EA025626B1 - ПРОДУЦЕНТ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА (рчЭФР) - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу получения рекомбинантного эпидермального фактора роста человека культивированием нового штамма E.coli, продуцирующего рчЭФР, который был получен трансформацией рекомбинантной плазмидой, содержащей ген чЭФР в составе экспрессионной кассеты методом электропорации. Полученный продуцент культивируют в селективных условиях, синтез рчЭФР индуцируют с помощью индуктора - изопропилтиогалактозида (ИПТГ). Штамм способен продуцировать рчЭФР в количестве до 200 мг на литр культуры. После культивирования клетки собирают центрифугированием, лизируют и выделяют тельца включения. Процедура выделения рчЭФР включает выделение телец включения, ренатурацию ЭФР, кислотное осаждение балластных белков и хроматографическую очистку на сильном катионите. Получают электрофоретически чистый ЭФР с выходом до 90 мг с литра культуры. Рекомбинантный чЭФР по своим биологическим и физико-химическим свойствам соответствует природному чЭФР. Изобретение позволяет получить биологически активный рчЭФР с высоким выходом.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения рекомбинантных белков, конкретно к получению рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (рчЭФР) и может быть использовано в фармакологи и медицине для создания новых противоожоговых и ранозаживляющих средств, для диагностики злокачественных заболеваний, ассоциированных с гиперпродукцией рецептора чЭФР, а также в создании новых методов адресной доставки тех или иных терапевтических средств в клетки-мишени, специфически экспрессирующие рецептор чЭФР. Полученные препараты рекомбинантного рчЭФР могут использоваться также для косметологических целей, а также для научных исследований, в том числе в качестве компонентов питательных сред для культур животных клеток.

Уровень техники рчЭФР - пептидный гормон, продуцируемый разнообразными тканями и содержащийся практически во всех биологических жидкостях организма человека. ЭФР синтезируется в виде предшественника длиной 1217 аминокислот и подвергается дальнейшему протеолитическому процессингу с образованием зрелого белка с характерным размером в 53 аминокислотных остатка и с тремя внутренними дисульфидными связями [1].

ЭФР действует на клетки, содержащие соответствующий рецептор на своей поверхности, преимущественно эпителиальных и соединительных тканей, и стимулирует их рост и деление.

Биологически активный чЭФР в препаративных количествах был получен первоначально из мочи человека [2,3]. Но низкое содержание целевого продукта и недостаточность источников сырья логично привели к необходимости экспрессии этого белка в бактериальных культурах клеток с помощью технологии рекомбинантных ДНК [4,5]. Однако экспрессия чЭФР в бактериальных клетках ограничена вследствие высокой токсичности целевого продукта для микробной клетки-хозяина.

Существует два метода преодоления этого ограничения:

1) клонирование в экспрессионной плазмиде гена белка-предшественника с последующим отщеплением сигнального пептида и секрецией зрелого белка во внеклеточное пространство;

2) переход целевого белка в нерастворимую форму и его локализация в клетке в виде телец включения.

В настоящее время в практике используется преимущественно первый вариант. Известны рекомбинантные плазмиды, контролирующие синтез и секрецию рчЭФР в культурах бактерий Ε.οοΙί [6,7,8] с максимальной продуктивностью до 70 мг с литра культуры, а также различных видов ВасШик [9, 10], Ркеиботоиак [11] и дрожжей [12,13,14,15] с несколько более высоким выходом целевого продукта. Однако этот подход экономически не оправдан, так как из-за относительно низкого содержания целевого продукта в микробной культуре, приходится перерабатывать большие объемы сырья, что существенно усложняет технологию выделения и очистки рчЭФР. В случае бактерий ВасШик и Ркеиботоиак дополнительным ограничением является экологическая опасность применения в производстве спорулирующих микроорганизмов. Второй недостаток состоит в частичном протеолизе продукта при его накоплении в растворимой форме в культуральной жидкости, доступной для действия протеаз, выделяемых клетками микроорганизмов в результате секреции или лизиса части клеток в популяции [16,17]. Это приводит к гетерогенности рекомбинантного белка и снижению выхода целевого продукта.

Так, известен патент РФ 2150551 [14], в котором заявляется рекомбинантный штамм дрожжей 8.сетеу1К1ае, из культуральной среды которого выделяли до 10 мг/л нативного рчЭФР.

Известен также рекомбинантный штамм Е.соП. который способен секретировать в культуральную жидкость рчЭФР [6], из которой методом иммуноаффинной хроматографии выделяли целевой продукт с выходом 1,2 мг с 1 л культуры. Это составляло около 95% от его содержания в исходной культуре [18].

Второй подход состоит в конструирование штаммов-продуцентов, в которых рЭФР образует тельца включения, защищающие целевой продукт от протеолиза. Однако, недостатком этого подхода является механизм отрицательной автоселекции в культурах таких штаммов, что обусловлено наличием определенного уровня спонтанного синтеза рчЭФР и его токсичностью для клетки-хозяина. Это явление приводит к быстрому снижению продуктивности полученных штаммов-продуцентов при их культивировании по сравнению с первичной трансформированной культурой бактерий и, как следствие, к низкому выходу целевого белка.

В большинстве известных работ авторы обходят это препятствие путем синтеза рекомбинантного белка большего размера (химеры), в котором аминокислотная последовательность ЭФР соединена с последовательностью другого белка [19, 20, 21]. Вариантом этого подхода является удлинение последовательности ЭФР на 6 или более остатков гистидина (НкЧаддеб) [22, 23]. Этот подход дает хорошие результаты в лабораторных условиях, однако нетехнологичен, так как для получения целевого продукта необходимо проведение дополнительной дорогостоящей и трудно воспроизводимой в производственных условиях стадии ферментативного отщепления дополнительного пептида.

- 1 025626

Прототипом предлагаемого изобретения является способ получения аутентичного ЭФР человека путем конструирования рекомбинантной плазмиды на основе вектора рЕТ21Ь с низким уровнем спонтанного синтеза в Е. сой, что обеспечивает снижение уровня отрицательной автоселекции [24]. Последующее выделение телец включения, их растворение, ренатурация и очистка методом НРЬС-хроматографии обеспечивают получение биологически активного ЭФР с выходом до 10 мг с литра исходной культуры.

Раскрытие изобретения

Изобретательской задачей предлагаемого изобретения является получение высокоочищенного биологически активного полностью зрелого рекомбинантного рчЭФР с высоким выходом.

Для этого была сконструирована рекомбинантная плазмида ρΜΖΕΗΕΟΡ, произведена трансформация этой плазмидой Е.сой, с получением стабильного штамма Е.сой - продуцента рчЭФР, Е.сой ВЬ21/ОЕ3 ρΜΖΕΗΕΟΡ, в котором был практически исключен спонтанный синтез рчЭФР и, тем самым, блокирован механизм отрицательной автоселекции (что позволило сохранять высокий уровень синтеза рчЭФР на протяжении всего цикла ферментации), отработаны приемы культивирования полученного штамма на селективных питательных средах с последующим выделением рчЭФР из телец включения, его ренатурации и очистки.

Полученный штамм И.соП был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ: В-11670.

Таким образом, заявляется штамм-продуцент эпидермального фактора роста человека (рчЭФР) ΒΕ21/ΟΕ3 ρΜΖΕΗΕΟΡ, (ВКПМ № В11670), содержащий плазмидную ДНК ρΜΖΕΗΕΟΡ с картой, соответствующей чертежу и содержащей экспрессионную кассету, с нуклеотидной последовательностью 8ΕΟ ГО № 1.

Штамм предпочтительно характеризуется уровнем продукции рчЭФР до 200 мг/л культуры.

Заявляется также способ получения штамма-продуцента, охарактеризованного выше, трансформацией клеток Ε.^ΐί ΒΕ21/ΟΕ3 плазмидой ρΜΖΕΗΕΟΡ, которая содержит полусинтетический ген зрелого чЭФР, кодирующий аутентичный белок рчЭФР, вставленный в экспрессионную кассету векторной плазмиды под контроль промотора и терминатора транскрипции фага Т7 с последующей селекцией.

Заявляется также способ получения рчЭФР, включающий культивирование клеток штамма И.соП ΒΕ21/ΟΕ3 ρΜΖΕΗΕΟΡ в селективных условиях, индукцию синтеза рчЭФР, отделение клеток от культуральной жидкости, их лизис, выделение и растворение телец включения, содержащих рч ЭФР, его ренатурацию, кислотное осаждение балластных белков и хроматографическую очистку рчЭФР на катионите.

Способ получения рчЭФР предпочтительно характеризуется тем, что культивирование штамма Б.соП продуцента рчЭФР - ΒΕ21/ΏΕ3 ρΜΖΕΗΕΟΡ проводят в газо-вихревом биореакторе в селективной среде при 35-37°С, предпочтительно при 37°С, скорости вращения турбины до 1200-2000 об/мин, автоматическом контроле рН и рО₂ при аэрировании воздухом.

Индукцию синтеза рчЭФР проводят добавлением раствора изопропилтиогалактозида (ИПТГ) и ферментацию ведут до ОЕ₆₀₀ культуры 6,0±0,5, отделение клеток от культуральной жидкости из биомассы проводят центрифугированием.

Отделение и концентрирование клеток из биомассы проводят методом диафильтрации на мембране с диаметром пор 0,45 мкм.

Лизис клеток может быть осуществлен ферментативно последовательной обработкой суспензии клеток лизоцимом, замораживанием, разморозкой и дезоксирибонуклеазой.

Лизис клеток может быть осуществлен обработкой суспензии в ультразвуковом или механическом дезинтеграторе.

Выделение телец включения осуществляют методом дифференциального центрифугирования или диафильтрацией на модуле с диаметром пор 0,2-0,45 мкм.

Растворение телец включения осуществляют в присутствии гуанидинхлорида и сульфгидрильных соединений. Растворение телец включения можно осуществить также в присутствии мочевины и сульфгидрильных соединений.

Ренатурацию рчЭФР целесообразно проводить разбавлением в 20-100 раз в растворе ацетатного буфера и длительной инкубацией при перемешивании на холоде.

Выделение рчЭФР предпочтительно производить кислотным осаждением балластных белков снижением рН уксусной кислотой и центрифугированием или фильтрацией.

Очистку рчЭФР проводят хроматографией на колонке, упакованной сильным катионитом, например на колонке, упакованной δ-Сефароза ЕР.

Элюцию рчЭФР осуществляют предпочтительно ацетатным буфером, содержащим Твин-20, и при этом рН элюата доводят до значения 7,1±0,1 добавлением, например, натрия гидроокиси.

Содержание целевого рчЭФР в препарате превышало 98%, и удельная активность полученного рчЭФР была не ниже 1,0 х 10⁶ МЕ/мг белка.

- 2 025626

Краткое описание чертежей

На чертеже показана генетическая карта экспрессионной плазмиды ρΜΖΕΙιΕΟΕ. Она содержит Т7 ргот - промотор бактериофага Т7, ΕΟΡ - ген чЭФР, Т7 1егт - терминатор транскрипции бактериофага Т7, К - ген устойчивости к антибиотику, например ген устойчивости к ампициллину, канамицину или др., Οτι - ориджин репликации вектора рВК322.

Осуществление изобретения

Полученные преимущества разработанного способа иллюстрируются примерами.

Пример 1. Получение рекомбинантной плазмиды ρΜΖΕΗΕΟΡ.

Плазмида ρΜΖΕΗΕΟΡ представляет собой вектор, содержащий полусинтетический ген зрелого рчЭФР.

Полусинтетический ген рчЭФР был наработан методом ПЦР, на матрице ДНК полученной методом химического синтеза олигонуклеотидов с последующей лигазной сборкой. В реакции использовали олигонуклеотидные праймеры:

содержащие инициирующий и терминирующие кодоны, а также необходимые для клонирования сайты рестрикции. По окончании реакции продукт обрабатывали последовательно эндонуклеазой ВатН1, ДНК-полимеразой бактериофага Т4 и эндонуклеазой ΝάβΙ. Конечный продукт очищали от избытка солей и побочных продуктов реакции на сефадексе 0-50. В результате был получен фрагмент ДНК размером 170 п.о.

ДНК вектора переводили в линейную форму обработкой эндонуклеазой рестрикции Βρί11102Ι, затем последовательно обрабатывали ДНК-полимеразой бактериофага Т4 и эндонуклеазой ΝάβΙ.

Фрагмент 170 п.о., содержащий ген зрелого рчЭФР, клонировали в полученную линейную форму вектора в реакции лигирования ДНК-лигазой бактериофага Т4. Лигазной смесью трансформировали клетки штамма Ε.αοΐί ΌΗ10Β (0Фко ВКБ, генотип Р^-тегА, Д(тгг-Ь5бКМ§-тегВС), φ806ΕκΖΔΜ 15, Д1аеХ74, беоК, гесА1, еибА1, агаО139, Δ(αΓα.1ου)769. да1И, да1К/_. τρδΕ, ηυρΟ). Трансформированные клетки высевали на чашки Петри с агаризованной средой ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Из полученных колоний выделяли плазмидные ДНК и проводили скрининг методом ПЦР и гельэлектрофореза с последующим секвенированием. В результате был получен рекомбинантный клон Ε^οΐί ИН10В, содержащий искомую плазмиду ρΜΖΕΙιΕΟΕ. Плазмидную ДНК ρΜΖΕΙιΕΟΕ выделяли из ночной культуры клеток Б.сои ОНЮВ/ρΜΖΕΙιΕΟΕ методом, основанным на лизисе биомассы щелочью с последующей очисткой.

Пример 2. Характеристика плазмиды, контролирующей синтез рчЭФР.

Полученная плазмида ρΜΖΕΙιΕΟΕ (см. чертеж), имеет размер 4,7 тысяч пар оснований (т.п.о.) содержит ген зрелого чЭФР, кодирующий аутентичный белок рчЭФР под контролем промотора и терминатора фага Т7 (см. Нуклеотидную последовательность ЗБЦ ГО № 1).

Плазмида ρΜΖΕΙιΕΟΕ состоит из следующих фрагментов ДНК: фрагмент ДНК с геном зрелого чЭФР размером 170 п.о., наработанный полимеразной цепной реакцией (ПЦР), на матрице ДНК полученной методом химического синтеза олигонуклеотидов с последующей лигазной сборкой, с олигонуклеотидными затравками

последовательно обработанный эндонуклеазой ВатН1, ДНК-полимеразой бактериофага Т4 и эндонуклеазой Ше1;

фрагмент ДНК векторной плазмиды, полученный последовательной обработкой эндонуклеазой Ври 11021, ДНК-полимеразой бактериофага Т4 и эндонуклеазой Ше1.

Пример 3. Получение культуры клеток Б.соН - продуцента рчЭФР.

Клетки Б.соН ВБ21ГОБ3 (Рготеда, генотип Ε-, οтρΤ, НкбЗВ (г_В- г_В-), бст, да1, [ИБ3]) трансформировали плазмидой ρΜΖΕΗΕΟΕ методом электропорации.

Трансформированные клетки высевали на чашки Петри с агаризованной средой БВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали в течение 14-18 ч при 37°С. По окончании инкубации биологическим материалом отдельной колонии засевали 2 мл жидкой среды БВ содержащей 100 мкг/мл ампициллина, культивировали 3 ч при 37°С при перемешивании, вносили изопропилтиогалактозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ и продолжали культивирование в течение 4 ч. По окончании культивирования клетки собирали центрифугированием, лизировали в растворе, содержащем 0,125 М трис-НС1, рН 6.8, 10% Р-меркаптоэтанол и 4% δΌδ кипячением в течение 5 мин. Количество белка рчЭФР в лизате определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). В результате был отобран клон Β^21/^Б3 ρΜΖΕΙιΕΟΕ, обеспечивающий уровень экспрессии рчЭФР до 200 мг на литр культуры. Штамм Ε.^1ί продуцент рчЭФР был депонирован в бактериальный музей ООО Протеиновый контур под номером: Β^21/^Б3 ρΜΖΕΙιΕΟΕ и в ВКПМ под номером: В-11670.

- 3 025626

Пример 4. Ферментация штамма-продуцента рчЭФР.

Материалом 3-5 отдельно растущих колоний засевали 50 мл среды ЬВ содержащей 100 мкг/мл ампициллина в колбы емкостью 0,5 л и культивировали 16-18 ч при температуре 37°С на термостатированном шейкере. Полученный материал высевали в соотношении 1:20 (У/У) в колбы емкостью 2 л, содержащие по 200 мл среды ЬВ со 100 мкг/мл ампициллина. Колбы инкубировали 3-6 ч при температуре 37°С на термостатированном шейкере до достижения оптической плотности ОЕ₆₀₀ = 1,5-2,0. К полученной культуре клеток добавляли диметилсульфоксид до конечной концентрации 10% (У/У), аликвотировали по 50 мл и замораживали в холодильнике при температуре -70°С. Полученная культура клеток (посевной материал) может храниться при -70°С не менее 4 мес. или при -150°С - до 2 лет.

Криоконсервированную культуру клеток (посевной материал) вносили в количестве 350 мл, в газовихревой биореактор БИОК (ЗАО Саяны), содержащий 7 л свежей среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.

Ферментер подключали к магистрали подачи сжатого воздуха от компрессора со стерилизующим фильтром. Включали нагрев ферментера, устанавливали автоматическую регулировку температуры на 37°С и доводили скорость вращения турбины до 1200-1500 об/мин. Контролировали рН среды в ферментере: удерживая значение рН не выше величины 7,6.

Давление воздуха на компрессоре устанавливали на уровне (0,20±0,05) атм. Контролировали значение рО₂, после снижения рО₂ до величины (15±5) постепенно переключают подачу сжатого воздуха на барбатер, поддерживая величину рО₂ в пределах (20±10). После полного переключения на барбатер, величину рО₂ поддерживали, постепенно увеличивая давление сжатого воздуха и контролируя расход воздуха с помощью ротаметра. Расход воздуха должен оставаться в пределах (10-15) л/мин.

После 2 ч культивирования с периодичностью 30 мин отбирали пробы культуры для определения оптической плотности. После достижения оптической плотности культуры величины ОЕ₆₀₀, равной 1,0-1,5 в емкость ферментера подавали стерильный раствора индуктора (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ. После индукции величину рО₂ увеличивали до значений >30 и поддерживали на этом уровне до конца ферментации, увеличивая давление на компрессоре и скорость перемешивания.

После достижения величины давления в ферментере 1,8-2,0 атм необходимую величину рО₂ в культуре поддерживали, импульсами подавая в систему подачи сжатого воздуха кислород из баллона через редуктор. Это позволило поддерживать параметры культивирования: давление в пределах 1,8-2,0 атм, скорость перемешивания 2000-2300 об./мин. рН среды поддерживали на уровне (7,6-7,8) до конца ферментации.

Через 2 ч после добавления индуктора и с периодичностью 30 мин отбирали пробы культуры. Контролировали оптическую плотность культуры и морфологию клеток под микроскопом. Наблюдали за динамикой увеличения оптической плотности и образования телец включения. Через 5-6 ч после индукции оптическая плотность выходила на плато на уровне величины ОЕ600, равной (6,0±0,5). Практически все клетки содержат тельца включения, 1-3 на клетку, от небольших темных включений до черных телец, превышающих по размеру в 2-3 раза толщину клетки.

Оптимальный уровень выхода рчЭФР в анализируемых образцах культуры был достигнут через 5 ч после добавления индуктора, при увеличении продолжительности культивирования более 5,5 ч после добавления индуктора наблюдалось снижение выхода рчЭФР.

Средний выход биомассы при культивировании в оптимальных условиях составил 7,2 г/л с содержанием рчЭФР 27,2 мг/г клеток.

Пример 5. Выделение телец включения.

А) Метод дифференциального центрифугирования.

К замороженному осадку 8 г клеток добавляли равный объем раствора для лизиса биомассы: 10 мМ трис-НС1, 10мМ ЭДТА, рН 7.4, 80 мкг/мл ΡΜδΡ. Биомассу размораживали, суспендировали на Вортексе, добавляли при перемешивании навеску лизоцима из расчета 1 мг/г клеток, разводили вдвое раствором для лизиса биомассы и замораживали. Затем, суспензию размораживали в водяной бане при комнатной температуре, оставляли при перемешивании на 20 мин при комнатной температуре, добавляли раствор дезоксирибонуклеазы до 10 мкг/мл и навеску магния сернокислого до конечной концентрации 11-12 мМ. Суспензию обрабатывали в блендере в течение 5-7 мин, после чего разводили в 10 раз раствором для лизиса биомассы.

Полученный лизат бактериальных клеток осветляли центрифугированием при 9000 об/мин, 20 мин (центрифуга 42-21, Бекман, США, ротор 1Л-14).

Осадок после центрифугирования последовательно промывали следующими растворами, суспендируя каждый раз осадок и осаждая центрифугированием в условиях, приведенных выше:

мМ трис-НС1, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 0.1% тритон Х-100, 1 л;

мМ трис-НС1, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 0.05% твин-20,1 л;

мМ трис-НС1, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 200 мл; изопропиловый спирт, охлажденный до -20°С, 100 мл; деионизованная вода, 0.7 л.

- 4 025626

Осадок взвешивали и суспендировали в равном объеме деионизированной воды. 50% суспензию хранили при -20°С. Было получено 1.73 г телец включения (22% от веса биомассы). Выход очищенного ЭФР составил около 25,4 мг на 1 г телец включения.

Б). Диафильтрация на модуле νίν;·ιΠο\ν 200, νίν;·ιΠο\ν Ыб. Великобритания с 0 пор 0.2 мкм. Лизис 16,2 г биомассы производили как описано выше (пример 5А). Осветленный лизат доводили до 800 мл раствором для лизиса и концентрировали на микрофильтрационном модуле νίναΠον 200 с мембраной с диаметром пор 0.2 мкм с перистальтическим насосом Майегйех Ь/δ при рабочем давлении 1.5 атм. Объем суспензии доводили до 200 мл. Суспензию последовательно промывали в режиме диафильтрации следующими растворами:

мМ трис-НС1, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 0.1% тритон Х-100, 400 мл, добавляют по 100-150 мл, концентрируют до 200 мл;

мМ трис-НС1, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 0.05% твин-20, 200 мл, добавляют по 50-70 мл, концентрируют до 25 мл;

мМ трис-НС1, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 50 мл, добавляют по 15-20 мл, концентрируют до 25 мл; изопропиловый спирт, охлажденный до -20°С, 50 мл, добавляют по 15-20 мл, концентрируют до мл;

деионизованная вода, 75 мл, добавляют по 15-20 мл, концентрируют до 25 мл.

С помощью насоса переносили суспензию в центрифужный стакан, промывали модуль деионизованной водой (3 раза по 20 мл). Суспензию и смывы объединяли, тельца включения собирали центрифугированием при 12000 об./мин при 4°С в течение 30 мин, центрифуга 62-21. Бекман, США, ротор 1Λ14. Супернатант сливали, осадок взвешивали и суспендировали в равном объеме деионизированной воды. 50% суспензию хранили при -20°С.

Получили 1,8 г телец включения (11,1% от веса биомассы) с содержанием рчЭФР 116 мг на 1 г телец включения.

В) Диафильтрация на модуле Мййрог с мембраной Ре1Бкои, 0 пор 0.45 мкм.

Лизис 86,6 г биомассы производили как описано выше (пример 5А). Осветленный лизат доводили до 4 л раствором для лизиса клеток и концентрировали на микрофильтрационном модуле МППрог с мембраной Ре1Бкои, 0 пор 0.45 мкм до 800 мл.

Суспензию последовательно промывали в режиме диафильтрации следующими растворами:

мМ трис-НС1, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 0.1% тритон Х-100, 2 л, добавляют по 200-250 мл, концентрируют до 800 мл;

мМ трис-НС1, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 0.05% твин-20, 1 л, добавляют по 100-150 мл, концентрируют до 100 мл;

мМ трис-НС1, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 250 мл, добавляют по 40-50 мл, концентрируют до 100 мл; изопропиловый спирт, охлажденный до -20°С, 250 мл, добавляют по 40-50 мл, концентрируют до

100 мл;

деионизованная вода, 300 мл, добавляют по 40-50 мл, концентрируют до 100 мл.

С помощью насоса переносили суспензию в центрифужный стакан, промывали модуль деионизованной водой (3 раза по 50 мл). Суспензию и смывы объединяли, тельца включения собирали центрифугированием при 12000 об./мин при 4°С в течение 30 мин, центрифуга 12-21, Бекман, США, ротор 1Λ14. Супернатант сливали, осадок взвешивали и суспендировали в равном объеме деионизированной воды. 50% суспензию хранили при -20°С.

Получили 16,1 г телец включения (18,6% от веса биомассы) с содержанием рчЭФР 155 мг на 1 г телец включения.

Пример 6. Растворение телец включения, ренатурация и очистка рчЭФР.

32,2 г 50% водной суспензии ТВ размораживали при комнатной температуре и добавляли при перемешивании на магнитной мешалке гуанидинхлорид до конечной концентрации 7 М и 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 100 мМ. Значение рН раствора доводили до (8,0±0,1), добавляя по каплям 0.5 М гидроокись натрия. Инкубировали при перемешивании 2 часа при комнатной температуре.

В емкость вместимостью 10 л, находящуюся в холодильном шкафу, помещали 5 л 50 мМ ацетатного буфера рН 8.0, охлажденного предварительно до температуры 5°С. При постоянном перемешивании добавляли раствор телец включения порциями по 5 мл. Инкубировали при перемешивании в течение 24 ч. По окончании инкубации раствор закисляли до значения рН 3,0, добавляя по каплям ледяную уксусную кислоту. Раствор осветляли центрифугированием при 9000 об./мин при 4°С в течение 30 мин.

Супернатант наносили на колонку К 25x20 с сорбентом δ-Сефароза РР со скоростью 5 мл/мин, колонку отмывали от несорбированного материала, пропуская 300 мл 50 мМ ацетатного буфера рН 3.0. Элюцию ЭФР осуществляли 50 мМ ацетатным буфером рН 5.0, содержащим 0,05% Твин-20 (ν/ν). Собирали элюат, ориентируясь на показания абсорбциометра. рН элюата немедленно доводили до значения 7,1±0,1 добавлением 0.5 М натрия гидроокиси.

- 5 025626

Получено 140 мл раствора рчЭФР с концентрацией 9,2 мг/мл. По данным δΌδ-электрофореза в ПААГ, чистота полученного препарата превышала 98%

Пример 7. Определение биологической активности рчЭФР.

Раствор исследуемого рчЭФР с концентрацией 9,2 мг/мл стерильно разводили в 9,2 раза в среде ГОМЕМ (ΙΟΝ, США) до концентрации 1 мг/мл.

В лунки 96-луночного плоскодонного планшета Со81аг вносили по 150 мкл среды ГОМЕМ. Затем в лунках левой половины (6 лунок из 12 в каждом ряду) планшета последовательно разбавляли в среде ГОМЕМ 1-й международный стандарт ЭФР (1 81 1п1етпайопа1 81аийатй) - из Национального института биологических стандартов и контроля (ΝΙΒδΟ), Великобритания (гес ΌΝΑ, Ьишап 1уре, собе 91/530). Для этого в шесть лунок левой половины первого ряда (ряд А) многоканальной пипеткой добавляли по 4,8 единиц активности в 150 мкл стандартного ЭФР, перемешивали пипетированием, переносили по 150 мкл в лунки левой половины следующего ряда (ряд В), и повторяли процедуру переноса и перемешивания вплоть до шестого ряда планшета включительно (ряд Р), из которого 150 мкл раствора выбрасывали. В шесть лунок правой половины первого ряда (ряд А) многоканальной пипеткой добавляли по 150 мкл раствора рчЭФР с концентрацией 1 мг/мл. Затем исследуемый образец рчЭФР последовательно разбавляли в лунках правой половины планшета до последнего (ряда Н), так же, как это было описано для стандартного ЭФР. Ко всем лункам планшета добавляли по 150 мкл суспензии клеток линии НС 11 (РпебпсН М1е8сйет 1п8Й1и1е, Базель, Швейцария) по 5 тыс. на лунку, в среде ГОМЕМ (ΙΗΝ, США), содержащей 20%, бычьей фетальной сыворотки (НуС1опе, США). Таким образом, конечная активность стандартного ЭФР в рядах А-Р для лунок левой половины планшета составляла 8 МЕ/мл (ряд А), 4 МЕ/мл (ряд В), 2 МЕ/мл (ряд С), 1 МЕ/мл (ряд Ό), 0,5 МЕ/мл (ряд Е) и 0,25 МЕ/мл (ряд Р). В лунках правой половины планшета образец исследуемого рчЭФР был последовательно разведен в 18 (ряд А), 36 (ряд В), 72 (ряд С), 144 (ряд Ό), 288 (ряд Е), 576 (ряд Р), 1152 (ряд О) и в 2304 раз (ряд Н).

Через 4 дня инкубации планшета в СО₂-инкубаторе при 37°С лунки планшета дважды промывали физиологическим раствором, добавляли по 40 мкл раствора, содержащего 20% спирта метилового и 20 мг/мл кристаллического фиолетового, и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Лунки планшета промывали семь раз водопроводной водой и добавляли по 100 мкл раствора, содержащего 5% глицерина и 20 мг/мл додецилсульфата натрия. Поглощение света определяли для каждой лунки при длине волны 540 нм на ридере ΒΙΟ-ΚΑΌ, тобе1 3550, вычисляли среднее из шести значений одного разведения. Из средних значений вычитали среднее для лунок левой половины рядов О и Н (отрицательный контроль пролиферации клеток без добавления ЭФР). Строили калибровочную кривую для стандартного образца ЭФР и кривую зависимости пролиферативного эффекта исследуемого образца рчЭФР от величины его разбавления. Используя линейный участок калибровочной кривой, определяли биологическую активность исследуемого образца рчЭФР, которая составила 9,2χ 10⁶ МЕ/мл.

Удельную активность (УА) в МЕ на мг белка вычисляли по формуле: УА = БА/СБ, где БА - биологическая активность в МЕ/мл, СБ - концентрация белка в мг/мл. Удельная активность полученного рчЭФР составила 1,0 χ 10⁶ МЕ/мг белка.

- 6 025626

Литература

1. Век Ο.Ι., Ροη§ Ν.Μ., Κίβιηρίβη М.М. е1 а1. Нитап ерИегта! §гоМЬ ГасЮг ргесигзог: ίϋΝΑ зеяиепсе, ехргеззюп ίη νίίτο апб депе ог^атгабоп.// 14ис1ею Ас1бз Кез,-1986,У.14.-Р.8427-844б.

2. Пат. ЛР №58099418,1983, кл.А61К35/22.

3. Пат. ЛР №62030718,1987, кл. А61К35/22.

4. Пат. ЛР №62040290,1987, кл. С07Н21/04.

5. Батчикова Н.В., Скапцова Н.В., Твардовская С.Е, и др. Химический синтез и клонирование гена эпидермального фактора роста человека.// Биоорган, химия.- 1988.Т.14(5).-С.621-630.

6. Птицын Л.Р., Альтман И.Б. Экстраклеточная продукция рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (ЬЕОР) в клетках ЕвсЬепсЫа сой.// Биоорган. химия.-1999.-Т.25(12).-С.923-929.

7. Пат. СИ №1279288, 2001, кл.А61К38/18.

8. Пат.ЕР №0352839, 1990, кл. С07К14/485.

9. Пат. ЛР №2031682, 1990, кл.С07К 14/32.

10. \Уап§ В., Уагщ X., \Уи К., Ηί§Η-Ιβνβ1 ргобисбоп оГ 1Ье тоизе ерк1егта1 дгоадЬ ГасЮг ίη а ВасШиз Ьгехчз ехргеззюп вузЮт.// Рго1ет Ехрг ΡιιτίΓ.-Ι993.-V.4(3),-Р.223-231.

11. Науаве Ν., СЫуата А., №\чапо М, Зесгебоп оГ Ьитап ер1бегта1 ^τον,ΐΗ ГасЮг (ЕОР) ίη аиЮ1горЫс сикиге Ьу а гесотЬтат Ьубго§еп- ибИйп£ ЬасЮпшп, Рвеиботопаз рзеибоЯауа, саггут§ Ьгоаб-ЬовТ-гапде ЕОР зесгебоп чесЮг рК8ЕОР2.// Αρρΐ Εηνίτοη М1сгоЬю1.-1994.-У.60(9)Р.3336-3342.

12. Пат. из №5102789,1992, кл.С07К14/485.

13. Пат. КК №920008372, 1992, кл.С12Ы15/12.

14. Пат. РФ №2150501, 2000, κπ.Ο12Ν1/19.

15. Пат. ΨΟ №2012060666,2012, кл. С07К14/485.

16. С1аге Л.Л., Котапоз М.А., Каутеп! Р.В., е! а1, Ргобисбоп оГ тоизе ерИегта! §гочлЬ ГасЮг ίη уеав1: Ηίβΐι-ΐβνβΐ зесгебоп изт§ РюЫа разЮпз в1га!пв соШаттд ти1бр1е сепе сор1ев.// Оепе.-1991,- ν.105.- 2,- Р.205-12.

17. Натза Ρ.Ύ., КасЬгоо Р., СЬаПоо В.В. Ргобисбоп апб зесгебоп оГЬю1о£1са11у асбуе Ьитап ер1бегта1 §гомбЬ ГасЮг ίη Уаггоила Нро1убса.// Сип^- ОепеС- 1998.- У.ЗЗ,- №3.- Р.231-7.

18. Пат. РФ №2108343, 1998, кл.С07К14/485.

19. Пат. КК №930001386, 1993, кл.С12Ы15/19

20. Пат. ΟΝ №1765929, 2006, кл.А61К38/18.

21. Пат. ΟΝ №101875699, 2010. кл.А61К38/18.

22. Гее .Τ.Υ., Υοοη С.8, СНипд Ι.Υ. е1 а1. 8са1е-ир ргосезз Гог ехргеззюп апб гепаЮгабоп οί гесотЫпап! Ьитап ергбегта! §гомЧЬ ГасЮг Ггот ЕзсЬейсЫа соб тс1изюп Ьоблез.// ВюЮсЬпо1 Арр1 ВюсЬет.-2000.-У.31(Р13).-Р.245-248.

23. ЗЬагта К., ВаЬи Р.У.С., Заз|бНаг Р е1 а1. КесотЬтап! Ьитап ер1бега1 βΓυν,τΗ ГасЮг тс1изюп Ьобу зо1иЫИгабоп апб геГо1бт£ а1 1аг§е зса1е изт§ ехрапбеб-Ьеб абзогрбоп сЬготаЮ$гарЬу Ггот ЕзсЬепсЫа соН.// ΡτοΙβίη Ехргеззюп апб Рипйсабоп.- 2008.- У.60,Р.7-14.

24. 8о1ег Е.Р., Себапо Л, ()иего1 Е, бе Погепз К.. С1оптд, ехргеззюп апб рипйсабоп оГ Ьитап ер1бегта1 §гомбЬ ГасЮг изтс ббГегет ехргеззюп зузЮтз.// Л.СЬготаЮ^г В Апа1у1 ТесЬпо! Вютеб 1лГе 8сГ-2003.-У.788(1).-Р.113-123.

- 7 025626

Перечень последовательностей <110> ООО «Протеиновый Контур», ООО ΡΕΟΐβϊηονίγ КопРиг <120> Продуцент эпидермального фактора роста человека (рчЭФР) <130> Продуцент эпидермального фактора роста человека (рчЭФР) <160> 1 <170> РаРепРШ νβΓΒΪοη 3.5 <210> 1 <211> 328 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты плазмиды ρΜΖΕΡΕΟΡ, содержащая последовательности промотора бактериофага Т7 {Т7 рготоРег), сайта связывания рибосомы (КВЗ), гена ЕСГ и терминатора транскрипции бактериофага Т7 (Т7 РегшЗпаРог)

<400> 1
ада£с1:сда£	сссдсдаааР	РааРасдасР	сасРаРаддд	адассасаас	ддРРРсссРс	60
Ъадааа^ааЪ	ΡΉΐ: д-Ы;-Ьаас	РРРаадаадд	адаРаРасаР	аРдааРРсРд	асРсРдааРд	120
сссаЪЕдЪсе	сасдасддРР	асРдсРРдса	сдасддРдРР	рдсардраса	РсдаадсРсР	180
ддасаааЪас	дсРРдсааРР	дсдРРдРРдд	РРасаРсддР	даасдррдсс	ааРассдада	240
^с^дааа^дд	РдддаасРдс	дррдараддд	аРсдсааРаа	сРадсаРаас	сссРРддддс	300
с£с£ааасдд	дРсРРдаддд	дррррррд				328

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (22)

1. Штамм-продуцент эпидермального фактора человека (рчЭФР) ΒΕ21/ΏΕ3 ρΜΖΕΕΕΟΡ, (ВКПМ № В11670), содержащий плазмидную ДНК ρΜΖΕΗΕΟΡ с картой, соответствующей чертежу и содержащей экспрессионную кассету с нуклеотидной последовательностью, соответствующей 8Ε0 ГО № 1.

2. Штамм по п.1, характеризующийся уровнем продукции рчЭФР до 200 мг/л культуры.

3. Способ получения штамма-продуцента, охарактеризованного по пп.1, 2, трансформацией клеток Е.соН ВБ21ГОЕ3 плазмидой ρΜΖΕΙιΕΟΕ, которая содержит полусинтетический ген зрелого чЭФР, кодирующий аутентичный белок рчЭФР, вставленный в экспрессионную кассету векторной плазмиды под контроль промотора и терминатора транскрипции фага Т7 с последующей селекцией.

4. Способ получения рчЭФР, включающий культивирование клеток штамма Εχοΐί ΒΕ21/ΏΕ3 ρΜΖΕΙιΕΟΕ, охарактеризованного в пп.1, 2, в селективных условиях, индукцию синтеза рчЭФР, отделение клеток от культуральной жидкости, их лизис, выделение и растворение телец включения, содержащих рчЭФР, его ренатурацию, кислотное осаждение балластных белков и хроматографическую очистку рчЭФР на катионите.

5. Способ по п.4, характеризующийся тем, что культивирование штамма Ε+ο1ί продуцента рчЭФР ΒΕ21/ΌΕ3 ρΜΖΕΙιΕΟΕ - проводят в газо-вихревом биореакторе в селективной среде при 37°С, скорости вращения турбины до 1200-2000 об/мин, автоматическом контроле рН и рО₂ при аэрировании воздухом.

6. Способ по п.4, характеризующийся тем, что индукцию синтеза рчЭФР проводят добавлением раствора изопропилтиогалактозида (ИПТГ) и ферментацию ведут до ОЕ₆₀₀ культуры 6,0±0,5.

7. Способ по п.4, характеризующийся тем, что отделение клеток от культуральной жидкости из биомассы проводят центрифугированием.

8. Способ по п.4, характеризующийся тем, что отделение и концентрирование клеток из биомассы проводят методом диафильтрации на мембране с диаметром пор 0,45 мкм.

9. Способ по п.4, характеризующийся тем, что лизис клеток осуществляют ферментативно последовательной обработкой суспензии клеток лизоцимом, замораживанием, разморозкой и дезоксирибонук- 8 025626 леазой.

10. Способ по п.4, характеризующийся тем, что лизис клеток осуществляют обработкой суспензии в ультразвуковом дезинтеграторе.

11. Способ по п.4, характеризующийся тем, что лизис клеток осуществляют обработкой суспензии в механическом дезинтеграторе.

12. Способ по п.4, характеризующийся тем, что выделение телец включения осуществляют методом дифференциального центрифугирования.

13. Способ по п.4, характеризующийся тем, что выделение телец включения осуществляют диафильтрацией на модуле с диаметром пор 0,2 мкм.

14. Способ по п.4, отличающийся тем, что выделение телец включения осуществляют диафильтрацией на модуле с диаметром пор 0,45 мкм.

15. Способ по п.4, характеризующийся тем, что растворение телец включения осуществляют в присутствии гуанидинхлорида и сульфгидрильных соединений.

16. Способ по п.4, характеризующийся тем, что растворение телец включения осуществляют в присутствии мочевины и сульфгидрильных соединений.

17. Способ по п.4, характеризующийся тем, что ренатурацию рчЭФР проводят разбавлением в

20-100 раз в растворе ацетатного буфера и длительной инкубацией при перемешивании на холоде.

18. Способ по п.4, характеризующийся тем, что выделение рчЭФР производят кислотным осаждением балластных белков снижением рН уксусной кислотой и центрифугированием или фильтрацией.

19. Способ по п.4, характеризующийся тем, что очистку рчЭФР проводят хроматографией на колонке, упакованной сильным катионитом.

20. Способ по п.4, характеризующийся тем, что очистку рчЭФР проводят хроматографией на колонке, упакованной δ-Сефароза РР.

21. Способ по п.4, характеризующийся тем, что элюцию рчЭФР осуществляют ацетатным буфером, содержащим Твин-20, и рН элюата немедленно доводят до значения 7,1±0,1 добавлением натрия гидроокиси.

22. Способ по п.4, характеризующийся тем, что в результате очистки рчЭФР содержание его в препарате превышало 98% и удельная активность полученного рчЭФР была не ниже 1,0х 10⁶ МЕ/мг белка.

Продуцент эпидермального фактора роста человека (рчЭФР). Генетическая карта экспрессионной плазмиды ρΜΖΕΕΕΟΡ. Т7 ргот - промотор бактериофага Т7, БОР - ген чЭФР, Т7 1сгт - терминатор транскрипции бактериофага Т7, К - ген устойчивости к антибиотику, например ген устойчивости к ампициллину, канамицину или др., Ой - ориджин репликации вектора рВК322