JPS63503352A - タンパク質の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「タンパク質の精製Ｊ 本出願は、１９８５年６月２０日に出願された出願番号第０６／７４７．１１９ 号の一部継続出願である。 青−量 本発明は、一般にクロマトグラフィー技術を用いたタンパク質の精製に関する。 特に、糖タンパク質、特に自然の物質（例えば血液や尿）及び組み換え物質（例 えば、遺伝的に形質転換された補乳動物細胞培養液）起源の、シアル酸を高濃度 に含有する糖タンパク質（例えば、エリトロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏ−ｐｏｉ ｅｔｉｎ）のような赤血球造血因子（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｆａｃｔ ｏｒ））のような生物学的に活性を有するタンパク質の迅速且つ有効な分離操作 に関するものである。 生化学的に重要な物質の分離において、従来多くの技術が提案されている。従来 一般に用いられている分離技術には、限外濾過法、カラム等電点電気泳動法（ｃ ｏｌｕｍｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）、平板等電点電気泳動法（ｆｌ ａｔ−ｂｅｄ　ｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）、ゲル濾過法、電気泳動法、等電 点電気泳動法、様々な形態のクロマトグラフィー法等がある。従来一般に用いら れるクロマトグラフィー技術の中には、イオン交換クロマトグラフィー、吸着ク ロマトグラフィーがある。前者は、異なった純電荷（ｎｅｔ　ｃｈａｒｇｅ）を 有する液体成分が、異なったイオン強度の溶出液による溶出（段階的に或いは連 続勾配によって）によって分離される分離方法である。正の電荷或いは負の電荷 を有するゲルマトリックス（（Ｈ脂）が、反対の純電荷をもった成分を吸着（結 合）するために用いられる。分ｇ１（ｉ出）の際には、荷電されたサンプル成分 が、選択された溶出液中の塩イオンによって交換され、イオン強度の特異性によ って特異的なサンプル成分が溶出される。 逆相吸着クロマトグラフィーは、極性の相違に基づく液体サンプル成分の分離を 含んでいる。サンプル成分は、非共有結合によって粒状のゲルマトリックス（樹 脂）に吸着される。その後、段階的或いは連続的勾配溶出によって、溶出液中の 非極性溶媒による交換で、成分の選択的吸着がなされる。 前述の多くの分離技術は、通常は比較的小さな疎水性分子及び親水性分子の分離 に用いられるが、それらの技術は、例えばタンパク質、特に、リポタンパク質、 核タンパク質、糖タンパク質等の複合タンパク質分離の際には幾分か利用の面で 限界がある。タンパク質の分離技術分野について開示したものとしては、Ｂｒｏ ｗｎ等、　Ａｎａｌ　ｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　玉１−２１（ １９７９）及びＲｕｌ＋１ｎｓｔｅｉｎ、　紅ｕ犯七刀Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ、　玉１−７（１９７９）がある。また、”ＶＹＤＡＣＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓ ｉｖｅ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＰｈａｓｅＭａｔｅｒｉａｌｓ　 ｆｏｒ　）ＩＰＬＣ”、　Ｔｈｅ　Ｓｅｐ／Ａ／Ｒａ／ＴｉｏｎｓＧｒｏｕｐｓ 、　ｔｌｅｓｐｅｒｉａ、　ＣＡ、　と、共同出願人である５ｔｒｉｃｋｌａｎ ｄとＰａｒｓｏｎｓの共働者等の刊行物すなわち１的封肛亘蛙■ｙ、ユ旦、　（ ６）、　２２２３−２２２７（１９８４）参照。さらに、例えば、逆相液体高速 クロマトグラフィー法（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｈａｓｅ　ＨＰＬＣｐｒｏｃｅｄｕ ｒｅ）が、タンパク質或いはポリペプチドの分離に提案され或いは用いられてき たように、一般的に推奨された非極性溶媒には、アセトニトリルのような所望の タンパク質から分離、取扱が困難な試薬を使用しなければならなかった。Ｐａｒ ｓｏｎｓ等、　紐肛ａ参照。特に水溶性のエタノールとギ酸の混合液のような、 エタノールによる溶出を開示したものは、僅かに一つだけである。Ｔａｋａｇａ ｋｉ等、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ−ｂｔ至畦」ｈｅｍｉｓｔｒｙ、　５ ．　（４）、　１５３６４５４＋　（１９８０）参照。 高分子量の複合タンパク質の分離調製においては、前述の技術の使用には明らか に限界がある。即ち、他の無数の複合タンパク質と結びついている場合が多い自 然に存在する物質から、極少量存在する様々な複合ウィルスと真核生物のタンパ ク質を分離精製して、治療や免疫予防や診断薬に用いるといった、最近力の入れ られている分野においては、特に問題が多い。−例として、エリトロポエチン、 トロンポボエチン（ｔｈｒｏ…ｂｏ−ｐｏｉｅｔｉｎ）、グラニュロポエチン（ ｇｒａｎｕｌｏｐｏｉｅＬｉｎ）、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａ ｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）のような生化学的に重要な哺乳動物造血因子（ｍａｍ ｍａｌｉａｎ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）は、再生不良性貧 血（ａｐｌａｓｔｉｃ　ａｎｅｍｉａ）患者の尿からは極少量しか分離できない 。原液体源からの回収操作は、一般的に非常に複雑であり、コストが高く、煩雑 であり、しかも活性物質の回収率が比較的低い。生物学的に活性を有する尿のエ リトロポエチン調製物（高分子量でシアル酸を多く含むタンパク質）を得るため に広く用いられている方法は、Ｍｉｙａｋｅ等、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５２　（１５）、　５５５８−５５ ６４　（１９７７）に開示されている。 これは七つのステップからなり、イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈 澱、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー等の方法を用いて、？０，４００　Ｕｎ ｉｔｓ／ｍｇの力価を有する糖タンパク質が２１％の収率で得られることが報告 されている。 真核生物のタンパク質を大量に調製するために、組み換え方法が広範囲に適用さ れているのは、生物学的に活性を有する物質を得るために必要な、量の点から及 び簡単な精製の点から、所望の分子を得る可能性を実質的に増大するためであっ た。−例を挙げると、生物学的活性を保持するために、所望の組み換えタンパク 質を糖付加する必要がない場合に、組み換え宿主大腸菌旦匹旦ｉ）　の中で、ク ンバク質性汚染物質やプロテアーゼ等を殆ど含まない不溶性“封入体”の形態で 、大量のタンパク質が屡々生産される。適切な第２及び第３の立体配座を形成す るための糖付加（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）及び／或いは宿主細胞膜の処理 が、生物学的活性には必要であるが、酵母や哺乳動物細胞のような真核宿主の培 ！！（例えば、ＣＯ５−１、ＣＨＯ細胞）によって、より適切な組み換え宿主が もたらされる。しかしながら、これらの宿主を用いた場合には、生物学的に活性 を有する形態のタンパク質を高収率で得るのが困難になってしまう。宿主細胞溶 解物は屡々、（組み換えタンパク質に関して）分子量、電荷、極性、熔解性が非 常に類似したタンパク質性構成成分を含んでおり、分離が困■である。さらに、 宿主にとって内在性のタンパク質分解酵素が、所望のタンパク質の生物学的活性 を損なう大きな原因となる。組み換え物質が宿主細胞によって培養液上清中に分 泌されている場合には、培養液に用いられている組成が複雑なために、形質転換 された補乳動物細胞培養液から、所望のタンパク質を分離する際にも同様な問題 が生じる。 従って、液体源から生物学的活性を有するタンパク質を回収するために適した、 迅速で且つ効果的な分８Ｍ調製方法が、当該技術分野においてはめられている。 とりわけ、哺乳動物細胞培養液の上清のような種々の物質で゛汚染”された液体 から、組み換えエリトロポエチンのような組み換え複合タンパク質を回収する際 には必要である。 Ｋｕｅｎ　Ｌｉｎによって、“エリトロポエチンの製造（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ　Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）という名称で、１９８４年１１月３０日 に出願された共同出願の米国係ヱ特許出願第６７５，２９８号（１９８４年１２ 月１１日に出願された国際比＠　ＵＳ８４１０２０２４　で、１９８５年６月２ ０日に−０８５１０２６１０として公開予定に対応する）の開示を、本発明の背 景に関係するので、特に、哺乳動物のエリトロポエチンを大量に製造するために 適用される組み換え方法に関する技術分野に言及しているので、本明細書に参照 として組み入れた。 叉−約 本発明は、タンパク質の分離に適した、特にエリトロポエチンの分離に適したよ く知られたクロマトグラフィー分離操作を、個々にまたは組み合わせた方法を提 供するものである。特に前述のエリトロポエチンとしては、培養液、特に哺乳動 物宿主細胞培養液上ｆ？から生物学的に活性を有する形態の組み換えエリトロポ エチンである。 本発明による一態様によれば、逆相液体クロマトグラフィー分離によって、培養 液からエリトロポエチンを迅速に且つ効果的に回収することができる。この逆相 液体クロマトグラフィーは、Ｃ４或いはＣ６樹脂に所望の成分を選択的に結合さ せて、約５０〜８０％のエタノール水溶液を用いて、ｐＨ４，５〜８．０で溶出 させるものである。本発明のこの態様を効果的に実施するための好ましい条件と しては、Ｃ４樹脂を用い、ｐＨ７，０で、段階的に或いは連続的勾配を用い、約 ６０％のエタノール水溶液を用いて溶出すれば、哺乳動物宿主細胞培養液上清か ら、生物学的に活性を存する糺み換えエリトロポエチンが高収率で回収される、 培養液上清は、好ましくはクロマトグラフィー処理を実施する前に濃縮しておき 、さらに集めたエリ）・ロボエチンを含んだ溶出分画からエタノールを除去する ために、適切なステップを実施する。上述の優れ且つ簡単な分剤操作によって、 収率５ｏ％以上で、高い比活性を有するエリトロポエチンの分離が可能となる。 本発明による他の態様によれば、陰イオン交換クロマトグラフィーによって、培 養液からエリトロポエチンを迅速に且つ効果的に回収することができる。この陰 イオン交換クロマトグラフィーは、選択された陽イオン樹脂にエリトロポエチン を選択的に結合させ、存在する酸性プロテアーゼに対して結合物質の保護処理を して、ｐｌ＋　４．（１〜６．０の酸の水溶液を用いて、エリトロポエチンのｐ Ｋａよりも大きなｐＫａを有する結合物質を選択的に溶出して、さらに約ｐＨ７ ，０の塩の水溶液を用いて溶出する。 エリトロポエチンを含んだ溶出分画は、生物学的活性物質に富んでいるが、さら に、例えばエタノールを除去してゲル濾過などの処理をすることも可能であ葛。 本発明のこの態様を効果的に実施するための好ましい条件としては、ＤＥＡＥ　 アガロース樹脂（ジエチルアミノエチルアガロース樹脂）を用いた陰イオン交換 クロマトグラフィーを用いれば、哺乳動物宿主細胞培養液上清から、生物学的に 活性を有する組み換えエリトロポエチンが高収率で回収される。　ＤＥＡＥカラ ムを充填して、つづいて生じる酸性プロテアーゼの活性化を防ぐために、尿素を 添加し、さらに、約ｐＨ４，３の酸の水溶液を用いて酸洗いして、エリトロポエ チンよりも大きなｐＫａを有する液体結合成分を選択的に溶出する。その後、ｐ Ｈを約７．０に調整して、塩の水溶液を用いて段階的或いは連続的勾配にかけて 、生物学的に活性を有するエリトロポエチンを選択的に溶出させる。 本発明によるさらに池の！３様によれば、前述のイオン交換クロマトグラフィー と逆相液体クロマトグラフィー操作を連続的に用いたエリトロポエチン回収操作 が提供される。特にエリトロポエチン（特に組み換えエリトロポエチン）が、培 養液（哺乳動物宿主細胞培養液上清）から、下記の段階的方法で回収される。培 養液上清プール（好ましくは、前もって完全に濾過して濃縮した）を、約ｐＨ７ ，０のイオン交換カラムに通して、陽イオン樹脂（好ましくはＤＥＡＥアガロー ス）にエリトロポエチンを選択的に結合させる。結合している物質は酸性プロテ アーゼによる分解（好ましくは、尿素を加える）に対して安定であって、エリト ロポエチンよりも大きなｐＫａ値を有する結合物質を、約ｐｎ　４．０〜６．０ の酸の水溶液（好ましくは約ｐＨ４，３）で、−回或いはそれ以上洗って溶出さ せる。その後、約ｐＨ７，０の塩の水溶液を用いて、生物学的に活性を有するエ リトロポエチンを溶出させる。このエリトロポエチンを含んだ溶出分画を、Ｃ６ 樹脂或いは好ましくばＣ４樹脂の逆相液体クロマトグラフィーにかけて、エリト ロポエチンを選択的に結合させる。その後、約ＰＨ４，５〜８．０（好ましくは ｐＨ７，０）で、約５０〜８０ｏＡ（好ましくは約６０％）のエタノール水溶液 を用いて、結合している生物学的に活性を有するエリトロポエチンを溶出する。 所望のエリトロポエチンは、エリトロポエチンを含んだ溶出分画から分離する（ ２８Ｏｒ＋ｎの吸光度によって定量される）、その後、エタノールを除去して、 例えば、２０　ｎｍクエン酸ナトリウム／１００　ｎｍ塩化ナトリウム、　ｐＨ ６，８〜７．０のような調整成分の緩衝液を用いて、生成物をゲル濾過（例えば セファクリルＳ−２００カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００ｃｏｌｕｍｎ ））にかけることも可能テアル。 本発明の他の態様或いは利点は、下記の好ましい実施例の詳細な説明を考慮する ことによって明白となるであろう。 韮坦友戎所 本発明の実施は、前述の米国特許出願第６７５．２９８号の実施例１Ｏに記載さ れた方法で開裂したプールしたＣ）１０細胞上滑で実施した、下記の実施例によ って適切に開示されているものである。特に、この処理された上清は、ＭＴＸ（ メトトレクセイト）によって“増幅（ａｍｐｌ　ｉｆ　１ｅｄ）″されたＣＨＯ ｐＤＳＶＬ−ｇＨｕＥＰｏ株を、前述の米国出願の第６２頁に記載されているよ うに、無血清培地で回転ビン培養をおこなって得たものである。実施例１では、 逆相液体クロマトグラフィーによって、生物学的活性を有する組み換えヒトエリ トロポエチンの回収について言及している。実施例２は、同じ上清材料で実施し た複合回収操作に関する。実施例３は、その結果生成された物質で実施した、Ｉ ？ＩＡと生体内（ｉｎ血）検定に関する。 ス１」Ｌ」− 第１回目と第２回目（７日）の培養サイクルの上清をプールすることによって得 られた未濃縮の培養液上清を、０４基質（ＶＹＤＡＣ２１４ＴＰ−８）で充裟し て密閉した（高圧配置の）実験用カラムにのせる＊　０−４５Ｘ１０　ｎｍのカ ラムで、流速は１　ｍ　Ａ／１ＩＩｉｎである。サンプルを流した後、生物学的 に活性を有する組み換えエリトロポエチンを、ｐＨ７，０の１０　ｍｍのトリス （Ｔｒｉｓ）からｐＨ７，０の８０％のＥｔＯＨ／１０　ｍｍ　Ｔｒｉｓまでの 直線勾配で溶出した。タンパク質の濃度をＵＶモニターで測定して、約６０％の エタノール（ＥｔＯＨ）の溶出分画を集めた。 実五■赴−」− この実施例の複合回収操作は、実施例１よりも大きな上清分画で、イオン交換ク ロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィー操作を連続的に実施することから成 る。このクロマトグラフィー操作の前に、濃縮と完全濾過を行い、つづいてゲル 濾過処理ステップを行う。 １、」１Ｌ５完省→Ｌ過 第１回目と第２回目（７日）の培養サイクルで得た上清を別々に、Ｐｅｌ　１１ ｃｏｎ限外濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓ、） を用いて、分子量１０，０００以下の物質を除去して３０倍に濃縮した。 ：ａ縮した第１回目と第２回目の培養サイクルの培養液を集めて、約ｐ）１７． ０の１０μｍ）リス（Ｔｒｉｓ）でＰｅ１ｌｉｃｏｎ装置を用いて完全濾過した 。（この完全濾過した培養液に、イオン交換クロマトグラフィーにかける前に、 Ｃｕ５Ｏ＊を２０μｍ加えてもよい。）１ｏ。 ０００或いは３０，０００の分子量をカットする圃外濾過装置はすべて使用可能 であり、また、完全濾過は、ｐｌ（が約６．０〜８．５の適切な低イオン強度を 有するすべての緩衝液で行うことが可能である。 ２、イオン六　クロマトグラフィー 前述のステップ１で濃縮、完全濾過した培養液を、比較的低密度のＤＥＡＥアガ ロースカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒ４ｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ、）に加える。そ の後、約ｐＨ４，５で５　ｍｍ　酢酸／１　ｍｍグリシン７６月尿素を含む４倍 量の溶液で洗う、また、洗浄液には、所望でないタンパク質のスルフヒドリル基 を酸化させるために、２０μ−のＣｕ５Ｏ＊を含んでもよい。グリシンは存在す るシアン酸塩と反応して、吸収される。尿素は、低いｐＨで酸性プロテアーゼに 対する安定化、及びタンパク質の可溶化を助ける働きをもつ。エリトロポエチン よりも大きなｐＫａ値を有する結合物質を溶出した後で、カラムのｐ）ｌを中性 化させ且つ尿素を除去するために、カラムを２５　ｍｍ　ＮａＣ］／１０　ｍｍ 　Ｔｒｉｓを用いて洗う、生物学的に活性ををするエリトロポエチンは、約ｐＨ ７，０で７５　ｍｍ　ＮａＣｌ／１０　ｍＩＩＩＴｒｉｓを用いて溶出する。　 Ｃｕ５Ｏ４（２０μ−は、中性化のための洗浄及び／或いは溶出ステップの双方 で用いることができる。 ３．１　ロマ　”−− この操作は、開放コラム、低圧条件を用いること以外は、実質的に実施例１の操 作と同じである。上述のステップ２のＢ　ｆＥ液において硫酸銅を用いた場合に は、銅の除去を促進するために、逆相カラムにのせる前に、１ｍｍのＥＤＴＡを エリトロポエチンの分画に加える。エリトロポエチンの°ピーク”は、直線勾配 の約６０％エタノールの分画にもみられるが、これを集めて、例えば、ｐＨ７， ０の１０　ｍｍ　Ｔｒｉｓで５倍に希釈して、エタノール濃度を下げて、エタノ ールを除去しやすくする。エリトロポエチンをＤＥＡＥ　カラムに結合させて、 少量の緩衝液（２０ｍｍ　クエン酸ナトリウム／１００　＋ｎｍ塩化ナトリウム ）で溶出して、エタノールを除去する。 ４、ゲル濾過 エタノールを除去したステップ３で得られた生成物を、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ −２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、）のカラ ムにのせる。このカラムを、ｐＨ６，８〜７．０の２０１１μｍクエン酸ナトリ ウム／１００　ｍｍ　塩化ナトリウムのｍ　製Ｂｆｆｉ液で展開する。 ス４１舛−」ユ 前述した米国特許出願筒６７５．２９８号に記載されたラジオイムノアッセイと 生体内（ｉｎ　ｖｉν０）生物学的定量を、実施例１と実施例２の操作で回収し た組み換えエリトロポエチンを用いて行った。実験結果より、実施例】と実施例 ２の生成物は収率がそれぞれ、５２％、１６％であり、生体内のＰＴＡ　（ラジ オイムノアッセイ）の比活性がそれぞれ１．０２と１，３であった。また別の上 清を用いて実施例２の操作を繰り返した結果、収率は３０〜５０％のレベルであ った。 本発明の＄ｉ製スステップ行った後のエリトロポエチンの純度は、少なくとも約 ９５％で、殆どの場合約９８％以上であった０組み換えエリトロポエチンの純度 は、非還元５ＩＩＳ−ＰＡＧＥ分析、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析、高圧液体ゲル 濾過クロマトグラフィーで測定した。本発明で得られた高純度の組成物は、エラ イザ（ＥＬＩＳＡ）アッセイで測定した結果、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉ ｎｅｓｅｈａｍｓｔａｒ）の卵巣細胞（Ｃ）ｔｏ）とウシ血清タンパク質が、０ ．５％以下しか含まれていなかった。本発明の方法で精製した組み換えエリトロ ポエチンは、他の精製技術で以前に得られたエリトロポエチンに比べると、比活 性が実質的に大きいものである。さらに、本発明の精製した組み換えエリトロポ エチン組成物には、Ｉｉｍｕｌｕｓ　ａｍｅｂｏｃｙｔｅ（カブトガニのアメー バ様細胞）アッセイで測定した結果、２．５　ＥＵ／ｍｌ以下の発熱物質（ｐｙ ｒｏｇｅｎ）を含んでいた。さらに、本発明の精製した組成物には、ドツトプロ ット分析（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）で測定した結果、ＤＮＡコン クミネーションが１０　ｐｇ　ＤＮＡ／１０，０００　ｕｎｉｔｓ以下であった 。 高純度で￥ｒｉ製された組み換えエリトロポエチン組成物は、目的物以外のクン バク質が除去されている点で、製薬的に利用可能な組成物である０本発明の方法 を用いて組み換えエリトロポエチンから不純なタンパク質を除去することによっ て、ヒトに対して用いた場合に、免疫学的反応、例えばアナフィラキシ−（ａｎ ａｐｈｙｌａｘｉｓ）が減少した精製組成物が提供できるものである。さらに、 加水分解酵素のコンタミネーションによる組み換えエリトロポエチンの分解を防 止することによって、不純なタンパク質の除去によって、組み換えエリトロポエ チン組成物の安定性を増加することが可能である。 前述に記載した実施例は、哺乳動物細胞培養源からのエリトロポエチンの回収を 実施するように本発明の操作を記載したが、この操作は、哺乳動物の溶解物と上 清の結合物のような他の培養液や、酵母細胞培養の同様な培養液に実施する回収 にも適用できると思われる。同様に、個々の操作、及び複合操作（及び特にイオ ン交換クロマトグラフィー操作）が、尿などの自然の物質からのエリトロポエチ ンの回収に有用であると期待されている。 エリトロポエチンの回収に適用した前述の操作が、伯の複合タンパク質、特に組 み換え方法で生成した糖タンパク質の回収にも使用可能であることは、当該技術 分野に熟達したものであれば明白であろう。その回収が本発明の範囲である糖タ ンパク質には、組み換え体組織のプラスミノゲン（ｐｌａｓＩＩｌｉｎｏｇｅｎ ）活性化因子、即ち、ＦａｃＬｏｒ■と単純ヘルペスウィルス糖タンパク質Ｄ（ Ｈｅｒｐｅｓ　Ｓｉｍｐｌｅｘ　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄ） のような独特な生成物を含むものである。 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．培養液から生物学的に活性を有する形態で、エリトロポエチンを効果的に回 収する方法であって、該方法が、前述の培養液を、固定されたＣ４樹脂或いはＣ ６樹脂を含んだ逆相液体クロマトグラフィー分離にかけて、前述の培養液中のエ リトロポエチンを前述の樹脂に選択的に結合させ、ｐＨが約４．５〜８．０の５ ０〜８０％のエタノール水溶液で、前述の樹脂から結合したエリトロポエチンを 選択的に溶出し、溶出液のエリトロポエチンを含んだ分画を分離する、ことから 成る。 ２．細胞培養液からの組み換えエリトロポエチンの回収に適用する請求の範囲第 １項に記載の方法。 ３．哺乳動物細胞培養液からのエリトロポエチンの回収に適用する請求の範囲第 ２項に記載の方法。 ４．哺乳動物細胞培養上清からのエリトロポエチンの回収に適用する請求の範囲 第３項に記載の方法。 ５．尿液からのエリトロポエチンの回収に適用する請求の範囲第１項に記載の方 法。 ６．前述の樹脂がＣ４樹脂である請求の範囲第１項に記載の方法。 ７．前述の溶出が約ｐＨ７．０で行われる請求の範囲第１項に記載の方法。 ８．前述の溶出が、エタノール水溶液の直線勾配によって、連続的に行われる請 求の範囲第１項に記載の方法。 ９．前述のエリトロポエチンが、約６０％のエタノール水溶溶出液を含んだ分画 で分離される請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．さらに分離されたエリトロポエチンを含んだ溶出分画からエタノールを除 去する請求の範囲第１項に記載の方法。 １１．培養液からエリトロポエチンを効果的に回収する方法であって、該方法が 、 前述の培養液を、約ｐＨ７．０でイオン交換クロマトグラフィー分離にかけて、 前述の培養液中のエリトロポエチンを陽イオン樹脂に選択的に結合させ、 酸性活性化プロテアーゼによる分解に対して、前述の樹脂に結合した物質を安定 化させ、 エリトロポエチンのｐＫａ値よりも大きいｐＫａ値を有する結合している汚染物 質を、約４．０〜６．０のｐＨで酸の水溶液を用いて処理することによって選択 的に溶出し、約７．０のｐＨで塩の水溶液を用いて処理することによって、エリ トロポエチンを選択的に溶出し、 エリトロポエチンを含んだ溶出分画を分離する、ことから成る。 １２．細胞培養液からの組み換えエリトロポエチンの回収に適用する請求の範囲 第１１項に記載の方法。 １３．哺乳動物細胞培養液からのエリトロポエチンの回収に適用する請求の範囲 第１２項に記載の方法。 １４．哺乳動物細胞培養上清からのエリトロポエチンの回収に適用する請求の範 囲第１３項に記載の方法。 １５．尿液からのエリトロポエチンの回収に適用する請求の範囲第１１項に記載 の方法。 １６．前述の陽イオン樹脂がＤＥＡＥアガロース樹脂である請求の範囲第１１項 に記載の方法。 １７．前述の安定化が尿素を用いた処理を含む請求の範囲第１１項に記載の方法 。 １８．培養液からエリトロポエチンを効果的に回収する方法であって、該方法が 、 （１）前述の培養液を、約ｐＨ７．０でイオン交換クロマトグラフィー分離にか けて、前述の培養液中のエリトロポエチンを陽イオン樹脂に選択的に結合させ、 （２）酸性活性化プロテアーゼによる分解に対して、前述の樹脂に結合した物質 を安定化させ、 （３）エリトロポエチンのｐＫａ値よりも大きいｐＫａ値を有する結合している 汚染物質を、約４．０〜６．０のｐＨで酸の水溶液を用いて処理することによっ て選択的に溶出し、（４）約７．０のｐＨで塩の水溶液を用いて処理することに よって、エリトロポエチンを選択的に溶出し、（５）溶出したエリトロポエチン を含んだ培養液を、固定されたＣ４樹脂或いはＣ６樹脂を含んだ逆相液体クロマ トグラフィー分離にかけて、前述の培養液中のエリトロポエチンを前述の樹脂に 選択的に結合させ、 （６）ｐＨが約４．５〜８．０の５０〜８０％のエタノール水溶液で、前述の樹 脂から結合したエリトロポエチンを選択的に溶出し、（７）溶出液のエリトロポ エチンを含んだ分画を分離する、ことから成る。 １９．細胞培養液からの組み換えエリトロポエチンの回収に適用する請求の範囲 第１８項に記載の方法。 ２０．哺乳動物細胞培養液から組み換えエリトロポエチンを効果的に回収する方 法であって、該方法が、（１）前述の培養液を、約ｐＨ７．０でイオン交換クロ マトグラフィー分離にかけて、前述の培養液中のエリトロポエチンをＤＥＡＥア ガロース陽イオン樹脂に選択的に結合させ、（２）酸性活性化プロテアーゼによ る分解に対して、前述の樹脂に結合した物質を尿素処理によって安定化させ、（ ３）エリトロポェチンのｐＫａ値よりも大きいｐＫａ値を有する結合している汚 染物質を、約４．３のｐＨで酸の水溶液を用いて処理することによって選択的に 溶出し、（４）約７．０のｐＨで塩の水溶液を用いて処理することによって、エ リトロポエチンを選択的に溶出し、（５）エリトロポエチンを含んだ溶出分画を 、固定されたＣ４樹脂を含んだ逆相液体クロマトグラフィー分離にかけて、前述 の培養液中のエリトロポエチンを前述の樹脂に選択的に結合させ、 （６）ｐＨが約７．０の６０％のエタノール水溶液で、前述の樹脂から結合した エリトロポエチンを選択的に溶出し、（７）溶出液のエリトロポエチンを含んだ 分画を分離する、ことから成る。 ２１．さらに分離したエリトロポエチンを含んだ分画を除去する請求の範囲第２ ０項に記載の方法。 ２２．非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定して、少なくとも約９５％の含 有量のエリトロポエチンを有する精製した組み換えエリトロポエチン組成物。 ２３．前述のエリトロポエチンの含有量が、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によっ て測定して、約９８％以上である請求の範囲第２２項に記載の精製した組み換え エリトロポエチン組成物。 ２４．０．５％以下のＣＨＯと、ウシ血清タンパク質を有する請求の範囲第２２ 項に記載の精製した組み換えエリトロポエチン組成物。 ２５．０．５％以下のＣＨＯと、ウシ血清タンパク質を有する請求の範囲第２３ 項に記載の精製した組み換えエリトロポエチン組成物。 ２６．少なくとも約９５％のエリトロポエチン含有量と、０．５％以下のＣＨＯ とウシ血清タンパク質と、２．５ＥＵ／ｍ１の発熱物質と、１０ｐｇＤＮＡ／１ ０，０００ユニットとを含む精製した組み換えエリトロポエチン組成物。