DE69427515T2 - Neuartiger genvektor codierend fur den epidermis wachstumsfaktor und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Neuartiger genvektor codierend fur den epidermis wachstumsfaktor und verfahren zu seiner herstellung

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DE69427515T2
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Description

    Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von humanem Epidermiswachstumsfaktor unter Einsatz eines rekombinanten Expressionsvektors dafür.
    • Beschreibung des Standes der Technik
  • Es ist bekannt, daß der menschliche Epidermiswachstumsfaktor (nachfolgend als "hEGF" bezeichnet) ein aus 53 Aminosäuren und 3 Disulfidbrücken bestehendes Polypeptid ist [siehe: Cohen, S., J. Biol. Chem., 237: 1555-1562 (1962); Savage, C. R., Jr. et. al. J. Biol. Chem., 248: 7669-7672 (1973); Savage, C. R. Jr., et. al., J. Biol. Chem., 247: 7612-7621 (1972)]. hEGF spielt eine wichtige Rolle bei der Wachstumssteuerung in Säugetierzellen, unter anderem in Epidermis- und Epitheliumzellen, wobei dies auf einem molekularen Niveau geschieht. [siehe: Sporn, M. B. et. al., Nature (London), 313: 745-747 (1985); Sporn, M. B. et. al. N. Engl., J. Med., 303: 878-880 (1980)], und bei der Behandlung von Verletzungen (siehe: Buckley, A. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 7340-7344 (1985)]. Weiterhin ist berichtet worden, daß hEGF bei der Behandlung eines Magengeschwürs eingesetzt werden kann, was auf die Tatsache zurückgeht, daß hEGF die Sekretion von Magensäure in den Magen unterdrückt [siehe: Gregory, H., J. Cell Sci. Suppl., 3: 11-17 (1985)].
  • Zu diesen Umständen sind Untersuchungen hinsichtlich der Massenproduktion von hEGF aktiv durchgeführt worden, da Starkey et. al. die biochemischen Eigenschaften von hEGF berichteten, das aus menschlichem Urin gewonnen wurde [siehe: Starkey, R. H. et. al., Science, 189 : 800 (1975); Cohen, 5. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72: 1317 (1975)]. Mehrere Forscher waren erfolgreich bei dem Klonen des hEGF-Gens durch DNA-Rekombinationstechnologie [siehe: Smith, J. et. al., Nucleic Acids Res., 10: 4467-4482 (1982); Urdea, M. S. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80: 7461-7465 (1983); Oka, T. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 7212-7216 (1985)]. Der Stand der Technik hat hEGF aufgrund seiner geringen Aktivität und Produktivität nicht in einer industriell anwendbaren Menge zur Verfügung gestellt.
  • Dementsprechend sind Untersuchungen hinsichtlich der Erhöhung der Aktivität und der Produktivität bei der hEGF-Herstellung durchgeführt worden, die sich hauptsächlich auf die Herstellung einer Nucleotidsequenz konzentrierten, die hEGF effizient für dessen Massenherstellung codiert, und auf einen Expressionsvektor, dessen Regulationsfunktion gestärkt ist.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder ein neues hEGF-Gen synthetisiert und einen neuen Expressionsvektor dafür, der hEGF in großer Menge exprimiert und sie entwickelten ein Verfahren zur Herstellung von hEGF daraus.
  • Die Erfindung stellt einen Expressionsvektor für hEGF bereit, der eine par-Stelle zur Stabilisierung in E. coli umfaßt, einen Tetracyclin-Resistenzmarker und eine aus einer Omp-A-Leitsequenz bestehende Expressionskassette, eine hEGF-Codierungssequenz, eine Translationsterminierungssequenz und eine trp-A- Transkriptionsterminierungssequenz, wobei die Expressionskassette unter der Transkriptionsregulation durch den tac-Promoter steht. In dem Vektor besitzt die hEGF- Sequenz bevorzugt eine Restriktionsenzymspaltungsstelle für HpaI an dessen 5'-Ende, für PstI an dessen 3'-Ende und für Bpu1 102, NsiI, MluI, Eco-47III und AflII, wobei die Nucleotidsequenz die Codierungssequenz besitzt:
  • 5' GTT AAC AGC GAG TCC GAA TGC CCG CTG AGC GAT GAG GGC 3' CAA TTG TCG CTG AGG CTT ACG GGC GAC TCG GTA CTG CCG
  • TAC TGC CTG CAC GAC GGC GTA TGC ATG TAC ATC GAA GCA ATG ACG GAC GTG CTG CCG CAT ACG TAC ATG TAG CTT CGT
  • CTG GAC AAA TAC GCG TGC AAC TGT GTT GTT GGC TAC ATC GAC CTG TTT ATG CGC ACG TTG ACA CAA CAA CCG ATG TAG
  • GGC GAG CGC TGT CAG TAC CGT GAC CTT AAG TGG TGG GAA CCG CTC GCG ACA GTC ATG GCA CTG GAA TTC ACC AGG CTT
  • CTG CGC TGATAACCTGCA 3'
  • GAC CGC ACTATTGG 5'
    • Kurzbeschreibung der Figuren
  • Fig. 1 beschreibt die Sequenz des in der Erfindung verwendeten hEGF- Gens,
  • Fig. 2a beschreibt 10 synthetisierte Oligonucleotide,
  • Fig. 2b beschreibt das Aufbaumuster der 10 synthetisierten Oligonucleotide aus Fig. 2a,
  • Fig. 3 beschreibt die Strategie zur Konstruktion von pUE118,
  • Fig. 4 ist ein Foto, das das Agarosegel-Elektrophoresemuster von pUE118 zeigt, das das hEGF-Gen trägt, welches mit Restriktionsenzymen aufgeschlossen ist.
  • Fig. 5 beschreibt die Omp-A-Leitsequenz-Universal-Translationsterminierungstrp-A-Transkriptionsterminierungsequenz,
  • Fig. 6 beschreibt die Konstruktionsstrategie von pDT420,
  • Fig. 7 beschreibt die Konstruktionsstrategie von pDE135,
  • Fig. 8 beschreibt die Konstruktionsstrategie von pTC 108,
  • Fig. 9 beschreibt die Konstruktionsstrategie von pTC226,
  • Fig. 10 beschreibt die Konstruktionsstrategie von pTE105,
  • Fig. 11a ist eine Fotografie, das das SDS-PAGE-Muster von hEGF zeigt, exprimiert in E. coli JM101, pTE105 beherbergend,
  • Fig. 1 1b ist eine Fotografie, daß die Western-Blot-Analyse von hEGF zeigt, exprimiert in E. coli JM101, beherbergend pTE 105,
  • Fig. 12 ist eine Fotografie, die das SDS-PAGE-Muster von hEGF zeigt, exprimiert aus E. coli JM101, pTE145 beherbergend, in jedem Reinigungsschritt,
  • Fig. 13 ist eine Fotografie, die das SDS-PAGE-Muster von gereinigtem hEGF aus E. coli JM101, pTE105 beherbergend, zeigt,
  • Fig. 14 ist ein Chromatogramm von mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigtem hEGF und
  • Fig. 15 ist eine Fotografie, die die isoelektronische Fokusanalyse von gereinigtem hEGF aus E. coli JM141, beherbergend pTE105, zeigt.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfinder haben ein hEGF-Gen synthetisiert, das zur Maximierung der Expression des Gens entwickelt wurde, das die folgenden Anforderungen erfüllt: Zuerst soll das daraus exprimierte hEGF dasselbe wie natürliches EGF im Hinblick auf die Aminosäuresequenz und Proteinstruktur sein, zweitens soll die Nucleotidsequenz unter Berücksichtigung der in E. coli ubiquitären Codons entwickelt werden, drittens soll der Anteil an Sekundärstruktur von mRNA, die von diesem übersetzt wurde, minimiert werden, viertens sollen viele einzigartige Restriktionsstellen soweit wie möglich positioniert werden.
  • In diesem Zusammenhang wurde das hEGF-Gen basierend auf der zuvor auf dem Fachgebiet bekannten hEGF-Sequenz entwickelt [siehe: Gregory, H., Nature, 257 : 325 (1975)]. Als erstes haben die Erfinder zehn komplementäre Oligonucleotide unter Verwendung eines automatischen Nucleotidsynthesizers nach dem Festphasenphosphat- Triesterverfahren synthetisiert [siehe: Narang, S. A., Synthesis and Applications of DNA and RNA, Academic Press, 1987]. Zum Erhalt des vollständigen hEGF-Gens wurde das Schrotschuß-Legierungsverfahren eingesetzt.
  • Die in der Erfindung verwendete hEGF-Codierungssequenz enthält folgende Restriktionsstellen: HpaI am 5'-Terminus, PstI am 3'-Terminus und Bpu11021, NsiI, MluI, Eco 47III und AfIII innerhalb ihrer inneren Sequenz. Die Einführung des hEGF-Gens in pUC18, einem in der Erfindung verwendeten Startvektor erzeugt die obigen sieben spezifischen Stellen, die als Restriktionsstellen in dem rekombinanten Vektor existieren. Die Tatsache, daß die einzigen stellen durch ihre spezifischen Restriktionsenzyme gespalten werden und in einem regelmäßigen Intervall positioniert sind, ermöglicht eine praktische Verfügbarkeit des Gens zur Induktion von Mutierungen, was eine hohe Aktivität und Stabilität von hEGF sicherstellt. Weiterhin ermöglicht die HpaI- Restriktionsstelle am 5'-Terminus, die Herstellung von intaktem hEGF, das frei von Fusionsprotein aus dem Expressionsvektor ist.
  • Das hEGF- Gen wird in mit SmaI und PstI aufgeschlossenes pUC18 eingefügt und das so erhaltene Plasmid wird pUE118 genannt. E. coli JM109 wird mit pUE118 gemäß dem Hanahan-Verfahren transformiert [siehe: DNA Cloning, Vol.. I: A Practical Approach, IRL Press, 1985, Seiten 109-135] und dieser Transformant wurde am 9. April 1993 unter dem Namen E. coli/DW/BT-2040 (KCCM 10026) bei der Korean Culture Collection of Microorganisms (KCCM) hinterlegt, die sich im Department of Food Engineering, College of Eng., Yonsei University, Sodaemun-gu, Seoul 120-749, Korea, befindet.
  • Es ist bekannt, daß die Regulierung der Proteinexpression den Wachstumsmustern von Mikroorganismen entspricht und dies ist sehr wichtig für eine Proteinmassenproduktion. In diesem Zusammenhang wird ein tac-Promoter [siehe: de Boer et. al., DNA, 2: 231- 235 (1983); Amann et. al., Gene, 25: 167-178 (1983)] in den erfindungsgemäßen Expressionsvektor eingeführt. Da der tac-Promoter kontinuierlich mit zwei stromab liegenden Ribosombindungsstellen verknüpft ist [siehe: Shine und Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 71: 1342 (1974)], initiiert er die Translation des hEGF-Gens auf wirksame Weise.
  • Für die genaue wirksame Expression und Sekretion von hEGF werden im erfindungsgemäßen Expressionsvektor die folgenden Sequenzen eingesetzt (1) eine Omp-A- Leitsequenz [siehe: von Gabain, A. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80: 653-657 (1983)], (2) eine universelle Translationsterminierungssequenz [siehe: P. Singleton and D. Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2. Ausgabe, Wiley, 383, 1987], und (3) eine trp-A-Transkriptionsterminierungssequenz [siehe: Christie, G. E. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78 : 418 (1981)]. Weiterhin enthält der Expressionsvektor eine par-Stelle für die Stabilität in E. coli [siehe Austin und Abeles, J. Mol. Biol., 169: 373-387, (1983)].
  • Die "Omp-A-Leit-Universal-Translationsterminierungs-trp-A- Transkriptionsterminierungssequenz" wurde zur Insertion eines hEGF-Gens entwickelt und synthetisiert, daß eine BamHI-Restriktionsstelle am 5'-Terminus und eine XbaI- Stelle am 3'-Terminus umfaßt, und NaeI- und PstI-Stellen zwischen der Omp-A-Leit- und der Universal-Translationsterminierungssequenz.
  • Es ist bekannt, daß die Sekretion des exprimierten Proteins vermindert wird, wenn ein Ampicillin-Resistenzmarker, der für β-Lactamase, ein Sekretionsprotein, codiert, zum Screening auf E. coli verwendet wird, welche einen diesen Marker umfassenden Vektor enthalten, weil die beiden Proteine, d. h. das interessierende Protein und β-Lactamase im Verlauf der Sekretion konkurrieren [siehe: A. Oka, et, al., J. Mol. Biol., 147: 217 (1981)). Daher führt ein Tetracyclin-Resistenzmarker, der für ein intrazelluläres Protein codiert, zu einer hohen Sekretion des interessierenden exprimierten Proteins durch Vermeidung der Konkurrenz und wird in der Erfindung anstelle des Ampicillin- Resistenzmarkers eingesetzt. Als Ergebnis wird klar garantiert, daß der erfindungsgemäße Expressionsvektor hEGF in hoher Ausbeute exprimiert und sekretiert wird und stabil in E. coli ist.
  • Ein kommerziell verfügbares Plasmid pDR540 wird mit Pvu II aufgeschlossen und nachfolgend mit einem XbaI-Linker ligiert; und es wird ein Doppelaufschluß mit XbaI und BamHI durchgeführt. Ein so erhaltenes DNA-Fragment von 2,4 kb wird mit der "Omp-A-Leit-Universal-Translationsterminierungs-trp-A- Transkriptionsterminierungssequenz" ligiert und pDT420 genannt.
  • Ein doppelter Aufschluß von pDT420 mit NaeI und PstI erzeugt eine Spaltung zwischen der Omp-A-Leit.-Sequenz und der Universal-Translationsterminierungssequenz; und pUIEl 18, das Gen tragende hEGF wird mit HpaI und PstI aufgeschlossen, um das hEGF-Gen zu erhalten. Nachfolgend wird das hEGF-Gen in mit NaeI und PstI aufgeschlossenes pDT420 ligiert und der resultierende Vektor wird pDE135 genannt.
  • Das auf dem Fachgebiet bekannte pUC 19 wird mit DraI und EcoRI zum Erhalt eines DNA-Fragments von 1, 2 kb aufgeschlossen, dessen Enden jeweils stumpf und haftfähig für EcoRI sind; und pBR322 wird mit Aval aufgeschlossen und mit Klenows Fragment mit stumpfen Enden versehen, wobei ein Aufschluß mit EcoRI folgt, um ein Fragment von 1,4 kb zu erhalten. Die obigen DNA-Fragmente von 1,4 kb und 1,2 kb werden mit T&sub4; DNA-Legase ligiert und das Produkt wird pTC108 genannt. Als ein Ergebnis umfaßt pTC108 einen Tetracyclin-Resistenzmarker, eine Mehrfachklonierungsstelle und den Replikationsursprung von pUC19. Eine par-Stelle wird für die Stabilität des Expressionsvektors in Transformanten und zur exakten Trennung von Plasmiden nach der Zellteilung eingeführt. Plasmid pTC108 wird mit EcoRI und SmaI aufgeschlossen. Andererseits wird pSC101 mit Aval aufgeschlossen, um ein DNA-Fragment von 3,3 kb zu erhalten, welches mit Klenows Fragment mit stumpfen Enden versehen wird und dann mit einem EcoRI-Linker ligiert wird, gefolgt von einem Aufschluß mit EcoRI. Das DNA-Fragment von 3,3 kb, das klebrige EcoRI-Enden enthält wird mit HincII zum Erhalt eines DNA-Fragments von 0,37 kb aufgeschlossen, das eine par-Stelle enthält. Dieses 0,37 kb DNA-Fragment wird an das mit EcoRI und SmaI aufgeschlossene pTC108 mittels T&sub4; DNA-Ligase ligiert und das ligierte Plasmid wird pTC226 genannt.
  • Plasmid pTC226 wird mit AfIIII aufgeschlossen, mit Klenow-Fragment abgestumpft und mit XbaI in dieser Weise zum Erhalt eines DNA-Fragments von 2,5 kb aufgeschlossen. Andererseits wird pDE135 mit HindIII aufgeschlossen, mit Klenow- Fragment abgestumpft und in dieser Reihenfolge mit XbaI aufgeschlossen, um ein 0,45 kb DNA-Fragment zu erhalten. Die DNA-Fragmente von 2,5 kb und 0,45 kb werden mit T4-DNA-Ligase ligiert und das ligierte Plasmid wird pTE 105 genannt.
  • E. coli JM101 wird mit pTE105 transformiert und der Transformant wird bei der Korean Culture Collection of Microorganisms (KCCM) angesiedelt im Department of Food Engineering, College of Eng., Yonsei University, Sodaemun-gu, Seoul 120-749, Korea, am 09. April 1993 unter der Bezeichnung E. coli DW/BT-2042 (KCCM10027) hinterlegt.
  • Transformierte E. coli DW/BT-2042 werden in LB-Medium kultiviert und die Exprimierung von hEGF daraus wird durch 15% SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse mittels Einsatz von gewerblich erhältlichem hEGF (Amersham, ARN 5100, UK) als Standard bestimmt. Die Menge an exprimiertem hEGF wird durch hEGF-Rezeptor- Bindungsanalyse unter Einsatz der ZellinieA431 (ATCC CRL 1555) bestimmt. Ein Kultivieren dieser Transformanten für 30 Std. ergab 343,5 mg/l an hEGF wobei das meiste des exprimierten hEGF aus Cytosol sekretiert wurde.
  • Die Erfinder isolierten hEGF aus der Kultur, wobei eine Kontamination durch andere zellulärer Proteine und Endotoxine durch Einsatz einer Reihe chromatographischer Reinigungsverfahren, d. h. Amberchrom CG71-Chromatographie, Q- Sepharoseanionenaustausch-Chromatographie und präparative C&sub1;&sub8;-Reverse Phase HPLC, herabgesetzt wurde. Die Reinheit des gereinigten hEGF wird mittels analytischer HPLC in Übereinstimmung mit einem modifizierten Verfahren nach Hayashi et. al. durchgeführt [siehe: Hayashi, T. et. al., Anal. Sci., 3: 445-449 (1987)].
  • Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert, die nicht zur Beschränkung der Erfindung dienen sollen.
    • Beispiel 1: Entwicklung des hEGF-Gens
  • Das hEGF-Gen wurde zunächst auf der Basis der hEGF-Aminosäuresequenz und der Untersuchung von Grantham et. al. hinsichtlich der Häufigkeit der Codonverwendung in E. coli entwickelt [siehe: Grantham et. al., Nucleic Acid Res., 9: 243-274 (1981)]. Nachfolgend wurde ein Sequenz, die keine Bildung einer Sekundärstruktur der davon transkripierten mRNA hervorruft, ausgewählt, während untersucht wurde, ob das Gen Codons enthält, die in E. coli ubiquitär sind und eine Bildung einer Sekundärstruktur von mRNA hervorrufen oder nicht, wobei das PC-FOLD-Programm (Version 2,0) verwendet wurde [siehe: Turner, D. et. al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 52: 123 (1987)]. Die so entwickelte hEGF-Sequenz trägt die folgenden zwei Restriktionsstellen um eine akkurate Insertion zu garantieren, eine Isolation und Manipulation des hEGF- Gens: HpaI an dem 5'-Ende; PstI stromab des translationalen Terminierungscodons. Die hEGF-Sequenz umfaßt weiter viele einzigartige Restriktionsstellen auf einer regulären Basis wie folgt:
  • HpaI-22bp-Bpu1102I-39bp-NsiI-25bp-MluI- 35bp-Eco47III-21bp-AflII-32bp-PstI
  • Die zur Verwendung in der Erfindung verwendete hEGF-Sequenz ist in Fig. 1 offenbart, die die Positionen von Restriktionsstellen zeigt: HpaI am 5'-Ende, PstI am 3'-Ende und Bpu11021, NsiI, MIuI, Eco47III und AfIII.
    • Beispiel 2: Synthese von Oligonucleotiden
  • Das in Beispiel 1 entwickelte hEGF-Gen wurde chemisch synthetisiert. Zunächst wurden zehn Oligonucleotide bestehend aus 29-mer bis 41-mer getrennt synthetisiert. Sie sind in Fig. 2a offenbart. In diesem Zusammenhang besitzen das C1 (30-mer), C2 (35 -mer), C3 (29-mer), C4 (39-mer) und C5 (140-mer) Oligonucleotide, die dieselbe Sequenz wie die von der korrespondierenden hEGF-Sequenz transkripierten mRNA und die N1 (29-mer), N2 (38-mer), N3 (29-mer), N4 (36-mer), N5 (38-mer) Oligonucleotide waren komplementär jeweils zu den C5, C4, C3, C2 und C1 Oligonucleotiden [siehe: Fig. 2B]. Jedes Oligonucleotid wurde durch einen automatischen Nucleotid- Synthesizer synthetisiert [siehe: Pharmacia LKB Biotechnolgy, Uppsala, Schweden].
    • Beispiel 3: Isolierung und Sequenzierung von Oligonucleotiden
  • Die so synthetisierten Oligonucleotide wurden auf der Silicamatrix durch Behandlung mit TTD-Lösung (Thiophenol/Triethylamin/Dioxan = 1/2/2, v/v) und Waschen mit Methanol, Ethanol und konzentriertem Ammoniakwasser in dieser Reihenfolge getrennt. Die Lösung, die die so getrennten Oligonucleotide enthält wurde konzentriertem Ammoniakwasser bei 50ºC für 12 Std. unterworfen, um die Schutzgruppe zu entfernen, wobei ein Aufkonzentrieren unter Vakuumbedingungen bis auf ein Volumen von 0,5 ml folgte, zusammen mit der Entfernung von Gas. Die sooft konzentrierte Oligonucleotidlösung wurde auf eine SEP-PAK-Patrone (Waters Inc., MA, USA) aufgebracht und das Eluieren erfolgte mit Acetonitril/Triethylaminlösung, um partiell gereinigtes Oligonucleotid zu erhalten. Dann wurde eine Elektrophorese an 15% denaturiertem Polyacrylamidgel (TE-Borsäure (pH 8,3) mit 8 Mol Harnstoff) durchgeführt und die Lokalisierung des Oligonucleotids in dem Gel wurde mittels Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen bestimmt. Das der Oligonucleotidbande entsprechende Gel wurde ausgeschnitten, das Oligonucleotid wurde elektroeluiert und Salze wurden an einer mit einem Injektor verbundenen SEP-PAK-Patrone durch Eluieren mit Acetonitril/Triethylamin- Lösung entfernt. Die so isolierten Oligonucleotide wurden mit γ-³²-P-ATP durch Einsatz von T&sub4;-Polynucleotidkinase (New England Biolabs., #201 S. USA) markiert und in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Maxam & Gilbert sequenziert [siehe: Maxam, A. M. & Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74: 560-564 (1977)].
    • Beispiel 4: Ligation von Oligonucleotiden
  • 100 pMol jedes in Beispiel 3 hergestellten Oligonucleotids, in dem alle Oligonucleotide außer zwei Oligonucleotiden (C1 und N1) am 5'-Ende phosphoriliert worden sind, wurden unter Zugabe von 40 ul 0,1 Mol Tris-HCl (pH 7,5) in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben. Dann wurde die Inkubation bei 100ºC für 3 Min. durchgeführt, um Oligonucleotide zu denaturieren, wobei die Denaturierung von einem langsamen Absenken der Temperatur gefolgt wurde. Zu dem resultierenden Rückstand wurden 10 Einheiten T4- DNA-Ligase (New England Biolabs, #202S, USA) und Ligation-Pufferlösung gegeben und es wurde jeweils bei 4ºC für 12 Stunden und bei Raumtemperatur für 3 Std. inkubiert. Dann folgten eine 7% Acrylamidgel-Elektrophorese und eine Autoradiographie, um die erfindungsgemäß ligierte hEGF-Sequenz zu bestimmen.
  • Beispiel 5: Konstruktion von pUE 188 und seinen Transformanten pUC 18 ist auf dem vorliegenden Fachgebiet bekannt (siehe: Norrander J., et. al., Gene 26: 101 (1985)) und wurde mit SmaI und PstI (New England Biolabs., # 141S und #140S, MA, USA; sämtliche nachfolgen beschriebenen Enzyme und Linker wurden von New England Biolabs., MA, USA, bezogen) aufgeschlossen und mit dem hEGF-Gen ligiert. Die Ligation wurde einfach durchgeführt, basierend auf dem stumpfen 5'-Ende und dem klebrigen 3'-Ende in dem entwickelten hEGF-Gen. Der so erhaltene rekombinante Vektor wurde pUE118 genannt [siehe: Fig. 3].
  • Dann wurde pUE118 jeweils mit HpaI, PstI, Bpu1102I, NsiI, MIuI, Eco47III und AfIII aufgeschlossen und eine Elektrophorese der erzeugten Gen-Fragmente oder ein 1%- Agarosegel durchgeführt. Wie in Fig. 4 offenbart, wurde die Insertion des hEGF-Gens auf akkurate Weise durchgeführt und es wurde bestätigt, daß eine einzige Restriktionsstelle für jedes Restriktionsenzym existiert. In Fig. 4 ist die Reihe 1 eine 1 kb-DNA- Leiter (BRL, USA), die Reihen 2 und 3 sind jeweils pUE 118, aufgeschlossen mit HpaI und PstI; Reihe 4 ist mit HpaI und PstI doppelt aufgeschlossenes pUE118 und die Reihen 5 bis 9 sind jeweils mit Bpu118, NsiI, MIuI, Eco47III und Af1II aufgeschlossenes pUE 118.
  • Kompetente E. coli JM109 wurden mit pUE118 transformiert und der so transformierte Stamm E. coli IM 109 wurde bei dem Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) unter dem Namen Escherichia coli (DW/BT-2040) am 9. April 1993 unter der Hinterlegungs-Nr. KCCM 10026 hinterlegt.
    • Beispiel 6: Synthese einer "Omp-A-Leit-Universal-Translationsterminierungs-trp- A-Transkriptionsterminierungssequenz"
  • Ein Oligonucleotid, umfassend eine Omp-A-Leit-Universal-Translationsterminierung- und trp-A-Transkriptionsterminierungssequenz wurde so entwickelt, daß sie mehrere Restriktionsstellen besaß, wie in Fig. 5 offenbart. Das Oligonucleotid umfaßt Restriktionsstellen von BamHI am 5'-Terminus und XbaI am 3'-Terminus und NaeI und PstI zwischen der Omp-Leit- und Universal-Translationsterminierungssequenz, um sicherzustellen, daß die endterminale Aminosäuresequenz exakt dieselbe wie das von zusätzlichen Aminosäuresequenzen freie Originalprotein ist.
  • Als erstes wurde eine Omp-A-Leit-Universal-Translationsterminierungs-trp-A- Transkriptitionsterminierungssequenz wie folgt aus 8 Oligonucleotiden, die als 31-mer oder 32-mer vorlagen, auf getrennte Weise hergestellt.
  • 5' GATCCAAAATTATGAAAAAGACAGCTATCGGC 3'
  • 5' GATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACC 3'
  • 5' GTAGCGCAGGCCGGCCTGCAGCTTATTAATT 3'
  • 5' AAGCAGCCCGCCTAATGAGCGGCCTTTTTTTT 3'
  • 5' CTAGAAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCT 3'
  • 5' GCTTAATTAATTAAGCTGCAGGCCGGCCTGCG 3'
  • 5' CTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACTGC 3'
  • 5' AATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATAATTTTG 3'
  • Die Oligonucleotide wurden mit einem automatischen Nucleotidsynthesizer (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden) gemäß einem Festphasenphosphattriesterverfahren synthetisiert [siehe: Narang, S. A., Synthesis and Applications of DNA and RNA, Academic Press, 1987].
  • In Analogie zur Beispiel 3 wurden die synthetisierten Oligonucleotide von der Silicamatrix getrennt, wobei ein Entfernen der Schutzgruppe und ein Aufkonzentrieren folgten, eine Isolierung von Oligonucleotiden, eine Markierung mit γ-³²-P-ATP, ein Denaturieren und Renaturieren und schließlich eine Ligation von Oligonucleotiden durchgeführt wurde.
    • Beispiel 7: Konstruktion von Plasmid pDT 420
  • Plasmid pDR540 (Pharmacia LKB Biotechnology, #27-4928-01, Uppsala, Schweden) wurde mit PvuII (#1032) aufgeschlossen, mit dem XbaI-Linker ligiert und mit XbaI (#145S) und BamHI (#136S) zum Erhalt eines 2,4 kb DNA-Fragments aufgeschlossen. Das Fragment wurde von dem Gel nach einer Elektrophorese aufgeschlossener Fragmente durch Einsatz eines Geneclean II-DNA-Elutionskits (BIO 101, Inc., CA, USA) isoliert und mit dem in Beispiel 6 hergestellten "Omp-A-Leit-Universal- Translationsterminierungs-trp-A-Transkriptionsterminierungssequenz" mittels T&sub4;-DNA- Ligase (#202S) ligiert. E. coli JM101 wurde mit der ligierten DNA gemäß dem Verfahren von Nahan transformiert [siehe: DNA Cloning Vol. I, A Practical Approach IRL Press, 109-135 (1985)]. Aus den Transformanten wurde rekombinantes Plasmid isoliert und gemäß dem Verfahren von Maxam & Gilbert zum Screening auf rekombinante Plasmide sequenziert, die eine "Omp-A-Leit-Universal-Translationsterminierungs-trp- A-Transkriptionsterminierungssequenz" enthielten. Das so ausgewählte rekombinante Plasmid wurde pDT420 genannt [siehe: Fig. 6].
    • Beispiel 8: Konstruktion von Expressionsvektor pDE135 und Bestimmung der hEGF-Expression
  • Ein doppelter Aufschluß wurde am Plasmid pDT420 mit NaeI (#190S) und PstI (#140S) zur Spaltung der Sequenz zwischen der Omp-A-Leit- und Universal- Translationsterminierungssequenz durchgeführt. Andererseits wurde das in Beispiel 5 hergestellte Plasmid pUEl 18 mit HpaI (# 105S) und PstI zum Erhalt eines 0,17 kb hEGF-Gens aufgeschlossen. Das so erhaltene hEGF-Gen wurde mit pDT420 ligiert, das mit NaeI und PstI gespalten worden war, und die ligierte DNA wurde in E. coli IVM 101 transformiert. Von den Transformanten wurde rekombinantes Plasmid mittels eines alkalischen Lyseverfahrens isoliert [Sambrook et. al., Molecular Cloning, a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, 1989]. Unter Bezugnahme auf PstI und die HindllI-Restriktionsenzymkarte, wurde rekombinantes Plasmid, das hEGF-Gen zwischen der Omp-A-Leit- und Universal-Translationsterminierungssequenz enthielt, ausgewählt und pDE135 genannt [siehe: Fig. 7].
  • E. coli JM101 wurde mit pDE135 transformiert und die Transformante wurde in LB- Medium (Luria-Bertrani; Molecular Cloning/ a laboratory manual, 2. Auflage, CSH 1989) kultiviert. Nachfolgend wurde die Expression von hEGF SDS-PAGE und Western Blot-Analyse untersucht. Die Expression von hEGF wurde mittels Rezeptorbindungsassay bestimmt [siehe: M. W. Rieman, Peptides, 8: 877-885 (1987)], wobei die Zellinie 431 (ATCC CRL 1555) und kommerziell erhältliches hEGF (Amersham, ARN 5100, UK) als Standard eingesetzt wurde. hEGF wurde mit einer Ausbeute von 10 mg/l nach 30 Stunden Kultur exprimiert. Unter diesen Umständen nahmen die Erfinder an, daß die Gründe für die niedrige Wirksamkeit der Expression folgende waren: die vorgegebene Transkriptionsrichtung zwischen Ampicillin-Resistenzmarker und hEGF-Gen, Kompetition der Proteinproduktion und Instabilität des Expressionsvektors im Transformanten. Dementsprechend waren die Erfinder entschlossen, eine verbesserte hEGF- Expressionskassette zu entwickeln, um die oben angetroffenen Probleme durch Einsatz eines Tetracyclin-Resistenzmarkers anstelle eines Ampicillin-Resistenzmarkers, dessen Produkt nicht aus Cytosol sekretiert wird zu entwickeln.
    • Beispiel 9: Konstruktion von Plasmid pTC108
  • Plasmid pBR322 (Bolivar, F. et. al., Gene, 2: 95-113 (1977)) wurde mit Aval (#152S) aufgeschlossen und mit Klenows Fragment (#2145) zum Abstumpfen der Enden manipuliert. Dann wurden die resultierenden Fragmente mit EcoRI aufgeschlossen, gefolgt von einer Elektrophorese an 0,8% Agarosegel und das 1,4 kb-DNA-Fragment wurde aus dem Gel durch Einsatz eines Geneclean II-DNA-Elutionskits erhalten. Andererseits wurde pUC19 (Yanish-Perron, C., et. al., Gene, 33: 103-119 (1985)) mit Dral (#129S) und EcoRI aufgeschlossen, um ein 1, 2 kb DNA-Fragment zu ergeben. Das 1,2 kb DNA- Fragment besitzt den Replikationsursprung von pUC19, um eine hohe Effizienz der Repliaktion beizubehalten und eine Mehrfachklonierungsstelle, um eine Genmanipulation zu erleichtern. Die so erhaltenen 1,4 kb und 1,2 kb DNA-Fragmente wurden mit T&sub4;- DNA-Ligase ligiert, und E. coli JM101 wurde mit dem ligierten DNA-Fragment nach Hanahans Verfahren transformiert. Von den Transformanten wurde rekombinantes Plasmid durch alkalische Lyse isoliert. Unter Bezugnahme auf die EcoRI- und AfIIII- Restriktionsenzymkarte wurde ein Plasmid, das den Replikationsursprung von pUC19, eine Mehrfachklonierungsstelle und einen Tetracyclin-Resistenzmarker enthielt ausgewählt und pTC108 genannt [siehe: Fig. 8].
    • Beispiel 10: Konstruktion von Plasmid pTC226
  • Die Erfinder führten eine par-Stelle für die Stabilität des Expressionsvektors in Transformanten und zur leichten Trennung von Plasmiden nach einer Zellteilung ein. Plasmid pSC101 (Cohen and Chang, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 70: 1293-1297 (1973), LCTC 11251] wurde mit Aval (#1525) aufgeschlossen und an 0,8% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und ein 3,3 kb DNA-Fragment wurde daraus durch Einsatz eines Geneclean II DNA-Elutionskits erhalten. Das so erhaltene DNA-Fragment würde mit Klenows Fragment manipuliert um die Enden abzustumpfen, mit EcoRI-Linker (#1020) ligiert und mit EcoRI aufgeschlossen. Das 3, 3 kb DNA-Fragment, das das klebrige Ende der EcoRI-Stelle enthielt, wurde mit HincII (#1035) aufgeschlossen und an 0,8% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Ein 0,37 kb DNA-Fragment, das eine par- Stelle enthielt, wurde nach der Elektrophorese aus dem Gel durch Einsatz eines Geneclean DNA-Elutionskits erhalten. Das erhaltene DNA-Fragment wurde unter Hilfe von T&sub4;-DNA-Ligase an pTC108 ligiert, das zuvor mit EcoRI und SmaI (#1415) aufgeschlossen worden war und E. coli JM101 wurde mit dem ligierten DNA-Fragment gemäß Hanahans Verfahren transformiert. Aus den Transformanten wurde rekombinantes Plasmid durch alkalische Lyse isoliert. Unter Bezugnahme auf die EcoRI- und PstI- Restriktionsenzymkarte wurde das rekombinante Plasmid, das eine par-Stelle enthielt, ausgewählt und pTC226 genannt [siehe: Fig. 9].
    • Beispiel 11: Konstruktion von Expressionsvektor pTE 105
  • Die Erfinder konstruierten einen Plasmidvektor, der stabil in E. coli ist und von hoher Effizienz bei der hEGF-Expression, wobei die hEGF-Gen-Expressionskassette von pTE135 so in pTC226 eingefügt wurden, daß sie dieselbe Transkriptionsrichtung besaß. Plasmid pTC226 wurde mit AfIIII aufgeschlossen, mit Klenow Fragment zum Abstumpfen der Enden aufgeschlossen, mit XbaI (#145S) aufgeschlossen und an 0,8% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, wobei ein 2,5 kb DNA-Fragment nach der Elektrophorese aus dem Gel durch Einsatz eines Geneclean 11-DNA-Elutionskits erhalten wurde. Auf dieselbe Weise wurde Plasmid pDE135 mit HindIII (#104S) aufgeschlossen. Mit Klenow Fragment abgestumpft, mit XbaI aufgeschlossen und an 1% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, wobei ein 0,45 kb DNA-Fragment nach der Elektrophorese durch Einsatz eines Geneclean DNA-Elutionskits aus dem Gel erhalten wurde. Jedes isolierte DNA-Fragment, d. h. die DNA-Fragmente mit 2,5 kb und 0,45 kb, wurden mit T&sub4;-DNA-Ligase ligiert und E. coli JM101 wurde mit dem ligierten DNA-Fragment gemäß der Verfahren von Hanahan transformiert. Aus dem Transformanten wurde rekombinantes Plasmid durch alkalische Lyse isoliert. Unter Bezugnahme auf die EcoRI und BamHI-Enzymkarte wurde ein rekombinantes Plasmid ausgewählt, das einen Tetracyclin-Resistenzmarker eine par-Stelle und einen Omp-A- Leitsequenz und ein hEGF-Gen enthielt und pTE105 genannt [siehe: Fig. 10].
  • Mit pTE105 transformierte E. coli JM101 wurde DM/BT-2042 genannt und bei der Korean Culture Collection of Microorganisms (KCCM) am 09. April 1993 unter der Hinterlegungs.-Nr. KCCM 10027 hinterlegt.
    • Beispiel 12: Expression von hEGF in Transformanten
  • Transformant E. coli DWBT2042 (KCCM 10027) wurde für 5 Std. in LB-Medium kultiviert, wobei dann Isopropyl-β-D-thio-galactosid (IPTG, Sigma I-6758) zu einer Endkonzentration von 1 mMol zugegeben wurde, wobei Kulturen jeweils nach 19 Std. und 25 Std. gesammelt und zentrifugiert wurden. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden an 15% Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen (siehe:[H. Schagger et. al., Anal. Biochem., 166: 368-379 (1987)], wobei kommerziell erhältliches hEGF (Amersham, ARN 5100, UK) als Standard eingesetzt wurde. Fig. 11a zeigt, daß die Molekulargröße von exprimiertem hEGF zu 6000 Dalton bestimmt wurde. Eine Western-Blot- Analyse (W. N. Burnett, Anal. Biochem., 112: 195-203 (1981)) wurde ebenfalls zur Bestätigung, daß das Produkt hEGF war, durchgeführt [siehe: Fig. 11B]. In den Fig. 11A und 11B ist Reihe 1 ein Molekulargewichtsmarker (Sigma, #MW-SDS-175), Reihe 2 ist das Standard-hEGF, Reihe 3 ist eine 24 Std.-Kultur ohne Zugabe von IPTG, Reihe 4 ist die 30 Std.-Kultur ohne Zugabe von IPTG, Reihe 5 ist die 24 Std.-Kultur mit Zugabe von IPTG und Reihe 6 ist die 30 Std.-Kultur mit Zugabe von IPTG. Die Menge des in der 24 Std.-Kultur und in der 30 Std.-Kultur enthaltenen hEGFs wurden quantitativ durch hEGF-Rezeptor-Bindungsassay analysiert und sind in Tabelle 1 offenbart.
  • Wie deutlich in Tabelle 1 angegeben, wurde bestimmt, daß: die Gesamtmenge der 30 Std.-Kultur 343,5 mg/l betrug, wobei das meiste des exprimierten hEGF aus Cytosol sekretiert worden war. Tabelle 1
    • Beispiel 13: Massenproduktion von hEGF
  • Transformant E. coli DWBT-2042 (KCCM 10027) wurde in 4 ml LB-Medium, das 0,5 % Glucose und 12,5 ug/ml Tetracyclin enthielt, bei 37ºC für 11 Std. kultiviert und 400 ul der Kultur wurden auf 100 ml desselben Mediums inokuliert und für 11 Std. inkubiert, um eine Saatkultur zu erhalten. 80 ml der Saatkultur wurden auf 21 Medium inokuliert, das 10 g Baktotrypton, 20 g Hefeextrakt, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 4 g Na&sub2;HPO&sub4; &sub8;H&sub2;O, 2,5 g (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 0,01 g CaCl&sub2; &sub2;H&sub2;O, 1 ml Sigma-Antifoam-A, 5 g Glucose, und 5 mg Tetracyclin pro 1 l enthielt und wurden bei 30ºC inkubiert. Nach 4 Std. Inkubation wurde IPTG zur Endkonzentration von 1 mMol zur Induktion von hEGF zugegeben und eine weitere Inkubation wurde für 26 Std. durchgeführt.
    • Beispiel 14: Quantitatives Assay des erzeugten hEGF
  • Die Menge an exprimiertem hEGF wurde mittels Rezeptor-Bindungassay bestimmt, bei dem eine Zelline A431 (ATCC CRL 1555) eingesetzt wurde, welches ein modifiziertes Verfahren nach Rieman ist [siehe: Rieman, M. W., Peptides, 8: 877-885 (1987)] und nach DiAugustine [siehe: DiAugustine, R. P., J. Biol. Chem., 260: 2807-2811 (1985)].
  • Die A431-Zellen wurden mit Kalbsserum enthaltendem DMEM-Medium gemischt, auf 24 Costa-Zellkulturplatten zu 4 · 10&sup5;-Zellen/Tüpfel inokuliert und unter 5% CO&sub2;- Atmosphäre bei 37ºC für 6 oder 7 Tage unter Wechsel des neuen Mediums an jedem zweiten Tag inkubiert. Danach folgten eine Entfernung des Mediums und ein Waschen mit Kochsalzphosphatpuffer und die Zellen wurden durch die 10 Minuten Behandlung mit 10% Formaldehyd immobilisiert. Nachdem das Entfernen des Formaldehyds durch Waschen mit Kochsalzphosphatpuffer durchgeführt worden war, wurden 250 ul Rezeptor-Bindungspuffer zu jedem Tüpfel gegeben, der aus 1% BSA, 0,2% Natriumazid und Kochsalzphosphatpuffer bestand. Zu dem obigen wurden eine auf 0,01-20 ng/20 ul verdünnte Standard-hEGF-Lösung gegeben oder eine zu bestimmende hEGF-Lösung und ¹²&sup5;I-EGF (Amersham, IM196, UK), bis auf 30.000 cpm/100 ul in dieser Reihenfolge verdünnt worden war, wobei eine Inkubation unter Schütteln bei 100 Umdrehungen/Min. für 2 Std. folgte.
  • Dann wurde jeder Tüpfel mit Rezeptor-Bindungspuffer gespült und daran gebundene Zellen wurden von dem Tüpfel durch Inkubation mit 250 ul Zellyse-Lösung getrennt, die aus 0,1 N NaOH und 1% SDS bestand. Die Radioaktivität von ¹²&sup5;I-EGF gebundenen Zellen wurden mit der Hilfe eines γ-Scintillationszählers (Packard Cobra II, USA) bestimmt.
    • Beispiel 15: Reinigung von hEGF
  • 2 l der im Beispiel 13 hergestellten Kultur wurde bei 8000 Umdrehungen/Min. für 30 Min. zentrifugiert (SorvallTM RC 28S, USA). Die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine Amberchrom CG71 (Tosohass Corp., USA) Säule (2,5 · 40 cm) gegeben, die mit 20 mMol Trispuffer (pH 8,0) voräquilibriert worden war. Ein Waschen erfolgte mit 1 l desselben Puffers oder eine schrittweise Elution wurde mit 500 ml 20 mMol Trispuffer (pH 8,0) durchgeführt, der 40% Acetonitril enthielt. Die Flußrate wurde auf 60 cm/Std. während des Beladens, Waschens und Eluierens eingestellt. Die eluierte hEGF-Fraktion wurde bei 4ºC gelagert.
  • 350 ml einer wie oben erhaltenen hEGF-Fraktion wurden auf einer Q-Sepharose FF (Pharmacia, USA) Säule 2,5 · 40 cm gegeben, die mit 20 mMol Trispuffer (pH 8,0) voräquilibiert worden war und mit 500 ml desselben Puffers gewaschen. Eine Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten von 0 Mol bis 0,5 Mol NaCl in 20 mMol Trispuffer (pH 8,0). Hierbei wurde die Schlußrate während des Beladens, Waschens und Eluierens auf 55 cm/Std. eingestellt. 316,4 mg hEGF wurden in 80 bis 85% Reinheit erhalten.
  • Die wie oben erhaltene hEGF-Fraktion wurde mit 20% Phosphatlösung auf pH 6,5 eingestellt und auf eine C&sub1;&sub8;-Umkehrphasensäule (Walters, Delta Prep 4000, USA, 8 · 100 mm) gegeben, gefolgt von einer zweiten C&sub1;&sub8;-Umkehrphasensäule (8 · 100 mm). Die eingesetzten C&sub1;&sub8;-Umkehrphasensäulen waren mit 10 mMol Phosphatpuffer (pH 6,5) voräquilibiert und die Flußrate war auf 4 mm/Min. eingestellt, die Elution von hEGF wurde mit 10 mMol Phosphatpuffer (pH 6,5, Puffer A) und 10 mMol Phosphatpuffer, der 70% Acetonitril (Puffer B) enthielt, durchgeführt. Bei einer Retentionszeit von 29 Min. wurde eine 98% Reinheit erhalten. Tabelle 2 erläutert die HPLC- Chromatographiebedingungen für die hEGF-Reinigung. Tabelle 2
  • Die Homogenität des gereinigten hEGF im Reinigungsverfahren wurde mittels SDS- PAGE bestimmt (Schagger, H. et. al., Anal. Biol. Chem., 166: 368-379 (1987)) [siehe: Fig. 12]. In Fig. 12 ist Reihe A eine überstehende Flüssigkeit, die durch Zentrifugieren der Kultur erhalten wurde, Reihe B sind mittels Amberchrom CG71 Chromatographie isolierte Proteine, Reihe C sind mittels Q-Sepharose FF Anionenaustausch- Chromatographie isolierte Proteine und Reihe D ist mittels C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen HPLC gereinigtes hEGF.
  • Der Reinigungsschritt von hEGF ist in Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3
  • 282,3 mg gereinigtes hEGF wurden in einer Ausbeute von 48,4% erhalten. Die Proteinkonzentration wurde nach dem Bradford Verfahren bestimmt (Bradford, M., Anal. Biochem., 72 : 248 (1976)), wobei ein quantitativer Proteinkit (Biorad, #500-0006, USA) eingesetzt wurde. Das Molekulargewicht von gereinigtem hEGF wurde zu 6,000 Dalton mittels 15% SDS-PAGE-Analyse bestimmt [siehe : Fig. 13]. In Fig. 13 ist Reihe A ein Gewichtsmarker von niederer Molekulargröße (Biorad, #161-0304); Reihe B ist gereinigtes hEGF und Reihe C ist ein Peptidmarker (Sigma, #MW-SDS-175).
  • Die Reinheit des gereinigten hEGF wurde mittels HPLC analysiert und ist in Fig. 14 wiedergegeben. Wie deutlich in Fig. 14 gezeigt, wurde bestimmt, daß: die Reinheit des hEGF über 98% lag und ein Abbau des C-Terminus und eine Oxidation von Methionin nicht eingetreten war.
  • Schließlich wurde eine isoelektrische Fokusanalyse zur Bestimmung des pI-Werts im pH-Bereich von 4 bis 6 ampholyt durchgeführt (siehe: Carfin, D. E., Methods Enzymol., 183: 459-475 (1990)), wobei dessen Ergebnisse in Fig. 15 dargestellt sind. In Fig. 15 sind die Reihen A und D niedrige isoelektrische Kalibrierungsfokus-Analysemarker (Pharmacia, #17-0472-01, USA), die Reihen B und C sind 2 ug gereinigtes hEGF und Reihe E ist 4 ug gereinigtes hEGF. Wie gut aus Fig. 15 zu ersehen ist, wurde bestimmt, daß der pI des gereinigten hEGF 4,55 ist, welches derselbe pI-Wert für hEGF aus dem Stand der Technik ist.
    • Beispiel 16: Limulus Amebocyt Lysattest
  • Das gereinigte hEGf wurde lyophilisert und von einem Limulus Amebocyte Lysattest (Associates of Cape Code, USA) gefolgt. Das Ergebnis zeigte, daß die Menge an Endotoxin in hEGF unterhalb 0,36 EU pro mg lag, was extrem niedrig ist. Dementsprechend war das hEGF-Reinigungsverfahren der Erfindung sehr effizient, wobei die Kombination durch andere zelluläre Proteine und Endotoxin herabgesetzt wurde.
    • SEQUENZPROTOKOLL
  • (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
  • (i) ANMELDER:
  • (A) NAME: DAEWOONG PHARMACEUTICAL CO., LTD.
  • (B) STRASSE: 223-23, Sangdaewon-Dong, Joongwon-Ku
  • (C) ORT: Sungnam, Kyunggi-Do
  • (D) BUNDESLAND: nicht zutreffend
  • (E) LAND: KOREA
  • (F) POSTLEITZAHL: 462-120
    • (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: NEUARTIGER GENVEKTOR CODIEREND FÜR DEN MENSCHLICHEN EPIERMISWACHSTUMSFAKTOR UND VERFAHREN ZU SEINER HERSTELLUNG
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 21
  • (iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
  • (A) DATENTRÄGER: Floppy Disk
  • (B) COMPUTER: IBM PC Compatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0 Version # 1.30 (EPO)
  • (v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
  • ANMELDENUMMER: EP 94 913 826.7
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 174 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: doppelt
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ix) Merkmal:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) LAGE: 4..162 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 53 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 30 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
  • GTTAACAGCG ACTCCGAATG CCCGCTGAGC
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 35 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
  • CATGACGGCT ACTGCCTGCA CGACGGCGTA TGCAT
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 29 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
  • GTACATCGAA GCACTGGACA AATACGCGT
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 39 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 6:
  • GCAACTGTGT TGTTGGCTAC ATCGGCGAGC GCTGTCAGT
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 41 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
  • ACCGTGACCT TAAGTGGTGG GAACTGCGCT GATAACCTGC A
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 29 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
  • GGTTATCAGC GCAGTTCCCA CCACTTAAG
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 38 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
  • GTCACGGTAC TGACAGCGCT CGCCGATGTA GCCAACAA
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 29 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
  • CACAGTTGCA CGCGTATTTG TCCAGTGCT
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 36 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
  • YGGATGTACA TGCATACGCC GTCGTGCAGG CAGTAG
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 38 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
  • CCGTCATGGC TCAGCGGGCA TTCGGAGTCG CTGTTAAC
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
  • (i) SEQUENZCHAIRAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 32 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
  • GATCCAAAAT TATGAAAAAG ACAGCTATCG CG
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 30 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14: (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 32 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
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  • GTAGCGCAGG CCGGCCTGCA GCTTAÄ TT
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 32 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
  • AAGCAGCCCG CCTAATGAGC GGGCTTTTTT TT
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 32 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
  • CTAGAAAAAA AAGCCCGCTC ATTAGGCGGG CT
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 32 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
  • GCTTAATTM TTAAGCTGCA GGCCGGCCTG CG
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIIKA:
  • (A) LÄNGE: 31 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
  • CTACGGTAGC GAAACCAGCC AGTGCCACTG C
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 31 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
  • AATCGCGATA GCTGTCTTTT TCATAATTTT G
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 126 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: doppelt
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
  • GATCCAAAAT TATGAAAAAG ACAGCTATCG CGATTGCAGT GGCACTGGCT GGTTTCGCTA 60
  • CCGTAGCGCA GGCCGGCCTG CAGCTTAATT AATTAAGCAG CCCGCCTAAT GAGCGGGCTT 120
  • TTTTTT 126

Claims (5)

1. Expressionsvektor für hEGF, umfassend eine par-Stelle zur Stabilisierung in E. coli einen Tetracyclin-Resistenzmarker und eine Expressionskassette, bestehend aus einer Omp A-Leitsequenz, einer hEGF- Codierungssequenz, einer Translationsterminierungssequenz und einer trp A-Transkriptionsterminierungssequenz, wobei die Expressionskassette unter der Transkriptionsregulation durch den tac- Promoter steht.
2. Vektor gemäß Anspruch 1, wobei die hEGF-Codierungssequenz eine Restriktionsenzymspaltungsstelle für Hpal an seinem 5'-Ende umfaßt, für Pstl an seinem 3'-Ende und für Bpu1102, Nsil, M1ul, Eco-47III und AfIII und worin die Nuecleotidsequenz von folgender Codierungssequenz ist:
5' GTT AAC AGC GAC TCC GAA TGC CCG CTG AGC CAT GAC GGC 3' CAA TTG TCG CTG AGG CTT ACG GGC GAC TCG GTA CTG CCG
TAC TGC CTG CAC GAC GGC GTA TGC ATG TAC ATC GAA GCA ATG ACG GAC GTG CTG CCG CAT ACG TAC ATG TAG CTT CGT
CTG GAC AAA TAC GCG TGC AAC TGT GTT GTT GGC TAC ATC GAC CTG TTT ATG CGGG TTG ACA CAA CAA CCG ATG TAG
GGC GAG CGC TGT CAG TAC CGT GAC CTT AAG TGG TGG GAA CCG CTG GCG ACA GTC ATG GCA CTG GAA TTC ACC ACC CTT
CTG CGC TGATAACCTGCA 3'
GAC GCG ACTATTGG 5'.
3. Vektor gemäß Anspruch 2, wobei dieser pTE105 ist, wie in Fig. 10 dargestellt.
4. E. coli JM101 (KCCM 10027) transformiert mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 3.
5. Verfahren zur Herstellung von hEGF, das die Kultur von E. coli JM101 (KCCM 10027) gemäß Anspruch 4 umfaßt.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100447530B1 (ko) * 2001-08-14 2004-09-08 한국과학기술원 ＯｍｐＦ를 이용하여 목적 단백질을 대장균 세포외로분비생산하는 방법
CA2427190A1 (en) * 2002-04-30 2003-10-30 Alberta Research Council Inc. Production of recombinant epidermal growth factor in plants
TW200927161A (en) * 2007-11-15 2009-07-01 Posh Cosmeceuticals Inc Composition containing granulocyte colony stimulating factor (GCSF) for hair growth
CN103484471B (zh) * 2013-09-30 2015-07-08 王悦 人表皮细胞生长因子核酸序列及大肠杆菌表达载体
KR102013788B1 (ko) * 2016-11-04 2019-08-23 한국과학기술연구원 인간상피세포 성장인자 또는 피부침투성 인간상피세포 성장인자 발현용 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미세조류
KR102091170B1 (ko) * 2018-04-20 2020-03-19 티앤에이치바이오(주) 상피세포 성장인자의 생산 방법

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK339781A (da) * 1980-08-05 1982-02-06 Searle & Co Syntetisk gen
DE3382547D1 (de) * 1983-01-12 1992-05-27 Chiron Corp Sekretorische expression in eukaryoten.
US5096825A (en) * 1983-01-12 1992-03-17 Chiron Corporation Gene for human epidermal growth factor and synthesis and expression thereof
JPS6028994A (ja) * 1983-07-08 1985-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 〔２１―ロイシン〕ヒトウロガストロン
JPS60130393A (ja) * 1983-12-19 1985-07-11 Sumitomo Chem Co Ltd ヒトウロガストロン遺伝子，対応する組換えプラズミド及び組換え体
JP2554459B2 (ja) * 1984-07-02 1996-11-13 アース製薬 株式会社 β−ウロガストロン遺伝子、対応プラスミド組換体及び対応形質転換体
JPS61291598A (ja) * 1985-06-18 1986-12-22 Sagami Chem Res Center 魚類カルシトニン誘導体及びその製造方法
JPH0644866B2 (ja) * 1985-08-13 1994-06-15 武田薬品工業株式会社 ヒト表皮細胞増殖因子生産用形質転換体
JPH0642833B2 (ja) * 1984-10-09 1994-06-08 武田薬品工業株式会社 ヒト表皮細胞増殖因子の遺伝子
CA1263619A (en) * 1984-10-09 1989-12-05 Ryuji Marumoto Dna, production and use thereof
US4935350A (en) * 1985-11-18 1990-06-19 Amgen Materials and methods for controlling plasmid copy number and stability
US4743679A (en) * 1986-02-24 1988-05-10 Creative Biomolecules, Inc. Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
US5447862A (en) * 1987-02-04 1995-09-05 Ciba-Geigy Corporation Pectin lyase genes of aspergillus niger
DE68915841T2 (de) * 1988-03-30 1995-02-02 Hitachi Chemical Co Ltd Verfahren zur Herstellung von Epidermal-Wachstumsfaktor durch genetische Transformation.
JPH01247098A (ja) * 1988-03-30 1989-10-02 Hitachi Ltd ヒトの上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法
JPH01257482A (ja) * 1988-04-08 1989-10-13 Hitachi Ltd ヒト表皮増殖因子生産のための合成遺伝子を有するｄｎａ及びそのプラスミド組換え体
JPH0227993A (ja) * 1988-07-15 1990-01-30 Nippon Shinyaku Co Ltd ｈＥＧＦの製法
US5223407A (en) * 1988-08-31 1993-06-29 Allelix Inc. Excretion of heterologous proteins from e. coli
WO1991015228A1 (en) * 1990-04-11 1991-10-17 Indu Parikh Method for the purification of epidermal growth factor

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