JPS62246600A - ヒト上皮成長因子およびその類似物質の産生法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏ
ｗｔｈｆａｃｔｏｒ、　］ｌ３Ｆ）および生物学的活性
を有するその類似物質の新しい調製法および使用に関す
るものである。

（従来技術） 上皮成長因子（ｇｅｙ’　）およびその類似物質は、多
様な生物学的活性を有する一連のポＩＪ　６プチドを表
す。ヒ）ＥＧＦそれ自身は５３個のアミノ酸からなるポ
リペプチドである。その類似物質は、ポリぼプチド鎖の
アミノ酸数が異なりている。これらの多様性は、文献に
記述されている１例えレイ、１９７５年１１月４日に発
行された米国特許第３．９）７，８２４号明細書参照。

文献には、上記物質の多様な生物学的活、性についても
述べられて〜・る、各々の物質は、他のものと同じ活性
、すなわ５ち、同範囲の生物学的活性を有する場合も有
さない場合もあるが、−役に、ＥＧＦおよびその類似物
質は、胃酸分泌を抑制し、１ｌＦＪ胞成長を促進するこ
とが見いだされている。このように、上記物質は、ｍｓ
治療への応用に利用されてきた。

ヒ）　ＥＧＦは％實年男子の尿、上顎腺、お−よび、全
身の他の多様な部分に見いだされる。ヒ）　ＥＧＦ’お
よびその類似物質を産生する現在の技術は、大部分は尿
からの活性因子の単離によるものであり、組み換えＤＮ
Ａ技術を用いた生産による産生も若干性なわれている。

上記の方法のうち、尿からの方法に固有な問題点は全く
明らかである。尿を出発材料とする単離は時間を消費し
、高価であり、さらに原材料の供給に依存する。さらに
、密接に関連している類似物質の存在のため、完全なヒ
）　ＥＧＦの単離法は複雑である。一方、　ＥＧｉｉ’
産生のための、組み換え技術を含む現在の方法は、産生
および精製過程でのヒトＥＧＦの明らかな不安定さによ
り、完全に十分なものではない、いくつかの欠点は１本
明細書中′（上り３釧ｉｆ　ｌＰ棟弐引−六ととに上り
明らめ）にｔｒるであろう。

ウロガストロンとしても知られて〜するＥＧＦをま、以
下の、配列に示される％５３アミノ酸から成る：Ａｓｎ
５ｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｉｒ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌ
＠ｕ　Ｓｇ、ｒＨｌｓ　ＡｓｐＧｘｙ　Ｔｙｒ　Ｃｙ＋
　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　ＡＩＩＩ）　Ｇ１７　’Ｖａｎ、　
Ｃ７１１Ｍｅｔ　Ｔｙｒ工１ｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅ
ｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｅ　Ｔｙｒ　Ａｘａ　Ｃｙｓ　Ａａｎ
　ＣｙａＷａＩＶａＩＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ｉｔｓ　Ｇｌｙ
　Ｇ’ｌｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇ’ｌｎ　ＴｙｒＡｒｇ
　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｅ　Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　
Ｌｅｕ　Ａｒｇ　　。

上記配列は、ヒトに存在しており、文献に報告され【い
るＥＧＦの配列である。；とに述べられる発明は、ヒ）
　写Ｇｒおよび生物学的活性を有す２るその類似物質の
微生物による産生に関するものである。しかしながら、
本発明はマウスＫＧＩ’および、ヒトＥＧＦと同数か、
より少ないグルタミン残基を有するいかなるＥＧＦ’に
も事実上同様に適用できる。

上に示した配列中で、ｓ、２４，４０および５１番目の
アミノ酸残基がダｙタミンであること警１注目されるべ
きである。この分子は、その天然の形態では６−２０．
１４−３１および３３−４２の各残基間にジスルフィド
結合が存在するように折りたたまれている。

（発明が解決しようとする問題点） ＥＧＦ’が大腸菌（Ｅ．ａｏｘｌ）を用いた組み換えＤ
ＮＡ系に於いて産生されることが強く望まれているが、
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）は細菌内在性プロテアーゼの存
在下で不安定である還元型でＥＧＦ’を産生ずる傾向が
あるため、克服しなければならない重大な障害があった
。安定性を増大させるためには、細＠ば一ストから容易
に回収できる不溶性融合タンパク質を産生させるリーダ
ー配列を用いるべきであることが、文献に報告されてい
る。そのよ５な辱異的リーダー配列の選択は困難である
ことが仰られている。しかも、ポ１７　ｄプチド単離過
程の最終段階で、リーダー配列はそのＮ末端アミノ基に
あるＥＧＩ’部分から分離して消化除去されなげればな
らない、適切なリーダー配列が使用された場合でさえ、
得られたポリープチドな精製する際に重要な困難が生じ
る。産物の損失につながる冗長なりロマトグラフィー分
離が必要な場合がしばしばある。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、ヒ）ＥＧＦ’および新しい類似物質を含む融
合タンツク質を産生ずる組み換えＤＮＡ技術を与えるも
のである。また、本発明はリーダー配列結合部およびＥ
ＧＧ’の最初のアミノ酸にグルタミン残基を導入する方
法に関するものである。

最後に、本発明は、ＥＧｒおよび類似物質のアミノ酸配
列に先立つＧｌｕ残基の特異的、優先的酵素切断により
、融合タンパク質からＥＧＦおよび類似物質を生成する
ための生化学的方法を与える・ものである。

本発明のＥＧＧ’類似物質の望ましい態様のアミノ酸配
列は、上記類似物質をコードする構造遺伝子および同遺
伝子内に含まれる切断部位とともに、本明細書に示され
る１本発明に従って作製されたリーダーペプチド０の望
ましい態様のアミノ酸配列も、上記リーダーペプチドを
コードするＤＮＡ配列および同ＤＮＡ配列内に含まれる
制限エンドヌクレアーゼ切断部位とともに示されている
。

詳細な説明 本発明により、新しいＥＧＦ類似物質が、　ＩＧＩ’を
含む融合タンパク質として得られる。上記融合タンパク
質は、本発明により、Ｇｌｕ−特異的プロチアーゼ処理
により、ＥＧＩ’　に隣接するＧｌｕ切断部位で選択的
に切断することが可能である。

ＥＧＧ’分子には４個のＧｌｕ残基が存在するため、特
定のＧｌｕ部位での選択的切断が自明でないことは、本
分野に習熟した者には理解されるであろう。

ところが、本発明によれば、Ｇｌｕ特異的プロテアーゼ
が、ＥＧＰ分子中のＧｌｕ残基な実質的に変化させずに
、ＥＧＦのＮ末端のＧｌｕ残基で切断することが発見さ
れた０分子の特異的な折りたたみおよび前記３つのジス
ルフィド結合による立体構造的安定性により、内部のＧ
ｌｕ残基が酵素の攻撃から保護されていると考えられる
。さらに、この特異的Ｇｌｕ切断部位に隣接したアミノ
酸配列は、Ｇｌｕ−特異的プロテアーゼの加水分解によ
って切断される、優先的切断部位を与えるようＫするこ
とが可能である。例えば、　Ｇｌｕ−５、Ｇｌｕ−２５
およびｏｌｕ−４０は驚くべきことに、容易に２切断さ
れない、しかしながら、Ｇｌｕ−５１は、その位置がヒ
）ＥＧＦのＣ末端にあるため、容易に切断され得る０本
発明の望ましい形態を実施する段階で、５３および５１
個のアミノ酸残基よりなる類似物質はほぼ等ｉ産生され
るのに対し、２５および４０個のアミノ酸残基よりなる
類似物質は非常に低水準でしか産生されない。

また、上記類似物質および融合タンパク質の発現を導入
できるようなりＮＡ配列も得られるが、そのようなりＮ
Ａ配列においては、適当な発現ベクター中でＥＧＦ’構
造遺伝子が付加的アミノ酸配列をコードするＤＮＡ　　
配列および選択的開裂部位とともに読み枠内に存在する
。上記ＤＮＡ配列の発現により、ＥＧＦ’類似物質およ
び類似物質に近接した選択的Ｇｌｕ切断部位を含む融合
夕／・ンク質が得られる。

本発明によれば、さらに、適当な時間および条件でイン
キ為ベートすることＫよって、本発明の融合タンパク質
および類似物質の発現を誘導することのできる上記発現
ベクターを含む微生物も得られる。

本発明のペプチド化合物は、一般的に次の式を有するＥ
ＧＦ類似物質よりなる； Ｘ−Ｇｌｕ−ＥＧＦ （式中、Ｘは２００個のアミノ酸まで、望ましくは７５
個のアミノ酸までのリーダー配列オリゴペプチドであり
、ＥＧＦ’は一般的に約４２個のアミノ酸から約５３個
のアミノ酸をもつポリペプチド成分である任意の活性Ｅ
ＧＦ　７う／メントであるが、唯一の必要条件はそのＮ
末端アミノ酸残基でＧｌｕ残基に連結し、且つ該Ｇｌｕ
残基がリーダー配列ＸのＣ末端に結合していることであ
る。）上述の共通な構造的特徴を有する活性類似物質は
、塩基配列保存性が低い領域内でのアミノ酸置換による
多様性を考慮に入れ、本発明の記述に従って産生され得
る０本発明の範囲に含まれる化合物は、得られたペプチ
ド°化合物の活性を保存する限り、多様な方法で、上述
の化学式を修飾することにより得られる。

例えば、上記ペプチドのアミノ酸は通常り型であるが、
１個以上（通常２個以上）のアミノ酸な光学異性体り型
と置換することもできる。−！プチド化合物中に含まれ
るアミノ噴残基は、例えば、その生物学的活性に影響を
及ぼさずに上記化合物の溶解度を変化させるよう忙、ア
シル化に−よる修飾あるいは他の化学反応基と置換する
ことも可能である。

さらに、１個以上のアミノ酸残基を機能的に同等な残基
と置換することが可能である：例えば塩基性極性アミノ
酸は他の塩基性極性アミノ酸と置換可能であり、°酸性
極性アミノ酸は他の極性アミノ酸と置換可能である。し
かしながら、ある種のアミノ酸、特にシスティンの置換
は：　６−２ｏ。

１４−３１．および３３−４２のシスティン　ジスルフ
ィド結合の形成を阻害する可能性があるため、望ましく
ないと考えられる。

一般に、上記化学式中の又は、リーダーペプチドとして
表されるＮ末端の延長物であり、選択された細胞発現系
内におけるＥＧＧ’および類似物質の発現を最大にする
ように考案されている。上記リーダーペプチドは、実施
例に示されるよ５にＥＧＦ融合類似物質の精製を容易に
するよ５に工夫された。切断試薬としては、以下に示す
Ｇｌｕ切断プロテアーゼを使用する。

本発明によれば、開示された融合タンパク質中のリーダ
ーベプチｒは、全てのシスティンおよびＮ末端以外のメ
チオニンおよびＣ末端以外のグルタミン酸を排除するよ
うに考案された０本発明に従ったリーダーベプチｒの望
ましい態様のアミノ酸配列は、スタフィロコッカス・ア
ウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏａａｕａ　ａｕｒｅｕ
ａ）　Ｖ　８プロテアーゼの切断部位を与える。上記の
ように、望ましい態様は、驚くべきことに活性ＥＧＦ’
および類似物質の放出を妨げない方法によりて切断部位
を与える。

さらに１リーダーイプチド内のシスティン残基の排除に
より、活性類似物質内でジスルフィド結合が形成されて
しまう等の相互作用および阻害の可能性を防ぐことがで
きる。加えて、形質転換された細胞培養内の細胞機能の
利用度を非効率的にするような、リーダーペプチドの必
要量以上の合成を避けるために、リーダーペプチドは最
短とするべきである。

上述の型のリーダー配列チｒの現在望ましい態様の一つ
は、次の化学式によって示される二表ｌ Ｘ１ｍ　　Ｍｅｔ　Ｌｙｅ　　Ａｌａ　　１１ｅ　　Ｐ
ｈｅ　　Ｔａｘ　Ｌｅｕ　、Ｌｙｅ　　０１７’Ｓ＠ｒ
　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　
Ｓｓｒ　Ａｒｇ　ＬｅｕＡｓｐ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｔａ
ｘ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｅｌｔａ　Ｌｙｅ　Ａｓ
ｐＬ６ｕ　Ｓｅｒ　Ａｌｐ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　ＴａＩＬ
ｅｕ　ＶａＩＡｓｐ　ＬｅｕＡｈａ　Ａｒｇ　Ａａｎ　
Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　１１ｅＷａＩＴｈｒ
Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　ｗａｘ　Ａ
ｌａ　Ａｓｐ−上記リーダーＸをコードするＤＮＡの望
ましい慢様は、実施例中で示す、融合タンパク質の発現
の準備に使用されるＤＮＡ配列および構造遺伝子は、遺
伝暗号の縮重のため、同等な核酸配列によって効果的に
置換され得ることは、容易に理解されるであろう。さら
に、リーダー４プチドおよび類似物質化合物のアミノ酸
配列の多様な修飾は、り四−ン化された構造遺伝子、お
よび、類似物質および融合タンパク質の合成の誘導に使
用されるＤＮＡ配列のヌクレオチド配列中の変化により
て行なうことが可能である、上記ＤＮＡ配列の修飾には
、多様なコドンを、同じアミノ酸の合成を誘導する他の
コドンと置換することを含む、また、上述の様に１機能
的に同等である残基によって１個以上のアミノ酸残基を
置換するようなコドン置換も含まれる。

目的のＭＡ配列が選択されると、この配列は複製および
発現を可能とするような他のＤＮＡ配列と連結される。

細菌や菌類な含む微生物、あるいは酵母や確立された細
胞系等の多様な真核細胞のような細胞内で発現させるた
めの多数のベクターが入手可能である。上記ベクターを
含有可能な宿主には、大腸菌（１，ａｏｌｉ）％Ｓ、セ
レビシェ（Ｓ、ａｅｒｅｖｉｅｉａｅ）、Ｂ、サブチリ
ｘ　（Ｂ、　ａｕ’ｂｔｉｌｉａ）、哺乳動物細胞など
が含まれる。

合成りＮＡ配列を含むＤＮＡイクターの宿主内での選別
および維持を可能にするために、複製系内に少なくとも
１１のマーカーが含まれていることが一般に望ましい。

本分野では、多数のマーカーが仰られており、抗生物質
耐性、重金属耐性などが含まれる。

期待されるＥＧ１ｉ’　ＲＲ似物質を含む融合タンパク
質の構造の計画に際しては、細菌発現系内における類似
物質産生を容易にするように計画することが望ましい。

本発明によれば、リーダーベプチｒは１発現産物の安定
性および収量を増大させ。

Ｇｌｕ残基をＥＧＦへの結合部処導入することにより活
性ＥＧＦ’の切断を容易にするよ５に考案された合成ア
ミノ酸配列となるであろう０例えば、適当な融合タンパ
ク質は、細菌発現系内忙屈折体（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ
　ｂｏｄｉｅｓ）　　を形成することができ、細菌細胞
の全タンパク量の約５０％までも達することが可能であ
る。

しかしながら、上記屈折体中の融合ペプチドが適当な方
法で溶解できるよ５工夫することも必要であり、さもな
いと上記屈折体中に含まれる融合ペプチドの不溶性は期
待される生物学的活性類似物質の収量を減じさせること
がある。

発現系から融合タンパク質が得られた後、リーダーイプ
チドは融合タンパク質から除去され、生物学的活性ＥＧ
Ｆ’類似物質を生成する。いかなる切断法も採用され得
るが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙ
ｘｏｃｏｏａｕｓ　ａｕｒ＠ｕｓ）　ｖｓ　プロテアー
ゼあるいは他の選択的Ｇｌｕ切断酵素を用いて生物学的
活性ＥＧｌｉ’の最初のアミノ酸に先立つＧｌｕ残基部
分で酵素的切断を行ない得ることが、本発明の特徴であ
る。

上述の生理学的効果を有することが示される本発明の化
合物は、増進された細胞成長特性を利用する治療的応用
に使用することができるであろう。

上述のように、上記化合物はやけどおよび擦過傷などの
傷の治療、および胃潰瘍などの治療における治療薬とし
て使用することが可能である。

上記化合物は、生理学的に受は入れられる担体とともに
、家畜等に対する獣医学的使用、および、他の治療薬と
類似の方法で人間に対する臨床的使用のため、哺乳類受
容動物に対して、局所的または全身的に投与し得る。一
般に、投薬量は受容動物の単位重量あたりおよそ０．０
０１から１００岬ｌ匂の範囲になるであろう、上記範囲
内の投薬量は、効果が得られるまでに治療状態の重度に
よりて変化させつつ、１回あたりの投薬量として局所的
に使用されうる。

上記化合物は、純品として、他の薬学的に活性あるいは
不活性な物質との混合物として、あるいは例えば水ある
いは生理食塩水のような生理学的に適切な担体との混合
物として投与され得る。上記化合物は、例えば注射によ
って非経口的に役ヰされ得る。注射は、皮下注射、静脈
注射、あるいは筋肉内注射が可能である。

上記化合物は、治療上有効量を、しばしば酸付加塩のよ
うな薬学的に受容可能な塩として投与することが望まし
い、上記塩は、例えば、塩酸塩、臭化水Ｘ酸塩、リン喰
塩、硫酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、およびリンゴ酸塩な
どを含む。

本発明の化合物は、Ｓｒａされた試薬、通常は抗体、を
使用するイムノアッセイにおいて用いる抗血清のＶ＠製
にも使用し得る。都合のよいととに１本発明の化合物は
ジアルデヒド、特に４個から６個の炭素原子を有する脂
肪族ジアルデヒｒ１あるいはカルボジイミドによって抗
原と結合することができる。上記化合物および免疫試薬
は、色素源、例えばフルオレセインあるいはローダミン
のようす螢光１１！、、”’Ｉ、　”８１１４Ｃｓ　３
Ｈノヨ５す放射性同位体、あるいは、磁性粒子などの多
様な標識により、本分野で広く知られている方法によっ
て標識される。

上記標識化合物および試薬、あるいは本発明化合物を認
識し、特異的に結合可能な標識試薬は、例えば診断用試
薬として使用することが可能である０本発明の化合物と
共通の抗原決定基を有する物質の存在あるいは量につい
て、生物標本由来の試料をアッセイすることが可能であ
る。さらＫ。

本分野で既知の方法によりモノクローナル抗体を調製す
ることができ、同抗体は例えば生体内（１ｎ　ｖｉｖｏ
）　で免疫学的に関連した化合物の過剰生成を中和化す
る、などの治療的使用が可能である。

本発明の方法には、５３個のアミノ酸および５１個のア
ミノ酸よりなるＥＧＦ’を最大量産生し。

他のＯＩＵ残基での切断によって得られるような他の類
似物質を最小ｔｘ生することを可能にする、特異的切断
法が含まれる。

そのような方法の処理条件の詳細は、後記実施例におい
て型抜しい態様をもって示すが、峨述すると以下のよう
である； ＥＧＦ融合タンパク質は宿主系内での形成に続いて細胞
内に沈殿し、標準的方法を用いて分離される。望ましい
方法では、望ましくは８Ｍ尿累な用いて尿素溶解化によ
って融合タンパク質溶解上清を得、次にこれをクロマト
グラフィーカラムに吸着させ、それから適当な緩衝液ｌ
溶媒混合液により溶出させる。富裕化したＥＧＦ融合タ
ン・（り質は、次にＧｌｕ切断プロテアーゼ、最も望ま
しくはスタフィロコッカス・アウレウス”１８−１０テ
アーゼ（マイルス・ラボラトリーズ社から適当な形態で
入手可能である）によっ℃処理する。酵素一度は、５３
および５１アミノｒｆｉＥＧＦを最大量そして他の類似
物質を最小１得るようにするため非常に重要である。適
当な酵素：基質比が１：ＳＯＯから１　：　１０，００
０の間が適するが％　１：１．０００が最良の結果を得
る。

加水分解は通常８−１５時間行ない、最も望ましくはＩ
　Ｏ−１２時間３２℃から４０’Ｃに高めた温度、最も
望ましくは３７℃で行なう。

本発明の詳細をより完全に説明するため、実施例を以下
に示す。

実施例（組み換えＤＮＡ標準法） 本分野の関係者は、ベクター作製、形質転換、ＤＮＡ塩
基配列決定、プローブ技術、部位特異的ミ為−タジェネ
シスなどの一投的技術には精通しているであろう、上記
技術の多くは、マニアティス（Ｍａｒｉａｔｉａ）他著
、１モレキエラー・クローニング（ＭＯｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ）−コールドＱスプリング・ハーノζ
−・プレスのような一般的研究手引書に記述されている
。

しかしながら、便宜のため、本発明の実行に有用な条件
を以下に提起する。以下に述べる実施例からも見られる
ように、これらの方法の改変あるいはこれらに代わる方
法もしばしば用いられる。

プラスミド、ファージ、ｃＤＮＡまたはベクターにクロ
ーン化された合成フラグメント由来のＤＮＡ配列は、現
在一般的な技術により操作することができる。一般的に
、ＤＮＡ配列は、市販品として入手可能な制限酵素（Ｒ
，Ｅ、）によりて切断される。

ｐＨｓ時間、温度、酵素濃度などの切断条件は、一般に
は製造業者によって指定されている。各々のインキエベ
ーシヲン後、タンパク質は、例えばフェノール／クロロ
ホルムを用いた抽出によって徐去し、核酸分画はエタノ
ール沈、殴（（より回収される。切断断片のサイズによ
る分離は、′メソッズ・イン拳エンザイモロＩ　−（Ｍ
ｅｔｈｏａａ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）’、（１９
８０）６５：４９９−５６０に記述されている標準的な
アガロースゲルあるいはポリアクリルアミドゲル電気泳
動法によって行なわれる。断片をプラント端にすること
が望まれる場合には、４種のデオキシヌクレオチド３リ
ン酸（ａＮＴＰａ）　　（Ｏ存在下で、ａｍで３０分間
、５０μ！ｌのｄＮＴＰ　ｔｓ中において大腸菌（Ｅ、
、　ｃｏｌｉ）Ｄ１１ｉＡポリメラーゼＩ（クレノー断
片）によって処理することＫより行なわれる。粘着端の
埋め込み（ｒｌｎ−ｔｎ）　　の程度は、もちろん、ａ
ＮＴＰｓ　の適当な選択によって制御される。適当な条
件下でのＳエヌクレアーゼ処理により、一本鎖部分が除
去される。連結反応は、製造業者によって推奨される条
件下で、トリス緩衝液中ｐａ　７．ｓで、Ｔ８７ＤＮＡ
ライゲースにより行なわれる。

意図されたＤＮＡ配列が構成されたことを確認するため
には、大腸菌あるいは他の適当な宿主を形ｆＸ転遺し、
適当な抗生物質耐性あるいは他のマーカかを用いて、成
功したｔ形質転換体を選択し、　ｌ形質転換由来のプラ
スミドを分析することにより、例えは、クレウ：ｔ　Ａ
／　（Ｃｌｓｗｓｓｌｌ）他、Ｐｒｏｃ、　１ａｔ１゜
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、　（１９７０）　、
　７４　：　５４６３の方法、さらに詳しく述べられた
、メッシング（Ｍｅｓ＆＃ｉｎｇ）他、　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８１）Ｃ９：３０９
の方法、あるいは、マクサＡ　（Ｍａｘａｍ）他、Ｍｅ
ｔｈｏａｓ　ｚｎ　Ｅｉｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９８
０）　ｅ　６５　：４９９の方法によって確認した。

大腸菌あるいは他の原核生轡へのＤＮＡはフタ−のトラ
ンスフェクシ菅ンは、コーエン（Ｃｏｈ８ｎ）。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｘ、　Ａｃａｄ、　Ｓａｔ、　ＵＳ
Ａ　（１９７２）　。

６９：１１０に述べられているように行なった；哺乳動
物細胞に対しては、形質転換は、グラハム（Ｇｒａｈａ
ｍ　）および７７ン・プアーｘプ（’ＶＢｎ　ｄｅｒＩ
Ｅｂ）　、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９７Ｂ　）　、　
５２　：　５４６の方法によった。

上に挙げた方法以外の方法および改良法も行なわれ得る
が、上に概略を述べた方法が、本発明で有効な方法の特
徴を示している。

ＩＧＩ’融合類似物質なコードする、本発明のＤＮＡ断
片は、望みのタンパク質を産生ずるために、種々の発現
系に於いて使用され得る。宿主として原核生物系では大
腸菌が最も一般的に使用されているが、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）　、　シｚ−ト９モナス（Ｐ６ｅｕａｏ
ｍｏｎａｓ　）、あるいは他のダラム陽性菌あるいはダ
ラム陰性菌原核生物も使用可能である。原核動物宿主を
用いる場合には、上記宿主と適合し得る、実施可能な制
御系を本発明のＤＮＡ断片と連結し、細菌宿主細胞内で
複製可能な適当な転移ベクター上に組み込む、複製可能
なバックボーンとなるベクターは、本分野で仰られてい
るように、ファージベクターおよびグラスミｒはフタ−
を含む。標準的なプラスミドベクターは、ｐＢＲ３２２
由来のものおよびｐＵＣ系統のものを含む。シャロンラ
ムダファージは、しばしば使用されるファージベクター
である。制御配列はプロそ一ターおよびリポソーム結合
部位をｗ−）１１する配列を必須的に含み、は−ターラ
クタマーゼ（イエシリナーゼ）とラクトース（１ａＣ）
プロ蕃−ター系。

シャンク（Ｃｈａｎｇ）他、Ｎａｔｕｒｅ　（１９，７
７）　、　１９８：１０６、およびトリプトファン（ｆ
ｔｐ）プロモーター系、ゲデル（Ｇｏａｄｄｅｄ　）他
、　Ｎｕｃｌｅｔｃ　Ａｃ１ｄｓ旦シ■（１９８０）、
８：４０５７のよ５な、多様な制御系が、本分野で使用
可能である。ｔｙｐおよび１ａＯプロモーター系の双方
の要素を含む複合プロモーターも本分野で使用可能モあ
る。

真核微生物も発現に使用され、最も一般的には、パン酵
母・サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙａｅｓ　ａｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　　の研究用株が用
いられる。解糖系酵素合成のプロモーターである制御系
、ヘス（Ｈｅｌｓ）他、　Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍ
ｅＲａｇ、（１９６８）、７：１４９；ホラｙ　）”　
（ＥＩｏｘｌａｎａ）他、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　（１９７８）　、　１７　：　４９００％を含む、多
数の酵母制御系およびベクターが入手可能である。２ミ
クロン複製起点を使用する酵母ベクターが、転移ベクタ
ーとして適切である゛（例えば、プローチ（Ｂｒｏａｃ
ｈ）　、　Ｍｓｔｈ　Ｅｎｚｙｍ、（１９８２）＊１０
１：３０７参照）。

哺乳動物あるいは他の高等生物由来の不死化された細胞
系を用いた組織培養細胞も、組み換え宿主として使用さ
れている。上記細胞系には、チャ、イエーズ・ハムスタ
ー卵巣細胞（ＣＨＯ）、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｓＬａ細胞、
およびＣＯＯ細抱が含まれる。一般的に、　ＣＨＯ細胞
がトランスホームされたＤＩＩＴＡを染色体中に統合す
る代表的なものであるのに対し、Ｃｏ５Ｉｖｌ！ＩＩ胞
系は一時的な発現に使用される。適切な哺乳動物ベクタ
ーは、一般的にウィルスの複製起点および制御配列ｆに
基づいている。最も一般的に使用されるのは、シミアン
ウィルス４０（ｓｖ４ｔ）　）プロモーターおよびレプ
リコン（フィアース（１’１ｅｒｓ）他、Ｎａｔｕｒｅ
（１９７８）　、　２７３：１１３）およびアデノウィ
ルス２　（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓ　２）。

ウシパｌ　ロマウイルス（ｂｏｖｉｎ＠ｐａｐｉｌｌｏ
ｍａ　ｖｉｒｕｓ）。

あるいはトリザルコーマウィルス（ａマｉａｎ　ｓａｒ
ｃｏｍａｖｉｒｕｓ）由来の同様の系である。

微生物系を作製する過程およびＥＧＦ’　産生のために
使用される生化学的方法を以下に述べる。以下に示す方
法の特徴は、他のＥＧＦ　Ｍ供物質および他の種由来の
ＥＧＦの合成、および、特にｗ　）　ＥＧＦの合成に適
用できる。

１、　　ＤＮＡ合成および遺伝子連結 所望のヒ）　ＫＧＦおよび類似物質の発現をコード可能
なりＮＡ配列、あるいは上記ポリペプチドを含む融合タ
ン・セフ質を構成するために、例えば、フレア（Ｃｒｅ
ａ　）およびホ／Ｉ／　ｙ　（Ｈｏｒｎ）　；　Ｎｕｃ
ｘｅｌｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、８：２３３１−２３４
８（１９８０）に記述されたような固相ホスホトリエス
テル法、あるいは、ビニ−ケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）
およびカルタース（ｃａｒｕｔｈｅｒａ）　、　Ｔｅｔ
？ａｈｅｌｒｏｎＬｅｔｔｅｒａ、２２：１８５９−１
８６２に述べられたような、ホスフェイトトリエステル
法を用いた自動イーシステムによって、オリ！ヌクレオ
チド°ヲ化学的に合成する。

遺伝子合成のために用いられるオリＩヌクレオチｒは、
多様な長さを有するが、一般的には１１かう１５ヌクレ
オチドの範囲である。二本＠　ＤＮＡ配列を作製するた
めに、オリＩヌクレオチドのあるものは、二本鎖ＤＮＡ
の上側の鎖を含み、他のものは下方の鎖を含む、各々の
オリビヌクレオチドのある部分は、他のオリＩヌクレオ
チｒの相補的領域とオーバーラツプし、水素結合により
て。

対応する断片との相補性により自己会合を促進すること
が望ましい、上記方法により会合すると、二本鎖配列は
、例えば、ＤＮＡ　　リガーゼを用いて。

連結によって完全にすることが可能である。

望みのヒ）ＥＧＦあるいは融合タンパク質の構造遺伝子
および発現な；−ドするＤＮＡ配列が発現ベクターに挿
入されるべき場所では、遺伝子あるいはＤＮＡ配列は、
嘗開始１コドン、例えば、ＡＴＧの後にあり、１個以上
の終止コドンが直後に続く、ここにさらに詳述するよう
に、融合タンパク質のアミノ酸配列は発現され、ｋ）Ｋ
ＧＦ　Ｋ隣接した、望ましくはヒトＥＧＦのＮ末端ある
いはＮ末端近傍の、タンパク質切断部位を与える。

上記切断部位は、リーダーペプチドとＥＧＦ類似物質間
の選択性切断部位を規定する適当なコドンに：ｒ−ドさ
れる。

望ましいヒ）ＥＧＦ態様の構造遺伝子を構成するために
、会合した際に、ヒ）　ＥＧＦ遺伝子を与えるような、
以下の２６オリＩヌクレオチドが作製された： １　：　　　ＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＣＴ２：　　　ＣＴ
ＧＡＣＩＩ’ＣＴＧＡＡＴＧ３：　　　ＣＣＣＧＣＴＧ
ＡＧＣＣＡＣ４：　　　ＧＡＣＧＧＣＴＡＣＴＧＣＣ７
：　　　ＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡ１３：　　ＴＧＧ
ＧＡＡＣＴＧＣＧＴ１’ＡＧ１４：　　ＧＡＴＣＣＴＡ
ＡＣＧＣＡ １５：　　ＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＴＴ１８：　　ＣＧ
ＡＴＧＴＡＧＣＣＴＡＣ１９：　　ＡＡＣＧＧＡＧＴＴ
ＧＣＡＴ２０：　　ＧＣＧＴＡＴＴＴＧＴＣＣＡ２６：
　　ＧＡＧＴＣＡＧＴＴＣＡＴＧ上記配列は、−投的に
、フレア（Ｃ１ｅａ　）およびホルン（Ｈｏｒｎ）（１
９８０）に述べられた、ホスホトリエステル法を用いて
セルロース支持体上でジヌクレオチｒＫ薬から作製され
た。

さらに、リーダーベプナＦ’ＸＩおよびｘ２、Ｔｒｐプ
四モーターを含み、そして本発明のヒトＥＧＦ’遺伝子
を含む融合ペプチド遺伝子は、オリゴヌクレオチド断片
の合成および連結忙よって作製される。上記ＤＮＡ　　
の配列は、以下の表２．＠３．および表４に示される。

ｌｌ−１ （表　３） リーダーはプチドｘ−２ 本　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　２０
　　　　　　　　　３０　　　　　　　　　　　　４Ｏ
Ｎ１ａＩＩＩ　　　　　　　　　　　ＢｂｖＩＤｄｅＩ
ＳｔｙＩ　　　　　　　　　　　　　Ｆｎｕ４ＨＩＳｆ
ａＮＩＡ１ｕＩ　　　　　　　ＳｒａＮＩＢｇＩＩより
ｂｖＩＤｄｅＩ　　　　　　　　　　　５ａｕ３ＡＦｎ
ｕ４ＨＩ　　　　　　　　　　　　ＸｈｏＩ工本ＣＧは
ｔａｑ　Ｉ部位の粘着端である。同部位は、ヘリックス
を合成ｔｒｐプロモーターのｔａｑ　Ｉ（ｃｘａＩ部位
）と連結させるために使用された。

（表　４） Ｂａｎ工Ｉ ｇｉＡＩ ａｃ１ Ａ（７Ｉ’ＡＧＴＴＡＡＧＴＡＧＴＡｃＧＯＡＡＧＴＴ
Ｃ；ＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＳｐｅＩ
ＨｌｎｃＩＩ　　ＲｓａＩ　　　　　ＭａｅＩエ　　　
　Ｃ１１ａＩ上記オリゴヌクレオチドを除いては、遺伝
子合成に使用される他のＤＮＡ断片は、アルバラｒ−ウ
ルビナ（Ａ’１ｖａｒａｄ−Ｕｒｂｉｎａ　）他、５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　２１４　：２７０−２７４（１９８１）
　　の自動化段階的付加法を用いて、ジイソプロピルホ
スホルアミダイト（ｄｉ　ｉａＯｐｒＯｐ７１ｐｈＯａ
ｐｈＯｒａｍｉｃＬｉｔｅ）　　から合成された。

例えば　Ｓ／、（ジメトキシトリチル）−２７−ゾオキ
シヌクレオチ）”（１ｍモル）を、１５Ｗｔｌの無水ア
セトニトリル、０．６ｄの乾燥２／、６／−ロイチジン
、および０．２　ｄのりｐ口（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル
アミノ）メトキシホスフィンを含む反応混合液中で、対
応するジイソプロピルホスホルアミダイト誘導体に転換
した。１５分振盪後、上記反応液に３０ａｌの７１１９
７ｄｌＨ−テトラゾールｌアセトニトリル溶液を加えた
。得られた活性化ホスホルアさダイト誘導体は、シリカ
誘導支持体（アルパ２ｒ−ウルビナ（Ａｌｖａｒａｄｏ
−Ｕｒｂｉｎａ　）　　他、１９８１）上でのオリゴヌ
クレオチド合成に使用された。典型的な付加サイクルは
、次の過程からなる。（ａ）　　ホスホルアきダイト誘
導体の添加（１分）、（ｔｌ）　　液流停止（１分）、
（ｃ）　　テトラヒドロフラン−ピリジン−水（３：１
：ｌｖ／ｖ）中の１％ヨウ素溶液の添加（３０秒）、（
ａｔ　　ピリジン洗浄（１，５分）、（６）　　メチン
）ロライド洗浄（１シ分）、（ｆ）　　メチレンク四う
イド中の３％）リクロロ酢酸溶液（Ｖ／マ）になる洗浄
（１，５分）　ｓ　（ｇｌ　　メチレンクロライド洗浄
（１，５分）、モして帆）　アセトニトリル洗浄（２分
）、流速は、サイクル全過程でｓｔａ１ｍｙ維持した。

合成の完了後、オリゴヌクレオチドをジオキサン−トリ
エチルアミン−チオフェノール（２：１：　Ｉ　Ｖ／Ｖ
）で４５分間室温で処理し、次に濃アン七ニアで一晩５
５℃で処理した。得られた混合液中から、キーイルゲル
６０プレート（アルパラｒ−ウルビナ他、１９８１）上
の薄層り四マトダラフィーによりて精製した。最終腫物
の純度およびサイズは、以前に記述されている（フレア
（Ｃｒｅａ）’他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓａｄ、　ＵＳＡ、　７５　：　５７５５−５７５
９．１９７８）　　ポリアクリルアミド９ゲル上の電気
泳動分析によって確認した。

遺伝子の連結 前記２から１３および１５から２６のオリゴヌクレオチ
ドを、オリゴヌクレオチド（各々１．２μｇ）。

１ｍＭ　　ＡＴＪ’？、Ｔ４．−ポ’）　ｆｆ　／　Ｌ
／＃？　ｒ−１−−−ｔ／　（１，２ユニツト／／Ｊｔ
ＤＮＡ、）、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、５ｍＭジチオスレ
イトールおよび７０ｍＭ　　）リス−塩酸ｐＨ７，６を
含む反応混合液中で、３７℃で１時間ホリヌクレオチド
キナーゼでリン酸化した。

オリゴヌクレオチド１から２６の連結反応は。

０．７５　ｍＭ　ＡＴＰ、　Ｔ４　　ＤＮＡ　　ＩＪガ
ーゼ（１，５ユ＝ット／μｇ　　ＤＮＡ）、１０　ｍＭ
　Ｍ　ｇ　Ｇ　Ｑ２．２０　Ｚ（ｌ　Ｍ　　ジチオスレ
イトール、５０μ９／ｌｈｌ　Ｂ５Ａ１５０ｍＭ　）リ
スーＨＯｌ、ｐＨ７，８Ｙ含む反応混合液中で、１５℃
２時間行な５つた。ＤＮＡ断片は、マニアティス（Ｍａ
ｎｉｓｔｉｓ）他、Ｐｒｏａ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｉｃ、。

Ｕ、Ｓ、Ａ、７２：１１８４−１１８８（１９７５）　
　に述べられている、トリス−ホウ虐−ＥＤＴＡ緩衝液
系における８％（Ｗ／Ｖ　）　　ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離した０期待された分子量の位置に
移動したバンドをゲルから切り出し、電気溶出を行なっ
た（マニアティスら、１９８２）、溶出されたＤＮＡは
真空下で乾燥させ、２００μ宛の０．２Ｍ６酸ナトリウ
ム、ｐＨｓ　に再懸濁した。試料は等容の７エノールお
よびクロロホルムで２回抽出し、上記ＤＮＡは２．５容
の無水エタノールで沈殿させた。精製された遺伝子断片
はｓ　　１ｍＭ）９ｘ−ＨＯｌおよび０．１　ｍＭ　Ｋ
ＤＴＡ、　ｐＨ７，５中で４℃で保存した。

ヒトＥＧＦ遺伝子の増幅およびクローニング合成ヒトＥ
ＧＦ遺伝子を、　＃ｔＪｃｓ　（ヴイエラ（Ｖｔｅｒａ
　）　　およびメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、　Ｇｅ
ｎｅ。

１９：２５９−２６８．（１９８２））のＥｔｏＲ工　
およびＢａｍＨＩ部位に挿入した１合成ヒトＥＧＦ　Ｄ
ＮＡ（３０ｎ９）およびｐＵｃ　ｓのＥｃｏＲ工／Ｂａ
ｍＨＩ大断片（１００ｎ９）を混合し、Ｔ４ＤＮＡＩＪ
ガーゼで処理した。上記連結混合液は、コンピテントな
大腸菌Ｋ　１２　ＵＴ４８１　細胞の形質転換に使用し
た。コンピテント細胞は、エネア（Ｅｎ・ａ）他、　Ｊ
、　Ｍｏｌ。

Ｂｔｏｌ、、９６：４９５−５０９．（１９７５）に示
された低ｐＨ法を用いて調製した。形質転換体は、２５
μｆｊ／ｄ　　アンピシリンを含むＮＺＣＹＭアガープ
レート（マニアティス他、１９８２）上にまくことによ
り、選択した。プラスミドは、マニアティスら（１９Ｂ
２）に記述されているような、ビルンポイム（Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ）　　およびドーリ−（Ｄｏｘｙｊ。

Ｎｕｃｌａｉａ　Ａａｔａｓ　Ｒｅθ、、７：１５１３
−１５２３（１９７９）の方法の改良法を用いて、形質
転換細菌の小規模培養液から単離した。精製されたプラ
スミドは、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ切断および、ひ
き続くポリアクリルアミドゲル電気泳動により、１７０
塩基対ＥＧＦ遺伝子挿入物の存在についてスクリーニン
グを行なった。ヒ）ＥＧＦ挿入物を含むプラスミｒの大
量調製は、ビルンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）とドー（
リー（Ｄｏｘｙ）の７／Ｉ／カリ融解法（１９７９）を
用いて行なりた。

クローン化したヒトＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列を、ジデ
オキシヌクレオチド９チエーンターミネーシ璽ン法（サ
ンガー（Ｓａｎｇｅｒ）他、ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｘ。

ＡＯａ（１，Ｓａｉ、　ＵＳＡ、　７４：　５４６３−
５４６７゜１９７７；７．＋）　　によりて決定した。

ヒトＥＧＦ遺伝子を含むｐａｃ８　プラスミド’１Ｅｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、遺伝子挿入物をゲル
電気泳動により精製しり、ヒトＥＧＦ遺伝子は、Ｍ１３
　　ｍｐｒｏｗ　およびｍｐＨｗ　　にニー・イングラ
ンド・ノ２イオラプズ・メッシング、　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　Ｅｎｍｙｍｏｌ、　、　１０１　：２０−７８．１９
８３）のＥａｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入された
。単鎖鋳型Ｍ１３を、シェライヤー　（Ｓｃｈｒｅｉａ
ｒ）およびコルテース（Ｇｏｒｔａａｅ）。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１２９　：　１６９−１
７２（１９７９）の方法により調製した。

リーダーＲプチト”１＊Ｘ２　および合成Ｔｒｐ　　プ
ロモーター（表２−４）は、化学的に合成した断片の薄
葉的連結反応により作製し、プラスミドｐＵｏ　　８に
り四−ン化し、増幅させて上記ヒトＥＧＦ遺伝子につい
て述べたものと同様な方法により塩基配列を決定した。

全ての合成遺伝子を、ＥＧＦ遺伝子の合成について報告
されたものと等しい条件下で、ＤＮＡ　＋）ガーゼによ
りてオリゴヌクレオチドから調製した。

リーダーＸ−１に対応する遺伝子は、５′端および３′
端にそれぞれＴａｑＩおよびＢａ　ｍＨＩ制限エンドヌ
クレアーゼ切断部位に対応する粘着端を有するように作
製された（表２参照）、リーダーＸ−２に対応する遺伝
子は、ＴａｑＩおよびＢｇｌｌ粘着端を有するように作
製された（表３）、さらに、トリプトファン（ＴＲＰ）
　　プロモーターに対応する合成遺伝子は、オリ！ヌク
レオチドから計画され、調製された０本遺伝子はＳａｃ
工およびＣ１ａＩ粘着端を有するように作製された（表
４参照）。

ＫＧＦ合成遺伝子のＮ末端を修飾し、スタフイルコツカ
ス・プロシラスｖ８プロテアーゼによる特異的酵素切断
に必要なグルタミン残基のコドンを導入した。

上記目的を達成するために、ｐＵｃｅ　にクローン化さ
れたＥＧＦ遺伝子をＨｌｎｆＩ−Ｈｌｎａ　ｍ断片とし
て回収した。ＨｌｎｆＩは遺伝子のＮ末端に隣接して存
在する部位であり、　Ｈｌｎｄｌｌは合成遺伝子の３′
端のＢａｍＨＩ部位の下流に存在する部位である。

プラスミ１’ｐｔＪｃ１３０ＸＴは、非常に多数の制限
酵素切断部位を与えるために考案ｉれた。プラスミドの
詳細およびその構成を以下に述べる６本プラスミドを制
限酵素ＢｇｘｌｌおよびＨｌｎｄｌｌで切断して粘着端
の対応対を形成させた。　ＥＧＦ、断片とプラスミドは
、塩基配列が以下に示すような合成断片の助けにより３
断片連結反応忙より連結した： ダＧＡＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＭＣＴＣＴ　Ｇ　３’ＡＣ
ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＡＧＡ　ＣＴＣＡＢｇｘ　Ｉ　　　　
　　　　　　　　　　　ＨｔｎｒＩ上記断片は、ＥＧＦ
遺伝子のＮ末端を再構成し、ＥＧＦの最初のアミノ酸の
直前にグルタミン残基のコドンを置くことになる。この
新しいＧｌｕ−ＫＧＦ遺伝子は、融合ＥＧＦ類似物質を
生成するために作製された発現ベクターへの挿入に使用
され、以下に記述する。

ｔ＋ｅ”：Ｌ−ニバーサル　クローニングベクターｐｏ
ｃ　１３０ＸＴの構成 より多数の制限酵素切断部位を有する利点を持つ、新し
いクローニングベクターを作製する開始プラスミドとし
てプラスミドｐＵＯ８が使用された。

これによりｐＵＧ８を非常に適応性のあるクロー二ング
イクターとする＊　ｐＵｃ８をＰｖｕ［で切断し、ポリ
リンカーＤＮＡを含むＤＮＡ断片を除去した。

この断片は、市販品として入手可能な二本鎖Ｍ１３ベク
ター％＊ｌ　３−ＴＧＩ３０、アマ−ジャム）から得ら
れ、より多数の制限酵素切断部位を含む、対応するＰｖ
ｕｌｌ断片と直換した。青いコロニーを選択し、新しい
マルチリンカ−ＤＮｉは制限酵素分析により【確認した
。上記プラスミｒをＥｃｏＲ工およびＫｐｎＩで切断し
、切断された断片を０１ａＸ。

５ｐｈＩ　、およびＮａ１Ｉの制限酵素切断部位を含む
合成断片で置換することにより、さらに修飾した。

上記修飾は、ＬａＯ領域の読み枠を変化させないので、
新しいプラスミドは生成される青色の表現型に基づいて
選択し得る。本プラスミドをｐＵＣ１３０ＸＴ　と名付
けた。

合成ＴＲＰプ１２％−ターを、　５ａａＩおよびＣ１ａ
Ｉで切断したｐ［Ｊｃｉａｏｘ’ｒ　にクローニングし
た。続いて、Ｔａｑ］：およびｒ３ｇｌｌ［（あるいは
ＢａｍＨＩ、表２および表３参照）切断部位を有するリ
ーダーペプチド遺伝子を、同様の方法を用いてＴＲＰプ
ロモーターの０１ａ工およびＢａｍＨＩ部位に融合させ
た。

（ｂｇｌｎｌ　／　ｂａｎ　／％イブリッド部位は、Ｘ
ｈｏｌ［あるいは５ａｕ３Ａによって切断され得る）、
上記構造物を他の発現プラスミドに転移させるために、
リーダー配列に隣接する合成ＴＲＰプロモーターを含む
断片を、二ンｒヌクレアーゼＳｍａ工およびＰｓｄで切
断することにより単離する。　Ｓｗａｍ部位はプロモー
ターの上流に存在し、　ＰｓｔＩ部位は２つのリーダー
ペプチドのＣ末端の下流に存在する。

ｄ、融合ＥＧＦ類似物質の発現ベクターの作製効果的な
発現ベクターを作製するために、プロシラス（Ｂｒｏａ
ｉｕｓ　）らによりて開発されたプラスミドｐＫＫ　２
２３−３が選択された。このプラスミドは元来のＰａｔ
Ｉ部位が破壊された部位１１ＣＡｍｐ耐性遺伝子を有す
る。このプラスミｒはテトラサイクリン感受性である６
本発明者らは、この不完全なＴ・を遺伝子を、ｐＢＲ３
２２由来の完全で機能的な遺伝子と置換した。　Ｓｍａ
Ｉ　（ＡｖａＩ）部位がＥｃｏＲ１部位に隣接して存在
するポリリンカーをＥｃ　ｏＲＩ部位に含むｐＢＲ３２
２訪導プラスミド由来ノＡｖａＩ断片を、ｐＫＫ２２３
−３由来の対応するＡｖａＩ断片との置換に使用した。

本発明者らは、Ｔｓｔ遺伝子を反時計回りの方向に持つ
プラスミドを選択した。上記Ｔθを耐性プラスミドをＳ
ｍａＩおよびＰｓｔＩで切断し、リーダーＸ−１および
Ｘ−２にそれぞれ隣接するＴＲＰプロモーターを含む。

ｐｏｃ　１３０ＸＴから得られる５ｒｎａＩ−ＰａｔＩ
断片に連結した。最後に、このプラスミドをＢｇ１１消
化（あるいは部分的Ｂａｍ消化）およびＰｓｔＩで切断
し、ＧｌｕＪＣＧＦ　遺伝子と連結し、ＴＲＰプロモー
ター、およびグルタミン残基を介してヒ）ＥＧＦ　と融
合している２つのリーダーペプチドのいずれかを含む完
全なプラスミドを生成した。こうして得られた２つの発
現プラスミド、　ｐＥＧＦＸＩおよびｐＥＧＦＸ２は、
　Ｔｅｔ遺伝子を有するので、コンピテント大腸菌細胞
の形質転換に使用し、Ｔθを耐性形質転換体をスクリー
ニングすることが可能である。

発現プラスミドｐＥＧＦＸｌおよびｐｇＧＦｘ２を、標
準的条件下で大腸＠ＪＭ８３株の形質転換に使用した６
組み換えプラスミ）Ｉを有する形質転換株は、２０１１
３Ｐ／ｆｉ　　Ｌ−）ワットファンを含むＭ９培地（ミ
Ｇｅｎｅｔｉｃｅ、コールド・スプリング嚇ハーバ−２
１９７２）中で選択し、培養した。上記細胞は１５ｇ１
ｆｔのグルコースおよび１５９／Ｊ！カザミノ酸を添加
し富裕化したｌＯリットル容量のファーメンタ−中のＭ
９培地１０リットルに植えつけ、およそ４０　Ｏｒｐｍ
で攪拌した。全ての発酵は、３７℃、ｐＨ７，０，１分
間あたりＬｏｔの通気速度で行なりた。

融合タンパク質の単離および精製 ＥＧＦ融合タンパク質は、その合成後宿主細胞中で析出
した。これら明屈折体（ｌｉｇｈｔ　ｒｅｆｒａｃｔｉ
ｌｅｂｏｄｙ）　　を他の細胞物質から選択的に可溶化
して、基本的に８０％産物濃密化を与える。全ての過程
は４℃で行なう、細胞ペーストは２５ｍＭ）リス、１０
ｍＭ　　ＫＤＴＡ、ｐＨ８，０（１０ｗ１／を細胞ペー
スト）に懸濁し、リゾチームＣ１１１１１／９細胞４−
スト）（シグマ・ケミカル社）で処理し、３０分間攪拌
する。′ａ濁液を、間に５分間冷却時間をおいて、３分
間３＠の超音波処理を行なう（フィッシャー・ソニック
・ディスメンプレーターモデル３００．６０％にセット
）、得られたｙ＃、ｒｉｊ液は１７．ＯＯＯｒｐｍ　で
２０分間遠心する（ベックマン・インストルメンツ、モ
デルＪ２−２１Ｍ、ＪＡ−１７０−ター）。

ベレットは同じ緩衝液に再懸濁し、３０秒間ホモジナイ
ズした（デ、−ポン・オムニミキサー・七デル１７１０
５、＄４にセット）、得られたホモジナイズは、以降の
遠心は１５分間であることを除いては前述のように遠心
する。ベレットは同じ緩衝液の９５％容量罠再懸濁し、
上述のようにホそジナイズした。混合後、適当な濃度の
トリトンＸ−１００を加え、最終界面活性剤湯度が１−
となるよ５に懸濁する。懸濁液は３０分間攪拌し、上述
のように遠心する。得られたベレットは希釈した緩衝液
（２，５ｍＭ　　トリス、１．０Ｍ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ
８，０）Ｋ再懸濁させ、ホモジナイズし、上述のように
遠心する。得られたベレットは８Ｍ尿素を含む希釈した
緩衝液に再懸濁しく５＠ｌ経衝液／９細胞ペースト）、
上述のようにホモジナイズし、遠心する。全【の上清を
、１５％ｓｎｓポリアクリルアミｒゲル電気泳劫によっ
て融合タンパク質の存在を調べる。遠心に続いて、産物
に富んだ上清を、　ＤＥＡＥ−５２クロマトグラフィー
カラム（ワットマン・ケミカルズ）にかける、カラムの
大きさは、処理する試料量によって決定される。カラム
はスラリー状で充てんし、２．５ｍＭ）リス、１．Ｏｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ、　６Ｍ尿素、ｐＨ８，０で平衡化する。

タンパク質は連続的壇勾配（０−２５０ｍ１Ｊ　　Ｎａ
０党）で溶出する。カラム分画は、２８０ｎｍ　で分光
光学的に追跡し、分画アリコートを１５％５ＤｓＰＡＧ
　Ｅに流す０次に、ＥＧＦ　１ｌｌ１合タンパク質を含
む分画をプールし、タンパク分解段階で使用した緩衝液
（１００ｍＭ　　酢酸アンモニウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ
。

ｐＨ７，８）を数回変臭して透析する。透析後のタン／
々り質濃度は、ＵＶスキャンにより決定する。　Ｉｉ：
ＣＦ融合タンパク質は、逆相０１Ｓカラム（４，６ｍＸ
　２５０■、ビダック）を用いてＨＰＬＣ：により決定
したところ、約９５％純粋である。タンパク買は、連続
的勾配（緩衝液Ａは０．０５　％　　ＴＦＡ／Ｈ２０；
　　緩衝液Ｂは０．０３５％ＴＦＡ　／アセトニトリル
、ｐＨ２）によりて溶出する。次処、富裕化されたＥＧ
Ｆ融合タンｔＺりを、スタフィロコッカス・アウレウス
ｖ８プロテアーゼ（マイルス・ラボラトリーズ）を用い
、酵素：基質比を１：１０００として、１２時間３７℃
で処理する。＃素切断後の産物は、逆相０１８クロマト
グラフイーな用いて、連続的勾配（謹賀液Ａは１０ｍＭ
　　リン酸ナトリウム、ｐＨ６，２；　緩衝液Ｂはアセ
トニトリル）で精製スル。

１−５３および１−５１類似物買がほぼ等量得られる。

アミノ酸分析 全ての化合物および溶媒はＨＰＬＣグレード（Ｊ、Ｔ。

はイカ−・ケミカル社／ＶＷＲサイエンティフィック）
である、アミノ酸組成分析用試料は、真空中、０．２ｄ
の常に沸騰した６ＮＨＣ１（ピアス・ケミカル社）中で
２４時間１１０℃加水分解した。加水分解に続いて、水
酸化ナトリウムベレット上、真空デシケータ−内で試料
を乾燥させ、およそ１１００ｐ／２０μｌ　の濃度にＨ
ＰＬＣグレードの水に溶解した。完全自動化決は、ジ嘗
−ンズ（Ｈ，Ｊｏｎｅｓ）他（Ｊ、　Ｌｉｑｕｌ　、Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇ、　４（４）　：　５６５−５９６゜
１９８１）　　に述べられた、０ＰＡ（ｏ−７タルアル
デヒｐ）によるプレーカラム誘導法の応用である。０Ｐ
Ａ（フルオロパ：ピアス　ケミカル社）は、以下のよう
に調製する：１００ηＯＰＡを２．０　ｄのメタノール
に溶解し、次に、２９．Ｑａｊの０．４Ｍホウ酸ナナト
リウムｐＨ９，５（四ホウ駿ナトリウムから調製）Ｓお
よび、１００μｍの２−メルカプトエタノール（バイオ
−ランド・ラボラトリーズ）を添加する。

使用溶液は、７５０μｌの上記ＯＰＡ　ストックを３．
２５ｍｊホウ酸緩衝液で当日新たに希釈することにより
調製する。同じく当日新しく調製される、アミノ酸標隼
液は、ＨＰＬＣグレードの水で、Ｚｏ。

ｐｍ　／　２０μＬ注入の濃度に希釈する。

アミノ酸配列決定は、気相シークエンサー（アプライｒ
・）２イオシステムモデル４７０Ａ）で、標準的手法を
用いて、自動化エドマン分解法により行なった。ＥＧＦ
を＃素の基質に対する比が１：１０（ｗ／ｗ）　　とな
るようにして、トリプシン分解し、得られた堅ブチｒを
ＨＰＬＣで分離し、自動化配列分析により、ＥＧＦ５３
および５１の産生を確認するために固定した。

下朦を施した残基は全て直接配列分析により同定された
。Ｃｙｓは配列分析後標準的化学的方法により決定する
。

上皮成長因子（ＫＧＦ）のレセプター結合アッセイ５３
アミノ酸ＥＧＦおよび５１アミノ酸ＫＧＦの生物学的活
性は、上皮細胞上のレセプターへの結合を測定する競合
ラジオメトリックアッセイを用いて定量した。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式： Ｘ−Ｇｌｕ−ＥＧＦ （式中、Ｘはアミノ酸２００個までのリーダー配列オリ
   ゴペプチドであり、Ｇｌｕはグルタミン残基であり、Ｅ
   ＧＦは上皮成長因子あるいはアミノ酸４２個からアミノ
   酸５３個を有するその類似物質であり、ＥＧＦはそのＮ
   末端で上記Ｇｌｕ残基に結合し、上記Ｇｌｕ残基はリー
   ダー配列オリゴペプチドのＣ末端に結合している） の構造を有するペプチド化合物。
2. （２）ＥＧＦが上皮成長因子の５３個のアミノ酸配列で
   ある、特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
3. （３）ＥＧＦが、上皮成長因子から５２番目のＬｅｕ残
   基および５３番目のＡｒｇ残基を除いたアミノ酸配列で
   ある、特許請求の範囲第１環記載のペプチド。
4. （４）Ｘが本明細書の表３に示されるアミノ酸配列を有
   する、特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
5. （５）特許請求の範囲第１項記載のペプチド化合物をコ
   ードするＤＮＡ。
6. （６）次式： Ｘ−Ｇｌｕ−ＥＧＦ （式中、Ｘはアミノ酸２００個までのリーダー配列オリ
   ゴペプチドであり、Ｇｌｕはグルタミン残基であり、Ｅ
   ＧＦは上皮成長因子あるいはアミノ酸４２個からアミノ
   酸５３個を有するその類似物質であり、ＥＧＦはそのＮ
   末端で上記Ｇｌｕ残基に結合し、上記Ｇｌｕ残基はリー
   ダー配列オリゴペプチドのＣ末端に結合している） の構造を有する融合ペプチドをコードする構造遺伝子を
   含む、組み換え微生物クローニングベクターを有する細
   胞を含有する発酵混合液を発酵させること、 上記発酵混合液から微生物細胞を得、上記細胞から上記
   融合ペプチドを放出させること、および、得られた融合
   ペプチドを、グルタミン残基でペプチドを特異的に切断
   するスタフィロコッカス・アウレウス（￥Ｓｔａｐｈｙ
   ｌｏｃｏｃｃｕｓ￥　￥ａｕｒｅｕｓ￥）プロテアーゼ
   で処理すること、 よりなる、上皮成長因子産生法。
7. （７）融合ペプチドを、上記プロテアーゼ処理以前に尿
   素中で可溶化して、得られた溶液を濃縮することを含む
   、特許請求の範囲第６項記載の方法。
8. （８）処理過程でのプロテアーゼと融合ペプチドとのモ
   ル比が１：５００から１：１０，０００である、特許請
   求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）プロテアーゼ処理過程が８時間から１５時間で行
   なわれる、特許請求の範囲第８項記載の方法。
10. （１０）プロテアーゼ処理過程が３２℃から４０℃で行
    なわれる、特許請求の範囲第９項記載の方法。
11. （１１）Ｘがアミノ酸７５個までのリーダー配列オリゴ
    ペプチドである、特許請求の範囲第１項記載のペプチド
    化合物。
12. （１２）上記微生物クローニングベクターが、大腸菌（
    Ｅ．ｃｏｌｉ）株のものである、特許請求の範囲第６項
    記載の方法。
13. （１３）Ｘが表３に示されるアミノ酸配列を有する、特
    許請求の範囲第６項記載の方法。