JPH03500410A - モノマーインターフェロンの精製 - Google Patents

モノマーインターフェロンの精製

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JPH03500410A
JPH03500410A JP63508519A JP50851988A JPH03500410A JP H03500410 A JPH03500410 A JP H03500410A JP 63508519 A JP63508519 A JP 63508519A JP 50851988 A JP50851988 A JP 50851988A JP H03500410 A JPH03500410 A JP H03500410A
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タルノウスキ,スタンレイ ジェイ.,ジュニア
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インターフェロン サイエンシズ,インコーポレイティド
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノマーインターフェロンノ精製 本発明は十分に酸化された均一なモノマーヒト白血球インターフェロンの新規な 単離法に関する。さらに詳しくは、この発明は、イムノアフィニティークロマト グラフィー、逆相クロマトグラフィー、陽イオン変換クロマトグラフィー及びゲ ル濾過クロマトグラフィーを含む一連の精製段階を通して十分に酸化された形の αインターフェロンを単離する方法に関する。
発明の背景 ヒト白血球インターフェロン(IFN−α−2)のα−2サブスペーシスは2個 の分子内ジスルフィド@(CYS’−CYS”及びCYS”−CYS13”)に より特徴付けられる二次構造を有する165アミノ酸のポリペプチド鎖である[ G、 Bodo及び1. Pogy。
[アフィニティー精製された組換ヒトインターフェロンα2における異る分子種 の特徴付け、The Interferon System。
23−27頁(1985) ; R,%!1etzelら、「大腸菌抽出物から 精製されたヒトα−インターフ、oンの性質J 、J、 Interfer R es、 1゜381−90頁(1981))。しかしながら、アフィニティー精 製されたポリペプチドにおいて、BO(IO及びPogyはまた、ジスルフィド 結合が誤って対を成しているかあるいは必須のシスティンが部分的に又は完全に 還元されているIFN−α−2の種を見出した。これらの形態のあるものは低い 比活性有する[H。
Mooreheadら、[抗ウィルス活性及びフンホーメーション安定性におけ るヒトα−インターフェロンのサブタイプAの29−138ジスルフィド結合の 役割J 、Biochemistry、 23.2500−07頁(19B4) ]。あるいは、これらは生来の分子とは異るコンホーメーションを示し、その結 果投与に際し不都合な反応を惹起するかもしれない。部分的に又は完全に還元さ れた形態は安全性が低くそしてさらによじれた分子をもたらす可能性がある。
文献は、少なくとも1個の遊離スルヒドリル基を有する遅く移動するモノマー( slow−moving monomer ; SMM) (部分的に又は完全 に還元された形)と、2個のジスルフィド結合を有する速く移動するモノv − (fast−rnoving monomer (FMM) (十分に酸化され た形)を区別している。SMMの遊離スルヒドリル基は分子間ジスルフィド結合 を介してオリゴマーを生成するかも知れない。これらのオリゴマーはより低い比 活性を有し、そしてヒトにおいて不都合な反応を生じさせるかも知れないCS、  Pe5tka及びS、J、Tarnowski、rインターフェロンの精製J  、Pharmac、Ther、、 29.299−319(1986)を参照 のこと〕。
インターフェロンのオリゴマーの測定法は知られている[S。
Pe5tkaら、「蛋白質ダイマー、トリマー及び高オリゴマーのための特異的 イムノアッセイJ 、Anal、Biochen+、、 132.328−33 頁(19B3) ; S、Pe5tkaら、「ラジオイムノアッセイによるイン ターフェロンダイマー及び高オリゴマーの測定方法」、Meth、Enzymo l、、 119.588−93頁(1986) ]。
蛋白質の広範な精製の後、D、 R,Thatcher及びN、 Panayo tatosは組換IFN−α−2を単離し、彼らはこれをpI5.9の主成分と 3個のより小さい陽極バンドを含んで成るものとして特徴付けた〔「組換ヒト  IFN−aの精製、Meth’、Enzy+nology、 119゜16ロ一 77頁(1986)) 。Thatcher及びPanayotatosによれ ば、正しく再生された(folded)十分に酸化されたモノマーの精製は簡単 ではなく、その理由はこれらの「コンホーメーション変形体」は生来の分子のそ れと非常に類似した性質を有するからである。さらに、彼らの研究が示すところ によれば、宿主微生物の分子内環境が還元形千ツマ−の生成に好都合な正味酸化 還元電位を有するためにコンホーメーション変形体が生ずる可能性がある。これ らの観察されたコンホーメーション変形体は還元されたモノマーから生じ得る。
純粋な十分に酸化された形のIFN−α−2の臨床的な重要性の観点から、FM Mを蛋白質の他の形態から単離する試みが行われている。IFNを精製するため の多くの方法が文献中に記載されている。ヨーロッパ特許出願108.585は 、酸性pH及び上昇した温度での長時間のインキュベーションによるインターフ ェロン調製物からのオリゴマー及び遅いモノマーの両者の除去に言及している。
A、 M、 Fel ixら、「高速液体クロマトグラフィーによる組換ヒト白 血球インターフェロンの種々の形態の分析J 、Methods in Enz yrnology、 119.242−48頁(1986)は、J、porat hら〔「金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、蛋白質分画のための 新しいアプローチ」、Nature (oンドン) 、258.598−99頁 (1975))の金属キレートクロマトグラフ法の変法によるFMMからのSM Mの分離を報告している。米国特許4.432.895は酸化還元試薬での処理 によるオリゴマーインターフェロンのモノマーインターフェロンへの転換につい て言及している。しかしながら、十分に酸化された速く移動するモノマーの分離 法を記載していない。均一なFMMをその生来のコンホーメーションで大量に単 離することが困難であるために、その製造方法の必要性がなお存在する。
発明の概要 本発明は、FMMを実質的に純粋な生来形で単離する手段を提供することにより 上に言及した問題点を解決する。さらに詳しくは、本発明は非−インターフェロ ン蛋白質、オリゴマーインターフェロン及びSMMからFMMを単離する方法を 提供する。さらに、本方法は、異るFMF形(すなわちFMM 、及びFMM2 )の相互分離を提供する。
この方法に従えば、種々の精製段階を通してFMMが他のインターフェロン(I FN)形及び非−インターフェロン夾雑物から分離される。特に、この方法はイ ムノアフィニティークロマトグラフィー及びこれに続く逆相肝LCを含む。FM Mの2つの形態であるFMM 、及びFMM2はサイズが同一であるために5O S−PAGEにより相互に分離することができない。しかしながら、本発明者ら はこれらを疎水性及び電荷に基いて、それぞれ逆相HPLC及び陽イオン交換ク ロマトグラフィーを用いて分離する。この方法に従えば、次にFMM2をゲル濾 過により均一にまで精製することができる。
図面の簡単な説明 第1図は、十分に酸化された形態の組換α−2インターフエロン(速く移動する モノマー)(FMM、)の製造のための精製法の概略を示す。
第2図は、イムノアフィニティークロマトグラフィーからの溶出物の典型的な分 取用RP−HPLC溶出プロフィール(A);RP−HPLCからのFMM画分 の陽イオン交換クロマトグラフィー溶出プロフィール(B) ; RP−)IP LCからのFMM画分の第二の陽イオン交換クロマトグラフィー溶出プロフィー ル(C):及び陽イオン交換クロマトグラフィーからのFMM2のセファデック スG−50ゲル濾過溶出プロフイール(D)、を示す。
第3図は、カラム操作温度を25℃から40℃に上昇せしめることから生ずる、 FMM 、とFMM2との間の改良されたRP−HPLC分離を示す。
第4図は、組換IFM−α−2FMM2精製中間体のRP−HPLC分析を示す 。
第5図は、イントロン”’Aと組換IPM−α−2FMM、及びFMM2のRP −HPLC比較を示す。
第6図は、組換α−2FMM2とイントロン”’A及びロフェロン(R)AのR P−HPLC’比較を示す。
第7図はFMM 、及びFMM2のトリプシンマツプを示す。
発明の具体的な記載 本発明はFMM間の疎水性の差及び電荷の差の両方を用い、これにより個々の異 性体を完全に分離して純粋で且つ安定な十分に酸化されたモノマーを製造するこ とができる。組換lFF−α−2を含有する抗体カラム溶出液(精製工程におけ る第一段階の生成物)はまたFMM、遅く移動するモノマー、断片、ダイマー及 び高度オリゴマー並びに非IFN蛋白質を含有する。この蛋白質混合物は主とし て疎水性相互作用により逆相カラム(The 5eparations Gro up、 He5peria、 CA)に結合し、そして蛋白質は多数の均一(す なわち、単一の溶剤濃度)溶出段階によりクロマトグラフ処理される。次に、F MMを含有する両分を陽イオン交換カラムに結合させる。この陽イオン交換段階 が、特定のpHにおける正味正電荷の差に基く蛋白質分子の分離を可能にする。
均一緩衝塩溶出を用いることにより、FMM異性体が単離される。陽イオン交換 カラムからのそれらの溶出の順序に基いて、これらの異性体はFMM 、及びF MM、と命名される。緩衝液の交換を行いそしてモノマーから残りのすべてのオ リゴマーを分離するだめの最終段階としてサイズ排除カラムを用いる。最終精製 されたFMM、はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(S OS−PAGE) 、等電点ゲル電気泳動(IBF)及び分析用逆相高速液体ク ロマトグラフィー(RP−HPLC)において単一種として特徴付けられる。
本発明の方法は、組換α−2インターフエロン及び白血球から得られる天然α− 2インターフエロン、あるいは有機合成により調製されたα−2インターフエロ ンに適用することができる。これらはまた、他のα−インターフェロンのモノマ ー形を得るためにも有用である。
天然由来の又は遺伝子操作された(すなわち、組換)蛋白質の精製において、精 製工程の結果としての可能性ある修飾に加えて、生来の蛋白質の翻訳後修飾の可 能性が存在する。
これらの修飾は、アミノ酸側鎖の化学反応の形を取り、例えばメチオニンのメチ オニンスルホキシドへの転換、又はアミノ酸残基、例えばアスパラギン及びグル タミンの脱アミノ化の形を取るであろう。さらに、エキソペプチダーゼによる末 端(カルボキシ又はアミノ)残基の除去が生来の蛋白質の修飾の可能性ある機構 である。
本発明精製方法は、少なくともIFN−αの場合には、その生来の状態又は天然 状態での生物学的に活性な千ツマ−の回収を可能にする。上昇した純度が安定性 を増強し、夾雑物への不所望な反応の危険を低下せしめ、そして得られる生成物 の比活性を上昇せしめる。
本発明の方法に従って生成されたFMMは、医薬として有用な組成物を調製する ための既知の方法を用いて製剤化することができる。この様な組成物はまた好ま しくは常用の医薬として許容されるキャリヤーを含有するであろう。また、助剤 、賦形剤又は他の薬剤を含有することができる。得られる製剤はIFN−αによ る静脈内、非経腸又は局所治療において有効な量のFMMを含有するであろう。
本発明のFMM2はその活性断片を得るために蛋白質分解酵素又は化学薬剤によ り選択的に処理することができる。これはまたポリペプチド又は他の物質に共有 結合により又は他の方法で連結してより大きな蛋白質又は蛋白質接合体を生成す ることができる。
本発明の方法に従って精製されたFMMは種々の形で使用することができる。好 ましい形態は意図される投与方法及び療法的用途に依存する。例えば、米国特許 Nα4.680.175 (局所投与ビヒクル)を参照のこと。投与量及び速度 は治療されるべき疾患に特徴的な種々の因子に依存するであろう。
この発明がよりよく理解されるように次の実施例を記載する。これらの実施例は 例示のみを目的とするものであり、そして本発明の範囲を限定するものとして解 すべきでない。
この実施例において、本発明者らは、酵母細胞溶解物からの、酵母蛋白質、イン ターフェロン断片及びインターフェロン分子の異常形を本質的に含有しない組換 白血球(α) IFNFMM、の回収のための方法を記載する。
組換α−2インターフエロンの発現 Co11aborative Re5earch、 Inc(レキシントン、マ サッーセッツ)から得られた、アメリカン・タイプ力ルチュアー・コレクション (ロックビル、メリーランド(ATCCNn20663) !ご寄託されている 発現ベクターC(S281゛ 用いて酵母〔サツカロミセス・セレビシェ−(S acct+aromycescerevisiae)、l中でIFN遺伝子をク ローン化しそして発現させるためにDNA技法が用いられた。
イムノアフィニティーカラムへの供給ストックは、酵母蛋白質を含有する発酵物 から得られた無細胞透明細胞溶解物であった。本発明者らは、ホモゲナイゼーシ ョン、並びに遠心分離と接線マイクロフィルトレージョンとの組合わせを含む多 段法により透明細胞溶解物を得た。これにより透明な溶解物を得、次にこれを抗 −IFN−α2モノクローナル抗体−セファロース力ラムに付加した。得られる 溶出物はIFNモノマー及びオリゴマーを含有するが、非−IFN蛋白質夾雑物 (例えば非特異的に吸着された酵母蛋白質)を少量のみ含有する。精製法をさら に具体的に下記する。
イムノアフィニティークロマトグラフィ一本発明者らは、遺伝子操作された酵母 細胞を集めそして破壊することにより組換IFN−α−2を放出せしめ、そして 遠心分離及び接線マイクロフィルトレージョンを用いて未破壊細胞及び細胞破片 を除去した。本発明者らは得られた透明な細胞溶解物を、セファロースに結合し た抗−INF−α−2モノクローナル抗体(rL1丁1」)を含んで成るイムノ アフィニティーマトリクスに付加した。本発明者らはインターフェロン・サイエ ンス社からLIT 1モノクローナル抗体を得たが、他の抗−α2イタン一フエ ロン抗体で置き換えることもできよう〔例えば、米国特許Nu 4.432.1 47 ;ヨーロッパ特許出願Nα91.543 ;英国特許Nα2.111.5 27を参照のこと〕。本発明者らは細胞溶解物を本発明者らのイムノアフィニテ ィーマトリクス(以後、rLIT1/SJと称する)カラムに通して組換lNN −αをマトリクスに結合せしめ、そして大部分の他細胞溶解物成分及び蛋白質を 除去した。本発明者らはカラムを、1、5 M NaCR及び50%(V/V) エチレングリコールを含有するリン酸緩衝液で洗浄した。溶出液のり、0.28 0追跡が0に対するまで、0.15M NaC17を含有する第二のリン酸緩衝 液(p)17.4)を用いた。LITI/Sマトリクスが十分に洗浄された後、 結合したIFNを0.3 M NaCj2を含有する0、1Mクエン酸(p)1 2.0)から成る酸性緩衝液により取り出した。酢酸又はグリシン緩衝液が溶離 剤として有効であろう。
粗細胞溶解物の最初の処理に変更を加えれば全体精製工程から、イムノアフィニ ティークロマトグラフィ一段階を除去することができよう。例えば、粗細胞溶解 物を適当な逆相媒体又はイオン交換媒体にバッチ吸着させることができよう。
次に、部分的に精製したIFNをバッチ式又はカラム式に取り出し、そしてIF Nを下記のようにしてさらに精製することができる。
逆相クロマトグラフィー(RPC) 次に、本発明者らは、RPCを用いて、SMM、ダイマー及び高オリゴマー並び に非−IFN−雑蛋白質からIFN FMMを分離した。本発明者らは逆相高速 液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)を、自動勾配調節器、2個のHPL Cポンプ、LC分光光度計及び記録器/積分器を装備したウォーターズ・バイナ リ−(Waters Binary)IIPLCシステムにおいて行った。C− 4カラム(22mmx 250mm ;粒子サイズ10p;孔サイズ300人) を水中0.1%(W/W) ) IJフルオロ酢酸で平衡化した。LITI/S 溶出物をポンプAを通して直接に負荷することによりIFNを逆相カラムに結合 させた。結合した蛋白質をC−4カラムから18m1/分の速度で、下記のプロ グラムされた勾配で溶出した。
1146 直線的 41 46 * 45 100 直線的 ココテ、溶液Bハアセトニトルル(CH3CN)中0.1%(V/V)TFAか ら成る。結合した蛋白質をC−4カラムから溶出し、個々の両分として集め、そ してFMM、及びFMM2に対応する隣接したピークをさらに精製するためにプ ールした。
ここで第2図Aに関し、15.5分と18.0分の間の画分がFMMを含有する 。これらの両分は負荷された全蛋白質の約25%の相対面積率を占める。この特 定のカラム及び操作条件について、FMM、及びFMM2は約46%のBにおい て溶出した。
FMM 、とFMM2との比率は相対面積率に基いて約50 : 50であった が、この比率は10 : 90=FMM、 : FMM、に変化し得る。14. 55分で溶出するピークは酵母由来のインターフェロン蛋白質を含有しない。
場合によっては、疎水性相互作用クロマトグラフィーをRPCで代替し、これに よって有機溶剤の使用を回避することができる。さらに、逆相段階のスケールア ップにおいて、より大きな粒子サイズのカラム充填材を用いることができよう。
これがより低い圧力のクロマトグラフィーの使用を可能にし、これによって高価 な)IPLC装置の必要性が回避され、そして保守が一層少なくてすむ操作及び 一層容易な全体システムの自動化が可能となるであろう。
RP−HPLC段階のさらなる変更には、勾配及び/又は均一溶液の使用;流速 の増加又は減少;アセトニトリル以外の有機変性剤、例えばn−プロパツール、 2−プロパツール、メタノール、エタノール、ジオキサン及び溶離用溶剤として 使用される他の物質;TFA以外のイオン対形成剤、例えばドデシル硫酸ナトリ ウム、リン酸もしくは過塩酸、又は過塩酸塩の使用;イオン対形成剤の量の増加 (すなわち、0.1%(V/V)より大、又は減少:他の固定疎水性基を有する 固定相、例えばC3、Cs l Cs l CI8又はフェニルの使用;及び0 ℃〜56℃の範囲の温度での操作、が含まれる。上記パラメーターの1つ又は複 数個の変更はFMM2と他の成分との間の分離の最適化を目的とするものである べきである。
本発明者らは、C−4充填剤の粒子サイズの変化の効果を試験し、そして上記の 溶出条件を用いて粒子サイズが増加するに従ってモノマー種間の分離のロスが増 加するが、しかし粒子サイズが5〜30ミクロンの間で異っても他の組換α−2 形からモノマーの分離はなお達成され得ることを見出した。
FMM、及びFMM2は、これら2つの種間の疎水性の差異に基いて、例えばカ ラム温度を変えることにより、逆相技法を用いて分離することができる。第3図 は、カラム温度を25℃(パネルA)及び40℃(パネルB)で調節することに より生じた2つのクロマトグラムを比較している。40℃におけるFMM2とF MM、との間の分離性(ピーク分離約3分間)は25℃において達成される分離 性(ピーク分離約1分間)に比べて非常に卓越している。
本発明者らは、この段階においてS−200ゲル濾過段階を試験したが、それに も拘らず次の幾つかの理由によりC−4カラムを使用することを決定した: ( 1)大きなS−200カラムが必要である; (2) S−200カラムに負荷 する前にサンプルを濃縮しなければならない; (3)ゲル濾過の間にサンプル が稀釈される; (4) S−200カラムは限定された容量を有する; (5 ) S−200クロマトダラムは徐々に展開する(24時間以上);及び(6)  S−200カラムによるオリゴマー、モノマー及び断片の分離は逆相クロマト グラフィーにより達成され得る分離に比べて悪化する。
陽イオンクロマトグラフィー 陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、本発明者らはFMM 、及びFMM 2モノマーをpH5,2におけるそれらの正味電荷の差異に基いて分離した。
本発明者らは、アンモニアによりCM−セファロースCL−6Bゲルのナトリウ ムカウンターイオンを交換した後、陽イオン交換カラムを0.05M酢酸アンモ ニウム(pH5,2)により平衡化した。RPCからのアセトニトリル及びトリ フルオロ酢酸を透析、相分離又は凍結乾燥により分離することができるが、FM Mを含有する有機画分を稀釈するのが好ましい。
両分を0.05M酢酸アンモニウム(pt15.2>により約8倍に稀釈し、そ して平衡化されたCM−セファロースCL−6Bカラムに25印/時の線速度で 直接に負荷した。次に、カラムを約2カラム容量の0.05M酢酸アンモニウム (pH5,2)により洗浄し、そして次に0.15M酢酸アンモニウム(pH5 −2>により9.0CII+/時の線速度で溶出した。分離したFMM 、及び FMM2のモノマーピークの両分を集めた後、1.0M酢酸アンモニウム(pH 6,0)を用いて25cm/時の線速度にて、強く結合したオリゴマーを溶出し た。0.2M−0,3M酢酸アンモニウム(pH5,0)の塩勾配溶出を用いる こともできるが、特に大規模製造のためには前記の均−塩溶出が好ましい。
第2図Bに関し、FMM、ピークは4〜5カラム容量において溶出し、他方PM M2ピニクは約5.5〜7カラム容量において溶出する。
陽イオン交換クロマトグラフィ一段階は、線速度を上昇又は低下させることによ り;溶離液のpH及び/又はイオン強度を変えることにより;酢酸アンモニウム 以外の緩衝剤又はカウンターイオン、例えばコハク酸ナトリウム又は酢酸ナトリ ウムを使用することにより;カラムの幾何学形状を変えることにより;より高い 温度(50℃まで)において操作することにより;勾配溶出又は均一溶出を用い ることにより;異るリガンド又はリガンド密度を有するイオン交換マトリクス、 例えばCM−セファロース−ファーストフロー、SP−セファデックス、CM− セファデックス、CM−)リスアクリルM又は5P−)リスアクリルMを用いる ことにより:あるいはソストゲル・セファロースより機械的に強い持支マトリク ス、例えばCM−ファストフロー・又はCM−シリカ−を使用することにより、 変更することができる。言うまでもなく、FMM。
と他の成分、特にFMM、との間の分離性を増強するために、この実施例に示さ れた方法の任意の変更を導入することができる。
ゲル濾過クロマトグラフィー 次に、本発明者らはCM−セファロースカラムからのFMM2ビークを限外濾過 により約2■/−の蛋白質濃度に濃縮した。
これを、0.05Mコハク酸緩衝液(pH5,0)により平衡化した2、 5  cIuX 80C1l+ゲル濾過カラム(セファデックスG−50スーパーフア イン)に負荷した。次に、本発明者らは、コハク酸緩衝液を用いて3cm/時の 線速度において溶出した。コハク酸緩衝液は非経口投与のために許容される賦形 剤だからである。
第2図りに関し、カラムから出現する2個の分離されたピークはそれぞれダイマ ー及びFMM2を示す。FMM、ピークを集め、そして0.22−の孔の非結合 フィルターを通して、0.55Mコハク酸緩衝液(pH5,0)巾約0.5〜1 .0 mg/mlの蛋白質濃度の精製された薬物濃縮物を得た。本発明者らはゲ ル濾過溶出物のFMM2が銀染色5O3−PAGEゲル上で均一であることを観 察した。
適当な分子量範囲において分画するであろう任意のゲル濾過カラム、例えば5e phacryl S−2005uperfine、 5uperose−12゜ FractoHel 50S、 Llltrogel ACA 54及びTSK −250ゲル濾過マトリクスをこの段階で使用することができる。さらに、ゲル 濾過段階の代りに限外濾過を用いて操作のスピードを上げることができる。しか しながら、限外濾過はすべての残りのダイマーを除去するとは思われないのでゲ ル濾過が好ましい。最後に、各段階について、流速を増加することにより操作の 時間を短縮することができる。
第1表は、抗体カラム溶出から出発して組換1FN−α−2FMM、蛋白質につ いての精製段階当りの回収率及び収量をまとめたものである。物質の全体回収率 は5.8%である。モノクローナル抗体カラム溶出物中のFMM、含量に対する 回収率は48.6%である。
逆相クロマトグラフィー 65 24.4 24.4濃 縮 17.9 6.7  88.2 ” 280nmにおける光学濃度により推定。
次に、本発明者らは、本発明の精製されたFMM、の比活性を決定するため、S 、Rubensteinら〔「インターフェロンのための便利な測定法J 、J ournal of Virology、 37.755−58頁(1981) 〕の方法を用いて細胞変性効果アッセイ(CPE)を行った。まず、インターフ ェロンに対して感受性であることが知られている細胞を、力価が決定されるべき サンプルの逐次稀釈物と共にインキュベートした。各稀釈物にチャレンジウィル スを加えた。再びインキュベートした後、細胞に対するウィルス性細胞変性効果 の50%の低下を達成する稀釈レベルを観察した。標準単位で表わされる濃度を 国際標準、例えば米国国立衛生研究所(National In5titute s of )lealth)でヤスダ、メリーランド、により確立されたもの、 に対するアッセイを同時に行うことにより決定した。
本発明者らは、単にイムノアフィニティー(すなわちLITI/S)クロマトグ ラフィーにより精製された未分画の組換αについて約1゜0XIO”ユニット/ ■蛋白質であるのと比べて、FMM2の比活性が約2.3X10”ユニット/■ 蛋白質であることを見出した。
実施例■ この例においては、細胞溶解物の「透明化」法を単純化し、低速遠心のみを使用 した。その結果、イムノアフィニティーカラムフィードストックは濁った細胞溶 解物であった。発明者らは、生ずる細胞溶解物を加工するために、イムノアフィ ニティークロマトグラフィー用流動床反応器を用いた。本発明者らは三部分均一 溶出プログラムをRPC段階のために含めた。これは生ずるLITI/S溶出物 が実質的な量(35%まで)の非IFN蛋白質夾雑物、例えば酵母蛋白質を含ん でいたからである。第一段階が挾雑酵母蛋白質を本質的に除去し:第二段階が陽 イオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製のためにIPN FMMを溶 出し;そして第三段階が多量のIFNSMMオリゴマー及び断片を除去する。
LITI/S流動床において処理した後、粗細胞溶解物中の組換JPN−α−2 の約50%を代表する約600■の組換IFN−α−2を溶出画分中に回収した 。LITI/S溶出物(7,2A)を0、45 ミクロン膜を通して濾過しそし て分取用Vydac C−4<22mmX 250oun)逆相カラムに8回に 分けて負荷した。各負荷を、下記のごときアセトニトリルの多段均一勾配により 溶出した。
時 間(分) B(%) カーブ 1143 直線的 20 43 * 2146 直線的 36 46 * 40 100 直線的 45 100 * 各試行からの約24.5〜26.0分の溶出を代表するFMM画分をプールした 。分析用RP−HPLCにより決定した場合、115■の理論量の92%を代表 するLITI/Sカラム溶出物からの105■のFMMを回収した。
FMM画分を、0.05M酢酸アンモニウム(pH5,2)により6%(V/V )アセトニトリルに稀釈し、そして200m1(4,4X14cm)陽イオン交 換カラム(CM−セファロースCL−6B)に負荷した。このカラムを0.14 M酢酸アンモニウム(pH5,2)により均一に(isocratically )溶出した。この結果を第2図Cに示す。酢酸アンモニウム緩衝液のモル濃度の わずかな低下(0,15Mから0.14Mへ)が前の分離(実施例工を参照のこ と)に比べてFMM 、とFMM2との間の分離を改善した。FMM2を示す両 分を一緒にし、そしてこれらを限外濾過を用いて約5■蛋白質/rn1.に濃縮 した。濃縮されたFMM2をセファデックスG−50スーパーフアインゲル濾過 カラムに負荷して痕跡量のオリゴマーを除去し、そして酢酸アンモニウムと0. 05Mコハク酸緩衝液(pt15.0)とを交換した。ゲル濾過カラムからのP MM2溶出物の蛋白質濃度は約1mg/mfであり、そして約2.2 X 10 ”ユニット/■の蛋白質の比活性を有していた。第2表にFMM2についての精 製段階ごとの回収率及び収量を要約する。蛋白質に基く全体収率は全蛋白質から 7.3%であり、モしてLITI/Sカラム溶出物中に含まれる全FMM2に対 して約50%であった。
第2表 LITIモノク ローナル抗体 600 100 100 116第4図は、精製工程の各中間体 についての分析用RP−HPLCのプロフィールの比較を示し、そしてFMM2 最終精製薬物濃縮物の均一性を確するものである。
実施例■ FMM 、及びFMM2の特徴付は 本発明者らは特徴付けのため上記のようにしてFMM2のサンプルを調製した。
FMM 、を調製するため、陽イオン交換FMM 、画分をRP−HPLCにて 再クロマトグラフィー処理しそしてFMM 、に相当するピークを集めてすべて の残留FMM2又はSMMを除去することによりサンプルをさらに精製した。両 分ごとの分析により、FMM 、の比活性がFMM2のそれ(約200x 10 1′U/■)とおよそ同じであることが見出された。
における分析的等電点法J LKB Application Note 25 0(1977)]により記載されている方法の変法を用いてサンプルを分析した 。サンプルを5 mM Tris−HCA (pH8,0)に対してダイアフィ ルトレージョンし、そして10. OOOMWCO膜を装着したアミコン・セン トリコン(Amicon Centricon)”ユ= 7ト中で濃縮した。水 平前成形LKBアンホライン(Amphol 1ne) RPAGプレート(p )13.5〜9.5 )を用いてL K B (Bromma、スエーデン)分 析用等電点装置により等電点測定を行った。約10ハ(約5〜10.q蛋白質) の適用に先立ち、ゲルを50ワツトの定電源において0.5時間前フォーカシン グした。電気泳動を冷却しながら1〜2時間、又は一定電流が達成されるまで電 気泳動した。ファルマシア・ファインケミカル社(Piscataway、 N J)から等電点マーカーを得た。ゲルを室温にて、30%メタノール、3.5% スルホサリチル酸、11.5%トリクロロ酢酸溶液中で固定した。次に、ゲルを 60℃にて10分間、25%メタノール中8%酢酸中の0.1%(W/V)クマ ッシーブリリアントブルーR−250を用いて染色した。最後に、25%メタノ ール中8%酢酸の溶液中での拡散により脱染色して明瞭なバックグラウンドにし た。
IEFゲル電気泳動の結果は、FMM 、が約5.85のprを示し、他方FM M2のそれは約6.09であることを示した。
本発明者らはFMM+とFMM2の等電点の相違がメチオニンスルホキシド残基 に帰せられるとは信じない。なぜなら、これら2種類の千ツマ−からのブロムシ アン消化のペプチドマツプは区別できないからである。
動(SO3−PAGE) 本発明者らは我々のサンプルを5mM Tris−)1(J’ (pH8,3) 中で、U、に、Laemmli (rバクテリオファージT4の頭部の集成の間 の構造蛋白質の開裂J 、Nature (ロンドン) 、227゜680−8 5頁(1970) ]の方法に従って分析した。5〜10jIgの蛋白質を含む 一定容量の濃縮物を一定容量のサンプル緩衝液と混合して、10mM Tris −HCl(pH6,8)中で、0.1%(Ill/V)SO3゜10%(ν/V )グリセロールの最終濃度を得た。次に、サンプルを95℃に3分間加熱した。
還元されたサンプルが必要な場合、サンプルに2−メルカプトエタノールを加え て10%(V/V)の最終濃度とした。サンプルを、4%ポリアクリルアミドス タッキングゲル(1,OX 18x O,75cm)中に前形成されたウェルに 適用し、そしてそれらを、それぞれ0.1%(MV)のSDSを含有する14. 5%ポリアクリルアミド分離ゲル(16X18XO,75cJn)上で電気泳動 した。電気泳動を、30ミリアンペアの定電流において、冷却しながら、追跡色 素先端(ブロモフェノールグル)がゲルの底部に泳動するまで(約3時間)行っ た。ゲルを固定し、そして室温にて1時間、イソプロパツール/ 酢M/水(2 5: 10 : 65)中0.1%(W/v)クマッシーブリリアントブルーR −250により染色し、そしてメタノール/酢酸/水(5:10:85)を用い る拡散により明瞭なバックグラウンドになるように脱染色した。染色工程の感度 を上げる必要がある場合、又はゲルに負荷した蛋白質がクマッシーブルー染色に よる検出限界より低い場合、Merr i lらの方法〔「ポリアクリルアミド ゲル中での単純化された蛋白質検出及びイメージ増強法J 、Electrop horesis、 3.17−23頁は982) ]に従でて0.012M硝酸 銀(AgNos)溶液により洗色した。5O3−PAGE分析を用いて、本発明 者らは、PMM 、及びFMM2が非還元条件下及び還元条件下のいずれにおい ても区別できないことを見出した。非還元条件下で、両者は約19.000ダル トンの見かけ分子量で泳動した。
C,アミノ酸組成 本発明者らは、J、W、Eveleigh及びG、D、Winter (rアミ ノ酸組成の決定J 、Protein 5equence Determina tion、 91−95頁(1970) )の方法に従って、100℃にて24 時間、標準的条件下で0.5〜1.0ナノモルのサンプルを加水分解するために 塩酸を用いてアミノ酸残基の濃度を決定した。MET及びCYS濃度の決定のた め、過蟻酸加水分解を行った。得られる加水分解物のアミノ酸をDurram  Model D−500アミノ酸アナライザーを用い、検出のためにニンヒドリ ン及び蛍光を用いて分析した。
FMM2及びFMM 、の各々の合計8サンプルを分析した。平均及び標準偏差 を第3表に示す。この結果が示すところによれば、FMM2とFMM 、との間 にアミノ酸組成に基く有意な差は存在しない。
第3表 アミノ酸分析(±標準偏差) 残 基 FMM、 FMM2 推定値(0)ASX 13.9N±1.05>  14.22 (+1.20) 12THR101010 GLY 7.44(+1.10) 8.02(+1.87) 5ALA 8.8 6(+0.53) 8.9N±0.69) 8VAL 6.61(+0.36)  6.40(+0.21> 7HIS 2.93(+0.53) 3.05 ( +0.63) 3ARG 10.47(+0.82) 10.66 (+0.9 5) 10TYR5,20(+0.09) 5.17(+0.16) 5PHE  9.50±1.37) 9.67(+1.09) 10SER13,89(+ 0.55) 、14.15(+0.50) 14GLX 28.06(+0.8 2) 28.16+1.07) 26ILE 7.39(+0.61) 7.4 8(+0.68) 8L E U 20.47 (+1.83) 20.76  <±2.46) 21LY3 9.97(+0.89) 10.04(+1.2 0) 10PR04,99(+0.54) 4.46 (+1.26) 5CY S 4.00(+0.85) 3.85(+0.49) 4MET 5.35( +0.35) 5.35 (+0.21) 5TRP 2(”) 2(”) 2 D、FMM、及びF M )、+ 2のN−末端配列的0.5〜1.0ナノモル のS−カルボキシメチル化サンプルをTFAに溶解し、そして現在の自動化エド マン分解法〔M、W、Hunkapiller及びり、E、Hood、r超高感 度高速液体クロマトグラフィーによるフェニルチオヒダントインの分析」、Me thods in Enzyrnology、 91.486−93頁(198 3)]を用いて470A気相シーケンサ−(Applieed Biosyst ems)において配列決定した。PTH−アミノ酸を、WISP自動サンプラー 及び固定波長検出器を有するウォーターズ・モデル6000勾配系でRP−HP LCを用いて分析した。Ne1son Analytical Softwar e及びIBM computerを用いてデーターを解析した。
FMM2の結果 CM、 CYS−ASP−LEU−PRO−GLN−(THR) −HIS−5 ER−LE[l−GLYSER−ARG−ARG−(TIIR)−LEローME T−LEU−LEローALA−GINFMM2のN−末端配列は成熟組換α−2 1FNについて公表されているそれCD、V、Goeddelら、「8個の異る クローンのヒト白血球インターフェロンcDNAの構造J 、Nature、  290.20−26頁(1981):lに正確に対応するが、但し、Goedd elは23位をLYSと推定している。カッコで囲まれたアミノ酸残基は本発明 者の分析において不確かであることを示す。
FMM 、の結果 通常のエドマン分解法により配列データーを得ることができなかった。従って、 本発明者は蛋白質がそのN−末端でブロックされていると結論した。
E、スルヒドリル基の決定 本発明者らは、FMM 、及びFMM2の純粋な調製物中のスルヒドリル基をエ リマン(ElliIIIan)試薬5.5′−ジチオビス−(2−ニトロ安息香 酸) (DTNB)を用いて、Habeeb法[A、 P、 S。
A、tlabeeb、r蛋白質スルヒドリル基とエリマン試薬との反応」、Me thods in Enzymology、 25.457−64頁(1972 ) 〕の変法により測定した。20mM BDTAを含有する6M Go−HC j!溶液(pH8、3)666m、327IJ1の0.5 M Tris−HC A (pH8,3、20rnM EDTA)巾約10ナノモルのサンプル蛋白質 、及び水中90p1の10rnlil DTNBを30分間、穏やかに混合した 。標準として20mM EDTA(pH8,3)中新しく調製したシスティン溶 液(2mM)を用いて412nrnでの吸光度を測定した。これらの条件下でモ ル吸光係数は13.000〜13.600であり、これは報告されている値とよ く一致した。
PMM 、及びFMM、についてのこれらの結果は蛋白質モル当り0.1モル未 満のSHを示し、本発明のFMM、及びFMM2の両者が十分に酸化されている ことが示された。
F0分析用逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)自動データーコ ントローラーモデル680.2個のモデル510ポンプ、LC分光光度計モデル 481、Rheodyne注入器、ウォーターズ・カラム温度調節モジュール及 び高滓記録/積分器を装着したくウォーターズ) Binary )IPLc  System上でRP−HPLCを行った。
本発明者らは、40℃の一定温度に保持されたVydac C−4逆相カラム( 4,6n+mX25cm ; 5 jnn粒子サイズ)を用いて少なくとも20 1Hのサンプルを分析した。カラムは水中0.1%(v/V)トリフルオロ酢酸 (TFA)中で平衡化した。次のプログラムに従ッテ、0.1%(V/V) T  F A中−rセ) = ) !J ル(CH3CN) (溶剤B)により1r n1/分の流速で勾配溶出を展開した。
1545 直線的 45 45 + 50 100 直線的 本発明者らはカラム溶出液を280nmでの吸収についてモニターした。
これらのクロマトグラフィー条件下で、本発明者らは、FMM、及びFMM 、 の各々が、それぞれ27.6分間(第4図、段階5を参照のこと)及び30.4 分間(データーは示してない)の保持で単一の対称的ピークとして泳動すること を観察した。
in Enzymology、 Vol、XI、 231−39頁(1967) )の方法に従って精製した。約2ナノモルの5−カルボキシアミドメチル化され たサンプルを、1ニア5重量比の精製トリプシン:蛋白質(FMM、又はFMM 、)で2回消化した。この消化は0.1 MNt(4HCOs (pH8,0) 中で37℃にて2時間行われた。消化の後、ペプチド混合物のpHを水中2%T FAにより2.0に調整した。
ペプチド混合物を乾燥し、そして水中0.1%TFA中に再溶解し、そして再度 乾燥した。最後に、ペプチド混合物を既知容量の0.1%水性TFAに入れた。
本発明者らはRP−11PLcを用いてトリプシンマツプを作成した。約2ナノ グラムの各消化物を別々に95%水、5%アセトニトリル(0,1%TFA)に て平衡化した逆相カラム(Vydac C−18,5ミクロン粒子サイズ、30 0人孔サイズ、4.6耶×250M)に別々に負荷した。ペプチドを30℃にて 、5〜50%アセトニl−IJルの0.23%/分の直線勾配により溶出した。
ピークを215nmにてモーターした。
対照として、(a)ペプチド混合物のために用いたものと同じ条件を用いて、ト リプシンのみ; (b)未消化のFMM 、又はFMM2;及び(C)アルキル 化された未消化のFMM +又はFMM2を処理した。第7図に示すように対照 処理はペプチドマツプを妨害しないことが見出された。本発明者は、FMM 、 モノマーとFMM2モノマーとの間の明確な差異を観察した(第7図を参照のこ と)。
本発明者らは1ntron A及びRoferon Aを地方の薬局から入手し 、そしてそれぞれのインターフェロン組成を分析した。
これは、複雑な混合物中の組換え白血球インターフェロンα−2を決定するため の迅速測定法を用いて達成された。この測定は、逆相HPLCカラムにタンデム に連結された高速モノクローナルアフィニティーカラムの使用に頼るC L、R ybacekら、「組換白血球インターフェロン−α−2の迅速二重カラムク0 7トグラフイー測定J 、J、Chromatography、 397.35 5−64頁(1987) )。
この迅速測定系からインターフェロンを集めた後、H3A不含有1ntron  A又はRoferon Aのいずれかを分析用Vydac C−4カラム(4, 6mm X 250mm ;粒子サイズ5ミクロン)に負荷し、そして0.1% トリフルオロ酢酸中44%アセトニトリルへの段階的勾配によりクロマトグラム を展開した。第5図Aに関し、本発明者らはIntron Aが16.7分間の 保持時間を有する1つのピークとして溶出することを観察した。次に、組換えI FN−α−2−FMM、及びFMM2の混合物を同じ条件下でクロマトグラフ処 理した。FMM2はIntron Aに近い保持時間(16,8分間)で溶出し 、他方FMM 、は1分間遅れて17.3分間で溶出した(第5図B)。更なる 研究において、本発明者らはIntron Aと組換JFN −a −2FAI M、との等量混合物、及びIntron AL組換IFN−α〜2 FMM2と の等量混合物を上記の逆相クロマトグラフィーにかけた。第5図Cに関し、FM M、及びIntron Aは逆相カラムから同時溶出し、他方PMM l及びI ntron Aは各ユニーク保持時間を示した(第5図D)。
別の実験において、Roferon A 、 Intron A及び組換JFN −α−2FMM2の逆相クロマトグラムを比較した。第6図に関し、各サンプル の主ピークは密接に対応する保持時間を有していたが、Roferon A ( 第6図C)は主ピーク上に痕跡の肩を含んでいた。これらの結果は、Rofer on Aが一層不均一であること、又はそれが組換a 2 FMM2 (パネル A)又はIntron A(パネルB)のいずれよりも多くの分解生成物を含有 していることを示唆する。
本発明者はまた、等電点ゲル電気泳動を用いて組換IFN−a −2FMM2を Intron A及びRoferon Aと比較した。その結果が示すところに よれば、組換lFF−α−2FMM2が最も少ない等電点種を有していた。In tron Aは少なくとも2種の等電点形を示し、そしてRoferon Aは 少なくとも4種を、他方本発明のFMM2は唯一つの形を示した。さらに、Ro feron AO主バンドはFMM2及びIntron Aとは異る等電点を有 していた。この相違は、ポリペプチドの23位のアルギニンのリジンへの置換で ある、α2とαAとの間の一次構造の相違に帰することができる。
他の検討において、本発明者は、非還元条件下及び還元条件下の両者のもとての 5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、FMM、を1ltron A及び Roferon Aと比較した。この結果が示すところによれば、Intron  Aが痕跡量のダイマーを含有しそしてRoferon Aが幾つかの未同定の 高分子量蛋白質を含有する点を除き、サイズについて区別できなかった。
実施例■ 組換−JPNα2 FMM、の精製された濃縮物の安定性組換えIFN−α−2 FMM2の精製された濃縮物(比活性2.3x 10”U/mg)を、0.05 Mクエン酸緩衝液(pH5,0)中0.48mg/−で、幾種類かの温度(−2 0℃、4℃、25℃及び37℃)において4週間貯蔵した。本発明者らは、CP Eアッセイにより活性について、そして5DS−PAGEにより分解について、 各温度を評価した。37℃にて4週間後でさえ比活性は変化しなかった(平均的 2.5 X 10’U/■)。さらに、37℃にて7週間後、銀染色ゲル上での 5O3−PAGEによるFMM2の分析は、非還元サンプルにおいてオリゴマー 又は低分子量分解生成物を示さず、そして還元されたサンプルにおいて痕跡量の 低分子量物質が存在した。
本発明者らは、今まで本発明の多くの具体例を示したが、本発明の基本構成を変 えて本発明の方法及び組成物を用いる他の具体例を提供することができることは 明らかである。従って、本発明の範囲に今まで実施例により示した特定の具体例 によってではなく本明細書に添付された請求の範囲によって定められるべきであ る。
F/θ/ 組換α2FMM2を製造するための精製工程段階 !: 酵母の発酵 段階 2: イムノアフィニティークロマトグラフィーam −x、’ 陽イオ ン交換クロマトグラフィ一段階5: ゲルシ濾過りロマトグラフィーFI6.2 (A) 逆相クロマトグラフィ一 時間(分) 陽イオン交換クロマトグラフィー 実施例1 実施例2 F/θ 2ど72ノ カラム容量 F/63 パネルA:25°Cパネル B:H)’Cサンプル :url/s溶離剤 温度:ウォーターズTCMにより調節 勾配プログラム 溶離剤 A:杓グa、yzry 溶離剤 B : CA/3(ルン〆0./に、yaf 5 直線的 f5 45 45 4f 直線的 jθ グθ0 55 /θ0 F/θ4 時間(分) FIG5 パネルA: パネルB; In1rOn A FMM+とFMM2と(Di合物時間(分) 時間(分) FIG6 時間(分) FIG、? 国際調査報告

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.白血球インターフェロンの部分的に又は完全に還元された形の遅く移動する モノマー(SMM)及びオリゴマー並びに非一インターフェロン蛋白質を実質的 に含有しない、十分に酸化された形のヒトα−2インターフェロンの速く移動す るモノマー(FMM)を単離する方法であって、a)十分に酸化された形のヒト α−2インターフェロンの速く移動するモノマーを含有する未精製のヒトα−2 インターフェロン(IFN−α−2)を低アルキル逆相カラムに負荷し、そして 溶出し; b)段階a)の生成物を陽イオン交換カラム上に負荷しそして溶出し; c)段階(b)の生成物をゲル濾過カラムに負荷しそして溶出し;そして d)前記速く移動するモノマーを精製された形で回収する;ことを含んで成る方 法。
  2. 2.IFN−α−2をまずイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製 する、請求項1に記載の方法。
  3. 3.IFN−α−2を酸性緩衝液により前記イムノアフィニティーカラムから溶 出する、請求項2に記載の方法。
  4. 4.前記逆相カラムがC−4カラムであり、そして前記FMMを0.1%トリフ ルオロ酢酸及び46%CH3CNにより溶出する、請求項1に記載の方法。
  5. 5.前記陽イオン交換カラムが固定化カルボキシメチルカラムである、請求項1 に記載の方法。
  6. 6.前記FMMを前記ゲル濾過カラムから、全カラム体積の約0.45部分から 集め始める、請求項1に記載の方法。
  7. 7.段階(a)の前記逆相クロマトグラフィーをC−4カラム上で行い、段階( b)の前記イオン交換クロマトグラフィーをカルボキシメチル化カラム上で行い 、段階(a)の溶離剤がアセトニトリル中トリフルオロ酢酸であり、そして段階 (b)の酢酸アンモニウムである、請求項1に記載の方法。
  8. 8.段階(a)の溶出を均一条件下で行う、請求項1に記載の方法。
  9. 9.α−2インターフェロンの異る複数のFMMを電荷及び疎水性に基づいて分 離する、請求項1に記載の方法。
  10. 10.α−インターフェロンの部分的に又は完全に還元された形態、α−インタ ーフェロンの遅く移動するモノマー及びオリゴマー、並びに非一インターフェロ ン蛋白質を本質上含まない、十分にジスルフィド結合した形のα−インターフェ ロン。
  11. 11.前記インターフェロンがヒトα−2インターフェロンである、請求項10 に記載のFMM。
  12. 12.1×108ユニット/mg以上の比活性を有する、請求項10に記載のF MM。
  13. 13.請求項10に記載のFMMを1又は複数の他のポリペプチドと組合わせて 含んで成る医薬組成物。
  14. 14.請求項10に記載の医薬として有効な量を含んで成る、α−インターフェ ロン処置に対して感受性の状態の処置のための組成物。
  15. 15.請求項10に記載のFMMの医薬として有効な量を適当なキャリヤーと共 に含んで成る局所用組成物。
  16. 16.α−インターフェロンの部分的に又は完全に還元された形態、α−インタ ーフェロンの遅く移動するモノマー及びオリゴマー並びに非一イントロン蛋白質 を本質上含有しない、請求項1の方法によって製造される、十分にジスルフィド 結合した形態のヒトα−2インターフェロン(FMM)。
  17. 17.まずIFN−α−2をイムノアフィニティークロマトグラフィーにより部 分精製することにより製造される、請求項16に記載のFMM。
  18. 18.段階(a)においてIFN−α−2をC−4逆相カラムに負荷しそしてア セトニトリル中トリフルオロ酢酸により溶出し、溶出物を進め、そして段階(b )においてそれをカルポキシメチル化カラムに負荷しそして酢酸アンモニウムに より溶出することにより製造される、請求項16に記載のFMM。
  19. 19.ゲル濾過カラムから、全カラム体積の約0.45部分から集め始めたもの である請求項16に記載のFMM。
  20. 20.電荷及び疎水性に基いて分離される、α−2インターフェロンの異るFM M。
  21. 21.分離されたモノマーFMM1及びFMM2、並びにそれらの断片。
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