KR100870353B1 - 항-ｖｅｇｆ 항체 - Google Patents

항-ｖｅｇｆ 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR100870353B1
KR100870353B1 KR1020077027779A KR20077027779A KR100870353B1 KR 100870353 B1 KR100870353 B1 KR 100870353B1 KR 1020077027779 A KR1020077027779 A KR 1020077027779A KR 20077027779 A KR20077027779 A KR 20077027779A KR 100870353 B1 KR100870353 B1 KR 100870353B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
vegf
seq
antibodies
human
Prior art date
Application number
KR1020077027779A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080003453A (ko
Inventor
마뉴얼 배카
제임스 에이. 웰스
레너드 지. 프레스타
헨리 비. 로우만
이본 만-예 쳉
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27125626&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR100870353(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/908,469 external-priority patent/US6884879B1/en
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Priority claimed from KR1019997009194A external-priority patent/KR100794454B1/ko
Publication of KR20080003453A publication Critical patent/KR20080003453A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100870353B1 publication Critical patent/KR100870353B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Air Bags (AREA)
  • Steering Control In Accordance With Driving Conditions (AREA)

Abstract

인간화 및 변이 항-VEGF 항체 및 그의 각종 용도가 개시되어 있다. 항-VEGF 항체는 VEGF에 대해 강한 결합 친화도를 가지며, 시험관내 내피 세포의 VEGF 유도 증식을 억제하며 생체내 종양 성장을 억제한다.
인간화 항-VEGF 항체, 변이체, 내피 세포, VEGF 유도 증식, 종양, 혈관형성

Description

항-ＶＥＧＦ 항체 {Anti-VEGF Antibodies}
본 발명은 일반적으로 항-VEGF 항체, 특히 인간화 항-VEGF 항체 및 변이 항-VEGF 항체에 관한 것이다.
현재, 혈관형성은 각종 질병의 발병과 관련되는 것으로 잘 알려져있다. 이들에는 고형 종양, 안내 신혈관 증상, 예를 들어 증식성 망막증 또는 노화 관련 황반 변성(AMD), 루마티스성 관절염, 및 건선 (Folkman 등, J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun 등, Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); 및 Garner A., Vascular disease, In: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach, Garner A, Klintworth GK, Eds. 2nd Edition Marcel Dekker, NY, pp 1625-1710 (1994)). 고형 종양의 경우에서, 신혈관생성으로 종양 세포는 정상 세포에 비해 성장 이점 및 증식 자발성을 얻게 된다. 따라서, 종양 부분에서의 미세혈관의 밀도 및 폐암 뿐만 아니라 몇몇 다른 종양에서의 환자 생존율 사이에 상관성이 관찰된다 (Weidner 등, N. Engl J Med 324:1-6 (1991); Horak 등 Lancet 340:1120-1124 (1992); 및 Macchiarini 등 Lancet 340:145-146 (1992)).
혈관형성의 양성 조절자에 대한 연구는 aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-β, 앤지오제닌, IL-8 등을 포함하는 많은 후보를 생산하였다 (Folkman 등, 및 Klagsbrun 등). 확인된 음성 조절자로는 트롬보스폰딘 (Good 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6624-6628 (1990)), 16-킬로달톤의 프로락틴의 N-말단 단편 (Clapp 등, Endocrinology, 133:1292-1299 (1993)), 앤지오스타틴 (O'Reilly 등, Cell, 79:315-328 (1994)) 및 엔도스타틴 (O'Reilly 등, Cell. 88:277-285 (1996)).
지난 수년간 행해진 연구는 정상 및 비정상 혈관형성의 조절에서 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 중요한 역할을 확립하였다 (Ferrara 등, Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)). 단일 VEGF 대립 유전자의 손실은 배아에 치명적이라는 발견은 혈관계의 발생 및 분화에서 이 인자에 의해 역할되는 대체불가능한 역할을 지적하고 있다 (Ferrara 등). 더욱이, VEGF는 종양 및 안내 질병과 관련된 신혈관생성의 중요한 매개자인 것으로 알려졌다 (Ferrara 등). VEGF mRNA는 조사된 대다수 사람의 종양에 의해 과발현된다 (Berkman 등, J Clin Invest 91: 153-159 (1993); Brown 등, Human Pathol. 26:86-91 (1995)); Brown 등, Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern 등, Brit. J. Cancer 73:931-934 (1996): 및 Dvorak 등, Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)). 또한, 눈의 유체에서의 VEGF의 농도는 당뇨병 및 다른 허혈 관련 망막증을 갖는 환자에 있어서 혈관의 능동적 증식의 존재와 매우 관련된다 (Aiello 등, N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)). 더욱이, 최근의 연구는 AMD에 의해 영향을 받는 맥락막의 신혈관 막에서의 VEGF의 위치화를 입증하였다 (Lopez 등, Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)). 항-VEGF 중화 항체 는 누드 마우스에 있어서 각종 사람의 종양 세포주의 성장을 억제하고 (Kim 등, Nature 362:841-844 (1993); Warren 등, J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstroem 등, Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); 및 Melnyk 등, Cancer Res. 56:921-924 (1996)), 또한 허혈성 망막 질병의 모델에 있어서 안내 혈관형성을 억제한다 (Adamis 등, Arch. Ophtalmol. 114:66-71 (1996)). 인간화 항체에 대해서는 문헌 [Bending, Methods: Comp. Meth. Enzy., 8: 83-93 (1995)]에 기재되어 있다. 따라서, 항-VEGF 모노클론 항체 또는 VEGF 작용의 다른 억제제는 고형 종양 및 각종 안내 신혈관 질명의 치료를 위한 후보로 기대된다.
<발명의 요약>
본 출원은 VEGF에 대한 강한 결합 친화도, 시험관내 내피 세포의 VEGF 유도 증식을 억제하는 능력, 및 생체내 VEGF 유도 혈관형성을 억제하는 능력을 포함하는, 치료적 전망으로부터 바람직한 특성을 갖는 치료적 인간화 항-VEGF 항체 및 항-VEGF 항체 변이체를 기재하고 있다.
본 명세서에서 바람직한 인간화 항-VEGF 항체 또는 변이 항-VEGF 항체는 Kd 값이 약 1 x 10-8 M 이하이고, 바람직하게는 약 5 x 10-9 M 이하로 사람의 VEGF와 결합한다. 또한, 인간화 또는 변이 항-VEGF 항체는 시험관내 내피 세포의 VEGF 유도 증식을 억제하기 위한 ED50 값이 약 5 nM 이하일 수 있다. 본 명세서에서 특별히 중요한 인간화 또는 변이 항-VEGF 항체는 항체 투여량 5 ㎎/㎏에서 생체내 종양 모델에 있어서 A673에서 종양 성장을 약 50 % 이상 억제하는 것이다.
한 실시태양에서, 항-VEGF 항체는, 중쇄 가변 도메인이 아미노산 서열: CDRH1 (GYX1FTX2YGMN (식중, X1은 T 또는 D이고, X2는 N 또는 H임): 서열 128), CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; 서열 2) 및 CDRH3 (YPX1YYGX2SHWYFDV (식중, X1은 Y 또는 H이고, X2는 S 또는 T임); 서열 129)을 갖는 초가변 영역을 포함하는, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 CDRH1 (GYTFTNYGMN; 서열 1), CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; 서열 2) 및 CDRH3 (YPHYYGSSHWYFDV; 서열 3)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 3개의 중쇄 초가변 영역은 사람의 프레임워크 영역에서, 예를 들어 화학식: FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4로 나타내어지는 인접 서열로서 제공된다.
또한, 본 발명은 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX1FTX2YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX3YYGX4SHWYFDVWGQGTLVTVSS (서열 125) (식중, X1은 T 또는 D이고, X2는 N 또는 H이며, X3은 Y 또는 H이며, X4는 S 또는 T임)을 포함하는 항-VEGF 항체 중쇄 가변 도메인을 제공한다. 하나의 특히 유용한 중쇄 가변 도메인 서열은 실시예 1의 F(ab)-12 인간화 항체의 서열이고, 서열 7의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 이러한 바람직한 중쇄 가변 도메인 서열은 하기의 바람직한 경쇄 가변 도메인 서열 또는 다른 경쇄 가변 도메인 서열과 함께 조합될 수 있고, 이렇게 제조된 항체는 사람 VEGF와 결합한다.
또한, 본 발명은 상기한 중쇄 가변 도메인 서열 또는 다른 중쇄 가변 도메인 서열과 조합될 수 있는 바람직한 경쇄 가변 도메인 서열을 제공하며, 이렇게 제조된 항체는 사람 VEGF에 결합하는 능력을 보유한다. 예를 들어, 경쇄 가변 도메인은 아미노산 서열: CDRL1 (SASQDISNYLN; 서열 4), CDRL2 (FTSSLHS; 서열 5) 및 CDRL3 (QQYSTVPWT; 서열 6)을 갖는 초가변 영역을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 3개의 경쇄 초가변 영역은 사람의 프레임워크 영역에서, 예를 들어 화학식: FR1- CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4로 나타내어지는 인접 서열로서 제공된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 아미노산 서열:
DIQX1TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (서열 124) (식중, X1은 M 또는 L임)을 포함하는 인간화 항-VEGF 항체 경쇄 가변 도메인을 제공한다. 하나의 특히 유용한 경쇄 가변 도메인 서열은 실시예 1의 F(ab)-12 인간화 항체의 서열이고, 서열 8의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 항-VEGF 모항체의 변이체 (모항체는 바람직하게는 인간화 또는 사람의 항-VEGF 항체임)을 제공하고, 여기서 변이체는 사람의 VEGF와 결합하고, 항-VEGF 모항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 초가변 영역에서 아미노산 치환을 포함한다. 변이체는 바람직하게는 항-VEGF 항체의 하나 이상의 초가변 영역에서 하나 이상의 치환(들)을 갖는다. 바람직하게는, 치환(들)은 모항체의 중쇄 가변 도메인에 있다. 예를 들어, 아미노산 치환(들)은 중쇄 가변 도메인의 CDRH1 및(또는) CDRH3에 있을 수 있다. 바람직하게는, 치환은 이들 초가변 영역 둘다에 있을 수 있다. 본 명세서에서 이러한 "친화도 숙성된" 변이체는 이들을 생성시킨 항-VEGF 모항체 보다 강하게 사람의 VEGF에 결합하는 것으로 입증되며, 즉 이들은 Kd 값이 항-VEGF 모항체의 것보다 상당히 작다. 바람직하게는, 변이체는 시험관내 내피 세포의 VEGF 유도 증식을 억제하기 위한 ED50 값이 항-VEGF 모항체의 것보다 약 10배 이상 작고, 바람직하게는 약 20배 이상 작고, 가장 바람직하게는 약 50배 이상 작다. 하나의 특히 바람직한 변이체는 실시예 3의 Y0317 변이체이고, 이것은 아미노산 서열: GYDFTHYGMN (서열 126)을 포함하는 CDRH1 및 아미노산 서열: YPYYYGTSHWYFDV (서열 127)를 포함하는 CDRH3을 갖는다. 이들 초가변 영역 및 CDRH2는 일반적으로 예를 들어, 서열 116의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 생성하는, 사람의 프레임워크 영역으로 제공된다. 이러한 중쇄 가변 도메인 서열은 임의로 서열 124의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 바람직하게는 서열 115의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열과 조합된다.
본 명세서에서는 각종 형태의 항체가 고려된다. 예를 들어, 항-VEGF 항체는 전체 길이의 항체 (예를 들어, 본래의 사람의 Fc 영역을 가짐) 또는 항체 단편 (예를 들어 Fab, Fab' 또는 F(ab'2))일 수 있다. 더욱이, 항체는 고상상에 고정되거나(되고) 이종 화합물 (예를 들어, 세포독성제)로 공액된, 검출가능한 표지로 표식될 수 있다.
항체를 위한 진단 및 치료 용도가 고려된다. 한 진단 응용에서, 본 발명은 VEGF 단백질을 함유한 것으로 의심되는 시료를 항-VEGF 항체에 노출시키고 시료에 대한 항체의 결합을 측정하는 것을 포함하는 VEGF 단백질의 존재를 측정하기 위한 방법을 제공한다. 이 용도를 위해, 본 발명은 VEGF 단백질을 검출하기 위해 항체를 사용하기 위한 항체 및 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 항체를 코딩하는 단리된 핵산; 벡터로 형질변형된 숙주 세포에 의해 인식되는 서열을 조절하기 위해 임의로 작동가능하게 연결되는 핵산을 포 함하는 벡터; 그 벡터를 포함하는 숙주 세포; 핵산이 발현되도록 숙주 세포를 배양하고 임의로 항체를 숙주 세포 배양물로부터 (예를 들어, 숙주 세포 배양 배지로부터) 회수하는 것을 포함하는 항체 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항-VEGF 항체 및 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 치료적 용도를 위한 조성물은 멸균되고 동결건조될 수 있다. 또한, 본 발명은 치료상 유효량의 항-VEGF 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 또는 망막 질병으로부터 고통받는 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다.
I. 정의
본 명세서에서 사용되는 "인간 VEGF"란 용어는 문헌 [Leung 등, Science 246:1306 (1989) 및 Houck 등, Mol. Endocrin. 5:1806 (1991)]에서 기재되어 있는 바와 같이, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련 121-, 189- 및 206-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자 뿐만 아니라 천연의 이런 성장 인자의 대립형질 형태 및 변화된 형태를 함께 의미한다.
본 발명은 VEGF의 하나 이상의 생물학적 활성, 예를 들어 유사분열 또는 혈관형성 활성을 억제할 수 있는 항-VEGF 길항성 항체를 제공한다. VEGF의 길항제는 세포 수용체에 VEGF의 결합을 방해함으로써, VEGF에 의해 활성화된 세포를 무능력하게 하거나 사멸시킴으로써, 또는 세포 수용체에 VEGF를 결합시킨 후 혈관 내피 세포 활성화를 방해함으로써 작용한다. VEGF 길항제가 개입되는 모든 곳은 본 발명의 목적을 위한 것과 등가물로 고려될 것이다.
본 명세서에서 사용된 "VEGF 수용체" 또는 "VEGFr"이란 용어는 VEGF에 대한 세포 수용체, 통상, 혈관 내피 세포에서 발견되는 세포-표면 수용체 및 hVEGF를 결합시키는 능력을 보유하는 그의 변이체를 의미한다. VEGF 수용체의 한 예로는 fms형 티로신 키나제 (flt)인 티로신 키나제류에 있는 트랜스멤브레인 수용체가 있다 [DeVries 등, Science 255:989 (1992); Shibuya 등, Oncogene 5; 519 (1990)]. flt 수용체는 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 및 티로신 키나제 활성을 갖는 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 VEGF의 결합과 관련이 있는 반면, 세포내 도메인은 신호 변환과 관련이 있다. VEGF 수용체의 또다른 예로는 flk-1 수용체 (KDR이라고도 함)가 있다 [Matthews 등, Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Terman 등, Oncogene 6:1677 (1991); Terman 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579 (1992)]. flt 수용체에 대한 VEGF의 결합은 겉보기 분자량 205,000 내지 300,000 달톤을 갖는, 2개 이상의 고분자량 복합체를 형성시킨다. 300,000 달톤의 복합체는 VEGF의 단일 분자에 결합된 두개의 수용체 분자를 포함하는 이량체인 것으로 생각된다.
본 명세서에서 사용되는 "에피토프 A4.6.1"이란 용어는 달리 언급되지 않는다면 문헌 [Kim 등, Growth Factors 7:53 (1992) 및 Kim 등, Nature 362:841 (1993)]에 개시되어 있는 A4.6.1 항체가 결합하는 인간 VEGF의 영역을 말한다.
"치료"란 치료상의 치료와 예방상의 조치를 모두 의미한다. 치료를 필요로하는 사람이란 이미 질병에 걸린 사람 뿐만 아니라 질환을 예방하고자 하는 사람을 포함한다.
치료 대상인 "포유동물"은 인간, 가축과 사육 동물, 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
"항체"(Abs) 및 "면역글로불린"(Igs)은 동일한 구조적 특성을 갖는 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 한편, 면역글로불린은 항원 특이성이 부재한 다른 항체형 분자 및 항체 모두가 포함된다. 면역글로불린의 폴리펩티드는 예를 들어 림프계에 의해서는 낮은 수치로 생산되며, 골수종에 의해서는 증가된 수치로 생산된다.
"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 보통 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 디술파이드 결합에 의해 중쇄와 연결되지만, 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄 중에서 디술파이드 결합의 수는 변한다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디술파이드 브릿지를 갖는다. 각 중쇄는 하나의 말단에 많은 불변 도메인이 연결되는 가변 도메인 (VH)을 갖는다. 각 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (VL)을 다른 말단에는 불변 도메인을 가지며; 경쇄 불변 도메인은 중쇄 제1 불변 도메인과 배열되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인과 배열된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
"가변"이란 용어는 가변 도메인의 특정 부분이 항체간 서열에서 크게 다르 며, 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성으로 사용되는 것을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되어 있지는 않다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 초가변 영역이라 불려지는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 보다 많이 보존된 가변 도메인 부분을 프레임워크 영역 (FR)이라고 부른다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 대개 루프 연결을 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, β-시트 배열을 채택하고, 어떤 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 4가지 FR (FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함한다. 각 사슬 중의 초가변 영역은 FR에 의해 다른 사슬의 초가변 영역과 근접하게 함께 고정되며, 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여를 한다 (문헌 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), pp. 647-669] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합하는데 직접 관여하지는 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은 여러가지 작용기 기능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 "초가변 영역"이란 용어는 항원-결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기에 관한 것이다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"으로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인에서의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인에서의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)), 및(또는) "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인에서의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인에서의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 상기 정의한 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편이라고 부르는 2개의 동일한 항원-결합 단편 (각각은 단일 항원-결합 부위를 가짐) 및 용이하게 결정화시키는 능력을 반영하는 이름인 잔류 "Fc"단편을 생성한다. 펩신 처리에 의해 2개의 항원-결합 부위를 가지며 항원을 여전히 가교할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소의 항체 단편이다. 이 영역은 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유 결합된 이량체로 구성된다. 이 배열에서는 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 VH-VL 이합체의 표면에서 항원-결합 부위를 한정하도록 상호작용한다. 총괄적으로, 6개의 초가변 영역이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 반) 만으로도 완전한 결합 부위보다는 친화도가 낮지만 항원을 인식하여 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄 불변 도메인 및 중쇄 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 1개 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 몇개의 잔기를 첨가하여 Fab 단편과 구별된다. 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 함유하는 Fab'를 본 명세서에서 는 Fab'-SH라고 표현한다. F(ab')2 항체 단편은 원래는 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다.
임의의 척추동물로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파(κ) 및 람다(λ)라고 불려지는, 2개의 분명히 구별되는 형태 중 하나로 지정될 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클라스로 지정될 수 있다. 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 클래스가 있으며, 이들 중 몇몇은 서브클래스(이소타입): 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 세분될 수 있다. 면역글로불린 중 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라고 부른다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 3차원 배열의 하위 단위 구조체는 공지되어 있다.
본 명세서에서의 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 단클론 항체 (전체 길이의 단클론 항체 포함), 다클론 항체, 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다.
"항체 단편"은 전체 길이의 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이 성 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻어지는 항체를 의미하며, 즉 집단을 이루는 개별 항체들은 소량 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일 항원 부위에 대해 유도되는 단클론 항체는 매우 특이적이다. 또한, 전형적으로 상이한 항원 결정군 (determinant) (에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체들을 포함하는 통상의 (다클론) 항체 제제와는 달리, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 항원 결정군에 대해 유도된다. 수식어 "단클론"은 항체의 특성이 항체들의 실질적으로 동종 집단으로부터 얻어지는 것을 나타내며, 임의의 특정 방법으로 항체를 생산하는 것을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌[Kohler 등, Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조할 수 있다. "단클론 항체"는 또한 예를 들어, 문헌[Clackson 등, Nature 352:624-628 (1991); 및 Marks 등, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
본 명세서에서 단클론 항체는 구체적으로, 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 유사하지만, 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 유사한 "키메릭" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라, 목적하는 생물학적 활성을 나 타내는 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
비인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 포함하는 키메릭 항체이다. 대부분, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종 (공여자 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기로 교체된 인간 면역글로불린 (수여자 항체)이다. 몇몇 경우, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 교체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개량시키기 위해 행해질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역이 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 서열의 것인 하나, 전형적으로 2개 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌[Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Reichmann 등, Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조하시오.
"단쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재하는, 항체 의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 더 포함한다 (sFv에 대해서는 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113권, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)]을 참조).
용어 "디아바디"는 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 대합을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여, 도메인을 다른 사슬의 상보적인 도메인과 강제로 대합시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어, 유럽 특허 제404,097호; 국제 특허 출원 공개 제93/11161호; 및 문헌[Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본 출원 전체에서 사용되는 "선형 항체"라는 표현은 문헌[Zapata 등, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]에 기재된 항체를 의미한다. 간략하게, 이들 항체는 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한쌍의 순차(tandem) Fd 세그먼트 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적이거나 단일특이적일 수 있다.
본 명세서에서의 "변이" 항-VEGF 항체란 모항체 서열에 1개 이상의 아미노산 잔기(들)의 첨가, 결실 및(또는) 치환에 의해 "모" 항-VEGF 항체 아미노산 서열과 아미노산 서열이 다른 분자를 말한다. 바람직한 실시태양에서, 변이체는 모항체의 하나 이상의 초가변 영역에 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 예를 들어, 변이체는 모항체의 하나 이상의 초가변 영역에 하나 이상, 예를 들어 약 1 내지 약 10개, 바람직하게는 약 2 내지 약 5개의 치환을 포함할 수 있다. 보통, 변이체는 모항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 서열 (예를 들어, 서열 7 또는 8에서와 같음)과 동일한 아미노산 서열을 75 % 이상, 보다 바람직하게는 80 % 이상, 보다 바람직하게는 85 % 이상, 보다 바람직하게는 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 본 명세서에서는 상기 서열에 대한 동일성 또는 상동성은 서열을 배열하고, 필요한 경우 최대 서열 동일성 비율을 달성하기 위해 갭을 도입한 후에 모항체와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 항체 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결실 또는 삽입 중 그 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 주는 것으로서 간주되지 않는다. 변이체는 인간 VEGF와 결합하는 능력을 보유하며, 바람직하게는 모항체보다 탁월한 특성을 갖는다. 예를 들어, 변이체는 결합 친화도가 보다 강해지며, 내피 세포의 VEGF 유도 증식을 억제하는 능력이 증가되고(거나) 생체내 VEGF 유도 혈관형성을 억제하는 능력이 증가될 수 있다. 항-VEGF 항체의 형식이 본 명세서에 개시된 생물학적 활성 분석에서 그의 활성에 영향을 준다는 것이 밝혀졌기 때문에, 상기 특성을 분석하기 위해서는, 변이체의 Fab형을 모항체의 Fab형과 비교하거나 또는 변이체의 전체 길이 형태를 모항체의 전체 길이 형태와 비교해야 한다. 본 발명에서 관심이 있는 특정 변이 항체는 모항체와 비교할 때 약 10배 이상, 바람직하게는 약 20배 이상, 가장 바람직하게는 약 50배 이상의 생물학적 활성의 증가를 보이는 것이다.
본 명세서에서의 "모"항체는 변이체 제조에 사용된 아미노산 서열에 의해 코딩되는 항체이다. 바람직하게, 모항체는 인간 프레임워크 영역을 가지며, 존재하는 경우 인간 항체 불변 영역을 갖는다. 예를 들어, 모항체는 인간화 또는 인간 항체일 수 있다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리되고(되거나) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 저해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로리(Lowry)법으로 측정할 때 항체의 95 중량% 이상, 가장 바람직하게는 99 중량% 이상으로, (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열결정기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 잔기 이상을 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시(Coomassie) 블루 또는 바람직하게는 은 염색제를 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의한 동질성으로 정제될 것이다. 항체의 천연 환경의 성분이 어느 하나도 존재하지 않으므로, 단리된 항체는 재조합 세포 내에서 동일계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계로 제조된다.
본원에서 사용되는 용어 "태그가 결합된(tagged) 에피토프"는 "에피토프 태그(tag)"에 융합된 항-VEGF 항체를 나타낸다. 에피토프 태그 폴리펩티드는 그에 대한 항체가 제조될 수 있는 에피토프를 제공하기에는 충분한 잔기를 갖지만, VEGF 항체의 활성을 저해하지 않도록 충분히 짧다. 에피토프 태그는 바람직하게는 그에 대한 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차반응하지 않도록 충분히 독특하다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기, 보통 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는 약 9 내지 30개의 잔기)를 갖는다. 그 예로는 flu HA 태그 폴리펩티드와 그의 항체 12CA5 [Field 등, Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 태그와 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan 등, Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)]; 및 허피스 심플렉스(Herpes Simplex) 바이러스 당단백질 D (gD)와 그의 항체 [Paborsky 등, Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)]를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 에피토프 태그는 "샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프"이다. 본원에서 사용되는 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 의미한다.
용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 저해하고(하거나) 세포를 파괴시키는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, I131, I125, Y90 및 Re186), 화학요법제 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 이들의 단편을 포함하는 것으로 의도된다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 탁소테어 (도세탁셀), 부술판, 사이톡신, 탁솔, 메토 트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크레이스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "전구약물"은 모약물에 비해 종양 세포에 대해 세포독성은 더 작지만 효소적으로 활성화되거나 전환되어 보다 활성인 모형태로 될 수 있는 제약학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 나타낸다 [예를 들어, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast (1986); 및 Stella 등, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt 등(ed.), pp.247-267, Humana Press (1985) 참조]. 본 발명의 전구약물은 인산염 함유 전구약물, 티오인산염 함유 전구약물, 황산염 함유 전구약물, 펩티드 함유 전구약물, D-아미노산 변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, β-락탐 함유 전구약물, 임의 치환된 페녹시아세트아미드 함유 전구약물, 또는 임의 치환된 페닐아세트아미드 함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 보다 활성인 세포독성이 없는 약물로 전환될 수 있는 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기한 바와 같은 화학요법제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "표지"는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 자체로 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
"고상"은 본 발명의 항체가 부착할 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포함되는 고상의 예는 부분적으로 또는 전적으로 유리 (예를 들어, 조절된 다공성 유리), 다당류 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 형성된 것을 포함한다. 문맥에 따라 특정 실시태양에서, 고상은 분석판의 웰을 포함할 수 있고; 다른 것에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어, 친화도 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 바와 같은 별개 입자의 비연속 고상을 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어, 본원에 기재된 항-VEGF 항체 및 임의로, 화학요법제)을 포유동물에 전달시키기 위해 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 소낭(vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상 생물학적 막의 지질 배열과 유사한, 2층 구조로 배열된다. "단리된" 핵산 분자는 보통 항체 핵산의 천연 공급원에서 함께 결합되어 있는 하나 이상의 오염물 핵산 분자로부터 동정하고 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태는 아니다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포 내에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 통상 항체를 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하고, 여기에서 예를 들어 핵산 분자는 천연 세포의 핵산 과 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"조절 서열"이라는 표현은 특정한 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA와 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며; 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우 인접하고 리딩 상 내에 존재한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 사용한다.
본원에서 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이라는 표현은 상호교환가능하게 사용되고, 그러한 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 일차 대상 세포 또는 전환의 수와 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한 모든 자손은 고의적 또는 우연적 돌연변이로 인해 DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수 있음이 이해된다. 본래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되는 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도되는 경우 이는 문맥으로부터 명백해 질 것이다.
II. 본 발명의 실시 방법
하기 실시예는 (a) VEGF 항원에 대한 강한 결합 친화도; (b) 시험관내 내피 세포의 VEGF 유도 증식 인자를 억제하는 능력; (c) 생체내 VEGF 유도 혈관형성을 억제하는 능력을 포함하는, 치료상 전망으로부터 바람직한 특성을 가진 인간화 및 변이 항-VEGF 항체의 제조를 설명한다.
항체 친화도는 하기 실시예에 기술되는 바와 같이 결정할 수 있다. 바람직한 인간화 또는 변이 항체는 약 1 x 10-7 M 이하, 바람직하게는 약 1 x 10-8 M 이하, 가장 바람직하게는 약 5 x 10-9 M 이하의 Kd 값으로 인간 VEGF에 결합하는 것이다.
인간 VEGF에 대한 강한 결합 친화도를 가진 항체 이외에도, 치료상 전망으로부터 다른 유익한 특성을 가진 인간화 또는 변이 항체를 선택하는 것도 바람직하다. 예를 들어, 항체는 VEGF에 반응하여 내피 세포 성장을 억제하는 것일 수 있다. 한 실시태양에서, 항체는 VEGF의 거의 최대로 효과적인 농도 (3 ng/ml)에 반응하여 소 모세관 내피 세포 증식을 억제할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 "내피 세포 성장 분석"에서 내피 세포의 VEGF 유도 증식을 억제하기 위하여 즉 항체가 시험관내 VEGF 유도 내피 세포 성장을 50 %까지 억제할 수 있는 농도로 약 5 nM 이하, 바람직하게는 약 1 nM 이하, 가장 바람직하게는 약 0.5 nM 이하의 유효 투여량 50 (ED50) 값을 갖는다. 바람직한 "내피 세포 성장 분석"은 특히 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이 10 % 태송아지 혈청, 2 mM 글루타민 및 항생제를 보충한 저글루코스 둘베코(Dulbecco) 변형 이글(Eagle) 배지 (DMEM)(GIBCO)(성장 배지)의 존재 하에서 소 부신 피질에서 유래한 모세관 내피 세포를 배양하는 것을 포함한다. 이러한 내피 세포는 성장 배지 중에 6웰 플레이트에 웰 당 6 x 103 세포의 밀도로 시딩한다. 이어서 모 항-VEGF 항체 (대조군), 인간화 또는 변이 항-VEGF 항체를 1 내지 5000 ng/㎖ 범위의 농도로 첨가한다. 2-3 시간 후에, 정제된 VEGF를 3 ng/㎖의 최종 농도로 첨가한다. 특이성 대조를 위해, 각각의 항체를 단독으로 또는 2 ng/㎖의 bFGF의 존재 하에 5000 ng/㎖의 농도로 내피 세포에 첨가할 수 있다. 5 또는 6일 후, 세포를 트립신에 노출시켜 분리시키고 콜터 카운터 (Coulter Electronics, 미국 플로리다주 하이알레아)에서 카운트한다. 데이타를 4개 파라미터의 곡선 피팅 프로그램 (KaleidaGraph)으로 분석할 수 있다.
바람직한 인간화 또는 변이 항-VEGF 항체는 생체내 항종양 활성을 갖는 것일 수도 있다. 예를 들어, 항체는 누드 마우스에서 인간 A673 횡문근육종 세포 또는 유방암 MDA-MB-435 세포의 성장을 억제할 수 있다. 생체내 종양 연구를 위하여, 인간 A673 횡문근육종 세포 (ATCC, CRL 1598) 또는 MDA-MB-435 세포 (ATCC로부터 입수 가능함)를 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이 10 % 태송아지 혈청, 2 mM 글루타민 및 항생제를 보충한 DMEM/F12에서 배양한다. 6-10주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스에게 200 ㎕ 부피로 등부위에 2×106개의 종양 세포를 피하 주사한다. 이어 서, 동물을 인간화 또는 변이 항체 및 이 분석에서 활성을 보이지 않는 대조군 항체로 처리한다. 인간화 또는 변이 항-VEGF MAb를 0.5 및(또는) 5 ㎎/㎏의 투여량으로 투여한다. 각 MAb를 종양 세포를 접종한지 24시간 후에 시작하여 매주 2회 100 ㎕의 부피로 복강내 투여한다. 종양 크기를 매주 간격으로 측정한다. 종양 세포를 접종한지 4주후, 동물을 안락사시키고, 종양을 제거하여 칭량한다. 통계적 분석은 ANOVA에 의해 수행할 수 있다. 바람직하게는, "생체내 종양 분석"에서 항체는 5 mg/kg의 투여량으로 약 50 내지 100 %, 바람직하게는 약 70 내지 100 %, 가장 바람직하게는 약 80 내지 100 % 인간 A673 종양 세포 성장을 억제한다.
바람직한 실시태양에서는, 인간화 또는 변이 항체는 인간 환자에게 치료상 유효량의 항체를 투여할 때 면역 반응을 이끌어내지 못한다. 면역 반응이 일어나면, 바람직하게는 항체가 치료된 환자에 치료상 이익을 제공하도록 반응이 일어날 것이다.
인간화 또는 변이 항체는 또한 바람직하게는 인간에서 VEGF 유도 혈관형성, 예를 들어, 인간 종양 성장 및(또는) 망막 질병의 안내 혈관형성을 억제할 수 있는 것이다.
바람직한 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 "에피토프 A4.6.1"에 결합한다. 목적 항체에 의해 결합되는 인간 VEGF 상의 에피토프에 결합하는 항체 (예를 들어, 인간 VEGF에 대한 A4.6.1 항체의 결합을 차단하는 항체)를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상의 교차차단 분석법을 수 행할 수 있다. 별법으로, 문헌[Champe 등, J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)]에 기재된 바와 같은 에피토프 맵핑을 수행하여 항체가 목적 에피토프에 결합하는지를 결정할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 실시태양의 항체는 FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 가지며, "FR1-4"는 4개의 프레임워크 영역을 나타내고, "CDRH1-3"은 항-VEGF 항체 가변 중쇄 영역의 3개의 초가변 영역을 나타낸다. FR1-4는 하기 실시예에서와 같이 "컨센서스 서열" (즉, 인간 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 클래스, 서브클래스 또는 아군의 가장 통상적인 아미노산)로부터 유도될 수 있거나 개인 인간 항체 프레임워크 영역 또는 서로 다른 프레임워크 영역 서열의 조합으로부터 유도될 수 있다. 수많은 인간 항체 프레임워크 영역은 예를 들어 문헌 (Kabat 등, 상기 문헌)에서 소개되어 있다. 바람직한 한 실시태양에서는, 중쇄 가변 FR이 문헌 (Kabat 등, 상기 문헌)에 의하여 소개된 인간 면역글로불린 아군의 컨센서스 서열에 의하여 제공된다. 바람직하게는, 인간 면역글로불린 아군은 인간 중쇄 아군 III (예, 서열 11)이다.
인간 중쇄 가변 FR 서열은 바람직하게는 그 안에 치환을 포함하는데, 예를 들어, 여기서 인간 FR 잔기가 상응하는 비인간 잔기 ("상응하는 비인간 잔기"는 인간 및 비인간 서열이 정렬될 때, 목적 인간 잔기와 동일한 Kabat 잔기 번호를 가진 비인간 잔기를 의미한다)에 의해 치환되지만, 비인간 잔기로의 치환은 필요하지 않다. 예를 들어, 상응하는 비인간 잔기 이외의 치환 FR 잔기는 파지 표시에 의해 선택될 수 있다 (하기 실시예 2 참조). 치환될 수 있는 예시의 중쇄 가변 FR 잔기 는 FR 잔기 번호: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H, 94H (본 명세서에서 사용된 Kabat 잔기 번호) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 이들 잔기중 2 이상 또는 3 이상, 또는 4 이상이 치환된다. 특히 바람직한 FR 치환의 조합은 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H, 및 94H이다.
중쇄 초가변 영역에 대하여, 이들은 바람직하게는 다음과 같은 아미노 서열을 가진다.
CDRH1
GYX1X2X3X4YGX5N (서열 117) (식중, X1은 D, T 또는 E이지만, 바람직하게는 D 또는 T이고, X2는 F, W, 또는 Y이지만, 바람직하게는 F이고, X3은 T, Q, G 또는 S이지만, 바람직하게는 T이고, X4는 H 또는 N이고, X5는 M 또는 I이지만, 바람직하게는 M임).
CDRH2
WINTX1TGEPTYAADFKR (서열 118) (식중, X1은 Y 또는 W이지만, 바람직하게는 Y임).
CDRH3
YPX1YX2X3X4X5HWYFDV (서열 119) (식중, X1은 H 또는 Y이고, X2는 Y, R, K, I, T, E 또는 W이지만, 바람직하게는 Y이고, X3은 G, N, A, D, Q, E, T, K 또는 S이지만, 바람직하게는 G이고, X4는 S, T, K, Q, N, R, A, E 또는 G이지만, 바람직하게는 S 또는 T이고, X5는 S 또는 G이지만, 바람직하게는 S임).
중쇄 가변 도메인은 임의로 FR3 이내에 (부분을 형성하는) 본 명세서에서 "CDR7"으로 명명된 것을 포함하고(도 9B 및 10B 참조), 여기서, CDR7은 다음 아미노산 서열을 가질 수 있다.
CDR7
X1SX2DX3X4X5X6TX7 (서열 120) (식중, X1은 F, I, V, L, 또는 A이지만, 바람직하게는 F이고, X2는 A, L, V, 또는 I이지만, 바람직하게는 L이고, X3은 T, V 또는 K이지만, 바람직하게는 T이고, X4는 S 또는 W이지만, 바람직하게는 S이고, X5는 S 또는 K이지만, 바람직하게는 K이고, X6은 N 또는 S이지만, 바람직하게는 S이고, X7은 V, A, L 또는 I이지만, 바람직하게는 A임)
본 명세서에서 바람직한 실시태양의 항체는 FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 가지는데, 여기서, "FR1-4"는 4개의 프레임워크 영역을 나타내고, "CDRL1-3"은 항-VEGF 항체 중쇄 가변 도메인의 3가지 초가변 영역을 나타낸다. FR1-4는 하기 실시예에서와 같이 "컨센서스 서열" (즉, 인간 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 클래스, 서브클래스 또는 아군의 가장 통상적인 아미노산)로부터 유도되거나, 개별 인간 항체 프레임워크 영역 또는 서로 상이한 프레임워크 영역 서열의 조합으로부터 유도될 수 있다. 바람직한 한 실시태양에서는, 경쇄 가변 FR이 문헌 (Kabat 등, 상기 문헌)에 의하 여 소개된 인간 면역글로불린 아군의 컨센서스 서열을 제공된다. 바람직하게는, 인간 면역글로불린 아군은 인간 카파 경쇄 아군 I (예, 서열 12에서와 같이)이다.
인간 경쇄 가변 FR 서열은 바람직하게는 그 안에 치환을 포함하는데, 예를 들어, 여기서 인간 FR 잔기가 상응하는 설치류 잔기에 의해 치환되지만, 비인간 잔기로의 치환은 필요하지 않다. 예를 들어, 상응하는 비인간 잔기 이외의 교체 잔기는 파지 표시에 의해 선별될 수 있다 (하기 실시예 2 참조). 치환될 수 있는 예시의 경쇄 가변 FR 잔기는 FR 잔기 번호: 4L, 46L 및 71L (본 명세서에서 사용된 Kabat 잔기 번호) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 단지 46L이 치환된다. 다른 실시태양에서는, 4L 및 46L이 치환된다.
CDR에 대하여, 이들은 바람직하게는 다음과 같은 아미노산 서열을 가진다.
CDRL1
X1AX2X3X4X5SNYLN (서열 121) (식중, X1은 R 또는 S이지만, 바람직하게는 S이고, X2는 S 또는 N이지만, 바람직하게는 S이고, X3은 Q 또는 E이지만, 바람직하게는 Q이고, X4는 Q 또는 D이지만, 바람직하게는 D이고, X5는 I 또는 L이지만, 바람직하게는 I임).
CDRL2
FTSSLHS (서열 122)
CDRL3
QQYSX1X2PWT (서열 123) (식중, X1은 T, A 또는 N이지만, 바람직하게는 T이 고, X2는 V 또는 T이지만, 바람직하게는 V임).
바람직한 인간화 항-VEGF 항체는 실시예 1에서 F(ab)-12의 중쇄 및(또는) 경쇄 가변 도메인 서열 및 실시예 3에서 변이체 Y0317, Y0313-1 및 Y0238-3를 포함하는 친화도 숙성 형태와 같은 그의 변이체를 가지는 것이고, Y0317이 바람직한 변이체이다. 본 명세서에서 목적 인간화 항-VEGF 항체를 생성하는 방법은 하기에 보다 상세하게 설명될 것이다.
A. 항체 제조
비인간 VEGF 항체를 인간화하는 방법 및 항-VEGF 항체의 변이체를 생성시키는 방법을 하기 실시예에서 설명한다. 항-VEGF 항체를 인간화하기 위해서 비인간 항체 출발 물질을 제조한다. 변이체를 생성시키고자 하는 경우에는 모항체를 제조한다. 상기와 같은 비인간 항체 출발 물질 및 모항체의 생성을 위한 기술의 예는 하기 섹션에서 설명할 것이다.
(i) 항원 제조
항체 생산에 사용되는 VEGF 항원은 예를 들어 무손상 VEGF 또는 VEGF의 단편 (예들 들어, "에피토프 A4.6.1"을 포함하는 VEGF 단편)일 수 있다. 항체 생성에 유용한 다른 형태의 VEGF는 당업자에게 명백할 것이다. 항체 생성에 사용되는 VEGF 항원은 바람직하게는 예를 들어 문헌 [Leung 등, Science 246:1306 (1989)] 및 [Houck 등, Mol. Endocrin. 5:1806 (1991)]에 기재된 바와 같은 인간 VEGF이다.
(ii) 다클론 항체
다클론 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보조제를 다수회 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사하여 동물 내에서 생성시킨다. 관련 항원을, 면역시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 삿갓조개(keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 타이로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에, 이관능성 제제 또는 유도화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기에서, R 및 R1은 상이한 알킬기임)을 사용하여 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
동물을 예를 들어, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합물 (각각 토끼와 마우스에 대해)을 3 부피의 프로인드(Freund) 완전 보조제와 혼합하고, 용액을 다수 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 접합물 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후에, 동물을 원래의 양의 1/5 내지 1/10의 프로인드 완전 보조제 중의 펩티드 또는 접합물로 다수 부위에 피하 주사함으로써 부스팅시킨다. 7 내지 14일 후, 동물을 출혈시키고, 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 역가가 정체 (plateau)될 때까지 동물을 부스팅시킨다. 바람직하게는, 동물을 상이한 단백질에, 및(또는) 상이한 가교제를 통해 접합된 동일 항원의 접합물로 부스팅시킨다. 결합물은 또한 단백질 융합물로서 재조합 세포 배양에서 제조할 수 있다. 또한, 명반과 같은 응집제를 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.
(iii) 단클론 항체
단클론 항체는 문헌 [Kohler 등, Nature, 256:495 (1975)]에서 처음 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호)을 이용하여 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 백혈구를 유도하도록 마우스, 또는 햄스터나 머카크 원숭이와 같은 다른 적절한 숙주 동물을 상기한 바와 같이 면역화시킨다. 별법으로, 백혈구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 백혈구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킬 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].
이렇게 제조한 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합 골수종 모세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에 접종하고 성장시킨다. 예를 들어, 골수종 모세포가 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 높은 수준의 안정한 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 로부터 입수가능한 MOP-21 및 M.C.-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 매릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포와 같은 설치류 골수종 세포주이다. 또한 인간 단클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 세포주 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 기재되어 있다 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 유도된 단클론 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성을 면역침강법에 의해, 또는 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡수 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정한다.
단클론 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson 등, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드 (Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 제한 희석 방법에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]으로 성장시킨다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단클론 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로즈 (Sepharose), 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리시킨다.
단클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 이용하여 (예를 들어, 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리되고 서열결정된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 백터내로 넣을 수 있고, 이어서 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 트랜스펙션시켜 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체를 합성시킬 수 있다. 항체의 재조합 생산은 보다 상세하게 후술될 것이다.
(iv) 인간화 및 아미노산 서열 변이체
하기 실시예 1-2는 항-VEGF 항체의 인간화 방법을 설명한다. 특정 실시태양에서, 인간화 항체의 아미노산 서열 변이체, 특히 인간화 항체의 결합 친화도 또는 다른 생물학적 특성이 개선된 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 실시예 3은 모항체에 비해 친화도가 개선된 항-VEGF 항체의 아미노산 서열 변이체를 생성시키기 위한 방법을 설명한다.
항-VEGF 항체의 아미노산 서열 변이체는 항-VEGF 항체 DNA 내에 적절한 뉴클레오티드 변이를 도입하거나 펩티드 합성법에 의해 제조된다. 이러한 변이체는 예를 들어, 본 실시예의 항-VEGF 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및(또는) 이 서열 내로의 잔기의 삽입 및(또는) 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 만들어 목적하는 특성을 갖는 최종 구조체를 제조한다. 또한, 아미노산 변이는 글리코실화 부위의 숫자 또는 위치를 변경시키는 것과 같이 인간화 또는 변이 항-VEGF 항체의 번역후 처리를 변경시킬 수 있다.
돌연변이 유발에 바람직한 위치를 갖는 항-VEGF 항체의 특정 잔기 또는 영역의 동정에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 언급된다. 여기서, 표적 잔기 또는 일군의 표적 잔기(예를 들어 arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전 잔기)가 동정되고 중성 또는 음하전 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환되어 아미노산의 VEGF 항원과의 상호작용에 영향을 준다. 이어서, 치환에 대해 관능적 감수성을 보이는 아미노산 위치는 치환 부위에서, 또는 치환 부위에 대해 추가 또는 다른 변이체의 도입에 의해 확인된다. 따라서, 아미노산 서열 변형을 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 그 자체의 성질을 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 소정 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해서 알라닌 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이 유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고 발현된 항-VEGF 항체 변이체를 목적 활성에 대해 스크리닝한다. 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발은 실시예 3에 설명되어 있다.
아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입 뿐만 아니라 하나 내지 1백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및(또는) 카르복시 말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항-VEGF 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항-VEGF 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드의 항-VEGF 항체의 N-말단 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다 (하기 참조).
또다른 형태의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항-VEGF 항체 분자의 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그 대신에 상이한 잔기가 삽입된 것이다. 치환 돌연변이 유발에 가장 흥미로운 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경도 또한 고려된다. 보존적 치환은 표 I의 "바람직한 치환" 부분에 나타내었다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변화시키면, 표 I에서 "예시적인 치환"으로 나타내거나, 또는 아미노산 종류에 대해서 후술하는 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입되고 그 생성물이 스크리닝될 수 있다.
본래의 잔기 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala(A) val; leu; ile val
Arg(R) lys; gln; asn lys
Asn(N) gln; his; asp, lys; arg gln
Asp(D) glu; asn glu
Cys(C) ser; ala ser
Gln(Q) asn; glu asn
Glu(E) asp; gln asp
Gly(G) ala ala
His(H) asn; gln; lys; arg arg
Ile(I) leu; val; met; ala; phe; norleucine leu
Leu(L) norleucine; ile; val; met; ala; phe ile
Lys(K) arg; gln; asn arg
Met(M) leu; phe; ile leu
Phe(F) leu; val; ile; ala; tyr tyr
Pro(P) ala ala
Ser(S) thr thr
Thr(T) ser ser
Trp(W) tyr; phe tyr
Tyr(Y) trp; phe; thr; ser phe
Val(V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine leu
항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들어 시트 또는 나선 배열, (b) 표적 부위에서 분자의 하전 또는 소수성 또는 (c) 벌크한 측쇄를 유지하는데 그의 효과에서 상당히 상이한 치환을 선별함으로써 달성된다. 천연 잔기는 일반적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 분류된다:
(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 상기 군 중 한 종류의 구성성분을 다른 종류의 구성성분으로 교환시킬 것이다.
인간화 또는 변이 항-VEGF 항체의 적절한 배열의 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 비정상적인 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 항체에 첨가되어 그의 안정성 (특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우)을 개선시킬 수 있다.
특히 바람직한 형태의 치환 변이체는 모항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 또다른 개발을 위해 선택된 얻어진 변이체(들)은 이들이 생성되는 모항체에 비해 생물학적 특성이 개선될 것이다. 이와 같은 치환 변이를 생성시키는 편리한 방법은 파지 표시를 이용하는 친화도 숙성이다(본 실시예 3 참조). 간략하게, 수개의 초가변 영역 부위(예를 들어, 6-7부위)를 돌연변이시켜 모든 가능한 아미노 치환을 각 부위에서 생성시킨다. 이렇게 생성된 항체 변이체들은 각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 섬유질 파지 입자로부터 1가 형식으로 표시된다. 이어서, 파지 표시된 변이체들을 본 명세서에 개시된 바와 같이 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형에 대한 후보 초가변 영역 부위를 동정하기 위하여, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발(실시예 3 참조)을 수행하여 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 동정할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 항체와 인간 VEGF간의 접촉점들을 동정하기 위하여 항원-항체 착물의 결정 구조를 분석하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 이와 같은 변이체가 일단 생성되면, 변이체의 패널을 본 명세서에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 분석법으로 우수한 특성을 갖는 항체를 선택하여 추가로 개발시킬 수 있다.
다른 종류의 항체의 아미노산 변이체는 항체의 본래의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 여기서 변경은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가를 의미한다.
항체의 글리코실화는 일반적으로 N-결합 또는 O-결합이다. N-결합은 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착함을 의미한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기의 아스파라긴 측쇄에 대한 효소적 부착의 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에 상기 트리펩티드 서열 중 어느 하나가 존재하면 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-결합 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 어느 하나가 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착됨을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가는 상기한 하나 이상의 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-결합 글리코실화 부위). 또한, 변경은 본래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가, 또는 치환에 의해 이루어질 수도 있다(O-결합 글리코실화 부위).
항-VEGF 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 올리고뉴클레오티드 매개 (또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 항-VEGF 항체의 기제조된 변이체 또는 비변이체의 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
(v) 인간 항체
인간화에 대한 별법으로서, 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역화시에 내인성 면역글로불린 생성없이 완전한 목록의 인간 항체를 생성시킬 수 있는 유전자 이식동물 (예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 이제 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식주 돌연변이 마우스에 있어서 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형접합성 결실에 의해 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다는 것이 설명되어 왔다. 상기와 같은 생식주 돌연변이 마우스에서의 인간 생식주 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 대항시에 인간 항체를 생성시킬 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits 등, Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann 등, Year in Immuno., 7:33 (1993)] 및 미국 특허 제5,591,669호, 동 제5,589,369호 및 동 제5,545,807호를 참조한다. 또한, 인간 항체는 파지 표시 라이브러리로부터 유래될 수도 있다 ([Hoogenboom 등, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) 및 미국 특허 제5,565,332호 및 동 제5,573,905호 참조). 기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관내 활성화 B 세포에 의해 생성될 수도 있다 (미국 특허 제5,567,610호 및 동 제5,229,275호 참조).
(vi) 항체 단편
특정 실시태양에서, 인간화 또는 변이 항-VEGF 항체는 항체 단편이다. 항체 단편을 생성하기 위한 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질 분해성 절단에 의해 유래되었다 (예를 들어, Morimoto 등, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) 및 브렌난 (Brennan) 등, Science, 229: 81 (1985) 참조). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 위해 직접 생성될 수 있다. 예를 들어, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수하고 화학적으로 결합시켜 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 [Carter 등, Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. 다른 실시태양에서는, F(ab')2를 F(ab')2 분자의 조립을 촉진시키는 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 형성시킨다. 또다른 방법으로, Fv, Fab 또는 F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리시킬 수 있다. 항체 단편을 생성하기 위한 다른 기법은 숙련된 당업자에게 명백할 것이다.
(vii) 다중특이적 항체
일부 실시태양에서, 2 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는, 다중특이적 (예, 이중특이적) 인간화 또는 변이 항-VEGF 항체를 생성시키는 것이 바람직하다. 예시적인 이중특이적 항체는 VEGF 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 별법으로, 세포 방어 메카니즘을 VEGF 발현 세포에 집중시키기 위해 항-VEGF 암(arm)은 T-세포 수용체 분자 (예, CD2 또는 CD3)와 같은 백혈구 상의 트리거링(triggering) 분자, 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들면 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)에 결합하는 암과 조합될 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 세포독성제를 VEGF를 발현하는 세포에 위치시킬 수 있다. 이들 항체는 VEGF 결합 암 및 세포독성제 (예, 사포린, 항인터페론-α, 빈카알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)와 결합하는 암을 갖는다. 이중특이적 항체는 전체 길이의 항체 또는 항체 단편 (예, F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조할 수 있다.
이중특이적 항체의 다른 제조 방법에 따라, 한 쌍의 항체 분자들 사이의 계면을 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 유전공학적으로 처리할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)로 치환시킨다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄 (예, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써 제2 항체 분자의 계면 상에 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 상보적인 "공간"이 생성된다. 이것은 동종이량체와 같은 다른 원하지 않는 최종 생성물보다 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다 (1996년 9월 6일 공개된 국제 특허 공개 제WO96/27011호 참조).
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들면, 이종접합물 내의 항체 중 하나는 아비딘과 커플링되고, 다른 하나는 비오틴과 커플링될 수 있다. 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교제는 당업계에 공지되어 있고, 많은 가교 기법과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기법은 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학 결합을 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan 등, Science, 229: 81 (1985)]에는 F(ab')2 단편을 생성하기 위해 무손상 항체를 단백질 분해에 의해 절단시키는 과정이 기재되어 있다. 이들 단편은 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원되어 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술파이드 형성을 방지한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 이. 콜리로부터 직접적으로 회수된 Fab'-SH 단편은 시험관 내에서 화학적으로 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성한다 [Shalaby 등, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)].
재조합 세포 배양물로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리시키는 다양한 기법이 또한 기재되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼 (zippers)를 사용하여 생산되었다 [Kostelny 등, J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 일부에 연결시켰다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 모노머를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용할 수 있다. 문헌 [Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재되어 있는 "디아바디 (diabody)" 기법은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대체 메카니즘을 제공하였다. 단편은 동일 사슬 상의 2개의 도메인 사이를 대합시키기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 강제로 대합되어, 2개의 항원 결합 부위를 형성하게 된다. 단일 사슬 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 다른 방법이 또한 보고되어 있다 [Gruber 등, J. Immunol., 152: 5368 (1994)]. 별법으로 이중특이적 항체는 문헌 [Zapata 등, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)]에 기재된 바와 같이 생산된 "선형 항체"일 수 있다.
2 이상의 역가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들면, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 [Tutt 등, J. Immunol. 147: 60 (1991)].
(viii) 기타 변형
인간화 또는 변이 항-VEGF 항체의 다른 변형도 고려된다. 예를 들면, 암 치료시에 항체의 유효성을 증가시키기 위해, 작동기 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 시스테인 잔기(들)을 Fc 영역에 도입하여, 이 영역에서 쇄간 디술파이드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이렇게 생산된 동종이량체 항체는 개선된 내부이행(internalization) 능력 및(또는) 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron 등, J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992); 및 Shopes, B., J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)] 참조. 문헌 [Wolff 등, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이형 이관능성 가교제를 사용하여 증가된 항종양 활성을 갖는 동종이량체 항체를 또한 제조할 수 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 유전공학적으로 처리할 수 있고, 이에 의해 보체 용해 및 ADCC 능력을 증진시킬 수 있다. 문헌 [Stevenson 등, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)] 참조.
본 발명은 또한 세포독성제, 예를 들면 화학요법제, 독소 (예, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (예, 방사성접합물)에 접합된 본 명세서에 기재한 항체를 포함하는 면역접합물에 관한 것이다.
이러한 면역접합물의 생성에 유용한 화학요법제는 상기 기재하였다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 사슬 [슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터], 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알루라이츠 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노미신, 에노미신 및 트리코테센이 포함된다. 방사성접합된 항-VEGF 항체를 생산하기 위해 다양한 방사성핵종을 이용할 수 있다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re이 있다.
항체 및 세포독성제의 접합은 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 [예, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민], 비스-디아조늄 유도체 (예, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta 등, Science 238:1098(1987)]에 기재된 바에 따라 제조될 수 있다. 탄소-14 표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오티드를 항체에 결합시키기 위한 킬레이팅제의 예이다 (예, 국제 특허 공개 제WO94/11026호 참조).
다른 실시태양에서, 항체는 종양 예비 표적화에 사용하기 위한 "수용체" (예, 스트렙타비딘)에 접합될 수 있고, 여기서 항체-수용체 접합물은 환자에게 투여된 후 세정제를 사용하여 비결합된 접합물을 순환물로부터 제거한 후 세포독성제 (예, 방사성 핵종)에 접합된 "리간드" (예, 아비딘)이 투여된다.
항-VEGF 항체는 또한 면역리포좀으로서 제조될 수도 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 공지의 방법에 의해 제조된다 [Epstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030(1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호]. 순환 시간이 증가된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 한정된 세공 크기를 갖는 필터를 통하여 압출하여 목적 직경을 갖는 리포좀을 생성시킨다. 본 발명 항체의 Fab' 단편은 디술파이드 교환 반응을 통하여 문헌 [Martin 등, J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 접합될 수 있다. 화학요법제 (예, 독소루비신)는 리포좀 내에 임의로 함유된다 [Gabizon 등, J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989) 참조].
본 발명의 항체는 또한 전구약물 (예, 펩티딜 화학요법제, 국제 특허 공개 제WO81/01145호 참조)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물 활성화 효소에 항체를 접합시킴으로써 ADEPT에 사용될 수 있다 (예를 들어 국제 특허 공개 제WO88/07378호 및 미국 특허 제4,975,278호 참조).
ADEPT에 유용한 면역접합물의 효소 성분은 전구약물을 그의 보다 활성인 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물에 대해 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 효소로는 인산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리 포스파타제; 황산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암제인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 프로테아제, 테르모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물 분해 효소, 예를 들어 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 아민 질소에서 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제가 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 별법으로, 당업계에 "아브짐(abzyme)"으로도 알려진 효소적 활성을 갖는 항체를 사용하여 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시킬 수 있다 [예, Massey, Nature 328:457-458(1987) 참조]. 항체-아브짐 접합물은 아브짐의 종양 세포 집단으로의 전달에 대해서 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
본 발명의 효소는 상기 논의한 헤테로 이관능성 가교제의 사용과 같은 당업계에 공지된 기법에 의해 항-VEGF 항체에 공유결합될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 효소의 적어도 기능적 활성 부분에 연결된 본 발명의 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다 [예, Neuberger 등, Nature, 312:604-608(1984) 참조].
본 발명의 특정 실시태양에서, 예를 들어 종양 침투를 증가시키기 위해서 무손상 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우, 항체 단편은 그의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 예를 들어 샐비지 수용체 결합 에피토프를 항체 단편에 도입함으로써 (예를 들어, 항체 단편의 적절한 영역의 돌연변이에 의해, 또는 예를 들어 DNA 또는 펩티드 합성에 의해 항체 단편의 말단 또는 중앙에 융합되는 펩티드 태그에 에피토프를 도입함으로써) 달성될 수 있다 (1996년 10월 17일 공개된 국제 특허 공개 제WO96/32478호 참조).
샐비지 수용체 결합 에피토프는 일반적으로 Fc 도메인의 하나 또는 두개의 루프로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 항체 단편의 유사 위치로 이전된 영역을 구성한다. 보다 바람직하게는, Fc 도메인의 하나 또는 두개의 루프로부터의 3개 이상의 잔기가 이전된다. 보다 더 바람직하게는, 에피토프는 (예, IgG의) Fc 영역의 CH2 도메인으로부터 선발되어 항체의 CH1, CH3 또는 VH 영역, 또는 하나 이상의 상기 영역으로 이전된다. 별법으로, 에피토프는 Fc 영역의 CH2 도메인으로부터 선발되어 항체 단편의 CL 영역 또는 VL 영역, 또는 두 영역 모두로 이전된다.
가장 바람직한 한 실시태양에서, 샐비지 수용체 결합 에피토프는 서열 PKNSSMISNTP (서열 17)를 포함하고, 특히 항체 단편은 Fab 또는 F(ab')2인 경우 임의로 HQSLGTQ (서열 18), HQNLSDGK (서열 19), HQNISDGK (서열 20) 또는 VISSHLGQ (서열 21)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 추가로 포함한다. 가장 바람직한 다른 실시태양에서, 샐비지 수용체 결합 에피토프는 서열(들) HQNLSDGK (서열 19), HQNISDGK (서열 20) 또는 VISSHLGQ (서열 21) 및 서열: PKNSSMISNTP (서열 17)를 함유하는 폴리펩티드이다.
또한, 인간화 또는 변이 항-VEGF 항체의 공유결합 변형도 본 발명의 범위에 포함된다. 이들은 화학적 합성 또는 적용가능한 경우 항체의 효소적 분해 또는 화학적 분해에 의해 제조될 수 있다. 항체의 다른 유형의 공유결합 변형은 항체의 표적 아미노산 잔기를 선발된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도화제와 반응시킴으로써 분자 내에 도입된다. 폴리펩티드의 공유결합 변형은 본 명세서에 참고로 구체적으로 포함된 미국 특허 제5,534,615호에 기재되어 있다. 항체의 공유결합 변형의 바람직한 유형은 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 개시된 방법으로 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 결합시키는 것을 포함한다.
B. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명은 인간화 또는 변이 항-VEGF 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 이 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 항체를 제조하는 재조합 기술을 제공한다.
재조합 항체의 생산을 위해, 이 항체를 코딩하는 핵산을 단리하여 추가 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현용 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 또다른 실시태양에서 예를 들면 본 명세서에 참고로 구체적으로 포함된 미국 특허 제5,204,244호에 기재된 바와 같이 항체는 상동 재조합에 의해 제조될 수 있다. 단클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 과정을 사용하여 (예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열을 결정한다. 많은 벡터를 사용할 수 있다. 일반적으로는, 벡터 성분은 예를 들면, 1996년 7월 9일자로 공개되고 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,534,615호에 기재된 바와 같이, 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모 또는 상기 기재된 고등 진핵세포이다. 상기 목적에 적합한 원핵세포로는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아, 예를 들어 에셔리키아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜리 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실루스 (Bacillus), 예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 제266,710호에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)가 포함된다. 하나의 바람직한 이. 콜리 클로닝 숙주는 이. 콜리 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예를 들어 이. 콜리 B, 이. 콜리 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜리 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다.
원핵세포 외에, 필라멘트상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항-VEGF 항체 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 베이커 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 예를 들어 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyvermyces) 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (유럽 특허 제402,226호); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (유럽 특허 제183,070호); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (유럽 특허 제244,234호); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니게르 (A. niger)가 통상 입수가능하며 본원에서 유용하다.
글리코실화 항-VEGF 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충), 애데스 애깁티 (Aedes aegypti) (모기), 애데스 알보픽투스 (albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (과일파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터 유래한 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스성 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주를 구입할 수 있고, 상기 바이러스는 본 발명에 따라 본 명세서의 바이러스로서, 특히 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다. 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 가장 크고, 척추동물 세포의 배양 (조직 배양)에서의 증식은 일반적인 방법으로 행하게 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배(胚) 신장 세포주 [293 또는 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham 등, J. Gen Virol., 36:59(1977)]; 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO, Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)]; 마우스 세르톨리 세포 [TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)]; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL 1587); 인간 경부암 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [Mather 등, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68(1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 항-VEGF 항체 생산을 위한 상기 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선발 또는 목적 서열 코딩 유전자 증폭에 적합하게 변형된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다.
본 발명의 항-VEGF 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지 중에서 배양할 수 있다. 통상 사용가능한 배지, 예를 들어 Ham F10 (Sigma), 최소 필수 배지 (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘벡코 변형 이글 배지 (DMEM) (Sigma)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham 등, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes 등, Anal. Biochem., 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호, 동 제4,657,866호, 동 제4,927,762호, 동 제4,560,655호 또는 동 제5,122,469호, 국제 특허 공개 제90/03430호, 동 제87/00195호, 또는 미국 특허 등록 제30,985호에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포 배양 배지로서 사용할 수 있다. 이들 임의의 배지는 호르몬 및(또는) 다른 성장 인자 (예, 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장 인자), 염 (예, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액 (예, HEPES), 뉴클레오티드 (예, 아데노신 및 티미딘), 항생제 [예, GENTAMYCIN (상표명) 약물], 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물) 및 글루코스 및 등가의 에너지원으로 필요에 따라 보충될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물이 당업계의 숙련가에게 공지된 적합한 농도로 포함될 수도 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 이전에 사용된 조건이고, 당업계의 숙련가에게 자명하다.
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포내에서, 세포질 주변(periplasm) 공간에서 생산될 수 있거나 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서 파편 입자, 숙주 세포 또는 용균 단편이 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter 등, Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜리의 세포질 주변 공간에 분비된 항체를 단리하는 방법이 기재되어 있다. 요약하면, 세포 페이스트는 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동된다. 세포 파쇄물은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 상기 발현계로부터의 상청액은 일반적으로 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질분해를 억제하기 위해 상기 단계에 포함될 수 있고, 항생제도 우발의 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조되는 항체 조성물은 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피, 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 좌우된다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기재로 한 항체의 정제에 사용될 수 있다 [Lindmark 등, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3을 위해 추천된다 [Guss 등, EMBO J. 5:1567-1575 (1986)]. 친화성 리간드가 결합되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 사용가능하다. 조절된 세공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스를 사용하여 달성할 수 있는 것 보다 빠른 유속 및 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에는, 베이커본드 (Bakerbond) ABX 수지(등록상표) (J.T. Baker, 미국 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온 교환 컬럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로즈 (SEPHAROSE, 등록상표) 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예, 폴리아스파르산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전이 회수하고자 하는 항체에 따라 사용가능하다.
예비 정제 단계(들) 후에, 목적 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 약 2.5 내지 4.5의 pH의 용출 완충액을 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예, 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는 저 pH 소수성 크로마토그래피에 주입할 수 있다.
C. 제약 제제
항체의 치료 제제는 목적 순도를 갖는 항체를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 함께 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조되어 보관된다 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16판, Osol, A. Ed. (1980)]. 적합한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 복용자에게 비독성이고, 완충액, 예를 들어 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하여 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착체); 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 TWEEN (상표명), PLURONICS (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다.
또한, 제제는 치료되는 특정 증상에 필요한 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 해로운 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다 (하기 섹션 F 참조). 상기 분자는 적절하게는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합하여 존재한다.
또한, 활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에서 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16판, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태인, 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT (상표명) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 장시간 동안 체내에 잔유할 때, 이들 항체는 37 ℃에서 수분에 대한 노출의 결과로서 변성되거나 응집될 수 있고, 이것은 생물학적 활성의 상실 및 면역원성의 변화 가능성을 야기한다. 관련 메카니즘에 따라서 안정화를 위해 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술파이드 교환을 통한 분자간 S-S 결합의 형성으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고 수함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성할 수 있다.
D. 항체의 비치료적 사용
본 발명의 항체는 친화도 정제제로서 사용될 수 있다. 이 방법에서, 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세파덱스 (Sephadex) 수지 또는 여과지와 같은 고체상 상에 고정된다. 고정된 항체는 정제되는 VEGF 단백질 (또는 그의 단편)을 함유하는 시료와 접촉한 후 지지체는 고정된 항체에 결합하는 VEGF 단백질을 제외하고 시료 내의 모든 물질을 실질적으로 제거하는 적합한 용매로 세척된다. 최종적으로, 지지체는 항체로부터 VEGF 단백질을 방출시키는 글리신 완충액 (pH5.0)과 같은 다른 적합한 용매로 세척된다.
또한, 항-VEGF 항체는 VEGF 단백질의 진단 분석법, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서의 그의 발현의 검출에 유용할 수 있다. 상기 진단법은 암 진단에 유용할 수 있다.
진단 용도를 위해, 항체는 일반적으로 검출가능 잔기로 표지될 것이다. 많은 표지가 사용될 수 있고, 다음과 같은 범주로 일반적으로 분류할 수 있다.
(a) 방사성 동위 원소, 예를 들어 35S, 14C, 125I, 3H 및 131I. 항체는 문헌 [예를 들어 Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen 등, Ed., Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs., (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 방사성 동위원소로 표지할 수 있고, 방사성은 신틸레이션 카운터를 사용하여 측정할 수 있다.
(b) 형광 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민 (Lissamine), 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red)를 사용할 수 있다. 형광 표지는 예를 들어 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology]에 개시된 기술을 사용하여 항체에 접합시킬 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 측정할 수 있다.
(c) 상이한 효소-기질 표지를 사용할 수 있고, 미국 특허 제4,275,149호는 이러한 몇몇 표지를 제공한다. 일반적으로, 효소는 다양한 기술을 사용하여 측정할 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매화한다. 예를 들어, 효소는 분광광도계로 측정될 수 있는 기질의 색깔 변화를 촉매화할 수 있다. 별법으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기한 바와 같다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 후, 측정될 수 있는 (예를 들어 화학발광계를 사용하여) 광을 방출하거나 형광 수용체에 에너지를 제공할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시퍼라제 (예를 들어 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균성 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈아진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스 옥시다제, 칼락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예를 들어 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 결합시키는 기술은 문헌 [O'Sullivan 등, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합물의 예는 예를 들어
(i) 염료 전구체 (예를 들어 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시키는 기질로서의 하이드로겐 퍼옥시다제와 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO);
(ii) 알칼린 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및
(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예를 들어 p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제를 포함한다.
많은 다른 효소-기질 조합물이 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다 (이러한 조합물에 대해서는 미국 특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호 참조).
때때로, 표지는 항체와 간접적으로 접합된다. 숙련가는 이를 달성하는 다양한 기술을 이해할 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴에 접합될 수 있고, 상기 언급한 3개의 넓은 범주의 항체 중의 하나가 아비딘과 접합될 수 있거나, 이와 반대로 접합될 수도 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하여 표지가 상기 간접적인 방식으로 항체에 결합될 수 있다. 별법으로, 표지의 항체에 대한 간접적인 접합을 달성하기 위해 항체는 작은 합텐 (예를 들어 디곡신)과 접합되고, 상기한 상이한 종류의 표지 중의 하나가 항-합텐 항체 (예를 들어 항-디곡신 항체)와 결합된다. 이와 같이, 표지와 항체의 간접적인 결합을 달성할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 항-VEGF 항체는 표지될 필요가 없고, 그의 존재는 항-VEGF 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 항체는 공지의 분석법, 예를 들어 경쟁적 결합 분석, 직간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석법으로 사용될 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)].
경쟁적 결합 분석은 제한된 양의 항체와 결합하기 위해 시험 시료 분석물과 경쟁하는 표지된 표준물질의 능력에 의존한다. 시료 내의 VEGF 단백질의 양은 항체에 결합하게 되는 표준물질의 양에 반비례한다. 결합되는 표준물질의 양의 결정을 용이하게 하기 위하여, 항체는 일반적으로 경쟁 전후에 불용화되어 항체에 결합되는 표준물질과 분석물이 결합되지 않은 표준물질과 분석물로부터 편리하게 분리될 수 있다.
샌드위치 분석법은 검출되는 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2개의 항체의 사용을 수반한다. 샌드위치 분석법에서, 시료 분석물은 고형 지지체 상에 고정된 제1 항체에 의해 결합되고, 이어서 제2 항체는 분석물에 결합하여 불용성 3부분 복합체를 형성한다 (미국 특허 제4,376,110호 참조). 제2 항체 자체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있거나 (직접 샌드위치 분석법) 또는 검출가능한 잔기로 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 분석법). 예를 들어, 샌드위치 분석법의 한 종류는 ELISA 분석법으로서, 이 경우 검출가능한 잔기는 효소이다.
면역조직화학법의 경우, 종양 시료는 신선하거나 동결된 것일 수 있거나 또는 예를 들어 포르말린과 같은 방부제와 함께 파라핀에 함침되어 고정될 수 있다.
또한, 항체는 체내 진단 분석에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 방사성 핵종 (예를 들어 111In, 99Tc, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S)으로 표지되어 면역신티오그래피 (immunoscintiography)를 사용하여 종양을 위치시킬 수 있다.
E. 진단 키트
편리성의 문제로서, 본 발명의 항체는 키트, 즉 소정량의 시약의 조합물의 패키지 및 진단 분석 수행 설명서로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 키트는 효소가 필요로 하는 기질 및 공인자 (예를 들어 검출가능 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 다른 첨가제, 예를 들어 안정화제, 완충액 (예를 들어 블록킹 완충액 또는 용해 완충액) 등이 포함될 수 있다. 각종 시약의 상대적인 양은 분석법의 감도를 실질적으로 최적화하는 시약 용액의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 변경될 수 있다. 특히, 시약은 용해시에 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있다.
F. 항체의 치료적 용도
치료 용도를 위하여, 본 발명의 항-VEGF 항체는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액낭내, 모지구내, 구강, 국부 또는 흡입 경로에 의해서, 주사 또는 연속 주입에 의해서 일정 시간에 걸쳐서 정맥으로 사람에게 투여할 수 있는 것들을 포함하는, 상기 언급한 바와 같은 제약학적으로 허용가능한 투여량 형태로 포유동물, 바람직하게는 사람에게 투여된다. 또한, 항체는 국부 또한 전신 치료 효과를 내기 위하여 적합하게는 종양내, 종양주위, 병소내, 병소주위 경로에 의해서 투여된다. 복강내 투여는 예를 들어, 난소암 치료에 특히 유용할 것으로 예상된다.
질병의 억제 또는 치료를 위해, 항체의 적합한 투여량은 상기한 바와 같은 치료되는 질병의 종류, 질병의 심도 및 경과에 따라 결정되고, 항체는 예방 또는 치료 목적, 사전 치료, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 처방 의사의 판단에 따라 투여된다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료 기간에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
항-VEGF 항체는 다양한 종양질환 및 비종양질환 및 질병의 치료에 유용하다. 종양 및 치료될 수 있는 관련 증상은 흉부암, 폐암, 위암, 식도암, 결장직장암, 간암, 난소암, 난포악종, 남화아세포종, 경부암, 자궁내막암, 자궁내막과형성, 자궁내막증, 섬유육종, 맥락막염, 두경암, 비인강암, 후두암, 간종양, 키포시 육종, 색소세포종, 피부암, 혈관종, 해면상혈관종, 혈관아세포종, 췌장암, 망막아종, 성상세포종, 교아세포종, 신경초종, 굡지 신경 교종, 수아세포종, 신경아세포종, 횡문근육종, 골형성 육종, 평활근 육종, 요로암, 갑상선암, 빌름종양, 신장세포암, 전립선암, 모반증 관련 비정상적 혈관 증식증, 부종 (예를 들어, 뇌종양과 관련됨) 및 메이그스 증상을 포함한다.
치료될 수 있는 비종양질환은 류머티스성 관절염, 건선, 아테롬성 동맥 경화증, 당뇨병 및 미성숙 막망증을 포함하는 다른 증식성 망막증, 수정체 후방 섬유증식증, 혈관 신생 녹내장, 노화 관련 황반 변성, 갑상산 과형성 (그래이브 (Grave)병 포함), 각막 및 다른 조직 이식, 만성 염증, 폐염증, 신장 질병, 자간전증, 복수증, 심낭삼출액 (예를 들어, 심막증) 및 흉막 삼출액을 포함한다.
노화 관련 황반 변성 (AMD)은 나이든 사람들에게 있어서 심한 시각적 손실의 주된 원인이다. AMD의 삼출형태가 맥락막 신혈관생성 및 망막 색소 상피 세포 탈리를 특징으로 한다. 맥락막 신혈관생성은 예측상의 급작스런 악화와 관련되고, 본 발명의 VEGE 항체는 AMD의 심각성을 감소시키는데 특히 유용한 것으로 예측된다.
질병의 종류 및 심도에 따라, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg (즉, 0.1 내지 20 mg/kg)이 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에 투여되는 초기 후보 투여량이다. 일반적인 1일 또는 주간 투여량은 상기 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg 이상일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 질환에 따라 치료는 질병의 증상이 목적 수준으로 억제될 때까지 유지된다. 그러나, 다른 투여 요법도 유용할 수 있다. 상기 치료법의 진행은 예를 들어, 방사선 사진의 종양 영상을 포함하는, 통상의 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링할 수 있다.
또다른 본 발명의 실시태양에 따라서, 질병을 억제 또는 치료하는데 있어서 항체의 효율성은 이러한 목적에 유용한 또다른 제제, 예를 들어, 종양 괴사 인자 (TNF), 산성 또는 염기성 파골세포 성장 인자 (FGF) 또는 간세포 성장 인자 (HGH)의 혈관형성 활성을 억제하거나 중성화시킬 수 있는 항체, 조직 인자, 단백질 C, 또는 단백질 S의 응고제 활성을 억제하거나 중성화시킬 수 있는 항체[Esmon 등, 1991년 2월 21일 공개된 PCT 특허 공개 제WO91/01753호 참조], HER2 수용체에 결합할 수 있는 항체 [Hudziak 등 1989년 7월 27일 공개된 PCT 특허 공개 제WO 89/06692호 참고), 또는 1 종 이상의 통상적인 치료 제제, 예를 들어, 알킬화제, 엽산 길항제, 핵산 대사의 항대사물질, 항생물질, 피리미딘 동족체, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 퓨린 뉴클레오시드, 아민, 아미노산, 트리아졸 뉴클레오시드 또는 코르티코스테로이드와 함께 또는 순차적으로 항체를 투여함으로써 개선될 수 있다. 그러한 다른 제제는 조성물내에 존재하여 투여되거나 별도로 투여될 수 있다. 또한, 항체는 적합하게는, 방사활성 물질의 조사 또는 투여와 관련하면, 방사선 처리와 함께 또는 순차적으로 투여된다.
하나의 실시태양에서, 종양의 혈관생성은 조합적 치료법으로 처리된다. 항체 및 하나 이상의 다른 항-VEGF 길항제를 종양 보유 환자에게 예를 들어, 존재하는 경우 종양의 괴사 또는 그의 전이 중심을 관찰하므로써 결정된 치료학적 유효량으로 투여한다. 이러한 치료는 더이상의 유익한 효과가 관찰되지 않거나 임상 조사가 종양 또는 임의의 전이 중심의 흔적을 나타내지 않을 때까지 계속한다. 이어서, TNT는 단독 또는 보조제 (예를 들어, 알파-, 베타- 또는 감마-인터페론, 항-HER2 항체, 헤레굴린, 항헤레굴린 항체, D-인자, 인터류킨-1 (IL-1), 인터류킨-2 (IL-2), 과립구-매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 또는 종양내 미세혈관 응고를 촉진시키는 제제, 예를 들어, 항-단백질 C 항체, 항-단백질 S 항체 또는 C4b 결합 단백질 [Esmon 등, 1991년 2월 21일 공개된 PCT 특허 공개 제WO91/01753호 참고] 또는 열 또는 조사와 조합하여 투여된다.
보조제는 그들의 효과에 따라서 다르므로, 통상적인 방식의 매트릭스 스크리닝에 의해서 종양에 대한 그들의 영향을 비교하는 것이 바람직하다. 항-VEGF 항체 및 TNF 투여는 목적하는 임상 효과가 얻어질 때까지 반복된다. 별법으로, 항-VEGF 항체는 TNF 및 임의로 보조제와 함께 투여된다. 예를 들어, 고상 종양은 팔다리 또는 일반적 순환으로부터 단리에 민감한 다른 부위에서 발견되는 경우, 본 명세서에서 개시된 치료 제제는 단리된 종양 또는 기관에 투여된다. 다른 실시태양에서, FGF 또는 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 길항제, 예를 들어 항-FGF 또는 항-PDGF 중성화 항체가 항-VEGF 항체와 함께 환자에게 투여된다. 임의로 항VEGF 항체로의 치료는 상처 치유 또는 바람직한 신혈관 생성 기간 동안 지연될 수 있다.
G. 제품
본 발명의 또다른 실시태양에서, 상기 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 제조될 수 있다. 용기는 질환 치료에 유효한 조성물을 보유하고 멸균 출입구를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 정맥내 투여 용액 백 또는 피하주사 바늘이 침투가능한 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 활성제는 항-VEGF 항체이다. 용기 상의 또는 용기에 부착된 라벨은 조성물이 대상 질환의 치료에 사용된다는 것을 나타낸다. 제품은 추가로 제약상 허용되는 완충액, 예를 들어 인산염 완충 염수, 린저 (Ringer) 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 사용 설명서와 함께 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다.
인간화 및 변이 항-VEGF 항체 및 그의 각종 용도가 개시되어 있다. 항-VEGF 항체는 VEGF에 대해 강한 결합 친화도를 가지며, 시험관내 내피 세포의 VEGF 유도 증식을 억제하며 생체내 종양 성장을 억제한다.
<실시예 1>
본 실시예는 치료학적 관점에서 바람직한 특성을 갖는 인간화 항-VEGF 항체의 생산을 기술한다.
<재료 및 방법>
설치류 A4.6.1 MAb의 클로닝과 설치류-인간 키메릭 Fab의 제작:
설치류 항-VEGF mAb A4.6.1은 이전에 문헌[Kim 등, Growth Factors 7:53 (1992) 및 Kim 등, Nature 362:841 (1993)]에서 기재되었다. 전체 RNA를, RNAsol (TEL-TEST)을 사용하여 항-VEGF Mab A.4.6.1을 생산하는 하이브리도마 세포로부터 단리시키고, 올리고-dT 프라이머 및 SuperScript II 시스템 (GIBCO BRL, 미국 매릴랜드주 게터스버그)을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 항체의 경쇄와 중쇄의 N-말단 아미노산 서열에 기초된, 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머 풀을 합성하여 전진 (forward) 프라이머로서 사용하였다. 역 프라이머는 설치류 경쇄 아군 kV와 중쇄 아군 II로부터 얻은 프레임워크 4 서열에 기초되었다 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판. Public Health Service, National Institutes of Health, 미국 매릴랜드주 베테스다 (1991)]. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시킨 후, DNA 단편을 TA 클로닝 벡터 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에 결찰시켰다. 각각의 경쇄 및 중쇄의 8개의 클론을 서열결정하였다. 경쇄 VL 도메인에 대한 컨센서스 서열을 갖는 1개의 클론과 중쇄 VH 도메인에 대한 컨센서스 서열을 갖는 1개의 클론을 인간 CL 및 CH1 도메인을 함유하는 pEMX1 벡터내로 각각 서브클로닝시켜 [Werther 등, J. Immunol. 157:4986-4995 (1996)], 마우스-인간 키메라를 생성하였다. 이 키메릭 F(ab)는 아미노산 SerH113에서 인간 CH1 도메인에 융합된 전체 설치류 A4.6.1 VH 도메인과 아미노산 LysL107에서 인간 CL 도메인에 융합된 전체 설치류 A4.6.1 VL 도메인으로 이루어졌다. 키메릭 F(ab)의 발현과 정제는 인간화 F(ab)의 발현 및 정제와 동일하였다. 키메릭 F(ab)는 결합 분석에서 표준물질으로 사용하였다.
설치류 및 인간화 F(ab)의 컴퓨터 그래픽 모델:
VL 및 VH 도메인의 서열 (도 1a 및 도 1b)을 사용하여 설치류 A4.6.1 VL-VH 도메인의 컴퓨터 그래픽 모델을 제작하였다. 이 모델을 사용하여 어떠한 프레임워크 잔기들이 인간화 항체에 도입될 것인지 결정하였다. 인간화 F(ab)의 모델을 또한 제작하여 설치류 프레임워크 잔기들의 정확한 선별을 입증하였다. 모델의 제작은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 [Carter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992); 및 Eigenbrot 등, J. Mol. Biol. 229:969-995 (1993)].
인간화 F(ab)의 제작:
돌연변이 유발을 위해 사용된 플라스미드 pEMX1 및 이. 콜라이에서 F(ab)의 발현은 이전에 기술되었다 [Werther 등, 상기 문헌]. 요약하면, 플라스미드는 컨센서스 인간 k 아군 I 경쇄 (VLkI-CL) 및 컨센서스 인간 아군 III 중쇄 (VHIII-CH1)를 코딩하는 DNA 단편 및 알칼리성 포스파타제 프로모터를 포함한다. VL과 VH에 대한 컨센서스 서열의 사용은 이전에 기술되었다 [Carter 등, 상기 문헌].
인간화 A4.6.1의 제1 F(ab) 변이체, F(ab)-1을 제작하기 위해, pEMX1의 데옥시우리딘 함유 주형에 대해 부위 지정 돌연변이 유발 [Kunkel 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)]를 수행하였다. 카뱃 등 [Kabat 등, 상기 문헌]에 따른 6개의 CDR을 설치류 A4.6.1 서열로 교체시켰다. 따라서, F(ab)-1는 6개의 완전한 설치류 CDR 서열을 갖는 완전한 인간 프레임워크 (VLk 아군 I 및 VH 아군 III)으로 이루어졌다. 다른 모든 F(ab) 변이체들에 대한 플라스미드는 F(ab)-1의 플라스미드 주형로부터 제작하였다. 플라스미드를 이. 콜라이 균주 XL-1 블루 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 내로 형질전환시켜 이중 및 단 일 가닥의 DNA를 제조하였다. 각각의 변이체에 대해, 경쇄와 중쇄를 코딩하는 DNA를 디데옥시뉴클레오티드 방법 (Sequenase, U.S. Biochemical Corp., 오하이오주 클리블랜드)을 이용하여 완전히 서열결정하였다. 플라스미드를 이. 콜라이 균주 16C9 (MM294의 유도체) 내로 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 카르베니실린을 함유하는 루리아(Luria) 브로쓰 플레이트 상에 플레이팅하고, 단일 콜로니를 선별하여 단백질 발현시켰다. 단일 콜로니를 37 ℃에서 5 ㎖ 루리아 브로쓰-100 ㎎/㎖ 카르베니실린 중에서 5 내지 8시간 동안 배양하였다. 5 ㎖의 배양물을 500 ㎖ AP5-50 ㎍/㎖ 카르베니실린에 첨가하고, 30 ℃에서 20시간 동안 4ℓ 차폐된 진탕 플라스크 내에서 배양하였다. AP5 배지는 물 1ℓ 중 1.5 g 글루코스, 11.0 g Hycase SF, 0.6 g 효모 추출액(보증품), 0.19 g MgSO4(무수), 1.07 g NH4Cl, 3.73 g KCl, 1.2 g NaCl 및 120 ㎖ 1M 트리에탄올아민, pH 7.4로 이루어지며, 이어서, 0.1 ㎜ Sealkeen 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 1ℓ 원심분리병에서 3000xg로 원심분리하고 상청액을 제거하여 세포를 회수하였다. 1시간 동안 동결시킨 후, 펠렛을 25 ㎖의 냉 10mM 트리스-1mM EDTA-20 % 수크로스 (pH 8.0)에 재현탁시켰다. 250 ㎖의 0.1M 벤즈아미딘 (Sigma, 미국 미저리주 세인트루이스)을 첨가하여 단백분해를 방지하였다. 얼음 상에서 3시간 동안 가볍게 교반한 후, 시료를 40,000xg로 15분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 10mM 트리스-1mM EDTA (pH 7.5)로 평형화시킨 단백질 G-세파로즈 CL-4B (Pharmacia, 스웨덴 웁살라) 칼럼 (0.5 ㎖ 층부피)에 적용하였다. 칼럼을 10 ㎖의 10mM 트리스-1mM EDTA (pH 7.5)로 세척하고, 3 ㎖의 0.3M 글리신 (pH 3.0)을 사용하여 1.25 ㎖의 1M 트리스, pH 8.0 내로 융출시켰다. 이어서, F(ab)를 센트리콘 (Centricon)-30 (Amicon, 미국 매사추세츠주 비버리)을 사용하여 PBS 내로 완충액 교환하고, 0.5 ㎖의 최종 부피로 농축시켰다. 모든 F(ab)의 SDS-PAGE 겔을 전개시켜 순도를 확정하고, 전자분무 질량 분광기에 의해 각각의 변이체의 분자량을 확인하였다.
키메릭 및 인간화 IgG의 제작과 발현:
키메릭 A4.6.1 (chIgG1)와 인간화 A4.6.1 (HuIgG1)의 인간 IgG1 변이체들을 생성하기 위해, 적절한 설치류 또는 인간화 VL 및 VH (F(ab)-12, 표 2) 도메인을 이전에 기술된 개별 pRK 벡터 내로 서브클로닝하였다 [Eaton 등, Biochemistry 25:8343-8347 (1986)]. 각각의 변이체의 전체 경쇄와 전체 중쇄를 코딩하는 DNA를 디데옥시뉴클레오티드 서열결정에 의해 확인하였다.
변이체의 일시적 발현을 위해, 중쇄와 경쇄 플라스미드를, 고능률 과정 [Gorman 등, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)]를 이용하여 인간 293 세포 [Graham 등, J. Gen. Virol. 36:59-74 (1977)] 내로 함께 형질감염시켰다. 배지를 무혈청으로 교환하고 5일까지 매일 채취하였다. 모은 상청액으로부터 단백질 A-세파로즈 CL-4B (Pharmacia)를 사용하여 항체를 정제하였다. 용출된 항체를 Centricon-30 (Amicon)을 사용하여 PBS 내로 완충액 교환하고, 0.5 ㎖로 농축시키고, Millex-GV (Millipore, 미국 매사추세츠주 베드포드)를 사용하여 멸균 여과시켜 4 ℃에서 보관하였다.
최종 인간화 IgG1 변이체 (rhuMAb VEGF)의 안정한 발현을 위해, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포들을, 중쇄와 경쇄를 함께 발현하도록 설계된 디시스트론 벡터 로 형질감염시켰다 [Lucas 등, Nucleic Acid Res. 24:1774-79 (1996)]. 플라스미드를 리포감염(lipofection)을 통해 DP 12 세포 [L. Chasin, 콜롬비아 유니버시티]에 의해 개발된 CHO-K1 DUX B11 세포주의 독점 유도체] 내로 도입시키고, 선별하여 GHT 비함유 배지에서 성장시켰다 [Chisholm, V., High efficiency gene transfer in mammalian cells. In: Glover, DM, Hames, BD, DNA Cloning 4. Mammalian systems. Oxford Univ. Press, Oxford, pp.1-41 (1996)]. 약 20개의 비증폭된 클론을 무작위로 선택하여 96 웰 플레이트에 재시딩하였다. 각각의 콜로니의 비특이적 생산성을, ELISA를 이용하여 3일후 각각의 웰에 축적된 전체 길이의 인간 IgG를 정량하고 웰당 생존 세포수의 대용 마커로서 형광 염료인 Calcien AM을 사용하여 모니터링하였다. 이들 데이타를 기준으로, 몇몇의 비증폭된 클론을 선택하여 증가하는 농도의 메토트렉세이트의 존재 하에 추가로 증폭시켰다. 10, 50 및 100 nM의 메토트렉세이트에서 생존한 개개의 클론을 선택하고, 96 웰 플레이트에 옮겨 생산성을 스크리닝하였다. 높은 비생산성을 재현가능하게 나타내는 하나의 클론을 T-플라스크에서 증식시켜, 스피너(spinner) 배양물을 접종하기 위해 사용하였다. 수회 통과시킨 후, 현탁액에 적응된 세포를 사용하여, 각종 호르몬과 단백질 가수분해물을 보충한 GHT 함유, 무혈청 배지에 생산 배양물을 접종하였다. rhuMAb VEGF를 함유하는 회수된 세포 배양액을 단백질 A-세파로즈 CL-4B를 사용하여 정제하였다. 이 단계후 순도는 ∼99 %이었다. 이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용하여 균질화를 위한 후속 정제를 수행하였다. 최종 정제된 항체의 엔도톡신 함량은 < 0.10 eu/㎎이었다.
F(ab) 및 IgG 정량:
F(ab) 분자를 정량하기 위해, ELISA 플레이트를 4 ℃에서 밤새 50mM 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중에서 2 ㎍/㎖의 염소 항-인간 IgG Fab (Organon Teknika, 노쓰 캐롤라이나주, 더럼)로 도포시키고, 실온에서 1시간 동안 PBS-0.5 % 소 혈청 알부민 (블로킹 완충액)으로 블로킹시켰다. 표준물질 (0.78-50 ng/㎖ 인간 F(ab))을 케미콘사 (Chemicon, 미국 캘리포니아주 테메쿨라)에서 구입하였다. PBS-0.5 % 소 혈청 알부민-0.05 % 폴리소르베이트 20 (분석 완충액) 중 시료의 순차 희석액을 플레이트 상에 2시간 동안 접종하였다. 양고추냉이 페록시다제로 표지한 염소 항-인간 IgG F(ab) (Organon Teknika), 이어서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (Kirkegaard & Perry Laboratories, 매릴랜드주 개터스버그)을 기질로서 사용하여 결합된 F(ab)를 검출하였다. 플레이트를 단계들 사이마다 세척하였다. Vmax 플레이트 판독기 (Molecular Devices, 캘리포니아주 멘로파크) 상에서 450 ㎚에서 흡광도를 판독하였다. 표준 곡선을 4개 파라미터의 비선형 회귀 곡선-피팅 프로그램으로 피팅시켰다. 표준 곡선의 범위 내에 있는 데이타점들을 사용하여 시료의 F(ab) 농도를 계산하였다. 포획을 위해 염소 항-인간 IgG Fc (Cappel, 미국 펜실베니아주 웨체스터)를 사용하고 검출을 위해 양고추냉이 페록시다제로 표지한 염소 항-인간 Fc (Cappel)를 사용하여 전체 길이의 항체의 농도를 측정하였다. 인간 IgG1 (Chemicon)을 표준물질으로 사용하였다.
VEGF 결합 분석:
F(ab)의 VEGF 결합 활성을 측정하기 위해, ELISA 플레이트를 인간 IgG Fc에 대한 2 ㎍/㎖의 토끼 F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch, 미국 펜실베니아주 웨스트그로브)로 코팅시키고 블로킹 완충액(상기함)으로 블로킹시켰다. 블로킹 완충액 중 3 ng/㎖의 KDR-IgG를 함유하는 콘디션닝된 희석 배지 [Park 등, J. Biol. Chem. 269:25646-25645 (1994)]를 플레이트 상에 1시간 동안 접종하였다. 표준물질 (6.9-440 ng/㎖의 키메릭 F(ab))과 시료의 2배 계열 희석액을 튜브 내에서 2nM 비오틴화 VEGF와 함께 1시간 동안 배양시켰다. 이어서, 튜브의 용액을 ELISA 플레이트에 옮기고 1시간 동안 배양시켰다. 세척한 후, KDR에 결합된 비오틴화 VEGF를, 양고추냉이 페록시다제로 표지한 스트렙타비딘 (Zymed, 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 또는 Sigma, 미저리주 세인트루이스), 이어서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 기질로서 사용하여 검출하였다. 적정 곡선을 4개 파라미터의 비선형 회귀 곡선-피팅 프로그램 (KaleidaGraph, Synergy Software, 펜실베니아주 레딩)을 사용하여 피팅시켰다. 표준물질의 적정 곡선의 중간 흡광도에 상응하는 F(ab) 변이체의 농도를 계산한 다음, 표준 적정 곡선의 중간 흡광도에 상응하는 표준물질의 농도로 나누었다. 전체 길이의 IgG에 대한 분석은 분석 완충액이 10 % 인간 혈청을 함유하는 것을 제외하고는 F(ab)에 대한 분석과 동일하였다.
비아코아 (BIAcore, 상표명) 바이오센서 분석:
인간화 및 키메릭 F(ab)의 VEGF 결합을, 비아코아 (상표명) 바이오센서 [Karlsson 등, Methods: A Comparison to Methods in Enzymology 6:97-108 (1994)]를 이용하여 비교하였다. F(ab)의 농도를 정량적 아미노산 분석에 의해 측정하였 다. VEGF를 제조업자의 지시 (Pharmacia)에 따라 1차 아민기를 통해 CM-5 바이오센서 칩에 결합시켰다. 오프-레이트(off-rate) 속도는 칩을 F(ab) (35 ㎕의 2 μM F(ab)를 20㎕/분의 유속으로)로 포화시킨 다음 완충액 (PBS-0.05 % 폴리소르베이트 20)에 교환시킴으로써 측정하였다. 0 내지 4500초의 데이타점을 오프-레이트 속도 분석에 사용하였다. 해리율 상수(koff)는 시간에 대한 In(R0/R) 플롯의 기울기로부터 얻었으며, 이때, R0은 t=0에서의 신호이고 R은 각각의 시점에서의 신호이다.
온-레이트(on-rate) 속도는 F(ab)의 2배 순차 희석액 (0.0625 내지 2 mM)을 사용하여 측정하였다. 기울기 Ks는 파마시아 바이오센서(Pharmacia Biosensor) 매뉴얼에 기술된 바와 같이 BIAcore™ 운동학 평가 소프트웨어를 사용하여, 각각의 F(ab) 농도에 대해 시간에 대한 In(-dR/dt)의 플롯으로부터 얻었다. R은 시간 t에서의 신호이다. 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2 mM F(ab)에 대해 각각 80 및 168, 148, 128, 114, 102 및 92초 사이의 데이타를 사용하였다. 회합율 상수 (kon)는 F(ab) 농도에 대한 Ks 플롯의 기울기로부터 얻었다. 각각의 사이클의 끝에, 5 ㎕의 50 mM HCl을 20 ㎕/분의 유속으로 주입하여 결합된 F(ab)를 제거하여 칩을 재생하였다.
내피 세포 성장 분석:
소 부신 피질에서 유래한 모세관 내피 세포를 본질적으로 이전에 기술된 바와 같이 [Leung 등, Science 246:1306-1309 (1989)], 10 % 송아지 혈청, 2 mM 글루타민과 항생제를 보충한 저글루코스 둘베코(Dulbecco) 변형 이글(Eagle) 배지 (DMEM) (GIBCO) (성장 배지)의 존재 하에 배양하였다. 미토겐 분석을 위해, 내피 세포를 6×103 세포/웰의 밀도로 성장 배지 중에 6웰 플레이트에 시딩하였다. 이어서, muMAb VEGF A.4.6.1 또는 rhuMAb VEGF를 1 내지 5000 ng/㎖ 범위의 농도로 첨가하였다. 2-3시간 후, 이. 콜라이에서 발현된 정제 rhVEGF165를 3 ng/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 특이성 대조를 위해, 각각의 항체를 단독으로 또는 2 ng/㎖의 bFGF의 존재 하에 5000 ng/㎖의 농도로 내피 세포에 첨가하였다. 5 또는 6일 후, 세포를 트립신에 노출시켜 분리시키고 콜터 카운터 (Coulter Electronics, 플로리다주 하이알레아)에서 카운트하였다. 평균으로부터의 편차는 10 %를 초과하지 않았다. 데이타를 4개 파라미터의 곡선 피팅 프로그램 (KaleidaGraph)으로 분석하였다.
생체내 종양 연구:
인간 A673 횡문근육종 세포(ATCC: CRL 1598)를 10 % 태송아지 혈청, 2 mM 글루타민과 항생제를 보충한 DMEM/F12에서 이전에 기술된 바와 같이 배양하였다 [Kim 등, Nature 362:841-844 (1993) 및 Borgstroem 등, Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)]. 6-10주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스에게 200 ㎕ 부피로 등부위에 2×106개의 종양 세포를 피하 주사하였다. 이어서, 동물을 muMAb VEGF A.4.6.1, rhuMAb VEGF, 또는 gp120 단백질에 대한 대조 MAb로 처리하였다 [Kim 등, Nature 362:841-844 (1993)]. 항-VEGF Mab 둘다 0.5 및 5 ㎎/㎏의 투여량으로 투여하고; 대조 MAb는 5 ㎎/㎏의 투여량으로 투여하였다. 각각의 MAb를 종양 세포를 접종한지 24시간 후에 시작하여 매주 2회 100 ㎕의 부피로 복강내 투여하였다. 각각의 군은 10마리의 마우스로 이루어졌다. 종양 크기를 매주 간격으로 측정하였다. 종양 세포를 접종한지 4주후, 동물을 안락사시키고, 종양을 채취하여 칭량하였다. 통계적 분석은 ANOVA에 의해 수행하였다.
<결과>
인간화:
인간 중쇄 아군 III 및 경쇄 아군 kI에 대한 컨센서스 서열을 인간화를 위한 프레임워크로서 사용하였다 [Kabat 등, 상기 문헌] (도 1a 및 도 1b). 이 프레임워크는 다른 설치류 항체의 인간화에 성공적으로 사용되었다 [Werther 등, 상기 문헌; Carter 등, 상기 문헌; Presta 등, J. Immunol. 151:2623-2632 (1993); 및 Eigenbrot 등, Proteins 18:49-62 (1994)]. CDR-H1은 잔기 H26-H35를 포함하였다. 다른 CDR들은 카뱃 등(상기 문헌)에 따른다. 모든 인간화 변이체들을 먼저 제조하여, F(ab)를 이. 콜라이에서 발현시키면서 결합에 대해 스크리닝하였다. 500 ㎖의 진탕 플라스크로부터 전형적인 수율은 0.1 내지 0.4 ㎎ F(ab)였다.
키메릭 F(ab)를 결합 분석에서 표준물질으로서 사용하였다. 최초 변이체인 F(ab)-1에서, CDR 잔기는 인간 프레임워크로 설치류 항체로부터 전달되었고, 설치류 및 인간화 F(ab)의 모델을 기준으로 H49 위치의 잔기 (인간에서 Ala)가 설치류 Gly로 교체되었다. 또한, 키메릭 중쇄/F(ab)-1 경쇄(F(ab)-2)와 F(ab)-1 중쇄/키메릭 경쇄(F(ab)-3)로 이루어진 F(ab)를 생성시켜 결합에 대해 시험하였다. F(ab)-1은 키메릭 F(ab)로부터 1000배 이상 감소된 결합 친화도를 나타냈다 (표 2). F(ab)-2와 F(ab)-3의 결합 친화도를 비교하면, 결합을 증가시키기 위해서는 F(ab)-1 VH 도메인에서 프레임워크 잔기들을 변경시킬 필요가 있음을 제시했다.
VEGF에 대한 인간화 항-VEGF F(ab) 변이체의 결합a
변이체 주형 변화b 목적 EC50 F(ab)-X
EC50 키메릭 F(ab)c
평균 S.D. N
chim-F(ab) 키메릭 F(ab) 1.0
F(ab)-1 인간 FR 직접 CDR 교환 AlaH49Gly >1350 2
F(ab)-2 키메라 경쇄 F(ab)-1 중쇄 >145 3
F(ab)-3 F(ab)-1 경쇄 키메라 중쇄 2.6 0.1 2
F(ab)-4 F(ab)-1 ArgH71Leu AsnH73Thr CDR-H2 배열 프레임워크 >295 3
F(ab)-5 F(ab)-4 LeuL46Val VL-VH 계면 80.9 6.5 2
F(ab)-6 F(ab)-5 LeuH78Ala CDR-H1 배열 36.4 4.2 2
F(ab)-7 F(ab)-5 IleH69Phe CDR-H2 배열 45.2 2.3 2
F(ab)-8 F(ab)-5 IleH69Phe LeuH78Ala CDR-H2 배열 CDR-H1 배열 9.6 0.9 4
F(ab)-9 F(ab)-8 GlyH49Ala CDR-H2 배열 >150 2
F(ab)-10 F(ab)-8 AsnH76Ser 프레임워크 6.4 1.2 4
F(ab)-11 F(ab)-10 LysH75Ala 프레임워크 3.3 0.4 2
F(ab)-12 F(ab)-10 ArgH94Lys CDR-H3 배열 1.6 0.6 4
a 항-VEGF F(ab) 변이체를 비오틴화 VEGF와 함께 배양시킨 다음, KDR-IgG로 코팅된 ELISA 플레이트에 옮겼다 [Park 등, 상기 문헌]. b 설치류 잔기를 밑줄침; 잔기수는 카뱃 등(상기 문헌)에 따름. c 평균과 표준 편차는 각각의 독립 분석에 대해 계산한 비의 평균임; 키메릭 F(ab) 에 대한 EC50은 0.049±0.013 ㎎/㎖ (1.0 nM)이었다.
F(ab)-4에서 인간 잔기 H71과 H73을 이들의 설치류 대응 부분으로 교체시키면, 결합이 4배 증진되었다 (표 2). 설치류 및 인간화 F(ab)의 모델을 조사하면, VL-VH 계면에 묻히고 CDR-H3과 상호작용하는 잔기 L46 (도 2)이 또한 CDR-H3의 배열을 결정하고(하거나) VL 및 VH 도메인들의 관계에 해를 끼치는 역할을 할 수도 있음을 제시한다. L46에서 인간 Leu에 대해 설치류 Val로 교환하면 (F(ab)-5), 결합 친화도가 거의 4배 증가하였다 (표 2). 3개의 다른 묻힌 프레임워크 잔기들: H49, H69 및 H78을 분자량을 기준으로 평가하였다. H69 위치는 CDR-H2의 배열에 영향을 끼칠 수 있으며, H78 위치는 CDR-H1의 배열에 영향을 끼칠 수 있다 (도 2). 각각 인간으로부터 설치류 대응 부분으로 개별적으로 교체시키면, 각각의 경우 결합이 2배 증진하였다 (F(ab)-6 및 F(ab)-7, 표 2). 둘 모두를 동시에 교체시키면, 결합이 8배 증진하였다 (F(ab)-8, 표 2). 잔기 H49는 원래 설치류 Gly로서 포함되었으며; 이를 인간 컨센서스 대응 부분 Ala로 교체시키면, 결합이 15배 감소되었다 (F(ab)-9, 표 2).
F(ab)-10과 F(ab)-11에서는 프레임워크 루프 3, FR3의 2개의 잔기들을 그들의 설치류 대응 부분으로: AsnH76을 설치류 Ser로 (F(ab)-10), LysH75를 설치류 Ala로 (F(ab)-11) 교체시켰다. 둘 모두는 결합을 비교적 약간 개선시켰다 (표 2). 마지막으로, H94 위치에서 인간 및 설치류 서열은 가장 종종 Arg를 갖는다 [Kabat 등, 상기 문헌]. F(ab)-12에서는 이 Arg를 설치류 항체에서 드물게 발견되는 Lys로 교체시켰고 (도 1a), 그 결과 결합이 키메릭 F(ab)로부터 2배 미만이 되었다 (표 2). F(ab)-12를 또한 비아코아 (상표명) 시스템 (Pharmacia)을 사용하여 키메릭 F(ab)와 비교하였다. 이 기법을 이용하면, 인간화 F(ab)-12의 Kd는 보다 느린 kon과 보다 빠른 koff 때문에 키메릭 F(ab)의 Kd보다 2배 더 약했다 (표 3).
비아코아 (상표명) 시스템을 사용하는 VEGF에 대한 항-VEGF F(ab) 변이체의 결합a
변이체 결합된 (Fab)의 양 (RU) koff (s-1) kon (M-1s-1) Kd (nM)
chim-F(ab)b 4250 5.9×10-5 6.5×104 0.91
F(ab)-12 3740 6.3×10-5 3.5×104 1.8
a결합된 F(ab)의 양(공명 단위(RU))은 비아코아 (상표명) 시스템을 사용하여 측정하였고, 이때, 2 ㎍의 F(ab)를 2480 RU의 고정된 VEGF를 함유하는 칩 상에 주입하였다. 오프-레이트 속도(koff)는 칩을 F(ab)로 포화시킨 다음, 완충액에 교환시킨 후 해리를 모니터함으로써 측정하였다. 온-레이트 속도(kon)는 F(ab)의 2배 순차 희석액을 사용하여 측정하였다. 평형 해리 상수 Kd는 Koff/Kon로서 계산하였다. b chim-F(ab)는 인간 CL 및 CH1 중쇄 도메인에 융합된 설치류 VL 및 VH 도메인을 갖는 키메릭 F(ab)임.
키메릭 F(ab)와 변이체 F(ab)-12의 VL 및 VH 도메인을 인간 k 경쇄와 인간 IgG1 중쇄의 불변 도메인에 융합시켜 전체 길이의 mAb를 제작하였다. 전체 길이의 12-IgG1 (인간 IgG1에 융합시킨 F(ab)-12)은 키메릭 IgG1보다 1.7배 더 약한 결합을 나타냈다 (표 4). 12-IgG1 및 키메릭 IgG1은 원래 설치류 mAb A4.6.1보다 약간 덜 결합하였다 (표 4).
VEGF에 대한 항-VEGF IgG 변이체의 결합a
IgG1/chIgG1b
변이체 평균 S.D. N
chIgG1 1.0 2
murIgG1c 0.759 0.001 2
12-IgG1d 1.71 0.03 2
a 항-VEGF IgG 변이체는 비오틴화 VEGF와 함께 배양시킨 다음 KDR-IgG로 도포된 ELISA 플레이트에 옮겼다 [Park 등 (1994), 상기 문헌] b chIgG1은 인간 CL 및 IgG1 중쇄에 융합된 설치류 VL 및 VH 도메인을 갖는 키메릭 IgG1임; chIgG1에 대한 EC50은 0.113±0.013 ㎍/㎖ (0.75 nM)임. c murIgG1은 복수로부터 정제한 muMAb VEGF A461임. d 12-IgG1은 인간 CL 및 IgG1 중쇄에 융합된 F(ab)-12 VL 및 VH 도메인임.
생물학적 연구:
rhuMAb VEGF 및 muMAb VEGF A.4.6.1을, 거의 최대 유효 농도 (3 ng/㎖)의 VEGF에 반응하여 소의 모세관 내피 세포 증식을 억제시키는 그들의 능력에 대해 비교하였다. 도 3에 예시된 바와 같이, 2개의 MAb들은 효력과 효능 면에서 본질적으로 동등하였다. ED50값은 각각 50±5 ng/㎖ 및 48±8 ng/㎖ (∼0.3 nM)이었다. 두 경우 모두, 90 % 억제는 500 ng/㎖ (∼3 nM)의 농도에서 도달하였다. muMAb VEGF A.4.6.1과 rhuMAb VEGF는 모두 모세관 내피 세포의 기초 증식 또는 bFGF-자극된 증식에 영향을 끼치지 않았으며, 이는 억제가 VEGF에 특이적임을 확증한다.
그러한 동등성이 생체내 시스템에서도 또한 적용되는지 여부를 결정하기 위해, 2개의 항체들을 누드 마우스에서 인간 A673 횡문근육종 세포의 성장을 억제시키는 그들의 능력에 대해 비교하였다. 이전의 연구에서는 muMAb VEGF A.4.6.1이 상기 종양 모델에서 극적인 억제 효과가 있음을 보여준다 [Kim 등, Nature 362:841-844 (1993) 및 Borgstroem 등, Cancer Res 56:4032-4039 (1996)]. 도 4에 도시된 바와 같이, 두가지 시험 투여량 (0.5 및 5 ㎎/㎏) 모두에서, 2개의 항체들은 세포 접종 후 4주간의 종양 중량 측정에 의해 평가할 때 종양의 성장을 뚜렷하게 억제하였다. 대조군과 비교하면, 종양 중량의 감소는 muMAb VEGF A.4.6.1로 처리한 동물에서 각각의 투여량에서 각각 85 % 및 93 %였고, rhuMAb VEGF로 처리한 동물에서는 각각 90 % 및 95 %였다. 유방암 세포주 MDA-MB 435를 사용할 때에도 유사한 결과를 얻었다.
<실시예 2>
본 실시예에서, 친화도 기준 선별을 통하여 고 친화도 프레임워크 서열을 동정하기 위하여 작은 세트의 프레임워크 잔기를 랜덤화하고, 필라멘트성 파지의 표면상에 생성된 항체 분자의 라이브러리의 모노밸런트(monovalent) 표시에 의해 상기 논의된 설치류 항-VEGF 항체 A4.6.1을 인간화하였다.
<재료 및 방법>
항-VEGF 파지미드 벡터, pMB4-19의 제작:
설치류 항-VEGF mAB A4.6.1을 상기 실시예 1에서 설명하였다. 인간화 A4.6.1의 제1 Fab 변이체, hu2.0을 인간 VLkI-Ck1 경쇄 및 인간 VHIII-CH1γ1 중쇄 Fd 단편을 코딩하는 플라스미드 pAK2의 데옥시우리딘 함유 주형 [Carter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285-4289 (1992)]을 사용하여 부위 지정 돌연변이 유발에 의하여 제작하였다. 잔기 26-35를 포함하는 CDR-H1의 경우를 제외하고는 상기 카뱃 (Kabat) 등의 문헌의 서열 정의에 따라 이식된 A4.6.1 CDR 서열을 선택하였다. Fab 코딩 서열을 파지미드 벡터 phGHamg3에 서브클론하였다 [Bass 등, Proteins 8:309-314 (1990) 및 Lowman 등, Biochemistry 30:10832-10838 (1991)]. 이 제작물 pMB4-19는 M13 유전자 III 외피 단백질의 카르복실 부분에 정확히 융합되는 중쇄의 C-말단을 갖는 초기 인간화 A4.6.1 Fab, hu2.0을 코딩한다. pMB4-19는 앞서 설명된 Fab 단편의 모노밸런트 표시의 플라스미드 pDH188의 제작과 유사하다 [Garrard 등, Biotechnology 9:1373-1377 (1991)]. pMB4-19 및 pDH188의 중요한 차이는 M13 유전자 III 세그먼트 (코돈 249-406)가 더 짧고, 항체 중쇄 Fd 단편 직후의 앰버 정지 코돈이 사용된다는 것이다. 이로 인해, 분비된 중쇄 또는 중쇄- 유전자 III 융합체 모두가 이. 콜라이의 supE 억제자 균주에서 발현된다.
인간화 A4.6.1 Fab 단편의 발현 및 정제:
비억제자인 이. 콜라이 균주 34B8을 파지미드 pMB4-19, 또는 그의 변이체로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 50 ㎍/ml의 카르베니실린을 함유하는 5 ml의 2YT에서 37 ℃로 밤새 성장시켰다. 이 배양물을 20 ㎍/ml의 카르베니실린을 함유하는 200 ml의 AP5 배지 [Chang 등, Gene 55:189-196 (1987)]로 희석하고, 30 ℃에서 26시간 동안 배양하였다. 4000xg에서 세포를 펠렛화하고, 2 시간 이상 -20 ℃에서 동결하였다. 이어서, 세포 펠렛을 1 mM EDTA를 함유하는 10 mM 트리스-HCl (pH 7.6) 5 ml에 재현탁하고, 4 ℃에서 90 분 동안 진탕하고, 10,000xg에서 15 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 1ml 스트렙토코코스성 단백질 G-세파로오즈 컬럼 (Pharmacia)에 적용하고, 10 mM MES (pH 5.5) 10 ml로 세척하였다. 결합된 Fab 단편을 100 mM 아세트산 2.5 ml로 용출시키고, 즉시 1 M 트리스-HCl (pH 8.0) 0.75 ml로 중화시켰다. Fab 제조물을 PBS로 완충액을 교환하고, 센트리콘-30 농축기 (Amicon)을 사용하여 농축시켰다. 통상 Fab의 수율은 단백질 G 정제후 ∼1 mg/L 배양물이었다. 정제된 Fab 시료를 전자분무 질량 분광기로 특성화하고, 아미노산 분석으로 농도를 결정하였다.
항-VEGF Fab 파지미드 라이브러리의 제작:
문헌 [Kunkel 등, Methods in Enzymol. 204:125-139 (1991)]의 방법에 따라 부위 지정 돌연변이 유발로 인간화 A4.6.1 파지미드 라이브러리를 제작하였다. 돌연변이 주형으로서 사용하기 위해 VH 코돈 24, 37, 67 및 93에서 TAA 정지 트리플렛을 함유하는 pMB4-19의 유도체를 제조하였다 (모든 서열 번호는 상기 Kabat 등의 문헌을 따름). 이러한 변형은 야생 타입 서열에 의한 후속 배경 오염을 방지하기 위한 것이었다. 랜덤화의 표적 코돈은 4 및 71 (경쇄) 및 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 및 94 (중쇄)이었다.
단일 돌연변이성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 중쇄 코돈 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 및 94를 랜덤화하기 위하여, 주형-강화 효소 라이게이션으로 60- 및 66-머 단편으로부터 두개의 126-머 올리고뉴클레오티드를 먼저 예비조합하였다. 구체적으로, 1.5 nmol의 5'-인산화 올리고뉴클레오티드 503-1 (5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (서열 22)) 또는 503-2 (5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT TTA GAC ACC TCC GCA AGC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (서열 23))를 1.5 nmol의 503-3 (5'-AGC CTG CGC GCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT DYA ARG TAC CCC CAC TAT TAT GGG-3' (서열 24)) (밑줄친 랜덤화된 코돈: N=A/G/T/C, W=A/T, B=G/T/C; D=G/A/T; R=A/G; Y=C/T))과 배합하였다. 그 후, 503-1/2의 5'-말단 및 503-3의 3'-말단에 대한 상보적 서열을 갖는 1.5 nmol의 주형 올리고뉴클레오티드 (5'-CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA-3' (서열 25)을 첨가하여 라이게이션 연결부의 각 말단에 혼성화하였다. Taq 리가제 (New England Biolabs에서 시판하는 열안정성 리가제) 및 완충액을 첨가하고, 반응 혼합물을 40회의 가열 주기 (95 ℃, 1.25분; 50℃, 5분)를 수행하여 라이게이트된 및 라이게이트되지 않은 연결부 사이에 주형 올리고뉴클레오티드를 사이클링시켰다. 126-머 올리고뉴클레오티드 생성물을 6% 우레아/TBE 폴리아크릴아미드 겔상에서 정제하고 완충액 중에서 폴리아크릴아미드로부터 추출하였다. 두개의 126-머 생성물을 동일한 비율로 합하고, 에탄올 침전시키고, 최종적으로 10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA에 용해시켰다. 혼합된 126-머 올리고뉴클레오티드 생성물을 504-01로 표지하였다.
선별 프레임워크 코돈 (VL 4, 71; VH 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93, 94)의 랜덤화를 두 단계로 수행하였다. 먼저, VL 랜덤화는 변형된 pMB4-19 주형의 세가지 부가적인 유도체를 제조함으로서 달성되었다. 경쇄에서 프레임워크 코돈 4 및 71은 각각 또는 쌍으로 두 돌연변이성 올리고뉴클레오티드 5'-GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG-3' (서열 26) 및 5'-TCT GGG ACG GAT TAC ACT CTG ACC ATC-3' (서열 27)을 사용하여 치환하였다. 데옥시우리딘-함유 주형은 각각 이들 새로운 유도체로부터 제조하였다. 원래의 주형과 함께, 이들 4개의 제작물이 4개의 가능한 경쇄 프레임워크 서열 조합 각각을 코딩하였다 (표 5).
올리고뉴클레오티드 504-1, 두개의 126-머 올리고뉴클레오티드 (상기 참조)의 혼합물 및 5'-CGT TTG TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC TGG RTC CGT CAG GCC CCG GGT AAG-3' (서열 28)을 사용하여 상기 설명된 4개의 주형 각각을 사용하는 중쇄 프레임워크 코돈을 랜덤화하였다. 4개의 라이브러리를 이. 콜라이 XL-1 블루 세포 (Stratagene)에 일렉트로포레이션시키고, 합하였다. 각각의 형질전환체의 총 수는 > 1.2 × 108개로, 라이브러리의 최대 DNA 서열 수의 1,500 배 정도 였다.
필라멘트성 파지의 표면 상에 항체 단편의 기능적 표시를 위한 다양한 시스템이 개발되었다 [Winter, 등, Ann. Rev. Immunol. 12,433 (1994)]. 이들에는 M13 박테리오파지의 유전자 III 또는 유전자 VIII 외피 단백질과의 융합물로서의 Fab 또는 단일 사슬 Fv(scFv) 단편의 표시가 포함된다. 본원에서 선택된 시스템은 Fab 단편이 유전자 III 융합물로서 단일 표시되는 문헌 [Garrard 등, Biotechn, 9,1373 (1991)]에서 설명된 것과 유사하다 (도 7). 이러한 시스템은 두가지 주목할만한 특징이 있다. 특히, scFv와 달리, Fab 단편은 아비디티 효과에 기인한 긴밀한 결합제의 선별을 방지할 수 있는 이량체 종을 형성하는 경향이 없다. 또한, 표시된 단백질의 모노밸런시는 각각의 파지미드 입자 상의 단백질의 다중 카피의 존재로부터 초래될 수 있는 아비디티 효과의 제2의 잠재적인 공급원을 제거한다 [Bass and Wells, Proteins 8:309 (1990) 및 Lowman 등, Biochemistry 30:10832 (1991)].
인간화 A4.6.1 Fab 단편을 표시하는 파지미드 입자는 이. 콜라이 XL-1 블루 세포에서 증식하였다. 요약하면, 랜덤화된 pMB4-19 제작물을 함유하는 세포를 50 ㎍/ml 카르베니실린 및 1010 M13KO7 헬퍼 파지를 함유하는 25 ml의 2YT 배지에서 37 ℃로 밤새 성장시켰다 (Vieira & Messing Methods Enzymol. 153:3-11, 1987). 폴리에틸렌글리콜 식염수 용액으로 침전시켜 배양 상청액으로부터 파지미드 스톡을 정제하고, 100 ㎕ PBS에 재현탁하였다 (∼1014 파지미드/ml).
인간화 A4.6.1 Fab 변이체의 선별:
정제된 VEGF121 (10 ㎍/ml의 PBS 중의 100 ㎕)을 마이크로타이터 플레이트 웰 상에 4 ℃에서 밤새 도포하였다. 도포 용액을 버리고, 도포되지 않는 웰과 함께 이 웰을 6 % 스킴 밀크로 1 시간 동안 블록킹하고, 0.05 % TWEEN 20 (등록상표명) (세정제)를 함유하는 PBS로 세척하였다. 이어서, 10 ㎕의 파지미드 스톡을 0.1 % BSA 및 0.05 % TWEEN 20을 함유하는 20 mM 트리스 (pH 7.5)를 사용하여 100 ㎕로 희석하고, 각 웰에 첨가하였다. 2 시간 후, 웰을 세척하고, 결합된 파지를 0.1 M 글리신 (pH 2.0) 100 ㎕로 용출하고, 1 M 트리스 (pH 8.0) 25 ㎕로 중화하였다. 이 분액을 사용하여 용출된 파지의 수를 적정하였다. VEGF 도포된 웰로부터 용출된 나머지 파지를 다음 선별 사이클에서 사용하기 위하여 증식시켰다. 총 8회의 선별을 수행한 후, 각 20개의 클론을 선별하여 서열결정하였다 [Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467 (1977)].
VEGF 결합 친화도의 측정:
VEGF121에 대한 인간화 A4.6.1 Fab 변이체의 결합에 대한 결합 (Kon) 및 해리 (koff)율 상수는 파마시아(Pharmacia) BIAcore 인스트루먼트상에서 표면 플라즈몬 공명으로 측정하였다 [Karlsson 등, J. Immunol. Methods 145:229-240 (1991)]. VEGF121은 1차 아미노기를 통하여 바이오센서 칩에 공유적으로 고정되었다. 인간화 A4.6.1 Fab 변이체의 결합은 PBS/0.05% TWEEN 20 중의 Fab 용액을 칩상에서 20 ㎕/분의 유동 속도로 유동하여 측정하였다. 각 결합 측정 이후에, 50 mM의 수성 HCl 5 ㎕로 3 ㎕/분으로 세척하여 고정된 리간드로부터 잔류 Fab를 박리하였다. 단순 모노밸런트 결합 모델 (BIA평가 소프트웨어 v2.0; Pharmacia)을 사용하여 비선형 회귀로 결합 프로파일을 분석하였다.
<결과>
인간화 A4.6.1의 제작:
초기 인간화 A4.6.1 Fab 단편을 제작하고 (hu2.0, 도 5a 및 도 5b), A4.6.1로부터 CDR을 인간 VLkI-VHIII 프레임워크 상에 그래프트하였다. hu2.0에서의 모든 다른 잔기는 인간 서열로서 유지되었다. VEGF에 대한 이러한 변이체의 결합은 너무 약하여 검출될 수 없었다. 다른 약하게 결합하는 인간화 A4.6.1 변이체의 상대 친화도를 기준으로 hu2.0의 결합에 대한 KD는 >7μM로 측정되었다. 이것은 설치류 A4.6.1의 무손상 VL 및 VH 도메인 및 인간 불변 영역으로 이루어지는 키메릭 Fab 제작물의 경우에 1.6 nM의 친화도와 비교된다. 따라서, VEGF에 대한 hu2.0의 결합은 키메라에 대하여 4000 배 이상 감소하였다.
항체 라이브러리의 고안:
프레임워크 군을 본원에서의 인간 프레임워크 서열로 변경하여 하기 표 5 및 도 6에 나타내었다.
항원 결합에 대한 중요한 프레임워크 잔기 및 랜덤화 목적물
프레임워크 잔기 인간 VkLI, VHIII 컨센서스 잔기 설치류 A4.6.1 잔기 랜덤화a
VL 4 Met Met Met, Leu
71 Phe Tyr Phe, Tyr
VH 24 Ala Ala Ala, Val, Thr
37 Val Val Val, Ile
67 Phe Phe Phe, Val, Thr, Leu, Ile, Ala
69 Ile Phe Ile, Phe
71 Arg Leu Argb, Leub Aspb, Thrb, Lysb, Alab, Asnb, Serb
73 Asp Thr
75 Lys Ala
76 Asn Ser
78 Leu Ala Leu, Ala, Val, Phe
93 Ala Ala Ala, Val, Leu, Ser, Thr
94 Arg Lys Arg, Lys
a: 파지미드 라이브러리에서의 아미노산 다양성 b: 모든 설치류 (L71/T73/A75/S76) 또는 모든 인간 (R71/D73/K75/N76) VHIII 테트라드를 수득하기 위하여 랜덤화된 VH71, 73, 75, 76.
인간화 A4.6.1 파지미드 라이브러리를 고안하는데 있어서, 랜덤화할 목적 잔기는 VL 및 VH 서열에서 넓게 분포되어 있는 것을 고려한다. 이들 프레임워크 위치 각각의 동시 랜덤화는 단지 다중 올리고뉴클레오티드의 사용을 통하여만이 달성될 수 있도록 합성 올리고뉴클레오티드 길이의 제한이 필요하였다. 그러나, 올리고뉴클레오티드의 총 수가 증가하면서 돌연변이 유발의 효율 (즉, 돌연변이성 올리고뉴클레오티드로부터 유도된 서열이 혼입되어 수득된 돌연변이의 비율)이 감소하였다. 이러한 문제를 회피하기 위하여, 라이브러리 제작에 두가지 특징이 도입되었다. 첫번째는, 각 가능한 VL 프레임워크 조합을 코딩하는 4개의 상이한 돌연변이 유발 주형을 제조하는 것이었다. 이것은 경쇄 프레임워크의 제한된 다양성 (단지 4개의 상이한 서열)으로 간단히 수행되지만, 돌연변이 유발의 전략으로부터 두개의 올리고뉴클레오티드 대한 필요를 제거하는 것이 유리하였다. 둘째, 작은 합성 단편으로부터 두개의 126-염기 올리고뉴클레오티드를 미리조합하였다. 이것은 두개의 작은 것 이외에 단일의 긴 올리고뉴클레오티드로 VH 코돈 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93 및 94의 랜덤화를 가능하게 하였다. 따라서, 최종 랜덤화 돌연변이 유발 전략은 단지 두개의 올리고뉴클레오티드를 4개의 상이한 주형에 사용하였다.
긴밀하게 결합하는 인간화 A4.6.1 Fab의 선별:
VEGF에 대한 결합을 기준으로 인간화 A4.6.1 Fab 파지미드 라이브러리로부터 변이체를 선별하였다. VEGF-도포 대 비도포된 마이크로타이터 플레이트 웰로부터 용출된 파지의 양을 비교함으로써 측정하였을 때, 기능성 파지미드의 증식은 친화도 패닝의 7번째 까지 증가하였다. 1회의 부가적인 분류 (sorting) 후에, 20개의 클론을 서열결정하여 각 랜덤화된 위치에서 선별된 바람직한 프레임워크 잔기를 동정하였다. 이러한 결과를 표 6에 요약하였으며, 선별된 클론 중에서 강한 콘센서스가 밝혀졌다. 20 개의 클론 중 10개는 동일한 DNA 서열을 가졌으며 hu2.10으로 명명하였다. 랜덤화된 13개의 프레임워크 위치 중, hu2.10 중에서 8개의 치환체가 선별되었다 (VL71; VH 37, 71, 73, 75, 76, 78 및 94). 흥미롭게도, 잔기 VH37 (Ile) 및 78 (Val)은 인간 VHIII 또는 설치류 A4.6.1 서열로서 선별되지 않았다. 이러한 결과는 몇몇 프레임워크 위치가 목적 인간 및 모 설치류 프레임워크 서열을 넘어서는 다양성으로 확장되는 이점을 가질 수 있음을 제안한다.
인간화 A4.6.1 파지미드 Fab 라이브러리로부터 선별된 서열
변이체 잔기 치환
VL VH
4 71 24 37 67 69 71 73 75 76 78 93 94
설치류 A4.6.1 M Y A V F F L T A S A A K
hu2.0 (CDR-그래프트) M F A V F I R N K N L A R
파지 선별 클론:
hu2.1 (2) - Y - I - - - - - - V - K
hu2.2 (2) L Y - I - - - - - - V - K
hu2.6 (1) L - - I T - L T A S V - K
hu2.7 (1) L - - I - - - - - - V - K
hu2.10 (10) - Y - I - - L T A S V - K
hu2.0 및 설치류 A4.6.1 항체 사이의 차이에 밑줄을 그었다. 동일한 클론의 수는 각 파지의 경우에 특성화하였으며, 괄호안에 나타내었다. 파지 선별 클론의 서열에서 줄은 인간 VLkI-VHIII 프레임워크 서열의 선별을 나타낸다(즉, hu2.0에서처럼).
분석된 나머지 10개의 클론 중에서 4개의 독특한 아미노산 서열, hu2.1, hu2.2, hu2.6 및 hu2.7이 있었다. hu2.10 이외에 이들 클론 모두는 위치 VH37 (Ile), 78 (Val) 및 94 (Lys)에서 동일한 프레임워크 치환체를 함유하였으나, 위치 24 및 93에서 인간 VHIII 콘센서스 서열을 보유하였다. 4개의 클론은 경쇄 코딩 서열을 잃어버렸으며, 파지 ELISA 분석으로 실험하였을 때 VEGF에 결합하지 않았다 [Cunningham 등 EMBO J. 13:2508-251 (1994)]. 이러한 인위적인 구조물은 종종 분류 주기의 수를 감소시키거나, 고체 배지에서 라이브러리를 증식함으로써 최소화할 수 있다.
인간화 A4.6.1 변이체의 발현 및 결합 친화도:
진탕 플라스크를 사용하여 파지 선별 변이체 hu2.1, hu2.2, hu2.6, hu2.7 및 hu2.10을 이. 콜라이에서 발현하고, 단백질 G 친화도 크로마토그래피를 사용하여 세포질 추출물로부터 Fab 단편을 정제하였다. 이들 5개의 클론에 대해 회수된 Fab의 수득량은 0.2 (hu2.6) 내지 1.7 mg/L (hu2.1)이었다. 이들 변이체 각각의 항원 (VEGF)에 대한 친화도는 BIAcore 인스트루먼트 상에서 표면 플라스몬 공명에 의하여 측정하였다 (표 7). 이러한 결합 데이터에 대한 분석은 실험된 5개의 변이체 중에서 콘센서스 클론 hu2.10이 VEGF에 대하여 가장 높은 친화도를 갖고 있음을 보여주었다. 따라서, Fab 파지미드 라이브러리를 선택적으로 긴밀한 결합 클론을 위하여 선택적으로 증식하였다. hu2.10에 대하여 계산된 KD는 55 nM로 프레임워크 변화가 없는 hu2.0의 경우(KD >7μM)에 비하여 125배 이상 긴밀하여졌다. 다른 4개의 선별된 변이체 모두는 가장 약한 경우 (hu2.7)의 360 nM의 KD 이하의 범위로 VEGF에 대한 더 약한 결합을 나타내었다. 흥미있게도, hu2.6의 경우 KD 67 nM은 hu2.10의 경우보다 사소하게 약했으며, 서열결정된 20개 클론 중에서 이러한 클론의 단지 하나의 카피가 발견되었다. 이것은 이러한 변이체의 가용성 Fab를 발현시키는 경우에서 처럼 낮은 수준의 발현 및 표시에 기인하는 것일 수 있다. 그러나, 낮은 발현율에도 불구하고, 이러한 변이체는 인간화 항체로서 유용하다.
인간화 A4.6.1 Fab 변이체의 VEGF 결합 친화도
변이체 kon M-1s-1/104 koff 104s-1 KD nM KD (mut)/ KD (A4.6.1)
A4.6.1 키메라 hu2.0 5.4 ND 0.85 ND 1.6 >7000** >4000
파지 선별 클론
hu2.1 0.70 18 260 170
hu2.2 0.47 16 340 210
hu2.6 0.67 4.5 67 40
hu2.7 0.67 24 360 230
hu2.10 0.63 3.5 55 35
*hu2.10V 2.0 1.8 9.3 5.8
*hu2.10V: VLLeu46 → Val의 돌연변이를 갖는 hu2.10 비아코어 결합 측정에서의 측정 오차는 ±25%. **너무 약하여 측정할 수 없음, 하한 결합의 측정치.
인간화 변이체 hu2.1의 추가적인 개선:
초기 인간화 변이체에 대한 항원 친화도에서의 커다란 개선에도 불구하고, VEGF에 대한 hu2.10의 결합은 설치류 A4.6.1 VL 및 VH 도메인을 포함하는 키메릭성 Fab 단편보다 여전히 35배 더 약하였다. 이러한 현저한 차이는 추가적인 돌연변이를 통하여 인간화 프레임워크에서의 추가적인 최적화가 가능하다는 것을 제안하였다. 문헌 [Foote & Winter, J. Mol. Biol. 224:487-499 (1992)]에서 동정된 베르니어(Vernier) 잔기 중에서, 인간 VLkI-VHIII 프레임워크에 대하여 A4.6.1에서 단지 잔기 VL46, VH2 및 VH48이 상이하지만 (도 5a 및 도 5b), 우리의 파지미드 라이브러리에서 랜덤화되지 않았다. 인간화 A4.6.1 Fv 단편의 분자 모델은 VL46이 VL-VH 계면에 있고 CDR-H3의 형태에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다. 더욱이, 이러한 아미노산은 대부분의 VLk 프레임워크에서 거의 항상 루이신이지만 (Kabat 등의 상기 문헌), A4.6.1에서는 발린이다. 따라서, Leu → Val 치환은 hu2.10의 배경에서 이러한 위치에서 이루어졌다. 이러한 새로운 변이체 hu2.10V의 결합 역학에 대한 분석은 VEGF 결합에 대한 KD에서 6배의 추가적인 향상이 있음을 가리키고, 항체 A4.6.1에서의 위치 VL46에서의 발린의 중요성을 보여준다. 따라서, hu2.10V의 경우 KD (9.3 nM)는 키메라의 경우의 6배내이었다. VL46에 비교할 때, 설치류 A4.6.1의 해당 잔기로 VH2 또는 VH48을 치환하는 경우 hu2.10의 결합 친화도에서의 개선이 관찰되지 않았다.
<실시예 3>
본 실시예에서, CDR 랜덤화, 모노밸런트 Fab 파지 표시에 위한 친화도 숙성 및 누적 돌연변이 조합을 사용하여 인간화 항-VEGF 항체의 친화도를 향상시켰다.
인간화 항체 pY0101의 제작:
파지-표시 항체 벡터 phMB4-19-1.6 (도 8a 내지 8e 참조)을 모항체로 사용하였다. 이러한 제작물에서, 항-VEGF는 중쇄가 일부절단된 g3P의 N-말단에 융합된 Fab 단편으로 발현되었다. 경쇄 및 중쇄 모두가 세포질로의 분비를 위한 상류 stII 신호 서열을 갖는 phoA 프로모터의 조절하에 있다. CDR 영역외의 점 돌연변이는 부위 지정 돌연변이 유발에 의하여 이루어지며, 하기 표 8에 나타낸 것처럼, 올리고뉴클레오티드 HL-242, HL-243, HL-245, HL-246, HL-254, HL-256, 및 HL-257과의 VEGF 친화도를 향상시켰다.
지정 돌연변이에 대한 올리고
올리고 번호 영역 치환/코멘트 서열
HL-242 VL M4L 5'-GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCG-3' (서열 29)
HL-243 VL L46V 5'-GCTCCGAAAGTACTGATTTAC-3' (서열 30)
HL-245 VH CDR-7 5'-CGTCGTTTCACTTTTTCTGCAGACACCTCCAGCAACACAGTATACCTG CAGATG-3' (서열 31)
HL-246 VH R98K 5'-CTATTACTGTGCAAAGTACCCCCAC-3' (서열 32)
HL-254 VL Y71F 5'-GGGACGGATTTCACTCTGACCATC-3' (서열 33)
HL-256 VH I37V 5'-GGTATGAACTGGGTCCGTCAGGCCCC-3' (서열 34)
HL-257 VH CDR-7 A72L S76K N77S 5'-CGTCGTTTCACTTTTTCTTTAGACACCTCCAAAAGCACAGCATACCTG CAGATGAAC-3' (서열 35)
그 결과의 변이체를 Y0101로 명명하였다 (도 9a 및 9b).
항체-파지 라이브러리의 제1 세대 제작:
야생 타입 서열에 의한 오염을 방지하기 위하여, 랜덤화의 목적 부위에 TAA 정지 코돈을 갖는 주형을 제조하고, 포화 돌연변이 유발의 경우 축퇴성 NNS 코돈 (N은 A, G, C 및 T의 동일 혼합물이며, S는 G 및 C의 동일 혼합물임)을 사용하여 올리고뉴클레오티드로 부위 지정 돌연변이 유발에 의한 라이브러리를 제작하는데 사용하였다. VL1 및 VH3을 친화도 향상을 위한 잠재적 후보자로서 선택하였다 (도 9a 및 9b). CDR내에서, pYO101 주형으로부터 두개의 라이브러리를 제작하였다. 정지-주형 올리고뉴클레오티드 HL-248 및 HL-249 (표 9), 및 라이브러리 올리고뉴클레오티드 HL-258 및 HL-259 (표 10)을 사용하여 VL1을 돌연변이시켰다. 유사하게, 정지 주형 올리고뉴클레오티드 HL-250, HL-251 및 HL-252 (표 9) 및 라이브러리 올리고뉴클레오티드 HL-260, HL-261, 및 HL-262 (표 10)을 사용하여 VH3에 대하여 3개의 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리 제작물은 하기 표 9 및 10에 요약하였다.
돌연변이를 위한 주형 올리고
올리고 번호 영역/코멘트 서열
HL-248 VL1 5'-GGGTCACCATCACCTGCTAAGCATAATAATAATAAAGCAACTATTTAAACTGG-3' (서열 36)
HL-249 VL1 5'-GCGCAAGTCAGGATATTTAATAATAATAATAATGGTATCAACAGAAACCAGG-3' (서열 37)
HL-250 VH3 5'-GTCTATTACTGTGCAAAGTAATAACACTAATAAGGGAGCAGCCACTGG-3' (서열 38)
HL-251 VH3 5'-GGTACCCCCACTATTATTAATAATAATAATGGTATTTCGACGTCTGGGG-3' (서열 39)
HL-252 VH3 5'-CACTATTATGGGAGCAGCCACTAATAATAATAAGTCTGGGTCAAGGAACCCTG-3' (서열 40)
HL-263 VH1 5'-TCCTGTGCAGCTTCTGGCTAATAATTCTAATAATAAGGTATGAACTGGGTCCG-3' (서열 41)
HL-264 VH2 5'-GAATGGGTTGGATGGATTAACTAATAATAAGGTTAACCGACCTATGCTGCGG-3' (서열 42)
YC-80 VH3 5'-CTGTGCAAAGTACCCGTAATATTAATAATAATAACACTGGTATTTCGAC-3' (서열 43)
YC-100 CDR7 5'-CGTTTCACTTTTTCTTAAGACTAATCCAAATAAACAGCATACCTGCAG-3' (서열 44)
YC-102 VH2 5'-GAATGGGTTGGATGGATTTAATAATAATAAGGTGAACCGACCTATG-3' (서열 45)
라이브러리 제작을 위한 랜덤 올리고
올리고 번호 영역/코멘트 서열
HL-258 VL1 5'-GGGTCACCATCACCTGCNNSGCANNSNNSNNSNNSAGCAACTATTTAAACTGG-3' (서열 46)
HL-259 VL1 5'-GCGCAAGTCAGGATATTNNSNNSNNSNNSNNSTGGTATCAACAGAAACCAGG-3' (서열 47)
HL-260 VH3 5'-GTCTATTACTGTGCAAAGNNSNNSCACNNSNNSGGGAGCAGCCACTGG-3' (서열 48)
HL-261 VH3 5'-TACCCCCACTATTATNNSNNSNNSNNSTGGTATTTCGACGTCTGGGG-3' (서열 49)
HL-262 VH3 5'-CACTATTATGGGAGCAGCCACNNSNNSNNSNNSGTCTGGGGTCAAGGAACCCTG-3' (서열 50)
HL-265 VH1 5'-TCCTGTGCAGCTTCTGGCNNSNNSTTCNNSNNSNNSGGTATGAACTGGGTCCG-3' (서열 51)
HL-266 VH2 5'-GAATGGGTTGGATGGATTAACNNSNNSNNSGGTNNSCCGACCTATGCTGCGG-3' (서열 52)
YC-81 VH3 5'-CTGTGCAAAGTACCCGNNSTATNNSNNSNNSNNSCACTGGTATTTCGAC-3' (서열 53)
YC-101 CDR7 5'-CGTTTCACTTTTTCTNNSGACNNSTCCAAANNSACAGCATACCTGCAG-3' (서열 54)
YC-103 VH2 5'-GAATGGGTTGGATGGATTNNSNNSNNSNNSGGTGAACCGACCTATG-3' (서열 55)
랜덤 돌연변이 반응의 생성물을 XL-1 블루 이. 콜라이 세포 (Stratagene)에 일렉트로포레이션시키고, M13KO7 헬퍼 파지와 함께 15 내지 16 시간 성장시켜 증폭하였다. 각 라이브러리의 복잡성은 2 × 107 내지 1.5 × 108의 범위로 카르베니실린 플레이트 상에서 초기 형질전환의 플레이팅을 기준으로 평가하였다.
초기 친화도 선별:
각 선별 주기에서, 약 109 내지 1010개의 파지를 50 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중 VEGF (재조합체; 잔기 9 내지 109 버젼) 2 ㎍/mL으로 도포된 플레이트 (Nunc Maxisorp 96웰)에의 결합에 대해 스크리닝하고, 50 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중 5% 인스턴트 우유로 블록킹하였다. PBS 중 0.5% 소혈청 알부민 및 0.05% 트윈 20 (상표명)의 존재하에서 실온에서 결합한지 1 내지 2 시간 후, 파지 용액을 제거하고 플레이트를 PBS/트윈 (상표명) (PBS 완충액 중 0.05% 트윈 20 (상표명))으로 10 회 세척하였다. 통상 해리속도가 느린, 친화도가 증가된 변이체를 선별하기 위해, 각 선별 주기가 점차 길어지는 기간 (선별의 첫번째 주기 0 분에서 9번째 주기 3 시간) 동안 플레이트를 PBS/트윈 (상표명) 완충액과 배양하였다. PBS/트윈 (상표명) 완충액을 없앤 후, 남아있는 파지를 0.1 M HCl로 용출한 후 즉시 1/3 부피의 1 M 트리스 (pH 8.0)로 중화하였다. 용출된 파지를 다음 선별 주기를 위해 XL-1 블루 이.콜라이 세포 (Stratagene)에 감염시켜 증식시켰다.
서열결정 데이타 결과, 8/9번째 주기에서 분류한 후일지라도 VL1 라이브러리랜덤화 부위에서 다양한 여러 내성 유형의 잔기가 남아있었다. 이와 반대로, VH3 라이브러리에는 야생 타입 잔기만 보유하거나 매우 보존적인 치환만을 함유하였다. 이는 VL1이 용매 및 결합 계면의 외층에 더 노출되었다는 것을 시사하는 것이다. 이와 달리, VH3은 두드러지게 상이한 측쇄 치환을 나타내지 않으므로 항원 결합에 보다 친밀하게 관여할 수 있다.
결합 친화도의 파지-ELISA 분석:
이들 라이브러리 각각으로부터 대표적인 클론 (빈도수가 높은 서열로 나타내어지는 것)을 모 클론 pY0101에 대한 친화도에 대비하여 그들의 치환에 대해 파지-ELISA 분석으로 분석하였다. 이러한 분석에서 먼저 파지를 연속 희석하여 분획 포화 역가를 측정한 후 일정하게 유지하고 용액 중 VEGF의 농도를 달리하여 (200 nM에서부터 0 nM로) 배양하는데 사용하였다. 이어서 혼합물을 VEGF (2 ㎍/mL)로 미리 도포된 플레이트로 옮기고 5% 인스턴트 우유로 블록킹하고 실온에서 1 시간 동안 평형화하였다. 이어서 파지 용액을 없애고, 양고추냉이 퍼옥시다제의 염소 항-토끼 접합물과 혼합된 토끼 항-파지 항체 용액으로 남아있는 결합 파지를 검출하였다. 실온에서 1 시간 배양한 후, 플레이트를 발색단 기질인 o-페닐렌디아민 (Sigma)으로 디벨로핑하였다. 1/2 부피의 2.5 M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단하였다. 492 nm에서의 광학 밀도를 분광광도계 플레이트 판독기에서 측정하였다.
이들 5개 라이브러리에서 선별된 클론 모두는 파지-ELISA 분석에서 야생 타입 pY0101 보다 약하거나 유사한 친화도를 나타내지만, 라이브러리 HL-258에서 얻은 한 특정 변이체(pY0192)는 발현 수준에서 pY0101에 비해 발현 또는 파지 표시의 명백한 장점 (약 10배)을 나타내었다. 이 클론은 VL 영역에서 돌연변이 S24R, S26N, Q27E, D28Q 및 I29L을 함유하였다 (도 9a). 또한, 변이체는 VH에서 허위 돌연변이 M34I이 있는 것으로 밝혀졌다. 이 변이체는 pY0101 변이체와 비교해 볼 때 VEGF에 대한 결합 친화도에 있어서 현저한 차이를 나타내지 않았다. 파지 상의 Fab 표시 수준 및 파지-ELISA 분석을 위한 신호 대 노이즈의 비율을 개선하기 위해, VL1에서 pY0192의 상응하는 치환을 CDR Ala 돌연변이체 및 항-VEGF의 제2 세대 라이브러리 모두를 제작하기 위해 주형 배경에 혼입하였다.
항VEGF의 CDR의 Ala-스케닝:
CDR 영역의 아미노산 각각에 의해 기인된 에너지를 측정하고 랜덤화의 표적 잔기를 잘 선별하기 위해, 각 잔기에 대해 알라닌을 치환하여 CDR 영역을 스크리닝하였다. 특정 알라닌 치환을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드에 의한 부위 지정 돌연변이 유발을 이용하여 각 Ala 돌연변이체를 제작하였다. Ala가 야생 타입 잔기인 경우, 측쇄 치환의 영향을 시험하기 위해 Ser을 치환하였다. 단일 Ala 돌연변이가 있는 파지 클론을 정제하고 상기와 같이 파지-ELISA로 분석하였다. Ala 스케닝 결과, 여러 위치에서의 Ala-치환은 pY0192와 비교해 볼 때 항원 결합 친화도에 2 내지 150배의 감소 효과를 줄 수 있는 것으로 입증되었다. 또한, VL1이 아닌 VH3가 항원 결합에 관여한다는 종래 관찰 결과를 확인하였다. CDR-Ala 스케닝 결과를 하기 표 11에 요약하였다.
Ala-스케닝 Fab 변이체의 상대적 VEGF 친화도
잔기 VL IC50 (돌연변이체) 잔기 VH IC50 (돌연변이체)
IC50 (야생 타입) IC50 (야생형)
R24A 1 G26A 2
A25S 1 Y27A 34
N26A 1 T28A 1
E27A 1 F29A 16
Q28A 1 T30A 1
L29A 1 N31A >150
S30A 2 Y32A >150
N31A 2 G33A 6
Y32A 2 I34A 6
L33A 2 N35A 66
N34A 4
W50A >150
F50A 1 I51A 4
T51A 1 N52A >150
S52A 1 T53A 9
S53A 1 Y54A 9
L54A 1 T55A 4
H55A 1 G56A 1
S56A 1 E57A 2
P58A 1
Q89A 4 T59A 3
Q90A 3 Y60A 2
Y91A 14 A61S 1
S92A 1 A62S 1
T93A 1 D63A 1
V94A 2 F64A 1
P95A 3 K65A 1
W96A >150 R66A 1
T97A 1
Y99A >150
P100A 38
H101A 4
Y102A 4
Y103A 5
G104A 2
S105A 1
S106A >150
H107A 2
W108A >150
Y109A 19
F110A 25
D111A 2
모든 변이체는 pY0192의 배경 중에 있었다 ("Wt"은 도 9a-b 참조). IC50은 경쟁적 파지-ELISA 분석으로 측정하였다.
가장 큰 Ala 치환의 효과는 Y27A (친화도 34배 감소), N31A, Y32A, W50A, N52A, Y99A, S106A 및 W108A (각각 150배 이상 감소); N35A (66배 감소), P100A (38배 감소) 및 F110A (25배 감소)를 비롯하여 CDR H1, H2 및 H3에서 관찰되었다. 이와 달리, 하나의 VL 치환, 즉 W96A (150배 이상 감소)만이 결합 친화도에 큰 영향을 주었다. 이 결과는 VL3로부터의 기여와 함께 Fab가 VEGF에 결합하는 주된 에너지 결정군이 3개의 VH CDR이라는 것을 가리키는 것이다.
제2 세대 CDR 돌연변이 라이브러리의 고안:
항-VEGF 버젼 Y0192에 현존하는 잔기를 랜덤화한 추가의 2개의 라이브러리를 결정 구조의 검사 결과를 기준으로하여 고안하였다. VH2에서 잔기 52 내지 55를 랜덤화하였는데, 이들이 VEGF와의 결합 계면내에 있기 때문이다. CDR7이라 불리는 추가의 Fab 영역 (도 10b 참조)도 랜덤화의 표적으로 정했는데, 이 루프 내의 다수 잔기가 VEGF와 접촉하지 않으면서 항체의 VH 루프와 접촉하기 때문이다. 이들은 계면 잔기에 대한 2차 영향을 통한 친화도 개선을 위한 가능성 있는 부위를 나타내었다. 잔기 L72, T74 및 S77을 이 CDR7 라이브러리에서 랜덤화하였다.
또한 결정 구조를 기준으로 하여 VH1 CDR에서의 친화도 숙성을 위한 돌연변이에 대한 가능성을 다시 시험하기 위해 본래의 CDR 라이브러리 중 하나를 다시 제작하였다. 잔기 27, 28 및 30 내지 32를 새로운 Y0192 배경을 사용하여 랜덤화하였다.
항-VEGF 라이브러리의 제2 세대 선별:
항원-항체 (F(ab)-12) 복합물의 결정 구조 뿐만 아니라 Ala 스케닝 결과를 기준으로 하여 pY1092 주형 및 정지 주형 올리고뉴클레오티드 (랜덤화를 표적으로 하는 자리에서 정지 코돈을 코딩함) YC-80, YC-100, YC-102, HL-263 및 HL-264를 사용하여 전체 17개의 라이브러리를 제작하였다 (상기 표 9 참조). (랜덤화의 표적인 부위에서 NNS를 사용하는) 상응하는 랜덤화 올리고뉴클레오티드는 YC81, YC101, YC-103, HL-265 및 HL-266이었다 (상기 표 10 참조). 생성된 형질전환체에 의해 복합성이 6 x 107 내지 5 x 108 범위인 라이브러리가 얻어졌고, 이는 라이브러리가 가능한 모든 변이체에 걸쳐 포괄적이라는 것을 제안한다. 파지 라이브러리를 하기 표 12에 기재된 조건을 이용하여 7 내지 8 주기 동안 선별하였다.
Fab 변이체의 2차 선별을 위한 조건
선별 주기 배양 시간 (h) 배양 용액 배양 온도 (℃)
1 0 0 실온
2 1 ELISA 완충액 실온
3 2 1 μM VEGF/ELISA 실온
4 18 1 μM VEGF/ELISA 실온
5 37 1 μM VEGF/ELISA 실온
6 실온에서 17 시간 동안/37 ℃에서 30 시간 동안 1 μM VEGF/ELISA 실온/37 ℃
7 63 1 μM VEGF/ELISA 37 ℃
8 121 1 μM VEGF/ELISA 37 ℃
ELISA 완충액은 PBS 중 0.5% 소혈청 알부민 및 0.05% 트윈 20 (상표명)을 함유하였다. 플레이트 표면에 도포되어 있는 VEGF에 파지가 재결합하는 것을 최소화하기 위해 VEGF를 배양 완충액에 넣었다. 7 내지 8 회 주기의 선별을 거쳐 라이브러리를 분류하여 파지를 풍부하게 얻었다.
제2 세대 클론의 파지-ELISA 분석:
8회 주기의 선별 후, 각 라이브러리에서 얻은 10 내지 20개의 클론을 용출된 파지 풀로 감염된 이.콜라이 (XL1) 콜로니가 있는 카베니실린 함유 플레이트로부터 단리하였다. 콜로니를 단리하고 헬퍼 파지와 함께 성장시키고 서열결정을 위해 단일 가닥의 DNA를 얻었다. VEGF에 보다 우선하여 결합할 수 있도록 선택된 CDR 치환은 파지미드 클론의 DNA 서열에서 유추하였다. 선별된 클론의 샘플링을 하기 표 13에 나타냈다.
제2 세대 Fab 파지 라이브러리에서 얻은 항-VEGF 변이체의 단백질 서열
라이브러리 YC-81로부터의 변이체
명칭 VH3 서열 (잔기 99 - 111)
Y0238-1 YPYYRGTSHWYFD (서열 56)
Y0238-2 YPYYINKSHWYFD (서열 57)
Y0238-3 YPYYYGTSHWYFD (서열 58)
Y0238-4 YPYYYNQSHWYFD (서열 59)
Y0238-5 YPYYIAKSHWYFD (서열 60)
Y0238-6 YPYYRDNSHWYFD (서열 61)
Y0238-7 YPYYWGTSHWYFD (서열 62)
Y0238-8 YPYYRQNSHWYFD (서열 63)
Y0238-9 YPYYRQSSHWYFD (서열 64)
Y0238-10 YPYYRNTSHWYFD (서열 65)
Y0238-11 YPYYKNTSHWYFD (서열 66)
Y0238-12 YPYYIERSHWYFD (서열 67)
Y0228-21 YPYYRNASHWYFD (서열 68)
Y0228-22 YPYYTTRSHWYFD (서열 69)
Y0228-23 YPYYEGSSHWYFD (서열 70)
Y0228-24 YPYYRQRGHWYFD (서열 71)
Y0228-26 YPYYTGRSHWYFD (서열 72)
Y0228-27 YPYYTNTSHWYFD (서열 73)
Y0228-28 YPYYRKGSHWYFD (서열 74)
Y0228-29 YPYYTGSSHWYFD (서열 75)
Y0228-30 YPYYRSGSHWYFD (서열 76)
Y0229-20 YPYYTNRSHWYFD (서열 77)
Y0229-21 YPYYRNSSHWYFD (서열 78)
Y0229-22 YPYYKESSHWYFD (서열 79)
Y0229-23 YPYYRDASHWYFD (서열 80)
Y0229-24 YPYYRQKGHWYFD (서열 81)
Y0229-25 YPYYKGGSHWYFD (서열 82)
Y0229-26 YPYYYGASHWYFD (서열 83)
Y0229-27 YPYYRGESHWYFD (서열 84)
Y0229-28 YPYYRSTSHWYFD (서열 85)
라이브러리 HL-265로부터의 변이체
명칭 VH1 서열 (잔기 26-35)
Y0243-1 GYDFTHYGMN (5/10개의 클론) (서열 86)
Y0243-2 GYEFQHYGMN (서열 87)
Y0243-3 GYEFTHYGMN (서열 88)
Y0243-4 GYDFGHYGMN (서열 89)
Y0243-5 GYDFSHYGMN (서열 90)
Y0243-6 GYEFSHYGMN (서열 91)
라이브러리 YC-101로부터의 변이체
명칭 VH"CDR7" 서열 (잔기 70-79)
Y0244-1 FSVDVSKSTA (서열 92)
Y0244-2 FSLDKSKSTA (서열 93)
Y0244-3 FSLDVWKSTA (서열 94)
Y0244-4 FSIDKSKSTA (서열 95)
DNA 서열결정으로부터 유추할 때 랜덤화 영역만의 서열이 나타났다.
다수의 클론을 모 클론 pY0192와 함께 파지-ELISA 분석으로 시험한 경우, 어느 것도 모 클론에 비해 특징적인 개선을 나타내지 않았다. 이것은 분석을 수행하는 시간 스케일 (3 시간 미만)로 설명할 수 있다.
모 클론에 대한 항원 결합의 개선을 정량화하기 위해 다수 항-VEGF 변이체의 DNA를 Fab로서 발현되는, 이.콜라이 균주 34B8에 형질전환시키고, 하기 실시예 2에 기재된 바와 같이, 주변세포질 쇽케이트 (shockate)를 단백질 G 컬럼 (Pharmacia)으로 통과시켜 정제하였다.
CDR 조합 변이체:
VEGF 결합 친화도를 더 개선하기 위해 파지 표시에 의해 발견된 돌연변이를 서로 다른 CDR과 조합하여 복합 CDR 돌연변이체를 제조하였다. 특히 결합 친화도에 미치는 이들의 영향을 시험하기 위해, VH1, VH2 및 VH3 라이브러리에서 얻은 친화도가 가장 많이 개선된 파지 변이체에서 확인된 돌연변이를 조합하였다 (하기 표 14 참조).
CDR 항-VEGF 변이체 조합
명칭 모 클론 돌연변이 유발 올리고/평가 서열
Y0313-1 Y0243-1 YC-115 (VH3; H101Y 및 S105T) 5'-GCAAAGTACCCGTACTATTATGGGACGA GCCACTGGTATTTC-3' (서열 96)
Y0317 Y0313-1 YC-108 (VL1이 야생 타입으로 복귀) 5'-GTCACCATCACCTGCAGCGCAAGTCAGGA TATTAGCAACTATTTAAAC-3' (서열 97)
Y0313-3 Y0238-3 YC-116 (VH3; T105S) 5'-CCGTACTATTATGGGAGCAGCCACTGGTAT TTC-3' (서열 98)
상기 모 벡터에서의 돌연변이를 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 상기 올리고뉴클레오티드에서부터 얻은 것과 조합하여 열거된 조합 변이체를 얻었다.
버젼 Y0317은 VL1에서의 배경 돌연변이가 제거되고 그 서열이 pY0101의 것으로 복귀되었다는 것을 제외하고는 Y0313-1과 동일하다. H101Y 및 S105T를 돌연변이시킨 효과를 Y0238-3에서 얻은 복귀 돌연변이체를 제작하여 시험하였다.
비아코어 (BIAcore) 분석:
Fab 단편의 VEGF 결합 친화도를 비아코어-2000 (BIAcore-2000 (상표명)) 표면 플라스몬 공명 시스템 (BIAcore, Inc., 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 이용하여 측정한 결합 및 해리 속도 상수에서부터 계산하였다. VEGF의 공유결합 커플링을 위해 공급업자 (BIAcore, Inc., 미국 뉴저지주 피스카타웨이)의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 사용하여 바이오센서 칩 (Biosensor chip)을 활성화하였다. VEGF를 완충시켜 20 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 교환하고, 약 50 ㎍/mL로 희석하였다. 커플링된 단백질의 약 700 내지 1400 반응 유닛 (RU)을 달성하도록 분액 (35 μL)을 2 μL/분의 유속으로 주입하였다. 마지막으로, 1 M 에탄올아민을 블록킹제로 주입하였다.
동력학 측정을 위해 2배 연속 희석한 Fab를 25 ℃에서 10 μL/분의 유속으로 PBS/트윈 (상표명) 완충액 (인산염 완충 염수 중 0.05% 트윈 20 (상표명))에 주입하였다. 온 및 오프-속도를 표준 프로토콜을 이용하여 계산하였다[Karlsson 등 J. Immun. Methods 145:229-240 (1991)]. 표면 플라스몬 공명 (SPR)에서의 평형 해리 상수 kd를 koff/kon 로서 계산하였다. 데이타를 하기 표 15에 나타냈다.
비아코어 (상표명) 측정값에서 얻은 Fab-VEGF 결합의 동력학
변이체 kon (104/M/s) koff (10-4/s) kd (nM) Kd (wt)/Kd (mut)
Y0244-1 3.4 2.7 8 3.6
Y0244-4 5.2 1.7 3.3 0.9
Y0243-1 6.7 0.45 0.7 4.1
Y0238-3 1.7 ≤0.04* ≤0.2* ≥14*
Y0238-7 1.5 ≤0.06* ≤0.4* ≥7.3*
Y0238-10 1.6 0.09 0.6 4.8
Y0238-5 0.8 0.08 0.9 3.2
Y0238-1 2.6 0.09 0.4 7.3
Y0313-1 3.5 ≤0.054* ≤0.15* ≥20*
Y0313-3 1.2 0.081 0.65 4.5
*오프-속도는 비아코어에 의해 검출 한계에 근접하기 때문에 관찰된 해리 상수는 본 실시예의 진정 해리속도에 대한 상한값을 아마도 반영한다.
표 15의 비아코어 (상표명) 데이타는 다수 변이체가 Y0192에 비해 친화도가 개선되었음을 나타낸다. 예를 들어, 돌연변이 T28D 및 N31H에서 발생한, CDRH1 변이체, Y0243-1은 친화도가 4.1배 높아졌다. 변이체 Y0238-3은 Y0192에 비해 결합 친화도가 14배 이상 개선된 것으로 나타났다. T105에서 S로의 복귀 (변이체 Y0313-3)가 0.15 nM에서 0.65 nM로 Y0238-3의 친화도를 감소시키기 때문에 CDRH3 돌연변이 둘다 Y0238-3의 친화도 개선에 기여하였다 (표 15 참조). Y0192에 비해 친화도가 더 크게 향상된 것은 CDRH1 돌연변이와 조합된 CDRH3 돌연변이가 함유된 Y0313-1에서 볼 수 있다.
세포를 기준으로한 VEGF 억제 분석:
A4.6.1 항-VEGF 항체의 다수 버젼을 HuVECs (인간 제대 정맥 내피 세포)의 성장 유도시 VEGF (재조합체; 버젼 1 - 165)를 길항하는 능력에 대해 시험하였다. 96웰 플레이트에 웰 당 1000 HuVECs를 접종하고, 24 시간 동안 분석용 배지 (1.5% 투석여과된 소 혈청으로 보충된 F12:DMEM 50:50)에서 영양 공급을 하지 않았다. 세포를 유도하는데 사용된 VEGF의 농도를 먼저 최대 DNA 합성의 80%를 자극할 수 있는 VEGF의 양을 적정하여 측정하였다. 이어서 고정량의 VEGF (0.2 nM 최종 농도)를 함유하고 항-VEGF Fab 또는 Mab의 농도를 증가시킨 신선한 분석용 배지를 첨가하였다. 40 시간 동안 배양한 후 적정한 티미딘을 혼입하여 DNA 합성을 측정하였다. 24 시간 동안 세포에 웰 당 [3H]-티미딘 0.5 μCi를 가하고 모아서 탑카운트 (TopCount) 감마 카운터를 이용하여 카운트하였다.
그 결과 (도 11 참조) F(ab)-12의 전체 길이의 IgG형은 VEGF 활성을 억제하는데 있어서 Fab형 (본 발명에서는 Y0192가 사용됨) 보다 더 현저히 강력한 것으로 나타났다. 그러나, 변이체 Y0238-3 및 Y0313-1 둘다 Y0192 Fab 또는 F(ab)-12 Mab 중 어느 하나 보다 더 강력히 VEGF 활성을 억제하는 것으로 나타났다. Fab형들을 비교해 볼 때 변이체 Y0313-1은 야생형 Fab 보다 30배 이상 더 강력한 것으로 나타났다. 본 분석에서 사용된 VEGF의 양 (0.2 nM)이 돌연변이체에 대한 정확한 IC50을 측정하는데 있어 제한적일 수 있음을 주의해야 한다. 예를 들어, 돌연변이체의 결합 친화도 (Kd)가 사실상 0.2 nM 미만인 경우, 본 실시예에서의 IC50은 보다 낮은 VEGF 농도의 조건하에서는 보다 수치가 높게 나타났다. 따라서 이 결과는 친화도가 개선된 변이체가 VEGF에 대해 30배 이상 친화도가 개선되고 시험관내에 VEGF 활성을 효과적으로 볼록킹한다는 결론을 지지해준다. 변이체 Y0317은 VL1 서열의 야생형으로의 복귀시에서만 Y0313-1과 다르기 때문에 (도 10a), Y0317은 Y0313-1과 유사한 활성을 가질 것으로 예측된다.
변이체 Y0317 (Fab) 및 실시예 1에서 얻은 인간화 변이체 F(ab)-12 (전체 길이 및 Fab)는 실시예 1에 기재된 분석을 이용한 VEGF의 최대 근접한 유효 농도에 대해 소 모세혈관 내피 세포를 억제하는 능력과 비교하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, Y0317은 소 모세혈관 내피 세포 증식을 억제하는데 이 분석의 F(ab)-12의 전체 길이 및 Fab형 보다 훨씬 더 효과적이었다. Y0317 친화도 숙성된 Fab는 이 분석에서 ED50 값이 F(ab)-12 Fab 보다 약 20배 이상 낮은 것으로 입증되었다.
도 1a및 도 1b는 muMAbVEGF A.4.6.1의 중쇄 가변 도메인 (서열 9) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 10), 인간화 F(ab) (F(ab)-12)의 중쇄 가변 도메인 (서열 7) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 8) 및 인간 컨센서스 프레임워크 (중쇄 하위군 III에 대한 hum III (서열 11); 경쇄 κ 하위군 I에 대한 humκ1 (서열 12))의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 1a에는 중쇄 가변 도메인 서열이 배열되어 있고, 도 1b에는 경쇄 가변 도메인 서열이 배열되어 있다. 인간화 F(ab)-12와 설치류 MAb, 또는 F(ab)-12와 인간의 프레임워크 간의 차이는 별표로 표시한다. 상보성 결정 영역 (CDR)에는 밑줄을 그었다.
도 2는 인간화 F(ab)-12 VL 및 VH 도메인 모델의 리본 다이아그램이다. VL 도메인은 황갈색의 CDR을 갖는 갈색으로 나타내어진다. 잔기 L46의 측쇄는 황색으로 나타내어진다. VH 도메인은 핑크색의 CDR을 갖는 보라색으로 나타내어진다. 인간에서 설치류로 변하는 VH 잔기의 측쇄는 황색으로 나타내어진다.
도 3은 실시예 1의 인간화 항-VEGF F(ab)-12에 의한 VEGF 유도 유사 분열의 억제율을 나타낸다. 소의 부신 피질의 모세관 내피 세포를 실시예 1에서 기재되어 있는 바와 같이, 6개의 웰 플레이트에 웰 1개 당 세포 6×103개의 밀도로 시딩하였다. muMAb VEGF A.4.6.1 또는 rhuMAb VEGF (IgG1; F(ab)-12)를 표시된 농도로 첨가하였다. 2 내지 3 시간 후, rhVEGF165를 최종 농도인 3 ng/ml로 가하였다. 5 내지 6일 후, 세포를 트립신처리하여 카운트하였다. 나타낸 수치들은 이중 측정의 평균이다. 평균의 편차는 10%를 넘지 않았다.
도 4는 실시예 1의 인간화 항-VEGF F(ab)-12에 의한 생체내 종양 성장의 억제율을 나타낸다. A673 횡문 근육종 세포를 마우스 당 2×106의 밀도로 BALB/c 누드 마우스에게 주사하였다. 종양 세포를 접종한지 초기 24 시간 후, 동물들에게 대조 MAb, muMAb VEGF A.4.6.1 또는 rhuVEGF MAb (IgG1;F(ab)-12)를 주 2회 복막내로 주사하였다. 대조 Mab의 투여량은 5 mg/kg였고, 항-VEGF MAb는 표시된 대로 (n=10) 0.5 또는 5 mg/kg로 투여하였다. 종양 세포를 주사한지 4주 후, 동물을 안락사시키고, 종양을 제거하여 칭량하였다 (*: ANOVA (p<0.05)에 의한 대조군과의 비교시 유의한 차이).
도 5a 및 5b는 설치류 항체 A4.6.1 (VL에 대한 서열 10 및 VH에 대한 서열 9) 및 실시예 2의 인간화 A4.6.1. 변이체 hu2.0 (VL에 대한 서열 13 및 VH에 대한 서열 14) 및 hu2.10 (VL에 대한 서열 15 및 VH에 대한 서열 16) 각각의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열의 넘버링은 문헌 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 의한 것이며, 미스매치는 별표 (설치류 A4.6.1 대 hu2.0) 또는 큰점 (hu2.0 대 hu2.10)으로 표시한다. 변이체 hu2.0은 인간의 경쇄 κ 아군 I 컨센서스 프레임워크 (서열 12) 및 중쇄 아군 III 컨센서스 프레임워크 (서열 11)에 이식된 설치류 항체로부터의 CDR 서열 (굵은선)만을 함유한다. hu2.10은 본 명세서에 기재된 파지 분류 실험에서 얻은 컨센서 스 인간화 클론이었다.
도 6은 실시예 2에서 랜덤화를 위해 표적된 프레임워크 잔기를 나타낸다.
도 7은 파지에서의 Fab-pIII 융합체의 표면 표시를 위한 파지미드 구조물을 나타낸다. 파지미드는 M13 유전자 III 코트 단백질의 일부에 융합된 항체 A4.6.1에 대한 Fab 단편의 인간화 버젼을 코딩한다. 융합 단백질은 중쇄의 카르복실 말단에서 (supE E. Coli에서의 앰버 코돈의 억제로부터의) 단일 글루타민 잔기, 이어서 유전자 III 단백질의 C-말단 영역(잔기 249-406)에 결합된 Fab로 구성된다. F+ 이. 콜라이(E. Coli)에 형질전환된 후, M13K07 헬퍼 파지로 복감염되어 이들의 작은 분율이 융합 단백질의 단일 카피를 나타내는 파지미드 입자를 생성시킨다.
도 8a-e는 실시예 3에서의 파지-표시 항체 벡터 phMB4-19-1.6에 대한 뉴클레오티드 서열 (서열 99) 및 이로써 코딩된 2개의 아미노산 서열 (서열 100 및 130)을 나타낸다.
도 9a 및 9b는 실시예 1의 F(ab)-12 (경쇄 및 중쇄 가변 도메인 각각에 대한 서열 8 및 서열 7)와 비교하여, 실시예 3에서의 친화도 숙성된 항-VEGF 변이체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 각각에 대한 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. CDR에는 밑줄을 그었고, L(경쇄) 또는 H(중쇄) 및 숫자 1 내지 3으로 표시하였다. 잔기는 카바트(Kabat) 넘버링 식과는 반대로, VL 및 VH 도메인에서 순차적으로 넘버링하였다. 주형 분자인 MB1.6 (경쇄 및 중쇄 가변 도메인 각각에 대해 서열 101 및 102)는 변이체 H2305.6 (경쇄 및 중쇄 가변 도메인 각각에 대해 서열 103 및 104), Y0101 (경쇄 및 중쇄 가변 도메인 각각에 대해 서열 105 및 106) 및 Y0192 (경쇄 및 중쇄 가변 도메인 각각에 대해 서열 107 및 108)와 함께 나타내었다. F(ab)-12와 상이한 부분은 회색 상자로 나타내었다.
도 10a 및 10b는 실시예 1의 F(ab)-12 (경쇄 및 중쇄 가변 도메인 각각에 대한 서열의 8 및 7)와 비교하여, 실시예 3에서의 친화도 성숙된 항-VEGF 변이체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 각각에 대한 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. CDR에는 밑줄을 그었고, L(경쇄) 또는 H(중쇄) 및 숫자 1 내지 3으로 표시하였다. 변이체는 Y0243-1 (경쇄 및 중쇄 가변 도메인 각각에 대해 서열 109 및 110), Y0238-3 (경쇄 및 중쇄 가변 도메인 각각에 대해 서열 111 및 112), Y0313-1 (경쇄 및 중쇄 가변 도메인 각각에 대해 서열 113 및 114) 및 Y0317 (경쇄 및 중쇄 가변 도메인 각각에 대해 서열 115 및 116)로 나타내었다. F(ab)-12와 상이한 부분은 회색 상자로 나타내었다.
도 11은 실시예 1의 전체 길이의 F(ab)-12 뿐만 아니라 변이체 Y0238-3, Y0192 및 Y0313-1에 대한 실시예 3에서의 HuVEC 활성 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 실시예 1의 전체 길이의 F(ab)-12 (rhuMAb VEGF), 실시예 1의 F(ab)-12의 Fab 단편 (rhuFab VEGF) 및 실시예 3의 친화도 숙성된 변이체 Y0317의 Fab 단편 (rhuFab VEGF (친화도 숙성됨))에 의한 VEGF 유도 유사 분열의 억제율을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Baca, Manuel Wells, James A. Presta, Leonard G. Lowman, Henry B. Chen, Yvonne M. (ii) TITLE OF INVENTION: ANTI-VEGF ANTIBODIES (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 131 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Genentech, Inc. (B) STREET: 1 DNA Way (C) CITY: South San Francisco (D) STATE: California (E) COUNTRY: USA (F) ZIP: 94080 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: 3.5 inch, 1.44 Mb floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: WinPatin (Genentech) (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: 08/908,469 (B) FILING DATE: 06-AUG-97 (C) CLASSIFICATION: (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: 08/833,504 (B) FILING DATE: 07-APR-1997 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Cui, Steven X. (B) REGISTRATION NUMBER: 44,637 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: P1093P1 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: 650/225-8674 (B) TELEFAX: 650/952-9881 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 17 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 1 5 10 15 Lys Arg (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 14 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 11 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 7 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: Phe Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 9 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 123 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120 Val Ser Ser (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 108 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 123 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Gln Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser 65 70 75 Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Asp Asp 80 85 90 Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr 110 115 120 Val Ser Ser (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 108 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10: Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Ile Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 Ile Lys Arg (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 113 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ser Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 95 100 105 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 108 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12: Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 107 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13: Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 123 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120 Val Ser Ser (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 107 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15: Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 123 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Ala Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120 Val Ser Ser (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 11 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17: Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 7 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18: His Gln Ser Leu Gly Thr Gln 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19: His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20: His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21: Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 66 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22: GATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTAGA GACAACTCCA AAAACACABY 50 TTACCTGCAG ATGAAC 66 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:23: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 66 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23: GATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTTTA GACACCTCCG CAAGCACABY 50 TTACCTGCAG ATGAAC 66 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:24: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 60 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24: AGCCTGCGCG CTGAGGACAC TGCCGTCTAT TACTGTDYAA RGTACCCCCA 50 CTATTATGGG 60 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25: CTCAGCGCGC AGGCTGTTCA TCTGCAGGTA 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26: GCTGATATCC AGTTGACCCA GTCCCCG 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27: TCTGGGACGG ATTACACTCT GACCATC 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:28: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 75 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:28: CGTTTGTCCT GTGCARYTTC TGGCTATACC TTCACCAACT ATGGTATGAA 50 CTGGRTCCGT CAGGCCCCGG GTAAG 75 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:29: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29: GATATCCAGT TGACCCAGTC CCCG 24 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:30: GCTCCGAAAG TACTGATTTA C 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:31: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 54 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31: CGTCGTTTCA CTTTTTCTGC AGACACCTCC AGCAACACAG TATACCTGCA 50 GATG 54 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 25 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:32: CTATTACTGT GCAAAGTACC CCCAC 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33: GGGACGGATT TCACTCTGAC CATC 24 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 26 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34: GGTATGAACT GGGTCCGTCA GGCCCC 26 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 57 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:35: CGTCGTTTCA CTTTTTCTTT AGACACCTCC AAAAGCACAG CATACCTGCA 50 GATGAAC 57 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:36: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 53 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:36: GGGTCACCAT CACCTGCTAA GCATAATAAT AATAAAGCAA CTATTTAAAC 50 TGG 53 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:37: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 52 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:37: GCGCAAGTCA GGATATTTAA TAATAATAAT AATGGTATCA ACAGAAACCA 50 GG 52 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:38: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 48 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:38: GTCTATTACT GTGCAAAGTA ATAACACTAA TAAGGGAGCA GCCACTGG 48 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:39: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 49 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39: GGTACCCCCA CTATTATTAA TAATAATAAT GGTATTTCGA CGTCTGGGG 49 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:40: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 53 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40: CACTATTATG GGAGCAGCCA CTAATAATAA TAAGTCTGGG TCAAGGAACC 50 CTG 53 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:41: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 53 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41: TCCTGTGCAG CTTCTGGCTA ATAATTCTAA TAATAAGGTA TGAACTGGGT 50 CCG 53 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:42: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 52 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:42: GAATGGGTTG GATGGATTAA CTAATAATAA GGTTAACCGA CCTATGCTGC 50 GG 52 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:43: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 49 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:43: CTGTGCAAAG TACCCGTAAT ATTAATAATA ATAACACTGG TATTTCGAC 49 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:44: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 48 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:44: CGTTTCACTT TTTCTTAAGA CTAATCCAAA TAAACAGCAT ACCTGCAG 48 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:45: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 46 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:45: GAATGGGTTG GATGGATTTA ATAATAATAA GGTGAACCGA CCTATG 46 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:46: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 53 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:46: GGGTCACCAT CACCTGCNNS GCANNSNNSN NSNNSAGCAA CTATTTAAAC 50 TGG 53 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:47: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 52 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:47: GCGCAAGTCA GGATATTNNS NNSNNSNNSN NSTGGTATCA ACAGAAACCA 50 GG 52 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:48: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 48 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:48: GTCTATTACT GTGCAAAGNN SNNSCACNNS NNSGGGAGCA GCCACTGG 48 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:49: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 49 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:49: GGTACCCCCA CTATTATNNS NNSNNSNNST GGTATTTCGA CGTCTGGGG 49 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:50: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 54 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:50: CACTATTATG GGAGCAGCCA CNNSNNSNNS NNSGTCTGGG GTCAAGGAAC 50 CCTG 54 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:51: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 53 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:51: TCCTGTGCAG CTTCTGGCNN SNNSTTCNNS NNSNNSGGTA TGAACTGGGT 50 CCG 53 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:52: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 52 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:52: GAATGGGTTG GATGGATTAA CNNSNNSNNS GGTNNSCCGA CCTATGCTGC 50 GG 52 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:53: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 49 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:53: CTGTGCAAAG TACCCGNNST ATNNSNNSNN SNNSCACTGG TATTTCGAC 49 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:54: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 48 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:54: CGTTTCACTT TTTCTNNSGA CNNSTCCAAA NNSACAGCAT ACCTGCAG 48 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:55: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 46 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:55: GAATGGGTTG GATGGATTNN SNNSNNSNNS GGTGAACCGA CCTATG 46 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:56: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:56: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:57: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:57: Tyr Pro Tyr Tyr Ile Asn Lys Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:58: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:58: Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:59: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:59: Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Asn Gln Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:60: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:60: Tyr Pro Tyr Tyr Ile Ala Lys Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:61: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:61: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asp Asn Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:62: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:62: Tyr Pro Tyr Tyr Trp Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:63: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:63: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Asn Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:64: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:64: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:65: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:65: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:66: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:66: Tyr Pro Tyr Tyr Lys Asn Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:67: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:67: Tyr Pro Tyr Tyr Ile Glu Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:68: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:68: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Ala Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:69: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:69: Tyr Pro Tyr Tyr Thr Thr Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:70: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:70: Tyr Pro Tyr Tyr Glu Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:71: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:71: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Arg Gly His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:72: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:72: Tyr Pro Tyr Tyr Thr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:73: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:73: Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:74: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:74: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Lys Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:75: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:75: Tyr Pro Tyr Tyr Thr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:76: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:76: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Ser Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:77: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:77: Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:78: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:78: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:79: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:79: Tyr Pro Tyr Tyr Lys Glu Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:80: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:80: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asp Ala Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:81: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:81: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Lys Gly His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:82: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:82: Tyr Pro Tyr Tyr Lys Gly Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:83: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:83: Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ala Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:84: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:84: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gly Glu Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:85: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:85: Tyr Pro Tyr Tyr Arg Ser Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:86: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:86: Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:87: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:87: Gly Tyr Glu Phe Gln His Tyr Gly Met Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:88: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:88: Gly Tyr Glu Phe Thr His Tyr Gly Met Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:89: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:89: Gly Tyr Asp Phe Gly His Tyr Gly Met Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:90: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:90: Gly Tyr Asp Phe Ser His Tyr Gly Met Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:91: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:91: Gly Tyr Glu Phe Ser His Tyr Gly Met Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:92: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:92: Phe Ser Val Asp Val Ser Lys Ser Thr Ala 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:93: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:93: Phe Ser Leu Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:94: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:94: Phe Ser Leu Asp Val Trp Lys Ser Thr Ala 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:95: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:95: Phe Ser Ile Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:96: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 42 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:96: GCAAAGTACC CGTACTATTA TGGGACGAGC CACTGGTATT TC 42 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:97: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 48 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:97: GTCACCATCA CCTGCAGCGC AAGTCAGGAT ATTAGCAACT ATTTAAAC 48 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:98: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:98: CCGTACTATT ATGGGAGCAG CCACTGGTAT TTC 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:99: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 6072 base pairs (B) TYPE: Nucleic Acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:99: GAATTCAACT TCTCCATACT TTGGATAAGG AAATACAGAC ATGAAAAATC 50 TCATTGCTGA GTTGTTATTT AAGCTTTGGA GATTATCGTC ACTGCAATGC 100 TTCGCAATAT GGCGCAAAAT GACCAACAGC GGTTGATTGA TCAGGTAGAG 150 GGGGCGCTGT ACGAGGTAAA GCCCGATGCC AGCATTCCTG ACGACGATAC 200 GGAGCTGCTG CGCGATTACG TAAAGAAGTT ATTGAAGCAT CCTCGTCAGT 250 AAAAAGTTAA TCTTTTCAAC AGCTGTCATA AAGTTGTCAC GGCCGAGACT 300 TATAGTCGCT TTGTTTTTAT TTTTTAATGT ATTTGTAACT AGAATTCGAG 350 CTCGGTACCC GGGGATCCTC TAGAGGTTGA GGTGATTTTA TGAAAAAGAA 400 TATCGCATTT CTTCTTGCAT CTATGTTCGT TTTTTCTATT GCTACAAACG 450 CGTACGCTGA TATCCAGTTG ACCCAGTCCC CGAGCTCCCT GTCCGCCTCT 500 GTGGGCGATA GGGTCACCAT CACCTGCAGC GCAAGTCAGG ATATTAGCAA 550 CTATTTAAAC TGGTATCAAC AGAAACCAGG AAAAGCTCCG AAACTACTGA 600 TTTACTTCAC CTCCTCTCTC CACTCTGGAG TCCCTTCTCG CTTCTCTGGA 650 TCCGGTTCTG GGACGGATTA CACTCTGACC ATCAGCAGTC TGCAGCCAGA 700 AGACTTCGCA ACTTATTACT GTCAACAGTA TAGCACCGTG CCGTGGACGT 750 TTGGACAGGG TACCAAGGTG GAGATCAAAC GAACTGTGGC TGCACCATCT 800 GTCTTCATCT TCCCGCCATC TGATGAGCAG TTGAAATCTG GAACTGCTTC 850 TGTTGTGTGC CTGCTGAATA ACTTCTATCC CAGAGAGGCC AAAGTACAGT 900 GGAAGGTGGA TAACGCCCTC CAATCGGGTA ACTCCCAGGA GAGTGTCACA 950 GAGCAGGACA GCAAGGACAG CACCTACAGC CTCAGCAGCA CCCTGACGCT 1000 GAGCAAAGCA GACTACGAGA AACACAAAGT CTACGCCTGC GAAGTCACCC 1050 ATCAGGGCCT GAGCTCGCCC GTCACAAAGA GCTTCAACAG GGGAGAGTGT 1100 TAAGCTGATC CTCTACGCCG GACGCATCGT GGCCCTAGTA CGCAACTAGT 1150 CGTAAAAAGG GTATCTAGAG GTTGAGGTGA TTTTATGAAA AAGAATATCG 1200 CATTTCTTCT TGCATCTATG TTCGTTTTTT CTATTGCTAC AAACGCGTAC 1250 GCTGAGGTTC AGCTGGTGGA GTCTGGCGGT GGCCTGGTGC AGCCAGGGGG 1300 CTCACTCCGT TTGTCCTGTG CAGCTTCTGG CTATACCTTC ACCAACTATG 1350 GTATGAACTG GATCCGTCAG GCCCCGGGTA AGGGCCTGGA ATGGGTTGGA 1400 TGGATTAACA CCTATACCGG TGAACCGACC TATGCTGCGG ATTTCAAACG 1450 TCGTTTTACT ATATCTGCAG ACACCTCCAG CAACACAGTT TACCTGCAGA 1500 TGAACAGCCT GCGCGCTGAG GACACTGCCG TCTATTACTG TGCAAAGTAC 1550 CCGCACTATT ATGGGAGCAG CCACTGGTAT TTCGACGTCT GGGGTCAAGG 1600 AACCCTGGTC ACCGTCTCCT CGGCCTCCAC CAAGGGCCCA TCGGTCTTCC 1650 CCCTGGCACC CTCCTCCAAG AGCACCTCTG GGGGCACAGC GGCCCTGGGC 1700 TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT CGTGGAACTC 1750 AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC CTACAGTCCT 1800 CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG 1850 GGCACCCAGA CCTACATCTG CAACGTGAAT CACAAGCCCA GCAACACCAA 1900 GGTCGACAAG AAAGTTGAGC CCAAATCTTG TGACAAAACT CACCTCTAGA 1950 GTGGCGGTGG CTCTGGTTCC GGTGATTTTG ATTATGAAAA GATGGCAAAC 2000 GCTAATAAGG GGGCTATGAC CGAAAATGCC GATGAAAACG CGCTACAGTC 2050 TGACGCTAAA GGCAAACTTG ATTCTGTCGC TACTGATTAC GGTGCTGCTA 2100 TCGATGGTTT CATTGGTGAC GTTTCCGGCC TTGCTAATGG TAATGGTGCT 2150 ACTGGTGATT TTGCTGGCTC TAATTCCCAA ATGGCTCAAG TCGGTGACGG 2200 TGATAATTCA CCTTTAATGA ATAATTTCCG TCAATATTTA CCTTCCCTCC 2250 CTCAATCGGT TGAATGTCGC CCTTTTGTCT TTAGCGCTGG TAAACCATAT 2300 GAATTTTCTA TTGATTGTGA CAAAATAAAC TTATTCCGTG GTGTCTTTGC 2350 GTTTCTTTTA TATGTTGCCA CCTTTATGTA TGTATTTTCT ACGTTTGCTA 2400 ACATACTGCG TAATAAGGAG TCTTAATCAT GCCAGTTCTT TTGGCTAGCG 2450 CCGCCCTATA CCTTGTCTGC CTCCCCGCGT TGCGTCGCGG TGCATGGAGC 2500 CGGGCCACCT CGACCTGAAT GGAAGCCGGC GGCACCTCGC TAACGGATTC 2550 ACCACTCCAA GAATTGGAGC CAATCAATTC TTGCGGAGAA CTGTGAATGC 2600 GCAAACCAAC CCTTGGCAGA ACATATCCAT CGCGTCCGCC ATCTCCAGCA 2650 GCCGCACGCG GCGCATCTCG GGCAGCGTTG GGTCCTGGCC ACGGGTGCGC 2700 ATGATCGTGC TCCTGTCGTT GAGGACCCGG CTAGGCTGGC GGGGTTGCCT 2750 TACTGGTTAG CAGAATGAAT CACCGATACG CGAGCGAACG TGAAGCGACT 2800 GCTGCTGCAA AACGTCTGCG ACCTGAGCAA CAACATGAAT GGTCTTCGGT 2850 TTCCGTGTTT CGTAAAGTCT GGAAACGCGG AAGTCAGCGC CCTGCACCAT 2900 TATGTTCCGG ATCTGCATCG CAGGATGCTG CTGGCTACCC TGTGGAACAC 2950 CTACATCTGT ATTAACGAAG CGCTGGCATT GACCCTGAGT GATTTTTCTC 3000 TGGTCCCGCC GCATCCATAC CGCCAGTTGT TTACCCTCAC AACGTTCCAG 3050 TAACCGGGCA TGTTCATCAT CAGTAACCCG TATCGTGAGC ATCCTCTCTC 3100 GTTTCATCGG TATCATTACC CCCATGAACA GAAATTCCCC CTTACACGGA 3150 GGCATCAAGT GACCAAACAG GAAAAAACCG CCCTTAACAT GGCCCGCTTT 3200 ATCAGAAGCC AGACATTAAC GCTTCTGGAG AAACTCAACG AGCTGGACGC 3250 GGATGAACAG GCAGACATCT GTGAATCGCT TCACGACCAC GCTGATGAGC 3300 TTTACCGCAG GATCCGGAAA TTGTAAACGT TAATATTTTG TTAAAATTCG 3350 CGTTAAATTT TTGTTAAATC AGCTCATTTT TTAACCAATA GGCCGAAATC 3400 GGCAAAATCC CTTATAAATC AAAAGAATAG ACCGAGATAG GGTTGAGTGT 3450 TGTTCCAGTT TGGAACAAGA GTCCACTATT AAAGAACGTG GACTCCAACG 3500 TCAAAGGGCG AAAAACCGTC TATCAGGGCT ATGGCCCACT ACGTGAACCA 3550 TCACCCTAAT CAAGTTTTTT GGGGTCGAGG TGCCGTAAAG CACTAAATCG 3600 GAACCCTAAA GGGAGCCCCC GATTTAGAGC TTGACGGGGA AAGCCGGCGA 3650 ACGTGGCGAG AAAGGAAGGG AAGAAAGCGA AAGGAGCGGG CGCTAGGGCG 3700 CTGGCAAGTG TAGCGGTCAC GCTGCGCGTA ACCACCACAC CCGCCGCGCT 3750 TAATGCGCCG CTACAGGGCG CGTCCGGATC CTGCCTCGCG CGTTTCGGTG 3800 ATGACGGTGA AAACCTCTGA CACATGCAGC TCCCGGAGAC GGTCACAGCT 3850 TGTCTGTAAG CGGATGCCGG GAGCAGACAA GCCCGTCAGG GCGCGTCAGC 3900 GGGTGTTGGC GGGTGTCGGG GCGCAGCCAT GACCCAGTCA CGTAGCGATA 3950 GCGGAGTGTA TACTGGCTTA ACTATGCGGC ATCAGAGCAG ATTGTACTGA 4000 GAGTGCACCA TATGCGGTGT GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA 4050 TACCGCATCA GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC 4100 GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC 4150 GGTTATCCAC AGAATCAGGG GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA 4200 GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT 4250 CCATAGGCTC CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA CGCTCAAGTC 4300 AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT 4350 GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA 4400 CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGCTCAC 4450 GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT 4500 GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC TGCGCCTTAT CCGGTAACTA 4550 TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA CTGGCAGCAG 4600 CCACTGGTAA CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG 4650 TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA CTACGGCTAC ACTAGAAGGA CAGTATTTGG 4700 TATCTGCGCT CTGCTGAAGC CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT 4750 CTTGATCCGG CAAACAAACC ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC 4800 AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT 4850 CTTTTCTACG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA CGTTAAGGGA 4900 TTTTGGTCAT GAGATTATCA AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT 4950 TAAAAATGAA GTTTTAAATC AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC 5000 TGACAGTTAC CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC 5050 TATTTCGTTC ATCCATAGTT GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG 5100 ATACGGGAGG GCTTACCATC TGGCCCCAGT GCTGCAATGA TACCGCGAGA 5150 CCCACGCTCA CCGGCTCCAG ATTTATCAGC AATAAACCAG CCAGCCGGAA 5200 GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT 5250 ATTAATTGTT GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG TTAATAGTTT 5300 GCGCAACGTT GTTGCCATTG CTGCAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT 5350 TTGGTATGGC TTCATTCAGC TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA 5400 TGATCCCCCA TGTTGTGCAA AAAAGCGGTT AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT 5450 CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG CCGCAGTGTT ATCACTCATG GTTATGGCAG 5500 CACTGCATAA TTCTCTTACT GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG 5550 ACTGGTGAGT ACTCAACCAA GTCATTCTGA GAATAGTGTA TGCGGCGACC 5600 GAGTTGCTCT TGCCCGGCGT CAACACGGGA TAATACCGCG CCACATAGCA 5650 GAACTTTAAA AGTGCTCATC ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC 5700 TCAAGGATCT TACCGCTGTT GAGATCCAGT TCGATGTAAC CCACTCGTGC 5750 ACCCAACTGA TCTTCAGCAT CTTTTACTTT CACCAGCGTT TCTGGGTGAG 5800 CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG 5850 AAATGTTGAA TACTCATACT CTTCCTTTTT CAATATTATT GAAGCATTTA 5900 TCAGGGTTAT TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA 5950 ATAAACAAAT AGGGGTTCCG CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGAC 6000 GTCTAAGAAA CCATTATTAT CATGACATTA ACCTATAAAA ATAGGCGTAT 6050 CACGAGGCCC TTTCGTCTTC AA 6072 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:100: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 237 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:100: Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser 20 25 30 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 35 40 45 Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln 50 55 60 Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser 65 70 75 Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 80 85 90 Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 95 100 105 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr 110 115 120 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 125 130 135 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 140 145 150 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 155 160 165 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 170 175 180 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 185 190 195 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 200 205 210 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 215 220 225 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 230 235 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:101: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 110 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:101: Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val 110 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:102: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 118 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:102: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Ser Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 110 115 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:103: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 110 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:103: Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val 110 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:104: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 118 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:104: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Ser Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 110 115 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:105: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 110 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:105: Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val 110 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:106: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 118 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:106: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 110 115 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:107: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 110 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:107: Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val 110 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:108: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 118 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:108: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 110 115 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:109: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 110 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:109: Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val 110 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:110: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 118 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:110: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr 20 25 30 His Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 110 115 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:111: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 110 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:111: Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val 110 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:112: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 118 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:112: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 110 115 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:113: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 110 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:113: Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val 110 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:114: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 118 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:114: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr 20 25 30 His Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 110 115 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:115: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 110 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:115: Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val 110 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:116: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 118 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:116: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr 20 25 30 His Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 110 115 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:117: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 3 represents either Aspartic acid, Threonine or Glutamic acid (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 4 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 4 represents either Phenyalanine, Tryptophan or Tyrosine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 5 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at osition 5 represents either Threonine, Glutamine, Glycine or Serine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 6 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 6 is either Histidine or Asparagine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 9 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 9 represents either Methionine or Isoleucine (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:117: Gly Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:118: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 17 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 5 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 5 represents either Tyrosine or Tryptophan (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:118: Trp Ile Asn Thr Xaa Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 1 5 10 15 Lys Arg (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:119: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 14 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 3 represents either Histidine or Tyrosine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 5 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 5 represents either Tyrosine, Arginine, Lysine, Isoleucine, Threonine, Glutamic acid or Tryptophan (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 6 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 6 represents either glycine, Arginine, Alanine, Aspartic acid, Glutamine, Glutamic acid, Threonine, Leucine aor Serine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 7 represents either Serine, Threonine, Lysine, Glutamine, Asparagine, Arginine, Alanine, Glutamic acid or Glycine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 8 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 8 represents either Serine or Glycine (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:119: Tyr Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:120: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 1 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 1 represents either Phenyalanine, Isoleucine, Valine, Leucine or Alanine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 3 represents either Alanine, Leucine, Valine or Isoleucine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 5 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 5 represents either Threonine, Valine or Lysine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 6 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 6 represents either Serine or Tryptophan (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 7 represents either Serine or Lysine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 8 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 8 represents either Asparagine or Serine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 10 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 10 represents either Valine, Alanine, Leucine or Isoleucine (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:120: Xaa Ser Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:121: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 11 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 1 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 1 represents either Arginine or Serine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 3 represents either Serine or Asparagine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 4 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 4 represents either Glutamine or Glutamic acid (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 5 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 5 represents either Glutamine or Aspartic acid (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 6 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 6 represents either Isoleucine or Leucine (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:121: Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:122: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 7 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:122: Phe Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:123: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 9 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 5 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 5 represents either Threonine, Alanine or Asparagine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 6 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 6 represents either Valine or Threonine (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:123: Gln Gln Tyr Ser Xaa Xaa Pro Trp Thr 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:124: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 108 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 4 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 4 represents either Methionine or Leucine (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:124: Asp Ile Gln Xaa Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:125: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 123 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 28 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 28 represents either Threonine or Aspartic acid (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 31 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 31 represents either Asparagine or Histidine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 101 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 101 represents either Tyrosine or Histidine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 105 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 105 represents either Serine or Threonine (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:125: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Thr 20 25 30 Xaa Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Xaa Tyr Tyr Gly Xaa 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120 Val Ser Ser (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:126: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:126: Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:127: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 14 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:127: Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:128: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 3 represents either Threonine or Aspartic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:128: Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr Gly Met Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:129: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 14 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 3 represents either Tyrosine or Histidine (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (C) IDENTIFICATION METHOD: (D) OTHER INFORMATION: Where the X at position 7 represents either Serine or Threonine (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:129: Tyr Pro Xaa Tyr Tyr Gly Xaa Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:130: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 254 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:130: Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 35 40 45 Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Ile 50 55 60 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn 65 70 75 Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg 80 85 90 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr Leu Gln 95 100 105 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 110 115 120 Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 125 130 135 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 140 145 150 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 155 160 165 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 170 175 180 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 185 190 195 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 200 205 210 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 215 220 225 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 230 235 240 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu 245 250 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:131: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 158 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:131: Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met 1 5 10 15 Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn 20 25 30 Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr 35 40 45 Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly 50 55 60 Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn 65 70 75 Ser Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met 80 85 90 Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu 95 100 105 Cys Arg Pro Phe Val Phe Ser Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser 110 115 120 Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe 125 130 135 Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala 140 145 150 Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser 155

Claims (27)

  1. 서열 11에 기재된 인간 중쇄 하부군 III의 컨센서스 골격 영역 및 하기 아미노산 서열을 갖는 초가변영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및, 서열 12에 기재된 인간 카파 경쇄 하부군 I의 컨센서스 골격 영역 및 하기 아미노산 서열을 갖는 초가변영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체로서, 잔기 번호 매김이 도 1에 기재된 바와 같을 때, 서열 11과 비교해서 중쇄 가변 도메인이 컨센서스 골격 영역 중 잔기 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 74H, 75H, 76H, 78H 및 94H 중 하나 이상에 치환을 가지고, 치환시 37H에서 I, 49H에서 G 또는 A, 67H에서 T, 69H에서 F, V, L 또는 A, 71H에서 A, L, V 또는 I, 73H에서 T, V 또는 K, 74H에서 W, 75H에서 S 또는 A, 76H에서 S, 78H에서 V, A 또는 I, 94H에서 K로 치환되고, 서열 12와 비교해서 경쇄 가변 도메인이 컨센서스 골격 영역 중 잔기 46L에서만 치환을 가지거나 컨센서스 골격 영역 중 잔기 4L 및 46L에서 치환을 가지고, 치환시 4L에서 L, 46L에서 V로 치환되는, 생체내에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 혈관형성(angiogenesis)을 억제하고 Kd 값 1 x 10-8 M 이하로 인간 VEGF와 결합하며, 시험관내에서 내피세포의 VEGF-유도 증식을 억제하는 ED50 값이 5nM 이하인 인간화 항-VEGF 항체 (단, 서열 7과 서열 8을 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열로 포함하는 항체 및 서열 115와 서열 116을 각각 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열로 포함하는 항체는 제외):
    CDRH1: GYX1X2X3X4YGX5N (서열 117) (식중, X1은 D, T 또는 E이고, X2는 F, W, 또는 Y이고, X3은 T, Q, G 또는 S이고, X4는 H 또는 N이고, X5는 M 또는 I임);
    CDRH2: WINTX1TGEPTYAADFKR (서열 118) (식중, X1은 Y 또는 W임);
    CDRH3: YPX1YX2X3X4X5HWYFDV (서열 119) (식중, X1은 H 또는 Y이고, X2는 Y, R, K, I, T, E 또는 W이고, X3은 G, N, A, D, Q, E, T, K 또는 S이고, X4는 S, T, K, Q, N, R, A, E 또는 G이고, X5는 S 또는 G임);
    CDRL1: X1AX2X3X4X5SNYLN (서열 121) (식중, X1은 R 또는 S이고, X2는 S 또는 N이고, X3은 Q 또는 E이고, X4는 Q 또는 D이고, X5는 I 또는 L임);
    CDRL2: FTSSLHS (서열 122);
    CDRL3: QQYSX1X2PWT (서열 123) (식중, X1은 T, A 또는 N이고, X2는 V 또는 T임).
  2. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 도메인이 컨센서스 골격 영역 중 잔기 46L에서만 치환을 갖는 것인 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 중쇄 잔기 중 둘 이상에서 치환을 갖는 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 중쇄 잔기 중 세 개 이상에서 치환을 갖는 항체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 중쇄 잔기 중 네 개 이상에서 치환을 갖는 항체.
  6. 제5항에 있어서, 잔기 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H 및 94H에서 치환을 갖는 항체.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    CDRH1 중, X1이 D 또는 T이고, X2가 F이고, X3이 T이고, X5가 M이고;
    CDRH2 중, X1이 Y이고;
    CDRH3 중, X2가 Y이고, X3이 G이고, X4가 S 또는 T이고, X5가 S인 항체.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    CDRL1 중, X1이 S이고, X2가 S이고, X3이 Q이고, X4가 D이고, X5가 I이고;
    CDRL3 중, X1이 T이고, X2가 V인 항체.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, Kd 값이 약 1 x 10-8 M 이하로 인간 VEGF와 결합하는 항체.
  12. 제11항에 있어서, Kd 값이 약 5 x 10-9 M 이하로 인간 VEGF와 결합하는 항체.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 전체 길이의 항체.
  14. 제13항에 있어서, 인간 IgG인 항체.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 단편인 항체.
  16. 제15항에 있어서, Fab인 항체.
  17. 제1항 또는 제2항의 항체 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  18. 제1항 또는 제2항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  19. 제18항의 핵산을 포함하는 벡터.
  20. 제19항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제20항의 숙주 세포를 배양하여 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는, 인간화 항-VEGF 항체의 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 인간화 항-VEGF 항체를 숙주 세포 배양물로부터 회수하는단계를 더 포함하는 방법.
  23. 포유동물에게서 VEGF-유도 혈관형성을 억제하는데 사용하기 위한 제1항 또는 제2항의 인간화 항-VEGF 항체를 포함하는, 치료상 유효량으로 포유동물에게 투여될 수 있는 의약.
  24. 제23항에 있어서, 포유동물이 사람인 의약.
  25. 제23항에 있어서, 포유동물이 종양이 있는 포유동물인 의약.
  26. 제23항에 있어서, 포유동물이 망막 질병이 있는 포유동물인 의약.
  27. 아미노산 서열:
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX1FTX2YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX3YYGX4SHWYFDVWGQGTLVTVSS (서열 125) (식중, X1은 T 또는 D이고, X2는 N 또는 H이고, X3은 H 또는 Y이고, X4는 S 또는 T임)을 포함하는 항-VEGF 항체 중쇄 가변 도메인 (단, X1은 T이고, X2는 N이고, X3은 H이고, X4는 S인 중쇄 가변 도메인 및 X1은 D이고, X2는 H이고, X3은 Y이고, X4는 T인 중쇄 가변 도메인 제외).
KR1020077027779A 1997-04-07 1998-04-03 항-ｖｅｇｆ 항체 KR100870353B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US83350497A 1997-04-07 1997-04-07
US08/833,504 1997-04-07
US08/908,469 US6884879B1 (en) 1997-04-07 1997-08-06 Anti-VEGF antibodies
US08/908,469 1997-08-06
KR1019997009194A KR100794454B1 (ko) 1997-04-07 1998-04-03 항-ｖｅｇｆ 항체

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019997009194A Division KR100794454B1 (ko) 1997-04-07 1998-04-03 항-ｖｅｇｆ 항체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080003453A KR20080003453A (ko) 2008-01-07
KR100870353B1 true KR100870353B1 (ko) 2008-11-25

Family

ID=27125626

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077027778A KR100816621B1 (ko) 1997-04-07 1998-04-03 항-ｖｅｇｆ 항체
KR1020077027779A KR100870353B1 (ko) 1997-04-07 1998-04-03 항-ｖｅｇｆ 항체

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077027778A KR100816621B1 (ko) 1997-04-07 1998-04-03 항-ｖｅｇｆ 항체

Country Status (26)

Country Link
US (2) US7060269B1 (ko)
EP (4) EP1325932B9 (ko)
JP (1) JP3957765B2 (ko)
KR (2) KR100816621B1 (ko)
CN (1) CN100480269C (ko)
AT (2) ATE349470T1 (ko)
AU (1) AU743758B2 (ko)
BR (1) BRPI9809387B8 (ko)
CA (1) CA2286330C (ko)
CY (3) CY2005008I2 (ko)
DE (5) DE69836729T2 (ko)
DK (2) DK0973804T3 (ko)
ES (2) ES2273415T3 (ko)
FR (2) FR05C0020I2 (ko)
GE (1) GEP20105118B (ko)
HK (2) HK1084402A1 (ko)
IL (1) IL132240A0 (ko)
LT (1) LTPA2005005I1 (ko)
LU (2) LU91167I2 (ko)
NL (2) NL300193I2 (ko)
NO (3) NO324264B1 (ko)
NZ (1) NZ500078A (ko)
PT (1) PT1325932E (ko)
SI (1) SI1325932T1 (ko)
TR (1) TR199903123T2 (ko)
WO (1) WO1998045331A2 (ko)

Families Citing this family (497)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US6238884B1 (en) 1995-12-07 2001-05-29 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6939689B2 (en) 1995-12-07 2005-09-06 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US6713279B1 (en) 1995-12-07 2004-03-30 Diversa Corporation Non-stochastic generation of genetic vaccines and enzymes
US5830696A (en) 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6740506B2 (en) 1995-12-07 2004-05-25 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6358709B1 (en) 1995-12-07 2002-03-19 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6352842B1 (en) 1995-12-07 2002-03-05 Diversa Corporation Exonucease-mediated gene assembly in directed evolution
US7018793B1 (en) 1995-12-07 2006-03-28 Diversa Corporation Combinatorial screening of mixed populations of organisms
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US6562594B1 (en) 1999-09-29 2003-05-13 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US7122636B1 (en) 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
JP3521382B2 (ja) 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
US7112655B1 (en) 1997-02-27 2006-09-26 Japan Tobacco, Inc. JTT-1 protein and methods of inhibiting lymphocyte activation
US7885697B2 (en) 2004-07-13 2011-02-08 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US20070059302A1 (en) 1997-04-07 2007-03-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
DK0973804T3 (da) 1997-04-07 2007-05-07 Genentech Inc Anti-VEGF-antistoffer
US6887674B1 (en) 1998-04-13 2005-05-03 California Institute Of Technology Artery- and vein-specific proteins and uses therefor
US6864227B1 (en) 1998-04-13 2005-03-08 California Institute Of Technology Artery-and vein-specific proteins and uses therefor
WO2000029584A1 (en) * 1998-11-18 2000-05-25 Genentech, Inc. Antibody variants with higher binding affinity compared to parent antibodies
EP1950300A3 (en) 1998-11-18 2011-03-23 Genentech, Inc. Antibody variants with higher binding affinity compared to parent antibodies
WO2000034337A1 (en) * 1998-12-10 2000-06-15 Tsukuba Research Laboratory, Toagosei Co., Ltd. Humanized monoclonal antibodies against vascular endothelial cell growth factor
EP2016953A3 (en) * 1998-12-22 2009-04-15 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists and uses thereof
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2372053C (en) 1999-04-28 2008-09-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
TWI290146B (en) * 1999-07-29 2007-11-21 Dyax Corp Binding moieties for fibrin
JP4210454B2 (ja) 2001-03-27 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 炎症性腸疾患治療剤
JP3871503B2 (ja) 1999-08-30 2007-01-24 日本たばこ産業株式会社 免疫性疾患治療剤
PT1240337E (pt) 1999-12-24 2007-01-31 Genentech Inc Métodos e composições para prolongar as meias-vidas de eliminação de compostos bioactivos
EP1757701A1 (en) 1999-12-24 2007-02-28 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
JP3597140B2 (ja) 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
EP2792747A1 (en) 2000-06-23 2014-10-22 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
EP2168980A1 (en) 2000-06-23 2010-03-31 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogensis
US6902718B2 (en) 2000-10-24 2005-06-07 Diatide, Inc. Stabilization of radiopharmaceutical compositions using hydrophilic thioethers
US6989138B2 (en) 2000-10-24 2006-01-24 Diatide, Inc. Stabilization of radiopharmaceutical compositions using hydrophilic thioethers and hydrophilic 6-hydroxy chromans
JP4212278B2 (ja) 2001-03-01 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 移植片拒絶反応抑制剤
US7117096B2 (en) 2001-04-17 2006-10-03 Abmaxis, Inc. Structure-based selection and affinity maturation of antibody library
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
TWI240632B (en) 2001-07-30 2005-10-01 Epix Medical Inc Purified peptides for peptide-based multimeric targeted contrast agents
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AU2002337935B2 (en) * 2001-10-25 2008-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20030190705A1 (en) * 2001-10-29 2003-10-09 Sunol Molecular Corporation Method of humanizing immune system molecules
CA2473144C (en) 2002-02-05 2013-05-28 Genentech, Inc. Protein purification
ES2545067T3 (es) 2002-04-26 2015-09-08 Genentech, Inc. Purificación de proteínas basada en la no afinidad
KR101086533B1 (ko) 2002-05-24 2011-11-23 쉐링 코포레이션 중화 사람 항-ｉｇｆｒ 항체, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 조성물
US9028822B2 (en) 2002-06-28 2015-05-12 Domantis Limited Antagonists against TNFR1 and methods of use therefor
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
NZ537690A (en) 2002-07-15 2009-07-31 Univ Texas Antibodies binding to anionic phospholipids and aminophospholipids and their use in treating viral infections
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
CA2965865C (en) 2002-07-18 2021-10-19 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
US7575893B2 (en) 2003-01-23 2009-08-18 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
WO2004070016A2 (en) 2003-02-03 2004-08-19 Fraunhofer Usa Inc. System for expression of genes in plants
JP2006521111A (ja) 2003-03-12 2006-09-21 バスジーン セラピューティクス， インコーポレイテッド 血管形成及び腫瘍増殖阻害用ポリペプチド化合物及びその応用
US7381410B2 (en) 2003-03-12 2008-06-03 Vasgene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
US8431396B2 (en) 2003-03-21 2013-04-30 The Cleveland Clinic Foundation Anti-angiogenic peptides
EP1664322B1 (en) 2003-05-22 2013-07-10 Fraunhofer USA, Inc. Recombinant carrier molecule for expression, delivery and purification of target polypeptides
MXPA05012723A (es) * 2003-05-30 2006-02-08 Genentech Inc Tratamiento con anticuerpos anti-vgf.
EP2395016A3 (en) 2003-05-30 2012-12-19 Merus B.V. Design and use of paired variable regions of specific binding molecules
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
DK3095793T3 (da) 2003-07-28 2020-05-25 Genentech Inc Reducering af udvaskning af protein A under en protein A-affinitetskromatografi
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
US7758859B2 (en) 2003-08-01 2010-07-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
CA2534055A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Genentech, Inc. Antibody cdr polypeptide sequences with restricted diversity
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
NZ546088A (en) * 2003-08-27 2009-10-30 Ophthotech Corp Combination therapy for the treatment of ocular neovascular disorders using a PDGF antagonist and a VEGF antagonist
FR2859725B1 (fr) * 2003-09-16 2006-03-10 Neovacs Procede a haut rendement pour l'obtention d'anticorps humains neutralisant l'activite biologique d'une cytokine humaine
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
DK1737971T3 (da) 2004-01-20 2017-11-13 Merus Nv Blandinger af bindingsproteiner
CA2555820C (en) 2004-02-19 2016-01-19 Genentech, Inc. Cdr-repaired antibodies
WO2005090406A2 (en) 2004-03-12 2005-09-29 Vasgene Therapeutics, Inc. Antibodies binding to ephb4 for inhibiting angiogenesis and tumor growth
ATE492564T1 (de) 2004-03-12 2011-01-15 Vasgene Therapeutics Inc Ephb4-bindende antikörper zur inhibierung von angiogenese und tumorwachstum
MXPA06014031A (es) 2004-06-01 2007-10-08 Domantis Ltd Anticuerpos de fusion biespecificos con vida media de serica mejorada.
US20070045902A1 (en) 2004-07-13 2007-03-01 Brauker James H Analyte sensor
US8604185B2 (en) 2004-07-20 2013-12-10 Genentech, Inc. Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein, combinations, and their use
BRPI0513534A (pt) * 2004-07-20 2008-05-06 Genentech Inc inibidores de proteìna 4 semelhante à angiopoietina, combinações, e seu uso
AU2005267020B2 (en) 2004-07-23 2011-08-11 Genentech, Inc. Crystallization of antibodies or fragments thereof
US7662926B2 (en) 2004-09-02 2010-02-16 Genentech, Inc. Anti-Fc-gamma receptor antibodies, bispecific variants and uses therefor
US7655229B2 (en) 2004-09-02 2010-02-02 Chan Andrew C Anti-FC-gamma RIIB receptor antibody and uses therefor
WO2006034455A2 (en) 2004-09-23 2006-03-30 Vasgene Therapeutics, Inc. Polipeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
RS52539B (en) 2004-10-21 2013-04-30 Genentech Inc. METHOD FOR TREATMENT OF INTRAOCULAR NEOVASCULAR DISEASES
US20080107648A1 (en) † 2005-12-16 2008-05-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with DII4 antagonists
NZ556635A (en) 2004-12-22 2010-11-26 Genentech Inc Method for producing soluble multi-membrane-spanning proteins
EP1833512A1 (en) * 2005-01-06 2007-09-19 GE Healthcare AS Optical imaging
US8735394B2 (en) 2005-02-18 2014-05-27 Abraxis Bioscience, Llc Combinations and modes of administration of therapeutic agents and combination therapy
PT1853250E (pt) 2005-02-18 2012-02-03 Abraxis Bioscience Llc Combinações e modos de administração de agentes terapêuticos e terapia de combinação
US20070166388A1 (en) 2005-02-18 2007-07-19 Desai Neil P Combinations and modes of administration of therapeutic agents and combination therapy
US20160355591A1 (en) 2011-05-02 2016-12-08 Immunomedics, Inc. Subcutaneous anti-hla-dr monoclonal antibody for treatment of hematologic malignancies
PT1861116E (pt) 2005-03-25 2015-11-04 Regeneron Pharma Formulações de antagonista do vegf
CA2604393A1 (en) * 2005-04-15 2006-10-26 Schering Corporation Methods and compositions for treating or preventing cancer
WO2006138690A2 (en) * 2005-06-17 2006-12-28 Abbott Laboratories Improved method of treating degenerative spinal disorders
USRE47223E1 (en) 2005-06-20 2019-02-05 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
CN101948541B (zh) * 2005-06-20 2014-08-06 健泰科生物技术公司 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法
WO2007117264A2 (en) 2005-08-03 2007-10-18 Fraunhofer Usa, Inc. Compositions and methods for production of immunoglobulins
CN103054798B (zh) 2005-08-31 2021-03-16 阿布拉科斯生物科学有限公司 用于制备稳定性增加的水难溶性药物的组合物和方法
UA96139C2 (uk) 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
KR100877824B1 (ko) 2005-11-11 2009-01-12 한국생명공학연구원 Ｅ2ｅｐｆ ｕｃｐ-ｖｈｌ 상호작용 및 그 용도
EP1959958A4 (en) * 2005-11-14 2010-07-14 Univ Southern California INTEGRIN-BINDING SMALL MOLECULES
TW200804425A (en) * 2005-12-06 2008-01-16 Domantis Ltd Ligands that have binding specificity for EGFR and/or VEGF and methods of use therefor
TWI596111B (zh) 2006-01-05 2017-08-21 建南德克公司 抗ｅｐｈｂ４抗體及使用該抗體之方法
AR059096A1 (es) 2006-01-20 2008-03-12 Genentech Inc Anticuerpos anti- efrina -b2 y metodos que usan estos
KR20080106433A (ko) 2006-02-13 2008-12-05 프라운호퍼 유에스에이, 인코포레이티드 인플루엔자 항원, 백신 조성물 및 관련 방법
AR059851A1 (es) 2006-03-16 2008-04-30 Genentech Inc Anticuerpos de la egfl7 y metodos de uso
BRPI0709338A2 (pt) 2006-03-21 2011-07-12 Genentech Inc anticorpo, molécula de ácido nucleico isolada, célula, composições, método de detecção da proteìna alfa5beta1, uso de anticorpo, métodos de tratamento, kit, uso de uma composição, uso de uma antagonista de alfa5beta e uso de uma antagonista de vegf
CN101405030B (zh) * 2006-03-22 2013-03-13 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对血管内皮生长因子的抗体和针对人表皮生长因子2型受体的抗体在制备治疗肿瘤的试剂盒中的应用
TW200812615A (en) * 2006-03-22 2008-03-16 Hoffmann La Roche Tumor therapy with an antibody for vascular endothelial growth factor and an antibody for human epithelial growth factor receptor type 2
CN101448856A (zh) * 2006-03-29 2009-06-03 健泰科生物技术公司 肿瘤的诊断和治疗
MY150400A (en) 2006-04-07 2014-01-15 Aerpio Therapeutics Inc Antibodies that bind human protein tyrosine phosphatase beta (hptpbeta) and uses thereof
US20080014196A1 (en) * 2006-06-06 2008-01-17 Genentech, Inc. Compositions and methods for modulating vascular development
JP2009539384A (ja) 2006-06-06 2009-11-19 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ｄｌｌ４抗体および抗ｄｌｌ４抗体使用の方法
CN101478949A (zh) 2006-06-16 2009-07-08 瑞泽恩制药公司 适合玻璃体内施用的vegf拮抗剂的制剂
FR2902799B1 (fr) 2006-06-27 2012-10-26 Millipore Corp Procede et unite de preparation d'un echantillon pour l'analyse microbiologique d'un liquide
EP2068877A4 (en) 2006-07-19 2011-09-21 Cleveland Clinic Foundation COMPOUNDS AND METHODS FOR MODULATING ANGIOGENESIS
CN100448892C (zh) * 2006-08-02 2009-01-07 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 抗肿瘤血管内皮生长因子受体vegf－r2抗原及其编码基因与应用
MX2009001715A (es) 2006-08-21 2009-02-25 Hoffmann La Roche Terapia tumoral con un anticuerpo anti-vegf.
BRPI0717431A2 (pt) 2006-09-29 2013-11-12 Oncomed Pharm Inc Composições e métodos de diagnóstico e tratamento do câncer
KR101551984B1 (ko) 2006-10-04 2015-09-09 제넨테크, 인크. Ｖｅｇｆ용 ｅｌｉｓａ
EP2086583A4 (en) * 2006-10-20 2010-05-26 Schering Corp FULLY HUMAN ANTI-VEGF ANTIBODIES AND METHODS OF USE
EP2101807B1 (en) 2006-12-19 2016-05-25 Genentech, Inc. Vegf-specific antagonists for adjuvant and neoadjuvant therapy and the treatment of early stage tumors
US8362217B2 (en) 2006-12-21 2013-01-29 Emd Millipore Corporation Purification of proteins
WO2008079280A1 (en) 2006-12-21 2008-07-03 Millipore Corporation Purification of proteins
US8569464B2 (en) 2006-12-21 2013-10-29 Emd Millipore Corporation Purification of proteins
ZA200904482B (en) 2007-01-22 2010-09-29 Genentech Inc Polyelectrolyte precipitation and purification of antibodies
US20100119526A1 (en) * 2007-01-26 2010-05-13 Bioinvent International Ab DLL4 Signaling Inhibitors and Uses Thereof
AR065271A1 (es) 2007-02-09 2009-05-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-robo4 y sus usos
PE20090245A1 (es) 2007-05-08 2009-03-17 Genentech Inc Anticuerpos anti-muc16 disenados con cisteina y conjugados de anticuerpos y farmacos
ES2469743T3 (es) 2007-05-17 2014-06-18 Genentech, Inc. Inhibición de la metástasis tumoral por anticuerpos anti neuropilina 2
PE20090321A1 (es) 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
HUE037633T2 (hu) 2007-07-09 2018-09-28 Genentech Inc Diszulfidkötés redukciójának megelõzése polipeptidek rekombináns elõállítása során
US8404252B2 (en) 2007-07-11 2013-03-26 Fraunhofer Usa, Inc. Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods
CN102083861B (zh) 2007-08-13 2016-04-13 瓦斯基因治疗公司 使用结合EphB4的人源化抗体的癌症治疗
CA2697032C (en) 2007-08-22 2021-09-14 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
KR20140015166A (ko) * 2007-10-30 2014-02-06 제넨테크, 인크. 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 항체 정제
KR101502267B1 (ko) 2007-11-09 2015-03-18 페레그린 파마수티컬즈, 인크 항-ｖｅｇｆ 항체 조성물 및 방법
ES2554812T3 (es) * 2007-11-09 2015-12-23 Genentech, Inc. Composiciones de antagonistas de quinasa 1 de tipo receptor de activina y métodos de uso
TWI468417B (zh) 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8663643B2 (en) 2008-03-18 2014-03-04 Genentech, Inc. Combinations of an anti-HER2 antibody-drug conjugate and chemotherapeutic agents, and methods of use
DK2274008T3 (da) * 2008-03-27 2014-05-12 Zymogenetics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til hæmning af PDGFRBETA og VEGF-A
WO2009129538A2 (en) * 2008-04-18 2009-10-22 Xencor, Inc. Human equivalent monoclonal antibodies engineered from nonhuman variable regions
CA2722466A1 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY31861A (es) 2008-06-03 2010-01-05 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
EP2297209A4 (en) 2008-06-03 2012-08-01 Abbott Lab IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
US8999702B2 (en) 2008-06-11 2015-04-07 Emd Millipore Corporation Stirred tank bioreactor
DK3216803T3 (da) 2008-06-25 2020-06-02 Novartis Ag Stabile og opløselige antistoffer, der hæmmer vegf
WO2010006060A2 (en) * 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100029491A1 (en) * 2008-07-11 2010-02-04 Maike Schmidt Methods and compositions for diagnostic use for tumor treatment
WO2010010153A1 (en) 2008-07-23 2010-01-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Identification of subjects being susceptible to anti-angiogenesis therapy
RS59232B1 (sr) 2008-08-14 2019-10-31 Genentech Inc Postupci za uklanjanje zagađivača koristeći hromatografiju membrane razmene jona sa razmeštanjem autohtonih proteina
CN102137939A (zh) * 2008-08-29 2011-07-27 霍夫曼-拉罗奇有限公司 不依赖vegf的肿瘤的诊断和治疗
CA2736029A1 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Duke University Anti-lipid antibodies
MX2011002372A (es) 2008-09-10 2011-04-04 Genentech Inc Composiciones y metodos para la prevencion de la degradacion oxidativa de proteinas.
WO2010037046A1 (en) 2008-09-28 2010-04-01 Fraunhofer Usa, Inc. Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
JP5913980B2 (ja) 2008-10-14 2016-05-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリン変異体及びその用途
CN102272148A (zh) 2008-11-03 2011-12-07 分子组合公司 抑制vegf-a受体相互作用的结合蛋白
US20120003641A1 (en) 2008-11-05 2012-01-05 Graham Robert R Genetic polymorphisms in age-related macular degeneration
WO2010059969A2 (en) 2008-11-22 2010-05-27 Genentech, Inc. Anti-angiogenesis therapy for the treatment of breast cancer
EP2358734A1 (en) 2008-12-16 2011-08-24 Millipore Corporation Purification of proteins
JP2012511929A (ja) 2008-12-16 2012-05-31 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン 攪拌タンク反応器及び方法
KR20160021308A (ko) 2008-12-23 2016-02-24 제넨테크, 인크. 암 환자에서의 진단 목적용 방법 및 조성물
CN102482347B (zh) 2009-01-12 2017-04-26 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
WO2010081838A2 (en) 2009-01-14 2010-07-22 Novartis Ag Sterile prefilled container
WO2010091234A2 (en) 2009-02-06 2010-08-12 The General Hospital Corporation Methods of treating vascular lesions
US8399219B2 (en) 2009-02-23 2013-03-19 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease activatable interferon alpha proprotein
EP2400992B1 (en) 2009-02-27 2015-07-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for protein labelling
US20120189701A1 (en) 2009-03-13 2012-07-26 Desai Neil P Combination therapy with thiocolchicine derivatives
MX2011010012A (es) 2009-03-25 2011-12-06 Genentech Inc NUEVOS ANTICUERPOS ANTI-A5ß1 Y SUS USOS.
RU2598248C2 (ru) 2009-04-02 2016-09-20 Роше Гликарт Аг Полиспецифичные антитела, включающие антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты fab
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
RU2595379C2 (ru) * 2009-04-16 2016-08-27 АббВай Биотерапеутикс Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ TNF-α И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
JP2012524083A (ja) * 2009-04-20 2012-10-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド アジュバント癌治療
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
CA2665956A1 (en) * 2009-05-07 2010-11-07 Samir Patel Combination treatment for ocular diseases
WO2010129609A2 (en) 2009-05-07 2010-11-11 The Regents Of The University Of California Antibodies and methods of use thereof
TWI428142B (zh) 2009-05-08 2014-03-01 Genentech Inc 人類化之抗－ｅｇｆｌ７抗體及其使用方法
KR101754433B1 (ko) 2009-05-08 2017-07-05 백시넥스 인코포레이티드 항-ｃｄ100 항체 및 이의 사용 방법
WO2010145846A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Bayer Bioscience N.V. Nicotiana benthamiana plants deficient in xylosyltransferase activity
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
SG10201510152RA (en) 2009-07-13 2016-01-28 Genentech Inc Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
AR078060A1 (es) 2009-07-14 2011-10-12 Novartis Ag Descontaminacion de superficie de contenedores previamente llenados en empaque secundario
AR077595A1 (es) 2009-07-27 2011-09-07 Genentech Inc Tratamientos de combinacion
MX2012001306A (es) * 2009-07-31 2012-02-28 Genentech Inc Inhibicion de matastasis de tumor.
SG10201901417UA (en) 2009-08-11 2019-03-28 Genentech Inc Production of proteins in glutamine-free cell culture media
MX2012001716A (es) 2009-08-14 2012-04-02 Genentech Inc Marcadores biologicos para monitorizar la respuesta del paciente a los antagonistas vegf.
TW201431558A (zh) 2009-08-15 2014-08-16 建南德克公司 用於治療先前治療過之乳癌之抗-血管新生療法
EP3736338A1 (en) 2009-09-01 2020-11-11 F. Hoffmann-La Roche AG Enhanced protein purification through a modified protein a elution
US8642515B2 (en) 2009-09-04 2014-02-04 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Genetic determinants of prostate cancer risk
CA2773662A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Genentech, Inc. Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer agent
CA2781519A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
CA2772670A1 (en) 2009-09-17 2011-03-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for diagnostics use in cancer patients
WO2011041391A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza hemagglutinin antibodies, compositions, and related methods
DK2488204T3 (en) 2009-10-16 2016-06-06 Oncomed Pharm Inc Therapeutic combination and use of DLL4 antagonist antibodies and blood pressure lowering agents
CN102686743B (zh) 2009-10-21 2015-06-24 基因泰克公司 年龄相关黄斑变性中的遗传多态性
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
WO2011056502A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use
TWI505836B (zh) 2009-12-11 2015-11-01 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ－ｃ抗體及其使用方法
US8765432B2 (en) 2009-12-18 2014-07-01 Oligasis, Llc Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates
EP3616719A1 (en) 2009-12-21 2020-03-04 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody formulation
HUE027713T2 (en) 2009-12-23 2016-10-28 Hoffmann La Roche Anti-BV8 antibodies and their use
EP2695889A1 (en) 2009-12-29 2014-02-12 Dr. Reddy's Laboratories Limited Protein purification by ion exchange
EP2531592A1 (en) 2010-02-04 2012-12-12 Vivalis Fed-batch process using concentrated cell culture medium for the efficient production of biologics in eb66 cells
MX2012009554A (es) 2010-02-23 2012-11-23 Hoffmann La Roche Terapia anti-angiogenesis para el tratamiento del cancer ovarico.
KR101878369B1 (ko) 2010-03-22 2018-07-16 제넨테크, 인크. 단백질-함유 제제의 안정화에 유용한 조성물 및 방법
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
CA2794147A1 (en) 2010-03-29 2011-10-06 Abraxis Bioscience, Llc Use of a composition comprising nanoparticles comprising a taxane and an albumin to improve uptake of chemotherapeutics by tumors and for treating a cancer that is highly fibrotic and/or has a dense stroma
MX364637B (es) 2010-03-29 2019-05-03 Abraxis Bioscience Llc Star Platino y nanopartículas que incluyen placlitaxel/albúmina para usarse en el trartamiento de nsclc.
US20130156755A1 (en) 2010-04-19 2013-06-20 Synta Pharmaceuticals Corp. Cancer therapy using a combination of a hsp90 inhibitory compounds and a vegf inhibitor
TWI510246B (zh) 2010-04-30 2015-12-01 Molecular Partners Ag 抑制ｖｅｇｆ－ａ受體交互作用的經修飾結合性蛋白質
MX2012012743A (es) 2010-05-03 2012-11-23 Genentech Inc Composiciones y metodos utiles para reducir la viscosidad de formulaciones que contienen proteina.
EP2571903B1 (en) 2010-05-17 2019-09-04 EMD Millipore Corporation Stimulus responsive polymers for the purification of biomolecules
HUE030820T2 (en) 2010-05-28 2017-06-28 Hoffmann La Roche Decreasing Lactate Levels and Enhancing Polypeptide Production by Control of Lactate Dehydrogenase and Pyruvate Dehydrogenase Kinase Expression
WO2011153224A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
WO2011153243A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Anti-angiogenesis therapy for treating gastric cancer
KR20190130050A (ko) 2010-06-04 2019-11-20 아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨 췌장암의 치료 방법
SG186783A1 (en) 2010-06-24 2013-02-28 Genentech Inc Compositions and methods containing alkylgycosides for stabilizing protein- containing formulations
RU2013104381A (ru) 2010-07-02 2014-08-10 Дженентек, Инк. Лечение отслойки васкуляризированного пигментного эпителия терапевтическим средством против vegf
CN103097418A (zh) 2010-07-09 2013-05-08 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗神经毡蛋白抗体及使用方法
MX2013000672A (es) 2010-07-19 2013-02-27 Hoffmann La Roche Metodo para identificar un paciente con probabilidad incrementada de responder a una terapia anti-cancer.
MX2013000667A (es) 2010-07-19 2013-02-27 Hoffmann La Roche Metodo para identificar pacientes con probabilidad incrementada de responder a una terapia anticancer.
JP2013537415A (ja) 2010-08-03 2013-10-03 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
KR20130100125A (ko) 2010-08-13 2013-09-09 제넨테크, 인크. 질환의 치료를 위한, ＩＬ-1β 및 ＩＬ-18에 대한 항체
AR082693A1 (es) 2010-08-17 2012-12-26 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 afucosilado con un anticuerpo anti-vegf
MX340558B (es) 2010-08-24 2016-07-14 F Hoffmann-La Roche Ag * Anticuerpos biespecificos que comprenden fragmento fv estabilizado con disulfuro.
AU2011293253B2 (en) 2010-08-26 2014-12-11 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012030512A1 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Percivia Llc. Flow-through protein purification process
US8551479B2 (en) 2010-09-10 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
SG190788A1 (en) 2010-11-15 2013-07-31 Five Prime Therapeutics Inc Fgfr1 extracellular domain combination therapies
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
WO2012092539A2 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies to dll4 and uses thereof
WO2012095514A1 (en) 2011-01-14 2012-07-19 Vivalis Recombinant protein production system
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
KR101638224B1 (ko) 2011-02-28 2016-07-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원 결합 단백질
WO2012123755A1 (en) 2011-03-17 2012-09-20 The University Of Birmingham Re-directed immunotherapy
HUE041335T2 (hu) 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
SG194045A1 (en) 2011-04-01 2013-11-29 Genentech Inc Combinations of akt inhibitor compounds and abiraterone, and methods of use
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
AU2012245439B2 (en) 2011-04-20 2017-04-06 Acceleron Pharma, Inc. Endoglin polypeptides and uses thereof
MX2013012716A (es) 2011-05-03 2014-03-21 Genentech Inc Agentes de disociacion vascular y sus usos.
WO2012172054A1 (en) 2011-06-16 2012-12-20 Scil Proteins Gmbh Modified multimeric ubiquitin proteins binding vegf-a
KR20140045440A (ko) 2011-06-30 2014-04-16 제넨테크, 인크. 항-c-met 항체 제제
WO2013009767A2 (en) 2011-07-12 2013-01-17 Epitomics, Inc. Facs-based method for obtaining an antibody sequence
EP2551348B1 (en) 2011-07-29 2014-09-24 Icon Genetics GmbH Production of galactosylated N-glycans in plants
EP2744825A1 (en) 2011-08-17 2014-06-25 F.Hoffmann-La Roche Ag Inhibition of angiogenesis in refractory tumors
US8858941B2 (en) 2011-09-23 2014-10-14 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. VEGF/DLL4 binding agents and uses thereof
EP2764105B1 (en) 2011-10-04 2017-03-15 Icon Genetics GmbH Nicotiana benthamiana plants deficient in fucosyltransferase activity
ES2669209T3 (es) 2011-10-11 2018-05-24 Vaccinex, Inc. Uso de moléculas de unión a semaforina-4D para la modulación de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica
BR112014008759A8 (pt) * 2011-10-13 2017-09-12 Aerpio Therapeutics Inc Tratamento de doença ocular
CA2850830A1 (en) 2011-10-13 2013-04-18 Aerpio Therapeutics, Inc. Methods for treating vascular leak syndrome and cancer
WO2013082511A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Genentech, Inc. Methods for overcoming tumor resistance to vegf antagonists
EP2788026A4 (en) 2011-12-05 2015-08-05 Univ Duke V1V2 IMMUNOGENIC
US8790652B2 (en) 2011-12-06 2014-07-29 Vaccinex, Inc. Use of the combination of semaphorin-4D inhibitory molecules and VEGF inhibitory molecules to inhibit angiogenesis
JP6605202B2 (ja) 2011-12-22 2019-11-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド イオン交換膜クロマトグラフィー
WO2013091903A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Novo Nordisk A/S Anti-crac channel antibodies
CA2861610A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17
RU2659173C2 (ru) 2012-01-13 2018-06-28 Дженентек, Инк. Биологические маркеры для идентификации пациентов для лечения антагонистами vegf
KR20140127854A (ko) 2012-02-10 2014-11-04 제넨테크, 인크. 단일-쇄 항체 및 다른 이종다량체
US9475840B2 (en) 2012-02-27 2016-10-25 Universitat De Barcelona Protease-resistant compounds useful as shuttles through the blood-brain barrier and shuttle-cargo constructs
SI2825558T1 (sl) 2012-03-13 2019-08-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Kombinirana terapija za zdravljenje raka jajčnikov
SG10201508420VA (en) 2012-03-27 2015-11-27 Genentech Inc Improved harvest operations for recombinant proteins
CA2867588A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
AU2013249985B2 (en) 2012-04-20 2017-11-23 Merus N.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
US10494440B2 (en) 2012-05-11 2019-12-03 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4D binding molecules to promote neurogenesis following stroke
WO2013170182A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Synta Pharmaceuticals Corp. Treating cancer with an hsp90 inhibitory compound
AR091220A1 (es) 2012-05-31 2015-01-21 Genentech Inc Metodos para tratar cancer usando antagonistas de union a pd-1 axis y antagonistas de vegf
LT3777834T (lt) 2012-06-01 2022-05-25 Novartis Ag Švirkštas
NZ702244A (en) 2012-06-08 2017-06-30 Hoffmann La Roche Mutant selectivity and combinations of a phosphoinositide 3 kinase inhibitor compound and chemotherapeutic agents for the treatment of cancer
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
JOP20200175A1 (ar) 2012-07-03 2017-06-16 Novartis Ag حقنة
PE20150361A1 (es) 2012-07-13 2015-03-14 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-vegf/anti-ang-2 y su utilizacion en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares
JP6464085B2 (ja) 2012-08-07 2019-02-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 神経膠芽腫の治療のための併用療法
US20140081003A1 (en) 2012-09-19 2014-03-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for preventing norleucine misincorporation into proteins
EP2914961A4 (en) 2012-10-31 2016-04-20 Oncomed Pharm Inc METHODS AND MONITORING A TREATMENT BY AN ANTAGONIST OF DLL4
NZ707641A (en) 2012-11-01 2016-09-30 Abbvie Inc Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2013341711A1 (en) 2012-11-12 2015-05-21 Redwood Bioscience, Inc. Compounds and methods for producing a conjugate
JP2016505528A (ja) 2012-11-16 2016-02-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア タンパク質の化学修飾のためのピクテ−スペングラーライゲーション
US9310374B2 (en) 2012-11-16 2016-04-12 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-indole compounds and methods for producing a conjugate
CA2891686A1 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Novartis Ag Compositions and methods that utilize a peptide tag that binds to hyaluronan
US9393327B2 (en) 2012-12-19 2016-07-19 Genentech, Inc. Methods and compositions for radiohalogen protein labeling
WO2014110261A1 (en) 2013-01-11 2014-07-17 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Cyp450 lipid metabolites reduce inflammation and angiogenesis
WO2014118643A2 (en) 2013-02-04 2014-08-07 Vascular Biogenics Ltd. Methods of inducing responsiveness to anti-angiogenic agent
CA2901226C (en) 2013-02-18 2020-11-17 Vegenics Pty Limited Vascular endothelial growth factor binding proteins
AU2014243783B2 (en) 2013-03-13 2018-12-13 Genentech, Inc. Antibody formulations
TW201512219A (zh) 2013-03-15 2015-04-01 Abbvie Inc 針對ＩＬ－１β及／或ＩＬ－１７之雙特異性結合蛋白
JP2016513478A (ja) 2013-03-15 2016-05-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド 細胞培養培地及び抗体を産生する方法
US9707154B2 (en) 2013-04-24 2017-07-18 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
SG10201800492PA (en) 2013-04-29 2018-03-28 Hoffmann La Roche Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use
JP2016524611A (ja) 2013-05-23 2016-08-18 ファイヴ プライム セラピューティクス インク がんを治療する方法
KR101541478B1 (ko) * 2013-05-31 2015-08-05 동아쏘시오홀딩스 주식회사 항-vegf 항체 및 이를 포함하는 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물
EP3656392A1 (en) 2013-06-25 2020-05-27 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4d inhibitory molecules in combination with an immune modulating therapy to inhibit tumor growth and metastases
EP3019243A4 (en) 2013-07-12 2017-03-15 Ophthotech Corporation Methods for treating or preventing ophthalmological conditions
KR20160042438A (ko) 2013-08-12 2016-04-19 제넨테크, 인크. 보체-연관 상태의 치료를 위한 조성물 및 방법
US10456470B2 (en) 2013-08-30 2019-10-29 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
US10617755B2 (en) 2013-08-30 2020-04-14 Genentech, Inc. Combination therapy for the treatment of glioblastoma
SI3041513T1 (sl) 2013-09-08 2020-11-30 Kodiak Sciences Inc. Zwitterionski polimerni konjugati faktorja VIII
NZ630881A (en) 2013-10-10 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treatment of atherosclerosis
JP6422956B2 (ja) 2013-10-11 2018-11-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体
NZ630892A (en) 2013-10-21 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treating neurodegenerative disorders
CA2928708A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Acceleron Pharma, Inc. Endoglin peptides to treat fibrotic diseases
US10568951B2 (en) 2013-11-18 2020-02-25 Formycon Ag Pharmaceutical composition of an anti-VEGF antibody
CA2927806C (en) 2013-11-27 2023-01-10 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-pyrrolo compounds and methods for producing a conjugate
JP2016530244A (ja) * 2013-12-31 2016-09-29 ディベロップメント センター フォー バイオテクノロジーＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 抗ｖｅｇｆ抗体及びその使用
CN110981957A (zh) 2014-01-15 2020-04-10 豪夫迈·罗氏有限公司 具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
US10100115B2 (en) 2014-02-14 2018-10-16 Macrogenics, Inc. Methods for the treatment of vascularizing cancers
JP6666848B2 (ja) 2014-02-18 2020-03-18 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル Ｎｒｐ−１／ｏｂｒ複合体シグナル伝達経路により媒介される疾患の処置のための方法及び医薬組成物
US10590455B2 (en) 2014-02-25 2020-03-17 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process for modifying galactosylation and G0F content of a glycoprotein composition by glutamine supplementation
PL3116891T3 (pl) 2014-03-10 2020-07-27 Richter Gedeon Nyrt. Oczyszczanie immunoglobuliny z zastosowaniem etapów wstępnego oczyszczania
CU24481B1 (es) 2014-03-14 2020-03-04 Immutep Sas Moléculas de anticuerpo que se unen a lag-3
JP2017516458A (ja) 2014-03-24 2017-06-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド ｃ−ｍｅｔ拮抗剤による癌治療及びｃ−ｍｅｔ拮抗剤のＨＧＦ発現との相関
EP3126386A1 (en) 2014-03-31 2017-02-08 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists
US10179821B2 (en) 2014-05-01 2019-01-15 Genentech, Inc. Anti-factor D antibodies
US20170232199A1 (en) 2014-05-12 2017-08-17 Formycon Ag Pre-Filled Plastic Syringe Containing a VEGF Antagonist
KR20230144099A (ko) 2014-05-15 2023-10-13 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-pd-1 항체 및 또 다른 항암제의 조합물을 사용한 폐암의 치료
WO2015187428A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Redwood Bioscience, Inc. Anti-her2 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof
WO2015198240A2 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Novartis Ag Compositions and methods for long acting proteins
WO2015198243A2 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Novartis Ag Compositions and methods for long acting proteins
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
BR112017000142B1 (pt) 2014-07-09 2021-08-17 Genentech, Inc Métodos para melhorar a recuperação por descongelamento de bancos de células e para congelamento de células cho para armazenamento, grupo de células cho para o congelamento de células de mamíferos, e banco de células
WO2016011052A1 (en) 2014-07-14 2016-01-21 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
DK3180018T3 (da) 2014-08-12 2019-10-28 Massachusetts Inst Technology Synergistisk tumorbehandling med IL-2 og integrinbindende Fc-fusionsprotein
US20170224777A1 (en) 2014-08-12 2017-08-10 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and a cancer vaccine
CN105330739B (zh) * 2014-08-12 2020-12-25 中美华世通生物医药科技（武汉）有限公司 与人血管内皮生长因子特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其用途
JP6681905B2 (ja) 2014-09-13 2020-04-15 ノバルティス アーゲー Ａｌｋ阻害剤の併用療法
WO2016044334A1 (en) 2014-09-15 2016-03-24 Genentech, Inc. Antibody formulations
AU2015327868A1 (en) 2014-10-03 2017-04-20 Novartis Ag Combination therapies
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
CR20170143A (es) 2014-10-14 2017-06-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas
KR20210013299A (ko) 2014-10-17 2021-02-03 코디악 사이언시스 인코포레이티드 부티릴콜린에스테라제 양성이온성 중합체 컨쥬게이트
US10316094B2 (en) 2014-10-24 2019-06-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for inducing phagocytosis of MHC class I positive cells and countering anti-CD47/SIRPA resistance
US20160176962A1 (en) 2014-10-31 2016-06-23 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Combination Therapy For Treatment Of Disease
EA201791029A1 (ru) 2014-11-10 2017-12-29 Дженентек, Инк. Антитела против интерлейкина-33 и их применение
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
JP7320919B2 (ja) 2014-12-11 2023-08-04 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー 小さい活動性脈絡膜新生血管病変を有する加齢黄斑変性症の治療
WO2016100882A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Novartis Ag Combination therapies
JP2018508183A (ja) 2014-12-23 2018-03-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 化学療法耐性癌を治療及び診断する組成物及び方法
WO2016120753A1 (en) 2015-01-28 2016-08-04 Pfizer Inc. Stable aqueous anti- vascular endothelial growth factor (vegf) antibody formulation
AU2016229982B2 (en) 2015-03-09 2020-06-18 Intekrin Therapeutics, Inc. Methods for the treatment of nonalcoholic fatty liver disease and/or lipodystrophy
EP3913052A1 (en) 2015-04-24 2021-11-24 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of identifying bacteria comprising binding polypeptides
US20180155429A1 (en) 2015-05-28 2018-06-07 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of pd-l1 positive lung cancer using an anti-pd-1 antibody
US11078278B2 (en) 2015-05-29 2021-08-03 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of renal cell carcinoma
MX2017015937A (es) 2015-06-08 2018-12-11 Genentech Inc Métodos de tratamiento del cáncer con anticuerpos anti-ox40 y antagonistas de unión al eje de pd-1.
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
EP3858859A1 (en) 2015-07-14 2021-08-04 Bristol-Myers Squibb Company Method of treating cancer using immune checkpoint inhibitor; antibody that binds to programmed death-1 receptor (pd-1) or programmed death ligand 1 (pd-l1)
ES2828694T3 (es) 2015-07-29 2021-05-27 Allergan Inc Anticuerpos sólo de cadena pesada frente a ANG-2
PT3317301T (pt) 2015-07-29 2021-07-09 Novartis Ag Terapias de associação compreendendo moléculas de anticorpo contra lag-3
US20180207273A1 (en) 2015-07-29 2018-07-26 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
WO2017019896A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to pd-1
HU231463B1 (hu) 2015-08-04 2024-01-28 Richter Gedeon Nyrt. Módszer rekombináns proteinek galaktóz tartalmának növelésére
EP3334762A1 (en) 2015-08-14 2018-06-20 Allergan, Inc. Heavy chain only antibodies to pdgf
CA2987644A1 (en) * 2015-08-21 2017-03-02 Immunomedics, Inc. Subcutaneous anti-hla-dr monoclonal antibody for treatment of hematologic malignancies
CN108601828B (zh) 2015-09-17 2023-04-28 伊缪诺金公司 包含抗folr1免疫缀合物的治疗组合
WO2017046140A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Treatment regimens for dr and rvo in dependence of the extent of retinal ischemia
EP3353196B1 (en) 2015-09-22 2022-12-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Polypeptides capable of inhibiting the binding between leptin and neuropilin-1
US11339213B2 (en) 2015-09-23 2022-05-24 Mereo Biopharma 5, Inc. Methods and compositions for treatment of cancer
JP6959912B2 (ja) 2015-09-23 2021-11-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体の最適化変異体
WO2017055321A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of fibroblasts in a tissue sample
WO2017055325A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of nk cells in a tissue sample
WO2017055327A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of endothelial cells in a tissue sample
WO2017055324A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of cells of monocytic origin in a tissue sample
WO2017055320A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of cytotoxic lymphocytes in a tissue sample
WO2017055326A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of myeloid dendritic cells in a tissue sample
WO2017055322A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of neutrophils in a tissue sample
WO2017055319A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of b cells in a tissue sample
ES2846835T3 (es) 2015-10-13 2021-07-29 Inst Nat Sante Rech Med Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la neovascularización coroidea
AU2016344133A1 (en) 2015-10-30 2018-05-17 Genentech, Inc. Anti-Factor D antibody formulations
CA3001362C (en) 2015-10-30 2020-10-13 Genentech, Inc. Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof
WO2017075173A2 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Genentech, Inc. Anti-factor d antibodies and conjugates
US10654932B2 (en) 2015-10-30 2020-05-19 Genentech, Inc. Anti-factor D antibody variant conjugates and uses thereof
SG11201803520PA (en) 2015-11-03 2018-05-30 Janssen Biotech Inc Antibodies specifically binding pd-1 and their uses
EP3370764A4 (en) 2015-11-05 2019-07-17 The Regents of The University of California CELLS MARKED BY LIPID CONJUGATES AND METHODS OF USING THE SAME
AU2016354009B2 (en) 2015-11-09 2021-05-20 R.P. Scherer Technologies, Llc Anti-CD22 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof
CN108883057A (zh) 2015-11-18 2018-11-23 Sio2医药产品公司 用于眼科配制品的药物包装
CA3005692A1 (en) 2015-11-18 2017-05-26 Formycon Ag Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist
CA3005117C (en) 2015-11-18 2023-01-24 Formycon Ag Pre-filled pharmaceutical package comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist
ES2956007T3 (es) 2015-12-03 2023-12-11 Regeneron Pharma Métodos de asociación de variantes genéticas con un resultado clínico en pacientes que padecen degeneración macular asociada a la edad tratados con anti-VEGF
AU2016369537B2 (en) 2015-12-17 2024-03-14 Novartis Ag Antibody molecules to PD-1 and uses thereof
IL290457B1 (en) 2015-12-30 2024-10-01 Kodiak Sciences Inc Antibodies and their conjugates
EP3407868A1 (en) 2016-01-26 2018-12-05 Formycon AG Liquid formulation of a vegf antagonist
WO2017165681A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Gensun Biopharma Inc. Trispecific inhibitors for cancer treatment
US10941406B2 (en) 2016-03-29 2021-03-09 Geltor, Inc. Expression of proteins in gram-negative bacteria wherein the ratio of periplasmic volume to cytoplasmic volume is between 0.5:1 and 10:1
AU2017248766A1 (en) 2016-04-15 2018-11-01 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
WO2017181111A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
ES2912131T3 (es) 2016-05-20 2022-05-24 Biohaven Therapeutics Ltd Uso de agentes moduladores del glutamato con inmunoterapias para tratar el cáncer
TWI823836B (zh) 2016-07-08 2023-12-01 美商建南德克公司 人類副睪蛋白４（ｈｅ４）用於評定癌症治療反應性之用途
JP7050702B2 (ja) 2016-07-08 2022-04-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｎｒｆ２及びその遺伝子の下流標的遺伝子の発現状態及び変異状態によるがんの診断及び治療方法
WO2018011166A2 (en) 2016-07-12 2018-01-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of myeloid dendritic cells in a tissue sample
CA3030298A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Aerpio Therapeutics, Inc. Humanized monoclonal antibodies that target ve-ptp (hptp-.beta.)
WO2018018613A1 (zh) 2016-07-29 2018-02-01 广东东阳光药业有限公司 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法
CN106222129A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 广东东阳光药业有限公司 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法
JP2019524820A (ja) 2016-08-12 2019-09-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｍｅｋ阻害剤、ｐｄ−１軸阻害剤及びｖｅｇｆ阻害剤での組合せ療法
IL264961B1 (en) * 2016-08-23 2024-10-01 Medimmune Ltd Antibodies against VEGF-A and their uses
JPWO2018070390A1 (ja) 2016-10-12 2019-08-22 第一三共株式会社 抗ｒｏｂｏ４抗体と他剤を含む組成物
EP3528785A4 (en) 2016-10-19 2020-12-02 Adverum Biotechnologies, Inc. MODIFIED AAV CASPIDS AND USES THEREOF
CN109071656B (zh) 2017-01-05 2021-05-18 璟尚生物制药公司 检查点调节物拮抗剂
EP3568150A4 (en) 2017-01-10 2020-12-02 Xcella Biosciences, Inc. POLYTHERAPY FOR TUMOR TREATMENT WITH INTEGRIN-BOUND FC FUSION PROTEIN AND IMMUNE MODULATOR
US10350266B2 (en) 2017-01-10 2019-07-16 Nodus Therapeutics, Inc. Method of treating cancer with a multiple integrin binding Fc fusion protein
AU2018228873A1 (en) 2017-03-01 2019-08-29 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
KR20190131082A (ko) * 2017-03-24 2019-11-25 카운슬 오브 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 재조합 항체 단편을 정제하는 방법
EP3606527A1 (en) 2017-04-03 2020-02-12 Coherus Biosciences, Inc. Ppar-gamma agonist for treatment of progressive supranuclear palsy
JOP20190245A1 (ar) 2017-04-20 2019-10-15 Novartis Ag أنظمة توصيل إطلاق مستدام تتضمن روابط بلا أثر لنقطة الربط
EP3624847A1 (en) 2017-05-19 2020-03-25 Council of Scientific and Industrial Research A method for producing refolded recombinant humanized ranibizumab
US20200171244A1 (en) 2017-05-24 2020-06-04 Sio2 Medical Products, Inc. Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations
EP3630043A1 (en) 2017-05-24 2020-04-08 Formycon AG Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist
WO2018215580A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Formycon Ag Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist
TW201904610A (zh) 2017-06-14 2019-02-01 德商拜耳製藥公司 用於治療新生血管型青光眼之非抗體vegf拮抗劑
SG11201912473PA (en) 2017-06-22 2020-01-30 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2018237173A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag ANTIBODY MOLECULES DIRECTED AGAINST CD73 AND CORRESPONDING USES
TW201906635A (zh) 2017-07-04 2019-02-16 日商第一三共股份有限公司 伴隨視細胞變性的視網膜變性的疾病用藥
WO2019020777A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Formycon Ag LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST
WO2019057946A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 F. Hoffmann-La Roche Ag MULTI-CYCLIC AROMATIC COMPOUNDS AS D-FACTOR INHIBITORS
US11180541B2 (en) 2017-09-28 2021-11-23 Geltor, Inc. Recombinant collagen and elastin molecules and uses thereof
WO2019077593A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 Vascular Biogenics Ltd. DIAGNOSTIC METHODS FOR ANTI-ANGIOGENIC AGENT TREATMENT
JP2021506861A (ja) 2017-12-19 2021-02-22 アコーオス インコーポレイテッド 内耳への治療用抗体のａａｖ媒介送達
EP3731865A1 (en) 2017-12-29 2020-11-04 F. Hoffmann-La Roche AG Method for improving vegf-receptor blocking selectivity of an anti-vegf antibody
CN110283248B (zh) * 2018-01-05 2020-07-28 百奥泰生物制药股份有限公司 一种长效低毒的重组抗vegf人源化单克隆抗体及其生产方法
SG11202006712XA (en) 2018-02-06 2020-08-28 Hoffmann La Roche Treatment of ophthalmologic diseases
MX2020009152A (es) 2018-03-02 2020-11-09 Kodiak Sciences Inc Anticuerpos de il-6 y constructos de fusion y conjugados de los mismos.
AU2019231791B2 (en) 2018-03-09 2022-08-11 Agenus Inc. Anti-CD73 antibodies and methods of use thereof
CN111989095A (zh) 2018-04-16 2020-11-24 上海岸阔医药科技有限公司 预防或治疗肿瘤疗法副作用的方法
MA52570A (fr) 2018-05-10 2021-03-17 Regeneron Pharma Formulations contenant des protéines de fusion du récepteur vegf à haute concentration
JP7361727B2 (ja) 2018-05-24 2023-10-16 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Ｐｓｍａ結合剤及びその使用
US11519020B2 (en) 2018-05-25 2022-12-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of associating genetic variants with a clinical outcome in patients suffering from age-related macular degeneration treated with anti-VEGF
AR126019A1 (es) 2018-05-30 2023-09-06 Novartis Ag Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2019229116A1 (en) 2018-05-31 2019-12-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Intravitreal delivery of a decorin polypeptide for the treatment of choroidal neovascularisation
CN112638401A (zh) 2018-06-29 2021-04-09 璟尚生物制药公司 抗肿瘤拮抗剂
SI3818078T1 (sl) 2018-07-03 2024-05-31 Bristol-Myers Squibb Company Postopki za proizvodnjo rekombinantnih proteinov
GB201811410D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd OX40 Binding molecules
CN109053895B (zh) 2018-08-30 2020-06-09 中山康方生物医药有限公司 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途
WO2020068653A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Aerpio Pharmaceuticals, Inc. MULTISPECIFIC ANTIBODIES THAT TARGET HPTP - β (VE-PTP) AND VEGF
KR20210074341A (ko) 2018-10-10 2021-06-21 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 고밀도 생물 반응기 배양에서 막 기체 전달을 위한 방법
CN113196061A (zh) 2018-10-18 2021-07-30 豪夫迈·罗氏有限公司 肉瘤样肾癌的诊断和治疗方法
HU231514B1 (hu) 2018-11-07 2024-07-28 Richter Gedeon Nyrt. Sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer
WO2020109343A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for treatment of macular degeneration
CN109134651B (zh) * 2018-12-03 2019-02-22 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 一种抗vegf的单克隆抗体及其制备方法和应用
WO2020118043A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Coherus Biosciences, Inc. Methods for producing recombinant proteins
CA3120800A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 Revitope Limited Twin immune cell engager
US20220154212A1 (en) 2019-03-13 2022-05-19 Vascular Biogenics Ltd. Methods of anti-tumor therapy
CA3133652A1 (en) 2019-04-01 2020-10-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for stabilizing protein-containing formulations
HU231498B1 (hu) 2019-04-04 2024-05-28 Richter Gedeon Nyrt Immunglobulinok affinitás kromatográfiájának fejlesztése kötést megelőző flokkulálás alkalmazásával
TW202104254A (zh) 2019-04-12 2021-02-01 美商格爾托公司 重組彈性蛋白及其生產
JP2022529985A (ja) 2019-04-19 2022-06-27 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｐｓｍａ／ｃｄ３抗体で前立腺癌を治療する方法
TW202106699A (zh) 2019-04-26 2021-02-16 美商愛德維仁生物科技公司 用於玻璃體內遞送之變異體aav蛋白殼
AU2020270376A1 (en) 2019-05-03 2021-10-07 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with an anti-PD-L1 antibody
US20220211847A1 (en) 2019-05-06 2022-07-07 Medimmune Limited Combination of monalizumab, durvalumab, chemotherapy and bevacizumab or cetuximab for the treatment of colorectal cancer
CN114340735A (zh) 2019-06-28 2022-04-12 璟尚生物制药公司 突变的TGFβ1-RII胞外域和免疫球蛋白支架组成的抗肿瘤拮抗剂
EP4007808A1 (en) 2019-08-01 2022-06-08 Bristol-Myers Squibb Company Methods of improving protein productivity in fed-batch cell cultures
EP4031578A1 (en) 2019-09-18 2022-07-27 Novartis AG Entpd2 antibodies, combination therapies, and methods of using the antibodies and combination therapies
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
US20240092883A1 (en) 2019-10-11 2024-03-21 Coherus Biosciences, Inc. Methods of purifying ranibizumab or a ranibizumab variant
WO2021072182A1 (en) 2019-10-11 2021-04-15 Coherus Biosciences, Inc. Methods for producing ranibizumab
WO2021100034A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Protalix Ltd. Removal of constructs from transformed cells
CA3162748A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Akeso Biopharma, Inc. Anti-pd-1-anti-vegfa bispecific antibody, pharmaceutical composition and use thereof
WO2021180818A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of determining whether a subject has or is at risk of having a central serous chorioretinopathy
IL296256A (en) 2020-03-13 2022-11-01 Genentech Inc Antibodies against interleukin-33 and uses thereof
WO2021191870A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 Dcprime B.V. Ex vivo use of modified cells of leukemic origin for enhancing the efficacy of adoptive cell therapy
EP4127724A1 (en) 2020-04-03 2023-02-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
EP4171617A1 (en) 2020-06-30 2023-05-03 Mendus B.V. Use of leukemia-derived cells in ovarian cancer vaccines
UY39324A (es) 2020-07-16 2022-02-25 Novartis Ag Anticuerpos anti-betacelulina, sus fragmentos, moléculas de unión multiespecíficas, casetes de expresión, composiciones y métodos de tratamiento.
WO2022066595A1 (en) 2020-09-22 2022-03-31 Bristol-Myers Squibb Company Methods for producing therapeutic proteins
JP2023545999A (ja) 2020-10-05 2023-11-01 プロタリクス リミテッド ダイサー（ｄｉｃｅｒ）様ノックアウト植物細胞
WO2022079161A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Non-covalent protein-hyaluronan conjugates for long-acting ocular delivery
KR20230088781A (ko) 2020-11-13 2023-06-20 제넨테크, 인크. 고형 종양 치료를 위한 krasg12c 억제제 및 vegf 억제제를 포함하는 방법 및 조성물
PE20240115A1 (es) 2020-12-01 2024-01-22 Akouos Inc Construcciones de anticuerpos anti-vegf y metodos relacionados para el tratamiento de los sintomas asociados al schwannoma vestibular
KR20230135075A (ko) 2021-01-22 2023-09-22 멘두스 비.브이. 종양 백신접종 방법
MX2023008909A (es) 2021-01-28 2023-10-23 Janssen Biotech Inc Proteínas de unión a psma y usos de estas.
JP2024510989A (ja) 2021-03-12 2024-03-12 メンドゥス・ベスローテン・フェンノートシャップ ワクチン接種方法及びｃｄ４７遮断薬の使用
WO2022188832A1 (zh) 2021-03-12 2022-09-15 中山康方生物医药有限公司 含有抗pd-1-抗vegfa双特异性抗体的药物组合及其用途
JP2024516230A (ja) 2021-04-30 2024-04-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんのための治療及び診断方法並びに組成物
KR20240014477A (ko) 2021-05-28 2024-02-01 상하이 레제네리드 테라피즈 컴퍼니 리미티드 변이체 캡시드를 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스 및 이의 응용
US20240279324A1 (en) 2021-06-03 2024-08-22 Gensun Biopharma Inc. Multispecific antagonists
BR112023026966A2 (pt) 2021-07-02 2024-03-12 Hoffmann La Roche Métodos para tratar um indivíduo com melanoma, para alcançar uma resposta clínica, para tratar um indivíduo com linfoma não hodgkin, para tratar uma população de indivíduos com linfoma não hodgkin e para tratar um indivíduo com câncer colorretal metastático
EP4377351A1 (en) 2021-07-28 2024-06-05 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and compositions for treating cancer
WO2023015234A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Bristol-Myers Squibb Company Cell culture methods for producing therapeutic proteins
EP4386004A1 (en) 2021-08-13 2024-06-19 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-vegf a and -vegf c bispecific antibody and use thereof
EP4145456A1 (en) 2021-09-06 2023-03-08 Bayer AG Prediction of a change related to a macular fluid
WO2023049687A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods of controlling the level of dissolved oxygen (do) in a solution comprising a recombinant protein in a storage container
WO2023080900A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Genentech, Inc. Methods and compositions for classifying and treating kidney cancer
JPWO2023144973A1 (ko) 2022-01-27 2023-08-03
CN118742325A (zh) 2022-01-28 2024-10-01 上海岸阔医药科技有限公司 预防或治疗与抗肿瘤剂相关的疾病或病症的方法
MX2024009456A (es) 2022-02-02 2024-08-09 Akouos Inc Construcciones de anticuerpos anti-vegf y metodos relacionados para el tratamiento de los sintomas asociados al schwannoma vestibular.
WO2023155905A1 (zh) 2022-02-21 2023-08-24 上海岸阔医药科技有限公司 化合物及其用途
WO2024040175A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Pulmatrix Operating Company, Inc. Methods for treating cancer using inhaled angiogenesis inhibitor
CN117679505A (zh) 2022-09-09 2024-03-12 中山康方生物医药有限公司 药物组合及用途
WO2024186635A2 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-stem cell factor (scf) and anti-thymic stromal lymphopoietin (tslp) antibodies and bispecific constructs

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
JPS6289971A (ja) * 1985-06-13 1987-04-24 Toray Ind Inc 静電潜像用液体現像剤
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1990004788A1 (en) * 1988-10-28 1990-05-03 Genentech, Inc. Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5147638A (en) 1988-12-30 1992-09-15 Oklahoma Medical Research Foundation Inhibition of tumor growth by blockade of the protein C system
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
CZ282603B6 (cs) * 1991-03-06 1997-08-13 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschränkter Haftun G Humanizované a chimerické monoklonální protilátky
ES2315612T3 (es) 1991-04-10 2009-04-01 The Scripps Research Institute Genotecas de receptores heterodimericos usando fagemidos.
WO1992022653A1 (en) * 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
WO1993016177A1 (en) 1992-02-11 1993-08-19 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
DE69233803D1 (de) * 1992-10-28 2011-03-31 Genentech Inc Verwendung von vaskulären Endothelwachstumsfaktor-Antagonisten
DE69329503T2 (de) 1992-11-13 2001-05-03 Idec Pharma Corp Therapeutische Verwendung von chimerischen und markierten Antikörpern, die gegen ein Differenzierung-Antigen gerichtet sind, dessen Expression auf menschliche B Lymphozyt beschränkt ist, für die Behandlung von B-Zell-Lymphoma
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6037454A (en) * 1996-11-27 2000-03-14 Genentech, Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
US20020032315A1 (en) * 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
DK0973804T3 (da) * 1997-04-07 2007-05-07 Genentech Inc Anti-VEGF-antistoffer
DK1695985T3 (da) * 1997-04-07 2011-06-14 Genentech Inc Fremgangsmåde til dannelse af humaniserede antistoffer ved tilfældig mutagenese

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Biological Chemistry, Vol. 272(16), pp. 10678
Nature, Vol. 362, pp. 841

Also Published As

Publication number Publication date
ATE349470T1 (de) 2007-01-15
EP0973804A2 (en) 2000-01-26
US20050112126A1 (en) 2005-05-26
NZ500078A (en) 2001-10-26
LTPA2005005I1 (lt) 2017-11-27
TR199903123T2 (xx) 2000-05-22
NO994869L (no) 1999-12-06
KR100816621B1 (ko) 2008-03-24
KR20080003452A (ko) 2008-01-07
CY2007012I2 (el) 2009-11-04
US7060269B1 (en) 2006-06-13
HK1023577A1 (en) 2000-09-15
HK1084402A1 (en) 2006-07-28
EP1787999B1 (en) 2010-08-04
IL132240A0 (en) 2001-03-19
CY2005008I1 (el) 2009-11-04
CY2005008I2 (el) 2017-11-14
NO2007014I2 (no) 2011-02-21
EP1325932B9 (en) 2006-07-19
LU91167I2 (fr) 2005-06-20
DK0973804T3 (da) 2007-05-07
KR20080003453A (ko) 2008-01-07
CY1106382T1 (el) 2010-07-28
DE69829891D1 (de) 2005-05-25
DE69836729T2 (de) 2007-12-13
FR07C0017I1 (fr) 2007-04-27
AU743758B2 (en) 2002-02-07
EP0973804B1 (en) 2006-12-27
CA2286330C (en) 2008-06-10
GEP20105118B (en) 2010-11-25
NO2007015I2 (ko) 2011-11-28
EP1325932A2 (en) 2003-07-09
JP3957765B2 (ja) 2007-08-15
DE69836729D1 (de) 2007-02-08
BRPI9809387B8 (pt) 2021-05-25
US7297334B2 (en) 2007-11-20
FR07C0017I2 (fr) 2008-05-09
ES2236634T3 (es) 2005-07-16
FR05C0020I1 (ko) 2005-05-27
CA2286330A1 (en) 1998-10-15
CY2007012I1 (el) 2009-11-04
NL300278I1 (nl) 2007-06-01
NL300278I2 (nl) 2007-10-01
BRPI9809387B1 (pt) 2016-11-22
DE122007000021I1 (de) 2007-05-24
JP2001509817A (ja) 2001-07-24
NL300193I2 (nl) 2005-10-03
NO2007015I1 (no) 2008-01-14
EP1650220A2 (en) 2006-04-26
ES2273415T3 (es) 2007-05-01
NL300193I1 (nl) 2005-07-01
DK1325932T5 (da) 2005-10-03
WO1998045331A3 (en) 1998-12-03
EP1325932B1 (en) 2005-04-20
EP1650220B1 (en) 2007-09-05
SI1325932T1 (ko) 2005-08-31
EP1787999A1 (en) 2007-05-23
FR05C0020I2 (fr) 2008-05-09
DE69829891T2 (de) 2005-10-06
EP1325932A3 (en) 2003-10-29
BR9809387A (pt) 2001-09-11
CN1259962A (zh) 2000-07-12
DE122005000050I1 (de) 2005-12-29
PT1325932E (pt) 2005-06-30
ATE293640T1 (de) 2005-05-15
EP1650220A3 (en) 2006-05-03
NO324264B1 (no) 2007-09-17
NO994869D0 (no) 1999-10-06
WO1998045331A2 (en) 1998-10-15
AU7100798A (en) 1998-10-30
LU91320I9 (ko) 2018-12-31
DK1325932T3 (da) 2005-05-30
DE122005000026I1 (de) 2005-08-04
NO2007014I1 (no) 2008-01-14
CN100480269C (zh) 2009-04-22
LU91320I2 (fr) 2007-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100870353B1 (ko) 항-ｖｅｇｆ 항체
KR100794454B1 (ko) 항-ｖｅｇｆ 항체
US7365166B2 (en) Anti-VEGF antibodies
US6884879B1 (en) Anti-VEGF antibodies
US7169901B2 (en) Anti-VEGF antibodies
US20170369564A1 (en) Anti-vegf antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
G170 Re-publication after modification of scope of protection [patent]
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121019

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131030

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161028

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170929

Year of fee payment: 10

EXPY Expiration of term