KR20030005005A

KR20030005005A - 양이온 교환 크로마토그래피를 통한 약리학적 활성단백질의 정제방법

Info

Publication number: KR20030005005A
Application number: KR1020020037622A
Authority: KR
Inventors: 루시아스카폴; 기세페클라우디오비스코미
Original assignee: 알파 와셔만 에스. 피. 에이.
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-06-29
Publication date: 2003-01-15
Also published as: CA2388716A1; PL209954B1; ES2250544T3; KR100771252B1; HRP20020480B1; UY27354A1; HU0202124D0; CN1396176A; MXPA02006303A; RU2274471C2; PL354769A1; ATE307824T1; US20030010715A1; CU23149A3; SI1273592T1; AR034663A1; US6866782B2; HRP20020480A2; EP1273592A2; ITBO20010426A0

Abstract

본 발명의 목적은 보다 염기성의 pH, 즉, 정제될 단백질의 등전점인 pI에 상응하는 pH보다 높지만, 상기 단백질은 그 pH에서 여전히 흡수된 상태로 남아있는 pH에서 수행되는, 고체 매트릭스 상에서의 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)의 사용에 기초하는 약리학적 활성 단백질의 정제를 위한 방법이다.

이와 같은 결과를 얻기 위하여 정제될 약리학적 활성 단백질의 종류에 적응된 pH 및 이온 세기의 값을 갖는 버퍼용액을 사용한다.

상기 방법은 주로 인터페론 및 알부민 단백질의 정제에 대한 것이다.

Description

양이온 교환 크로마토그래피를 통한 약리학적 활성 단백질의 정제방법{PROCESS FOR THE PURIFICATION OF PHARMACOLOGICALLY ACTIVE PROTEINS THROUGH CATIONIC EXCHANGE CHROMATOGRAPHY}

생체의료과학의 광범위한 부분은 추출기술에 의하여 얻어지는 천연적 기원 및 재조합 DNA로부터의 기술에 의하여 얻어지는 합성적 기원의 모두의 약리학적 활성 단백질의 이용에 기초하고 있다. 원하는 산물의 순도는 위 두 경우 모두에 있어서 중요하며, 그 이유는 그들의 활성에 대한 이해는 소정의 양의 단백질의 존재와 생물학적 효과와의 깊은 연관 가능성으로 결정되기 때문이다.

이러한 관계에 있어서, 제조된 단백질의 순도는 특수 의약품에 포함된 활성 주성분 또는 첨가제가 수반될 때, 현저한 중요성을 나타내기 때문에, 약리학적 활성 단백질의 정제 방법이 중요하다. 사실, 치료 동안 독성효과의 유발 및/또는 역효과를 가져올 가능성에 의하여, 등록과 허가에 책임이 있는 당국이 단백질 기재의 의약품 시장에 거래되는 의약품에 함유된 단백질 유래의 활성 주성분의 질과 제조 일관성을 결정하기 위하여 보다 엄격한 규정을 도입하게 되었다.

상기한 바로부터, 주요한 난점이 약리학적 활성 단백질이 항상 다른 많은 단백질과 합성 혼합물 상태로 존재한다는데 있다는 사실에 단백질 정제 방법의 중요성이 명확하게 나타난다.

이러한 사실은, 예컨대 혈액, 동물 또는 식물 기원의 추출물과 같은 천연 소스가 약리학적 활성 단백질의 추출에 사용되는 경우 및 상기 단백질이 그 기원과 독립적으로 그들 사이에 유사한 화학적-물리적 특성을 보여주기 때문에 재조합 DNA 기술을 사용하는 경우 모두에 있어서 적용된다.

따라서, 상기한 바로부터, 약리학적 활성 단백질의 정제의 경우, 유사한 특성을 갖는 다른 단백질 및 종종 충분히 과도한 양의 원하는 단백질과 함께 혼합된 단백질은 고 순도로서 분리되어야 한다는 것이 성취된다.

공정 수행은 엄격하고, 몇 몇 정제 단계는 원하는 순도를 얻기 위하여 통상적으로 사용된다. 이와 같은 방법으로는 정제 공정이 매우 복잡해지며, 정제 공정이 제조 비용을 주로 결정하기 때문에, 단백질의 산업적 제조의 성공 여부가 근본적으로 정제 공정의 효율에 죄우된다.

예컨대, 수성 및 유성 용매 내 또는 카오트로픽제(caotropic agent)를 사용하는 선택적 침전; 여과 및/또는 투석에 의한 분지; 절절한 항체를 이용하는 면역-침전법; 크로마토그래피법과 같은 많은 기술들이 단백질 정제에 사용된다.

Regnier F.E. on J. Chromatogr.418, 115-143 (1987)에서 보고된 바와 같이, 이들 후자의 방법들이 원하는 순도를 갖도록 할수 있기 때문에, 근래들어 이들 후자의 방법들이 대부분 중대한 중요성을 갖는다. 많은 기술들이 과학 문헌에 인용되어 있고, 이들 기술들은 단백질 분리에 적용되는 기작의 메카니즘에 따라서, 예컨대, 분자량, 고정상이라고도 칭해지는 극성 매트릭스 상에서의 흡수, 역고정상이라 불리우는 비극성 매트릭스 상에서의 흡수, 구리, 아연, 철 및 플라티늄과 같은 중금속, 브릴리언트 블루(brilliant blue)와 같은 화학염료, 단백질 A 및 단백질 C와 같은 단백질, 폴리사카라이드 및 글루코사미노글리칸과 같은 탄수화물 등의 비활성 매트릭스에 결합된 리간드에 대한 선택적 친화성, 비활성 매트릭스 상에 결합된 특정 항체에 대한 면역-친화성에 의한 흡수, 비활성 매트릭스 상에 결합된 정전기적으로 대전된 리간드와의 이온적 상호작용에 의한 흡수 등과 같이 분류될 수 있다.

선택력, 즉, 원하는 단백질을 선택적으로 인지하는 능력, 비용 및 산업적 수준으로 사용될 가능성이 상이한 크로마토그래피 기술의 수행을 평가하는 조건으로서 사용된다.

이러한 조건들에 기초하여, 면역-친화성 크로마토그래피는 보다 큰 선택력을 보증하지만, 높은 이용 비용, 항체 변성의 위험성 및 항체가 동물 기원이기 때문에 발생하는 정제된 산물의 최종 안정성과 관련된 위험성과 같은 결점을 나타낸다.

이온 교환 크로마토그래피라고도 불리우는 이온 상호작용을 사용하는 크로마토그래피는 단백질의 약리학적 활성을 유지하기 위한 보다 위험성이 적은 기술이고 낮은 경영비용으로 산업적 방법으로 수행하기에 보다 용이하지만, 선택력이 좋지 못하다는 결점을 나타낸다.

따라서, 얻어진 산물의 순도의 견지에서 다른 기술과 경쟁할 수 있도록 하기 위하여 이온 교환 크로마토그래피의 선택력을 증가시키는 이온 교환 크로마토그래피의 수행 조건을 찾는 것이 매우 유리하다.

통상적으로 이온 교환 크로마토그래피는 영구적으로 또는 특정 조건 하에서 정전기적으로 대전되는 화학기를 포함하는 고체 매트릭스로 채워진 다양한 크기의 컬럼을 사용하여 수행한다.

이온 교환 컬럼에 삽입된 화합물은 매트릭스에 결합된 전하에 대한 쿨롱 인력/척력에 의하여 상호 작용한다. 혼합물에 포함된 상이한 화합물들은 자기 자신을 포함된 전하의 양과의 상관관계로 고정상에 결합시킬 수 있을 것이고, 그 결과로서, 컬럼 출구에서의 그들의 분리를 한정한 바와 같이, 상기 화합물을 많게 또는 적게 유지할 수 있게 될 것이다.

매트릭스의 전하가 음의 전기를 띨 때 양이온은 유지되기 때문에 이러한 크로마토그래피를 양이온 교환 크로마토그래피라고 칭하고, 매트릭스의 전하가 양의 전기를 띨 때에는 음이온 교환 크로마토그래피라고 칭한다.

단백질은 아미노산의 혼성 중합체에 의하여 만들어지는 10,000 달톤 이상의 고분자량을 갖는 화합물이고; 몇 몇 아미노산은 자신의 곁사슬에 용액의 pH와 상관관계를 가지고 산성 아미노산에서는 음성적으로, 염기성 아미노산에서는 양성적으로 이온화될 수 있는 작용기를 가지고, 이에 따라서, 모든 단백질들이 많은 음전하 및 양전하를 포함하게 된다. 단백질의 등전점, pI는 음전하의 분포가 양전하의 분포와 동일하기 때문에 단백질이 중성인 pH이며, pI에서 전기장 속에 놓여진 단백질은 전기장의 어떠한 극으로부터도 인력을 받지 않는다.

pH가 pI 보다 높으면 음전하의 수가 증가하고, 단백질은 순수 음전하를 얻게되는 반면, pH가 pI 보다 낮으면 반대현상이 생겨서 단백질은 순수 양전하를 얻게된다. 모든 단백질은 다른 단백질과 구분되는 자신의 고유한 pI를 가지고, 몇몇 단백질은 등전점에서 불용성이 되는 경향이 있다.

Regnier F.E., Science, 238, 319-323, (1987) 및 Yamamoto S. et al., Chromatographic Science series, 43, (1988), Marcel Dekker, Inc. Publisher, New York에 보고된 바와 같이, 단백질이 자신의 pI 보다 높은 pH에서 음이온 이온 교환 크로마토그래피를 따르는 반면, 단백질이 pH 보다 낮은 pH의 용액 내에 있을 때, 순수 양전하를 갖게 되고, 이에 따라서, 음성적으로 대전된 매트릭스와 상호작용할 수 있게 되어, 양이온 교환 크로마토그래피를 따르게 된다.

이에 반하여, 본 발명자들은 양이온 교환 크로마토그래피를 계속적으로 수행할 수 있도록 단백질이 양이온 교환 크로마토그래피의 매트릭스에 계속 흡수되어 머무르는 pH인, 단백질의 대응 pI 보다 높은 pH 값 범위를 발견하는 것이 가능하다는 것을 예기치 못하게 발견하였으며, 본 발명이 목적은 이러한 사실을 기초로 한 것이다. 단백질 사이의 높은 선택력이 이러한 조건 하에서 얻어지고, 또한, 단백질 사이의 매우 작은 pI 차이가 높은 정제 효율이 가능한 상당한 분리를 얻기 위하여충분해지기 때문에, 이러한 상황은 특히 중요하다.

이러한 측면은 원하는 생성물이 상호연관된 불순물, 즉, 예컨대, 상이한 산화 상태, 아세틸화, 아미드 관능기(amidic functions)의 손실 등과 같이 생성물 구조의 매우 미세한 변화로부터 만들어지는 불순물로부터 수반되는 재조합 단백질 정제 공정에 있어서 특히 중요하다. 이러한 종류의 불순물은 대부분의 경우 항체가 이들을 구별할 수 없기 때문에 면역-친화성 크로마토그래피에 의하여 제거시키기가 매우 곤란하다.

발견된 현상을 설명할 수 있는 메카니즘은 단백질의 외부 표면을 따른 전하의 분포가 균일하지 아니하여 pH가 pI 보다 약간 높고 단백질이 총 순 음전하를 가질 때, 여전히 분자내로 위치하는 몇 몇 양전하가 있고, 음성적 고정상과 상호작용 할 수 있다.

이러한 메카니즘을 유효하게 만들기 위하여, 과량의 음전하가 너무 많이 강조되지 아니하며, 그렇지 아니하다면, 음전하로부터 형성되는 전기장이 너무 높아서 전체 단백질이 음의 전기로 대전된 크로마토그래피 매트릭스와 상호작용하는 것을 방지할 수 없다.

게다가, 이온 세기가 높으면 단백질을 감추어 단백질과 고정상과의 상호작용을 방지하는 효과를 가지기 때문에, 용리액으로 사용되는 용액의 이온 세기는 적절하게 조절되어야할 필요가 있다.

Lampson G,P. et al., Anal. Biochem., 11, 374-377, (1965), 확증 보고에 있어서, 인간 감마 글로불린, 리보뉴클레아제, 헤모글로빈, 델타 키모트립신, 글로빈 및 리소자임과 같은 단백질의 경우, pH는 조금만 변화시키고 0,1 M 포스페이트 용액에 의하여 주어진 매우 높은 이온 세기를 유지시키면, 양이온 교환 크로마토그래피에서의 용리는 pI 보다 거의 0.4 유니트 낮은 pH에서 일어난다.

본 발명이 기초로 하고 있는 상기한 원리는, 본 발명자들이 알고 있는 한, 단백질 정제의 효울적인 방법을 수행하기 위하여 사용된 바가 없다.

Kontturi A.K. et al., Acta Chem. Scand., 50(2), 102-106, (1996)에 설명된 정제공정을 최적화시키기 위하여 단백질의 등전점 차이를 사용하는 가능성은 사실 양이온 교환 크로마토래피가 항상 등전점보다 낮은 pH에서 수행되고 음이온 교환 크로마토그래피는 등전점보다 높은 pH에서 수행되는 통상적인 이온 교환 크로마토그래피의 사용에 관한 것이다. 본 특허 출원에 개시된 방법은 대조적으로 양이온 교환 크로마토그래피가 단백질의 등전점보다 높은 pH에서 수행되는 것이다.

본 특허 출원에 개시된 방법은 그것이 천연 기원의 단백질 및 재조합 DNA 유래의 단백질 모두에 성공적으로 적용됨을 보여주는 보고예에서 보는 바와 같이 일반성질로서 고려될 수 있다. 단백질과 단백질 사이의 차이점은 pH 장의 범위의 한도내에 존재하며, pI보다 높고, 원하는 단백질의 정제에 유용하다. 사실, 예컨대, 다음의 실시예에서 보여지는 바와 같이, 이러한 범위는 인터페론 단백질의 경우에는 약 0.2 pH 유니트이고, 알부민의 경우에는 약 1 pH 유니트이다.

Thatcher D. 및 Panayotatos N., Methods Enzymol. 119, 166-177, (1986)으로브터 보고된 바와 같은, 등전점이 5.9인 재조합 알파 인터페론(rINFα)의 정제에 대한 본 발명의 적용을 실시예 중에 보고할 것이며, pH 6.1에서의 양이온 교환에의하여 정제하는 것이 어떻게 가능한지 및 그 이점을 나타낼 것이다. 또한, 실시예는 Rylatt D.B. et al., J. Chromatogr., 865, 145-153(1999)에 보고된 바와 같은, pI 4.9인 인간 혈청 알부민(human seric albumin)을 보여주며, pH 6.0에서의 양이온 교환에 의하여 정제하는 것이 어떻게 가능한지 및 그 이점을 보여줄 것이다.

본 발명의 목적 방법의 이점은 높은 산업상 비용을 야기하고 생산율을 감소시키고, 일반적으로 3 단계 이상의 연속적인 처리를 요구하는 공정인, α 인터페론 및 인간 혈청 알부민의 정제를 개시하고 있는 과학 간행물 및/또는 특허에 기재된 공정의 결과와 비교하면 매우 현저하게 나타난다. Thatcher D. 및 Panayotatos N.는 Methods Enzymol., 119, 166-177, (1986)에다음의 연속적인 5 가지 처리를 통한 인간 재조합 알파 인터페론 rINF-α2 의 정제를 기재하고 있다:

a) 양이온 교환 크로마토그래피; b) 음이온 교환 크로마토그래피; c) 중금속용 친화성 크로마토그래피; d) 암모늄 설페이트의 포화용액으로 처리; e) 분자 배타 크로마토그래피(molecular exclusion chromatography).

유럽특허 제0108585호에는 다음의 3 가지 유형의 크로마토그래피를 연속적으로 상용하는 인터페론의 정제에 관하여 개시되어 있다: a) 면역 친화; b) 양이온 교환; c) 분자 배타.

미국 특허 제4765903호에는 인터페론 정제에 대하여 다음의 4 가지 유형의 크로마토그래피의 연속적인 사용이 개시되어 있다: a) 단클론항체를 사용하는 면역 친화; b) 역상(inverted phase); c) 양이온 교환; d) 분자 배타.

유럽특허 제0679718호에는 다음의 4 가지 크로마토그래피 단계를 나타내는알파 인터페론 생산 방법을 개시하고 있다: a) 금속-킬레이트; b) 양이온 교환; c) 음이온 교환; d) 겔 여과.

예컨대, 미국특허 제4732683호, 국제특허출원공개공보 제8604067호 및 Khan F.R. 및 Rai V.R., Bioprocess Technol., 7, 161-169 (1990) 등의 다른 간행물과 특허는 인터페론 단백질의 정제를 위하여 필요한 3 가지 이상의 처리를 개시하고 있다.

인용된 실시예는 인터페론 정제에 대하여 일반적으로, 알파 인터페론 정제에 대하여 특수하게 보고된 가장 관련된 사항을 포함한다. 이는 최근의 정제가 어떻게 특별하게 곤란하고 많은 정제 단계를 요구하는지를 보여준다. 게다가, 쥐 유래의 단클론항체를 이용하는 면역-친화성 크로마토그래피에 의하여 높은 정제 수준을 특별히 얻는 방법을 명확히 보여준다. 그러나, 인간에서의 약학적 사용을 위한 활성 주성분의 제조를 목적으로 하는 산업적 생산공정 내의 이와 같은 크로마토그래피 기술의 존재는, 최종 산물 내의 쥐 면역글로불린으로부터 유래하는 면역성 단편의 존재 및 산업적 견지에서의 크로마토그래피 매트릭스를 확인의 어려움 때문에, 쥐 유래의 바이러스로부터 가능한 바이러스 오염의 위험이 야기된다.

게다가, 간략하게 예시된 실시예로부터, 양이온 교환 크로마토그래피가 광범위하게 사용되지만 그 수행이 순도의 증가와 관련하여 제한되기 때문에 고유한 분리 기술로서 사용될 수 없다는 결과가 나타난다.

간행물 Babu K. R. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53 (6), 655-660, (2000) 및 Bouyon R. et al., Biotechnologia Aplicada, 14, 189-192, (1997)은 살린 농도구배에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 한 단계로 알파 인터페론을 정제하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 두 경우에 있어서, 충분히 순수한 생성물을 얻기 위하여 저자들은 알파 인터페론이 함유된 몇 몇 크로마토그래피 분획만을 분지하여야 했으며, 최소 7,5 까지의 매우 낮은 수율을 얻었다. 게다가, 기재된 살린 농도구배에서의 크로마토그래피의 정제 공정은 산업적 수준에서 사용되기에 적합하지 않다.

많은 크로마토그래피 정제 기술은 또한 인간 혈청의 분획화 또는 재조합 DNA 기술에 의하여 얻어진 알부민의 제조로부터 시작하는 인간 알부민의 경우에 기재되어 있으며, 기술의 복잡성 및 산업적 수준으로 전환되기 어렵다는 천연 및 재조합 기원의 인간 알부민의 효율적인 정제 문제점이 여전히 남아있다.

미국특허 제6150504호 및 제5521287호는 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용에 의하는 알부민의 정제를 기재하고 있다. 미국특허 제6034211호에 개시된 정제 설계은 2 가지의 크로마토그래피 단계, 한 가지의 초여과 공정 및 추가적인 2 가지의 크로마토그래피 정제 단계에 의한 알부민 정제를 나타내고 있다. Streamline과 같은 상업적으로 입수 가능한 매트릭스 또는 적절하게 제조된, 변형된 지르코늄 입자 또는 퍼플루오로 하이드로카본의 에멀젼 등과 상호작용하는친화-크로마토그래피 또는 유체 베드 내의 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 알부민 정제의 보다 덜 전형적인 방법이 미국특허 제5962649호 및 간행물 Sumi A. et al., Bioseparation, 8 (1-5), 195-200, (1999), Mullick A. 및 Flikinger M.C., Biotechnol. Bioeng., 65 (3), 282-290, (1999) 및 Mc Creth G.E. et al.,J. Chromatogr., 597(1-2), 189-196, (1992)에 기재되어 있다.

최근의 중금속 상에서의 알부민 정제 기술 또한 Yang L. et al., Sheng Wu Kung Cheng Hsueh Pao, 16(1), 74-77, (2000)에 기재되어 있으며, Cibacron Blue F3G와 같은 염료분자가 결합된 메트릭스 상에서의 친화성 기술이 Companini A. et al., J. Chromatogr. A, 736(1-2), 115, (1996)에 기재되어 있다.

이러한 모든 기술은 다양한 방법으로 수행의 복잡성 및 고 비용의 문제점을 보여주며, 용이하고 효율적인 산업적 실현가능성 및 경제적 이점이 있는 약리학적 활성 단백질의 새로운 정제 방법의 개별화의 문제점은 해결되지 않는다.

이하 설명되는 발명은 용이하게 산업적 개척을 할 수 있고 현저한 경제적 이점에 의하여 저비용인 약리학적 활성 단백질의 정제 방법을 제공함으로써, 이들 중요한 요구에 대한 해답을 제공한다.

도 1a 및 1b는 인터페론의 정제 전후의 크로마토그래피 프로필을 나타낸 것이다.

도 2a 및 2b는 인간 혈청 알부민의 정제 전후의 크로마토그래피 프로필을 나타낸 것이다.

본 발명은, 샘플의 로딩 후에, 적절한 pH 및 이온 세기의 용리액을 갖는 컬럼을 조절하여, 보다 염기성의 pH, 즉, 약리학적으로 활성인 단백질의 대응 등전점인 pI 보다 높고, 단백질이 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 고체 매트릭스 상에 흡수되어 여전히 남아있을 수 있는 pH가 컬럼 내에 균질하게 존재하도록 하는 것을 포함하는 특유한 조건 하에서, 고체 매트릭스 상에서의 양이온 교환 크로마토그래피의 사용에 기초하는 약리학적 활성 단백질의 정제를 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 조절 단계 후에, 용리액의 이온 세기 및/또는 pH를 증가시킴으로써, 약리학적 활성 단백질을 컬럼으로부터 용리시킨다.

일단 크로마토그래피 매트릭스가 정해지면, pH 및/또는 pH 단위의 수 십분의 1의 이온 세기의 제한된 변화 및/또는 수 백 μS의 이온 세기의 변화를 발생시킴으로써 효율적인 정제를 얻을 수 있기 때문에, 본 발명의 효율적인 수행은 크로마토그래피 용리액에 사용될 이온세기, pI보다 높은 pH 및 사용되는 크로마토그래피 매트릭스 사이의 올바른 조합의 개별화를 요구한다.

양이온 교환 크로마토그래피의 고정상으로서 일반적으로 사용되는 모든 기능화된 고체 매트릭스를 사용할 수 있지만, 특히, 정제될 단백질의 pI가 6 보다 낮고 강력한 양이온 교환 및 약한 양이온 교환 모두를 갖는 고성상을 6 보다 높은 pI를 갖는 단백질을 제외함 없이 사용할 수 있을 때, 강력 양이온 교환 크로마토그래피라고 칭해지는 고정상을 사용하는 것이 바람직하다. 예컨대, SourceS(pharmacia Biotech), SepharoseSP-Fast Flow, SepharoseSP-High Performance, Sp SepharoseXL(pharmacia Biotech), FractogelS(Merck Darmstadt), MusrangS (Pall Corporate), CM SepharoseFF (Phamacia Biotech), Dowex, Bio-RadAG (Bio-Rad), PorosS (PerSeptive Biosystems), Shodex-S, ToyopearlSP (Tosohass)과 같은 상업적으로 입수 가능한 고성상이 성공적으로 사용될 수 있다.

본 발명이 효율적으로 수행될 수 있는 pH 값 범위는 매우 광범위하며, 정제될 약리학적 활성 단백질의 등전점에 의존하며, 2과 11 사이를 포함하고, 바람직하게는 2와 8.5 사이를 포함한다.

본 발명에 기재된 방법이 적용되는 범위 내의 pI 보다 높은 pH 값의 범위의 확장은 약리학적 활성 단백질의 pI에 해당하는 pH 값으로부터, 단백질과 단백질 사이에 현저한 차이점을 보여주는, 상기 pI보다 1 pH 유니트 이상까지 변화할 수 있다.

예컨대, 재조합 알파 2b 인터페론(rIFNα-2b)의 경우에 있어서 pI인 5.9 보다 0.2 pH 유니트까지 높은 양이온 교환 매트릭스 상에서의 다백질의 흡수를 얻는 것이 가능하고, 연속적으로, 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제를 수행하는 것이 가능하지만, 인간 혈청 알부민의 경우 이 단백질은 자신의 pI 보다 1 pH 유니트까지 높아도 흡수된 상태로 머무른다는 것을 발견하였다.

효과적으로 사용가능한 용리액으로써 사용되는 수용액의 살린 농도 범위는 정제될 단백질의 종류에 따라 달라지며, 상기 범위는 1 mM 과 100 mM 사이의 값을 포함하며, 바람직하게는 1 mM 및 30 mM 사이이다.

예컨대, 재조합 알파 2b 인터페론(rIFNα-2b)의 경우에 있어서 살린 수용액의 농도는 1 mM 과 30 mM 사이를 포함하며, 바람직하게는 5 mM 및 15 mM 사이이다.

본 발명의 크로마토그래피 목적에 사용되는 용리액이 고정되고 안정된 pH값을 가져야 한다는 요구는, 비록 절대적으로 필요한 것은 아니라고 하더라도, 5 내지 10 mM, 바람직하게는 10 내지 20 mM의 버퍼 혼합물을 함유하는 적절하게 완충된 수용액을 사용하는데 매우 유용하다. 사용될 수 있는 용리액의 pH 값은 2와 11 사이이기 때문에, pH 2와 11 사이의 범위에서 완충력을 갖는 모든 화학 물질 또는 화학물질의 혼합물을 유리하게 사용할 수 있다.

다음의 것들을 포함하는 많은 수성 버퍼 용액을 본 발명을 수행하는데 유리하게 사용할 수 있다: 글리신 및 소듐 클로라이드, 말레산 및 소듐 하이드록사이드, 말론산 및 소듐 하이드록사이드, 락트산 및 소듐하이드록사이드, 포름산 및 소듐 또는 리튬 하이드록사이드, 숙신산 및 소듐 하이드록사이드, N-메틸피페리진 및 염산, 피페리진 및 염산 또는 아세트산, L-히스티딘 및 염산, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 및 소듐 또는 리튬 하이드록사이드, N-메틸디에탄올아민 및 황산, N-메틸디에탄올아민 및 염산 또는 아세트산, 피리딘 및 포름산, 이염기성(dibasic) 소듐 시트레이트 및 소듐 하이드록사이드, 일염기성(monobasic) 포타슘 프탈레이트 및 염산, 일염기성 포타슘 프탈레이트 및 소듐 하이드록사이드, 일염기성 포타슘 및 이염기성 소듐 포스페이트, 비신(bicine) 및 소듐 하이드록사이드, 소듐 바르비탈 및 염산, 소듐 보레이트 및 염산, 소듐 보레이트 및 소듐 하이드록사이드, 1,3-이아미노프로판 및 염산, 시트르산 및 이염기성 소듐 포스페이트, 소듐 아세테이트 및 아세트산, 이미다졸 및 염산, 트리에탄올아민 및 염산 또는 아세트산, 트리스(하이드록시메틸아미노메탄) 및 염산, 소듐 카르보네이트 및 소듐 산 카르보네이트, 에탄올아민 및 염산, 피페리딘 및 염산, 트리메틸아민 및 포름산, 피리딘 및 아세트산, 트리에틸아민 및 아세트산, 트리메틸아민 및 염산, 암모늄 하이드록사이드 및 포름산, 암모늄 하이드록사이드 및 아세트산, 트리메틸아민 및 소듐 카르보네이트, 암모늄 카르보네이트 및 암모늄 하이드록사이드.

특히, 재조합 알파 2b 인터페론(rIFNα-2b)의 경우에 있어서, 5.9와 6.1 사이를 포함하는 pH에서 완충력을 나타내는 모든 버퍼 용액을 사용할 수 있고, 일염기성 포타슘 포스페이트 및 이염기성 소듐 포스페이트, 일염기성 포타슘 프탈레이트 및 소듐 하이드록사이드, 이염기성 소듐 시트레이트 및 소듐 하이드록사이드, 시트르산 및 이염기성 소듐 포스페이트, 이미다졸 및 염산을 포함하는 5.9와 6.1 사이의 pH에서의 완충용액이 바람직하고, 인간 혈청 알부민을 정제하는 경우에 있어서는 동일한 화학적 화합물의 혼합물을 포함하고 4.9와 6.0 사이를 포함하는 pH에서 완충력을 보이는 버퍼 용액을 사용할 수 있다.

용리액으로 사용되는 수용액은 pH를 완충하기 위한 화악물질 외에 용액의 이온 세기를 변화시키는 역할을 갖는 화학 물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 예컨대, 카르복실레이트, 알킬술포네이트, 프탈레이트와 같은 유기염 또는, 예컨대, 소듐, 포타슘, 암모늄, 일차, 이차, 삼차 또는 방향족 아민으로 염화된 술페이트, 클로라이드, 포스페이트를 유리하게 사용할 수 있다.

이들 화합물을 1 mM 과 100 mM 사이의 값을 포함하는 농도, 바람직하게는 1 mM 및 30 mM 사의 농도로 사용할 수 있다.

예컨대, 재조합 알파 2b 인터페론(rIFNα-2b)의 경우에 있어서 이들 화합물의 농도는 1 mM 과 30 mM 사이에서 변화할 수 있으며, 바람직하게는 2 mM 및 20 mM 사이이다.

약리학적 활성 단백질의 용리액 전에, 적절한 pH와 이온 세기를 갖는 용리액으로 한 번 이상 세척함으로써, 컬럼의 pH를 항상 pI 보다 높게 하여, 정제 효율을 정가시킬 수 있다.

예컨대, pI가 4.9인 인간 혈청 알부민의 경우, 5.5와 5.8 사이를 포함하는pH의 버퍼 용액으로 세척할 수 있으며, pI가 5.9인 재조합 알파 2b 인터페론(rIFNα-2b)의 경우에는 6.0 내지 6.1 사이를 포함하는 pH의 버퍼 용액으로 세척할 수 있다.

이러한 세척 동안에 통과한 용리액의 양은 통상적으로 5 내지 100 컬럼 부피(column volumes, CV) 사이를 포함하는 범위에서 다양하다.

예컨대, 인간 혈청 알부민의 경우 수행되는 세척은 20 내지 40 CV 사이를 포함하며, 재조합 알파 2b 인터페론(rIFNα-2b)의 경우에는 10과 80 CV 사이이다.

컬럼 내에 들어갈 수 있는 정제될 생성물의 양은 사용되는 크로마토그래피 매트릭스에 따라 달라지고, 일반적으로, 5 내지 20 mg/ml를 포함하는 보다 적은 양이 사용된다고 하더라도, 고정상 1 밀리리터에 대하여 총 단백질 최대 100 밀리그램까지를 사용할 수 있다.

용리액은 고정상과 모순없는 10 cm/min와 동등한 최대값까지의 선속력으로 컬럼을 통과한다.

상기한 정제 방법은 모든 약리학적 활성 단백질에 적용 가능하다; 특히 알파, 베타, 감마, 델타, 오메가, 타우 인터페론, 백혈구로 부터 얻은 천연알파 인터페론, 재조합 알파 2b 및 콘센서스 인터페론과 관련있는 인터페론 단백질의 정제 및 천연적 기원 및 재조합 기원 모두의 인간 알부민과 관련있는 알부민의 정제가 본 발명의 수행에 있어서 바람직하다.

상기한 정제 방법의 범위는 약리학적 활성 단백질을 포함하는 특수 의약의 제조에 직접적으로 사용될 수 있을 정도의 순도의 약리학적 활성 단백질을 산업적및 경제적 방법으로 얻는 것이다.

특히, 본 발명의 범위 내서 바람직한 특수 의약은 인터페론, 보다 바람직하게는 재조합 알파 2b 인터페론(rIFNα-2b), 및 알부민, 보다 바람직하게는 천연적 기원 및 재조합적 기원 모두의 인간 알부민을 포함하는 것이다.

몇 몇 개의 본 발명의 방법 목적의 예시적인 실시예를 본 발명을 명확하게 하는 단독적 범위 내에서 본 명세서에 기재하였으나, 이들이 본 발명 자체를 어떠한 방법으로든 제한하는 것으로 고려하지는 않는다.

실시예 1

재조합 알파 2b 인터페론(rIFNα-2b)의 생산

대장균 BL21 DE3 균주 세포들 중 일부를, IFNα-2b의 인간 유전자 서열을 재생하는 합성 유전자를 클로닝하여 얻어지고, 대장균 내에서 보다 빈번하게 서열을 코돈에 맞추기 위하여 적합하게 변형된, 5 ng의 pET9a-IFNα-2b 플라스미드를 사용하여 pET9a 플라스미드(Novagen) 내로 형질전환 시켰다.

상기와 같이 변형된 대장균으로부터 발현되는 단백질 서열은 아카데미 출판사에서 출판된 Methods in Enzymology, Interferons, part C, editor Pestka S., 119, 3-14, (1986)에 기재된 것과 동일하다.

pET9a-IFNα-2b 플라스미드에 의하여 형질변형된 대장균 BL21 DE3 균주는 에컨대, 피토 펩토톤 12 g/l (Phyto peptoton, BBL), 효모 추출물 24 g/l(Yeast extract, DIFCO), 글리세롤 4 g/l(BDH) 및 네오마이신을 포함하는 용액과 같은 적절한 배지에서, 37 ℃에서, 600nm에서의 흡광도가 0.6 내지 0.8과 동등한 값에 도달하기에 충분한 시간, 일반적으로 7 내지 9시간 동안, 플라스크 내에서 배양하였다. 그리고 나서, 이와 같이 얻어진 배양물을 1 내지 100 희석하여 사용하여 전술한 플라스크의 것과 동일한 배양 배지가 포함된 5 1 발효기에 접종하였다.

균 세포를 배양 마지막에 1 분당 6000 회전(6000rpm)의 속도로 원심분리하여 수집하고, 이들을 원심분리된 균의 습윤 중량 1 그램에 대하여 6 ml를 넘지 않는 양으로 1 mM의 디티오트레이톨(DTT)를 포함하는 적절한 수용액 내에서 부유시킨다. 상기 균 부유물을, 예컨대, 초음파 또는 유압에 의한 파괴와 같이 통합되고 상술된 기술에 의하여 세포 용해시켰다.

생성된 부유물을 원심분리하여 회수하고, 고형 부분을 DTT 1 mM를 함유하는 살린 용액 50 ml에 부유시키고 다시 원심분리하였다.

고형 성분, 바디를 포함하는 성분을 모으고, 실온에서 격렬하게 교반하여 6M의 구아니디늄 클로라이드, pH 8인 50 mM의 트리스-HCl 및 0.1 mM의 EDTA를 함유하는 용액 450 ml 내로 부유시켰다. 부유물을 원심분리 시키고, 상청액을 단백질의 원상 회복(renaturation)에 적합한 pH 8인 50 mM의 트리스-HCl 및 pH 8인 0.1 mM의 EDTA를 함유하는 살린 용액 내에서 1:100 내지 1:200의 비율로 희석하였다. 상기 원상 회복을 위한 용액은, 예컨대, 글리신 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 예컨대, 글루타티온, 에탄올아민, 시스테인과 같이 형성된 다이 설파이드 브릿지를 갖는 산화 및 환원 형태의 설파이드를 함유하는 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다. 원상 회복은 4 ℃에서 거의 72 시간 동안 용액을 격렬하게 교반하여 수행하고, 그리고 나서, 상기 용액을 여과시키고, pH 8인 40 mM의 트리스-HCl에 의하여 만들어진 버퍼에 대한 dia-filtration법에 의하여 최종 농도 팩터가 5 내지 10배가 될 때까지 농축시킨다. 용액의 최종 농도는 일반적으로 0.4 와 1.0 mg/ml 사이를 포함한다.

실시예 2

재조합 알파 2b 인터페론(rIFNα-2b)의 정제

1 M 소듐 아세테이트 용액을 최종 농도가 20 mM가 될 때까지 실시예 1로부터 얻어진 rIFNα-2b를 포함하는 혼합물에 첨가하였고, 아세트산으로 이 혼합물의 pH를 5.5로 맞추었다. 이와 같이 얻은 용액을 상업적으로 입수가능한 크로마토그래피 매트릭스 MustangS(Pall Corporate)을 포함하는 강력 양이온 교환 컬럼 상에서 대전시켰다.

상기 양이온 교환 컬럼을, 단백질 용액의 대전 전에, 20 컬럼 부피(CV)와 동등한 양의 pH 5.5인 20 mM 소듐 아세테이트에 의하여 조절하였다.

그리고 나서, 상기 단백질 용액을 고정상 1 밀리리터에 대하여 대전된 단백질이 10 mg를 넘지 않는 양으로, 바람직하게는 6 내지 8 mg/ml의 양으로 대전시킨다.

대전 후, 고정상에 결합된 생성물에 대하여 5와 15 mM 사이를 포함하는 전체 농도의 일염기성 포타슘 포스페이트와 이염기성 소듐 포스페이트의 혼합물에 의하여 만들어진 pH 6.1의 살린용액으로 세척하는 첫 번째 사이클을 수행한다. 용액의 최적 농도는 전도성이 약 1800 μS를 넘지 않는다는 사실에 의하여 정해진다. 용액의 총량이 5와 60 CV 사이를 포함하고, 바람직하게는 25와 35 CV 사이이다.

그리고 나서, 첫 번째 세척 사이클과 동일한 용액으로 두 번째 세척 사이클을 수행하는데, 여기에 첨가되는 포타슘 클로라이드의 양은 최종 농도가 3 mM을 넘지 않는, 바람직하게는 2 mM을 넘지 않는 것과 동일한 양이며, 용액의 총량은 10과 100 CV 사이를 포함하고, 바람직하게는 30과 60 CV 사이이다.

세척 사이클 후, 최종 농도가 10 mM보다 낮지 않은, 바람직하게는 15와 25 mM 사이를 포함하는 농도의 포타슘 클로라이드 최종량을 함유하는 첫 번째 사이클과 같은 용액을 사용함으로써 용리 단계를 수행한다. 용리를 위하여 전체 용액 양을 15와 40 CV 사이를 포함하여, 바람직하게는 20과 30 CV 사이를 포함하여 사용하였다.

모든 대전된 샘플과 용액은 0.1과 1 cm/min 사이를 포함하는, 보다 바람직하게는 0.4와 0.7 cm/min 사이를 포함하는 선속력으로 컬럼을 통과한다.

이러한 조건하에서, 98% 이상의 순도를 갖는 rIFNα-2b를 컬럼으로부터 용리시켰으며, 시발 용액내에서 순도는 약 40%였으며 원하는 산물의 회수율은 80% 이상이었다.

크로마토그래피 정제 전후의 크로마토그래피 프로필을 도 1a 및 1b에 나타내었다.

도 1a는 정제 전의 인터페론 용액의 크로마토그래피 프로필이고 도 1b는 정제후의 크로마토그래피 프로필이다. 크로마토그래피 프로필은 Vydac C18 컬럼 및 214 nm에서의 UV 탐지기를 사용하여 액체 크로마토그래프 HP 1090에 의하는 HPLC 내에서 수행하였다. 물 700 ml, 아세토니트릴 298 ml 및 트리플로오로아세트산 2ml로 만들어진 용리액 A 및 물 198 ml, 아세토니트릴 800 ml 및 트리플로오로아세트산 2ml로 만들어진 용리액 B의 두 가지 용리액의 혼합물을 이용하여 1 ml/min 흐름에서 용리를 수행하였다. 상기 두 용리액은 다음의 표에 따라서 용리동안 혼합되었다.

시간 (분)	% A	% B
0	72	28
1	72	28
5	67	33
20	63	37
30	57	43
40	40	60
42	40	60
50	28	72
60	72	28

실시예 3

일염기성 포타슘 프탈레이트 및 소듐 하이드록사이드로 구성된 버퍼 용액을 사용하여 실시예 2에 기재된 바에 따라서 공정을 수행하였다.

실시예 4

이염기성 소듐 시트레이트 및 소듐 하이드록사이드로 구성된 버퍼 용액을 사용하여 실시예 2에 기재된 바에 따라서 공정을 수행하였다.

실시예 5

시트르산 및 이염기성 소듐 포스페이트로 구성된 버퍼 용액을 사용하여 실시예 2에 기재된 바에 따라서 공정을 수행하였다.

실시예 6

이미다졸 및 염산으로 구성된 버퍼 용액을 사용하여 실시예 2에 기재된 바에 따라서 공정을 수행하였다.

실시예 7

인간 혈청 알부민의 정제

인간 혈청 알부민(HSA)을 시그마(2000년도 카탈로그 번호 A1653)에서 구입하였다. 이 알부민의 명목상의 순도는 99.6으로 표시되어 있지만, 알부민-유사 산물을 불순물로 본다면 RP-HPLC 분석 따른 실제 순도는 88%이다. HSA를 최종 농도 1 mg/ml, pH 3의 20 mM 시트르산 용액에서 제조하였으며, 상업적으로 구입가능한 크로마토그래피 메트릭스 MustangS(Pall Corporation)를 포함하는 강력 양이온 교환 컬럼 상에서 대전시켰다. 양이온 교환 컬럼을 대전시키기 전에 pH 3인 20 mM 시트르산 용액을 20 컬럼 부피(CV)의 양으로 사용하여 조절하였다.

대전된 용액의 양은 고정상 1 밀리리터에 대하여 대전된 단백질 값이 10 mg를 넘지 않는 값이며, 바람직하게는 6 내지 8 mg/ml 사이를 포함하는 양이다.

대전 후, 고정상에 결합된 생성물에 대하여 다음과 같은 세척 사이클을 수행하였다:

1. pH 5.5의 소듐 아세테이트 용액 20 mM을 사용하는 세척 사이클 - 40 CV

2. pH 5.8의 소듐 아세테이트 용액 20 mM을 사용하는 세척 사이클 - 30 CV.

일염기성 포타슘 포스페이트 및 이염기성 소듐 포스페이트의 혼합물을 혼합물 조성에 따라 5 내지 100 mM 사이의 농도로 사용하여 만든 pH 6.0의 살린 용액을 이용하여 컬럼으로부터 원하는 산물의 용리를 수행하였다. 그러나, 용액의 전도성은 140 μS를 넘지 않았다. 용액의 총량은 25 내지 35 CV 사이 값으로 사용되었다.

모든 용액과 대전된 샘플은 0.1 내지 1 cm/min 사이, 바람직하게는 0.4 내지 0.7 사이의 선속력으로 컬럼을 통과하였다.

이와 같은 조건 하에서, HSA가 99 % 이상의 56 % 이상의 순도와 원하는 산물의 회수율로 컬럼으로부터 용리되었다.

도 2a 및 도 2b는 정제 전후의 HPLC 크로마토그래피 프로필을 나타낸 것이다. 상기 분석은 0.1 % 트리플루오로아세트산 950 ml와 아세토니트릴 50 ml로 구성된 용리액 A 및 아세토니트릴 950 ml와 0.1 % 트리플루오로아세트산 50 ml로 구성된 용리액 B의 두 가지 용리액의 혼합물을 사용하여 도 1a 및 1b와 동일한 방법으로 수행하였다. 용리액 A 및 B의 선형 농도구배를 용리액 B의 비율이 20%로 시작하여 20분 후에 60%에 도달하도록 하여1 ml/min 흐름으로 용리를 수행하였다.

본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 약리학적 활성 단백질을 높은 순도로 정제하는 방법은, 특수 의약품 제조에 직접 쓰일 수 있는 고순도의 약리적 활성 단백질을 제공함으로써, 약품 제조 비용을 절감시키고 공정의 단순화를 꾀할 수 있다.

Claims

정제될 단백질이 계속 흡수된 상태로 남아있으면서, 정제될 단백질의 pI에 대응하는 pH 보다 염기성인 pH에서 고체 매트릭스상의 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하고, 용리액의 이온세기 및/또는 pH를 증가시킴으로써 상기 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 약리학적 활성 단백질의 정제 방법.
제 1 항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피에 상용되는 용리액이 2 내지 11 사이를 포함하는 pH의 버퍼 수용액으로 만들어진 것인 방법.
제 2 항에 있어서, 버퍼 수용액의 pH가 4 내지 8.5 사이를 포함하는 방법.
제 2 항 또는 3 항에 있어서, 버퍼 수용액이 다음의 완충 혼합물을 5 내지 100 mM 함유하는 방법:

일염기성 포타슘 포스페이트 및 이염기성 소듐 포스페이트, 일염기성 포타슘 프탈레이트 및 소듐 하이드록사이드, 이염기성 소듐 시트레이트 및 소듐 하이드록사이드, 시트르산 및 이염기성 소듐 포스페이트, 이미다졸 및 염산.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 버퍼 용액이 용액의 이온세기를 변화시키는데 적합한 1 내지 100 mM의 유기염 또는 무기염을 포함할 수 있는방법.
제 1 항에 있어서, 상기 약리학적 활성 단백질이 인터페론 및 알부민 단백질인 방법.
제 6 항에 있어서, 인터페론 단백질이 알파, 베타, 감마, 델타, 오메가, 타우, 백혈구로부터 얻은 천연 알파, 재조합 알파-2b 및 콘센서스 인터페론이고, 알부민 단백질이 천연 및 재조합 인간 알부민인 방법.
20 mM의 소듐 아세테이트 용액으로 pH 5.5로 조절되어 고정상 1 ml당 6 내지 8 mg의 단백질이 존재하는 강력 양이온 교환 수지로 충전된 컬럼 상에서, 1 M 소듐 아세테이트가 첨가되고 아세트산으로 pH를 5.5로 맞춘 재조합 알파-2b 인터페론(rIFNα-2b)을 발효시켜 제조한 단백질 혼합물을 대전시키고, 컬럼을 두 번의 세척 사이클, 즉, 5 내지 15 mM 농도의 pH 6.1의 완충 용액으로 첫 번째 세척하고 난 후, 2 mM 포타슘 클로라이트이 첨가된 첫 번째와 동일한 완충용액을 사용하여 세척하고, 마지막으로 15 내지 25 mM 농도의 포타슘 클로라이드를 함유하는 pH 6.1인 5 내지 15 mM 농도의 버퍼 용액을 사용하여 컬럼으로부터 순수한 rIFNα-2b을 용리시키는 단계를 포함하는 재조합 알파-2b 인터페론의 정제방법.
제 8 항에 있어서, 사용된 수지가 MustangS이고 버퍼 혼합물이 일염기성포타슘 포스페이트 및 이염기성 소듐 포스페이트, 일염기성 포타슘 프탈레이트 및 소듐 하이드록사이드, 이염기성 소듐 시트레이트 및 소듐 하이드록사이드, 시트르산 및 이염기성 소듐 포스페이트, 이미다졸 및 염산 중에서 선택되는 방법.
20 mM의 시트르산 용액으로 pH 3으로 조절되어 고정상 1 ml당 6 내지 8 mg의 단백질이 존재하는 강력 양이온 교환 수지로 충전된 컬럼 상에서, 시트르산으로 pH를 3으로 맞춘 인간 혈청 알부민을 함유하는 용액을 대전시키고, 컬럼을 5 내지 15 mM 농도의 pH 6.1의 완충 용액으로 첫 번째 세척하고 난 후, 20 mM 소듐 아세테이트를사용하여 연속적으로 pH 값을 5.5 및 5.8로 맞추는 두 번의 세척 사이클을 수행하고 난 후, 5 내지 100 mM 농도의 일염기성 포타슘 포스페이트 및 이염기성 소듐 포스페이트의 혼합물로 만들어진 pH 6.1의 버퍼 용액을 사용하여 컬럼으로부터 순수한 인간 혈청 알부민을 용리시키는 단계를 포함하는 인간 혈청 알부민의 정제방법.
약리학적 활성 단백질 기재의 특수 의약에 함유된 활성 주성분의 제조에 사용되는 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
제 11 항에 있어서, 활성 주성분이 인터페론 단백질인 용도.
제 12 항에 있어서, 인터페론 단백질이 재조합 알파-2b 인터페론인 용도.
제 11 항에 있어서, 활성 주성분이 알부민 단백질인 용도.
제 14 항에 있어서, 알부민 단백질이 천연 또는 재조합 인간 혈청 알부민인 용도.