KR100339153B1 - 일부봉입체로발현된재조합스트렙토키나제의정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전공학적인 방법으로 형질 전환된 대장균에서 일부 봉입체로 발현된 스트렙토키나제를 pH 4.5∼5.5의 완충용액에 의한 단백질 침전화 및 원상화 과정을 특징으로 하여, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 컬럼 크로마토그래피 등의 통상의 정제 과정을 실시하여 고활성 및 고순도로 대량 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

일부 봉입체로 발현된 재조합 스트렙토키나제의 정제 방법

본 발명은 일부 봉입체로 발현된 재조합 스트렙토키나제(streptokinase, 이하 SK라 함)의 정제 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 유전 공학적인 방법으로 대장균에서 일부 봉입제로 발현된 재조합 스트렙토키나제를 pH가 4.5∼5.5인 완충용액에 의한 단백질 침전화 및 원상화 과정을 특징으로 하여, 음이온 교환 수지 크로마토그래피, 겔여과 컬럼 크로마토그래피 등의 통상의 정제 과정을 실시하여 고활성 및 고순도로 대량 정제할 수 있는 방법에 관한 것이다.

스트렙토키나제는 여러 종의 병독성 스트렙토코커스 균에 의해서 생산되어분비되는 분자량 47,000인 단백질로서 생체내에서 플라스 미노겐과 결합하여 복합체를 이루면서 이를 활성화시켜서 플라스민을 생성하게 하는 단백질이다(Castellino, F.J. et al, Methods in Enzymolgy 45, 244-257(1976)). 이러한 효소적 활성은 스트렙토키나제가 생체내에서 혈전을 용해시키는데 중요한 역할을 할 수 있고, 따라서 혈전에 기인하는 질병을 치료하는데 사용될 수 있다는 점을 시사하고 있다.

스트렙토키나제는 이미 구미.각국에서 트롬빈 용해 물질로 사용되어 폐 색전증(lung thrombus)과 급성 심근경색증(acute myocardial infarction)등의 치료제로써 임상적으로 쓰이고 있고, 상당한 치료 효과를 나타내고 있는 것으로 보고되었다(월간약국, 94년 2월호, 41(1994)).

그러나, 기존의 그룹 C 베타-용혈성(hemolytic) 스트렙토코커스 균의 배양액에서 추출한 스트렙토키나제의 경우, A.B. Kabi(스톡홀름, 스웨덴)에 의하여 제공된 스트렙토키나제가 분비된 배양액에서 1차 추출한 카비키나제를 이용하여 실시하였으나, 이는 안정제로 많은 양의 혈청 알부민을 포함하고, 배양액 중에는 병원균으로부터 분비된, 인체에 유해할 것으로 알려진 물질들이 다량 존재하기 때문에 치료제로 사용하기 위해서는 극도의 주의를 요하는 다수의 정제단계가 필요하고, 게다가 이렇게 얻은 스트렙토키나제도 면역적인 안정성이 낮기 때문에 상업적인 활용면에서 부적합하다(Castellino, F.J. et al., Methods in Enzymology 45, 248-252 (1976)).

위와 같은 이유로 말케(Malke) 등은 유전공학적인 방법을 사용하여 재조합스트렙토키나제를 대장균에서 발현시키는 방법을 개발하였는데, 이들 방법을 사용하여 발현된 재조합 SK는 대장균에서 분비되거나, 혹은 페리플라즘(periplasm)이나, 원형질에 용해상태로 존재하며, 대체적으로 페리플라즘에 총 발현된 양의 30%∼94%가 존재하는 것으로 알려졌다(Malke, H. & Ferretti, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3557-3561(1984)). 그러므로, 위의 방법으로 얻은 재조합 SK를 대량으로 정제할 때에는 대장균 세포에 삼투압을 가하여 페리플라즘 분획을 얻은 후, 이를 통상의 황산 암모늄 분별 침전, 소수성 크로마토그래피, 이온 교환 수지 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 과정으로 정제하였다. 이는 발현된 재조합 스트렙토키나제의 회수율이 낮다는 문제점을 가지고 있다(Huang, T.T et al, Molecular Microviol. 3, 197-205(1989): Fujii et al, 미합중국 특허 제 5,240,845 호(1993)).

본 발명자들은 스트렙토코커스 H46(ATCC 35556)으로부터 클로닝된 새로운 스트렙토키나제 유전자인 SKI 유전자를 이용하여 형질전환된 대장균(대장균 W3110/ptrp-SK, ATCC 68884, (주)럭키의 대한민국 특허출원 공개 제 94-7184 호 참조)에서 발현된 재조합 SK의 50%정도가 봉입체로 발현되는 사실을 발견하였고, 페리플라즘에 존재하는 재조합 SK를 정제하는 기존의 방법으로는 봉입체로 발현된 재조합 SK를 효율적으로 정제할 수 없다는 사실도 발견하였다. 따라서, 봉입체로 발현된 재조합 SK를 효율적으로 정제할 수 있는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 스트렙토키나제가 열 또는 우레아에 의해 물리적으로 또는 화학적으로 변성되어도 투석에 의하여 원상화가 되며, 이렇게 원상화된 스트렙토키나제의 활성이 변성되기이전의 스트렙토키나제의 활성과 거의 같다는 연구(Radek, J.T. and Castellino, F.J., J. Biol. Chem. 264, 9915-9922(1989))에 착안하여 pH 4.5∼5.5 의 완충액을 사용한 대장균 세포의 세척 및 파쇄, 회수된 달백질 침전물의 변성 및 용해, 이의 원상화 과정을 중심으로 통상의 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피 등으로 이루어진 본 발명의 방법을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 형질전환된 대장균에서 일부 봉입체로 발현된 재조합 스트렙토키나제를 생물학적인 활성이 높은 상태로 대량 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적에 따라, 본 발명에서는 재조합 스트렙토키나제가 일부 봉입체로 발현된 대장균을 pH 4.5∼5.5의 완충액을 사용하여 세척함으로써 등전점(pI)이 4.5∼5.5인 SK가 거의 모두 침전될 수 있는 상태에서 세포 파쇄 작업을 실시하고 봉입체로 존재하는 재조합 SK와 pI에 의하여 침전된 재조합 SK를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 SK의 정제 방법이 제공된다.

또한, 본 발명에서는 상기 방법으로 회수한 재조합 SK를 우레아 등 양친매성 염(chaotropic salt)을 포함한 수용액을 이용하여 화학적으로 변성된 상태에서 용해시키고, 투석에 의해 다시 원상화한 후 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피 등을 수행함을 포함하는 과정을 거쳐 고순도로 정제하는 정제 방법이 제공된다.

본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 정제 방법은 형질전환된 대장균에서 일부 봉입체 형태로 발현된재조합 스트렙토키나제를 정제하는 데 있어서, 상기 대장균을 pH 4.5∼5.5의 완충액으로 세척하고, 파쇄한 후 단백질 침전물을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이다.

이와 같은 본 발명은, 예를 들어, (가) 양친매성 염을 포함하는 수용액을 이용한 상기 단백질 침전물의 용해 및 이온 강도가 높은 중성 완충액을 이용한 단백질의 원상화, 및 (나) 컬럼 크로마토그래피의 단계들을 추가로 포함할 수 있다.

우선, 재조합 스트렙토키나제를 일부 봉입체로 발현하는 형질 전환된 대장균, 예를 들어, 대장균 W3110 /ptrp-SK(ATCC 68884, (주)럭키의 대한민국 특허출원 공개 제 94-7184 호 참조)를 배양하고, 배양액을 원심분리하여 균체를 수집한 후, 이를 pH 4.5∼5.5 의 완충액으로 세척하여 배양도중 손상된 세포나 기타 배양액 잔존물을 제거한다. 이때, 세척 완충액으로서는 pH 4.5∼5.5 의 구연산나트륨 완충액, 초산나트륨 완충액 또는 말론산나트륨 완충액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 pH 5.0의 20mM 내지 50mM 구연산 나트륨 완충액, 가장 바람직하게는 pH 5.0의 50mM 구연산 나트륨 완충액을 사용할 수 있다. 상기 세척 과정을 2-3회 반복하고, 동일 완충액에 트리톤 X-100, 염화 나트륨, 베타머캡토에탄올 등을 첨가한 완충액에 세포를 현탁시킨 후, 초음파 분쇄기나 마이크로플루이다이저(microfluidizer)를 이용하여 세포를 파쇄시킨다. 이때, pI에 의한 침전이나 봉입체 이외의 변성에 의한 단백질 침전을 막기 위해서는 0∼10℃에서 세포를 파쇄한다. 상기에서, 세포 현탁 완충액에 첨가되는 트리톤 X-100, 염화 나트륨, 베타 머캡토에탄올은 대장균 세포내에 용해상태로 존재하는 불순 단백질의 용해를 용이하게 하기 위하여 첨가하는것이며, 최종 농도가 각각 0.1 내지 0.5%, 50 내지 200mM, 5 내지 20mM이 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 각각 0.1%, 100mM, 10mM 의 최종 농도가 되도록 첨가하는 것이 가장 바람직하다.

세포 파쇄가 끝난 후 현탁액을 원심 분리하여 단백질 침전물을 얻고, 이를 상기 세척 완충액과 동일한 완충액으로 세척하여 불순물을 완전히 제거한다.

상기 (가) 단계에서는 충분한 양의 양친매성 염을 포함한 수용액으로 단백질을 변성시키면서 용해시킨다. 이때, 양친매성 염으로서는 우레아, 구아니딘, 티오시아네이트 등을 사용할 수 있고, 우레아가 가장 바람직하며, 우레아의 농도는 6M 내지 11M 이 바람직하고, 10 M의 우레아 수용액을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 용해가 완료되면, 단백질 용액을 원심분리하여 불용성 불순물을 제거한 후, 높은 이온강도를 가진 완충액, 바람직하게는 20mM 내지 100mM의 염화나트륨을 포함하는 중성의 완충액, 예를 들어, pH 7.6의 트리스 완충액에 투석함으로써 재조합 SK를 원상화시킨다. 원상화되지 않은 불순물들은 침전되므로 단백질 용액을 원심분리함으로써 제거할 수 있다.

상기 (나) 단계는 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 단계 (가)에서 얻은 원심분리 상충액을 투석시 사용한 것과 같은 완충용액으로 희석하여 동일 완충액으로 평형화한 음이온 교환 수지 컬럼, 바람직하게는 QAE-세파로즈 컬럼(파마시아, 스웨덴)에 점적하여 단백질을 흡착시킨다. 동일한 완충액을 계속 통과시켜 흡착되지 않은 단백질을 충분히 제거한 후, 적정한 염화나트륨 선형 농도 구배를 형성시켜 단백질을 용출시킨다. 용출된단백질 분획을 표준 단백질을 이용한 전기영동으로 확인하여 재조합 SK를 포함한 단백질 분획만을 수집한다.

수집된 단백질 분획을 농축한 다음, 이를 이온 강도가 높은 약염기성의 완충액, 바람직하게는 200mM 염화나트륨을 포함하는 20mM 트리스 완충액으로 평형화한 겔 여과 컬럼, 바람직하게는 세파크릴 S-100 컬럼(Pharmaria, 스웨덴)에 통과시키고 동일 완충액으로 용출시킨다. 용출된 단백질 분획을 표준 단백질을 이용한 전기영동을 통해 분석하여 재조합 SK를 포함한 순도가 높은 분획을 모음으로써 형질전환된 대장균에서 일부 봉입체로 발현된 재조합 스트렙토키나제를 생물학적인 활성이 높은 상태로 고순도로 정제할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하면 발현된 재조합 SK를 거의 모두 회수하게 되므로, 기존의 말케 등에 의한 방법과 비교하여 볼 때, 회수율면에서 이점을 갖게 된다.

스트렙토키나제의 플라스미노겐 활성화 활성은 스트렙토키나제가 플라스미노겐과 일대일 복합체를 형성하여 플라스민 활성을 나타내므로 스트렙토키나제의 활성 단위가 스트렙토키나제-플라스미노겐 복합체의 활성 단위와 같고, 이는 플라스민 활성 단위와 일치한다는 사실에 착안하여 다음과 같이 측정할 수 있다.

플라스민의 활성은 플라스민의 기질인 합성 펩티드 S-2251 (D-Val-Leu-Lys-p-니트로아닐린(nitroaniline))이 플라스민에 의하여 37℃에서 가수 분해되면서 1분간 1㎛의 p-니트로아닐린을 생성할 때의 플라스민의 양을 1 국제 단위(IU)로 나타낸다.(Jackson, K.W. et al., Methods in Enzymology 80, 387(1981)).

우선, 스트렙토키나제의 활성을 측정할 시료를 트리톤 X-100 수용액에 적당량 희석한 후, 트리스 완충용액을 첨가하고 37℃에서 3∼10분, 바람직하게는 5분 동안 활성화시킨다. 그 후 트리스 완충액으로 희석한 인간 플라스미노겐(안정제로 소 혈청 알부민을 첨가함)을 상기 용액에 혼합하고 37℃에서 10∼20분간, 바람직하게는 15분 동안 스트렙토키나제와 인간 플라스미노겐의 복합체가 형성되게 한다. 이 경우에 반응 시간이 짧아지면 복합체가 적게 형성되어 활성 측정에 영향을 미치며, 반응시간이 필요 이상으로 길어지면 다음 단계의 반응이 불안정하게 된다. 이때부터 플라스민의 활성이 나타나므로, 염화 나트륨을 포함한 트리스 완충액으로 희석한 플라스민의 기질인 S-2251을 첨가하여 37℃에서 5∼20분, 바람직하게는 10분 동안 반응시킨 후, 초산을 첨가하여 스트렌토키나제와 인간 플라스미노겐의 복합제를 파괴하고, p-니트로아닐린을 안정화시키면서 반응을 중지시킨다. 반응이 끝난 용액은 405nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정한다. 405nm에서 p-니트로아닐린의 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient)는 10,000M^-1cm^-1이다. 시료의 활성단위는 스트렙토코커스 균으로부터 분리한 활성 단위를 알고 있는 표준 스트렙토키나제를 이용하여 작성된 표준곡선을 이용하여 결정한다.

그 결과, 본 발명의 방법으로 얻은 재조합 SK의 비활성도는 1㎍당 250 IU로서 표준 스트렙토키나제(시그마사 S8026, 미국)의 비활성도인 1㎍당 100 IU 와 비교할 때 2.5배나 높다. 따라서, 본 발명의 방법으로 얻은 재조합 SK를 이용하면 주사제 등을 제조할 때, 기존의 스트렙토키나제 보다 적은 양의 이종 단백질을 사용할 수 있다는 이점이 있다.

이상과 같은 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다.

하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 주어진 것이며, 어느 면으로든 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재조합 스트렙토키나제 침전물의 회수

(단계 1) SKI 유전자를 포함한 대장균 세포의 배양 및 수확

SKI 발현벡터 ptrp-SK를 포함하는 형질 전환된 대장균 균주(ATCC 68884)를 한천을 포함하는 LB-Amp 배지(0.5% 효모 추출물, 1% 트립톤, 1% 염화 나트륨, 1.5% 한천, 0.1% 앰피실린)에서 37℃로 24시간 배양한 후, 생성된 콜로니 한 개를 25㎖의 LB배지(0.5% 효모 추출물, 1% 트립톤, 1% 염화 나트륨)가 포함된 500㎖ 용량의 배플달린 플라스크에 접종한 후, 37℃로 약 6시간 동안 배양하였다. 많은 양의 재조합 SK의 발현을 위해서는 상기 종배양액 25㎖를 500㎖의 LB배지에 접종하여 37℃에서 약 5시간 동안 2차 종배양을 수행한 다음, 9ℓ의 LB 배지가 포함된 14ℓ발효기에 접종하고, 37℃에서 약 6시간 동안 배양하였다. 6시간 후, 1ℓ의 발현 유도체가 포함된 배지(0.5% 카사미노산, 0.5% 솔비톨, 0.01% 인들-아크릴산)를 첨가하고 37℃에서 6시간 동안 배양한 후, 배양액을 15℃, 8, 500rpm에서 15분간 원심 분리하여 대장균 세포를 수확하여 배양액 1ℓ당 50g의 대장균 세포를 얻었다.

(단계 2) 대장균 세포의 세척 및 세포 파쇄

회수된 대장균 세포를 50mM 구연산 나트륨 완충액(pH 5.0) 500㎖에 현탁시키고 이를 15℃, 12,000rpm에서 15분 동안 원심분리하는 과정을 2회 실시하여 배양토중 손상된 세포나 기타 배양액 잔존물들을 제거하였다. 세척이 끝난 대장균 세포를 50mM 구연산 나트륨 완충액(pH 5.0) 250㎖에 현탁시키고, 여기에 트리톤 X-100, 염화나트륨 수용액, 베타-머캡토에탄올을 최종농도가 각각 0.1%, 100mM, 10mM이 되게 첨가한 후 혼합액을 상온에서 30분 동안 교반하였다. 생성된 세포 현탁액을 10,000psi의 공기 압력하에서 마이크로플루이다이저에 3회 반복하여 통과시켜 대장균 세포가 95%이상 파쇄되게 하였다. 이 때, 얼음을 마이크로플루이다이저 출구 주위에 두어 급격한 온도 상승을 방지하였다.

(단계 3) 단백질 침전물 회수 및 세척.

세포 파쇄가 끝난 현탁액을 15℃, 12,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 단백질 침전물을 얻었다. 수득된 단백질 침전물을 50mM 구연산 나트륨 완충액(pH 5.0) 500㎖에 현탁시키고 원심분리하는 과정을 거쳐 세척하였다(제 2 도 A 참조).

상기 (단계 2) 및 (단계 3)에서, pH 5.0인 50mM 구연산 나트륨 완충액 대신 pH 6.0인 50mM 인산 나트륨 완충액을 사용하였을 때에는 약 50% 의 스트렙토키나제만이 침전되었다(제 1 도 참조).

제 1 도는 상기 각 단계에서 얻은 시료를 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분석하여 각 시료에 포함된 재조합 SK의 양을 측정한 결과를 나타낸다.

제 1 도에서, A1, A2 및 A3는 pH 6.0인 50mM 인산 나트륨 완충액을 (단계 2) 및 (단계 3)에서 사용한 경우에 세포 파쇄후 원심 분리하기 전의 현탁액(A1), 원심분리한 후의 단백질 침전물(A2) 및 원심분리 상층액(A3)을 각각 나타내고, B1, B2 및 B3는 pH 5.0인 50mM 구연산 나트륨 완충액을 (단계 2) 및 (단계 3)에서 사용한경우에 세포 파쇄 후 원심 분리하기 전의 현탁액(B1), 원심 분리한 후의 단백질 침전물(B2) 및 원심분리 상충액(B3)을 각각 나타내며, C는 대장군 세포가 제거된 배양액을 나타낸다. 이 결과를 보아 알 수 있듯이, 형질 전환된 대장균에서 재조합 SK는 50%정도가 봉입체로 발현되며(A1, A2, A3), 이를 재조합 SK의 등전점(pI) 부근인 pH 5,0의 완충액으로 세척하고 파쇄하였을 경우에는 거의 모든 재조합 SK가 단백질 침전물로 되었다(B1, B2, B3).

실시예 2: 회수된 재조합 스트렙토키나제의 정제

(단계 1) 우레아 수용액을 이용한 단백질 침전물의 용해 및 원상화

실시예 1의 (단계 3)에서 얻은 단백질 침전물에 10M 우레아 수용액 500㎖ 를 가하여 현탁시킨 후 이를 37℃에서 3시간 동안 교반하였다. 용해가 완료된 용액을 25℃, 12,000rpm에서 45분 동안 원심분리하여 불용성 침전물을 제거하고, 상충액(제 2 도 B 참조)을 100mM 염화 나트륨을 포함한 20mM 트리스 완충액(pH 7.6) 5ℓ 에 상온에서 10시간 동안 투석하였다. 투석이 완료되면서 단백질 용액중 원상화가 되지 않은 불순물들이 침전되므로, 이를 15℃, 12,000rpm에서 20분간 원심 분리하여 제거하고 상충액은 투석시 사용한 것과 같은 완충액으로 4배 희석하였다(제 2 도 C 참조).

(단계 2) 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피

상기 (단계 1)에서 얻은 단백질 용액을 100mM 염화 나트륨을 포함한 pH 7.6의 트리스 완충액으로 미리 평형시킨 QAE-세파로스 컬럼(파마시아 XK-50 컬럼, 스웨덴, 250㎖)에 점적하여 흡착시켰다. 흡착이 완료된 후, 동일한 완충액을 10㎖/분의 속도로 컬럼에 계속 통과시키면서 흡광 파장이 280nm로 고정된 분광 광도계를 이용하여 컬럼 용출 물질을 측정하였다. 이 때, 완충액 이외의 흡광도가 나타나지 않게 되면, 농도 구배 혼합기를 이용하여 염화 나트륨의 선형 농도 구배를 100mM∼400mM까지 형성시켜 10㎖/분의 일정한 속도로 단백질을 용출시키는데, 농도 구배를 형성하는 완충액의 총 부피는 1,200㎖이었다. 수득된 각 분획을 분자량 표준 단백질을 이용한 15% SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동으로 확인하여 스트렙토키나제를 포함하는 분획만을 모았다(제 2 도 D 참조).

(단계 3) 겔 여과 컬럼 크로마토그래피.

상기 (단계 2)에서 모은 단백질 용액을 한외여과막(Amicon사, 미국)으로 최종 농도가 30㎖가 되게 농축한 다음, 200mM 염화 나트륨을 포함한 pH 8.0인 20mM 트리스 완충액으로 미리 평형시킨 세파크릴 S-100 컬럼(지름 5cm, 길이 8cm. 1.5ℓ)에 점적한 후, 동일 완충액을 2㎖/분의 속도로 계속 흘려 보내면서, 흡광 파장이 280nm로 고정된 분광 광도계를 이용하여 컬럼 용출 물질을 측정하였다. 흡광도가 나타난 각 분획을 분자량 표준 단백질을 이용한 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인하여 스트렙토키나제를 포함하는 분획만을 모았다(제 2 도 E 참조). 정제가 완료된 스트렙토키나제의 단백질 농도와 활성을 측정하고, 장기 보관시 최종 농도가 50%가 되게 글리세롤을 첨가하여 -70℃에서 보관하였다.

상기 정제 과정의 각 단계에서 얻은 시료를 15% 폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동으로 분석한 결과를 제 2 도에 나타내었으며, 도면의 각 항목은 실시예의 해당 단계에 나타내었다.

정제된 재조합 스트렙토키나제의 활성 측정

본 실시예에서 스트렙토키나제의 활성 측정을 위해 사용된 시약은 다음과 같다:

시약 A: 0.02% 트리론 X-100

시약 B: 50mM 트리스 완충액, pH 7.5

시약 C: 인간 플라스미노겐(베링거만하임, 독일)을 최종 농도 80㎍/㎖가 되게 시약 B에 용해시킴(안정제로 소 혈청 알부민(시그마사, 미국)을 1mg/㎖의 농도로 첨가)

시약 D: 1.6M 염화 나트륨을 포함한 시약 B에 S-2251(시그마사, 미국)을 최종 농도 2.5mg/㎖가 되게 용해시킴

시약 E: 0.3M 초산 수용액

(단계 1) 단백질 시료의 준비

활성 측정을 위한 단백질 시료와 표준 스트렙토키나제(시그마, 미국)를 시약 A로 최종 농도 3㎍/㎖가 되게 희석하였다. 이를 각각 0, 5, 10, 15, 20㎕씩 1.5㎖ 용량의 에펜도르프 시험관에 넣고 시약 A를 첨가하여 각 시험관의 부피가 25㎕가 되게 하였다. 시약 A에 존재하는 트리톤 X-100은 스트렙토키나제의 활성을 높여 주는 것으로 알려져 있다.

(단계 2) 스트렙토키나제의 활성화

(단계 1)의 각 에펜도르프 시험관에 25㎕의 시약 B를 첨가하고, 37℃에서 5분간 반응시켜 스트렙토키나제를 활성화시켰다. 이 경우에는 3∼10분 동안 실시하여도 스트렙토키나제의 활성이 낮게 나타났다.

(단계 3) 스트렙토키나제와 플라스미노겐의 복합체 형성

(단계 2)가 끝난 후 각 에펜도르프 시험관에 25㎕의 시약 C를 첨가하고, 37℃에서 15분간 반응시켜 복합체를 형성시켰다. 시약 C에 첨가된 소 혈청 알부민은 플라스미노겐을 안정화하는데 도움이 되며, 복합체의 형성을 도와준다.

(단계 4) 플라스미노겐의 활성화에 의한 플라스민의 반응

(단계 3)이 끝난 후 각 에펜도르프 시험관에 25㎕의 시약 D를 첨가하고, 37℃에서 10분간 반응시켜 플라스민의 기질인 S-2251이 가수분해되게 하였다. 이 때, 시약 D에 첨가된 염화 나트륨은 염소 음이온이 스트렙토키나제의 플라스미노겐 활성화의 억제제로 작용하기 때문에 더 이상의 플라스미노겐 활성화가 일어나지 않게 한다. 또한, 반응 시간이 길어 질수록 가수 분해된 산물인 p-니트로아닐린의 양이 포화상태로 되므로 활성 측정을 곤란하게 하였다.

(단계 5) 반응 중지 및 활성도 측정

(단계 4)가 완료된 각 에펜도르프 시험관에 1㎖의 시약 E를 첨가하여 반응을 중지시키고, 흡광 파장 405nm에서 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 표준 스트렙토키나제의 비활성도는 1㎕당 100 IU이므로 이를 이용하여 농도에 따른 표준 곡선을 그린 후, 재조합 SK 시료의 흡광도로부터 활성도를 구하고 농도에 대해 그래프를 그림으로써 비활성도를 구할 수 있다.

제 4 도에 상기 활성 측정의 결과를 나타내었으며, 제 4 도에서 가로축은 활성 측정 시험관에 포함된 표준 SK와 재조합 SK의 양을 pg단위로 나타낸 것이고, 세로축은 활성 단위를 알고 있는 표준 SK를 이용하여 흡광 파장 405nm에서 분광 광도계를 이용하여 측정한 측정값을 토대로 구한 활성 단위를 나타낸 것이다. 아래의 직선은 표준 스트렙토키나제의 양에 따른 활성도 곡선(표준 곡선)을 나타낸 것이고, 위의 직선은 표준 곡선에 의거하여 구한 재조합 SK의 활성도를 나타낸 곡선이다. 제 4 도의 결과를 보면, 본 발명의 방법으로 얻은 재조합 SK의 비활성도는 1㎍당 250 IU이다.

이와 같은 결과는 기존의 스트렙토키나제와 비교하여 볼 때 비활성도가 2.5배 높은 것으로써, 이를 이용하면 주사제 등을 제조할 때 기존의 스트렙토키나제를 사용할 때보다 적은 양의 이종 단백질을 사용할 수 있다는 이점이 있다.

제 1 도는 대장균내에서 발현된 재조합 스트렙토키나제를 완충용액의 pH에 따라 배양액, 용해상태, 단백질 침전물 등으로 나누어 전기 영동한 결과이고,

제 2 도는 정제 단계별로 재조합 스트렙토키나제를 포함한 분획을 전기 영동으로 확인한 결과이며,

제 3 도는 재조합 스트렙토키나제의 활성을 표준 스트렙토키나제의 활성도를 측정하여 구한 표준 곡선을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.

Claims (7)

1. 재조합 스트렙토키나제 유전자에 의해 형질전환된 대장균에서 발현된, 일부 단백질 봉입체 형태를 포함하는 재조합 스트렙토키나제를 정제하는 데 있어서,

   (가) 상기 대장균을 pH 4.5∼5.5의 완충액으로 세척하고 파쇄하여 단백질 침전물을 회수하는 단계,

   (나) 양친매성 염을 포함하는 수용액을 이용한 단백질 침전물의 용해 및 이온 강도가 높은 중성 완충액을 이용한 단백질의 원상화 단계, 및

   (다) 컬럼 크로마토그래피 단계를 포함하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 (가) 단계에서 사용되는 완충액이 20mM 내지 50mM 구연산 나트륨 완충액인

   방법.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 (나) 단계에서 양친매성 염이 6M 내지 10M와 우레아인

   방법.
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 (나) 단계에서 이온 강도가 높은 중성의 완충액이 20mM 내지 100mM의 염화 나트륨을 포함하는

   방법.
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 (다) 단계의 크로마토그래피 과정이 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는

   방법.
6. 제 5 항에 있어서,

   상기 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피에서 QAE-세파로스 컬림을 사용하고, 100mM 내지 400mM의 염화 나트륨 선형 농도 구배를 포함하는 트리스 완충액을 사용하여 단백질을 용출시키는

   방법.
7. 제 5 항에 있어서,

   상기 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에서 세파크릴 S-100 컬럼을 사용하는

   방법.