JPH0284196A - タンパク質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｍ菌糸（ｓｙｓｔｅｍ）におけるタンパク質の発現にお
いて、一般に、タンパク質はメチオニンによってＮ末端
が伸長されて得られる。生理学的に活性なタンパク質で
は、この追加のメチオニンは免疫原性を発揮することが
できる。このＮ末端伸長を避けるために、したがって、
遺伝子を融合タンパク質をコードするように構築し、所
望のタンパク質から望ましくない部分を化学的にまたは
酵素的に除去することができる。しかし、所望のタンパ
ク質を一つあるいはそれ以上の副産物から分離すること
はきわめて難しく、収量低下をきたすかもしれない。

確かに、場合によっては適当な培養条件を用いて細苗に
おける直接発現においてメチオニンによるＮ末端伸長を
多少は抑制することが可能であるが、Ｄｅｓ−Ｍｅｔ（
脱メチオニン）型は定量的には得られない。メチオニン
化型をやめて収量の低下を既に考慮に入れた場合でさえ
も、メチオニン化型からの所望のタンパク質の分離は、
一般にきわめて難しく、さらに大きな収量の低下を伴う
。

Ｎ末端がプロリンで始まるタンパク質の製造法は既に示
唆されている。この方法は、遺伝子工学によって得られ
た、短い、好ましくはメチオニン残基からなる、Ｎ末端
伸長を有する前駆体をアミノペプチダーゼ−Ｐを用いる
酵素的切断に供することからなる（前に非公開であった
西独特許出願Ｐ３８１１９２１．８）。場合によっては
、Ｎ末端にメチオニン残基を有するタンパク質の混合物
もまたこの工程の出発材料として用いることができる。

本発明の概念のさらなる発展において、そのＮ末端を少
なくともプロリンで伸長させるようにタンパク質を遺伝
子工学によって生産し、プロリンイミノペプチダーゼと
の反応によって（必要に応じてアミノペプチダーゼ−Ｐ
を用いる他のアミノ酸を予めの切断した後に）、所望の
タンパク質がこのタンパク質から遊離される場合には、
いかなるタンパク質も遺伝子的にコードされたアミノ酸
から産生されること、が今や見出された。

第１図は、インターロイキン−２および顆粒球／マクロ
ファージコロニー刺激因子（Ｃ；Ｍ−ＣＳ　Ｆ　）から
形成された三機能性タンパク質をコードする発現ベクタ
ーｐＢ３２の構築を示す、説明図である。このタンパク
質は、Ｎ末端がＭｅｔ−Ｐｒ。

で始まり、本発明の工程のための好ましい出発材料を表
す。

本発明の好ましい態様は、以下に詳細に示す通りである
。

Ｎ末端がプロリンで始まる遺伝子工学によって得られた
すべてのタンパク質を、本発明の工程の出発材料として
用いることができる。例えば、必要に応じて予めタンパ
ク質切断処理されたタンパク質なども用いることができ
、これには欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０．２１９
，７８１号、第０　、２２７　、９３８号および第０．
２２８，０１８号明細書に従って得られるものなどがあ
る。好ましくは、直接に発現されたタンパク質、とくに
西独特許出願第ｐ　３８１１９２１．８号明細書に示唆
されている方法によって得られるまたは適用されるタン
パク質、を用いる。出発材料として、プロリン残基の前
または多くのプロリン残基の前に、さらに他のアミノ酸
残基、とくにメチオニン残基、を有するタンパク質が用
いられる場合には、これら残基を７ミノベプチダーゼー
Ｐを用いてまず除去する。適当な出発材料は、また、あ
る場合にのみプロリン残基の前にメチオニン残基を有す
る、遺伝子工学によって得られるタンパク質の混合物で
ある。加えて、アミノペプチダーゼ−ＰはＮ末端におい
て配置されたアミノ酸をプロリン残基の前で非特異的に
切断することから、遺伝子工学によって得られ、ざらに
Ｎ末端において伸長されたタンパク質のいかなるものを
も原理的には用いることができる。

プロリンイミノペプチダーゼを既知の方法にて得ること
ができる（Ｓａｒｉｄら：　（１９５９）　Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ。

Ｃｈｅｍ、　２３４．１７４０および（＋９６２）　２
３７．２２０？）。しかしながら、既知の電気泳動精製
工程の代わりに第二のクロマトグラフィー精製が有利に
行われる。

プロリンの酵素的切断を通常の方法にて行う。

酵素は遊離の状態または担体に固定化したかたちで行う
。酵素の固定化を、例えば、欧州特許（ＥＰ−８）第０
．１４１，２２３号および第０．１４１，２２４号明細
書ならびにそれら明細書に記載の文献の方法に従って行
う。

池のアミノ酸、とくにメチオニン、の酵素的切断をアミ
ノペプチダーゼ−Ｐを用いて予め行う場合には、この酵
素も遊離の状態または担体に固定化したかたちで用いる
ことができる。とくに、担体結合酵素を用いる場合には
、反応溶液がまず結合アミノペプチダーゼ−Ｐと接触し
てから次にプロリンイミノペプチダーゼと接触するよう
に固定化酵素を適当な酵素リアクターに配置して、二つ
の酵素反応を組み合わせることができる。

本発明は、このように、穏やかな酵素的条件を用いて、
遺伝子工学によって得られるポリペプチドおよびタンパ
ク質、とくに直接発現によって得られる産生物、に得ら
れるべき限定されたＮ末端を持たせる。本発明による工
程は、このように、化学的切断工程においてみられる欠
点および限界に支配されないものである。

本発明は、次の諸例によってより詳細に説明される通り
である。とく記載がない限り、パーセントおよび比の表
示は重量表示である。

例１： プロリンイミノペプチダーゼの単離および精製単離およ
び精製を５ａｒｉｄらの方法（前出）に従って大腸菌株
のタイプに１２−Ｗ−１３６１：ｐｒｏ−ｍｅｔ−から
出発して行う。

有利には、しかしながら、記載の酵素の電気泳動的濃縮
の代わりにＤＥＡＥセルロース（Ｍｏｎ。

Ｑ　ＨＲ５５カラムを用いるファルマシアＦＰＬＣシス
バルビッル酸およびそのナトリウム塩、ｐＨ８，６，５
０μ＋のＯ，１ＭＭｎＣＩ２溶液当り）に対して透析す
る。

本発明の工程においてアミノペプチダーゼ−Ｐを用いる
場合には、これを西独特許出願第Ｐ３８１１９２１．８
号明細書に提案されている工程に従って単離する。

大腸菌Ｂ細胞を５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液中で破砕
して、遠心分離して、粗細胞抽出物を約１５分間５０℃
でインキュベートする。混合物を再び遠心分離して、硫
安沈澱を４５％飽和で行う。

遠心分離の後、酵素は上清に見出される。さらに、既知
の工程に従って精製を行う。

例２： 発現プラスミドの構築 二機能性タンパク質をコードする発現プラスミドｐＢ３
０はＥＰ−Ａ第０　、２８８　、８０９号明細書（また
はＡＵ−Ａ第１４，６６１／８８号明細書）に提案され
ている。こメンＩぐ− のタンパク質では、架Ｍ’ｌ＃；ｅの１５個のアミノ酸
および次いでＣ；Ｍ−ＣＳ　Ｆのアミノ酸配列がインタ
ーロイキン−２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列に続いてい
る。構造遺伝子のＩ　Ｌ−２部分は、この場合、ＥＰ−
Ａ第０．１６３，２４９号明細書（またはＡＵ−Ａ第４
３．０７０／８５号明細書）に記載の合成遺伝子に基づ
いている（表１）。この合成遺伝子は、一連の制限酵素
の唯一の切断部位を含んでおり、このうち、酵素Ｐｓｔ
ｌ、ＸｂａＩおよび５ａｃｌを遺伝子断片のサブクロー
ニングに用いた。Ｐｓｔｌ切断部位は、この場合、アミ
ノ酸２１／２２領域に位置し、Ｘｂａ　Ｉ切断部位はア
ミノ酸５８−６０の領域に位置する。

プラスミドｐＢ３０　（１）を、ＰｓｔＩを用いて部分
的に、Ｘｂａｌを用いて全体的に、消化して、小さい断
片（２）を単離する。これはＩＬ−２の部分的断片をコ
ードする。

ＥＰ−Ａ第０．１６３，２４９号明細書に従って、オリ
ゴヌクレオチド（３）（該明細書に記載のＤＮＡ配列［
１ａに対応するオリゴヌクレオチド構築ブロックＩａ〜
Ｉｆであるが、プロリンをコードするトリブレラ）ＣＣ
ＧがＡＴＧ開始コドンの後に挿入されている）を合成す
る。

市販のベクターｐＵｃ１９をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ
を用いて開環して、大きい断片（４）をｒ　Ｌ−２部分
断片（２）および（３）と連結させる。この目的のため
に、コンピテントにした大腸［７９１０２株の細胞をラ
イゲーション混合物で形質転換させて、２０　ｍｇ／リ
ットルのアンピシリンを含むＩＰＴＣ；／Ｘｇａｌプレ
ートにブレーティングする。白色コロニーを単離して、
プラスミドＤＮＡを制限酵素および配列分析によって特
徴付けする。ＩＬ−２の最初の５９個のアミノ酸をコー
ドする所望のプラスミドをｐＢ３１　（５）と称する。

【Ｌ−２断片（６）を酵素ＥｅｏＲＩおよびＸ　ｂ　ａ
　Ｉを用いてプラスミドｐＢ３１（５）から切り出して
、対応する断片の代わりにプラスミドｐＢ３０に用いる
。この目的のために、ｐＢ３０（１）をＥｃｏＲＩおよ
びＸｂａｌを用いて消化して、大きい断片（７）を断片
（６）と連結させて、プラスミドｐＢ３２　（８）を得
る（これはｆ　Ｌ−２遺伝子の模式的に代表されていな
い５′領域においてしか相違しないことから、構成の図
示の繰り返しを省略する）。

プラスミドｐＢ３２　（８）で大腸菌ＭＭ２９４株を形
質転換させて、増幅させて、再単離して、大腸菌Ｗ３１
１０株において発現のために形質転換させた。発現はＥ
Ｐ−８第０　、２８８　、８０９号明細書に提示されて
いる方法に従って行う。

例３： 三機能性タンパク質の単離および精製 発現を完成させた後、細胞を遠心分離して、燐酸緩衝液
（ｐＨ６，５）中で破砕する。破砕混合物を遠心分離す
ると、三機能性タンパク質は沈澱中漬を遠心分離して、
水で再び洗浄する。これを０．４％Ｎ−ラウロイルサル
コシン （１ａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓ目］ｅ）ナトリウム塩溶
液に移して、１時間振どうする。硫酸銅溶液濃度を１０
ｍＭに調整した後、混合物を４℃で一晩再び据どうする
。

混合物を遠心分離して、上溝液に６倍量のアセトンを加
えて、沈澱するタンパク質を遠心分離する。

沈澱を乾燥させて、６Ｍグアニジン塩酸溶液を用いてタ
ンパク質濃度が５０〜１００　ｍｇ／リットルになるよ
うにして溶解させる。次いで、グリシン緩衝液（０，０
１Ｍグリシン、１０ｍＭ）リスＨＣＬ　　ｐ　Ｆ（７，
５）に対して透析を行う。透析の後、混合物を再び遠心
分離して、結合Ｉ　Ｌ−２抗体を含むアフィニティーカ
ラム（Ａｆｆｉ−ＧｅｔｌＯ）に上清液を通す。カラム
をＩＭＮａＣｌの５　ｍＭ　）リス−ＨＣｌ溶液で、次
いで１０Ｍ）リス−Ｅ（ＣＩ　（１）　Ｈ７，５）で洗
浄してから、三機能性タンパク質を０．２Ｎ酢酸を用い
て溶出させて、Ｍ　ｎ　２＋緩？ｔｊ　ｉ’ａ　（Ｙａ
ｒｏｎら：　（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａ
ｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｂＣｏ
ｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　３２．６５８）に対して透
析する。

例４： Ｎ末端Ｎｅｔ−Ｐｒｏ配列の切断 例３によりて得られる三機能性タンパク質を濃度５　Ｘ
　１０−６〜１０−’ｍｏｌに調整する。次いて、０．
１〜１μ８／ｍ１のアミノペプチダーゼ−Ｐを加えて、
反応混合物を３７〜４０’Ｃで１時間反応さセル。反応
ヲ１０ｍＭト’Ｊ　ス−ＨＣｌ　　（ｐ　Ｈ７，５）に
対する透析によって終結させる。例３の方法のようにし
て反応成分をアフィニティークロマトグラフィーによっ
てそれぞれ分離する。三機能性タンパク質を含む両分を
集めて、プロリンイミノペプチダーゼ反応緩衝液（例１
に既述）に対して透析する。次いで、酵素二基質の重量
比が約１：５になるようにプロリンイミノペプチダーゼ
を加える。反応混合物を４０℃で８〜１６時間インキュ
ベートする。このようにして、Ｔｒｏｌｌらの方法（（
１９５５）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２１５．
６５５）にてプロリン切断を続いて起こすことができる
。１０−３ＭＺｎＣｌ２溶液を添加して反応を終結させ
ろ。反応産生物を「逆相Ｊ　ＨＰＬＣにょフて精製して
から、脱塩の後、活性測定およびタンパク質配列分析を
行う。配列分析によって、事実上均質なＮ末端が示され
た。

骨髄増殖試験における生物学的活性を調べた結果は、Ｅ
Ｐ−Ａ第０．２８８，８０９号明細書に提示されたタン
パク質と一致する。

／ ／ ／ ４、

【図面の簡単な説明】

第１図は、 三機能性タンパク質をコートする発 現ベクターｐＢ３２の構築を図示する、説明図で ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ末端を少なくともプロリンによって伸長させた前
   駆体を遺伝子工学によって調製すること、および、必要
   に応じてアミノペプチダーゼ−Ｐを用いて予め他のアミ
   ノ酸を切断した後に、プロリンイミノペプチダーゼとの
   反応によって所望のタンパク質をこのタンパク質から遊
   離させること、からなるタンパク質の製造法。 ２、遺伝子工学によって調製される前駆体が所望のタン
   パク質の前に配列Ｍｅｔ−ＰｒｏをＮ末端に有すること
   を特徴とする、請求項１に記載の製造法。 ３、遺伝子工学によって調製される前駆体が直接発現の
   産生物であることを特徴とする、請求項１または２に記
   載の製造法。 ４、前駆体を細菌中での直接発現によって得ることを特
   徴とする、請求項３に記載の製造法。 ５、場合によってタンパク質がプロリン残基の前にメチ
   オニン残基を有するのみである混合物を用いることを特
   徴とする、請求項３または４に記載の製造法。