-C(O)-, cicloalquenil-C(O)-, cicloalquenil sustituido-C(O)-, aril-C(O)-, aril sustituido-C(O)-, heteroaril-C(O)-, heteroaril sustituido-C(O)-, heterociclil-C(O)- y heterociclil sustituido-C(O)-, en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en el presente documento. Por ejemplo, acilo incluye el grupo "acetilo" CH3C(O)-
"Acilamino" se refiere a los grupos —NR20C(O)alquilo, -NR20C(O)alquilo sustituido, NR20C(O)cicloalquilo, -NR20C(O)cicloalquilo sustituido, -NR20C(O)cicloalquenilo, -NR20C(O)cicloalquenilo sustituido, -NR20C(O)alquenilo, -NR20C(O)alquenilo sustituido, -NR20C(O)alquinilo, -NR20C(O)alquinilo sustituido, -NR20C(O)arilo, -NR20C(O)arilo sustituido, -NR20C(O)heteroarilo, -NR20C(O)heteroarilo sustituido, -NR20C(O)heterocíclico y -NR20C(O)heterocíclico sustituido, en donde R20 es hidrógeno o alquilo y en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en el presente documento.
"Aminocarbonilo" o el término "aminoacilo" se refiere al grupo -C(O)NR21R22, en donde R21 y R22 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido y donde R21 y R22 se unen opcionalmente junto con el nitrógeno unido a los mismos para formar un grupo heterocíclico o heterocíclico sustituido, y en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en el presente documento.
"Aminocarbonilamino" se refiere al grupo —NR21C(O)NR22R23 donde R21, R22 y R23 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo, arilo o cicloalquilo, o donde dos grupos R se unen para formar un grupo heterociclilo.
El término "alcoxicarbonilamino" se refiere al grupo -NRC(O)OR donde cada R es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, heteroarilo o heterociclilo, en donde alquilo, alquilo sustituido, arilo, heteroarilo y heterociclilo son como se definen en el presente documento.
El término "aciloxi" se refiere a los grupos alquil-C(O)O-, alquil sustituido-C(O)O-, cicloalquil-C(O)O-, cicloalquil sustituido-C(O)O-, aril-C(O)O-, heteroaril-C(O)O- y heterociclil-C(O)O- en donde alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, heteroarilo y heterociclilo son como se definen en el presente documento.
"Aminosulfonilo" se refiere al grupo —SO2NR21R22, en donde R21 y R22 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido y donde R21 y R22 se unen opcionalmente junto con el nitrógeno unido a los mismos para formar un grupo heterocíclico o heterocíclico sustituido y alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en el presente documento.
"Sulfonilamino" se refiere al grupo —NR21SO2 R22, en donde R21 y R22 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido y donde R21 y R22 se unen opcionalmente junto con los átomos unido a los mismos para formar un grupo heterocíclico o heterocíclico sustituido, y en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en el presente documento.
"Arilo" o "Ar" se refiere a un grupo carbocíclico aromático monovalente de desde 6 hasta 18 átomos de carbono que tiene un único anillo (tal como está presente en un grupo fenilo) o un sistema de anillos que tiene múltiples anillos condensados (los ejemplos de dichos sistemas de anillos aromáticos incluyen naftilo, antrilo e indanilo) cuyos anillos condensados pueden ser o pueden no ser aromáticos, a condición de que el punto de unión sea mediante un átomo de un anillo aromático. Este término incluye, a modo de ejemplo, fenilo y naftilo. A menos que se limite de otro modo por la definición del sustituyente de arilo, dichos grupos arilo se puede sustituir opcionalmente con desde 1 hasta 5 sustituyentes, o desde 1 hasta 3 sustituyentes, seleccionados de aciloxi, hidroxi, tiol, acilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilo sustituido, alcoxi sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo sustituido, amino, amino sustituido, aminoacilo, acilamino, alcarilo, arilo, ariloxi, azido, carboxilo, carboxilalquilo, ciano, halógeno, nitro, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, aminoaciloxi, oxiacilamino, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, tioariloxi, tioheteroariloxi, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-alquilo sustituido, -SO2-arilo, -SO2-heteroarilo y trihalometilo.
"Ariloxi" se refiere al grupo -O-arilo, en donde arilo es como se define en el presente documento, que incluye, a modo de ejemplo, fenoxi, naftoxi y similares, que incluye grupos arilo opcionalmente sustituidos como también se definen en el presente documento.
"Amino" se refiere al grupo —NH2.
El término "amino sustituido" se refiere al grupo -NRR donde cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, heteroarilo y heterociclilo, a condición de que al menos un R no sea hidrógeno.
El término "azido" se refiere al grupo —N3.
"Carboxilo", "carboxi" o "carboxilato" se refiere a —CO2H o sales del mismo.
"Carboxil éster" o "carboxiéster" o los términos "carboxialquilo" o "carboxilalquilo" se refiere a los grupos -C(O)O-alquilo, -C(O)O-alquilo sustituido, -C(O)O-alquenilo, -C(O)O-alquenilo sustituido, -C(O)O-alquinilo, -C(O)O-alquinilo sustituido, -C(O)O-arilo, -C(O)O-arilo sustituido, -C(O)O-cicloalquilo, -C(O)O-cicloalquilo sustituido, -C(O)O-cicloalquenilo, -C(O)O-cicloalquenilo sustituido, -C(O)O-heteroarilo, -C(O)O-heteroarilo sustituido, -C(O)O-heterocíclico y -C(O)O-heterocíclico sustituido, en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en el presente documento.
"(Carboxil éster)oxi" o "carbonato" se refiere a los grupos —O-C(O)O-alquilo, -O-C(O)O-alquilo sustituido, -O-C(O)O-alquenilo, -O-C(O)O-alquenilo sustituido, -O-C(O)O-alquinilo, -O-C(O)O-alquinilo sustituido, -O-C(O)O-arilo, -O-C(O)O-arilo sustituido, -O-C(O)O-cicloalquilo, -O-C(O)O-cicloalquilo sustituido, -O-C(O)O-cicloalquenilo, -O-C(O)O-cicloalquenilo sustituido, -O-C(O)O-heteroarilo, -O-C(O)O-heteroarilo sustituido, -O-C(O)O-heterocíclico y -O-C(O)O-heterocíclico sustituido, en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en el presente documento.
"Ciano" o "nitrilo" se refiere al grupo -CN.
"Cicloalquilo" se refiere a grupos alquilo cíclicos de desde 3 hasta 10 átomos de carbono que tiene un único anillo cíclico o múltiples anillos cíclicos que incluyen sistemas de anillos condensados, puenteados y espiro. Los ejemplos de grupos cicloalquilo adecuados incluyen, por ejemplo, adamantilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclooctilo y similares. Dichos grupos cicloalquilo incluyen, a modo de ejemplo, estructuras de anillo únicas, tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclooctilo y similares, o múltiples estructuras de anillo tales como adamantanilo y similares.
El término "cicloalquilo sustituido" se refiere a grupos cicloalquilo que tienen desde 1 hasta 5 sustituyentes, o desde 1 hasta 3 sustituyentes, seleccionados de alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-alquilo sustituido, -SO2-arilo y -SO2-heteroarilo.
"Cicloalquenilo" se refiere a grupos alquilo cíclicos no aromáticos de desde 3 hasta 10 átomos de carbono que tienen un único anillo o múltiples anillos y que tienen al menos un doble enlace y preferentemente desde 1 hasta 2 dobles enlaces.
El término "cicloalquenilo sustituido" se refiere a grupos cicloalquenilo que tienen desde 1 hasta 5 sustituyentes, o desde 1 hasta 3 sustituyentes, seleccionados de alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, ceto, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-alquilo sustituido, -SO2-arilo y -SO2-heteroarilo.
"Cicloalquinilo" se refiere a grupos cicloalquilo no aromáticos de desde 5 hasta 10 átomos de carbono que tienen un único anillo o múltiples anillos y que tienen al menos un triple enlace.
"Cicloalcoxi" se refiere a —O-cicloalquilo.
"Cicloalqueniloxi" se refiere a —O-cicloalquenilo.
"Halo" o "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo y yodo.
"Hidroxi" o "hidroxilo" se refiere al grupo —OH.
"Heteroarilo" se refiere a un grupo aromático de desde 1 hasta 15 átomos de carbono, tal como desde 1 hasta 10 átomos de carbono y 1 a 10 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre dentro del anillo. Dichos grupos heteroarilo pueden tener un único anillo (tal como, piridinilo, imidazolilo o furilo) o múltiples anillos condensados en un sistema de anillos (por ejemplo, como en grupos tales como indolizinilo, quinolinilo, benzofurano, bencimidazolilo o benzotienilo), en donde al menos un anillo dentro del sistema de anillos es aromático. Para cumplir los requisitos de valencia, cualquier heteroátomo en dichos anillos de heteroarilo pueden o pueden no se unirse a H o un grupo sustituyente, por ejemplo, un grupo alquilo u otros sustituyente como se describe en el presente documento. En ciertos ejemplos, el (los) átomo(s) de anillo de nitrógeno y/o azufre del grupo heteroarilo se oxidan opcionalmente para proporcionar los restos de N-óxido (N ^O ), sulfinilo o sulfonilo. Este término incluye, a modo de ejemplo, piridinilo, pirrolilo, indolilo, tiofenilo y furanilo. A menos que se limite de otro modo por la definición del sustituyente de heteroarilo, dichos grupos heteroarilo pueden estar sustituidos opcionalmente con 1 a 5 sustituyentes, o desde 1 hasta 3 sustituyentes, seleccionados de aciloxi, hidroxi, tiol, acilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilo sustituido, alcoxi sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo sustituido, amino, amino sustituido, aminoacilo, acilamino, alcarilo, arilo, ariloxi, azido, carboxilo, carboxilalquilo, ciano, halógeno, nitro, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, aminoaciloxi, oxiacilamino, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, tioariloxi, tioheteroariloxi, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-alquilo sustituido, -SO2-arilo y -SO2-heteroarilo, y trihalometilo.
El término "heteroaralquilo" se refiere a los grupos -alquilen-heteroarilo donde alquileno y heteroarilo se definen en el presente documento. Este término incluye, a modo de ejemplo, piridilmetilo, piridiletilo, indolilmetilo y similares.
"Heteroariloxi" se refiere a -O-heteroarilo.
"Heterociclo", "heterocíclico", "heterocicloalquilo" y "heterociclilo" se refieren a un grupo saturado o insaturado que tiene un único anillo o múltiples anillos condensados, que incluyen sistemas de anillos condensados, puenteados y espiro, y que tiene desde 3 hasta 20 átomos de anillo, que incluyen 1 a 10 heteroátomos. Estos átomos de anillo se seleccionan de nitrógeno, azufre u oxígeno, donde, en sistemas de anillos condensados, uno o más de los anillos puede ser cicloalquilo, arilo o heteroarilo, a condición de que el punto de fijación sea mediante el anillo no aromático. En ciertas realizaciones, el (los) átomo(s) de nitrógeno y/o azufre del grupo heterocíclico se oxidan opcionalmente para proporcionar los restos N-óxido, -S(O)- o -SO2-. Para cumplir los requisitos de valencia, cualquier heteroátomo en dichos anillos heterocíclicos puede o puede no unirse a uno o más H o uno o más grupos sustituyentes, por ejemplo, un grupo alquilo u otro sustituyente como se describe en el presente documento.
Los ejemplos de heterociclos y heteroarilos incluyen, pero no se limitan a, azetidina, pirrol, imidazol, pirazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, dihidroindol, indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftilpiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, fenantrolina, isotiazol, fenazina, isoxazol, fenoxazina, fenotiazina, imidazolidina, imidazolina, piperidina, piperazina, indolina, ftalimida, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 4,5,6,7-tetrahidrobenzo[b]tiofeno, tiazol, tiazolidina, tiofeno, benzo[b]tiofeno, morfolinilo, tiomorfolinilo (también denominado tiamorfolinilo), 1,1-dioxotiomorfolinilo, piperidinilo, pirrolidina, tetrahidrofuranilo y similares.
A menos que se limite de otro modo por la definición del sustituyente heterocíclico, dichos grupos heterocíclicos pueden estar sustituidos opcionalmente con 1 a 5, o desde 1 hasta 3 sustituyentes, seleccionados de alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-alquilo sustituido, -SO2-arilo, -SO2-heteroarilo y heterociclo condensado.
"Heterocicliloxi" se refiere al grupo —O-heterociclilo.
El término "heterocicliltio" se refiere al grupo heterocíclico-S-.
El término "heterociclona" se refiere al grupo dirradical formado a partir de un heterociclo, como se define en el presente documento.
El término "hidroxiamino" se refiere al grupo -NHOH.
"Nitro" se refiere al grupo —NO2.
"Oxo" se refiere al átomo (=O).
"Sulfonilo" se refiere al grupo SO2-alquilo, SO2-alquilo sustituido, SO2-alquenilo, SO2-alquenilo sustituido, SO2-cicloalquilo, SO2-cicloalquilo sustituido, SO2-cicloalquenilo, SO2-cicloalquenilo sustituido, SO2-arilo, SO2-arilo sustituido, SO2-heteroarilo, SO2-heteroarilo sustituido, SO2-heterocíclico y SO2-heterocíclico sustituido, en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en el presente documento. Sulfonilo incluye, a modo de ejemplo, metil-SO2-, fenil-SO2- y 4-metilfenil-SO2-.
"Sulfoniloxi" se refiere al grupo —OSO2-alquilo, OSO2-alquilo sustituido, OSO2-alquenilo, OSO2-alquenilo sustituido, OSO2-cicloalquilo, OSO2-cicloalquilo sustituido, OSO2-cicloalquenilo, OSO2-cicloalquenilo sustituido, OSO2-arilo, OSO2-arilo sustituido, OSO2-heteroarilo, OSO2-heteroarilo sustituido, OSO2-heterocíclico, y OSO2-heterocíclico sustituido, en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en el presente documento.
El término "aminocarboniloxi" se refiere al grupo -OC(O)NRR, donde cada R es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, heteroarilo o heterocíclico, en donde alquilo, alquilo sustituido, arilo, heteroarilo y heterocíclico son como se definen en el presente documento.
"Tiol" se refiere al grupo -SH.
"Tioxo" o el término "tioceto" se refiere al átomo (=S).
"Alquiltio" o el término "tioalcoxi" se refiere al grupo -S-alquilo, en donde alquilo es como se define en el presente documento. En ciertas realizaciones, el azufre se puede oxidar en -S(O)-. El sulfóxido puede existir como uno o más estereoisómeros.
El término "tioalcoxi sustituido" se refiere al grupo -S-alquilo sustituido.
El término "tioariloxi" se refiere al grupo aril-S-, en donde el grupo arilo es como se define en el presente documento que incluye opcionalmente grupos arilo sustituidos también definidos en el presente documento.
El término "tioheteroariloxi" se refiere al grupo heteroaril-S-, en donde el grupo heteroarilo es como se define en el presente documento que incluye grupos arilo opcionalmente sustituidos como también se definen en el presente documento.
El término "tioheterociclooxi" se refiere al grupo heterociclil-S-, en donde el grupo heterociclilo es como se define en el presente documento que incluye grupos heterociclilo opcionalmente sustituidos como también se definen en el presente documento.
Además de la divulgación en el presente documento, el término "sustituido", cuando se usa para modificar un grupo o radical especificado, también puede significar que uno o más átomos de hidrógeno del grupo o radical especificado están cada uno sustituidos, independientemente entre sí, con los mismos grupos sustituyentes o diferentes como se define a continuación.
Además de los grupos desvelados con respecto a los términos individuales en el presente documento, grupos sustituyentes para la sustitución de uno o más hidrógenos (cualesquiera dos hidrógenos en un único carbono se pueden sustituir con =O, =NR70, =N-OR70, =N2 o =S) en átomos de carbono saturados en el grupo o radical especificado son, a menos que se especifique de otro modo, -R60, halógeno, =O, -OR70, -SR70, -NR80R80, trihalometilo, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2 , =N2 , -N3 , -SO2 R70, -SO2O-M+, -SO2OR70, -OSO2 R70, -OSO2O-M+, -OSO2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)O-M+, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)O -M+, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2-M+, -NR70CO2 R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 y -NR70C(NR70)NR80R80, donde R60 se selecciona del grupo que consiste en alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo, heteroalquilo, heterocicloalquilalquilo, cicloalquilalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo y heteroarilalquilo, cada R70 es independientemente hidrógeno o R60; cada R80 es independientemente R70 o alternativamente, dos R80, tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un heterocicloalquilo de 5, 6 o 7 miembros que puede incluir opcionalmente desde 1 hasta 4 de los mismos heteroátomos o heteroátomos diferentes adicionales seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, de los que N puede tener -H o sustitución de alquilo C1-C3 ; y cada M+ es un contraión con una carga positiva individual neta. Cada M+ puede ser independientemente, por ejemplo, un ion alcalino, tal como K+, Na+, Li+; un ion amonio, tal como N(R60)4; o un ion alcalinotérreo, tal como [Ca2+]0,5, [Mg2+]0,5, o [Ba2+]0,5 ("el subíndice 0,5 significa que uno de los contraiones para dichos iones alcalinotérreos divalentes puede ser una forma ionizada de un compuesto de la invención y el otro aun contraión típico, tal como cloruro, o dos compuestos ionizados desvelados en el presente documento pueden servir de contraiones para dichos iones alcalinotérreos divalentes, o un compuesto doblemente ionizado de la invención puede servir de contraión para dichos iones alcalinotérreos divalentes). Como ejemplos específicos, -NR80R80 pretende incluir -NH2 , -NH-alquilo, N-pirrolidinilo, N-piperazinilo, 4N-metil-piperazin-1-ilo y N-morfolinilo.
Además de la divulgación en el presente documento, grupos sustituyentes para hidrógenos en átomos de carbono insaturados en grupos alqueno, alquino, arilo y heteroarilo "sustituidos" son, a menos que se especifique de otro modo, -R60, halógeno, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80, trihalometilo, -CF3 , -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2 , -N3 , -SO2 R70, -SO3-M+, -SO3R70, -OSO2R70, -OSO3-M+, -OSO3R70, -PO3-2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -CO2-M+, -CO2R70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OCO2-M+, -OCO2R70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2-M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 y -NR70C(NR70)NR80R80, donde R60, R70, R80 y M+ son como se definieron previamente, a condición de que en caso de alqueno o alquino sustituido, los sustituyentes no son -O-M+, -OR70, -SR70 o -S-M+.
Además de los grupos desvelados con respecto a los términos individuales en el presente documento, grupos sustituyentes para hidrógenos en átomos de nitrógeno en grupos heteroalquilo y cicloheteroalquilo "sustituidos" son, a menos que se especifique de otro modo, -R60, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80, trihalometilo, -CF3 , -CN, -NO, -NO2 , -S(O)2 R70, -S(O)2O-M+, -S(O)2OR70, -OS(O)2 R70, -OS(O)2 O-M+, -OS(O)2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2 , -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)(OR70), -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70C(O)OR70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 y -NR70C(NR70)NR80R80, donde R60, R70, R80 y M+ son como se definieron previamente.
Además de la divulgación en el presente documento, en una cierta realización, un grupo que está sustituido tiene 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, 1, 2 o 3 sustituyentes, 1 o 2 sustituyentes, o 1 sustituyente.
Se entiende que en todos los grupos sustituidos definidos anteriormente, los polímeros a los que se llega definiendo sustituyentes con sustituyentes adicionales a ellos mismos (por ejemplo, arilo sustituido que tiene un grupo arilo sustituido como sustituyente que está en sí mismo sustituido con un grupo arilo sustituido, que está además sustituido con un grupo arilo sustituido, etc.) no están destinados para su inclusión en el presente documento. En tales casos, el número máximo de dichas sustituciones es tres. Por ejemplo, sustituciones en serie de grupos arilo sustituidos específicamente contemplados en el presente documento se limitan a sustituido aril-(aril sustituido)-arilo sustituido.
A menos que se indique lo contrario, a la nomenclatura de sustituyentes que no se definen explícitamente en el presente documento se llega nombrando la porción terminal de la funcionalidad, seguido por la funcionalidad adyacente hacia el punto de unión. Por ejemplo, el sustituyente "arilalquiloxicarbonilo" se refiere al grupo (aril)-(alquil)-O-C(O)-.
En cuanto a cualquiera de los grupos desvelados en el presente documento que contienen uno o más sustituyentes, se entiende, por supuesto, que dichos grupos no contienen ninguna sustitución ni patrones de sustitución que sean estéricamente poco prácticos y/o sintéticamente no factibles. Además, los compuestos objeto incluyen todos los isómeros estereoquímicos que surgen de la sustitución de estos compuestos.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" significa una sal que es aceptable para administración a un paciente, tal como un mamífero (sales con contraiones que tienen seguridad aceptable para el mamífero para una pauta de administración dada). Dichas sales pueden derivar de bases inorgánicas u orgánicas farmacéuticamente aceptables y de ácidos inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente aceptables. "Sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de un compuesto, cuyas sales derivan de una variedad de contraiones orgánicos e inorgánicos bien conocidos en la técnica e incluyen, a modo de ejemplo solo, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, tetraalquilamonio y similares; y cuando la molécula contiene una funcionalidad básica, sales de ácidos orgánicos o inorgánicos, tales como clorhidrato, bromhidrato, formiato, tartrato, besilato, mesilato, acetato, maleato, oxalato y similares.
El término "sal del mismo" significa un compuesto formado cuando un protón de un ácido se sustituye por un catión, tal como un catión metálico o un catión orgánico y similares. Si procede, la sal es una sal farmacéuticamente aceptable, aunque esto no se requiere para sales de compuestos intermedios que no están previstos para administración a un paciente. A modo de ejemplo, las sales de los presentes compuestos incluyen aquellas en donde el compuesto es protonado por un ácido inorgánico u orgánico para formar un catión, con la base conjugada del ácido inorgánico u orgánico como el componente aniónico de la sal.
"Solvato" se refiere a un complejo formado por combinación de moléculas de disolvente con moléculas o iones del soluto. El disolvente puede ser un compuesto orgánico, un compuesto inorgánico, o una mezcla de ambos. Algunos ejemplos de disolventes incluyen, pero no se limitan a, metanol, N,N-dimetilformamida, tetrahidrofurano, sulfóxido de dimetilo y agua. Cuando el disolvente es agua, el solvato formado es un hidrato.
"Estereoisómero" y "estereoisómeros" se refieren a compuestos que tienen la misma conectividad atómica, pero diferente disposición atómica en el espacio. Los estereoisómeros incluyen isómeros cis-trans, isómeros E y Z, enantiómeros y diaestereómeros.
"Tautómero" se refiere a formas alternas de una molécula que se diferencian solo en la unión electrónica de átomos y/o en la posición de un protón, tal como tautómeros enol-ceto y imina-enamina, o las formas tautómeras de grupos heteroarilo que contienen una disposición de átomos del anillo -N=C(H)-NH-, tales como pirazoles, imidazoles, bencimidazoles, triazoles y tetrazoles. Un experto habitual en la técnica reconocería que son posibles otras disposiciones de átomos del anillo tautomérico.
Se apreciará que el término "o una sal o solvato o estereoisómero del mismo" pretende incluir todas las permutaciones de sales, solvatos y estereoisómeros, tales como un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable de un estereoisómero o compuesto objeto.
"Cantidad farmacéuticamente eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren a una cantidad de un compuesto suficiente para tratar un trastorno o enfermedad especificado o uno o más de sus síntomas y/o para prevenir la aparición de la enfermedad o trastorno. En referencia a los trastornos proliferativos tumorigénicos, una cantidad farmacéuticamente o terapéuticamente eficaz comprende una cantidad suficiente para provocar, entre otras cosas, que el tumor se encoja o disminuya la tasa de crecimiento del tumor.
"Paciente" se refiere a sujetos humanos y no humanos, especialmente a sujetos mamíferos.
El término "tratar" o "tratamiento", como se usa en el presente documento, significar el tratar o tratamiento de una enfermedad o afección médica en un paciente, tal como un mamífero (particularmente un ser humano) que incluye: (a) prevenir que ocurra la enfermedad o afección médica, tal como tratamiento profiláctico de un sujeto; (b) mejorar la enfermedad o afección médica, tal como eliminar o causar la regresión de la enfermedad o afección médica en un paciente; (c) suprimir la enfermedad o afección médica, por ejemplo, ralentizando o deteniendo el desarrollo de la enfermedad o afección médica en un paciente; o (d) aliviar un síntoma de la enfermedad o afección médica en un paciente.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud. A menos que se indique específicamente de otro modo, "polipéptido", "péptido" y "proteína" pueden incluir aminoácidos genéticamente codificados y no codificados, aminoácidos químicamente o bioquímicamente modificados o derivatizados, y polipéptidos que tienen esqueletos modificados en los péptidos. El término incluye proteínas de fusión, que incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias conductoras heterólogas y homólogas, proteínas que contienen al menos un resto aminoterminal de metionina (por ejemplo, para facilitar la producción en una célula hospedadora bacteriana recombinante); proteínas inmunológicamente marcadas; y similares.
"Secuencia de aminoácidos nativa" o "secuencia de aminoácidos parental" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido antes de la modificación para incluir un resto de aminoácido modificado.
Los términos "análogo de aminoácido", "aminoácido no natural" y similares se pueden usar indistintamente, e incluyen compuestos de tipo aminoácido que son similares en estructura y/o forma global a uno o más aminoácidos comúnmente encontrados en proteínas que existen de forma naturales (por ejemplo, Ala o A, Cys o C, Asp o D, Glu o E, Phe o F, Gly o G, His o H, Ile o I, Lys o K, Leu o L, Met o M, Asn o N, Pro o P, Gln o Q, Arg o R, Ser o S, Thr o T, Val o V, Trp o W, Tyr o Y). Los análogos de aminoácidos también incluyen aminoácidos naturales con cadenas laterales o esqueletos modificados. Los análogos de aminoácidos también incluyen análogos de aminoácidos con la misma estereoquímica que en la forma D que existe de forma natural, así como la forma L de análogos de aminoácidos. En algunos casos, los análogos de aminoácidos comparten estructuras de esqueleto, y/o las estructuras de cadena lateral de uno o más aminoácidos naturales, siendo la(s) diferencia(s) uno o más grupos modificados en la molécula. Dicha modificación puede incluir, pero no se limita a, sustitución de un átomo (tal como N) con un átomo relacionado (tal como S), adición de un grupo (tal como metilo, o hidroxilo, etc.) o un átomo (tal como Cl o Br, etc.), deleción de un grupo, sustitución de un enlace covalente (enlace sencillo con doble enlace, etc.), o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, los análogos de aminoácidos pueden incluir a-hidroxiácidos y a-aminoácidos, y similares.
Los términos "cadena lateral de aminoácido" o "cadena lateral de un aminoácido" y similares se pueden usar para referirse al sustituyente unido al carbono a de un resto de aminoácido, que incluye aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos. Una cadena lateral del aminoácido también puede incluir una cadena lateral de aminoácido como se describe en el contexto de los aminoácidos modificados y/o conjugados descritos en el presente documento.
El término "hidrato de carbono" y similares se pueden usar para referirse a unidades de monómeros y/o polímeros de monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. El término azúcar se puede usar para referirse a los hidratos de carbono más pequeños, tales como monosacáridos, disacáridos. El término "derivado de hidrato de carbono" incluye compuestos donde uno o más grupos funcionales de un hidrato de carbono de interés están sustituidos (sustituidos por cualquier sustituyente conveniente), modificados (convertidos en otro grupo usando cualquier química conveniente) o ausentes (por ejemplo, eliminados o sustituidos por H). Estás disponibles una variedad de hidratos de carbono y derivados de hidrato de carbono y se pueden adaptar para su uso en los compuestos y conjugados objeto.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos Fab) y similares. Un anticuerpo es capaz de unirse a un antígeno diana (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5a ed., Garland Publishing, New York). Un antígeno diana puede tener uno o más sitios de unión, también llamados epítopes, reconocidos por regiones determinantes de la complementariedad (CDR) formadas por una o más regiones variables de un anticuerpo.
El término "anticuerpo natural" se refiere a un anticuerpo en el que las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo han sido producidas y emparejadas por el sistema inmunitario de un organismo multicelular. Bazo, ganglios linfáticos, médula ósea y suero son ejemplos de tejidos que producen anticuerpos naturales. Por ejemplo, los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos aisladas de un primer animal inmunizado con un antígeno son anticuerpos naturales.
El término "anticuerpo humanizado" o "inmunoglobulina humanizada" se refiere a un anticuerpo no humano (por ejemplo, ratón o conejo) que contiene uno o más aminoácidos (en una región estructural, una región constante o una CDR, por ejemplo) que se han sustituido con un aminoácido correspondientemente situado de un anticuerpo humano.
En general, los anticuerpos humanizados producen una respuesta inmunitaria reducida en un hospedador humano, en comparación con una versión no humanizada del mismo anticuerpo. Los anticuerpos se pueden humanizar usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, injerto de CDR (documento de patente EP 239.400; publicación PCT WO 91/09967; patentes de EE. UU. N.25.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), inactivación o acondicionamiento superficial (documentos de patente EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)) y barajado de cadenas (patente de EE. UU. N.° 5.565.332). En ciertas realizaciones, las sustituciones de la región estructural se identifican por modelado de las interacciones de las CDR y los restos de la región estructural para identificar restos de la región estructural importantes para la unión al antígeno y comparación de secuencias para identificar restos poco usuales de la región estructural en las posiciones particulares (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Métodos adicionales para la humanización de los anticuerpos contemplados para su uso en la presente invención se describen en las patentes de EE. UU. N.° 5.750.078; 5.502.167; 5.705.154; 5.770.403; 5.698.417; 5.693.493; 5.558.864; 4.935.496; y 4.816.567, y las publicaciones PCT WO 98/45331 y WO 98/45332. En realizaciones particulares, un anticuerpo de conejo objeto se puede humanizar según los métodos expuestos en los documentos de patente US20040086979 y US20050033031. Por consiguiente, los anticuerpos descritos anteriormente se pueden humanizar usando métodos que son bien conocidos en la técnica.
El término "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos cuyos genes de la cadena ligera y pesada se han construido, normalmente por ingeniería genética, a partir de genes de la región variable y constante del anticuerpo que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón se pueden unir a segmentos constantes humanos, tales como gamma 1 y gamma 3. Un ejemplo de un anticuerpo quimérico terapéutico es una proteína híbrida compuesta del dominio variable o de unión al antígeno de un anticuerpo de ratón y el dominio constante o efector de un anticuerpo humano, aunque se pueden usar dominios de otras especies de mamíferos.
Una región ligera o variable de la cadena pesada de inmunoglobulina de polipéptidos de inmunoglobulina está compuesta por una región estructural (FR) interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Se ha definido el grado de la región estructural y las CDR (véase "Sequences of Proteins of Immunological Interest", E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1991). La región estructural de un anticuerpo, que es las regiones estructurales combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para situar y alinear las CDR. Las CDR son responsables principalmente de la unión a un epítope de un antígeno.
En toda la presente divulgación, la numeración de los restos en una cadena pesada de la inmunoglobulina y en una cadena ligera de la inmunoglobulina es la de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).
Un "polipéptido Ig parental" es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que carece de una región constante marcada con aldehído como se describe en el presente documento. El polipéptido parental puede comprender una región constante de secuencia nativa, o puede comprender una región constante con modificaciones preexistentes en la secuencia de aminoácidos (tales como adiciones, deleciones y/o sustituciones).
En el contexto de un polipéptido Ig, el término "región constante" es bien entendido en la técnica, y se refiere a una región carboxiterminal de una cadena pesada de Ig, o una cadena ligera de Ig. Una región constante de la cadena pesada de Ig incluye dominios CH1, CH2 y CH3 (y dominios CH4, donde la cadena pesada es una cadena pesada g o s). En una cadena pesada de Ig nativa, los dominios CH1, CH2, CH3 (y, si está presente, CH4) empiezan inmediatamente después de (carboxiterminal a) la región la cadena pesada variable (VH), y tienen cada una desde aproximadamente 100 aminoácidos hasta aproximadamente 130 aminoácidos de longitud. En una cadena ligera de Ig nativa, la región constante empieza inmediatamente después de (carboxiterminal a) la cadena ligera variable (VL) región, y tiene aproximadamente 100 aminoácidos a 120 aminoácidos de longitud.
Como se usa en el presente documento, el término "CDR" o "región determinante de la complementariedad" pretende significar los sitios de combinación de antígenos no contiguos encontrados dentro de la región variable de tanto los polipéptidos de la cadena pesada como ligera. Los CDR se han descrito por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1991); por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1987); y MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), donde las definiciones incluyen el solapamiento o los subconjuntos de restos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. Sin embargo, la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o anticuerpos injertados o variantes de los mismos pretende estar dentro del alcance del término como se define y usa en el presente documento. Los restos de aminoácidos que engloban las CDR como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a continuación en la Tabla 1 como comparación.
Tabla 1: Definiciones de CDR
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"Genéticamente codificable", como se usa en referencia a una secuencia de aminoácidos de polipéptido, péptido o proteína, significa que la secuencia de aminoácidos está compuesta por restos de aminoácidos que son capaces de producir por transcripción y traducción un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos, donde la transcripción y/o la traducción pueden ocurrir en una célula o en un sistema de transcripción/traducción in vitro sin células.
El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN que facilitan la expresión de una secuencia codificante operativamente unida en un sistema de expresión particular, por ejemplo, célula de mamífero, célula bacteriana, síntesis sin células, etc. Las secuencias de control que son adecuadas para los sistemas procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Los sistemas de células eucariotas pueden utilizar promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
Un ácido nucleico se "une operativamente" cuando se pone en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o conductor secretor está unido operativamente con el ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente con una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificante si está situado para facilitar el inicio de la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de un conductor secretor, contiguas y en marco de lectura. La unión se lleva a cabo por ligación o mediante reacciones de amplificación. Se pueden usar adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos para unir secuencias según la práctica convencional.
El término "casete de expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento de ácido nucleico, normalmente ADN, que se puede insertar en un ácido nucleico (por ejemplo, por uso de sitios de restricción compatibles con la ligación en una construcción de interés o por recombinación homóloga en una construcción de interés o en un genoma de célula hospedadora). En general, el segmento de ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, y el casete y los sitios de restricción se diseñan para facilitar la inserción del casete en el marco de lectura apropiado para la transcripción y la traducción. Los casetes de expresión también pueden comprender elementos que facilitan la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés en una célula hospedadora. Estos elementos pueden incluir, pero no se limitan a: un promotor, un promotor mínimo, un potenciador, un elemento de respuesta, una secuencia terminadora, una secuencia de poliadenilación y similares.
Como se usa en el presente documento, el término "aislado" se indica para describir un compuesto de interés que está en un entorno diferente de aquél en el que el compuesto ocurre naturalmente. "Aislado" pretende incluir compuestos que están dentro de muestras que están enriquecidas sustancialmente en el compuesto de interés y/o en las que el compuesto de interés está purificado parcialmente o sustancialmente.
Como se usa en el presente documento, el término "purificado sustancialmente" se refiere a un compuesto que se retira de su entorno natural y está al menos 60 % libre, al menos 75 % libre, al menos 80 % libre, al menos 85 % libre, al menos 90 % libre, al menos 95 % libre, al menos 98 % libre o más del 98 % libre, de otros componentes con los que está asociado naturalmente.
El término "condiciones fisiológicas" se indica para englobar las condiciones compatibles con células vivas, por ejemplo, condiciones predominantemente acuosas de una temperatura, pH, salinidad, etc., que son compatibles con las células vivas.
Por "componente reactivo" se indica una molécula o resto molecular que reacciona específicamente con otro componente reactivo para producir un producto de reacción. Los componentes reactivos a modo de ejemplo incluyen una cisteína o serina de un motivo de sulfatasa y enzima generadora de formilglicina (FGE), que reaccionan para formar un producto de reacción de una marca de aldehído convertida que contiene una formilglicina (FGly) en lugar de cisteína o serina en el motivo. Otros componentes reactivos a modo de ejemplo incluyen un aldehído de un resto fGly de una marca de aldehído convertida (por ejemplo, un grupo aldehído reactivo) y un "componente reactivo reactivo con aldehído", que comprende un grupo reactivo con aldehído y un resto de interés, y que reacciona para formar un producto de reacción de un polipéptido marcado con aldehído modificado que tiene el resto de interés conjugado con el polipéptido modificado mediante un resto fGly modificado.
"Extremo N" se refiere al resto de aminoácido terminal de un polipéptido que tiene un grupo amina libre, grupo amina que en restos de aminoácidos no aminoterminales forma parte normalmente del esqueleto covalente del polipéptido.
"Extremo C" se refiere al resto de aminoácido terminal de un polipéptido que tiene un grupo carboxilo libre, grupo carboxilo que en restos de aminoácidos no carboxiterminales forma parte normalmente del esqueleto covalente del polipéptido.
"Sitio interno", como se usa con referencia a un polipéptido o una secuencia de aminoácidos de un polipéptido, significa una región del polipéptido que no está ni en el extremo N ni en el extremo C.
Antes de describir aún más la presente invención, se debe entender que la presente invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que dichas pueden, por supuesto, variar. También se debe entender que la terminología usada en el presente documento es con el fin de describir realizaciones particulares solo, y no pretende ser limitante, puesto que el alcance de la presente invención se limitará solo por las reivindicaciones adjuntas.
Donde se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, al décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor intermedio establecido o intermedio en ese intervalo establecido, está englobado dentro de la invención. Los límites superiores e inferiores de estos intervalos más pequeños se pueden incluir independientemente en los intervalos más pequeños, y también están englobados dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Donde el intervalo establecido incluya uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de los límites incluidos también están incluidos en la invención.
Se aprecia que ciertas características de la invención, que se describen, por claridad, en el contexto de realizaciones separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una única realización. En cambio, diversas características de la invención, que se describen, por brevedad, en el contexto de una única realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las realizaciones referentes a la invención están englobadas específicamente por la presente invención y se desvelan en el presente documento como si cada combinación fuera desvelada individualmente y explícitamente, hasta el punto de que dichas combinaciones engloben materia que son compuestos, por ejemplo, que son compuestos estables (es decir, compuestos que se pueden preparar, aislar, caracterizar y probar para su actividad biológica). Además, todas las subcombinaciones de las diversas realizaciones y elementos de las mismas (por ejemplo, elementos de los grupos químicos enumerados en las realizaciones que describen dichas variables) también están englobadas específicamente por la presente invención y se desvelan en el presente documento como si cada dicha subcombinación fuera desvelada individualmente y explícitamente en el presente documento.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento también se puede usar en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.
Se debe observar que, como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes al plural, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Se observa además que las reivindicaciones pueden ser redactadas para excluir cualquier elemento opcional. Como tales, esta afirmación pretende servir de antecedente para el uso de dicha terminología excluyente como "únicamente", "solo" y similares, a propósito de la relación de los elementos de reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".
Se aprecia que ciertas características de la invención, que se describen, por claridad, en el contexto de realizaciones separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una única realización. En cambio, diversas características de la invención, que se describen, por brevedad, en el contexto de una única realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada.
Las publicaciones tratadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento se debe interpretar como una admisión de que la presente invención no tenga derecho a anticiparse a dicha publicación en virtud de la invención previa. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona estructuras de conjugado de anticuerpo anti-CD22-maitansina. La divulgación también engloba métodos de producción de dichos conjugados, así como métodos de uso de los mismos. Realizaciones de cada uno se describen con más detalle en las siguientes secciones.
Conjugados de anticuerpo-fármaco
La presente divulgación proporciona conjugados, por ejemplo, conjugados de anticuerpo-fármaco. Por "conjugado" se indica que un primer resto (por ejemplo, un anticuerpo) está asociado establemente con un segundo resto (por ejemplo, un fármaco). Por ejemplo, un conjugado de maitansina incluye una maitansina (por ejemplo, un resto de agente activo de maitansina) asociada establemente con otro resto (por ejemplo, el anticuerpo). Por "asociado establemente" se indica que un resto está unido a otro resto o estructura en condiciones habituales. En ciertas realizaciones, el primer y segundo restos se unen entre sí mediante uno o más enlaces covalentes.
En ciertas realizaciones, el conjugado es un conjugado de polipéptido, que incluye un polipéptido conjugado con un segundo resto. En ciertas realizaciones, el resto conjugado con el polipéptido puede ser cualquiera de una variedad de restos de interés, tales como, pero no se limitan a, una marca detectable, un fármaco, un polímero soluble en agua, o un resto para la inmovilización del polipéptido a una membrana o una superficie. Los conjugados de la presente invención son conjugados de maitansina, donde un polipéptido está conjugado con una maitansina o un resto de agente activo de maitansina. "Maitansina", "resto de maitansina", "resto de agente activo de maitansina" y "maitansinoide" se refieren a una maitansina y análogos y derivados de la misma, y restos de maitansina farmacéuticamente activos y/o porciones de los mismos. Una maitansina conjugada con el polipéptido puede ser cualquiera de una variedad de restos de maitansinoide, tales como, pero no se limitan a, maitansina y análogos y derivados de la misma, como se describe en el presente documento.
El resto de interés se puede conjugar con el polipéptido en cualquier sitio deseado del polipéptido. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona, por ejemplo, un polipéptido modificado que tiene un resto conjugado con un sitio en o cerca del extremo C del polipéptido. Otros ejemplos incluyen un polipéptido modificado que tiene un resto conjugado en una posición en o cerca del extremo N del polipéptido. Los ejemplos también incluyen un polipéptido modificado que tiene un resto conjugado en una posición entre el extremo C y el extremo N del polipéptido (por ejemplo, en un sitio interno del polipéptido). También son posibles combinaciones de lo anterior, donde el polipéptido modificado está conjugado con dos o más restos.
En ciertas realizaciones, un conjugado de la presente divulgación incluye una maitansina conjugada con un resto de aminoácido de un polipéptido en el carbono a de un resto de aminoácido. Dicho de otra forma, un conjugado de maitansina incluye un polipéptido donde la cadena lateral de uno o más restos de aminoácidos en el polipéptido se han modificado para unirse a una maitansina (por ejemplo, unida a un maitansina mediante un conector como se describe en el presente documento). Por ejemplo, un conjugado de maitansina incluye un polipéptido donde el carbono a de uno o más restos de aminoácidos en el polipéptido se ha modificado para unirse a una maitansina (por ejemplo, unido a una maitansina mediante un conector como se describe en el presente documento).
Las realizaciones de la presente divulgación incluyen conjugados donde un polipéptido está conjugado con uno o más restos, tales como 2 restos, 3 restos, 4 restos, 5 restos, 6 restos, 7 restos, 8 restos, 9 restos, o 10 o más restos. Los restos se pueden conjugar con el polipéptido en uno o más sitios en el polipéptido. Por ejemplo, uno o más restos se pueden conjugar con un único resto de aminoácido del polipéptido. En algunos casos, un resto se conjuga con un resto de aminoácido del polipéptido. En otras realizaciones, dos restos se pueden conjugar con el mismo resto de aminoácido del polipéptido. En otras realizaciones, un primer resto se conjuga con un primer resto de aminoácido del polipéptido y un segundo resto se conjuga con un segundo resto de aminoácido del polipéptido. También son posibles combinaciones de los anteriores, por ejemplo, donde un polipéptido se conjuga con un primer resto en un primer resto de aminoácido y se conjuga con otros dos restos en un segundo resto de aminoácido. También son posibles otras combinaciones, tales como, pero no se limitan a, un polipéptido conjugado con el primer y segundo restos en un primer resto de aminoácido y conjugado con un tercer y cuarto restos en un segundo resto de aminoácido, etc.
El uno o más restos de aminoácidos del polipéptido que están conjugados con el uno o más restos pueden ser aminoácidos que existen de forma natural, aminoácidos no naturales, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, el conjugado puede incluir un resto conjugado con un resto de aminoácido que existe de forma natural del polipéptido. En otros casos, el conjugado puede incluir un resto conjugado con un resto de aminoácido no natural del polipéptido. Uno o más restos se pueden conjugar con el polipéptido en un único resto de aminoácido natural o no natural como se ha descrito anteriormente. Uno o más restos de aminoácidos naturales o no naturales en el polipéptido se pueden conjugar con el resto o restos como se describe en el presente documento. Por ejemplo, dos (o más) restos de aminoácidos (por ejemplo, restos de aminoácidos naturales o no naturales) en el polipéptido se pueden conjugar cada uno con uno o dos restos, de forma que se modifiquen múltiples sitios en el polipéptido.
Como se describe en el presente documento, un polipéptido se puede conjugar con uno o más restos. En ciertas realizaciones, el resto de interés es una entidad química, tal como un fármaco o una marca detectable. Por ejemplo, un fármaco (por ejemplo, maitansina) se puede conjugar con el polipéptido, o en otras realizaciones, una marca detectable se puede conjugar con el polipéptido. Por lo tanto, por ejemplo, las realizaciones de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: un conjugado de un polipéptido y un fármaco; un conjugado de un polipéptido y una marca detectable; un conjugado de dos o más fármacos y un polipéptido; un conjugado de dos o más marcas detectables y un polipéptido; y similares.
En ciertas realizaciones, el polipéptido y el resto de interés se conjugan mediante un resto de acoplamiento. Por ejemplo, el polipéptido y el resto de interés se pueden unir cada uno (por ejemplo, unir covalentemente) con el resto de acoplamiento, uniéndose así indirectamente juntos el polipéptido y el resto de interés (por ejemplo, un fármaco, tal como maitansina) mediante el resto de acoplamiento. En algunos casos, el resto de acoplamiento incluye un compuesto de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinMo, o un derivado de un compuesto de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo. Por ejemplo, un esquema general para acoplar un resto de interés (por ejemplo, una maitansina) con un polipéptido mediante un resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo se muestra a continuación en el esquema de reacción general. El resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo e hidrazinil-pirrolo-piridinilo se denomina en el presente documento un resto de acoplamiento de hidrazino-iso-Pictet-Spengler (HIPS) y un resto de acoplamiento de aza-hidrazino-/'so-Pictet-Spengler (azaHIPS), respectivamente.
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En el esquema de reacción anterior, R es el resto de interés (por ejemplo, maitansina) que está conjugado con el polipéptido. Como se muestra en el esquema de reacción anterior, un polipéptido que incluye un resto de 2-formilglicina (fGly) se hace reaccionar con un fármaco (por ejemplo, maitansina) que ha sido modificado para incluir un resto de acoplamiento (por ejemplo, un resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo) para producir un polipéptido conjugado unido al resto de acoplamiento, uniéndose así la maitansina al polipéptido mediante el resto de acoplamiento.
Como se describe en el presente documento, el resto puede ser cualquiera de una variedad de restos, tales como, pero no se limitan a, entidad química, tal como una marca detectable, o un fármaco (por ejemplo, un maitansinoide). R' y R" pueden ser cada uno independientemente cualquier sustituyente deseado, tal como, pero no se limita a, hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acilamino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido. Z puede ser CR11, NR12, N, O o S, donde R11 y R12 se seleccionan cada uno independientemente de cualquiera de los sustituyentes descritos para R' y R" anteriormente.
También son posibles otros restos de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo, como se muestra en los conjugados y compuestos descritos en el presente documento. Por ejemplo, los restos de acoplamiento de hidrazinilindolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo se pueden modificar para unirse (por ejemplo, unirse covalentemente) con un conector. Como tales, las realizaciones de la presente divulgación incluyen un resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo unido a un fármaco (por ejemplo, maitansina) mediante un conector. Diversas realizaciones del conector que pueden acoplar el resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo con el fármaco (por ejemplo, maitansina) se describen con detalle en el presente documento.
En ciertas realizaciones, el polipéptido se puede conjugar con un resto de interés, donde el polipéptido se modifica antes de la conjugación con el resto de interés. La modificación del polipéptido puede producir un polipéptido modificado que contiene uno o más grupos reactivos adecuados para la conjugación con el resto de interés. En algunos casos, el polipéptido se puede modificar en uno o más restos de aminoácidos para proporcionar uno o más grupos reactivos adecuados para la conjugación con el resto de interés (por ejemplo, un resto que incluye un resto de acoplamiento, tal como un resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo como se ha descrito anteriormente). Por ejemplo, el polipéptido se puede modificar para incluir un grupo aldehído reactivo (por ejemplo, un aldehído reactivo). Un aldehído reactivo se puede incluir en una "marca de aldehído" o "marca ald", que como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de aminoácidos derivada de un motivo de sulfatasa (por ejemplo, L(C/S)TPSR) que se ha convertido por la acción de una enzima generadora de formilglicina (FGE) para contener un resto de 2-formilglicina (denominado en el presente documento "FGly"). El resto de FGly generado por una FGE también se puede denominar una "formilglicina". Dicho de otra forma, el término "marca de aldehído" se usa en el presente documento para referirse a una secuencia de aminoácidos que incluye un motivo de sulfatasa "convertido" (es decir, un motivo de sulfatasa en el que un resto de cisteína o serina se ha convertido en una FGly por la acción de una FGE, por ejemplo, L(FGly)TPSR). Un motivo de sulfatasa convertida puede derivar de una secuencia de aminoácidos que incluye un motivo de sulfatasa "sin convertir" (es decir, un motivo sulfatasa en el que el resto de cisteína o serina no se ha convertido en FGly por una FGE, pero es capaz de ser convertido, por ejemplo, en un motivo de sulfatasa sin convertir con la secuencia: L(C/S)TPSR). "Conversión", como se usa en el contexto de la acción de una enzima generadora de formilglicina (FGE) en un motivo de sulfatasa, se refiere a la modificación bioquímica de un resto de cisteína o serina en un motivo de sulfatasa en un resto de formilglicina (FGly) (por ejemplo, Cys en FGly, o Ser en FGly). Aspectos adicionales de marcas de aldehído y usos de los mismos en la modificación de proteína específica del sitio se describen en la patente de EE. UU. N.° 7.985.783 y la patente de EE. UU. N.° 8.729.232.
En algunos casos, el polipéptido modificado que contiene el resto FGly se puede conjugar con el resto de interés haciendo reaccionar la FGly con un compuesto (por ejemplo, un compuesto que contiene un resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo, como se ha descrito anteriormente). Por ejemplo, un polipéptido que contiene FGly se puede poner en contacto con un fármaco que contiene un componente reactivo en condiciones adecuadas para proporcionar la conjugación del fármaco con el polipéptido. En algunos casos, el fármaco que contiene un componente reactivo puede incluir un resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, se puede modificar una maitansina para incluir un resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo. En algunos casos, la maitansina se une a un hidrazinil-indolilo o un hidrazinil-pirrolo-piridinilo, tal como se une covalentemente con un hidrazinil-indolilo o un hidrazinil-pirrolo-piridinilo, mediante un conector, como se describe en detalle en el presente documento.
En ciertas realizaciones, un conjugado de la presente divulgación incluye un polipéptido (un anticuerpo anti-CD22 en los conjugados de la presente invención) que tiene al menos un resto de aminoácido modificado. El resto de aminoácido modificado del polipéptido se puede acoplar con un fármaco (por ejemplo, maitansina) que contiene un resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo como se ha descrito anteriormente. En ciertas realizaciones, el resto de aminoácido modificado del polipéptido (por ejemplo, anticuerpo anti-CD22) puede derivar de un resto de cisteína o serina que se ha convertido en un resto de FGly como se ha descrito anteriormente. En ciertas realizaciones, el resto FGly está conjugado con un fármaco que contiene un resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo como se ha descrito anteriormente para proporcionar un conjugado de la presente divulgación donde el fármaco está conjugado con el polipéptido mediante el resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo. Como se usa en el presente documento, el término FGly' se refiere al resto de aminoácido modificado del polipéptido (por ejemplo, anticuerpo anti-CD22) que se acopla con el resto de interés (por ejemplo, un fármaco, tal como un maitansinoide).
La presente invención proporciona un conjugado que incluye al menos un resto de aminoácido modificado con una cadena lateral de la fórmula (I):
Figure imgf000020_0001
en donde W2 es un anticuerpo anti-CD22
También se describe en el presente documento un conjugado que incluye al menos un resto de aminoácido modificado de la fórmula (1) descrita en el presente documento. Por ejemplo, el conjugado puede incluir al menos un resto de aminoácido modificado con una cadena lateral de la fórmula (1):
Figure imgf000020_0002
en donde
Z es CR4 o N;
R1 se selecciona de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido;
R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acil amino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido, o R2 y R3 se unen opcionalmente cíclicamente para formar un heterociclilo de 5 o 6 miembros;
cada R4 se selecciona independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acil amino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido;
L es un conector que comprende -(T1-V1)a-(T2-V2)b-(T3-V3)c-(T4-V4)d-, en donde a, b, c y d son cada uno independientemente 0 o 1, donde la suma de a, b, c y d es 1 a 4;
T1, T2, T3 y T4 se seleccionan cada uno independientemente de alquilo (C1-C12), alquilo (C1-C12) sustituido, (EDA)w, (PEG)n, (AA)p, -(CR13OH)h-, piperidin-4-amino (4AP), un grupo acetal, una hidracina, un disulfuro y un éster, en donde EDA es un resto de etilendiamina, PEG es un polietilenglicol o un polietilenglicol modificado, y AA es un resto de aminoácido, en donde w es un número entero desde 1 hasta 20, n es un número entero desde 1 hasta 30, p es un número entero desde 1 hasta 20, y h es un número entero desde 1 hasta 12;
V1, V2, V3 y V4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en un enlace covalente, -CO-, -NR15-, -NR15(CH2)q-, -NR15(CsH4)-, -CONR15-, -NR15CO-, -C(O)O-, -OC(O)-, -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2NR15-, -NR15SO2- y -P(O)OH-, en donde q es un número entero desde 1 hasta 6;
cada R13 se selecciona independientemente de hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo y un arilo sustituido;
cada R15 se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido;
W 1 es un maitansinoide; y
W2 es un anticuerpo anti-CD22.
En ciertos ejemplos, Z es CR4 o N. En ciertos ejemplos, Z es CR4. En ciertos ejemplos, Z es N.
En ciertos ejemplos, R1 se selecciona de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido. En ciertos ejemplos, R1 es hidrógeno. En ciertos ejemplos, R1 es alquilo o alquilo sustituido, tal como alquilo C1-6 o alquilo C1-6 sustituido, o alquilo C1-4 o alquilo C1-4 sustituido, o alquilo C1-3 o alquilo C1-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R1 es alquenilo o alquenilo sustituido, tal como alquenilo C2-6 o alquenilo C2-6 sustituido, o alquenilo C2-4 o alquenilo C2-4 sustituido, o alquenilo C2-3 o alquenilo C2-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R1 es alquinilo o alquinilo sustituido, tal como alquenilo C2-6 o alquenilo C2-6 sustituido, o alquenilo C2-4 o alquenilo C2-4 sustituido, o alquenilo C2-3 o alquenilo C2-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R1 es arilo o arilo sustituido, tal como arilo C5-8 o arilo C5-8 sustituido, tal como un arilo C5 o arilo C5 sustituido, o un arilo C6 o arilo C6 sustituido. En ciertos ejemplos, R1 es heteroarilo o heteroarilo sustituido, tal como heteroarilo C5-8 o heteroarilo C5-8 sustituido, tal como un heteroarilo C5 o heteroarilo C5 sustituido, o un heteroarilo C6 o heteroarilo C6 sustituido. En ciertos ejemplos, R1 es cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, tal como cicloalquilo C3-8 o cicloalquilo C3-8 sustituido, tal como un cicloalquilo C3-6 o cicloalquilo C3-6 sustituido, o un cicloalquilo C3-5 o cicloalquilo C3-5 sustituido. En ciertos ejemplos, R1 es heterociclilo o heterociclilo sustituido, tal como heterociclilo C3-8 o sustituido C3-8 heterociclilo, tal como un heterociclilo C3-6 o heterociclilo C3-6 sustituido, o un heterociclilo C3-5 o heterociclilo C3-5 sustituido.
En ciertos ejemplos, R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acil amino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido, o R2 y R3 se unen opcionalmente cíclicamente para formar un heterociclilo de 5 o 6 miembros.
En ciertos ejemplos, R2 se selecciona de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acil amino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido. En ciertos ejemplos, R2 es hidrógeno. En ciertos ejemplos, R2 es alquilo o alquilo sustituido, tal como alquilo C1-6 o alquilo C1-6 sustituido, o alquilo C1-4 o alquilo C1-4 sustituido, o alquilo C1-3 o alquilo C1-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R2 es alquenilo o alquenilo sustituido, tal como alquenilo C2-6 o alquenilo C2-6 sustituido, o alquenilo C2-4 o alquenilo C2-4 sustituido, o alquenilo C2-3 o alquenilo C2-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R2 es alquinilo o alquinilo sustituido. En ciertos ejemplos, R2 es alcoxi o alcoxi sustituido. En ciertos ejemplos, R2 es amino o amino sustituido. En ciertos ejemplos, R2 es carboxilo o carboxil éster. En ciertos ejemplos, R2 es acilo o aciloxi. En ciertos ejemplos, R2 es acilamino o aminoacilo. En ciertos ejemplos, R2 es alquilamida o alquil sustituido-amida. En ciertos ejemplos, R2 es sulfonilo. En ciertos ejemplos, R2 es tioalcoxi o tioalcoxi sustituido. En ciertos ejemplos, R2 es arilo o arilo sustituido, tal como arilo C5-8 o arilo C5-8 sustituido, tal como un arilo C5 o arilo C5 sustituido, o un arilo C6 o arilo C6 sustituido. En ciertos ejemplos, R2 es heteroarilo o heteroarilo sustituido, tal como heteroarilo C5-8 o heteroarilo C5-8 sustituido, tal como un heteroarilo C5 o heteroarilo C5 sustituido, o un heteroarilo C6 o heteroarilo C6 sustituido. En ciertos ejemplos, R2 es cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, tal como cicloalquilo C3-8 o cicloalquilo C3-8 sustituido, tal como un cicloalquilo C3-6 o cicloalquilo C3-6 sustituido, o un cicloalquilo C3-5 o cicloalquilo C3-5 sustituido. En ciertos ejemplos, R2 es heterociclilo o heterociclilo sustituido, tal como un heterocicliclo C3-6 o heterociclilo C3-6 sustituido, o un heterocicliclo C3-5 o heterociclilo C3-5 sustituido.
En ciertos ejemplos, R3 se selecciona de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acil amino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido. En ciertos ejemplos, R3 es hidrógeno. En ciertos ejemplos, R3 es alquilo o alquilo sustituido, tal como alquilo C1-6 o alquilo C1-6 sustituido, o alquilo C1-4 o alquilo C1-4 sustituido, o alquilo C1-3 o alquilo C1-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R3 es alquenilo o alquenilo sustituido, tal como alquenilo C2-6 o alquenilo C2-6 sustituido, o alquenilo C2-4 o alquenilo C2-4 sustituido, o alquenilo C2-3 o alquenilo C2-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R3 es alquinilo o alquinilo sustituido. En ciertos ejemplos, R3 es alcoxi o alcoxi sustituido. En ciertos ejemplos, R3 es amino o amino sustituido. En ciertos ejemplos, R3 es carboxilo o carboxil éster. En ciertos ejemplos, R3 es acilo o aciloxi. En ciertos ejemplos, R3 es acilamino o aminoacilo. En ciertos ejemplos, R3 es alquilamida o alquil sustituido-amida. En ciertos ejemplos, R3 es sulfonilo. En ciertos ejemplos, R3 es tioalcoxi o tioalcoxi sustituido. En ciertos ejemplos, R3 es arilo o arilo sustituido, tal como arilo C5-8 o arilo C5-8 sustituido, tal como un arilo C5 o arilo C5 sustituido, o un arilo C6 o arilo C6 sustituido. En ciertos ejemplos, R3 es heteroarilo o heteroarilo sustituido, tal como heteroarilo C5-8 o heteroarilo C5-8 sustituido, tal como un heteroarilo C5 o heteroarilo C5 sustituido, o un heteroarilo C6 o heteroarilo C6 sustituido. En ciertos ejemplos, R3 es cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, tal como cicloalquilo C3-8 o cicloalquilo C3-8 sustituido, tal como un cicloalquilo C3-6 o cicloalquilo C3-6 sustituido, o un cicloalquilo C3-5 o cicloalquilo C3-5 sustituido. En ciertos ejemplos, R3 es heterociclilo o heterociclilo sustituido, tal como heterociclilo C3-8 o heterociclilo C3-8 sustituido, tal como un heterocicliclo C3-6 o heterociclilo C3-6 sustituido, o un heterocicliclo C3-5 o heterociclilo C3-5 sustituido.
En ciertos ejemplos, R2 y R3 se unen opcionalmente cíclicamente para formar un heterociclilo de 5 o 6 miembros. En ciertos ejemplos, R2 y R3 se unen cíclicamente para formar un heterociclilo de 5 o 6 miembros. En ciertos ejemplos, R2 y R3 se unen cíclicamente para formar un heterociclilo de 5 miembros. En ciertos ejemplos, R2 y R3 se unen cíclicamente para formar un heterociclilo de 6 miembros.
En ciertos ejemplos, cada R4 se selecciona independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acil amino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido.
Las diversas posibilidades para cada R4 se describen con más detalle del siguiente modo. En ciertos ejemplos, R4 es hidrógeno. En ciertos ejemplos, cada R4 es hidrógeno. En ciertos ejemplos, R4 es halógeno, tal como F, Cl, Br o I. En ciertos ejemplos, R4 es F. En ciertos ejemplos, R4 es Cl. En ciertos ejemplos, R4 es Br. En ciertos ejemplos, R4 es I. En ciertos ejemplos, R4 es alquilo o alquilo sustituido, tal como alquilo C1-6 o alquilo C1-6 sustituido, o alquilo C1-4 o alquilo C1-4 sustituido, o alquilo C1-3 o alquilo C1-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R4 es alquenilo o alquenilo sustituido, tal como alquenilo C2-6 o alquenilo C2-6 sustituido, o alquenilo C2-4 o alquenilo C2-4 sustituido, o alquenilo C2-3 o alquenilo C2-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R4 es alquinilo o alquinilo sustituido. En ciertos ejemplos, R4 es alcoxi o alcoxi sustituido. En ciertos ejemplos, R4 es amino o amino sustituido. En ciertos ejemplos, R4 es carboxilo o carboxil éster. En ciertos ejemplos, R4 es acilo o aciloxi. En ciertos ejemplos, R4 es acilamino o aminoacilo. En ciertos ejemplos, R4 es alquilamida o alquil sustituido-amida. En ciertos ejemplos, R4 es sulfonilo. En ciertos ejemplos, R4 es tioalcoxi o tioalcoxi sustituido. En ciertos ejemplos, R4 es arilo o arilo sustituido, tal como arilo C5-8 o arilo C5-8 sustituido, tal como un arilo C5 o arilo C5 sustituido, o un arilo C6 o arilo C6 sustituido (por ejemplo, fenilo o fenilo sustituido). En ciertos ejemplos, R4 es heteroarilo o heteroarilo sustituido, tal como heteroarilo C5-8 o heteroarilo C5-8 sustituido, tal como un heteroarilo C5 o heteroarilo C5 sustituido, o un heteroarilo C6 o heteroarilo C6 sustituido. En ciertos ejemplos, R4 es cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, tal como cicloalquilo C3-8 o cicloalquilo C3-8 sustituido, tal como un cicloalquilo C3-6 o cicloalquilo C3-6 sustituido, o un cicloalquilo C3-5 o cicloalquilo C3-5 sustituido. En ciertos ejemplos, R4 es heterociclilo o heterociclilo sustituido, tal como heterociclilo C3-8 o heterociclilo C3-8 sustituido, tal como un heterocicliclo C3-6 o heterociclilo C3-6 sustituido, o un heterocicliclo C3-5 o heterociclilo C3-5 sustituido.
En ciertos ejemplos, W 1 es un maitansinoide. La descripción adicional del maitansinoide se encuentra en la divulgación en el presente documento.
En ciertos ejemplos, W2 es un anticuerpo anti-CD22. La descripción adicional del anticuerpo anti-CD22 se encuentra en la divulgación en el presente documento.
En ciertos ejemplos, los compuestos de la fórmula (1) incluyen un conector, L. El conector se puede utilizar para unir un resto de acoplamiento con uno o más restos de interés y/o uno o más polipéptidos. En algunos ejemplos, el conector se une con un resto de acoplamiento a o un polipéptido o una entidad química. El conector se puede unir (por ejemplo, unir covalentemente) con el resto de acoplamiento (por ejemplo, como se describe en el presente documento) en cualquier posición conveniente. Por ejemplo, el conector puede unir un resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo con un fármaco (por ejemplo, una maitansina). El resto de acoplamiento de hidrazinilindolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo se puede usar para conjugar el conector (y así el fármaco, por ejemplo, maitansina) con un polipéptido, tal como un anticuerpo anti-CD22.
En ciertos ejemplos, L fija el resto de acoplamiento con W 1, y así el resto de acoplamiento se une indirectamente con W1 mediante el conector L. Como se ha descrito anteriormente, W 1 es un maitansinoide, y así L fija el resto de acoplamiento con un maitansinoide, por ejemplo, el resto de acoplamiento se une indirectamente con el maitansinoide mediante el conector, L.
Se puede utilizar cualquier conector conveniente en los conjugados y compuestos objeto. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo seleccionado de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilamino, alquilamida, alquil sustituidoamida, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo alquilo o alquilo sustituido. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo alquenilo o alquenilo sustituido. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo alquinilo o alquinilo sustituido. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo alcoxi o alcoxi sustituido. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo amino o amino sustituido. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo carboxilo o carboxil éster. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo aminoacilo. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo alquilamida o alquil sustituido-amida. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo arilo o arilo sustituido. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo heteroarilo o heteroarilo sustituido. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. En ciertos ejemplos, L incluye un grupo heterociclilo o heterociclilo sustituido.
En ciertos ejemplos, L incluye un polímero. Por ejemplo, el polímero puede incluir un polialquilenglicol y derivados de los mismos, que incluyen polietilenglicol, metoxipolietilenglicol, homopolímeros de polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol con propilenglicol (por ejemplo, donde los homopolímeros y los copolímeros están sin sustituir o sustituidos en un extremo con un grupo alquilo), poli(alcohol vinílico), polivinil etil éteres, polivinilpirrolidona, combinaciones de los mismos, y similares. En ciertos ejemplos, el polímero es un polialquilenglicol. En ciertos ejemplos, el polímero es un polietilenglicol. También son posibles otros conectores, como se muestra en los conjugados y compuestos descritos más abajo en más detalle.
En algunos ejemplos, L es un conector descrito por la fórmula -(L1)a-(L2)b-(L3)c-(L4)d-, en donde L1, L2, L3 y L4 son cada uno independientemente una unidad de conector, y a, b, c y d son cada uno independientemente 0 o 1, en donde la suma de a, b, c y d es 1 a 4.
En ciertos ejemplos, la suma de a, b, c y d es 1. En ciertos ejemplos, la suma de a, b, c y d es 2. En ciertos ejemplos, la suma de a, b, c y d es 3. En ciertos ejemplos, la suma de a, b, c y d es 4. En ciertos ejemplos, a, b, c y d son cada uno 1. En ciertos ejemplos, a, b y c son cada uno 1 y d es 0. En ciertos ejemplos, a y b son cada uno 1 y c y d son cada uno 0. En ciertos ejemplos, a es 1 y b, c y d son cada uno 0.
En ciertos ejemplos, L1 se une al resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo (por ejemplo, como se muestra en la fórmula (1) anteriormente). En ciertos ejemplos, L2, si está presente, se une a W1. En ciertos ejemplos, L3, si está presente, se une a W 1. En ciertos ejemplos, L4, si está presente, se une a W 1.
Se puede utilizar cualquier unidad de conector conveniente en los conectores objeto. Las unidades de conectores de interés incluyen, pero no se limitan a, unidades de polímeros, tales como polietilenglicoles, polietilenos y poliacrilatos, resto(s) de aminoácido, polímeros basados en hidrato de carbono o restos de hidrato de carbono y derivados de los mismos, polinucleótidos, grupos alquilo, grupos arilo, grupos heterocíclicos, combinaciones de los mismos, y versiones sustituidas de los mismos. En algunos ejemplos, cada uno de L1, L2, L3 y L4 (si están presentes) comprende uno o más grupos independientemente seleccionados de un polietilenglicol, un polietilenglicol modificado, un resto de aminoácido, un grupo alquilo, un alquilo sustituido, un grupo arilo, un grupo arilo sustituido y una diamina (por ejemplo, un grupo de enlace que incluye una alquilendiamina).
En algunos ejemplos, L1 (si está presente) comprende un polietilenglicol, un polietilenglicol modificado, un resto de aminoácido, un grupo alquilo, un alquilo sustituido, un grupo arilo, un grupo arilo sustituido o una diamina. En algunos ejemplos, L1 comprende un polietilenglicol. En algunos ejemplos, L1 comprende un polietilenglicol modificado. En algunos ejemplos, L1 comprende un resto de aminoácido. En algunos ejemplos, L1 comprende un grupo alquilo o un alquilo sustituido. En algunos ejemplos, L1 comprende un grupo arilo o un grupo arilo sustituido. En algunos ejemplos, L1 comprende una diamina (por ejemplo, un grupo de enlace que comprende una alquilendiamina).
En algunos ejemplos, L2 (si está presente) comprende un polietilenglicol, un polietilenglicol modificado, un resto de aminoácido, un grupo alquilo, un alquilo sustituido, un grupo arilo, un grupo arilo sustituido o una diamina. En algunos ejemplos, L2 comprende un polietilenglicol. En algunos ejemplos, L2 comprende un polietilenglicol modificado. En algunos ejemplos, L2 comprende un resto de aminoácido. En algunos ejemplos, L2 comprende un grupo alquilo o un alquilo sustituido. En algunos ejemplos, L2 comprende un grupo arilo o un grupo arilo sustituido. En algunos ejemplos, L2 comprende una diamina (por ejemplo, un grupo de enlace que comprende una alquilendiamina).
En algunos ejemplos, L3 (si está presente) comprende un polietilenglicol, un polietilenglicol modificado, un resto de aminoácido, un grupo alquilo, un alquilo sustituido, un grupo arilo, un grupo arilo sustituido o una diamina. En algunos ejemplos, L3 comprende un polietilenglicol. En algunos ejemplos, L3 comprende un polietilenglicol modificado. En algunos ejemplos, L3 comprende un resto de aminoácido. En algunos ejemplos, L3 comprende un grupo alquilo o un alquilo sustituido. En algunos ejemplos, L3 comprende un grupo arilo o un grupo arilo sustituido. En algunos ejemplos, L3 comprende una diamina (por ejemplo, un grupo de enlace que comprende una alquilendiamina).
En algunos ejemplos, L4 (si está presente) comprende un polietilenglicol, un polietilenglicol modificado, un resto de aminoácido, un grupo alquilo, un alquilo sustituido, un grupo arilo, un grupo arilo sustituido o una diamina. En algunos ejemplos, L4 comprende un polietilenglicol. En algunos ejemplos, L4 comprende un polietilenglicol modificado. En algunos ejemplos, L4 comprende un resto de aminoácido. En algunos ejemplos, L4 comprende un grupo alquilo o un alquilo sustituido. En algunos ejemplos, L4 comprende un grupo arilo o un grupo arilo sustituido. En algunos ejemplos, L4 comprende una diamina (por ejemplo, un grupo de enlace que comprende una alquilendiamina).
En algunos ejemplos, L es un conector que comprende -(L1)a-(L2)b-(L3)c-(L4)d-, donde:
- (L1)a- es -(T1-V1)a-;
- (L2)b- es -(T2-V2)b-;
- (L3)c- es -(T3-V3)c-; y
- (L4)d- es -(T4-V4)d-,
en donde T1, T2, T3 y T4 , si están presentes, son grupos de enlace;
V1, V2, V3 y V4, si están presentes, son enlaces covalentes o grupos funcionales de enlace; y
a, b, c y d son cada uno independientemente 0 o 1, en donde la suma de a, b, c y d es 1 a 4.
Como se ha descrito anteriormente, en ciertos ejemplos, L1 se une al resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo (por ejemplo, como se muestra en la fórmula (1) anterior). Como tales, en ciertos ejemplos, T1 se une al resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo (por ejemplo, como se muestra en la fórmula (1) anterior). En ciertos ejemplos, V1 se une a W 1 (el maitansinoide). En ciertos ejemplos, L2, si está presente, se une a W 1. Como tales, en ciertos ejemplos, T2, si está presente, se une a W 1, o V2, si está presente, se une a W 1. En ciertos ejemplos, L3, si está presente, se une a W 1. Como tales, en ciertos ejemplos, T3, si está presente, se une a W 1, o V3, si está presente, se une a W 1. En ciertos ejemplos, L4, si está presente, se une a W 1. Como tales, en ciertos ejemplos, T4, si está presente, se une a W 1, o V4, si está presente, se une a W 1.
Con respecto a los grupos de enlace, T1, T2, T3 y T4, se puede utilizar cualquier grupo de enlace conveniente en los conectores objeto. En algunos ejemplos, T1, T2, T3 y T4 comprenden cada uno uno o más grupos independientemente seleccionados de un alquilo (C1-C12), un alquilo (C1-C12) sustituido, una (EDA)w, (PEG)n, (AA)p, -(CR13OH)h-, piperidin-4-amino (4AP), un grupo acetal, un disulfuro, una hidracina y un éster, donde w es un número entero desde 1 hasta 20, n es un número entero desde 1 hasta 30, p es un número entero desde 1 hasta 20 y h es un número entero desde 1 hasta 12.
En ciertos ejemplos, cuando la suma de a, b, c y d es 2 y uno de T1-V1, T2-V2, T3-V3, o T4-V4 es (PEG)n-CO, entonces n no es 6. Por ejemplo, en algunos casos, el conector puede tener la siguiente estructura:
Figure imgf000024_0001
donde n no es 6.
En ciertos ejemplos, cuando la suma de a, b, c y d es 2 y uno de T1-V1, T2-V2, T3-V3, o T4-V4 es alquil (Ci-Ci2)-NR15, entonces alquilo (C1-C12) no es un alquilo C5. Por ejemplo, en algunos casos, el conector puede tener la siguiente estructura:
Figure imgf000025_0001
donde g no es 4.
En ciertos ejemplos, el grupo de enlace (por ejemplo, T1, T2, T3 y/o T4) incluye un alquilo (C1-C12) o un alquilo (C1-C12) sustituido. En ciertos ejemplos, alquilo (C1-C12) es un grupo alquilo de cadena lineal o ramificado que incluye desde 1 hasta 12 átomos de carbono, tal como 1 a 10 átomos de carbono, o 1 a 8 átomos de carbono, o 1 a 6 átomos de carbono, o 1 a 5 átomos de carbono, o 1 a 4 átomos de carbono, o 1 a 3 átomos de carbono. En algunos casos, alquilo (C1-C12) puede ser un alquilo o alquilo sustituido, tal como alquilo C1-C12, o alquilo C1-C10, o alquilo C1-C6 , o alquilo C1-C3. En algunos casos, alquilo (C1-C12) es un alquilo C2. Por ejemplo, alquilo (C1-C12) puede ser un alquileno o alquileno sustituido, tal como alquileno C1-C12, o alquileno C1-C10, o alquileno C1-C6 , o alquileno C1-C3. En algunos casos, alquilo (C1-C12) es un alquileno C2.
En ciertos ejemplos, alquilo (C1-C12) sustituido es un grupo aril sustituido-alquilo de cadena lineal o ramificado que incluye desde 1 hasta 12 átomos de carbono, tal como 1 a 10 átomos de carbono, o 1 a 8 átomos de carbono, o 1 a 6 átomos de carbono, o 1 a 5 átomos de carbono, o 1 a 4 átomos de carbono, o 1 a 3 átomos de carbono. En algunos casos, alquilo (C1-C12) sustituido puede ser un alquilo sustituido, tal como alquilo C1-C12 sustituido, o alquilo C1-C10 sustituido, o alquilo C1-C6 sustituido, o alquilo C1-C3 sustituido. En algunos casos, alquilo (C1-C12) sustituido es un alquilo C2 sustituido. Por ejemplo, alquilo (C1-C12) sustituido puede ser un alquileno sustituido, tal como alquileno C1-C12 sustituido, o alquileno C1-C10 sustituido, o alquileno C1-C6 sustituido, o alquileno C1-C3 sustituido. En algunos casos, alquilo (C1-C12) sustituido es un alquileno C2 sustituido.
En ciertos ejemplos, el grupo de enlace (por ejemplo, T1, T2, T3 y/o T4) incluye un resto etilendiamina (EDA), por ejemplo, un EDA que contiene enlace. En ciertos ejemplos, (EDA)w incluye uno o más restos EDA, tales como donde w es un número entero desde 1 hasta 50, tal como desde 1 hasta 40, desde 1 hasta 30, desde 1 hasta 20, desde 1 hasta 12 o desde 1 hasta 6, tal como 1, 2, 3, 4, 5 o 6). Los restos etilendiamina (EDA) unidos se puede sustituir opcionalmente en una o más posiciones convenientes con cualquier sustituyente conveniente, por ejemplo, con un alquilo, un alquilo sustituido, un acilo, un acilo sustituido, un arilo o un arilo sustituido. En ciertos ejemplos, el resto EDA se describe por la estructura:
Figure imgf000025_0002
donde y es un número entero desde 1 hasta 6, r es 0 o 1, y cada R12 se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acilamino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido. En ciertos ejemplos, y es 1,2, 3, 4, 5 o 6. En ciertos ejemplos, y es 1 y r es 0. En ciertos ejemplos, y es 1 y r es 1. En ciertos ejemplos, y es 2 y r es 0. En ciertos ejemplos, y es 2 y r es 1. En ciertos ejemplos, cada R12 se selecciona independientemente de hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo y un arilo sustituido. En ciertos ejemplos, cualesquiera dos grupos R12 adyacentes de EDA pueden estar unidos cíclicamente, por ejemplo, para formar un anillo de piperazinilo. En ciertos ejemplos, y es 1 y los dos grupos R12 adyacentes son un grupo alquilo, unidos cíclicamente para formar un anillo de piperazinilo. En ciertos ejemplos, y es 1 y los grupos R12 adyacentes se seleccionan de hidrógeno, un alquilo (por ejemplo, metilo) y un alquilo sustituido (por ejemplo, alquil inferior-OH, tal como etil-OH o propil-OH).
En ciertos ejemplos, el grupo de enlace incluye un resto 4-amino-piperidina (4AP) (también denominado en el presente documento piperidin-4-amino, P4A). El resto 4AP se puede sustituir opcionalmente en una o más posiciones convenientes con cualquier sustituyente conveniente, por ejemplo, con un alquilo, un alquilo sustituido, un resto de polietilenglicol, un acilo, un acilo sustituido, un arilo o un arilo sustituido. En ciertos ejemplos, el resto 4AP se describe por la estructura:
Figure imgf000025_0003
donde R12 se selecciona de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, un resto de polietilenglicol (por ejemplo, un polietilenglicol o un polietilenglicol modificado), alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acilamino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido. En ciertos ejemplos, R12 es un resto de polietilenglicol. En ciertos ejemplos, R12 es un polietilenglicol modificado con carboxi.
En ciertos ejemplos, R12 incluye un resto de polietilenglicol descrito por la fórmula: (PEG)k, que se puede representar por la estructura:
Figure imgf000026_0001
donde k es un número entero desde 1 hasta 20, tal como desde 1 hasta 18, o desde 1 hasta 16, o desde 1 hasta 14, o desde 1 hasta 12, o desde 1 hasta 10, o desde 1 hasta 8, o desde 1 hasta 6, o desde 1 hasta 4, o 1 o 2, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. En algunos casos, k es 2. En ciertos ejemplos, R17 se selecciona de OH, COOH, o COOR, donde R se selecciona de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido. En ciertos ejemplos, R17 es COOH.
En ciertos ejemplos, un grupo de enlace (por ejemplo, T1, T2, T3 y/o T4) incluye (PEG)n, donde (PEG)n es un polietilenglicol o una unidad de enlace modificada por polietilenglicol. En ciertos ejemplos, (PEG)n se describe por la estructura:
Figure imgf000026_0002
donde n es un número entero desde 1 hasta 50, tal como desde 1 hasta 40, desde 1 hasta 30, desde 1 hasta 20, desde 1 hasta 12 o desde 1 hasta 6, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. En algunos casos, n es 2. En algunos casos, n es 3. En algunos casos, n es 6. En algunos casos, n es 12.
En ciertos ejemplos, un grupo de enlace (por ejemplo, T1, T2, T3 y/o T4) incluye (AA)p, donde AA es un resto de aminoácido. Se puede utilizar cualquier aminoácido conveniente. Los aminoácidos de interés incluyen, pero no se limitan a, L- y D-aminoácidos, aminoácidos que existen de forma natural, tales como cualquiera de los 20 alfaaminoácidos primarios y beta-alanina, no aminoácidos que existen de forma natural (por ejemplo, análogos de aminoácidos), tales como un alfa-aminoácido que no existe de forma natural o un beta-aminoácido que no existe de forma natural, etc. En ciertos ejemplos, p es un número entero desde 1 hasta 50, tal como desde 1 hasta 40, desde 1 hasta 30, desde 1 hasta 20, desde 1 hasta 12 o desde 1 hasta 6, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. En ciertos ejemplos, p es 1. En ciertos ejemplos, p es 2.
En ciertos ejemplos, un grupo de enlace (por ejemplo, T1, T2, T3 y/o T4) incluye un resto descrito por la fórmula -(CR13OH)h-, donde h es 0 o n es un número entero desde 1 hasta 50, tal como desde 1 hasta 40, desde 1 hasta 30, desde 1 hasta 20, desde 1 hasta 12 o desde 1 hasta 6, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12. En ciertos ejemplos, h es 1. En ciertos ejemplos, h es 2. En ciertos ejemplos, R13 se selecciona de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acilamino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido. En ciertos ejemplos, R13 es hidrógeno. En ciertos ejemplos, R13 es alquilo o alquilo sustituido, tal como alquilo C1-6 o alquilo C1-6 sustituido, o alquilo C1-4 o alquilo C1-4 sustituido, o alquilo C1-3 o alquilo C1-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R13 es alquenilo o alquenilo sustituido, tal como alquenilo C2-6 o alquenilo C2-6 sustituido, o alquenilo C2-4 o alquenilo C2-4 sustituido, o alquenilo C2-3 o alquenilo C2-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R13 es alquinilo o alquinilo sustituido. En ciertos ejemplos, R13 es alcoxi o alcoxi sustituido. En ciertos ejemplos, R13 es amino o amino sustituido. En ciertos ejemplos, R13 es carboxilo o carboxil éster. En ciertos ejemplos, R13 es acilo o aciloxi. En ciertos ejemplos, R13 es acilamino o aminoacilo. En ciertos ejemplos, R13 es alquilamida o alquil sustituido-amida. En ciertos ejemplos, R13 es sulfonilo. En ciertos ejemplos, R13 es tioalcoxi o tioalcoxi sustituido. En ciertos ejemplos, R13 es arilo o arilo sustituido, tal como arilo C5-8 o arilo C5-8 sustituido, tal como un arilo C5 o arilo C5 sustituido, o un arilo C6 o arilo C6 sustituido. En ciertos ejemplos, R13 es heteroarilo o heteroarilo sustituido, tal como heteroarilo C5-8 o heteroarilo C5-8 sustituido, tal como un heteroarilo C5 o heteroarilo C5 sustituido, o un heteroarilo C6 o heteroarilo C6 sustituido. En ciertos ejemplos, R13 es cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, tal como cicloalquilo C3-8 o cicloalquilo C3-8 sustituido, tal como un cicloalquilo C3-6 o cicloalquilo C3-6 sustituido, o un cicloalquilo C3-5 o cicloalquilo C3-5 sustituido. En ciertos ejemplos, R13 es heterociclilo o heterociclilo sustituido, tal como heterociclilo C3-8 o heterociclilo C3-8 sustituido, tal como un heterocicliclo C3-6 o heterociclilo C3-6 sustituido, o un heterocicliclo C3-5 o heterociclilo C3-5 sustituido.
En ciertos ejemplos, R13 se selecciona de hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo y un arilo sustituido. En estos ejemplos, alquilo, alquilo sustituido, arilo y arilo sustituido son como se han descrito anteriormente para R13.
Con respecto a los grupos funcionales de enlace, V1, V2, V3 y V4, se puede utilizar cualquier grupo funcional de enlace covalente en los conectores objeto. Los grupos funcionales de enlace de interés incluyen, pero no se limitan a, amino, carbonilo, amido, oxicarbonilo, carboxi, sulfonilo, sulfóxido, sulfonilamino, aminosulfonilo, tio, oxi, fosfo, fosforamidato, tiofosforamidato y similares. En algunos ejemplos, V1, V2, V3 y V4 se seleccionan cada uno independientemente de un enlace covalente, -CO-, -NR15-, -NR15(CH2)q-, -NR15(C6H4)-, -CONR15-, -NR15CO-, -C(O)O-, -OC(O)-, -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2NR15-, -NR15SO2- y -P(O)OH-, donde q es un número entero desde 1 hasta 6. En ciertos ejemplos, q es un número entero desde 1 hasta 6 (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 o 6). En ciertos ejemplos, q es 1. En ciertos ejemplos, q es 2.
En algunos ejemplos, cada R15 se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acilamino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido.
Las diversas posibilidades para cada R15 se describen con más detalle del siguiente modo. En ciertos ejemplos, R15 es hidrógeno. En ciertos ejemplos, cada R15 es hidrógeno. En ciertos ejemplos, R15 es alquilo o alquilo sustituido, tal como alquilo C1-6 o alquilo C1-6 sustituido, o alquilo C1-4 o alquilo C1-4 sustituido, o alquilo C1-3 o alquilo C1-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R15 es alquenilo o alquenilo sustituido, tal como alquenilo C2-6 o alquenilo C2-6 sustituido, o alquenilo C2-4 o alquenilo C2-4 sustituido, o alquenilo C2-3 o alquenilo C2-3 sustituido. En ciertos ejemplos, R15 es alquinilo o alquinilo sustituido. En ciertos ejemplos, R15 es alcoxi o alcoxi sustituido. En ciertos ejemplos, R15 es amino o amino sustituido. En ciertos ejemplos, R15 es carboxilo o carboxil éster. En ciertos ejemplos, R15 es acilo o aciloxi. En ciertos ejemplos, R15 es acilamino o aminoacilo. En ciertos ejemplos, R15 es alquilamida o alquil sustituido-amida. En ciertos ejemplos, R15 es sulfonilo. En ciertos ejemplos, R15 es tioalcoxi o tioalcoxi sustituido. En ciertos ejemplos, R15 es arilo o arilo sustituido, tal como arilo C5-8 o arilo C5-8 sustituido, tal como un arilo C5 o arilo C5 sustituido, o un arilo C6 o arilo C6 sustituido. En ciertos ejemplos, R15 es heteroarilo o heteroarilo sustituido, tal como heteroarilo C5-8 o heteroarilo C5-8 sustituido, tal como un heteroarilo C5 o heteroarilo C5 sustituido, o un heteroarilo C6 o heteroarilo C6 sustituido. En ciertos ejemplos, R15 es cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, tal como cicloalquilo C3-8 o cicloalquilo C3-8 sustituido, tal como un cicloalquilo C3-6 o cicloalquilo C3-6 sustituido, o un cicloalquilo C3-5 o cicloalquilo C3-5 sustituido. En ciertos ejemplos, R15 es heterociclilo o heterociclilo sustituido, tal como heterociclilo C3-8 o heterociclilo C3-8 sustituido, tal como un heterocicliclo C3-6 o heterociclilo C3-6 sustituido, o un heterocicliclo C3-5 o heterociclilo C3-5 sustituido.
En ciertos ejemplos, cada R15 se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido. En estos ejemplos, el hidrógeno, los sustituyentes alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido son como se han descrito anteriormente para R15.
En ciertos ejemplos, el grupo de enlace incluye un grupo acetal, un disulfuro, una hidracina o un éster. En algunos ejemplos, el grupo de enlace incluye un grupo acetal. En algunos ejemplos, el grupo de enlace incluye un disulfuro. En algunos ejemplos, el grupo de enlace incluye una hidracina. En algunos ejemplos, el grupo de enlace incluye un éster.
Como se ha descrito anteriormente, en algunos ejemplos, L es un conector que comprende -(T1-V1)a-(T2-V2)b-(T3-V3)c-(T4-V4)d-, donde a, b, c y d son cada uno independientemente 0 o 1, donde la suma de a, b, c y d es 1 a 4.
En algunos ejemplos, en el conector objeto:
T1 se selecciona de un alquilo (C1-C12) y un alquilo (C1-C12) sustituido;
T2, T3 y T4 se seleccionan cada uno independientemente de alquilo (C1-C12), alquilo (C1-C12) sustituido, (EDA)w, (PEG)n, (AA)p, -(CR13OH)h-, 4-amino-piperidina (4AP), un grupo acetal, un disulfuro, una hidracina y un éster; y V1, V2, V3 y V4 se seleccionan cada uno independientemente de un enlace covalente, -CO-, -NR15-, -NR15(CH2)q-, -NR15(C6H4)-, -CONR15-, -NR15CO-, -C(O)O-, -OC(O)-, -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2NR15-, -NR15SO2- y -P(O)OH-, en donde q es un número entero desde 1 hasta 6;
en donde:
(PEG)n es
Figure imgf000027_0001
donde n es un número entero desde 1 hasta 30;
EDA es un resto de etilendiamina que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000028_0001
donde y es un número entero desde 1 hasta 6 y r es 0 o 1;
4-amino-piperidina (4AP) es
Figure imgf000028_0002
AA es un resto de aminoácido, donde p es un número entero desde 1 hasta 20; y
cada R15 y R12 se selecciona independientemente de hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo y un arilo sustituido, en donde cualesquiera dos grupos R12 adyacentes se pueden unir cíclicamente para formar un anillo de piperazinilo; y
R13 se selecciona de hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo y un arilo sustituido.
En ciertos ejemplos, T1, T2, T3 y T4 y V1, V2, V3 y V4 se seleccionan de la siguiente tabla, por ejemplo, una fila de la siguiente tabla:
Figure imgf000028_0003
Figure imgf000029_0001
En ciertos ejemplos, L es un conector que comprende -(L1)a-(L2)b-(L3)c-(L4)d-, donde - (L1)a- es -(T1-V1)a-; -(L2)b- es -(T2-V2)b-; -(L3)c- es -(T3-V3)c-; y -(L4)d- es -(T4-V4)d-.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (AA)p, V2 es -NR15-, T3 es (PEG)n, V3 es -CO-, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (EDA)w, V2 es -CO-, T3 es (CR13OH)h, V3 es -CONR15-, T4 es alquilo (C1-C12) y V4 es -CO-.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (AA)p, V2 es -NR15-, T3 es alquilo (C1-C12), V3 es -CO-, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CONR15-, T2 es (PEG)n, V2 es -CO-, T3 está ausente, V3 está ausente, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (AA)p, V2 está ausente, T3 está ausente, V3 está ausente, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CONR15-, T2 es (PEG)n, V2 es -NR15-, T3 está ausente, V3 está ausente, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (AA)p, V2 es -NR15-, T3 es (PEG)n, V3 es -NR15-, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (EDA)w, V2 es -CO-, T3 está ausente, V3 está ausente, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CONR15-, T2 es alquilo (C1-C12), V2 es -NR15-, T3 está ausente, V3 está ausente, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CONR15-, T2 es (PEG)n, V2 es -CO-, T3 es (EDA)w, V3 está ausente, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (EDA)w, V2 está ausente, T3 está ausente, V3 está ausente, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CONR15-, T2 es (PEG)n, V2 es -CO-, T3 es (AA)p, V3 está ausente, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (EDA)w, V2 es -CO-, T3 es (CR13OH)h, V3 es -CO-, T4 es (AA)p y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (AA)p, V2 es -NR15-, T3 es alquilo (C1-C12), V3 es -CO-, T4 es (AA)p y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (AA)p, V2 es -NR15-, T3 es (PEG)n, V3 es -CO-, T4 es (AA)p y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (AA)p, V2 es -NR11-, T3 es (PEG)n, V3 es -SO2-, T4 es (AA)p y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (EDA)w, V2 es -CO-, T3 es (CR13OH)h, V3 es -CONR15-, T4 es (PEG)n y V4 es -CO-.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (CR13OH)h, V2 es -CO-, T3 está ausente, V3 está ausente, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CONR15-, T2 es alquilo (C1-C12) sustituido, V2 es -NR15-, T3 es (PEG)n, V3 es -CO-, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -SO2-, T2 es alquilo (C1-C12), V2 es - CO-, T3 está ausente, V3 está ausente, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CONR15-, T2 es alquilo (C1-C12), V2 está ausente, T3 es (CR13OH)h, V3 es -CONR15-, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (AA)p, V2 es -NR15-, T3 es (PEG)n, V3 es -CO-, T4 es (AA)p y V4 es -NR15-.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (AA)p, V2 es -NR15-, T3 es (PEG)n, V3 es -P(O)OH-, T4 es (AA)p y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (EDA)w, V2 está ausente, T3 es (AA)p, V3 está ausente, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (EDA)w, V2 es -CO-, T3 es (CR13OH)h, V3 es -CONR15-, T4 es alquilo (C1-C12) y V4 es -CO(AA)p-.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CONR15-, T2 es alquilo (C1-C12), V2 es -NR15-, T3 está ausente, V3 es -CO-, T4 está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CONR15-, T2 es alquilo (C1-C12), V2 es -NR15-, T3 está ausente, V3 es -CO-, T4 es alquilo (C1-C12) y V4 es -NR15-.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es (EDA)w, V2 es -CO-, T3 es (CR13OH)h, V3 es -CONR15-, T4 es (PEG)n y V4 es -CO(AA)p-.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12),
Figure imgf000030_0002
T2 es 4AP, V2 es -CO-, T3
Figure imgf000030_0001
es alquilo (C1-C12), es (AA)p y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, T1 es alquilo (C1-C12),
Figure imgf000030_0004
T2 es 4AP, V2 es -CO-, T3
Figure imgf000030_0003
es alquilo (C1-C12), está ausente y V4 está ausente.
En ciertos ejemplos, el conector se describe por una de las siguientes estructuras:
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
En ciertos ejemplos de las estructuras de conector representadas anteriormente, cada f es independientemente 0 o un número entero desde 1 hasta 12; cada y es independientemente 0 o un número entero desde 1 hasta 20; cada n es independientemente 0 o un número entero desde 1 hasta 30; cada p es independientemente 0 o un número entero desde 1 hasta 20; cada h es independientemente 0 o un número entero desde 1 hasta 12; cada R es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acilamino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido; y cada R' es independientemente H, una cadena lateral de un aminoácido, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, carboxilo, carboxil éster, acilo, aciloxi, acilamino, aminoacilo, alquilamida, alquil sustituido-amida, sulfonilo, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo y heterociclilo sustituido. En ciertos ejemplos de las estructuras de conector representadas anteriormente, cada f es independientemente 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6; cada y es independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; cada n es independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; cada p es independientemente 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6; y cada h es independientemente 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6. En ciertos ejemplos de las estructuras de conector representadas anteriormente, cada R es independientemente H, metilo o -(CH2)m-OH donde m es 1,2, 3 o 4 (por ejemplo, 2).
En ciertos ejemplos del conector, L, T1 es alquilo (C1-C12), V1 es -CO-, T2 es 4AP, V2 es -CO-, T3 es alquilo (C1-C12), V3 es -CO-, T4 está ausente y V4 está ausente. En ciertos ejemplos, T1 es etileno, V1 es -CO-, T2 es 4AP, V2 es -CO-, T3 es etileno, V3 es -CO-, T4 está ausente y V4 está ausente. En ciertos ejemplos, T1 es etileno, V1 es -CO-, T2 es 4AP, V2 es -CO-, T3 es etileno, V3 es -CO-, T4 está ausente y V4 está ausente, donde T2 (por ejemplo, 4AP) tiene la siguiente estructura:
en donde
R12 es un resto de polietilenglicol (por ejemplo, un polietilenglicol o un polietilenglicol modificado).
En ciertos ejemplos, el conector, L, incluye la siguiente estructura:
Figure imgf000033_0001
en donde
cada f es independientemente un número entero desde 1 hasta 12; y
n es un número entero desde 1 hasta 30.
En ciertos ejemplos, f es 1. En ciertos ejemplos, f es 2. En ciertos ejemplos, un f es 2 y un f es 1.
En ciertos ejemplos, n es 1.
En ciertos ejemplos, el lado izquierdo de la estructura de conector anterior se une al resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo, y el lado derecho de la estructura de conector anterior se une a una maitansina.
Cualquiera de las entidades químicas, conectores y restos de acoplamiento expuestos en las estructuras anteriores se puede adaptar para su uso en los compuestos y conjugados objetos.
La divulgación adicional relacionada con los compuestos de hidrazinil-indolilo y de hidrazinil-pirrolo-piridinilo y métodos para producir un conjugado se encuentra en la publicación de solicitud de EE. UU. N.° 2014/0141025, presentada el 11 de marzo de 2013, y la publicación de solicitud de EE. UU. N.° 2015/0157736, presentada el 26 de noviembre de 2014.
Anticuerpos anti-CD22
Como se observa anteriormente, los conjugados de la presente invención comprenden, como sustituyente W2 un anticuerpo anti-CD22. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD22 se ha modificado para incluir un resto de 2-formilglicina (FGly). Como se usa en el presente documento, se puede hacer referencia a los aminoácidos por su nombre convencional, su abreviatura convencional de tres letras y/o su abreviatura convencional de una letra, tal como: Alanina o Ala o A; Cisteína o Cys o C; Ácido aspártico o Asp o D; Ácido glutámico o Glu o E; Fenilalanina o Phe o F; Glicina o Gly o G; Histidina o His o H; Isoleucina o Ile o I; Lisina o Lys o K; Leucina o Leu o L; Metionina o Met o M; Asparagina o Asn o N; Prolina o Pro o P; Glutamina o Gln o Q; Arginina o Arg o R; Serina o Ser o S; Treonina o Thr o T; Valina o Val o V; Triptófano o Trp o W; y Tirosina o Tyr o Y.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado se une específicamente a un polipéptido CD22, donde el epítope comprende restos de aminoácidos dentro de un antígeno CD22 (por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1-670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8A-8C).
El epítope CD22 se puede formar por un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con un tramo contiguo de desde aproximadamente 500 aminoácidos hasta aproximadamente 670 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la isoforma 4 de CD22 humana representada en la FIG. 8A-8C. El epítope CD22 se puede formar por un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con un tramo contiguo de desde aproximadamente 500 aminoácidos hasta aproximadamente 751 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la isoforma 3 de CD22 humana representada en la FIG. 8A-8C. El epítope CD22 se puede formar por un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con un tramo contiguo de desde aproximadamente 500 aminoácidos hasta aproximadamente 759 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la isoforma 2 de CD22 humana representada en la FIG. 8A-8C. El epítope CD22 se puede formar por un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con un tramo contiguo de desde aproximadamente 500 aminoácidos hasta aproximadamente 846 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la isoforma 1 de CD22 humana representada en la FIG. 8A-8C.
Un "antígeno CD22" o "polipéptido CD22" puede comprender una secuencia de aminoácidos que tienen al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con un tramo contiguo de desde aproximadamente 500 aminoácidos (aa) hasta aproximadamente 846 aa (isoforma 1), hasta aproximadamente 759 aa (isoforma 2), hasta aproximadamente 751 aa (isoforma 3), o hasta aproximadamente 670 aa (isoforma 4) de una de secuencia de aminoácidos de la isoforma 1,2, 3 o 4 de c D22 representada en la FIG. 8A-8C.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado presenta unión de alta afinidad por CD22. Por ejemplo, en algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado se une a CD22 con una afinidad de al menos aproximadamente 10-7 M, al menos aproximadamente 10-8 M, al menos aproximadamente 10-9 M, al menos aproximadamente 10-10 M, al menos aproximadamente 10-11 M, o al menos aproximadamente 10-12 M, o superior a 10-12 M. En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado se une a un epítope presente sobre CD22 con una afinidad de desde aproximadamente 10-7 M hasta aproximadamente 10-8 M, desde aproximadamente 10-8 M hasta aproximadamente 10­ 9 M, desde aproximadamente 10-9 M hasta aproximadamente 10-10 M, desde aproximadamente 10-10 M hasta aproximadamente 10-11 M, o desde aproximadamente 10-11 M hasta aproximadamente 10-12 M, o superior a 10-12 M.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado compite por la unión a un epítope dentro de CD22 con un segundo anticuerpo anti-CD22 y/o se une al mismo epítope dentro de CD22, como un segundo anticuerpo anti-CD22. En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 que compite por la unión a un epítope dentro de CD22 con un segundo anticuerpo anti-CD22 también se une al epítope como el segundo anticuerpo anti-CD22. En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 que compite por la unión a un epítope dentro de CD22 con un segundo anticuerpo anti-CD22 se une a un epítope que se solapa con el epítope unido por el segundo anticuerpo anti-CD22. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado puede inducir la apoptosis en una célula que expresa CD22 sobre su superficie celular.
Un anticuerpo anti-CD22 adecuado para su uso en un sujeto conjugado inhibirá en algunos casos la proliferación de células tumorales humanas que expresan en exceso CD22, donde la inhibición ocurre in vitro, in vivo, o tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, en algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado para su uso en un conjugado objeto inhibe la proliferación de células tumorales humanas que expresan en exceso CD22 en al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, o más del 80 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado compite por la unión a un epítope CD22 (por ejemplo, un epítope que comprende restos de aminoácidos dentro de un antígeno CD22 (por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1-670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8A-8C) con un anticuerpo que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR) de cadena pesada seleccionada de IYDMS (CDR1 de VH; SEQ ID NO://), YISSGGGTTYYPDTVKG (CDR2 de VH; SEQ ID NO://) y HSGYGSSYGVLFAY (CDR3 de VH; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado compite por la unión a un epítope CD22 (por ejemplo, un epítope que comprende restos de aminoácidos dentro de un antígeno CD22 (por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1-670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8A-8C) con un anticuerpo que comprende una CDR de la cadena ligera seleccionada de RASQDISNYLN (CDR1 de VL; SEQ ID NO://), YTSILHS (CDR2 de VL; SEQ ID NO://) y QQGNTLPWT (CDR3 de VL; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado compite por la unión a un epítope CD22 (por ejemplo, un epítope que comprende restos de aminoácidos dentro de un antígeno CD22 (por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1-670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8A-8C) con un anticuerpo que comprende las CDR de VH IYDMS (CDR1 de VH; SEQ ID NO://), YISSGGGTTYYPDTVKG (CDR2 de VH; SEQ ID NO://) y HSGYGSSYGVLFAY (CDR3 de VH; SEQ ID n O://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado compite por la unión a un epítope CD22 (por ejemplo, un epítope que comprende restos de aminoácidos dentro de un antígeno CD22 (por ejemplo, un epítope dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1-670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8A-8C) con un anticuerpo que comprende las CDR de VL RASQDISNYLN (CDR1 de VL; SEQ ID NO://), YTSILHS (CDR2 de VL; SEQ ID NO://) y QQGNTLPWT (CDR3 de VL; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado compite por la unión a un epítope CD22 (por ejemplo, un epítope que comprende restos de aminoácidos dentro de un antígeno CD22 (por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1-670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8A-8C) con un anticuerpo que comprende las CDR de VH IYDMS (CDR1 de VH; SEQ ID NO://), YISSGGGTTYYPDTVKG (CDR2 de VH; SEQ ID NO://) y HSGYGSSYGVLFAY (CDR3 de VH; SEQ ID NO://) y las CDR de VL RASQDISNYLN (CDR1 de VL; SEQ ID NO://), YTSILHS (CDR2 de VL; SEQ ID NO://) y QQGNTLPWT (CDR3 de VL; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende las CDR de VH IYDMS (CDR1 de VH; SEQ ID NO://), YISSGGGTTYYPDTVKG (CDR2 de VH; SEQ ID NO://) y HSGYGSSYGVLFAY (CDR3 de VH; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende las CDR de VL RASQDISNYLN (CDR1 de VL; SEQ ID NO://), YTSILHS (CDR2 de VL; SEQ ID NO://) y QQGNTLPWT (CDR3 de VL; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende las CDR de VH IYDMS (CDR1 de VH; SEQ ID NO://), YISSGGGTTYYPDTVKG (CDR2 de VH; SEQ ID NO://) y HSGYGSSYGVLFAY (CDR3 de VH; SEQ ID NO://) y las CDR de VL RASQDISNYLN (CDR1 de VL; SEQ ID NO://), YTSILHS (CDR2 de VL; SEQ ID NO://) y QQGNTLPWT (CDR3 de VL; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende las CDR de VH presentes en una región VH anti-CD22 que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTT YYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende las CDR de VL presentes en una región VL anti-CD22 que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSILHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende las CDR de VH presentes en EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTT YYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO://) y las CDR de VL presentes en DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSILHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende: a) una cadena pesada que comprende una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos EVQLVESGGGLVKPGGSLX1LSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTT YYPDTVKGRFTISRDNAKNX2LYLQMX3SLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO:1), donde X1 es K (Lys) o R (Arg); X2 es S (Ser) o T (Thr); y X3 es N (Asn) o S (Ser); y b) una cadena ligera de la inmunoglobulina.
Una cadena ligera puede tener cualquier secuencia de aminoácidos de VL adecuada, mientras que el anticuerpo resultante se une específicamente a CD22.
Las secuencias de aminoácidos de Vl a modo de ejemplo incluyen:
DIQMTQS PS S LS AS V GDR VTITCRAS QDIS N YLNW Y QQKPGKA VKLLIY Y
TSILHS G VPS RFS GS GS GTD YTLTIS S LQQEDF AT YFCQQGNTLPWTF GGGTKVEIKR
(SEQ ID NO:7; VK1);
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLL1YY
TSILIISGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKR
(SEQ ID NO:8; VK2);y
DIQMTQS PSSVSASV GDR VTITCRAS QDIS N YLNW Y QQKPGKAPKLLIY Y
TSILHS GVPSRFS GS GS GTD YTLTIS SLQPEDFAT YFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKR
(SEQ ID NO:9; VK4).
Así, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD22 adecuado puede comprender: a) una cadena pesada que comprende una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:1); y una cadena ligera que comprende la región VL de VK1. En otros casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado puede comprender: a) una cadena pesada que comprende una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID n O:1); y una cadena ligera que comprende la región VL de VK2. En aún más casos, un anticuerpo anti-CD22 objeto puede comprender: a) una cadena pesada que comprende una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:1); y una cadena ligera que comprende la región VL de VK4.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende: a) una cadena ligera de la inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos DIQMTQSPSSX1SASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAX2KLLIYYTSILHSGVP SRFSGSGSGTDYTLTISSLQX3EDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:2), donde X1 es L (Leu) o V (Val); X2 es V (Val) o P (Pro); y X3 es Q (Gln) o P (Pro); y b) una cadena pesada de la inmunoglobulina. La cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVA
YIS S GGGTT Y YPDT VKGRFTIS RDN AKNTL YLQMS S LR AEDT AM Y Y C ARHS G Y GS S YG
VLFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:3; VH3);
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVA
YIS S GGGTT Y YPDT VKGRFTIS RDN AKN S L YLQMS S LR AEDT AM Y Y C ARHS G Y GS S Y G V
LFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:4; VH4);
E VQL VES GGGLVKPGGS LKLS C AAS GF AFSIYDMS W VRQAPGKGLEW V A
YIS S GGGTT Y YPDT VKGRFTIS RDN AKN S LYLQMNSLR AEDT AM YY C ARHS G YGS S YG
VLFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:5; VH5); y EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVA
YIS S GGGTT Y YPDT VKGRFTIS RDN AKN S L YLQMS S LR AEDT AM Y Y C ARHS G Y GS S Y G V
LFAYW GQGTLVTV S S (SEQ ID NO:6; VH6).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende una región VH que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
E V QL VES GGGLVKPGGS LRLS C A AS GF AF SIYDMSW VRQAPGKGLEW V A YIS S GGGTT
Y YPDT VKGRFTIS RDN AKN S LYLQMS S LR AEDT AM Y YC ARHS G Y GS S Y G VLFAYW GQ
GTLVTVSS (SEQ ID NO://).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende una región VH que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTT YYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO://) y la región VL que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSILHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO://).
Secuencias de la región constante modificadas
Como se observa anteriormente, la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa que contiene un resto de serina o de cisteína que es capaz de convertirse (oxidarse) en un resto de 2-formilglicina (FGly) por la acción de una enzima generadora de formilglicina (FGE) ya sea in vivo (por ejemplo, en el momento de la traducción de una proteína que contiene una marca ald en una célula) o in vitro (por ejemplo, poniendo en contacto una proteína que contiene una marca ald con una FGE en un sistema sin células). Dichos motivos de sulfatasa también se pueden denominar en el presente documento un sitio de modificación de FGE.
Motivos de sulfatasa
Un motivo de sulfatasa mínimo de una marca de aldehído tiene normalmente 5 o 6 restos de aminoácidos de longitud, normalmente no más de 6 restos de aminoácidos de longitud. Los motivos de sulfatasa proporcionados en un polipéptido Ig tienen al menos 5 o 6 restos de aminoácidos, y pueden tener, por ejemplo, desde 5 hasta 16, 6-16, 5­ 15, 6-15, 5-14, 6-14, 5-13, 6-13, 5-12, 6-12, 5-11, 6-11, 5-10, 6-10, 5-9, 6-9, 5-8 o 6-8 restos de aminoácidos de longitud, para definir un motivo de sulfatasa de menos de 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 o 7 restos de aminoácidos de longitud.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos de interés incluyen aquellos donde uno o más restos de aminoácidos, tales como 2 o más, o 3 o más, o 4 o más, o 5 o más, o 6 o más, o 7 o más, o 8 o más, o 9 o más, o 10 o más, o 11 o más, o 12 o más, o 13 o más, o 14 o más, o 15 o más, o 16 o más, o 17 o más, o 18 o más, o 19 o más, o 20 o más restos de aminoácidos, se han insertado, delecionado, sustituido (reemplazado) con respecto a la secuencia de aminoácidos nativa para proporcionar una secuencia de un motivo de sulfatasa en el polipéptido. En ciertas realizaciones, el polipéptido incluye una modificación (inserción, adición, deleción y/o sustitución/reemplazo) de menos de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos nativa del polipéptido. Donde una secuencia de aminoácidos nativa al polipéptido (por ejemplo, anticuerpo anti-CD22) contiene uno o más restos del motivo de sulfatasa deseado, el número total de modificaciones de restos se puede reducir, por ejemplo, por modificación específica del sitio (inserción, adición, deleción, sustitución/reemplazo) de los restos de aminoácidos que flanquean los restos de aminoácidos nativos para proporcionar una secuencia del motivo de sulfatasa deseado. En ciertas realizaciones, el grado de modificación de la secuencia de aminoácidos nativa del polipéptido anti-CD22 diana se minimiza, para minimizar el número de restos de aminoácidos que se insertan, delecionan, sustituyen (reemplazan) o añaden (por ejemplo, al extremo N o C). El minimizar el grado de la modificación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido anti-CD22 diana puede minimizar el impacto que dichas modificaciones pueden tener sobre la función y/o estructura anti-CD22.
Se debe observar que mientras que las marcas de aldehído de interés particular son las que comprenden al menos un motivo de sulfatasa mínimo (también denominado un "motivo de sulfatasa consenso"), se apreciará fácilmente que marcas de aldehído más largas son tanto contempladas como están englobadas por la presente divulgación y pueden encontrar uso en las composiciones y métodos de la presente divulgación. Las marcas de aldehído pueden así comprender un motivo de sulfatasa mínimo de 5 o 6 restos, o pueden ser más largas y comprender un motivo de sulfatasa mínimo que se puede flanquear en los lados amino- y/o carboxiterminal del motivo mediante restos de aminoácidos adicionales. Se contemplan las marcas de aldehído de, por ejemplo, 5 o 6 restos de aminoácidos, así como secuencias de aminoácidos más largas de más de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más restos de aminoácidos.
Una marca de aldehído puede estar presente en o cerca del extremo C de una cadena pesada de Ig; por ejemplo, una marca de aldehído puede estar presente dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos del extremo C de una cadena pesada de Ig nativa no mutante. Una marca de aldehído puede estar presente dentro de un dominio CH1 de una cadena pesada de Ig. Una marca de aldehído puede estar presente dentro de un dominio CH2 de una cadena pesada de Ig. Una marca de aldehído puede estar presente dentro de un dominio CH3 de una cadena pesada de Ig. Una marca de aldehído puede estar presente en una región constante de la cadena ligera de Ig, por ejemplo, en una región constante kappa de la cadena ligera o una región constante lambda de la cadena ligera.
En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa usado se puede describir por la fórmula:
X1Z10X2Z20X3Z30 (I')
donde
Z10 es cisteína o serina (que también se puede representar por (C/S));
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina (que también se puede representar por (P/A));
Z30 es un aminoácido básico (por ejemplo, arginina (R), y puede ser lisina (K) o histidina (H), por ejemplo, lisina), o un aminoácido alifático (alanina (A), glicina (G), leucina (L), valina (V), isoleucina (I) o prolina (P), por ejemplo, A, G, L, V o I;
X1 está presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, L, M, V, S o T, por ejemplo, L, M, S o V, con la condición de que cuando el motivo de sulfatasa esté en el extremo N del polipéptido diana, X1 esté presente; y
X2 y X3 pueden ser independientemente cualquier aminoácido, aunque normalmente un aminoácido alifático, un aminoácido polar sin carga o un aminoácido que contiene azufre (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, S, T, A, V, G o C, por ejemplo, S, T, A, V o G.
La secuencia de aminoácidos de una cadena pesada y/o ligera anti-CD22 se puede modificar para proporcionar una secuencia de al menos 5 aminoácidos de la fórmula X1Z10X2Z20X3Z30, donde
Z10 es cisteína o serina;
Z20 es un resto de prolina o de alanina;
Z30 es un aminoácido alifático o un aminoácido básico;
X1 está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido, con la condición de que cuando el motivo de sulfatasa heterólogo esté en un extremo N del polipéptido, X1 está presente;
X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido,
donde la secuencia está dentro de o es adyacente a una región de bucle accesible para el disolvente de la región constante de Ig, y en donde la secuencia no está en el extremo C de la cadena pesada de Ig.
El motivo de sulfatasa se selecciona, en general, de manera que sea capaz de la conversión por una FGE seleccionada, por ejemplo, una FGE presente en una célula hospedadora en la que el polipéptido marcado con aldehído se expresa o una FGE que se va a poner en contacto con el polipéptido marcado con aldehído en un método in vitro sin células.
Por ejemplo, donde la FGE sea una FGE eucariota (por ejemplo, una FGE de mamífero, que incluye una FGE humana), el motivo de sulfatasa puede ser de la fórmula:
X1CX2PX3Z30 (I")
donde
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, L, M, S o V, con la condición de que cuando el motivo de sulfatasa esté en el extremo N del polipéptido diana, X1 esté presente;
X2 y X3 pueden ser independientemente cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, S, T, A, V, G, o C, por ejemplo, S, T, A, V o G; y
Z30 es un aminoácido básico (por ejemplo, arginina (R), y puede ser lisina (K) o histidina (H), por ejemplo, lisina), o un aminoácido alifático (alanina (A), glicina (G), leucina (L), valina (V), isoleucina (I) o prolina (P), por ejemplo, A, G, L, V o I.
Ejemplos específicos de motivos de sulfatasa incluyen LCTPSR (SEQ ID NO://), MCTPSR (SEQ ID NO://) VCTPSR (SEQ ID NO://), LCSPSR (SEQ ID NO://), LCAPSR (SEQ ID NO://), LCVPSR (SEQ ID NO://), LCGPSR (SEQ ID NO://), ICTPAR (SEQ ID NO://), LCTPSK (SEQ ID NO://), MCTPSK (SEQ ID NO://), VCTPSK (SEQ ID NO://), LCSPSK (SEQ ID NO://), LCAPSK (SEQ ID NO://), LCVPSK (SEQ ID NO://), LCGPSK (SEQ ID NO://), LCTPSA (SEQ ID NO://), ICTPAA (SEQ ID NO://), MCTPSA (SEQ ID NO://), VCTPSA (SEQ ID NO://), LCSPSA (SEQ ID NO://), LCAPSA (SEQ ID NO://), LCVPSA (SEQ ID NO://) y LCGPSA (SEQ ID NO://). Secuencias que contienen FGly
Tras la acción de FGE sobre la cadena pesada y/o ligera anti-CD22 modificada, la serina o la cisteína en el motivo de sulfatasa se modifica en FGly. Por lo tanto, el motivo de sulfatasa que contiene FGly puede ser de la fórmula:
X1(FGly)X2Z20X3Z30 (I"')
donde
FGly es el resto de formilglicina;
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina (que también se puede representar por (P/A));
Z30 es un aminoácido básico (por ejemplo, arginina (R), y puede ser lisina (K) o histidina (H), normalmente lisina), o un aminoácido alifático (alanina (A), glicina (G), leucina (L), valina (V), isoleucina (I) o prolina (P), por ejemplo, A, G, L, V o I;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, L, M, V, S o T, por ejemplo, L, M o V, con la condición de que cuando el motivo de sulfatasa esté en el extremo N del polipéptido diana, X1 esté presente; y
X2 y X3 pueden ser independientemente cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, S, T, A, V, G o C, por ejemplo, S, T, A, V o G.
Como se ha descrito anteriormente, el polipéptido modificado que contiene el resto FGly se puede conjugar con un fármaco (por ejemplo, un maitansinoide) haciendo reaccionar la FGly con el fármaco (por ejemplo, un fármaco que contiene un resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo, como se ha descrito anteriormente) para producir un motivo de sulfatasa que contiene FGly'. Como se usa en el presente documento, el término FGly' se refiere al resto de aminoácido modificado del motivo de sulfatasa que se acopla al fármaco, tal como un maitansinoide (por ejemplo, el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I)). Por lo tanto, el motivo de sulfatasa que contiene FGly' puede ser de la fórmula:
X1(FGly')X2Z20X3Z30 (II)
donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina (que también se puede representar por (P/A));
Z30 es un aminoácido básico (por ejemplo, arginina (R), y puede ser lisina (K) o histidina (H), normalmente lisina), o un aminoácido alifático (alanina (A), glicina (G), leucina (L), valina (V), isoleucina (I) o prolina (P), por ejemplo, A, G, L, V o I;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, L, M, V, S o T, por ejemplo, L, M o V, con la condición de que cuando el motivo de sulfatasa esté en el extremo N del polipéptido diana, X1 esté presente; y
X2 y X3 pueden ser independientemente cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, S, T, A, V, G o C, por ejemplo, S, T, A, V o G.
En ciertas realizaciones, el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I) está situado en un extremo C de una región constante de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD22. En algunos casos, la región constante de la cadena pesada comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1(FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina (que también se puede representar por (P/A));
Z30 es un aminoácido básico (por ejemplo, arginina (R), y puede ser lisina (K) o histidina (H), normalmente lisina), o un aminoácido alifático (alanina (A), glicina (G), leucina (L), valina (V), isoleucina (I) o prolina (P), por ejemplo, A, G, L, V o I;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, L, M, V, S o T, por ejemplo, L, M o V, con la condición de que cuando el motivo de sulfatasa esté en el extremo N del polipéptido diana, X1 esté presente;
X2 y X3 pueden ser independientemente cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, S, T, A, V, G o C, por ejemplo, S, T, A, V o G; y
en donde la secuencia es carboxiterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos QKSLSLSPGK, y donde la secuencia puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, o desde 5 hasta 10, aminoácidos no presentes en una región constante de cadena de Ig pesada no mutante nativa.
En ciertas realizaciones, la región constante de la cadena pesada comprende la secuencia SLSLSPGSL(FGly')TPSRGS en el extremo C de la cadena pesada de Ig, por ejemplo, en lugar de una secuencia nativa SLSLSPGK (SEQ ID NO://).
En ciertas realizaciones, el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I) está situado en una región constante de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD22. En ciertas realizaciones, la región constante de la cadena ligera comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1(FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina (que también se puede representar por (P/A));
Z30 es un aminoácido básico (por ejemplo, arginina (R), y puede ser lisina (K) o histidina (H), normalmente lisina), o un aminoácido alifático (alanina (A), glicina (G), leucina (L), valina (V), isoleucina (I) o prolina (P), por ejemplo, A, G, L, V o I;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, L, M, V, S o T, por ejemplo, L, M o V, con la condición de que cuando el motivo de sulfatasa esté en el extremo N del polipéptido diana, X1 esté presente; X2 y X3 pueden ser independientemente cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, S, T, A, V, G o C, por ejemplo, S, T, A, V o G; y
en donde la secuencia es carboxiterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos KVDNAL (SEQ ID NO://) y/o es aminoterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos QSGNSQ (SEQ ID NO://).
En ciertas realizaciones, la región constante de la cadena ligera comprende la secuencia KVDNAL(FGly')TPSRQSGNSQ (SEQ ID NO://).
En ciertas realizaciones, el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I) está situado en una región CH1 de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD22. En ciertas realizaciones, la región CH1 de la cadena pesada comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1(FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina (que también se puede representar por (P/A));
Z30 es un aminoácido básico (por ejemplo, arginina (R), y puede ser lisina (K) o histidina (H), normalmente lisina), o un aminoácido alifático (alanina (A), glicina (G), leucina (L), valina (V), isoleucina (I) o prolina (P), por ejemplo, A, G, L, V o I;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, L, M, V, S o T, por ejemplo, L, M o V, con la condición de que cuando el motivo de sulfatasa esté en el extremo N del polipéptido diana, X1 esté presente; X2 y X3 pueden ser independientemente cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar sin carga (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), por ejemplo, S, T, A, V, G o C, por ejemplo, S, T, A, V o G; y
en donde la secuencia es carboxiterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos SWNSGA (SEQ ID NO://) y/o es aminoterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos GVHTFP (SEQ ID NO://).
En ciertas realizaciones, la región CH1 de la cadena pesada comprende la secuencia SWNSGAL(FGly')TPSRGVHTFP (SEQ ID NO://).
Sitio de modificación
Como se observa anteriormente, la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa que contiene un resto de serina o de cisteína que es capaz de convertirse (oxidarse) en un resto FGly por la acción de una FGE ya sea in vivo (por ejemplo, en el momento de traducción de una proteína que contiene una marca ald en una célula) o in vitro (por ejemplo, poniendo en contacto una proteína que contiene una marca ald con una FGE en un sistema sin células). Los polipéptidos anti-CD22 usados para generar un conjugado de la presente divulgación incluyen al menos una región constante de Ig, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada de Ig (por ejemplo, al menos un dominio CH1; al menos un dominio CH1 y CH2; un dominio CH1, CH2 y CH3; o un dominio CH1, CH2, CH3 y CH4), o una región constante de la cadena ligera de Ig. Dichos polipéptidos Ig se denominan en el presente documento "polipéptidos Ig diana" o "anticuerpos anti-CD22 diana" o "polipéptidos Ig anti-CD22 diana".
El sitio en un anticuerpo anti-CD22 en el que un motivo de sulfatasa se introduce puede ser cualquier sitio conveniente. Como se observa anteriormente, en algunos casos, el grado de modificación de la secuencia de aminoácidos nativa del polipéptido anti-CD22 diana se minimiza, para minimizar el número de restos de aminoácidos que se insertan, delecionan, sustituyen (reemplazan) y/o añaden (por ejemplo, al extremo N o C). El minimizar el grado de modificación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido anti-CD22 diana puede minimizar el impacto que dichas modificaciones puede tener sobre la función y/o estructura anti-CD22.
Una región constante de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD22 puede incluir regiones constantes de Ig de cualquier isotipo de cadena pesada, regiones constantes de la cadena pesada de Ig que no existen de forma natural (incluyendo regiones constantes de la cadena pesada de Ig consenso). Se puede modificar una región constante de Ig para incluir una marca de aldehído, donde la marca de aldehído está presente en o es adyacente a una región de bucle accesible por el disolvente de la región constante de Ig. Una región constante de Ig se puede modificar por inserción y/o sustitución de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoácidos, o más de 16 aminoácidos, para proporcionar una secuencia de aminoácidos de un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 marcado con aldehído comprende una región constante de la cadena pesada de Ig marcada con aldehído (por ejemplo, al menos un dominio CH1; al menos un dominio CH1 y CH2; un dominio CH1, CH2 y CH3; o un dominio CH1, CH2, CH3 y CH4). La región constante de la cadena pesada de Ig marcada con aldehído puede incluir secuencias de la región constante de la cadena pesada de una cadena pesada de isotipo IgA, IgM, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 o cualquier valiente alotípica de la misma, por ejemplo, secuencias de la región constante de la cadena pesada humana o secuencias de la región constante de la cadena pesada de ratón, una región constante de la cadena pesada híbrida, una región constante de la cadena pesada sintética, o una secuencia consenso de la región constante de la cadena pesada, etc., modificada para incluir al menos un motivo de sulfatasa que se puede modificar por una FGE para generar un polipéptido Ig modificado por FGly. Se conocen en la técnica variantes alotípicas de cadenas pesadas de Ig. Véase, por ejemplo, Jefferis y Lefranc (2009) MAbs 1:4.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 marcado con aldehído comprende una región constante de la cadena ligera de Ig marcada con aldehído. La región constante de la cadena ligera de Ig marcada con aldehído puede incluir secuencias de la región constante de una cadena ligera kappa, una cadena ligera lambda, por ejemplo, regiones constantes de la cadena ligera kappa o lambda humanas, una región constante de la cadena ligera híbrida, una región constante de la cadena ligera sintética o una secuencia consenso de la región constante de la cadena ligera, etc., modificada para incluir al menos un motivo de sulfatasa que se puede modificar por una FGE para generar un polipéptido de anticuerpo anti-CD22 modificado por FGly. Las regiones constantes a modo de ejemplo incluyen regiones gamma 1 y gamma 3 humanas. Con la excepción del motivo de sulfatasa, una región constante modificada puede tener una secuencia de aminoácidos no mutante, o puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica (por ejemplo, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica) a una secuencia de aminoácidos no mutante.
En algunas realizaciones, el motivo de sulfatasa está en una posición distinta de, o además de, el extremo C de la cadena pesada del polipéptido Ig. Como se observa anteriormente, un polipéptido anti-CD22 marcado con aldehído aislado puede comprender una región constante de la cadena pesada modificada para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde el motivo de sulfatasa está en o es adyacente a una región de bucle accesible por la superficie de la región constante de la cadena pesada del polipéptido anti-CD22.
En algunos casos, una inmunoglobulina anti-CD22 diana se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 122-127; 2) los aminoácidos 137-143; 3) los aminoácidos 155-158; 4) los aminoácidos 163-170; 5) los aminoácidos 163-183; 6) los aminoácidos 179-183; 7) los aminoácidos 190-192; 8) los aminoácidos 200-202; 9) los aminoácidos 199-202; 10) los aminoácidos 208-212; 11) los aminoácidos 220-241; 12) los aminoácidos 247-251; 13) los aminoácidos 257-261; 14) los aminoácido 269-277; 15) los aminoácidos 271-277; 16) los aminoácidos 284-285; 17) los aminoácidos 284-292; 18) los aminoácidos 289-291; 19) los aminoácidos 299-303; 20) los aminoácidos 309-313; 21) los aminoácidos 320­ 322; 22) los aminoácidos 329-335; 23) los aminoácidos 341-349; 24) los aminoácidos 342-348; 25) los aminoácidos 356-365; 26) los aminoácidos 377-381; 27) los aminoácidos 388-394; 28) los aminoácidos 398-407; 29) los aminoácidos 433-451; y 30) los aminoácidos 446-451; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se representa en la Figura 9B.
En algunos casos, una inmunoglobulina anti-CD22 diana se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 16-22; 3) los aminoácidos 34-47; 4) los aminoácidos 42-49; 5) los aminoácidos 42-62; 6) los aminoácidos 34-37; 7) los aminoácidos 69-71; 8) los aminoácidos 79-81; 9) los aminoácidos 78-81; 10) los aminoácidos 87-91; 11) los aminoácidos 100-121; 12) los aminoácidos 127-131; 13) los aminoácidos 137-141; 14) los aminoácido 149-157; 15) los aminoácidos 151-157; 16) los aminoácidos 164-165; 17) los aminoácidos 164-172; 18) los aminoácidos 169­ 171; 19) los aminoácidos 179-183; 20) los aminoácidos 189-193; 21) los aminoácidos 200-202; 22) los aminoácidos 209-215; 23) los aminoácidos 221-229; 24) los aminoácidos 22-228; 25) los aminoácidos 236-245; 26) los aminoácidos 217-261; 27) los aminoácidos 268-274; 28) los aminoácidos 278-287; 29) los aminoácidos 313-331; y 30) los aminoácidos 324-331; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se expone en SEQ ID NO:// (región constante de IgG1 humana; secuencia representada en la Figura 9B).
Las regiones de bucle accesibles por la superficie a modo de ejemplo de una cadena pesada de IgG 1 incluyen: 1) ASTKGP (SEQ ID NO://); 2) KSTSGGT (SEQ ID NO://); 3) PEPV (SEQ ID NO://); 4) NSGALTSG (SEQ ID NO://); 5) NSGALTSGVHTFPAVLQSSGL (SEQ ID NO://); 6) QSSGL (SEQ ID NO://); 7) VTV; 8) QTY; 9) TQTY (SEQ ID NO://); 10) HKPSN (SEQ ID NO://); 11) EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO://); 12) FPPKP (SEQ ID NO://); 13) ISRTP (SEQ ID NO://); 14) DVSHEDPEV (SEQ ID NO://); 15) SHEDPEV (SEQ ID NO://); 16) DG; 17) DGVEVHNAK (SEQ ID NO://); 18) HNA; 19) QYNST (SEQ ID NO://); 20) VLTVL (SEQ ID NO://); 21) GKE; 22) NKALPAP (SEQ ID NO://); 23) SKAKGQPRE (SEQ ID NO://); 24) KAKGQPR (SEQ ID NO://); 25) PPSRKELTKN (SEQ ID NO://); 26) YPSDI (SEQ ID NO://); 27) NGQPENN (SEQ ID NO://); 28) TPPVLDSDGS (SEQ ID NO://); 29) HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO://); y 30) SLSPGK (SEQ ID NO://), como se muestra en las Figuras 9A y 9B.
En algunos casos, una inmunoglobulina diana se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG2 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 13-24; 3) los aminoácidos 33-37; 4) los aminoácidos 43-54; 5) los aminoácidos 58-63; 6) los aminoácidos 69-71; 7) los aminoácidos 78-80; 8) 87-89; 9) los aminoácidos 95-96; 10) 114-118; 11) 122-126; 12) 134-136; 13) 144­ 152; 14) 159-167; 15) 175-176; 16) 184-188; 17) 195-197; 18) 204-210; 19) 216-224; 20) 231-233; 21) 237-241; 22) 252-256; 23) 263-269; 24) 273-282; 25) los aminoácidos 299-302; donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:// (IgG2 humana; también representada en la Figura 9B).
Las regiones de bucle accesibles por la superficie a modo de ejemplo de una cadena pesada de IgG2 incluyen 1) ASTKGP (SEQ ID NO://); 2) PCSRSTSESTAA (SEQ ID NO://); 3) FPEPV (SEQ ID NO://); 4) SGALTSGVHTFP (SEQ ID NO://); 5) QSSGLY (SEQ ID NO://); 6) VTV; 7) TQT; 8) HKP; 9) DK; 10) VAGPS (SEQ ID NO://); 11) FPPKP (SEQ ID NO://); 12) RTP; 13) DVSHEDPEV (SEQ ID NO://); 14) DGVEVHNAK (SEQ ID NO://); 15) FN; 16) VLTVV (SEQ ID NO://); 17) GKE; 18) NKGLPAP (SEQ ID NO://); 19) SKTKGQPRE (SEQ ID NO://); 20) PPS; 21) MTKNQ (SEQ ID NO://); 22) YPSDI (SEQ ID NO://); 23) NGQPENN (SEQ ID NO://); 24) TPPMLDSDGS (SEQ ID NO://); 25) GNVF (SEQ ID NO://); and 26) HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO://), como se muestra en la Figura 9B.
En algunos casos, una inmunoglobulina diana se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG3 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 13-22; 3) los aminoácidos 33-37; 4) los aminoácidos 43-61; 5) los aminoácido 71; 6) los aminoácidos 78­ 80; 7) 87-91; 8) los aminoácidos 97-106; 9) 111-115; 10) 147-167; 11) 173-177; 16) 185-187; 13) 195-203; 14) 210­ 218; 15) 226-227; 16) 238-239; 17) 246-248; 18) 255-261; 19) 267-275; 20) 282-291; 21) los aminoácidos 303-307; 22) los aminoácidos 313-320; 23) los aminoácidos 324-333; 24) los aminoácidos 350-352; 25) los aminoácidos 359­ 365; y 26) los aminoácidos 372-377; donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:// (IgG3 humana; también representada en la Figura 9B).
Las regiones de bucle accesibles por la superficie a modo de ejemplo de una cadena pesada de IgG3 incluyen 1) ASTKGP (SEQ ID NO://); 2) PCSRSTSGGT (SEQ ID NO://); 3) FPEPV (SEQ ID NO://); 4) SGALTSGVHTFPAVLQSSG (SEQ ID NO://); 5) V; 6) TQT; 7) HKPSN (SEQ ID NO://); 8) RVELKTPLGD (SEQ ID NO://); 9) CPRCPKP (SEQ ID NO://); 10) PKSCDTPPPCPRCPAPELLGG (SEQ ID NO://); 11) FPPKP (SEQ ID NO://); 12) RTP; 13) DVSHEDPEV (SEQ ID NO://); 14) DGVEVHNAK (SEQ ID NO://); 15) YN; 16) VL; 17) GKE; 18) NKALPAP (SEQ ID NO://); 19) SKTKGQPRE (SEQ ID NO://); 20) PPSREEMTKN (SEQ ID NO://); 21) YPSDI (SEQ ID NO://); 22) SSGQPENN (SEQ ID NO://); 23) TPPMLDSDGS (SEQ ID NO://); 24) GNI; 25) HEALHNR (SEQ ID NO://); y 26) SLSPGK (SEQ ID NO://), como se muestra en la Figura 9B.
En algunos casos, una inmunoglobulina diana se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG4 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-5; 2) los aminoácidos 12-23; 3) los aminoácidos 32-36; 4) los aminoácidos 42-53; 5) los aminoácidos 57-62; 6) los aminoácidos 68-70; 7) los aminoácidos 77-79; 8) los aminoácidos 86-88; 9) los aminoácidos 94-95; 10) los aminoácidos 101-102; 11) los aminoácidos 108-118; 12) los aminoácidos 122-126; 13) los aminoácidos 134-136; 14) los aminoácidos 144­ 152; 15) los aminoácidos 159-167; 16) los aminoácidos 175-176; 17) los aminoácidos 185-186; 18) los aminoácidos 196-198; 19) los aminoácidos 205-211; 20) los aminoácidos 217-226; 21) los aminoácidos 232-241; 22) los aminoácidos 253-257; 23) los aminoácidos 264-265; 24) 269-270; 25) los aminoácidos 274-283; 26) los aminoácidos 300- 303; 27) los aminoácidos 399-417; donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:// (IgG4 humana; también representada en la Figura 9B).
Las regiones de bucle accesibles por la superficie a modo de ejemplo de una cadena pesada de IgG4 incluyen 1) STKGP (SEQ ID NO://); 2) PCSRSTSESTAA (SEQ ID NO://); 3) FPEPV (SEQ ID NO://); 4) SGALTSGVHTFP (SEQ ID NO://); 5) QSSGLY (SEQ ID NO://); 6) VTV; 7) TKT; 8) HKP; 9) DK; 10) YG; 11) CPAPEFLGGPS (SEQ ID NO://); 12) FPPKP (SEQ ID NO://); 13) RTP; 14) DVSQEDPEV (SEQ ID NO://); 15) DGVEVHNAK (SEQ ID NO://); 16) FN; 17) VL; 18) GKE; 19) NKGLPSS (SEQ ID NO://); 20) SKAKGQPREP (SEQ ID NO://); 21) PPSQEEMTKN (SEQ ID NO://); 22) YPSDI (SEQ ID NO://); 23) NG; 24) NN; 25) TPPVLDSDGS (SEQ ID NO://); 26) GNVF (SEQ ID NO://); y 27) HEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO://), como se muestra en la Figura 9B.
En algunos casos, una inmunoglobulina diana se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgA correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-13; 2) los aminoácidos 17-21; 3) los aminoácidos 28-32; 4) los aminoácidos 44-54; 5) los aminoácidos 60-66; 6) los aminoácidos 73-76; 7) los aminoácidos 80-82; 8) los aminoácidos 90-91; 9) los aminoácidos 123-125; 10) los aminoácidos 130-133; 11) los aminoácidos 138-142; 12) los aminoácidos 151-158; 13) los aminoácidos 165-174; 14) los aminoácidos 181­ 184; 15) los aminoácidos 192-195; 16) los aminoácido 199; 17) los aminoácidos 209-210; 18) los aminoácidos 222­ 245; 19) los aminoácidos 252-256; 2 0 ) los aminoácidos 266-276; 21) los aminoácidos 293-294; 22) los aminoácidos 301- 304; 23) los aminoácidos 317-320; 24) los aminoácidos 329-353; donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:// (IgA humana; también representada en la Figura 9B).
Las regiones de bucle accesibles por la superficie a modo de ejemplo de una cadena pesada de IgA incluyen 1) ASPTSPKVFPLSL (SEQ ID NO://); 2) QPDGN (SEQ ID NO://); 3) VQGFFPQEPL (SEQ ID NO://); 4) SGQGVTARNFP (SEQ ID NO://); 5) SGDLYTT (SEQ ID NO://); 6) PATQ (SEQ ID NO://); 7) GKS; 8) YT; 9) CHP; 10) HRPA (SEQ ID NO://); 11) LLGSE (SEQ ID NO://); 12) GLRDASGV (SEQ ID NO://); 13) SSGKSAVQGP (SEQ ID NO://); 14) GCYS (SEQ ID NO://); 15) CAEP (SEQ ID NO://); 16) PE; 17) SGNTFRPEVHLLPPPSEELALNEL (SEQ ID NO://); 18) ARGFS (SEQ ID NO://); 19) QGSQELPREKY (SEQ ID NO://); 20) AV; 21) AAED (SEQ ID NO://); 22) HEAL (SEQ ID NO://); y 23) IDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY (SEQ ID NO://), como se muestra en la Figura 9B.
Se puede proporcionar un motivo de sulfatasa dentro de o adyacente a una o más de estas secuencias de aminoácidos de dichos sitios de modificación de una cadena pesada de Ig. Por ejemplo, se puede modificar un polipéptido de la cadena pesada de Ig (por ejemplo, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos) en una o más de estas secuencias de aminoácidos para proporcionar un motivo de sulfatasa adyacente y aminoterminal y/o adyacente y carboxiterminal a estos sitios de modificación. Alternativamente o además, se puede modificar un polipéptido de cadena pesada de Ig (por ejemplo, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos) en una o más de estas secuencias de aminoácidos para proporcionar un motivo de sulfatasa entre cualesquiera dos restos de los sitios de modificación de la cadena pesada de Ig. En algunas realizaciones, un polipéptido de la cadena pesada de Ig se puede modificar para incluir dos motivos, que pueden ser adyacentes entre sí, o que se pueden separar por uno, dos, tres, cuatro o más (por ejemplo, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 25, desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 50, o desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100, o más, aminoácidos. Alternativamente o además, donde una secuencia de aminoácidos nativa proporciona uno o más restos de aminoácidos de una secuencia de motivo de sulfatasa, se pueden modificar restos de aminoácidos seleccionados de los sitios de modificación de una secuencia de aminoácidos de polipéptidos de la cadena pesada de Ig (por ejemplo, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos) de manera que se proporcione un motivo de sulfatasa en el sitio de modificación.
La secuencia de aminoácidos de una región de bucle accesible por la superficie se puede así modificar para proporcionar un motivo de sulfatasa, donde las modificaciones pueden incluir inserciones, deleciones y/o sustituciones. Por ejemplo, donde la modificación sea en un dominio CH1, la región de bucle accesible por la superficie puede tener la secuencia de aminoácidos NSGALTSG (SEQ ID NO://) y la secuencia marcada con aldehído puede ser, por ejemplo, NSGALCTPSRG (SEQ ID NO://), por ejemplo, donde los restos "TS" de la secuencia NSGALTSG (SEQ ID NO://) se sustituyen por "CTPSR", (SEQ ID NO://) de forma que el motivo de sulfatasa tenga la secuencia LCTPSR (SEQ ID NO://). Como otro ejemplo, donde la modificación sea en un dominio CH2, la región de bucle accesible por la superficie puede tener la secuencia de aminoácidos NKALPAP (SEQ ID NO://) y la secuencia marcada con aldehído puede ser, por ejemplo, NLCTPSRAP (SEQ ID NO://), por ejemplo, donde los restos "KAL" de la secuencia de NKALPAP (SEQ ID NO://) se sustituyen por "LCTPSR", (SEQ ID NO://), de forma que el motivo de sulfatasa tenga la secuencia LCTPSR (SEQ ID NO://). Como otro ejemplo, donde la modificación es en un dominio CH2/CH3, la región de bucle accesible por la superficie puede tener la secuencia de aminoácidos KAKGQPR (SEQ ID NO://) y la secuencia marcada con aldehído puede ser, por ejemplo, KAKGLCTPSR (SEQ ID NO://), por ejemplo, donde los restos "GQP" de la secuencia KAKGQPR (SEQ ID NO://) se sustituyen por "Lc TPs " (SeQ ID NO://), de forma que el motivo de sulfatasa tenga la secuencia LCTPSR (SEQ ID NO://).
Como se observa anteriormente, un polipéptido Ig anti-CD22 marcado con aldehído aislado puede comprender una región constante de la cadena ligera modificada para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde el motivo de sulfatasa está en o es adyacente a una región de bucle accesible por la superficie de la región constante de la cadena ligera del polipéptido Ig. Los ejemplos ilustrativos de regiones de bucle accesibles por la superficie de una región constante de la cadena ligera se presentan en las Figuras 9A y 9C.
En algunos casos, una inmunoglobulina diana se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena ligera de Ig correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 130-135; 2) los aminoácidos 141-143; 3) los aminoácido 150; 4) los aminoácidos 162-166; 5) los aminoácidos 163-166; 6) los aminoácidos 173-180; 7) los aminoácidos 186-194; 8) los aminoácidos 211-212; 9) los aminoácidos 220-225; 10) los aminoácidos 233-236; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de la cadena ligera kappa humana como se representa en la Figura 9C. En algunos casos, una inmunoglobulina diana se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena ligera de Ig correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácido 21; 4) los aminoácidos 33-37; 5) los aminoácidos 34-37; 6) los aminoácidos 44-51; 7) los aminoácidos 57-65; 8) los aminoácidos 83-83; 9) los aminoácidos 91-96; 10) los aminoácidos 104-107; donde la numeración de aminoácidos se basa en SEQ ID NO:// (cadena ligera kappa humana; secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9C).
Las regiones de bucle accesibles por la superficie a modo de ejemplo de una cadena ligera de Ig (por ejemplo, una cadena ligera kappa humana) incluyen: 1) RTVAAP (SEQ ID NO://); 2) PPS; 3) Gly (véase, por ejemplo, Gly en la posición 150 de la secuencia de la cadena ligera kappa humana representada en la Figura 9C); 4) YPREA (SEQ ID NO://); 5) PREA (SEQ ID NO://); 6) DNALQSGN (SEQ ID NO://); 7) TEQDSKDST (SEQ ID NO://); 8) HK; 9) HQGLSS (SeQ iD NO://); y 10) RGEC (SeQ ID NO://), como se muestra en las Figuras 9A y 9C.
Las regiones de bucle accesibles por la superficie a modo de ejemplo de una cadena ligera lambda de Ig incluyen QPKAAP (SEQ ID NO://), PPS, NK, DFYPGAV (SEQ ID NO://), DSSPVKAG (SEQ ID NO://), TTP, SN, HKS, EG y APTECS (SEQ ID NO://), como se muestra en la Figura 9C.
En algunos casos, una inmunoglobulina diana se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena ligera de Ig de rata correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácidos 121-22; 4) los aminoácidos 31-37; 5) los aminoácidos 44-51; 6) los aminoácidos 55-57; 7) los aminoácidos 61-62; 8) los aminoácidos 81-83; 9) los aminoácidos 91-92; 10) los aminoácidos 102-105; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de la cadena ligera de rata como se expone en SEQ ID NO:// (secuencia representada en la Figura 9C).
En algunos casos, un motivo de sulfatasa se introduce en la región CH1 de una región constante de la cadena pesada anti-CD22. En algunos casos, un motivo de sulfatasa se introduce en o cerca (por ejemplo, dentro de 1 a 10 aminoácidos de) el extremo C de una cadena pesada anti-CD22. En algunos casos, un motivo de sulfatasa se introduce en la región constante de la cadena ligera.
En algunos casos, un motivo de sulfatasa se introduce en la región CH1 de una región constante de la cadena pesada anti-CD22, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 121 -219 de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de IgG1 representada en la Figura 9A. Por ejemplo, en algunos casos, un motivo de sulfatasa se introduce en la secuencia de aminoácidos:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE (SEQ ID NO://). Por ejemplo, en algunas de estas realizaciones, la secuencia de aminoácidos GALTSg Vh (SEQ ID NO://) se modifica en GALCTPSRGVH (SEQ ID NO://), donde el motivo de sulfatasa es LCTPSR (SEQ ID NO://).
En algunos casos, un motivo de sulfatasa se introduce en o cerca del extremo C de una cadena pesada anti-CD22, por ejemplo, los motivos de sulfatasa introducidos dentro de 1 aminoácido, 2 aminoácidos (aa), 3 aa, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, o 10 aa el extremo C de una cadena pesada anti-CD22. Como un ejemplo no limitante, el resto de lisina carboxiterminal de una cadena pesada anti-CD22 se puede sustituir con la secuencia de aminoácidos SLCTPSRGS (SEQ ID NO://).
En algunos casos, un motivo de sulfatasa se introduce en la región constante de una cadena ligera de un anticuerpo anti-CD22. Como un ejemplo no limitante, en algunos casos, un motivo de sulfatasa se introduce en la región constante de una cadena ligera de un anticuerpo anti-CD22, donde el motivo de sulfatasa es carboxiterminal a KVDNAL (SEQ ID NO://), y/o es aminoterminal con respecto a QSGNSQ (SEQ ID NO://). Por ejemplo, en algunos casos, el motivo de sulfatasa es LCTPSR (SEQ ID NO://) y la cadena ligera anti-CD22 comprende la secuencia de aminoácidos KVDNALLCTPSRQSGNSQ (SEQ ID NO://).
Anticuerpos anti-CD22 a modo de ejemplo
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado compite por la unión a un epítope CD22 (por ejemplo, un epítope dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1 -670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8 A-8 C) con un anticuerpo que comprende una CDR VH de la cadena pesada seleccionada de IYDMS (CDR1 de VH; SEQ ID NO://), YISSGGGTTYYPDTVKG (CDR2 de VH; SEQ ID NO://) y HSGYGSSYGVLFAY (CDR3 de VH; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 16-22; 3) los aminoácidos 34-47; 4) los aminoácidos 42-49; 5) los aminoácidos 42-62; 6 ) los aminoácidos 34-37; 7) los aminoácidos 69-71; 8 ) los aminoácidos 79-81; 9) los aminoácidos 78-81; 10) los aminoácidos 87-91; 11) los aminoácidos 100-121; 12) los aminoácidos 127-131; 13) los aminoácidos 137-141; 14) los aminoácido 149-157; 15) los aminoácidos 151-157; 16) los aminoácidos 164-165; 17) los aminoácidos 164-172; 1 8 ) los aminoácidos 169-171; 19) los aminoácidos 179-183; 20) los aminoácidos 189-193; 21) los aminoácidos 200-202; 22) los aminoácidos 209-215; 23) los aminoácidos 221-229; 24) los aminoácidos 22-228; 25) los aminoácidos 236-245; 26) los aminoácidos 217-261; 27) los aminoácidos 268-274; 28) los aminoácidos 278-287; 29) los aminoácidos 313-331; y 30) los aminoácidos 324-331; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se expone en SEQ ID NO:// (región constante humana de IgG1 representada en la Figura 9B). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos; por ejemplo, donde el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante kappa de Ig correspondiente a uno o más de: 1 ) los aminoácidos 1 -6 ; 2 ) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácido 21; 4) los aminoácidos 33-37; 5) los aminoácidos 34-37; 6 ) los aminoácidos 44­ 51; 7) los aminoácidos 57-65; 8 ) los aminoácidos 83-83; 9) los aminoácidos 91-96; 10) los aminoácidos 104-107; donde la numeración de aminoácidos se basa en SEQ ID NO:// (cadena ligera kappa humana; secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9C).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado compite por la unión a un epítope CD22 (por ejemplo, un epítope dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1 -670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8 A-8 C) con un anticuerpo que comprende una CDR de la cadena ligera seleccionada de RASQd Is NYLN (CDR1 de VL; SEQ ID NO://), YTSIl Hs (CDR2 de VL; SEQ ID NO://) y QQGNTLPWT (CDR3 de VL; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 122-127; 2) los aminoácidos 137-143; 3) los aminoácidos 155-158; 4) los aminoácidos 163-170; 5) los aminoácidos 163-183; 6 ) los aminoácidos 179-183; 7) los aminoácidos 190-192; 8 ) los aminoácidos 200-202; 9) los aminoácidos 199-202; 10 ) los aminoácidos 208-212; 11) los aminoácidos 220-241; 12) los aminoácidos 247-251; 13) los aminoácidos 257-261; 14) los aminoácido 269-277; 15) los aminoácidos 271-277; 16) los aminoácidos 284-285; 17) los aminoácidos 284­ 292; 18) los aminoácidos 289-291; 19) los aminoácidos 299-303; 20) los aminoácidos 309-313; 21) los aminoácidos 320-322; 22) los aminoácidos 329-335; 23) los aminoácidos 341-349; 24) los aminoácidos 342-348; 25) los aminoácidos 356-365; 26) los aminoácidos 377-381; 27) los aminoácidos 388-394; 28) los aminoácidos 398-407; 29) los aminoácidos 433-451; y 30) los aminoácidos 446-451; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se representa en la Figura 9B. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos; por ejemplo, donde el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante kappa de Ig correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácido 21; 4) los aminoácidos 33-37; 5) los aminoácidos 34-37; 6 ) los aminoácidos 44-51; 7) los aminoácidos 57-65; 8 ) los aminoácidos 83-83; 9) los aminoácidos 91-96; 10) los aminoácidos 104-107; donde la numeración de aminoácidos se basa en SEQ ID NO:// (cadena ligera kappa humana; secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9C).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado compite por la unión a un epítope CD22 (por ejemplo, un epítope dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1 -670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8A-8C) con un anticuerpo que comprende las CDR de VH IYDMS (CDR1 de VH; SEQ ID NO://), YISSGGGTTYYPDTVKG (CDR2 de VH; SEQ ID NO://) y HSGYGSSYGVLFAY (CDR3 de VH; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 16-22; 3) los aminoácidos 34-47; 4) los aminoácidos 42-49; 5) los aminoácidos 42-62; 6) los aminoácidos 34-37; 7) los aminoácidos 69-71; 8) los aminoácidos 79-81; 9) los aminoácidos 78-81; 10) los aminoácidos 87-91; 11) los aminoácidos 100-121; 12) los aminoácidos 127-131; 13) los aminoácidos 137-141; 14) los aminoácido 149-157; 15) los aminoácidos 151-157; 16) los aminoácidos 164-165; 17) los aminoácidos 164-172; 18) los aminoácidos 169­ 171; 19) los aminoácidos 179-183; 20) los aminoácidos 189-193; 21) los aminoácidos 200-202; 22) los aminoácidos 209-215; 23) los aminoácidos 221-229; 24) los aminoácidos 22-228; 25) los aminoácidos 236-245; 26) los aminoácidos 217-261; 27) los aminoácidos 268-274; 28) los aminoácidos 278-287; 29) los aminoácidos 313-331; y 30) los aminoácidos 324-331; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se expone en SEQ ID NO:// (región constante humana de IgG1 representada en la Figura 9B). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos; por ejemplo, donde el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante kappa de Ig correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácido 21; 4) los aminoácidos 33-37; 5) los aminoácidos 34-37; 6) los aminoácidos 44-51; 7) los aminoácidos 57­ 65; 8) los aminoácidos 83-83; 9) los aminoácidos 91-96; 10) los aminoácidos 104-107; donde la numeración de aminoácidos se basa en SEQ ID NO:// (cadena ligera kappa humana; secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9C).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado compite por la unión a un epítope CD22 (por ejemplo, un epítope dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1 -670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8A-8C) con un anticuerpo que comprende las CDR de VL RASQDISNYLN (CDR1 de VL; SEQ ID NO://), YTSILHS (CDR2 de VL; SEQ ID NO://) y QQGNTLPWT (CDR3 de VL; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 16-22; 3) los aminoácidos 34-47; 4) los aminoácidos 42-49; 5) los aminoácidos 42-62; 6) los aminoácidos 34-37; 7) los aminoácidos 69-71; 8) los aminoácidos 79-81; 9) los aminoácidos 78-81; 10) los aminoácidos 87-91; 11) los aminoácidos 100-121; 12) los aminoácidos 127-131; 13) los aminoácidos 137-141; 14) los aminoácido 149-157; 15) los aminoácidos 151-157; 16) los aminoácidos 164-165; 17) los aminoácidos 164-172; 18) los aminoácidos 169-171; 19) los aminoácidos 179-183; 20) los aminoácidos 189-193; 21) los aminoácidos 200-202; 22) los aminoácidos 209-215; 23) los aminoácidos 221 -229; 24) los aminoácidos 22-228; 25) los aminoácidos 236-245; 26) los aminoácidos 217-261; 27) los aminoácidos 268-274; 28) los aminoácidos 278-287; 29) los aminoácidos 313-331; y 30) los aminoácidos 324-331; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se expone en SEQ ID NO:// (región constante humana de IgG1 representada en la Figura 9B). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos; por ejemplo, donde el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante kappa de Ig correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácido 21; 4) los aminoácidos 33-37; 5) los aminoácidos 34-37; 6) los aminoácidos 44-51; 7) los aminoácidos 57-65; 8) los aminoácidos 83-83; 9) los aminoácidos 91-96; 10) los aminoácidos 104-107; donde la numeración de aminoácidos se basa en SEQ ID NO:// (cadena ligera kappa humana; secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9C).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado compite por la unión a un epítope CD22 (por ejemplo, un epítope dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1 -670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8A-8C) con un anticuerpo que comprende las CDR de VH IYDMS (CDR1 de VH; SEQ ID NO://), YISSGGGTTYYPDTVKG (CDR2 de VH; SEQ ID NO://) y HSGYGSSYGVLFAY (CDR3 de VH; SEQ ID NO://) y las CDR de VL RASQDISNYLN (CDR1 de VL; SEQ ID NO://), YTSILHS (CDR2 de VL; SEQ ID NO://) y QQGNTLPWT (CDR3 de VL; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 16-22; 3) los aminoácidos 34-47; 4) los aminoácidos 42-49; 5) los aminoácidos 42-62; 6) los aminoácidos 34-37; 7) los aminoácidos 69-71; 8) los aminoácidos 79-81; 9) los aminoácidos 78-81; 10) los aminoácidos 87-91; 11) los aminoácidos 100-121; 12) los aminoácidos 127-131; 13) los aminoácidos 137-141; 14) los aminoácido 149-157; 15) los aminoácidos 151-157; 16) los aminoácidos 164-165; 17) los aminoácidos 164-172; 1 8 ) los aminoácidos 169-171; 19) los aminoácidos 179-183; 20) los aminoácidos 189-193; 21) los aminoácidos 200-202; 22) los aminoácidos 209-215; 23) los aminoácidos 221-229; 24) los aminoácidos 22-228; 25) los aminoácidos 236-245; 26) los aminoácidos 217-261; 27) los aminoácidos 268-274; 28) los aminoácidos 278-287; 29) los aminoácidos 313-331; y 30) los aminoácidos 324-331; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se expone en SEQ ID NO:// (región constante humana de IgG1 representada en la Figura 9B). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos; por ejemplo, donde el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante kappa de Ig correspondiente a uno o más de: 1 ) los aminoácidos 1 -6 ; 2 ) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácido 21; 4) los aminoácidos 33-37; 5) los aminoácidos 34-37; 6 ) los aminoácidos 44­ 51; 7) los aminoácidos 57-65; 8 ) los aminoácidos 83-83; 9) los aminoácidos 91-96; 10) los aminoácidos 104-107; donde la numeración de aminoácidos se basa en SEQ ID NO:// (cadena ligera kappa humana; secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9C).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende las CDR de VH IYDMS (CDR1 de VH; SEQ ID NO://), YISSGGGTTYYPDTVKG (CDR2 de VH; SEQ ID NO://) y HSGYGSSYGVLFAY (CDR3 de VH; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 16-22; 3) los aminoácidos 34-47; 4) los aminoácidos 42-49; 5) los aminoácidos 42-62; 6 ) los aminoácidos 34-37; 7) los aminoácidos 69-71; 8 ) los aminoácidos 79-81; 9) los aminoácidos 78-81; 10) los aminoácidos 87-91; 11) los aminoácidos 100-121; 12) los aminoácidos 127­ 131; 13) los aminoácidos 137-141; 14) los aminoácido 149-157; 15) los aminoácidos 151-157; 16) los aminoácidos 164-165; 17) los aminoácidos 164-172; 18) los aminoácidos 169-171; 19) los aminoácidos 179-183; 20) los aminoácidos 189-193; 21) los aminoácidos 200-202; 22) los aminoácidos 209-215; 23) los aminoácidos 221-229; 24) los aminoácidos 22-228; 25) los aminoácidos 236-245; 26) los aminoácidos 217-261; 27) los aminoácidos 268-274; 28) los aminoácidos 278-287; 29) los aminoácidos 313-331; y 30) los aminoácidos 324-331; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se expone en SEQ ID NO:// (región constante humana de IgG 1 representada en la Figura 9B). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos; por ejemplo, donde el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante kappa de Ig correspondiente a uno o más de: 1 ) los aminoácidos 1 ­ 6 ; 2) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácido 21; 4) los aminoácidos 33-37; 5) los aminoácidos 34-37; 6 ) los aminoácidos 44-51; 7) los aminoácidos 57-65; 8 ) los aminoácidos 83-83; 9) los aminoácidos 91 -96; 10) los aminoácidos 104-107; donde la numeración de aminoácidos se basa en SEQ ID NO:// (cadena ligera kappa humana; secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9C).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende las CDR de VL RASQDISNYLN (CDR1 de VL; SEQ ID NO://), YTSILHS (CDR2 de VL; SEQ ID NO://) y QQGNTLPWT (CDR3 de VL; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 16-22; 3) los aminoácidos 34-47; 4) los aminoácidos 42-49; 5) los aminoácidos 42-62; 6 ) los aminoácidos 34-37; 7) los aminoácidos 69-71; 8 ) los aminoácidos 79-81; 9) los aminoácidos 78-81; 10) los aminoácidos 87-91; 11) los aminoácidos 100-121; 12) los aminoácidos 127-131; 13) los aminoácidos 137-141; 14) los aminoácido 149-157; 15) los aminoácidos 151-157; 16) los aminoácidos 164-165; 17) los aminoácidos 164-172; 1 8 ) los aminoácidos 169-171; 19) los aminoácidos 179-183; 20) los aminoácidos 189-193; 21) los aminoácidos 200-202; 22) los aminoácidos 209-215; 23) los aminoácidos 221-229; 24) los aminoácidos 22-228; 25) los aminoácidos 236-245; 26) los aminoácidos 217-261; 27) los aminoácidos 268-274; 28) los aminoácidos 278-287; 29) los aminoácidos 313-331; y 30) los aminoácidos 324-331; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG 1 humana como se expone en SEQ ID NO:// (región constante humana de IgG1 representada en la Figura 9B). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos; por ejemplo, donde el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante kappa de Ig correspondiente a uno o más de: 1 ) los aminoácidos 1 -6 ; 2 ) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácido 21; 4) los aminoácidos 33-37; 5) los aminoácidos 34-37; 6 ) los aminoácidos 44­ 51; 7) los aminoácidos 57-65; 8 ) los aminoácidos 83-83; 9) los aminoácidos 91-96; 10) los aminoácidos 104-107; donde la numeración de aminoácidos se basa en SEQ ID NO:// (cadena ligera kappa humana; secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9C).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende las CDR de VH IYDMS (CDR1 de VH; SEQ ID NO://), YISSGGGTTYYPDTVKG (CDR2 de VH; SEQ ID NO://) y HSGYGSSYGVLFAY (CDR3 de VH; SEQ ID NO://) y las CDR de VL RASQDISNYLN (CDR1 de VL; SEQ ID NO://), YTSILHS (CDR2 de VL; SEQ ID NO://) y QQGNTLPWT (CDR3 de VL; SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 16-22; 3) los aminoácidos 34-47; 4) los aminoácidos 42-49; 5) los aminoácidos 42-62; 6) los aminoácidos 34-37; 7) los aminoácidos 69-71; 8) los aminoácidos 79-81; 9) los aminoácidos 78-81; 10) los aminoácidos 87-91; 11) los aminoácidos 100-121; 12) los aminoácidos 127-131; 13) los aminoácidos 137-141; 14) los aminoácido 149-157; 15) los aminoácidos 151-157; 16) los aminoácidos 164-165; 17) los aminoácidos 164-172; 18) los aminoácidos 169-171; 19) los aminoácidos 179-183; 20) los aminoácidos 189-193; 21) los aminoácidos 200-202; 22) los aminoácidos 209-215; 23) los aminoácidos 221 -229; 24) los aminoácidos 22-228; 25) los aminoácidos 236-245; 26) los aminoácidos 217-261; 27) los aminoácidos 268-274; 28) los aminoácidos 278-287; 29) los aminoácidos 313-331; y 30) los aminoácidos 324-331; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se expone en SEQ ID NO:// (región constante humana de IgG1 representada en la Figura 9B). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos; por ejemplo, donde el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante kappa de Ig correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácido 21; 4) los aminoácidos 33-37; 5) los aminoácidos 34-37; 6) los aminoácidos 44-51; 7) los aminoácidos 57-65; 8) los aminoácidos 83-83; 9) los aminoácidos 91-96; 10) los aminoácidos 104-107; donde la numeración de aminoácidos se basa en SEQ ID NO:// (cadena ligera kappa humana; secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9C).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende las CDR de VH presentes en una región VH anti-CD22 que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTT YYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 16-22; 3) los aminoácidos 34-47; 4) los aminoácidos 42­ 49; 5) los aminoácidos 42-62; 6) los aminoácidos 34-37; 7) los aminoácidos 69-71; 8) los aminoácidos 79-81; 9) los aminoácidos 78-81; 10) los aminoácidos 87-91; 11) los aminoácidos 100-121; 12) los aminoácidos 127-131; 13) los aminoácidos 137-141; 14) los aminoácido 149-157; 15) los aminoácidos 151-157; 16) los aminoácidos 164-165; 17) los aminoácidos 164-172; 18) los aminoácidos 169-171; 19) los aminoácidos 179-183; 20) los aminoácidos 189-193; 21) los aminoácidos 200-202; 22) los aminoácidos 209-215; 23) los aminoácidos 221-229; 24) los aminoácidos 22­ 228; 25) los aminoácidos 236-245; 26) los aminoácidos 217-261; 27) los aminoácidos 268-274; 28) los aminoácidos 278-287; 29) los aminoácidos 313-331; y 30) los aminoácidos 324-331; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se expone en SEQ ID NO:// (región constante humana de IgG1 representada en la Figura 9B). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos; por ejemplo, donde el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante kappa de Ig correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácido 21; 4) los aminoácidos 33-37; 5) los aminoácidos 34-37; 6) los aminoácidos 44­ 51; 7) los aminoácidos 57-65; 8) los aminoácidos 83-83; 9) los aminoácidos 91-96; 10) los aminoácidos 104-107; donde la numeración de aminoácidos se basa en SEQ ID NO:// (cadena ligera kappa humana; secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9C).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende las CDR de VL presentes en una región VL anti-CD22 que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSILHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 16-22; 3) los aminoácidos 34-47; 4) los aminoácidos 42-49; 5) los aminoácidos 42-62; 6) los aminoácidos 34-37; 7) los aminoácidos 69-71; 8) los aminoácidos 79-81; 9) los aminoácidos 78-81; 10) los aminoácidos 87-91; 11) los aminoácidos 100-121; 12) los aminoácidos 127-131; 13) los aminoácidos 137-141; 14) los aminoácido 149-157; 15) los aminoácidos 151-157; 16) los aminoácidos 164-165; 17) los aminoácidos 164-172; 18) los aminoácidos 169-171; 19) los aminoácidos 179-183; 20) los aminoácidos 189-193; 21) los aminoácidos 200­ 202; 22) los aminoácidos 209-215; 23) los aminoácidos 221-229; 24) los aminoácidos 22-228; 25) los aminoácidos 236-245; 26) los aminoácidos 217-261; 27) los aminoácidos 268-274; 28) los aminoácidos 278-287; 29) los aminoácidos 313-331; y 30) los aminoácidos 324-331; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se expone en SEQ ID NO:// (región constante humana de IgG1 representada en la Figura 9B). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos; por ejemplo, donde el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante kappa de Ig correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácido 21; 4) los aminoácidos 33-37; 5) los aminoácidos 34-37; 6) los aminoácidos 44­ 51; 7) los aminoácidos 57-65; 8) los aminoácidos 83-83; 9) los aminoácidos 91-96; 10) los aminoácidos 104-107; donde la numeración de aminoácidos se basa en SEQ ID NO:// (cadena ligera kappa humana; secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9C).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende las CDR de VH presentes en EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTT YYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO://) y las CDR de VL presentes en DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSILHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 es humanizado. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 16-22; 3) los aminoácidos 34-47; 4) los aminoácidos 42-49; 5) los aminoácidos 42-62; 6) los aminoácidos 34-37; 7) los aminoácidos 69-71; 8) los aminoácidos 79-81; 9) los aminoácidos 78-81; 10) los aminoácidos 87-91; 11) los aminoácidos 100-121; 12) los aminoácidos 127-131; 13) los aminoácidos 137-141; 14) los aminoácido 149-157; 15) los aminoácidos 151-157; 16) los aminoácidos 164-165; 17) los aminoácidos 164-172; 18) los aminoácidos 169-171; 19) los aminoácidos 179-183; 20) los aminoácidos 189-193; 21) los aminoácidos 200­ 202; 22) los aminoácidos 209-215; 23) los aminoácidos 221-229; 24) los aminoácidos 22-228; 25) los aminoácidos 236-245; 26) los aminoácidos 217-261; 27) los aminoácidos 268-274; 28) los aminoácidos 278-287; 29) los aminoácidos 313-331; y 30) los aminoácidos 324-331; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se expone en SEQ ID NO:// (región constante humana de IgG1 representada en la Figura 9B). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos; por ejemplo, donde el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante kappa de Ig correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 12-14; 3) los aminoácido 21; 4) los aminoácidos 33-37; 5) los aminoácidos 34-37; 6) los aminoácidos 44­ 51; 7) los aminoácidos 57-65; 8) los aminoácidos 83-83; 9) los aminoácidos 91-96; 10) los aminoácidos 104-107; donde la numeración de aminoácidos se basa en SEQ ID NO:// (cadena ligera kappa humana; secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9C).
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende la secuencia de aminoácidos de VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTT YYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO://). En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende la secuencia de aminoácidos de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSILHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO://). En algunos casos, un anticuerpo anti-CD22 adecuado comprende la secuencia de aminoácidos de VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTT YYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO://); y la secuencia de aminoácidos de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSILHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO://). En algunos casos, el anticuerpo anti-CD22 se modifica para incluir un motivo de sulfatasa como se ha descrito anteriormente, donde la modificación incluye una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el motivo de sulfatasa está dentro de, o es adyacente a, una región de una región constante de la cadena pesada de IgG1 correspondiente a uno o más de: 1) los aminoácidos 1-6; 2) los aminoácidos 16-22; 3) los aminoácidos 34-47; 4) los aminoácidos 42-49; 5) los aminoácidos 42-62; 6) los aminoácidos 34-37; 7) los aminoácidos 69-71; 8) los aminoácidos 79-81; 9) los aminoácidos 78-81; 10) los aminoácidos 87-91; 11) los aminoácidos 100-121; 12) los aminoácidos 127-131; 13) los aminoácidos 137-141; 14) los aminoácido 149-157; 15) los aminoácidos 151-157; 16) los aminoácidos 164-165; 17) los aminoácidos 164-172; 18) los aminoácidos 169-171; 19) los aminoácidos 179-183; 20) los aminoácidos 189-193; 21) los aminoácidos 200-202; 22) los aminoácidos 209-215; 23) los aminoácidos 221 -229; 24) los aminoácidos 22-228; 25) los aminoácidos 236-245; 26) los aminoácidos 217-261; 27) los aminoácidos 268-274; 28) los aminoácidos 278-287; 29) los aminoácidos 313-331; y 30) los aminoácidos 324-331; en donde la numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de IgG1 humana como se expone en SEQ ID NO:// (región constante humana de IgG1 representada en la Figura 9B).
Fármacos para la conjugación con un polipéptido
La presente divulgación proporciona conjugados de fármaco-polipéptido. Los ejemplos de fármacos incluyen fármacos de molécula pequeña, tales como un agente quimioterapéutico para el cáncer. Por ejemplo, donde el polipéptido es un anticuerpo (o fragmento del mismo) que tiene especificidad por una célula tumoral, el anticuerpo se puede modificar como se describe en el presente documento para incluir un aminoácido modificado, que puede ser posteriormente conjugado con un agente quimioterapéutico para el cáncer, tal como un agente que afecta los microtúbulos. En ciertos ejemplos, el fármaco es un agente que afecta los microtúbulos que tiene actividad antiproliferativa, tal como un maitansinoide. En los conjugados de la presente invención, el fármaco es un maitansinoide, que tiene la siguiente estructura:
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donde " " indica el punto de unión entre el maitansinoide y el conector, L, en la fórmula (1). Por "punto de unión" se indica que el símbolo indica el enlace entre la N del maitansinoide y el conector, L, en la fórmula (1). Por ejemplo, en la fórmula (1), W1 es un maitansinoide, tal como un maitansinoide de la estructura anterior, donde •/wu indica el punto de unión entre el maitansinoide y el conector, L.
Como se ha descrito anteriormente, en ciertos ejemplos, L es un conector descrito por la fórmula -(L1)a-(L2)b-(L3)c-(L4)d-, en donde L1, L2, L3 y L4 son cada uno independientemente una unidad de conector. En ciertos ejemplos, L1 se une al resto de acoplamiento, tal como un resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo (por ejemplo, como se muestra en la fórmula (1) anterior). En ciertos ejemplos, L2, si está presente, se une a W 1 (el maitansinoide). En ciertos ejemplos, L3, si está presente, se une a W 1 (el maitansinoide). En ciertos ejemplos, L4, si está presente, se une a W 1 (el maitansinoide).
Como se ha descrito anteriormente, en ciertos ejemplos, el conector -(L1)a-(L2)b-(L3)c-(L4)d- se describe por la fórmula -(T1-V1)a-(T2-V2)b-(T3-V3)c-(T4-V4)d-, en donde a, b, c y d son cada uno independientemente 0 o 1, donde la suma de a, b, c y d es 1 a 4. En ciertos ejemplos, como se ha descrito anteriormente, L1 se une al resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo (por ejemplo, como se muestra en la fórmula (1) anterior). Como tal, en ciertos ejemplos, T1 se une al resto de acoplamiento de hidrazinil-indolilo o de hidrazinil-pirrolo-piridinilo (por ejemplo, como se muestra en la fórmula (1) anterior). En ciertos ejemplos, V1 se une a W 1 (el maitansinoide). En ciertos ejemplos, como se ha descrito anteriormente, L2, si está presente, se une a W 1 (el maitansinoide). Como tal, en ciertos ejemplos, T2, si está presente, se une a W 1 (el maitansinoide), o V2, si está presente, se une a W 1 (el maitansinoide). En ciertos ejemplos, como se ha descrito anteriormente, L3, si está presente, se une a W 1 (el maitansinoide). Como tal, en ciertos ejemplos, T3, si está presente, se une a W 1 (el maitansinoide), o V3, si está presente, se une a W 1 (el maitansinoide). En ciertos ejemplos, como se ha descrito anteriormente, L4, si está presente, se une a W 1 (el maitansinoide). Como tal, en ciertos ejemplos, T4, si está presente, se une a W1 (el maitansinoide), o V4, si está presente, se une a W 1 (el maitansinoide).
Los ejemplos de la presente divulgación incluyen conjugados donde un polipéptido (por ejemplo, anticuerpo anti-CD22) está conjugado con uno o más restos de fármaco (por ejemplo, maitansinoide), tal como 2 restos de fármaco, 3 restos de fármaco, 4 restos de fármaco, 5 restos de fármaco, 6 restos de fármaco, 7 restos de fármaco, 8 restos de fármaco, 9 restos de fármaco o 10 o más restos de fármaco. Los restos de fármaco se pueden conjugar con el polipéptido en uno o más sitios en el polipéptido, como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, los conjugados tienen una relación entre fármaco y anticuerpo (DAR) promedio (relación molar) en el intervalo de desde 0,1 hasta 10, o desde 0,5 hasta 10, o desde 1 hasta 10, tal como desde 1 hasta 9, o desde 1 hasta 8, o desde 1 hasta 7, o desde 1 hasta 6, o desde 1 hasta 5, o desde 1 hasta 4, o desde 1 hasta 3, o desde 1 hasta 2. En ciertas realizaciones, los conjugados tienen una DAR promedio desde 1 hasta 2, tal como 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 o 2. En ciertas realizaciones, los conjugados tienen una DAR promedio de 1,6 a 1,9. En ciertas realizaciones, los conjugados tienen una DAR promedio de 1,7. Por promedio se indica la media aritmética.
Formulaciones
Los conjugados (incluyendo los conjugados de anticuerpo) de la presente divulgación se pueden formular en una variedad de formas diferentes. En general, donde el conjugado es un conjugado de polipéptido-fármaco, el conjugado se formula de un modo compatible con el fármaco conjugado con el polipéptido, la condición que se va a tratar y la vía de administración que se va a usar.
El conjugado (por ejemplo, conjugado de polipéptido-fármaco) se puede proporcionar en cualquier forma adecuada, por ejemplo, en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, y se puede formular por cualquier vía de administración adecuada, por ejemplo, administración oral, tópica o parenteral. Donde el conjugado se proporciona como un líquido inyectable (tal como en las realizaciones donde se administran por vía intravenosa o directamente en un tejido), el conjugado se puede proporcionar como una forma farmacéutica lista para uso, o como un polvo o líquido reconstituible estable durante el almacenamiento compuesto de vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los métodos de formulación de los conjugados se pueden adaptar de los fácilmente disponibles. Por ejemplo, los conjugados se pueden proporcionar en una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado y un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, solución salina). La composición farmacéutica puede incluir opcionalmente otros aditivos (por ejemplo, tampones, estabilizadores, conservantes y similares). En algunas realizaciones, las formulaciones son adecuadas para administración a un mamífero, tales como aquellas que son adecuadas para administración a un ser humano.
Métodos de tratamiento
Los conjugados de polipéptido-fármaco de la presente divulgación encuentran uso en el tratamiento de una afección o enfermedad en un sujeto que es tributario de tratamiento por administración del fármaco original (es decir, el fármaco antes de la conjugación con el polipéptido). Por "tratamiento" se indica que se logra al menos una mejora de los síntomas asociados a la afección que afectan al hospedador, donde mejora se usa en un amplio sentido para referirse a al menos una reducción en la magnitud de un parámetro, por ejemplo, un síntoma, asociado a la afección que está tratándose. Como tal, el tratamiento también incluye situaciones donde la afección patológica, o al menos los síntomas asociados a ella, son inhibidos completamente, por ejemplo, se previene que ocurran, o se detienen, por ejemplo, finalizan, de forma que el hospedador ya no padezca la afección, o al menos los síntomas que caracterizan la afección. Por lo tanto, el tratamiento incluye: (i) prevención, es decir, reducción del riesgo de desarrollo de síntomas clínicos, que incluyen causar que no se desarrollen los síntomas clínicos, por ejemplo, prevenir la progresión de la enfermedad hacia un estado perjudicial; (ii) inhibición, es decir, detención del desarrollo o desarrollo adicional de síntomas clínicos, por ejemplo, mitigar o inhibir completamente una enfermedad activa; y/o (iii) alivio, es decir, causar la regresión de los síntomas clínicos.
En el contexto del cáncer, el término "tratar" incluye cualquiera o todos de: reducir el crecimiento de un tumor sólido, inhibir la replicación de células cancerosas, reducir la carga tumoral global y mejorar uno o más síntomas asociados a un cáncer.
El sujeto que se va a tratar puede ser uno que está en necesidad de terapia, donde el hospedador que se va a tratar es uno tributario de tratamiento usando el fármaco original. Por consiguiente, una variedad de sujetos pueden ser tributarios de tratamiento usando los conjugados de polipéptido-fármaco desvelados en el presente documento. En general, dichos sujetos son "mamíferos", siendo de interés los seres humanos. Otros sujetos pueden incluir animales domésticos (por ejemplo, perros y gatos), ganado (por ejemplo, vacas, cerdos, cabras, caballos y similares), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas, por ejemplo, como en modelos animales de enfermedad), así como primates no humanos (por ejemplo, chimpancés y monos).
La cantidad de conjugado de polipéptido-fármaco administrado puede ser inicialmente determinada basándose en la orientación de una dosis y/o pauta posológica del fármaco original. En general, los conjugados de polipéptido-fármaco pueden proporcionar la administración dirigida y/o semivida en suero potenciada del fármaco unido, proporcionando así al menos uno de dosis reducida o administraciones reducidas en una pauta posológica. Por lo tanto, los conjugados de polipéptido-fármaco pueden proporcionar dosis reducida y/o administración reducida en una pauta posológica con respecto al fármaco original antes de ser conjugado en un conjugado de polipéptido-fármaco de la presente divulgación.
Además, como se observa anteriormente, debido a que los conjugados de polipéptido-fármaco pueden proporcionar estequiometría controlada de la administración del fármaco, las dosis de conjugados de polipéptido-fármaco se pueden calcular basándose en el número de moléculas de fármaco proporcionadas por conjugado de polipéptido-fármaco.
En algunas realizaciones, se administran dosis múltiples de un conjugado de polipéptido-fármaco. La frecuencia de administración de un conjugado de polipéptido-fármaco puede variar dependiendo de cualquiera de una variedad de factores, por ejemplo, intensidad de los síntomas, afección del sujeto, etc. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un conjugado de polipéptido-fármaco se administra una vez al mes, dos veces al mes, tres veces al mes, cada dos semanas, una vez por semana (qwk), dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana, cinco veces a la semana, seis veces a la semana, cada dos días, diariamente (qd/od), dos veces al día (bds/bid), o tres veces al día (tds/tid), etc.
Métodos de tratamiento del cáncer
La presente invención proporciona un conjugado o composición farmacéutica de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cáncer. Los métodos pueden incluir administrar un agente quimioterapéutico para el cáncer a un individuo que tiene un cáncer. Los métodos son útiles para tratar una amplia variedad de cánceres, que incluyen carcinomas, sarcomas, leucemias y linfomas.
Los carcinomas que se pueden tratar usando un método objeto incluyen, pero no se limitan a, carcinoma esofágico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células basales (una forma de cáncer de piel), carcinoma de células escamosas (diversos tejidos), carcinoma de vejiga, que incluye carcinoma de células transitorias (una neoplasia maligna de la vejiga), carcinoma broncogénico, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, carcinoma gástrico, carcinoma de pulmón, que incluye carcinoma de células pequeñas y carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma adrenocortical, carcinoma tiroideo, carcinoma pancreático, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma de células renales, carcinoma ductal in situ o carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, carcinoma cervical, carcinoma uterino, carcinoma testicular, carcinoma osteogénico, carcinoma epitelial y carcinoma nasofaríngeo, etc.
Los sarcomas que se pueden tratar usando un método objeto incluyen, pero no se limitan a, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, cordoma, sarcoma osteogénico, osteosarcoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, sarcoma de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, y otros sarcomas de tejido blando.
Otros tumores sólidos que se pueden tratar usando un método objeto incluyen, pero no se limitan a, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
Las leucemias que se pueden tratar usando un método objeto incluyen, pero no se limitan a, a) síndromes mieloproliferativos crónicos (trastornos neoplásicos de células madre hematopoyéticas multipotenciales); b) leucemias mielógenas agudas (transformación neoplásica de una célula madre hematopoyética multipotencial o una célula hematopoyética de potencial de linaje restringido; c) leucemias linfocíticas crónicas (CLL; proliferación clonal de linfocitos pequeños inmunológicamente inmaduros y funcionalmente incompetentes), que incluyen CLL de linfocitos B, leucemia prolinfocítica CLL de linfocitos T y leucemia de células pilosas; y d) leucemias linfoblásticas agudas (caracterizadas por la acumulación de linfoblastos). Los linfomas que se pueden tratar usando un método objeto incluyen, pero no se limitan a, linfomas de linfocitos B (por ejemplo, linfoma de Burkitt); linfoma de Hodgkin; linfoma no hodgkiniano de linfocitos B; y similares.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se exponen de manera que se proporcione a los expertos habituales en la técnica una divulgación y descripción completa de cómo hacer y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni pretenden representar que los siguientes experimentos sean todos o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular medio ponderal, la temperatura es en grados Celsius y la presión es la atmosférica o próxima a ella. Por "promedio" se indica la media aritmética. Se pueden usar abreviaturas habituales, por ejemplo, pb, par(es) de bases; kb, kilobase(s); pl, picolitro(s); s, segundo(s); min, minuto(s); h, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, kilobase(s); pb, par(es) de bases; nt, nucleótido(s); i.m., intramuscular (por vía intramuscular); i.p., intraperitoneal (por vía intraperitoneal); s.c., subcutánea (por vía subcutánea); y similares.
Procedimientos de síntesis generales
Están disponibles muchas referencias generales que proporcionan esquemas de síntesis química y condiciones comúnmente conocidas útiles para sintetizar los compuestos desvelados (véase, por ejemplo, Smith y March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, quinta edición, Wiley-Interscience, 2001; o Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, cuarta edición, New York: Longman, 1978).
Los compuestos que se describen en el presente documento se pueden purificar por cualquier protocolo de purificación conocido en la técnica, que incluyen cromatografía, tal como HPLC, cromatografía preparativa en capa fina, cromatografía en columna ultrarrápida y cromatografía de intercambio iónico. Se puede usar cualquier fase estacionaria adecuada, que incluye fases normales e invertidas, así como resinas iónicas. En ciertas realizaciones, los compuestos desvelados se purifican por cromatografía en gel de sílice y/o alúmina. Véanse, por ejemplo, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2a edición, ed. L. R. Snyder and J. J. Kirkland, John Wiley and Sons, 1979; y Thin Layer Chromatography, ed E. Stahl, Springer-Verlag, New York, 1969.
Durante cualquiera de los procesos para la preparación de los compuestos objeto, puede ser necesario y/o deseable proteger grupos sensibles o reactivos en cualquiera de las moléculas en cuestión. Esto se puede lograr por medio de grupos protectores convencionales como se describen en obras de referencia, tales como J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973, en T. W. Greene y P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", tercera edición, Wiley, New York 1999, en "The Peptides"; Volumen 3 (editores: E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981, en "Methoden der organischen Chemie", Houben-Weyl, 4a edición, Vol. 15/1, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, en H.-D. Jakubke and H. Jescheit, "Aminosauren, Peptide, Proteine", Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982, y/o en Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide and Derivate", Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974. Los grupos protectores se pueden retirar en una etapa posterior conveniente usando métodos conocidos de la técnica.
Los compuestos objeto se pueden sintetizar por una variedad de rutas de síntesis diferentes usando materiales de partida comercialmente disponibles y/o materiales de partida preparados por métodos de síntesis convencionales. En los siguientes esquemas se describe una variedad de los ejemplos de rutas de síntesis que se pueden usar para sintetizar los compuestos desvelados en el presente documento.
EJEMPLO 1
Se sintetizó un conector que contenía un grupo 4-amino-piperidina (4AP) según el Esquema 1, mostrado a continuación.
Figure imgf000053_0001
Síntesis de 4-oxopiperidin-1-carboxilato de (9H-fluoren-9-il)met¡lo (200)
A un matraz redondo de 100 ml que contenía una barra de agitación magnética se añadió clorhidrato de piperidin-4-ona monohidratado (1,53 g, 10 mmoles), cloruro de Fmoc (2,58 g, 10 mmoles), carbonato sódico (3,18 g, 30 mmoles), dioxano (20 ml) y agua (2 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se diluyó con EtOAc (100 ml) y se extrajo con agua (1 x 100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SÜ4, se filtró y se concentró a presión reducida. El material resultante se secó a vacío dando el compuesto 200 como un sólido blanco (3,05 g, 95 % de rendimiento).
1H RMN (CDCla) 57,78 (d, 2H, J = 7,6), 7,59 (d, 2H, J = 7,2), 7,43 (t, 2H, J = 7,2), 7,37 (t, 2H, J = 7,2), 4,60 (d, 2H, J = 6,0), 4,28 (t, 2H, J = 6,0), 3,72 (a, 2H), 3,63 (a, 2H), 2,39 (a, 2H), 2,28 (a, 2H).
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C20H20NO3322,4; Hallado 322,2.
Síntesis de 4-((2-(2-(3-(ferc-butoxi)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)amino)piperidin-1-carboxilato de (9H-fluoren-9-il)metilo (201)
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió piperidinona 200 (642 mg, 2,0 mmoles), H2N-PEG2-CO2t-Bu (560 mg, 2,4 mmoles), tamices moleculares de 4 Á (polvo activado, 500 mg) y 1,2-dicloroetano (5 ml). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. A la mezcla de reacción se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (845 mg, 4,0 mmoles). La mezcla se agitó durante 5 días a temperatura ambiente. La mezcla resultante se diluyó con EtOAc. La fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado (1 x 50 ml) y salmuera (1 x 50 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró a presión reducida dando el compuesto 201 como un aceite, que se llevó adelante sin más purificación.
Síntesis de ácido 13-(1-(((9HLfluoren-9-il)metoxi)carbonil)piperidin-4-il)-2,2-dimetil-4,14-dioxo-3,7,10-trioxa-13-azaheptadecan-17-oico (202)
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió N-Fmoc-piperidin-4-amino-PEG2-CO2t-Bu (201) de la etapa previa, anhídrido succínico (270 mg, 2,7 mmoles) y diclorometano (5 ml). La mezcla se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se repartió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase acuosa se extrajo con EtOAc (3x). La fase acuosa se acidificó con HCl (1 M) hasta pH ~3. La fase acuosa se extrajo (3x) con DCM. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. La mezcla de reacción se purificó por cromatografía ultrarrápida C18 (eluir 10-100 % de MeCN/agua con 0,1 % de ácido acético). Las fracciones que contenían producto se concentraron a presión reducida y luego se destilaron azeotrópicamente con tolueno (3 x 50 ml) para retirar el ácido acético residual para proporcionar 534 mg (42 %, 2 etapas) de compuesto 202 como un sólido blanco.
1H RMN (DMSO-afe) 5 11,96 (a, 1H), 7,89 (d, 2H, J = 7,2), 7,63 (d, 2H, J = 7,2), 7,42 (t, 2H, J = 7,2), 7,34 (t, 2H, J = 7,2), 4,25-4,55 (m, 3H), 3,70-4,35 (m, 3H), 3,59 (t, 2H, J = 6,0), 3,39 (m, 5H), 3,35 (m, 3H), 3,21 (a, 1H), 2,79 (a, 2H), 2,57 (m, 2H), 2,42 (c, 4H, J = 6,0), 1,49 (a, 3H), 1,37 (s, 9H).
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C35H47N2O9639,3; Hallado 639,2.
Síntesis de ácido (2S)-1-(((14S,16S,33S,2fí,4S,10£,12£,14fí)-86-cloro-14-hidroxi-85,14-dimetoxi-33,2,7,10-tetrametil-12,6-dioxo-7-aza-1(6,4)-oxazinana-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-bencenaciclotetradecafano-10,12-dien-4-il)oxi)-2,3-dimetil-1,4,7-trioxo-8-(piperidin-4-il)-11,14-dioxa-3,8-diazaheptadecan-17-oico (203)
A una disolución de éster 202 (227 mg, 0,356 mmoles), diisopropiletilamina (174 pl, 1,065 mmoles), N-deacetilmaitansina 124 (231 mg, 0,355 mmoles) en 2 ml de DMF se añadió PyAOP (185 mg, 0,355 mmoles). La disolución se agitó durante 30 min. Se añadió piperidina (0,5 ml) a la mezcla de reacción y se agitó durante 20 min adicionales. La mezcla de reacción en bruto se purificó por cromatografía de fase inversa C18 usando un gradiente de 0-100 % de acetonitrilo:agua dando 203,2 mg (55 %, 2 etapas) del compuesto 203.
Síntesis de 1-((14S,16S,33S,2fí,4S,10£,12£,14fí)-86-cloro-14-hidroxi-85,14-dimetoxi-33,2,7,10-tetrametil-12,6-dioxo-7-aza-1(6,4)-oxazinana-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-bencenaciclotetradecafano-10,12-dien-4-il)(2S)-8-(1-(3-(2-((2-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)-1,2-dimetilhidrazinil)metil)-1H-indol-1-il)propanoil)piperidin-4-il)-2,3-dimetil-4,7-dioxo-11,14-dioxa-3,8-diazaheptadecanodioato de 17-(terc-butilo) (204)
Se agitó una disolución de piperidina 203 (203,2 mg, 0,194 mmoles), éster 12 (126,5 mg, 0,194 mmoles), 2,4,6-trimetilpiridina (77 pl, 0,582 mmoles), HOAT (26,4 mg, 0,194 mmoles) en 1 ml de d Mf durante 30 min. La reacción en bruto se purificó por cromatografía de fase inversa C18 usando un gradiente de 0-100 % de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido fórmico dando 280,5 mg (97 % de rendimiento) del compuesto 204.
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para Cb1H106CINbO1b 1513,7; Hallado 1514,0.
Síntesis de ácido (2S)-8-(1-(3-(2-((2-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)-1,2-dimetilhidrazinil)metil)-1H-indol-1-il)propanoil)piperidin-4-il)-1-(((14S,16S,33S,2fí,4S,10£,12£,14fí)-86-cloro-14-hidroxi-85,14-dimetoxi-33,2,7,10-tetrametil-12,6-dioxo-7-aza-1(6,4)-oxazinana-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-bencenaciclotetradecafano-10,12-dien-4-il)oxi)-2,3-dimetil-1,4,7-trioxo-11,14-dioxa-3,8-diazaheptadecan-17-oico (205)
A una disolución del compuesto 204 (108 mg, 0,0714 mmoles) en 500 pl de DCM anhidro se añadió 357 pl de una disolución 1 M de SnCl4 en DCM. La mezcla heterogénea se agitó durante 1 h y luego se purificó por cromatografía de fase inversa C18 usando un gradiente de 0-100 % de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido fórmico dando 78,4 mg (75 % de rendimiento) del compuesto 205.
MS (ESI) m/z: [M-H]- Calculado para C77H96CINBO1B 1455,7; Hallado 1455,9.
EJEMPLO 2
Se sintetizó un conector que contenía un grupo de 4-amino-piperidina (4AP) según el Esquema 2, mostrado a continuación.
Figure imgf000055_0001
Síntesis de 4-oxopiperidin-1-carboxilato de ferc-butilo (210)
A un matraz redondo de 100 ml que contenía una barra de agitación magnética se añadió clorhidrato de piperidin-4-ona monohidratado (1,53 g, 10 mmoles), dicarbonato de di-ferc-butilo (2,39 g, 11 mmoles), carbonato sódico (1,22 g, 11,5 mmoles), dioxano (10 ml) y agua (1 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se diluyó con agua (100 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El material resultante se secó a vacío dando 1,74 g (87 %) del compuesto 210 como un sólido blanco.
1H RMN (CDCla) 53,73 (t, 4H, J = 6,0), 2,46 (t, 4H, J = 6,0), 1,51 (s, 9H).
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C10H18NO3200,3; Hallado 200,2.
Síntesis de 4-((2-(2-(3-(ferc-butoxi)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)amino)piperidin-1-carboxilato de ferc-butilo (211)
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió 4-oxopiperidin-1-carboxilato de ferc-butilo (399 mg, 2 mmoles), H2N-PEG2-COOf-Bu (550 mg, 2,4 mmoles), tamices moleculares de 4 Á (polvo activado, 200 mg) y 1,2-dicloroetano (5 ml). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. A la mezcla de reacción se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (845 mg, 4 mmoles). La mezcla se agitó durante 3 días a temperatura ambiente. La mezcla resultante se repartió entre EtOAc y NaHCO3 acuoso saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró a presión reducida proporcionando 850 mg del compuesto 211 como un aceite viscoso.
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C21H41N2O6417,3; Hallado 417,2.
Síntesis de ácido 13-(1-(ferc-butoxicarbonil)piperidin-4-il)-2,2-dimetil-4,14-dioxo-3,7,10-trioxa-13-azaheptadecan-17-oico (212)
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió 4-((2-(2-(3-(ferc-butoxi)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)amino)piperidin-1-carboxilato de ferc-butilo 211 (220 mg, 0,5 mmoles), anhídrido succínico (55 mg, 0,55 mmoles), 4-(dimetilamino)piridina (5 mg, 0,04 mmoles) y diclorometano (3 ml). La mezcla se agitó durante 24 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se purificó parcialmente por cromatografía ultrarrápida (eluir 50­ 100 % de EtOAc/hexanos) dando 117 mg del compuesto 212 como un aceite transparente, que se llevó adelante sin caracterización adicional.
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C25H45N2O9517,6; Hallado 517,5.
Síntesis de 1 -((14S,16S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-cloro-14-hidroxi-85,14-dimetoxi-33,2,7,10-tetrametil-12,6-dioxo-7-aza-1(6,4)-oxazinana-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-bencenaciclotetradecafano-10,12-dien-4-il)(2S)-8-(1-(tercbutoxicarbonil)piperidin-4-il)-2,3-dimetil-4,7-dioxo-11,14-dioxa-3,8-diazaheptadecanodioato de 17-(terc-butilo) (213)
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió ácido 13-(1-(terc- butoxicarbonil)piperidin-4-il)-2,2-dimetil-4,14-dioxo-3,7,10-trioxa-13-azaheptadecan-17-oico 212 (55 mg, 0,1 mmoles), W-deacilmaitansina 124 (65 mg, 0,1 mmoles), HATU (43 mg, 0,11 mmoles), DMF (1 ml) y diclorometano (0,5 ml). La mezcla se agitó durante 8 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se purificó directamente por cromatografía ultrarrápida C18 (eluir 5-100 % de MeCN/agua) dando 18 mg (16 %) del compuesto 213 como una película blanca.
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C57Hs7ClN5O171148,6; Hallado 1148,7.
Síntesis de ácido (2S)-1-(((14S,16S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-cloro-14-hidroxi-85,14-dimetoxi-33,2,7,10-tetrametil-12,6-dioxo-7-aza-1(6,4)-oxazinana-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-bencenaciclotetradecafano-10,12-dien-4-il)oxi)-2,3-dimetil-1,4,7-trioxo-8-(piperidin-4-il)-11,14-dioxa-3,8-diazaheptadecan-17-oico (214)
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió maitansinoide 213 (31 mg, 0,027 mmoles) y diclorometano (1 ml). La disolución se enfrió hasta 0 °C y se añadió tetracloruro de estaño (IV) (disolución 1,0 M en diclorometano, 0,3 ml, 0,3 mmoles). La mezcla de reacción se agitó durante 1 h a 0 °C. La mezcla de reacción se purificó directamente por cromatografía ultrarrápida C18 (eluir 5-100 % de MeCN/agua) dando 16 mg (60 %) del compuesto 214 como un sólido blanco (16 mg, 60 % de rendimiento).
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C4sH71ClN5O15992,5; Hallado 992,6.
Síntesis de ácido (2S)-8-(1-(3-(2-((2-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)-1,2-dimetilhidrazmil)metil)-1H-indol-1-il)propanoil)piperidin-4-il)-1-(((14S,16S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-cloro-14-hidroxi-85,14-dimetoxi-33,2,7,10-tetrametil-12,6-dioxo-7-aza-1(6,4)-oxazinana-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-bencenaciclotetradecafano-10,12-dien-4-il)oxi)-2,3-dimetil-1,4,7-trioxo-11,14-dioxa-3,8-diazaheptadecan-17-oico (215)
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió maitansinoide 214 (16 mg, 0,016 mmoles), 1,2-dimetil-2-((1-(3-oxo-3-(perfluorofenoxi)propil)-1H-indol-2-il)metil)hidracina-1-carboxilato de (9H-fluoren-9-il)metilo (5) (13 mg, 0,02 mmoles), DIPEA (8 pl,0,05 mmoles) y DMF (1 ml). La disolución se agitó durante 18 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se purificó directamente por cromatografía ultrarrápida C18 (eluir 5-100 % de MeCN/agua) dando 18 mg (77 %) del compuesto 215 como un sólido blanco.
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C77H98ClN8O181457,7; Hallado 1457,9.
Síntesis de ácido (2S)-1-(((14S,16S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-cloro-14-hidroxi-85,14-dimetoxi-33,2,7,10-tetrametil-12,6-dioxo-7-aza-1(6,4)-oxazinana-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-bencenaciclotetradecafano-10,12-dien-4-il)oxi)-8-(1-(3-(2-((1,2-dimetilhidrazinil)metil)-1 H-indol-1-il)propanoil)piperidin-4-il)-2,3-dimetil-1,4,7-trioxo-11,14-dioxa-3,8-diazaheptadecan-17-oico (216)
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió maitansinoide 215 (18 mg, 0,012 mmoles), piperidina (20 pl, 0,02 mmoles) y DMF (1 ml). La disolución se agitó durante 20 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se purificó directamente por cromatografía ultrarrápida C18 (eluir 1-60 % de MeCN/agua) dando 15 mg (98 %) del compuesto 216 (también denominado en el presente documento HIPS-4AP-maitansina o HIPS-4-amino-piperidin-maitansina) como un sólido blanco.
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para Cs2H88ClN8O161235,6; Hallado 1236,0.
EJEMPLO 3
Procedimientos experimentales
General
Se realizaron experimentos para crear conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) conjugados específicamente en el sitio. La producción de ADC específicos en el sitio incluyó la incorporación de formilglicina (FGly), un aminoácido no natural, en la secuencia de proteínas. Para instalar FGly (FIG. 1), se insertó una secuencia consenso corta, CXPXR, donde X es serina, treonina, alanina o glicina, en la localización deseada en las regiones conservadas de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo usando técnicas de clonación de biología molecular habituales. Esta construcción "marcada" se produjo recombinantemente en células que coexpresan la enzima generadora de formilglicina (FGE), que convirtió cotraduccionalmente la cisteína dentro de la marca en el resto de FGly, generando un grupo funcional aldehído (también denominado en el presente documento una marca de aldehído). El grupo funcional aldehído sirvió de pretexto químico para la conjugación bioortogonal. Se usó una ligación de hidrazino-/'so-Pictet-Spengler (HIPS) para conectar la carga activa (por ejemplo, un fármaco, tal como una citotoxina (por ejemplo, maitansina)) con FGly, dando como resultado la formación de un enlace C-C covalente estable entre la carga activa de citotoxina y el anticuerpo. Cabía esperar que este enlace C-C fuera estable a las condiciones fisiológicamente relevantes encontradas por el ADC durante la circulación y la recirculación de FcRn, por ejemplo, proteasas, pH bajo y reactivos reductores. Los anticuerpos que llevan la marca de aldehído se pueden producir en una variedad de localizaciones. Los experimentos se realizaron para probar los efectos de la inserción de la marca de aldehído en el extremo C (CT) de la cadena pesada. Se realizó la caracterización biofísica y funcional en los ADC resultantes preparados por conjugación con cargas activas de maitansina por un conector de HIPS.
Clonación, expresión y purificación de anticuerpos marcados
Se insertó la secuencia de marca de aldehído en el extremo C (CT) de la cadena pesada usando técnicas habituales de biología molecular. Para la producción a pequeña escala, se transfectaron células CHO-S con construcciones de expresión de FGE humana y se usaron conjuntos de células que expresaban en exceso FGE para la producción transitoria de anticuerpos. Para la producción a gran escala, se usó la tecnología GPEx (Catalent, Inc., Somerset, NJ) para generar una estirpe celular clonal que expresaba en exceso FGE humana (GPEx). Entonces, el clon FGE se usó para generar conjuntos estables a granel de células que expresan el anticuerpo. Los anticuerpos se purificaron del medio acondicionado usando una cromatografía de proteína A (MabSelect, GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA). Los anticuerpos purificados se ultracongelaron y se almacenaron a -80 °C hasta uso posterior.
Bioconjugación, purificación y análisis por HPLC
Se conjugó el anticuerpo aCD22 marcado con aldehído carboxiterminalmente (15 mg/ml) con HIPS-4AP-maitansina (8 equivalentes mol. de fármaco:anticuerpo) durante 72 h a 37 °C en citrato de sodio 50 mM, NaCl 50 mM a pH 5,5 que contenía 0,85 % de DMA. Se retiró el anticuerpo sin conjugar usando cromatografía de interacción hidrófoba a escala preparativa (HIC; GE Healthcare 17-5195-01) con fase móvil A: sulfato de amonio 1,0 M, fosfato de sodio 25 mM a pH 7,0, y fase móvil B: 25 % de isopropanol, fosfato de sodio 18,75 mM a pH 7,0. Se usó un gradiente isocrático de 33 % de B para eluir material sin conjugar, seguido por un gradiente lineal de 41-95 % de B para eluir especies mono- y diconjugadas. Para determinar la DAR del producto final, se examinaron ADC por HIC analítica (Tosoh N.° 14947, Grove City, OH) con fase móvil A: sulfato de amonio 1,5 M, fosfato de sodio 25 mM a pH 7,0, y fase móvil B: 25 % de isopropanol, fosfato de sodio 18,75 mM a pH 7,0. Para determinar la agregación, las muestras se analizaron usando cromatografía de exclusión por tamaño analítica (SEC; Tosoh N.° 08541) con una fase móvil de NaCl 300 mM, fosfato de sodio 25 mM a pH 6,8.
Resultados
Los anticuerpos aCD22 modificados para contener la marca de aldehído en el extremo C (CT) de la cadena pesada se conjugaron con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP como se ha descrito anteriormente. Tras completarse la reacción de conjugación, el anticuerpo sin conjugar se retiró por HIC preparativa y el fármaco libre restante se retiró durante el intercambio de tampón por filtración de flujo tangencial. Las reacciones fueron de alto rendimiento, con >84 % de eficiencia de conjugación y >70 % de rendimiento total. Los ADC resultantes tuvieron relaciones entre fármaco y anticuerpo (DAR) de 1,6-1,9 y fueron predominantemente monoméricos. Las FIG. 2-5 muestran DAR de fracciones en bruto representativas y los ADC purificados como se ha determinado por HIC y cromatografía PLRP de fase inversa, y muestran la integridad monomérica como se ha determinado por SEC.
La FIG. 2 muestra un trazado de columna de interacción hidrófoba (HIC) de un anticuerpo anti-CD22 marcado con aldehído conjugado en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP. La FIG. 2 indica que la DAR en bruto fue 1,68 como se ha determinado por HIC.
La FIG. 3 muestra un trazado de HIC de un anticuerpo anti-CD22 marcado con aldehído conjugado en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP. La FIG. 3 indica que la DAR final fue 1,77 como se ha determinado por HIC.
La FIG. 4 muestra un trazado de cromatografía de fase inversa (PLRP) de un anticuerpo anti-CD22 marcado con aldehído conjugado en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP. La FIG. 4 indica que la DAR final fue 1,81 como se ha determinado por PLRP.
La FIG. 5 muestra un gráfico de análisis de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) analítica de un anticuerpo anti-CD22 marcado con aldehído conjugado en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP. Como se muestra en la FIG. 5, la SEC analítica indicó 98,2 % de monómero para el producto final.
Citotoxicidad in v itro
Se obtuvieron estirpes celulares de linfoma de linfocitos B CD22-positivo, Ramos y WSU-DLCL2, de los bancos de células ATCC y DSMZ, respectivamente. Las células se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Cellgro, Manassas, VA) complementado con 10 % de suero bovino fetal (Invitrogen, Grand Island, NY) y Glutamax (Invitrogen). 24 h antes de la siembra, las células se sometieron a pases para garantizar el crecimiento en fase logarítmica. El día de la siembra, se sembraron 5000 células/pocillo sobre placas de 96 pocillos en 90 gl de medio de crecimiento normal complementado con 10 UI de penicilina y 10 pg/ml de estreptomicina (Cellgro). Las células se trataron en diversas concentraciones con 10 pl de analitos diluidos, y las placas se incubaron a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2. Después de 5 d, se añadieron 100 pl/pocillo del reactivo Cell Titer-Glo (Promega, Madison, WI), y se midió la luminiscencia usando un lector de placas Molecular Devices SpectraMax M5. Se usó el software GraphPad Prism para el análisis de datos.
Resultados
El aCD22 CT HIPS-4AP-maitansina presentó una actividad muy potente contra células WSU-DLCL2 y Ramos in vitro en comparación con maitansina libre (FIG. 6). Las concentraciones CI50 fueron 0,018 y 0,086 nM para ADC y el fármaco libre, respectivamente, contra células WSU-DLCL2, y fueron 0,007 y 0,040 nM para el ADC y el fármaco libre, respectivamente, contra células Ramos.
La FIG. 6A muestra un gráfico de potencia in vitro contra células WSU-DLCL2 (% de viabilidad frente al log de la concentración de anticuerpo-fármaco conjugado (ADC) (nM)) para ADC anti-CD22 conjugados en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP. La FIG. 6B muestra un gráfico de potencia in vitro contra células Ramos (% de viabilidad frente al log de la concentración de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) (nM)) para ADC anti-CD22 conjugados en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP.
Estudios de xenoinjerto
Se inocularon ratones ICR SCID hembra (8/grupo) por vía subcutánea con 5 x 106 células WSU-DLCL2. El tratamiento empezó cuando los tumores alcanzaron un promedio de 262 mm3, momento en que los animales se administraron por vía intravenosa con vehículo solo o aCD22 HIPS-4AP-maitansina marcado CT (10 mg/kg). La administración tuvo lugar cada cuatro días para un total de cuatro dosis (q4d x 4). Los animales se monitorizaron dos veces a la semana para peso corporal y tamaño del tumor. Los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron 2000 mm3.
Resultados
La mediana del tiempo hasta el punto final para los animales en los grupos de control de vehículo fue 16 días; por lo tanto, la inhibición del crecimiento tumoral (% de TGI) se calculó en ese día. El % de TGI se definió por la siguiente fórmula:
% de TGI (%) = (TVgrupo de control — TVgrupo tratado) / TVcontrol X 100
donde TV es el volumen del tumor.
Los animales que se administraron con aCD22 HIPS-4AP-maitansina mostraron 90 % de TGI en el día 16, experimentando 5 de los 8 tumores regresión completa (FIG. 7). Tres de estas regresiones completas fueron duraderas hacia el final del estudio (día 58). La FIG. 7 muestra un gráfico que indica la eficacia in vivo contra un modelo de xenoinjerto WSU-DLCL2 (volumen medio del tumor (mm3) frente a días) para ADC anti-CD22 conjugados en el extremo C (CT) con una carga activa de maitansina unida a un conector de HIPS-4AP. Las flechas verticales en la FIG. 7 indican la administración, que ocurrió cada cuatro días para un total de cuatro dosis (q4d x 4).
EJEMPLO 4
Introducción
Los tumores derivados hematológicamente constituyen ~10 % de todos los casos de cáncer recientemente diagnosticados en los EE. UU. De estos, la designación de linfoma no hodgkiniano (NHL) describe un diverso grupo de cánceres que se clasifican conjuntamente entre los 10 cánceres más comúnmente diagnosticados en todo el mundo. Aunque están mejorando las tendencias de supervivencia a largo plazo, sigue existiendo una significativa necesidad clínica sin cumplir de tratamientos para ayudar a los pacientes con enfermedad recidivante o resistente, una causa de las cuales es la salida de fármaco mediante la regulación por incremento de bombas xenobióticas, tales como MDR1. Se produjo un conjugado de anticuerpo-fármaco conjugado específicamente en el sitio dirigido contra CD22 y que lleva una carga activa de maitansina no escindible que fue resistente a la salida mediada por MDR1. La construcción fue eficaz contra xenoinjertos de NHL CD22+ y se puede administrar repetidamente en macacos cangrejeros a 60 mg/kg sin efectos adversos observados. Juntos, los datos indicaron que este fármaco tiene el potencial de ser usado eficazmente en pacientes con tumores CD22+ que han desarrollado resistencia relacionada con MDR1 en terapias previas. CD22 es una diana clínicamente validada para el tratamiento de NHL y ALL. Se puede usar un conjugado de anticuerpo anti-CD22-fármaco (ADC) según la presente divulgación para el tratamiento de pacientes con NHL y ALL recidivante/refractario.
Material y métodos
Se conjugó un anticuerpo anti-CD22 específicamente en el sitio, usando una tecnología de marcas de aldehído, con una carga activa de maitansina no escindible. El ADC se caracterizó tanto biofísicamente como funcionalmente in vitro.
Entonces, se determinó la eficacia in vivo en ratones usando dos modelos de xenoinjerto y se realizaron estudios de toxicidad en tanto rata como macacos cangrejeros. Se realizaron estudios de farmacodinámica en monos, y se compararon los estudios de farmacocinética y toxicocinética con la exposición a ADC total en los estudios de eficacia y toxicidad.
Resultados
El ADC fue muy potente in vivo, incluso contra estirpes celulares que se habían construido para expresar en exceso la bomba de expulsión, MDR1. La construcción fue eficaz a 10 mg/kg x 4 dosis contra modelos de tumor de xenoinjerto de NHL, y en un estudio de toxicidad en macacos cangrejeros, el ADC se administró dos veces a 60 mg/kg sin efectos adversos observados. La exposición a ADC total a estas dosis (como se evaluó por ABCü-inf) indicó que la exposición necesaria para lograr la eficacia estaba por debajo de los límites tolerables. Finalmente, un examen de la respuesta farmacodinámica en los monos tratados demostró que el compartimento de linfocitos B fue reducido selectivamente, que indica que el ADC eliminó las células elegidas sin notable toxicidad inespecífica.
Los resultados indicaron que el ADC se puede usar eficazmente en pacientes con tumores CD22+ que han desarrollado resistencia relacionada con MDR1 en terapias previas.
EJEMPLO 5
Introducción
Leucemias, linfomas y mielomas son altamente predominantes en la población, representando ~10 % de todos los casos de cáncer recién diagnosticados en los EE. UU. durante 2015. De estos cánceres, los tumores malignos derivados de linfocitos B constituyen un grupo grande y diverso que incluye linfoma no hodgkiniano (NHL), leucemia linfocítica crónica (CLL) y leucemia linfoblástica aguda (ALL). Similarmente, como una categoría, NHL designa aproximadamente 60 subconjuntos de linfoma, de los que aproximadamente el 85 % derivan de linfocitos B, que incluyen linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL), linfoma folicular (FL) y linfoma de células del manto (MCL). Conjuntamente, las enfermedades de NHL están entre los tipos de cáncer más comunes observados, clasificándose como el 7° cáncer más común en los EE. UU. y el 10° cáncer más común diagnosticado en todo el mundo en 2012. Mientras que las tendencias a largo plazo muestran mejorías en las tasas de supervivencia a los 5 años para la mayoría de los diagnósticos de cánceres de la sangre, sigue existiendo una significativa necesidad clínica sin satisfacer, dejando de cumplir el 16 % de los pacientes con CLL, el 30 % de los pacientes con ALL y el 30 % de los pacientes con NHL diagnosticados desde 2004 hasta 2010 el criterio de valoración de supervivencia a los 5 años.
CD22 es una glucoproteína de la superficie celular restringida por la estirpe de linfocitos B que se expresa en la mayoría de los tumores malignos hematológicos de linfocitos B, pero no se expresa en células madre hematopoyéticas, linfocitos B de memoria, u otros tejidos no hematopoyéticos normales. Su patrón de expresión y la rápida internalización cinética hacen que sea una diana para las terapias de conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), y se ha validado como tal en ensayos clínicos contra NHL y ALL.
En los experimentos descritos en el presente documento, se usó la tecnología de conjugación específica del sitio basada en la marca de aldehído y la química de hidrazino-iso-Pictet-Spengler (HIPS) para acoplar una carga activa de maitansina mediante un conector no escindible con el extremo C de la cadena pesada del anticuerpo. La marca de aldehído genéticamente codificada incorporó la secuencia de seis aminoácidos, LCTPSR. La enzima generadora de formilglicina (FGE) expresada en exceso cotraduccionalmente convirtió la cisteína dentro de la secuencia consenso en un resto de formilglicina, que lleva un grupo funcional aldehído, que se hizo reaccionar con una carga activa de HIPS-conector para generar un ADC. Este enfoque proporcionó control durante tanto la colocación de carga activa como la DAR, y dio preparaciones de ADC altamente homogéneas. Los ADC conjugados específicamente en el sitio presentaron una farmacocinética (FC) y eficacia mejoradas con respecto a los conjugados estocásticos, probablemente debido a la falta de especies conjugadas por defecto y por exceso en la preparación, que puede conducir a moléculas ineficaces o excesivamente tóxicas, respectivamente. Además, la carga activa de conectormaitansina no escindible usada en el ADC anti-CD22 fue resistente a la salida por MDR1 y no medió en la destrucción inespecífica o por vecindad. Juntas, estas características contribuyeron a la eficacia y seguridad del ADC anti-CD22 observadas en estudios preclínicos.
Materiales y métodos
General
Todos los estudios en animales se realizaron según las normas del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales y se realizaron en Charles River Laboratories, Aragen Bioscience, o Covance Laboratories. El anticuerpo anti-maitansina murino se preparó por ProMab y se validó internamente. El anticuerpo anti-AF488 de conejo se compró de Life Technologies. Los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) fueron de Jackson ImmunoResearch. Los anticuerpos usados para los estudios farmacodinámicos fueron de BD Pharmingen. Las estirpes celulares se obtuvieron de los bancos de células ATCC y DSMZ donde se autenticaron por morfología, cariotipado y enfoques basados en PCR.
Clonación, expresión y purificación de anticuerpos marcados
Los anticuerpos se generaron usando técnicas habituales de clonación y purificación y tecnología de expresión GPEx®.
Bioconjugación, purificación y análisis de HPLC
Los ADC se prepararon y caracterizaron como se describe en Drake et al., Bioconjugate Chem., 2014, 25, 1331-41.
Generación de estirpes celulares MDR1
Se obtuvo ADNc de MDR1 (ABCB 1) de Sino Biological y se clonó en un plásmido pEF con un marcador de selección de higromicina. Se usó un instrumento AMAXA Nucleofector™ para electroporar células Ramos (ATCC CRL-1923) y WSU-DLCL2 (DSMZ ACC 575) según las instrucciones del fabricante. Después de la selección con higromicina (Invitrogen 10687010), los conjuntos se enriquecieron con tratamiento con paclitaxel (25 nM durante hasta 10 días) para seleccionar adicionalmente células con MDR1 funcional. Las células resultantes se mantuvieron bajo selección con higromicina en RPMI (Gibco 21870-092) complementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS) y 1X GlutaMax (Gibco 35050-079).
Ensayos de citotoxicidad in v itro
Se sembraron estirpes celulares en placas de 96 pocillos (Costar 3610) a una densidad de 5 x 104 células/pocillo en 100 pl de medio de crecimiento y se dejó que reposaran durante 5 h. La dilución sucesiva de muestras de prueba se realizó en RPMI a 6x la concentración final y se añadieron 20 pl a las células. Después de la incubación a 37 °C con 5 % de CO2 durante 5 días, se midió la viabilidad usando un ensayo de proliferación celular Promega CellTiter96® AQueous One Solution (G3581) según las instrucciones del fabricante. Las curvas de GI50 se calcularon en GraphPad Prism usando el valor de la relación entre fármaco y anticuerpo (DAR) de ADC para normalizar la dosis con la concentración de carga activa.
Estudios de xenoinjerto
Se inocularon por vía subcutánea ratones CB17 ICR SCID hembra con cualquiera de células WSU-DLCL2 o Ramos en 50 % de Matrigel. Los tumores se midieron dos veces a la semana y el volumen del tumor se estimó según la fórmula:
ivz x l
Figure imgf000060_0001
donde w = anchura del tumor y l = longitud del tumor. Cuando los tumores alcanzaron el volumen medio deseado, los animales se aleatorizaron en grupos de 8-12 ratones y fueron administraron como se describe a continuación. Los animales se sacrificaron al final del estudio o cuando los tumores alcanzaron 2000 mm3.
Estudios de toxicología en ratas y análisis toxicocinético (TC)
Se administraron ratas Sprague-Dawley macho (8-9 semanas de edad al comienzo del estudio) con una dosis intravenosa única de 6, 20, 40 o 60 mg/kg del ADC anti-CD22 (5 animales/grupo). Los animales se observaron durante 12 días después de la administración. Se registraron los pesos corporales en los días 0, 1, 4, 8 y 11. Se recogió la sangre de todos los animales a las 8 h y 5, 9 y 12 d y se usó para los análisis toxicocinéticos (todos los momentos de tiempo) y para la bioquímica clínica y análisis de hematología (días 5 y 12). Los análisis toxicocinéticos se realizaron por ELISA, usando las mismas condiciones y reactivos que se describen para los análisis farmacocinéticos.
Estudios de toxicología y TC en primates no humanos
Se administraron macacos cangrejeros (2/sexo/grupo) con dos dosis (cada 21 días) de 10, 30 o 60 mg/kg del ADC anti-CD22 seguido por un periodo de observación de 21 días. Los pesos corporales se evaluaron antes de la administración en el día 1, y en los días 8, 15, 22 (predosis), 29, 36 y 42. La sangre se recogió para los análisis toxicocinéticos, de bioquímica clínica y de hematología según los programas presentados en la Tabla 2. Los análisis toxicocinéticos se realizaron por ELISA, usando las mismas condiciones y reactivos que se describen para los análisis farmacocinéticos, excepto que se usó la proteína CD22-His como reactivo de captura para el anticuerpo total y las mediciones de ADC total.
Tabla 2. Resumen de resultados farmacocinéticos en ratas administradas con 3 mg/kg con ADC anti-CD22
Figure imgf000061_0001
Estudio farmacodinámico en primates no humanos
Se analizaron muestras de sangre completa de los macacos cangrejeros reclutados en el estudio de toxicología de ADC anti-CD22 por citometría de flujo para evaluar poblaciones de leucocitos CD3+, CD20+ y CD3-/CD20-. Brevemente, a una alícuota de 100 gl de sangre completa se añadieron o anticuerpos de control de isotipo conjugados con fluoresceína y ficoetritina o anticuerpos anti-CD20 conjugados con fluoresceína y anti-CD3 conjugados con ficoetritina y se incubaron sobre hielo durante 30 min. Entonces, se lisaron los glóbulos rojos con una disolución de cloruro de amonio (Stem Cell Technologies), y las células se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato 1 % de FBS. Las células marcadas se analizaron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto™ que ejecutaba el software FACSDiva™.
Diseños del estudio farmacocinético (FC)
Para el estudio en ratones, los animales usados en el experimento de xenoinjerto de Ramos se muestrearon en grupos de tres en momentos de tiempo que empezaron 1 h después de la primera dosis y que continuaron durante el periodo de observación. Para el estudio en ratas, se administraron ratas Sprague-Dawley macho (3 por grupo) por vía intravenosa con un único bolo de 3 mg/kg de ADC. Se recogió el plasma 1 h, 8 h y 24 h, y 2, 4, 6, 8, 10, 14 y 21 días después de la administración. Las muestras de plasma se almacenaron a -80 °C hasta uso.
Análisis FC y TC de muestras
Se cuantificaron las concentraciones de anticuerpo total, ADC total (sensible a DAR) y conjugado total (DAR >1) por ELISA como se representa en diagrama en la FIG. 10. Para anticuerpo total, se capturaron conjugados con un anticuerpo específico anti-IgG humana y se detectaron con un anticuerpo específico anti-Fc humano conjugado con HRP. Para ADC total, los conjugados se capturaron con un anticuerpo específico anti-Fab humano y se detectaron con un anticuerpo primario de ratón anti-maitansina, seguido por un anticuerpo secundario específico de anti-IgG de ratón subclase 1 conjugado con HRP. Para conjugado total, los conjugados se capturaron con un anticuerpo antimaitansina y se detectaron con un anticuerpo específico anti-Fc humano conjugado con HRP. El anticuerpo secundario unido se detectó usando sustrato de ELISA Ultra TMB One-Step (Thermo Fisher). Después de la extinción de la reacción con ácido sulfúrico, las señales se leyeron tomando la absorbancia a 450 nm en un lector de placas Molecular Devices Spectra Max M5 equipado con el software SoftMax Pro. Los datos se analizaron usando el software GraphPad Prism y Microsoft Excel.
Unión al antígeno CD22 por ELISA indirecto
Se recubrieron placas de 96 pocillos Maxisorp (Nunc) durante la noche a 4 °C con 1 gg/ml de CD22-His humano (Sino Biological) en PBS. La placa se bloqueó con tampón caseína (ThermoFisher), y luego el anticuerpo anti-CD22 no mutante y los ADC se sembraron en una serie de 11 etapas de diluciones dobles empezando en 200 ng/ml. La placa se incubó, agitando, a temperatura ambiente durante 2 h. Después de lavar en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 % de Tween-20, el analito unido se detectó con un anticuerpo secundario de asno conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) específica de anti-Fc-Y humano. Las señales se visualizaron con Ultra TMB (Pierce) y se extinguieron con H2SO42 N. La absorbancia a 450 nm se determinó usando un lector de placas Molecular Devices SpectraMax M5 y los datos se analizaron usando GraphPad Prism.
Internalización de CD22 mediada por ADC anti-CD22 en estirpes celulares de NHL CD22+
Se incubaron células Ramos, Granta-519 y WSU-DLCL2 (1e6/prueba) o en tampón de marcado solo [PBS 1 % de suero bovino fetal (FBS)], o en tampón de marcado con el ADC anti-CD22 (1 pg/prueba). Las muestras se dispusieron a 4 o 37 °C durante 2 h. Entonces, las células se incubaron sobre hielo durante 20 min con anti-CD22 marcado con fluoresceína. Después de lavar 2x en tampón de marcado, las células se analizaron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto™ que ejecutaba el software FACSDiva™. La diferencia en la fluorescencia entre las células a 4 y 37 °C ± ADC se interpretó como internalización mediada por el ADC anti-CD22.
Estudios de reactividad cruzada de tejido de macaco cangrejero y humano
Se realizaron estudios de reactividad cruzada de tejido por Ensigna Biosystems Inc. (Richmond, CA) usando ADC anti-CD22 biotinilado y un anticuerpo de isotipo biotinilado conjugado con carga activa de conector de HIPS-4AP-maitansina como control. Se usaron micromatrices de tejido que contenían piel, corazón, pulmón, riñón, hígado, páncreas, estómago, intestino delgado, intestino grueso y bazo (un control positivo). El anticuerpo primario se detectó usando estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante, seguido por visualización con sustrato DAB.
Síntesis de carga activa de conector de HIPS-4AP-maitansina
FmocCI
Figure imgf000062_0001
c
1,2-dimetilhidracina-1-carboxilato de (9H-fluoren-9-il)metilo (2).
Se disolvió MeNHNHMe^2HCl (1) (5,0 g, 37,6 mmoles) en CH3CN (80 ml). Se añadió Et3N (22 ml, 158 mmoles) y el precipitado que se formó se retiró por filtración. A la disolución restante de MeNHNHMe se añadió gota a gota una disolución de FmocCl (0,49 g, 18,9 mmoles, 0,5 eq) durante 2,5 h a -20 °C. La mezcla de reacción se diluyó entonces con EtOAc, se lavó con H2O, salmuera, se secó sobre Na2SÜ4 y se concentró a vacío. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (hexanos:EtOAc = 3:2) dando 3,6 g (34 %) del compuesto 2.
1H RMN (400 MHz, CDCh) 67,75-7,37 (m, 8 H), 4,48 (s a, 2H), 4,27 (t, J = 6,0 Hz, 1 H), 3,05 (s, 3H), 2,55 (s a, 3H).
Figure imgf000062_0002
2-(((fórc-Butildimetilsilil)oxi)metil)-1 H-indol (4)
Se cargó un matraz secado es estufa con indol-2-metanol, 3, (1,581 g, 10,74 mmoles), TBSCl (1,789 g, 11,87 mmoles) e imidazol (2,197 g, 32,27 mmoles), y esta mezcla se suspendió en CH2G 2 (40 ml, anhidro). Después de 16 h, la mezcla de reacción se concentró dando un residuo naranja. La mezcla en bruto se recogió en Et2Ü (50 ml), se lavó con AcOH acuoso (5 % v/v, 3 x 50 ml) y salmuera (25 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SÜ4 y se concentraron dando 2,789 g (99 %) del compuesto 4 como un sólido cristalino que se usó sin más purificación.
1H RMN (500 MHz, CDCls) 58,29 (s, 1H), 7,57 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,37 (dd, J = 8,1,0,6 Hz, 1H), 7,19 — 7,14 (m, 1H), 7,12 — 7,07 (m, 1H), 6,32 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 4,89 (s, 2H), 0,95 (s, 9H), 0,12 (s, 6H).
RMN 13C (101 MHz, CDCh) 5 138,3, 136,0, 128,6, 121,7, 120,5, 119,8, 110,9, 99,0, 59,4, 26,1, 18,5, -5,2.
HRMS (ESI) calculado para C15H24NOSi [M+H]+: 262,1627; hallado: 262,1625.
3-(2-(((ferc-But¡ld¡met¡ls¡l¡l)ox¡)met¡l)-1H-¡ndol-1-¡l)propanoato de metilo (6)
A una disolución del indol 4 (2,789 gg, 10,67 mmoles) en CH3CN (25 ml) se añadió acrilato de metilo, 5, (4,80 ml, 53,3 mmoles) seguido por 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (800 gl, 5,35 mmoles), y la mezcla resultante se sometió a reflujo. Después de 18 h, la disolución se enfrió y se concentró dando un aceite naranja que se purificó por cromatografía en gel de sílice (9:1 de hexanos:EtOAc) dando 3,543 g (96 %) del compuesto 6 como un aceite incoloro.
1H RMN (400 MHz, CDCls) 57,58 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,34 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,23 - 7,18 (m, 1H), 7,12 - 7,07^(m, 1H), 6,38 (s, 1H), 4,84 (s, 2H), 4,54 - 4,49 (m, 2H), 2,89 - 2,84 (m, 2H), 0,91 (s, 9H), 0,10 (s, 6H).
RMN 13C (101 MHz, CDCla) 5 172,0, 138,5, 137,1, 127,7, 122,0, 121,0, 119,8, 109,3, 101,8, 58,2, 51,9, 39,5, 34,6, 26,0, 18,4, -5,2.
HRMS (ESI) calculado para C1gH30NO3Si [M+H]+: 348,1995; hallado: 348,1996.
3-(2-(Hidroximet¡l)-1H-¡ndol-1-¡l)propanoato de metilo (7)
A una disolución del compuesto 6 (1,283 g, 3,692 mmoles) en THF (20 ml) a 0 °C se añadió una disolución 1,0 M de fluoruro de tetrabutilamonio en THF (3,90 ml, 3,90 mmoles). Después de 15 minutos, la mezcla de reacción se diluyó con Et2O (20 ml) y se lavó con NaHCO3 (ac. sat., 3 x 20 ml) y se concentró dando un aceite verde pálido. El aceite se purificó por cromatografía en gel de sílice (2:1 de hexanos:EtOAc) dando 822 mg (95 %) de 7 como un sólido cristalino blanco.
1H RMN (500 MHz, CDCh) 57,60 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,34 (dd, J = 8,2, 0,4 Hz, 1H), 7,27 — 7,23 (m, 1H), 7,16 — 7,11 (m, 1H), 6,44 (s, 1H), 4,77 (s, 2H), 4,49 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 3,66 (s, 3H), 2,87 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,64 (s, 1H).
RMN 13C (126 MHz, CDCh) 5 172,3, 138,5, 137,0, 127,6, 122,2, 121,1, 119,9, 109,3, 102,3, 57,1,52,0, 39,1,34,3. HRMS (ESI) calculado para C13H15NNaO3 [M+Na]+: 256,0950; hallado: 256,0946.
3-(2-Form¡l-1H-indol-1-¡l)propanoato de metilo (8)
Se suspendió peryodinano de Dess-Martin (5,195 g, 12,25 mmoles) en una mezcla de CH2CL (20 ml) y piridina (2,70 ml, 33,5 mmoles). Después de 5 min, la suspensión blanca resultante se transfirió a una disolución de 3-(2-(hidroximetil)-1 H-indol-1-il)propanoato de metilo (7; 2,611 g, 11,19 mmoles) en CH2CL (10 ml), dando como resultado una suspensión marrón rojiza. Después de 1 h, la reacción se inactivó con tiosulfato de sodio (disolución acuosa al 10 %, 5 ml) y NaHCO3 (disolución acuosa saturada, 5 ml). La fase acuosa se extrajo con CH2CL (3 x 20 ml); los extractos combinados se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron dando un aceite marrón. La purificación por cromatografía en gel de sílice (5-50 % de EtOAc en hexanos) dio 2,165 g (84 %) del compuesto 8 como un aceite incoloro.
1H RMN (400 MHz, CDCh) 59,87 (s, 1H), 7,73 (dt, J = 8,1, 1,0 Hz, 1H), 7,51 (dd, J = 8,6, 0,9 Hz, 1H), 7,45 — 7,40 (m, 1H), 7,29 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 7,18 (ddd, J = 8,0, 6,9, 1,0 Hz, 1H), 4,84 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 3,62 (s, 3H), 2,83 (t, J = 7,2 Hz, 2H).
RMN 13C (101 MHz, CDCl3) 5182,52, 171,75, 140,12, 135,10, 127,20, 126,39, 123,46, 121,18, 118,55, 110,62, 51,83, 40,56, 34,97.
HRMS (ESI) calculado para C13H13NO3Na [M+Na]+: 254,0793; hallado: 254,0786.
Ácido 3-(2-formil-1 H-indol-1-il) propanoico (9)
A una disolución del indol 8 (2,369 g, 10,24 mmoles) disuelto en dioxano (100 ml) se añadió LiOH (disolución acuosa 4 M, 7,68 ml, 30,73 mmoles). Se formó gradualmente un precipitado blanco denso durante el transcurso de varias horas. Después de 21 h, se añadió gota a gota HCl (disolución acuosa 1 M, 30 ml) dando una disolución con pH = 4. La disolución se concentró y el aceite marrón pálido resultante se disolvió en EtOAc (50 ml) y se lavó con agua (2 x 50 ml) y salmuera (20 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró dando un sólido naranja. La purificación por cromatografía en gel de sílice (10-50 % de EtOAc en hexanos con 0,1 % de ácido acético) dio 1,994 g (84 %) del compuesto 9 como un sólido amarillo pálido.
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 59,89 (s, 1H), 7,76 (dt, J = 8,1,0,9 Hz, 1H), 7,53 (dd, J = 8,6, 0,9 Hz, 1H), 7,48 - 7,43 (m, 1H), 7,33 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 7,21 (ddd, J = 8,0, 6,9, 1,0 Hz, 1H), 4,85 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,91 (t, J = 7,2 Hz, 2H). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) 5182,65, 176,96, 140,12, 135,02, 127,33, 126,42, 123,53, 121,27, 118,76, 110,55, 40,19, 34,82.
HRMS (ESI) calculado para C12H10NO3 [M-H]-: 216,0666; hallado: 216,0665.
Ácido 3-(2-((2-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)-1,2-dimetilhidrazinil)metil)-1H-indol-1-il)propanoico (10) A una disolución del compuesto 9 (1,193 g, 5,492 mmoles) y 1,2-dimetilhidracinacarboxilato de (9H-fluoren-9-il)metilo, 2, (2,147 g, 7,604 mmoles) en 1,2-dicloroetano (anhidro, 25 ml) se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (1,273 g, 6,006 mmoles). La suspensión amarilla resultante se agitó durante 2 h y luego se extinguió con NaHCO3 (disolución acuosa saturada, 10 ml), seguido por la adición de HCl (disolución acuosa 1 M) hasta pH 4. La fase orgánica se separó, y la fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (5 x 10 ml). Los extractos orgánicos reunidos se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron dando un aceite naranja. La purificación por cromatografía en gel de sílice C18 (20-90 % de CH3CN en agua) dio 1,656 g (62 %) del compuesto 10 como un sólido rosa ceroso.
1H RMN (400 MHz, CDCh) 57,76 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,70 - 7,47 (a m, 3H), 7,42 - 7,16 (a m, 6H), 7,12 — 7,05 (m, 1H), 6,37 (s, 0,6H), 6,05 (s, 0,4H), 4,75 - 4,30 (a m, 4H), 4,23 (m, 1H), 4,10 (s a, 1H), 3,55 (a d, 1H), 3,11 - 2,69 (m, 5H), 2,57 (s a, 2H), 2,09 (s a, 1H).
RMN 13C (101 MHz, CDCl3) 5174,90, 155,65, 143,81,141,42, 136,98, 134,64, 127,75, 127,48, 127,12, 124,92, 122,00, 120,73, 120,01, 119,75, 109,19, 103,74, 67,33, 66,80, 51,39, 47,30, 39,58, 39,32, 35,23, 32,10.
HRMS (ESI) calculado para C29H30N3O4 [M+H]+: 484,2236; hallado: 484,2222.
1,2-Dimetil-2-((1-(3-oxo-3-(perfluorofenoxi)propil)-1H-indol-2-il)metil)hidracina-1-carboxilato de (9H-fluoren-9-il)metilo (RED-004).
Se añadió el compuesto 10 (5,006 g, 10,4 mmoles) a un matraz redondo de 2 bocas de 100 ml secado que contenía una barra de agitación secada. Se añadió EtOAc anhidro, 40 ml, por jeringa y la disolución se agitó a 20 °C durante 5 min, dando una disolución clara de color verde amarillento pálida. La disolución se enfrió hasta 0 °C en un baño de agua con hielo y se añadió gota a gota pentafluorofenol (2098,8 mg, 11,4 mmoles), en 3 ml de EtOAc anhidro. La disolución se agitó a 0 °C durante 5 min. Se añadió gota a gota, lentamente por jeringa, DCC (2348,0 mg, 11,4 mmoles) en 7 ml de EtOAc anhidro. La disolución se agitó a 0 °C durante 5 min, luego se sacó del baño y se calentó hasta 20 °C. La reacción se agitó durante 2 h, se enfrió hasta 0 °C y se filtró dando una disolución clara de color verde amarillento pálido. La disolución se diluyó con 50 ml de EtOAc, y se lavó con 2 x 25 ml de H2O, 1 x 25 ml de NaCl 5 M, y se secó sobre Na2SO4. La disolución se filtró, se evaporó y se secó a alto vacío, dando 6552,5 mg (97 %) de RED-004 como un sólido blanco verdoso.
1H RMN (400 MHz, CDCh) 5780 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,58 (m, 3H), 7,45-7,22 (m, 6H), 7,14 (dd(appt. t), J = 7,4 Hz, 1H), 6,42 & 6,10 (2 s a, 1 H), 4,74 (dd(appt. t), J = 5,4 Hz, 2H), 3,65-3,18 (a, 3H), 3,08 & 2,65 (2 s a, 3H), 2,88 (s, 3H).
Figure imgf000064_0001
(S)-3,4-dimetiloxazolidina-2,5-diona (RED-194).
A una disolución de W-Boc-Ala-OH (11) (0,005 moles) en cloruro de metileno (25 ml) a 0 °C, se añadió bajo nitrógeno 1,2 equivalentes de tricloruro fosforoso. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h a 0 °C, el disolvente se retiró a presión reducida y el residuo se lavó con tetracloruro de carbono (3 x 20 ml) proporcionando RED-194.
Metil-L-alaninato de (14S,16S,32fí,33fí,2fí,4S,10£,12£,14fí)-86-cloro-14-hidroxi-85,14-dimetoxi-33,2,7,10-tetrametil-12,6-dioxo-7-aza-1(6,4)-oxazinana-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-bencenaciclotetradecafano-10,12-dien-4-ilo (RED-062).
Se disolvió maitansinol (RED-063) (4,53 g, 8 mmoles) en DMF anhidra (11 ml) dando una disolución incolora clara que se transfirió a un matraz redondo de bocas secado bajo N2. Se añadió THF anhidro (44 ml) seguido por DIPEA (8,4 ml, 48 mmoles). Se añadió una disolución de RED-194 (5,4 g, 42 mmoles) dando una disolución incolora clara. Se añadió Zn(OTf)2 (8,7 g, 24 mmoles) desecado finamente molido a la disolución de agitación y la mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 2 días. La reacción se inactivó añadiendo una disolución de 70 ml de NaHCO3 1,2 M y 70 ml de EtOAc. Tras la agitación, la mezcla resultante produjo un precipitado blanco que se retiró por filtración. El filtrado se extrajo con EtOAc (5 x 70 ml), se secó (Na2SO4) y se concentró dando un aceite naranja rojizo. Este se disolvió en CH2Cl2 (15 ml) y se purificó usando un sistema Biotage (adsorbido sobre 2x muestras pequeñas de 10 g de Biotage Ultra, purificación en 2x cartucho de 100 g de Biotage Ultra con 0-20 % de gradiente de MeOH en CH2Cl2) para producir 4,38 g de RED-062 como un sólido de color melocotón pálido (95 % de, 93,7 % del diaestereómero deseado).
Figure imgf000065_0001
4-Oxopiperidin-1-carboxilato de ferc-butilo (13).
A un matraz redondo de 100 ml que contenía una barra de agitación magnética se añadió clorhidrato de piperidin-4-ona monohidratado (12) (1,53 g, 10 mmoles), dicarbonato de di-ferc-butilo (2,39 g, 11 mmoles), carbonato sódico (1,22 g, 11,5 mmoles), dioxano (10 ml) y agua (1 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se diluyó con agua (100 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El material resultante se secó a vacío dando 1,74 g (87 %) del compuesto 13 como un sólido blanco.
1H RMN (CDCla) 53,73 (t, 4H, J = 6,0), 2,46 (t, 4H, J = 6,0), 1,51 (s, 9H).
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C10H18NO3200,3; hallado 200,2.
4- ((2-(2-(3-(tere-Butox¡)-3-oxopropox¡)etox¡)et¡l)am¡no)p¡per¡d¡n-1-carbox¡lato de te re -b u tilo (14).
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió el compuesto 13 (399 mg, 2 mmoles), H2N-PEG2-COOf-Bu (550 mg, 2,4 mmoles), tamices moleculares de 4 Á (polvo activado, 200 mg) y 1,2-dicloroetano (5 ml). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. A la mezcla de reacción se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (845 mg, 4 mmoles). La mezcla se agitó durante 3 días a temperatura ambiente. La mezcla resultante se repartió entre EtOAc y NaHCO3 acuoso saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar 850 mg del compuesto 14 como un aceite viscoso.
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C21H41N2O6417,3; hallado 417,2.
Ác¡do 13-(1-(tere-butox¡carbon¡l)p¡per¡d¡n-4-¡l)-2,2-d¡met¡l-4,14-d¡oxo-3,7,10-tr¡oxa-13-azaheptadecan-17-o¡co (RED-195).
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió el compuesto 14 (220 mg, 0,5 mmoles), anhídrido succínico (55 mg, 0,55 mmoles), 4-(dimetilamino)piridina (5 mg, 0,04 mmoles) y diclorometano (3 ml). La mezcla se agitó durante 24 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se purificó parcialmente por cromatografía ultrarrápida (eluir 50-100 % de EtOAc/hexanos) dando 117 mg de compuesto RED-195 como un aceite transparente, que se llevó adelante sin caracterización adicional.
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C25H45N2O9517,6; hallado 517,5.
(2S)-8-(1-(tere-Butox¡carbon¡l)p¡per¡d¡n-4-¡l)-2,3-d¡met¡l-4,7-d¡oxo-11,14-d¡oxa-3,8-d¡azaheptadecanod¡oato de 17-(tere-but¡l)1-((14S,16S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-cloro-14-h¡drox¡-85,14-d¡metox¡-332,7,10-tetramet¡l-12,6-d¡oxo-7-aza-1(6,4)-oxaz¡nana-3(2,3)-ox¡rana-8(1,3)-bencenac¡clotetradecafano-10,12-d¡en-4-¡lo) (RED-196).
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió RED-195 (445 mg, 0,86 mmoles), HATU (320 mg, 0,84 mmoles), DIPEA (311 mg, 2,42 mmoles) y diclorometano (6 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. La disolución resultante se añadió a RED-062 (516 mg, 0,79 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se purificó directamente por cromatografía ultrarrápida (eluir 3-10 % de MeOH/DCM) dando 820 mg (90 %) de RED-196 como un sólido de color tostado claro.
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C57H87ClN5O171148,6; hallado 1148,8.
Ác¡do (2S)-1 -(((14S,16S33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-cloro-14-h¡drox¡-85,14-d¡metox¡-33,2,7,10-tetramet¡l-12,6-d¡oxo-7-aza-1(6,4)-oxaz¡nana-3(2,3)-ox¡rana-8(1,3)-bencenac¡clotetradecafano-10,12-d¡en-4-¡l)ox¡)-2,3-d¡met¡l-1,4,7-tr¡oxo-8-(p¡per¡d¡n-4-¡l)-11,14-d¡oxa-3,8-d¡azaheptadecan-17-o¡co (RED-197).
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió RED-196 (31 mg, 0,027 mmoles) y diclorometano (1 ml). La disolución se enfrió hasta 0 °C y se añadió tetracloruro de estaño (IV) (disolución 1,0 M en diclorometano, 0,3 ml, 0,3 mmoles). La mezcla de reacción se agitó durante 1 h a 0 °C. La mezcla de reacción se purificó directamente por cromatografía ultrarrápida C18 (eluir 5-100 % de MeCN/agua) dando 16 mg (60 %) de RED-197 como un sólido blanco (16 mg, 60 % de rendimiento).
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C4sH71ClN5O15992,5; hallado 992,6.
Ác¡do (2S)-8-(1-(3-(2-((2-(((9H-fluoren-9-¡l)metox¡)carbon¡l)-1,2-d¡met¡lh¡draz¡n¡l)met¡l)-1H-¡ndol-1-¡l)propano¡l)p¡per¡d¡n-4-¡l)-1-(((14S,16S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-cloro-14-h¡drox¡-85,14-d¡metox¡-33,2,7,10-tetramet¡l-12,6-d¡oxo-7-aza-1(6,4)-oxaz¡nana-3(2,3)-ox¡rana-8(1,3)-bencenac¡clotetradecafano-10,12-d¡en-4-¡l)ox¡)-2,3-d¡met¡l-1,4,7-tr¡oxo-11,14-d¡oxa-3,8-d¡azaheptadecan-17-o¡co (RED-198).
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió RED-197 (16 mg, 0,016 mmoles), 1,2-dimetil-2-((1-(3-oxo-3-(perfluorofenoxi)propil)-1H-indol-2-il)metil)hidracina-1-carboxilato de (9H-fluoren-9-il)metilo (12) (13 mg, 0,02 mmoles), DIPEA (8 pl, 0,05 mmoles) y DMF (1 ml). La disolución se agitó durante 18 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se purificó directamente por cromatografía ultrarrápida C18 (eluir 5- 100 % de MeCN/agua) dando 18 mg (77 %) de RED-198 como un sólido blanco.
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C77Hg8ClN8O181457,7; hallado 1457,9.
Ác¡do (2S)-1 -(((14S,16S33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-cloro-14-h¡drox¡-85,14-d¡metox¡-33,2,7,10-tetramet¡l-12,6-d¡oxo-7-aza-1(6,4)-oxaz¡nana-3(2,3)-ox¡rana-8(1,3)-bencenac¡clotetradecafano-10,12-d¡en-4-¡l)ox¡)-8-(1-(3-(2-((1,2-d¡met¡lh¡draz¡n¡l)met¡l)-1H-¡ndol-1-¡l)propano¡l)p¡per¡d¡n-4-¡l)-2,3-d¡met¡l-1,4,7-tr¡oxo-11,14-d¡oxa-3,8-d¡azaheptadecan-17-o¡co (Re D-106).
A un vial de centelleo secado que contenía una barra de agitación magnética se añadió RED-197 (18 mg, 0,012 mmoles), piperidina (20 pl, 0,02 mmoles) y DMF (1 ml). La disolución se agitó durante 20 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se purificó directamente por cromatografía ultrarrápida C18 (eluir 1-60 % de MeCN/agua) dando 15 mg (98 %) del compuesto RED-106 como un sólido blanco.
MS (ESI) m/z: [M+H]+ Calculado para C62H88ClN8O161235,6; hallado 1236,0.
Resultados y discusión
Producción y caracterización inicial de ADC anti-CD22
El anticuerpo anti-CD22 que se usó (CAT-02) fue una variante humanizada del anticuerpo RFB4. El anticuerpo anti-CD22 marcado en el extremo carboxi se preparó usando una estirpe celular clonal GPEx® con títulos de biorreactor de 1,6 g/l y 97 % de conversión de cisteína en formilglicina. Se sintetizó la carga activa de conector de HIPS-4AP-maitansina (descrito anteriormente) y se conjugó con el anticuerpo marcado con aldehído. El ADC resultante se caracterizó (FIG. 11) por cromatografía de exclusión por tamaño para evaluar el porcentaje de monómero (99,2 %), y por interacción hidrófoba (HIC) y cromatografía de fase inversa (PLRP) para evaluar la relación entre el fármaco y el anticuerpo (DAR), que fue 1,8. El ADC se comparó con el anticuerpo anti-CD22 no mutante (sin marcar) en términos de afinidad por la proteína CD22 humana e internalización en células CD22+ usando un método basado en ELISA (FIG. 12) y un método basado en citometría de flujo (FIG. 13), respectivamente. Para ambas medidas funcionales, el ADC rindió igualmente de bien que el anticuerpo no mutante, que indica que la conjugación no tuvo efecto sobre estos parámetros.
El ADC anti-CD22 no fue un sustrato para MDR1 y no promueve la destrucción inespecífica o por vecindad
Se probó la potencia del ADC anti-CD22 in vitro contra las estirpes celulares Ramos y WSU-DLCL2 de tumor HNL. La actividad se comparó con la de la maitansina libre y un ADC relacionado preparado con el anticuerpo anti-CD22 CAT-02 conjugado con maitansina mediante un conector dipeptídico escindible de valina-citrulina. Ambos ADC mostraron actividad subnanomolar contra células no mutantes Ramos y WSU-DLCL2 (FIG. 14, panel A y panel C). En las variantes de las células manipuladas para expresar la bomba de expulsión xenobiótica, MDR1, solo el ADC anti-CD22 de la presente divulgación retuvo su potencia original (FIG. 14, panel B y panel D). Por el contrario, la maitansina libre fue ~ 10 veces menos eficaz, y el ADC que lleva maitansina escindible careció esencialmente de actividad. En un experimento de control, el cotratamiento de células WSU-DLCL2 con ciclosporina, un inhibidor de MDR1, no tuvo efecto sobre las células no mutantes, pero restauró la potencia original de maitansina libre y el ADC escindible en células MDR1+ (FIG. 14, panel E y panel F). Juntos, estos resultados indicaron que el metabolito activo del ADC anti-CD22 de la presente divulgación no era un sustrato para la expulsión de MDR1. En estudios de citotoxicidad in vitro relacionados, el ADC anti-CD22 de la presente divulgación no tuvo efecto sobre la estirpe celular negativa para el antígeno, NCI-N87 (FIG. 15), que indica que no tuvo actividad inespecífica durante un periodo de cultivo celular de 5 días. Además, un ADC basado en anti-HER2 conjugado con la carga activa de conector de HIPS-4AP-maitansina no medió en la destrucción por vecindad de células negativas para el antígeno en cocultivo con células positivas para el antígeno (FIG. 16), lo que implica que el metabolito activo del ADC anti-CD22 de la presente divulgación, que sería el mismo que el del conjugado ADC de anti-HER2, tampoco mediaría en la destrucción por vecindad.
El ADC anti-CD22 fue eficaz contra modelos de xenoinjerto de NHL
Se evaluó la eficacia in vivo del ADC anti-CD22 frente a los modelos de xenoinjerto WSU-DLCL2 y Ramos (FIG. 17), que expresaron cantidades relativamente más altas y más bajas de CD22, respectivamente (FIG. 18). En un estudio de dosis única, se administraron ratones que tenían tumores WSU-DLCL2 con 10 mg/kg del ADC anti-CD22 o un control de vehículo. La administración se inició cuando los tumores promediaron 118 mm3. De los animales que recibieron el ADC, el 25 % (2 de 8) tuvieron una respuesta parcial, con tumores que habían remitido hasta 4 mm3 en el día 31. Los grupos tratados con el ADC anti-CD22 y de control de vehículo tuvieron volúmenes de tumor medios de 415 y 1783 mm3, respectivamente, en el día 31. A continuación, en un estudio de dosis múltiples, los ratones que tenían xenoinjertos de WSU-DLCL2 se trataron con 10 mg/kg del ADC anti-CD22 o un control de vehículo cada cuatro días durante un total de cuatro dosis. La administración se inició cuando los tumores promediaron 262 mm3. De los animales que recibieron el ADC, el 75 % (6 de 8) mostraron una respuesta completa, siendo el 38 % de estas (3 de 8) duraderas hasta el final del estudio (día 59), 43 días después de la última dosis. Por el contrario, el grupo de control de vehículo alcanzó un volumen medio del tumor de 2191 mm3 en el día 17. Finalmente, en un estudio de dosis múltiples, los ratones que tenían xenoinjertos de Ramos se trataron con o 5 o 10 mg/kg del ADC anti-CD22 o un control de vehículo cada cuatro días durante un total de cuatro dosis. La administración se inició cuando los tumores promediaron 246 mm3. Como se anticipó, se observó un efecto de la dosis con los grupos que recibieron la dosis de 5 o 10 mg/kg, lo que mostró un retraso del crecimiento tumoral del 63 % o 87 %, respectivamente. En concreto, la mediana de los tiempos hasta el punto final fueron 12, 19 y 22 días para los grupos de control de vehículo, de dosis de 5 y 10 mg/kg, respectivamente. En los tres estudios, no se observó efecto sobre el peso corporal de ratón en los grupos de administración de ADC anti-CD22 (FIG. 19).
El ADC anti-CD22 fue bien tolerado a hasta 60 mg/kg en ratas y macacos cangrejeros
El ADC anti-CD22 no se unió a CD22 de roedor, sin embargo, la administración del ADC en estos animales proporcionó información relacionada con la toxicidad inespecífica y la seguridad de la carga activa de conector. Como se ha mencionado anteriormente, en estudios de xenoinjerto de ratón, no se observó efecto de la administración sobre el peso corporal ni las observaciones clínicas. En un estudio exploratorio de toxicidad en ratas (FIG. 20), los animales (5 por grupo) se administraron con una dosis intravenosa única del ADC anti-CD22 de 6, 20, 40 o 60 mg/kg y se observaron durante 12 días después de la administración. Todos los animales sobrevivieron hasta el final del estudio. Los animales administrados con 60 mg/kg experimentaron una disminución del 10 % en peso corporal con respecto al grupo de control de vehículo. Los cambios en la bioquímica clínica compatibles con la lesión hepatobiliar de mínima a leve ocurrieron en el día 5 en animales administrados con >40 mg/kg e incluyeron elevadas actividades de alanina aminotransferasa (ALT), aspartato transaminasa (AST) y fosfatasa alcalina (ALP). La mayoría de los cambios se habían invertido en el día 12. Con respecto a la hematología, números de plaquetas de moderadamente a notablemente reducidos ocurrieron en el día 5 en animales administrados con >40 mg/kg y se habían invertido completamente en el día 12. Los cambios compatibles con la inflamación ocurrieron en los días 5 y 12 en animales administrados con >40 mg/kg e incluyeron recuentos de neutrófilos y monocitos de ligeramente a moderadamente elevados, concentraciones de globulina ligeramente elevadas y reducida relación albúmina:globulina.
El ADC anti-CD22 se unió a CD22 de macaco cangrejero (FIG. 21) y tuvo un perfil de reactividad cruzada en tejido similar en monos en comparación con seres humanos (FIG. 22). Por lo tanto, los macacos cangrejeros representaron un modelo apropiado en el que probar tanto las toxicidades específicas como inespecíficas de este ADC. En un estudio exploratorio de dosis repetidas, los monos (2/sexo/grupo) se administraron con 10, 30 o 60 mg/kg del ADC anti-CD22 una vez cada tres semanas para un total de dos dosis, seguido por un periodo de observación de 21 días. Todos los animales sobrevivieron hasta la terminación del estudio. No hubo cambios relacionados con ADC anti-CD22 en las observaciones clínicas, pesos corporales ni el consumo de alimentos. Los cambios en la patología clínica ocurrieron principalmente en animales administrados con >30 mg/kg, y estuvieron de acuerdo con lesión hepática mínima, elevado consumo y/o secuestro de plaquetas, e inflamación (FIG. 23). Estos cambios fueron similares a 30 y 60 mg/kg y después de la primera y segunda dosis, y fueron de una magnitud que no se cabría esperar que se asociara con cambios microscópicos o efectos clínicos. Los cambios compatibles con la lesión hepática mínima en animales administrados con >30 mg/kg consistieron en elevadas actividades de ALT, AST y ALP que se habían invertido parcialmente en los días 21 y 42. Los números de plaquetas de ligeramente a moderadamente reducidos observados en una semana desde la administración se habían invertido principalmente en los días 21 y 42. Los cambios compatibles con la inflamación consistieron en recuentos de neutrófilos y monocitos de mínimamente a moderadamente elevados, concentraciones de globulina de ligeramente a moderadamente elevados y concentraciones de albúmina mínimamente reducidas.
La administración del ADC anti-CD22 condujo a la reducción de linfocitos B en macacos cangrejeros
Para evaluar los efectos farmacodinámicos del ADC anti-CD22 en una especie de forma cruzada, se monitorizaron poblaciones de células mononucleares de sangre periférica en muestras tomadas de macacos cangrejeros reclutados en el estudio de toxicidad de dosis repetidas. En concreto, se usó citometría de flujo para detectar la relación de linfocitos B (CD20+), linfocitos T (CD3+) y linfocitos NK (CD20-/CD3-) observados en animales antes de la dosis y en los días 7, 14, 28 y 35 (Figura 5). En animales tratados con ADC anti-CD22 antes de la dosis, los linfocitos B incluyeron un promedio del 11,6 % de linfocitos totales; este valor disminuyó hasta un promedio del 3,8 % en el día 35, lo que representa una disminución promedio del 68 % en las poblaciones de linfocitos B medidos con respecto a los niveles basales (FIG. 24). La reducción de linfocitos B fue similar en todos los grupos de administración, desde 10 hasta 60 mg/kg, que indica que la dosis más baja fue suficiente para obtener el efecto. Mientras tanto, los linfocitos B en animales tratados con control de vehículo, y los linfocitos T y los linfocitos NK (no mostrados) en todos los grupos, permanecieron en gran medida invariables durante el transcurso del tratamiento. Los resultados indicaron que el ADC anti-CD22 fue capaz de mediar selectivamente en la reducción de las células CD22+ de macaco cangrejero in vivo sin que condujera a toxicidades inespecíficas adversas.
Farmacocinética y toxicocinética del ADC anti-CD22 en ratones, ratas y macacos cangrejeros
Para evaluar la estabilidad in vivo del ADC anti-CD22, se realizó un estudio farmacocinético (FC) en ratas. Se monitorizaron las concentraciones de anticuerpo total, ADC total y conjugado total en la sangre periférica de los animales (3/grupo) durante 21 días después de recibir una dosis única de 3 mg/kg del ADC anti-CD22 (Tabla 2 y FIG. 25). Como se muestra en la FIG. 10, los ensayos de ADC total y de conjugado total emplearon mediciones sensibles a DAR e insensibles a DAR, respectivamente. Los parámetros FC obtenidos para los tres analitos fueron similares, que indica que el conjugado fue muy estable en circulación. Por ejemplo, las semividas de eliminación de anticuerpo total, ADC total y conjugado total fueron 9,48, 6,13 y 7,22 días, respectivamente.
A continuación, se midieron las concentraciones de analito ADC anti-CD22 con el tiempo en la sangre periférica de ratones del estudio de eficacia de dosis múltiples de Ramos descrito anteriormente. El fin de este análisis era determinar el nivel de exposición del ADC total lograda en una dosis eficaz en estudios de xenoinjerto (FIG. 26). Para este punto de referencia, recordar que 10 mg/kg x 4 dosis durante 22 días condujo a un retraso del crecimiento tumoral del 87 % en el modelo Ramos, y que 10 mg/kg x 4 dosis durante 28 días condujo al 75 % de los animales que presentaban una respuesta completa (quedando tumor no palpable) en el modelo WSU-DLCL2. El área media bajo la curva de concentración frente al tiempo desde tiempo 0 hasta el infinito (ABCü-inf) para 10 mg/kg x 4 dosis en el ratón fue 2530 ± 131 (D.E.) día •pg/ml.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado que incluye al menos un resto de aminoácido modificado con una cadena lateral de la fórmula (I):
Figure imgf000130_0001
en donde
W2 es un anticuerpo anti-CD22.
2. El conjugado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-CD22 se une a un epítope dentro de los aminoácidos 1 a 846, dentro de los aminoácidos 1-759, dentro de los aminoácidos 1-751, o dentro de los aminoácidos 1-670, de una secuencia de aminoácidos de CD22 representada en la FIG. 8A-8C.
3. El conjugado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-CD22 comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1 (FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina;
Z30 es un aminoácido básico o un aminoácido alifático;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, con la condición de que cuando la secuencia esté en el extremo N del conjugado, X1 esté presente; y
X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido,
preferentemente en donde
a) la secuencia es L(FGly')TPSR, o
b) en donde
Z30 se selecciona de R, K, H, A, G, L, V, I y P;
X1 se selecciona de L, M, S y V; y
X2 y X3 se seleccionan cada uno independientemente de S, T, A, V, G y C.
4. El conjugado de la reivindicación 1, en donde el resto de aminoácido modificado está situado en un extremo C de una región constante de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD22,
preferentemente en donde la región constante de la cadena pesada comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1 (FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina;
Z30 es un aminoácido básico o un aminoácido alifático;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, con la condición de que cuando la secuencia esté en el extremo N del conjugado, X1 esté presente; y
X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido, y
en donde la secuencia es carboxiterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos SLSLSPG,
más preferentemente en donde o
a) la región constante de la cadena pesada comprende la secuencia SPGSL(FGly')TPSRGS, o
b) en donde
Z30 se selecciona de R, K, H, A, G, L, V, I y P;
X1 se selecciona de L, M, S y V; y
X2 y X3 se seleccionan cada uno independientemente de S, T, A, V, G y C.
5. El conjugado de la reivindicación 1, en donde el resto de aminoácido modificado está situado en una región constante de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD22,
preferentemente en donde la región constante de la cadena ligera comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1(FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina;
Z30 es un aminoácido básico o un aminoácido alifático;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, con la condición de que cuando la secuencia esté en el extremo N del conjugado, X1 esté presente; y
X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido, y
en donde la secuencia es carboxiterminal con respecto a la secuencia KVDNAL, y/o es aminoterminal con respecto a la secuencia QSGNSQ,
más preferentemente en donde o
a) la región constante de la cadena ligera comprende la secuencia KVDNAL(FGly')TPSRQSGNSQ, o b) en donde
Z30 se selecciona de R, K, H, A, G, L, V, I y P;
X1 se selecciona de L, M, S y V; y
X2 y X3 se seleccionan cada uno independientemente de S, T, A, V, G y C.
6. El conjugado de la reivindicación 1, en donde el resto de aminoácido modificado está situado en una región CH1 de cadena pesada del anticuerpo anti-CD22,
preferentemente en donde la región CH1 de cadena pesada comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1(FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina;
Z30 es un aminoácido básico o un aminoácido alifático;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, con la condición de que cuando la secuencia esté en el extremo N del conjugado, X1 esté presente; y
X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido, y
en donde la secuencia es carboxiterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos SWNSGA y/o es aminoterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos GVHTFP,
más preferentemente en donde o
a) la región CH1 de cadena pesada comprende la secuencia SWNSGAL(FGly')TPSRGVHTFP, o
b) en donde
Z30 se selecciona de R, K, H, A, G, L, V, I y P;
X1 se selecciona de L, M, S y V; y
X2 y X3 se seleccionan cada uno independientemente de S, T, A, V, G y C.
7. El conjugado de la reivindicación 1, en donde el resto de aminoácido modificado está
a) situado en una región CH2 de cadena pesada del anticuerpo anti-CD22, o
b) situado en una región CH3 de cadena pesada del anticuerpo anti-CD22.
8. Una composición farmacéutica que comprende:
un conjugado de cualquiera de cualquier reivindicación precedente; y
un excipiente farmacéuticamente aceptable.
9. Un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composición farmacéutica según la reivindicación 8 para su uso en el tratamiento del cáncer.
10. El conjugado de la reivindicación 4, en donde el resto de aminoácido modificado está situado en un extremo C de una región CH3 de cadena pesada del anticuerpo anti-CD22,
preferentemente en donde la región CH3 de cadena pesada comprende una secuencia de la fórmula (II):
X1(FGly')X2Z20X3Z30 (II)
en donde
FGly' es el resto de aminoácido modificado de la fórmula (I);
Z20 es cualquiera de un resto de prolina o de alanina;
Z30 es un aminoácido básico o un aminoácido alifático;
X1 puede estar presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, con la condición de que cuando la secuencia esté en el extremo N del conjugado, X1 esté presente; y
X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido, y
en donde la secuencia es carboxiterminal con respecto a la secuencia de aminoácidos SLSLSPG,
más preferentemente en donde o
a) la región CH3 de cadena pesada comprende la secuencia SPGSL(FGly')TPSRGS, o
b) en donde
Z30 se selecciona de R, K, H, A, G, L, V, I y P;
X1 se selecciona de L, M, S y V; y
X2 y X3 se seleccionan cada uno independientemente de S, T, A, V, G y C.
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