JPH02503635A - 原核生物中で発現されたプラスミノゲン活性化因子の調製物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 原核生物中で発現されたプラスミノゲン活性化因子の調製物本発明は、活性な、 原核生物中で発現されたプラスミノゲン活性化因子（ｐ−ｔ−ＰＡ）の含有率が 非常に高く、かつ生物学的活性が高い組換えｐ−ｔ−ＰＡの調製物、該調製物の 製造方法、およびその適用に関する。

フィブリン溶解システムの活性化は、血液凝固におけると同様の反応カスケード において生理学的条件下で進行する。このカスケードの中心的な反応は、プラス ミノゲンのプラスミンへの活性化である。次に、プラスミンは、凝固した血液の タンパクマトリックスの主成分であるフィブリンを溶解する。フィブリンに特異 的に結合するプラスミンの能力により、組織型プラスミノゲン活性化因子１−Ｐ Ａは、一般に、生理学的に活性なプラスミノゲン活性化因子とみなされる［マツ オ（Ｍａｔｓｕｏ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２９１　（１９８１）、 ５９０］。このフィブリン表面上での酵素活性中心が、プラスミンを病的脈管閉 塞（例えば、心筋梗塞における）の治療に適した薬物としている。ｔ−ＰＡの適 用にかけられた望みは、広範な臨床研究において大部分は確認された［コレン（ Ｃｏｌｌｅｎ）ら、サーキユレーション（Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ）　７０、（ １９８４）、１０１２　：サーキニレーション７３、（１９８６）、５１１］。

大量のｔ−ＰＡの単離に関するいくつかの方法が既に提案されている。例えば、 療法学的適用について必要な雪のｔ−ＰＡを製造することができる異なる哺乳動 物の細胞系が開示された［リイケン（Ｒｉｉｋｅｎ）およびコレン（Ｃｏｌｌｅ ｎ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ、　）　２５６、（１９８１）、７０３５　；　）　ｌ／ン（Ｃｏ ｌｌｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・ファーマコロジイ・アンド・イクスペリメン タル・セラビューティクス（Ｊ　、　Ｐ　ｈａｒｍ、　Ｅ　ｘｐ、　Ｔ　ｈｅｒ 、　）胆、（１９８４）、１４６；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、モレキュ ラー・アンド・セルーラー・パイオロジ４　（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂ　ｉｏｌ 、）　互、（１９８５）、１７５０］。しかし、このような細胞の培養は、比較 的困難であり、高価である。イー・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）中でのｔ−ＰＡ　ｃＤ ＮＡのクローニング［ペン二カ（Ｐｅｎｎｉｃａ）ら、ネイチャー　（Ｎ　ａｔ ｕｒｅ）　３０、（１９８３）、２１４−２２１］以来、原核生物系中での酵素 の発現に関する方法が広げてきた。原核生物中で産生されたプラスミノゲン活性 化因子は、２〜３位でグリコジル化される哺乳動物の細胞由来のｔ−ｐＡとは対 照的にグリコジル化されない。以下、真核生物のｔ−ＰＡと区別するためにｐ− ｔ−ＰＡ（原核生物のｔ−ＰＡ）と称する。しかし、ｐ−ｔ−ＰＡは、細菌中で 発現された多くの他の真核生物タンパクと同様に、不活性凝集形態、いわゆる封 入体（ＩＢ’ｓ）の形で細菌中に蓄積され、天然活性構造を形成するための正し いひた形成（ｃｏｒｒｅｅｔ　ｆｏｌｄｉｎｇ）は生じない。これらタンパク凝 集物は、しばしば、細菌のタンパクによっても汚染される。ｐ−ｔ−ｐＡの場合 、これらは主に外膜タンパクおよび延長因子Ｅ　Ｆ−Ｔｕであるしブリンクマン （Ｂ　ｒｉｎｋｍａｎｎ）、１９８７、ジプロマルバイト（Ｄ　ｉｐｌｏｍａｒ ｂｅｉｔ）、ウニベルシテット・ミュンヘン（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔＭｔ　ＭＬｌ ｎｅｈｅｎ）］。さらに、このような不溶性封入体の形態で蓄積される不純なタ ンパク調製物は、タンパクの正しいひだ形成を生じさせるために、原核細胞中で それらが発現した後、まず可溶化させ、変性させ、次いで、復元させなければな らない。

しかし、今までに知られている方法を用いて、活性形態で、封入体中の利用可能 な物質を比較的少量しか得ることができなかったので、復元の後、ｐ−ｔ−ＰＡ の比較的低い比活性しか得ることができなかった。さらに、活性ｐ−ｔ−ＰＡ含 有率は、異種タンパクの存在によって制限された。

本発明の目的は、原核生物中で発現されたｐ−ｔ−ＰＡを、できる限り高収率お よびできる限り高純度で製造することである。

この目的は、全タンパクに対して９０％以上の活性ｐ−ｔ−ＰＡ含有率および０ ．４　Ｘ　１０＠Ｉ　ＬＪ／３１９以上の比活性を有する、原核生物中で発現さ れる組換えＰ−ｔ−ＰＡの調製物による本発明に従って達成される。

好ましい態様において、本発明のｐ−ｔ−ＰＡ調製物は、９５％以上、特に９８ ％以上の活性ｐ−ｔ−ｐＡ含有率を有している。

本発明の別の態様は、ｐ−ｔ−ＰＡを発現する原核細胞を溶解し、Ｉ　Ｂ’ｓを 単離し、変性および還元条件下でＩ　Ｂ’ｓを可溶化し、混合ジスルフィドに誘 導し、次いで、制御されたレドックス条件下で復元させることからなる組換えｐ −ｔ−ｐＡの調製物の製造方法において、該復元の後、復元混合液中でｐ−ｔ− ＰＡを濃縮し、次いで、アフィニティークロマトグラフィーによってクロマトグ ラフ精製を行い、全タンパクに対して９０％以上の活性ｐ−ｔ−ＰＡ含有率およ び少なくとも０．４　Ｘ　１０”　Ｉ　Ｕ／ｘｇの比活性を有する原核生物中で 発現される組換えｐ−ｔ−ＰＡの調製物を得ることを特徴とする組換えｐ−ｔ− ｐＡの調製物の製造方法である。

本発明の製造方法の使用によって、驚くべきことに、原核生物中で発現されたｐ −ｔ−ＰＡを、非常に純粋な形態で、異種タンパクを含有せずに、９０％以上の 活性ｐ−ｔ−ＰＡ含有率で成功裏に製造することができたことが実証された。

ｔ−ＰＡプラスミドを含有する全ての原核生物が、該製造方法に適している。こ のような原核生物およびプラスミドは公知である。

ＥＰ−Ａ−０２４２８３５に開示されているプラスミドが特に適しており、プラ スミドｐｅＰＡ１３３を用いるのが好ましい。

ｐ−ｔ−ＰＡを発現する原核生物の細胞溶解は、通常の方法に従って、例えば、 トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ　　１００およびＮａＣＱの存在下でリゾチーム で処理し、次いで、高圧分散させることによって行われる。

変性または還元条件下での可溶化および酸化条件下での復元は、例えばＥＰ−Ａ −０２５３８２３に記載された既知の方法を用いて行うことができる。

全ての通常の変性剤またはアルギニンは、可溶化工程のための変性剤として使用 することができる。公知の変性剤であるグアニジン・塩酸塩、尿素またはその誘 導体が好ましい。さらに、これら変性剤の混合物を使用することができる。また 、例えばＥＰ−Ａ−０１１４５０６によって知られている変性剤を使用すること ができる。還元剤としては、例えば、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）または２− メルカプト−エタノールのようなチオール類による還元剤を用いるのが好ましい 。これらは、約５０〜４００ミリモル／ｇの濃度で使用することができる。さら に、好ましい還元剤は、例えば約８０〜４００ミリモル／１２の濃度のＤＴＥ（ ジチオエリトリトール）およびＤＴＴ（ジチオトレイトール）である。１〜数時 間、好ましくは２時間、可溶化するのが好都合である。周囲の酸素による還元剤 の酸化を防止するためにＥＤＴＡを添加することができる。

上記の欧州出願ＥＰ−Ａ−０２５３８２３に開示されているように、直接または ｐ−ｔ−ＰＡからＧ５５Ｇおよびｐ−ｔ−ＰＡの混合ジスルフィドへの転換を介 して復元を行うことができる。これに必要な反応条件も、該欧州出願に詳細に説 明されている。

本発明のｐ−ｔ−ＰＡ調製物の製造方法では、ｐ−ｔ−ＦＡを、その復元の後に 復元混合物中で濃縮し、その後、異種タンパクをアフィニティークロマトグラフ ィーによって除去する。

復元混合物中でのＰ−ｔ−ＰＡの濃縮は、公知の方法によって行うことができる ；少量の場合は硫酸アンモニウム沈降法が好ましいが、大量の場合は血液透析器 中での濃縮が好ましい。

硫酸アンモニウム沈降法の場合、遠心分離および繰り返し遠心分離の後、再度ペ レットを洗浄し、再酸化緩衝液中にそれを溶解するのが好都合である。

本発明方法は、特に２５〜１００Ｃ）１モル／Ｑの濃度のし一アルギニンの存在 下で行うのが好ましい。

本発明の好ましい態様において、本発明に係るアフィニティークロマトグラフィ ーによる異種タンパクの除去は、ＥＴＩ（エリトリナートリプシン−阻害薬）吸 着カラムによるクロマトグラフィーによつて行われる。このために、ＥＴＩを、 例えばセファロース（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）のような支持物質（吸着剤）上に 固定する。ＥＴＩ吸着カラムによる精製は、０．８ミリモル／Ｑアルギニンと同 じ濃度のアルギニンの存在下でさえ、濃縮された再酸化溶液でカラムのＥＴＩ吸 着物質を直接負荷することができるという長所を有している。従って、２５ミリ モル／ｅ以下の低いアルギニン濃度で生じ得るｐ−ｔ−ＰＡの凝集が回避される 。ＥＴＩ吸着カラムによるｐ−ｔ−ＰＡ調製物の精製は、０，５〜］、０Ｍアル ギニンの存在下で行うのが特に好ましい。この工程において、ｐ−ｔ−ＦＡ含有 溶液は、ｐＨ６，５以上であり、特に好ましくは７以上である。

ＥＴ２カラムからの溶離は、原核生物中で発現されたｔ−ＰＡを良好に溶解させ る条件下、アルギニンの存在または非存在下、ｐＨを低下させることによって行 われる。好ましい溶離において、ｐＨは弱酸領域であり、特に好ましくは５．５ 〜６．５の範囲である。

本発明に従って製造されたＰ−ｔ−Ｐ　Ａ調製物は、＞０．４Ｘ１０’ＩＬ７／ ｕのｔ−ＰＡ比活性を有し、フィプリノゲン開裂生成物によって１０倍以上（フ ィプリノゲンペブチド存在下での活性／フィブリノゲンベブチド非存在下での活 性）刺激され得る。本発明の調製物の純度は９０％以上であり、好ましくは９５ ％以上であり、特に好ましくは９８％以上であり、該純度を５ＤＳ−ＰＡＧＥお よびＲＰ−ＨＰ　Ｌ　Ｃ（逆相ＨＦ’ＬＣ）によって検出した。本発明に従って 製造されたｐ−ｔ−ＰＡＲ製物が血餅を溶解する能力を、ラビフ）モデルにおい て検出した。さらに、本発明のｐ−ｔ−ＰＡ−１］製物のクリアランス速度を、 ラビットモデルにおいて測定した。原核生物中で発現されるｔ−ＰＡと比較する と、本発明のｐ−ｔ−ＰＡｇｌ製物は、血漿から非常にゆっくりとした速度で消 失する。

本発明の別の態様は、ヒトおよび動物における血餅溶解用薬物としての、高い活 性ｐ−ｔ−ＰＡ含有率有し、かつ高純度である本発明ｐ−ｔ−ＰＡ調製物の使用 を提供するものである。本発明の調製物は、さらに、例えばアルギニン、尿素（ 例えば、各々、１００ミリモル／ｆｆ）のような医薬的に許容される添加剤およ び補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）ならびに緩衝剤成分を含有することができる。

以下の実施例および図面によって本発明をさらに説明する。

１１図は、ＥＴＩ−セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーに よる精製の前および後の５ＤＳ−ＰＡＧＥを示す模式図である。

第２図は、ＥＴＩ−セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーに よるイー・コリ由来ｐ−ｔ−ＰＡの精製の後のＲＰ−ＨＰＬＣを示すチャートで ある。

第３図は、イー・コリ由来ｐ−ｔ−ＰＡとフィブリンとのインビトロ結合率を示 すグラフである。

第４図は、ラビットにおける注入の間およびその後のｐ−ｔ−ＰＡ活性の経時変 化を示すグラフである。

実施例１ イー・フリ由来活性ｐ−ｔ−ＰＡ調製物細胞溶解および封入体（ＩＢ’ｇ）の調 製湿重量１．６＆９の細胞［イー・コリ、ＤＳＭ　３６８９、ＥＰ−Ａ−０２４ ２８３５に記載されたプラスミドｐｅＰＡ１３３によって形質転換された］を、 ０．１モル／Ｑ　）リス（Ｔ　ｒｉｓ）−ＨＣＱ、　２０ミリモル／Ｑ　ＥＤＴ Ａ（ｐＨ６，５）１０１２に４℃で懸濁させた。これにリゾチーム２．５９を添 加し、４℃で３０分間インキュベートした；その後、高圧分散によって完全な細 胞溶解を行った。該溶解産物溶液を、０．１モル／１トリスーＨ（Ｊ、２０ミリ モル／ｊＥＤＴＡ。

６％トリトン（Ｔ　ｒｉｔｏｎ）−Ｘ　−１００および１．５モル／Ｑ　ＮａＣ （ｌｃｐＨ６，５＞５０と混合し、４°Ｃでさらに３０分間インキュベートした 。

この後、不溶性成分（ＩＢ’ｓ）を遠心分離によって分離した。

ペレットを０．１モル／ぐ　トリス−ＨＣ（，２０ミリモル／ρＥＤＴＡ（ｐＨ ６，５）１０ｆｆに懸濁させ、４℃で３０分間インキニベートし、次いで、ＩＢ −１製物を遠心分離によって単離した。

ＴＢ’ｓの可溶化 ０．１モル／Ｑ　トリス−ＨＣ（，６モル／Ｑグアニジン・ＨＣＩ！、０゜２モ ル＃　ＤＴＥ、１ミリモル／（２ＥＤＴＡ（ｐＨ８，６）４５０峠にＩＢ’ｓ　 １００９（湿重量）を懸濁させ、次いで２５°Ｃで２．５時間撹拌した。

ＨＣｌ２（２５％）でＰＨを３に調節した後、該溶液を１０ミリモル／ＱＨＣρ に対して透析した（３　Ｘ　５０１２．２４時間、４℃）。

誘導 １０ミリモル／ＮＨＣ（による上記透析の最終希釈の後にグアニジン・ＨＣＣ濃 度が６モル／Ｑになるような量の固形グアニジン・ＨＣｌを添加した。

該調製物を、２５℃で１．５時間、予めインキュベートし、その後、Ｇ５５Ｇ濃 度を０．１モル／１に、そしてトリス−ＨＣρ濃度を０゜０５モル／ａに調節し 、５モル／ＱＮ！１０Ｈで滴定してｐＨを９．３に調節した。該調製物を２５° Ｃで３．５時間撹拌した。

Ｈ（Ｊ！（２５％）でｐＨ３に調節した後、該溶液を１０ミリモル／１２Ｈ（Ｊ ’１ｍ対して透析Ｌり（３Ｘ　１００ｆｆ、　４８時間、４°Ｃ）。透析ノ後、 調製物を遠心分離し、透明な上澄み液をさらに処理した。

復元 １０ｆｆの反応容器に、０．１モル／Ｑトリスー）（Ｃ４，０，８モル／ＱＬ− アルギニン、２ミリモル／１２ＧｓＨ，１ミリモル／ＣＥＤＴＡ（ｐＨ８，５） を入れた。２０℃で、２４時間おきに、誘導体（混合ジスルフィド、上記参照） ｌｏｏｉ＆を３回添加することによって復元を行った。

復元の後、１００００〜２００００　１１Ｊ／ｙの比活性を有する調製物を得た ［エイチ・リル（Ｈ，Ｌ　１ｌｌ）（２，Ｇｅｓ、　Ｉ　ｎｎ、Ｍｅｄ、、醪、 ４７Ｂ、１９８７）に従って変えたジェイ・エイチ・ヘルハイヘン（Ｊ、Ｈ。

Ｖ　ｅｒｈｅｉｈｅｎ）等（スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏ ｍｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓ；）、４８．２６６．１９８２）による試験法］。

濃縮 必要であれば、復元調製物を、硫酸アンモニウムによる沈降法または限外濾過法 によって濃縮することができる。

硫酸アンモニウム沈降法において、復元溶液のｐＨをｐＨ７，５に調節した。該 沈降法は、４°Ｃで、固体（ＮＨ，）、Ｓｏ、を添加することによって、最終濃 度が６０％に至るまで行った。０℃で１時間撹拌した後、懸濁液を遠心分離し、 初期値の１／１０〜１／１００の量のベレットを、ｏ、８モル／１２　Ｌ−アル ギニン、２ミリモル／ＱＧＳＨ，１ミリモル／ｇＥＤＴＡ（ｐＨ８，５）を用い て再溶解した。

実施例２ エリトリナトリプシン阻害薬（ＥＴＩ）を用いるアフィニティークロマトグラフ ィーによるイー・フリ由来ｐ−ｔ−ＰＡの精製アフィニティー吸着剤の調製 当業者の周知技術に従って、ＥＴＩをファルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）か ら入手したＢｒＣＮ−活性化セファロースと結合させた。

復元調製物を予め濃縮しないアフィニティークロマトグラフィーＥＴ　Ｉ−ｔ’ ７ｙｏ−スカラム（Ｖ＝５ｘｆｆ）をＱ、　ｌ　モル／（）リス−ＨＣρ、０． ８モル／ｆｆ　Ｌ−アルギニン、２ミリモル／ρＧＳＨ，１ミリモル／Ｑ　ＥＤ ＴＡ（ｐＨ８，５）で平衡化させた。

次いで、復元調製物（実施例１）１（ｌを１０力ラム容ｊｌ／時の流速で適用し た。該カラムを、２８０ｎｍの吸光度が緩衝液のブランク値に達するまで、平衡 緩衝液で再洗浄した。

０．１モル／Ｑ　　）リス−ＨＣｆｆ５０．８モル／１２　Ｌ−アルギニン、２ ミリモル／（ｌ　Ｇ　Ｓ　Ｈｌｌ　ミ９％ル／（ｌ　ＥＤＴＡ（ｐＨ５）を用Ｌ ’ルｐＨジャンプ（ｐＨｊｕｍｐ）によって、ｐ−ｔ−ＰＡの溶離を行った。

限外濾過による復元溶液の濃縮の後のアフィニティークロマトグラフィー 血液透析器を用いて復元調製液を１：４５に濃縮した。該濃縮液にＮａＣ（ｌを 添加して、０．５モル／１２の濃度を得た。

０．１％）ｋ／Ｑ　）　リス−ＨＣ（，０，８モル／ｆｆ　Ｌ−フルギニン、０ ゜５モル／Ｑ　Ｎａ（Ｊｌ（ｐＨ７，５）を用いて、ＥＴＩ−セファＣ１−スカ ラム（Ｖ＝８０ｚＩ２）を平衡化した。濃縮液７ｏｏｘｃを４力ラム容量／時の 流速で適用した。その後、２８０ｎｍでの吸光度が緩衝液のブランク値に達する までカラムを平衡緩衝液で再洗浄した。

２０ミリモル／ｇクエン酸（ｐＨ３，２）を用いてｐ−ｔ−ＰＡを溶離した。

実施例３ 精製されたイー・コリ由来ｐ−ｔ−ＰＡの特性タンパクの特性 −５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣ）ＳＤＳ−電気泳動お よびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、ＥＴＩ−セファロースを用いるアフィニティーク ロマトグラフィーによって精製された調製物の等質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ）を試験した。第１図は、濃縮された復元溶液と精製されたタンパクの電気泳動 分析の比較を示している。ゲルのデンシトメトリー分析によって、ＥＴＩ−セフ ァロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーによってｐ−ｔ−ＰＡの濃 度が〉９５％になったことがわかる。イー・コリ由来ｐ−ｔ−ＰＡの６０±２ｋ Ｄａの分子量は相対運動性から評価することができる。

各タンパクは、お互いに、高分子疎水マトリックスによる疎水性相互作用におい て異なる。この特徴的性質は、純度をモニターする分析方法としてＲＰ−ＨＰＬ Ｃにおいて用いられる。トリフルオロ酢酸／アセトニトリル勾配液（Ｉ！衝液Ａ ：Ｈ，０１０００ｉ１２中トリフルオロ酢酸１．２１１）：緩衝液Ｂ：Ｈｔ０３ ００１ｇ、アセトニトリル７００ｚρ、トリフルオロ酢酸１ｘＱ：０〜１００％ ）を用い、ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　３００　［ナウアー（ｋｎａ ｕｅｒ）］分離カラムによって、精製されたｐ−ｔ−ＰＡの分析を行った。第２ 図は、ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製されたイー・コリ由来ｐ−ｔ−ＰＡのクロマト グラフィー分析を示している。この分析によって、等質性が〉９５％であること がわかる。

−Ｎ−末端アミノ酸配列 標準プログラムおよびオンラインＰＴＨ検出を有するＡＢＩ　　４７０配列装置 （ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて、Ｎ−末端アミノ酸配列を決定した。決定され た配列Ｓ　１−Ｙ２−Ｑ３−Ｖ４−１５は、ＤＮＡ−配列から誘導された予想さ れたアミノ酸配列と一致した。

活性測定 一インピトロ活性 ベーリンガー・マンハイム・カンパニー、ｔ−ＰＡ標準に関スルオーダー・ナン バー１０８０９５４の試験指示に従って、イー・フリ由来ｐ−ｔ−ＰＡのインビ トロ活性を測定した。比活性は０．７８±０．２Ｘ　１０”　Ｉ　Ｕ／ｘｇであ った。ＣＮＢｒ−フィブリノゲンフラグメントによるこの試験システムにおける 活性の刺激性（フィブリノゲンベブチド存在下の活性をフィブリノゲンーベブチ ド非存在下の活性で割った商）は、〉１０であった。

−フィブリンとのインビトロ結合 ヒギンズおよびベハー［ディー・エル・ヒギンズ（Ｄ、　Ｌ、　）Ｉｉｇｇｉｎ ｓ）、ジー・ニー・ベハ−（Ｇ、　Ａ、　ｌ’ｅｈａｒ）、バイオケミストリー （Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅｍ、　）、２６、（１９８７）　７７８６−９０によって記 載された方法に従って、イー・コリ由来ｐ−ｔ−ＰＡとフィブリンとのインビト ロ結合を測定した。第３図は、ｐ−ｔ−ｐＡ濃度の関数として一定のフィブリン 濃度でのイー・コリ由来ｐ−ｔ−ＦＡとフィブリンとの結合率を示す。

−インビボ血栓崩壊 コレン等［ディー・コレン（Ｄ、　Ｃｏｌｌｅｎ）、ジェイ・エム・スタセン（ Ｊ　、　Ｍ、　Ｓ　ｔａｓｓｅｎ）およびエム・フェルストレーテ（１１，Ｖｅ ｒｓｔｒａｅｔｅ）、Ｊ　、　ＣＩｉｎ、　Ｉ　ｎｖｅｓｔ、、■、（１９８Ｂ ）　３６Ｂ−３７６３によって記載された形態の試験的頚静脈血栓崩壊によって 、ラビットにおいてイー・コリｐ−ｔ−ＰＡの血栓崩壊活性を測定した。

体重１＆ｇ当たり８０００００　１ｔＪの投薬によって７９％（ｎ＝６）の血栓 崩壊を得た。自然発生的な血栓崩壊は１０．８％（ｎ＝７）であり、使用したモ デルにおいて達成され得る最大血栓崩壊率は約８０％であった。

−インビボクリアランス ラビットにおけるイー・コリ由来ｐ−ｔ−ＰＡのインビボクリアランス（分解率 ）を研究した。合計６１１ｆｆ中、体重１ｋｇ当たり２００００Ｑ　　ＩｔＪを 、３０分間かけて、耳静脈に注入した。大腿静脈中のカテーテルから血漿試料を 採取した。ｔ−ＰＡ積標準関する試験指標（ベーリンガー・マンハイム）に従っ て、真性グロブリン沈降の後、試料中のｐ−ｔ−ＰＡ活性を測定した。第４図は 、注入の間およびその後の活性レベルの経時変化を示す。

実施例４ イー・コリ由来ｐ−ｔ−ＰＡの溶解特性イー・コリ由来ｐ−ｔ−ＰＡは、生理学 的ｐＨ値を有する希釈緩衝液（例えば、Ｑ、　ｌ　％ル／（ｌ　）　リス−ＨＣ （ｌ、ｐＨ７，５または０．１（−ル／ｇリン酸ナトリウム、ｐＨ７，５）中で 僅かな溶解性を呈する。

通常のクロマトグラフ分離法によって充分に精製するために、イー・コリ由来ｐ −ｔ−ＦＡが容易に溶解する条件を定義することが必須である。同一のものが薬 学的に耐え得るガレン製剤の開発に用いられる。以下に、異なる緩衝液中のｐ− ｔ−ＰＡの溶解性のデータをまとめる。

濃縮された復元溶液（実施例１参照）による溶解性試験復元溶液の濃縮物を、４ ℃で、２０ミリモル／ｇクエン酸、ｐＨ２，５に対して透析し、遠心分離した。

次いで、透明な上澄み液０゜５ｉ１２を、４°Ｃで、緩衝液３００ｘ（！に対し て透析し、遠心分離した。

上澄み液中の活性度の測定シこよって溶解性を測定した。

２０ミリモル／ρクエン酸／ＮａＯＨまたは２０ミリモル／ｇリン酸ナトリウム における溶解性のｐＨ依存性０．３モル／ｆｆアルギニン・ＨＣｇ＋２０ミリモ ル／Ｑクエン酸または２０ミリモル／ｇ　トリス−ＨＣｌ２の存在下での溶解性 のｐＨ依存性 ０．３モル／Ｑグアニジン・ＨＣｆｆ＋２０ミリモル／ｆｆクエン酸または２０ ミリモル／Ｉ２トリスーＨＣ（！の存在下での溶解性のｐＨ依存２０ミリモル／ ｇクエン酸／　Ｎ　ａｏ　Ｈ、ｐＨ３、５における溶解性への尿素、尿素誘導体 またはカルボン酸のアミドの作用アフィニティークロマトグラフィーによる精製 後のイー・コリ由来ｐ−ｔ−ＰＡによる溶解性試験（実施例２参照）ｏ、５モル 、／ｇ　Ｌ−フルギ：−７／　ＨＳ　Ｐ　Ｏａ、ｐＨ７，２，０，０１％トゥイ ーン（Ｔｖｅｅｎ）　８０中の精製されたイー・コリ由来ｐ−ｔ−ＰＡ０．５罰 を、緩衝液（Ｌ−アルギニン／Ｈ，ＰＯ，、ｐ）（７，２，０゜０１％トウィー ン８０）２００裏Ｃに対して透析し、遠心分離した。

上澄み液中での活性度の測定によって、溶解性を測定した。

低いアルギニン濃度での溶解性の低下は、テトラメチル尿素の添加によって部分 的に補うことができる。

精製されたｐ−ｔ−ＰＡが、特にＬ−アルギニンまたはグアニジン・塩酸塩の存 在下、ｐＨ４以下で良好な溶解性を有することがわかる。

ＦＩＧ、Ｉ ＥＴＩ−セファロース上のアフィニティークロマトグラフィーによる精製の前お よび後の５ＤＳ−ＰＡＧＥ。

１．５：分子量基準、２．６：復元溶液（濃縮物）、３．４：アフィニティーク ロマトグラフィー処理炭のｐ−ｔ−ＰＡｅＦＩＧ　、　２ 吸光度 ＥＴＩ−セファロース上のアフィニティークロマトグラフィー：こよるイー・コ リ由来ｐ−ｔ−ＰＡの精製後のＲＰ−ＨＰＬＣ。

結合率（％） ＦＩＧ、４ 血漿中のｐ−ｔ−ＰＡ活性 手続補正書 平成　２年　７月　５日

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）全タンパクに対する活性の原核生物中で発現されたプラスミノゲン活性化 因子（ｐ−ｔ−ＰＡ）の含有率が９０％以上であり、比活性が０．４×１０６Ｉ Ｕ／ｍｇであることを特徴とする組換えｐ−ｔ−ＰＡの調製物。
2. （２）全タンパクに対する活性ｐ−ｔ−ＰＡ含有率が９５％以上であり、特に９ ８％以上である請求項（１）記載の調製物。
3. （３）原核生物中で発現されるプラスミノゲン活性化因子（ｐ−ｔ−ＰＡ）を発 現する原核生物細胞を溶解し、封入体（ＩＢ′ｓ）を単離し、変性および還元条 件下でＩＢ′ｓを可溶化し、混合ジスルフィドに誘導し、次いで、制御されたレ ドックス条件下で復元させることからなる組換えｐ−ｔ−ＰＡの調製物の製造方 法において、該復元の後、復元混合物中でｐ−ｔ−ＰＡを濃縮し、次いで、アフ ィニティークロマトグラフィーによってクロマトグラフ精製を行い、全タンパク に対して９０％以上の活性Ｐ−ｔ−ＰＡ含有率および０．４×１０６ＩＵ／ｍｇ 以上の比活性を有する組換えｐ−ｔ−ＰＡの調製物を得ることを特徴する組換え ｐ−ｔ−ＰＡ調製物の製造方法。
4. （４）硫酸アンモニウム沈降法によって、復元混合物中でのｐ−ｔ−ＰＡの濃度 を、特に少量で行う請求項（３）記載の製造方法。
5. （５）血液透析器中で、復元混合物中でのｐ−ｔ−ＰＡの濃縮を、特に大量で行 う請求項（３）記載の製造方法。
6. （６）クロマトグラフ精製のためにＥＴＩ吸着カラムを用いる請求項（３）〜（ ５）のいずれか１つに記載の製造方法。
7. （７）２５〜１０００ミリモル／ｌＬ−アルギニンの存在下で行う請求項（３） 〜（６）のいずれか１つに記載の製造方法。
8. （８）復元混合物の濃縮物を、２５〜１０００ミリモル／ｌ、好ましくは５００ 〜１０００ミリモル／ｌＬ−アルギニンを含有するＥＴＩ吸着カラムにかけてク ロマトグラフ精製を行う請求項（３）〜（７）のいずれか１つに記載の製造方法 。
9. （９）クロマトグラフ精製に用いる濃縮物をｐＨ７．０以上に調節する請求項（ ８）記載の製造方法。
10. （１０）溶離をｐＨ５．５〜６．５で行う請求項（３）〜（９）のいずれか１つ に記載の製造方法。
11. （１１）血餅溶解用薬物としての請求項（１）または（２）記載の調製物の使用 。