JPH02104293A - ウサギ上皮細胞成長因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 吏員よ五五■方１ 本発明は新規な構造を有するウサギの上皮細胞成長因子
（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　
、　Ｅ　Ｇ　Ｆ　＞、該ウサギＥＧＦをコードする遺伝
子、該遺伝子を有するベクター、該ベクターを保有する
宿主細胞、之等の製造法及びウサギＥＧＦの用途に関す
る。

従来技術とその問題点 １９７２年にコーエン（Ｃ０ｈｅｎ）らは、雄マウス顎
下腺より新生仔マウスに対して眼瞼開裂促進作用及び切
歯防出促進作用を奏するポリペプチドとしてマウス上皮
細胞成長因子（ｍ　Ｅ　Ｇ　Ｆ　：　ｍｏｕｓｅｅｐｉ
ｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　）を単離
し、その構造を決定した（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、
　　２４７．７６１２−７６２１　（１９７２））。

続いて、１９７５年にグレゴリ−（Ｈ，Ｇｒｅｇｏｒｙ
　）は、人尿より胃酸分泌抑制活性を有するポリペプチ
ドとしてβ−ウロガストロン（ヒトＥＧＦ）を単離し、
その構造を決定した（Ｎａｔｕｒｅ、　２５７　。

３２５−３２７　（１９７５））。

更に１９８５年になって、シンプソン（Ｒ，Ｊ。

ＳｉｍｐＳＯｎ）らは、ＥＧＦレセ°ブタ−との結合性
を指標として、ラット顎下腺から４８アミノ酸残塁から
なるポリペプチドの単離に成功し、ラットＥＧＦの一次
構造を初めて報告した（　Ｅｕｒ、　Ｊ。

、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５３．６２９−６３７　（１
９８５）参照）。上記シンプソンらの報告中には、また
モルモット巳ＧＦの一次構造も記載されている。上記報
告された各種ポリペプチドはいずれも４Ｂ乃至５３個の
アミノ酸残塁からなり、３個の分子内ジスルフィド結合
を有しており、之等のアミノ酸配列の相同性は７０％と
高値を示している。

一方、上記各ポリペプチドは、成長因子として重要な生
理的機能を有するものと児なされており、特にマウス、
ヒト及びラットのそれらＥＧＦについては、種々の生物
活性が詳細に調べられている（例えば特願昭６２−３６
４９８号等〕。その結果、之等ＥＧＦは細胞増殖促進活
性、新生仔マウス眼瞼開裂促進作用並びに切歯防出促進
作用を初めとする多様な生物活性を共通して有すること
が明らかになった。

以上のことから、上記ＥＧＦは哺乳動物に普遍的に存在
し、種々の細胞の増殖に重要な役割を演するポリペプチ
ドであることが示されたが、現在までその構造が明らか
にされたＥＧＦは、上記の通りヒト、マウス、ラット及
びモルモットの４種だけでおり、種々の動物におけるＥ
ＧＦの役割の解明、医薬品の開発等を目的とした各種実
験動物におけるＥＧＦの体内動態等の解明、更に之等の
知見に基づ＜ＥＧＦの用途開発等を横開する上では、現
在知られている情報は不充分といわざるを得ない。尚、
現在上記以外の動物種についても種々研究がなされ、例
えばイヌ尿（Ｒ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔａｌ、、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　２２７．６’ｌ　１−６１９
（１９８５））及びアカシカ顎下腺（に、Ｈｌにｏ　ｅ
ｔａｌ、、Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｒａｔ
ｉｖｅ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ。

句旦、４３１−４４０　（１９８６））からのＥＧＦの
単離が試みられているが、之等の構造はいまだ不明でめ
る。

以上のように、ウサギＥＧＦは、ｍＥＧＦと同様に巾広
い生物活性を有するものとしてそれ自体有用で必る。ま
た各種生化学、薬理学等の分野での実験動物としてのウ
サギの重要性を考慮すると、上記ウサギＥＧＦの組織、
体液中での増減を正確に測定評価できる系の開発が要望
されるが、ウサギＥＧＦはかかる測定系等の開発等に重
要な１９割を演じる。即ち、ウサギＥＧＦを抗原として
ウサギＥＧＦ特異抗血清乃至特異モノクローナル抗体を
作成できれば、之等を利用してウサギＥＧＦを正確に測
定するアッセイ系の開発が可能である。

しかして、現在ウサギＥＧＦの測定には、僅かにラジオ
リセプターアッセイ（ＲＲＡ＞やｍＦＧＦ乃至β−ウロ
ガストロンの測定のためのラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）等が代用されているに過ぎず、之等の方法ではウサ
ギＥＧＦのみを正確に測定することはできず、之等に代
りウサギＥＧＦを正確に測定できるアッセイ系の開発、
殊に該系に抗原として、また標準品として利用できる高
純度のウサギＥＧＦの製造技術の開発が、当業界で切望
されている。

明が解決しようとする爛　、 本発明の目的は、従来知られているマウス、ヒト、ラッ
ト等のＥＧＦとは異なる新規なアミノ酸配列を有するポ
リペプチドからなるウサギＥＧＦを提供することにある
。

また本発明の目的は、上記ウサギＥＧＦの製造法、特に
該ウサギＥＧＦを容易に、高純度で且つ大巾に製造でき
る、遺伝子組換え技術を利用した製造法、並びに該方法
のためのウサギＥＧＦをコードする遺伝子、該遺伝子を
含むＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を保有するベクター、該
ベクターにより形質転換された宿主細胞等を提供するこ
とにおる。

また本発明の伯の目的は、ウサギＥＧＦを正確に測定す
るためのアッセイ系の開発に有用な抗原乃至標準品とし
てのウサギＥＧＦ及びその製造技術を提供することにあ
る。

４題点を解決するための　段 本発明によれば、下記式（１）で表わされるアミノ酸一
次配列を有するポリペプチドであるウサギＥＧＦが提供
される。

（Ｎ末端側） ＡＳｎ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣｙＳ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−旧５−Ａ５ｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−旧５−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃ
ｙｓ−Ｎｅｔ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−ＣｙＳ−八ｓｎ
−Ｃｙｓ−ＶａＩ−ＶａＩ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ａ
ｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ （Ｃ末端側）　　　　　　　　　（１〉また本発明によ
れば、ウサギＥＧＦをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配
列、該ＤＮＡ配列を保有するベクター、該ベクターによ
り形質転換された宿主細胞及びその培養によるウサギＥ
ＧＦの製造技術が提供される。

上記及び以下の本明細書におけるアミノ酸、核酸塩基、
その他に関する略号は、ＩＵＰＡＣ。

ＩＵＢの規定乃至当該分野における慣用記号に従うもの
とする。その例は次の通りである。

ＡＩａ・・・アラニン　　　ＡｒＣ１・・・アルギニン
ＡＳｎ・・・アスパラギン　ＡＳＩ）・・・アスパラギ
ン酸Ｃｙｓ・・・システィン　　Ｇｌｎ・・・グルタミ
ン（３１ｕ・・・グルタミン！ｔ！　　Ｇｌｙ・・・グ
リシン１−（ｉＳ・・・ヒスチジン　　Ｉｌｅ・・・イ
ソロイシン１−ｅｕ・・・ロイシン　　　Ｌ’／Ｓ・・
・リジンＭｅｔ・・・メチオニン　　Ｐｈｅ・・・フェ
ニルアラニンＰｒｏ・・・プロリン　　　３ｅｒ・・・
セリンＴｈｒ・・・スレオニン　　ＴｒＤ・・・トリプ
トファンＴＶｒ・・・チロシン　　　Ｖａｔ・・・バリ
ンＡ・・・・・・アデニン　　　Ｃ・・・・・・シトシ
ンＧ・・・・・・グアニン　　　Ｔ・旧・・チミン本発
明のウナギＥＧＦは、上記式（１〉のアミノ酸一次配列
を有する点において待取付けられ、その構造は、公知の
マウスＥＧＦ、ヒトＥＧＦ、ラットＥＧＦ及びモルモッ
トＥＧＦのいずれとも異なり、他の既知物質にも認めら
れない新規なものであり、これはその有する生物活性を
利用して、後述するように、各種分野において有効に利
用することができる。

本発明ウサギＥＧＦは、ウサギの尿又は顎下腺等の組織
から通常の抽出法に従い製造できる。また本発明ウサギ
ＥＧＦは上記式（１）のアミノ酸配列に基づいて、通常
のペプチドの化学合成法によっても製造でき、更に遺伝
子組換え技術に従っても製造できる。

上記抽出法につきまず説明すれば、これは通常の方法に
従い実施できる。その詳細は後記実施例に示す通りであ
る。

上記各種の方法に従い得られるウサギＥＧＦの単離、精
製は、該ウサギＥＧＦを含有する組成物、例えばウサギ
尿等より、−殻内操作に従い、疎水クロマト担体、ゲル
濾過クロマト担体、逆相高速液体クロマト担体等の、分
画原理の異なる数種のカラムクロマト担体を組合せ用い
ることにより行ない得る。

かくして得られる本発明ウサギＥ’ＧＦのｒＩ！認は、
。

例えば各種の細胞表面に存在するＥＧＦリセプターに、
ウサギＥＧＦが結合することを利用したラジオリセプタ
ーアッセイ（ＲＲＡ）等の手法によって行ない得る。

また、上記ウサギＥＧＦが高純度に精製されていること
の確認は、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ＞により単一ピークになること、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）で単一バンドになること等
を指標として容易に行ない得る。

上記のごとくして得られる精製されたウサギＥＧＦは、
通常のポリペプチド乃至蛋白質の構造解析手段と同様の
手段、例えばアミノ酸分析器を用いたアミノ酸組成の測
定、プロテインシークエンサーを用いたアミノ酸配列の
決定等により、その構造を決定できる。

更に、本発明ウサギＥＧＦの生物活性は、例えば以下の
各種方法により確認できる。

■　細胞増殖促進活性 ＢＡＬＢ／ｃ３丁３等の培養細胞又は成熟ラット肝細胞
等の初代培養細胞等を、低血清条件下にウサギＥＧＦ又
は対照としてのヒトＥＧＦを添加した培地で培養し、培
養液中に標識されたデオキシウリジン、チミジン等を加
えることにより、新たに合成されたＤＮＡ中に取込まれ
るラジオアイソｉ−−プの１を測定する。このラジオア
イントープ出に比例して、新たなりＮＡ合成が行なわれ
たこと、即ち細胞の増殖が促進されたことが判る（丁、
Ｎａｋａｍｕｒａ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｊ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、、９　４　。

１０２９−’Ｉ　０３５　（１９８３）参照）。

■　軟寒天上コロニー形成活性 ＮＲＫ４９Ｆ　（ラット腎繊維芽細胞）等の細胞は軟寒
天培地中では殆／υど増殖しないが、ＴＧＦ−β（トラ
ンスフォーミンググロースファクタータイプβ）の存在
下に、ＥＧＦが共存すると増殖シテコロニーを形成する
（Ｊ、Ｅ、ＤｅＬａｒＣＯａｎｄ　Ｇ、Ｊ。

Ｔａｄａｒｏ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、、ＵＳＡ、、　　７５＊４００１−４００５　（１
９７８）　、Ａ、Ｂ、Ｒｏｂｅｒｔｅｔ　ａｔ、、　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、、　
７７　。

３４９４−３４９８　（１９８０）等参照）。即ち、Ｅ
ＧＦは上記軟寒天上コロニー形成活性を有する。

■　析生仔マウス眼瞼開裂及び切歯前出促進活性新生仔
マウスに、ウサギＥＧＦ又はヒトＥＧＦを２４時間毎に
皮下注射し、各被検動物の眼瞼が開裂する日及び切歯の
出現する日を記録する。

ＥＧＦの投与によれば、之等に要する日数は顕著に短縮
される（　Ｓ、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、　、　２３７　。

１５５５−１５６２　（１９６２））。

本発明ウサギＥＧＦは、上記■〜■に示される如き生物
活性を有しており、これに基づいて広範な用途に有用で
ある。例えば本発明ウサギＥＧＦは、その細胞成長促進
活性より、ヒト或いは家畜等の哺乳動物の成長促進剤と
して、或いは眼科、皮膚科、内科領域等におけるす１傷
治癒作用を利用した疾患治療剤として有効に利用できる
。また、これは例えばヒツジ、ヤギ、ウサギ等の毛用動
物の脱毛剤としても有用でおる（例えばＢ、　Ａ。

Ｐａｎａｒｅｔｔｏ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、Ｅｎｄｏｃ
ｒ、、　１００．２５−３１　（１９８４）等参照〕。

更に、本発明ウサギＥＧＦは、疾患診断或いは体内動態
等の内分泌研究の実施のためのウサギＥＧＦ測定系の開
発に必要不可欠な免疫抗原としても重要なものである。

更に加えて、これは他種動物由来のＥＧＦと同様に、動
物の細胞、組織培養用培地の成分としても有用である。

次に、本発明ウサギＥＧＦの遺伝子組換え技術を用いた
製造技術につき説明すれば、該技術はウサギＥＧＦのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子及びこれを含むＤＮＡ配
列の設計、合成、該ＤＮＡ配列を保有させたベクターの
構築、該ベクターによる宿主細胞の形質転換、該形質転
換細胞の培養を包含する。以下之等を順次詳述する。

ウサギＥＧＦアミノ酸配列をコードする遺伝子（以下「
ウサギＥＧＦ遺伝子」又は「本発明遺伝子」という）と
しては、前記式（１）のアミノ酸配列に基づいて種々の
ＤＮＡ配列を設定できる。

即ち、ウサギＥＧＦを構成する前記式（１）で表わされ
る５３個の各アミノ酸に対応する１乃至６通りのコドン
の中から任意のコドンを選択し、之等を組合せることに
より設計できる。但し、この設計される配列中には、例
えば転写終結信号等の不都合な配列が生じることがあっ
てはならない。

上記本発明遺伝子の好ましい一興体例を、そのアミノ酸
配列と対応させて下記式（２）に示す。

式（２）： ％式％ 上記式（２）で表わされる本発明遺伝子は、互いに相補
的な二本鎖ＤＮＡ配列として示されるが、これを構成す
るそれぞれの一本鎖ＤＮＡ配列も、また本発明ＤＮＡ配
列に包含される。

また、上記式（２）の本発明遺伝子は、宿主細胞として
大腸菌を利用することを考慮して、大腸菌による使用頻
度の高いコドンを優先的に選択、組合せて設計された具
体例であるが、大腸菌を利用する場合でも該大腸菌によ
る使用頻度の高い他のコドンを利用することができ、か
くして得られる配列もまた本発明遺伝子に包含される。

更に、本発明に利用される宿主細胞は、後述するように
大腸菌に限定されるものではなく、従って利用する宿主
細胞に応じて、該細胞による使用頻度の高い他のコドン
を選択、組合せることによっても、本発明遺伝子を構築
することができる。

本発明遺伝子の他の好ましい例としては、ウサギの組織
、細胞等より抽出したメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮ
Ａ＞又はこれを鋳型として得られる相補ＤＮＡ　（ｃＤ
ＮＡ）或いは上記細胞等の染色体ＤＮＡ中に含まれる配
列、即ちウサギＥＧＦ前駆体遺伝子中のウサギＥＧＦア
ミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を挙げることができる
。

上記の如き本発明遺伝子は、その設計された配列に従い
、例えば市販のＤＮＡ合成機等を利用して、通常の方法
に従い、容易に化学合成できる。

該方法としては、例えば同相リン酸トリエステル法（Ｎ
ａｔｕｒｅ　、　３１０．１０５　（１９８４）　）等
を例示できる。また得られるＤＮＡ配列は、例えば高速
液体クロマトグラフィー等の常法により単離精製でき、
精製されたＤＮＡ配列の確認は、例えばホモクロマトグ
ラフィーによる二次展開法（Ｅ、Ｊａｙ、Ｒ，Ａ、　Ｂ
ａｍｂａｒａ、Ｒ，Ｐａｄｍａｎｂｈａｎ　ａｎｄ　Ｒ
，Ｗｕ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　　１．　３
３１　　（１９７４）　）やマキサム−ギルバート法（
Ａ、Ｈ，ＨａＸａｍ　ａｎｄ　Ｗ。

Ｇｉ　１ｂｅｒｔ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　７４　。

５６０　（１９７７）　：Ａ、Ｍ、Ｍａｘａｍ　ａｎｄ
　Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ。

）１ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、Ｖｏｌ
、　　６５．　ｔ）ｌ）４９９゜八ｃａｄ、　Ｐｒｅｓ
ｓ　　（１９８０）　）等により、それぞれ行ない得る
。

上記化学合成に当っては、設計されたＤＮＡ配列及びこ
れと相補的なりＮＡ配列を、それぞれ数本の一本鎖ＤＮ
Ａ断片として別々に合成した後、之等を連結させて所望
の二本鎖ＤＮＡを製造するのが有利である。更に上記二
本鎖ＤＮＡの合成においては、得られるＤＮＡ鎖の両末
端部がそれぞれ適当な制限酵素により切断された結果生
じる配列（制限酵素五２識部位）を有するものとするの
が好ましい。

かかる適当な制限酵素認識部位を有する本発明遺伝子（
二本鎖ＤＮＡ配列）の−具体例としては、下記式（３）
に示す配列を例示できる。

式（３）： ％式％ 尚、上記式（３）では、制限酵素認識部位としてＥＣ０
ＲＩ及びＰＳｔＩ認識部位が示されているが、本発明遺
伝子に付与されるべき制限酵素認識部位は之等に限定さ
れず、後述するように該遺伝子を導入して構築すべきウ
サギＥＧＦ発現ベクターの種類に応じて、従来公知の各
種のものを適宜運択使用できる。

上記式（３）の二本鎖ＤＮＡ配列は、例えば下記第１表
に示す各−重鎖ＤＮＡ断片をまず合成し、次いで之等を
適当に連結させることにより製造できる。

上記式（３）で示される如き本発明の二本鎖ＤＮＡ配列
の製造は、通常の方法、例えば特開昭６１−１５６９１
号公報に記載の方法に従い行なうことができる。その具
体例として上記式（３）のＤＮＡ配列の製造の概略を第
５図に示し、その詳細を後記実施例に示す。

本発明は、前記式（２）で代表されるウサギＥＧＦ！仏
子と共に、更にシグナルペプチドのアミノ酸配列とウサ
ギＥＧＦアミノ酸配列とが連結された融合ポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列をも提供するものでおる。

ここでシグナルペプチドとは、各種の分泌性蛋白等の前
駆体のアミン末端に存在する十数個乃至数十個の疎水性
に富んだアミノ酸配列であり、これは上記前駆体を細胞
の細胞質内から膜外に導き出す作用を奏すると共にそれ
自体は前駆体より切離され、かくして該シグナルペプチ
ドの作用により活性型の分泌性蛋白等が分泌される。遺
伝子組換え法におけるシグナルペプチドの利用及びそれ
による利点は、例えば特開昭６１−１４９０８９“　　
　号公報等に詳述されている。特にシグナルペプチドの
利用によれば、例えばβ−ウロガストロンのように多数
の分子内ジスルフィド結合を有し、通常の遺伝子組換え
法、或いは化学合成法による製造が極めて困難なもので
も、正しくジスルフィド結合の形成された天然型ポリペ
プチドとして収得できるという利点がある〔大貝秀雄、
バイオインダストリー、旦、８７５−８８３　（１９８
６））。

本発明に利用されるシグナルペプチドは、上記各公報等
に記載のものと同一でもよく、また之等と異なってもよ
い。その具体例としては、例えば大腸菌β−ラクタマー
ゼ（ｂｌａ）、リン酸結合蛋白（ｐＳｔＳ又はｐｈＯ８
）、アルカリフォスファターゼ（１）ｈＯＡ＞　、動物
のＩＬ−２、成長ホルモン、プロインシュリンの前駆体
蛋白等のそれぞれのシグナルペプチドを例示できる。

２等シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、化学
合成することもでき、天然のＤＮＡ配列を利用すること
もできる。上記シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列を含むベクターの具体例としてはｐＫＴＮを例示でき
る。

ｐＫＴＮは、ｂｌａシグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を含むベクターであり、その詳細は特開昭６３−
２０２３８７号公報に示しておる。

また該ｐＫＴＮを保有する大腸菌ＪＭ１０３株は、１Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　、　ＪＭ　−１０３
，ｐＫＴＮ−２−２Ｊなる表示で、微工研条奇第１３９
８号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１３９８＞として奇託されて
いる。

本発明の上記ウサギＥＧＦアミン駿配列とシグナルペプ
チドのアミノ酸配列との融合ポリペプチドのアミノ酸配
列及びこれをコードするＤＮＡ配列に包含される具体例
としては、下記式（４）で表わされるものを例示できる
。該式（４）のアミノ酸配列はｂｌａシグナルペプチド
とウサギＥＧＦとの融合ポリペプチド配列であり、同Ｄ
ＮＡ配列は該融合ポリペプチドをコードする配列の一例
である。

式（４）： ％式％ 本発明ＤＮＡ配列は、これを遺伝子組換え技術に利用す
るためには、その５′末端に開始コドン（ＡＴＧ等）を
、また３′末端に終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ
等）を有している必要がおり、かかる開始コドン及び終
止コドンを有するＤＮＡ配列（以下これを「構造遺伝子
」という）もまた本発明に包含される。該構造遺伝子に
は、開始コドンに始まり上述したウサギＥＧＦ遺伝子又
はウサギＥＧＦとシグナルペプチドとの融合ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列を経て終止コドンで終わる一
本ＩＮＡ配列、これと相補的な一本ｌＤＮＡ配列及び之
等からなる二本鎖ＤＮＡ配列が含まれる。

上記式（４）に示１ノだ各ＤＮＡ配列は、共にシグナル
ペプチドのアミノ末端Ｍｅｔに対応する開始コドン（Ａ
ＴＧ＞及びウサギＥＧＦのカルボキシ末端Ａｒ（］のコ
ドンの直後に終止コドン（Ｔ　Ａ　Ａ　＞を有しており
、本発明構造遺伝子の具体例でめる。

また前記式（２）に示す如き本発明ウサギＥＧＦ遺伝子
は、常法に従いその両末端にそれぞれ開始コドン及び終
止コドンを付加することにより本発明構造遺伝子とする
ことができる。かかる本発明構造遺伝子はその全配列を
前記した化学合成により製造することもでき、一部のＤ
ＮＡ配列として天然のＤＮＡ断片を利用し、これと合成
りＮＡ断片とを連結させて製造することもできる。この
連結操作は常法、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ処理等によ
ることができる。

本発明ＤＮＡ配列はこれを適当なベクターに挿入させて
、本発明ベクターを構築される。

上記ベクターの構築はこの種遺伝子組換え技術における
通常の方法に従い得る。これには各種制限酵素による切
断処理、上記Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等を用いた上記連結処
理、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法等による単離、精製、フェノール抽出法に
よる回収、精製等が包含される。１ｑられるベクターの
確認も常法に従い、例えばそのＤＮＡ配列を直接マキサ
ム−ギルバート法（Ａ、Ｍ、）Ｉａｘａｍ、　Ｗ、Ｇ１
１ｂｅｒｔ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　　７４．　
５６０　（１９７７）　）で解析するか、ミニプレバレ
ージョンやマツピング法により遺伝子の挿入やその方向
を確認する方法　〔ト１．ｃ、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　　ｅ
ｔ　　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅ
ａｒｃｈ、　　７．１５１３−１５２３　（１９７９）
　）等によることができる。

本発明ベクターの構築のために利用される起源ベクター
は特に制限な〈従来公知の種々のものでよい。これには
例えばバクテリオファージ及び動植物ウィルスを含む各
種ウィルスベクター各種プラスミド、コスミド等が包含
される。之等の内では、ｐＢＲ３２２又はこれに由来す
る各種プラスミドベクターが好適でおる。更に本発明Ｄ
ＮＡ配列はこれに対応するＲＮＡ配列として、ＲＮＡ遺
伝子からなる適当なベクターに保有させてもよい。

本発明ベクターの具体例としては、後記実施例に詳述す
る方法により得られるｐＲＥ１２５を例示できる。該ベ
クターｐＲＥ１２５は、大きざ約４．４８キロベースペ
アーズ（ｋｂｐ　）のプラスミドであり、前記式（３）
に示した本発明のウサギＥＧＦ遺伝子と共にテトラサイ
クリン耐性遺伝子を保有している。該ベクター１）ＲＥ
１２５を保有する大腸菌ＪＭ１０３株は、微工研に「微
工研条奇第２０４２号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２０４２＞
Ｊとして奇託されている。

本発明のＤＮＡ配列を保有させたベクターは、これが宿
主細胞内に導入されて目的とするウサギＥＧＦを発現す
るためには、本発明構造遺伝子の他にその発現に必要な
各種の遺伝情報、例えばプロモーター、転写終結信号、
ポリＡ鎖付加信号（真核細胞を宿主細胞とする場合）等
の転写のための情報やりボゾーム結合部位（シャイン・
ダルガルノー配列、ＳＤ配列）等の翻訳のための情報等
が必要である。かかる遺伝情報は宿主細胞に応じてそれ
ぞれよく知られており、例えばプロモーターとしては、
大腸菌に対するｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモータ
ー、ｒｅｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐ
プロモーター、ｔａｃプロモーター等、枯草菌に対する
５ＰＯＩプロモーター、５ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎ
プロモーター等、酵母その他の真核細胞に対するＰＨ０
５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモー
ター、ＡＤＨプロモーター、ＳＶ４０由来プロモーター
等を例示できる。之等の遺伝情報は本発明ベクターの構
築に当り、之等を含むプラスミドを選択して起源ベクタ
ーとすることにより、又は之等を含むプラスミドから常
法に従い単離するか、化学合成した後、適当なベクター
に組込むことにより、それぞれ本発明ベクターに存在さ
せ得、かくして所望のウサギＥＧＦ発現ベクターを収得
できる。

かくして得られるウサギＥＧＦ発現ベクターは、本発明
の構造遺伝子の上流にプロモーター及びリボゾーム結合
部位を、また下流に転写終結信号を各々連結されてなる
ウサギＥＧＦ発現情報単位の少なくともひとつを保有し
、適当な宿主細胞内に導入して該細胞を形質転換させる
ことにより、該細胞に目的とするウサギＥＧＦを生産、
蓄積させることができる。本発明は、かかるウサギＥＧ
Ｆ発現ベクターをも提供するものである。

上記ウサギＥＧＦ発現情報単位の一個を有する本発明発
現ベクターの具体例としては、後記実施例に詳述する方
法により得られるｐＲＥ２２５を例示できる。

ｐＲＥ２２５は、前記式（４）で表わされる本発明構造
遺伝子の上流に、ｔａｃプロモーター及びｌａｃ　Ｚ遺
伝子のりボゾーム結合部位を有する。また該構造遺伝子
の下流にｂｌａ遺伝子の転写終結信号を有する。更にこ
れはテトラサイクリン耐性遺伝子をも有している。この
＄）ＲＥ２２５を保有する大腸菌Ｈ８１０１株は、微工
研に「微工研条奇第２０４３号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２
０４３）Ｊとして寄託されている。

また、本発明のウサギＥＧＦ発現ベクターは、該ベクタ
ー内に、上記ウサギＥＧＦ発現情報単位の複数個を有す
るものでおってもよく、かかる複数個のウサギＥＧＦ発
現情報単位を保持させたベクターによれば、ウサギＥＧ
Ｆの生産性を高め１ｑる場合がある。

上記の如くして得られる本発明のウサギＥＧＦ発現ベク
ターは、これを適当な宿主ｉ胞に導入（形質転換）する
ことにより、該宿主細胞に本発明ウサギＥＧＦ産生能を
付与できる。ここで用いられる宿主細胞としては、特に
限定はなく公知の各種のもの、例えば大腸菌等のダラム
陰性細菌、枯草菌等のグラム陽性細菌、放線菌、酵母、
動植物細胞等のいずれでもよいが、特に大腸菌に１２株
由来のＨＢ’１０１株（Ｈ，Ｗ、ＢＯｙｅｒ　ａｎｄ　
Ｄ。

Ｒｏｕｌｌａｎｄ−［）ｕｓｓｏｉｘ、、　Ｊ、Ｈｏ１
．Ｂｉｏｌ、、　４ユ、仝５９−４７２　（１９６９）
）及びＪＭ１０３株（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９゜３０９（１９８１））は好
ましい。

上記宿主細胞への本発明ベクター乃至本発明ウサギＥＧ
Ｆ発現ベクターの導入及びこれによる形質転換法として
は、一般に用いられている方法、例えば宿主細胞を低温
で塩化カルシウムを含む水溶液中で処理し、該溶液中に
ベクターを添加する方法（Ｅ、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ　ａ
ｎｄ　Ｓ、Ｃ０ｈｅｎ、　、１．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、。

１１９．１０７２　（１９７４））等を例示できる。

上記のようにして、本発明ベクターの導入により形質転
換した細胞を収得できる。本発明はかかる形質転換され
た宿主細胞をも提供する。

本発明のウサギＥＧＦ発現ベクターにより形質転換され
た細胞は、通常の適当な細胞培養用培地を用いて培養で
き、該培養により所望のウサギＥＧＦが生産、蓄積され
る。上記培養に利用できる培地としては、例えばＬ培地
、Ｅ培地、Ｍ９培地、Ｍ６３培地等の各種の培地を好ま
しく例示できる。また之等の培地には、更に通常知られ
ている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類、天
然物抽出物、生理活性物質等を添加でき、かがる培地も
好ましく利用できる。培養は前記宿主細胞の生育に適し
たＩＩ、温度、通気、撹拌等の条件を採用した各種の方
法により実施できる。例えば大腸菌の場合には、ｐＨ約
５〜Ｂの範囲、特にｐＨ７が適当であり、約２０〜４３
°Ｃの温度で、通気撹拌条件で培養するのが望ましく、
培養のスケールには特に限定はない。更に目的とするウ
サギＥＧＦの発現量乃至分泌量を高めるため、また菌体
外への目的蛋白の排出を促進乃至抑制する目的等に応じ
て、上記培地組成や培養条件等は適宜変更設定できる。

上記培養により、例えばシグナルペプチドとウサギＥＧ
Ｆとの融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有
させた本発明の発現ベクターで形質転換した細胞では、
細胞質内で融合ポリペプチドが生産され、続いて細胞外
又はペリプラズムに目的のウサギＥＧＦが成熟ポリペプ
チドの形で分泌蓄積される。即ち、まずベクター中の融
合ポリペプチドをコードする遺伝子から、ベクター中の
転写調面囚子並びに宿主細胞中の諸因子の作用でｍＲＮ
Ａが生産される。次いで、該ｍＲＮＡから翻訳調節因子
並びに宿主細胞中の諸々因子の作用で融合ポリペプチド
が生産される。更にここで生産されるポリペプチドは、
シグナルペプチドの作用により、細胞外又はペリプラズ
ムに分泌され、同時にシグナルペプチダーゼの作用によ
り、該ポリペプチドからシグナルペプチドが切り離され
る。

その結果、シグナルペプチドも他の如何なる不要なアミ
ノ駿配列も含まないウサギＥＧＦが細胞外又はペリプラ
ズムに分泌、蓄積される。またシグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を付さない本発明の発現ベクターで形
質転換した細胞では、通常目的のウサギＥＧＦは細胞内
に生産、蓄積される。

かくして宿主細胞の■）脂膜、ペリプラズム等の内部又
は培養土（び等に蓄積されたウサギＥＧＦは、例えば遠
心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕等の常法に従い
分離できる。またかくして分離されたウサギＥＧＦの単
離、精製及び生物活性の確認等は、前記した各種方法に
従い実施できる。

発明の効果 本発明によればウサギＥＧＦ並びに該ウサギＥＧＦをコ
ードする遺伝子、これを含むベクター、該ベクターを保
有する宿主細胞、その培養によるウサギＥＧＦの製造法
が提供される。

本発明ウサギＥＧＦは、その有する生物活性を利用して
、ヒト、家畜等の浦乳動物の成長促進剤、眼科、皮膚科
、内科領域における創傷治療剤、主用動物の脱毛剤等と
して有用である。

また本発明ウサギＥＧＦはこれを免疫抗原としてモノク
ローナル抗体等を作成することができ、かくして得られ
る抗体はＥＧＦに対して特異反応性を有しており、従っ
てＥＧＦの測定、アッセイ系の開発に有効利用でき、Ｅ
ＧＦの関与する各種疾患の診断や体内動態等の内分泌研
究に役立つ。

更に本発明ＥＧＦは、他種動物由来のＥＧＦと同様に、
動物細胞、組織等の培養用培地成分としても有用でおる
。

亙−一度一一舅 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。

尚、形質転換、ＤＮＡ単離、電気泳動等の各操作はマニ
アテイス等の実験書（ＭａｎｉａｔｉＳ、Ｔ。

Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、　ａｎｄ　５ａｉｎｂｒｏｏ
ｋ、Ｊ、　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　
ＮＹ、１９Ｂ２）等に記載の方法に従った。また制限酵
素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等の酵素、ＤＮＡシーケンシン
グキット（宝酒造）等はそれぞれ各社の使用説明書に従
い使用した。更に各側におけるウサギＥＧＦの測定は、
以下のＲＲＡ法により実施した。

＜ＲＲＡによるウサギＥＧＦの測定〉 ウサギＥＧＦの測定を、Ａ４３１細胞を用いたＲＲＡに
より＊施した。用いたＡ４３１細胞は、ヒト扁平上皮癌
由来の細胞株であり、細胞表面に多数のＥＧＦリセプタ
ーを持つことが知られている（Ｒ，Ｎ、Ｆａｂｒｉｃａ
ｎｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ、、７４．５６５−５６９　（１９７７））。

本ＲＲＡは、上記Ａ４３１細胞表面のＥＧＦリセプター
に対するウサギＥＧＦとヒトＥＧＦの結合の競合反応を
利用したものであり、以下の各操作に従い実施された。

０Ａ４３１細胞の調製 Ａ４３１細胞を下記組成の１０％牛脂児血清ＣＦＯ３＞
添加ＤＭＥ培地培地２０中Ｑ中５％ＣＯ２の存在下に３
７℃の条件で３日間培養した。

く］０％ＦＣ３添力ｕＤＭＥ培地〉 ダルベツコ変法イーグル培地　　　９００ｍ０Ｌ−グル
タミン　　　　　　　　　０．６ｇ１０％炭酸水素ナト
リウム水溶液　　１０ｍＱストレプトマイシン　　　　
　　　２００ｍｇペニシリン　　　　　　　　　　　２
０万ＵＦＣ３１００ｍＣ？ その１麦、細胞を懸濁させ細胞数を計数後、２０鵬の１
０％中性ホルマリン液を加え、３０分間、４℃に放置し
た。次いで下記組成のＤ−ＰＢＳ−″で数回洗浄し、分
注後、凍結乾燥させて保存した。

＜Ｄ−ＰＢＳ−＞ 塩化ナトリウム　　　　　　　　８．０　ｇ塩化カリウ
ム　　　　　　　　　０．２　　ｇリン酸二ナトリウム
　　　　　　１．１５０リン酸−カリウム　　　　　　
　０．２　　ｇ合　　　　　　計　　　　　　　　　　
　　１ＱＯ測定方法 スタンダードとしてヒトＥＧＦを用いた。またヒトＥＧ
ＦをクロラミンＴ法によりヨード化して１２５■−ヒト
ＥＧＦを調製した。スタンダード、１２５Ｉ−ヒトＥＧ
Ｆ、Ａ４３１細胞及び測定用検体は、すべて０．１％Ｂ
ＳＡを含むＤ−ＰＢＳ−の溶液又は懸濁液として利用し
た。

まず、スタンダード又は測定用検体０．２ｍＱと約３０
万ｃｐｍ、’ｍＱの１２５Ｉ−ヒトＥＧＦ０．１ｍｆ２
とを混合し、次いで、混合液に約１００万細胞／＋ｎＱ
のＡ４３１細胞０．２ＴＩＩＱを加えて２５°Ｃで２０
時間放置した。その後、０．１％牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）添加Ｄ−ＰＢＳ−１ｍＱを加え、４℃にて遠心分
離（３０００回転／分、３０分間）を行ない、上澄をす
てた。次に沈渣の放射能をγ−カウンターにて測定し、
スタンダードから得られる標準曲線に基づいて、検体中
のウサギＥＧＦＩをヒトＥＧＦ換算値として求めた。

標準曲線の一例を第１図に示す。図において、縦軸はＡ
４３１細胞に対する１２５Ｉ−ヒトＥＧＦ結合比［８／
Ｂｏ（％〉］を、横軸はヒトＥＧＦｆｆｉ（ｎ（］／ア
ッセイチューブ）をそれぞれ示す。

実施例　１ ウサギＥＧＦの単離、精製 ■　日本内ウサギｌｌ［ｔｌｏ羽から代謝ケージを用い
てウサギ尿を採取した。

上記で採取したウサギ尿３Ｑを９０００ＸＱで約２５分
間遠心分離して上清を冑、該上清に約３００回の氷酢酸
を加えてｐｔ−１を４．０に調整した。次いで上記調整
液に約８００Ｃ］の硫酸アンモニウム粉末を投入して溶
解させた後、ブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）
を充填したカラム（１１，２Ｘ７，５ｃｍ＞に吸着させ
た。カラムラ０．４Ｍ硫酸アンモニウム溶液２．３２で
洗浄した後、０．２Ｍ硫酸アンモニウム溶液、水、次い
で４０％メタノール／１０％酢酸溶液のそれぞれ２．３
Ｑで溶出し、各溶出液をプールした。更に、上記と同様
の操作を４回繰返して尿１２Ｑを処理し、同様に溶出液
をプールした。プールされた５回分の溶液中のウサギＥ
ＧＦ量、即ちウサギ尿１５９から得られたウサギＥＧＦ
量は、２８６μｑでおり、蛋白質量（ウシ血清アルブミ
ン換算値）は１．３Ｘ１０”μｑでおった。

■　上記■のブチルトヨパール６５００カラムクロマト
グラフイーにより得られたウサギ尿３９分のウサギＥＧ
Ｆ画分を、水に対して透析後、凍結乾燥した。次にこれ
を３戒の５０％酢酸に溶解し、水を加えて全量を２５ｍ
Ｑとし、１１００００Ｘで２０分間遠心分離して上清を
得た。かくして得られた上清を１Ｍ酢酸で平衡化したセ
ファデックスＧ−５０スーパーフアイン（ファルマシア
社製）カラム（４，４Ｘ１２０ｃｍ）を用いてゲル３濾
過して、ウサギＥＧＦ画分約３００ｍ（ｌを得た。

上記セファデックスカラムによるゲル濾過の溶出パター
ンを第２図に示す。図において、縦軸は２８０１ｍにお
ける吸光度を、横軸は溶出液量（ｍＱ）を示す。また図
には各溶出液についてＲＲＡにて測定した本発明ウサギ
ＥＧＦの活性を破線にて示した。

また、前記■で得た残りのウサギ尿１２Ｑ分からのウサ
ギＥＧＦ画分についても、上記と同様の操作を４回繰返
して処理し、合計５回のウサギＥＧＦ画分を合せて、ウ
サギＥＧＦ１３６μｑを含む蛋白質量８．６Ｘ１０’μ
ｑを得た。

■　上記■のセファデックスＧ−５０スーパーフアイン
カラムクロマトグラフイーから１稈られたウサギＥＧＦ
１３６μｑを含む両分を凍結乾燥し、１０ｍＱの１Ｍ酢
酸に溶解させた後、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液
（ｐＨ４，０＞で平衡化したスルホプロピル（ＳＰ）　
トヨパール（東ソー社製）カラム（１Ｘ４．４Ｃｍ）に
吸着させた。上記カラムを、２０ｍＧの０．１Ｍ酢酸ア
ンモニウム緩衝液（ｐＨ４，０＞で洗浄後、１０回の１
Ｍ酢酸アンモニウム溶液を用いてウサギＥＧＦを溶出さ
せた。この溶出液中のウサギＥＧＦ量は、１１９μΩで
おり、蛋白質量は６９８μＱであった。

■　上記■で得た１Ｍ酢酸アンモニウムによる溶出液を
凍結乾燥後、１　ｍＱの１Ｍ酢酸に溶解させ、ＴＳＫゲ
ル−ｏｏｓ−１２０Ｔカラム［東ソー社製、４．６ｍｍ
内径ｘ２５ｃｍ）を用いたＨＰＬＣ［ウォーターズ社製
、ポンプ：Ｍ６００マルチソルベント送液システム、検
出器：４９０型超高感度多機能検出器］による分取を行
なって、２３μｑの精製ウサギＥＧＦを単離した。

■　上記で得られた精製ウサギＥＧＦを、上記と同じＨ
ＰＬＣシステムを用いて、０．０５％トリフルオロ酢酸
を含有する２８％アセトニトリルを溶離液として、毎分
１　ｍｆ２の流速で溶出させて、２１５ｎｍの吸収を測
定した。

その測定結果は第３図に示す通りである。図において縦
軸は２１５ｎｍにおける吸光度を、横軸は保持時間（分
）を示す。

該図より、単一でシャープなピークが保持時間１４．４
分に溶出されることが判る。

また、上記精製ウサギＥＧＦにつき１５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行ない、クマシーブ
リリアントブルー染色した結果、該精製ウサギＥＧＦは
、単一なバンドとなり、その泳動度は０．３４であった
。尚、対照として用、いたヒトＥＧＦの上記泳動度は０
．５４でめった。

実施例　２ ウサギＥＧＦの特性 ■　アミノ酸組成 精製ウサギＥＧＦ溶液（実施例１で得たもの）約２μΩ
相当量を、硬質ガラスサンプル管（日型理化硝子社製、
６Ｘ５０ｍｍ）にとり、加水分解用反応バイアル（ピア
ース社製）に入れ、真空乾固後、６Ｎ−塩Ｍ（含１％フ
ェノール＞２００μＱを該反応バイアルに入れ、減圧密
封し、１３０’Ｃで４時間加水分解反応を行なった。

反応後、サンプル管に０．０２Ｎ−塩酸４００μＱを加
え、アミノ酸分析用サンプル管に移し、その２５０ｕＱ
を日立高速アミノ酸分析計（日立社製）に自動注入して
アミノ酸組成の分析を行なった。尚、検出法としてはＯ
ＰＡ　（オルトフタルアルデヒド）法を用いた。この方
法ではＰ　ｒｏ。

ｃｙｓ及びＴｒｉ）は検出されず、ＡＳＩ）及びＡＳｒ
ｌ並びにＧｌｕ及びＱｌｎはそれぞれ合計量として（Ａ
ｓｘ及びＧｌｘとして表示）検出される。

Ｐｈｅを１個含むものとして、その組成比を算出した結
果を下記第２表に示す。

第　　　２　　　表 尚、ＮＤＸは検出されないことを示す。

■　アミノ酸配列の分析 精製ウサギＥＧＦのアミノ酸配列をアプライドバイオシ
ステバズ社製４７０Ａ型気相式プロティン・シークエン
サーを用いて分析した。即ち、精製ウサギＥＧＦを上記
シークエンサーにてＰＴＨ−アミノ酸に分離し、各ＰＴ
Ｈ−アミノ酸をベックマン社ＩＰＬｃシステムにより同
定した。

その結果は、前記式（１）に示した通りであり、かくし
て本発明ウサギＥＧＦの一次構造が決定された。

■　Ｓ−８結合部位 精製ウサギＥＧＦをサーモライシン、キモトリプシン又
はペプシンを用いて、下記条件で酵素消化させた後、Ｄ
ＥＡＥ５ＰＷ及び０Ｍ５ＰＷ（いずれも東ソー社製）カ
ラムを用いたイオン交換ＨＰＬＣ及びコスモシル力ラム
［Ｃｏｓｍｏｓ　ｉ　１５ｃｔａ−３００カラム、ナカ
ライテスク社Ｗ！Ａ］を用いた逆相ＨＰＬＣで分離する
ことにより、シスチンを１つだけ含むフラグメントに分
離される。

サーモライシン消化条件： ０．１Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ６，５＞、４５°Ｃ１２
４時間 キモトリプシン消化条件： ０．１Ｍ酢酸アンモニウム（１）Ｈ６，５＞、３７°Ｃ
１２４時間 ペプシン消化条件： ０．１Ｍピリジン−酢酸（Ｄｉ−（３，５＞、２５℃、
１時間 尚、酵素／基質は１／１００（モル比）とした。

次に得られたシスチンを１個含む各フラグメントを各々
前記と同様にしてアミノ酸分析及びシーフェンス分析し
た。

その結果、各フラグメントは、ｃｙｓ６ｃｙｓ２０゜Ｖ
ＴＶ″３１　　　　□ Ｃｙｓ　　Ｃｙｓ　　及びＣｙＳ３３ＣｙＳ４２の３つ
のうちの１つのＳ−８結合を持つフラグメントと完全に
一致し、他の組合せのＳ−８結合を持つフラグメントは
見出せなかった。

このことより、本発明ウサギＥＧＦは、６番目と２０番
目、１４番目と３１番目及び３３番目と４２番目のシス
ティンの間にＳ−８結合を持つことが確認された。

■　生物活性の測定 （ａ）細胞増殖促進活性 本発明ウサギＥＧＦの細胞増殖促進活性を、以下の通り
、成熟ラット初代培養肝細胞（に、　Ｔａｎａｋａｅｔ
　ａｔ、、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、８４　、９３７−
９４６（コ９７８＞　）を用いて、標識デオキシウリジ
ンのＤＮＡへの取込みを指標として測定した。

叩ら、体重約２００ＣＩのウィスター系雄ラットにネン
ブタール０．４ｍ（Ｉｔを腹腔的投与して麻酔後、開腹
し門脈を露出させた。門脈の切開面からカニユーレを挿
入し、３７°Ｃに保温した前潅流用緩衝液を流した。ま
た、右心房を切開し、ここから別のカニユーレを上大静
脈に挿入した。次いで、前潅流用緩衝液に代えて、３７
°Ｃに保温したコラゲナーゼ溶液を用いて、１０〜２０
分間潅流を行なつた。次いで、肝臓多葉を切り離し、シ
ャーレに移してイーグルＭＥＭ培地を加えてメスで細分
し、更にピペットで細胞を分散させた。次いで１５０メ
ツシユを通過する細胞を集め、これを遠心分離（６００
０叩…、１分間）し、沈降した肝実質細胞を、５％仔牛
血清、１０″″９Ｍインスリン、１０−”Ｍデキサメサ
ゾン及び５Ｕ／ｍＱアプロチニンを含むウィリアムＥ培
地に懸濁させた。その一部を用いトリバンブルー法で染
色後、血球計算盤で生細胞数を計測した。

尚、用いた前潅流用緩衝液及びコラゲナーゼ溶液組成＜
Ｃｌ／Ｑ　＞は次の通りである。

成　分　くｇ／Ｑ　）　　　前潅流用　１ラゲナ緩衝液
　　−ゼ溶液 塩化ナトリウム　　　　　　　８８ 塩化カリウム　　　　　　　０．４　　　０．９４塩化
カルシウム　　　　　　　　　　　　０．１リン酸−ナ
トリウム ・２水塩　　　　　　　　　０．０７Ｂ　　　０．０７
８リン酸二ナトリウム ・１２水塩　　　　　　　　０．１５１　　０．１５１
ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　２．３８　　　２．３
８フエノールレツド　　　　　　０．００６　　０．０
０６コラグナーゼ　　　　　　　　　　　　０．５トリ
プシンインヒビター　　　　　　　　０．０５ＥＤＴＡ
　　　　　　　　　　　Ｏ，１９−炭駿水素ナトリウム
　　　　０．３５　　　０．３５上記肝実質細胞を２４
穴のプラスチック製デイツシュに１．２５’Ｘ１０５個
／ウェルとなるように分注し、２０時間培養した後、培
地を捨てて、種々の濃度のウサギＥＧＦ又はヒトＥＧＦ
と共に１０−９Ｍインスリン、１０−”Ｍデキサメサゾ
ン及び５Ｕ／ｍＱアプロチニンを含むウィリアムスＥ培
地Ｑ、５ｍＱを加えた。これを２２時間３７°Ｃに保っ
た後、］μ０１の５−１１２５Ｉ）−ヨード−２′−デ
オキシウリジン（０，６０ｉ／ミリモル）をｈａえ、３
７℃で更に１２時間培養した。次いで細胞をＰＢＳで２
回洗浄し、１０％ＴＣＡを加え、４℃で１０分間放置す
ることにより固定した。固定された細胞に１　Ｎ−Ｎａ
ＯＨの０．５ｍＱを加え、３７°Ｃにて３０分間保温し
て溶解させ、これを試料液とした。

試料液全量を試験管に移し、γ−カウンターで放射能を
測定した。

得られた結果を第３表に示す。

第　　　３　　　表 上記第３表から、本発明ウサギＥＧＦはヒトＥＧＦと同
等のＤＮＡ合成促進活性、即ち細胞増殖促進活性を有す
ることが明らかである。

（ｂ）軟寒天中コロニー形成活性 まず、０．６％寒天（Ａ（Ｊａｒ　Ｎｏｂｌｅ、デイフ
コ社製）及び５％仔牛血清を含むダルベツコ改変イーグ
ル培地（ＤＭＥ＞を、直径３５ｍｍのシャーレに２ｙｎ
Ｑづつ分注して固化させた。別に、０．３％寒天、５％
仔牛血清、’＋ｎｇ／＋ｎＱのヒトＴＧＦ−β及び種々
の濃度のウサギＥＧＦ又はヒトＥＧＦを含むＤＭＥ培地
３．５ｍＱに、７．５Ｘ１Ｑ’細胞／購のＮＲＫ−４９
Ｆ細胞１４０μＱを加え、このもの’ｌ　ｍＱを前記０
．６％寒天培地上に注ぎ、３０分間室温に放置して固ま
らせた。これを炭酸ガス培養器中で３７℃で、５％ＧＯ
２の条件下に７日間培養した後、３１００μｍ２以上（
６０μｍ直径）のＮＲＫ−４９Ｆ細胞のコロニーを顕微
鏡下で計数した。

得られた結果を第４図に示す。図において縦軸はコロニ
ー数Ｘ１０−３／シヤーレを、横軸は用いたＥＧＦの濃
度（ｎｃｌ／ｍＱ）を示す。また図中、・−・は本発明
ウサギＥＧＦを示し、ムームは対照とするヒトＥＧＦを
示す。

第４図より、本発明のウサギＥＧＦは、ヒトＥＧＦと同
様に、ＴＧＦ−βの共存下で軟寒天中のコロニー形成活
性を有することが明らかである。

実施例　３ ウサギＥＧＦをコードするＤＮＡ配列の造成この造成の
概略は第５図に示す通りでおり、まず第１表に示す各Ｄ
ＮＡ断片を以下に示夏ように合成し、之等を連結させ、
次いで連結物をベクターｐＢＲ３２２に挿入してベクタ
ーｐＲＥ１２５を構築した。

■　−重鎖ＤＮＡの合成 前記第１表に示したＵＳＡＥ−１〜ＵＳＡＥ−８の８種
の一本鎖ＤＮＡを、それぞれＤＮＡ合成機３８１Ａ型（
アプライドバイオシステムズ社製：を用いて合成した。

■　ＤＮＡ断片の連結 上記で合成したｔＪＳＡＥ−２〜ＵＳＡＥ−４及びＵＳ
ＡＥ−６〜ｔＪＳＡＥ−８の各々約８μ９を、１００ｍ
ＭのＡＴＰの存在下にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
宝酒造社製）を用いてリン酸化した。次いでＵＳＡＥ−
１及びＵＳＡＥ−５と、上記でリン酸化された各断片の
それぞれ約１．３μＱとを混合し、それぞれをＴ４リガ
ーゼ（宝酒造社製）を用いて連結させた。

上記連結物を、８％ポリアクリルアミドゲルを用いて電
気泳動させ、０．０５％エチジウム　ブロマイド溶液で
染色した後、前記式（３）の二本鎖ＤＮＡ配列に相当す
る約１７８ｂｐのＤＮＡ断片（Ａ＞をポリアクリルアミ
ドゲルから分離した。

■　クローニング プラスミドＤＢＲ３２２の５μｑを１００ｍＭ）　塩化
ナトリウム、５０ｍＭトリス塩′ｔｉ（ｐＨ５，５＞　
、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び１ｍＭジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）を含む水溶液（以下これを「高塩濃度緩
衝液」という）に溶解させ１、　　これにＥＣ０ＲＩ（
宝酒造社製＞２０単位及びＰＳｔ■（宝酒造社製）３０
単位を加えて全量を１００μＱとし、３７℃で３時間反
応させて切断させた後、０．９％アガロースゲル電気泳
動を行なって、約３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片＜Ｂ＞を分
離した。

１降られた２種のＤＮＡ断片（Ａ）と＜Ｂ＞とを混合し
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、得られた連結
物で大腸菌ＪＭ１０３株を形質転換させた。

その結果、テトラサイクリン耐性を示す形質転換体が得
られ、之等はすべてアンピシリン感受性でめった。

上記形質転換体より一株を選び、これからプラスミドＤ
ＲＥ１２５を単離した。

得られたプラスミドｐＲＥ１２５を、制限酵素３ａｌ工
、ＭＩＬＪＩ、Ｐ　ｓｔ　工、Ｈｌ）ａＩ及びＡＶａＩ
（以上いずれも宝酒造社製〉をそれぞれ組合せて用いて
切断し、生じたＤＮＡ断片の大きさをポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で調べた。

その結果、該１）ＲＥ１２５はｐＢＲ３２２のＥＣｏＲ
ニーＰｓｔエサイト間に、前記式（３）の二重鎖ＤＮＡ
配列が挿入されたものであることが確認された。

実施例　４ ウサギＥＧＦ発現ベクターＤＲＥ２２５の構築このベク
ターの構築の概略図は第６図に示す通りでおり、該ベク
ターｐＲＥ２２５は以下の通り、前記実施例３で得られ
たρＲＥ１２５並びにプラスミドｐＫＴＮ　［特開昭６
３−２０２３８７号公報参照］を用参照溝築した。

■　まず１）ＲＥＩ　２５の３μｑを１００ｍＭ塩化す
ｌ〜ツリウム１０ｍＭトリス塩１１（ｐＨ７，５）、１
０ｍＭ塩化マグネシウム及び１ｍＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ＞を含む水溶液（以下これを１中塩濃度緩衝液
」という）に溶解させ、これに制限酵素Ｈ１）ａ工及び
ＢａｍＨＩをそれぞれ２０及び２４単位加えて全量を１
００μＱとした後、３７°Ｃで１時間反応させて切断し
た。その後、０．９％アガロースゲル電気泳動を行ない
、約３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ）を得た。

別に、ｐＫＴＮの１０μｑを生塩濃度緩衝液に溶解させ
、これにＮａｅ工（東洋紡社製〉９単位を加えて全量を
１００μＱとし、３７℃で３時間反応させて切断した。

次いで高塩濃度緩衝液に溶解させ、これにＢａｍＨＩの
２４単位を加えて全量を１００μＱとし、３７°Ｃで３
時間反応させ切断した。その後、１．６％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、約０．８８ｋｂｌ）のＤＮＡ断片
（Ｄ＞を得た。

■　上記■で得た各ＤＮＡ断片＜Ｃ＞及び＜Ｄ＞を混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、得られた連
結物で大腸菌ＪＭ１０３株を形質転換させ、テトラサイ
クリン耐性の形質転換株を得た。

その中から一株を選び、プラスミドｐＲＥ２２５を単離
した。

単離されたｐＲＥ２２５の２μｑを、７−ジアザシーケ
ンシング千ット（東洋紡社製）を用いてシーケンス分析
を行ない、ウサギＥＧＦをコードするＤＮＡ配列を確認
した。

得られたｐＲＥ２２５は大きざ約４，４８ｋｂｐのプラ
スミドであり、テ［ヘラサイクリン耐性遺伝子を有して
いると共に、ｐＫＴＮ由来のｂｌａシグナルペプチドと
ｐＲＥ１２５由来のウサギＥＧＦとが連結してなる融合
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有しており、そ
の上流にｌａｃ１Ｍ伝子リボゾーす結合部位を、更にそ
の上流にｔａｃプロモーターを有していることが確認さ
れた。

実施例　５ 本発明組換え微生物の培養及びこれによるウサギＥＧＦ
の製造 ■　菌の培養 実施例４で得られたベクターｐＲＥ２２５を保有する大
腸菌Ｈ８１０１株を以下の通り培養した。

培地としては、グルコース、カザミノ酸、プロリン及び
サイアミンを添加した下記組成のＭ９培地を用いた。

く試薬添加Ｍ９９培地成〉 リン酸二ナトリウム・１２水塩　　　１０．ＯＣ１リン
酸−カリウム　　　　　　　　　　３．０ｇ塩化ナトリ
ウム　　　　　　　　　　　０．５ｑ塩化アンモニウム
　　　　　　　　　　１．０ＣＩ塩化カルシウム・２水
塩　　　　　　１５．０ＩＩＩＣ１塩化マグネシウム・
６水塩　　　　　　２５０ｍｇ塩化マンガン・４水塩　
　　　　　　　２，５ｍａカゼイン　　　　　　　　　
　　　　１０　　ｑグルコース　　　　　　　　　　　
　　５５．Ｏｑカザミノ酸　　　　　　　　　　　　　
　５．０ｐＬ−プロリン　　　　　　　　　　　　　　
２０ｍｑＬ−ロイシン　　　　　　　　　　　　　　２
０ｍｇサイアミン・塩酸塩　　　　　　　　　　１０ｍ
。

テトラサイクリン　　　　　　　　　　　３０ｍｇ合　
　　計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２
上記培地３Ｑを含む５Ｑジャーファーメンタ−（丸菱バ
イオエンジ社製、ＭＤ３００−５１）に、菌を接種して
３５°Ｃ，ｐＨ６，７にて、通気撹拌条件で培養を行な
った。培養開始１７．５時間後に、培養液の一定量（８
ｍ１２）を採取し、遠心分離（１００００回転／分Ｘ１
０分間、４℃）により菌体と培養上清とを分離した。

かくして得られた培養上清を菌体外画分とする。

また、菌体から浸透圧ショック法（Ｈ，Ｃ，Ｎｅｗａｎ
ｄ　　＾、Ｈｅｐｐｅｌ、　　Ｊ、ｆＳｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、、　　　２４０．　３６８５−３６９２　（１９６
５））に従い、以下の操作によりペリプラズム画分を抽
出した。即ち、まず前記菌体を２０％蔗糖を含む３０ｍ
Ｍ　トリス塩酸緩衝液（１）Ｈ８，０）４鵬に懸濁させ
、０．２５ＭＥＤＴＡ水溶液（１１８，０）１６μＱを
加え、１０分間撹拌した後、遠心分離（１００００回転
／分ＸＩＯ分間）して菌体を集め、次いでこの菌体を水
冷した水４ｍｌに再懸濁させ、水中に１０分間静置して
時々撹拌し、遠心分離（１００００回転／分Ｘ１０分間
）により、菌体と上清とを分離した。

かくして得られた上清をペリプラズム画分とする。

更に菌体を洗浄用緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸及び３０
ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８，０＞で洗浄後、ＰＢＳ　
（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナト
リウム、ｐＨ７，０）１０ｍＱに懸濁させ、超音波破砕
機（大岳製作所社製、５２０２型）を用いて、出力１０
０Ｗにて３０秒ずつ３回破砕処理し、次いで遠心分離 （１２０００回転／分Ｘ２０分間、４℃）して上清を得
た。

かくして得られた上清を菌体内画分とする。

以上で得られた各画分につき、前記実施例に示したＲＲ
Ａ法によりウサギＥＧＦ含量を測定した。

得られた結果を下記第４表に示す。尚、測定値は培養液
１Ｑ中のウサギＥＧＦＩとして、ヒトＥＧＦ換算１直で
示した。

第　　　４　　　表 第４表より、ウサギＥＧＦ発現ベクターＤＲＥ２２５を
保有する本発明の組換え大腸菌は、ウサギＥＧＦをペリ
プラズム及び菌体外に産生することが明らかである。

実施例　６ ウサギＥＧＦのｍ製及び同定 ■精製 以下の方法によりウサギＥＧＦの精製を行なった。即ち
、実施例５と同様にして培養を行なって得た菌体外画分
５．６９からＲＲＡを指標として、以下の工程を順次行
なった。

（１）−ブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）を用
いた吸着クロマトグラフィー （２）ＳＰトヨバール（東ソー社製）を用いた陽イオン
交換クロマトグラフィー （３）ＴＳＫゲル−〇ＤＳ−１２０Ｔカラム（東ソー社
製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） かくしてウサギＥＧＦ６７６μｑを単離した。

得られた遺伝子組換え技術によるウサギＥＧＦは、実施
例１の■と同一のＨＰＬＣシステムを利用した分析の結
果、該実施例１で冑られたウサギ尿由来のウサギＥＧＦ
と同一の溶出パターンを示し、同一物質でめることが確
認された。

また１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、上
記遺伝子組換え技術によるウサギＥＧＦとウサギ尿由来
ウサギＥＧＦの泳動度は同一でめった。

■　アミノ酸組成分析 上記■で精製したウサギＥＧＦ溶液約６．７６μΩ相当
量を、硬質ガラスサンプル管（日型理化硝子社製、４．
Ｏｘ４０ｍｍ＞に取り、加水分解用反応バイヤル（ウォ
ーターズ社製）に入れ、真空乾固後、６Ｎ塩酸（１％フ
ェノールを含む）２００μＱを該反応バイヤルに入れ、
減圧密封し、１３０’Ｃで４時間加水分解反応を行なっ
た。

反応後、サンプル管にベックマン社製Ｎａ−３バツフＦ
　　２００ｔｉＱを加え、アミノ酸分析用サンプル管に
移し、その５０μＱをベックマン６３００Ｅ型アミノ酸
分析計（ベックマン社製）に注入してアミノ酸組成の分
析を行なった。尚、検出法としてはニンビドリン法を用
いた。この方法ではＴ叩は検出されない。またＡＳｔ）
及びＡｓｎ並びにＧｌｕ及びＧｌｎは、それぞれ合計量
（Ａｓｘ及びＧＩＸとして表示）として検出される。

Ｐｈｅを１個含むものとして、その組成比を算出した結
果を第５表に示す。

第　　　５　　　表 尚、ＮＤＸは検出されないことを示す。

上記第５表より、精製ウサギＥＧＦのアミノ酸組成は、
理論値と一致することが判る。尚、丁ｒｐについては、
他の公知の方法による測定の結果、上記理論値と一致す
ることが確認された。

■　生物活性の測定 上記遺伝子組換え技術に従って得られた精製ウサギＥＧ
Ｆの生物活性を、前記実施例２の■（ｂ）に記載の軟寒
天中コロニー形成活性の測定法に従って調べた。

得られた結果を第７図に示す。図において縦軸はコロニ
ー数Ｘ１０−３／シヤーレを、横軸は用いたＥＧＦの濃
度（ｎＭ　ｍ１２　）を示す。また図中、・−・は本発
明の遺伝子組換え技術に従い得られたウサギＥＧＦを示
し、ムームは対照とするヒトＥＧＦを示す。

第７図より、本発明の遺伝子組換え技術に従い得られた
ウサギＥＧＦは、軟寒天中のコロニー形成活性を有する
ことが明らかでおる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＥＧＦの測定のためのＲＲＡ法の標準曲線を示
すグラフでおる。 第２図は本発明ウサギＥＧＦのセファデックスＧ−５０
スーパーフアインカラムを用いたゲルを濾過法によるク
ロマトグラムである。 第３図は本発明ウサギＥＧＦの０ＤＳ−１２０Ｔカラム
を用いた逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムである。 第４図は実施例２に従う本発明ウサギＥＧＦの有する軟
寒天中コロニー形成活性の測定結果を示すグラフである
。 第５図はベクターＤＢＲ３２２に合成オリゴヌクレオチ
ドＬＪＳＡＥ−１〜ＵＳＡＥ−８を挿入してプラスミド
ＤＲＥ１２５を得る工程及び得られるｐＲＥ１’２５の
特徴を示す図であり、図中口はウサギＥＧＦをコードす
るＤＮＡ配列を示し、ＴＣｒはテトラサイクリン耐性遺
伝子を、Ａｐｒはアンピシリン耐性遺伝子をそれぞれ示
し、０は合成オリゴヌクレオチドのリン酸化されていな
い５′末端を、・は同リン酸化された５′末端を示す。 第６図はｐＲＥ１２５及びｐＫＴＮからウサギＥＧＦ発
現ベクターＦＲＥ２２５を得る工程及び得られたベクタ
ーの特徴を示す図でおり、図中口ヌキの矢印はｔａｃプ
ロモーターを、凶はｂｌａシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ配列をそれぞれ示す。 第７図は実施例６に従う本発明ウサギＥＧＦの有する軟
寒天コロニー形成活性の測定結果を示すグラフである。 （以　上） 第７図 ＥＧＦ　（ｎｇ／ｍｌ） 第５図 第６図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］下記のアミノ酸一次配列を有することを特徴とす
   るウサギ上皮細胞成長因子。 （Ｎ末端側） 【遺伝子配列があります】 （Ｃ末端側） ［２］請求項［１］記載のウサギ上皮細胞成長因子のア
   ミノ酸配列をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列。 ［３］ウサギ上皮細胞成長因子のアミノ酸配列をコドす
   る遺伝子が下記配列のものである請求項［２］記載のＤ
   ＮＡ配列。 【遺伝子配列があります】 ［４］シグナルペプチドのアミノ酸配列とウサギ上皮細
   胞成長因子のアミノ酸配列とが連結された融合ポリペプ
   チドをコードするＤＮＡ配列を含む請求項［２］記載の
   ＤＮＡ配列。 ［５］請求項［２］〜［４］記載のいずれかのＤＮＡ配
   列を含むベクター。 ［６］請求項［５］記載のベクターを保有する宿主細胞
   。 ［７］請求項［６］記載の宿主細胞を培養して、ウサギ
   上皮細胞成長因子を製造、採取するウサギ上皮細胞成長
   因子の製造法。