RU2274471C2 - Способ очистки интерфероновых белков с помощью катионообменной хроматографии - Google Patents

Способ очистки интерфероновых белков с помощью катионообменной хроматографии Download PDF

Info

Publication number
RU2274471C2
RU2274471C2 RU2002117383/15A RU2002117383A RU2274471C2 RU 2274471 C2 RU2274471 C2 RU 2274471C2 RU 2002117383/15 A RU2002117383/15 A RU 2002117383/15A RU 2002117383 A RU2002117383 A RU 2002117383A RU 2274471 C2 RU2274471 C2 RU 2274471C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
interferon
proteins
purification
sodium
solution
Prior art date
Application number
RU2002117383/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2002117383A (ru
Inventor
Лючи СКАПОЛЬ (IT)
Лючия СКАПОЛЬ
Джузеппе Клаудио ВИСКОМИ (IT)
Джузеппе Клаудио Вискоми
Original Assignee
Альфа Вассерманн С.П.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Альфа Вассерманн С.П.А. filed Critical Альфа Вассерманн С.П.А.
Publication of RU2002117383A publication Critical patent/RU2002117383A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2274471C2 publication Critical patent/RU2274471C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/811—Interferon

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к препаративной биохимии, фармакологии, медицине. Способ очистки интерфероновых белков основан на применении катионообменной хроматографии на твердой матрице, осуществляемый при более основном рН, то есть более высоком относительно рН, соответствующего изоэлектрической точке, pI, белков, предназначенных для очистки, однако при данном рН указанные белки все еще остаются абсорбированными, при этом используют буферные растворы органических или неорганических солей, способных модифицировать ионную силу раствора. Изобретение обеспечивает простоту промышленного осуществления способа и экономическую доступность. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 табл.

Description

Предпосылки создания изобретения
Большая часть биомедицинских наук основана на применении фармакологически активных белков как природного происхождения, полученных способами экстракционной технологии, так и синтетического происхождения, полученных из рекомбинантной ДНК с использованием разработанных методов. Уровень чистоты представляющих интерес продуктов важен в обоих случаях, поскольку понимание их активности определяется возможностью точного связывания биологического действия с присутствием фиксированного количества белка.
В данном контексте способы очистки фармакологически активных белков приобретают важную роль, поскольку чистота полученного белка приобретает особую значимость, когда в лекарственные препараты включаются активные начала или наполнители. Возможность возникновения токсичного действия и/или появления неблагоприятных последствий во время лечения действительно вынуждает администрацию, ответственную за регистрацию и выдачу разрешения на сбыт лекарств на основе белков, вводить еще более строгие правила для определения качества и промышленного соответствия активных начал белкового происхождения, содержащихся в продаваемых лекарственных средствах.
Из вышесказанного четко явствует важность способов очистки (1-5), 135-200 (1999), Mullick A. and Flickinger M.C., Biotechnol. Bioeng., 65(3), 282-290 (1999) и Mc Creath G.E. et al., J. Chromatogr., 597(1-2), 189-196 (1992).
Наконец, Yang L. et al., Sheng Wu Kung Cheng Hsueh Pao, 16(1), 74-77 (2000) также были описаны способы очистки альбумина на тяжелых металлах и методы аффинности на матрицах, с которыми связаны молекулы красителей, таких как Цибакрон синий F3G, были описаны Compagnini A. et al., J. Chromatogr. A, 736(1-2), 115 (1996).
В патенте US 6194553 раскрыт способ очистки ингибитора альфа-1 протеиназы при помощи катионообменной хроматографии на твердой матрице, где катионообменную хроматографию проводят при значении рН более основном, чем рН в соответствующей изоэлектрической точке.
В документе ЕР 0203382 раскрыт способ очистки альфа-интерферона при помощи катионообменной хроматографии при рН 4,5-5,0.
Все данные способы демонстрируют различным образом проблемы сложности реализации и высокой стоимости, так что проблема индивидуализации новых способов очистки фармакологически активных белков как легких, так и легко промышленно осуществимых и экономически выгодных остается не решена.
Описанное далее изобретение дает ответ на данные важные требования путем разработки способа очистки интерфероновых белков, который является легким в промышленной эксплуатации и имеет низкую стоимость, обладая значительными экономическими преимуществами.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу очистки интерфероновых белков, который включает проведение катионообменной хроматографии на твердой матрице при более основном значении рН, чем рН, соответствующий изоэлектрической точке, pI, очищаемых белков, однако при данном значении рН белки все еще остаются абсорбированными, и элюирование указанных белков путем повышения ионной силы и/или рН водных буферных растворов.
Эффективное осуществление настоящего изобретения требует индивидуализации правильной комбинации используемой хроматографической матрицы, значения рН выше pI и ионной силы используемых хроматографических элюентов, поскольку, когда определена хроматографическая матрица, эффективная очистка может быть достигнута путем проведения ограниченных изменений рН и/или ионной силы, часто в десятые доли единиц рН и/или изменений ионной силы на несколько сотых долей мкS.
Можно использовать все функционализированные твердые матрицы, обычно применяемые в качестве стационарных фаз для катионообменной хроматографии, однако в частности, стационарные фазы, называемые сильными катионообменниками, имеют предпочтение, когда pI белка, предназначенного для очистки, ниже 6, тогда как стационарные фазы как с сильным, так и со слабым катионным обменом можно использовать без исключения для белков, имеющих pI выше 6. Указанные стационарные фазы могут иметь кремневую или полимерную матрицу, функционализированную с помощью сульфонильных или карбоксильных групп, как в протонной форме, так и в форме щелочных солей.
С успехом можно использовать коммерчески доступные стационарные фазы, такие как, например, Source® S (Pharmacia Biotech), Sepharosa® SP-Fast Flow, Sepharose® SP-High Performance, Sp Sepharose® XL (Pharmacia Biotech), Fractogel® S (Merck. Darmstadt), Mustang® S (Pall Corporate), CM Sepharose® FF (Pharmacia Biotech), Dowex®, Bio-Rad® AG (Bio-Rad), Poros® S (PerSeptive Biosystems), Shodex®-S, Toyopearl® SP (Tosohass).
Диапазон значений рН, при которых настоящее изобретение может быть эффективно осуществлено, очень широк, в зависимости от изоэлектрических точек, предназначенных для очистки интерфероновых белков, и составляет между 2 и 11, предпочтительно между 4 и 8,5.
Расширение диапазона значений рН, превышающих pI, при которых можно проводить описанный в настоящем изобретении способ, может изменяться от значений рН, соответствующих pI интерфероновых белков, до значения рН, на одну единицу рН превышающего указанную pI, демонстрируя поразительное различие от белка к белку.
Например, было установлено, что в случае рекомбинантного альфа-2b-интерферона (rIFNα-2b) можно проводить абсорбирование белка на катионообменной матрице до значения, превышающего на 0,2 единицы рН его pI, составляющую 5,9, и, следовательно, возможно проводить его очистку с помощью катионообменной хроматографии, в то время как было установлено, что в случае сывороточного альбумина человека белок остается абсорбированным до значения рН, превышающего на одну единицу рН его pI.
Диапазон концентраций солевого раствора водных растворов, применяемых в качестве эффективно используемых элюентов, зависит от типа очищаемых интерфероновых белков и, как было установлено, включает значения между 1 мМ и 100 мМ, предпочтительно между 1 мМ и 30 мМ.
Например, в случае очистки рекомбинантного альфа-2b-интерферона (rIFNα-2b) концентрация водных солевых растворов составляет между 1 мМ и 30 мМ, предпочтительно между 5 и 15 мМ.
Необходимость иметь фиксированные и стабильные значения рН элюентов, используемых для хроматографических задач настоящего изобретения, делает очень полезным, если не абсолютно необходимым, применение подходящим образом забуференных водных растворов, содержащих от 5 до 100 мМ, предпочтительно от 10 до 20 мМ буферных смесей. Преимущественно можно использовать любое химическое вещество или смесь химических веществ, имеющих буферную способность в диапазоне рН между 2 и 11, поскольку значения рН элюентов, которые можно применять, заключаются между 2 и 11.
Преимущественно при осуществлении настоящего изобретения можно использовать множество водных буферных растворов, включая те, которые содержат: глицин и хлорид натрия, малеиновую кислоту и гидроксид натрия, малоновую кислоту и гидроксид натрия, молочную кислоту и гидроксид натрия, муравьиную кислоту и гидроксид натрия или лития, янтарную кислоту и гидроксид натрия, N-метилпиперазин и хлористо-водородную кислоту, пиперазин и хлористо-водородную или уксусную кислоту, L-гистидин и хлористо-водородную кислоту, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту и гидроксид натрия или лития, N-метилдиэтаноламин и серную кислоту, N-метилдиэтаноламин и хлористо-водородную или уксусную кислоту, пиридин и муравьиную кислоту, двухосновный цитрат натрия и гидроксид натрия, моноосновный фталат калия и хлористо-водородную кислоту, моноосновный фталат калия и гидроксид натрия, моноосновный фосфат калия и двухосновный фосфат натрия, бицин и гидроксид натрия, барбитал натрия и хлористо-водородную кислоту, борат натрия и хлористо-водородную кислоту, борат натрия и гидроксид натрия, 1,3-диаминопропан и хлористо-водородную кислоту, лимонную кислоту и двухосновный фосфат натрия, ацетат натрия и уксусную кислоту, имидазол и хлористо-водородную кислоту, триэтаноламин и хлористо-водородную или уксусную кислоту, трис(гидроксиметиламинометан) и хлористо-водородную кислоту, карбонат натрия и кислый карбонат натрия, этаноламин и хлористо-водородную кислоту, пиперидин и хлористо-водородную кислоту, триметиламин и муравьиную кислоту, пиридин и уксусную кислоту, триметиламин и уксусную кислоту, триметиламин и хлористо-водородную кислоту, гидроксид аммония и муравьиную кислоту, гидроксид аммония и уксусную кислоту, триметиламин и карбонат натрия, карбонат аммония и гидроксид аммония.
В частности, в случае очистки рекомбинантного альфа-2b-интерферона (rIFNα-2b) можно использовать все буферные растворы, которые имеют буферную способность при рН, заключающемся между 5.9 и 6.1, предпочтительно буферные растворы при рН между 5.9 и 6.1, содержащие моноосновный фосфат калия и двухосновный фосфат натрия, моноосновный фталат калия и гидроксид натрия, двухосновный цитрат натрия и гидроксид натрия, лимонную кислоту и двухосновный фосфат натрия, имидазол и хлористо-водородную кислоту, хотя в случае очистки сывороточного альбумина человека можно использовать буферные растворы, содержащие те же смеси химических соединений, имеющие буферную способность между 4.9 и 6.0.
Используемые в качестве элюентов водные растворы также могут содержать, в дополнение к химическим веществам, используемым для буферизации рН, химические вещества, задачей которых является модификация ионной силы раствора. Для этого преимущественно можно использовать как органические соли, как, например, карбоксилаты, алкилсульфонаты, фталаты, так и неорганические соли, такие как, например, сульфаты, хлориды, фосфаты, которые могут образовывать соль с натрием, калием, аммонием, первичными, вторичными, третичными или ароматическими аминами.
Данные соединения преимущественно можно использовать в концентрации, находящейся в диапазоне значений от 1 мМ до 100 мМ, предпочтительно между 1 мМ и 30 мМ.
Например, в случае очистки рекомбинантного альфа-2b-интерферона (rIFNα-2b) концентрация таких соединений может изменяться между 1 мМ и 30 мМ, предпочтительно между 2 и 20 мМ.
Эффективность очистки может быть повышена при использовании до элюирования интерфероновых белков одной или нескольких промывок, проводимых элюентами, имеющими подходящий рН и ионную силу, так что колонка всегда находится при рН, превышающем pI.
В случае рекомбинантного альфа-2b-интерферона (rIFNα-2b), pI которого составляет 5,9, промывки можно проводить буферными растворами при рН, заключающемся между 6,0 и 6,1.
Количество элюента, проходящего через колонку во время таких промывок, является переменным, обычно составляя между 5 и 100 объемов колонки (ОК), в случае рекомбинантного альфа-2b-интерферона (rIFNα-2b) количество элюента составляет от 10 до 80 ОК.
Количество предназначенного для очистки продукта, которое может быть загружено в колонку зависит от используемой хроматографической матрицы и может достигать максимум 100 миллиграмм общего количества белков на каждый миллилитр стационарной фазы, даже если обычно используют более низкие количества, включающие от 5 до 20 мг/мл.
Элюенты могут проходить через колонку с линейной скоростью, совместимой со стационарной фазой, до максимального значения, равного 10 см/мин.
Проиллюстрированный выше способ очистки можно применять для всех интерфероновых белков, в частности, относящихся к интерферонам альфа, бета, гамма, дельта, омега, тау, природному альфа-интерферону из лейкоцитов, рекомбинантному альфа-2b и консенсусным интерферонам как природного, так и рекомбинантного происхождения.
Объем описанного выше способа очистки состоит в получении промышленным и экономичным образом фармакологически активных белков с высокой степенью чистоты, так что их можно непосредственно использовать для получения содержащих их лекарственных препаратов.
В частности, лекарственные препараты в объеме настоящего изобретения включает препараты, содержащие интерферон, еще более предпочтительно рекомбинантный альфа-2b-интерферон (rIFNα-2b) как природного, так и рекомбинантного происхождения.
Далее представлены некоторые иллюстративные примеры объекта способа по настоящему изобретению.
Пример 1
Продуцирование рекомбинантного альфа-2b-интерферона (rIFNα-2b)
Часть клеток штамма Escherichia coli BL21 DE3 трансформировали 5 нг плазмиды pET9a-IFNα-2b, полученной клонированием синтетического гена, репродуцирующего генную последовательность IFNα-2b человека, модифицированного подходящим образом для соответствия последовательности кодонам более частым в Escherichia coli, в плазмиду рЕТ9а (Novagen).
Последовательность белка, экспрессированного клетками Escherichia coli, модифицированными как указано выше, является аналогичной последовательности, о которой сообщалось в Methods in Enzymology, Interferons, part С, под редакцией Pastka S., 119, 3-14 (1996), опубликованной Academic Press Inc.
Штамм Escherichia coli BL21 DE3, трансформированный с помощью плазмиды pET9a-IFNα-2b, помещали в культуре в колбу с подходящей культуральной средой, например, раствором, содержащим 12 г/л фитопептона (Phyto peptoton, BBL), 24 г/л дрожжевого экстракта (Yeast extract, DIFCO), 4 г/л глицерина (BDH) и неомицин, при 3°С в течение времени, достаточного для достижения значения оптической плотности при 600 нм, равного 0,6-0,8, обычно в течение 7-9 часов. Полученную таким образом культуру затем использовали при разбавлении от 1 до 100 для инокулирования в 5 л ферментеры, где содержалась культуральная среда, аналогичная ранее описанной среде в колбе. Культуру выдерживали в течение 14 часов при 37°С при аэрации, составляющей один объем воздуха в течение каждой минуты относительно объема культуры.
Бактериальные клетки собирали центрифугированием при 6000 оборотах в минуту (об/мин) в конце культивирования, их суспендировали в подходящем водном растворе, содержащем 1 мМ дитиотрейтола (DTT) в количестве, не превышающем 6 мл на каждый грамм сырого веса бактериального цетрифугата. Бактериальную суспензию подвергали клеточному лизису с помощью утвердившихся и описанных методов, как например расщепление ультразвуком или с помощью гидравлического давления.
Полученную суспензию выделяли центрифугированием и твердую часть суспендировали в 50 мл физиологического раствора, содержащего 1 мМ DTT и опять центрифугировали.
Твердый компонент, составляющий включенные тела, собирали и суспендировали при интенсивном перемешивании при комнатной температуре в 450 мл раствора, содержащего 6 М хлорида гуанидиния, 50 мМ Трис-HCl при рН 8 и 0,1 мМ ЭДТК. Суспензию центрифугировали и супернатант разбавляли в соотношении от 1 к 100 до 1 к 200 в физиологическом растворе, содержащем 50 мМ Трис-HCl при рН 8 и 0,1 мМ ЭДТК при рН 8, подходящего для ренатурации белка. Раствор для ренатурации может содержать аминокислоты, как например глицин или аргинин; смеси соединений, содержащих сульфиды в окисленной и восстановленной форме с образованными дисульфидными мостиками, как например глутатион, этаноламин, цистеин. Ренатурацию проводят при интенсивном перемешивании раствора при 4°С почти в течение 72 часов, затем раствор фильтруют и затем концентрируют с помощью способа диа-фильтрования относительно буфера, полученного из 40 мМ трис-HCl при рН 8 до достижения конечного фактора концентрирования в 5-10 раз. Конечная концентрация раствора обычно составляет между 0,4 и 1,0 мг/мл.
Пример 2.
Очистка рекомбинантного альфа-2b-интерферона (rIFNα-2b)
1 М раствор ацетата натрия добавляют до конечной концентрации 20 мМ к смеси белков, содержащей rIFNα-2b, полученный в примере 1, и смесь доводят до рН 5,5 уксусной кислотой. Полученный таким образом раствор загружают в сильную катионообменную колонку, содержащую коммерчески доступную хроматографическую матрицу Mustang® S (Pall Corporate). Перед загрузкой раствора белков катионообменную колонку кондиционируют с помощью 20 мМ раствора ацетата натрия при рН 5,5 в количестве, равном 20 объемам колонки (OK).
Затем загружают раствор белка в таком количестве, чтобы не превышать количество загружаемых белков, равное 10 мг, на каждый миллилитр стационарной фазы, предпочтительно в количестве, составляющем между 6 и 8 мг/мл.
После загрузки продукты, связанные со стационарной фазой, подвергают первому циклу промывки с помощью солевого раствора при рН 6,1, полученного из смеси моноосновного фосфата калия и двухосновного фосфата натрия в общей концентрации, составляющей между 5 и 15 мМ. Оптимальная концентрация раствора так или иначе фиксируется по тому факту, что его проводимость не должна превышать примерно 1800 мкS. Используют общее количество раствора, составляющее от 5 до 60 OK, предпочтительно между 25 и 35 ОК.
Затем осуществляют второй цикл промывки с использованием того же раствора, что и в первом цикле промывки, к которому добавляют количество хлорида калия, равное конечной концентрации, не превышающей 3 мМ, предпочтительно 2 мМ; используют общее количество раствора, составляющее между 10 и 100 OK, предпочтительно между 30 и 60 ОК.
После циклов промывки осуществляют фазу элюирования с помощью раствора, аналогичного использованному в первом цикле промывки с конечным количеством хлорида калия в концентрации, составляющей от 15 до 25 мМ. Для элюирования используют общее количество раствора, составляющее между 15 и 40 OK, предпочтительно между 20 и 30 ОК.
Все растворы и загруженный образец пропускают через колонку с линейной скоростью, составляющей от 0,1 до 1 см/мин, предпочтительно между 0,4 и 0,7 см/мин.
При данных условиях rIFNα-2b элюируют из колонки со степенью чистоты, превышающей 98%, хотя в исходном растворе степень чистоты составляла примерно 40%, при выходе выделения целевого продукта, превышающем 80%.
Хроматографические профили до и после хроматографической очистки представлены на фиг.1а и 1b.
На фиг.1а показан хроматографический профиль раствора интерферона перед очисткой, а на фиг.1b показан хроматографический профиль после очистки.
Хроматографические профили получали с использованием ВЭЖХ с использованием жидкостного хроматографа HP 1090, колонки Vydac C18 и УФ детектора, установленного при 214 нм. Элюирование проводили при скорости потока 1 мл/мин с использованием смеси двух элюентов, элюент А получали из 700 мл воды, 298 мл ацетонитрила и 2 мл трифторуксусной кислоты, а элюент В получали из 198 мл воды, 800 мл ацетонитрила и 2 мл трифторуксусной кислоты. Два элюента смешивали во время элюирования в соответствии со следующей таблицей:
Время (минуты) % А % В
0 72 28
1 72 28
5 67 33
20 63 37
30 57 43
40 40 60
42 40 60
50 28 72
60 72 28
Пример 3
Способ осуществляли в соответствии с описанием примера 2 с использованием буферного раствора, полученного из моноосновного фталата калия и гидроксида натрия.
Пример 4
Способ осуществляли в соответствии с описанием примера 2 с использованием буферного раствора, полученного из двухосновного цитрата натрия и гидроксида натрия.
Пример 5
Способ осуществляли в соответствии с описанием примера 2 с использованием буферного раствора, полученного из лимонной кислоты и двухосновного фосфата натрия.
Пример 6
Способ осуществляли в соответствии с описанием примера 2 с использованием буферного раствора, полученного из имидазола и хлористо-водородной кислоты.

Claims (8)

1. Способ очистки интерфероновых белков, включающий проведение катионообменной хроматографии на твердой матрице при значении рН более основном, чем рН, соответствующий изоэлектрической точке, pI, очищаемых белков, при таком значении рН, при котором указанные белки все еще остаются абсорбированными, и элюирование указанных белков путем увеличения ионной силы и/или рН водных буферных растворов.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что водные буферные растворы содержат от 5 до 100 мМ буферных смесей, выбранных из смесей, которые получены из моноосновного фосфата калия и двухосновного фосфата натрия, моноосновного фталата калия и гидроксида натрия, двухосновного цитрата натрия и гидроксида натрия, лимонной кислоты и двухосновного фосфата натрия, или имидазола и хлористо-водородной кислоты.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что буферные растворы содержат от 1 до 100 мМ органических или неорганических солей, способных модифицировать ионную силу раствора.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что интерфероновые белки представляют собой альфа, бета, гамма, дельта, омега, тау, природный альфа из лейкоцитов, рекомбинантный альфа-2b и консенсусный интерфероны.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что осуществляют очистку рекомбинантного альфа-2b-интерферона, rIFNa-2b, которая включает загрузку полученной проведением ферментации rIFNa-2b смеси белков, дополненной добавлением 1М раствора ацетата натрия и доведенной до рН 5,5 уксусной кислотой, на колонку, наполненную сильной катионообменной смолой, кондиционированной при рН 5,5 с помощью 20 мМ раствора ацетата натрия, так что на каждый мл стационарной фазы приходится от 6 до 8 мг белка; проведение двух циклов промывки колонки, первый из которых представляет собой промывку буферным раствором при рН 6,1 при концентрации между 5 и 15 мМ, затем - тем же буферным раствором, дополненным 2 мМ хлорида калия, и, в заключение, проводят элюирование чистого rIFNa-2b из колонки с использованием буферного раствора при рН 6,1, содержащего хлорид калия в концентрации между 15 и 25 мМ.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что используемая смола представляет собой сильную катионообменную среду, состоящую из гидрофильного полимера с группами сульфоновой кислоты, сшитыми на полиэфирсульфоновой мембране, а буферные смеси выбирают из смесей, которые получены из моноосновного фосфата калия и двухосновного фосфата натрия, моноосновного фталата калия и гидроксида натрия, двухосновного цитрата натрия и гидроксида натрия, лимонной кислоты и двухосновного фосфата натрия, или имидазола и хлористо-водородной кислоты.
7. Применение способов по любому из предшествующих пунктов для получения активных начал, содержащихся в лекарственных препаратах, на основе интерфероновых белков.
8. Применение по п.7, где интерфероновый белок представляет собой рекомбинантный альфа-2b-интерферон.
RU2002117383/15A 2001-07-06 2002-06-28 Способ очистки интерфероновых белков с помощью катионообменной хроматографии RU2274471C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITBO2001A000426 2001-07-06
IT2001BO000426A ITBO20010426A1 (it) 2001-07-06 2001-07-06 Processo per la purificazione di proteine farmacologicamente attive mediante cromatografia in scambio cationico

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2002117383A RU2002117383A (ru) 2004-01-27
RU2274471C2 true RU2274471C2 (ru) 2006-04-20

Family

ID=11439471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2002117383/15A RU2274471C2 (ru) 2001-07-06 2002-06-28 Способ очистки интерфероновых белков с помощью катионообменной хроматографии

Country Status (27)

Country Link
US (1) US6866782B2 (ru)
EP (1) EP1273592B1 (ru)
JP (1) JP3940037B2 (ru)
KR (1) KR100771252B1 (ru)
CN (1) CN100484954C (ru)
AR (1) AR034663A1 (ru)
AT (1) ATE307824T1 (ru)
BG (1) BG65748B1 (ru)
BR (1) BR0202431A (ru)
CA (1) CA2388716C (ru)
CU (1) CU23149A3 (ru)
DE (1) DE60206847T2 (ru)
DK (1) DK1273592T3 (ru)
DZ (1) DZ3236A1 (ru)
EG (1) EG23150A (ru)
ES (1) ES2250544T3 (ru)
HR (1) HRP20020480B1 (ru)
HU (1) HUP0202124A2 (ru)
IT (1) ITBO20010426A1 (ru)
ME (1) MEP3408A (ru)
MX (1) MXPA02006303A (ru)
PL (1) PL209954B1 (ru)
RS (1) RS51512B (ru)
RU (1) RU2274471C2 (ru)
SI (1) SI1273592T1 (ru)
SK (1) SK287827B6 (ru)
UY (1) UY27354A1 (ru)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2662929C2 (ru) * 2013-03-08 2018-07-31 Джензим Корпорейшн Интегрированное непрерывное производство терапевтических белковых лекарственных веществ
US10071364B2 (en) 2014-01-17 2018-09-11 Genzyme Corporation Sterile affinity chromatography resin
US11369703B2 (en) 2018-08-31 2022-06-28 Genzyme Corporation Sterile chromatography resin and use thereof in manufacturing processes
US11912739B2 (en) 2014-01-17 2024-02-27 Genzyme Corporation Sterile chromatography and manufacturing processes

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2525880C (en) * 2003-05-16 2011-10-11 Cryobiophysica, Inc. External gradient chromatofocusing
JP3920913B2 (ja) * 2004-03-30 2007-05-30 寛 柳澤 タンパク質の分離方法
US7943046B2 (en) * 2004-10-01 2011-05-17 Agilent Technologies, Inc Methods and systems for on-column protein delipidation
US7449116B2 (en) * 2004-10-01 2008-11-11 Agilent Technologies, Inc. Methods and systems for protein separation
ES2532804T3 (es) * 2006-04-12 2015-03-31 Crealta Pharmaceuticals Llc Purificación de proteínas con tensioactivo catiónico
CA2708291A1 (en) * 2007-12-10 2009-06-18 National Research Council Of Canada Production of recombinant interferon proteins
DE102009032179A1 (de) 2009-07-07 2011-01-13 Biogenerix Ag Verfahren zur Reinigung von Interferon beta
CN101768601B (zh) * 2010-02-01 2013-08-07 山东泉港药业有限公司 一种重组人血白蛋白—干扰素α2b的生产方法
JP6292718B2 (ja) * 2011-07-01 2018-03-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 凝集ポリペプチドから単量体ポリペプチドを分離するための方法
US8921113B2 (en) 2012-12-21 2014-12-30 Dionex Corporation Buffer kit and method of generating a linear pH gradient
CN104236983A (zh) * 2013-06-14 2014-12-24 中国科学院大连化学物理研究所 溶液样品中含长烷基链的离子液体的去除方法
WO2016079598A1 (en) * 2014-11-18 2016-05-26 Unichem Laboratories Limited An improved process for the preparation of pharmacopoeial grade interferon alpha 2b
CN106496302B (zh) * 2015-09-08 2021-12-10 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种用离子交换层析纯化蛋白质的方法
GB201517450D0 (en) * 2015-10-02 2015-11-18 Ipsen Biopharm Ltd Method
RU2018124771A (ru) * 2015-12-09 2020-01-13 Басф Се Способ очистки белка от ферментационных твердых веществ при десорбирующих условиях
GB2568936B (en) 2017-12-01 2019-12-25 Ford Global Tech Llc Liquid cooled injector
US11022585B2 (en) 2019-06-09 2021-06-01 Dionex Corporation Methods and systems for optimizing buffer conditions with liquid chromatography
CN111138523A (zh) * 2019-12-10 2020-05-12 天津生机集团股份有限公司 一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法
CN113968900B (zh) * 2020-07-23 2023-07-25 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种纯化C1q蛋白的方法
CN115918902A (zh) * 2022-12-19 2023-04-07 新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种通过微水波扩散重力法预处理葡萄脱水并获取高酚葡萄提取物的方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4228154A (en) * 1979-02-26 1980-10-14 Armour Pharmaceutical Company Purification of plasma albumin by ion exchange chromatography
US4534906A (en) * 1982-11-01 1985-08-13 Genentech, Inc. Removal of impurities from human leukocyte interferon preparations
DE3515336C2 (de) * 1985-04-27 1994-01-20 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon
US5037644A (en) * 1986-10-27 1991-08-06 Cetus Corporation Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation processes
US4732683A (en) * 1986-12-02 1988-03-22 Biospectrum, Inc. Purification method for alpha interferon
US4765903A (en) * 1987-10-06 1988-08-23 Interferon Sciences, Inc. Purification of monomeric interferon
US5250662A (en) * 1989-10-05 1993-10-05 Alpha Therapeutic Corporation Albumin purification
US5849874A (en) * 1991-07-12 1998-12-15 Gist-Brocades, N.V. Process for the purification of serum albumin
IT1262899B (it) * 1992-03-27 1996-07-22 Sclavo Spa Processo per l'isolamento di fattore ix, fattore x e fattore ii altamente purificati dal complesso protrombinico o dal plasma umano
US5440018A (en) * 1992-05-20 1995-08-08 The Green Cross Corporation Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same
US5521287A (en) * 1992-05-20 1996-05-28 The Green Cross Corporation Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same
US5728553A (en) * 1992-09-23 1998-03-17 Delta Biotechnology Limited High purity albumin and method of producing
US5367054A (en) * 1993-04-12 1994-11-22 Stolle Research & Development Corp. Large-scale purification of egg immunoglobulin
DE69522492T2 (de) * 1994-04-09 2002-05-23 Hoffmann La Roche Verfahren zur Herstellung von Alpha-Interferon
JP3702474B2 (ja) * 1994-06-01 2005-10-05 三菱ウェルファーマ株式会社 血清アルブミン製剤の製造方法
US5486470A (en) * 1994-07-21 1996-01-23 Merck & Co., Inc. Purified herpes simplex virus protease and methods of purification
CA2157219C (en) 1994-08-31 2010-10-05 Munehiro Noda Process for purifying recombinant human serum albumin
EP1736483A3 (en) * 1995-09-07 2008-07-30 Pharming Intellectual Property BV Purification of alpha-1 proteinase inhibitor
GB9902000D0 (en) * 1999-01-30 1999-03-17 Delta Biotechnology Ltd Process

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Хроматография. Практическое приложение метода/ Ред. Э.Хефтман. М.: Мир, ч.I, 1986, с.108-109. *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2662929C2 (ru) * 2013-03-08 2018-07-31 Джензим Корпорейшн Интегрированное непрерывное производство терапевтических белковых лекарственных веществ
US10711034B2 (en) 2013-03-08 2020-07-14 Genzyme Corporation Integrated continuous manufacturing of therapeutic protein drug substances
RU2768003C2 (ru) * 2013-03-08 2022-03-22 Джензим Корпорейшн Интегрированное непрерывное производство терапевтических белковых лекарственных веществ
US10071364B2 (en) 2014-01-17 2018-09-11 Genzyme Corporation Sterile affinity chromatography resin
US10919021B2 (en) 2014-01-17 2021-02-16 Genzyme Corporation Sterile chromatography resin and use thereof in manufacturing processes
US11839861B2 (en) 2014-01-17 2023-12-12 Genzyme Corporation Sterile chromatography resin and use thereof in manufacturing processes
US11912739B2 (en) 2014-01-17 2024-02-27 Genzyme Corporation Sterile chromatography and manufacturing processes
US11369703B2 (en) 2018-08-31 2022-06-28 Genzyme Corporation Sterile chromatography resin and use thereof in manufacturing processes

Also Published As

Publication number Publication date
CA2388716A1 (en) 2003-01-06
PL209954B1 (pl) 2011-11-30
ES2250544T3 (es) 2006-04-16
KR100771252B1 (ko) 2007-10-30
HRP20020480B1 (en) 2006-11-30
UY27354A1 (es) 2003-04-30
HU0202124D0 (ru) 2002-09-28
CN1396176A (zh) 2003-02-12
MXPA02006303A (es) 2003-02-10
PL354769A1 (en) 2003-01-13
ATE307824T1 (de) 2005-11-15
US20030010715A1 (en) 2003-01-16
CU23149A3 (es) 2006-06-29
SI1273592T1 (sl) 2006-02-28
AR034663A1 (es) 2004-03-03
US6866782B2 (en) 2005-03-15
HRP20020480A2 (en) 2003-02-28
EP1273592A2 (en) 2003-01-08
ITBO20010426A0 (it) 2001-07-06
BG106768A (en) 2003-05-30
DZ3236A1 (fr) 2005-04-20
JP3940037B2 (ja) 2007-07-04
KR20030005005A (ko) 2003-01-15
CN100484954C (zh) 2009-05-06
RU2002117383A (ru) 2004-01-27
EP1273592A3 (en) 2003-03-19
SK287827B6 (sk) 2011-11-04
BR0202431A (pt) 2003-09-09
DE60206847D1 (de) 2005-12-01
ITBO20010426A1 (it) 2003-01-06
CA2388716C (en) 2008-01-08
MEP3408A (en) 2010-10-10
YU50502A (sh) 2005-09-19
EG23150A (en) 2004-05-31
EP1273592B1 (en) 2005-10-26
BG65748B1 (bg) 2009-09-30
SK8592002A3 (en) 2003-01-09
JP2003096092A (ja) 2003-04-03
DE60206847T2 (de) 2006-07-06
DK1273592T3 (da) 2006-01-02
HUP0202124A2 (hu) 2003-10-28
RS51512B (sr) 2011-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2274471C2 (ru) Способ очистки интерфероновых белков с помощью катионообменной хроматографии
US6399333B1 (en) Process for producing erythropoietin containing no animal proteins
Caprioli et al. A cell division-active protein from E. coli
KR930003665B1 (ko) 에리스로포이에틴의 정제방법
EP0949335B2 (en) Process for preparing purified dimer of bone-derived factor
JPH05279396A (ja) 第ｖｉｉｉ因子の精製法と、それによって得られた調製品
EP0446582B1 (en) Method for producing of recombinant human cysteineless gamma-interferon free of methionine at n-terminal
US4617378A (en) Purification of biologically active human immune interferon
Paus α‐Mannosidase from Phaseolus vulgaris: Composition and Structural Properties
JPH02234692A (ja) ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する蛋白質の精製法
US4845032A (en) Process for the isolation and purification of alpha-interferons
RU2294372C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b И ИНТЕРФЕРОНСОДЕРЖАЩИЙ ПРЕПАРАТ (ВАРИАНТЫ)
JPH022390A (ja) 新規なヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
Heine et al. Stabilization of human fibroblast interferon purified on concanavalin A-agarose
JPH06256399A (ja) ヒト・インターロイキン１１の精製法
RU2020120894A (ru) Способ получения высокоочищенного рекомбинантного ингибитора с1-эстеразы человека для медицинского применения
RU2049793C1 (ru) Способ выделения рекомбинантного проинсулина
RU2007143928A (ru) Способ получения фармацевтического препарата из культуральной среды дрожжей и фармацевтический препарат на основе альфа-интерферона человека (варианты)
JPS60258129A (ja) インタ−フエロンの活性化法
JPH03275700A (ja) 熱ショック蛋白質
JPH06209786A (ja) ヒトパルボウイルス構造タンパク質の精製方法
JPH04135488A (ja) 活性型ヒトリゾチームの製造方法
JPH03259092A (ja) 蛋白質の製造法
JPH022388A (ja) 新規なヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20120629