JPH0227993A - ｈＥＧＦの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）を遺伝子
工学的手法を利用して効率的に製造する方法に関する。 ｈＥＧＦは、今日ではβ−ウロガストロンと同一物質で
あることが判明しており、本発明は抗かいよう剤等の医
薬品として有用であるｈＥＧＦを大量にたやすく提供し
ようとするものである。

【従来の技術１ ■ベクターに所望物質をコードする遺伝子を組み込み、
［２］このベクターを用いて宿主大腸菌を形質転換し、
［３］このようにして得られた形質転換体を培養し、■
培養液から回収することにより所望物質を取得する、の
上記［１］〜［４］の一連の操作を行う遺伝子工学的手
法については既に公知であり、人体に有用な微量蛋白質
をこの手法にのっとって取得するための種々の工夫がな
されてきた。 Ｔａｃｏｎ＋　　Ｗ、、　　Ｃａｒｅｙ、　　Ｎ、　Ｅ
ｍｅｔａｇｅ＋　　Ｓ、　　：　　、Ｍｏ１ｅｃ。 ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１７７、４２７（１９８０
）　＊Ｔａｃｏｎ、　Ｗ、、　ｅｔ、ａｌ、　　：　Ｇ
ｅｎｅ　ｌＪ＋　２５５（１９Ｂ３）　＠Ｋａｗａｉ、
　ｓ、ｌ　ｅｔ、ａｌ、　：　Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔ、
　Ｔｅｃｈｎｏｌ、＋６４、５０３（１９８６）　。 Ｏｋａ、　Ｔ、、　ａｔ、ａｌ、　：Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。 ＵＳＡ、　　８２．７２１２（１９８５）、その他に詳
しい。 最新の技術によれば、例えば、大腸菌アルカリ性ホスフ
ァターゼ遺伝子由来のプロモーターをコードする遺伝子
と、その制御下にシグナルペプチドをコードする遺伝子
とを同時に具備し、かつｈＥＧＦをコードする遺伝子を
も組み込んで組み換えＤＮＡを造成することで、最終的
にｈＥＧＦを取得する方法が開示されている（特開昭６
３−００３７９９号公報、特開昭６３−００３８００号
公報）、ここでは、培養に際してその取得収量をあげる
目的で、例えば、蛋白質合成能の誘導が起こる前は低温
域で蛋白質合成能誘導後は高温域で培養を行ったり、又
は、蛋白質合成能の誘導が起こる前は弱酸性又は中性の
条件で蛋白質合成能誘導後は弱アルカリ性の条件で培養
を行ったり、その培養方法の工夫が種々なされそれぞれ
成果をあげている。 【発明が解決しようとする課題】 上記した従来技術によれば、目的とするｈＥＧＦはなる
ほどある程度の収量を得ることができる。 しかしながら、培地への分泌発現を伴らた高密度培養を
目指す場合には多くの欠点があった０例えば、■これま
での方法では形質転換大腸菌がｈＥＧＦの産生を開始す
る時期を任意にコントロールすることができない、■そ
のため、ｈＥＧＦ産生を開始する前に形質転換大腸菌を
充分に増殖させておくことができない、■従って、いわ
ゆる高密度培養（本明細書中では４００Ｄｓｉ。以上の
大腸菌による培養のことをいうこととする）をする場合
には、形質転換大腸菌がｈＥＧＦを産生ずる過程をコン
トロールすることができないという欠点を有していた。 更に、高密度培養に必須であるフェッド・バッチ（Ｆｅ
ｄ−Ｂａｔｃｈ）法（培養中に培地を添加しつつ培養を
継続する手法）を適用することも原理的に不可能であっ
た。 本発明者らの実験によれば、形質転換大腸菌がｈＥＧＦ
の産生を開始すると、形質転換大腸菌自体の増殖が抑制
される現象がある。この理由は必ずしも明らかではない
が、産生されたｈＥＧＦは形質転換大腸菌の細胞内やペ
リプラズム（内膜と外膜との間）に留まることなく細胞
外に分泌されるというｈＥＧＦ特異の現象から、形質転
換大腸菌に大きなストレスがかかっていることが推測で
き、これによりｈＥＧＦ産生と同時に形質転換大腸菌自
体の増殖が抑制されるためと推測される。 以上のことから、高密度培養を実現せしめるためには、
形質転換大腸菌を充分に増殖せしめた時点でｈＥＧＦ産
生を開始する必要があり、このためにはｈＥＧＦ産生時
点を任意にコントロールすることができることが必須で
あった。

【課題を解決するための手段】

本発明の要旨は、以下の諸点にある。 ■プロモーターとしてｔｒｐ合成酵素系遺伝子のプロモ
ーターをコードする遺伝子を使用すること。 ■３−インドールアクリル酸（Ｉ　ＡＡ）を添加するこ
とで形質転換大腸菌がｈＥＧＦを産生ずる時期をコント
ロールすること。 ■培養にあたって、添加すべき培地の添加速度を可変と
するフエッド・バッチ法を駆使すること。 ■添加する培地の炭素源が、グルコース、グリセロール
、又はグルコースとグリセロールの組み合わせであるこ
と。 ■更に、上記■におけるフェッド・バッチ法において、
添加する培地の炭素源として、グルコースを用いた後に
グリセロールを用いること。 以下に、上記の諸点について詳しく述べる。 プロモーターとして大腸菌アルカリ性ホスファターゼ遺
伝子由来のものを適用した場合には、培地中のリン酸塩
の存在によりｈＥＧＦ産生能が停止している。形質転換
大腸菌が増殖しこの過程でリン酸塩が消費され、一定濃
度以下になることで大腸菌アルカリ性ホスファターゼ遺
伝子由来プロモーターが働きを始めてｈＥＧＦ産生が開
始する。 この間の現象を培養液のｐＨと温度とを調節することで
、そのｈＥＧＦ産生能を高めようとするのが従来の技術
であった。 本発明においては、大腸菌アルカリ性ホスファターゼ遺
伝子由来のプロモーターの代わりに上記したｔｒｐ合成
酵素系遺伝子のプロモーターを適用する。 本発明においては、培地中に５０ｍｇ／Ｉ！程度のトリ
プトファンを加えておく、形質転換大腸菌の増殖に従っ
てトリプトファンが消費され一定濃度以下になればｔｒ
ｐ合成酵素系遺伝子のプロモーターが働き始めｈＥＧＦ
産生を開始するが、充分のトリプトファンが培地中に存
在すれば、本発明のプロモーターがｈＥＧＦ産生を開始
することはない。 また後記実施例に示すように、特に形質転換大腸菌はｈ
ＥＧＦを分泌すると増殖速度を弱め又は増殖を止める性
質を存している。 これらのことから、本発明に用いたｔｒｐプロモーター
をもつ分泌発現プラスミドベクターは、その厳密な発現
制御が容易に可能であるところから、後述する形質転換
大腸菌の高密度培養に利用するのに極めて適しているこ
とが判った。即ち、分泌ｈＥＧＦの産生量を１５０ｍｇ
／ｊ！以上に上げるためには、トリプトファン存在下で
培養を行って形質転換大腸菌が充分高密度に増殖したと
きにＩＡＡをすばやく添加し、短時間（１０〜１８時間
）後に産生物を培地から回収することができる。 また、フェッド・バッチ法における添加培地中にグルコ
ースの代わりにグリセロールを加えておくこと又は添加
途中でグルコースをグリセロールに変更することにより
、後に詳述するようにｔｒｐプロモーターの働きを開始
する時期を巧妙にコントロールすることが可能となる。 ところで、ＩＡＡはトリプトファンの構造類似体であっ
てかつレプレッサー蛋白への親和性はトリプトファンよ
りも強いので、レプレッサーと優先的に結合することに
より、レプレッサーがプロモーター（オペレーター）に
結合するのを防ぐ。 従って培地中にトリプトファンが存在する状態において
もＩＡＡを培地中に添加することによりこのプロモータ
ーが働きを開始する。 以上のことから、本発明においては、培養中のいずれの
段階においても、ＩＡＡを添加することで高密度培養条
件下での培地中への分泌発現によるｈＥＧＦ産生を開始
させることができることが理解できる。本発明の重要な
要旨は、実はここにある。 形質転換大腸菌の増殖を高めれば、その後のｈＥＧＦ産
生がそれに比例して高まることが判っている。培地自体
の工夫により、又はフェッド・バッチ法の通用により、
培地中の形質転換大腸菌の密度を高めることができるか
ら、その高密度培養によって形質転換大腸菌の増殖を高
めた後にｈＥＧＦ産生を開始させてやれば、それだけ効
率的にｈＥＧＦを取得することができることとなる。 （以下次頁） 本発明においては、通常の遺伝子工学上で常用されてい
る方法を適宜用いることができる０例えば、宿主大腸菌
としては汎用されているに１２由来大腸菌株を使用し、
またベクターとしては市販のプラスミドを遺伝子工学的
に組み換えて使用することができる。更に具体的には、
本発明においては、以下のような大腸菌を使用すること
ができる。 ＪＭＩＯＩ　、ＴＢＩ　、　ＨＢＩＯＩ、ＲＲＩ、Ｄ旧
、ＭＭ２９４、Ｃ６００ｇＣ６０Ｏ、Ｙ１０９０（ｐＭ
Ｃ９消失株）。 また、これらの誘導株も使用することができる。 また、本発明においては、例えば、以下のようなプラス
ミド及びファージＤＮＡを使用することができる。 ｐＤＲ５４０（ファルマシア社製）　、ｌ’ｌ１３ｍｐ
ｌＢ及びｍｐ１９（宝酒造製）。 また本発明においては、例えば、以下のような培地を基
礎培地及び添加培地として使用することができる。 ＬＢ培地（１０ｇ／ｌバクトドリプトン、５ｇ八へ母エ
キス、５ｇ／１食塩）。 Ｍ９培地（６ｇ／ｌリン酸水素酸水素ジナトリウム／１
１ノン酸二水素カリウム、０．５ｇ／１食塩、Ｉｇ／ｌ
塩化アンモニウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１ｍ
Ｍ塩化カルシウム）、 ４ＹＴＭ９培地（Ｍ９培地に以下の成分を添加したもの
、　　３２ｇ／ｌバクトドリプトン、２０ｇ／ｌ酵母エ
キス）また、平板培地には１．５％となるよう、Ｍ１３
ファージ上層培地には０．６％となるよう寒天を加えて
調製することができる。すべてのプラスミドを含む大腸
菌の培養には、アンピシリンを１００ｍｇ／ｌとなるよ
うに培地に加えてプラスミドの離脱を防ぐようにするこ
とができる。 本発明において使用する制限酵素とＤＮＡ修飾酵素とし
ては、通常の遺伝子工学上で常用されているものを適宜
使用することができる０例えば、宝酒造製、東洋紡製、
ファルマシア社製、及びベーリンガーマンハイム社製の
ものを適宜使用することができる０本発明においては、
これらのものは、説明書及び文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ　；ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｎ＋
ａｎｕａ１．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に従って使用するこ
とができる。 また、本発明においては、大腸菌の形質転換、プラスミ
ド精製及びファージＤＮＡ精製は、通常の遺伝子工学上
で常用されている手法を適宜使用することができる。ま
た、文献（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）の記載
及び説明書に従ってすることができる。 本発明におけるオリゴヌクレオチドは、通常のＤＮＡ合
成で常用されている手法（例えば、トリエステル法）を
適宜使用することにより合成することができる。また一
方、市販のＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムＡ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製　モデル３８０
Ｂ）によっても行うことができる。 また、本発明におけるオリゴヌクレオチドの連結は、通
常の遺伝子工学上で常用されている手法を適宜使用する
ことができる。具体的には、例えば、各合成オリゴヌク
レオチド１μｇを、２０μ２のリンカ−キナーゼ緩衝液
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇによる）中でリ
ン酸化した後混合し、７０°Ｃ１１０分間加熱した後、
室温まで約１時間かけて徐冷し、次に混合液と同量の１
倍濃度リンカーキナーゼ緩衝液を加え、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを加え、１６℃−晩装置した０次に７０°Ｃで１０
分間加熱してＴ４リガーゼを失活させた後、エタノール
沈澱法によって緩衝液を交換し、目的とする断片を生じ
るよう両端の制限酵素で切断した後、８％ポリアクリル
アミドスラブゲル電気泳動で分画する。目的のＤＮＡ断
片を含むゲルからは、緩衝液による抽出（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇによる）法でＤＮＡを抽出し精
製する。このような手法は、本発明におけるオリゴヌク
レオチドの連結の典型的な例である。 本発明における目的物であるｈＥＧＦｉｉの測定にあた
っては、通常の遺伝子工学上で常用されている手法を適
宜使用することができる。具体的には、例えば、市販の
ｈＥＧＦ　（湧永製薬製、アマジャム社製）を標準とし
てラジオイムノアッセイ（アマジャム社製キットを使用
）によって測定することができる。

【実施例】

以下に参考例及び実施例を掲げて、本発明を更に詳しく
説明する。 参考例１ ［分泌発現プラスミドの作製］ （１）ｔｒｐプロモーター、ＳＤ配列、大腸菌アルカリ
性ホスファターゼシグナルペプチド遺伝子の合成利用す
るｔｒｐプロモーターとそのＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄ
ａｒｇａｒｎｏリポソーム結合部位）ば、転写開始点の
Ａを＋１とした場合の一６０位のＴから＋２６位の４ま
でとした。−６０位のＴの５゛側にはベクターとの連結
を考慮して旧ｎｄｌ［ｌ切断点を設けた。大腸菌アルカ
リ性ホスファターゼシグナルペプチド遺伝子は、天然の
配列に従ったが、ベクターとの連結とｈＥＧＦ遺伝子へ
の連結を考慮して開始コドンのＧＴＧをＡＴＧへ変更し
、Ｃ末端のＧＣＴをＧＣＧへ変更し、その３″側へＥｃ
ｏＲｌ切断点を設けた０以上の配列を８個のオリゴヌク
レオチドに分けて合成し、常法に従って連結し、旧ｎｄ
Ｉ［［−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片として精製した。また、
この断片をＭ１３ｓ＋ｐ１Ｂファージ複製型ＤＮＡの旧
ｎｄＩ［Ｉ　　ＥｃｏＲＩ切断点間に挿入し、ジデオキ
シ（ｄｉｄｅｏｘｙ）法により塩基配列の確認を行った
（図１）。 （２）ｈＥＣ，Ｆ遺伝子の合成 ｈＥＧＦ遺伝子の配列は、天然のｈＥＣ；Ｆのアミノ酸
配列を基にして考案した。配列の考案に際しては、大腸
菌で使用頻度の高いコドンの使用、二次構造をとりうる
ような繰り返し配列の除去、遺伝子中程に遺伝子連結の
ため必要なｓｐｈ　ｌ切断点を設けること、の３点を考
慮した。 具体的には、２１個のオリゴヌクレオチドからなるＥｃ
ｏＲＩ　−５ａｃ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片としてｈＥＧＦ
遺伝子を作製した。 まず前半部分のＢｃｏＲＩ　　　Ｓｐｈ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　
Ａ断片を構成する１１個のオリゴヌクレオチドを常法に
従って合成、連結し、Ｍ１３ｍｐ１８ファージ複製型Ｄ
ＮＡのＥｃｏＲＩ　−Ｓｐｈ　ｌ切断点間に挿入しジデ
オキシ法により塩基配列の確認を行った。 次に後半部分の５ｐｈＩ−ＳａｃＩＤＮＡ断片を構成す
る１０個のオリゴヌクレオチドを常法に従って合成、連
結し、Ｍ１３ｍｐｌＢファージ複製型ＤＮＡのＳｐｈ　
Ｉ　−５ａｃ　ｌ切断点間に挿入し、ジデオキシ法によ
り塩基配列の確認を行った。 それぞれの組換Ｍ１３ファージの複製型ＤＮＡより、前
半部分のＥｃｏＲＩ　−５ｐｈ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片と
後半部分の５ｐｈｌ−ＳａｃｌＤＮＡ断片を切り出して
連結し、ｈＥＧＦ遺伝子を作製した。 完成したｈＥＧＦ遺伝子は、５゛末端がＥｃｏＲｌ切断
点になっており、この部分は、ｈＥＧＦのＮ末端アミノ
酸のアスパラギンに相当する。３°末端はＳａｃ　ｌ切
断点になっており、その直前には終止コドンＴＧＡ、　
ＴＡＧが連続する形になっている。連結したｈＥＧＦ遺
伝子のＥｃｏＲＩ　−５ａｃ　Ｉ　Ｄ　ＮＡＩＭ片をＭ
１３ｍｐ１８ファージ複製型ＤＮＡのＥｃｏＲＩ　−５
ａｃ■切断点に挿入し、ジデオキシ法により、再度塩基
配列の確認を行った（図２）。 （３）分泌発現プラスミドの作製 まずｐＤＲ５４０（ファルマシア社製）のＥｃｏＲｌ切
断点をＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏ−断片とＴ４リガ
ーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を用いた常法により消失せしめ、
ｐＤＲ５４０Ｅ−プラスミドを作製した。 次にこのｐＤＲ５４０Ｅ−ＤＮＡのＢａ５ａｌ　ｌ切断
点に常法に従って合成、連結したリンカ−を挿入し、新
たにＥＣ０ＲＩ、Ｘｈｏｌ、　５ａｃｌＳＰｖｕＩＩ切
断点を導入した。 更にこのＰｖｕ　ｎ切断点にｔｒｐ　Ａターミネータ−
配列（ファルマシア社製）を挿入してｐＡＴＧｔプラス
ミドを作製した。このＩ）ＡＴＧ　ｔプラスミドＤＮＡ
のＥｃｏＲｌ切断点とＳａｃ　ｌ切断点の間に、合成ｈ
ＥＧＦ遺伝子を含むｌ！ｃｏＲＩ　　Ｓａｃ　Ｉ　Ｄ　
Ｎ　Ａ断片を挿入し、ｐＢ７１９プラスミドを作製した
。 次にｔｒｐプロモーター・ＳＤ配列、大腸菌アルカリ性
ホスファターゼシグナルペプチド遺伝子を含む旧ｎｄＩ
Ｉ［−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片を、ｐＢＴ１９の旧ｎｄ■
切断点とＥｃｏＲｌ切断点の間に挿入し、ｈＥＧＦ分泌
発現プラスミドｐＢＴ２３を作製した（図３、及び図４
）。 参考例２ ［ｈＥＧＦの発現とその分布］ ｐＢＴ２３　Ｄ　Ｎ　Ａを用イテ大腸菌Ｃ６００ｇＣ６
０Ｏを形質転換し、ｐＢ７２３を保持する形質転換大腸
菌を得た。 このｐＢＴ２３を保持しているＣ６Ｃ６０Ｏｌ　Ｋ−株
を０．１１のＬＢ培地で一夜振盪培養し、前培養液とし
た。 ０、ｉ容振盪フラスコにおいて０．２２のＭ９培地（５
ｇ／ｌカザミノ酸、２ｇ／ｌグルコース、１０ｍｇ／ｆ
ビタミンＢｌ、１００ｍｇ／　ｌアンピシリンを含む）
に前記の前培養液を４ｄ植菌しく２％植菌）、３７°Ｃ
で１２５回／分の振盪を行い培養した。対数増殖初期（
このときの０Ｄｓｓｏは約０．１）に３−インドールア
クリル酸（Ｉ　ＡＡ）を２０Ｂ／Ｊ！となるように添加
して、ｔｒｐプロモーターの誘導を行った。培養開始１
．２．４．６．８．２４時間後に試料を採取し、遠心分
離して培地と菌体成分とを分離し、菌体からはさらに浸
透圧ショック法によりそのペリプラズム画分を分離した
。培地中とペリプラズム中のｈＥＧＦｉｉは、ラジオイ
ムノアッセイ法（アマジャム社製キット）により測定し
た。結果を表１に示す。 培養開始２４時間で、培地中のｈＥＧＦ量は０．７３ｍ
ｇ／ｉと最大となった。ペリプラズムに蓄積するｈＥＣ
−Ｆ量は培養４時間で最大となるが、その量はたかだか
０．０２ｍｇ／　１−程度であり、培養２４時間には減
少してほとんど存在しなくなっていた。 これらのことから、分泌されたｈＥＧＦはそのほとんど
が培地中に存在することが確認できたので、以降の実験
では産生ｈＥＧＦ量は培地中の量のみを測定した。 参考例３ ［宿主大腸菌株の検討］ ｐＢＴ２３　ＤＮＡを用いて、大腸菌ＨＢＩＯＩ、ＲＲ
Ｉ、ＤＨＩ　、ＭＭ２９４　、Ｙ１０９０（ｐＭＣ９消
失株）　、ＪＭＩＯＩ　、７８１株を形質転換し、それ
ぞれのｐＢＴ２３を保持する形質転換大腸菌を得た。 先のＣ６Ｃ６０ＯＩ　Ｋ−形質転換株とともに参考例２
と同様の条件で培養を行った。ＩＡＡによるｔｒｐプロ
モーターの誘導は、培養開始後９．５時間に行い、その
時と２４時間後の培地中のｈＥＧＦ量を測定した（表２
）。 ８種類の形質転換大腸菌のうちＴＢＩが最も産生量が多
く４ｍｇ／ｌに達した。その次がＣ６００Ｃ６０Ｏ−と
［１Ｂ１０１で、ともに１．２５　ｎｇ／　ｌであり、
これらの株がｈＥＧＦ産生に適していると考えられた。 参考例４ ［ｔｒｐプロモーター誘導時期の検討］ｐＢ７２３を保
持しているＨＢＩＯＩ形質転換株を用いて参考例２と同
様の条件で培養を行い、対数増殖中期、後期、定常期に
それぞれＩＡＡを２０ｍｇ／／！となるよう添加して培
地中のｈＥＧＦ量を調べた。 結果を表３に示す。 （以下次頁） 表３　　ｔｒｐプロモーター誘導時期とｈＥＧＦ産生て
は表４のものを用いた）　、　　４ＹＭ９．　Ｍ９−１
．　Ｍ９−２を培地として用いた場合には、５．５時間
後に、Ｍ９−３、Ｍ９−４を培地として用いた場合には
９時間後に、ＩＡＡを２０ｍｇ／ｆｆｉとなるよう添加
し、培養開始９．２４時間後の培地中のｈＥＧＦ量を測
定した。 対数増殖中期又は定常期にＩＡＡを添加した方がｈＥＧ
Ｆ産生量が多くなることが判った。 参考例５ ［培地組成とｈＥＧＦの産生量］ ｐＢ７２３を保持しているＴＢＩ形賞転換株を用いて参
考例２と同様の条件で培養を行った（培地としＨ９−３
培地（５ｇ／　１カザミノ酸、２ｇ／ｌグルコースを含
む）を用いた場合、ｈＥＧＦ産生量が最大（７，２５ｍ
ｇ／　ｌ　）　となった、また、トリプトファンを多量
に含有する天然成分（例えば、酵母エキス、バクトドリ
ブトン）を主体とする培地では、ｈＥＧＦ産生量が少な
いことが判った。 参考例６ ［培地中のトリプトファンによるｔｒｐプロモーターの
制？ａｌ］ 前記した各参考例等における′培養ｔよ、培地にトリプ
トファンを含んでおらず、前培養液由来のトリプトファ
ンが大腸菌の増殖に伴い一定濃度以下になった時期から
ｔｒｐプロモーターの誘導が起こる自然誘導系であった
。この系では、誘導物質であるＩＡＡは、ｈＥＧＦ産生
量を増加させるが、直接ｔｒｐプロモーター誘導のスイ
ッチをＯｎにさせることはなかった。 そこであらかじめ培地にトリプトファンを加えておき・
ｔｒｐプロモーターからの誘導を抑制できるか否か、ま
た抑制できるとしたらＩＡＡ添加により抑制解除が可能
か否かを確かめることとした。 加えるトリプトファンの量は−１，３，１０，２０，３
０，４０ｍｇ／ｊ！とじ、またＩＡＡを表６に示す濃度
となるように加えた。 ｐＢＴ２３を保持しているＨＢＩＯＩ形質転換株を用い
て培地及び条件は参考例２と同様にして培養した。 またＩＡＡは、培養開始５時間後に添加し、培地中のｈ
ＥＧＦ量を測定した。結果を表６に示す。 （以下次頁） 表６−１ 培地中トリプトファン濃度と ｈＥＧＦ産生量 培地に加えるトリプトファンの濃度がＬｏｎｇ／ｊ！以
下では、ｈＥＧＦ産生量は６〜１０＋＋＋ｇ／ｊ！であ
るのに対して、２０〜４０ｍｇ／ｊ！では１〜１．５ｔ
ｍｇ／　１２と大幅に減少し、一定濃度以上のトリプト
ファンはｈＥＧＦ産生を抑制することが判った。 また、トリプトファン濃度が２０ｍｇ／ｌの場合では、
ＩＡＡを２０又は４０１ｇ／ｌ添加するとｈＥＧＦ産生
量が約８倍増加したが、８０＋ｓｇ／ｌ添加では約４倍
の増加にとどまった。トリプトファン濃度が３０〜４０
ｔｍｇ／ｌの場合には、Ｉ　Ａ　Ａ８０＋ｅｇ／　ｌ−
添加によるｈＥＧＦ産生量の増加は約１．５倍と、小さ
かった。 以上の結果から、適当な量のトリプトファンの添加（こ
こでは２０ｔａｇ／　Ｉｔ　）は、ｔｒｐプロモーター
からの誘導を抑制すること、またＩＡＡの添加（２０〜
４０ｍｇ／　ｘ　）はその抑制を解除し、ｔｒｐプロモ
ーターのスイッチをｏｎにすることが確かめられた。ま
た微量のトリプトファンの添加は、形質転換大腸菌の増
殖を促進することが判っており（１０〜４抛ｇ／ｌのト
リプトファン添加により菌体量は１．５〜２倍になる）
、また４０ｓ＋ｇ／ｊ！以上の過剰の■Ａ、Ａの添加は
大腸菌の増殖を抑制し、ｈＥＧＦ産生量の低下を招くこ
とも判った。 以上をまとめると、以下のようになる。 （１）目的とするｈＥＧＦは、充分の培養により、はと
んどすべてが培養液中に出てくること。 （２）宿主大腸菌としては、）ＩＢＩＯＩ　、ＴＢＩ　
、又はＣ６００ｇＣ６０Ｏが適当テアルコト。 （３）　Ｉ　Ａ　Ａによるｔｒｐプロモーターの誘導は
、増殖後期が至適であること。 （４）培地としては、Ｍ９培地に５ｇ／ｌカザミノ酸、
２ｇ／ｌグルコース、１０ａ＋ｇ／ｊ！ビタミンａｔを
加えたものが適当であること。 （５）培地中にトリプトファンが存在していても、ＩＡ
Ａを添加することにより、ｔｒｐプロモーターの誘導が
可能であること。 これらの事実を指標として、ジャーファーメンタ−によ
る大量の高密度培養が可能となることを推測し、以下の
実験を行った。また大量実験に耐えるための大腸菌培養
上清中のｈＥＧＦの精製法を検討し、以下の方法を創案
した。 実験例１ ［ｈＥＧＦの精製法］ （１）陽イオン交換樹脂（８１０−ＲＥχ７０；バイオ
・ラッド社製）への吸着（ｐＨ３，０）→溶出（酢酸ア
ンモニウム　ｐＨ８，０）→透析（酢酸アンモニウム　
ｐＨ５，５）Ｃ）陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ；フ
ァルマシア社製、酢酸アンモニウム　ｐＨ５，５） （３）逆相（Ｃｐｍ）カラムクロマトグラフィー　（Ｐ
ｅｐＲＰＣ；ファルマシア社製、０．１％トリフルオロ
酢酸／アセトニトリル）→凍結乾燥 この方法は全工程を２〜４日で行うことができるほか、
通常用いられるゲル濾過クロマトグラフィーを含まない
ので、スケールアップが容易である。 例えば、この方法を用いて１０ｊ！の培養上清から１０
ａ＋ｇの精製ｈＥＧＦを得ることができた。 精製ｈＥＧＦは天然型と同じアミノ酸組成及び天然型と
同じＮ末端アミノ酸配列を有していた。 さらに精製ｈＥＧＦは、以下に述べる実験において生物
活性を示した。 実験例２ ［ＥＧＦレセプターへの結合能］ 以下に述べる方法に従って、精製ｈＥＧＦのヒト細胞表
面ＥＧＦレセプターへの結合能を確かめた。 ヒ）　Ａ４３１細胞を、１０％牛脂児血清（ギプコ社製
）を含むダルベツコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地：
ニッスイ製）に、１０４細胞／ｄとなるように懸濁した
。この細胞懸濁液を２４穴培養プレートに、１大当たり
ｌｌｌ１ずつ加え、３７°Ｃ，５％ＣＯｚ下で２４時間
培養した。細胞を５９＋ｇ＋ＭのＮ、Ｎ−ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（Ｂｕ
ｓ％ｐＨ６，５）、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ
　：　シグマ社製）を含むＤＭＥＭ培地（結合用緩衝液
）で２回洗浄した後、０．２ｍｇ／ｒｄのＩ：ＳＩ標１
ＩＩｈＥＧＦ（アマジャム社製）と０．１〜１Ｇ、　０
００ｎｇ／　ｄ　ｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆを含む結合用緩衝液を
０．３ｍ加えた。 室温で１時間放置した後、細胞を結合用緩衝液で２回洗
浄し、０．２１’ｌ水酸化ナトリウム溶液を１穴当たり
０．３ｄ加え、細胞を溶解した後、ＥＧＦレセプターへ
結合した”’　Ｉ　−ｈＥ　Ｇ　Ｆの放射活性を測定し
た。結果を表７に示す。 以上の結果から、精製ｈＥＧＦは、ヒト培養細胞のＥＧ
Ｆレセプターへの結合能を有していることが確かめられ
た。 実験例３ ［細胞増殖促進作用］ 以下に述べる方法に従って、精！！ｈＥＧＦの細胞増殖
促進作用を確かめた。 マウス５ｗ１ｓｓ　３７３１！胞を１０％の牛胎児血清
を含むＯＭＥＮ培地に１０’細胞／ｄの割合で懸濁した
。この細胞懸濁液を２４穴培養プレートに１穴当たりｌ
ｄずつ加え、３７℃、５％ＣＯｇ下で細胞が対数増殖中
期に達するまで培養した。培地を０．２％牛脂児血清を
含むＤＭＨＭ培地と交換し、さらに３７℃、５％ＣＯｔ
下で培養を続けた。はとんどの細胞が定常期になったと
ころで、ｈＥＧＦを加え、さらに８時間培養を続けた。 〔メチル−３Ｈ〕チミジン（２４７，９ＧＢｑ／ｍ＋５
ｏｌＢアマジャム社製）を１穴当たり０．５μＣｉ添加
し、２４時間培養した後、細胞内に取り込まれた〔３Ｈ
〕−チミジンの放射活性を測定した。結果を表８に示す
。 以上の結果から、精製ｈＥＧＦの細胞増殖促進作用が確
かめられた。 実験例４ ［モルモット胃壁細胞における酸生成の抑制］以下に述
べる方法に従って、精製ｈＥＧＦの分離壁細胞における
胃酸生成抑制作用を１４Ｃ−アミノビリン（ＡＰ）蓄積
を指標として確かめた。 分離壁細胞懸濁液（１，８０ｘｌＯ’細胞ノー、０．２
％ＢＳＡ含有Ｈａｎｋｓ液にッスイ製））を゛、１００
％酸素通気下に３７℃で２０分間保温をした後、０．１
μＣｉ”Ｃ−ＡＰ（４，３７ＧＢｑ／＋ｎｏｌ：アマシ
ャム社製）、精製ｈＥＧＦ及び刺激剤としてヒスタミン
（半井化学製）を３μｎ又は　ジブチリルサイクリック
ＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｌｙｌ　ｃｙｃｌｉｃ−ＡＭＰ）
（ｄｂｃ−ＡＭＰ、シグマ社製）を１＋ｓＭとなるよう
に加え、再び保温した。　６０分後、水冷Ｈａｎｋｓ液
４ｊｄｌを加え、ついで低速冷却遠心にて反応を停止さ
た。細胞は２１’ｌ水酸化ナトリウム溶液０．３ｄを加
えて溶解させ、２Ｎ塩酸で中和した後、液体シンチレー
シ四ンカウンターで放射活性を測定した。 ”　Ｃ−ＡＰ蓄積は刺激時の取り込み値から、コントロ
ール値を差し引いた値を１００％とし、精製ｈＥＧＦの
作用を％刺激で表示し、表９に示した。 以上の結果から、精製ｈＥＧＦは、ヒスタミン、ｄｂｃ
−＾肝のいずれの刺激によるモルモット胃壁細胞の酸生
成をも抑制する活性を有していることが確かめられた。 実施例１ ［バッチ法］ 前記したフラスコ培養で得られた種々の知見をもとに、
１０ｆのジャーファーメンタ−による大量培養を試みた
。ファーメンタ−としては、１０Ｉｔ容のオリエンタル
酵母社製の卓上型を用い、また培地中のｐＨと溶存酸素
濃度を調整する制御装置を取りつけた。宿主にはＨＢＩ
ＯＩを用いた。 前培養は、ＬＢ埼地で行い、それを２％植菌した。 培地として阿９培地（５ｇ／ｌカザミノ酸、２ｇ／ｌグ
ルコース、１０ｍｇ／ｌビタミンＢ＋１１００韻ｇ／ｌ
アンピシリン含有）を６１用い、３７°Ｃで通気量１　
ｖｖｍ（ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕ＋＊ｅ／ａ＋１ｎｕｔ
ｅｓ：　　１分間に培養容量と同量の空気をコンプレッ
サーで送り込むこと、ここでは６１分）、溶存酸素濃度
４ｐｐｍ＋　（攪拌羽根の回転数を１００＝１０００ｒ
ｐａ＋の間で変化させて制御した）　、ｐＨ１，０（４
Ｍ水酸化ナトリウム溶液滴下により制御した）、自動消
泡（ファーメンタ−上部のセンサーにより発泡状態を感
知し自動的にシリコン系消泡剤を滴下し消泡する）、の
条件で培養を行った。ＩＡＡは４．５時間後に添加し、
添加濃度は２０ｍｇ／ｊ！であった。 対照として同じ前培養液、同じ培地組成で参考例２と同
じ条件でフラスコ培養を行った。結果を図５に示す。 ファーメンダー培養でもフラスコ培養でも４時間経過後
からｈＥＧＦ産生が始まり、９時間後まではほぼ同量の
の産生が続いたが、２４時間後ではフラスコ培養で９ｔ
ｓｇ／１２の産生がみられたのに対して、ファーメンタ
−培養では９時間経過時とほぼ同じ２ｍｇ／ｊ！の産生
が認められただけであった。 従って、通常のバッチ法では、ｈＥＧＦ産生量を向上さ
せることが不可能であることが判った。 ファーメンタ−培養では、培地中の溶存酸素量とｐＨが
一定に保たれ、大腸菌の増殖に最適の条件が常に提供さ
れているがために培地中のトリプトファンが消費され、
ある濃度以下になり、ｔｒｐプロモーターが働きを開始
したときには培地中の栄養１ｌｌＩ（炭素源、窒素源等
）が枯渇してしまうためと考えられる。 そこで以下に述べるように、培養中に新しい培地を継続
的に添加するフエッド・バッチ法を考えてみることとし
た。 実施例２ ［フェッド・バッチ法−その１］ 実施例１と同じ培養条件を用いて、４時間後にＩＡＡ添
加と同時に添加培地（２０ｇ／ｌカザミノ酸、２００ｇ
／ｌグルコース、１０ｍｇ／ｆビタミンＢ、、　　１０
０ｍｇ／ｌアンピシリン、２０ｔａｇ／　Ｉ！　Ｉ　Ａ
　Ａを含有するＭ９培地）を、チューブポンプを使用し
て３０ｄ／時間で２４時間添加した。対照としてフラス
コ培養も行った。結果を図６に示す。 ファーメンタ−培養では６時間後からｈＥＧＦ産生が増
加し、９時間後で２５ｍｇ／ｊ！、２４時間後で５５ｍ
ｇ／ｊ！と、実施例１のバッチ法に比べて約２５倍の増
加を示した。 しかし、最大でもまだ５５ｍｇ／ｊ！程度にとどまり、
また菌体増殖も０Ｄｓｓｏで６程度と、高密度培養の初
期の目的にはほど遠いことから、更に検討を加えた。 培地にあらかじめトリプトファンを加えておくと菌体量
が増加することが判っており、基本培地にトリプトファ
ンを添加してｔｒｐプロモーターの働きを抑制して菌体
量の増加を図ることとした。 この場合に、培地中にトリプトファンが残存するとＩＡ
Ａを添加した際にｔｒｐプロモーターの働きを阻害する
ことが判っていたから、ＩＡＡ添加時にトリプトファン
が分解されていることが望まれた。 一方、グリセロールはグルコースと異なり、カタボライ
ト抑制を生じることがない、また、カタボライト抑制が
解除されたときにはトリプトファナーゼ（トリプトファ
ン分解酵素）が生産されて大腸菌内のトリプトファンを
分解することが判っている。 以上のことから、添加する培地には、グルコースの代わ
りにグリセロールを用いることとした。 これにより、基本培地中にあるグルコースが消費され尽
くしたときにカタボライト抑制が解除されトリプトファ
ナーゼが生産されてトリプトファンが無くなり、ｔｒｐ
プロモーターの働きが開始される、という仕組みが期待
できる。 また添加する培地の添加速度も大腸菌の増殖に合わせて
変化させることとし、きめこまかな工夫を試みた。 実施例３ ［フェッド・バッチ法−その２］ 基本培地にトリプトファンを３０ｍｇ／ｊ！となるよう
に加えることのほか、培地組成と培養条件は実施例１と
同一とし、３時間後より添加培地（５ｇ／ｌカザミノ酸
、２００ｇ／　１グリセロール、１０ｍｇ／７！ビタミ
ンＢ１．１００　ｍｇ／　ｌアンピシリン、５ｍｇ／　
ｌ　Ｉ　ＡＡを含有するＭ９培地）を添加し始め、４時
間後にＩＡＡを添加した。なお過剰量のＩＡＡは大腸菌
の増殖とｈＥＧＦ産生を阻害することから５−ｇ／２と
なるように加えた。 培地の添加には、Ｐ１チューブポンプ（ファルマシア社
製）、パーソナルコンビ五−ター（９８０１ＶＸ４１．
日本電気型）を用いた。添加速度は添加中合計４９回変
化するようにプログラムした。大腸菌の増殖とｈＥＧＦ
産生量とを図７に示した。 大腸菌の増殖速度が低下する５時間後項からｈＥＣＦ産
生が始まり、２４時間後のｈＥＧＦ産生量は７０■ｇ／
２に達した。また国体の増殖も０Ｄｓｓｏで９と増加し
た。 以上の結果から、菌体量の増加に伴ってｈＥＧＦ産生量
が増加することが判った。 そこでさらに高密度の培養を行うため、培地組成、添加
時期の詳細な検討を試みた。具体的には宿主大腸菌の増
殖に必須なアミノ酸を培地に添加することと、添加培地
中の炭素源を途中でグルコースからグリセロールに変更
することであった。 前記のようにグルコース存在下ではトリプトファンは大
腸菌の増殖に伴って消費はされるが、トリプトファナー
ゼによって分解されることはない。 そこで初めの添加培地にはグルコースとトリプトファン
とを加えておき、ｔｒｐプロモーターの働きを抑えなが
ら、大腸菌を充分に増殖させた後、ＩＡＡを添加、同時
に添加培地をグリセロール含有のものに変更して残存ト
リプトファンを分解してＩＡＡの働きを強め、ｈＥＧＦ
産生量を増加させようとするものであった。 実施例４ ［フェッド・バッチ法−その３］ これまでと同様のフェッド・バッチ法により以下のよう
に培養した。 （１）培地組成 ■基本培地 ｈ９培地に以下のものを加えたもの。 カザミノ酸　２．５ｇ八、グルコースＬｏｇ／ｌ、トリ
プトファン　５０ｍｇ／ｊ！、プロリン０．５ｇ／ｌ　
、ロイシン１．０ｇ／ｌ　、ビタミンＢ、１０■ｇ／Ｉ
ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／　ｊ！、微量金属塩。 ■添加培地Ｉ Ｍ９培地に以下のものを加えたもの。 カザミノ酸　４０ｇ／ｌ　、グルコース３００−ｇ／ｌ
、　　）リプトファン　５０５１ｇ／ｊ！、プロリン５
ｇ／ｌ　、ロイシン５ｇ／　ｌ、ビタミンＢ＋１０ｍｇ
／　ｊ！、アンピシリン１００■ｇ／ｌ、微量金属塩。 ■添加培地２ Ｍ９培地に以下のものを加えたもの。 カザミノ酸　４．０ｇ／Ｉ、グリセロール３００ｇ／Ｉ
、プロリン５ｇ／ｌ　ｚロイシン　５ｇ／ｌ、ビタミン
Ｂ＋１１０ｌ１／２、アンピシリン１００＋ｗｇ　／　
ｊ！　、微量金属塩。 （２）培養条件 プラスミド（宿主）は、ｐＢＴ２３　（ＨＢＩＯＩ）　
。 培養容量（基本培地＋添加培地１＋添加培地２）は、５
　Ｎ　＋　０．５４！　＋　１．Ｏｊ！。 培養温度は、３７℃、ｐＨは７．００ 通気量は、１．５ｖｖｍ　（７，５ｊ！／分）。 攪拌数は、９００ｒｐ＋ｍ。 消泡は、自動（シリコン系消泡剤滴下による）。 培地添加時期は、添加培地１は培養開始後０．５〜６時
間（添加速度可変）とし、添加培地２は培養開始後６〜
２４時間（添加速度一定、　５０ａｌｌ／時間）とした
。 ＩＡＡ添加時期は、培養開始６時間後とし、ＩＡＡ濃度
は５ｍｇ／ｊ！とした。 前培養培地は基本培地と同じとした。 植菌量は、１０％とした。 添加培地ｌの供給速度は、添加中合計２０回変化するよ
うプログラムした。大腸菌の増殖とｈＥＧＦ産生量を図
８に示した。 ２４時間後の０Ｄｓｓ＊は４２であり、培養の高密度化
が達成され、ｈＥＧＦ産生量として１６０■ｇ／ｌの量
を得ることができた。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明に係るｔｒｐプロモーター、ＳＤ配列、
大腸菌アルカリ性ホスファターゼシグナルペプチド遺伝
子の配列を示す。 図２は、本発明に係るｈＥＧＦ遺伝子の配列を示す。 図３は、本発明に係る分泌発現プラスミドの作製の過程
を図示したものである。 図４は、本発明に係る分泌発現プラスミドｐＢＴ２３の
旧ｎｄ　ｍ　　ＢａｍＨＩ断片の配列を示す。 図５は、実施例１の結果を示す、横軸は培養時間（時間
）を表し、縦軸は培地中のｈＥＧＦ量（ａ＋ｇ／ｊりを
示す、・はファーメンタ−での培養を、■はフラスコ培
養を示す。 図６は実施例２の結果を示す、横軸は培養時間（時間）
を表し、縦軸は培地中のｈＥＧＦ量（ｍｇ＃りを示す、
・はファーメンタ−での培養を、■はフラスコ培養を示
す。 図７は実施例３の結果を示す、横軸は培養時間（時間）
を表し、縦軸は培地中のｈＥＧＦ量（＋ｗｇ／ｊり、及
び菌体量（０Ｄｓｓ＊表示）を示す、Ｏは菌体量を、・
はｈＥＧＦ量をそれぞれ表す。 図８は実施例４の結果を示す、横軸は培養時間（時間）
を表し、縦軸は培地中のｈＥＧＦ量（ｍｇ／２）、及び
菌体量（０Ｄｓｓ＊表示）を示す、Ｏは菌体量を、・は
ｈＥＧＦ量をそれぞれ表す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）［１］ベクターに所望物質をコードする遺伝子を
   組み込み、 ［２］このベクターを用いて宿主大腸菌を形質転換し、 ［３］このようにして得られた形質転換体を培養し、 ［４］培養液から回収することにより所望物質を取得す
   る、の上記［１］〜［４］の一連の操作を行う遺伝子工
   学的手法において、 （ａ）所望物質がｈＥＧＦであること、 （ｂ）上記［１］の操作において、ｈＥＧＦ遺伝子の上
   流領域に、トリプトファン（ｔｒｐ）合成酵素系遺伝子
   のプロモーターをコードする遺伝子、及び大腸菌アルカ
   リ性ホスファターゼ遺伝子のシグナルペプチドをコード
   する遺伝子とを組み込み、下流領域に、連続した２つの
   終止コドン、及び転写ターミネーターとを組み込むこと
   、 の上記（ａ）及び（ｂ）を特徴とする、ｈＥＧＦの製法
   。
2. （２）培養時に３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を
   添加することにより、宿主大腸菌がｈＥＧＦを産生する
   時期と量を制御することを特徴とする、特許請求の範囲
   第（１）項記載のｈＥＧＦの製法。
3. （３）培養方法が、添加速度を工夫したフェッド・バッ
   チ（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ）法を駆使した高密度培養法で
   あることを特徴とする、特許請求の範囲第（２）項記載
   のｈＥＧＦの製法。
4. （４）フェッド・バッチ法において、添加する培地の炭
   素源として、グルコース、グリセロール、又はグルコー
   スとグリセロールの組み合わせを用いることを特徴とす
   る、特許請求の範囲第（３）項記載のｈＥＧＦの製法。
5. （５）フェッド・バッチ法において、添加する培地の炭
   素源として、グルコースを用いた後にグリセロールを用
   いることを特徴とする、特許請求の範囲第（３）項記載
   のｈＥＧＦの製法。