JPH04135488A - 活性型ヒトリゾチームの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、活性型ヒトリゾチームの製造方法に関する。

より具体的には、ＤＮＡ組換えの手法を利用して微生物
菌体内で生産された不活型ヒトリゾチームを蛋白変性剤
と還元剤で可溶化還元後、蛋白変性剤濃度を二段階に分
けて下げることにより活性型ヒトリゾチームを製造する
方法に関する。

〈従来の技術〉 ヒトリゾチームは、ヒトの涙、唾液、鼻粘膜、乳リンパ
腺、白血球等に見出される酵素タンパク質であり、Ｎ−
アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸量のβ
−１，４結合を加水分解するムラミダーゼとしての酵素
活性を有していることが知られている。ヒト乳由来のり
ゾチームは１３０個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸
配列はすでに知られている。（船津ら、「溶菌酵素」５
５〜５８頁、講談社　サイエンティフィック（１９７７
））ヒトリゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有し
、食品等の防腐剤あるいは医薬品としては抗菌剤、非ア
レルギー性の抗炎症薬として利用することができる。ヒ
トリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する事ができる
が、医薬品等を目的とする工業生産の要求を満たすには
効率が悪く実用的でない。

一方、微生物内で遺伝子を増幅させ、遺伝子由来の産物
を大量に生産させる、いわゆる組換えＤＮＡ技術は、ヒ
トホルモンやヒト由来の酵素の生産に極めて有用である
。しかしながら、大腸菌や酵母などの微生物を宿主とし
て、大量に発現させた場合ヒトリゾチームは全く不活性
である［Ｍ、　Ｍｕ　ｒ　ａ　ｋ　ｉｅｔ　　ａｌ、、
　　ｒＡｇｒｉｃｕｌｕｔｕｒａｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＪ＋　　４９．２
８２９　（１９８５）］。一方、菌体外に活性型で発現
させた場合ヒトリゾチームは少量しか生産されない（特
開平２−４１８）。

〈発明が解決しようとする課題〉 工業的に大量のヒトリゾチームを生産するには、微生物
の菌体内で生産される不活性型ヒトリゾチームを活性型
ヒトリゾチームに変換する必要がある。

この方法としては、不活性型ヒトリゾチームを蛋白変性
剤により可溶化して還元後、精製単離したのち、透析に
より酸化して再生する方法が知られている（特開昭６２
−１６６８８４）が、大量のヒトリゾチームを処理する
には、効率が悪く、操作性が煩雑であるなどの問題点が
ある。

く課題を解決するための手段〉 本発明者らは、不活性型ヒトリゾチームを効率よく再生
する方法を鋭意検討した結果、微生物の菌体内で生産さ
れた不活性なヒトリゾチームを、蛋白変性剤と還元剤の
存在下で可溶化還元したのち、酸化還元剤の存在下で、
蛋白変性剤濃度を可溶化反応時の１／１０〜１／３に下
げて、３時間保持したのち、さらに蛋白変性剤の濃度を
、０〜１／３に下げることにより、活性型ヒトリゾチー
ムを効率よく製造することができることを見出し本発明
を完成した。

以下詳細に本発明を説明する。

本発明で用いられるヒトリゾチームは組換えＤＮＡ技術
を用いたものであれば、コードするＤＮＡは化学合成し
たもの、ｍＲＮＡを基に合成した相補ＤＮＡ＜ＣＤＮＡ
）あるいは半合成したＤＮＡなどいずれでもよい。また
このように得られた該遺伝子を発現させる発現ベクター
としてはいがなるものでもよいが、具体的には大腸菌ベ
クターｐＵｃ１８、大腸閉・酵母シャトルベクターＹＥ
ｐ　１３などが挙げられる。得られたヒトリゾチームを
コードするＤＮＡを含むベクターを用いて各種宿主を公
知の方法で形質転換する。宿主としては例えば大腸菌、
酵母、枯草菌などが挙げられる。得られた形質転換体微
生物を培養し、ヒトリゾチームを発現させた後、通常の
方法により培養液や菌体、あるいは培養液上清を回収す
ることにより不活性なヒトリゾチームを調製することが
できる。

このようにして得られた培養液上清や、菌体破砕液、あ
るいは菌体破砕液の沈澱に蛋白変性剤と還元剤を加え可
溶化還元反応を行うことにより、還元型ヒトリゾチーム
溶液を得ることができる。蛋白変性剤としては、例えば
尿素や塩酸グアニジンなどを使うことができ、塩酸グア
ニジン濃度は４．０〜６０Ｍの範囲で、好ましくは６．
０Ｍで用いる。また還元剤としては、例えば２−メルカ
プトエタノールや、ジチオスレイトールなどを用いる。

還元剤は、０．００５Ｍ〜１．０Ｍの濃度で用いること
が望ましい。

蛋白変性剤を用いるヒトリゾチームの可溶化と、還元剤
と用いる還元型ヒトリゾチームの調製は、別々に行なう
ことができるが、本発明においては、同時に蛋白変性剤
と還元型を用いて、可溶化還元反応を行なっている。

可溶化還元反応を行なった後の還元型ヒトリゾチーム溶
液の蛋白変性剤の濃度を、酸化還元剤の存在化で、反応
時のｌ／１０〜１／３に下げる。その方法として、希釈
、透析あるいは限外ろ過が挙げられる。その濃度で３時
間以上保持したのち、さらに蛋白変性剤の濃度を、０〜
Ｉ／３に下げる。

例えば、蛋白変性剤として塩酸グアニジンを用いた場合
、可溶化還元反応時の塩酸グアニジンの濃度は、６．０
Ｍであり、その後０．７Ｍ　〜２．０Ｍ！：ｍさげ、さ
らにその後０〜０．４Ｍに下げる。

酸化還元剤は、ヒトリゾチームの蛋白分子内のＳＳ結合
を形成させるために添加する。酸化還元剤として、ジス
ルフィド体の酸化物とそのチオール体の組み合わせを用
いることができるが、例えばシスティンとシスチン、あ
るいは酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンなとの
組み合わせが好ましい。

該酸化還元剤として用いる酸化剤と還元剤の濃度比は、
１：５〜１：２０（モル濃度比）にし、総濃度か０．０
０１〜０．１Ｍになるように加えるのが好ましい。

最初の蛋白変性剤濃度低下後は、ｐＨを、６．０〜９．
０、好ましくは７．０〜８．０にした後、１時間〜４８
時間好ましくは３時間〜１２時間攪拌しながら放置する
。

そののち、２度目に蛋白変性剤の濃度を低下させた後は
、１時間〜４８時間、好ましくは３時間から２４時間攪
拌しながら放置する。

可溶化還元反応を行なった後、還元型ヒトリゾチーム溶
液をゲルろ過等の方法を用いて精製し、還元型ヒトリゾ
チーム精製溶液を用いて、その溶液の蛋白変性剤の濃度
を、二段階に分けて下げて、活性型ヒトリゾチームを製
造することも可能である。

還元型ヒトリゾチーム溶液の蛋白変性剤の濃度を下げて
、精製した後、さらに二段階の濃度低下によって、活性
型ヒトリゾチームを製造することが可能である。

上記精製の方法として、通常のゲルろ過等によるものの
以外に、還元型ヒトリゾチーム溶液を、酸性状態で保持
することによって、他の夾雑蛋白を沈澱として除く方法
も、挙げられる。

〈実施例〉 以下の実施例によって本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ ヒトリゾチームの発現 ヒトリゾチームをコードする遺伝子を含むプラスミドを
保持した大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ２９４　（ｐＬＹ−６０）
（特開平２−２７９８８号参照）を、５ｍｌの修正し培
地（１０ｇ／Ｉポリペプトン、５ｇ／ｌイーストエキス
トラクト、５ｇ／ｌＮａＣ１１５０ｍｇ’／１アンピシ
リン）に接種し、３０°Ｃで一夜培養した。培養液１ｍ
ｌを新たな上記培地１００ｍ１に加え、３０°Ｃで４時
間培養後、４１″Ｃで培養温度を上げてヒトリゾチーム
の発現を誘導し、さらに０Ｄ、６゜＝２．０になるまで
６時間培養を継続した。

還元型ヒトリゾチーム溶液の調製 Ｅ、ｃｏｌｉ２９４　（ｐＬＹ−６０）の培養液を６０
０Ｏｒｐｍ、１０分間遠心し、菌体を集め、得られた菌
体を一８０゛Ｃで凍結した。この菌体を、室温で融解し
、１０ｍ１の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，２）に懸
濁し、超音波破砕を１５分間行った。

破砕は検鏡で確認した。破砕液を、８０００ｒｐｍ１０
分間遠心し、ヒトリゾチームからなる凝集体を集めた。

これを、１０ｍ１の可溶化バッファー（６，０Ｍ塩酸グ
アニジン、３．０％ジチオスレイトールを含む５０ｒｎ
ＭＴｒ　１ｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５））に懸濁し、３
０°Ｃで、２時間攪拌しながら可溶化還元し、１１００
００ｒｐ、１０分間の遠心により不溶物を除いて、還元
型ヒトリゾチーム溶液を得た。この溶液のタンパク質濃
度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｍ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、ｒ
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ
、７２，２４８（１９７Ｂ））で定量し、還元型ヒトリ
ゾチームは逆相ＨＰＬＣを用いて定量した。ＨＰＬＣに
よる測定は、逆相系担体（ＹＭＣ−ＰａｃｋＡＰ−３０
３；山村化学研究社製）を用い、０，１２％ＴＦＡを含
む０，１ＭＮａＣ１水溶液中アセトニトリルの直線濃度
勾配による分析条件で行った。得られた還元型ヒトリゾ
チーム溶液の蛋白濃度は、２．８．ｍｇ／ｍｌで、ヒト
リゾチーム濃度は０．７ｍｇ／ｍｌであった。

活性型ヒトリゾチームへの変換 得られた還元型ヒトリゾチーム溶液１０ｍ１を、６．０
Ｍ塩酸グアニジン、２０ｍＭ２−メルカプトエタノール
を含む５０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　　（ｐＨ７５）
緩衝液で平衡化した５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００カラ
ム（２６ｍｍｘ　９０　ｃｍ）にかけ、同緩衝液を溶出
液としてゲル濾過を行い、ジチオスレイトール存在下で
還元した標準ヒトリゾチーム（ミドリ十字社製）と同じ
溶出位置に溶出される画分を回収した。ＨＰＬＣにより
定量した結果、４．８ｍｇの還元型ヒトリゾチーム３８
ｍ１を得た。　得られた画分の蛋白質濃度をｏ、１ｍｇ
／ｍｌに同緩衝液で調整し、０．５１ｍｇの還元型ヒト
リゾチームを含む溶液１２ｍ１を透析液１　（２，０Ｍ
塩酸グアニジン、２５ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＩ　　
（ｐＨ７，５）。

４．０ｍＭシスティン、０．４ｍＭシスチン）に対して
、４°Ｃで、１８時間透析を行い、さらに、透析液２　
（２５ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　
）に対して、４°Ｃで、１４時間透析を行い、活性型ヒ
トリゾチーム液１４ｍ１を得た。

得られた溶液を用いて、ミクロコツカス　リソデイキテ
ィクス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　　Ｉｙｓｏｄｅ　１
ｃｋｔ　ｉ　ｃｕｓ）を使用した濁度活性測定法（ｒＡ
ｇｒｉｃｕｌｕｔｕｒａｌ　　ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＪ。

５０．７１３　（１９８６））により活性を測定したと
ころ、天然型ヒトリゾチームと比活性か同等の０３６ｍ
ｇの活性型ヒトリゾチームが得られ、還元型ヒトリゾチ
ームの７１％が活性型に変換された。

実施例２ 実施例１記載の方法で、ゲルろ過を行なった。得られた
ゲル濾過後の溶出画分６ｍｌ　（還元型ヒトリゾチーム
０．７５ｍｇを含む）を、６．０Ｍ塩酸グアニジン、２
０ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭＴｒ　
ｉ　５−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５）緩衝液２９ｍ１を加
えて蛋白濃度を０．　０５ｍ、ｇ／ｒｎ　１に調整した
。これに、希釈液１　（５０ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ・ＨＣＩ
　　（ｐＨ７，５）　、４．０ｍＭシスティン、０４ｍ
Ｍシスチン）７０ｍｌを加えて塩酸グアニジン濃度が２
．ＯＭになるようにした。希釈液ｌは、マグネティック
スターラーで攪拌しなから４°Ｃで３時間かけて添加し
、３時間放置した。さらに、希釈液２　（５０ｍＭＴｒ
　ｉ　５−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　）４２０ｍｌを３
時間かけてマグネティックスターラーで攪拌しながら添
加し、５時間放置した。得られた溶液を、限外濾過膜Ｙ
Ｍ５（アミコン社製）を用いて２０ｍ１に濃樒し、ヒト
リゾチーム活性を、実施例１の方法に従って測定したと
ころ、天然型ヒトリゾチームと比活性が同等の０．４３
ｍｇの活性型ヒトリゾチームが得られ、還元型ヒトリゾ
チームの５７％が活性型に変換された。

実施例３ 実施例１記載の方法で、還元型ヒトリゾチーム溶液を調
製した。得られた還元型ヒトリゾチーム溶液１０ｍ１を
、水冷下で、マグネティックスターラーで攪拌しながら
、冷却した酢酸４ｍｌを加えて、４°Ｃで終夜放置後、
１５０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により、凝集蛋
白質を含む不溶画分を除いて上清画分を得た。還元型ヒ
トリゾチームを含むこの上清液１．１ｍｌのｐＨを水酸
化ナトリウムで７゜５に調整後、２．０Ｍ塩酸グアニジ
ン、２０ｍＭ２メルカプトエタノールを含む２５ｍＭＴ
ｒ　ｉ　ｓ・ＨＣＩ　（１）Ｈ７，５）緩衝液で蛋白質
濃度が、０゜０５ｍｇ／ｍｌになるよう調整した。この
蛋白液２０．６ｍｌに希釈液３　（５０ｍＭＴｒ　１ｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、４．０ｍＭシスティン、０
．４ｍＭシスチン）４０ｍｌをマグネティックスターラ
ーで攪拌しながら３時間かけて添加したのち、さらに、
希釈液４　（５０ｍＭＴｒ　１ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，
５））１２０ｍｌをマグネティックスターラーで攪拌し
ながら希釈して終夜放置した。得られた溶液を、実施例
２の方法に従って１９．８ｍｌに濃樒し、ヒトリゾチー
ム活性を、実施例１の方法で測定したところ、天然型ヒ
トリゾチームと比活性が同等の０゜２ｒｎｇの活性型ヒ
トリゾチームが得られ、還元型ヒトリゾチームの５２％
が活性型に変換された。

（完）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物の菌体内で生産された不活性なヒトリゾチ
   ームを、蛋白変性剤と還元剤の存在下で可溶化還元した
   のち、酸化還元剤の存在下で、蛋白変性剤濃度を可溶化
   還元時の１／１０〜１／３に下げて３時間以上保持した
   のち、さらに蛋白変性剤の濃度を、０〜１／３に下げる
   ことにより、活性型ヒトリゾチームを得ることを特徴と
   する活性型ヒトリゾチームの製造方法
2. （２）蛋白変性剤として塩酸グアニジンを用い、その濃
   度が可溶化還元時は、６．０Ｍであり、それを０．７〜
   ２．０Ｍに下げ、さらに０〜０．４Ｍに下げることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の活性型ヒトリゾチ
   ームの製造方法