KR20190131082A - 재조합 항체 단편을 정제하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 항체 단편을 미생물 세포에서 발현된 봉입체로부터 정제하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특별히, 본 발명은 재조합 인간화된(rHu) 항체 단편, 라니비추맙을 미생물 세포에서 발현된 봉입체로부터 정제하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 재조합 항체 단편을 미생물 세포에서 발현된 봉입체로부터 정제하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특별히, 본 발명은 재조합 인간화된(rHu: recombinant humanized) 항체 단편, 라니비추맙(Ranibizumab)을 미생물 세포에서 발현된 봉입체로부터 정제하는 방법에 관한 것이다.
생물의약품 연구 및 개발에 있어서의 최신 경향은 항체 단편의 개발에 더욱 중점을 둔다. 다수의 바이오시밀러(biosimilar) 치료 단백질이 이전에 비해 더 많이 개발되고 있지만, 바이오시밀러 제품 개발에 있어서의 중대한 어려움은 더 높은 분리 정제 공정(downstream processing) 비용, 공정 및 생성물 관련된 불순물의 비-선택적 소거, 생성물의 단백질분해에 의한 분해 등이다. 항체 단편은 전체 크기의 단일클론성 항체(mAb) 치료제에 비해 특정한 이점을 제공하는데, 이러한 이점은 예컨대 종양으로의 증진된 심부로의 침투, 전체 크기의 mAb에 접근할 수 없는 특이적 에피토프로의 결합 등이다. Fab는 임상 개발에 들어간 대다수의 항체 단편을 차지하고, 이중 3가지는 US FDA로부터 승인을 받았다. 고 역가 클론 및 연속적인 바이오-제조(bio-manufacturing)와 같은 발효 배양 공정(upstream processes)에서의 진보는, 생물의약품 산업의 초점을 전체적인 분리 정제 공정 경제를 향상시키는 쪽으로 옮겨 놓았다. 분리 정제 공정은 단일클론성 항체 치료제를 위한 전체 제조 비용의 대략 60 내지 70%를 차지한다. 분리 정제 공정의 포획 단계, 중간 단계 및 폴리싱(polishing) 단계는 고가의 다양한 크로마토그래피 조작의 사용을 포함한다.
라니비추맙은 인간 혈관 내피 성장인자-A(VEGF-A: Vascular Endothelial Growth Factor-A)의 활성 형태에 결합하여 이의 생물학적 기능을 저해하는 VEGF-A 길항물질이다. VEGF-A의 과도한 상향-조절은 이것이 새로운 혈관의 성장에 중요한 역할을 하도록 하여, 혈관형성 및 혈관의 과-침투성을 유도한다. 혈관의 침투성은 황반 부종 및 맥락막 혈관신생을 일으키고, 이로써 습성 형태의 노인성 황반 변성(AMD: age-related macular degeneration)을 야기한다. 그러므로, 혈관의 과침투성의 질환 증상을 제어 및 치료하기 위해, VEGF-A 길항물질에 의해 VEGF-A를 저해하는 것은 필수적이다. 라니비추맙은 루센티스(Lucentis: 등록상표)로서 약용 제형으로 상업적으로 입수가능하고, 유리체내 주사를 통해 투여된다. 이는 특별히 안구내 사용을 위해 고안되고 제작된다. 라니비추맙은 노인성 황반 변성(ARMD)의 치료에서 안구내 사용을 위해 고안된 재조합 인간화된 IgG1 카파 이소타입(isotype) 단일클론성 항체 단편이다.
라니비추맙의 분자량은 대략 48.37 kDa이고, 즉 경쇄 및 중쇄 각각에 대해 23.43 kDa 및 24.95 kDa이다. 인간화된 단일클론성 항체 단편은 이. 콜라이(E. coli) 세포에서 재조합 DNA 기술에 의해 발현되고, 인간 혈관 내피 성장 인자 A(VEGF-A)에 대해 표적화된다. 라니비추맙은 그의 C-말단에서 디설파이드 결합에 의해 중쇄의 231-잔기 N-말단 분절에 연결된 214-잔기 경쇄이다. 선행 기술 문헌은 항체 단편의 발현 및 그의 정제에 중점을 둔 자료들을 제공한다. 그러나, 이. 콜라이 세포를 사용하여 생산된 재조합 인간화된(rHu) 라니비추맙은 불용성 단백질 응집체의 형태로 봉입체를 형성한다.
US 제20160289314호는 라니비추맙을 제조하기 위한 클로닝, 발현 및 정제 방법을 개시한다. 정제 공정은 단지 가용화된 봉입체의 환원, 산화 및 시험관내 리폴딩(refolding)을 포함하고, 이후 한외여과 및 투석여과-I, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 한외여과 및 투석여과-II, 및 여과의 단계식 공정이 수반된다. 이러한 공정에서 다중 정제 단계는 낮은 처리량의 조작을 유발하고, 이로써 공정을 복잡하고 느리게 만든다.
그러므로, 정제된 항체 단편을 수득하기 위한 편리한 분리 정제 절차를 제공하는 것이 매우 필요하다. 선행 기술의 분리 정제 절차에 의해 제기된 문제점의 견지에서, 본 발명자들은 항체 단편을 정제하기 위한 방법을 제공하고자 하였다. 본 발명에 의해 수득된 정제된 항체 단편은 혁신 생성물의 순도 및 활성 기준을 만족시키고 충족시킨다.
따라서, 본 발명의 주요 목적은 항체 단편을 정제하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다중방식 크로마토그래피 정제 단계를 rHu 라니비추맙 분리 정제 공정과 통합시킴으로써 재조합 라니비추맙을 정제하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 기존의 제조 방법에 비해 생산성이 거의 두배 향상된 방법을 제공하는 것이다.
추가로 본 발명의 또 다른 목적은 개발된 정제 플랫폼(platform)이 시험관내 리폴딩된 항체 단편 및 가용성의 발현된 항체 단편 둘 다에 적용가능한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 재조합 항체 단편을 정제하는 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포로부터 rHu 라니비추맙을 봉입체 형태로 수득하는 단계; 가용화 완충액을 사용하여 봉입체를 가용화시킴으로써 가용화된 rHu 라니비추맙을 수득하는 단계; 리폴딩 완충액을 사용하여 가용화된 rHu 라니비추맙을 리폴딩함으로써 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 수득하는 단계; 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 한외여과에 의해 농축시켜 농축된 라니비추맙을 수득하는 단계; 농축된 rHu 라니비추맙에 순차적 다중방식 크로마토그래피 정제 단계를 적용하여 생성물 관련된 불순물, 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 핵산을 제거한 후, 투석여과 및 한외여과에 의해 정제된 rHu 라니비추맙을 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 인간 라니비추맙을 재조합 숙주 세포로부터 정제하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
(i) 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피에 적용함에 따라, pH 범위가 4.0 내지 10.0인 농축된 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 상으로 공급하고 20 내지 50 mM 트리스(Tris) HC1 및 0 내지 150 mM NaCl 또는 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 150 mM NaCl을 포함하고 pH 범위는 4.0 내지 10.0인 완충액을 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하고 불순물을 제거하는 단계;
(ii) 20 내지 50 mM 트리스 HCl 및 0 내지 1000 mM 염화 나트륨 또는 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 1000 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 10.0인 용리 완충액의 존재하에 rHu 라니비추맙을 용리 푸울(pool)로 용리시키되, 정제된 라니비추맙은 5% 미만의 언폴딩된(unfolded) 형태 또는 미스폴딩된(misfolded) 형태의 라니비추맙 및 2% 미만의 응집된 형태의 라니비추맙을 갖는 단계;
(iii) pH 범위가 4.5 내지 6.5인 단계 (ii)로부터 수득된 rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 상으로 공급하고 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 150 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 6.5인 완충액을 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하고 추가로 불순물을 제거하는 단계;
(iv) 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 1000 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 6.5인 용리 완충액의 존재하에 rHu 라니비추맙을 용리시키되, 정제된 rHu 라니비추맙은 0.1% 미만의 언폴딩된 형태 또는 미스폴딩된 형태의 rHu 라니비추맙 및 0.3% 미만의 응집된 형태의 rHu 라니비추맙을 갖는 단계
를 포함하는, 다중방식 크로마토그래피 정제 스테이지(stage)를 제공한다.
추가로 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 다중방식 크로마토그래피 상 I 및 II의 순서가 상호교환가능한 다중방식 크로마토그래피 방법을 제공한다.
또한 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 라니비추맙의 정제를 위한 분리 정제 공정에 의해 수득된 재조합 인간화된 라니비추맙을 제공한다.
재조합 인간 항체 단편(rHu 라니비추맙)을 정제하는 방법에 관한 개념을 소개하기 위해 이러한 요약이 제공된다. 이러한 요약은 청구된 특허 대상의 본질적 특징을 확인하려는 것이 아니며, 또한 청구된 특허 대상의 범주를 결정하거나 제한하는데 사용하려는 것도 아니다.
도 1은 청구된 다중방식 크로마토그래피 정제 플랫폼을 위한 공정 단계를 도시한다.
도 2는 다중방식 크로마토그래피 I에 대한 크로마토그램을 도시한다 - 용리 피크 I: 정제된 rHu 라니비추맙, 용리 피크 II: 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙) 및 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산).
도 3은 다중방식 크로마토그래피 II에 대한 크로마토그램을 도시한다 - 통류액(flow through) 및 용리 피크 I: 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산). 용리 피크 II: 정제된 rHu 라니비추맙, 용리 피크 III: 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙).
도 4는 통류 방식의 다중방식 크로마토그래피 I(공급 물질 전도도: 6.0 mS/cm, 평형 완충액: 20.0 mM 트리스 pH 9.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 5.0 CV 염 구배를 사용하여 용리됨)에 대한 크로마토그램을 도시한다 - 통류액: 정제된 rHu 라니비추맙(29.69% 순도); 용리 피크 I: rHu 라니비추맙을 포함하는 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산), 용리 피크 II: 미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙 및 공정 관련된 불순물.
도 5는 통류 방식의 다중방식 크로마토그래피 I(공급 물질 전도도: 12.0 mS/cm, 평형 완충액: 20.0 mM 트리스 pH 9.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 5.0 CV 염 구배를 사용하여 용리됨)에 대한 크로마토그램을 도시한다 - 통류액: 정제된 rHu 라니비추맙(33.12%); 용리 피크 I: 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산), 용리 피크 II: 미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙 및 공정 관련된 불순물.
도 6은 다중방식 크로마토그래피 I(평형 완충액: 20.0 mM 트리스 pH 9.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 단계 구배에 의해 용리되었고, 제1 단계는 1.0M NaCl을 갖는 20 mM 트리스 pH 9.0 포함하는 12.5%의 용리 완충액이었고, 제2 단계는 100% 용리 완충액임)에 대한 크로마토그램을 도시한다 - 용리 피크 I: 정제된 rHu 라니비추맙(38.25% 순도), 용리 피크 II: 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙) 및 공정 관련된 불순물.
도 7은 리폴딩된 rHu 라니비추맙과 회합된 저분자량 및 고분자량 불순물을 특징짓기 위한 비-환원 SDS-PAGE를 도시한다 - 레인 1: 본 발명의 다중방식 크로마토그래피를 사용하여 리폴딩된 정제된 rHu 라니비추맙, 레인 2: 단백질 분자량 표지자, 및 레인 3: 표준 혁신제품 라니비추맙.
도 8은 환원 SDS-PAGE를 도시한다 - 레인 1: 리폴딩된 정제된 rHu 라니비추맙, 레인 2: 단백질 분자량 표지자, 및 레인 3: 표준 혁신제품 라니비추맙.
도 9는 다중방식 크로마토그래피 I로부터의 용리 피크에 대한 비-환원 SDS-PAGE를 도시한다 - 1: 단백질 분자량 표지자. 2: 표준 혁신제품 rHu 라니비추맙. 3: 용리 피크 1(저분자량 불순물을 가지면서, 48 kDa에서 38.25% 순도의 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 포함), 4: 용리 피크 2(모든 기타 공정 관련된 불순물을 보여줌), (다중방식 크로마토그래피 I의 조건: 평형 완충액 pH 9.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 5 CV 염 구배에서 용리됨), 5: 용리 피크 1, 6: 용리 피크 2, (조건: 평형 완충액 pH 10.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 5 CV 염 구배에서 용리됨); 7: 용리 피크 1, 8: 용리 피크 2, (조건: 평형 완충액 pH 10.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 7.5 CV 염 구배에서 용리됨); 9: 용리 피크 1, 10: 용리 피크 2, (조건: 평형 완충액 pH 10.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 10 CV 염 구배에서 용리됨).
도 10은 정제된 가용성의 발현된 rHu 라니비추맙의 비-환원 SDS-PAGE를 도시한다 - 1: 표준 혁신제품 rHu 라니비추맙, 3: 본 발명의 정제된 rHu 라니비추맙.
도 11은 정제된 rHu 라니비추맙의 순도 분석을 위한 역상 HPLC 크로마토그램을 도시한다 - A: 표준 혁신제품 rHu 라니비추맙. B: 정제된 rHu 라니비추맙.
도 12는 정제된 rHu 라니비추맙의 크기 배제 크로마토그램을 도시한다 - A: 표준 혁신제품 rHu 라니비추맙, B: 정제된 rHu 라니비추맙.
도 13은 MALDI-TOF에 의한 원상태 질량 분석을 도시한다 - A: 표준 혁신제품 rHu 라니비추맙, B: 정제된 rHu 라니비추맙.
도 2는 다중방식 크로마토그래피 I에 대한 크로마토그램을 도시한다 - 용리 피크 I: 정제된 rHu 라니비추맙, 용리 피크 II: 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙) 및 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산).
도 3은 다중방식 크로마토그래피 II에 대한 크로마토그램을 도시한다 - 통류액(flow through) 및 용리 피크 I: 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산). 용리 피크 II: 정제된 rHu 라니비추맙, 용리 피크 III: 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙).
도 4는 통류 방식의 다중방식 크로마토그래피 I(공급 물질 전도도: 6.0 mS/cm, 평형 완충액: 20.0 mM 트리스 pH 9.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 5.0 CV 염 구배를 사용하여 용리됨)에 대한 크로마토그램을 도시한다 - 통류액: 정제된 rHu 라니비추맙(29.69% 순도); 용리 피크 I: rHu 라니비추맙을 포함하는 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산), 용리 피크 II: 미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙 및 공정 관련된 불순물.
도 5는 통류 방식의 다중방식 크로마토그래피 I(공급 물질 전도도: 12.0 mS/cm, 평형 완충액: 20.0 mM 트리스 pH 9.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 5.0 CV 염 구배를 사용하여 용리됨)에 대한 크로마토그램을 도시한다 - 통류액: 정제된 rHu 라니비추맙(33.12%); 용리 피크 I: 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산), 용리 피크 II: 미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙 및 공정 관련된 불순물.
도 6은 다중방식 크로마토그래피 I(평형 완충액: 20.0 mM 트리스 pH 9.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 단계 구배에 의해 용리되었고, 제1 단계는 1.0M NaCl을 갖는 20 mM 트리스 pH 9.0 포함하는 12.5%의 용리 완충액이었고, 제2 단계는 100% 용리 완충액임)에 대한 크로마토그램을 도시한다 - 용리 피크 I: 정제된 rHu 라니비추맙(38.25% 순도), 용리 피크 II: 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙) 및 공정 관련된 불순물.
도 7은 리폴딩된 rHu 라니비추맙과 회합된 저분자량 및 고분자량 불순물을 특징짓기 위한 비-환원 SDS-PAGE를 도시한다 - 레인 1: 본 발명의 다중방식 크로마토그래피를 사용하여 리폴딩된 정제된 rHu 라니비추맙, 레인 2: 단백질 분자량 표지자, 및 레인 3: 표준 혁신제품 라니비추맙.
도 8은 환원 SDS-PAGE를 도시한다 - 레인 1: 리폴딩된 정제된 rHu 라니비추맙, 레인 2: 단백질 분자량 표지자, 및 레인 3: 표준 혁신제품 라니비추맙.
도 9는 다중방식 크로마토그래피 I로부터의 용리 피크에 대한 비-환원 SDS-PAGE를 도시한다 - 1: 단백질 분자량 표지자. 2: 표준 혁신제품 rHu 라니비추맙. 3: 용리 피크 1(저분자량 불순물을 가지면서, 48 kDa에서 38.25% 순도의 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 포함), 4: 용리 피크 2(모든 기타 공정 관련된 불순물을 보여줌), (다중방식 크로마토그래피 I의 조건: 평형 완충액 pH 9.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 5 CV 염 구배에서 용리됨), 5: 용리 피크 1, 6: 용리 피크 2, (조건: 평형 완충액 pH 10.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 5 CV 염 구배에서 용리됨); 7: 용리 피크 1, 8: 용리 피크 2, (조건: 평형 완충액 pH 10.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 7.5 CV 염 구배에서 용리됨); 9: 용리 피크 1, 10: 용리 피크 2, (조건: 평형 완충액 pH 10.0, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 10 CV 염 구배에서 용리됨).
도 10은 정제된 가용성의 발현된 rHu 라니비추맙의 비-환원 SDS-PAGE를 도시한다 - 1: 표준 혁신제품 rHu 라니비추맙, 3: 본 발명의 정제된 rHu 라니비추맙.
도 11은 정제된 rHu 라니비추맙의 순도 분석을 위한 역상 HPLC 크로마토그램을 도시한다 - A: 표준 혁신제품 rHu 라니비추맙. B: 정제된 rHu 라니비추맙.
도 12는 정제된 rHu 라니비추맙의 크기 배제 크로마토그램을 도시한다 - A: 표준 혁신제품 rHu 라니비추맙, B: 정제된 rHu 라니비추맙.
도 13은 MALDI-TOF에 의한 원상태 질량 분석을 도시한다 - A: 표준 혁신제품 rHu 라니비추맙, B: 정제된 rHu 라니비추맙.
본 발명은 이제 특정의 바람직하고 임의적인 실시양태과 연관되어 상세히 설명될 것이므로, 이의 다양한 양태는 더욱 자세히 이해되고 인식될 수 있다.
정의
편의상, 본 발명에 대한 추가의 설명 이전에, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용된 특정 용어들을 아래에 모아두었다.
용어 "봉입체"는 표적 재조합 단백질의 불용성 응집체를 지칭한다. 표적 단백질의 봉입체는 미스폴딩된 단백질 및 부분적으로 폴딩된 단백질의 조합물을 함유한다. 단백질 리폴딩은 단백질이 생물학적 기능성의 입체배좌인 그의 고유의 3차원 구조를 획득하도록 하는 공정이다.
용어 "환원제"는 단백질의 디설파이드 연결의 환원을 일으키고 분자내 및 분자간 디설파이드 결합이 화학적으로 파열된채로 유지시키는 물질을 지칭한다.
용어 "카오트로픽(chaotropic) 제제"는 단백질을 더욱 수용성으로 만들도록 단백질 입체배좌를 변경시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 이러한 카오트로픽 제제의 예로는 에탄올, 부탄올, 우레아, 구아니듐 하이드로클로라이드, 티오우레아, 염화 마그네슘, 과염소산 리튬 등이 포함된다.
용어 "숙주 세포 단백질"은 발효 과정 또는 세포 배양 공정 동안 표적 단백질을 제외하고 숙주 세포에 의해 발현되는 모든 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 '다중방식 크로마토그래피'는, 리간드가 이온 상호작용, 소수성 상호작용 또는 수소 결합을 비롯한 여러가지 유형의 상호작용을 통해 단백질과 상호작용하는 크로마토그래피 기법을 지칭한다.
본 발명은 재조합 숙주 세포로부터 재조합 단일클론성 항체 단편을 정제하는 방법을 제공하고, 본 방법은
(i) 재조합 숙주 세포로부터 수득된 항체 단편을 함유하는 봉입체를 가용화 완충액에 의해 가용화시켜 가용화된 항체 단편을 수득하는 단계;
(ii) 가용화된 항체 단편을 리폴딩 완충액에 의해 리폴딩하여 리폴딩된 항체 단편을 수득하는 단계;
(iii) 리폴딩된 항체 단편을 한외여과에 의해 농축시켜 농축된 항체 단편을 수득하는 단계; 및
(iv) 농축된 항체 단편을 순차적 다중방식 크로마토그래피 정제에 적용하여 생성물 관련된 불순물, 즉 숙주 세포 단백질, 및 숙주 세포 핵산을 제거한 후, 투석여과 및 한외여과하여 정제된 rHu 항체 단편을 수득하는 단계를 포함한다.
재조합 라니비추맙은 바람직하게는 재조합 숙주 세포에서 중쇄 및 경쇄 농도의 동일한 비율로 상기 단백질의 발현에 의해 수득된다. 본 발명에서 사용된 재조합 숙주 세포는 이. 콜라이의 세포이다. 본 발명에 사용된 이. 콜라이 숙주 균주는 이 콜라이 BL21(DE3)이다. 상기 균주는 메르크 밀리포어(Merck Millipore)로부터 수득되었다.
본 발명은 재조합 인간화된(rHu) 라니비추맙의 경쇄 및 중쇄의 동일하거나 동일하지 않은 비율을 함유하는 봉입체를 가용화 완충액의 존재하에 가용화시켜 rHu 라니비추맙의 경쇄 및 중쇄의 가용화된 혼합물을 수득한다. 재조합 숙주 세포로부터 추출된 rHu 봉입체는 카오트로픽 청정제, 환원제 및 변성제의 조합물을 포함하는 가용화 완충액을 사용하여 가용화되었다.
카오트로픽 시약은 우레아 및 구아니듐 하이드로클로라이드 염을 포함한다. 가용화 완충액의 pH는 7 내지 10의 범위로 유지되었다. 가용화된 봉입체의 환원은 30 분 내지 2 시간 동안 디티오트레이톨, 베타 머캅토에탄올을 포함하는 환원제의 조합물을 사용하여 달성되었다.
카오트로픽 청정제, 환원제 및 변성제는 당분야에서 통상적으로 사용되는 물질로부터 선택된다.
가용화 공정은 라니비추맙 단백질을 함유한 재조합 숙주 세포로부터 수득된 봉입체를 초기에 15 ㎖의 가용화 완충액에서 가용화시킴을 포함한다. 가용화 완충액은 0.1M 트리스 pH 9.0, 2 mM EDTA 및 변성제로서의 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드를 30 분 동안 함유한 후, 1 시간 동안 5 mM DTT의 존재하에 환원된다. 가용성의 환원된 봉입체 용액은 10 mM 산화 글루타티온을 첨가함으로써 산화가 유지되었다.
또 다른 실시양태에서, 가용화된 rHu 라니비추맙의 시험관내 리폴딩은 리폴딩 완충액의 존재하에 수득된다. 리폴딩 완충액은 단백질 폴딩 제제, 폴리올 및 계면활성제를 포함하고, 여기서 pH는 8.0 내지 10.0으로 유지된다.
본원에서 지칭된 '시험관내 단백질 리폴딩'은 미스폴딩된 라니비추맙을 올바르게 폴딩된 형태로 전환시키는 공정에 관한 것이다. 라니비추맙 리폴딩은 5℃ 내지 20℃ 범위의 온도에서 0.1 M 트리스 pH 9.0, 0.6 M 아르기닌, 5% 소르비톨 및 2 mM EDTA가 함유된 리폴딩 완충액중에서 75배 희석을 사용하여 달성되었다.
리폴딩된 라니비추맙 단백질은 5 kDa 한외여과 울트라세테(Ultrasette: 상표명) 랩 접선 유동 여과(Lab Tangential Flow Filtration) 장치를 사용하여 한외여과함으로써 추가로 농축되고, 이어서 20 mM 트리스 pH 9.0으로 완충액 교환된다. 이어서 완충액 교환된 샘플은 다중방식 크로마토그래피를 위한 투입물로서 사용되었다.
가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 재조합 숙주 세포로부터의 rHu 라니비추맙의 경쇄 및 중쇄를 함유하는 봉입체를 가용화시켜 가용화된 rHu 라니비추맙을 수득하는 단계;
(b) 가용화된 rHu 라니비추맙을 리폴딩하여 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 수득하는 단계;
(c) 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 한외여과에 의해 농축시켜 농축된 리폴딩된 라니비추맙을 수득하는 단계; 및
(d) 농축된 리폴딩된 rHu 라니비추맙에 다중방식 크로마토그래피를 적용하는 단계
를 포함하는, 재조합 인간화된(rHu) 라니비추맙의 항체 단편을 재조합 숙주 세포로부터 정제하는 방법으로서,
상기 크로마토그래피 공정은
(i) pH 범위가 4.0 내지 10.0인 단계 (c)의 농축된 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 상으로 공급하고 20 내지 50 mM 트리스 HC1 및 0 내지 150 mM NaCl 또는 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 150 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 10.0인 완충액을 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하고 불순물을 제거하는 단계;
(ii) 20 내지 50 mM 트리스 HCl 및 0 내지 1000 mM 염화 나트륨 또는 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 1000 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 10.0인 용리 완충액의 존재하에 rHu 라니비추맙을 용리 푸울로 용리시키되, 정제된 라니비추맙은 5% 미만의 언폴딩된 형태 또는 미스폴딩된 형태의 라니비추맙 및 2% 미만의 응집된 형태의 라니비추맙을 갖는 단계;
(iii) pH 범위가 4.5 내지 6.5인 단계 (ii)로부터의 rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 상으로 공급하고 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 150 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 6.5인 완충액을 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하고 불순물을 추가로 제거하는 단계; 및
(iv) 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 1000 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 6.5인 용리 완충액의 존재하에 rHu 라니비추맙을 용리시키되, 정제된 rHu 라니비추맙은 0.1% 미만의 언폴딩된 형태 또는 미스폴딩된 형태의 rHu 라니비추맙 및 0.3% 미만의 응집된 형태의 rHu 라니비추맙을 갖는 단계
를 포함하는, 방법을 제공한다.
전술된 방법의 단계 (i) 및 (ii)에서 다중방식 크로마토그래피 정제에 관여된 공정 스테이지는 다중방식 크로마토그래피 상 I으로서 지칭되고, 전술된 방법의 단계 (iii) 및 (iv)에서 다중방식 크로마토그래피 정제에 관여된 공정 스테이지는 다중방식 크로마토그래피 상 II로서 지칭된다. 다중방식 크로마토그래피 상 I 및 II는 순차적 방식으로 수행되거나, 임의적으로 순서가 상호교환되어 라니비추맙과 회합된 다양한 공정 및 생성물 관련된 불순물을 제거할 수 있다.
다중방식 크로마토그래피 상 I(공정 단계 (i) 및 (ii)) 및 II(공정 단계 (iii) 및 (iv))는 각각 rHu 라니비추맙의 정제를 위한 2개의 단계를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 다중방식 크로마토그래피의 결합-용리 방식 및 다중방식 크로마토그래피의 통류 방식을 포함하는 다중방식 크로마토그래피 상 I을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 다중방식 크로마토그래피의 결합-용리 방식 및 다중방식 크로마토그래피의 통류 방식을 포함하는 다중방식 크로마토그래피 상 II를 제공한다.
다중방식 크로마토그래피 상 I
상 I에 이용되는 다중방식 크로마토그래피 방식은 결합-용리 크로마토그래피 방식 또는 통류 방식으로부터 선택된다. 다중방식 크로마토그래피 수지 I은 HEA 하이퍼셀(Hypercel), PPA 하이퍼셀, 및 베이커본드(BAKERBOND: 상표명) XWP 500 폴리(Poly)PEI-35 및 또는 캅토(Capto) 접착 수지로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은
(i) 농축된 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 I 상으로 결합시키고 20 내지 50 mM 트리스 HC1 및 0 내지 150 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 8.0 내지 10.0인 완충액을 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하고 불순물을 제거하는 단계;
(ii) rHu 라니비추맙을 20 내지 50 mM 트리스 HC1 및 0 내지 1000 mM 염화 나트륨이 포함되고 pH 범위가 8.0 내지 10.0인 용리 완충액의 존재하에 용리 푸울로 용리시키는 단계
를 포함하는 결합-용리 방식의 크로마토그래피가 관여된 다중방식 크로마토그래피 상 I을 제공한다.
결합-용리 크로마토그래피가 관여된 다중방식 크로마토그래피 상 I의 제1 스테이지는 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 결합시키는 단계 및 정제된 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 용리시키는 단계를 포함한다.
다중방식 크로마토그래피 수지 I에서, 8.0에서 10.0으로의 샘플 투입 pH에서의 변화, 및 5 CV에서 10 CV로의 상이한 염 구배에서의 용리는 불순물의 제거 및 정제 공정의 최적화에 있어서 중요한 역할을 한다.
다중방식 크로마토그래피 상 I의 결합 및 용리 방식에서, 평형 완충액 pH를 8.0에서 10.0으로 변경시키는 것은, 단백질의 전하 분포 및 3차원 입체배좌를 바꾼다. 이온 상호작용, 소수성 상호작용 및 상이한 염 구배에서의 용리의 조합에 의해, 평형 완충액 pH 9.0 및 5 CV 염 구배에서, 38.79%의 생성물 순도를 가지면서 67.56%의 회수율이 수득된 것으로 관찰되었다.
한가지 실시양태에서, 본 발명은
(i) 20 내지 50 mM 트리스-HCl, 및
(ii) 0 내지 150 mM 염화 나트륨을 포함하고, pH 범위가 8.0 내지 10.0인, rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 I에 결합시키기 위해 사용되는 결합 완충액을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
(i) 20 내지 50 mM 트리스-HCl, 및
(ii) 0 내지 1000 mM 염화 나트륨을 포함하고, pH 범위가 8.0 내지 10.0인, rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 I으로부터 용리 푸울로 용리시키기 위해 사용되는 용리 완충액을 제공한다.
본 발명은
(i) 농축된 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 6.0 mS/cm 내지 12 mS/cm 범위의 투입 전도도로 다중방식 크로마토그래피 수지 I 상으로 공급하고 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 150 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 6.5인 완충액을 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하고 불순물을 제거하는 단계; 및
(ii) 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0내지 1000 mM 염화 나트륨이 포함되고 pH 범위가 4.0 내지 6.5인 용리 완충액의 존재하에 불순물을 용리 푸울로 용리시키는 단계
를 포함하는 크로마토그래피의 통류 방식이 관여된 다중방식 크로마토그래피 상 I을 제공한다.
다중방식 크로마토그래피 상 I의 통류 방식에서, 재조합 라니비추맙의 리폴딩된 농축 분별물의 투입 전도도의 변경은 리폴딩된 rHu 라니비추맙 및 불순물의 결합 친화도를 바꾼다. 12 mS/cm의 샘플 투입 전도도에서, 불순물은 수지와 결합되고 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 통류시 용출된다. 이러한 조건하에, 33.12%의 생성물 순도를 가지면서 76.98%의 회수율이 수득된 것으로 관찰되었다.
다중방식 크로마토그래피 상 II
다중방식 크로마토그래피 상 I의 용리로부터 수득된 rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 II 상으로 공급하고 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 150 mM NaCl을 포함하고 pH 범위는 4.0 내지 6.5인 완충액을 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하고 불순물을 추가로 제거하여, 4.5 내지 6.5 범위의 pH로 조정한다.
본 발명은
(i) pH 범위가 4.5 내지 6.5인 다중방식 크로마토그래피 상 I의 용리 푸울로부터 수득된 rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 II 상으로 6.0 mS/cm 내지 12 mS/cm 범위의 투입 전도도에 의해 공급하고 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 150 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 6.5인 완충액을 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하고 추가로 불순물을 제거하는 단계; 및
(ii) 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 1000 mM NaCl이 포함되고 pH 범위가 4.0 내지 6.5인 용리 완충액의 존재하에 rHu 라니비추맙을 용리시키는 단계
를 포함하는, 결합-용리 크로마토그래피를 이용하여 수행되는 다중방식 크로마토그래피 상 II를 제공한다.
본 발명은
(i) pH 범위가 8.0 내지 10.0인 다중방식 크로마토그래피 상 I의 용리 푸울로부터 수득된 rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 II 상으로 공급하고 20 내지 50 mM 트리스-HCl 및 0 내지 150 mM NaCl이 포함되고 pH 범위가 8.0 내지 10.0인 완충액을 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하고 추가로 불순물을 제거하는 단계; 및
(ii) 20 내지 50 mM 트리스-HCl 및 0 내지 1000 mM NaCl이 포함되고 pH 범위가 8.0 내지 10.0인 용리 완충액의 존재하에 rHu 라니비추맙을 용리시키는 단계
를 포함하는, 다중방식 크로마토그래피의 통류 방식을 이용하여 수행되는 다중방식 크로마토그래피 상 II를 제공한다.
한가지 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명은
(i) 20 내지 50 mM 아세테이트, 및
(ii) 0 내지 150 mM 염화 나트륨을 포함하고, pH 범위가 4.0 내지 6.0인, rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 II에 결합시키기 위해 사용되는 결합 완충액을 제공한다.
또한 또 다른 실시양태에서, 본 발명은
(i) 20 내지 50 mM 트리스-HCl, 및
(ii) 0 내지 1000 mM 염화 나트륨을 포함하고, pH 범위가 4.0 내지 6.0인, rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 II로부터 용리 푸울로 용리시키기 위해 사용되는 용리 완충액을 제공한다.
다중방식 크로마토그래피 수지 II는 HEA 하이퍼셀, PPA 하이퍼셀, 및 베이커본드(상표명) XWP 500 폴리CSX-35 및 또는 캅토 MMC 수지로 구성된 군에서 선택된다. 다중방식 크로마토그래피 수지 II의 결합 및 용리 방식에서, 평형 완충액 pH를 4.0에서 6.5로 변경시키는 것은 단백질의 전하 분포 및 3차원 입체배좌를 바꾼다. 이온 상호작용, 소수성 상호작용 및 샘플 투입 전도도의 조합에 의해, 평형 완충액 pH 5.5 및 6.0 mS/cm의 샘플 투입 전도도에서, 99.50%의 생성물 순도를 가지면서 46.57%의 회수율이 수득된 것으로 관찰되었다.
전술된 표 1은 상이한 실험 설정으로부터 회수된 rHu 라니비추맙과 함께 조건의 최적화를 위해 검사된 평형 완충액 pH 및 염 농도의 다양한 조건을 열거한다.
pH에서의 증가는 rHu 라니비추맙 상의 음성 전하를 증가시키는 역할을 수행하여, rHu 라니비추맙 및 수지 리간드 사이에 더 강한 정전기적 상호작용을 유도한다.
염 구배는 rHu 라니비추맙의 선택적 용리에 있어서 중요한 역할을 담당한다. pH 9.0 및 5 CV 염 용리 구배에서 20 mM 트리스-HCl 완충액을 포함하는 용리 완충액이 38.25%의 매우 순수한 생성물인 rHu 라니비추맙을 달성하는데 조력하는 것으로 관찰되었다. 이러한 조건에서, 리폴딩된 rHu 라니비추맙의 최대 순도가 관찰되었는데, 이는 샘플 투입 전도도 및 용리시 염 농도가 불순물과 수지의 소수성 상호작용에 중요한 영향을 주어 최대로 정제된 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 용리하였기 때문이다.
표 2는 다중방식 크로마토그래피 II에서 용리된 rHu 라니비추맙의 회수율 및 순도에 미치는 평형 완충액의 상이한 pH 및 샘플 적재 조건의 영향을 보여준다. pH에서의 감소는 rHu 라니비추맙 상에서 양성 전하를 증가시키는 역할을 하여, rHu 라니비추맙 및 수지 리간드 사이에 더 강한 정전기적 상호작용을 유도한다. 단백질 분자의 소수성은 상이한 용액 전도도에서 상이하게 바뀌고, 이는 궁극적으로는 수지와의 상이한 결합 친화도를 유도한다. pH 5.5 및 6.0 mS/cm의 샘플 적재 전도도에서 20 mM 아세테이트 완충액을 포함하는 용리 완충액이 99.50%의 매우 순수한 rHu 라니비추맙을 달성하는데 조력하는 것으로 관찰되었다.
정제된 라니비추맙은 도 2에서 다중방식 수지 크로마토그래피 칼럼 I으로부터의 용리 후 38.79% 순도를 지시하는 용리 피크 I에서 관찰된다. 용리 피크 II는 미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙 및 공정 관련된 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질 및 핵산을 함유한다.
도 3을 통해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 포함한 공정 관련된 불순물은 통류액 및 용리 피크 I에서 관찰된 반면, 정제된 라니비추맙은 99.50% 순도를 지시하는 용리 피크 II에서 관찰되었고, 생성물 관련된 불순물, 예컨대 미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙은 용리 피크 III에서 관찰된 것으로 확인된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은
(i) 재조합 숙주 세포로부터 rHu 라니비추맙을 봉입체 형태로 수득하는 단계;
(ii) 봉입체를 가용화 완충액에 의해 가용화시켜 가용화된 rHu 라니비추맙을 수득하는 단계;
(iii) 가용화된 rHu 라니비추맙을 리폴딩 완충액에 의해 리폴딩하여 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 수득하는 단계;
(iv) 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 한외여과에 의해 농축시켜 농축된 rHu 라니비추맙을 수득하는 단계; 및
(v) 농축된 rHu 라니비추맙에 다중방식 크로마토그래피 정제 단계의 순서를 적용하여 생성물 관련된 불순물, 숙주 세포 단백질, 및 숙주 세포 핵산을 제거하고 정제된 rHu 라니비추맙을 수득하는 단계
를 포함하는 정제 방법에 의해 수득된 라니비추맙을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
한가지 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득된 재조합 인간화된 라니비추맙을 제공한다.
하나 이상의 실시양태에서, 본 발명은 유리체내 투여를 위하여 본 발명의 방법으로부터 수득된 라니비추맙을 포함하는 수성 조성물을 제공하고, 여기서 상기 조성물은 노인성 황반 변성 및 연관된 질환을 치료하고 제어하는데 사용된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시로서 제공되고, 그러므로 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1: 결합/용리 방식의 다중방식 크로마토그래피
(i) 봉입체의 가용화
이. 콜라이에서 발현된 재조합 인간 라니비추맙을 본 발명에서 사용하였다. 0.8 그램의 봉입체를 초기에 0.1M 트리스 pH 9.0, 2 mM EDTA 및 변성제로서의 6M 구아니딘 하이드로클로라이드가 함유된 40 ㎖의 가용화 완충액에서 30 분 동안 가용화시켰다. 30 분 동안 25℃의 온도에서 자기 교반기를 사용하여 봉입체를 가용화시켰다. 가용화 이후, IB를 7000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하고, 1.0 ㎛ 기공 크기의 여과지를 사용하여 여과시켰다. 가용화 완충액중 0.5M 디티오트레이톨(DTT)의 농도가 5.0 mM이도록, DTT를 환원제로서 첨가하였다. 환원을 위해 용액을 교반 조건하에 25℃에서 30 분 동안 유지시켰다. 3 시간 동안 10.0 mM 산화 글루타티온을 첨가함으로써 가용성의 환원된 봉입체 용액을 산화를 위해 유지시켰다.
(ii) 라니비추맙을 포함하는 가용화된 IB의 리폴딩
대략 40 ㎖의 가용화된, 환원 및 산화 봉입체 용액을 0.1M 트리스, 0.6M 아르기닌, 5.0% 소르비톨 및 2 mM EDTA, 0.60 mM 시스틴 및 0.75 mM 시스테인이 포함된 960 ㎖의 리폴딩 완충액(pH 9.0)에 첨가하였다. 리폴딩 공정을 50 rpm, 10 ± 2℃에서 120 시간 동안 실행하였다.
(iii) 리폴딩된 rHu 라니비추맙의 한외여과 및 투석여과
5 kDa 울트라세테(상표명) 랩 접선 유동 여과 장치를 사용하여 한외여과에 의해 리폴딩된 라니비추맙 단백질을 농축시켰다. 연속된 투석여과 조작을 사용하여 농축 단백질을 20 mM 트리스 pH 9.0으로 완충액 교환하였다. 이어서 완충액 교환된 샘플을 다중방식 크로마토그래피를 위한 투입물로서 사용하였다.
(iv) 다중방식 크로마토그래피 I
다중방식 크로마토그래피 I을 폴리PEI-35 수지에 의해 수행하였다. 농축된 리폴딩된 라니비추맙의 pH를 9.0으로 조정하고 공급 물질로서 사용하였다. 평형 완충액으로서 20 mM 트리스 pH 9.0을 사용하고, 이후 1M NaCl이 함유된 20 mM 트리스 pH 9.0에 의한 3 CV 염 구배에 의해, 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 수행하였다. 이러한 조건하에, 단백질은 통류액에서 관찰되지 않았다. 용리 피크를 RP-HPLC 분석한 결과, 정제된 라니비추맙은 용리 피크 I에서 관찰된 것으로 확인되었다(38.79% 순도)(도 2). 용리 피크 II는 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙) 및 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)을 함유한다. 도 2에서, 다중방식 크로마토그래피의 용리 피크 1은 SDS PAGE를 사용하여 특징지워진 정제된 rHu 라니비추맙을 함유하였다(도 9, 48 kDa에서의 레인 번호 3).
(v) 다중방식 크로마토그래피 II
폴리CSX-35 수지를 사용하여 다중방식 크로마토그래피 II를 수행하였다. 10 mM 아세테이트 완충액 pH 5.50을 평형 완충액으로서 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 실행하였다. 다중방식 크로마토그래피 I의 용리 푸울을 다중방식 크로마토그래피 II를 위한 공급 물질로서 사용하였다. 공급 물질의 pH를 빙초산에 의해 pH 5.50으로 조정하였다. 1M NaCl이 함유된 10 mM 아세테이트 완충액 pH 5.50에 의한 염 기반의 단계 구배에 의해 용리를 수행하였다. 10%의 구배에서 공정 관련된 불순물을 선택적으로 제거한 후, 45%의 용리 단계 구배를 사용하여 순수한 라니비추맙을 용리시켰다. 이들 피크를 RP-HPLC 분석한 결과, 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)은 통류액 및 용리 피크 I에서 관찰된 반면, 정제된 라니비추맙은 용리 피크 II(99.50% 순도)에서 관찰되고 생성물 관련된 불순물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙)은 용리 피크 III(도 3)에서 관찰된 것으로 확인되었다. 생성물의 품질을 SDS PAGE 분석에 의해 확인하였고, 표준 라니비추맙과 잘 일치하는 것으로 밝혀졌다(도 7의 48 kDa에서의 레인 번호 1).
실시예 2: 결합-용리 다중방식 크로마토그래피 I 및 II
rHu 라니비추맙의 리폴딩 및 이의 전처리:
(i) 봉입체의 가용화
이. 콜라이에서 발현된 재조합 인간 라니비추맙을 포함하는 0.4 그램의 IB를 0.1M 트리스 pH 9.0, 2.0 mM EDTA 및 변성제로서의 6.0M 구아니딘 하이드로클로라이드가 함유된 20 ㎖의 가용화 완충액에 30 분 동안 용해시켰다. 추가의 가공을 실시예 1(i)의 공정에 따라 수행하였다.
(ii) 가용화된 봉입체의 리폴딩
리폴딩을 실시예 1(ii)에 개시된 공정에 따라 수행하였다.
(iii) 리폴딩된 rHu 라니비추맙의 한외여과 및 투석여과
리폴딩된 rHu 라니비추맙의 한외여과 및 투석여과를 실시예 1(iii)에 개시된 공정에 따라 수행하였다.
(iv) 다중방식 크로마토그래피 I
다중방식 크로마토그래피 I을 폴리PEI-35 수지에 의해 수행하였다. 농축된 리폴딩된 라니비추맙의 pH를 10.0으로 조정하고 공급 물질로서 사용하였다. 20.0 mM 트리스 pH 10.0를 평형 완충액으로서 사용한 후 1.0M NaCl이 함유된 20.0 mM 트리스 pH 10.0에 의한 5.0 CV 염 구배에 의해, 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 실행하였다. 통류액에서 단백질이 관찰되지 않았다. 용리 피크를 RP-HPLC 분석한 결과, 정제된 라니비추맙은 용리 피크 I(37.97% 순도)에서 관찰된 것으로 확인되었다. 용리 피크 II는 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙) 및 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)을 함유하였다.
(v) 다중방식 크로마토그래피 II
폴리CSX-35 수지를 사용하여 다중방식 크로마토그래피 II를 수행하였다. 10.0 mM 아세테이트 완충액 pH 5.5를 평형 완충액으로서 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 실행하였다. 다중방식 크로마토그래피 I의 용리 푸울을 다중방식 크로마토그래피 II를 위한 공급 물질로서 사용하였다. 공급 물질의 pH를 빙초산에 의해 pH 5.5로 조정하였다. 1.0M NaCl이 함유된 10 mM 아세테이트 완충액 pH 5.5에 의한 염 기반의 단계 구배에 의해 용리를 수행하였다. 10%의 구배에서 공정 관련된 불순물을 선택적으로 제거한 후, 45%의 용리 단계 구배를 사용하여 순수한 라니비추맙을 용리시켰다. 이들 피크를 RP-HPLC 분석한 결과, 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)은 통류액 및 용리 피크 I에서 관찰된 반면, 정제된 라니비추맙은 용리 피크 II(99.50% 순도)에서 관찰되고(도 3), 생성물 관련된 불순물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙)은 용리 피크 III에서 관찰된 것으로 확인되었다.
실시예 3: 통류 방식의 다중방식 크로마토그래피 I, 및 결합 및 용리 방식의 다중방식 크로마토그래피 II
rHu 라니비추맙의 리폴딩 및 전처리:
(i) 봉입체의 가용화
본 연구에 이. 콜라이에서 발현된 재조합 인간 라니비추맙을 사용하였다. 0.267 그램의 봉입체(IB)를 13.3 ㎖의 가용화 완충액에 용해시켰다. 추가의 가공을 실시예 1(i)에서 수행된 공정에 따른다.
(ii) 가용화된 봉입체의 리폴딩
13.3 ㎖의 가용화된, 환원 및 산화 봉입체를 986.7 ㎖의 리폴딩 완충액에 첨가하고, 공정을 실시예 1(ii)에 따라 수행하였다.
(iii) 리폴딩된 rHu 라니비추맙의 한외여과 및 투석여과
5 kDa 울트라세테(상표명) 랩 접선 유동 여과 장치를 사용하여 한외여과에 의해 리폴딩된 라니비추맙 단백질을 농축시켰다. 연속된 투석여과 조작을 사용하여 농축 단백질을 20 mM 트리스 pH 8.0으로 완충액 교환하였다. 이어서 완충액 교환된 샘플을 다중방식 크로마토그래피를 위한 투입물로서 사용하였다.
(iv) 다중방식 크로마토그래피 I
다중방식 크로마토그래피 I을 폴리PEI-35 수지에 의해 수행하였다. 농축된 리폴딩된 라니비추맙의 pH를 8.0으로 조정하고 공급 물질로서 사용하였다. 평형 완충액으로서 20.0 mM 트리스 pH 8.0을 사용하고, 이후 1.0M NaCl이 함유된 20.0 mM 트리스 pH 8.0에 의한 5.0 CV 염 구배에 의해, 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 수행하였다. 이러한 조건하에, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 통류액에서 관찰되었다. 통류액을 RP-HPLC 분석한 결과, 정제된 라니비추맙은 통류액에서 관찰된 것으로 확인되었다(31.24% 순도). 용리 피크 I 및 용리 피크 II는 각각 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙) 및 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)을 함유하였다.
(v) 다중방식 크로마토그래피 II
폴리CSX-35 수지를 사용하여 다중방식 크로마토그래피 II를 수행하였다. 10.0 mM 아세테이트 완충액 pH 5.5를 평형 완충액으로서 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 실행하였다. 다중방식 크로마토그래피 I의 통류액을 다중방식 크로마토그래피 II를 위한 공급 물질로서 사용하였다. 공급 물질의 pH를 빙초산에 의해 pH 5.5로 조정하였다. 1.0M NaCl이 함유된 10.0 mM 아세테이트 완충액 pH 5.5에 의한 염 기반의 단계 구배에 의해 용리를 수행하였다. 10%의 구배에서 공정 관련된 불순물을 선택적으로 제거한 후, 45%의 용리 단계 구배를 사용하여 순수한 라니비추맙을 용리시켰다. 이들 피크를 RP-HPLC 분석한 결과, 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)은 통류액 및 용리 피크 I에서 관찰된 반면, 정제된 라니비추맙은 용리 피크 II(99.50% 순도)에서 관찰되고 생성물 관련된 불순물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙)은 용리 피크 III에서 관찰된 것으로 확인되었다.
실시예 4: 통류 방식의 다중방식 크로마토그래피 I, 및 결합 및 용리 방식의 다중방식 크로마토그래피 II
(i) 봉입체의 가용화
가용화를 실시예 2(i)의 공정에 따라 수행하였다.
(ii) 가용화된 봉입체의 리폴딩
리폴딩을 실시예 2(ii)의 공정에 따라 수행하였다.
(iii) 리폴딩된 rHu 라니비추맙의 한외여과
5 kDa 울트라세테(상표명) 랩 접선 유동 여과 장치를 사용하여 한외여과에 의해 리폴딩된 라니비추맙 단백질을 농축시켰다. 이어서 농축된 단백질 샘플을 다중방식 크로마토그래피 I을 위한 투입물로서 사용하였다.
(iv) 다중방식 크로마토그래피 I
다중방식 크로마토그래피 I을 폴리PEI-35 수지에 의해 통류 방식으로 수행하였다. 농축된 리폴딩된 라니비추맙의 pH를 9.0으로 조정하고, 전도도를 6.0 mS/cm로 조정하여 공급 물질로서 사용하였다. 평형 완충액으로서 20.0 mM 트리스 pH 9.0을 사용하고, 이후 불순물을 제거하기 위해 1.0M NaCl이 함유된 20.0 mM 트리스 pH 9.0에 의한 5.0 CV 염 구배에 의해, 통류액에서 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 수행하였다. 이러한 실험 조건하에, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 통류액에서 관찰되었다. 통류액을 RP-HPLC 분석한 결과, 정제된 라니비추맙은 통류액에서 관찰된 것으로 확인되었다(29.69% 순도). 용리 피크 I 및 용리 피크 II는 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙) 및 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)을 함유하였다. 도 4는 rHu 라니비추맙의 정제를 위해 실행된 다중방식 크로마토그래피 I에 대한 크로마토그램을 보여준다.
(v) 다중방식 크로마토그래피 II
폴리CSX-35 수지를 사용하여 다중방식 크로마토그래피 II를 수행하였다. 10.0 mM 아세테이트 완충액 pH 5.50을 평형 완충액으로서 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 실행하였다. 다중방식 크로마토그래피 I의 용리 푸울을 다중방식 크로마토그래피 II를 위한 공급 물질로서 사용하였다. 공급 물질의 pH를 빙초산에 의해 pH 5.5로 조정하였다. 1M NaCl이 함유된 10.0 mM 아세테이트 완충액 pH 5.5에 의한 염 기반의 단계 구배에 의해 용리를 수행하였다. 10.0%의 구배에서 공정 관련된 불순물을 선택적으로 제거한 후, 45.0%의 용리 단계 구배를 사용하여 순수한 라니비추맙을 용리시켰다. 이들 피크를 RP-HPLC 분석한 결과, 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)은 통류액 및 용리 피크 I에서 관찰된 반면, 정제된 라니비추맙은 용리 피크 II(99.50% 순도)에서 관찰되고 생성물 관련된 불순물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙)은 용리 피크 III에서 관찰된 것으로 확인되었다.
실시예 5: 통류 방식의 다중방식 크로마토그래피 I, 및 결합 및 용리 방식의 다중방식 크로마토그래피 II
(i) 봉입체의 가용화
봉입체의 가용화를 실시예 2(i)의 공정에 따라 수행하였다.
(ii) 가용화된 봉입체의 리폴딩
리폴딩을 실시예 2(ii)의 공정에 따라 수행하였다.
(iii) 리폴딩된 rHu 라니비추맙의 한외여과 및 투석여과
리폴딩된 rHu 라니비추맙의 한외여과를 실시예 4(iii)의 공정에 따라 수행하였다.
(iv) 다중방식 크로마토그래피 I
다중방식 크로마토그래피 I을 폴리PEI-35 수지에 의해 통류 방식으로 수행하였다. 농축된 리폴딩된 라니비추맙의 pH를 9.0으로 조정하고, 전도도를 12.0 mS/cm로 조정하여 공급 물질로서 사용하였다. 평형 완충액으로서 20.0 mM 트리스 pH 9.0을 사용하고, 이후 불순물을 제거하기 위해 1.0M NaCl이 함유된 20.0 mM 트리스 pH 9.0에 의한 5.0 CV 염 구배에 의해, 통류액에서 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 수행하였다. 이러한 실험 조건하에, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 통류액에서 관찰되었다. 통류액을 RP-HPLC 분석한 결과, 정제된 라니비추맙은 통류액에서 관찰된 것으로 확인되었다(33.12% 순도)(도 5). 용리 피크 I 및 용리 피크 II는 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙) 및 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)을 함유하였다. 도 5는 rHu 라니비추맙의 정제를 위해 실행된 다중방식 크로마토그래피 I에 대한 크로마토그램을 보여준다.
(v) 다중방식 크로마토그래피 II
폴리CSX-35 수지를 사용하여 다중방식 크로마토그래피 II를 수행하였다. 10.0 mM 아세테이트 완충액 pH 5.5를 평형 완충액으로서 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 실행하였다. 다중방식 크로마토그래피 I의 용리 푸울을 다중방식 크로마토그래피 II를 위한 공급 물질로서 사용하였다. 공급 물질의 pH를 빙초산에 의해 pH 5.5로 조정하였다. 1.0M NaCl이 함유된 10 mM 아세테이트 완충액 pH 5.5에 의한 염 기반의 단계 구배에 의해 용리를 수행하였다. 10.0%의 구배에서 공정 관련된 불순물을 선택적으로 제거한 후, 45.0%의 용리 단계 구배를 사용하여 순수한 라니비추맙을 용리시켰다. 이들 피크를 RP-HPLC 분석한 결과, 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)은 통류액 및 용리 피크 I에서 관찰된 반면, 정제된 라니비추맙은 용리 피크 II(99.50% 순도)에서 관찰되고 생성물 관련된 불순물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙)은 용리 피크 III에서 관찰된 것으로 확인되었다.
실시예 6: 결합 및 용리 방식의 다중방식 크로마토그래피 I이 수반되는 결합 및 용리 방식의 다중방식 크로마토그래피 II
(i) 봉입체의 가용화
가용화 공정을 실시예 1(i)의 공정에 따라 수행하였다.
(ii) 가용화된 봉입체의 리폴딩
리폴딩 공정을 실시예 1(ii)의 공정에 따라 수행하였다.
(iii) 리폴딩된 rHu 라니비추맙의 한외여과 및 투석여과
5 kDa 울트라세테(상표명) 랩 접선 유동 여과 장치를 사용하여 한외여과에 의해 리폴딩된 라니비추맙 단백질을 농축시켰다. 농축된 단백질 샘플의 pH를 빙초산에 의해 pH 5.5로 조정하였다. 농축된 리폴딩된 단백질 샘플의 전도도를 10.0 mS/cm로 조정하였다. 숙주 세포 단백질을 pH 5.5에서 침전시켰다. 침전된 숙주 세포 단백질을 8000 rpm에서 15 분 동안 원심분리에 의해 제거하고, 이어서 리폴딩된 단백질의 상청액을 다중방식 크로마토그래피 II를 위한 투입물로서 사용하였다.
(iv) 다중방식 크로마토그래피 II
폴리CSX-35 수지를 사용하여 다중방식 크로마토그래피 II를 수행하였다. 10.0 mM 아세테이트 완충액 pH 5.50을 평형 완충액으로서 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 실행하였다. 1.0M NaCl이 함유된 10.0 mM 아세테이트 완충액 pH 5.5에 의한 염 기반의 단계 구배에 의해 용리를 수행하였다. 10%의 구배에서 공정 관련된 불순물을 선택적으로 제거한 후, 45.0%의 용리 단계 구배를 사용하여 순수한 라니비추맙을 용리시켰다. 이들 피크를 RP-HPLC 분석한 결과, 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)은 통류액 및 용리 피크 I에서 관찰된 반면, 정제된 라니비추맙은 용리 피크 II에서 관찰되고 생성물 관련된 불순물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙)은 용리 피크 III에서 관찰된 것으로 확인되었다.
(v) 다중방식 크로마토그래피 I
다중방식 크로마토그래피 I을 폴리PEI-35 수지에 의해 통류 방식으로 수행하였다. 다중방식 크로마토그래피 II의 산출물의 pH를 pH 9.0으로 조정하였다. 평형 완충액으로서 20.0 mM 트리스 pH 9.0을 사용하고, 이후 불순물을 제거하기 위해 1.0M NaCl이 함유된 20.0 mM 트리스 pH 9.0에 의한 5.0 CV 염 구배에 의해, 통류액에서 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 수행하였다. 이러한 실험 조건하에, 리폴딩된 rHu 라니비추맙은 통류액에서 관찰되었다. 통류액을 RP-HPLC 분석한 결과, 정제된 라니비추맙은 통류액에서 관찰된 것으로 확인되었다. 용리 피크 I 및 용리 피크 II는 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙) 및 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)을 함유하였다.
실시예 7: 결합-용리 방식의 다중방식 크로마토그래피 I 및 II
rHu 라니비추맙의 생체내 가용성 발현 및 전처리:
(i) 돌연변이된 이. 콜라이에서의 가용성 rHu 라니비추맙의 발현
발현된 재조합 인간 라니비추맙을 포함하는 이. 콜라이 세포를 수거하고, 1:10(w/v)의 세포 펠릿:완충액 비로 세포용해 완충액(20.0 mM 트리스, 0.1 mM EDTA, pH 9.0)에 재현탁시켰다. 15000 bar 압력하에 20 분 동안 고압 분쇄기를 사용하여 세포 용해를 실행하였다. 세포 용해물을 10000 rpm하에 30 분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포 용해물의 상청액을 수득하였다.
(ii) 리폴딩된 rHu 라니비추맙의 한외여과 및 투석여과
연속적인 투석여과 조작을 사용하여 가용성 rHu 라니비추맙을 20.0 mM 트리스 pH 9.0으로 완충액 교환하였다. 완충액 교환된 샘플을 다중방식 크로마토그래피용 투입물로서 사용하였다.
(iii) 다중방식 크로마토그래피 I
다중방식 크로마토그래피 I을 폴리PEI-35 수지에 의해 수행하였다. 농축된 가용성 rHu 라니비추맙의 pH를 9.0으로 조정하고, 공급 물질로서 사용하였다. 평형 완충액으로서 20.0 mM 트리스 pH 9.0을 사용하고, 이후 1.0M NaCl이 함유된 20.0 mM 트리스 pH 9.0에 의한 5.0 CV 염 구배에 의해, 가용성 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 수행하였다. 이러한 실험 조건하에, 단백질은 통류액에서 관찰되지 않았다. 용리 피크를 RP-HPLC 분석한 결과, 정제된 라니비추맙은 용리 피크 I(38.79% 순도)에서 관찰된 것으로 확인되었다. 용리 피크 II는 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙) 및 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)을 함유하였다.
(iv) 다중방식 크로마토그래피 II
폴리CSX-35 수지를 사용하여 다중방식 크로마토그래피 II를 수행하였다. 10.0 mM 아세테이트 완충액 pH 5.50을 평형 완충액으로서 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 실행하였다. 다중방식 크로마토그래피 I의 용리 푸울을 다중방식 크로마토그래피 II를 위한 공급 물질로서 사용하였다. 공급 물질의 pH를 빙초산에 의해 pH 5.50으로 조정하였다. 1.0M NaCl이 함유된 10 mM 아세테이트 완충액 pH 5.50에 의한 염 기반의 단계 구배에 의해 용리를 수행하였다. 10.0%의 염 구배에서 공정 관련된 불순물을 선택적으로 제거한 후, 45.0%의 용리 단계 구배를 사용하여 순수한 라니비추맙을 용리시켰다. 이들 피크를 RP-HPLC 분석한 결과, 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)은 통류액 및 용리 피크 I에서 관찰된 반면, 정제된 라니비추맙은 용리 피크 II에서 관찰되고(도 3), 생성물 관련된 불순물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙)은 용리 피크 III에서 관찰된 것으로 확인되었다. 생성물의 품질을 SDS PAGE 분석에 의해 확인하였고, 표준 라니비추맙과 잘 일치하는 것으로 밝혀졌다(도 10의 48 kDa에서의 레인 번호 3).
실시예 8: 결합 및 용리 방식의 다중방식 크로마토그래피 I 및 II
(i) 봉입체의 가용화
가용화을 실시예 1(i)에 따라 수행하였다.
(ii) 가용화된 봉입체의 리폴딩
리폴딩을 실시예 1(ii)에 따라 수행하였다.
(iii) 리폴딩된 rHu 라니비추맙의 한외여과 및 투석여과
여과를 실시예 1(iii)에 따라 수행하였다.
(iv) 다중방식 크로마토그래피 I
다중방식 크로마토그래피 I을 캅토 접착 수지에 의해 수행하였다. 농축된 리폴딩된 rHu 라니비추맙의 pH를 pH 9.0으로 조정하고, 공급 물질로서 사용하였다. 평형 완충액으로서 20.0 mM 트리스 pH 9.0을 사용하고, 이후 1.0M NaCl이 함유된 20.0 mM 트리스 pH 9.0에 의한 5.0 CV 염 구배에 의해, 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 수행하였다. 이러한 실험 조건하에, 단백질은 통류액에서 관찰되지 않았다. 용리 피크를 RP-HPLC 분석한 결과, 정제된 라니비추맙은 용리 피크 I(38.79% 순도)에서 관찰된 것으로 확인되었다. 용리 피크 II는 생성물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙) 및 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)을 함유하였다.
(v) 다중방식 크로마토그래피 II
캅토 MMC 수지를 사용하여 다중방식 크로마토그래피 II를 수행하였다. 10.0 mM 아세테이트 완충액 pH 5.50을 평형 완충액으로서 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하기 위한 실험을 실행하였다. 다중방식 크로마토그래피 I의 용리 푸울을 다중방식 크로마토그래피 II를 위한 공급 물질로서 사용하였다. 공급 물질의 pH를 빙초산에 의해 pH 5.50으로 조정하였다. 1.0M NaCl이 함유된 10 mM 아세테이트 완충액 pH 5.50에 의한 염 기반의 단계 구배에 의해 용리를 수행하였다. 10.0%의 염구배에서 공정 관련된 불순물을 선택적으로 제거한 후, 45.0%의 용리 단계 구배를 사용하여 순수한 라니비추맙을 용리시켰다. 이들 피크를 RP-HPLC 분석한 결과, 공정 관련된 불순물(숙주 세포 단백질 및 핵산)은 통류액 및 용리 피크 I에서 관찰된 반면, 정제된 라니비추맙은 용리 피크 II에서 관찰되고 생성물 관련된 불순물(미스폴딩된 라니비추맙 및 언폴딩된 라니비추맙)은 용리 피크 III에서 관찰된 것으로 확인되었다.
실시예 9: 재조합 라니비추맙의 분석적 특성규명
(i) 라니비추맙 샘플에 대한 A280에서의 흡광도 측정
리폴딩된 크로마토그래피 산출물중 총 단백질을 280 nm에서의 UV 흡광도 측정에 의해 결정하였다. 수집된 모든 분별물을 280 nm에서 나노드롭(Nanodrop) 2000 및 UV-1800 시마주(Shimadzu) UV 가시 분광광도계에 의해 판독하였다.
(ii) 라니비추맙에 대한 총 단백질 추정을 위한 브래드포드(Bradford)의 검정
총 단백질 추정을 위해 사용되는 직교 기법(orthogonal technique)은 나노드롭 2000을 사용하는 595 nm에서의 브래드포드 검정이었다. 5 ㎕의 샘플을 250 ㎕의 브래드포드 시약내로 첨가한 후, 30 초 동안 진탕기 상에서 혼합을 수행하였다. 혼합 후, 샘플을 25 분 동안 염료의 존재하에 항온처리하고, 흡광도를 595 nm에서 측정하였다.
(iii) 라니비추맙의 정량화를 위한 역상 HPLC 분석
다양한 크로마토그래피 산출물에서의 rHu 라니비추맙의 농도를 아길런트(Agilent) 1260 HPLC 시스템 상에서 4.6 mm x 150 mm 에어리스(Aeris: 상표명) 3.6 um 와이드포어(WIDEPORE) XB C18 칼럼을 사용하여 결정하였다(도 11). 이동 상은 물중 0.1%(v/v) TFA(용매 A), 및 물중 0.1%(v/v) TFA, 70%(v/v) 아세토니트릴 및 20%(v/v) 이소프로판올(용매 B)로 구성되었다. 214 nm의 파장에서 A에서 B로의 선형 구배를 사용하여 1 ㎖/분으로 유동 속도를 유지시켰다. 본 발명의 방법에 의해 수득된 정제된 리폴딩된 라니비추맙(도 11(b))의 경우, 피크(보유 시간: 28.1 분)는 혁신제품 라니비추맙에 대한 도 11(a)에서 수득된 피크와 유사하다.
(iv) 라니비추맙 샘플의 SDS PAGE 분석
라니비추맙과 회합된 공정 및 생성물 관련된 불순물을 식별하기 위한 SDS PAGE 분석을, 비환원 조건(도 7) 및 환원 조건(도 8)하에 축적 겔(stacking gel) 정전압 120V 및 분해 겔(resolving gel) 정전압 100V 조건에서 12%(두께 1 mm)의 분해 겔을 사용하여 실행하였다. 각각의 샘플을 출발 완충액에서 10 분 동안 비등시킨 후, 겔에 적재하였다. 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동 분리 후, 4:1:5의 물:빙초산:메탄올중 0.05%(w/v)의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) G-250를 사용하여 단백질을 검출하였다. 도 7의 겔 분석은 정제된 리폴딩된 단백질에 대하여 레인 1에서 48 kDa의 단백질 밴드가 존재함을 지시하고, 이로써 rHu 라니비추맙의 존재를 확인한다. 도 8에서의 환원 겔 결과는 라니비추맙의 경쇄 및 중쇄의 존재를 보여준다. 도 7 및 8은 혁신제품 분자와의 생물학적 동등성(biosimilarity)을 보여준다.
(v) 라니비추맙 샘플의 시험관내 생물활성의 정량화를 위한 ELISA 분석
면역 효소 검정[루센티스/라니비추맙, 알파 디아그노스틱 인터내셔널(Alpha diagnostic international)로부터의 인간에 대한 항-VEGF ELISA 키트, USA]. 정제된 리폴딩된 라니비추맙을 함유하는 샘플을 플레이트 상에 코팅된 VEGF 항원과 반응시켰다. 결합된 라니비추맙을 호스래디시 과산화효소(HRP: horseradish peroxidase) 표지화된 항-인간 IgG에 의해 검출하였다. 면역학적 반응은 고체 상 VEGF 결합된 항체 - 라니비추맙-효소 표지화된 항체의 샌드위치형 복합체를 형성하였다. 미량정량 스트립(microtiter strip)을 세척하여 결합되지 않은 임의의 반응물을 제거하였다. 이어서 기질, 테트라메틸벤지딘(TMB)을 반응시켰다. 가수분해된 기질의 양을 450 nm에서 미량정량판 판독기 상에서 판독하였고, 이는 존재하는 라니비추맙의 농도와 직접적으로 비례하였다.
(vi) 라니비추맙의 숙주 세포 단백질(HCP) 정량화를 위한 ELISA 분석
양이온 교환 크로마토그래피 통류액에서의 숙주 세포 단백질 오염을 2-부위 면역 효소 검정에 의해 분석하였다[시그너스(Cygnus) 이. 콜라이, HCP 분석 키트 F 410). 이. 콜라이 HCP가 함유된 샘플을 친화도 정제된 포획 항-이. 콜라이 항체가 코팅된 미량정량 스트립에서 호스래디시 과산화효소(HRP) 표지화된 항-이 콜라이 항체와 동시에 반응시켰다. 면역학적 반응은 고체 상 항체 - HCP-효소 표지화된 항체의 샌드위치형 복합체를 형성하였다. 미량정량 스트립을 세척하여 결합되지 않은 임의의 반응물을 제거하였다. 이어서 기질, 테트라메틸벤지딘(TMB)을 반응시켰다. 가수분해된 기질의 양을 450 nm에서 미량정량판 판독기 상에서 판독하였고, 이는 존재하는 이. 콜라이 HCP의 농도와 직접적으로 비례하였다.
(vii) 라니비추맙 샘플의 SE HPLC 분석
야라(Yarra: 상표명) 3 um SEC-2000(300 x 7.8 mm ID) 칼럼을 사용하여 수행되는 SEC-HPLC 분석(도 12)을 이용하여 다양한 공정 산출물중 응집물 함량을 결정하였다. 이동 상은 20 mM 아세테이트 완충액 및 50 mM 염화 나트륨 완충액으로 구성되었다(pH 5.50에서). 분석을 0.5 ㎖/분의 유동 속도로 25℃에서 등용매(isocratic) 방식으로 실행하였다. 280 nm에서 광 다이오드 어레이(photo diode array) 검출기를 사용하여 단백질 검출을 실행하였다.
(viii) 이중 가닥 DNA 추정
퀀트-잇(Quant-iT: 상표명) 피코그린(picogreen) 검정[인비트로겐 바이오서비시즈 인디아 프라이빗 리미티드(Invitrogen BioServices India Private Limited), 인도]을 사용하여 산출물 샘플중 DNA의 존재를 추정하였다. 이중 가닥 람다 DNA를 사용하여 표준 곡선을 준비하였다. 0.5 ㎖의 공정 산출물 샘플을 0.5 ㎖의 희석된 퀀트-잇(상표명) dsDNA BR 시약에 첨가하고, 반응 혼합물을 5 분 동안 항온처리하였다. 5 분 후, 형광 분광광도계(여기 파장 480 nm 및 방출 파장 520 nm)를 사용하여 형광도를 측정하였다.
(ix) 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화(MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)에 의한 정제된 rHu 라니비추맙의 원상태 질량 분석
표준 및 정제된 rHu 라니비추맙을 시내핀산(sinapinic acid) 매트릭스와 1:1의 비로 혼합하여 MALDI-TOF 분석을 수행하였다. 매트릭스 시내핀산(1O mg/㎖)을 고순도의 물중 30%(v/v) 아세토니트릴 및 0.1%(v/v) TFA에서 제조하였다. 샘플 및 매트릭스의 1 ㎕의 균질 혼합물을 깨끗한 384 웰 MALDI 플레이트 상에 침적시켰다. 플레이트를 AB SCIEX TOF/TOF(상표명) 5800 기기내로 삽입하였다. 기기를 양성 이온 방식으로 사용하였다. 337 nm 복사에서의 질소 레이저를 이온화 공급원으로서 유지하였다. 4000 내지 5000 사이의 레이저 강도를 샘플의 분석에 사용하였다. 프로테인파일럿(ProteinPilot: 상표명) 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하였다(도 13). 도 13의 분석은 개발된 정제 플랫폼을 사용하여 수득된 정제된 rHu 라니비추맙 및 혁신제품 라니비추맙 분자의 원상태 질량 사이의 비교가능성을 보여준다.
(x) LC-MS에 의한 펩티드 핑거프린트법(fingerprinting)
SDS-PAGE 분석으로부터의 쿠마시 염색된 단백질 밴드를 절제하고 유리판 위에서 수술용 메스로 작은 조각으로 절단하였다. 겔 조각을 100 mM NH4HC03에 의해 세척하고, 200 ㎕의 50% 아세토니트릴 및 50% 50 mM NH4HC03를 첨가함으로써 억류시키고, 와동하고 이를 10 분 동안 항온처리하였다. 액체를 제거하고 다시 100% 아세토니트릴에 의해 세척하여 겔 조각을 탈수시켰다. 아세토니트릴을 제거하고 흄 후드(fume hood)에서 10 분 동안 공기-건조시켰다. 환원 및 알킬화를 위해 겔 조각을 100 mM NH4HC03중 50 ㎕의 10 mM DTT로 45 내지 60 분 동안 56℃에서 덮어두었다. DTT 용액을 제거하고 100 mM NH4HC03중 50 ㎕의 55 mM 요오드아세트아미드를 첨가하고, 45 분 동안 어두운 장소에서 실온하에 항온처리하였다. 요오드아세트아미드를 제거하였다. 겔 조각을 100 ㎕의 100 mM NH4HC03에 의해 5 분 동안 와동하에 세척한 다음, 50% 아세토니트릴 + 50% 50 mM NH4HC03에 의해 5 분 동안 와동하에 2회 세척하였다. 겔을 상기와 같이 100 ㎕의 아세토니트릴에 의해 탈수시켰다. 남은 액체를 제거하고, 스피드배큠(speedvac)에 의해 이를 건조시켰다. 트립신 소화를 위해 20 ㎕의 트립신(12.5 ng/㎕) 용액을 첨가하여 겔 조각을 덮었다. 겔 조각을 50 mM NH4HC03 및 트립신이 함유된 완충액중에서 4℃에서 30 분 동안 재수화시켰다. 겔 조각을 37℃에서 하룻밤 소화를 위해 정치시켰다. 펩티드 추출을 위해 소화된 상청액을 깨끗한 1.5 ㎖의 에펜도르프(Eppendorf) 관으로 옮겼다. 30 ㎕의 50% 아세토니트릴 및 2% 포름산을 겔 조각에 첨가하고, 20 분 동안 항온처리하였다. 펩티드 용액을 가열없이 수욕에서 5 분 동안 초음파처리하였다. 상청액을 제거하고, 초기 소화 용액과 합쳤다. 이어서 펩티드 용액을 스피드배큠 농축기에 의해 건조시켰다. 펩티드 샘플을 고순도의 물중 3.0%(v/v) 아세토니트릴 및 0.1%(v/v) 포름산으로 재구성하였다. 4 ㎕의 샘플(2.5 ㎍)을 아길런트 조르백스(ZORBAX) RRHD 300SB-C18, 0.3 x 100 mm, 3 ㎛ 칼럼으로 적재하고, Q 이그잭티브 오르비트랩(Exactive Orbitrap) LC-MS/MS 시스템에 의해 분석하였다.
본 발명의 이점
ㆍ rHu 라니비추맙 분리 정제 공정을 위한 다중방식 크로마토그래피 정제 단계를 통합함으로서 기존의 제조 방법에 비해 생산성이 거의 2-배 개선되었다.
ㆍ 직교 분석 시험은 본 발명을 사용하여 수득된 정제된 약물 물질 및 혁신제품 라니비추맙 분자 사이의 분석적 비교가능성을 확립하였다.
ㆍ 개발된 정제 플랫폼은 시험관내 리폴딩된 항체 단편 및 가용성의 발현된 항체 단편 둘 다에 적용가능하다.
Claims (6)
- (a) 재조합 숙주 세포로부터의 재조합 인간화된(rHu) 라니비추맙의 경쇄 및 중쇄를 함유하는 봉입체를 20 내지 30℃ 범위의 온도에서 3 내지 4 시간 동안 가용화시켜 가용화된 rHu 라니비추맙을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)의 가용화된 rHu 라니비추맙을 리폴딩하여 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)의 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 한외여과에 의해 농축시켜 농축된 리폴딩된 라니비추맙을 수득하는 단계; 및
(d) 단계 (c)의 rHu 라니비추맙의 농축된 리폴딩된/가용성 형태를 다중방식 크로마토그래피에 적용하는 단계
를 포함하는, 봉입체로서 발현되거나 가용성 형태인 재조합 숙주 세포로부터의 rHu 라니비추맙의 항체 단편을 정제하는 방법으로서,
상기 크로마토그래피 공정이
(i) pH 범위가 4.0 내지 10.0인 단계 (c)의 농축된 리폴딩된 rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 상으로 공급하고 20 내지 50 mM 트리스 HC1 및 0 내지 150 mM NaCl 또는 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 150 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 10.0인 완충액을 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하고 불순물을 제거하는 단계;
(ii) 20 내지 50 mM 아세테이트 또는 트리스 HCl 및 0 내지 1000 mM 염화 나트륨을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 10.0인 용리 완충액의 존재하에 rHu 라니비추맙을 용리 푸울로 용리시키되, 염 농도 구배는 5 내지 10 CV 범위이고, 상기 다중방식 크로마토그래피 수지는 HEA 하이퍼셀, PPA 하이퍼셀, 및 베이커본드 XWP 500 폴리PEI-35 및 캅토 접착 수지로 구성된 군에서 선택되고, 정제된 라니비추맙은 5% 미만의 언폴딩된 형태 또는 미스폴딩된 형태의 라니비추맙 및 2% 미만의 응집된 형태의 라니비추맙을 갖는 단계;
(iii) pH 범위가 4.5 내지 6.5인 단계 (ii)의 용리 푸울로부터의 rHu 라니비추맙을 다중방식 크로마토그래피 수지 상으로 공급하고 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 150 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 6.5인 완충액을 사용하여 rHu 라니비추맙을 포획하는 단계; 및
(iv) 20 내지 50 mM 아세테이트 및 0 내지 1000 mM NaCl을 포함하고 pH 범위가 4.0 내지 6.5인 용리 완충액을 사용하여 rHu 라니비추맙을 용리시키되, 다중방식 크로마토그래피 수지는 HEA 하이퍼셀, PPA 하이퍼셀, 및 베이커본드 XWP 500 폴리CSX-35 및 캅토 MMC 수지로 구성된 군에서 선택되고, 정제된 rHu 라니비추맙은 0.1% 미만의 언폴딩된 형태 또는 미스폴딩된 형태의 rHu 라니비추맙 및 0.3% 미만의 응집된 형태의 rHu 라니비추맙을 갖는 단계
를 포함하고,
정제된 rHu 라니비추맙의 순도 및 수율이 99.50±0.08 및 32.55±2.55인, 방법. - 제1항에 있어서,
다중방식 크로마토그래피 방식이 통류 다중방식 크로마토그래피 및 결합-용리 다중방식 크로마토그래피로부터 선택되는 방법. - 제2항에 있어서,
(i) 다중방식 크로마토그래피의 결합-용리 방식을 위한 pH 조건이 8.0 내지 10.0 범위이고,
(ii) 다중방식 크로마토그래피의 통류 방식을 위한 pH 조건이 4.0 내지 6.5 범위인 방법. - 제2항에 있어서,
통류 방식을 이용하는 다중방식 크로마토그래피가
(i) 6.0 mS/cm 내지 12 mS/cm 범위의 투입 전도도를 단계 (c)의 농축된 리폴딩된 라니비추맙에 적용하는 단계, 및
(ii) 6.0 mS/cm 내지 12 mS/cm 범위의 투입 전도도를 단계 (ii)에서 수득된 재조합 라니비추맙에 적용하는 단계를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서,
단계 (i) 및 (ii)가 각각 단계 (iii) 및 (iv)와 상호교환가능한 방법. - 제1항 또는 제5항에 있어서,
다중방식 크로마토그래피의 제 1 스테이지 이후 rHu 라니비추맙을 포함하는 용리 푸울의 pH를 순차적 다중방식 크로마토그래피 스테이지에서의 pH 범위에 상응하게 조정하고, 여기서 이러한 단계가
(a) 용리 푸울의 pH를 다중방식 크로마토그래피 공정 단계 (i) 및 (ii)의 제1 스테이지 이후에 4 내지 6 범위의 pH로 조정하는 단계, 또는
(b) 용리 푸울의 pH를 다중방식 크로마토그래피 공정 단계 (iii) 및 (iv)의 제1 스테이지 이후에 8 내지 10 범위의 pH로 조정하는 단계를 포함하는 방법.
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