DK175251B1 - Renfremstilling af erythropoietin - Google Patents

Description

i DK 175251 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til effektiv udvinding af erythropoietin fra en væske (f. eks. blod-, fraktioner og urin) og rekombinante kilder (f.eks. væske fra genetisk transformerede pattedyrcellekulturer).

5 Adskillige fremgangsmåder er tidligere blevet an vendt til præparativ adskillelse af biologisk vigtige materialer. Almindeligt anvendte præparative adskillelsesfremgangsmåder inkluderer: ultrafiltrering, søjle- elektrofokusering, flat-bed elektrofokusering, gelfil-trering, elektroforese, isotachoforese og forskellige former for chromatografi. Mellem de almindeligt anvendte chromatografiske fremgangsmåder er ionbytterchromatogra-fi og adsorptionschromatografi. Den førstnævnte proces er en adskillelsesmetode, hvori væskekoraponenter med forskellige nettoladninger adskilles og isoleres ved 15 hjælp af eluering (trinvis eller med en kontinuert gradient) med eluenter af forskellig ionstyrke. En gelma-trix (harpiks) med enten en positiv eller en negativ ladning benyttes til at adsorbere (binde) komponenter af modsat nettoladning. Under desorption (eluering) ud-20 veksles ladede komponenter fra prøven med saltioner i den udvalgte eluent, idet specifikke komponenter fra prøven elueres ved specifikke ionstyrker. Revers-fase adsorptionschromatografi involverer adskillelse af komponenter i en væskeformig prøve baseret på deres fors-25 kellige polaritet. Komponenter for prøven adsorberes på en granuleret gelmatrix (harpiks) ved ikke kovalent binding. Derefter vil en trinvis eller kontinuert gra- dienteluering føre til selektiv desorption af komponenter ved udbytning med et ikke polært opløsningsmiddel i 30 eluenten.

Mens de mange adskillelsesfremgangsmåder nævnt ovenfor anvendes rutinemæssigt ved adskillelse af terame-liq små hydrofobe og hydrofile molekyler, har de en no-

I DK 175251 B1 I

I 2 I

I get begrænset anvendelighed ved præparativ adskillelse I

I af temmelig store molekyler, såsom proteiner, især kom- I

I plekse proteiner såsom lipoproteiner, nueleoproteiner og I

I glycoproteiner. Eksempler på teknikkens stade i protei- I

I 5 nadskillelse er oversigter af Brown, et al., Analytical I

Biochemistry, 99, 1-21 (1979) og Rubinstein, Analytical I

I Biochemistry, 99, 1-7 (1979). Se også "VYDAC Comprehen- I

I sive Guide to Reverse Phase Materials for HPLC", The I

I Sep/A/Ra/Tions Groups, Hesperia, CA. og publikationen af I

^ en af ansøgerne Strickland og medarbejdere i Parsons, et I

I al.. Endocrinology, 114, (6), 2223-2227 (1984). I det I

I omfang, at man f.eks. har foreslået eller anvendt om- I

I vendt-fase HPLC fremgangsmåder ved isolering af protein- I

I er eller polypeptider har de almindeligt anbefalede ikke I

I polære opløsningsmidler omfattet reagenser, der er svære I

I 15 I

at have med at gøre eller svære at skille fra det øn- I

I skede protein, såsom acetonitril. Se Parsons, et al., I

I ovenfor. Der kendes kun en enkelt reference, hvor man I

I omtaler eluering med ethanol, nemlig blandinger af van- I

I dig ethanol og myresyre. Se Takagaki, et al. Journal of I

I 20 Biological Chemistry, 5, (4), 1536-1541 (1980). I

I Den Øjensynligt begrænsede nytte af de ovenfor I

I nævnte fremgangsmåder ved præparerende adskillelse af I

I højmolekylære komplekse proteiner er især problematisk i I

I lyset af den anstrengelse man nu gør sig i form af iso- I

I lering, rensning og anvendelse til terapeutiske immuno- I

I profylaktiske og diagnostiske procedurer af en bred I

I mængde komplekse virale og eukaryotiske proteiner, som I

I kun er tilgængelige i meget små mængder fra naturlige I

I kilder, hvor de findes sammen med utallige andre kom- I

I plekse proteiner. P. eks. er biokemisk betydningsfulde I

I 30 hæmatopoietiske faktorer hos pattedyr, såsom erythro- I

I poietin, thrombopoietin, granulopoietin og granulocytma- I

I crophag kolonistimulerende faktor kun tilgængelige i I

3 DK 175251 B1 overordentlig små mængder fra urin fra patienter med aplastisk anæmi. Fremgangsmåder til udvindelse fra urin-væskekilder har almindeligvis været meget indviklede, kostbare og krævet meget arbejdskraft foruden at de gi-5 ver temmelig lavt udbytte af det aktive produkt. En meget anvendt fremgangsmåde til at opnå biologisk aktive præparationer af urin-erythropoietin (et højmolekylært glycoprotein med højt indhold af sialsyre) kan findes hos Miyake, et al.. Journal of Biological Chemistry, 252 (15), 5558-5564 (1977). Syv-trins fremgangsmåden omfatter ionbytterchromatografi, ethanoludfældning, gelfiltrering og adsorbtionschromatografi og det meldes, at man opnår et 21%'s udbytte af glycoprotein med 70.400 eriheder/mg styrke.

Den store anvendelse af rekombinante metoder ved 1 5 fremstilling i større skala af eukaryotiske proteiner har i væsentlig grad forstærket muligheden for at opnå de ønskede molekyler i større mængder, og også i vis grad simplificeret den nødvendige rensning for at opnå biologisk aktivt materiale. Som en illustration kan 20 nævnes, at i tilfælde af, at det ønskede rekombinante protein ikke behøver at glycosyleres for at besidde biologisk aktivitet, kan store mængder af protein ofte fremstilles i E. coli rekombinante værter på form af uopløselige "inklusionsområder", som indeholder få pro-25 teinagtige kontaminanter, proteaser eller lignende. Når det er nødvendigt at glycosylere og/eller behandle værtsmembranen for at indføre en passende sekundær og tertiær konformation af hensyn til biologiske aktivitet, er imidlertid eukaryotiske værter såsom gær og pattedyrceller i kultur (f.eks. COS-1 og CHO celler) mere egnede 30 rekombinante værter. Anvendelse af sådanne værter fører imidlertid i almindelighed til større besvær i forbindelse med udvinding af biologisk aktive former for pro-

I DK 175251 B1 I

I 4 I

I teinerne i godt udbytte. Lysater fra værtscellerne om- I

I fatter ofte proteinagtigt indhold af tilstrækkelig I

I lignende molekylvægt, ladning, polaritet og opløselig- I

I hedskarakteristika (i forhold til det rekombinante I

I 5 protein), så en ordentlig adskillelse bliver vanskelig. I

I Proteolytiske enzymer, der findes i værtsorganismen, er I

I en temmelig kronisk kilde for tab af biologisk aktivitet I

I i det ønskede protein. Når rekombinante produkter ud- I

I skilles i supernatanter fra værtscellerne, er der lig- I

I nende problemer ved isolering fra f.eks. kulturmedier, I

I hvor man dyrker de transformerede pattedyrcellekulturer, I

I især på grund af kompleksiteten af de anvendte medier. I

I Der er derfor stadig brug for hurtige og effek- I

I tive præparative adskillelsesfremgangsmåder, der er I

I egnede til udvinding af biologiske aktive proteiner fra I

I 15 væskeformige kilder, og især til udvinding af komplekse I

I rekombinante proteiner såsom rekombinant erythropoietin I

I fra forskellige "kontaminerede" væsker såsom superna- I

I tanter fra pattedyrcellekulturer. I

I Indholdet af WO 85/02610, som er offentliggjort I

I 20 20.juni 1985, viser teknikkens stade med hensyn til re- I

I kombinante fremgangsmåder til fremstilling i stor skala I

I af pattedyrserythropoietin. I

I U.S. patent nr. 4,397,840 beskriver en fremgangs- I

I måde til fjernelse af inhibitorisk aktivitet fra et råt I

I 25 erythropoietin-præparat i det væsentlige uden indhold af I

I urinstof, under anvendelse af DEAE. Imidlertid kræver I

I den beskrevne fremgangsmåde ikke selektiv eluering af I

I bundet kontaminerende materiale med en vandig syre ved I

I pH ca. 4,0 til 6,0. I

I 30 Ved den herværende opfindelse gennemføres et så- I

I dant trin til fjernelse af kontaminerende materiale med I

I andre ladningsegenskaber end hos det ønskede EPO, og I

I dette trin kræver i sig selv en beskyttende behandling I

5 DK 175251 B1 {med urinstof) til fuld udnyttelse af fordelene ved opfindelsen.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav l's kendetegnen-5 de del anførte; og foretrukne udførelsesformer kan ses i underkravene.

Opfindelsen udnytter chromatografiske adskillelsesfremgangsmåder, der hver for sig og samlet er egnede til isolering af erythropoietin, især rekombinant eryth-10 ropoietin på biologisk aktiv form fra væsker, især supernatant er fra kulturer af pattedyrsværtsceller.

I en af sine udførelsesformer tilvejebringer opfindelsen en hurtig og effektiv udvinding af erythropoietin fra en væske ved hjælp af omvendt-fase væske-15 chromatografisk adskillelse/ der omfatter selektiv binding af den ønskede forbindelse til en C4 eller Cg harpiks, fulgt af eluering med vandig ca. 50-80% ethanolop-løsning ved et pH i området ca. 4,5 - 8,0. Ved en meget foretrukket udførelsesform i denne forbindelse opnår man store udbytter af biologisk aktiv rekombinant erythro- 20 poietin fra supernatanten fra pattedyrsværtscellekulturer ved anvendelse af en C4 harpiks og eluering ved en pH-værdi på 7,6, idet man trinvis eller med en kontinuert gradient benytter en eluent, der indeholder ca. 60% vandig ethanol. Supernatanter fra kulturer foretrækkes 25 indkoncentreret før den chromatograf i ske behandling, og man tager passende trin til at fjerne ethanol fra de indsamlede eluentfraktioner, der indeholder erythropoietin. Den ovenfor nævnte sinple og elegante adskillelses-fremgangsmåde tillader på reproducerbar måde isolering 30 af erythropoietin med høj specifik aktivitet i udbytter på op mod 50% eller mere.

I en anden udførelsesform tilvejebringer opfindelsen hurtig og effektiv udvinding af erythropoietin

I DK 175251 B1 I

i 6 I

I fra en væske ved hjælp af anionbytterchromatografi, der I

I involverer selektiv binding af erythropoietin til en I

I udvalgt kationharpiks, behandling af bundet materiale I

I til beskyttelse mod sur aktivering af tilstedeværende I

I 5 proteaser, selektiv eluering af bundet materiale med - I

I pKa-værdier større end for erythropoietin med vandig I

I syre i pH-området 4,0-6,0, og derefter eluering med en I

I vandig saltopløsning ved en pH-værdi på ca. 7,0. Ery- I

I thropoietinholdige eluentfraktioner er beriget med hen- I

I syn til biologisk aktivt materiale, men kan eventuelt I

I yderligere behandles, f.eks. ved hjælp af gelfiltrering, I

I når ethanolen er fjernet. Ved en i øjeblikket meget fo- I

I retrukken variant af denne udførelsesform udvinder man I

I høje udbytter af biologisk aktivt rekombinant erythro- I

I poietin fra supernatanter fra pattedyrsværtscellekul- I

I 15 turer ved anionbytterchromatografi under anvendelse af I

I DEAE agaroseharpiks. Nar væsken er påsat DEAE søjlen, I

I tilsætter man urinstof for at beskytte mod en senere sy- I

I reaktivering af tilstedeværende proteaser, og man elue- I

I rer bundne væskeformige komponenter med pKa-værdier I

2 0 større end for erythropoietin med vask med vandig syre I

ved pH-værdi på ca. 4,3. Derefter tilpasser man pH til I

I ca. 7,0 og tilsætter trinvis eller over en kontinuert I

I gradient en vandig saltopløsning med formål selektivt at I

I eluere biologisk aktiv erythropoietin. I

I I en yderligere udførelsesform tilvejebringer op- I

I findelsen en fremgangsmåde til udvinding af erythropoie- I

I tin, hvorved man i rækkefølge benytter ionbytterfrem- I

I gangsmåden og revers-fase væskechromatografifremgangsmå- I

I den, som er beskrevet ovenfor. Mere detaljeret udvinder

I man erythropoietin (især rekombinant erythropoietin) fra I

I en væske (såsom supernatanten fra en værtscellekultur af pattedyrceller) ved følgende trinvise fremgangsmåde.

I Portioner af supernatant fra kulturer (foretrukken fore- 7 DK 175251 B1 løbig diafiltreret og indkoncentreret) påsættes en ion-byttersøjle ved en pH-værdi på ca. 7,0 og erythropoietin binder selektivt til kationharpiksen (foretrukken DEAE agarose). Bundet materiale stabiliseres mod nedbrydning 5 forårsaget af syreaktiveret protease (foretrukken ved tilsætning af urinstof) og bundet materiale med pKa-vær-dier større end for erythropoietin elueres ved vask én eller flere gange med vandig syre ved pH-værdier fra ca. 4,0-6,0 (foretrukken ca. pH 4,3).

Derefter elueres biologisk aktivt erythropoietin med en vandig saltopløsning ved en pH-værdi på ca. 7,0.

De erythropoietinholdige eluentfraktioner underkastes derefter revers-fase væskechromatografi på en Cg eller foretrukken C4 harpiks med formål selektivt at binde erythropoietin. Bundet biologisk aktivt erythropoietin 15 elueres derefter ved et pH i området ca. 4,5 — 8,0 (foretrukken ca. pH 7,0) med en vandig 50-80% (foretrukken ca. 60%) ethanolopløsning. Det ønskede erythropoietin isoleres fra erythropoietinholdige eluentfraktioner (som bestemt ved absorbans ved 280 nm). Man kan derefter 20 fjerne ethanol og eventuelt underkaste produktet gelfiltrering (f.eks. ved brug af en Sephacryl S-200 søjle) og under fremkaldelse benytte f.eks. en puffer med farmaceutisk formulering såsom en 20 mM natriumcitrat/100 mM natriumchlorid, pH 6,8-7,0.

25 Andre detaljer og fordele ved opfindelsen vil ses af den følgende detaljerede beskrivelse af de foretrukne udførelsesforroer.

Udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen anses for at være passende illustreret ved følgende eksempler, hvorved der benyttes sammenbragte CHO cellesu-30 pernatanter, fremstillet som beskrevet i eksempel 10 i det ovennævnte skrift W0 85/02619. Mere detaljeret tilvejebragte man de behandlede supernatanter fra

I DK 175251 B1 I

I 8 I

I cellestammen CHO pDSVL-gHuEPO "forstærket" ved hjælp af I

I MTX og dyrket i rullende flasker i serumfrit medium, som I

I beskrevet på side 62 i denne ansøgning. Eksempel 1 angår I

I i almindelighed udvinding af biologisk aktiv rekombinant I

I 5 human erythropoietin ved hjælp af revers-fase væskechro- I

matografi. Eksempel 2 angår en sammensat udvindingsfrem- I

I gangsmåde benyttet på samme supernatantmateriale. Eksem- I

I pel 3 angår RIA og in vivo assays udført på det resulte- I

I rende rensede materiale. I

I 10 Eksenqpel 1 I

I Ikke indkoncentreret supernatant fra kulturer I

I tilvejebragt ved sammenbringning af supernatanter fra I

I første og anden (7 dages) vækstcyklus blev påsat en I

I lukket (højtryksudførelse) søjle, pakket i laboratoriet I

I med C4 matrix (VYDAC 214TP-B). Man benyttede en 0,45 x I

I 10 mm søjle med et flow på 1 ml/min. Efter påsætning af I

I prøven eluerede man biologisk aktivt rekombinant ery- I

I thropoientin med en lineær gradient fra 10 mM Tris, pH I

I 7,0 til 80% Et0H/10 mM Tris, pH 7,0. Koncentrationen af I

I protein blev UV-UV-kontrolleret ved 230 nm og man sam- I

I 20 I

lede fraktionerne fra eluent med ca. 60% EtOH. I

m Eksempel 2 I

I Den kombinerede udvindingsfremgangsmåde i dette I

I eksempel bestod i udførelse i rækkefølge af ionbytter og I

I 25 revers-fase chroma tografifremgangsmåderne udført på en I

I større portion supernatant end i eksempel 1. Før udfø- I

I reisen af den chromatografiske procedure udførte man I

I indkoncentrering og diafiltrering og man sluttede med I

I gelfiltrering. I

I 30 I

I 1· Indkoncentrering og diafiltrering I

I Supernatanter fra første og anden (7 dages) I

u vækst cyklus blev indkoncentreret hver for sig 30 gange I

I ved hjælp af Pellicon ultrafiltreringsudstyr (Millipore, I

9 DK 175251 B1

Bedford, Mass.) med afskæring ved MW 10.000. De indkon-centrerede medier fra første og anden vækstcyklus blev sammenbragt og diafiltreret på Pellicon udstyret over for 10 tnM Tris ved pH 7,0. (Det diafiltrerede medium kan 5 eventuelt gøres 20 μΜ med hensyn til CUSO4 før ionbytter chromatograf i) . Det bør bemærkes, at et hvilket som helst ultrafiltreringsudstyr med afskæring ved MW 10.000 eller MW 30.000 kan anvendes -og at diafiltreringen kan foregå imod en hvilken som helst passende puffer med lav ionstyrke ved en pH på ca. 6,0-8,5.

10 2. Ionbytterchromatografi

Det indkoncentrerede, diafiltrerede medium fra trin 1 blev pumpet over på en DEAE agarosesøjle med relativ lav tæthed (Bio-Rad, Richmond, CA.). Man vaskede 15 derefter søjlen med ca. fire rumfang 5 mM eddikesy-re/l mMglycin/6M urinstof ved pH ca. 4,5. Man kan eventuelt lade vaskevæsken indeholde 20 μΜ CUSO4 til hjælp ved oxidering af sulfhydrylgrupper på uønsket protein. Glycin blev tilsat, så det kunne reagere med eventuel 2Q tilstedeværende cyanat. Urinstof skal stabilisere mod syreaktivering af proteaser ved lav pH og ophjælpe proteinernes solubilisering. Efter vasketrinnene, hvorved bundet materiale med større pKa-værdier end erythropoietin bliver bortelueret, vaskede man søjlen med 25 mM

NaCl/10 mM Tris ved ca. pH 7,0 for at genoprette neutral 25 pH og fjerne urinstof. Man eluerede biologisk aktivt » erythropoietin med 75 mM NaCl/10 mM Tris ved pH 7,0.

CUSO4 (20 μΜ) kan eventuelt tilføjes både i det neutraliserende vasketrin og/eller i elueringstrinnet. 1 3. Revers-fase chromatografi

Man anvendte i det væsentlig samme fremgangsmåde som i eksempel 1 med den undtagelse, at man benyttede en åben lavtrykssøjle. I tilfælde af anvendelse af kobber-

I DK 175251 B1 I

I I

I sulfat i pufferne i ovennævnte trin 2 gjorde man ery- I

I thropoietinfraktionen i mM i EDTA før den blev påført re- I

I vers-fasesøjlen med formål at lette fjernelsen af kob- I

ber. Når erythropoietin "toppen” i gradientfraktioner I

I 5 med ca. 60% er blevet identificeret foretrækkes det at I

fortynde den eller de samlede fraktion(er) fem gange med I

f .eks. 10 mM TRIS ved pH 7,0 for at reducere koncentra- I

tion af ethanol og lette fjernelsen af ethanol. Man I

fjernede ethanol ved at binde erythropoietin til en DEAE I

I 10 °9 e^uere me^ en lili® mængde puffer (20 mM natri- umcitrat/100 mM natriumchlorid).

I 4. Gelfiltrering I Produktet fra trin 3, fra hvilket ethanol var blevet fjernet, blev påført en Sephacryl S-200 søjle I I5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Søjlen blev fremkaldt ved hjælp af en farmaceutisk formuleringspuffer, bestående

I af 20 mM natriumcitrat/100 mM natriumchlorid ved pH

I 6,8-7,0.

I 20 Eksempel 3

Man udførte radioimmunassay og in vivo bioassay fremgangsmåder som beskrevet i det ovennævnte skrift wo 85/02619 · på det rekombinante erythropoie- tin udvundet ved fremgangsmåderne ifølge eksempel 1 og 25 2' De eksperimentelle data angav udbytter på henholdsvis 52 og 16% for produkterne fra eksempel 1 og 2, med for- I hold mellem in vivo og RIA aktivitet på 1,02 og 1,3.

Gentagelser af fremgangsmåden i eksempel 2 på superna- tanter fra andre cellekulturer har givet udbytter på I ca. 30-50%.

I 30 Renheden af erythropoietin efter den trinvise I rensning ifølge opfindelsen er i det mindste ca. 95% og I almindeligvis større end ca. 98%. Man bestemte renheden I af det rekombinante erythropoietin ved ikke-reducerende I SDS-PAGE analyse, reducerende SDS-PAGE analyse og høj- 11 DK 175251 B1 tryksvæskechromatografisk gelfiltrering. De meget rene kompositioner ifølge opfindelsen indeholder mindre end 0,5% genetisk hamsterovarieceller (CHO) og bovine serum-' proteiner som bestemt ved en ELISA analyse. Det rekom- 5 binante erythropoietin renset ifølge opfindelsen har en betydelig større specifik aktivitet end erythropoietin tidligere tilvejebragt ved hjælp af andre rensningsfremgangsmåder. Derudover indeholder den rensede rekombi-nante erythropoietinkomposition ifølge opfindelsen min-^ dre end 2,5 EU/ml pyrogener, som bestemt ved limulus amoebocyt assay. Ydermere indeholder de rensede kompositioner ifølge opfindelsen mindre end 10 pg DNA/lO.OOO enheder DNA kontaminering som malt ved dot blot analyser.

Højrensede rekombinante erythropoietinkompositio-ner er farmaceutisk acceptable kompositioner, hvorfra uønskede proteiner er fjernet. Fjernelse af uønsket protein fra rekorabinant erythropoietin ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebringer en renset komposition, som ved anvendelse ved behandling af mennesker 20 fører til mindre immunologiske ulemper, dvs. anafylakse. Derudover kan fjernelsen af uønskede proteiner forøge stabiliteten af den rekombinante erythropoietinkomposition, idet den forhindrer nedbrydning af rekombinant e-rythropoietin af kontaminerende hydrolytiske enzymer.

De ovenstående illustrerende eksempler har beskrevet fremgangsmåder ifølge opfindelsen, som de udføres ved udvinding af erythropoietin fra kilder af pattedyr cel lekulturer, men vi anser, at fremgangsmåderne er egnede til udvinding fra andre kulturvæsker, såsom en kombination af pattedyrcellelysat/supernatant og tilsva-rende væsker fra kulturer af gærceller. På lignende måde venter vi, at de enkelte og sammensatte fremgangsmåder (og især de ionbytterchromatografiske fremgangsmåder), kan være nyttige ved udvinding af erythropoietin fra naturlige kilder, såsom urin.

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til effektiv udvinding af ery- I I thropoietin fra en væske, kendetegnet ved, I I at man i rækkefølge I I 5 (a) underkaster væsken en ionbytterchromatografisk ad- · I I skillelse ved en pH-værdi på ca. 7,0 til selektiv bin- I I ding af erythropoietin fra væsken til en kationhar- I I piks; I I (b) stabiliserer til harpiksen bundet materiale mod I I 10 nedbrydning forårsaget af syreaktiverede proteaser ved I I behandling med urinstof, fulgt af nedenstående trin I I (c) eller udført samtidigt med nedenstående trin (c); I I {c) selektivt eluerer bundet kontaminerende materiale I I med pKa-værdier større end for erythropoietin ved be- I I 15 handling med vandig syre ved pH-værdier på ca. 4,0- I I 6,0; I I (d) selektivt eluerer erythropoietin ved behandling I I med vandig saltopløsning ved en pH-værdi på ca. 7,0; I I og I 20 (e) isolerer eluentfraktioner med indhold af erythro- I I poietin. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kende- I I tegnet ved, at man benytter den til udvinding af I I rekombinant erythropoietin fra en cellekulturafledt I 25 væske. I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kende- ~ I tegnet ved, at man benytter den til udvinding af I I rekombinant erythropoietin fra en pattedyrscelle- I I kulturafledt væske og fortrinsvis fra supernatanten I I 30 fra en pattedyrscellekultur. I

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kende- I I tegnet ved, at man benytter den til udvinding af I erythropoietin fra urin-væsker. I I 35 I DK 175251 B1

5. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af de foregående krav, kendetegnet ved, at kation- , harpiksen er en DEAE agaroseharpiks.

6. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af de fo- ’ 5 regående krav, kendetegnet ved, at man yderligere (dl) underkaster i trin (d) eluerede erythropoie-tinholdige væsker en revers fase væskechromatografisk adskillelse under anvendelse af en immobiliseret C4 el-10 ler C6 harpiks til selektiv binding af erythropoietin fra væsken til harpiksen; og (d2) selektivt eluerer i trin (dl) bundet erythropoietin fra harpiksen med en 50-80% vandig ethano-lopløsning ved en pH-værdi i området ca. 4,5-8; hvor-15 efter man (e) isolerer eluentfraktioner med indhold af erythropoietin.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kende tegnet ved, at man som kationharpiks benytter en

20 DEAE agaroseharpiks; at man ved elueringen af kon-taminerende materiale behandler med vandig syre ved en pH-værdi på ca. 4,3; at man til den revers fase væskechromatografiske adskillelse i trin (dl) benytter en immobiliseret C4 harpiks; og at man ved den efter-25 følgende eluering i trin (d2) eluerer med en ca. 60% ' vandig ethanolopløsning ved en pH-værdi på ca. 7,0.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kende tegnet ved, at man yderligere fjerner ethanol fra de i trin (e) isolerede erythropoietinholdige elu- 30 entfraktioner. ^ — —— _ ____ - - _ _