JPH03123799A - フィブリン結合活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フィブロネクチン様のフィブリン結合活性ポ
リペプチドに関し、更に詳しくはヒトフィブロネクチン
のＣ末端側フィブリン結合ドメインポリペプチドを含有
するフィブリン結合活性ポリペプチドに関する。

〔従来の技術〕

フィブロネクチン（以下ＦＮと表示する）は血漿や細胞
外マトリックスに存在する糖タンパク質で、多彩な機能
を持つことが知られている〔アニュアル　レビュー　オ
ブ　バイオケミスト　　リ　　−　　（＾ｎｎｕａｌ　
　　Ｒｅｖｉｅｗ　　　ｏｆ　　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）　　、　　第５７巻、第３７５〜４１３頁（１
９８８）］。

天然のＦＮを創傷治癒、点眼薬等の医薬品や化粧品に利
用する試みがなされているが、血液から採取するために
供給に制限があること、コスト高であること、また、病
原性の細菌やウィルス等による汚染の可能性があるなど
の理由により、実用化されていない。また、天然のＦＮ
の機能ドメインを取出して利用することも同様の理由か
ら実用化されていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

ＦＮにはフィブリンに結合する領域（フィブリン結合ド
メイン）が２か所存在し、一方の領域はアミノ　（Ｎ）
末端にあり、もう一方の領域はカルボキシ（Ｃ）末端に
ある。フィブリン結合ドメインポリペプチドは、血小板
とフィブリンの結合を阻止することによる血液凝固阻止
剤としての用途が考えられる。また、最近の知見から、
ＦＮのＣ末端側フィブリン結合ドメインがインシュリン
結合活性を有することが明らかにされ（第４６回日本癌
学会総会記事、第１８１頁）　　ドラッグデリバリ−シ
ステムとしての用途も考えられる。

本発明の目的は、ＦＮのフィブリン結合活性を有するフ
ィブリン結合活性ポリペプチド、及びその有利な製造方
法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はフィブリン
結合活性ポリペプチドに関する発明であって、下記一般
式Ｉ： （Ｗ）ｚ−（Ｘ）ｍ−（Ｙ）ｍ、−Ｚ　　　　　　ＣＩ
　）〔式中、Ｗはメチオニン残基（Ｍｅｔ）を示し、ま
たＸはアラニン残基（Ａｌａ）を示し、Ｙはヒトフィブ
ロネクチンのポリペプチド残基で、Ａｓ　ｎ　２１３３
−８ｅｒ２１４３に相当する１１アミノ酸ポリペプチド
残基を示し、下記式■： で表される配列を有し、ＺはヒトフィブロネクチンのＣ
末端側フィブリン結合ドメインの［ｙｓ２１４４−に１
ｙ２２７５に相当する１３２アミノ酸ポリペプチド残基
を表し、下記式■： Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇ
ｌｕ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　５ｅｒＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ
　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　
Ｃｙｓしｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｇｌｙ　　Ｈｉｓ　　Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　　Ｃｙ
ｓＡｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　
Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　ＧｌｙＶａｌ　　Ａｓｉ　　
Ｔｙｒ　　Ｌｙｓ　　ｌｉｅ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　
Ｌｙｓ　　Ｔｒｐ　　ＡｓｐＡｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　５
ｅｒＣｙｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ
　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＧｌｕＰｈｅ　Ｌｙｓ　Ｃ
ｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｈ
ｒ　ＣｙｓＴｙｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　
Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　ＧｌｙＧｌｕ　Ｇｉ
ｎ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ
　Ｇｌｙ　Ａｌａｌｉｅ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＧｉｎＡｒｇ
　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　
Ｃｙｓ　Ａｒｇ　ＡｒｇＰｒｏ　Ｇｌｙ　　　　　　　
　　　　　　　　・［：ＩＩ［］で表される配列を有し
、１．ｍ及びｎはそれぞれ１又は零の数を示す〕で表さ
れることを特徴とする。

また、本発明の第２の発明は前記一般式■で表されるフ
ィブリン結合活性ポリペプチドをコードするＤＮＡを含
有せしめた組換え体プラスミドに関し、第３の発明は前
記組換え体プラスミドを導入せしめた形質転換体に関し
、第４の発明は、前記形質転換体を培養し、該培養物よ
り前記一般式■で表されるフィブリン結合活性ポリペプ
チドを採取することを特徴とするこれらポリペプチドの
製造方法に関する。

Ｃ末端側フィブリン結合ドメインについてはトリプシン
、サーモライシン、プラスミン等によって分解されて得
られた断片が報告されており〔フィブロネタチン、口、
Ｆ、モシャー（Ｄ、Ｐ。

Ｍｏ５ｈｅｒ　）編、アカデミツク　プレス　インク社
刊、第７３頁（１９８８）］、その大きさは２０ｋＯか
ら３４ｋＤに及んでいる。このドメインの詳しい特定は
なされていないが、一般的には約４４アミノ酸からなる
■型類似配列を３個と、その前後にそれらとは相同性の
無い隣接配列とを含む断片が知られている。本発明者ら
は、ヒトＦＮのフィブリン結合活性を有するポリペプチ
ドの構築及びその製造法について研究し、フィブリン結
合活性及びインシュリン結合活性はＣ末端側フィブリン
結合ドメインに存在する■型類似配列部分（（ｙｓ２１
４４−Ｑｌｙ２２ｆｆＳ　、　１３２アミノ酸残基）が
あれば十分であり、また、そのＩ型類似配列部分の前後
に隣接してそれぞれ存在しているペプチド配列の有無は
、大腸菌菌体内での発現量に著しく影響を及ぼすことを
見出した。本発明は以上の知見に基づいて達成された。

なお、本明細書において、アミノ酸に付された頁数字は
、ＢＭＢＬデータバンク（ＢＭＢＬ　ＤＡＴＡ　ＢＡＮ
に）中のＦＮのｃＤＮ＾配列を翻訳して得られるアミノ
酸配列に付されたＮ末からのアミノ酸残基数を示す。以
下、本発明を具体的に説明する。

ヒ）ＦＮのタンパク質の一次構造については、ジ　エン
ポ　ジャーナル（Ｔｈｅ　ＢＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）第
４巻、第１７５５〜１７５９頁（１９８５）に記載され
ている。また、Ｃ末端側フィブリン結合ドメインをコー
ドするＤＮＡ断片は、ＰＬＰ５、ｐＬＦ３、ｐＬＦ４及
びｐＬＦ２のＦ　Ｎ　ｃＤＮＡ部分をつなぎ合せて構築
されたｐＬＦ２４３５　　Ｃバイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、第２５巻、第４９３６〜４
９４１頁（１９８６））から必要な断片を切出すことに
よって調製することができる。ｐＬＦ２４３５から必要
なｃＤＮＡ断片を制限酵素で切出し、５°側に開始コド
ンを含む合成りＮＡを、また、３′側に終止コドンを含
む合成りＮＡをそれぞれＤ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼで連結
した後、適当な発現ベクターに接続することにより、目
的のポリペプチドをコードするプラスミドを得ることが
できる（第１図及び第２図参照）。すなわち、第１図は
、前記式■のｗ−ｘ−ｙ−ｚをコードするプラスミドＰ
ＦＤ７０５を、第２図はＷ−Ｘ−Ｚをコードするプラス
ミドｐＰＤ９０５をそれぞれ構築するための工程図であ
る。

このようにして得られるプラスミドによって発現される
ポリペプチドのＮ末端には、ｃＤＮＡの５°側とベクタ
ーとの連結部位に存在するＮｃ。

Ｉ　ＩＪンカー又はＮｃｏ　Ｉサイトを含む合成りＮＡ
に由来する、開始コドンのＭｅｔ残基（前記１式におい
てＷと表記）及びＡｌａ残基（前記１式においてＸと表
記）が付加しているが、そのことは本発明の効果を左右
するものではない。しかし、必要に応じてこれらの付加
配列を除去することができる。例えばＮｅｔについては
、組換え体に含まれるメチオニンアミノペプチダーゼ〔
ジャーナル　オブ　バクテリオロジー（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）第１６９巻、第７５１頁、（
１９８７）〕が作用し易い条件下に組換え体を培養する
ことにより、あるいは部分精製したポリペプチドに、メ
チオニンアミノペプチダーゼを作用させることにより、
Ｎ末端Ｍｅｔを除去することができる。また、Ａｌａは
部位特異的変異の手法で除去することができる。

発現ベクターとしては、既存のものはすべて利用するこ
とができるが、例えばｐＵｃ１１８Ｎ／ｐＵｃ１１９Ｎ
　［フェツス　レターズ（ＦロロＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）
ｍ第２２３巻、第１７４〜１８０頁（１９８７））及び
その誘導体を用いることにより好結果を得ることができ
る。これらのプラスミドを大腸菌に導入し、適当な条件
下に培養することにより、Ｃ末端側フィブリン結合ドメ
インポリペプチドが大腸菌内に蓄積される。発現の確認
にはイムノブロッティングが用いられる。組換え大腸菌
の全菌体タンパク質をＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＩＥ）で分離した後、泳動パ
ターンをニトロセルロース膜に移し取る。ＦＮのＣ末端
側フィブリン結合ドメインを認識するモノクローナル抗
体（ＨＦＮ−１１Ｐ６、セロチック社）で検出されるバ
ンドが目的のポリペプチドである。

目的ポリペプチドは、大腸菌菌体内で不溶化し、いわゆ
る封入体を形成する。このため、目的ポリペプチドの精
製は、例えば次のように行う。

組換え大腸菌をＬ−ブロスなどの培地に培養し、集菌し
た後、超音波処理により菌体破砕液を得、これを遠心分
離して目的ポリペプチドを含む封入体の沈殿を得る。こ
の沈殿を種々の界面活性剤〔例えばトリトン（Ｔｒｉｔ
ｏｎ）　Ｘ−１００等〕を含む緩衝液に懸濁、遠心分離
を繰返すことにより、沈殿を洗浄する。この沈殿を尿素
及びジチオスレイトールを含む緩衝液に溶解し、この溶
解液についてゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行う
。次いで、目的ポリペプチド画分を透析法等による方法
でリフォールディングする。以上の操作により、目的の
ポリペプチドを精製することができる。

得られたポリペプチドは、フィブリン結合活性の測定及
びインシュリン結合活性の測定に用いられる。

フィブリン結合活性については、ヒトフィブリンをＡＰ
−）レシルトヨパール６５０　　（東ソー）などのアフ
ィニティークロマトグラフィー用活性化担体に結合させ
ることにより調製したフィブリン固定化カラムに、一定
量の試料を吸着させ、アルギニン溶液にて溶出し、本カ
ラムを素通りした試料量、及び本カラムから溶出された
試料量を比較することによりフィブリンへの結合能力を
示すことができる。

インシュリン結合活性は、イムノブロッティングの手法
に準拠して行うことができる。すなわち、試料を５Ｏ３
−ＰＡＧＥ！で分離した後、ニトロセルロースフィルタ
ーに移し取り、酵素標識したインシュリンを作用させる
。フィルター洗浄後、結合したインシュリンを酵素活性
により判定することができる。

以上の測定により、得られたポリペプチドがフィブリン
やインシュリンに対しても強い親和性を示すことが証明
される。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例Ｉ ＦＮのＣ末端側フィブリン結合ドメインＡｓｎ２１３３
−Ｇｌｙ２２７５　　（１４３アミノ酸残基、以下Ｆ−
１４３と略称する）をコードするｃＤＮ＾断片のクロー
ニング（第１図参照） （１−１）合成りＮＡアダプターの調製Ｃ末端側フィブ
リン結合ドメインに存在する工型繰返し配列及びその上
流に隣接する１１アミノ酸配列をベクターに接続するた
めの３”側のアダプター（鎖長２９ｍｅｒ及び３７　ｍ
ａｒ　。

第１図参照）をアプライドバイオシステムズ社のＤＮＡ
合成機を用いて合成した。３００ρｍｏｌの鎖長２９ｍ
ａｒのものの５°末端をリン酸化した後、鎖長３７ｉｎ
ｅｒのＤＮＡを等置割え、アニーリング操作により、２
重鎮とした。

（１−２）　Ｎｃｏ　Ｉ　〜ＨｉｎｄＩＩＩ断片の調製
ＦＮのＦ−１４３をコードするｃＤＮＡ断片を含む５．
９ｋｂのプラスミドｐＬＦ２４３５　　Ｃバイオケミス
トリー第２５巻、第４９３６〜４９４１頁（１９８６）
　〕１００μｇを５ａｕ３Ａ　Ｉで分解し、アガロース
ゲル電気泳動にかけ、０．９６ｋｂの断片を回収した。

この断片を更に旧ｎｃＩ［とＨａｅ　ＩＩで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動にかけることにより、４０５ｂの
断片を回収した。この断片２μｇと１５０　ｐｍｏｌの
ＮＣ０Ｉリンカ−［宝酒造■、ｄ　（ｐＡ−Ｇ−Ｃ−Ｃ
−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−ＣＴ）　］及び（１−１）で得た３
°側のアダプター１５０　ｐｍｏｌをＴ４　ＤＮＡリガ
ーゼ用バッファ０．５ｍＭ　ＡＴＰ、　１０ｍＭ　ＤＴ
Ｔ、　３００ユ＝ットのＴ４　ＤＮＡリガーゼを含む１
２５μｌの反応液中、１５℃、−夜インキユベートした
。反応液を７０℃、１０分インキュベートした後、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼを添加し３７℃、３０分イン
キュベートして３°側アダプターの鎖長３７のものの５
°末端をリン酸化した。

この反応液をフェノール・クロロホルム抽出した後、エ
タノール沈殿してＤＮＡを回収し、次いでこのＤＮＡｅ
Ｎｃｏｌ及び旧ｎｄＩ［Ｉで分解し、アガロースゲル電
気泳動にかけ、０．４４ｋｂのＮｃｏ　Ｉ　＝Ｈｉｎｄ
Ｉ［Ｉ断片的１μｇを回収した。

（１−３）　ｐＵｃ１１９ＮＴの構築 分泌型発現ベクターｐＩＮ　［１−ｏｍｐＡＩ　Ｃジ　
エンボ　ジャーナル、第３巻、第２４３７〜２４４２頁
（１９８４）］　１２μｇを旧ｎｄＩＩＩ及びＳａｌ　
　Ｉで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、１ｐｐ
ターミネータ−配列を含む０゜９５ｋｂの旧ｎｄＩＩＩ
　−３ａｔ　Ｉ断片を回収した。この断片０．７５μｇ
をあらかじめＨｉｎｄＤＩ及びＳａｔ　Ｉで分解して脱
リン酸したプラスミドｐ［Ｉｃ１１９Ｎ０．５μｇと共
にＴ４　ＤＮＡリガーゼ用バッファー０、５　ｍＭ　Ａ
ＴＰ、　１０　ｍＭ　ＤＴＴ及び２．８ユニツトのＴ４
　ＤＮＡリガーゼを含む２０μｌの反応液中、１６℃、
−夜インキユベートした。反応液２μｌを用いて大腸菌
ＪＭ１０９を形質転換し、１ｐｐターミネータ−配列を
持つプラスミドを得、ｐ［Ｉｃ１１９ＮＴと命名した。

なお、ｐＵｃ１１９Ｎは、市販のｐＵＣ１１９ベクター
〔宝酒造■販売〕の翻訳開始コドン部位にＮｃｏ　Ｉサ
イトを導入し、更にリポソーム結合部位と開始コドンの
距離を８塩基にしたものである。

（１−４）　Ｎｃｏ　Ｉ　＝ｔｌｉｎｄＩＩＩ断片のｐ
Ｕｃ１１９ＮＴへのクローニング （１−３）で得たプラスミドｐＵｃ１１９ＮＴ　　１μ
ｇをＮｃｏ　Ｉ及び旧ｎｄＩ［［で分解後、脱リン酸し
た。このプラスミド０．５μｇを（１−２）で得たＮｃ
ｏ　Ｉ　＝　ｔｌｉｎｄＩＩ［断片０．２μｇと共にＴ
４ＤＮ＾リガーゼ用バッフｙ　−０，５ｍＭ　ＡＴＰ。

１０ｍＭ口ＴＴ、及び５ユニツトのＴ４０ＮＡリガーゼ
を含む５０μｌの反応液中、１６℃、５時間インキュベ
ートした。この反応液２μｌを大腸菌ＪＭ１０９の形質
転換に使用した。

（１−５）大腸菌の形質転換とプラスミドの確認 （１−４）で得た反応液２μｌを用いて、大腸菌ＪＭ１
０９を形質転換した。得られた形質転換体中６クローン
についてプラスミドの分析を行った。すなわち、ラビッ
ド法で調製したプラスミドをＮｃｏ　Ｉ及び旧ｎｄＩＩ
Ｉで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、予想され
るＮｃｏ　Ｉ　〜ＨｉｎｄｎＩ断片（０，４４ｋｂ）の
バンドの生成を調べた。その結果、１クローンに目的の
バンドの生成が認められた。また、ダイデオキシ法によ
り、組込まれたｃＤＮＡ断片領域の塩基配列を決定し、
目的の配列を含むことを確認した。この組換え体プラス
ミドをｐＰＤ’７０５と命名した。

また、このプラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９をＢ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｊ’Ｍ１０９／ｐＰ
Ｄ７０５と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託した〔微工研菌寄第１１０３７号（ＦＢＲＭ　Ｐ−
１１０３７）　］。

（１−６）組換え体からのポリペプチドの精製（１−５
）で得たＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０
９／ｐＰＤ？０５を５０３ｇ　／ｍｌのアンピシリンを
添加した５ｍｌのし一ブロスを含む試験管で３７℃、−
夜振とう培養した。これを５００ｒｎｌの同培地を含む
２１の三角フラスコ２本に接種し、１００　ｒｐｍで培
養を続けた。６６０　ｎｍの吸光度が０．３の時点でＩ
ＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）
を２ｍＭになるよう添加し、１６時間後に集菌した。菌
体の一部を用いてイムノブロッティングを行った。

すなわち、全菌体タンパク質を５Ｏ３−ＰＡＧＢ　（ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）で分離し、泳動ハター
ンをニトロセルロースメンプランに転写した後、ＦＮの
フィブリン結合ドメインを特異的に認識するモノクロ−
＃ル抗体［ＨＰＮ−１１Ｆ６、セロチック（３６ｒｏｔ
ｅｃ）社販売〕を作用させ、次いでパーオキシダーゼ標
識第２抗体を作用させた。結合した第２抗体のパーオキ
シダーゼ活性を４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水
素の存在下で発色させ、１６、５　ｋｌｌ付近に目的の
ポリペプチドが生産されていることを確認した。次に、
全菌体ペレット（湿重量４．４　ｇ　）を緩衝液［５０
ｍＭ）リス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ　、　ｐＨ８，０，２
５％ショ糖、１ｍＭ　ＢＤＴＡ　）　２１ｍ１ｉ！に懸
濁し、２ｍｇ／ｍＩ！リゾチーム溶液を１ｒｎｌ添加し
た。０℃、３０分放置後、超音波処理することにより菌
体を破砕した。この菌体破砕液に、Ｉ　Ｍ　ＭｇＣｌ□
を６６μｍ　−Ｉ　Ｍ　ＭｎＣ１ｚを２２μβ及び６０
．０００ユニツ）／ｒｎｌデオキシリボヌークレアーゼ
Ｉ　　（ＤＮａｓｅＩ）を５５μｌそれぞれ添加し、３
７℃、３０分インキュベートした。次いで、０．２ＭＮ
ａＣ１，１％デオキシコール酸、１％ノニデット（Ｎｏ
ｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０を含む２０ｍＭ）リス−〇Ｃ１、
ｐＨ７，５緩衝液４．４　ｍ１２を添加し、１２．００
Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。

沈殿を緩衝液（５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　、　ｐＨ８，
０，１０ｍＭ　　　ＢＤＴＡ　　　、　　　　１　　０
　　０ｍＭ　　　ＮａＣ１１０，５％　　ト　　リ）　
：／　Ｘ−１００）　２２　ｍｌに懸濁し、１４．００
Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離し上澄みを捨てた。この沈
殿を次いで２０％エチレングリコール水溶液２２−に懸
濁し、１４．　ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心分離した。

得られた沈殿を更に２％ノニデッ）　Ｐ−４０水溶液２
２ｒｎｌに懸濁し、１４．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心
分離し上澄みを捨てることにより精製された封入体０．
５ｇ（湿重量）のペレットを得た。この封入体を２０ｍ
Ｍ）！ＪスＨＣＩ　、　ｐｌ（８，３，５０ｍＭ　ＯＴ
Ｔ、　７　Ｍ尿素液１〇−に溶解した。不溶物を遠心分
離により除去した後、可溶化液を１ｍＭ　ＢＤＴＡ　、
５Ｍ尿素、５ｍＭＤＴＴを含む２０ｍＭ）リス−ＨＣｌ
　、　　ｐＨ８，３緩衝液で平衡化したセファクリル（
５ｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−１００）ＩＲ（ファルマシア
社製）７５０−を含むカラムを用いてゲルろ過クロマト
グラフィーを行った。同一緩衝液で溶出、分画し、各分
画液の一部を５Ｏ３−ＰＡＧＢにかけ、目的両分を９０
ｒｎｌ集めた。この画分を１　ｍＭＲ化型グルタチオン
を含む２０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　、　ｐＨ９，０緩衝液
中で４℃、二昼夜透析することにより、タンパクのりフ
ォールディングを行った。この透析内液を引続き蒸留水
中で透析することにより脱塩し、凍結乾燥して、電気泳
動的に単一なポリペプチドを２１．５　ｍｇ得た。アブ
ライドバイオシステムズ社のペプチドシーケンサ−４７
７Ａ／１２ＯＡを用いて、本ポリペプチドのＮ末端から
のアミノ酸配列を調べたところ、Ａｌａ−八５ｎ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎの配列が認められ、Ｆ−１
４３のＮ末端にＡｌａが付加したＮ未配列と一致した（
以下、本ポリペプチドをＡｌａ−Ｆ１４３と略称する） （１−７）　ｐＰＤ７０５からの介在配列（ＧＣＴ）の
除去（１−５）で得たプラスミドｐＦＤ７０５によって
発現されるポリペプチド（Ａｌａ−Ｆ−１４３）のＮ末
端にはＮｃｏ　Ｉリンカ−に由来する八ｌａが付加され
ている。このＡｌａに対応する配列（ＧＣＴ）を部位特
異的変異の手法により除去した。すなわち、オリゴヌク
レオチドｄ　［ＡＧＣＣＴＴＣＧＴＴＣＡＴＧＧＴＣＴ
ＧＴＩを合成し、サイト−ダイレクチイド　ミュータジ
エネシスシステムミュータンーＫ〔全酒造側販売〕を用
いて行った。その結果、末端のＡｌａが除去されたＦ−
１４３を発現するプラスミドを得、ｐＦＤ７０８と命名
した。

実施例２ ＦＮのＣ末端側フィブリン結合ドメインＣｙ８２１４４
　Ｇｌｙ２２７！＋　　（１３２アミノ酸残基、以下Ｆ
−１３２と略称する）をコードするｃＤＮＡ断片のクロ
ーニング（第２図参照） （２−１）合成りＮＡアダプターの調製Ｃ末端側フィブ
リン結合ドメインに存在する工型繰返し配列をベクター
に接続するための５゛側のアダプター（鎖長１１　ｍｅ
ｒ　＃１及び＃２、第２図参照）をアプライドバイオシ
ステムズ社のＤＮＡ合成機を用いて合成した。

３００　ｐｍｏｌの１１　ｍａｒ　＄２の５°末端をリ
ン酸化した後、鎖長１１　ｍｅｒ　＃１の合成りＮＡ等
量を加えてアニーリング操作により、２重鎮とした。ま
た、３°側には（１−１）で調製したアダプター（２９
ｍｅｒ及び３７　ｍｅｒ　）を用い、（１−１）と同様
の方法で２重鎮とした。

（２−２）　Ｎｃｏ　Ｉ　＝ＨｉｎｄＩＩＩ断片の調製
（１−２）で得たｐＬＦ２４３５の５ａｕ３Ａ　Ｉ断片
（０，９６ｋｂ断片）を更にＦｏｋ　ＩとＨａｅ　ＩＩ
で切断し、アガロースゲル電気泳動にかけることにより
、０．３７　ｋｂの断片を回収した。この断片２μｇと
１５０　ｐｍｏｌの５．°側アダプター及び１５０　ｐ
ｍｏｌの３′側アダプターとを３００ユニツトのＴ４Ｄ
ＮＡＩＪガーゼを含む１２５μｌの反応液中、１５℃、
−夜インキユベートした。反応液を７０℃、１０分イン
キュベートした後、（１−２）と同様の方法でアダプタ
ーのもう一方の側の５′末端をリン酸化し、次いで、Ｎ
ｃｏ　Ｉ及び旧ｎｄｎＩで分解し、アガロースゲル電気
泳動にかけ、０．４０　ｋｂのＮｃｏ　１〜ｆｌｉｎｄ
Ｉ［断片的０．５μｇを回収した。

（２−３）　Ｎｃｏ　Ｉ　〜ｔｌｉｎｄＩ［［断片のｐ
Ｕｃ１１９ＮＴへのクローニング （１−３）で得たブ５　ｘ　ミｔ’　ｐＵｃ１１９ＮＴ
　　１μｇをＮｃｏ　Ｉ及び旧ｎｄＩＩ［で分解後、脱
リン酸した。このプラスミド０．８μｇと（２−２）で
得たＮｃｏ　Ｉ　〜ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片０．２μｇに対
してライゲーションキット〔宝酒造側販売〕Ａ液６０μ
ｌ及びＢ液７．５μｌを加えて１６℃、３０分インキュ
ベートした。この反応液４μβを大腸菌ＪＭ１０９の形
質転換に使用した。

（２−４）大腸菌の形質転換とプラスミドの確認 （２−３）で得た反応液４μｌを用いて、大腸菌ＪＭ１
０９を形質転換した。得られた形質転換体中６クローン
についてプラスミドの分析を（１−５）と同様の方法で
行い、Ｎｃｏ　１〜ＨｉｎｄｌＩＩ断片（０，４１ｋｂ
）のバンドの生成を調べた。その結果、３クローンに目
的のバンドの生成が認められた。また、ダイデオキシ法
により、組込まれたｃＤＮＡ断片領域の塩基配列を決定
し、目的の配列を含むことを確認した。この組換え体プ
ラスミドをｐＦ［］９０５と命名した。

また、このプラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９をＢ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　、ＪＭ１０９／ｐＦ
Ｄ９０５と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託した〔微工研菌寄第１１０３８号（ＦＢＲＭ　Ｐ１
１０３８）　］。

（２−５）組換え体からのポリペプチドの精製（２−４
）で得たＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０
９／ｐＦ口９０５を（１−６）と同様の方法で培養し、
１１の培養菌体から精製封入体のペレット０．５ｇ（湿
重量）を得た。この封入体から、（１−６）と同様の方
法で目的タンパクの精製を行い、電気泳動的に単一なポ
リペプチドを１２ｍｇを得た。本ポリペプチドを還元カ
ルボキシメチル化することにより〔「生化学実験講座」
Ｉタンパク質の化学■、東京化学同人社刊、第２２８〜
２３０頁（１９７６）記載の方法に従った〕、あらかじ
めシスティン残基を保護したものについて、Ｎ末端のア
ミノ酸配列を調べた結果、Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｐ−Ｐｒ。

−Ｔｙｒの配列が認められ、Ｆ−１３２のＮ末端にＡｌ
ａが付加したＮ未配列と一致した（以下、本ポリペプチ
ドをＡｌａ−Ｆ−１３２と略称する）（２−６）ｐＦ口
９０５からの介在配列（ＧＣＴ）の除去（２−５）で得
たプラスミドＰＩＴ０９０５によって発現されるポリペ
プチド（Ａｌａ−Ｐ−１３２）のＮ末端にはＮｃｏ　Ｉ
サイトを有する５°側アダプター（第２図参照）に由来
するＡｌａが付加されている。このＡｌａに対応する配
列（ＧＣＴ）を部位特異的変異の手法により除去した。

すなわち、オリゴヌクレオチドｄ　［ＧＧＴＣＡＡＡＧ
ＣＡＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＩを合成し、サイト−ダイレ
クチイド　ミュータジェネシスシステム　ミュータン−
Ｋ〔宝酒造側販売〕を用いて行った。その結果、末端の
Ａｌａが除去されたＰ−１３２を発現するプラスミドを
得、ｐＦ０９０８と命名した。

参考例１　生物活性の測定 前記実施例１及び２で得られた各ポリペプチドを用いて
フィブリン結合活性及びインシュリン結合活性を測定し
た。

（３−１）フィブリン結合活性 関口らの方法〔ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケ
ミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ−ｇｉ
ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２５６巻、第６４５２
〜６４６２頁（１９８１））に従い、フィブリン固定化
カラムへの吸着によりフィブリン結合活性を調べた。な
お、フィブリン固定化カラムの調製法はヘーン（Ｄ、　
Ｌ、　１（ｅｅｎｅ）らの方法〔トロムボシス　リサー
チ（ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ）第２巻、
第１３７〜１５４頁（１９７３）〕により作製した。た
だし、担体樹脂としてＡＰ−）レシルトヨパール６５０
（東ソー）ヲ用いた。フィブリン−ＡＰ）ヨパール力ラ
ム（ｌｒｎｌ）に各種試料ポリペプチド過剰量（２７０
ｐｍｏｌ）を通した。５ｍ１．の洗浄バッファ　　　（
１・ＯｍＭ）リス−リン酸、ｐＨ７，５，５０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１、１ｍＭ　ＢＤＴＡ）で洗浄した後、５ｍｆノ溶
出バッファー１（０，５１４アルギニンＰＢＳ溶液）で
吸着画分を溶出させた。次いで、５−の溶出バッファー
２　（６Ｍ尿素、２５ｍＭ）リス−リン酸、ｐＨ７，５
）で溶出させた。各両分を０．５　ｍＩ！ずつ分画し、
試料ポリペプチドの溶出位置をＦＮのＣ末端側フィブリ
ン結合ドメインを認識するモノクローナル抗体（ＨＦＮ
１１Ｆ６、セロチック社）を用いたＢＬＩＳＡ法により
調べた。その結果、Ａｌａ−Ｆ−１４３、Ｆ−１４３、
Ａｌａ−Ｆ−１３２及びＦ−１３２の各フィブリン結合
活性ポリペプチドはいずれも本カラムの素通り画分及び
溶出バッファー１で溶出される吸着画分にＳ忍められ、
フィブリン結合活性を有することが認められた。また、
素通りした試料量と吸着した試料量との比から、各試料
のフィブリンへの結合能力を比較した結果、いずれの試
料も大差はなかったく後記第１表参照）（３−２）イン
シュリン結合活性 ＦＮのフィブリン結合ドメインにはインシュリン結合活
性があることが知られている（第４６回日本癌学会総会
記事、第１８１頁）そこでＡｌａ−Ｆ−１４３、Ｆ−１
４３、八１ａ−Ｆ−１３２及びＦ−１３２の各フィブリ
ン結合活性ポリペプチドのインシュリン結合活性を調べ
た。これら各ポリペプチドを２０μｇより順次２希釈し
たものをバイオラッド社製ＢＩＤ−ＤＯＴを用いてニト
ロセルロース膜に吸着させた。このニトロセルロース膜
を３％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーでブロッキング操
作を行った後、５０μｇ／ｍ１（Ｄバーｉキシダーゼ標
識したインシュリン（シグマ社）を含むＰＢＳバッファ
ー中室温、２時間放置した。次にこのニトロセルロース
膜をＰＢＳで５分間、２回洗浄した後、結合したパーオ
キシダーゼ−インシュリンを４−クロロ−１−ナフトー
ル及び過酸化水素を基質として検出した。その結果、い
ずれも濃度に対応した発色がみられ、インシュリン結合
活性があることが確認された（第１表参照）第１表 Ａｌａ−Ｐ−１４３＋　　　　　　　　　　　十　　　
　　　　　　　＋十Ｆ−１４３＋　　　　　　　　　　
　　十　　　　　　　　　　十＋Ａｌａ−Ｆ−１３２＋
　　　　　　　　＋　　　　　　　　＋〔発明の効果〕 以上述べてきたごとく、本発明により、少なくともフィ
ブリン結合活性を有するフィブリン結合活性ポリペプチ
ド及びその製造方法が提供される。

上記ポリペプチドは、血液凝固阻止剤、ドラッグデリバ
リ−システムとしてなど各種の用途に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は前言己式Ｉにおけるｗ−ｘ−ｙ−ｚをコードす
るプラスミドｐＦＤ７０５を構築するための工程図で、
第２図は前記式■におけるｗ−ＸＺをコードするプラス トｐＦＤ９０５を構築するた めの工程図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記一般式 I ： （Ｗ）＿ｌ−（Ｘ）＿ｍ−（Ｙ）＿ｎ−Ｚ・・・〔 I
   〕〔式中、Ｗはメチオニン残基（Ｍｅｔ）を示し、また
   Ｘはアラニン残基（Ａｌａ）を示し、Ｙはヒトフィブロ
   ネクチンのポリペプチド残基で、Ａｓｎ＾２＾１＾３＾
   ３−Ｓｅｒ＾２＾１＾４＾３に相当する１１アミノ酸ポ
   リペプチド残基を示し、下記式II： 【遺伝子配列があります】 ・・・〔II〕 で表される配列を有し、ＺはヒトフィブロネクチンのＣ
   末端側フィブリン結合ドメインのＣｙｓ＾２＾１＾４＾
   ４−Ｇｌｙ＾２＾２＾７＾５に相当する１３２アミノ酸
   ポリペプチド残基を表し、下記式III： 【遺伝子配列があります】 ・・・〔III〕 で表される配列を有し、ｌ、ｍ及びｎはそれぞれ１又は
   零の数を示す〕で表されることを特徴とするフィブリン
   結合活性ポリペプチド。 ２、請求項１記載のフィブリン結合活性ポリペプチドを
   コードするＤＮＡを含有せしめた組換え体プラスミド。 ３、請求項２記載の組換え体プラスミドを導入せしめた
   形質転換体。 ４、請求項３記載の形質転換体を培養し、該培養物より
   請求項１記載のフィブリン結合活性ポリペプチドを採取
   することを特徴とするフィブリン結合活性ポリペプチド
   の製造方法。