JPH07502652A - シグナルペプチドを有さないスタフィロキナーゼの発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ノグナルベブチドを有さないスタフィロキナーゼの発現本発明は細菌性プラスミ ノーゲン活性剤であるスタフィロキナーゼ（ｓｔａｐｈｙｌ。

ｋｉｎａｓｅ）　（以下ｒｓＡＫｊと略する）のシグナルペプチドを有さない発 現形に関する。本発明は新規品種のスタフィロキナーゼ、遺伝子工学手法による その製法および使用方法に関する。本発明には本発明のＳＡＫをコードするＤＮ Ａ配列、これらのＤＮＡ配列と高効果性の発現／グナルとを結合して含有するり コンビナンドプラスミド、これらの発現プラスミドのうちのひとつが導入された 後、培養条件下において、本発明のＳＡＫ変種の生合成が可能なりコンビナンド ホスト細胞を選択し、この培養およびスタフィロキナーゼ（目的とするポリペプ チド）を得られた培養上清から単離するそれぞれの方法に関する。

上記目的を達成するため、本発明はさらにモノクローナル抗スタフィロキナーゼ 抗体を提供する最初の出願である。

６７）　、２３３３〜２３４２）およびジャクソン（Ｋ、ｆ、　ＪＡＣＫＳＯＮ ）ら（メソッド・イン・エンザイモｏ　）−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ）、８０、（１９８１）３８７）により行われた研究より、スタフ ィロキナーゼ（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ　ａｕｒｅｕｓ）株から得られるポリペプチド）は、ヒトまたは動物の血漿に 存在するプロエンザイムであるプラスミノーゲンを血栓溶解活性を有する酵素で あるプラスミンへと転換させるのを制御するが、それ自身はタンパク質溶解性活 性を示さないことが示されている。活性化のメカニズムは未だにはっきりとは分 かっていない。

本発明のスタフィロキナーゼ変種は、ヒ′トに用いる医薬品として適当であり、 また所望により血栓塞栓血管症の治療のための獣医薬として有用である。一方体 ＳＡＫモノクローナル抗体は活性成分を得るための道具として、および以下によ り詳しく説明しているが、医薬処方の成分としても有用である。

スタフィロキナーゼ（分子長＝１３６アミノ酸）は血栓溶解系を、プラスミノー ゲンをプラスミンに転換させ、これによってフィブリンを分解することにより活 性化させる。最もよく知られている内因性活性剤はヒト組織プラスミノーゲン活 性化剤（ｔ−ＰＡ）およびウロキナーゼである。細菌由来の他のプラスミノーゲ ン活性剤は、ストレプトキナーゼである。上述の物質はすでに血栓塞栓血管症の 患者の治療に用いられている。これらの病気の発症率は高く、かかる物質を大量 に、高純度で得ることが望まれている。

この細菌性プラスミノーゲン活性剤は例えば以下のごとき有用性を示するにもか かわらず、ストレプトキナーゼの場合と異なり、近年の工業的微生物生産界にお いてはＳＡＫを生産する工業的方法はないニー熱および化学的環境に対する、高 いタンパク質安定性−ジスルフィド結合を有さない３次構造、および−小さな分 子サイズ（１５，８ＫＤ）。

実際に多くの毒性を有する副産物がスタフィロコッカス・アウレウス産生株から 形成されるということからかかる状況が生じたものである。

リコンビナントＤＮＡ技術の導入後、ＳＡＫの合成を組み替えたホスト生物にて 行うことが可能となり、このポリペプチドを活性成分として用いた医薬を工業的 に得ることが可能であることが認識し得るようになった。

スタフィロコッカス・アウレウスのファージより単離されたスタフィロキナーゼ をコードする２つの遺伝子が従来技術に示されている。遺伝子の提供者として用 いられたのは一方はＳ、アウレウス・ファージＣ（サコ（Ｔ、　５ＡＫＯ）ら、 モル・８３）、７６７９〜７６９３：ＥＰ　Ｏ０７７６６４参照）であり、もう 一方はＳ、アウレウス・ファージ４２Ｄ　（ＤＤ２４５　４４４およびベーンケ ／ゲラッなサブクローニングの１＆、ＤＮＡ配列分析により同定した。

他のスタフィロキナーゼ遺伝子の単離も近年報告されている（コリン（Ｄ、　Ｃ ０ＬＬＥＮ＞ら、フィブリツリシフ、　（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）、旦（１ ９９２）、２２６〜２３１）。

この遺伝子は５ＴＡＲと呼ばれ、Ｓアウレウス菌株の染色体ＤＮＡより得られた ものである。これらのすべての遺伝子は天然スタフィロキナーゼの対合バリアン トを提供する。

５ＡＫ−Ｃポリペプチドをコードする遺伝子は、イー・コリ発現系内に再クロー ニングした後、イー・コリ株ＷＡ８０２内に発現させた（ＥＰＯ０７７６６４； サコ、ユーロ・ジエイ・バイオケム（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ）、１４ ９　（１９８５）、５５７〜５６３）。

配列表の配列番号９に記載した５ＡＫ４２Ｄをコードする遺伝子は一方、グラム 陰性およびグラム陽性の両方のプラスミドベクター内へクローン化され、エラン エリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１）、バチルス・ズブチリス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ１ｉｓ）およびストレプトコッカス・サンダイ ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｓ）内で発現させられている（ ＤＤ２４５　４４４およびペンテ／ゲラツクのモル・ジエン・ジエネソト２１０ 　（１９８７）　、５２８〜５３４参照）。

５ａｋ−５ＴＡＲ遺伝子はその天然のシグナルの制御のもとでのみイー・コリ内 で発現し得ることが報告されている（コレンら、フィブリツリシス、６（１９９ ２）　、２０３〜２１３）。

引用した文献から、従来技術においては３つの遺伝子５ａｋ４２Ｄ、５ａｋ−Ｃ および５ａｋ−８ＴＡＲは専らその天然形でのみ発現させられていること、すな わちシグナルペプチドを担うポリペプチドが前駆体として存在することがわかる 。

かかるシグナル配列を有するプレポリペプチドの合成を行う場合、得られた生成 物をペリプラズム内または培養培地内へ放出させ必要がある。この方法には実質 的な欠点、グラム陽性リコンビナントホスト細胞を用いる場合、培地内へ放出す ると、ＳＡＫポリペプチドが該細胞の細胞外プロテアーゼの影響を受け、該ポリ ペプチドが即座に分解するという欠点を有する。

コリ型のホスト細菌を用いる場合、特にＥＰＯ０７７６６４に記載のごとく、目 的とするポリペプチドをペリプラズムへ放出することによって、この不利を迂回 しようとしており、その結果として目的とするポリペプチドの高濃度が達成され るものと期待しており、タンパク質を分解より保護し、細胞の分解時において、 目的とするポリペプチドへのアクセスが容易となるという効果も有する。

しかしながら、この発現機構は他の不利益、すなわち工業的に効果的な目的とす るＳＡＫポリペプチドの産生をまた妨げるという不利益を有する。これは以下の 理由による・ ・目的とするポリペプチド類（工業的に有用な産生物の生成に必要なペプチド類 等）の大部分をグラム陰性ホスト細胞のペリプラズムへ放出することは細胞の分 泌器に過度な負担をかけ、微生物の生理学的な崩壊を招く。

・全工程のうちの培養１稈において、発現し得る期間が非常に減少し、従って目 的とするポリペプチドの収量が、非常に減少するであろうこと。

・再生発酵プログラムが非常に困難であること、および・この生合成のモードの 結果、マチュアーなＳＡＫポリペプチドとＳＡＫブレポリペプチドのヘテロロー ガスな混合物が生成すること。

ＥＰ　Ｏ０７７６６４によると、５ＡＫ−Ｃはその天然の発現シグナルを用いて ヘテロローガスなホスト内で発現されるが、その結果適当な工業的効率と共に低 レベルの発現が得られる。５ＡＫ−Ｃの熱による発現がサコによって提案されて いる（ユーロ・ジエイ・バイオケム１４９、（１９８５）、５５７〜５６３）が 、これは上述の問題だけてなく、さらに工業的発酵条件の下で熱により誘導され るタンパク質生合成は、できたとしてもコストがかさみ、また不正確であるとい う不利益も有する。

合成された５ＡＫ４２Ｄは主にバチルス・ズブチリス培養上清液よりＤＤ　２４ ５　４４４の記載に従って単離される。この工程において、発現および分泌は対 応する５ａｋ４２Ｄ遺伝子の天然のコントロール配列を用いて、リコンビナント プラスミドｐＤＢ１５によりアレンジされている。しかしながら、この操作でも 発現レベルは満足のゆくものではない：またさらに、発現したＳＡＫポリペプチ ドの異質性のため、および標的タンパク質が長期培養の後に培養液中で迅速に分 解してしまうという欠点も有する（ゲルラックら、ゼブル・バクト・ヒゲ（Ｚｂ ｌ。

Ｂａｋｔ、　Ｈｙｇ）、Ａ２６９　（１９８８）　、３１４〜３２２参照）。

５ＡＫ−５ＴＡＲとして知られているＳＡＫの他の天然の対合バリアントもまた 、イー・コリ内でヘテロローガスに合成させるには、天然のシグナルを用いる場 合のみ可能である（コレンら、フィブリツリシス６　（１９９２）２０３〜２１ ３）これは５ＡＫ−Ｃについて記載したのと同じ問題をもたらす。

記載してきた通り、５ＡＫ−Ｃ，５ＡＫ４２Ｄまたは５ＡＫ−５ＴＡＲの合成の ための方法は今まで、例外なく完全な天然の遺伝子配列の発現に依存しており、 およびそれぞれ上述の不利益から免れることができない。

上述の現在の背景技術に対して、本発明の目的は工業的に効率的なＳＡＫポリペ プチドの生合成方法を提供し、これによって高純度で均質な当該目的とするポリ ペプチド製品の生成を可能とすることを目的とする。焦点となっているポリペプ チドは血栓塞栓血管症の治療のためのヒトまたは獣医用医薬に使用するのに適し たものである。

この目的を達成するため、プラスミノーゲン活性化作用を有するスタフィロキナ ーゼポリペプチドのりコンビナンドによる製造に際して、これらのポリペプチド をコードするＤＮＡ、すなわちｓａｋ遺伝子のごときＤＮＡ配列を、シグナルペ プチドコード領域を有さないＤＮＡ配列を用いることを提案する。シグナルペプ チドをコードするヌクレオチド配列を除去することにより、本発明において以下 に述べる有利な効果が得られ、そして本発明は目的とするＳＡＫポリペプチドを 工業的に生産し得るに足る効率を達成した最初の発明である。

本発明により生成されるシグナルペプチドを有さないポリペプチドは細胞内部に 収集され、そして驚くべきことに、予期されうる複合体、特に不溶性で生物学的 に不活性なタンパク質の凝集も認められないことが示される（ケーン（Ｋａｎｅ 。

Ｊ、Ｆ、）ら、チブテソク（ＴＩＢＴＥＣ■）旦、ｐ９５　（１９８８）　、ミ トラキ（ｌｌｉｔｒａｋｉ、　Ａ。

）らバイオ／テクノ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ、　）ヱ、ｐ６９０　（１９８９）参 照）。さらに、細胞内に発現した目的とするＳＡＫポリペプチドは、精製により 、複雑なおよびコストのかかる変性および再生操作することなく、可溶性で生物 学的に活性な形態で得られる。

本発明の方法により得られる有利な効果を以下に挙げる・・発現した目的とする ＳＡＫポリペプチドは細胞内に存在することから、生成物の濃縮操作が容易であ る： ・プレポリペプチドが全く生成されず、このため発現した目的とするＳＡＫポリ ペプチドが均一な形態て細胞内に存在する：・目的とするＳＡＫポリペプチドの 細胞内発現により長い生合成相を維持することができる。細胞の生理学的崩壇も 起こらず、このため高収率にて目的とするＳＡＫポリペプチドを得る（細胞の全 タンパク質の１０から１５％）ことが可能となる。

・目的とするＳＡＫポリペプチドの発現を化学的に誘導する（これは本発明の発 現ベクターによって可能となる）ことにより良好な発酵操作が容易に制御できる ようになる。

本発明により細胞内に発現したＳＡＫポリペプチドにはＮ末端メチオニンが欠損 しており、このため天然に発現するマチュアーな分泌性ＳＡＫポリペプチドと区 別されない。

ノブナルペプチドを有さない目的とするＳＡＫポリペプチドを発現させることの 上述の有用性に加えて、人工的なＳＡＫ対合バリアントであり配列表の配列番号 ６および７に示される、本発明の目的とするＳＡＫポリペプチド、および配列表 の４および５に示すＳＡＫフラグメントはプラスミノーゲンの活性化における特 異的活性の増強、より迅速なプラスミノーゲン活性死力イネテイクスおよび／又 は低分子量でありこのため低い抗原性であるというような有用性を有する。これ らの性質は特に目的とするＳＡＫポリペプチドをヒトおよび動物の血栓塞栓症の 治療に用いる上において有用である。

本発明において用いられるＤＮＡ配列は、基本的には以下のごとき性質を有する 。

・ノブナルペプチドを有さないマチュアーな天然のスタフィロキナーゼおよび対 合ＳＡＫバリアントまたはＳＡＫフラグメ−ントであって、等しく既知の天然分 子のプラスミノーゲン活性化作用を有するものをコードする；・翻訳開始コドン ＡＴＧがいずれの場合にも配列の５゛末端の上流に直接結合している。

本発明の目的を達成するために好ましいのは、上に説明したＤＮＡ配列であって 、図１の配列表の配列番号１に記載したヌクレオチド配列を有するがまたは、配 列番号１の配列の対合バリアントまたはフラグメントのいずれかを有するもので ある。特に、図１のヌクレオチド配列以外に、配列番号２および配列番号３の図 １に示した一部ヌクレオチド配列の天然の対合バリアントヌクレオチドも本発明 の目的に用いられる。

図１（配列番号１）に記載したヌクレオチド配列は天然の５ａｋ４２Ｄ構造遺伝 子を示し、これに本発明により 一５′末端をＡＴＧ開始コドンと、および＝３“末端をターミネーンヨンコドン ＴＡＡと結合させたものである。

Σａｋ４２Ｄ構造遺伝子は本発明において組換の出発プラスミドｐＭＥＴ５　（ 図１０）における要求に対して供給される。プラスミドｐＭＥＴ５は市販のクロ ーニングベクターｐＵＣ１９の誘導体であり、Σａｋ４２ＤをコードするＤＮＡ 領域を担い、これは文献により公知であるプラスミドｐＤＢファミリーのうちの １つのプラスミドより単離され（ＤＤ　２４５　４４４またはベーンヶ／ゲラツ ク、モル・ジエン・ジェネソトλよμ（１，９８７）、５２８〜５３４参照）、 好ましくはｐＤＢ１５またはｐＤＢ１７より、リコンビナントＤＮＡ技術として 公知の方法にて単離される。詳しくは、プラスミドｐＭＥＴ５は図９（配列番号 ９）の番号９に示した）は、例えばｐＤＢ１７上では欠損は天然の５°側の調節 領域、／グナルペプチドコード配列およびマチュアーな５ＡＫ４２Ｄの最初の４ つのアミノ酸をコードしているコドンである；後者はオリジナル遺伝子よりＴａ ｑｌ制限酵素切断により分離された（この５′末端において、ｐＭＥＴ５−ＤＮ Ａにおいては代りに唯一の５ａｌｌ制限部位が生成される）。５ＡＫ４２Ｄをコ ードする配列の下流に、最初に単離されたｓ　ａ　ｋ　４２Ｄ−ＤＮＡより原始 的に単離された３°側の非コード領域およびイー・コリプラスミドｐＢＲ３２２ の断片がｐＤＢ１７上にあるのと同様、未だｐＭＥＴＳ内に存在する。

本発明の目的のため、プラスミドｐＭＥＴ５の５ＡＫ４２ｄ遺伝子領域の再構築 を、図１（配列番号１）に示したマチュアーな天然５ＡＫ２４Ｄのシグナルベブ チドを有さないコード配列とするために、化学合成によるリンカ一対を相当する 特定のヌクレオチド配列へ付着させて行った。

同様の方法で、リコンビナントＤＮＡ手法として知られており、化学合成リンカ −分子をリンクさせる方法を含む各方法により、さらに本発明の５ａｋＤＮＡ領 域の天然のおよび人工の対合形態およびフラグメントを、プラスミドｐＭＥＴ５ から分離し得るｓ　ａ　ｋ　４２Ｄ−ＤＮＡから製造することが可能である。

ａ）図２及び３（配列番号２および３）に記載の２つのヌクレオチド配列−上述 のＡＴＧ出発コドンおよびターミネータ−コドンの間にはさまれている−は今ま で天然のマチュアーなＳＡＫポリペプチドとして知られた天然の対合バリアント の構造遺伝子である、さらに ｂ）図４及び５（配列番号４および５）のヌクレオチド配列を有するこれらの２ つのＤＮＡ配列は、天然のマチュアーな５ＡＫ４２ＤポリペプチドのＮ−末端が 欠損している新規なノブナルペプチドを含有しないフラグメントの構造遺伝子で ある、そして最後に Ｃ）図６及び７（配列番号６および７）のヌクレオチド配列を有する２つのＤＮ Ａ配列は天然のマチュアーなポリペプチド５ＡＫ４２Ｄの新規な人工対合１＜リ アントのノブナルペプチドを有さない構造遺伝子を表示する。

上述のＤＮＡ配列、特に配列番号１から７までに記載したＤＮＡ配列は原核生物 または真核生物のいずれのホスト細胞にも公知の方法で導入し、プラスミノーゲ ン活性効果を有するノブナルペプチドを含有しないスタフィロキナーゼとして発 現させることができる。

上述のＤＮＡ配列、好ましくは配列表の１から７に記載したＤＮＡ配列を提供す ることに加えて、本発明の目的には、適当な原核または真核ホスト細胞内へ導入 した後に、少なくとも該−次構造の一部を有し、本発明のＳＡＫポリペプチドの １またはそれ以上の生物的または免疫的性質を有するポリペプチドの発現を保証 するためのＤＮＡ配列を提供することも含む。特に詳しくは、以下のものが含ま れる： ａｌ）上述のＤＮＡ配列のＳＡＫポリペプチドコード領域とハイブリダイズする ようなりＮＡ配列、好ましくは配列表の配列番号１から７に記載のＤＮＡ配列ま たはそのフラグメントと標準的な条件下（以下参照）においてハイブリダイズす るようなりＮＡ配列、およびさらに ｂｌ）遺伝子コードの変性により生じる転向を除き、その一部がａ）に示された ＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ０本発明において、標準的な条件とはハ イブリダイゼーションを５５℃から６８℃の範囲の温度で、塩濃度５ｘ　ｓｓｃ のバッファー内で行う条件をいう。

本発明において、ａ）またはａｌ）にまとめられたＤＮＡ配列は、言わば静かな 変異とてもいうべき、配列番号１から７に記載のヌクレオチド配列、すなわち各 場合において対応するスタフィロキナーゼのアミノ酸配列への変化を及ぼさない 選択的ヌクレオチド交換である。

本発明において、本発明のすべてのＤＮＡ配列は好ましくは適当な原核および／ または真核ホスト細胞に形質転換により導入される。従って本発明には本発明の ＤＮＡ配列が取り扱えるよう、発現コントロール配列がリンクされている特定の 発現プラスミドも含まれる。

本発明によって、発現プラスミドのこれらのＤＮＡ領域であってそれぞれ本発明 のｓａｋ構造遺伝子にＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ停止コドンが組み合わさっ たものが発現調節配列に結合しているが、ノブナルペプチドをコードする領域を スミトは、ノブナルペプチドを有さないことが保証され、従って目的とするポリ ペプチドのホスト細胞における細胞内発現が保証される。

本発明に関連して、原核生物のＤＮＡから構築されたｓａｋリコンビナント発現 プラスミドが特に用いられ、とりわけ、その発現ボックス（全発現シグナルの詳 細に関しては以下に述べる通りである）が図１から７（配列番号１がら７）に示 したΣａｋ遺伝子を含有し、これらが原核性調節配列に操作し得るように結合し ているごときものが、原核性由来の宿主細胞が本発明のＳＡＫポリペプチドの発 現に提供される場合には特に好適に用いられる。

本発明によって、ベクターの発現ボックス内に原核性のコントロール配列の以下 のごとき組み合わせを配するのがよいことが証明された一以下読み取り方向に説 明する。

・ｔａｃプロモーターおよび土ａＣリプレッサーの結合配列・規定されたスペー サーを有するンヤイン・ダルガーノ配列がタンデムに配された翻訳開始領域 ・転写ターミネータ− （上記の組み合わせを、Ｒ；ｔａｃ；ＳＤ；Ｔ配置と略する。）本発明のΣａｋ 配列はいずれの場合においてもすでにＡＴＧ開始コドンとＴＡＡ停止コドンとに リンクしており、これが上述のＲ；ｔａｃ；ＳＤ；Ｔ配置にフィツトするように 導入される。

本発明の枠組の内において、図８（配列番号８）のＤＮＡ配列を翻訳開始領域と して有する場合、特に高い発現能がかかるＲ；　ｔａｃ　：　；ＳＤ：Ｔ−配置 のボックスを導入した際に達成することができる。

本発明は、上述の点より非常な有用性を示す、というのは、細菌ＤＮＡおよび細 菌細胞から得られる両方の発現プラスミド−好ましくはグラム陰性細菌、特にイ ー・コリ種が好ましい−のみならず、バチルス属をホスト細胞として用いること もできるという有用性がある。本発明の、シグナルペプチドを有さない目的とす るＳＡＫポリペプチドの高率の発現はかかる細菌発現系により達成し得る。特に 好ましい効果は、本発明の目的とするＳＡＫポリペプチドをイー・フリ発現系内 で合成させる場合に得られる。本発明のこの好ましい態様のため、発現プラスミ ドは複製オリジン、選択マーカーおよびポリリンカー領域を有するよう、構成ａ ）それぞれ図１から７（配列番号１から７）のＤＮＡ配列が、図８（配列番号８ ）の翻訳開始領域に直接リンクしている、Ｒ；ｔａｃ：ＳＤ；Ｔ−配置発現ボッ クスを有する ｂ）市販のイー・コリクローニングベクターまたは発現ベクターから誘導された ものであり、好ましくはｐＵＣおよびｐＭＥＸベクターより誘導されたものであ る。

Σａｋ遺伝子を有する本発明の発現プラスミドの例は以下のものである（図１１ 及び１２、実施例３．４．７．８も参照のこと）ニーｐＭＥＸ６０２ｓａｋ −ｐＭＥＸ６△Ｎ１０ｓＮ１ ０ｓａｋ−ｐ△１４ｓａｋ −ｐＭＥＸ６ｓａｋＭ２６Ｃ −ｐＭＥＸ６ｓａｋ２６Ｌ ｐＵＣ，ｐＢＲおよびｐ１５Ａタイプのプラスミドもまた、使用することができ る。

イー・コリホスト細胞はいずれの場合にも本発明のイー・コリ発現プラスミドを 用い、標準的なプロトコールにより形質転換させればよい。

目的とするＳＡＫポリペプチドの細胞内発現のため、例えばＪＭＩＯＩ、Ｋ１２ またはＣ６００のごときイー・コリレセプター株を好ましい発現系として用いる ことができる。イー・コリＴＧＩホスト細胞を用いた場合に特に良好な発現結果 が得られた。

本発明の組換ストレインは以下のものであり、これらは実施例３．４．７．８に 示した： イー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ６０２ｓａｋ）　、イー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥ Ｘ６△ＮＩＱｓａｋ）、イー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ６△Ｎ１４ｓａｋ）、イ ー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ６ｓａｋＭ２６Ｃ）　、イー・コリＴＧＩ　（ｐＭ ＥＸ６ｓａｋＭ２６Ｌ）。

上述の株は本発明の有用性を示すホスト細胞の例である。有用性とは特に、・本 発明のｓａｋ遺伝子を正確に、高レベルで発現する（図１３８も参照のこと）、 ・生成物の細胞内における完全な産生を可能にし、ホスト細胞の細胞質内の目的 とするポリペプチド濃度をあげる（目的とするポリペプチドは細胞ペリプラズム へ放出されることはない）、 ・いずれの場合においても、可溶性で生物学的に活性な目的とするポリペプチド が合成され、蓄積される ・培養中において化学的誘導のアルゴリズム上で効果的に反応する、・大量発酵 に適する、安定なりコンビナンド微生物であることのみならず、効率的に製品を 得る技術として必要とされる目的とするポリペプチドの高収率を得る高細胞密度 の方法に到達し得ることが示された（ホスト細胞の全タンパク質の上限１５％ま で）。

さらに、驚くべきことに、本発明で用いられたイー・３９１６１株はＮ末端メチ オニンをそのアミノ酸配列に有しない形態のＳＡＫを合成することが発見された 。

本発明のｓａｋリコンビナントホスト細胞の培養−特にリコンビナントイー・コ リＴＧＩ株の培養−は、無菌の好気的水中条件で、公知の方法による前培養およ び本培養を、それぞれ消化し得る炭素および窒素源および規定された鉱物および 塩を含有する栄養培地中て行う。

本発明の特に好ましい態様においては、Σａｋリコンビナントイー・３９１６１ 株を上記に加えて以下のごとく特徴付けられる発酵工程に付す。

・培養は２８℃から４２℃の範囲の温度で４時間から１６時間、全培地または合 成培地と呼ばれる培地中で行い、いずれの場合にも５０ｍｇ／Ｉから１００ｍｇ ／ｌのアンピノリンを添加しておく、 ・発酵の開始より２から４時間後、目的とするポリペプチドのりコンビナンドホ スト細胞による生合成を、イソプロピルチオガラクトピラノンド（Ｔ　ＰＴＧ） を培地に、細胞密度へ６００ユニットが約０．２から１０に達するバイオマスで ある場合に、最終濃度が０．３ミリモル／ｌまでとなるように添加することによ り開始する。

目的とするＳＡＫポリペプチドは好ましくはホスト細胞から以下の方法により単 離する：ホスト細胞を、好ましくは超音波により破壊し、破壊した物質のうちの 可溶性部分を不溶性部分から分離する。可溶性部分をその後直接イオン交換器へ 導く。次に、目的とするポリペプチドをＮａＣ１溶液を用いて選択的にイオン交 換器より溶出させる。ＮａＣ１濃度を上げた後、溶出物は直接、疎水性相互作用 クロマトグラフィーへ供するのが有利である。最終的に目的とするポリペプチド は疎水性相互作用クロマトグラフィーにより高い選択率にて、ＮａＣ＋濃度を下 げるグラジェントにより溶出され、この溶出物から得られる。この目的とするポ リペプチドのりコンビナンドイー・コリＴＧＩ細胞の溶菌物からの精製は、２段 階からなる精製段階の間でひとつのバッファを適用すればよいという特に有用な 方法である。

上述の操作方法は、最初の溶出段階におけるＮａＣ］濃度を３０から５００、好 ましくは２００から３００ｍＭとし、疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけ る前に２，０から３．０Ｍに増加させ、ＮａＣ１が減少するグラジェントにかけ るのが好ましい。疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいては２．０から３． ０Ｍの初期濃度を選択し、これを最終濃度１５から１００ｍＭへと減らす（図１ ４参照）。

上述の操作方法は、２つのクロマトグラフィ一段階のみにより、工業的に容易に なし得るに足るほど廉価な目的とするポリペプチドの分離を可能にする。この操 作において目的とするポリペプチドは非常に純粋な状態で得られ、これはクロマ トグラフ的に均質である。この精製操作を工業的な規模へ拡大することは容易で ある。この操作によりまた、粗溶間物より得られたＳＡＫポリペプチドを穏やか に、ロスが少な（（変性および再生操作をすることなく）精製することが可能と なる。本発明の発酵工程において、目的とするポリペプチドはプレポリペプチド とマチュアーな目的とするポリペプチドの混合物として存在するのではないとい う事実は、説明した精製操作において大いに有利である。

５ＡＫ４２Ｄ、５ＡＫ−Ｃおよび５ＡＫ−８ＴＡＲのごときすでに知られた天然 の対合スタフィロキナーゼに加えて、以下の新規なＳＡＫもまた、本発明の範囲 内に含まれ、特に以下の有用な性質を有する：・Ｎ１０△５ＡＫ４２ＤのＳＡＫ フラグメント、図４（配列番号４）にアミノ酸配列を記載する、 ・Ｎ１４△５ＡＫ４２ＤのＳＡＫフラグメント、図５（配列番号５）にそのアミ ノ酸配列を記載する、 ・ＳＡＫＭ２６Ｃの人工対合ＳＡＫ種、図６（配列番号６）にそのアミノ酸配列 を記載する。

・ＳＡＫＭ２６Ｌの人工対合ＳＡＫ種、図７（配列番号７）にそのアミノ酸配列 を記載する。

Ｎ１０△５ＡＫ４２ＤおよびＮ１４△５ＡＫ４２Ｄのフラグメントは、プラスミ ノーゲン活性化作用があるＮ末端欠損ＳＡＫポリペプチドが得られる、これらの 分子の長さはそれぞれ１２６と１２２アミノ酸である。

ＳＡＫＭ２６ＣおよびＳＡＫＭ２６Ｌの人工的対合形は本願により初めて示され たプラスミノーゲン活性化作用を有し、メチオニンを含有していないＳＡＫ種で ある。これらはそれぞれ１３６アミノ酸の分子長を有する。

このフラグメントはプラスミノーゲン活性化のカイネティクスを加速した。分子 サイズが小さくなったことはまた、抗原性が低いことを示唆する。

この人工の対合種において、ある場合においては特異的な活性が２倍高くなる（ 表２参照）一方、プラスミノーゲン活性化速度の加速も認められた。

本発明はまた、スタフィロキナーゼに対するモノクローナル抗体も提供する。

以前からポリクローナルな抗ＳＡＫ抗体は入手可能であった（サコ／ツチダ、ヌ クル・アンッズ・レス（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）第１１巻（１９ ８３）、７６７９〜７６９３およびゲラツクらラブル・バクト・ヒゲ（Ｚｂｌ、 　Ｂａｋｔ、　Ｉｌｙｇ、）第Ａ２６９　（１９８８）、３１４〜３２２参照） 。我々は、リコンビナントなイー・コリホスト細胞で産生された純粋な５ＡＫ４ ２Ｄポリペプチドにより、抗ＳＡＫ抗体を産生ずるハイブリドーマセルラインを ケラー／ミルスタイン（ＫＯＩＩＬＥＲ／ＭＩＬＳＴＥＩＮ）法の変法により初 めて得ることに成功した。

２ツノセルライン−フル７ｙｓＡＫ　ＩＧ８／１６（Ｚ　１ＭＯ５１１トＬテ寄 託、ＤＳＭ　ＡＣＣ２１００とトランスファーされた）およびアルファＳＡＫ　 ＩＩ＾４／＾１０（ＺＩＭＯ５１２として寄託、ＤＳＭ　ＡＣＣ２１０１とトラ ンスファーされた）と名付けたーをインビトロ培養に用い、モノクローナル抗Ｓ ＡＫ抗体ＩＧ８／Ｈ６およびＩＩ＾４／＾１０を免疫アフィニティークロマトグ ラフィーにより公知の方法により培養土清液より単離した。これらのモノクロー ナル抗体は、本発明のＳＡＫのプラスミノーゲン活性化作用を不活性とする（実 施例１７参照）。この性質を用いることにより、本発明の抗ＳＡＫモノクローナ ル抗体は以下のごと（用いることができる・ ａ）微生物内および疾病の診断においてスタフィロキナーゼの測定システムに用 いる、例えば ａｌ）サンプル液中のＳＡＫの定性的な測定を、ウェスタン・プロッティング法 または免疫沈降法にて行う場合およびａ２）サンプル液中のＳＡＫを定量的に測 定するＥＬＩ　ＳＡ試験を行う場合、また同様に、 ｂ）発酵培地または粗抽出液より、ＳＡＫポリペプチドを免疫アフィニティーク ロマトグラフィーによって直接調製するために用いられる。この場合には高効率 の処理方法を提供することができる。

プラスミノーゲン活性剤としての性質を有することから、本発明により製造され たＳＡＫポリペプチド、すなわちシグナルペプチドを有さない、細胞内で合成さ れる天然対合ＳＡＫおよび新規な人工対合ＳＡＫまたはフラグメントの両方は血 栓塞栓疾患の治療のための医薬組成物の優れた活性成分となる。

本発明の方法により合成された１またはそれ以上のＳＡＫ種が薬剤として適合性 の希釈剤、アジュバントおよび／または担体物質と共に含有されているかかる医 薬組成物が本発明の目的のために望ましい。この処方は好ましくは非経口的に投 与し、特に静脈内投与が好ましい。好ましい用量は、−回の投与につきポリペプ チド３から１００ｍｇの範囲である。

本発明のモノクローナル抗ＳＡＫ抗体もまた、解毒性製剤において有効な活性成 分として、すなわち希望しないＳＡＫによる強力なプラスミノーゲン活性化を阻 害する医薬として有用である。従って、本発明はかかる抗体を所望により薬剤適 合性の希釈剤、アジュバントおよび／または担体物質と共に含有する医薬組成物 も含有する。

本発明に関連して、生物的に純粋な以下のサンプル：プラスミドｐ　Ｍ　Ｅ　Ｔ 　５　（０５Ｍ６８４１）ハイブリドーマセルライン　アルファＳＡＫ　ＩＧ８ ／＋１６　（ＺＩＭＯ５１１）（ＤＳｌｉ　ＡＣＣ２１００） ハイブリドーマセルライン　アルファＳＡＫ　ｌｌＡ４／ＡＩＯ（ＺＩＭ　０５ １２）（ＤＳＭ　ＡＣＣ２１０１） は、ドイツ連邦共和国デー−３３００・ブランスウインク、マスチェログ−・ベ ツグ１ベーに住所を有する７ヤーマン・コレクション・フォア・マイクロオーガ ニズムス（ＤＳＭ）に寄託した。以下の寄託されているプラスミドまたはレセプ ター株もまた、用いている。

プラスミドベクター　１）　Ｕ　Ｃ１９（ＤＳＭ　３４２５）レセプター株イー ・コリＴＧＩ　（ＤＳＭ　６０５０６）本発明は以下に記載した本発明のｓａｋ 遺伝子の構築、発現プラスミドおよびホスト細胞好ましい例に関する実施例によ りさらに詳細に説明される。

本発明において用いたオリゴヌクレオチドリンカーは表１に挙げた。

図面の説明 図１　配列番号１の、マチュアーな野生型スタフィロキナーゼ５ＡＫ４２Ｄをコ ードする遺伝子のヌクレオチド配列、およびこれより得られるアミノ酸配列。

図２　配列番号２の、マチュアーな野生型スタフィロキナーゼＳＡＫΦＣをコー ドする遺伝子のヌクレオチド配列、およびこれより得られるアミノ酸配列。

図３　配列番号３の、マチュアーな野生型スタフィロキナーゼ５ＡＫ−３ＴＡＲ （Ｓアウレウスストレイン２３のゲノムＤＮＡ）をコートする遺伝子のヌクレオ チド配列、およびこれより得られるアミノ酸配列。

図４　配列番号４の、マチュアーな野生型スタフィロキナーゼに対して欠損を有 するＳＡＫ△ＮＩＯをコードするフラグメントのヌクレオチド配列、およびこれ より得られるアミノ酸配列。

図５　配列番号５の、マチュアーなスタフィロキナーゼに対して欠損を有するＳ ＡＫ△Ｎ１４をコードするフラグメントのヌクレオチド配列、およびこれより得 られるアミノ酸配列。

図６．配列番号６の、スタフィロキナーゼＳＡＫＭ２６Ｃをコードする人工の対 合バリアントのヌクレオチド配列、およびこれより得られるアミノ酸配列。

図７・配列番号７の、スタフィロキナーゼＳＡＫＭ２６Ｌをコードする人工の対 合バリアントのヌクレオチド配列、およびこれより得られるアミノ酸配列。

図８　配列番号８のＲＢＳタンデムコンフィグレーンヨンのヌクレオチド配列。

図９　スタフィロコッカス・アウレウス・ファージ４２Ｄのゲノム上で野生型ス タフィロキナーゼ４２Ｄをコードする遺伝子のヌクレオチド配列、およびこれよ り得られるアミノ酸配列。

図１０　プラスミドｐＭＥＴ５の遺伝子および制限地図。

図１１　プラスミドファミリーｐＵｃ１９ｓａｋの遺伝子および制限地図。

図１２・プラスミドファミリーｐＭＥＸ５ｓａｋの遺伝子および制限地図。

図１３ａ　スタフィロキナーゼポリペプチドが発現していることを、粗溶間物の ５ＤＳ−ＰＡＧＥのゲルにより示す図である。

図１３ｂ　モノクローナル抗体ＩＧ８／Ｈ６が記載したすべてのスタフィロキナ ーゼポリペプチドと結合することを、図１３ａで分離した粗溶間物のウェスタン プロットにより示した図である。

図１４　：　５ＡＫ４２Ｄを例として用いて、精製工程の効率を示した図である 。

図１５　スタフィロキナーゼポリペプチド５ＡＫ４２Ｄの定量的測定を行うため のＥＬＩ　ＺＡ試験の検量線。

図１６　モノクローナル抗体ＩＧ８／８６を用いた免疫沈降反応の評価を示す。

本発明の好ましい例は以下に示す各方法により実施したものである・（プラスミ ド名　ｐＴＺ１９ｓａｋｌ）マチュアーな５ＡＫ４２Ｄをコードするベースプラ スミドｐＴＺ１９ｓａｋｌを構築するために、リコンビナントプラスミドｐＭＥ Ｔ５　（図１０）を遺伝子ドナーＤＮＡとして用いた。プラスミドｐＭＥＴ５は プラスミドｐＤＢ１７より一連の遺伝子工学的操作により得られる。

ポータブルトランスレーノヨンングナル（リポソーム結合配列（ＲＢＳ）および ＡＴＧ開始コドン）および５ａｋ４２［）遺伝子の発現にむすびつくトランシノ ヨン配列を適当なトランスクリブノヨンシグナル（プローター）へ誘導すること を含み、化学的に合成されたリンカ−を唯一の５ａ１１部位の上流へ付着させる ことにより行う。この末端に、ｐＭＥＴ５をまずはじめにに唯一の５ａｉ１部位 で開環し、本発明のリンカ一対ＬＬ／Ｌ２＊　（これはＴ４ポリヌクレオチドキ ナーゼによって半リン酸化されており、（表１：＊は以下、リン酸化されたリン カ−のパートナ−を表示する）アニーリングにおいて５ａ１１およびＨｉｎｄｌ ｌｌの挿入部位に対して許容性の末端を設けている）を７４−ＤＮＡリガーゼを 用いて、線状ｐＭＥｔ５プラスミドの末端へ付着させた。続いてＨｉｎｄｌｌｌ により消化し、両端がＨｉｎｄｌｌｌ末端である約１．２ｋｂ犬の５ＡＫ４２Ｄ コードフラグメントを得、これを市販のベクタープラスミドｐＺＴ１９Ｒ（ＵＳ Ｂ、バッド・ハンブルグ）のＨｉｎｄｌ１１部位内へクローン化した。この操作 において、インフレーム方向の５ａｋ４２Ｄ遺伝子をベクタープラスミドの±ａ Ｃ遺伝子まで有するプラスミドＩ）ＴＺ１９ＲｓａｋＯが得られた。

５ＡＫ４２Ｄをコードしない３°−側のＤＮＡ部位を分離するため、１，２ｋｂ 大のＥｃｏＲ１／Ｈｉ　ｎｄ　ｌ　ｌ　１フラグメントをｐＴＺ１９ＲｓａｋＯ よりまず最初に単離し、そしてこれよりＡｖａ　Ｉ、Ａｖａ　Ｉ　Ｉ、およびＨ ｉｎｆｌの連続的な制限酵素による消化によって、３８８ｂｐ大のＥｃｏＲ１／ Ｈｉ　ｎ　ｆ　ｌフラグメントを得、５ＡＫ４２Ｄをコードする末端の２７ｂｐ の配列をＨｉｎｆｌ切断で除いた。５ａｋ４２Ｄ遺伝子の３゛末端の完全な配列 を再生するために、ＨｉｎｆｌおよびＰｓｔｌ末端に適合するリンカ一対Ｌ３＊ ／Ｌ４　（表１参照）をＥｃｏＲ１／ＨｉｎｆｌフラグメントのＨ４ｎｆｌ末端 に公知の方法で付加させた。こうして作成された、今や完全な５ａｋ４２Ｄ構造 遺伝子を有する４３３ｂｐ大のＥｃｏＲ１／Ｐｓ　ｔ　ｌフラグメントを今度は あらかじめ同じ酵素で処理したベクタープラスミドｐＴＺ１９Ｒへ挿入した。

こうして作成されたプラスミドｐＴＺ１９Ｒｓａｋｌは以下の遺伝子工学的操作 のベースプラスミドとして５ＡＫ４２Ｄの発現ベクターおよびＮ末端の欠損した ５ＡＫ４２Ｄ種の製造に役立つ。

方法Ｂ　５ＡＫ４２ＤおよびＮ末端欠損ＳＡＫポリペプチドの発現ベクターの構 築 市販のプラスミドｐＭＥＸ５およびｐＭＥＸ６　（共にメダック社、ハンブルグ ）を発現ベクターとして用いた。これらのプラスミド内において発現は合成ｔａ ｃプロモーターにより制御され、転写は二つのタンデム転写ターミネータ−ｒｒ ｎＢＴＩおよびｒｒｎＢ”ｒ’！にて停止される。発現しようとする遺伝子を調 節シグナル配列の間（以下Ｒ；　ｔａｃ　＋ＳＤ＋−：　ｒｒｎＢＴＩＴ２配置 という）へ挿入した。上記２つのプラスミドはお互い、イー・コリｆ１ファージ から一本鎖ＤＮＡの生成を可能にする領域を異なった方向に有しているという点 においてのみ異なっている。

上述のＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔｌフラグメントをベースプラ・スミドｐＴＺ１９Ｒｓ ａｋｌから単離し、続いてＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌで処理したプラスミドｐＭ ＥＸ５およびｐＭＥＸ６内へ挿入する。イー・コリＴＧＩ株内へ形質転換した後 、発現プラスミドｐＭＥＸ５０３ｓａｋおよびｐＭＥＸ６０３ｓａｋを担うイー ・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ５０３ｓａｋ）およびイー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ ６０３ｓａｋ）が形成される（図１２）。両方のプラスミドにおいて、目的とす るポリペプチドの発現は発現シグナルの同様の配置によってなされ、これは、Ｒ ；ｔａｃ；ＳＤ；−；ｒｒｎＢＴＩＴ２コンフィグレーンヨンにおいて、図８に 示すごとく２つのＲＢＳがタンデム方向に配されており、発現させようとする５ ａｋ４２Ｄ遺伝子の上流へ結合していることに特徴づけられる。第２のＲＢＳは すでにプラスミドｐＴＺ１９Ｒｓ、ａｋＯ内に、マチユア−な５ａｋ４２遺伝子 の５°末端の再構築に使用され（表１参照）だ、制限酵素５ｔｕｌおよびＮｄｅ ｌの認識部位とちょうど類似するリンカ一対Ｌｌ／Ｌ２により導入されている。

イー−）すＴＧＩ　（ｐＭＥＸ６０３ｓａｋ）株はマチユア−な５ＡＫ４２Ｄの 発酵生産に好適に用い得る。

Ｎ末端欠損スタフィロキナーゼの発現プラスミドを作成するため、公知のリンカ ーアダブノヨンが以下の実施において用いられる。使用するリンカ−はＬＸずれ の場合にも５ｔｕｌで切断したＤＮＡヘライゲーションさせた後、５°末端の５ ｔｕｌ認識配列を再構築することによって構築する。５ｔｕｌ部位の下流に、Ａ た５ＡＫ４２Ｄのための発現プラスミドを構築するのに用いた。両方の場合１こ おいて、試行錯誤のため、半リン酸化リンカ一対Ｌ５＊／Ｌ６　（ΔＮ　１０− ８ＡＫ４２Ｄ△に対して）およびＬ７＊／Ｌ８　（ΔＮ１４−３ＡＫ４２Ｄ番二 対して）を、５ｔｕｌにて開環させた発現プラスミドｐＭＥＸ６０２ｓａｋへＴ ４−ＤＮＡ’ノガーゼの助けにより付着させた。続いてＢｉｎｄｌｌｌで消化し 、５ａｋ４２Ｄ遺伝子を完全にリンカ−で修飾したベクターより除いた。こうし て得た直鎖状発現ベクターは、Ｂｓ　ｔＵＴ／Ｈｉｎｄ　Ｉ　ＴまたはＨａｅｌ ｌｌ／Ｈｉｎｄｌｒｌ末端てあり、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによって適当な欠損５ ａｋ４２Ｄ遺伝子を有するＢｓ　ｔｔｊｌ／Ｈ４ｎｄｌ　ｌまたはＨａｅｌｌｌ ／Ｈｉｎｄｌｌ　ｌフラグメント（両方のフラグメントはｐＺＴＲｓａｋｌを各 する制限酵素の組合わせで切断して得た。）とリンクさせた。

イー・コリＴＧＩ内に知−ニングした後、イー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ６Ｎ１ ０ｓａｋ）およびイー・コリＴＧＩ　（１）ＭＥＸ６Ｎ１４ｓａｋ）の各株で、 発現プラスミドｐＭＥＸ６Ｎ１０ｓａｋおよびｐＭＥＸ６Ｎ１４　ｓａｋを複製 するものが、説明した方法により得られた。

方法ＣマチュアーなＳＡＫＭ２６Ｘを有するベース・プラスミドｐＵｃ１９ｓａ ｋＭ２６Ｘ　（Ｘ＝１、ＲｌＶ、に、Ｌ、Ｃ，Ａ、Ｈ，ＧおよびＳである）の構 築 以下はｐＵｃ１９ｓａｋＭ２６Ｘ　（図１１参照）プラスミドファミリーの遺伝 子工学による構築を以下の３つのサブステップにより行う：・第１段階（方法Ｃ １）においては、翻訳結合配列を含む５ＡＫ４２Ｄの１位から２２位のアミノ酸 をコードする配列を最初に構築する。

・第２段階（方法Ｃ２）においては、５ＡＫ４２Ｄの３２位からのアミノ酸をコ ードする配列を構築する、そして ・最終の第三段階（方法Ｃ３）においてはマチユア−なＳＡＫＭ２６Ｘｓの完全 な遺伝子を表１に示した範囲の化学合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて構 築する。

方法Ｃ１ １から２２位のアミノ酸をコードする配列の構築には、ポータプル翻訳シグナル 配列（ＲＢＳ）および発現開始コドンＡＴＧへのトランシジシロン配列を、ＳＡ ＫＭ２６ＸコードＤＮＡ配列の発現コネクションまでのその他の配列と同様に翻 訳シグナル配列（ｐ　Ｍ　Ｅ　Ｘ　６より）へ導入することを含み、化学的に合 成したオリゴヌクレオチドリンカーと対応するヌクレオチドシリーズとのクロー ニングを媒介（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）プラスミドｐＵｃ１９ｓａｋＯを経 て２段階にて行った。

最初に半リン酸化リンカ一対Ｌ９＊／ＬＩＯを公知の方法にて７４−ＤＮＡリガ ーゼによりＥｃｏＲｌで切断して線状としたベクタープラスミドｐｌＪｃ１９の ２つの末端に付着させた。用いたリンカ一対は以下のごとくして調製した、即ち 、翻訳結合のためのポータプルヌクレオチド配列に加えて、アミノ酸１から３お よび４位アミノ酸の最初の２つのヌクレオチドのＤＮＡ配列を、ｐＵｃ１９にな い５ｆｕｌ制限酵素認識配列（コドン４とオーバーラツプする）およびＢａｍＨ Ｉ−適合性５°　−ヌクレオチド末端と共に含有する。同様にしてポリクローニ ング配列（ＰＣ５）に付着されたリンカ一対を再びＢａｍＨＩ切断により除いた 。得られたＬ９／ＬＩＯ改変線状ｐｔＪｃ１９ベクターをＴ４−ＤＮＡリガーゼ で環状とし、媒介クローンとした。プラスミドｐＵｃ１９ｓａｋｏが得られた。

　続いて、基本的には同じ方法を用いて、部分的にリン酸化されたリンカ一対Ｌ １１／Ｌ１２（表１参照）を、導入した５ｆｕ１部位で開裂させたプラスミドｐ ＵＣ１９ｓａｋＯに付着させた。マチュアーなｓａｋＭ２６Ｘ遺伝子のコドン４ の配列が完成され、そしてポータブルトランンジンヨン配列を含むマチュアーな ＳＡＫ生成物の１位から１３位のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が構築 される。

続いて、ＰＣ８に付着されたリンカ一対Ｌ１１＊／Ｌ１２を再び制限酵素５ｐｈ Ｉで切断して分離した。さきにリン酸化しておいたリンカ一対Ｌ１３／Ｌ１４＊ をＴ４−ＤＮＡリガーゼにより得られた線状プラスミドのｓｐｈ　ｌ末端へ付着 させた。この方法により、２２位から１６位のアミノ酸配列および制限酵素Ｎａ ｅＩの唯一の切断部位であってコドン２２およびｓｐｈ　１部位とオーバーラツ プするヌクレオチド配列が、再構築されたｓｐｈ　１部位からリーディング方向 からリンカ一対の５゛末端にかぶさるように導入される。得られた線状ｐＵｃ１ ９誘導体にはまた、その末端に、アニーリンした後にコドン１４および１５を完 成する、お互い相補的な６ヌクレオチドの環状−末鎖ＤＮＡ配列を有する。

フリーの重複５°ヌクレオチド末端をリン酸化した後、リンカ−で修飾したベク ターフラグメントを既述の方法にて環状化した。クローニングによって、内部に コドン２３の配列に結合したＮａｅ＋切断部位を有するプラスミドｐＵｃ１９ｓ ａｋｌ△が得られた。

方法Ｃ２ ＳＡＣ２５ＡＫの３２位のアミノ酸から先のＣ末端アミノ酸を以下の操作に適合 するようにコードするＤＮＡ配列を含有するｐＵｃ１９ｓａｋＡ２プラスミドの 構築を、お互い適合する２つの遺伝子工学操作を用い、方法ｃ１で得た中間プラ スミドｐＵｃ１９ｓａｋＡ１を用いて行った。プラスミドｐＭＥＴ５をＳＡＫＭ ２６Ｘの４４位から１２４位のアミノ酸をコードする本操作に必要なりＮＡの部 分配列を得るために再び用いた。３゛側のＤＮＡ部位を分離するため、この場合 には１．２ｋｂ大のＳａ　Ｉ　Ｉ／Ｐｓ　ｔ　ＩフラグメントをｐＭＥＴ５から まず最初に単離し、これより適当な（既述の）方法により、Ａｖａ　Ｉ、Ａｖａ 　Ｉ　＋およびＨｉｎｆｌによる制限消化により、配列の最後の２７ｂｐの領域 が５ＡＫ４２Ｄをコードする３６１ｂｐ大の５ａｌｌ／Ｈｉｎｆｌフラグメント を同様にして単離した。

平行した操作において、旧ｎｆｌ／Ｐｓｔｌ適合リンカ一対Ｌ１５／Ｌ１６＊（ 表１参照）を既述の方法により同じ酵素で消化したベクターｐＵｃ１９のＰｓｔ −ｌ末端へ付着させ、５ａｉｌで切断した後、５ａｌｌ／Ｈｉｎｆｌ−適合性の Ｌ１５／Ｌ１６＊リンカ−修飾クローニングベクターｐＵｃ１９を得た。付着さ せたリンカ一対には最適な方法により、マチュアーな５ａｋ４２Ｄ遺伝子のコド ン１２５の下流の修復されたコード配列を含有し、マチュアーな５ＡＫ４２Ｄの アミノ酸１２９及び１３０（静かな変異）（すなわち、３９１位のヌクレオチド ）を保持し、さらに５ｔｙｒ制限部位をも有する。

先に述べた修飾した線状ベクターｐＵｃ１９において、単離された３６１ｂｐ大 の５ａｉｌ／ＨｉｎｆＩフラグメント（ｐ　Ｍ　Ｅ　Ｔ　５より）をＴ４−ＤＮ Ａリガーゼによって挿入し、この形質転換の後中間プラスミドｐＵｃ１９ｓａｋ Ａ１が最初に得られ、これにはマチュアーな５ａｋ４２Ｄ遺伝子のコドン４より 先の完全なコードＤＮＡ配列を有する。

こうして作成された中間プラスミドを続いて遺伝子工学手法によりＥｃｏＲＩ切 断部位で切断し、既述の原理によって半リン酸化リンカ一対Ｌ　１７　＊／Ｌ　 １８により修飾した。これらのリンカ−はお互いに相補的であり、なかんずくマ チュアーな標的配列ＳＡＫＭ２６Ｘのコドン３２から４３の部分配列およびコド ン４４の最初の２つのヌクレオチドをコードする部分を有し、これによって、コ ドン導入される。結果として、この操作によりＳＡＫＭ２６Ｘのアミノ酸配列が この領域において保存され、さらに望ましい制限酵素Ｓａ　ｌ　Ｔ、、Ｓａｃ　 Ｉおよび５ａｃｌ＋それぞれの唯一の認識部位が導入される。リンカ−置換プラ スミドを続いてＨｉｎｄｌｌ＋で消化した後、線状のＬ１７／Ｌ１８−Ｈｉｎｄ ｌ　ｌ　Ｉ−にフランキングなベクターｐＵＣ１９および４１４ｂｐ大のｓａｋ 遺伝子サブフラグメントが同時に切断混合物より単離される。後者より制限酵素 Ｍｎｌ＋による切断によってなかんず＜２９０ｂｐ大のＭｎ１ｌ／Ｈｉｎｇｌｌ ＋フラグメントが得られ、これは５°側がリンカ一対Ｌ　１７／Ｌ　１８の３゛ 末端と適合性であり、ＳＡＫＭ２６Ｘの４６位のアミノ酸から先のＣ末端をコー ドするＤＮＡ配列を含有し、ＴＡＡストップコドンの後て不完全に終わっている 。

こうして得られたＤＮＡフラグメントを公知のＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いる方 法により互いに再結合した。形質転換および選択の後、最終的に第２相プラスミ ドｐＵｓ１９ｓａｋＡ２が得られ、これはその後の遺伝子工学操作においてｐＵ Ｃｌ、９ｓａｋ△１と共に出発プラスミドとして働く。

方法Ｃ３ 方法０１およびＣ２に記載のＮ−およびＣ−末端の遺伝子部位の結合およびマチ ュアーなｓａｋＭ２６Ｘ遺伝子をコンスタントに産生させるための媒介クローン を、２３位から３１位のアミノ酸領域を含有する一部欠損ＤＮＡをコードする相 補的アダプターオリゴヌクレオチドの補助により作製した。

本操作において、２種類のアダプタ一対（表１参ｌ１ｉ１）が用いられるがこれ らは以下のごとき特徴を有する −同じ配列長を有する。

一５°末端がＮａｅｌに３゛末端が５ａｉｌ切断末端に適合する、および−２６ 位のコドンが、１２の異なったコドンにそれぞれ対応するヌクレオチドを有する 。

これらの性質の結果、こうして構築され、自動オリゴヌクレオチド合成装置によ り作成されたアダプターオリゴヌクレオチドはそれぞれ１２の異なったオリゴヌ クレオチド配列（ＡＧ）の混合物であり、その結果、いずれのシリーズにおいて も１２の異なったアダプタ一対が製造される。オリゴヌクレオチドの合成の間の ヌクレオチド混合物はアダプターシリーズＡＧＩ／ＡＧ２によっては１１の、ア ダプター７リーズＡＧ３／Ａｃ４によっては６の異なったアミノ酸が２６位にお いてコード化され、２６位のアミノ酸に対して結果としてトータルで１７の異な ったコドンを取ることが可能となる。

遺伝子工学操作において、上述のアダプタ一対ＡＧＩ／ＡＧ２＊およびＡＧ３／ ＡＧ４＊はそれぞれ最初に別個の反応ステップにおいて公知の方法で、ｐＵＣ１ ９ｓａｋＡ２を５ａｌｌで切断した後に形成されたフリーの末端と結合させた。

それぞれＡＧＩ／ＡＧ２−Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｔ　ＩおよびＡＧ３／ＡＧ４−Ｈｉｎ ｄｌｌＩ末端であり、マチュアーな遺伝子のコドン２４のコード領域を含有する フラグメントの混合物が、続＜Ｈｉｎｄｌｌｌ消化によって得られた。フラグメ ント混合物のアダプター型を決定し、最終的にＮａｅｌおよびＨｉｎｄｌｌ＋に より開環されたプラスミドベクターｐＵｃ１９ｓａｋｌ内にクローン化した。形 質転換の後得られたクローンを、得られたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよび Ｈｉｎｄｌｌ＋によりｓａｋＭ２６Ｘ遺伝子を担うプラスミドを二重切断するこ とによって予備選択を行った。予備選択したりコンビナンドプラスミドの標本数 のＤＮＡ配列を分析した後、プラスミドｐＵｃ１９ｓａｋＭ２６＋、ｐＵｃ１９ ｓａｋＭ２６Ｒ，ｐＵｃ１９ｓａｋＭ２６Ｖ、ｐＵｃ１９ｓａｋＭ２６ＴＳｐＵ ｃ１９ｓａｋＭ２６におよびｐＵＣｓａｋＭ２６Ｌであって、それぞれマチュア ーなＳＡＫＭ２６Ｉ、ＳＡＫＭ２６ＲＳＳＡＫＭ２６ＶＳＳＡＫＭ２６ＴＳＳＡ ＫＭ２６におよびＳＡＫＭ２６Ｌをコードするものがアダプタ一対ＡＧＩ／ＡＧ ２を用いて得たクローンより得られた。同様の方法により、プラスミドｐＵｃ１ ９ｓａｋＭ２６ＣＳｐＵＣｓａｋＭ２６Ａ、ｐＵＣｓａｋＭ２６Ｈ，ｐＵｃｓａ ｋＭ２６ＧおよびｐＵＣｓａｋＭ２６ＳてあってそれぞれＳＡＫ２４ＣＳＳＡＫ Ｍ２６Ａ。

ＳＡＫＭ２６Ｈ，ＳＡＫＭ２６Ｇ、およびＳＡＫＭ２６Ｓが同定サレ、ＡＧ３／ ＡＧＪシリーズより単離された。

方法Ｄ・発現プラスミドｐＭＥＸ６ｓａｋＭ２６Ｘの構築；リコンビナント産生 株を得る 市販のプラスミドｐＭＥＸ６、これは発現が合成−ｔａｃ−プロモーターによっ て支配されていることが知られているプラスミドであり、これを再び発現ベクタ ー単離し、つづいてＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌで処理した発現ベクターｐＭＥＸ ６に挿入し、イー・コリ１６１株のサンプルを得られたりコンビナンドＤＮＡに て新たに形質転換した。これにより、一連のイー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ６ｓ ａｋＭ２６Ｘ）発現味が得られ、これらはプラスミドファミリーｐＭＥＸｓａｋ Ｍ２６Ｘのうちの関連するものに対応する。このファミリーの全てのプラスミド において、問題となる標的ポリペプチドの発現は、先に述べた発現プラスミドと 同様の発現シグナルの支配により生じる。

合成されたＳＡＫＭ２６Ｘポリペプチドをプライマリ−・スクリーニング（以下 に述べる方法により行う）によりそのプラスミノーゲン活性化作用をチェックし た後、イー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ６ｓａｋＭ２６Ｌ）株およびイー・コリＴ Ｇｌ　（ｐＭＥＸ６ｓａｋＭ２６Ｃ）株を、目的とするポリペプチドのさらなる 発酵および濃縮操作に用いるＳＡＫＭ２６ＬおよびＳＡＫＭ２６Ｃ産生株として 選形質転換されたイー・コリ株、イー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ６０２ｓａｋ） 、イー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ６△Ｎ１０ｓａｋ）、イー・コリＴＧＩ　（ｐ ＭＥＸ６△Ｎ１４ｓａｋ）、イー・コリＴＧ１　（ｐＭＥＸ６ｓａｋＭ２６Ｌ） およびイー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ６ｓａｋＭ２６Ｃ）を複合完全培地または 合成培地内で対数相の中期または後期まで増殖させて、細胞内のＳＡＫ生成を測 定した。この増殖相において、ＳＡＫポリペプチドの発現はイソプロピルチオガ ラクトピラノノド（ＩＰＴＧ）により誘導される。１がら６時間の後、細胞を遠 心分離によって収穫し、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を 含有スるリン酸緩衝液に最懸濁させた。細胞の粗抽出物を超音波破壊および高速 遠心分離によって得た。

プラスミノーゲン活性剤ポリペプチド、すなわち５ＡＫ４２Ｄ、５ＡＫＮＩＯ。

５ＡＫＮ１４、ＳＡＫＭ２６ＬおよびＳＡＫＭ２６Ｃ１１透明な遠心分離した粗 抽出物より、Ｓセファロース高速流動クロマトグラフィー（ファルマシア、フラ イブルグ）およびハイロード−フェニルセファロース知マドグラフィー（ファル 々ンア、フライブルグ）に続けて供する２段階カラムクロマトグラフィー精製法 によって、電気泳動で同一性を示す程度まで精製する。

粗抽出物中および知マドグラフのフラクション中のプラスミノーゲン活性化剤の 濃度は５ＤＳ−ＰＡＧＥの後、バンドの強度を着色剤ブリリアントブルーの強度 を計算することにより、またはプラスミンより遊離されるプロテアーゼであるプ ラスミンのタンパク質分解活性によって半定量的に測定することができる。

このための方法としては、プラスミノーゲン−カゼイン−寒天プレートの溶菌領 域の測定により行う（ペンテとゲラツク、モル・ジエン・ジェネット、２１０（ １９８７Ｌ５２８〜５３４）がまたは、合成プラスミン基質であるクロモザイム Ｐ　Ｌ　（Ｃｈｒｏｍｏｚｙ■ＰＬ）からのニトロフェルレートの遊離量を色に より測定することによって行うことができる。

プラスミノーゲンと５ＡＫ２４Ｄまたは本発明のＳＡＫポリペプチド複合体の解 離定数もまた、新規なアフィニティークロマトグラフ法により測定した。

挟体撚 以下の具体例は、実施例を参照して、ベクターの構築、生成物の合成および処理 方法の各方法を具体的に説明するためのものである。しがしながら、標準化され た各遺伝子工学的操作に関する、プラスミドＤＮＡを得る方法、ＤＮＡを制限酵 素で開裂させる、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルより単離する（特に、ジ ェンクリーゾ（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ’）　（バイ第１０１、う・ジョラ）を用い たグラス・ミルク法による）　、ＤＮＡフラグメントをベクタープラスミド内へ 挿入する、細菌レセプター株のプラスミドＤＮＡによる形質転換およびＤＮＡ配 列分析のごとき個々の方法についてのこまかいデータは挙げていない。かかる操 作は一連の文献に詳しく説明されており（例えば、「モレキュラー・クローニン グ、ア・ラボラトリ−・マニュアル」、マニアチスら（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ 、　Ｅ、Ｒ，Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｊ。

５ａＩＩｌｂｒｏｏｋ）著、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・ プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒ ｅｓｓ）社、第２版、１９８９または「リコンビナント・ＤＮＡ　・メソドロノ ー」、ディロンら（Ｊ−Ａ、　ＲｏＤｉｌｌｏｎ、＾、　Ｎａ５１ｍ　ａｎｄ　 Ｅ、Ｒ，Ｎｅｓｔｍａｎ）著、ンヨン・ウィリー・アンド・ソング（Ｊｏｈｎ　 Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）社）、また当業者であれば知っていることである。

本発明において用いた全てのオリゴヌクレオチド類は自動オリゴヌクレオチド合 成装置（モデル３８０Ｂ　ＤＮＡンンセサイザー（アプライド・バイオシステム ズ、ウェイタースタット）にて、ホスファミジット（ｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｉｔ ）法を用いｐＴＺ１９ＲｓａｋＯの調製 イー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＴ５）からプラスミドＤＮＡを公知の方法により単 離した。適当な量のｐＭＥＴ５　（５から１０μｇ）を２０μｌの対応する反応 バッファ内て２０ユニツトの５ａｌｌ（ベーリンガー、マンハイム）により２時 間３７℃でインキュベートした。反応はフェノール抽出により停止させ、トリプ ルエーテル抽出の後エタノール（Ｅ　ｔ　ＯＨ）によってＤＮＡを沈澱させた。

沈澱物を２回蒸留水（Ｈ２Ｏ）に吸収させた。各アリコート（２００ｎｇ）の線 状プラスミドＤＮＡを、５０倍モル過剰量のリンカ−Ｌｌおよび公知の方法にて リン酸化されているりンカ−２と混合し、この混合物がライゲーション条件とな るよう、１０倍量の７Ｍパンファー（７００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，５）　、 ６０ｍＭのＭｇＣ１□）にて調製した。二本鎖リンカ−ＤＮＡは反応混合物を８ ０℃に加熱し、その後ゆっくりと室ｉ　（ＲＴ）まて冷却することにより生成さ れる。

１／１０体積当量の１００ｍ八１ンへオセレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉ ｔｏｌＸＤＴＴ）（セルバ、ハイデルベルグ）および１０ｍＭののアデノノント リホスフェート（ＡＴＰ）（ベーリンガー）および領２ユニットの７４−ＤＮＡ リガーゼ（ベーリンガー）を反応混合物に添加し１２時間１５℃でインキュベー トした。２．５倍量のエタノールを添加して、反応混合物よりＤＮＡを沈殿させ た。沈殿物を５０μｍのＢ−バッファ（ベーリンガー）に吸収させ、２ｏユニツ トのＨｉｎｄＩＩＩ（ベーリンガー）と共に２時間３７℃にてインキュベートし た。アガロースゲル電気泳動およびその後の電気溶出によって、１．２ｋｂ大の フラグメントを公知の方法て単離し、あらかじめ標準的な方法によってＨｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素により消化したベクターｐＴＺ１９Ｒ（ＵＳＢ１バド・ホムブル グ）とのライゲーションに供した。反応は１０分間続け、その後７０℃に加熱し て停止させた。反応混合物の半分をイー・コリＴＧＩ株のコンピテント細胞の形 質転換に用いた。

形質転換体の選択は５−ブロモ−４−クロロ−３−インＦ’Ｊルーベー９−Ｄ− ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ、ベーリンガー）およびイソプロピルチオガラクトピ ラノシド（ＩＰＴＧ、ベーリンガー）を寒天へ添加して、白い細胞クローンを選 択することによって行った。プラスミドＤＮＡを１０個の白色形質転換クローン から標準的なプロトコールに基づいたミニ・プレバレージョン法（プラスミド・ ミニプレツブ（ｐｌａｓｍｉｄ園１ｎｉｐｒｅｐ）により行い、制限酵素による 分析の後、シークエナーゼ”　（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ”ＸＵ　Ｓ　Ｂ）を用いた サンガー法により配列決定を行った。分析したクローン中には、期待された修復 した５ａｋ４２Ｄ遺伝子配列を示す８個のクローンがあった。これらのプラスミ ドのうちのひとつを選択し、ｐＴＺ１９ｓａｋＯと名付けた。

プラスミドｐＴＺ１９ｓａｋｏに含有されている５ＡＫ４２Ｄをコードしない３ °側の領域を分離するため、このプラスミドｐＴＺ１９ｓａｋＯのＤＮＡを標準 的な方法により単離し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌ（ベーリンガー）の制 限消化およびアガロースゲル電気泳動により１．２ｋｂ大のフラグメントを得た 。およそ２μｇのこのフラグメントを公知の方法で続いて制限酵素Ａｖａｌｌお よびＨｉｎｆｌ（すべてベーリンガー）にて処理し、その結果目的とするフラグ メントの電気泳動による単離が容易となった。３８８ｂｐ大のＨｉ　ｎ　ｄｌＩ Ｉ／Ｈｉｎｆ　−５ａｋ４２Ｄ遺伝子フラグメントは、反応中に形成された非常 に小さな開裂フラグメントであるが、１８％アガロースゲルによる電気泳動によ って、適当な方法により単離される。２００ｎｇのアリコートのＤＮＡ水溶液を ５０倍モル過剰の、公知の方法によりリン酸化されたリンカ−Ｌ３＊およびリン カ−Ｌ４と反応させ、１／１０体積当量の１００倍量のＴＭバッファーの添加に より反応を開始させた。反応混合物を６５℃まで加熱し、その後室温（ＲＴ）ま でゆっくりと冷却することによって二本鎖リンカ−ＤＮＡが形成された。

１／１０体積当量の１００ｍＭのＤＴＴおよび１０ｍＭのＡＴＰ、　これに加え て０．２ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを反応混合物へ添加し、１６時間１５ ℃でインキュベートした。２５倍量のＥｔＯＨを反応混合物に添加することによ ってＤＮＡを反応混合物より沈殿させた。こうして得た沈殿を１５μＩのライゲ ー／ヨンバッファ−（ベーリンガー）に吸収させ、あらかじめ公知の方法で制限 酵素ＥｃｏＲ１およびＰｓｔｌ（ベーリンガー）により処理し、水に溶解させた プラスミドｐＴＺ１９Ｒおよそ５Ｑｎｇと共にインキュベートした。０２ユニツ トのＴ４−ＤＮＡリガーゼを反応混合物へ添加し、インキュベーションを１６時 間１５℃で行った。この混合物の半分をイー・３０１６１株のコンピテント細胞 を公知の方法により形質転換するために用いた。形質転換体の選択は既述のごと （、Ｘ−Ｇａ１およびｌ　ＰＴＧを寒天に添加し、白色の細胞コロニーを選択し て行った。

１０個の白色の形質転換体クローンよりプラスミドの小さな標本を公知の方法に より作成しこれらのプラスミドのうちの４つをプラスミド配列決定へ供した。

こうして分析したクローンのうちの３つが予期した、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ１ 部位にフランキングなマチエアー５ＡＫ４２Ｄコード配列を示した。これらのプ ラスミドのうちの一つを選択し、ｐＴＺ１９ｓａｋｌと命名した。

実施例３ ｐＭＥＸ５０３ｓａｋおよびｐＭＥＸ６０２ｓａｋの調製４３３ｂｐ大の、Ｅｃ ｏＲＩおよびＰｓｔｌとにフランキングなフラグメントをベースプラスミドｐＴ Ｚ１９ｓａｋｌから、反応混合物の１．６％アガロース電気泳動の後、公知の方 法により単離した。これと平行して、ベクターｐＭＥＸ５およびｐＭＥＸ６　（ メダック）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌで標準的な方法にて処理し、ベ クターフラグメントを単離した。こうして前処理した５０ｎｇのフラグメントを ５０ｎｇの上述の４３３ｂｐフラグメントとライゲーションバッファー（ベーリ ンガー）中で接合させ、０２ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼの添加後、１６時 間、１５℃でインキュベーションした。イー・コリＴＧ１内へ形質転換した後に 得られたアンピンリン耐性コロニーを、スタフィロキナーゼ活性発現の試験へ供 するため、プラスミノーゲン含有カゼインアガー（ペンケとケランク（１９８７ ）、ロック・ノット（ｌｏｃ、　ｃｉｔ）参照）であってさらに２００μｍのＩ ＰＴＧを添加している培地へ移した。

それぞれカゼイン試験板内に溶菌斑を形成した各４クローンのプラスミドＤＮＡ を公知の方法で得、そのヌクレオチド配列を標準的なプラスミド配列決定法によ り決定した。例外なく、こうして分析したプラスミドはマチュアーな５ａｋ４２ Ｄ遺伝子が挿入されており、その５゛末端には翻訳−決定領域とフランキングで ある正確な配列を示した。

ｐ　Ｍ　Ｅ　Ｘ　５ンリーズより得られるプラスミドのうちひとつにｐＭＥＸ５ ０３ｓａｋと名付け、ｐＭＥＸ６より誘導される池のプラスミドにｐＭＥＸ６０ ２ｓａｋと名付けた。発現プラスミドｐＭＥＸ６０２ｓａｋで形質転換したイー ・コリＲＧＩ　（ｐＭＥＸ６０２ｓａｋ）株を以下の５ＡＫ４２Ｄの発酵および 濃縮方法に用いるための産生株として選択した。

欠損を有する５ａｋ４２Ｄ遺伝子の発現プラスミドを調製するため、１０　Ｉｆ 　ｇのプラスミドｐＭＥＸ９６０２ｓａｋを５０μＩの１］−バッファー（ベー リンガー、マンハイム）内で、それぞれ８０ユニツトの５ｔｕｌ　（ベーリンガ ー）と共に２時間、３７℃でインキュベートした。線状ベクターＤＮＡを公知の 方法で、１％ケルにおけるアカロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）の後に単離した。

２つの別個の反応混合物中で、２μｇの線状プラスミドＤＮＡをそれぞれ５０倍 モル過剰量のあらかじめ公知の方法にてリン酸化したリンカ一対Ｌ　５　＊／Ｌ 　６およびＬ７＊／Ｌ８と反応させた。対応するリンカ−のパートナ−をＴＭバ ッファー中で８０℃まで加熱し、その後ゆっくりと室温まで冷却することによっ て（アニーリング）二本鎖（ｄｓ）リンカ−ＤＮＡが得られた。

１／１０体積当最の１００ｍＭのＤＴＴおよび１０ｍＭのＡＴＰ、これに加えて ０２ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼを反応混合物に添加し、１２時間１５℃で インキュベートした。適当なＬ５／Ｌ６またはＬ７／Ｌ８−フランキング線状プ ラスミドを、反応混合物に２５倍量のエタノールを添加することによって沈殿さ せた。沈殿を２０μｌのＢ−バッファー（ベーリンガー）に含有させ、２０ユニ ットのＨｉｎｄｌｌｌ（ベーリンガー）と共に２時間３７°Ｃにてインキュベー トしたその結果天然のマチュアーな５ＡＫ４２Ｄをコードする全遺伝子がベクタ ープラスミドの残存部分から分離された。Σａｋ遺伝子を有さない、リンカ−に より修飾したｐＭＥＸ６フラグメントを１％アガロースゲル（ＡＧ）内で電気泳 動により分離した。

これと平行して、４５０ｂｐ大の５ａｋ４２Ｄ遺伝子フラグメントを、最初に５ ０μｇのプラスミドｐＴＺ１９ｓａｋｌから、各５０ユニツトのＥｃｏＲｌおよ びＨｉｎｄｌｌｌ（ベーリンカー）によるこれを二重消化し、これに続＜ＡＧＥ にて単離した。再び、これに平行して、５ａｋ４２フラグメント（約８００ｎｇ ）を含有する反応混合物中５０μｍへ適当な１００倍量の反応パンファーを添加 することにより反応させた。ある混合物のフラグメントを１０ユニツトのＢｓｔ Ｕｌ　（ＮＥＢ）にて６０８Ｃで消化し、第２の混合物は１０ユニツトのＨａｅ ｌＩ＋（ベーリンカー）により３７℃で２時間消化させた。続いて１％ＡＧ内の ＡＧＥにより、最初の場合には３７０ｂｐ大のＢｓ　ｔＵＩ／Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ 　Ｉ’７ラグメントが単離され、第２の場合には３５８ｂｐ大のＨａｅｌｌｌ／ Ｈｉｎｄｌｌ■フラグメントが単離された。

水に溶解し、５ａｋ４２Ｄ遺伝子を有する１０μ＋　（８０ｎｇ）のフラグメン トをを１０μｌ　（５０ｎｇ）のそれぞれ先に調製し、水に溶解させたリンカ− て修飾したベクターＤＮＡと接合させるべく、１０倍ラうゲーンヨンバッファー によりライゲーション条件とし、３ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと共に１５ 時間１５℃で培養した。

これらのライゲーション混合物の半分の体積をイー・３０１６１株のコンピテン ト細胞の形質転換に用いた。それぞれアンピンリン栄養培地（Ａｍｐ−ＮＡ）上 で成育する２０個程度の形質転換体のスタフィロキナーゼ活性の発現を、プラス ミノーゲン含有カゼイン栄養培地へ移した後に調べた。この活性は２から５時間 ３７℃でインキュベートした後に、細胞の凹部のまわりの溶菌領域により認識で きる。プラスミドＤＮＡを公知の方法で、活性試験においてポジティブな結果が 得られた１０クローンより単離した。

期待した５ｔｕｌ／Ｈｉｎｄｌｌ！挿入部を担うプラスミドをＨｉｎｄｌｌｌお よび５ｔｕｌ　（ベーリンガー）を用いた制限分析によりプレセレクトした。続 いて対応するフリーズの４片の小さなプラスミドの配列を決定し、好ましいプラ スミド挿入の配列が確立された。例外なく、こうして研究された両方のノリーズ 欠損しているプラスミドをｐＭＥＸ６△Ｎ１４ｓａｋと名付けた。それぞれのプ ラスミドを形質転換したイー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ６△Ｎ１０ｓａｋ）およ びイー・コリＴＧｉ　（ｐＭＥＸ６△Ｎ１４）のそれぞれの株を本発明において それぞれ５ＡＫＮＩＯおよび５ＡＫＮ１４産生株として用いた。

ベクターｐＵｃ１９をイー・コリＪＭ１０９　（ｐＵｃ１９）株からエチジウム ブロマイド−ＣｓＣＩ−密度勾配遠心分離により公知の方法で単離し、以下の遺 伝子工学的操作に用いた。

２μｇ程度のｐＵｃ１９を３０μｍのＨバッファー内で１０ユニツトのＥｃ。

Ｒ１と共に、ベクターが完全に開裂されるまでインキュベートした（約１時間） 。

ＨＩＯを９０μＩとなるように添加し、１０μｍのトリス−ＨＣ１（ｐＨ８，５ ）を添加した後、水で飽和させ、０５％の８−オキソキノリンで安定化させたフ ェノール（以下単にフェノールという）を１００μｍ添加して抽出を行い、混合 物をその後２分間１５０００ｒｐｍにて遠心分離した。分離した水相を２．５Ｍ 濃度の酢酸アンモニウム溶液とした後、ＥｃｏＲＩで切断したベクターをエタノ ールによって沈殿させ、沈殿物を７０％エタノールによって２回洗浄し、その後 ２０μｌの水に溶解させた。

これと平行して、遊離のＥｃｏＲＩ末端を有する線状リンカ−（約０．１Ａ２ｇ 。

ユニットのリンカ−であって１μｇの線状ベクターにつき３０から４０のヌクレ オチド長を有する）の５０から８０倍モル過剰量に対応する量の線状ベクターｐ ＵＣ１９を１５μｌの反応体積中で、２ｍＭのＡＴＰの存在下、キナーゼ条件下 で３７℃ＰＮＫにてリン酸化した。２０分後に応を完全に停めるために、７０° Ｃで１５分間加熱し、その後混合物を氷上て冷却して等モル量のリンカ−ＬＩＯ を添加した。ｄｓクリンカ対Ｌ９＊／ＬＩＯをアニーリングにより調製した。こ うして得たリンカ一対Ｌ９＊／ＬＩＯへ、１８μ！のＥｃｏＲＩで開裂させたｐ ｕＣ１９−ＤＮＡを添加し、ＤＮＡのライゲートを行うため反応体積が１００μ ｍとなるよう１０倍濃度のＴ４−ＤＮＡリガーゼバッファーとＨ２０にて条件設 定をした。５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼの添加の後、インキュベーション を一晩１５℃で行った。リンカ−で修飾したベクターは酢酸アンモニウムの存在 下でエタノールによって沈殿させ、沈殿物を７０％エタノールにて２回洗浄し、 乾燥しこのちは５０μ！のＨバッファーへ吸収させた。１５ユニツトのＢａｍＨ Ｉ（イーリンガー）の添加の後、インキ、ベーンヨンを２時間３７℃にて行った 。

反応混合物を１％アガロースゲルにて分離し、ベクターフラグメントをヨウ化カ リウムゲル溶液で５μｌのガラスミルクによって単離した。

およそ５０ｎｇのＬ９／Ｉ−１０−Ｂ　ａｍＨＩにフランキングなｐＵｃ１９ベ クターを０５ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼと共に最終容量を２０μｍとして リガーゼ条件下で２時間１５℃でインキュベートし、その後イー・コリＴＧＩの コンピテント細胞内へ標準的な方法により形質転換した。形質転換の後、これら を１ｍｌの寒天につき８０ｍｇのアンピシリン、Ｘ−Ｇａ１およびＩＰＴＧ４添 加した栄養寒天プレート（セルバ）（Ｘ−Ｇａｌ−Ａｍｐ−ＮＡ）上に撒いた。

６個の白色コロニーよりプラスミドＤＮＡをミニ−ブレバレージョン法にて単離 し、唯一の５ｆｕｌ部位（イーリンガー）を有するか否かの試験を、この制限酵 素により開裂させることにより行い、リンカ−が正しく挿入されているがどうか をプラスミドの配列決定によって確認した。中間体プラスミドの単離のために、 ポジティブクローンのうちのひとつを選択し、ｐＵｃ１９ｓａｋｏと命名した。

実施例として既述の方法により、およそ１０μｇのｐＵｃ１９ｓａｋｏを１００ μｌのＨ−バッファー中で３０ユニツトの５ｆｕｌにて線状化し、反応混合物を フェノールで抽出し、開環させたベクタープラスミドをエタノールにより沈澱さ せ、沈澱物を７０％エタノールにより洗浄した後３０μｍのＨ，Ｏに溶解させた 。同時に、０．４Ａ２１１゜ユニットのオリゴヌクレオチドＬｌｌを４μｇのＰ ＮＫを添加してリン酸化し、ＰＮＫのインキュベーションの後、等モル量のリン カ−Ｌ１２とアニーリング反応によって相補的に結合させ、ｄｓクリンカ対を得 た。

１２μＩの５ｆｕｌで開裂させたベクタープラスミドをここへ添加し、１００μ ｍのライゲー７ヨンバッファ一をセットし、５ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼ と共に４時間１６℃にてインキュベートした。エタノール沈澱、洗浄の後、プラ スミドを８０μｌのＭ−バッファー（イーリンガー）に溶解させ、２０ユニツト の５ｐｈｌ（イーリンガー）にて３７℃でｐＵｃ１９レプリコンのポリクローニ ング配列（ＰＣ３）において開裂させた。Ｌｌｌ／Ｌ１２で修飾した５ｐｈＩ末 端を有するプラスミドのフラグメントを１％アガロースゲルを用いた電気泳動に より精製し、その後フラグメントを単離した。

既述の方法により、第二のリンカ一対、すなわちＬ１３／Ｌ１４＊を、７０μｍ の反応体積となるよう約６００ｎｇの精製フラグメントに付着させ、４ユニツト の７４−ＤＮＡリガーゼによって一晩処理した。あらかじめ約０．０５Ａ２８゜ ユニットのＬ１４を１５μｍのキナーゼバッファー内でリン酸化し、その後等モ ル量のＬ１３と５°末端におけるＰＮＫによるアニーリングを行った。Ｔ４−Ｄ ＮＡリガーゼを１５分間このライゲーション混合物を６５℃に加熱することによ り不活性化した。２サイドリンカ−付着の後に存在する、遊離の５’−〇Ｈ末端 番（Ｌ１２−およびＬ１３鎖の末端）をリン酸化するため、温度を調節したライ ゲーション混合物を３ｍＭのＡＴＰ溶液とし、２ユニツトのＰＮＫと共に２５分 間３７℃にてインキュベートした。プラスミドフラグメントは５’−Ｌ１２／Ｌ １３＊−フランキングとなっており、これを過剰のリンカ−よりＡＧＨによって 既述のごとく分離し、精製した。

３０ｎｇ［度のこうして得たベクターＤＮＡをＬ１２−およびＬ１３−の相補的 な６つのヌクレオチド端により、１ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼを用いての 、最終的な遺伝子工学の構築操作で一晩環化させた。ライゲーション混合物をイ ー・コリＴＧＩのコンピテント細胞に形質転換し、１／３のライゲーション混合 物をＡｍｐ−ＮＡプレートに撒いた。プラスミドの小片を１２クローンより調製 し、これらが制限酵素Ｎａｅｌ（イーリンガー）により切断される唯一の部位を 有するか否かを試験した。ＮａｅｌポジティブクローンのうちのひとつをＤＮＡ 配列解析の後、所望のリンカ−挿入を有するベースプラスミドのドナーとして選 択した。

このプラスミドにｐＵｃ１９Ａ１　（第一ベースプラスミド）と名付け、以下の 構築操作に用いた。

すてにｐＵｃ１９ｓａｋｏの製造において詳しく述べた方法により、Ｌ１４＊／ Ｌ１５にフランキングなｐＵｃ１９ベクターフラグメントを、リンカ一対Ｌ１４ 　＊／Ｌ　１５を、線状化したベクターｐＵｃ１９のＰｓｔｌ末端（Ｐｓｔｌ、 べ−リンガ−）付着させ、続いてＰＣ８内で５ａｌｌで開裂させて作成した。ま ず第一に天然のマチュアーな５ＡＫ４２Ｄの５位から１２４位のアミノ酸の領域 をコードする遺伝子配列を得るため、適当な量の、所望の遺伝子配列を有する１ ゜２ｋｂ大の５ａｌｌ／ＰｓｔｌフラグメントをプラスミドｐＭＥＴ５から単離 した。その後、２５０μＩのＨ−ノリファーに溶解させた、約５０μｇのｐＭＥ Ｔ５を最初に２００ユニットの５ａｌｌで消化し、完全に開裂した後に同活性の Ｐｓｌｌで再消化した。５ａｉｌ／Ｐｓｔｌフラグメントを１．２％アガロース ゲルより単離した。５ＡＫ４２Ｄをコードしない３゛側のＤＮＡ領域を分離する ため、約２μｇのこのフラグメントを実施例に述べた１５０μｍのＭ−バッファ ー条件下の１５ユニツトのＡｖａ　ｌ５Ａｖａ　Ｉ　１と共にインキュベートし 、およびＨｉｎｆｌ消化に供した（制限酵素は全てイーリンガー）。作成された ３６１ｂｐ大のＳａｌ　Ｉ／Ｈｉｎｆ−ｓａｋ４２Ｄ遺伝子フラグメントは非常 に小さな開裂フラグメントであり、１．８％アガロースゲル電気泳動の後に適当 な方法で単離される。

５０ｎｇ程度の得られた５ａｌｔ／Ｈｉｎｆｌフラグメントを３０ｎｇの上述の 修飾したｐＵｃ１９ベクター内へ挿入し、イー・コリＴＧＩ内へクローン化した 。選択されたクローンにおける５ｔｙ１制限開裂部位の存在のスクリーニング（ Ｓｔｙｌ、イーリンガー）およびＤＮＡ配列分析により所望の挿入配列がプラス ミド片に導入されていることを確認した。こうして解析したクローンのひとつを 選択し、プラスミドｐＵｃ１９ｓａｋＡ１と名付けてプラスミド源として用いた 。

同じ遺伝子工学操作を適用して、リンカ一対Ｌ１６＊／Ｌ１７をＥｃｏＲＩで開 裂させたプラスミドｐＵｃ１９ｓａｋＡ１の末端に付加させた。フェノール抽出 およびエタノール沈澱の後、約３μｇのリンカ−置換プラスミドフラグメントを ８０μＩのＢ−バッファー内で１５ユニツトのＨ４ｎｄｌｌｌで消化させ、開裂 混合物を１．６％ＡＧ内で電気泳動して分離させた。Ｌ１６／Ｌ１７−Ｈ４ｎｄ ｌｌｌの両方とフランキングであるＤＮＡフラグメントを、以下の方法において ベクタープラスミドとして用いた、Σａｋ遺伝子含有４１４ｂｐ大の断片をゲル より単離した。

２５０ｎｇ程度の最後に述べたサブフラグメントを再び５０μｍのＮＥ２バッフ ァー内で１０ユニツトのＭｎ　！　Ｉ　（ＮＥＢ）で再消化させ、２９０ｂｐ大 のＭｎ　］　Ｉ／Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメントを反応混合物を１．８％Ａ Ｇによる電気泳動にかけた後に単離した。２５ｎｇ程度のこうして得られた５Ａ Ｋ４２Ｄの４６位アミノ酸より先のアミノ酸領域をコードするＤＮＡフラグメン トを最終的にイ−・コリＴＧＩ内に、３０ｎｇの上記単離したベクターフラグメ ントを用いて標準的な方法によりクローン化した。

プラスミド標本のいくつかを、各条件における５ａｉｌとＨｉｎｄｌｌｌ、およ び５ａｃｌ＋（イーリンガー）とＨｉｎｄｌｌｌの両方の２段階消化の後に必要 なりＮＡ領領域存在するか否かを試験した。ＤＮＡ配列の分析の後、ポジティブ クローンのうちのひとつを第２のベースプラスミドの単離のために選択し、ｐＵ Ｃ１９ｓａｋＡ２と命名した。

実施例７ ＳＡＫＭ２６ＸをコードするドナープラスミドｐＵｃ１９ｓａｋＭ２６Ｘの作製 自動オリゴヌクレオチド合成機により、それぞれ１２個の配列バリアントの混合 物であるアダプター混合物ＡＧＩ、ＡＧ２、ＡＧ３およびＡＧ４を３または４の 異なったヌクレオチド構築ブロックを、マチュアーな５ＡＫ４２Ｄの２６位のコ ドンの最初の２箇所に同時に導入して調製した。先に述べた方法によって、第１ 段ではアダプター混合物ＡＧ２および他の混合物、アダプター混合物ＡＧ４をリ ン酸化した。リン酸化されたリンカ−混合物をアニーリングによって適当な相補 的アダプター混合物ＡＧＩまたはＡＧ３と結合させ、二本鎖ＤＮＡフラグメント を調製した。こうして得たアダプタ一対の混合物を、別個の反応として５ａｌｌ 制限酵素で開裂させ、そのｔ＆Ｈｉｎｄｌｌ＋で消化したベースプラスミドｐＵ Ｃ１９ｓａｋＡ２の５ａｉｌ末端にカップリングさせた後、適当な反応混合物を ゲル電気泳動分離によって得、ＡＧＩ／ＡＧ２と同定されるフラグメントが一方 の場合に、およびＡＧ３／ＡＧ４フラグメントと同定されるフラグメントがもう 一方の場合に得られた。これらの混合物はいずれもＨｉｎｄｌｌｌ−およびプラ ントすなわちＮａｅｌ−結合性末端で制限されている。

それぞれ１５０ｎｇのフラグメント混合物を１００ｎｇ１００ｎ／＋（ｉｎｄｌ ■１で線状化した第１のベースプラスミドｐＵｃ１９ｓａｋＡ１と再結合させ、 イーコリＴＧＩ内にクローン化した。両方のフリーズのクローンからいくつかの プラスミド標本をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｌｌｌ制限酵素で二重消化して４３６ｂ ｐ大のＤＮＡ挿入部位を有するプラスミドを予備選択した。プライマーＳ２６を 用いたＤＮＡ配列解析の強力なプログラムにおいて、以下のコドンをマチュアー なｓａｋＭ２６Ｘ遺伝子の２６位として有するプラスミドが最終的にＡＧＩ／Ａ ６２ノリーズより得られｔ二 ＡＴＡ（Ｔｉｅ）、ＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＧＴＡ（Ｖａｌ）、ＡＣＡ（Ｔｈｒ）、 ＡＡＡ　（Ｌｙｓ）およびＣＴＡ　（Ｌｅｕ）。

ＡＧ３／ＡＧＪシリーズより出発した場合、同様に下のコドンをｓａｋＭ２６Ｎ 遺伝子の２６位として有するプラスミドが得られた：ＴＧＣ（Ｃｙｓ）、　ＧＣ Ｃ（Ａｌａ）、ＣＡＣ（Ｈｉｓ）、ＧＧＣ（Ｇｌｙ）、ｐＭＥＸ６ｓａｋＭ２６ Ｘファミリーの発現プラスミドの調製的２０μｇのベクターｐＭＥＸ６を１００ ユニツトのＥｃｏＲＩにて完全に線状となるまで開裂させ、さらに同じ条件下で １００ユニツトのＰｓｔｌにて再消化させた。こうして得られたベクターをＰｃ ｓのフラグメントより１％ＡＣの電気泳動により分離した。異なったｓａｋ遺伝 子のバリアントをコードする１１個のドナープラスミドより、４３３ｂｐ大のＥ ｃｏＲＩ／Ｐｓｔｌフラグメントであってさらにトランスレーノヨンノグナル（ ＲＢＳおよびΔＴＧ開始コドン）を５゛末端に有するものを、説明したようにゲ ル電気泳動によって、１．６％のＡＧより単離した。

約５０ｎｇのこれらの発現適合Σａｋ遺伝子フラグメントを、約２ＱｎｇのＥｃ ｏＲＩ／Ｐｓｔｌで線状化したｐＭＥＸ６ベクターの別個の混合物においてライ ゲートさせ、イー・コリＴＧＩ内にクローン化した。問題となっている各発現プ ラスミドを含有するイー・コリＴＧＩ株の培養液１０ｍ１から、相当するプラス ミドをミニプレツブ法（ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｍｅｔｈｏｄ）により単離し、Ｅｃ ｏＲＩとＰｓｔｌによる制限分析および両方の鎖の配列分析により調べた。各場 合において所望のｓａｋ遺伝子記列を有するプラスミドをｐＭＥＸ６ｓａｋＭ２ ６Ｘ型プラス本発明の５ＡＫ４２ＤおよびＳＡＫポリペプチドの発現の定性的分 析本発明のＳＡＫポリペプチドの、プラスミドｐＭＥＸ６０２ｓａｋ、ｐＭＥＸ ６△Ｎ１０ｓａｋ、ｐＭＥＸ６△Ｎ１４ｓａｋおよびｐＭＥＸ６ｓａｋＭ２６Ｘ て形質転換したイー・コリＴＧＩ株内における発現を分析するため、２倍濃縮ト リプトンイースト抽出培地にさらに５０μｇ／ｍｌのアンビンリンを加えた培地 （２ｘ　Ｔ　’１’　ａ　ｍ　ｐ培地）に１０（ｂｌｌの、適当なりコンビナン ドイー・コリＴＧ１産生株の単一コロニーより調製し、−晩培養した物を接種し た。３時間、３７℃で振盪培養を行い、その後滅菌した１ＴＰＧ溶液（４０ｍｇ ／ｍＩイソプロパツール）を最終濃度が０．２ｍＭとなるように添加して発現の 誘導をした。発酵を４時間続け、１ｍｌの培養培地より細胞を遠心分離にて集め た。細胞のベレットを４００μｌの４０ｍＭリン酸ハソフｙ−（ｐＨ７，０）に 懸濁させ、１００μｍの５倍濃縮細胞分解溶液（２０％ＳＤＳ溶液／メルカプト エタノール／グリセロール１００２％ブロモフェノールブルー溶液、６：１・１ ：０．１；ｖ／ｖと反応させ、５分間沸騰水槽中で分解させた。得られた溶菌物 の各アリコート（２〜６μｌ）を、発現タンパク質を含むバンドを明らかにする ためのクーマツノー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌ ｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）Ｇ　２５０にて着色した後、標準的な方法により１ｍｍ厚 の１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって分析した（図１３ａ）。

実施例１０ 介！ユリ旦１哩剰１μ丼旦す■り込投す５ぴ王Δ晴全ての株は基本的には以下の 方法によって発酵させた。

株の発酵は３７６で５００ｍ１の丸底フラスコ内に２００ｍ１の培地を投入した ものの中で、強く振盪させながら、さらに曝気することなく行った。培養のため 、５ｍｌの２ｘＴＹａｍｐ培地に対応する株の単一コロニーを接種し、約１６時 間３７°Ｃて振盪しながら前培養を行った。各２ｍｌのこの前培養物を、同じ培 地２００ｍ１に接種した。培養は振盪しながら３７℃にて、Ａ、。。の光学密度 が１４から０．９となるまで行った。この細胞密度を達成した後、発現プラスミ ドヘコードされるスタフィロキナーゼ遺伝子の発現を４００μｌの滅菌Ｉ　ＰＴ Ｇ溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）を添加して誘導した。その後、培養物をさらに２がら ６時間、３７°Ｃにて振盪し、４℃４０００ｒｐｍの遠心分離により細胞を収穫 した。

細胞のペレットを１／２ｏがら１／４ｏ倍量（培養体積に対して）の破壊バッフ ァ（４０ｍＭのリン酸バッフ７−（ｐＨ６，５）　、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ　βメルカプトエタノール ）に懸濁し、最終濃度が１ｍＭのフェニルメチルスルボニルフルオライドと反応 させた。懸濁物は０°Ｃまで冷却し、この温度で１ｏ分間超音／１Ｍ（出力１０ ０がら１２０ワツト）にて破壊した。

破壊物は処理まで一２０Ｃにて保存した。精製の最初に最高３０ｍ１の破壌物の 懸濁液をウォーター・バスに浸け（３０℃）、その後６０分間４℃、２５００Ｏ ｒｐｍの条件で遠心分離を行った。上消液をＨ２Ｏにて４倍量に希釈し、１０ｍ Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ６，５）で平衡とし、Ｓ−セファロースを含有する 高速流クロマトグラフィーカラム（ファルマノア、フライブルグ）上に注入した 。ゲルヘットは直径２．６ｃｍで高さ３０ｃｍである。デポジノヨンの間は流速 が２ｍ１／分を越えないようにした。その後、平衡バッファーによって（流速３ から４ｍ１／分）、Ｕｖ検出装置のベースライン（２８０ｎｍ）となるまて洗浄 しこ。カラムに結合せずに通過した物質には目的とするポリペプチドが痕跡量の みしか含まれておらず、これは捨てた。カラムの溶出（流速３がら４分）は、２ ５０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのリン酸バッファー　（ｐＨ６，５）に て行った。溶出プロファイルはいくつかのピークを示し、そのうちのひとつに当 該ＳＡＫポリペプチドが濃縮された状態で含有されていた（検出は５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにて行った）。対応するピークのフラクションをひとつにし、その後固体Ｎ ａｃＩを添加して最終濃度２．０ＭのＮａＣ１溶液とした。この方法によって、 収集されたフラクションを、直接フェニルセファロースのクロマトグラフィーに かける。この操作のため、パッケージされた市販のハイロード・フェニル・セフ ァロース１（ＰＸＫ　２６／１０カラム（ファルマノア）を、２．０ＭのＮａＣ ｌを含有する１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６，５）で平衡として用いた。被 検物を注入したｉ＆（流速５．０ｍｌ／分）、ＵＶ検出装置のベースラインに達 するまで平衡バッファーにて洗浄した（流速１２．６ｍｌ／分）。ＳＡＫ変種は その後ＮａＣｌを減少させるグラジェント（流速１２．６ｍｌ／分）にて溶出さ せた：グラジエント １００％バッファーＡ　−→　２５％バッファーＡＯ％バッファーＢ−−７５％ バッファーＢバッフｙ　Ａ：１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６，５；２．ＯＭ 　ＮａＣｌバッファーＢ・１０ｍＭリン酸パンファー、ｐＨ６，５この規填にお いて全グラノエント体積は３００ｍ１である。純粋なＳＡＫポリペプチド（純度 の標準は５ＤＳ−ＰＡＧＥと等電点による）が２つの精製操作のみによって得ら れた。精製操作の効果を図１４に示したが、これによれば粗細胞抽出液より得た 典型的濃度の標的ペプチドＳＡＫＭ２６Ｌが、電気泳動により均一であることが ＳＤＳゲルによりわかる。

実施例１１ 本発明のＳＡＫポリペプチドの特異的活性の測定各ＳＡＫ変種の特異的活性を、 １ｇモルのこのＳＡＫポリペプチドによりプラスミノーゲン（過剰量を用いた） から１分間につき遊離されるプラスミンの量（μモル）により測定した。

適当なＳＡＫポリペプチド含有含有液溶液ンパク質含量をバイオ−ラッドプロテ ィン・アッセイ（バイオ−ラッド、ムニック）によりラン血清アルブミンを標準 タンパク質として用いて測定した。

ＳＡＫポリペプチドによるプラスミン遊離量の測定は以下の２段階にて行った− 　まず第一に、各ＳＡＫポリペプチドを（ｌｎｇから５００ｎｇ含有するように ）１００ｍＭｔ−リス（ｐＨ８，０）により連続的に希釈した。２０ｍｇのプラ スミノーゲン（フル力）を１ｍｌのＨ２Ｏに溶解して得たプラスミノーゲン溶液 ３０μｍ、１５０μｌの１００ｍＭ１−リスバッフｙ　（ｐＨ８，０）および１ ０μｍの活性剤溶液（ＳＡＫポリペプチドの一連の希釈物）からなる反応混合物 を調製した。この混合物を１０分間２５℃にてインキュベートした（活性化サン プル）。

−プラスミンの基質であるクロモザイム（Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ）−Ｐ　Ｌ（イー リンガー）の２ｍＭ水溶液を調製した。４００／１７１の１００ｍＭトリス（ｐ Ｈ８，０）および５０μｍの上記活性化サンプルをこの溶液５０μｍに添加した 。混合物を２分間２５℃にてインキュベートした。これと平行して、プラスミン の検量線を、４００μｌの１００ｍＭ）リスバッファー（ｐＨ６，５）にて一連 の希釈したプラスミン溶液各５０μｍを、上記のクロモザイムＰＬ溶液５０μｌ と共に同じ条件下でインキュベーション後に、反応停止したものによって得た。

リファレンスサンプル（ゼロ値のサンプル）には、２５μｌの濃縮酢酸を活性化 サンプルと共に添加してプラスミン基質の転化を抑制したものを用いた。リファ レンスサンプル、検量線サンプルおよび実際に測定するサンプル（各２５０μｌ ）は９６穴マイクロタイタープレート（平底）にピペットで移し、４０５ｎｍの 吸収をマルチチャンネル・フォトメーターにて測定した。

出発溶液（希釈用サンプル）に含有されているＳＡＫポリペプチドにより１分あ たり遊離されるプラスミンの量は、プラスミンの検量線およびリファレンスサン プルの吸光度を用いて測定サンプルの吸光度から計算し得る。

タンパク質濃度およびプラスミンの遊離から、ＳＡＫポリペプチドの特異的活性 が得られ、比較し得る。各記載したスタフィロキナーゼ変種のこの方法において 得られた特異的活性を表２にまとめた。

表２ ＳＡＫ種類　特異活性 ＳＡＫ△ＮＩＯ２２，７２，２１ｘｌＯ−ＳＡＫ△１４　８．１　４．４０Ｘ１ ０−＠ＳＡＫＭ２６Ｌ　３６．６　ｎ、ｔ ＳＡＫＭ２６Ｃ２１，１ｎ、ｔ。

実施例１２ スタフィロキナーゼプラスミノーゲン複合体の解離定数の分析アフィニティーク ロマトグラフィーを用いた測定 この方法の原理は、ヒトプラスミノーゲンを適当な担体上に固定化したものをク ロマトグラフィー用カラムに導入し、これがＳＡＫポリペプチドを一定量力ラム へ注入したものと相互作用をするということである。以下の関係が溶出量■εお よびサンプル中の有効５ＡＫａ度［ＳＡＫ］の間に成立する：１／　（Ｖ、−Ｖ ｎ）　＝ＫＤ／Ｍ、、＋　［ＳＡＫコ　７Ｍ、１゜各略号は以下の通っである・ ■ゎ−カラムのデッドボリューム ＼’、−５ＡＫポリペプチドの溶出量 ＭＰ、−バックされたカラム内での固定されたプラスミノーゲンが相互作用して いる量 ［ＳＡＫ］−アプライしたサンプルのうちの有効なＳＡＫポリペプチド濃度Ｋｎ −５ＡＫ変種とプラスミノーゲンの一時的複合体の解離定数。

カラムのデッドボリュームとＳＡＫ変種の溶出ボリュームとの差の逆数に対し、 サンプル中のＳＡＫポリペプチドの濃度は特定の濃度範囲においては直線をなす 。

Ｍｐｙはこの直線の傾きからめられ、知りたい解離定数は［ＳＡＫ］　＝Ｏへ外 挿することによって得られる。

実験上の問題は以下のように解決した、まず第１に、ヒト血漿よりデュークとメ ルフのインストラクション（Ｄ、　Ｇ、Ｄｅｕｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｅ、　Ｔ、　 ＭＥＲＴＺＸサイエンス、１７０（１９７０）、１０９５〜１０９６）に従って 単離されたプラスミノーゲンを、ウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ　Ｃｏｍｐａｎ ｙ）のインストラクションを用いてプロティン−パックＴＭ（Ｐｒｏｔｅｉｎ− Ｐａｋ’”）エポキ／−アクチイーテッド（ウォーターズ）と結合させる。

１ｍｇのカラムマトリックスに対して５ｍｇのタンパク質となるようチャージ量 を決めた。冷却ジャケットを嵌合し、ＦＰＬＣクロマトグラフィーンイーム（フ ァルマシア）に接続したＨＲ５１５クロマトグラフィーカラム（ファルマシア） へ、こうしてチャージしたアフィニティーゲルを充填した。全ての既述の試験は １６℃で流速Ｑ、５ｍｌ／分にて、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ値７．３） を用いて行った。

カラムのコンディショニングの後、各ＳＡＫサンプルを２５μｍカラム上に注入 する。この体積におけるタンパク質含量は０．５ｇから８μｇの範囲内である。

システム中にあるＦＰＬＣコントローラーを最大溶出ボリューム（ＶＦ）を正確 に決定するのに用いた。

既述の方法を用いて、プラスミノーゲンと選択したＳＡＫポリペプチドとの相互 作用に対する解離定数を得、これを表２に示した。

メスのバルブ／ンー／ハン（Ｂａ　Ｉ　ｂ／ｃ／Ｈａｎ）マウス（６〜８週齢） を上述の方法によりリコンビナントなイー・コリＴＧＩ　（ｐＭＥＸ６０２ｓａ ｋ）産生株より得た高純度、マチュアー５ＡＫ４２Ｄによって免疫した。免疫ス ケジュールは以下の通りである。

・各動物に最初の免疫用量として５０μｇの純粋５ＡＫ４２Ｄをフロイントの完 全アジュバントと共に皮下注射した。

・この４週間後、第２の用量として各動物につき５０μｇの純粋５ＡＫ４２Ｄを フロイントの不完全アジュバントと共に注射した。

・３週間後、最終用量としてもう一度５０μｇの純粋５ＡＫ４２Ｄをアジュバン トなしで各動物に静脈注射した。

（市販のディフコ製フロイントの完全および不完全アジュバントを用いた）。

５ＡＫ４２Ｄの規定用量を静脈内に投与した３日後、免疫した動物を殺し、主に リンホサイトを含む細胞懸濁液を公知の方法により肺臓より調製した（ＨＡＴＡ 地・セルバ社によってその組成が提供されている）。ミエローマセルラインＰ３ −Ｘ−６３Ａｇ８−６５３との融合操作を標準的な方法にて行った。詳しくは１ ０’個のミエローマ細胞を５Ｘ１０’個の肺臓細胞と共に５０ｍ１のＨＡＴ培地 中で共に培養した。

融合細胞を非融合ミエローマ細胞から分離するため、上述の細胞懸濁液を細胞培 養プレート（９６穴、ヌンク（Ｎｕｎｃ）社）の各穴に２００μｌずっ分配した （各穴あたり１から２細胞）。これを、３７℃、給湿、５％Ｃ０２インキユベー ター内で３週間インキュベーションした。続いてシングルクローン−培養（期間 ２週間、他の条件は上記と同じ）をＨＴ培地（組成は同様にセルバ社より提供さ れている）内で行った。すべてのシングルクローン培養物をさらに１５％５％ラ ン血清（フロラ）を含有するＲＰＭＩ標準培地（セルバ）内で培養した。この操 作段階において、各ハイブリドーマ細胞のコロニーがＳＡＫＡ異的抗体を産生ず るか否かの試験を固相ＥＬＩ　ＳＡ法を用いて１テった。５ＡＫ４２Ｄをその穴 の底表面に結合させた（５μｇ／穴：　ＰＢＳバッファー）マイクロテストプレ ートをこのアッセイに用いた。こうして前処理した穴のブロッキングを、０．０ ５％ツイン２０　（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含有する、セラチン含有（０５％ゼラ チン）ＰＢＳバッファーにて行った。被検ハイブリドーマ培養上清液を各穴へ投 入した。培養土清液に含有される抗ＳＡＫ抗体の結合は、パーオキシダーゼで標 識したヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（メダソク）によって確認される。

この方法で、１１個のハイブリドーマクローンが抗ＳＡＫ抗体の生合成を行うも のであると同定し得た。この細胞クローンを凍結保存した。

アルファＳＡＫ　ＩＧ８／Ｈ６およびアルファＳＡＫ　ＴｌＡ４／ＡＩＯと名付 けた２つのハイブリドーマラインを１５％ＦＣ８（供給元は上記）添加ＲＰＭ１ 培地内て、再クローニングプロセス（期間１４日間、３７℃：インキュベーター は吸湿５％Ｃｏ２）に供した。その後、２つのクローンそれぞれから（ＲＰＭＩ 培地中で続けて培養して）累積的に大量の培養上清（約２１）が得られ、それぞ れの場合において、こわらから抗ＳＡＫ抗体ＩＧ８／Ｈ６およびｌｌＡ４／Ａ１ ０を、固定化した５ＡＫ４２Ｄを用いたアフィニティークロマトグラフィーによ って純粋物として得られる。この最終段階においては、リコンビナント５ＡＫ４ ２ＤをＣＮＢｒ−セファロース−４Ｂ（ファルマシア）と結合させた（１０ｍｇ タンパク’Ｉｔ／ｍｌセファロース）。相当するノゾブリドーマ培養上清液をさ らにＮａＣｌ　（最終濃度０５Ｍ）およびツイン２０（最終濃度０．０５％；セ ルバ）と反応させ、その後上記固定化５ＡＫ４２Ｄを有するカラムのクロマトグ ラフィーにかけた。カラムの洗浄は０．５ＭＮａＣｌを添加したＰＢＳバッファ ーにて行った。結合した抗ＳＡＫ抗体の溶出は、０．５ＭＮａＣ１：　０．２Ｍ グリシン：ｐＨ２，８の溶液にて行った。タンパク質含有溶出フラクションは即 座にＮａＯＨにて中和した。

精製した抗体は、以下の目的にそのまま用い得る（実施例１４から１８）。

５ＡＫ４２Ｄ含有タンパク質サンプル（例えば粗溶間物）をＳＤＳポリアクリル アミドゲルによる電気泳動によって分離し、その後ニトロセルロース上へ公知の 方法にてトランスファーした。ポンンユーエス（Ｐｏｎｃｅａｕ−３）　（セル バ）によるタンパク質の一時的着色により、ニトロセルロース膜上のタンパク質 の位置を可視化させ、特定の分子量マーカーへ帰し、適当な位置に標識した。ニ トロセルロースプロットをその後、５％のスキムミルクパウダーを含有する洗浄 バッファー（０５Ｍ　ＮａＣ１，ＰＨ１，０，０５％ツイン２０．セルバ）にて ブロックした（約２時間、室温）。

次の操作においては、洗浄液（１％スキムミルクパウダー含有）にて１０００倍 に希釈した抗体１１Ａ４／ＡＩＯによる処理を行った。ニトロ七ロロースプロッ トをその後、ヤキー抗マウスイムノグロブリン抗体ＰＯＤ複合体（メダック）（ １％スキムミルク含有洗浄液にて１０００倍に希釈）で処理した。ウェスタンプ ロットの「現像」はジアミノベンズヨウ素を過酸化水素の存在下にて処理して行 った。

５ＡＫ４２Ｄバンドおよび他のＳＡＫＡリペプチドのバンドのみがニトロセルロ ース膜上に着色される（図１３ｂ）。この方法は天然の５ＡＫ４２Ｄの同定およ びスタフィロキナーゼポリペプチドを含有するエピトープの解析に用いることが スタフィロキナーゼの定量的測定のためのＥＬＩ　ＳＡ試試験系マイクロタイト レージョンプレート最初に、アフィニティークロマトグラフィーにて精製したポ リクローナルなブタ抗ＳＡＫ抗体にて被覆した（２μｇ／穴）。

上述の抗体は、まずはじめにブタをそれぞれ５００μｇの５ＡＫ４２Ｄにて３回 免疫して得た。超免疫化血清を得、これを固定化５ＡＫ４２Ｄ（実施例１３と同 様の方法にて得た）により精製した。被覆操作は１５時間、４℃または２時間、 ３７℃にて行った。その後実施例１３に記載のごとく、ゼラチン含有ＰＢＳノく ツフア−にてこのプラス千ツク表面をブロックすべく処理した。

純粋な５ＡＫ４２Ｄをセラチン含有ＰＢＳバッファーにて希釈した一連の標準希 釈サンプルを作成した。同様に、被検サンプルも希釈した。標準希釈サンプルお よび被検サンプルを各穴へ投入し、６０分間３７℃でインキュベートした。洗浄 操作の後、１０００倍に希釈したパーオキシダーゼ複合抗−３ＡＫ抗体ＩＧ８、 、／）（６（希釈培地はセラチン含有ＰＢＳバッファーである）をプレートの穴 内へ添加した。試験の定量的評価は波長４９２ｎｍの色度測定により基質Ｈ，０ ２およびオルソフェニレンジアミンを用いて行った。得られた検量線は３００　 ｐ　ｇ／ｍｌから７．５μｇ／ｍｌの５ＡＫＪ度範囲において、直線状であった （図１５参照）。

本試験のごとく細菌の破壊物内、ＳＡＫＡ製に伴う分析およびヒト血清中におけ るＳＡＫの定ｌ的測定が可能である。

実施例１６ モノクローナル抗体ＩＧ８／Ｈ６のＳＡＫＡリペプチドの免疫沈降への応用免疫 沈降方法は、溶菌物中のインビボおよびインビトロで合成された放射性標識をし たＳＡＫＡリペプチドの存在確認に用いられる。

被検細胞溶菌物をＳＤＳ溶液と混合しく最終５ＤＳ１１度１％）、ボイルした後 １０倍にＳＤＳトリスバッファ　（０，９％ＮａＣ］、１％トリトンＸ−１００ ，０５％デスオキシコレートナトリウム、０．１ＭトリスＨＣｌ　；　ｐＨ８， ２）で希釈した。１μｌの抗体ＩＧ８／Ｈ６（アンモニウムスルフェート沈殿物 ［５０％飽和］墾濁液）をこの混合物に添加し、−晩４℃でインキュベートした 。抗原−抗体複合体を沈降させるために、あらかじめ１００μｍの５ＴＤＩ−リ スバッファーで膨潤させた１０ｍｇのプロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ　 （ファルマンア）を添加して６０分間室温で振盪した。混合物をその後遠心分離 し、上清液をの除き、ペレットを３回、それぞれ５７００μｍのＳＴＤトリスバ ッファーにて洗浄した。洗浄の後、ペレットを４０μＩ　５ＤＳ−ＰＡＧＥＡン プルバッファーに吸収させ、ホイルしたｌ＆ｓＤｓポリアクリルアミドゲルへの せた。評価はオートラジオグラフィーにて行った。免疫沈降混合物の結果を図１ ６に示した。

２つのハイブリドーマクローンの希釈していない培養上清液（各２５μｍ）をそ れぞれリン酸バッファー　（１０ｍＭ、ｐＨ６，５）で希釈した５ＡＫ４２Ｄサ ンプル（濃度。タンパク質２０ｎｇ／２５μ１）２５μｌと混合した。コントロ ールとしては、５ＡＫ４２Ｄの代わりに上述のリン酸バッファーまたはストレプ トキナーゼ（カビキナーゼ（Ｋａｂｉｋｊｎａｓｅ）、カビビトラム（Ｋａｂｉ ｖｉｔｒｕｍ））をリン酸バッファーで希釈したものを添加して用いた（コント ロール処方）。これらの処方を３０分間室温でインキュベートした。各１０μｍ を被検およびコントロール処方より分取して、本発明のＳＡＫＡリペプチド、好 ましくは５ＡＫ４２Ｄに誘導されるプラスミンの遊離を測定するための他の試験 処方（この試験は９６穴マイクロテストプレートにて行った）へ添加した。最後 の試験は上述の１０μｍアリコートを３０μｌのプラスミノーゲン溶液（プラス ミノーゲン（ベージング）を２０ｍｇ／ｍｌの濃度に水で希釈したもの）および １５０μｍのトリスノく・ソファ−（１００ｍＭｌ−リス、ｐＨ８，０）と混合 し、１０分間２５℃でインキュベートして行った。

各５０μｍを分取して、４００μｍトリスバ・ソファ−（１００ｍＭトリス、ｐ Ｈ８，０）および５００μｍのプラスミン基質であるクロモザイムーＰＬ（べ− リンガー；２ｍＭ水溶液）からなる処方へ添加し、２分間２５℃でインキュベー トした。反応はそれぞれ２５μｌの濃縮酢酸を添加して停止させた。波長４０５ ｎｍの吸光度を測定した、これは５ＡＫ４２Ｄにより誘導されるプラスミン遊離 量と正比例する。

モノクローナル抗体ＩＧ８／Ｈ６およびＩＩＡ／ＡＩＯの場合にはこの効果力（ 明らかに認められた。与えられた試験条件の下で、抗体ＩＧ８／Ｈ６およびＩＩ Ａ／Ａ１０はプラスミンの遊離をそれぞれ１８．８および１７，５倍抑制した。

実施例１８ μｍ５佳たゴ座睡ニヒぞ区ゴヱ對ｌΣ「ゴ叫ｙ哩≦猛ツクローナル抗体ＩＧ８／ Ｈ６の応用 本操作は２つの別個の方法より構成されている。最初のステ・ツブ（１）１こお （蒐では、モノクローナル抗体ＩＧ８／Ｈ６をクロマトグラフィーの担体へ固定 イヒする。第２のステップ（２）では天然５ＡＫ４２ＤまたはＳＡＫボＩＪペプ チドを、例えば細菌の粗抽出物より得るのに、直接クロマトグラフにより分離す る。

（１）アフィニティークロマトグラフィーにより精製したモノクローナル抗体■ Ｇ８／Ｈ６（全量２０ｍｇ）を最初に力・ツブリングツ＜・ソフｙ−（０，５Ｍ 　ＮａＣ１，０，１Ｍ　ＮａＨＣＯ３；　ｐＨ８，３）に対して透析した。その 後、ＣＮＢｒ−セファロースＣＬ−４Ｂ　（ファルマンア）とがツブリングさせ た。対応量のセファロース（０，７ｇ）は１ｍＭのＨＣＩにてあらかじめ膨潤さ せてお０た。

モノクローナル抗体自身のカップリングをかノブリングツく・ソファ−内で行つ ｔこ（２時間室温で時折注意深く撹拌し、その後−装置いた）。上消液を除き、 セファロースをカンプリングバッファーにより数回洗浄した。

モノクローナル抗体ＩＧ８／Ｈ６をチャージしたセファロースを１Ｍエタノール アミン（ｐＨ８，０）で処理した（２時間、室温）。この操作と共に、０．５Ｍ のＮａＣｌを含有する０、１Ｍホウ酸バッフｙ−（ｐＨ８，０）および０．５Ｍ のＮａＣｌを含有する０、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４，０）による洗浄を行っ た。

洗浄はそれぞれ５回、ホウ酸バッファーと酢酸バッファーで交互に行った。最後 に、０．５ＭのＮａＣ１を含有する０、２Ｍグリシン／ＨＣＩバッフｙ−（ｐＨ ２゜８）にて洗浄し、得られたセファロースをＰＢＳバッファー内へ移した。

（２）モノクローナル抗体ＩＧ８／Ｈ６をチャージしたセファロースをクロマト グラフ用カラム（直径１ｃｍ）内へ移し、０．０５％ツイン２０およびさらに０ 、５Ｍ（＋）Ｎ　ａ　Ｃ１を含有するＰＢＳバッファーにて洗浄した（少なくと もカラム体積の２０倍量）。４濃度縮ＰＢＳバッファー内に生成されたＳＡＫ含 有細菌破壊物にプロテアーゼ阻害剤を添加し、これを蒸留水で希釈し、ＮａＣｌ およびツイン２０を添加することによって、カラム洗浄バッファーに相当するバ ッファー組成の溶液とした。その後アフィニティーカラムへこの物質をチャージ した。

その後０．５Ｍ　ＮａＣｌを含有する（ツイン２０は含まない）ＰＢＳバッファ ーにて洗浄を（少なくともカラム体積の２０倍量で）、カラムからタンパク質が 溶出されなくなるまで（ＵＶ検出機　波長２８０ｎｍ）行った。カラムの溶出は ０．５ＭのＮａＣｌを含有する０、２Ｍグリシン／ＨＣＩバッフｙ−（ｐＨ２， ８）にて行った。タンパク質含有溶出フラクションを、カラムマトリックスの場 合と同様、即座に中和した。

カラム溶出物に含まれる５ＡＫ４２ＤまたはＳＡＫポリペプチドは電気泳動的に 純粋であった。

リンカ−名　５°末瑞から３゛末端までのリンカ−の　ｙ＋ＬＩ　ＡＧＣＴＴＧ ＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣτＣＡＴＡＴＧ丁ＣＡＡＧＴＴＣＡ丁 Ｌ２　ＴＣＧＡＡＴＧＡＡＣττＧＡＣＡＴＡＴＧＡＧＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＴ ＴＣＡ Ｌ３　ＡＴＴＣＡＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＧτ丁ＡτＡＧＡＡＡＡ ＧＡＡＡＴＡＡＣＴＧＣＡＬ４　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　ＣττＴＴＣτ ＡＴＡＡＣ八入ＣＣＴττＧτ　ＡへＴＴＡＡＧＴＴＧ ＬＳ　ＣＣＴ　ＣＡ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　ＣＧ　Ａ　Ｔ　Ｇ 　Ａ　ＣＧＬ６　ＣＧ　Ｔ　ＣＡ　Ｔ　ＣＧ　ＣＣＴ丁丁ＧＡＴへτＧＡＧＧＬ ７　ＣＣＴＣＡＴＡＴＧＧＣＧＡＧＴＴＡＴＴττＧＡＡＣＣＡＬ８　ＣＣＴＧ ＴＧＧＴＴＣＡＡＡＡＴＡＡＣＴＣＧＣＣ入ＴＡτＬ９　μ、入ＴＴＣＡＧＧＡ ＧＧＣＣＴＣＡＴＡＴＧτＣＡＡＧττＣＡＴＴＣＧＡＡＧ ＬＩＯＧＡＴＣＣＴＴＣＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＡＣＡＴＡＴＧＪ’ｌ。

Ｌｌｌ　ＣＧＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＧＣＧＡＬ１２　Ｃ Ｇ　ＣＧ　Ｔ　ＣＡ　Ｔ　ＣＧ　ＣＣＴ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ａ丁ＡＴＴＴＴ ＣＣＬ１３　Ｇ　Ａ　ＣＧ　ＣＧ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ａ丁τＴＴＧＡＡＣＣＡＡ ＣＡＧＧＣＬ１４　ＣＣＧ　Ｇ　ＣＣＴ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　ＧττＣＡＡＡＡ丁 ＡＡＣＴＬ１５　ＡτＴＣＡＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＣＡＡＧＧＴＴＧＴＴＡτＡ ＧＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＧＣＡＬ１６　ＧＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡ ＴＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＧＴＡＡＴＴＡＡＧＴＴＧ 表１　（続き） Ｌ１２　ＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＣＴＴＧ ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＴＡＴＧＴＬｉｅ　ＣＡＴＡＣＣＧＣＧＧＧＧＡＣＡＡＧＡ ＧＣＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＧ ＡＧＩ　ＣＧＴＡＴＴＴＧＣＧＡＧＴＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＡＧ２　Ｔ ＣＧＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＡＣＴＣＧＣＡＡＡＣ Ｇ　丁 ＡＣ３ＣＧＴＡＴＴ　ＴＧＣＣＣＧＴＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＡＧ４　Ｔ ＣＧＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＡＣＧＣＣＣＡＡ入Ａ ＳＧ　２６　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ｔ　ＣＣＣＡ　Ｇ　Ｇτ丁τＡＡＴＡＧＧＦ １９に　１ Ｆｉｇｕｒ　ｌ　続き Ｆｉｇｕｒ　２ Ｆｉｇｕｒ２　ａき ＦＬｇｕｘ３ Ｓｏ　６０　７０　８０　９０　’ Ｆｉｇｕｒ　３　続き ４０６　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＰＡ Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　−−− ＦＬｇｕｘ　４ Ｆｉｇｕｒ　４　続き Ｆｉｇｕｒ　５ １　ＡＴＧ　ＧＣＧ　ＡＧＴ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＣＣＡ　ＡＣＡ　ＧＧ ＣＣＣＧ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＡＴＧ　ＧＴＡ　ＡＡＴＭＥＴ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　 Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　 ＭＥＴ　Ｖａｌ　Ａｓｎ４６　ＧＴＧ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＧＡＴ　ＧＧ Ｔ　ＭＡ　ＡＧＡ　ＭＴ　ＧＭ　ＴＴＧ　ＣＴＡ　ＴＣＣＣＣＴ　ＣＣＴＶａｌ 　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ 　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｑｌｏｏ　１１０　１２０　１３０ ９１　ＴＡＴ　ＧＴＣＧＡＧ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＧＧ Ｇ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＧＴＴＡＣＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡＴｙｒ　ＶａｌＧｌｕ　Ｐ ｈｅ　Ｐｒｏ　Ｘｌｅ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ１３６　ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＧＭ　ＴＡＣＴＡＴ　ＧＴＣＧ ＡＡ　ＴＧＧ　ＧＣＡ　ＴＴＡ　ＧＡＴ　ＧＣＧ　ＡＣＡ　ＧＣＡ　ＴＡＴＬｙ ｓ　工１ｅ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｌｅ ｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｊｌ−１ａ　Ｔｙｒ１８１　ＡＡＡ　ＧＡＧ　Ｔ ＴＴ　ＡＧＡ　ＧＴＡ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＴＴＡ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＡＧＣＧＣ Ａ　ＡＡＧ　ＡＴＣＧＡＡＬｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ２ ２６　ＧＴＣ、ｌＣＴ　ＴＡＴ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　Ｊ’ＡＧ　ＡＡＴ　ＡＡＧ　 ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＡＡＧ　ＴＣs Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓり　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　 Ｌｌ、Ｉｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　５ｅｒ２７１　ＴＴＣＣＣＴ　 ＡＴＡ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　ＧＴＴ　ＧＴＣＣＣＡ　Ｇ ＡＴ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　ＧＡＧＰｈｅ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙ ｓ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌ ｕＦ幻罫ぽ　５　続き Ｆｉａｕｒ　６　続き Ｆｌｇｕｒ　６ Ｆｉｇｕｒフ Ｆｉｇｕｒ　７　続き Ｆｉｇｕｒ　９　続き ９１２　、Ｕ、Ｇ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＡＴＡ　Ｇ７１ＡＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＩＩ Ａ　ＡＡＣＡＩす函ＴＡＧ　ＴＴＧＴＴＴ入ＴＴ入Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　１ １ｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　−−−８５６ＴＡＧＡＭＧＣＡＡ　ＴＧτＣＴ ＴＧＣＴＴ　Ｇ入へτハＴＧＴＧＴ　入Ｇ丁ＧＡＡＡＡ丁Ｔ　ＡＴＣＴＴτＣＡ 丁Ｃ９０６ＡＡＡＴＴＣＴＣＡＴ　ＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡ　ＡＴＧＧＣＴＣＴＴ ＣＣＣＣＡＣＣＴＡＡＴ　ＣＡＧＡＴＡＴＴＡＧ９５６　ＧＴＧＡＣＴＴＡＴＧ 　ＧＧＧＡＧｊ’Ａ八ＴＣＡへＴＴＡＧＣＡＴＡ　ＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴ　ＡＡ ＴＣＣτＴＴＴＴユ００６　ＴＴＡＧＧＣＡＧＧＴ　ＴＣＣＡＧＧＣハｉＰｉｇ ｕｒ　１０ Ｆｉｇｕｒ　１１ Ｆｉｇｕｒ　１２ Ｆｉｇｕｒｅｎ　１３ａ　ｕｎｄ　１３ｂ−１１−□−１ Ｆｉｇｕｒ　１４ Ｐｉｇｕｒ　１５ □□□■ ０．３＋　１．７　３，２．　４，６　６．Ｏｎｇ　７．５＋将度 フクフィロキナーゼの定…的測定のためのＥＬＩＺＡ試験の検重線である。測定 〔囲は３ＱＯｐＨ／’ｍｌ　（ｌｉｔ小）から７．５ｎｇ／ｍｌ　（最大）であ る。

Ｆｉｇｕｒ　１６ ＋２３４５ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９１００　 ９２８４−４ＣＣＯ７Ｋ　１４／１９５　ＺＮＡ　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１ ／２１　７２３６−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　９１６１−４Ｂ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０２ （Ｃ１２Ｎ　９／６４　Ｚ Ｃ１２Ｒ１：０１） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） ９０５０−４Ｂ （３１）優先権主張番号　Ｐ４２４０８０１．６（３２）優先臼　１９９２年１ ２月１日（３３）優先権主張国　ドイツ（ＤＥ）（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、 ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、　ＡＵ、　ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＲ，ＵＳ ＦＩ Ｃｌ２Ｎ　１５１００　Ｃ （７２）発明者　アルブレヒト、ジビルドイツ連邦共和国０１２１７ドレスデン 、ミケランジェロストラーセ２　／１５５−８（７２）発明者　ギュールス、カ ールーハインツドイツ連邦共和国０７７４５イエーナ、シュレーディンガースト ラーセ４ （７２）発明者　ハルトマン、マンフレートドイツ連邦共和国０７７４３イエー ナ、ドルンブルガー・ストラーセ６１番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．シグナルペプチドをコードする領域を有さない、プラスミノーゲン活性化作 用を有するスタフイロキナーゼポリペプチドのリコンビナント産生に用いられる ＤＮＡ配列。 ２．図１（配列番号１）のヌクレオチド配列と対合バリアントおよび／またはフ ラグメントを示す第１項のＤＮＡ配列。 ３．図２（配列番号２）または３（配列番号３）に示した天然の対合バリアント のヌクレオチド配列を示す第１項または２項記載のＤＮＡ配列。 ４．図４（配列番号４）または５（配列番号５）に示したフラグメントのヌクレ オチド配列を示す第１項または２項記載のＤＮＡ配列５．図６（配列番号６）ま たは７（配列番号７）の人工の対合バリアントのヌクレオチド配列を示す第１項 または２項記載のＤＮＡ配列。 ６．発現調節配列と操作し得るようにリンクしている第１から５順いずれかに記 載のＤＮＡを含有する発現プラスミド。 ７．５′末端が、図８（配列番号８）の翻択開始領域と操作し得るようにリンク している第１項から５項いずれかに記載のＤＮＡ配列を含有する第６項記載の発 現プラスミド。 ８．第６項または７項記載の発現プラスミドを担い、プラスミノーゲン活性化作 用を有するスタフィロキナーゼポリペプチドを発現し得るホスト細胞。 ９．原核細胞である第８項記載のホスト細胞。 １０．イー・コリ種である第９項記載のホスト細胞。 １１．バチルス属である第９項記載のホスト細胞。 １２．第８項から１１項に記載のホスト細胞を適当な培地内で培養し、標的ポリ ペプチドをホスト細胞から単離することを含む、プラスミノーゲン活性化作用を 有するスタフィロキナーゼポリペプチドを産生させるためのりコンビナント産生 方法。 １３．ホスト細胞がイー・コリ種である第１２項記載の方法。 １４．目的とするポリペプチドの単離を、ａ）ホスト細胞を破壊し、破壊物の可 溶性部分を不溶性部分より単離する、ｂ）可溶性部分を直接イオン交換器に通す 、ｃ）目的とするポリペプチドをＮａＣ１水溶液によってイオン交換器より溶出 させる、 ｄ）ＮａＣ１濃度を上げたのち、溶出物を直接疎水性相互作用クロマトグラフィ ーへかける、そして ｅ）標的ポリペプチドを選択的に、疎水性相互作用クロマトグラフィーのメディ ウムからＮａＣ１濃度を減少させるグラジエントによって溶出させ、溶出物より 得る、 ことにより行う、第１２または１３項記載の方法。 １５．各操作段階におけるＮａＣ１濃度をｃ）３０から５００ｍＭ ｄ）２．０から３．０Ｍ、および ｅ）初期濃度を２．０から３．０Ｍとし、最終濃度を１５から１００ｍＭとする とする第１４項記載の方法。 １６．図４から図７（配列番号４から７）のアミノ酸配列を有する、プラスミノ ーゲン活性化作用を有するスタフィロキナーゼポリペプチド。 １７．第１２から１５項に記載の方法により調製される１またはそれ以上のスタ フィロキナーゼポリペプチドを、所望により薬剤適合性である希釈剤、アジュバ ントまたは担体物質と組み合わせて含有する医薬組成物。 １８．第１６項記載のスタフィロキナーゼポリペプチドを所望により薬剤適合性 である希釈剤、アジュバントまたは担体物質と組み合わせて含有する医薬組成物 。 １９．第１２項から１５項記載の方法を用いて調製されるスタフィロキナーゼポ リペプチドまたは第１６項記載のスタフィロキナーゼポリペプチドに対して免疫 反応性を示し、これらのポリペプチドのプラスミノーゲン活性化作用を阻害する ことができるモノクローナル抗体。 ２０．ハイブリドーマ細胞ラインα−ＳＡＫＩＧ８／Ｈ１０（ＺＩＭ０５１１） またはα−ＳＡＫＩＩ４／Ａ１０（ＺＩＭ０５１２）由来のモノクローナル抗体 。 ２１．ハイブリドーマセルラインＺ０５１１およびＺＩＭ０５１２。 ２２．第１９項または２０項記載のモノクローナル抗スタフィロキナーゼ抗体を 所望により薬剤適合性である希釈剤、アジュバントおよび／または担体物質と組 み合わせて含有する医薬組成物。