JPH01252283A - 変異ヒトプロウロキナーゼの回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトプロウロキナーゼ（以下ヒトＰＵＫ）を
分子構造的に修飾してなる変異ヒ）ＰＵＫを遺伝子工学
的手法を用いて酵母に産生させ、産生した当該ヒトＰＵ
Ｋを酵母菌体から回収する方法に関する。

〔従来技術〕

従来、線維素溶解酵素としてはウロキナーゼが著名であ
る。このものは、従来人尿および人腎細胞の培養液から
精製されていたが、近年ＤＮＡ組み換え技術による生産
も可能となった（特開昭６０−１８０５９１号明細書）
。しかし、本薬剤は大量に用いると、凝固・線熔諸因子
の分解並びに活性化を惹起し、出血傾向を誘起する欠点
を有している。他方、本発明者らは、人腎細胞によって
産生されるヒトウロキナーゼの不活性型前駆物質ＰＵＫ
（特開昭６０−６２９８１号明細書、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　２６０．１２３７７　（１９８５））が
、ウロキナーゼと異なり出血傾向を惹起することなく血
栓を溶解することを既に見出している（Ｃｅｌｌ　５ｔ
ｒｕｃ、　Ｆｕｎｃ、。

１叶１５１　（１９８５）　）。

このヒトＰＵＫは、３つの機能ドメイン（ｄｏ−ｍａｉ
ｎ）　、すなわち、エピダーマルグロースフアクター（
ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｉｉｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　
、以下ＥＧＦと略称する。）ドメイン、クリングル（ｋ
ｒｉＢｌｅ）ドメイン、酵素活性ドメインから構成され
ている（Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　３６３＋　１１５５（１９
８２）　）。

ところが、本物質はウロキナーゼと同様血中での半減期
が短いため、血栓を溶解する目的のためには、比較的大
量に用いなければならないという問題点がある。

そこで、ヒトＰＵＫよりも血中半減期が長く、しかもヒ
トＰＵＫと同様出血傾向の極めて低い線維素溶解酵素の
開発が進められてきた。

そして、本発明らはヒトＰＩＪＫのＥＧＦドメインの全
領域またはその一部が欠失あるいは他のアミノ酸残基で
置換されている組み換え変異ヒ）ＰＵＫはヒｌ　Ｐ　Ｕ
　Ｋよりも血中半減期が長く、しかもヒトＰＵＫと同様
出血傾向の極めて低いことを見出した（特願昭６２−３
６４９５）。

即ち、当該発明はヒトＰＵＫのＥＧＦドメインの全領域
もしくはその一部を欠失、または該全領域もしくはその
一部を他のアミノ酸残基で置換されている変異ヒトＰＵ
Ｋ、当該変異ヒトＰＵＫをコードするＤＮＡ配列、当該
ＤＮＡ配列が組み込まれたプラスミド、当該プラスミド
によって形質転換された宿主および前記変異ヒ１−ＰＵ
Ｋの製造方法に関するものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

ところで、本発明者らは遺伝子工学の手法を用いて産生
した上記ヒ）ＰＵＫをどのように回収するかについて検
討を行ったところ、酵母が産生したヒトＰＵＫを回収す
る際、酵母菌体を粉砕して当該蛋白質を抽出する工程に
おいて、産生したヒトＰＵＫが不溶化を起こしており、
回収効率が低下することを見出した。

この知見を基に、本発明者らは種々研究を重ねてきたと
ころ、産生したヒｌ−Ｐ　Ｕ　Ｋを、−旦塩酸グアニジ
ンにより可溶化処理を行った後に回収することにより回
収効率が著しく改善されることを見出し、本発明を完成
した。

〔課題を解決するだめの手段〕

即ち、本発明はヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグ
ロースフアクター（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ）　　ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）の全領域
もしくはその一部を欠失、または該全領域もしくはその
一部を他のアミノ酸残基で置換されている変異ヒトプロ
ウロキナーゼをコードするＤＮＡ配列が組み込まれたプ
ラスミドによって形質転換された酵母が産生した変異ヒ
トプロウロキナーゼの回収方法において、塩−グアニジ
ンにより可溶化処理することを特徴とする回収方法であ
る。

（１）変異ヒ）ＰＵＫ産生酵母の調製 ヒトＰＵＫの４１１アミノ酸残基のうち、Ｎ末のセリン
より４９番目のスレオニンまでがＥＧＦドメインと報告
されている（Ｒｉｃｃｉｏ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、、　　１３　
　２７５９−２７７１　　（１９８５）　　〕　。

ＥＧＦドメインをコードする領域の欠失領域の好適な例
としては、Ａｓｎ　　（アスパラギン）（１０）〜Ｃｙ
ｓ　　（システィン）（４２）、八５ｎ（１０）〜＾ｓ
ｐ　　（アスパラギン酸）（４５）、Ａｓｎ　　（１０
）〜Ｔｈｒ　　（スレオニン）（４９）が例示される。

ヒトＰＵＫのＶａｎ−２０−Ｃｙｓ−４２の全領域もし
くはその一部を欠失、またはその一部を他のアミノ酸残
基で置換されている変異ヒ１−ＰＵＫ、およびそれをコ
ードするＤＮＡ配列、ヒトＰＵＫのＣｙｓ−３３〜Ｃｙ
ｓ−４２の全領域もしくはその一部を欠失、またはその
一部を他のアミノ酸残基で置換されている変異ヒトＰＵ
ＫをコードするＤＮＡ配列もまた、好適な対象となりう
る。

欠失処理にはプロティンエンジニアリングとして知られ
る方法が広く利用でき、たとえば５ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃ
ｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　　（部位指定削除）法（Ｎ
ｕｃｌ。

＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、月−＋　１６４５　（１９８３
１）　〕、Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ　　（部位特異的変異）法、制限酵素処理と合
成遺伝子の利用による方法などが例示される。

欠失処理された変異ＰＵＫは、発現ヘクター系に挿入し
て、発現用宿主・ヘクター系を構築する。

宿主・ヘクター系は一般に宿主細胞とコンバーチプルな
種から由来するレプリコンと制御配列を有するプラスミ
ドヘククーと、この宿主を組み合わせて使用する。ヘク
ターは一般に複製部位を有しており、また形質転換細胞
中で表現型の選択が可能となるマーカーの配列を有して
いる。

酵母ベクターにおける適当なプロモーターとしては、３
−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）のプロモータ
ー（Ｈ４ｔｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　（、ｈｅｍ、。

２５５、２０７３　（１９６８）　）や他の解糖系酵素
（ｌｌｅｓｓ　ｅｔａｌ、　Ｊ、　Ａｄｖ、、　Ｅｎｚ
ｙｍｅ　　−Ｒｅｇ、、　７．１４９（１９６Ｂ）；１
ｌｏ１１ａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、　１７．４９００（１９７８））であるエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ＧＡＰ−Ｉ）Ｈ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカ
ルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース
−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセルリン酸
ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナ
ーゼの様な酵素のプロモーターが例示される。

これらの中でも、小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーター、Ｐ
ＧＫプロモーターが、特に有用である。適当な発現ベク
ターを作製する場合、これらの遺伝子に存在する転写終
結配列もまた、発現したい遺伝子の３°側に挿入し、ｍ
ＲＮＡのポリＡ化と転写終結が生しる様にする。増殖条
件により、転写の制御ができる様な利点を有するブロモ
−クーとして、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロムＣ１酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連した
分解酵素、前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、あるいはマルトースやガラクトースを使
用するのに関連した酵素のプロモーターも使える。酵母
のコンバーチプルプロモーター、複製起点および転写終
結配列を含むすべてのプラスミドベクターが使える。そ
して宿主とし７　は、Ｓａ夏烟耶猟匹競ｃｅｒｅｖｉ■
並ＧＲＦ１８株、ＡＨ２２株などが使用される。

宿主細胞（酵母）の形質転換は公知の方法、たとえば、
リン酸カルシウム沈澱法、プロトプラストポリエチレン
グリコール融合法、エレクトロポレーション法などによ
り行う。

必要な形質転換体を選択する。

（２）培養 形質転換株は、宿主細胞用として自体公知の培地で培養
される。培地としてはＹＮＢ液体培地〔０７％Ｙｅａｓ
Ｌ　Ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ　（Ｄｉｆｃｏ社）
、２％グルコース〕、およびＹＰＤ液体培地〔１％イー
ストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社）、２％ポリペプト
ンＣ大大束栄養）、２％グルコース〕などが例示される
。

培養は、通常１５〜４３°Ｃ（好適には３０°Ｃ程度）
で２０〜１００時間程度行い、必要により通気や攪拌を
加えることもできる。

（３）抽出 変異ヒ）ＰＬＪＫを産生ずる酵母菌体をｐ）１７〜９の
緩衝液（たとえば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液な
ど）に懸濁後、菌体を粉砕した後、変異ヒトＰＵＫを菌
体内外から抽出する。

菌体の粉砕に際しては既知の方法、たとえば、凍結乾燥
法、ガラスピーズ法、高圧法、超音波処理法、酵素処理
法などが挙げられる。

遠心分離後に沈澱画分が回収される。

この沈澱画分においては、変異ヒＩ・Ｐ　Ｕ　Ｋは不溶
化しているので、これを可溶化処理する。その際、本発
明による塩酸グアニジンによる可溶化処理が行われる。

当該可溶化処理は、たとえば上記沈澱画分を１〜ＩＯＭ
塩酸グアニジンを含有するｐＨ８〜１０の緩衝液（たと
えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液など）に懸濁す
ることによって行われる。塩酸グアニジン溶液としての
添加量は、通常菌体残渣３０〜６０ｇ当たり２００〜５
００　ｍｌ程度が好適である。可溶化処理温度としては
２〜６°Ｃ程度が好適であり、処理時間としては６〜２
４時間程度が好適である。

上記可溶化処理後、遠心分離してよ清両分を回収して、
再度塩酸グアニジンによる可溶化処理を行うことが好ま
しい。この際、通常上記第１回目の処理より若干低濃度
の塩酸グアニジンにて処理される。また、塩酸グアニジ
ンの他に、酸化型グルタチオン、還元型グルタチオンの
存在下に処理されることが好ましく、さらにアルギニン
を存在させることが好ましい。特に好ましい処理液の組
成は、塩酸グアニジン１０〜２０ｇ／１００ｍＮ、アル
ギニン５〜１５　ｇ／　１００ｍｆｌ、酸化型グルタチ
オン４０〜６０■／　１００　ｍｌおよび還元型グルタ
チオン８０〜１２０ｍｇ／　１００ｍｆｌを含むｐ（）
８〜１０の緩衝液（たとえば、トリス塩酸緩衝液、リン
酸緩衝液など）である。可溶化処理は、当該処理液に遠
心分離上清画分を添加することによって行われる。添加
量としては上清両分の２〜８倍程度が例示される。

混合条件としては室温（１５〜２５°Ｃ程度）で２〜５
時間時間跡挙げられる。

その後、５〜１５ｍＭアルギニンを含有するｐ１１７〜
９の緩衝液（たとえば、１〜リス塩酸緩衝液、リン酸緩
衝液など）で透析する。

（４）精製 変異ヒトＰＵＫの精製は、既知のヒトＰＵＫの精製法に
準じて行うことができる（特開昭６０−６２９８１号明
細書）。たとえば、ａｎｔｉ−ＵＫ　ＩｇＧ−５ｐｈａ
ｒｏｓｅ　　４Ｂ＋　　ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉ
ｄｉｎｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　　６Ｂのカラムクロマ
トグラフィーの併用が好ましいが、特に５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　６Ｂは粗精製に、ａｎｔｉ−ＵＫ　ＩｇＧ−５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂは高度精製に、さらにｐ−ａｍｉ
ｎｏｂｅｎｚ−ａｍｉｄｉｎｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　
６Ｂは混入活性型ウロキナーゼの除去に各々、特に有効
である。

（５）性状 かくして得られた産生物を解析したところ、ＰＵＫ活性
においては変異型および非変異型で全く差はなく、変異
型ＰＵＫは、分子量的４２，０００の一木鎖型のプロエ
ンザイムであり、糖鎖をもたず、プラスミン処理により
完全に活性型に変換する。

更にこの変異ヒ）ＰＵＫの血中半減期を人腎細胞由来Ｐ
ＵＫ　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６０　１
２３７７（１９８５））のそれと比較すると、変異ヒト
プロウロキナーゼの血中半減期のほうが有意に長い。

〔発明の効果〕

本発明は、ウロキナーゼの前駆体型の生理的意義を有し
た変異ヒ）ＰＵＫを、より生産性高く提供することを可
能にするものである。

即ち、本発明の回収方法により、酵母が産生した不溶化
している変異ヒトＰＵＫを可溶化し、効率的に抽出する
ことができる。

従って、本発明の方法は、遺伝子工学的手法を用いて得
られた当該変異ヒ１−ＰＵＫ　（即ち、既知ヒトＰＵＫ
、ウロキナーゼに比して血中内半減期が有意に延長され
た変異ヒトＰＵＫ）を回収する方法として極めて有用で
ある。

〔実施例〕

本発明をより詳細に説明するために、実施例を挙げるが
、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない
。

実施例１ （１）組換え酵母の調製 組換えプラスミドｐＵｌ１３３は特願昭６２−３６４９
５号明細書に開示したｐｃｃｓおよびｐＵＩ−１２３か
ら構築した。その手順を第１図に示す。

このｐＵＨ３３は酵母グリセロアルデヒド−３−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼプロモーター、ヒトＰＵＫをコ
ードするＤＮＡ配列（第３図参照）中、１０番目のＡｓ
ｎから４２番目のＣｙｓまでのＤＮＡ配列を欠失した変
異ヒトＰＵＫをコードするＤＮＡ配列、酵母グリセロア
ルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼクーミネ
ーターを含むプラスミドである（第２図参照）。

変異ヒトＰＵＫ発現用プラスミドｐυ１１３３を酵母サ
ツカロミセスセレビシェＡＨ２２に以下の方法により導
入した。

ＹＰＤメディウム（イーストエキストラクト１０ｇ、ハ
タトペプトン２０ｇを水に溶解し９００ｍ１とした後オ
ートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ滅菌した２０
％グルコース１００戚と混合した。）５０ｍｌ中３７°
Ｃ１−夜振盪培養したサツカロミセスセレビシェＡＨ２
２を遠心し、得られた細胞を水２０ｄに懸濁後、再度遠
心して細胞を得た。

これを１０雁の５０１ジチオスレイトール、１，２Ｍソ
ルビトール、　　２５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ８，５
に懸濁後、３０°Ｃで１０分分間中かに振盪した。遠心
により細胞を集め、１．２Ｍソルビトール１０ｍ１に懸
濁し、再度遠心により細胞を集めた。細胞を１０　ｍｆ
ｌの１．２Ｍソルビトールに懸濁し、遠心により細胞を
集めた。細胞を１０ｍＮの０．２ｍｇ／Ｉｎ１ザイモリ
アーゼ１００Ｔ、１．２Ｍソルビトール ０、　１　Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．８に懸濁後
、３０°Ｃ″？：１時間穏やかに振盪した。遠心で細胞
を集め、１．２Ｍソルビトール、次いで１０ｍＭ塩化カ
ルシウム、１．２Ｍソルビトール各１０ｍ！で洗浄し、
遠心で細胞を集めた。細胞を１　ｍＲの１０ｍＭ塩化カ
ルシウム、１．２Ｍソルビトールに懸濁した。懸濁液１
００μ尼を滅菌試験管にとり、５μ！（５μｇ）のｐｔ
ｌｌ１３３と混合し、室温に１５分間静置した。更に、
１．２−の２０％ポリエチレングリコール４０００゜１
０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ７
，５を加え穏やかに混合後、室温で２０分間静置した。

遠心で細胞を集め、０．１　ｍｌの１．２Ｍソルビトー
ル、１０ｍＭ塩化カルシウム含有ＹＰＤメディウムに懸
濁し、３０゛Ｃで３０分分間中かに振盪した。

懸濁液１，５，１０．２０および５０μ！をそれぞれ４
５°Ｃに保温したｌｏｍＩＬの１，２Ｍソルビトール、
３％ノープルアガー、２％グルコース３０．７％イース
トナイト口ジェンヘースに懸濁し、１．２Ｍソルビトー
ル、３％ハタトアガー、２％グルコース、０．７％イー
ストナイト口ジェンヘースから成るプレートに拡げた。

プレートが固化したら、３０°Ｃで３日間静置培養した
。形成したコロニーを爪楊枝で採取し、３　ｍｆｌのＳ
Ｄメディウム（０，７％イーストナイト口ジエンヘース
、２％グルコース）に懸濁後、３０°Ｃで２日間振盪培
養した。そのうちの０１３ｍ１を遠心し、細胞を集め３
ｍβのＹＰＤメディウムに懸濁し、３０°Ｃで振盪培養
した。

（２）変異ヒトＰＵＫ発現酵母の培養 （１）で述べたｐＨ）１３３で形質転換され変異し）Ｐ
ＵＫ蛋白質を発現する酵母サツカロミセスセレビシェＡ
Ｈ２２を以下のように培養した。０．７％イーストナイ
ト口ジェンヘース、２％グルコース、３％ハクトアガー
から成るプレートで生育した上記組み換え酵母を白金耳
で採取し、５００　ｄの０．７％イーストナイト口ジェ
ンヘース、２％グルコースから成るＳＤメディウムに接
種し、３０°Ｃで２日間培養した。遠心により細胞を集
め、５ＬのＹＰＤメディウムに懸濁し、３０°Ｃで振盪
培養した。

（３）抽出・精製 ■菌体湿重量４００±５０ｇを調製する（培養液５〜１
０Ｌ）。

０５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ，０）　０．８〜１
１を混和し、ダイノミルで菌体をホモジネート（３００
０ｒｐｍ、　５分間）する。

■遠心分離（４００Ｏｒｐｍ、３０分間）し、沈澱画分
を回収する。

■沈澱画分に６Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ９，０）２、８
１！、を混和し、４°Ｃで一装置く。〔可溶化〕■■遠
心分離４０００　ｒｐｍ、３０分間）し、上清画分を回
収する。

■上清画分に再構成用緩衝液（１００ｍｆｆｉ当たり、
塩酸グアニジン１６ｇ１アルギニン１０ｇ１酸化グルタ
チオン５０ｍｇおよび還元グルタチオン１００ｍｇを含
有、ｐＨ９）１２．８ｆを混和、室温で２時間以上置く
。〔再構成〕 〔 ０１０ｍＭアルギニン含有リン酸緩衝液で透析すと る。

■ＵＫ抗体を用いてアフィニテイクロマトグラフィーを
行う。

吸着条件：Ｑ、４Ｍ塩化すトリウム含有０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０） 溶出条件：Ｑ、５Ｍ塩化ナトリウム含有０．２　Ｍグリ
シン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，５） 実施例２ 可溶化側の種類と抽出効果の関係を調べた。

実施例１で用いた６Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ８）の代わ
りに第１表で示した各薬剤を用いた。抽出効果はＵＫ活
性（ＲＰＨＡ法、フィブリン平板法）により判断した。

その結果を第１表に示す。

第１表 ｍＰＰ八＊へ（ｘｌｏ３１Ｌｌ）／ｇ（菌体）　　ｍＰ
ＰＡ（ｘｌｏ３１１１）／ｇ（培地）ＲＰＨＡ　　　Ｆ
ｉｂｒｉｎ平板　　　ＲＰＩＩ＾　　Ｆｉｂｒｉｎ平板
’ｐｔ　＊　　　　　　１．６　　　　４．１　　　７
４．１　　　１８５．２ｉｕｐ　＊　　　　　　０．４
　　　　０．２５　　　１Ｂ、０　　　１１．４ｉＭ　
　クアニンン、　　ｐＨ８３，４４，９１５２，４２１
９，０３Ｍ　　尿素、　ｐＨ９２，８０，９１２６，９
３９，７〕ｔ１２．４　　　　　Ｎ、Ｄ、　　　　ＯＮ
、０．　　　０）Ｈｌｏ、０　　　１．９　　　０　　
　　Ｂ４．６　　　０２Ｍ　ＫＳＣＮ、　ｐＨ２Ｎ、Ｄ
、　　　　ＯＮ、０．　　　０２Ｍ　ＤＴＴ、　ｐＨ８
１，４０６３，５０＊ｐｐｔ：酵母ホモジネートを遠心
した後の沈澱中の変異ヒ１−ＰＵＫ（Ｊ！ＩＩち、可溶
化処理剤不使用時の変異ヒトＰＵＫ） 本Ｓｕｐ　　−酵母ホモジネ−１・を遠心した後の上清
中の変買ヒトＰＵＫ（即ち、可溶化処理剤不使用時の変
異ヒトＰＵＫ） ＊　ｍＰＰＡ　：変異ヒトＰＵＫ

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵母用変異ヒ）ＰＵＫ発現用プラスミドｐＨ
ｌ−１３３を構築する手段を示す。 第２閲は、ｐＨＨ３３の構造および制限酵素地図を示す
。 第３同は、ヒトＰＵ、ＫをコートするＤＮＡ配列を示す
。 Ｃ１ａＩ ｍ−ＰＰＡ　Ｖ云”ｒ−ｆｒｐ　ａ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグロースフアクタ
   ー（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ
   ）ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）の全領域もしくはその一部
   を欠失、または該全領域もしくはその一部を他のアミノ
   酸残基で置換されている変異ヒトプロウロキナーゼをコ
   ードするＤＮＡ配列が組み込まれたプラスミドによって
   形質転換された酵母が産生した変異ヒトプロウロキナー
   ゼの回収方法において、塩酸グアニジンにより可溶化処
   理することを特徴とする回収方法。